CN113293115B - 肺炎链球菌无动物源冻干保护剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肺炎链球菌无动物源冻干保护剂，属于微生物保存领域。所述冻干保护剂由如下成分组成：1％～5％重量/体积的大豆胨，1％～5％重量/体积的海藻糖，4％～8％重量/体积的甘露醇和0.3％～1.5％体积/体积的甘油，余量为水。该冻干保护剂可较好维持肺炎链球菌活性，效果与脱脂牛奶保护剂或市售无动物源冻干保护剂相当，但不含动物源成分且成本低。
Description
技术领域
本发明属于微生物保存领域。
背景技术
冷冻干燥就是将含水的物质预先降温冻结成固体，然后在低温减压条件下利用水的升华性能，使物质低温脱水而达到干燥目的的一种干燥方法。冷冻干燥能较大程度保留菌的活性，活菌制品在储运前通常需要进行冷冻干燥处理。但是，冷冻干燥过程产生多种应力会造成部分微生物细胞一定的损伤，甚至死亡，需要加入冻干保护剂来尽可能维持微生物的活性。
冻干保护剂主要可分为复合物、糖类、无机盐类、醇类、氨基酸类、聚合物、表面活性剂和抗氧化剂等几种类别，每种类别下又包含多种具体物质，例如，前述复合物包括脱脂乳、血清、蛋白胨、明胶、多肽、糊精、甲基化纤维素等等，糖类包括蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖等等(张光磊，活菌制剂冻干保护剂的研究进展，微生物学免疫学进展，2015年8月第43卷第4期)。
肺炎链球菌是一种革兰阳性菌，可引起肺炎、脑膜炎和菌血症等多种疾病。肺炎链球菌的保存关系着肺炎链球菌疫苗的原料品质，因此，肺炎链球菌在相关疫苗生产中十分重要。
公布号为CN 111849781 A的专利申请文件公开了一种肺炎链球菌冻干保护剂，其包括浓度10％wt脱脂奶粉、5％wt蔗糖、2％wt甘油、1％wt山梨醇、0.5％wt谷氨酸钠、5％海藻糖、0.1％wt维生素C、1％wt甘露醇以及1.5％脱纤维羊血，能使菌体冻干后的存活率为84％。但是，该保护剂含有较大比例的动物源成分，即脱脂奶粉和脱纤维羊血，其缺点是：一方面成本较高；另一方面容易混入动物源的病原体或致敏原，给疫苗产品带来了安全隐患。
发明内容
本发明要解决的问题是：提供一种肺炎链球菌无动物源冻干保护剂。
本发明的技术方案如下：
一种肺炎链球菌无动物源冻干保护剂，由如下成分组成：
1％～5％重量/体积的大豆胨，1％～5％重量/体积的海藻糖，4％～8％重量/体积的甘露醇和0.3％～1.5％体积/体积的甘油，余量为水。
进一步的，所述保护剂由如下成分组成：
1％～4％重量/体积的大豆胨，1％～4％重量/体积的海藻糖，6％～7％重量/体积的甘露醇和0.6％～1.2％体积/体积的甘油，余量为水。
进一步的，所述保护剂由如下成分组成：
1.5％～2.5％重量/体积的大豆胨，1.5％～2.5％重量/体积的海藻糖，6％～7％重量/体积的甘露醇和0.6％～0.7％体积/体积的甘油，余量为水。
进一步的，所述保护剂由如下成分组成：
2％重量/体积的大豆胨，2％重量/体积的海藻糖，6％重量/体积的甘露醇和0.6％体积/体积的甘油，余量为水。
一种肺炎链球菌冻干方法，该方法是将前述冻干保护剂与肺炎链球菌的菌体沉淀混合后，制备成菌悬液，进行冻干。
进一步的，所述肺炎链球菌的血清型为血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F或23F。
一种肺炎链球菌冻干粉，所述冻干粉是将前述冻干保护剂与肺炎链球菌的菌体沉淀混合后，制备成菌悬液，进行冻干得到的产物。
如前述的冻干粉，所述肺炎链球菌的血清型为血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F或23F。
一种肺炎链球菌疫苗，所述疫苗使用上述的冻干粉，经过发酵纯化及必要化学处理，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成。
前述的冻干保护剂或前述的冻干粉在制备肺炎链球菌疫苗中的用途。
本发明的有益效果：
1.本发明的无动物源冻干保护剂中各组分相互配合，可在冻干过程中有效保护肺炎链球菌活性，效果与市售产品相当，但成本不到市售产品的1/10。
2.本发明的无动物源冻干保护剂在保护肺炎链球菌冻干后，可帮助维持菌体活性，在2～8℃存放1年活性几乎不会降低；在25℃存放32周的活性降低速度缓慢。而组分相近的保护剂(将大豆胨替换成谷氨酸钠)则很难长时间维持肺炎链球菌的活性，肺炎链球菌难以在25±2℃下稳定存活超过2周。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：脱脂牛奶、市售无动物源冻干保护剂(市售)和实施例1冻干保护剂(自制配方)保护下的肺炎链球菌血清型7F型的冻干后存活率。
图2：实施例1冻干保护剂和脱脂牛奶保护剂分别冻干肺炎链球菌血清型18C型后的冻干菌种加速稳定性(25±2℃)。
图3：13个血清型的肺炎链球菌冻干菌种的32周加速稳定性(25±2℃)。
图4：实施例1冻干保护剂参与保护的13个血清型的肺炎链球菌冻干后的实时稳定性(2～8℃)检测。
图5：肺炎链球菌冻干菌种外观。
图6：单一成分的冻干保护剂对肺炎链球菌血清型7F型冻干存活率的影响。
图7：几种组合冻干保护剂对肺炎链球菌血清型9V型冻干存活率的影响。图中仅显示外观合格的冻干保护剂以及脱脂牛奶。
图8：脱脂牛奶和海藻糖+甘露醇+甘油+谷氨酸钠的组合冻干肺炎链球菌血清型4型的冻干存活率。
图9：脱脂牛奶、海藻糖+甘露醇+甘油+谷氨酸钠(对比例3)和海藻糖+甘露醇+甘油+大豆胨(实施例1)分别冻干肺炎链球菌血清型18C型后，冻干菌种的活菌数在25±2℃条件下的变化。
具体实施方式
本部分所使用的肺炎链球菌菌种包括13种血清型，分别如表1所示。
表1菌种血清型
实施例1本发明冻干保护剂的制备和性能评价
1.制备方法
本发明冻干保护剂配方为：2％大豆胨、2％海藻糖、6％甘露醇、0.6％甘油，余量为水(除甘油％为体积/体积比，其余％均为重量/体积比)。按照如下步骤配制而成：
(1)原辅材料
A大豆胨
计算公式：需用量(g)＝配制量(ml)×0.02g/ml
B海藻糖
计算公式：需用量(g)＝配制量(ml)×0.02g/ml
C甘露醇
计算公式：需用量(g)＝配制量(ml)×0.06g/ml
D甘油
计算公式：需用量(ml)＝配制量(ml)×0.006ml/ml
(2)称取及溶解试剂(以配制100ml为例)
A在电子天平上放置称量纸，清零。用不锈钢药匙分别称取海藻糖2g、大豆胨2g、甘露醇6g于烧杯中。
B用移液枪缓慢吸取0.6ml甘油并缓慢加入上述烧杯中。
C用电动移液器吸取99.4ml的注射用水至上述烧杯中，加入磁力搅拌转子，将烧杯置于磁力搅拌器上，室温下搅拌至完全溶解。
D保存与效期：于2～8℃保存，有效期24小时，需24小时内除菌过滤，除菌后有效期一个月。
2.性能评价
2.1冻干存活率
肺炎链球菌培养至对数期，取一定量菌液离心后获得菌体沉淀，分别与冻干保护剂混合，制成菌悬液，分装到菌种管内，每瓶装0.3ml菌液，含活菌1×108～1×1010CFU/0.3ml，放入冻干机中进行冻干。冻干程序为：
(1)预冻：-50℃，180min；深冻，60min；
(2)主干燥：-40℃，600min；-10℃，300min(真空度：220mTorr)
(3)终末干燥：36℃，360min(真空度：100mTorr)
每种血清型的菌种取1支菌种管，加培养基复溶后，做10倍梯度稀释，取适宜稀释度的菌液100μl，滴入血琼脂平板并涂布均匀，放入培养箱中36℃培养18～24h，长出菌落后计数，计算菌浓度(活菌数(CFU)＝平板菌落数之和/平板个数×10×稀释度)，计算存活率(冻干后活菌数÷冻干前活菌数)。
另取10％脱脂牛奶(配制方法为：称取脱脂奶粉10g至容器中，加入100ml注射用水，加热(不超过60℃)搅拌至脱脂奶粉完全溶解，于110℃，15min高压灭菌)或市售产品(美国OPS诊断公司专利产品(货号：MFDB 500-06)作为冻干保护剂，按前段所述方法进行冻干后计算存活率。
以血清型7F为例，结果如图1所示。可见，本发明的冻干保护剂(自制配方)与脱脂牛奶、市售产品的冻干保护能力整体相当。
2.2加速稳定性
另取2.1中冻干的菌种管，在25±2℃放置8周，按2.1所述方法检测第0、1、2、3、4、5、6、7、8周活菌数。以血清型18C型为例，结果如图2所示。可见在25℃下，本发明的冻干保护剂对冻干后肺炎链球菌仍能起到一定的保护作用。
另取脱脂牛奶作为阳性对照组，以血清型18C型为例考察脱脂牛奶保护剂在25±2℃下的加速稳定性，结果如图2，实施例1中的保护剂与脱脂牛奶保护能力整体相当。
图3为在GMP车间下制备的13种血清型的种子批在25±2℃放置32周的活菌数变化。可见，在25±2℃放置32周菌种仍未失活。
2.3实时稳定性
另取2.1中冻干的菌种管，在2～8℃下放置1年，按2.1所述方法检测活菌数。
结果如图4所示。可见，在2～8℃放置1年对活菌数没有明显区别，表明本发明的冻干保护剂对保护冻干后肺炎链球菌的活性有良好效果。(图中仅展示13个血清型1年的实验结果，稳定性实验正在进行中。)
2.4外观评价实验结果
外观成形良好，无坍塌。如图5。
以上结果表明，本发明的冻干保护剂能在冻干过程中有效保护肺炎链球菌活性，并明显有助于冻干后肺炎链球菌活性的保持。
另外，本发明冻干保护剂的原料成本低廉，大豆胨1555.02元/kg，海藻糖3400元/kg，甘露醇205元/kg，甘油0.06元/ml，注射用水(忽略不计)；折合冻干保护剂的成本为0.11元/ml，而前述市售产品的售价为1.85元/ml，远高于本发明。
实施例2本发明冻干保护剂及其冻干保护作用
本发明冻干保护剂配方为：4％大豆胨、4％海藻糖、7％甘露醇、1.2％甘油，余量为水(除甘油％为体积/体积比，其余％均为重量/体积比)。制备方法同实施例1。
按照实施例1的2.1节所述方法检测本发明冻干保护剂对肺炎链球菌4型的冻干后的存活率的影响。
结果发现，在本实施例的冻干保护剂保护下，肺炎链球菌4型冻干后存活率为76.73％。
实施例3本发明冻干保护剂及其冻干保护作用
本发明冻干保护剂配方为：4％大豆胨、1％海藻糖、6％甘露醇、1.2％甘油，余量为水(除甘油％为体积/体积比，其余％均为重量/体积比)。制备方法同实施例1。
按照实施例1的2.1节所述方法检测本发明冻干保护剂对肺炎链球菌4型的冻干后的存活率的影响。
结果发现，在本实施例的冻干保护剂保护下，肺炎链球菌4型冻干后存活率为74.01％。
实施例4本发明冻干保护剂及其冻干保护作用
本发明冻干保护剂配方为：1％大豆胨、4％海藻糖、6％甘露醇、1.2％甘油，余量为水(除甘油％为体积/体积比，其余％均为重量/体积比)。制备方法同实施例1。
按照实施例1的2.1节所述方法检测本发明冻干保护剂对肺炎链球菌4型的冻干后的存活率的影响。
结果发现，在本实施例的冻干保护剂保护下，肺炎链球菌4型冻干后存活率为78.37％。
以下用对比例进一步说明本发明的有益效果。
对比例1单一成分的冻干保护剂对肺炎链球菌的保护作用
将10％脱脂牛奶、8％海藻糖、8％蔗糖、8％乳糖、5％大豆胨、6％甘露醇、4％甘氨酸、2％甘油、0.9％NaCl、2％聚乙二醇分别作为冻干保护剂(水为介质)，使用实施例1的2.1节的方法检测肺炎链球菌冻干后存活率。菌种选用血清型7F型。
冻干后，牛奶保护下的存活率最高，约70％。海藻糖、甘露醇、甘油均为本发明冻干保护剂的组成部分，但单独使用时，仅使用海藻糖和大豆胨的菌冻干后存活率为10％～20％，使用甘露醇或甘油的菌冻干后存活率为0(图6)。
对比例2海藻糖、甘油、甘露醇的组合对肺炎链球菌的保护作用
以水为介质，将海藻糖、甘油、甘露醇按照表2所述比例配制成冻干保护剂，使用实施例1的2.1节的方法检测肺炎链球菌冻干后存活率。以血清型9V型为例。
表2海藻糖、甘油、甘露醇的比例(除甘油％为体积/体积比，其余％均为重量/体积比)
| 编号 | 海藻糖(％) | 甘油(％) | 甘露醇(％) |
| 1 | 4 | 0.5 | 4 |
| 2 | 4 | 1.25 | 6 |
| 3 | 4 | 2 | 8 |
| 4 | 6 | 0.5 | 6 |
| 5 | 6 | 1.25 | 8 |
| 6 | 6 | 2 | 4 |
| 7 | 8 | 0.5 | 8 |
| 8 | 8 | 1.25 | 4 |
| 9 | 8 | 2 | 6 |
结果如图7所示，冻干后牛奶组的存活率约60％，而海藻糖、甘油和甘露醇的组合物组则最高存活率约30％，高于海藻糖、甘油和甘露醇单独使用的存活率之和(不到20％)。图7中未显示表2中编号1、4、6、8、9的组别，因冻干物外形坍塌，即配方组成无法支撑冻干物的成形，相对应的存活率不列入考察。
结果表明，海藻糖、甘油和甘露醇之间存在一定的协同作用，三者合在一起能提高冻干保护效果，但离本发明的冻干保护剂还有较大差距。可见，本发明的保护剂中，各种成分相互配合，可大幅度提高肺炎链球菌在冻干过程中的存活率。
对比例3海藻糖、甘露醇、甘油、谷氨酸钠组成的配方的性能
本对比例冻干保护剂的配方为：4％海藻糖、6％甘露醇、1.2％甘油、0.3％谷氨酸钠(除甘油％为体积/体积比，其余％均为重量/体积比)，余量为水。
使用本对比例冻干保护剂、脱脂牛奶和实施例1的冻干保护剂分别冻干肺炎链球菌血清型4、18C型，检测存活率(方法同实施例1的2.1节)，检测25±2℃下保存8周的活菌数。
存活率结果如图8所示，以肺炎链球菌4型为例，在对比例保护下，存活率与脱脂牛奶相当。
以肺炎链球菌18C为例，冻干粉在25±2℃下保存8周后，本发明冻干保护剂保护下的肺炎链球菌18C型活性较高，与脱脂牛奶相当；而本对比例冻干保护剂参与冻干的肺炎链球菌血清型18C型难以在25±2℃下稳定存活超过2周，效果比脱脂牛奶和本发明冻干保护剂明显更差，结果见图9。
该结果说明，冻干保护剂不仅仅需要在冻干过程中发挥保护作用，在冻干后也同样需要发挥保护作用。使用本发明冻干保护剂的特定组分，相比对比例3的组分，能更长时间地维持肺炎链球菌的活性。
对比例4配比不同的海藻糖、甘露醇、甘油、大豆胨的性能比较
按照表3准备不同的冻干保护剂，甘油按体积比计量，其余成分按质量/体积之比计量，以血清型4型为例。
表3保护剂配方
| 编号 | 配方 |
| 0# | 10％脱脂牛奶 |
| 1# | 4％海藻糖+6％甘露醇+1.2％甘油+1％大豆胨 |
| 2# | 4％海藻糖+7％甘露醇+1.2％甘油+4％大豆胨 |
| 3# | 1％海藻糖+6％甘露醇+1.2％甘油+4％大豆胨 |
| 4# | 1.5％海藻糖+7％甘露醇+0.7％甘油+1.5％大豆胨 |
| 5# | 2.5％海藻糖+7％甘露醇+0.7％甘油+2.5％大豆胨 |
将肺炎链球菌离心取菌体沉淀后，添加表3所述的保护剂。使用实施例1的2.1节的方法对肺炎链球菌冻干。
冻干后存活率结果如表4所示。
表4冻干存活率
冻干存活率结果表明，1％～4％海藻糖、6％～7％甘露醇、0.6％～1.2％甘油、1％～4％大豆胨的组合对肺炎链球菌的冻干保护效果较好，与脱脂牛奶保护剂保护率相当甚至高于脱脂牛奶。
该结果说明，本发明的冻干保护剂的冻干保护效果优良。
综上，本发明的冻干保护剂不含动物源成分，在其保护下肺炎链球菌冻干后存活率高，冻干制剂外观良好，成本低，且在2～8℃放置1年活菌数没有明显下降，在25±2℃下稳定存活较长时间。
Claims (5)
1.一种肺炎链球菌冻干方法，其特征在于：该方法是将冻干保护剂与肺炎链球菌的菌体沉淀混合后，制备成菌悬液，进行冻干；所述肺炎链球菌是CMCC菌号为31446的肺炎链球菌；所述冻干保护剂，由如下成分组成：4％大豆胨、4％海藻糖、7％甘露醇、1.2％甘油，余量为水；或者4％大豆胨、1％海藻糖、6％甘露醇、1.2％甘油，余量为水；或者1％大豆胨、4％海藻糖、6％甘露醇、1.2％甘油，余量为水。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述肺炎链球菌的血清型为血清型4。
3.一种肺炎链球菌冻干粉，其特征在于：所述冻干粉是采用权利要求1或2所述方法得到的。
4.一种肺炎链球菌疫苗，所述疫苗使用权利要求3所述的冻干粉，经过发酵纯化及必要化学处理，加上药学上可接受的辅料制备而成。
5.权利要求3所述的冻干粉在制备肺炎链球菌相关疫苗中的用途。
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| GR01 | Patent grant | ||
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