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BR112012021296B1 - Anticorpo humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a um receptor de folato humano 1, seu método de preparação, bem como imunoconjugado, reagente de diagnóstico, e usos - Google Patents

Anticorpo humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a um receptor de folato humano 1, seu método de preparação, bem como imunoconjugado, reagente de diagnóstico, e usos Download PDF

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BR112012021296B1
BR112012021296B1 BR112012021296-6A BR112012021296A BR112012021296B1 BR 112012021296 B1 BR112012021296 B1 BR 112012021296B1 BR 112012021296 A BR112012021296 A BR 112012021296A BR 112012021296 B1 BR112012021296 B1 BR 112012021296B1
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BR
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antibody
seq
light chain
folr1
heavy chain
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BR112012021296-6A
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BR112012021296A2 (pt
Inventor
Olga AB
Daniel Tavares
Lingyun Rui
Gillian Payne
Viktor S. Goldmakher
Original Assignee
Immunogen, Inc
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Filing date
Publication date
Application filed by Immunogen, Inc filed Critical Immunogen, Inc
Publication of BR112012021296A2 publication Critical patent/BR112012021296A2/pt
Publication of BR112012021296B1 publication Critical patent/BR112012021296B1/pt

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Abstract

anticorpo humanizado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a um receptor de folato humano 1, seu método de preparação e uso, bem como imunoconjugados, composição farmacêutica, reagente de diagnóstico e kit o compreendendo a presente invenção refere-se agentes anticâncer , que são fornecidos incluindo, mas não limitados a, anticorpos e imunoconjugados que se ligam a receptor de folato humano 1. métodos de usar os agentes, anticorpos ou imunoconjugados, tais como métodos de inibir crescimento de tumor, são ainda fornecidos.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica o benefício da prioridade do Pedido Provisório U.S. 61/307.797, depositado em 24 de fevereiro de 2010, Pedido Provisório U.S. 61/346.595, depositado em 20 de maio de 2010, e Pedido Provisório U.S. 61/413.172, depositado em 12 de novembro de 2010, cada um dos quais é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO
[0002] O campo dessa invenção refere-se geralmente aos anticorpos e imunoconjugados que se ligam ao receptor de folato humano 1, bem como métodos de uso dos anticorpos e imunoconjugados para o tratamento de doenças, como câncer.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0003] O câncer é uma das principais causas de morte no mundo desenvolvido, com mais de 1 milhão de pessoas diagnosticadas com câncer e 500.000 mortes por ano só nos Estados Unidos. Globalmente estima-se que mais de 1 em cada 3 pessoas desenvolverá algum tipo de câncer durante a sua vida. Há mais de 200 tipos diferentes de câncer, quatro dos quais — mama, pulmão, colo-retal e próstata — representam mais de metade de todos os novos casos (Jemal et al., 2003, Cancer J. Clin. 53:5-26).
[0004] O receptor de folato 1 (FOLR1), também conhecido como Receptor-Alfa de Folato, ou Proteína de Ligação de Folato, é uma proteína N-glicosilada expressa na membrana plasmática das células. FOLR1 tem uma alta afinidade para o ácido fólico e vários derivados de ácido fólico reduzidos. FOLR1 medeia a distribuição do folato fisiológico, 5-metiltetrahidrofolato para o interior das células.
[0005] O FOLR1 é superexpresso na grande maioria dos cânceres de ovários, assim como em muitos cânceres uterinos, endometriais, pancreáticos, renais, pulmonares e de mama, enquanto que a expressão da FOLR1 em tecidos normais é restrito para a membrana apical das células epiteliais nos túbulos renais proximais, pneumócitos alveolares do pulmão, bexiga, testículos, plexo coroide e tireoide (Weitman SD, et al, Cancer Res 52: 3396-3401 (1992); Antony AC, Annu Rev Nutr 16: 501-521 (1996); Kalli KR, et al. Gynecol Oncol 108: 619-626 (2008)). Esse padrão de expressão de FOLR1 torna um alvo desejável para a terapia de câncer direcionada por FOLR1.
[0006] Devido ao câncer de ovário ser normalmente assintomático até a fase avançada, ele é frequentemente diagnosticado tardiamente e tem mau prognóstico quando tratado com procedimentos atualmente disponíveis, normalmente quimioterápicos após a redução de volume cirúrgica (von Gruenigen V et al, Cancer 112: 2221-2227 (2008); Ayhan A et al, Am Obstet Gynecol 196: 81 e81-86 (2007); Harry VN et al, Obstet Gynecol Surv 64: 548-560 (2009)). Assim, existe uma clara necessidade médica não atendida por terapêuticos mais eficazes para cânceres de ovário.
[0007] Foram examinados três anticorpos anti-FOLR1 como potenciais fármacos anticâncer. Os anticorpos monoclonais murinos Mov18 e Mov19 foram isolados na década de 1980 (Miotti S et al, Int Cancer 39: 297-303 (1987)), confirmados para o FOLR1 alvo (Coney LR et al, Cancer Res 51 : 6125-6132 (1991)) e testados em estudos pré-clínicos, por sua capacidade de erradicar células de câncer que expressam o antígeno como conjugados com uma proteína de inativação de ribossoma citotóxica (Conde FP et al, Eur Biochem 178: 795-802 (1989)).
[0008] Mov19 foi testado como um anticorpo biespecífico objetivando as células T citotóxicas e células assassinas naturais (Mezzanzanica D et al, Int J Cancer 41 : 609-615 (1988); Ferrini S et al, Int J Cancer Suppl 4: 53-55 (1989); Ferrini S et al, Int J Cancer 48: 227-233 (1991)), e como uma proteína de fusão do Fv de cadei única (scFv) de Mov19 com interleucina-2 in vivo (Melani C et al, Cancer Res 58: 4146-4154 (1998)). Anticorpos anti-FOLR1 quiméricos (murino variável/humano constante) Mov18 e Mov19 foram examinados pré- clinicamente para sua habilidade de mediar a matança dependente de célula imune citotóxica de células tumorais expressando FOLR1 in vitro (Coney LR et al, Cancer Res 54: 2448-2455 (1994)), e um Mov18- IgE quimérico foi testado em modelos pré-clínicos imunoterapêuticos dependentes de IgE (Karagiannis SN et al, J Immunol 179: 2832-2843 (2007); Gould H] et al, Eur J Immunol 29: 3527-3537 (1999)).
[0009] Mov18 foi estudado na forma de conjugados com vários radionuclídeos em estudos pré-clínicos e então, no inínio dos anos 90, em testes clínicos (Zacchetti A et al., Nucl Med Biol 36: 759-770 (2009)), que terminaram sem qualquer fármaco sendo aprovada para uso clínico.
[00010] MORAb003, uma forma humanizada do anticorpo anti- FOLR1 monoclonal murino LK26 foi avaliada pré-clinicamente como um anticorpo não modificado (Ebel W et al, Cancer Immun 7:6 (2007)) e como um conjugado com o radionuclídeo 111In (Smith-Jones PM et al, Nucl Med Biol 35: 343-351 (2008)), e está atualmente passando por testes clínicos como um anticorpo não modificado (D. K. Armstrong et al J. Clin. Oncol 26: 2008, May 20 suppl; abstract 5500).
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[00011] A presente invenção fornece novos anticorpos que se ligam ao receptor de folato humano 1, imunoconjugados compreendendo esses anticorpos, e métodos para seu uso são descritos aqui. A presente invenção fornece ainda novos polipeptídeos, tais como anticorpos que se ligam ao receptor de folato humano 1, fragmentos de tais anticorpos, e outros polipeptídeos relacionados com tais anticorpos são também fornecidos. Os polinucleotídeos compreendendo sequências de ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos são também fornecidos, como são os vetores que compreendem os polinucleotídeos. As células compreendendo os polipeptídeos e/ou polinucleotídeos da invenção são ainda fornecidas. As composições (por exemplo, composições farmacêuticas) compreendendo os novos anticorpos do receptor de folato humano 1 ou imunoconjugados são também fornecidas. Além disso, os métodos para fazer e usar os novos anticorpos do receptor de folato humano 1 ou imunoconjugados são também fornecidos, tais como métodos de uso dos novos anticorpos ou imunoconjugados de receptor de folato humano 1 para inibir o crescimento do tumor e/ou tratar o câncer.
[00012] Assim, em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que especificamente liga um receptor de folato humano 1, em que o anticorpo compreende (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo GYFMN (SEQ ID NO:1); uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo RIHPYDGDTFYNQXaa1FXaa2Xaa3 (SEQ ID NO:56); e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo YDGSRAMDY (SEQ ID NO:3); e (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo KASQSVSFAGTSLMH (SEQ ID NO:7); uma CDR2 de cadeia leve compreendendo RASNLEA (SEQ ID NO:8); e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo QQSREYPYT (SEQ ID NO:9); em que Xaa1 é selecionado a partir de K, Q, H, e R; Xaa2 é selecionado a partir de Q, H, N, e R; e Xaa3 é selecionado a partir de G, E, T, S, A, e V. Em uma determinada modalidade, o anticorpo humanizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo liga um receptor de folato humano 1 com substancialmente a mesma afinidade como o anticorpo quimérico Mov19. Em uma determinada modalidade, o anticorpo humanizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende a sequência de CDR2 de cadeia pesada RIHPYDGDTFYNQKFQG (SEQ ID NO:2).
[00013] Em uma determinada modalidade, a afinidade de ligação é medida pela citometria de fluxo, Biacore, ou radioimunoensaio.
[00014] Em outra modalidade, a invenção fornece um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que especificamente liga um receptor de folato humano 1, em que o anticorpo compreende: (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo GYFMN (SEQ ID NO:1), ou uma variante do mesmo compreendendo 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservativas; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo RIHPYDGDTFYNQKFQG (SEQ ID NO:2), ou uma variante do mesmo compreendendo 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservativas; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo YDGSRAMDY (SEQ ID NO:3), ou uma variante do mesmo compreendendo 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservativas; e/ou (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo KASQSVSFAGTSLMH (SEQ ID NO:7), ou uma variante do mesmo compreendendo 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservativas; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo RASNLEA (SEQ ID NO:8), ou uma variante do mesmo compreendendo 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservativas; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo QQSREYPYT (SEQ ID NO:9), ou uma variante do mesmo compreendendo 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservativas.
[00015] Em uma determinada modalidade, a invenção fornece um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que especificamente liga o receptor de folato humano 1 compreendendo a cadeia pesada da SEQ ID NO:6. Em outra modalidade, o anticorpo humanizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo é codificado pelo DNA do plasmídeo depositado com o ATCC em 7 de abril de 2010 e tendo depósito ATCC n°s, PTA- 10772 e PTA- 10773 ou 10774.
[00016] Em uma determinada modalidade, a invenção fornece um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que compete para a ligação ao FOLR1 com um anticorpo compreendendo (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo GYFMN (SEQ ID NO: 1); uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo RIHPYDGDTFYNQXaa1FXaa2Xaa3 (SEQ ID NO:56); e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo YDGSRAMDY (SEQ ID NO:3); e (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo KASQSVSFAGTSLMH (SEQ ID NO:7); uma CDR2 de cadeia leve compreendendo RASNLEA (SEQ ID NO:8); e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo QQSREYPYT (SEQ ID NO:9); em que Xaa1 é selecionado a partir de K, Q, H, e R; Xaa2 é selecionado a partir de Q, H, N, e R; e Xaa3 é selecionado a partir de G, E, T, S, A, e V. Em uma determinada modalidade, o anticorpo humanizado compreende a sequência de CDR2 de cadeia pesada RIHPYDGDTFYNQKFQG (SEQ ID NO:2).
[00017] Em uma determinada modalidade, a invenção fornece um polipeptídeo, anticorpo humanizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada pelo menos cerca de 90% idêntico à SEQ ID NO:4, e um domínio variável de cadeia leve pelo menos cerca de 90% idêntico à SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11. Em outra modalidade, o anticorpo humanizado ou fragmento de ligação de antígeno compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos cerca de 95% idêntico à SEQ ID NO:4, e um domínio variável de cadeia leve pelo menos cerca de 95% idêntico à SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11. Em uma modalidade adicional, o anticorpo humanizado compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos cerca de 99% idêntico à SEQ ID NO:4, e um domínio variável de cadeia leve pelo menos cerca de 99% idêntico à SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 1 1. Em uma determinada modalidade, o anticorpo humanizado compreende o domínio variável de cadeia pesada da SEQ ID NO:4, e o domínio variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11. Em determinadas modalidades, a invenção fornece um polipeptídeo, anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno pelo menos cerca de 90% idêntico à SEQ ID NOs: 88-119. Em determinadas modalidades, a invenção fornece um polipeptídeo, anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno pelo menos cerca de 95% idêntico à SEQ ID NOs: 88-119. Em determinadas modalidades, a invenção fornece um polipeptídeo, anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno pelo menos cerca de 99% idêntico à SEQ ID NOs: 88-119.
[00018] Em uma determinada modalidade, a invenção fornece um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que é expresso pelo menos dez vezes maior do que chMov19 em células eucarióticas. Em uma determinada modalidade, as células eucarióticas são células HEK-293T.
[00019] Em determinadas modalidades, a invenção fornece um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que especificamente liga um receptor de folato humano 1, em que o anticorpo compreende: (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo SSYGMS (SEQ ID NO:30); uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo TISSGGSYTY (SEQ ID NO:31); e/ou uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo DGEGGLYAMDY (SEQ ID NO:32); e/ou (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo KASDHINNWLA (SEQ ID NO:27); uma CDR2 de cadeia leve compreendendo GATSLET (SEQ ID NO:28); e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo QQYWSTPFT (SEQ ID NO:29). Em outra modalidade, a invenção fornece um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que especificamente liga um receptor de folato humano 1, em que o anticorpo compreende: (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo TNYWMQ (SEQ ID NO:60); uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo AIYPGNGDSR (SEQ ID NO:61); e/ou uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo RDGNYAAY (SEQ ID NO:62); e/ou (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo RASENIYSNLA (SEQ ID NO:57); uma CDR2 de cadeia leve compreendendo AATNLAD (SEQ ID NO:58); e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo QHFWASPYT (SEQ ID NO:59). Em outra modalidade, a invenção fornece um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que especificamente liga um receptor de folato humano 1, em que o anticorpo compreende: (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo TNYWMY (SEQ ID NO:66); uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo AIYPGNSDTT (SEQ ID NO:67); e/ou uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo RHDYGAMDY (SEQ ID NO:68); e/ou (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo RASENIYTNLA (SEQ ID NO:63); uma CDR2 de cadeia leve compreendendo TASNLAD (SEQ ID NO:64); e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo QHFWVSPYT (SEQ ID NO:65). Em outra modalidade, a invenção fornece um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que especificamente liga um receptor de folato humano 1, em que o anticorpo compreende: (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo SSFGMH (SEQ ID NO:72); uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo YISSGSSTIS (SEQ ID NO:73); e/ou uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo EAYGSSMEY (SEQ ID NO:74); e/ou (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo RASQNINNNLH (SEQ ID NO:69); uma CDR2 de cadeia leve compreendendo YVSQSVS (SEQ ID NO:70); e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo QQSNSWPHYT (SEQ ID NO:71). Em outra modalidade, a invenção fornece um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que especificamente liga um receptor de folato humano 1, em que o anticorpo compreende: (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo TSYTMH (SEQ ID NO:78); uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo YINPISGYTN (SEQ ID NO:79); e/ou uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo GGAYGRKPMDY (SEQ ID NO:80); e/ou (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo KASQNVGPNVA (SEQ ID NO:75); uma CDR2 de cadeia leve compreendendo SASYRYS (SEQ ID NO:76); e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo QQYNSYPYT (SEQ ID NO:77).
[00020] Em determinadas modalidades, os polipeptídeos da invenção são anticorpos de comprimento completo ou fragmentos de ligação de antígeno. Em determinadas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno são um Fab, um Fab', um F(ab')2, um Fd, um Fv de cadeia única ou scFv, um dissulfeto ligado a Fv, um domínio V NAR, um IgNar, um intracorpo, um IgG-CH2, um minicorpo, um F(ab')3, um tetracorpo, um triacorpo, um diacorpo, um anticorpo de domínio único, DVD-Ig, Fcab, mAb2, um (scFv)2, ou um scFv-Fc.
[00021] Em determinadas modalidades, um anticorpo ou polipeptídeo da invenção se liga a um receptor de folato humano 1 com uma Kd de cerca de 1,0 a cerca de 10 nM. Em uma modalidade, o anticorpo ou polipeptídeo se liga a um receptor de folato humano 1 com uma Kd de cerca de 1,0 nM ou melhor. Em uma determinada modalidade, a afinidade de ligação é medida pela citometria de fluxo, Biacore, ou radioimunoensaio.
[00022] A invenção também fornece um método de fazer um anticorpo da invenção compreendendo o cultivo de uma célula que expressa o referido anticorpo; e (b) isolamento do anticorpo a partir da referida célula cultivada. Em uma determinada modalidade, a célula é uma célula eucariótica.
[00023] A invenção também fornece um imunoconjugado tendo a fórmula (A) - (L) - (C), em que: (A) é um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno ou polipeptídeo da invenção; (L) é um ligante; e (C) é um agente citotóxico, em que o referido ligante (L) liga (A) à (C).
[00024] Em uma modalidade, o ligante é selecionado a partir do grupo de um ligante clivável, um ligante não-clivável, um ligante hidrofílico, e um ligante a base de ácido dicarboxílico. Em uma modalidade adicional, o ligante é selecionado a partir do grupo consistindo em: N-succinimidil4- (2-piridilditio)pentanoato (SPP) ou N-succinimidil4-(2-piridilditio)-2- sulfopentanoato (sulfo-SPP); N-succinimidil-4-(2-piridilditio)butanoato (SPDB) ou N-succinimidil4-(2-piridilditio)-2-sulfobutanoato (sulfo-SPDB); N-succinimidil4-(maleimidometil)-ciclo-hexanocarboxilato (SMCC); N- sulfosuccinimidil 4-(maleimidometil)-ciclo-hexanocarboxilato (sulfoSMCC); N-succinimidil-4-(iodoacetil)-aminobenzoato (SIAB); e N- succinimidil-[(N-maleimidopropionamido)-tetraetilenoglicol] éster (NHS- PEG4-maleimida). Em uma determinada modalidade, o ligante é N- succinimidil-[(N-maleimidopropionamido)-tetraetilenoglicol] éster (NHS- PEG4-maleimida).
[00025] Em uma modalidade, os imunoconjugados compreendem um agente citotóxico selecionado a partir do grupo de um maitansinoide, análogo de maitansinoide, benzodiazepina, taxoide, CC-1065, análogo de CC-1065, duocarmicina, análogo de duocarmicina, caliqueamicina, dolastatina, análogo de dolastatina, auristatina, derivado de tomaimicina, e derivado de leptomicina ou um profármaco do agente. Em uma modalidade adicional, o agente citotóxico é um maitansinoide. Em outra modalidade, o agente citotóxico é N(2')-deacetil-N(2')-(3-mercapto-1-oxopropil)-maitansina ou N(2')-deacetil-N2-(4-mercapto-4-metil-1-oxopentil)-maitansina.
[00026] Em uma modalidade a invenção fornece um imunoconjugado compreendendo: (A) um anticorpo humanizado compreendendo o domínio variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 4, e o domínio variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO:11 ; (L) N- succinimidil-[(N-maleimidopropionamido)-tetraetilenoglicol] éster (NHS- PEG4-maleimida); e (C) N(2')-deacetil-N2-(4-mercapto-4-metil-1- oxopentil)-maitansina; em que (L) liga (A) à (C).
[00027] Em uma modalidade a invenção fornece um imunoconjugado compreendendo: (A) um anticorpo humanizado compreendendo o domínio variável de cadeia pesada da SEQ ID NO:4, e o domínio variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO:11 ; (L) 4-(2-piridilditio)butanoato de N-succinimidila (SPDB); e (C) N(2')-deacetil-N2-(4-mercapto-4-metil-1-oxopentil)-maitansina; em que (L) liga (A) à (C).
[00028] Em uma modalidade a invenção fornece um imunoconjugado compreendendo: (A) um anticorpo humanizado compreendendo o domínio variável de cadeia pesada da SEQ ID NO:4, e o domínio variável de cadeia leve da SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:11; (L) N -succinimidil 4-(2-piridilditio)2-sulfobutanoato (sulfo- SPDB); e (C) N(2')-deacetil-N2-(4-mercapto-4-metil-1-oxopentil)- maitansina; em que (L) liga (A) à (C).
[00029] Em uma modalidade a invenção fornece um imunoconjugado compreendendo: (A) um anticorpo humanizado compreendendo o domínio variável de cadeia pesada da SEQ ID NO:4, e o domínio variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO:11 ; (L) -succinimidil 4-(2-piridilditio)-2-sulfopentanoato (sulfo- SPP); e (C) N(2')-deacetil-N(2')-(3-mercapto-1-oxopropil)-maitansina; em que (L) liga (A) à (C).
[00030] Em uma modalidade a invenção fornece um imunoconjugado compreendendo: (A) um anticorpo humanizado compreendendo o domínio variável de cadeia pesada da SEQ ID NO:4, e o domínio variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO:11 ; (L) 4-(2-piridilditio)pentanoato de N-succinimidila (SPP); e (C) N(2')-deacetil-N(2')-(3-mercapto-1-oxopropil)-maitansina; em que (L) liga (A) à (C).
[00031] A invenção também fornece uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo, fragmento de ligação de antígeno, polipeptídeo, ou imunoconjugado da invenção e um transportador farmaceuticamente aceitável. Em uma determinada modalidade, a composição farmacêutica compreende ainda um segundo agente anticâncer.
[00032] A invenção também fornece um reagente de diagnóstico compreendendo um anticorpo, fragmento de ligação de antígeno, polipeptídeo, ou imunoconjugado da invenção que é marcado. Em uma modalidade, o marcador é selecionado a partir do grupo de um radiomarcador, um fluoroforo, um cromoforo, um agente de imagem e um íon metálico.
[00033] A invenção também fornece um kit compreendendo o anticorpo, fragmento de ligação de antígeno, polipeptídeo, ou imunoconjugado da invenção.
[00034] A invenção também fornece um método de inibir o crescimento tumoral em um sujeito, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo, fragmento de ligação de antígeno, polipeptídeo, imunoconjugado, ou composição farmacêutica da invenção ao sujeito. Em uma determinada modalidade, a invenção fornece um método de inibir o crescimento tumoral em um sujeito compreendendo administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um imunoconjugado tendo a fórmula (A) - (L) - (C), em que: (A) é um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que especificamente liga um receptor de folato humano 1; (L) é um ligante; e (C) é uma citotoxina selecionada a partir do grupo consistindo em um maitansinoide e um análogo de maitansinoide; em que (L) liga (A) à (C) e em que o imunoconjugado reduz o volume do tumor médio pelo menos duas vezes em um modelo de xenoenxerto KB. Em uma determinada modalidade, o método compreende administrar um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que compreende (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo GYFMN (SEQ ID NO:1); uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo RIHPYDGDTFYNQXaalFXaa2Xaa3 (SEQ ID NO:56); e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo YDGSRAMDY (SEQ ID NO:3); e (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo KASQSVSFAGTSLMH (SEQ ID NO:7); uma CDR2 de cadeia leve compreendendo RASNLEA (SEQ ID NO:8); e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo QQSREYPYT (SEQ ID NO:9); em que Xaa1 é selecionado a partir de K, Q, H, e R; Xaa2 é selecionado a partir de Q, H, N, e R; e Xaa3 é selecionado a partir de G, E, T, S, A, e V. Em uma modalidade adicional, o anticorpo compreende uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo RIHPYDGDTFYNQKFQ G (SEQ ID NO:2).
[00035] Em uma determinada modalidade, a invenção fornece um método para inibir o crescimento tumoral compreendendo a adminstração de um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo codificado pelo DNA do plasmídeo depositado com o ATCC em 7 de abril de 2010 e tendo depósito ATCC nos. PTA-10772 e PTA- 10773 ou 10774.
[00036] Em outra modalidade, o método fornece a administração de um imunoconjugado compreendendo um anticorpo humanizado compreendendo o domínio variável de cadeia pesada da SEQ ID NO:4, e o domínio variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO:11 ; (L) N-succimidil-[(N-maleimidopropionamido)-tetraetilenoglicol] éster (NHS-PEG4-maleimida); e (C) N(2')-deacetil-N2-(4-mercapto-4-metil-1- oxopentil)-maitansina.
[00037] Em outra modalidade, o método compreende a administração de um imunoconjugado que compreende (A) um anticorpo humanizado compreendendo o domínio variável de cadeia pesada da SEQ ID NO:4, e o domínio variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO:11 ; (L) 4-(2-piridilditio)butanoato de N- succinimidila (SPDB); e (C) N(2')-deacetil-N2-(4-mercapto-4-metil-1- oxopentil)-maitansina; em que (L) liga (A) à (C).
[00038] Em outra modalidade, o método compreende administração de um imunoconjugado que compreende (A) um anticorpo humanizado compreendendo o domínio variável de cadeia pesada da SEQ ID NO:4, e o domínio variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO:11 ; (L) N -succinimidil 4-(2-piridilditio)2-sulfobutanoato (sulfo- SPDB); e (C) N(2')-deacetil-N2-(4-mercapto-4-metil-1-oxopentil)- maitansina; em que (L) liga (A) à (C).
[00039] Em outra modalidade, o método compreende administração de um imunoconjugado que compreende (A) um anticorpo humanizado compreendendo o domínio variável de cadeia pesada da SEQ ID NO:4, e o domínio variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO:11 ; (L) 4-(2-piridilditio)-2-sulfopentanoato de N-succinimidila (sulfo-SPP); e (C) N(2')-deacetil-N(2')-(3-mercapto-1-oxopropil)- maitansina; em que (L) liga (A) à (C).
[00040] Em outra modalidade, o método compreende administração de um imunoconjugado que compreende (A) um anticorpo humanizado compreendendo o domínio variável de cadeia pesada da SEQ ID NO:4, e o domínio variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO:11 ; (L) 4-(2-piridilditio)pentanoato de N-succinimidila (SPP); e (C) N(2')-deacetil-N(2')-(3-mercapto-1-oxopropil)-maitansina; em que (L) liga (A) à (C).
[00041] Em outra modalidade, o método compreende a administração de um imunoconjugado que compreende o anticorpo huFR-1-21 depositado com ATCC em 7 de abril de 2010 e tendo depósito ATCC nos. PTA-10775 e PTA-10776. Em uma determinada modalidade, o anticorpo huFR1-21 compreende (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo SSYGMS (SEQ ID NO:30); uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo TISSGGSYTY (SEQ ID NO:31); e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo DGEGGLYAMDY (SEQ ID NO:32); e (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo KASDHINNWLA (SEQ ID NO:27); uma CDR2 de cadeia leve compreendendo GATSLET (SEQ ID NO:28); e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo QQYWSTPFT (SEQ ID NO:29). Em determinadas modalidades o método compreende a administração de um imunoconjugado que compreende o anticorpo é o anticorpo huFR1-48 que compreende:(a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo TNYWMQ (SEQ ID NO:60); uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo AIYPGNGDSR (SEQ ID NO:61); e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo RDGNYAAY (SEQ ID NO:62); e (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo RASENIYSNLA (SEQ ID NO:57); uma CDR2 de cadeia leve compreendendo AATNLAD (SEQ ID NO:58); e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo QHFWASPYT (SEQ ID NO:59). Em determinadas modalidades o método compreende a administração de um imunoconjugado que compreende o anticorpo é o anticorpo huFR1-49 que compreende: (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo TNYWMY (SEQ ID NO:66); uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo AIYPGNSDTT (SEQ ID NO:67); e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo RHDYGAMDY (SEQ ID NO:68); e (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo RASENIYTNLA (SEQ ID NO:63); uma CDR2 de cadeia leve compreendendo TASNLAD (SEQ ID NO:64); e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo QHFWVSPYT (SEQ ID NO:65). Em determinadas modalidades o método compreende a administração de um imunoconjugado que compreende o anticorpo é o anticorpo huFR1-57 que compreende: (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo SSFGMH (S EQ ID NO: 72); uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo YISSGSSTIS ( SEQ ID NO:73); e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo EAYGSSMEY (SEQ ID NO:74); e (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo RASQNINNNLH (SEQ ID NO:69); uma CDR2 de cadeia leve compreendendo YVSQSVS (SEQ ID NO:70); e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo QQSNSWPHYT (SEQ ID NO:71). Em determinadas modalidades o método compreende a administração de um imunoconjugado que compreende o anticorpo é o anticorpo huFR1-65 que compreende: (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo TSYTMH (SEQ ID NO:78); uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo YINPISGYTN (SEQ ID NO:79); e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo GGAYGRKPMDY (SEQ ID NO:80); e (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo KASQNVGPNVA (SEQ ID NO:75); uma CDR2 de cadeia leve compreendendo SASYRYS (SEQ ID NO:76); e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo QQYNSYPYT (SEQ ID NO:77).
[00042] Em uma modalidade, o método inibe o crescimento do tumor de ovário, tumor de cérebro, tumor de mama, tumor uterino, tumor endometrial, tumor pancreático, tumor renal, ou de tumor do pulmão. Em uma determinada modalidade, o método inibe o crescimento do tumor ovariano. Em outra modalidade, a invenção inibe o crescimento do tumor do pulmão. Em uma determinada modaldiade, a inibição do crescimento tumoral é usada para tratar o câncer. Em uma modalidade adicional, o método compreende a administração de um segundo agente anticâncer ao sujeito. Em uma determinada modalidade, o segundo agente anticâncer é um agente quimioterapêutico.
[00043] A invenção também fornece uma célula isolada que produz o anticorpo, o fragmento de ligação de antígeno, ou polipeptídeo da invenção.
[00044] A invenção também fornece um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência pelo menos 90% idêntica à uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 5, 14, 15, 37, 38, 43, 44, 47, 48, e 120 a 127. Em uma determinada modalidade, o polinucleotídeo isolado é pelo menos 95% idêntico a uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 5, 14, 15, 37, 38, 43, 44, 47, 48, e 120 a 127. Em outra modalidade, o polinucleotídeo isolado é pelo menos 99% idêntico à uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 5, 14, 15, 37, 38, 43, 44, 47, 48, e 120 a 127. A invenção também fornece um vetor compreendendo qualquer um dos polinucleotídeos das SEQ ID NOs: 5, 14, 15, 37, 38, 43, 44, 47, 48, e 120 a 127. Em outra modalidade, a invenção fornece uma célula hospedeira compreendendo um vetor que contém um polinucleotídeo das SEQ ID NOs: 5, 14, 15, 37, 38, 43, 44, 47, 48, e 120-127.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00045] Figura 1. Resíduos de superfície para Mov19 murino (muMov19) e humanizado (huMov19). (A) Resíduos de superfície de cadeia leve de Mov19 murino e humanizado. Os resíduos de superfície de quadro de região variável de cadeia leve de Mov19 murino e humanizado e número de posição (sistema Kabat) são dados. Os resíduos humanos que são diferentes das sequêncuas murinas originais são sublinhados. *Posição 74 não é uma posição de superfície, mas para remover um sítio de glicosilação ligado a N de consenso na versão 1.00, esta posição foi mudada para uma Treonina (o resíduo humano mais comum nesta posição), resultando na versão 1.60. (B) Resíduos de superfície de cadeia pesada de Mov19 Murino e Humano. Os resíduos de superfície do quadro da região variável de cadeia pesada de Mov19 murino e humanizado e número de posição (Sistema Kabat) são dados. Os resíduos humanos que são diferentes das sequêncuas murinas originais são sublinhados. Resíduos de superfície similares são fornecidos para FR1-21 (C) e (D).
[00046] Figura 2. Alinhamentos de domínios variáveis de cadeia pesada e leve de Mov19 e huMov19 quimérico e domínios variáveis de cadeia leve e pesada de muFR1-21 e huFR1-21. Alinhamento das sequências revestidas para as regiões variáveis de Mov19 e FR1-21 com suas contrapartes murinas. A) e C) domínios variáveis de cadeia leve; B) e D) domínio variável de cadeia pesada. Aspas "-" denotam identidade com a sequência murina. As CDRs (definição de Kabat) são sublinhadas.
[00047] Figura 3. Expressão de Mov 19 e huMov 19 quimérico em células HEK. Os plasmídeos de expressão de Mov19 quiméricos e humanos foram transientemente transfectados em células HEK293-T em suspensão, coletados 7 dias depois, e o anticorpo expresso foi determinado pela ELISA quantitativa. Os plasmídeos de cadeia leve e cadeia pesada foram transfectados em ambas as respectivas razões molares.
[00048] Figura 4. Especificidade de ligação dos anticorpos anti- FOLR1, como detectada pela sua ligação às células 300-19 expressando FOLR1. A ligação do huMov19 às células 300-19-FOLR1 pela citometria de fluxo. células 300-19 parentais expressando FOLR- 1. O sombreamento sólido cinza representa a auto fluorescência celular; as linhas pontilhadas pretas representam células incubadas com anticorpo secundário anti-humano conjugado com FITC, as linhas sólidas pretas representam células incubadas com o anticorpo huMov- 19 e anticorpo secundário anti-humano conjugado à FITC.
[00049] Figura 5. Afinidades de ligação e atividade citotóxica in vitro de anticorpos anti-FOLR1 e imunoconjugados. Afinidade de ligação de huMov19 e vários anticorpos FR-1 murinos e humanizados foi medida em células SKOV3. A atividade citotóxica in vitro dos conjugados de PEG4-Mal-DM4 dos anticorpos listados também foi testada.
[00050] Figura 6. Citotoxidade celular dependente de anticorpo dos imunoconjugados. Atividade ADCC dos huMov19, huFR1-21, e Mor003 foi testada contra células Igrov1. Igrov 1 foram incubadas a 15000 células/poço Alvo:Razão celular NK de 1 :4.
[00051] Figura 7. Atividade citotóxica da exposição contínua de huFR1-21-PEG4-mal-DM4 e huMov19-PEG4-mal-DM4 em células KB. Um excesso dos anticorpos não conjugados suprimiu a atividade dos imunoconjugados quando eles foram co-incubados na presença de células KB, indicando que a atividade citotóxica é dependente de antígeno.
[00052] Figura 8. Eficácia in vivo de conjugados direcionados a huMov19 em um modelo de xenoenxerto KB. Conjugado clivável direcionado a FOLR1 huMov19-SPDB-DM4 (B) em comparação com huC242-SPDB-DM4 direcionado a não-FOLR1 (D), e conjugado não clivável huMov19-PEG4-Mal-DM4 (C) em comparação com huC242- PEG4Mal-DM4 de não direcionamento (E) foram testados usando um modelo de xenoenxerto estabelecido de células KB implantadas subcutaneamente no camundongo SCID. O direcionamento do FOLR1 pelo huMovl 9 resultou na redução significativa no volume de tumor médio.
[00053] Figura 9. Eficácia in vivo de huMov 19-PEG4- Mal-DM4 comparada aos anticorpos anti-FOLR1 murinos FR-1 em um modelo de xenoenxerto KB. Os anticorpos da série FR-1, ou não conjugados, ou conjugado com PEG4-Mal-DM4 foram testados para sua habilidade para reduzir o volume do tumor médio comparada ao huMov 19-PEG4- Mal-DM4 em um modelo de tumor de xenoenxerto KB. (A) FR-1-9, (B) FR-1-13, (C) FR-1-22, e (D) FR-1-23.
[00054] Figura 10. Eficácia in vivo de huMov19-PEG4-Mal-DM4 e huFR1-21-PEG4- Mal-DM4 em um modelo de xenoenxerto KB. Injeções únicas de 10 mg/kg de huMovl9-PEG4-Mal-DM4 e huFR 1- 21-PEG4-Mal-DM4 no dia 6 após a inoculação foram realizadas. Ambos huMovl9-PEG4-Mal-DM4 e huFRl-21-PEG4-Mal-DM4 mostraram uma redução significativa no volume de tumor médio. "TV médio" refere-se ao volume do tumor médio.
[00055] Figura 11. HuMov 19-PEG4-mal-DM4 mostra atividade dependente da dose no modelo de xenoenxerto KB. A atividade dependente da dose do imunoconjugado foi testada através da faixa de doses testadas. A dosagem semanal resultou na melhoria da atividade anti-tumoral. Altas cargas de fármaco melhoraram somente marginalmente a atividade nos grupos da dose de 10 mg/kg, com atividade reduzida nos grupos de dose inferior. 3,7 DAR refere-se a 3,7 moléculas de fármaco por anticorpo.
[00056] Figura 12. Eficácia in vivo de huMov19 conjugado com DM1 e DM4 com vários ligantes. huMovl9 foi conjugado à SMCC-DM1 a 3,9 moléculas de fármaco por anticorpo; sulfo-mal-DM4 a 3,7 moléculas de fármaco por anticorpo (B), e sulfo-mal-DM4 a 8,23 moléculas de fármaco por anticorpo (C) e testados para sua habilidade para reduzir o volume do tumor médio em várias comparações comparadas ao huMovl9-PEG4-mal-DM4.
[00057] Figura 13. Eficácia in vivo de huMovl9 conjugado com DM1 e DM4 com vários ligantes. huMov19 foi conjugado à SPP-DM1 a 4,3 moléculas de fármaco por anticorpo; sulfo-SPDB-DM4 a 3,8 moléculas de fármaco por anticorpo, SPDB-DM4 a 3,8 moléculas de fármaco por anticorpo, e sulfo-SPDB-DM4 a 6,8 moléculas de fármaco por anticorpo e testados para sua habilidade para reduzir volume do tumor médio. Os camundongos foram tratados com 5 mg/kg (A) e 2,5 mg/kg (B) de um dos conjugados listados acima ou com PBS somente.
[00058] Figura 14. Eficácia in vivo do huMov19-sulfo-SPDB-DM4 no modelo de tumor de xenoenxerto OVCAR-3. Os camundongos foram tratados com 25, 50, ou 100 μg/kg de huMov 19-sulfo-SPDB-DM4 ou com PBS somente.
[00059] Figura 15. Eficácia in vivo de huMov19-sulfo-SPDB-DM4 no modelo de tumor de xenoenxerto IGROV-1. Os camundongos foram tratados com 25, 50, ou 100 μg/kg de huMov19-sulfo-SPDB-DM4 ou com PBS somente.
[00060] Figura 16. Eficácia in vivo de huMov19-sulfo-SPDB-DM4 no modelo de tumor de xenoenxerto OV-90. Os camundongos foram tratados com 25, 50, ou 100 μg/kg de huMov 19-sulfo-SPDB-DM4 ou com PBS somente.
[00061] Figura 17. Efeito de ligantes cleaváveis e ligantes não- cliváveis sobre a eficácia dos imunoconjugados em modelos de xenoenxerto KB.
[00062] Figura 18. Efeito de ligantes cleaváveis sobre a eficácia dos imunoconjugados no (A) modelo de xenoenxerto KB (B) modelo de xenoenxerto OVCAR-3.
[00063] Figura 19. Eficácia in vitro e in vivo de huFR1-48, huFR1- 49, huFR1-57, e huFRl -65-SMCC-DM1 em KB e modelos de tumor de xenoenxerto. Os camundongos foram tratados com doses únicas de 200 μg/kg.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[00064] A presente invenção fornece novos agentes, incluindo, mas não limitados aos polipeptídeos como anticorpos, e imunoconjugados que se ligam ao receptor de folato humano 1 (FOLR1). Polipeptídeos e polinucleotídeos relacionados, composições compreendendo os Agentes de ligação de FOLR1, e métodos de fazer os agentes de ligação de FOLR1 são também fornecidos. Métodos de uso dos novos agentes de ligação de FOLR1, como métodos de inibição de crescimento tumoral e/ou tratamento do câncer, são ainda fornecidos. I. Definições
[00065] Para facilitar uma compreensão da presente invenção, uma série de termos e frases é definida abaixo.
[00066] Os termos "receptor de folato humano 1" ou "FOLR1" como usados aqui, referem-se a qualquer FOLR1 nativo humano, a menos que indicado em contrário. O termo "FOLR1" engloba o "comprimento completo", FOLR1 não processado, bem como qualquer forma de FOLR1 que resulta do processamento dentro da célula. O termo também engloba variantes de ocorrência natural de FOLR1, por exemplo, variantes de splicing, variantes alélicas, e isoformas. Os polipeptídeos de FOLR1 descritos aqui podem ser isolados a partir de uma variedade de fontes, tais como a partir de tipos de tecidos humanos ou de outra fonte, ou preparados por métodos recombinantes ou sintéticos. Exemplos das sequências FOLR1 incluem, mas não são limitados aos números de referência de NCBI P15328, NP_001092242.1, AAX29268.1, AAX37119.1, NP_057937.1, e NP_057936.1.
[00067] O termo "anticorpo" significa uma molécula de imunoglobulina que reconhece e se liga especificamente a um alvo, tal como uma proteína, polipeptídeo, carboidratos, peptídeos, lipídeos, polinucleotídeo, ou combinações dos anteriores através de pelo menos um sítio de reconhecimento de antígeno dentro da região variável da molécula de imunoglobulina. Tal como utilizado aqui, o termo "anticorpo" engloba anticorpos policlonais intactos, anticorpos monoclonais intactos, fragmentos de anticorpos (tais como fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, e Fv), mutantes de Fv de cadeia simples (scFv), anticorpos multiespecífico tais como anticorpos biespecíficos gerados a partir de pelo menos dois anticorpos intactos, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos, proteínas de fusão compreendendo uma porção de determinação de antígeno de um anticorpo, e qualquer outra molécula de imunoglobulina modificada compreendendo um local de reconhecimento de antígeno, contanto que os anticorpos exibam a desejada atividade biológica. Um anticorpo pode ser de qualquer uma das cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, ou subclasses (isotipos) das mesmas (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2), com base na identidade de seus domínios constantes de cadeia pesada referidos como alfa, delta, épsilon, gama e mu, respectivamente. As diferentes classes de imunoglobulinas têm estruturas de subunidades diferentes e bem conhecidas e configurações tridimensionais. Os anticorpos podem ser nus ou conjugados com outras moléculas, tais como toxinas, radioisótopos, etc.
[00068] Um anticorpo de "bloqueio" ou um anticorpo "antagonista" é um que inibe ou reduz a atividade biológica do antígeno que se liga, tais como FOLR1. Em uma determinada modalidade, os anticorpos de bloqueio ou anticorpos antagonistas inibem substancialmente ou completamente a atividade biológica do antígeno. Desejavelmente, a atividade biológica é reduzida em 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou mesmo 100%.
[00069] O termo "anticorpo anti-FOLR1" ou "anticorpo que se liga a um FOLR1" refere-se a um anticorpo que é capaz de ligar FOLR1 com afinidade suficiente de tal forma que o anticorpo seja útil como um agente de diagnóstico e/ou terapêutico tendo como alvo FOLR1. A extensão da ligação de um anticorpo anti-FOLR1 a um não relacionado, proteína não-FOLR1 é inferior a cerca de 10% da ligação do anticorpo ao FOLR1 tal como medido, por exemplo, por um radioimunoensaio (RIA). Em certas modalidades, um anticorpo que se liga a FOLR1 tem uma constante de dissociação (Kd) de < 1 μM, < 100 nM, <10 nM, < 1 nm, ou < 0,1 nM.
[00070] O termo "fragmento de anticorpo" refere-se a uma porção de um anticorpo intacto e refere-se à determinação antigênica de regiões variáveis de um anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem, mas não estão limitados a fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, e Fv, anticorpos lineares, anticorpos de cadeia simples, e anticorpos multiespecífico formados a partir de fragmentos de anticorpo.
[00071] O termo "anticorpo monoclonal" refere-se a uma população homogênea de anticorpos envolvidos no reconhecimento altamente específico e ligação de um determinante antigênico único, ou epítopo. Isto está em contraste com os anticorpos policlonais que tipicamente incluem anticorpos diferentes dirigidos contra determinantes antigênicos diferentes. O termo "anticorpo monoclonal" engloba ambos os anticorpos monoclonais intactos e de comprimento completo, bem como fragmentos de anticorpos (tal como Fab, Fab', F(ab')2,Fv), mutantes de cadeia simples (scFv), proteínas de fusão compreendendo uma porção anticorpo, e qualquer outra molécula de imunoglobulina modificada compreendendo um local de reconhecimento de antígeno. Além disso, o "anticorpo monoclonal" refere-se a tais anticorpos feitos em qualquer número de maneiras, incluindo mas não limitado a, por hibridoma, seleção de fagos, expressão recombinante, e animais transgênicos.
[00072] O termo "anticorpo humanizado" refere-se a formas de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) que são cadeias de imunoglobulina específicas, imunoglobulinas quiméricas, ou fragmentos das mesmas que contêm sequências não humanas mínimas (por exemplo, de murino). Tipicamente, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas em que os resíduos da região determinante de complementaridade (CDR) são substituídos por resíduos da CDR de uma espécie não humana (por exemplo, camundongo, rato, coelho, hamster), que têm a especificidade, afinidade, e capacidade desejadas (Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536). Em alguns casos, os resíduos da região de estrutura (FR) de Fv de uma imunoglobulina humana são substituídos com os resíduos correspondentes em um anticorpo a partir de uma espécie não humana que tem a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. O anticorpo humanizado pode ser ainda modificado pela substituição de resíduos adicionais que na região de estrutura Fv e/ou dentro dos resíduos não humanos substituídos para refinar e otimizar a especificidade, afinidade, e/ou capacidade do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todo de pelo menos um, e tipicamente dois ou três, domínios variáveis contendo todas ou substancialmente todas as regiões CDR que correspondem à imunoglobulina não humana ao passo que todas ou substancialmente todas as regiões de FR são as de uma sequência de consenso de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado pode também compreender pelo menos uma porção de uma região ou domínio constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Exemplos de métodos usados para gerar anticorpos humanizados são descritos na Patente US 5.225.539 ou 5.639.641.
[00073] Uma "região variável" de um anticorpo refere-se à região variável de cadeia leve de anticorpo ou a região variável da cadeia pesada de anticorpo, quer individualmente ou em combinação. As regiões variáveis da cadeia pesada e leve consistem, cada, em quatro regiões de estrutura (FR) ligadas por três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) também conhecidas como regiões hipervariáveis. As CDRs em cada cadeia são mantidas juntas em estreita proximidade pelas FRs e, com as CDRs da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação a antígeno de anticorpos. Há pelo menos duas técnicas para a determinação de CDRs: (1) uma abordagem baseada em variabilidade de sequências de espécies cruzadas (ou seja, Kabat et al. Sequências of Proteins of Immunological Interest, (5° ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.)), e (2) uma abordagem baseada em estudos cristalográficos de complexos de antígeno-anticorpo (Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)). Além disso, as combinações destas duas abordagens são por vezes usadas na técnica para determinar CDRs.
[00074] O sistema de numeração de Kabat é geralmente usado quando se refere a um resíduo no domínio variável (aproximadamente resíduos 1-107 da cadeia leve e resíduos 1-113 da cadeia pesada) (por exemplo, Kabat et al., Sequências of Immunological Interest. 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)).
[00075] A numeração da posição do aminoácido como em Kabat, refere-se ao sistema de numeração usado para domínios variáveis de cadeia pesada ou domínios variável da cadeia leve da compilação de anticorpos em Kabat et al., Sequências of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991). Usando este sistema de numeração, a sequência de aminoácido real linear pode conter poucos aminoácidos ou aminoácidos adicionais correspondentes a um encurtamento de, ou inserção em, uma FR ou CDR do domínio variável Por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada pode incluir uma inserção de um único aminoácido (resíduo 52a de acordo com Kabat) após o resíduo 52 de H2 e de resíduos inseridos (por exemplo, resíduos 82a e 82b, e 82c, etc. de acordo com Kabat) após o resíduo 82 FR de cadeia pesada. A numeração de Kabat de resíduos pode ser determinada para um dado anticorpo por um alinhamento em regiões de homologia de sequência do anticorpo com uma sequência numerada de Kabat "padrão". Chothia refere-se em vez disso, a localização de alças estruturais (Chothia e Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). A extremidade da alça de CDR-H1 de Chothia quando numerada utilizando a convenção de numeração de Kabat varia entre H32 e H34, dependendo do comprimento da alça (isto é porque o esquema de numeração de Kabat coloca as inserções em H35A e H35B; se nem 35A nem 35B estão presentes, a alça termina em 32; se apenas 35A está presente, a alça termina em 33; se ambos 35A e 35B estão presentes, a alça termina em 34). As regiões hipervariáveis de AbM representam um compromisso entre as CDRs de Kabat e alças estruturais de Chothia, e são usadas pelo software de modelagem anticorpo AbM de Oxford Molecular.
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[00076] O termo "anticorpo humano" significa um anticorpo produzido por um humano ou um anticorpo possuindo uma sequência de aminoácidos correspondente a um anticorpo produzido por um humano feita usando qualquer técnica conhecida no estado da técnica. Esta definição de um anticorpo humano inclui anticorpos intactos ou de comprimento completo, fragmentos dos mesmos e/ou anticorpos que compreendem pelo menos um polipeptídeo de cadeia pesada e/ou leve humana, tais como, por exemplo, um anticorpo compreendendo polipeptídeos de cadeia pesada de humano e de cadeia leve de murino.
[00077] O termo "anticorpos quiméricos" refere-se um anticorpo em que a sequência de aminoácidos da molécula de imunoglobulina é derivada de duas ou mais espécies. Tipicamente, a região variável de ambas as cadeias leve e pesada corresponde à região variável de anticorpos derivados de uma espécie de mamíferos (por exemplo, camundongo, rato, coelho, etc.), com a especificidade, afinidade e capacidade desejadas enquanto que as regiões constantes são homólogas para as sequências em anticorpos derivados de uma outra (geralmente humana) para evitar a provocação de uma resposta imune nas espécies.
[00078] O termo "epítopo" ou "determinante antigênica" é usado aqui indiferentemente e refere-se a porção de um antígeno capaz de ser reconhecida e, especificamente, ligada por um anticorpo particular. Quando o antígeno é um polipeptídeo, os epítopos podem ser formados tanto a partir de aminoácidos contíguos quanto aminoácidos não contíguos justapostos por dobragem terciária de uma proteína. Epítopos formados a partir de aminoácidos contíguos são tipicamente mantidos na desnaturação da proteína, enquanto que os epítopos formados por dobragem terciária são tipicamente perdidos na desnaturação da proteína. Um epítopo inclui tipicamente pelo menos 3, e mais usualmente, pelo menos 5 ou 8-10 aminoácidos em uma conformação espacial original.
[00079] A "afinidade de ligação" refere-se geralmente a força da soma total de interações não covalentes entre um sítio de ligação único de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e o seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). A menos que indicado de outra forma, tal como usado aqui, "afinidade de ligação" refere-se à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação de 1:1 entre os membros de um par de ligação (por exemplo, o anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula de X para seu parceiro Y pode geralmente ser representada pela constante de dissociação (Kd). A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo aqueles aqui descritos. Os anticorpos de baixa afinidade geralmente se ligam a antígeno lentamente e tendem a dissociar prontamente, enquanto que os anticorpos de alta afinidade geralmente se ligam a antígeno mais rápido e tendem a permanecer ligados por mais tempo. Uma variedade de métodos de medição afinidade de ligação é conhecida na técnica, qualquer um dos quais podendo ser usado para os fins da presente invenção. As modalidades ilustrativas específicas são descritas a seguir.
[00080] "Ou melhor" quando usado aqui para se referir à afinidade de ligação refere-se a uma ligação mais forte entre uma molécula e o seu parceiro de ligação. "Ou melhor" quando usado aqui se refere a uma ligação mais forte, representada por um valor numérico de Kd menor. Por exemplo, um anticorpo que tem uma afinidade para um antígeno de "0,6 nM ou melhor", a afinidade do anticorpo para o antígeno é menor que 0,6 nM, ou seja, 0,59 nM, 0,58 nM, 0,57 nM etc., ou qualquer valor inferior a 0,6 nM.
[00081] A frase "substancialmente similar," ou "substancialmente o mesmo", tal como usada aqui, denota um grau suficientemente elevado de semelhança entre dois valores numéricos (geralmente um associado com um anticorpo da invenção e outro associado com um anticorpo de referência / de comparação) de tal modo que um versado na técnica iria considerar a diferença entre os dois valores como tendo pouco ou nenhum significado biológico e/ou estatístico dentro do contexto da característica biológica medida pelos ditos valores (por exemplo, os valores de Kd). A diferença entre os ditos dois valores pode ser menos de cerca de 50%, menos do que 40%, menos do que 30%, menos do que 20%, ou menos do que 10%, como uma função do valor para o anticorpo de referência/de comparação.
[00082] Um polipeptídeo, anticorpo, polinucleotídeo, vetor, célula ou composição que é "isolado" é um polipeptídeo, anticorpo, polinucleotídeo, vetor, célula ou composição que está de uma forma não encontrada na natureza. Os polipeptídeos, anticorpos isolados, polinucleotídeos, vetores, células ou composições incluem aqueles que foram purificados para um grau em que eles não estão mais em uma forma em que são encontrados na natureza. Em algumas modalidades, um anticorpo, polinucleotídeo, vetor, célula ou composição que é isolado é substancialmente puro.
[00083] Tal como usado aqui, "substancialmente puro" refere-se ao material que é pelo menos 50% puro (ou seja, livre de contaminantes), pelo menos 90% puro, pelo menos 95% puro, pelo menos 98% puro, ou pelo menos 99% puro.
[00084] O termo "imunoconjugado" ou "conjugado" tal como usado aqui se refere a um composto ou um derivado do mesmo que está ligado a um agente de ligação a células (ou seja, um anticorpo anti- FOLR1 ou um fragmento do mesmo) e é definido por uma fórmula genérica: C-L-A, em que C = citotoxina, L = ligante, e A = agente de ligação de célula ou anticorpo anti-FOLR1 ou fragmento de anticorpo. Os imunoconjugados também podem ser definidos pela fórmula genérica na ordem inversa: A-L-C.
[00085] Um "ligante" é qualquer porção química que é capaz de se ligar um composto, geralmente uma fármaco, tal como um maitansinoide, a um agente de ligação de célula tal como um anticorpo anti FOLR1 ou um fragmento do mesmo de uma maneira covalente estável. Os ligantes podem ser suscetíveis a, ou ser substancialmente resistente à, clivagem induzida por ácido, clivagem induzida por luz, clivagem induzida por peptidase, clivagem induzida por esterase, e clivagem da ligação dissulfeto, em condições sob as quais o composto ou o anticorpo permanece ativo. Os ligantes adequados são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, grupos dissulfeto, grupos tioéter, grupos lábeis de ácido, grupos fotolábeis, grupos lábeis de peptidase e grupos lábeis de esterase. Os ligantes também incluem ligantes carregados, e formas hidrofílicas dos mesmos como aqui descritos e conhecidos na técnica.
[00086] Os termos "câncer" e "canceroso" referem-se ou descrever a condição fisiológica em mamíferos, em que uma população de células é caracterizada por um crescimento celular desregulado. Exemplos de câncer incluem, mas não estão limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, e leucemia. Exemplos mais particulares de tais cânceres incluem câncer de células escamosas, câncer de pulmão de pequenas células, câncer de pulmão de células não pequenas, adenocarcinoma do pulmão, carcinoma de células escamosa do pulmão, câncer do peritônio, câncer hepatocelular, câncer gastrointestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer de ovário, câncer de fígado, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer colorretal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma de glândula salivar, câncer de rim, câncer de fígado, câncer de próstata, câncer de vulva, câncer de tireoide, carcinoma hepático e vários tipos de cânceres de cabeça e pescoço.
[00087] "Tumor" e "neoplasma" se referem a qualquer massa do tecido que resulta a partir do crescimento de célula excessivo ou proliferação, ou benígno (não-canceroso) ou malígno (canceroso) incluindo lesões precancerosas.
[00088] Os termos "célula de câncer", "célula de tumor", e equivalentes gramaticais referem-se à população total de células derivadas de um tumor ou uma lesão pré-cancerosa, incluindo ambas as células não-tumorigênicas, que compreendem a maior parte da população de células de tumor, e células-tronco tumorigênicas (células-tronco de câncer). Tal como usado aqui, o termo "célula de tumor" será modificado pelo termo "não tumorigênico" quando se refere apenas a essas células de tumor que não possuem a capacidade de se renovar e se diferenciar para distinguir as células de tumor a partir de células-tronco de câncer.
[00089] O termo "sujeito" refere-se a qualquer animal (por exemplo, um mamífero), incluindo, mas não limitado a, humanos, primatas não humanos, roedores, e semelhantes, o que deve ser o receptor de um tratamento particular. Normalmente, os termos "sujeito" e "paciente" são usados aqui indiferentemente em referência a um sujeito humano.
[00090] A administração "em combinação com" um ou mais outros agentes terapêuticos inclui a administração simultânea (concomitante) e consecutiva em qualquer ordem.
[00091] O termo "formulação farmacêutica" refere-se a uma preparação que está em tal forma que permite que a atividade biológica do ingrediente ativo seja eficaz, e que não contém nenhum componente adicional que é inaceitavelmente tóxico para um sujeito para o qual a formulação deve ser administrada. Tal formulação pode ser estéril.
[00092] Uma "quantidade eficaz" de um anticorpo como aqui divulgado é uma quantidade suficiente para realizar um propósito especificamente indicado. Uma "quantidade eficaz" pode ser determinada empiricamente e em uma forma de rotina, em relação ao propósito indicado.
[00093] O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade de um anticorpo ou outra fármaco eficaz para "tratar" uma doença ou distúrbio em um sujeito ou um mamífero. No caso de câncer, a quantidade terapeuticamente eficaz da fármaco pode reduzir o número de células de câncer, para reduzir o tamanho do tumor; inibir (ou seja, diminuir em certa medida, e em uma determinada modalidade parar) a infiltração de células de câncer em órgãos periféricos; inibir (ou seja, diminuir para certa medida e em uma determinada modalidade parar) a metástase tumoral; inibir, em certa medida, o crescimento do tumor e/ou aliviar, em certa medida um ou mais dos sintomas associados com o câncer. Veja aqui a definição de "tratamento". Na medida em que a fármaco pode impedir o crescimento e/ou matar as células de câncer existentes, as mesmas podem ser citostáticas e/ou citotóxicas. Uma "quantidade profilaticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessário, para atingir o resultado profilático desejado. Tipicamente, mas não necessariamente, uma vez que uma dose profilática é usada em sujeitos antes de, ou em uma fase mais precoce da doença, a quantidade profilaticamente eficaz será menor do que a quantidade terapeuticamente eficaz.
[00094] A palavra "marcador" quando usada aqui se refere a um composto ou composição detectável que é conjugado direta ou indiretamente com o anticorpo de modo a gerar um anticorpo "marcado". O marcador pode ser detectável por si só (por exemplo, marcadores de radioisótopos ou marcadores fluorescentes) ou, no caso de um marcador enzimático, pode catalisar a alteração química de um composto ou composição de substrato que é detectável.
[00095] Um "agente quimioterapêutico" é um composto químico útil no tratamento do câncer, independentemente do mecanismo de ação. As classes dos agentes quimioterapêuticos incluem, mas não estão limitados a: agentes de alquilação, antimetabólitos, alcaloides de planta venenosa de árvore, antibióticos citóxicos/antitumorais, inibidores de topoisomerase, anticorpos, fotosensibilizador, e inibidores de quinase. Os agentes quimioterapêuticos incluem compostos usados na "terapia direcionada" e quimioterapia convencional.
[00096] Termos tais como "tratando" ou "tratamento" ou "tratar" ou "aliviar" ou "para aliviar" referem-se tanto 1) a medidas terapêuticas capazes de curar, retardar, diminuir os sintomas de, e/ou progressão da parada uma condição ou distúrbio patológico diagnosticado e 2) a medidas profiláticas ou preventivas que previnem e/ou retardam o desenvolvimento de uma condição ou distúrbio patológico alvo. Assim, aqueles com necessidade de tratamento incluem os que já tem o distúrbio; aqueles propensos a apresentar o distúrbio, e aqueles nos quais o distúrbio deve ser prevenido. Em certas modalidades, um sujeito é "tratado" com sucesso para o câncer de acordo com os métodos da presente invenção, se o paciente mostra um ou mais dos seguintes: uma redução no número ou ausência completa de células de câncer; uma redução no tamanho do tumor; alívio ou; inibição ou ausência de uma infiltração de células de câncer em órgãos periféricos, incluindo, por exemplo, a propagação do câncer em tecido mole e ossos; inibição ou ausência de metástase de tumor; inibição ou ausência de crescimento do tumor, alívio de um ou mais sintomas associados ao câncer específico; redução da morbilidade e mortalidade, melhoria da qualidade de vida; redução na tumorigenicidade, frequência tumorigênica, ou capacidade tumorigênica, de um tumor, redução no número ou na frequência de células-tronco cancerosas em um tumor, diferenciação de células tumorigênicas para um estado não tumorigênico, ou alguma combinação de efeitos.
[00097] "Polinucleotídeo", ou "ácido nucleico", como usados aqui indiferentemente, referem-se a polímeros de nucleotídeos de qualquer comprimento, e incluem DNA e RNA. Os nucleotídeos podem ser desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos, nucleotídeos ou bases modificadas, e/ou os seus análogos, ou qualquer substrato que pode ser incorporado a um polímero de DNA ou RNA-polimerase. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e seus análogos. Se estiver presente, a modificação da estrutura de nucleotídeos pode ser conferida antes ou depois da montagem do polímero. A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídicos. Um polinucleotídeo pode ser adicionalmente modificado após a polimerização, tais como por conjugação com um componente de marcação. Outros tipos de modificações incluem, por exemplo, "capeamentos", a substituição de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural com um análogo, modificações internucleotídicas tais como, por exemplo, aquelas com ligações não carregadas (por exemplo, metila, fosfonatos e fosfotriésteres, fosfoamidatos e cabamatos, etc.) e com ligações carregadas (por exemplo, fosforotioatos e fosforoditioatos, etc.), aqueles contendo frações pendentes, tais como, por exemplo, proteínas (por exemplo, nucleases, toxinas, anticorpos, peptídeos sinal, ply-L-lisina, etc.), aqueles com intercaladores (por exemplo, acridina, psoraleno, etc.), aqueles contendo quelantes (por exemplo, metais, metais radioativos, boro, metais oxidativos, etc.), aqueles que contêm alquilantes, aqueles com ligações modificadas (por exemplo, ácidos nucleicos com carbono alfa anomérico, etc.), bem como formas não modificadas de polinucleotídeo(s). Além disso, qualquer um dos grupos hidroxil presentes nos açúcares comuns pode ser substituído, por exemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos de proteção padrões, ou por ativação para preparar ligações adicionais aos nucleotídeos adicionais, ou podem ser conjugados com suportes sólidos. Um terminal OH de 5 'e 3' pode ser fosforilado ou substituído com frações de grupo de nivelamento orgânico ou aminas de 1 a 20 átomos de carbono. Outros grupos hidroxil também podem ser derivados para grupos de proteção padrões. Os polinucleotídeos também podem conter formas análogas de açúcares de ribose ou desoxirribose que são geralmente conhecidas na técnica, incluindo, por exemplo, 2'-O-metil-, 2'-O-alila, 2'-fluoro-ou 2'-azido- ribose, análogos de açúcar carbocíclico,. açúcares alfa-anoméricos, açúcares epiméricos, tais como arabinose, açúcares xiloses ou lixoses, piranose, açúcares furanose, sedoheptuloses, análogos acíclicos e análogos de nucleosídeos não básicos, tais como metil ribosídeo. Uma ou mais ligações fosfodiéster podem ser substituídas por grupos de ligação alternativos. Estes grupos de ligação alternativos incluem, mas não estão limitados a, modalidades em que o fosfato é substituído por P(O)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), "(O)NR2 ("amidato"), P(O)R, P(O)OR', CO ou CH2 ("formacetal"), em que cada R ou R' é independentemente H ou alquil substituído ou não substituído (1-20 C) contendo opcionalmente uma ligação éter (--O--), arila, alquenila, cicloalquila, cicloalquenilo ou araldil Nem todas as ligações em um polinucleotídeo precisam ser idênticas. A descrição anterior é aplicável a todos os polinucleotídeos aqui referidos, incluindo RNA e DNA.
[00098] O termo "vetor" significa um construto, que é capaz de distribuir, e, opcionalmente, expressar, um ou mais gene(s) ou sequência(s) de interesse em uma célula hospedeira. Exemplos de vetores incluem, mas não estão limitados a, vetores virais, vetores de expressão de DNA ou RNA nus, vetores de plasmídeos, cosmídeos ou fagos, vetores de expressão de DNA ou RNA associados com agentes de condensação catiônicos, vetores de expressão de DNA ou RNA ou encapsulados em lipossomas, e certas células eucariotas, tais como células produtoras.
[00099] Os termos "polipeptídeo", "peptídeo", e "proteína" são usados aqui indiferentemente para se referir aos polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, pode compreender os aminoácidos modificados, e pode ser interrompido por não aminoácidos. Os termos também englobam um polímero de aminoácido que tenha sido modificado naturalmente ou por intervenção; por exemplo, formação de ligações dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação, ou qualquer outra manipulação, ou modificação, tais como a conjugação com um componente de marcação. Também estão incluídos dentro da definição, por exemplo, os polipeptídeos contendo um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais, etc.), bem como outras modificações conhecidas na técnica. Entende-se que, devido aos polipeptídeos desta invenção serem baseados em anticorpos, em certas modalidades, os polipeptídeos podem ocorrer como cadeias simples ou cadeias associadas.
[000100] Os termos "idêntico" ou "identidade" percentual no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos ou polipeptídeos referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são as mesmas ou têm uma porcentagem determinada de resíduos de nucleotídeos ou aminoácidos que são os mesmos, quando comparados e alinhados (introduzindo lacunas, se necessário) para a correspondência máximo, não considerando quaisquer substituições conservativas de aminoácidos, como parte da identidade de sequência. A identidade percentual pode ser medida utilizando software ou algoritmos de comparação de sequência ou por inspeção visual. Vários algoritmos e programas são conhecidos na técnica os quais podem ser usados para obter alinhamentos de sequências de aminoácido ou nucleotídeos. Um exemplo não limitativo de um algoritmo de alinhamento de sequências é o algoritmo descrito em Karlin et al, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci., 87:2264-2268, as modified in Karlin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90:5873-5877, e incorporado nos programas NBLAST e XBlast (Altschul et al., 1991, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402). Em certas modalidades, BLAST gapped pode ser usado como descrito em Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. BLAST-2, WU-BLAST-2 (Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology, 266:460-480), ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, California) ou Megalign (DNASTAR) são programas de software disponíveis publicamente adicionais que podem ser usados para alinhar as sequências. Em certas modalidades, a identidade percentual entre duas sequências de nucleotídeos é determinada utilizando o programa LACUNA em software GCG (por exemplo, utilizando uma matriz de NWSgapdna.CMP e um peso de lacuna de 40, 50, 60, 70, ou 90 e um peso comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6). Em certas modalidades alternativas, o programa LACUNA no pacote de software GCG, que incorpora o algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) pode ser usado para determinar a identidade percentual entre duas sequências de aminoácidos (por exemplo, usando quer uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250, e um peso de lacuna de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ou 4 e um peso comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ). Alternativamente, em certas modalidades, a identidade percentual entre as sequências de nucleotídeos ou aminoácidos é determinada utilizando o algoritmo de Myers e Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)). Por exemplo, a identidade percentual pode ser determinada utilizando o programa ALIGN (versão 2.0) e usando uma PAM120 com tabela de resíduo, uma penalidade de comprimento de gapa de 12 e uma penalidade de lacuna de 4. Os parâmetros apropriados para o alinhamento máximo pelo software de alinhamento em particular podem ser determinados por um versado na técnica. Em certas modalidades, os parâmetros padrões do software de alinhamento são usados. Em certas modalidades, a identidade percentual "X" de uma primeira sequência de aminoácidos a uma segunda sequência de aminoácidos é calculada como 100 x (Y/Z), onde Y é o número de resíduos de aminoácidos marcados como correspondências idênticas no alinhamento das primeira e segunda sequências (como alinhadas por inspeção visual ou um programa de alinhamento de sequência especial) e Z é o número total de resíduos na segunda sequência. Se o comprimento de uma primeira sequência é maior do que o da segunda sequência, a identidade percentual da primeira sequência para a segunda sequência será maior do que a identidade percentual da segunda sequência para a primeira sequência.
[000101] Como um exemplo não limitativo, se qualquer polinucleotídeo particular tem uma certa identidade percentual de sequência (por exemplo, é pelo menos 80% idêntico, pelo menos 85% idêntico, pelo menos 90% idêntico e, em algumas modalidades, pelo menos, 95 %, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntico) para uma sequência de referência pode, em certas modalidades, ser determinada utilizando o programa BestFit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). BestFit usa o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482 489 (1981), para encontrar o melhor segmento de homologia entre duas sequências. Quando se utiliza BestFit ou qualquer outro programa de alinhamento de sequências para determinar se uma sequência particular é, por exemplo, 95% idêntica a uma sequência de referência de acordo com a presente invenção, os parâmetros são ajustados de tal forma que a identidade percentual é calculada sobre o comprimento completo da sequência de nucleotídeos de referência e os lacunas na homologia de até 5% do número total de nucleotídeos na sequência de referência são permitidos.
[000102] Em algumas modalidades, dois ácidos nucleicos ou polipeptídeos da invenção são substancialmente idênticos, o que significa que têm pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, e em algumas modalidades, pelo menos, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de resíduo de nucleotídeos ou de aminoácidos, quando comparados e alinhados para a correspondência máxima, tal como medido utilizando um algoritmo de comparação de sequências ou por inspeção visual. Em determinadas modalidades, a identidade existi sobre uma região das sequências que tem pelo menos cerca de 10, cerca de 20, cerca de 40-60 resíduos de comprimento entre as mesmas, ou qualquer valor integral, ou sobre uma região mais longa do que 60-80 resíduos, por exemplo, pelo menos cerca de 90-100 resíduos, ou as sequências são substancialmente idênticas ao longo de todo o comprimento das sequências que estão sendo comparadas, tais como a região de codificação de uma sequência de nucleotídeos, por exemplo.
[000103] A "substituição conservativa de aminoácidos" é uma em que um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral semelhante. As famílias de resíduos de aminoácidos possuindo cadeias laterais semelhantes foram definidas na técnica, incluindo cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico) e cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, asparagina, glutamina, serina, treonina, cisteína, tirosina), cadeias laterais não polares (por exemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Por exemplo, a substituição de uma fenilalanina por uma tirosina é uma substituição conservativa. Em determinadas modalidades, as substituições conservativas nas sequências de polipeptídeos e anticorpos da invenção não anulam a ligação do polipeptídeo ou anticorpo contendo a sequência de aminoácidos, para o antígeno (s), ou seja, o FOLR1 ao qual o polipeptídeo ou anticorpo se liga. Métodos de identificação de substituições conservativas de nucleotídeos e aminoácidos que não eliminam a ligação a antígenos são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1 187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); e Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:.412-417 (1997)).
[000104] Como usado na presente divulgação e reivindicações, as formas singulares "um", "uma" e "o, a" incluem as formas no plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário.
[000105] Entende-se que em qualquer parte onde as modalidades são descritas aqui com a linguagem "compreendendo", modalidades de formas análogas descritas em termos de "consentindo em" e/ou "consistindo essencialmente em" também são fornecidas.
[000106] O termo "e/ou", como usado em uma frase como "A e/ou B" aqui é destinado a incluir tanto "A quanto B", "A ou B", "A" e "B". Da mesma forma, o termo "e/ou" tal como usado em uma frase como "A, B, e/ou C" destina-se a englobar cada uma das modalidades seguintes: A, B e C; A, B, ou C; A ou C; A ou B, B ou C; A e C; A e B; B e C; A (individualmente); B (individualmente) e C (individualmente). II. Agentes de ligação a FOLR1
[000107] A presente invenção fornece agentes que se ligam especificamente a FOLR1 humano. Estes agentes são aqui referidos como "agentes de ligação a FOLR1". As sequências de aminoácidos de comprimento completo (aa) e nucleotídeo (nt) para FOLR1 são conhecidas na técnica e também fornecidas aqui tal como representado pelas SEQ ID NOs :25 e 26, respectivamente.
[000108] Em certas modalidades, os agentes de ligação a FOLR1 são anticorpos, imunoconjugados ou polipeptídeos. Em algumas modalidades, os agentes de ligação a FOLR1 são anticorpos humanizados. Em determinadas modalidades, os agentes de ligação a FOLR-1 são versões humanizadas do anticorpo Mov19 murino (cadeia pesada e leve variável mostrada como SEQ ID NOs: 17 e 18 respectivamente).
[000109] Em certas modalidades, os agentes de ligação a FOLR1 tendo um ou mais dos seguintes efeitos: inibição da proliferação de células de tumor, redução da tumorigenicidade de um tumor através da redução da frequência de células troncos cancerosas no tumor, inibição do crescimento do tumor, aumento de sobrevivência, desencadeiamento da morte celular de células de tumor, diferenciação de células de tumor para um estado não tumorigênico, ou evita a metástase de células de tumor.
[000110] Em determinadas modalidades, imunoconjugados ou outros agentes que ligam especificamente o FOLR1 humano desencadeiam a morte da célula através de um agente citotóxico. Por exemplo, em determinadas modalidades, um anticorpo para um anticorpo FOLR1 humano é conjugado a um maitansinoide que é ativado em célula tumorais que expressam o FOLR1 pela internalização da proteína. Em determinadas modalidades alternativas, o agente ou anticorpo não é conjugado.
[000111] Em determinadas modalidades, os agentes de ligação de FOLR1 são capazes de inibir o crescimento tumoral. Em determinadas modalidades, os agentes de ligação de FOLR1 são capazes de inibir crescimento tumoral in vivo (por exemplo, em um modelo de camundongo de xenoenxerto e/ou em um humano tendo câncer). Em determinadas modalidades, os agentes de ligação de FOLR1 são capazes de inibir o crescimento tumoral em um humano.
[000112] Assim, a invenção fornece um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que especificamente liga um receptor de folato humano 1, em que o anticorpo compreende: (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo GYFMN (SEQ ID NO: 1); uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo RIHPYDGDTFYNQXaa1FXaa2Xaa3 (SEQ ID NO:56); e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo YDGSRAMDY (SEQ ID NO:3); e (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo KASQSVSFAGTSLMH (SEQ ID NO:7); uma CDR2 de cadeia leve compreendendo RASNLEA (SEQ ID NO:8); e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo QQSREYPYT (SEQ ID NO:9); em que Xaa1 é selecionado a partir de K, Q, H, e R; Xaa2 é selecionado a partir de Q, H, N, e R; e Xaa3 é selecionado a partir de G, E, T, S, A, e V. Em determinadas modalidades, o anticorpo é o anticorpo huMov19, que é o anticorpo acima descrito compreendendo a CDR2 de cadeia pesada RIHPYDGDTFYNQKFQG (SEQ ID NO:2).
[000113] Em determinadas modalidades, a invenção fornece anticorpos humanizados ou fragmentos de ligação de antígeno que ligam especificamente ao FOLR1 que compreendem os CDRs de huMov19 com até quatro (i.e. 0, 1, 2, 3, ou 4) substituições de aminoácido conservativas por CDR. Assim, em determinadas modalidades a invenção fornece anticorpos humanizados ou fragmentos de ligação de antígeno que especificamente ligam um receptor de folato humano 1, em que o anticorpo compreende: (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo GYFMN (SEQ ID NO: 1), ou uma variante do mesmo compreendendo 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservativas; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo RIHPYDGDTFYNQKFQG (SEQ ID NO:2), ou uma variante do mesmo compreendendo 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservativas; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo YDGSRAMDY (SEQ ID NO:3), ou uma variante do mesmo compreendendo 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservativas; e/ou (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo KASQSVSFAGTSLMH (SEQ ID NO:7), ou uma variante do mesmo compreendendo 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservativas; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo RASNLEA (SEQ ID NO:8), ou uma variante do mesmo compreendendo 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservativas; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo QQSREYPYT (SEQ ID NO:9), ou uma variante do mesmo compreendendo 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservativas.
[000114] A invenção também fornece um anticorpo humanizado (huFR1-21) ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que especificamente liga um receptor de folato humano 1, em que o anticorpo compreende: (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo SSYGMS (SEQ ID NO:30); uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo TISSGGSYTY (SEQ ID NO:31); e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo DGEGGLYAMDY (SEQ ID NO:32); e/ou (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo KASDHINNWLA (SEQ ID NO:27); uma CDR2 de cadeia leve compreendendo GATSLET (SEQ ID NO:28); e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo QQYWSTPFT (SEQ ID NO:29).
[000115] Em determinadas modalidades, a invenção fornece anticorpos humanizados ou fragmentos de ligação de antígeno que ligam especificamente ao FOLR1 que compreendem os CDRs de huFR1-21 com até quatro (i.e. 0, 1, 2, 3, ou 4) substituições de aminoácido conservativas por CDR. Assim, em determinadas modalidades a invenção fornece anticorpos humanizados ou fragmentos de ligação de antígeno que especificamente ligam um receptor de folato humano 1, em que o anticorpo compreende: (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo SSYGMS (SEQ ID NO:30) ou uma variante do mesmo compreendendo 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservativas; e/ou uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo TISSGGSYTY (SEQ ID NO:31 ) ou uma variante do mesmo compreendendo 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservativas; e/ou e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo DGEGGLYAMDY (SEQ ID NO: 32) ou uma variante do mesmo compreendendo 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservativas; e/ou (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo KASDHINNWLA (SEQ ID NO:27) ou uma variante do mesmo compreendendo 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservativas; e/ou uma CDR2 de cadeia leve compreendendo GATSLET (SEQ ID NO:28) ou uma variante do mesmo compreendendo 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservativas; e/ou uma CDR3 de cadeia leve compreendendo QQYWSTPFT (SEQ ID NO:29) ou uma variante do mesmo compreendendo 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservativas.
[000116] Em determinadas modalidades, a invenção fornece anticorpos humanizados ou fragmentos de ligação de antígeno que ligam especificamente ao FOLR1 que compreendem os CDRs de huFR1-48 com até quatro (i.e. 0, 1, 2, 3, ou 4) substituições de aminoácido conservativas por CDR. Assim, em determinadas modalidades a invenção fornece anticorpos humanizados ou fragmentos de ligação de antígeno que especificamente ligam um receptor de folato humano 1, em que o anticorpo compreende: (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo TNYWMQ (SEQ ID NO:60) ou uma variante do mesmo compreendendo 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservativas; e/ou uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo IYPGNGDSR (SEQ ID NO:61) ou uma variante do mesmo compreendendo 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservativas; e/ou e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo RDGNYAAY (SEQ ID NO:62) ou uma variante do mesmo compreendendo 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservativas; e/ou (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo RASENIYSNLA (SEQ ID NO: 57) ou uma variante do mesmo compreendendo 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservativas; e/ou uma CDR2 de cadeia leve compreendendo AATNLAD (SEQ ID NO:58) ou uma variante do mesmo compreendendo 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservativas; e/ou uma CDR3 de cadeia leve compreendendo QHFWASPYT (SEQ ID NO: 59) ou uma variante do mesmo compreendendo 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservativas.
[000117] Em determinadas modalidades, a invenção fornece anticorpos humanizados ou fragmentos de ligação de antígeno que ligam especificamente ao FOLR1 que compreendem os CDRs de huFR1-49 com até quatro (i.e. 0, 1, 2, 3, ou 4) substituições de aminoácido conservativas por CDR. Assim, em determinadas modalidades a invenção fornece anticorpos humanizados ou fragmentos de ligação de antígeno que especificamente liga um receptor de folato humano 1, em que o anticorpo compreende: (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo TNYWMY (SEQ ID NO:66) ou uma variante do mesmo compreendendo 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservativas; e/ou uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo AIYPGNSDTT (SEQ ID NO:67) ou uma variante do mesmo compreendendo 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservativas; e/ou e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo RHDYGAMDY (SEQ ID NO: 68) ou uma variante do mesmo compreendendo 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservativas; e/ou (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo RASENIYTNLA (SEQ ID NO:63) ou uma variante do mesmo compreendendo 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservativas; e/ou uma CDR2 de cadeia leve compreendendo TASNLAD (SEQ ID NO:64) ou uma variante do mesmo compreendendo 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservativas; e/ou uma CDR3 de cadeia leve compreendendo QHFWVSPYT (SEQ ID NO:65) ou uma variante do mesmo compreendendo 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservativas.
[000118] Em determinadas modalidades, a invenção fornece anticorpos humanizados ou fragmentos de ligação de antígeno que ligam especificamente ao FOLR1 que compreendem os CDRs de huFR1-57 com até quatro (i.e. 0, 1, 2, 3, ou 4) substituições de aminoácido conservativas por CDR. Assim, em determinadas modalidades a invenção fornece anticorpos humanizados ou fragmentos de ligação de antígeno que especificamente liga um receptor de folato humano 1, em que o anticorpo compreende: (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo SSFGMH (SEQ ID NO:72) ou uma variante do mesmo compreendendo 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservativas; e/ou uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo YISSGSSTIS (SEQ ID NO:73) ou uma variante do mesmo compreendendo 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservativas; e/ou e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo EAYGSSMEY (SEQ ID NO:74) ou uma variante do mesmo compreendendo 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservativas; e/ou (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo RASQNINNNLH (SEQ ID NO:69) ou uma variante do mesmo compreendendo 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservativas; e/ou uma CDR2 de cadeia leve compreendendo YVSQSVS (SEQ ID NO:70) ou uma variante do mesmo compreendendo 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservativas; e/ou uma CDR3 de cadeia leve compreendendo QQSNSWPHYT (SEQ ID NO:71) ou uma variante do mesmo compreendendo 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservativas.
[000119] Em determinadas modalidades, a invenção fornece anticorpos humanizados ou fragmentos de ligação de antígeno que ligam especificamente ao FOLR1 que compreendem os CDRs de huFR1-65 com até quatro (i.e. 0, 1, 2, 3, ou 4) substituições de aminoácido conservativas por CDR. Assim, em determinadas modalidades a invenção fornece anticorpos humanizados ou fragmentos de ligação de antígeno que especificamente liga um receptor de folato humano 1, em que o anticorpo compreende: (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo TSYTMH (SEQ ID NO:78) ou uma variante do mesmo compreendendo 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservativas; e/ou uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo YINPISGYTN (SEQ ID NO:79) ou uma variante do mesmo compreendendo 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservativas; e/ou e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo GG A YGRKPMD Y (SEQ ID NO: 80) ou uma variante do mesmo compreendendo 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservativas; e/ou (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo ASQNVGPNVA (SEQ ID NO:75) ou uma variante do mesmo compreendendo 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservativas; e/ou uma CDR2 de cadeia leve compreendendo SASYRYS (SEQ ID NO:76) ou uma variante do mesmo compreendendo 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservativas; e/ou uma CDR3 de cadeia leve compreendendo QQYNSYPYT (SEQ ID NO:77) ou uma variante do mesmo compreendendo 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácido conservativas.
[000120] Os polipeptídeos compreendendo uma das cadeias leves individuais ou cadeias pesadas descritas aqui, assim como polipeptídeos (por exemplo, anticorpos) compreendendo tanto uma cadeia leve e uma cadeia pesada são também fornecidos. Os polipeptídeos das SEQ ID NOs: 4 e 6 compreendem o domínio variável da cadeia pesada de huMovl9, e a cadeia pesada de huMovl9, respectivamente. Os polipeptídeos das SEQ ID NOs: 10- 13 compreendem a cadeia leve de domínio variável versão 1.00, a cadeia leve de domínio variável versão 1 .60, a cadeia leve versão 1.00, e a cadeia leve versão 1.60 de huMovl 9, respectivamente. Os polipeptídeos das SEQ ID NOs: 42 e 46 compreendem o domínio variável da cadeia pesada de huFR1-21, e a cadeia pesada de huFR1- 21, respectivamente. Os polipeptídeos das SEQ ID NOs:41 e 45 compreendem uma cadeia leve de domínio variável e cadeia leve de huFR1-21 , respectivamente. Os polipeptídeos das SEQ ID NOs: 97 e 113 compreendem o domínio variável da cadeia pesada de huFR1-48, e a cadeia pesada de huFR1-48, respectivamente. Os polipeptídeos das SEQ ID NOs:96 e 112 compreendem uma cadeia leve de domínio variável e cadeia leve de huFR1-48, respectivamente. Os polipeptídeos das SEQ ID NOs: 99 e 115 compreendem o domínio variável da cadeia pesada de huFR1-49, e a cadeia pesada de huFR1- 49, respectivamente. Os polipeptídeos das SEQ ID NOs:98 e 114 compreendem uma cadeia leve de domínio variável e cadeia leve de huFR1-49, respectivamente. Os polipeptídeos das SEQ ID NOs: 101 e 117 compreendem o domínio variável da cadeia pesada de huFR1-57, e a cadeia pesada de huFR1-57, respectivamente. Os polipeptídeos das SEQ ID NOs: 100 e 1 16 compreendem uma cadeia leve de domínio variável e cadeia leve de huFR1-57, respectivamente. Os polipeptídeos das SEQ ID NOs: 103 e 119 compreendem o domínio variável da cadeia pesada de huFR1-65, e a cadeia pesada de huFR1- 65, respectivamente. Os polipeptídeos das SEQ ID NOs: 102 e 118 compreendem uma cadeia leve de domínio variável e cadeia leve de huFR1-65, respectivamente.
[000121] Também são fornecidos polipeptídeos que compreendem: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência para a SEQ ID NO:4 ou 6; e/ou (b) um polipeptídeo tendo pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência para a SEQ ID NOs: 10-13. Também são fornecidos polipeptídeos que compreendem: (a) um polipeptídeo tendo cerca de 90% de identidade de sequência para a SEQ ID NO: 42 ou 46; e/ou (b) um polipeptídeo tendo pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência para a SEQ ID NOs: 41 e 45. Também são fornecidos polipeptídeos que compreendem: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência para a SEQ ID NO:97 ou 113; e/ou (b) um polipeptídeo tendo pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência para a SEQ ID NOs:96 ou 112. Também são fornecidos polipeptídeos que compreendem: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência para a SEQ ID NO:99 ou 115; e/ou (b) um polipeptídeo tendo pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência para a SEQ ID NOs: 98 ou 114. Também são fornecidos polipeptídeos que compreendem: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência para a SEQ ID NO: 101 ou 117; e/ou (b) um polipeptídeo tendo pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência para a SEQ ID NOs: 100 ou 116. Também são fornecidos polipeptídeos que compreendem: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência para a SEQ ID NO: 103 ou 119; e/ou (b) um polipeptídeo tendo pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência para a SEQ ID NOs: 102 ou 118. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo compreende um polipeptídeo tendo pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência para a SEQ ID NOs:4, 6, 10-13, 41, 42, 45 ou 46. Assim, em determinadas modalidades, o polipeptídeo compreende (a) um polipeptídeo tendo pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência para a SEQ ID NO:4 ou 6, e/ou (b) um polipeptídeo tendo pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência para a SEQ ID NOs: 10-13. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo compreende (a) um polipeptídeo tendo pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência para a SEQ ID NO:42 ou 46, e/ou (b) um polipeptídeo tendo pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência para a SEQ ID NOs:41 ou 45. Também são fornecidos polipeptídeos que compreendem: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência para a SEQ ID NO:97 ou 113; e/ou (b) um polipeptídeo tendo pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência para a SEQ ID NOs:96 ou 112. Também são fornecidos polipeptídeos que compreendem: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência para a SEQ ID NO:99 ou 115; e/ou (b) um polipeptídeo tendo pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência para a SEQ ID NOs:98 ou 114. Também são fornecidos polipeptídeos que compreendem: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência para a SEQ ID NO: 101 ou 117; e/ou (b) um polipeptídeo tendo pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência para a SEQ ID NOs: 100 ou 116. Também são fornecidos polipeptídeos que compreendem: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência para a SEQ ID NO: 103 ou 119; e/ou (b) um polipeptídeo tendo pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência para a SEQ ID NOs: 102 ou 118. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo compreende (a) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4; e/ou (b) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo compreende (a) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:45; e/ou (b) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:46. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo compreende (a) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6; e/ou (b) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo é um anticorpo e/ou o polipeptídeo especificamente liga o receptor de folato humano 1. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo é um anticorpo humanizado que liga especificamente o receptor de folato humano 1. Por exemplo, a invenção fornece um anticorpo ou anticorpo humanizado que especificamente liga um FOLR1 humano que compreende (a) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4; e (b) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11. Em determinadas modalidades o polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO:4 é uma região variável de cadeia pesada. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 10 ou 11 é uma região variável de cadeia leve. A invenção também fornece um anticorpo ou anticorpo humanizado que especificamente liga um FOLR1 humano que compreende (a) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6; e (b) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13. A invenção também fornece um anticorpo ou anticorpo humanizado que especificamente liga um FOLR1 humano que compreende (a) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:45; e (b) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:46. A invenção também fornece um anticorpo ou anticorpo humanizado que especificamente liga um FOLR1 humano que compreende (a) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 112; e (b) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 113. A invenção também fornece um anticorpo ou anticorpo humanizado que especificamente liga um FOLR1 humano que compreende (a) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 14; e (b) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 115. A invenção também fornece um anticorpo ou anticorpo humanizado que especificamente liga um FOLR1 humano que compreende (a) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:l 16; e (b) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 117. A invenção também fornece um anticorpo ou anticorpo humanizado que especificamente liga um FOLR1 humano que compreende (a) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 118; e (b) um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 119. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo tendo uma determinada porcentagem de identidade de sequência para a SEQ ID NOs: 4, 6, 10-13, 41, 42, 45, 46, 96-103 e 112-119 difere da SEQ ID NO: 4, 6, 1013, 41, 42, 45, 46, 96-103 e 112-119 pelas substituições de aminoácido conservativas somente.
[000122] Em determinadas modalidades, o agente de ligação ao FOLR-1 compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em um anticorpo anti-FOLR1 selecionado a partir do grupo consistindo em anticorpos huMovl9, FR-1-21, FR1-48, FR1-49, FR1-57, e FR1-65.
[000123] Em determinadas modalidades, o anticorpo huMov19 é codificado pelos plasmídeos depositados com o American Type Culture Collection (ATCC) em 7 de abril de 2010 e tendo depósito ATCC nos. PTA- 10772 e PTA- 10773 ou 10774.
[000124] Em determinadas modalidades, o anticorpo FR-1-21 é codificado pelos plasmídeos depositados com o ATCC em 7 de abril de 2010, e atribuídos os números de designação de depósito PTA- 10775 e 10776.
[000125] Em determinadas modalidades, os anticorpos humanizados se ligam ao FOLR1 com substancialmente a mesma afinidade como o anticorpo quimérico Mov19. A afinidade ou avidez de um anticorpo para o antígeno podem ser determinadas experimentalmente usando qualquer método adequado bem conhecido na técnica, por exemplo, citometria de fluxo, ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), ou radioimunoensaio (RIA), ou cinéticas (por exemplo, análise BIACORE™). Ensaios de ligação diretos assim como formatos de ensaio de ligação competitivos podem ser prontamente empregados. (Ver, por exemplo, Berzofsky, et al., "Antibody- Antigen Interactions," In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, N.Y. (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992); e métodos descritos aqui. A afinidade medida de uma interação de anticorpo-antígeno particular pode variar se medida sob diferentes condições (por exemplo, concentração de sal, pH, temperatura). Assim, medições de afinidade e outros parâmetros de ligação de antígeno (por exemplo, KD ou Kd, Kon, Koff) são feitas com soluções padronizadas de anticorpo e antígeno, e um tampão padronizado, como conhecido na técnica e como o tampão descrito aqui.
[000126] Em um aspecto, ensaios de ligação podem ser realizados usando a citometria de fluxo nas células que expressam o antígeno FOLR1 sobre a superfície. Por exemplo, as células de FOLR1 positivas como SKOV3 foram incubadas com concentrações variantes de anticorpos anti-FOLR1 usando 1 x 105 células por amostra em 100 μL de tampão FACS (meio RPMI-1640 suplementado com 2% de soro de cabra normal). Então, as células foram peletizadas, lavadas, e incubadas por 1 h com 100 μL de anticorpo IgG de cabra-anti- camundongo conjugado a FITC ou de cabra-anti-humano (como é obtível de, por exemplo Jackson Laboratory, 6 μg/mL em tampão FACS). As células foram peletizadas novamente, lavadas com tampão FACS e resuspensas em 200 μL de PBS contendo 1% de formaldeído. As amostras foram adquiridas, por exemplo, usando um citômetro de fluxo FACSCalibur com o amostrador de multi-poço HTS e analisadas usando CellQuest Pro (todos da BD Biosciences, San Diego, US). Para cada amostra a intensidade de fluorescência média para FL1 (MFI) foi exportada e plotada contra a concentração do anticorpo em um gráfico de semi-log para gerar uma curva de ligação. Uma curva de dose-resposta sigmoidal é ajustada para as curvas de ligação e valores de EC50 são calculados usando programas como GraphPad Prism v4 com parâmetros padrão (software GraphPad, San Diego, CA). Valores de EC50 podem ser usados como uma medida para a constante de dissociação aparente "Kd" ou "KD" para cada anticorpo.
[000127] Os anticorpos monoclonais podem ser preparados utilizando métodos de hibridoma, tais como os descritos por Kohler e Milstein (1975) Nature 256:495. Utilizando o método de hibridoma, um camundongo, hamster, ou outro animal hospedeiro apropriado, é imunizado como descrito acima para provocar a produção de anticorpos pelos linfócitos que se irão ligar especificamente a um antígeno imunizante. Os linfócitos também podem ser imunizados in vitro. Após a imunização, os linfócitos são isolados e fundidos com uma linhagem de células de mieloma adequada, utilizando, por exemplo, o polietileno glicol, para formar células de hibridoma que podem então ser selecionadas a partir de linfócitos não fundidos e células de mieloma. Os hibridomas que produzem anticorpos monoclonais dirigidos especificamente contra um antígeno escolhido, tal como determinado por imunoprecipitação, immunoblotting, ou por um ensaio de ligação in vitro (por exemplo, radioimunoensaio (RIA); ensaio de imunoabsorção de ligação a enzima (ELISA)) podem, em seguida, ser propagados ou cultivados in vitro utilizando métodos padrões (Goding, Monoclonal Anticorpos: Principles e Practice, Academic Press, 1986) ou in vivo como tumores de ascites em um animal. Os anticorpos monoclonais podem então ser purificados a partir do meio de cultura ou fluido de ascites, tal como descrito para os anticorpos policlonais acima referidos.
[000128] Em alternativa, os anticorpos monoclonais podem também ser feitos através de métodos de DNA recombinante tal como descrito na Patente US 4.816.567. Os polinucleotídeos que codificam um anticorpo monoclonal são isolados a partir de células B maduras ou células de hibridoma, tais como por meio de RT-PCR utilizando os iniciadores de oligonucleotídeos que especificamente amplificam os genes que codificam as cadeias pesada e leve do anticorpo, e a sua sequência é determinada utilizando procedimentos convencionais. Os polinucleotídeos isolados que codificam as cadeias pesadas e leves são então clonados em vetores de expressão adequados, os quais, quando transfectados para células hospedeiras, tais como células de E. coli, células COS de simio, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que, de outro modo, não produzem a proteína imunoglobulina, os anticorpos monoclonais são produzidos pelas células hospedeiras. Além disso, anticorpos monoclonais recombinantes, ou fragmentos dos mesmos das espécies desejadas podem ser isolados a partir de bibliotecas de exibição de fagos que expressam CDRs das espécies desejadas, tal como descrito (McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554; Clackson et al., 1991, Nature, 352:624-628; e Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581-597).
[000129] O(s) polinucleotídeo(s) que codifica(m) um anticorpo monoclonal pode ainda ser modificado de uma série de maneiras diferentes, usando tecnologia de DNA recombinante para gerar anticorpos alternativos. Em algumas modalidades, os domínios constantes das cadeias leve e pesada de, por exemplo, um anticorpo monoclonal de camundongo podem ser substituídos 1) pelas regiões de, por exemplo, um anticorpo humano para gerar um anticorpo quimérico, ou 2) por um polipeptídeo de não imunoglobulina para gerar um anticorpo de fusão. Em algumas modalidades, as regiões constantes são truncadas ou removidas para gerar o fragmento de anticorpo de um anticorpo monoclonal desejado. A mutagênese sítio- dirigida ou de alta densidade da região variável pode ser usada para otimizar a especificidade, afinidade, etc., de um anticorpo monoclonal.
[000130] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal contra o FOLR1 humano é um anticorpo humanizado. Em determinadas modalidades, tais anticorpos são usados terapeuticamente para reduzir a antigenicidade e respostas do HAMA (anticorpo humano anti- camundongo) quando administrados a um sujeito humano.
[000131] Métodos para a engenharia, humanização ou reaparecimento de anticorpos não humanos ou humanos também podem ser usados e são bem conhecidos na técnica. Um anticorpo humanizado, reaparecido ou projetado da mesma forma pode ter um ou mais resíduos de aminoácidos a partir de uma fonte que é não humana, por exemplo, mas não limitada a, camundongo, rato, coelho, primata não humano ou outros mamíferos. Esses resíduos de aminoácidos não humanos são substituídos por resíduos que são muitas vezes referidos como os resíduos de importação, que normalmente são tomados a partir de uma variável de importação, constante ou outro domínio de uma sequência humana conhecida.
[000132] Tais sequências importadas podem ser usadas para reduzir a imunogenicidade ou reduzir, aumentar ou modificar a ligação, afinidade, constante nominal, constante extranominal, avidez, especificidade, meia vida, ou qualquer outra característica adequada, como conhecido na técnica. Em geral, os resíduos de CDR são diretamente e mais substancialmente envolvidos em influenciar a ligação de FOLR1. Da mesma forma, parte ou todas as sequências de CDR humanas ou não humanas são mantidas enquanto as sequências não humanas das regiões constantes e variáveis podem ser substituídas por aminoácidos humanos ou outros.
[000133] Os anticorpos também podem opcionalmente ser humanizados, revestidos, modificados geneticamente ou anticorpos humanos modificados geneticamente com retenção de alta afinidade para o antígeno FOLR1 e outras propriedades biológicas favoráveis. Para atingir este objetivo, anticorpos anti-FOLR1 humanizados (ou humanos) ou modificados geneticamente e anticorpos revestidos podem ser opcionalmente preparados por um processo de análise das sequências parentais e vários produtos conceituais humanizados e geneticamente modificados usando modelos tridimensionais das sequências parentais, geneticamente modificadas e humanizadas. Modelos tridimensionais de imunoglobulina estão comumente disponíveis e são familiares àqueles versados na técnica. Estão disponíveis programas de computador, que ilustram e expõem estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências de imunoglobulina candidatas selecionadas. A inspeção destas exposições permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, ou seja, a análise dos resíduos que influenciam a habilidade da imunoglobulina candidata se ligar a seu antígeno, tais como FOLR1. Desta forma, os resíduos da estrutura (FR) podem ser selecionados e combinados a partir das sequências de consenso e importação de modo que o anticorpo desejado característico, tais como a afinidade aumentada para os antígenos alvo, é alcançado.
[000134] A humanização, recomposição da superfície ou modificação genética dos anticorpos da presente invenção podem ser realizados usando qualquer método conhecido, como, mas não limitado àqueles descritos em, Winter (Jones et al, Nature 321 :522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); Verhoeyen et al, Science 239: 1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993), Patentes US 5.639.641, 5.723.323; 5.976.862; 5.824.514; 5.817.483; 5.814.476; 5.763.192; 5.723.323; 5.766.886; 5.714.352; 6.204.023; 6.180.370; 5.693.762; 5.530.101; 5.585.089; 5.225.539; 4.816.567; PCT/US98/16280; US96/18978; US91/09630; US91/05939; US94/01234; GB89/01334; GB91/01134; GB92/01755; WO90/14443; WO90/14424; WO90/14430; EP 229246; 7.557.189; 7.538.195; e 7.342.110, cada um dos quais é interamente incorporado aqui por referência, incluindo as referências citadas aqui.
[000135] Em determinadas modalidades alternativas, o anticorpo para FOLR1 é um anticorpo humano. Os anticorpos humanos podem ser preparados diretamente utilizando várias técnicas conhecidas na técnica. Linfócitos B humanos imortalizados imunizados in vitro ou isolados a partir de um sujeito imunizado que produz um anticorpo dirigido contra um antígeno alvo podem ser gerados (Ver, por exemplo, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95; e Patente US 5.750.373). Além disso, o anticorpo humano pode ser selecionado a partir de uma biblioteca de fagos, em que a biblioteca de fagos expressa anticorpos humanos, conforme descrito, por exemplo, em Vaughan et al., 1996, Nat. Biotech., 14:309-314, Sheets et al., 1998, Proc. Nat'l. Acad. Sci., 95:6157-6162, Hoogenboom e Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381, e Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). As técnicas para a geração e uso de bibliotecas de fagos de anticorpos também são descritas nas Patentes US 5.969.108, 6.172.197, 5.885.793, 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915; 6.593.081; 6.300.064; 6.653.068; 6.706.484, e 7.264.963, e Rothe et al., 2007, J. Mol. Bio., doi:10.1016/j.jmb.2007.12.018 (cada uma das quais sendo incorporada por referência na sua totalidade). Estratégias de maturação de afinidade e estratégias de embaralhamento de cadeia (Marks et al., 1992, Bio/Technology 10:779-783, aqui incorporada por referência na sua totalidade) são conhecidas na técnica e podem ser empregadas para gerar anticorpos humanos de alta afinidade.
[000136] Os anticorpos humanizados podem também ser feitos em camundongos transgênicos contendo loci de imunoglobulina humana que são capazes de produzir, mediante a imunização, o repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Esta abordagem está descrita nas Patentes US 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425, e 5.661.016.
[000137] Esta invenção também engloba os anticorpos biespecíficos que reconhecem especificamente um receptor de folato humano 1. Os anticorpos biespecíficos são anticorpos que são capazes de reconhecer e de se ligar especificamente a pelo menos dois epítopos diferentes. Os epítopos diferentes podem estar dentro da mesma molécula (por exemplo, o mesmo receptor de folato humano 1) ou em diferentes moléculas de tal forma que ambos, por exemplo, os anticorpos podem reconhecer e se ligar especificamente ao receptor de folato humano 1, bem como, por exemplo, 1) uma molécula efetora em um leucócito, tal como um receptor de células T (por exemplo, CD3) ou receptores Fc (por exemplo, CD64, CD32, ou CD16), ou 2) um agente citotóxico, como descrito em detalhe abaixo.
[000138] Os anticorpos biespecíficos exemplares podem se ligar a dois epítopos diferentes, pelo menos um dos quais se originando de um polipeptídeo da invenção. Alternativamente, um braço antiantigênico de uma molécula de imunoglobulina pode ser combinado com um braço que se liga a uma molécula desencadeadora em um leucócito tal como uma molécula receptora de células T (por exemplo, CD2, CD3, CD28 ou B7), ou receptores Fc para IgG , de modo a focar os mecanismos de defesa celular para a célula que expressa o antígeno específico. Os anticorpos biespecíficos podem também ser usados para direcionar agentes citotóxicos para células que expressam um antígeno particular. Estes anticorpos possuem um braço de ligação ao antígeno e um braço que se liga a um agente citotóxico ou um quelante de radionuclídeo, tal como EOTUBE, DPTA, DOTA, ou TETA. As técnicas para a preparação de anticorpos biespecíficos são comuns na técnica (Millstein et al., 1983, Nature 305:537-539; Brennan et al., 1985, Science 229:81; Suresh et al, 1986, Methods in Enzymol. 121:120; Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10:3655-3659; Shalaby et al., 1992, J. Exp. Med. 175:217225; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553; Gruber et al., 1994, J. Immunol. 152:5368; e Patente US 5.731.168). Anticorpos com mais de duas valências são também contemplados. Por exemplo, os anticorpos triespecíficos podem ser preparados (Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)). Assim, em certas modalidades os anticorpos anti- FOLR1 são multiespecífico.
[000139] Em certas modalidades é fornecido um fragmento de anticorpo para, por exemplo, aumentar a penetração tumoral. Várias técnicas são conhecidas para a produção de fragmentos de anticorpos. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivados através de digestão proteolítica de anticorpos intactos (por exemplo, Morimoto et al., 1993, Journal of Biochemical e Biophysical Methods 24:107-117; Brennan et al., 1985, Science, 229:81). Em certas modalidades, os fragmentos de anticorpo são produzidos de forma recombinante. Os fragmentos de anticorpos Fab, Fv e scFv podem todos ser expressos em, e secretados a partir de E. coli ou outras células hospedeiras, permitindo assim a produção de grandes quantidades destes fragmentos. Tais fragmentos de anticorpos podem também ser isolados a partir de bibliotecas de fagos de anticorpos discutidas acima. O fragmento de anticorpo pode também ser de anticorpos lineares, tal como descrito na Patente US 5.641.870, por exemplo, e pode ser monoespecífico ou biespecifico. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo serão evidentes para o versado na técnica.
[000140] De acordo com a presente invenção, as técnicas podem ser adaptadas para a produção de anticorpos de cadeia simples específicos para o receptor de folato humano 1 (ver Patente US 4.946.778). Além disso, os métodos podem ser adaptados para a construção de bibliotecas de expressão de Fab (Huse, et al., Science 246:1275-1281 (1989)) para permitir uma identificação rápida e eficaz dos fragmentos Fab monoclonais com a especificidade desejada para o receptor de folato humano 1, ou derivados , fragmentos, análogos ou homólogos dos mesmos. Os fragmentos de anticorpos podem ser produzidos por meio de técnicas do estado da técnica, incluindo, mas não se limitadas a: (a) um fragmento F(ab')2 produzido por digestão com pepsina de uma molécula de anticorpo, (b) um fragmento Fab gerado por redução das pontes de dissulfeto de um fragmento F(ab')2, (c) um fragmento Fab gerado pelo tratamento da molécula de anticorpo com papaína e um agente de redução, e fragmentos de (d) fragmentos Fv.
[000141] Pode ainda ser desejável, em particular no caso de fragmentos de anticorpos, modificar um anticorpo de modo a aumentar a sua meia vida sérica. Isto pode ser conseguido, por exemplo, por incorporação de um epítopo de ligação de receptor de salvamento no fragmento de anticorpo por mutação da região apropriada no fragmento de anticorpo ou por incorporação do epítopo em um tag de peptídeo, que é então fundido ao fragmento de anticorpo em qualquer das extremidades ou no meio (por exemplo, por síntese de peptídeos ou DNA).
[000142] Os anticorpos heteroconjugados estão também dentro do escopo da presente invenção. Os anticorpos heteroconjugados são compostos por dois anticorpos ligados covalentemente. Tais anticorpos foram, por exemplo, propostos para direcionar células do sistema imune para células indesejadas (Patente US 4.676.980). É contemplado que os anticorpos podem ser preparados in vitro utilizando métodos conhecidos na química de proteínas sintéticas, incluindo os que envolvem agentes de reticulação. Por exemplo, imunotoxinas podem ser construídas utilizando uma reação de troca de dissulfeto ou formando uma ligação de tioéter. Exemplos de reagentes adequados para este fim incluem iminotiolato e metil-4- mercaptobutirimidato.
[000143] Para os fins da presente invenção, deve notar-se que os anticorpos modificados podem compreender qualquer tipo de região variável que fornece a associação do anticorpo com os polipeptídeos de um FOLR1 humano. A este respeito, a região variável pode incluir, ou ser derivada de qualquer tipo de mamífero que pode ser induzido para montar uma resposta imune humoral e gerar imunoglobulinas contra o antígeno associado ao tumor desejado. Como tal, a região variável dos anticorpos modificados pode ser, por exemplo, de origem humana, de murino, primata não humano (por exemplo, macacos cinomolgos, macacos, etc.) ou tremoço. Em algumas modalidades ambas as regiões variável e constante das imunoglobulinas modificadas são humanas. Em outras modalidades as regiões variáveis de anticorpos compatíveis (geralmente derivadas de uma fonte não humana) podem ser projetadas ou especificamente adaptadas para melhorar as propriedades de ligação ou reduzir a imunogenicidade da molécula. A este respeito, as regiões variáveis úteis na presente invenção podem ser humanizadas ou, de outro modo, alteradas pela inclusão de sequências de aminoácidos importadas.
[000144] Em certas modalidades, os domínios variáveis em ambas as cadeias pesada e leve são alteradas por pelo menos uma substituição parcial de uma ou mais CDRs e, se necessário, por substituição parcial da região de estrutura e mudança de sequência. Embora as CDRs possam ser derivadas de um anticorpo da mesma classe ou mesmo subclasse, que a do anticorpo a partir do qual as regiões de estrutura são derivadas, prevê-se que as CDRs irão ser derivadas de um anticorpo de uma classe diferente e em certas modalidades a partir de um anticorpo a partir de uma espécie diferente. Pode não ser necessário substituir todas as CDRs com as CDRs completas da região variável doadora para transferir a capacidade de ligação ao antígeno de um domínio variável para outro. Em vez disso, pode somente ser necessário transferir os resíduos que são necessários para manter a atividade do sítio de ligação ao antígeno. Dadas as explicações estabelecidas nas Patentes US 5.585.089, 5.693.761 e 5.693.762, que estará bem dentro da competência dos versados na técnica, ou através da realização de experiências de rotina, ou, por teste de tentativa e erro para se obter um anticorpo funcional, com imunogenicidade reduzida.
[000145] Apesar das alterações da região variável, os versados na técnica apreciarão que os anticorpos modificados da presente invenção irão incluir anticorpos (por exemplo, anticorpos de comprimento completo ou fragmentos imunorreativos dos mesmos) em que pelo menos uma fração de um ou mais dos domínios da região constante foi deletada ou alterada de modo a fornecer características bioquímicas desejadas, tais como o aumento da localização do tumor ou redução da meia vida sérica, quando comparado com um anticorpo de aproximadamente a mesma imunogenicidade compreendendo uma região constante nativa ou inalterada. Em algumas modalidades, a região constante dos anticorpos modificados irá compreender uma região constante humana. As modificações para a região constante compatível com a presente invenção compreendem adições, deleções ou substituições de um ou mais aminoácidos em um ou mais domínios. Isto é, os anticorpos modificados aqui descritos podem compreender alterações ou modificações de um ou mais dos três domínios constantes da cadeia pesada (CH1, CH2 ou CH3), e/ou para o domínio constante da cadeia leve (CL). Em algumas modalidades, as regiões constantes modificadas em que um ou mais domínios são parcialmente ou completamente deletados são contempladas. Em algumas modalidades, os anticorpos modificados irão compreender constructos ou variantes deletadas de domínio em que o domínio CH2 inteiro foi removido (constructos ΔCH2). Em algumas modalidades, o domínio da região constante omitido será substituído por um espaçador de aminoácidos curto (por exemplo, 10 resíduos) que fornece alguma das flexibilidades moleculares tipicamente transmitidas pela região constante ausente.
[000146] Além da sua configuração, é conhecido na técnica que a região constante medeia diversas funções efetoras. Por exemplo, a ligação do componente C1 do complemento um anticorpos ativa o sistema do complemento. A ativação do complemento é importante na opsonisação e lise de células de organismos patogênicos. A ativação do complemento também estimula a resposta inflamatória e pode também estar envolvida na hipersensibilidade autoimune. Além disso, os anticorpos se ligam a células através da região Fc, com um sítio de receptor de Fc sobre a região Fc de anticorpo de ligação a um receptor de Fc (FcR) em uma célula. Há um número de receptores de Fc, que são específicos para as diferentes classes de anticorpos, incluindo IgG (receptores gama), IgE (receptores eta), IgA (receptores-alfa) e IgM (receptores mu). A ligação do anticorpo a receptores Fc nas superfícies das células desencadeia uma série de importantes e diversas respostas biológicas, incluindo imersão e destruição de partículas revestidas de anticorpo, depuração de complexos imunes, lise de células alvos revestidas com anticorpo por células assassinas (chamadas citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos, ou ADCC), liberação de mediadores inflamatórios, transferência placentária e controle da produção de imunoglobulina.
[000147] Em certas modalidades, os anticorpos de ligação a FOLR1 fornecem funções efetoras alteradas que, por sua vez, afetam o perfil biológico do anticorpo administrado. Por exemplo, a deleção ou inativação (através de mutações pontuais ou outros meios) de um domínio de região constante, pode reduzir a ligação ao receptor de Fc do anticorpo circulante modificado aumentando, assim, a localização do tumor. Em outros casos, pode ser que as modificações das regiões constantes, em conformidade com esta invenção, moderem a ligação do complemento e, assim, reduzam a meia vida no soro e associação não específica de uma citotoxina conjugada. No entanto, outras modificações da região constante podem ser usadas para eliminar ligações de dissulfeto ou frações de oligossacarídeos que permitem a localização potencializada devido ao aumento da especificidade do antígeno ou flexibilidade de anticorpo. Do mesmo modo, as modificações da região constante, de acordo com a presente invenção podem facilmente ser feitas usando técnicas bem conhecidas de engenharia bioquímica ou molecular bem dentro da competência de um especialista na matéria.
[000148] Em certas modalidades, um agente de ligação a FOLR1 é um anticorpo que não tem uma ou mais funções efetoras. Por exemplo, em algumas modalidades, o anticorpo não tem atividade de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e/ou nenhuma atividade de citotoxicidade dependente do complemento de (CDC). Em certas modalidades, o anticorpo não se liga a um receptor de Fc e/ou a fatores de complemento. Em certas modalidades, o anticorpo tem função efetora.
[000149] Deve notar-se que, em certas modalidades, os anticorpos modificados podem ser manipulados para fundir o domínio CH3 diretamente com a região de dobradiça dos respectivos anticorpos modificados. Em outros constructos pode ser desejável fornecer um espaçador peptídico entre a região de dobradiça e os domínios modificados CH2 e/ou CH3. Por exemplo, os constructos compatíveis podem ser expressos em que o domínio CH2 foi deletado e o domínio CH3 restante (modificado ou não modificado) é ligado à região de dobradiça com um espaçador de aminoácido 5-20. Este espaçador pode ser adicionado, por exemplo, para assegurar que os elementos de regulação do domínio constante permanecem livres e acessíveis ou que a região de dobradiça se mantém flexível. No entanto, deve notar- se que os espaçadores de aminoácidos podem, em certos casos, provar serem imunogênicos e induzir uma resposta imune indesejável contra o construto. Assim, em certas modalidades, qualquer espaçador adicionado ao construto será relativamente não imunogênico, ou até mesmo omitido por completo, de modo a manter as qualidades desejadas bioquímicas dos anticorpos modificados.
[000150] Além da deleção dos domínios inteiros da região constante, será apreciado que os anticorpos da presente invenção podem ser fornecidos pela deleção ou substituição parcial de alguns ou mesmo de um único aminoácido. Por exemplo, a mutação de um único aminoácido em áreas selecionadas do domínio CH2 pode ser suficiente para reduzir substancialmente a ligação de Fc e, assim, aumentar a localização do tumor. Do mesmo modo, pode ser desejável simplesmente deletar a parte de um ou mais domínios da região constante que controlam a função efetora (por exemplo, ligação ClQ do complemento) a ser modulada. Tais deleções parciais das regiões constantes podem melhorar as características selecionadas do anticorpo (meia vida sérica), enquanto deixando outras funções desejáveis associadas com o domínio da região constante intacto do sujeito. Além disso, como mencionado acima, as regiões constantes dos anticorpos descritos podem ser modificadas por meio da mutação ou substituição de um ou mais aminoácidos que potencializam o perfil do construto resultante. A este respeito, pode ser possível afetar a atividade fornecida por um sítio de ligação conservado (por exemplo, ligação de Fc), embora mantendo substancialmente a configuração e o perfil imunogênico do anticorpo modificado. Certas modalidades podem compreender a adição de um ou mais aminoácidos na região constante para potencializar as características desejáveis, tais como a diminuição ou aumento da função efetora ou fornecer mais fixação de citotoxina ou carboidratos. Em tais modalidades, pode ser conveniente inserir ou replicar as sequências específicas derivadas selecionadas dos domínios da região constante.
[000151] A presente invenção também engloba variantes e equivalentes que são substancialmente homólogos aos anticorpos quiméricos, humanizados e humanos, ou fragmentos de anticorpos dos mesmos, aqui estabelecidos. Estes podem conter, por exemplo, as mutações de substituição conservativa, isto é, a substituição de um ou mais aminoácidos por aminoácidos similares. Por exemplo, a substituição conservativa refere-se à substituição de um aminoácido por outro dentro da mesma classe geral, tais como, por exemplo, um aminoácido ácido por outro aminoácido ácido, um aminoácido básico por um outro aminoácido básico, ou um aminoácido neutro por outro aminoácido neutro. O que se pretende através de uma substituição conservativa de aminoácidos é bem conhecido na técnica.
[000152] Os polipeptídeos da presente invenção podem ser polipeptídeos recombinantes, polipeptídeos naturais ou polipeptídeos sintéticos, compreendendo um anticorpo, ou fragmento do mesmo, contra o FOLR1 humano. Será reconhecido na técnica que algumas sequências de aminoácidos da invenção podem ser variadas sem efeito significativo da estrutura ou função da proteína. Assim, a invenção inclui ainda variações de polipeptídeos que mostram uma atividade substancial ou que incluem as regiões de um anticorpo, ou fragmento do mesmo, contra proteína FOLR1. Tais mutantes incluem deleções, inserções, inversões, repetições, e substituições de tipo.
[000153] Os polipeptídeos e análogos podem ser ainda modificados para conter frações químicas adicionais que não fazem parte da proteína normalmente. Aquelas frações derivadas podem melhorar a solubilidade, a meia vida biológica ou a absorção da proteína. As frações podem também reduzir ou eliminar os efeitos colaterais desejáveis das proteínas e semelhantes. Uma visão geral para as frações pode ser encontrada em REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 20a ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (2000).
[000154] Os polipeptídeos isolados aqui descritos podem ser produzidos por qualquer método adequado conhecido na técnica. Tais métodos variam entre os métodos diretos sintéticos de proteína para a construção de uma sequência de DNA que codifica sequências de polipeptídeos isolados e expressão dessas sequências em um hospedeiro adequado transformado. Em algumas modalidades, uma sequência de DNA é construída utilizando tecnologia recombinante através do isolamento ou síntese de uma sequência de DNA que codifica uma proteína de tipo selvagem de interesse. Opcionalmente, a sequência pode ser mutagenizada através de mutagênese sítio- específica para fornecer análogos funcionais da mesma. Veja-se, por exemplo, Zoeller et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81:5662-5066 (1984) e Patente US 4.588.585.
[000155] Em algumas modalidades, uma sequência de DNA que codifica um polipeptídeo de interesse seria construída por síntese química usando um sintetizador de oligonucleotídeos. Tais oligonucleotídeos podem ser projetados com base na sequência de aminoácidos do polipeptídeo desejado e seleção dos códons que são favorecidos na célula hospedeira em que o polipeptídeo recombinante de interesse será produzido. Métodos padrões podem ser aplicados para sintetizar uma sequência de polinucleotídeo isolada que codifica um polipeptídeo isolado de interesse. Por exemplo, uma sequência completa de aminoácidos pode ser usada para construir um gene retrotraduzido. Além disso, um oligômero de DNA contendo uma sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo particular isolado pode ser sintetizado. Por exemplo, vários oligonucleotídeos pequenos que codificam porções do polipeptídeo desejado podem ser sintetizados e depois ligados. Os oligonucleotídeos individuais normalmente contêm protuberâncias 5' ou 3' para uma montagem complementar.
[000156] Uma vez montadas (por síntese, mutagênese sítio-dirigida ou outro método), as sequências de polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo isolado particular de interesse serão inseridas em um vetor de expressão e operacionalmente ligadas a uma sequência de controle de expressão apropriada para a expressão da proteína em um hospedeiro desejado. A montagem apropriada pode ser confirmada por sequenciamento de nucleotídeos, mapeamento de restrição e expressão de um polipeptídeo biologicamente ativo em um hospedeiro adequado. Como é bem conhecido na técnica, de modo a obter níveis elevados de expressão de um gene transfectado em um hospedeiro, o gene deve ser operacionalmente ligado a sequências de controle de expressão de transcrição e de tradução que são funcionais no hospedeiro de expressão escolhido.
[000157] Em certas modalidades, os vetores de expressão recombinantes são usados para amplificar e expressar anticorpos que codificam DNA, ou fragmentos dos mesmos, contra o FOLR1 humano. Os vetores de expressão recombinantes são constructos de DNA replicáveis que têm fragmentos de DNA sintéticos ou derivados de cDNA que codificam uma cadeia de polipeptídeos de um anticorpo anti-FOLR1, ou um fragmento do mesmo, operativamente ligados a elementos de regulação de transcrição ou de tradução adequados derivados de genes de mamíferos, micróbios, vírus ou insetos . Uma unidade transcricional geralmente compreende um conjunto de (1) um elemento ou elementos genéticos tendo um papel regulador na expressão gênica, por exemplo, promotores ou potenciadores transcricionais, (2) uma sequência de codificação ou estrutural que é transcrita em mRNA e traduzida em proteína, e (3) sequências de iniciação e de terminação de transcrição e de tradução adequadas, tal como descrito em detalhe abaixo. Tais elementos de regulação podem incluir uma sequência de operador para controlar a transcrição. A capacidade de se replicar em um hospedeiro, normalmente conferida por uma origem de replicação, e um gene de seleção para facilitar o reconhecimento de transformantes pode ser adicionalmente incorporada. As regiões de DNA estão operacionalmente ligadas quando estão funcionalmente relacionadas umas com as outras. Por exemplo, o DNA para um peptídeo sinal (líder de secreção) é operativamente ligado ao DNA para um polipeptídeo se o mesmo é expresso como um precursor que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor é operativamente ligado a uma sequência de codificação se o mesmo controla a transcrição da sequência, ou um sítio de ligação a ribossoma está operativamente ligado a uma sequência de codificação se estiver posicionado de modo a permitir a tradução. Os elementos estruturais destinados ao uso em sistemas de expressão de levedura incluem uma sequência líder que permite a secreção extracelular da proteína traduzida por uma célula hospedeira. Alternativamente, quando a proteína recombinante é expressa sem uma sequência líder ou de transporte, a mesma pode incluir um resíduo de metionina N-terminal. Este resíduo pode opcionalmente ser subsequentemente clivado a partir da proteína recombinante expressa para fornecer um produto final.
[000158] A escolha da sequência de controle de expressão e do vetor de expressão dependerá da escolha do hospedeiro. Uma grande variedade de combinações de vetor/hospedeiro de expressão pode ser empregada. Os vetores de expressão úteis para hospedeiros eucarióticos incluem, por exemplo, vetores compreendendo sequências de controle de expressão a partir do SV40, vírus do papiloma bovino, adenovírus e citomegalovírus. Os vetores de expressão úteis para hospedeiros bacterianos incluem plasmídeos bacterianos conhecidos, tais como plasmídeos de E. coli, incluindo pCR 1, pBR322, pMB9 e seus derivados, plasmídeos de faixa de hospedeiros maiores, tais como M13 e fagos de DNA de fita única.
[000159] As células hospedeiras adequadas para expressão de um polipeptídeo ou um anticorpo de ligação a FOLR1 (ou uma proteína de FOLR1 para uso como um antígeno) incluem células procariotas, de levedura, de inseto ou de eucariotas superiores sob o controle de promotores apropriados. Os procariotas incluem organismos gram negativos ou gram positivos, por exemplo, E. coli ou bacilos. As células eucariotas superiores incluem linhagens de células estabelecidas de origem em mamífero tal como descrito abaixo. Sistemas de tradução isentos de células podem também ser empregados. Os vetores de clonagem e de expressão apropriados para uso com hospedeiros celulares de bactérias, leveduras, fungos, e de mamíferos são descritos por Pouwels et al. (Cloning Vetors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., 1985), cuja divulgação relevante da qual é aqui incorporada por referência. Informações adicionais sobre os métodos de produção de proteínas, incluindo a produção de anticorpos, podem ser encontradas, por exemplo, na Publicação de Patente US 2008/0187954, Patentes US 6.413.746 e 6.660.501, e Publicação de Patente Internacional WO 04009823, cada uma das quais sendo aqui incorporada por referência na sua totalidade.
[000160] Vários sistemas de cultura de células de mamífero ou de inseto também são vantajosamente usados para expressar a proteína recombinante. A expressão de proteínas recombinantes em células de mamíferos pode ser realizada porque tais proteínas são geralmente corretamente dobradas, apropriadamente modificadas e completamente funcionais. Exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamífero incluem as linhagens HE -293 e HEK-293T e COS-7 de células de rim de macaco, descritas por Gluzman (Cell 23:175, 1981), e outras linhagens de células capazes de expressar um vetor apropriado incluindo, por exemplo, células L, C127, 3T3, ovário de hamster chinês (CHO), linhagens de células HeLa e BHK. Os vetores de expressão de mamífero podem compreender elementos não transcritos tais como uma origem de replicação, um promotor adequado e potencializador ligado ao gene para ser expresso, e outras sequências não transcritas que flanqueiam 5' ou 3' e as sequências não traduzidas 5' ou 3', tais como sítios de ligação a ribossoma necessário, um sítio de poliadenilação, sítios receptores e doadores de splice, e sequências de terminação da transcrição. Os sistemas de baculovírus para produção de proteínas heterólogas em células de inseto são revistas por Luckow e Summers, Bio/Technology 6:47 (1988).
[000161] As proteínas produzidas por um hospedeiro transformado podem ser purificadas de acordo com qualquer método adequado. Tais métodos convencionais incluem cromatografia (por exemplo, cromatografia de troca iônica, de afinidade e em coluna dimensionamento), centrifugação, solubilidade diferencial, ou por qualquer outra técnica padrão para a purificação de proteínas. Tags de afinidade, tais como hexa-histidina, o domínio de ligação à maltose, sequência de revestimento da influenza e glutationa-S-transferase podem ser fixos à proteína para permitir fácil purificação através da passagem através de uma coluna de afinidade apropriada. As proteínas isoladas podem ser igualmente caracterizadas fisicamente usando técnicas tais como proteólise, ressonância magnética nuclear e cristalografia de raios-x.
[000162] Por exemplo, os sobrenadantes de sistemas que secretam proteína recombinante nos meios de cultura podem ser primeiro concentrados utilizando um filtro de concentração de proteínas comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Após a etapa de concentração, o concentrado pode ser aplicado em uma matriz de purificação adequada. Alternativamente, uma resina de troca de ânionss pode ser usada, por exemplo, uma matriz ou substrato tendo grupos pendentes de dietilaminoetil (DEAE). As matrizes podem ser acrilamida, agarose, dextrano, celulose ou outros tipos vulgarmente empregados na purificação de proteínas. Alternativamente, uma etapa de troca catiônica pode ser empregada. Trocadores catiônicos adequados incluem várias matrizes insolúveis compreendendo grupos sulfopropila ou carboximetil. Finalmente, uma ou mais etapas de cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa, (RP-HPLC) empregando meios de RP-HPLC hidrofóbicos, por exemplo, sílica gel tendo grupos metil pendentes ou outros grupos alifáticos, podem ser empregadas para purificar adicionalmente um agente de ligação a FOLR1. Algumas ou todas as etapas de purificação antecedentes, em várias combinações, podem também ser empregadas para fornecer uma proteína recombinante homogênea.
[000163] A proteína recombinante produzida em cultura bacteriana pode ser isolada, por exemplo, por extração inicial de péletes celulares, seguido por uma ou mais etapas de concentração, saltingout, de cromatografia de troca iônica aquosa ou de exclusão por tamanho. A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) pode ser empregada para as etapas finais de purificação. As células microbianas usadas na expressão de uma proteína recombinante podem ser rompidas por qualquer método conveniente, incluindo ciclos de congelação-descongelação, sonicação, ruptura mecânica ou uso de agentes de lise celular.
[000164] Os métodos conhecidos na técnica para a purificação de anticorpos e outras proteínas também incluem, por exemplo, os descritos nas Publicações de Patente US 2008/0312425, 2008/0177048, e 2009/0187005, cada uma das quais sendo aqui incorporada por referência neste documento na sua totalidade.
[000165] Em certas modalidades, o agente de ligação a FOLR1 é um polipeptídeo que não é um anticorpo. Uma variedade de métodos para a identificação e produção de polipeptídeos não anticorpos que se ligam com elevada afinidade a um alvo de proteína são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Skerra, Curr. Opin. Biotechnol., 18:295-304 (2007), Hosse et al., Protein Science, 15:14-27 (2006), Gill et al., Curr. Opin. Biotechnol., 17:653-658 (2006), Nygren, FEBS J., 275:2668-76 (2008), e Skerra, FEBS J., 275:2677-83 (2008), cada uma das quais sendo aqui incorporada por referência na sua totalidade. Em certas modalidades, a tecnologia de exibição de fagos tem sido usada para identificar/produzir o polipeptídeo de ligação a FOLR1. Em certas modalidades, o polipeptídeo compreende um suporte de proteína de um tipo selecionado dentre o grupo que consiste em proteína A, um lipocalina, um domínio de fibronectina, um domínio de repetição de consenso de anquirina e tioredoxina.
[000166] Em algumas modalidades, o agente é uma molécula não proteica. Em certas modalidades, o agente é uma molécula pequena. As bibliotecas de química combinatória e técnicas úteis para a identificação de agentes de ligação a FOLR1 de não proteínas são conhecidas dos versados na técnica. Veja, por exemplo, Kennedy et al., J. Comb. Chem, 10:345-354 (2008), Dolle et al, J. Comb. Chem., 9:855-902 (2007), e Bhattacharyya, Curr. Med. Chem., 8:1383-404 (2001), cada uma das quais sendo aqui incorporadas por referência na sua totalidade. Em certas modalidades, o agente é um carboidrato, um glicosaminoglicano, uma glicoproteína ou um proteoglicano.
[000167] Em certas modalidades, o agente é um aptâmero de ácido nucleico. Aptâmeros são moléculas de polinucleotídeos que foram selecionadas (por exemplo, a partir de pools aleatórios ou mutados) com base na sua capacidade para se ligar a uma outra molécula. Em algumas modalidades, o aptâmero compreende um polinucleotídeo de DNA. Em certas modalidades alternativas, o aptâmero compreende um polinucleotídeo de RNA. Em certas modalidades, o aptâmero compreende um ou mais resíduos de ácidos nucleicos modificados. Os métodos de geração e triagem de aptâmeros de ácido nucleico para ligação a proteínas são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Patente US 5.270.163, Patente US 5.683.867, Patente US 5.763.595, Patente US 6.344.321, Patente US 7.368.236, Patente US 5.582.981, Patente US 5.756.291, Patente US 5.840.867, Patente US 7.312.325, Patente US 7.329.742, Pedido de Patente Internacional WO 02/077262, Publicação de Patente Internacional. WO 03/070984, Publicação de Pedido de Patente US 2005/0239134, Publicação de Pedido de Patente US 2005/0124565 e na Publicação de Pedido de Patente US 2008/0227735, cada um dos quais sendo aqui incorporado por referência na sua totalidade.
III. Imunoconjugados
[000168] A presente invenção é também direcionada aos conjugados (também referidos aqui como imunoconjugados), compreendendo os anticorpos anti-FOLR1, fragmentos de anticorpo, equivalentes funcionais, anticorpos melhorados e seus aspectos são divulgados aqui, ligados ou conjugados a uma citotoxina (fármaco) ou profármaco. Assim, em uma determinada modalidade, a invenção fornece umn imunoconjugado compreendendo um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que especificamente liga um receptor de folato humano 1, em que o anticorpo compreende: (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo GYFMN (SEQ ID NO: 1); uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo RIHPYDGDTFYNQXaa1FXaa2Xaa3 (SEQ ID NO:56); e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo YDGSRAMDY (SEQ ID NO:3); e (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo KASQSVSFAGTSLMH (SEQ ID NO:7); uma CDR2 de cadeia leve compreendendo RASNLEA (SEQ ID NO:8); e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo QQSREYPYT (SEQ ID NO:9); em que Xaa1 é selecionado a partir de K, Q, H, e R; Xaa2 é selecionado a partir de Q, H, N, e R; e Xaa3 é selecionado a partir de G, E, T, S, A, e V. Em determinadas modalidades, o anticorpo é o anticorpo huMov19, que é o anticorpo acima descrito compreendendo a CDR2 de cadeia pesada RIHPYDGDTFYNQKFQG (SEQ ID NO:2). Em outras modalidades, o anticorpo é FR1-21 e compreende (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo SSYGMS (SEQ ID NO:30); uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo TISSGGSYTY (SEQ ID NO:31); e/ou uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo DGEGGLYAMDY (SEQ ID NO:32); e (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo KASDHINNWLA (SEQ ID NO:27); uma CDR2 de cadeia leve compreendendo GATSLET (SEQ ID NO:28); e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo QQYWSTPFT (SEQ ID NO:29). Em outras modalidades, o anticorpo é FR1-48 e compreende: (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo TNYWMQ (SEQ ID NO:60); uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo AIYPGNGDSR (SEQ ID NO:61); e/ou uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo RDGNYAAY (SEQ ID NO:62); e/ou (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo RASENIYSNLA (SEQ ID NO: 57); uma CDR2 de cadeia leve compreendendo AATNLAD (SEQ ID NO:58); e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo QHFWASPYT (SEQ ID NO:59). Em outras modalidades, o anticorpo é FR1-49 e compreende: (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo TNYWMY (SEQ ID NO:66); uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo AIYPGNSDTT (SEQ ID NO:67); e/ou uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo RHDYGAMDY (SEQ ID NO:68); e/ou (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo RASENIYTNLA (SEQ ID NO:63); uma CDR2 de cadeia leve compreendendo TASNLAD (SEQ ID NO:64); e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo QHFWVSPYT (SEQ ID NO:65). Em outras modalidades, o anticorpo é FR1-57 e compreende: (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo SSFGMH (SEQ ID NO:72); uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo YISSGSSTIS (SEQ ID NO:73); e/ou uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo EAYGSSMEY (SEQ ID NO: 74); e/ou (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo RASQNINNNLH (SEQ ID NO:69); uma CDR2 de cadeia leve compreendendo YVSQSVS (SEQ ID NO:70); e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo QQSNSWPHYT (SEQ ID NO:71). Ainda em outra modalidade, o anticorpo é FR1-65 e compreende: (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo TSYTMH (SEQ ID NO:78); uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo YINPISGYTN (SEQ ID NO:79); e/ou uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo GGAYGRKPMDY (SEQ ID NO:80); e/ou (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo KASQNVGPNVA (SEQ ID NO:75); uma CDR2 de cadeia leve compreendendo SASYRYS (SEQ ID NO:76); e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo QQYNSYPYT (SEQ ID NO:77).
[000169] Fármacos ou profármacos adequados são conhecidos na técnica. Em determinadas modalidades, as fármacos ou profármacos são agentes citotóxicos. O agente citotóxico usado no conjugado citotóxico da presente invenção pode ser qualquer composto que resulta na morte de uma célula, ou induz a morte celular, ou de algum modo diminui a viabilidade celular, e inclui, por exemplo, maitansinoides e análogos de maitansinol. Outros agentes citotóxicos são, por exemplo, benzodiazepinas, taxoides, análogos CC-1065 e CC-1065, duocarmicinas e análogos de duocarmicina, enedinas, como caliqueamicinas, dolastatina e análogos de dolastatina, incluindo auristatinas, derivados de tomaimicina, derivados de leptomicina, metotrexato, cisplatina, carboplatina, daunorrubicina, doxorrubicina, vincristina, vinblastina, melfalano, mitomicina C, clorambucil e morfolino doxorrubicina. Em determinadas modalidades, os agentes citotóxicos são maitansinoides e análogos de maitansinoides.
[000170] Tais conjugados podem ser preparados pelo uso de um grupo de ligação a fim de ligar um fármaco ou profármaco para o anticorpo ou equivalente funcional. Grupos de ligação adequados são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, grupos dissulfito, grupos tioéter, grupos lábeis de ácido, grupos fotolábeis, grupos lábeis de peptidase e grupos lábeis de esterase.
[000171] O fármaco ou profármaco pode, por exemplo, ser ligada ao anticorpo anti-FOLR1 ou um fragmento do mesmo através de uma ligação dissulfeto. A molécula ligante ou agente de reticulação compreende um grupo químico reativo que pode reagir com o anticorpo anti-FOLR1 ou um fragmento do mesmo. Em certas modalidades, os grupos químicos reativos para a reação com o agente de ligação a células são N-succinimidil ésteres e N-sulfossuccinimidil ésteres. Além disso, a molécula ligante compreende um grupo químico reativo, em determinadas modalidades um grupo ditiopiridil que pode reagir com o fármaco para formar uma ligação dissulfeto. Em certas modalidades, as moléculas ligantes incluem, por exemplo, N- succinimidil 3-(2-piridilditio) propionato (SPDP) (ver, por exemplo, Carlsson et al., Biochem. J., 173: 723-737 (1978)), N-succinimidil-4-(2- piridilditio)-butanoato (SPDB) (ver, por exemplo, Patente US 4.563.304), 4-(2-piridilditio)-2-sulfobutanoato de N-succinimidila (sulfo- SPDB) (ver Publicação US 20090274713), N-succinimidil 4 -(2- piridilditio) pentanoato (SPP) (ver, por exemplo, CAS Número de Registo 341498-08-6), 2-iminotiolano ou anidrido acetilsuccínico. Por exemplo, o anticorpo ou agente de ligação a células pode ser modificado com reagentes de reticulação e o anticorpo ou agente de ligação a células contendo grupos de tiol livres ou protegidos assim derivados é então reagido com um maitansinoide contendo tiol ou dissulfeto para produzir conjugados. Os conjugados podem ser purificados por meio de cromatografia, incluindo, mas não limitado a HPLC, de exclusão por tamanho, de adsorção, de troca iônica e de captura por afinidade, diálise ou filtração de fluxo tangencial. Em determinadas modalidades, o anticorpo anti-FOLR1 é ligado à citoxina através de um ligante SPDB ou sulfo-SPDB. Em uma determinada modalidade, o anticorpo huMov19 é ligado a uma citotoxina através de um ligante SPDB ou sulfo-SPDB.
[000172] Em outro aspecto da presente invenção, o anticorpo anti- FOLR1 está associado a fármacos citotóxicas através de ligações de dissulfeto e um espaçador de polietileno glicol na potencialização da potência, solubilidade, ou eficácia do imunoconjugado. Tais ligantes hidrofílicos cliváveis são descritos em WO2009/0134976. A vantagem adicional deste projeto de ligante é a razão de monômero desejada elevada e agregação mínima do conjugado de anticorpo-fármaco. Especificamente contemplados neste aspecto são conjugados de agentes de ligação a células e fármacos ligados via grupo dissulfeto (- S-S-) tendo espaçadores de polietilenoglicol ((CH2CH2O)n=1-14), com uma faixa estreitade carga de fármaco de 2-8 são descritas as quais mostram atividade biológica potente relativamente elevada para células cancerosas e possuem as propriedades bioquímicas desejadas de elevado rendimento de conjugação e com elevada razão de monômero com agregação de mínima de proteína.
[000173] Neste aspecto é especificamente contemplado um conjugado de fármaco de anticorpo anti-FOLR1 de fórmula (I) ou de um conjugado de fórmula (I '):
Figure img0002
em que: A representa um anticorpo anti-FOLR1 ou fragmento; C representa uma citotoxina ou fármaco; X representa uma unidade alifática, aromática ou heterocíclica fixa ao agente de ligação a célula por meio de uma ligação de tioéter, uma ligação de amida, uma ligação de carbamato, ou uma ligação de éter; Y representa uma unidade alifática, aromática ou heterocíclica fixa à fármaco por meio de uma ligação de dissulfeto; l é 0 ou 1; m é um inteiro de 2 a 8; e n é um inteiro de 1 a 24.
[000174] Em algumas modalidades, m é um inteiro de 2 a 6.
[000175] Em algumas modalidades, m é um inteiro de 3 a 5.
[000176] Também, em algumas modalidades, n é um inteiro de 2 a 8. Em alternativa, como divulgado, por exemplo, nas Patentes US 6.441.163 e 7.368.565, o fármaco pode ser primeiramente modificado para introduzir um éster reativo adequado para reagir com um agente de ligação a células. A reação destes fármacos com uma fração ligante ativada com um agente de ligação a células fornece outro método de produção de um conjugado de fármaco de agente de ligação a células. Maitansinoides também podem ser ligados ao anticorpo anti-FOLR1 ou fragmento utilizando grupos de ligação PEG, tal como indicado, por exemplo, na Patente US 6.716.821. Estes grupos de ligação não cliváveis de PEG são solúveis tanto em água quanto em solventes não aquosos, e podem ser usados para unir um ou mais agentes citotóxicos a um agente de ligação a células. Grupos de ligação a PEG exemplares incluem ligantes de PEG heterobifuncionais que reagem com agentes citotóxicos e agentes de ligação de células em extremidades opostas dos ligantes através de um grupo funcional de sulfidrila ou dissulfeto em uma extremidade, e de um éster ativo na outra extremidade. Como um exemplo geral de síntese de um conjugado citotóxico utilizando um grupo de ligação a PEG, é novamente feita referência à Patente US 6.716.821, que está incorporada completamente aqui por referência. A síntese começa com a reação de um ou mais agentes citotóxicos portadores de uma fração de PEG reativa com um agente de ligação a células, resultando no deslocamento do éster ativo do terminal de cada fração de PEG reativa por um resíduo de aminoácido do agente de ligação a células, para produzir um conjugado citotóxico compreendendo um ou mais agentes citotóxicos ligados covalentemente a um agente de ligação a células através de um grupo de ligação a PEG. Alternativamente, a ligação das células pode ser modificada com o reticulador de PEG bifuncional para introduzir uma fração de dissulfeto reativa (tal como um piridildissulfeto), que pode então ser tratado com um maitansinoide contendo tiol para fornecer um conjugado. Em outro método, a ligação da célula pode ser modificada com o reticulador de PEG bifuncional para introduzir um radical tiol, que pode, em seguida, pode ser tratado com um maitansinoide contendo dissulfeto reativo (tal como um piridildissulfeto), para fornecer um conjugado.
[000177] Os conjugados de anticorpo-maitansinoide com ligações não cliváveis também podem ser preparados. Tais agentes de reticulação são descritos na técnica (ver, ThermoScientific Pierce Crosslinking Technical Handbook e Publicação de Pedido de Patente N° US. 2005/0169933) e incluem mas não estão limitados a, N- succinimidil 4-(maleimidometil) ciclo-hexanocarboxilato (SMCC), N- succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclo-hexano-1-carbóxi-(6- amidocaproato), que é um análogo de "cadeia longa" de SMCC (LC- SMCC), N-succinimidil éster de ácido K-maleimidoundecanoico (KMUA), N-succinimidil éster de ácido β-maleimidopropanoico (BMPS), N-succinimidil éster de ácido Y-maleimidobutírico (GMBS), N- hidroxisuccinimida éster de ácido ε-maleimidocaproico (EMCS), m- maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida éster (MBS), N-(a- maleimidoacetoxi)-succinimida éster (AMAS), succinimidil-6-(p- maleimidopropionamido)hexanoato (SMPH), N-succinimidil 4-(p- malcimidofenil-butirato (SMPB), e N-(p-maleimidofenil)isocianato (PMPI), N-succinimidil-4-(iodoacetil)-aminobenzoato (SIAB), N- succinimidil iodoacetato (SIA), N-succinimidil bromoacetato (SBA), e N-succinimidil 3-(bromoacetamido)propionato (SBAP). Em determinadas modalidades, o anticorpo é modificado com reagentes de reticulação como succinimidil 4-(N-maleimidometil)-ciclo-hexano-1- carboxilato (SMCC), sulfo-SMCC, maleimidobenzoil-N- hidroxisuccinimida éster (MBS), sulfo-MBS ou succinimidil-iodoacetato, como descrito na literatura, para introduzir 1 a 10 grupos reativos (Yoshitake et al, Eur. J. Biochem., 101:395-399 (1979); Hashida et al, J. Applied Biochem., 56-63 (1984); e Liu et al, Biochem., 18:690-697 (1979)). O anticorpo modificado é então reagido com o derivado de maitansinoide contendo tiol para produzir um conjugado. O conjugado pode ser purificado por filtração em gel através de uma coluna Sephadex G-25, ou por diálise ou filtração por fluxo tangencial. Os anticorpos modificados são tratados com o maitansinoide contendo tiol (1 a 2 equivalente molar /grupo maleimido) e conjugados anticorpo- maitansinoide são purificador pela filtração em gel através de uma coluna Sephadex G-25, cromatografia sobre uma coluna de hidroxiapatita cerâmica, diálise ou filtração por fluxo tangencial ou uma combinação dos métodos dos mesmos. Tipicamente, uma média de 110 maitansinoides por anticorpo está ligada. Um método é o de modificar anticorpos com succinimidil 4-(N-maleimidometil)-ciclo- hexano-1-carboxilato (SMCC) para introduzir grupos maleimido, seguido pela reação do anticorpo modificado com um maitansinoide contendo tiol para dar um conjugado ligado a tioéter. Mais uma vez resultam conjugados com 1 a 10 moléculas de fármaco por cada molécula de anticorpo. Os conjugados de anticorpos de maitansinoide, fragmentos de anticorpos, hormônios da proteína, fatores de crescimento de proteína e outras proteínas são feitas da mesma maneira.
[000178] Em outro aspecto da invenção, o anticorpo FOLR1 (por exemplo, huMovl 9, FR1 -21, FR1-48, FRl-49, FRl-57 ou FRl-65) está associado à fármaco por meio de uma ligação não clivável por intermédio de um espaçador de PEG. Os reagentes de reticulação adequados que compreendem cadeias hidrofílicas de PEG que formam ligantes entre a fármaco e o fragmento ou anticorpo anti- FOLR1 também são bem conhecidos na técnica, ou estão disponíveis comercialmente (por exemplo, a partir de Quanta Biodesign, Powell, Ohio). Os retuculadores contendo PEG adequados podem também ser sintetizados a partir de PEGs comercialmente disponíveis usando técnicas padrões de química sintética conhecidas dos versados na técnica. Os fármacoss podem ser reagidos com reticuladores contendo PEG bifuncional para produzir compostos com a seguinte fórmula, Z - Xl-(-CH2-CH2-O-)n-Yp-D, através de métodos descritos em detalhe na Publicação de Patente US 20090274713 e Publicação WO2009/0134976, que podem então reagir com o agente de ligação a células para fornecer um conjugado. Alternativamente, a ligação das células pode ser modificada com o reticulador de PEG bifuncional para introduzir um grupo tiol reativo (tal como uma maleimida ou haloacetamida), que pode então ser tratado com um maitansinoide contendo tiol para fornecer um conjugado. Em outro método, a ligação da célula pode ser modificada com o reticulador de PEG bifuncional para introduzir uma fração tiol, que pode então ser tratada com um maitansinoide reativo a tiol (tal como um maitansinoide portador de uma maleimida ou haloacetamida), para fornecer um conjugado.
[000179] Em consequência, outro aspecto da presente invenção é um conjugado de fármaco de anticorpo anti-FOLR1 de fórmula (II) ou de fórmula (IF):
Figure img0003
em que, A representa um anticorpo anti-FOLR1 ou fragmento; C representa uma citotoxina ou fármaco; X representa uma unidade alifática, aromática ou heterocíclica ligada ao agente de ligação a células por meio de uma ligação de tioéter, uma ligação de amida, uma ligação de carbamato, ou uma ligação de éter; Y representa uma unidade alifática, aromática ou heterocíclica ligada a um fármaco por meio de uma ligação covalente selecionada do grupo que consiste em uma ligação de tioéter, uma ligação de amida, uma ligação de carbamato, uma ligação de éter, uma ligação de amina, uma ligação carbono-carbono e uma ligação de hidrazona; l é 0 ou 1; p é 0 ou 1; m é um inteiro de 2 a 15; e n é um inteiro de 1 a 2000.
[000180] Em uma determinada modalidade, m é um inteiro de 2 a 8; e n é um número inteiro de 1 a 24
[000181] Em uma determinada modalidade, m é um inteiro de 2 a 6.
[000182] Em uma determinada modalidade, n é um inteiro de 2 a 8.
[000183] Em uma determinada modalidade, m é um número inteiro a partir de 3 a 5. Em uma determinada modalidade, o anticorpo é huMovl 9. Em outra modalidade, o anticorpo é FR-1-21. Em outra modalidade, o anticorpo é FR-1 -48. Em outra modalidade, o anticorpo é FR-1-49. Em outra modalidade, o anticorpo é FR-1-57. Em outra modalidade, o anticorpo é FR-1-65. Exemplos de ligantes contendo PEG incluem ligantes com uma fração de éster de N-succinimidila ou éster de N- sulfossuccinimidil para reação com o anticorpo anti-FOLR1 ou um fragmento do mesmo, assim como uma fração à base de maleimido- ou haloacetil para reação com o composto. Um espaçador de PEG pode ser incorporado em qualquer reticulador conhecido na técnica com os métodos aqui descritos.
[000184] Muitos dos ligantes aqui divulgados são descritos em detalhe nas Publicações de Patente US 20050169933 e 20090274713, e no WO2009/0134976, os conteúdos das quais sendo aqui incorporados integralmente por referência.
[000185] A presente invenção inclui aspectos em que cerca de 2 a cerca de 8 moléculas de fármacos ("carga de fármacos"), por exemplo, maitansinoide, são ligadas a um anticorpo anti-FOLR1 ou um fragmento do mesmo, o efeito antitumor do conjugado é muito mais eficaz em comparação com uma carga de fármaco de um número menor ou ligados ao mesmo agente de ligação a células. A "carga de fármacos", tal como aqui usado, refere-se ao número de moléculas de fármaco (por exemplo, um maitansinoide) que pode ser ligado a um agente de ligação a células (por exemplo, um anticorpo anti-FOLR1 ou um fragmento do mesmo). Em um aspecto, o número de moléculas de fármaco que podem ser ligadas a um agente de ligação a células pode variar de cerca de 2 a cerca de 8 (por exemplo, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1). Em determinadas modalidades, a fármaco é N2-deacetil- N2'-(3-mercapto-1-oxopropil)- maitansina (DM1) ou N2'-deacetil- N2'-(4-mercapto-4-metii-i-oxopentii) maitansina (DM4). Assim, em uma determinada modalidade, o anticorpo huMov19 é conjugado à DM1 ou DM4. Em outra modalidade, o anticorpo FR-1-21 é conjugado à DM1 ou DM4. Em outra modalidade, o anticorpo FR-1-48 é conjugado à DM1 ou DM4. Em outra modalidade, o anticorpo FR-1-49 é conjugado à DM1 ou DM4. Em outra modalidade, o anticorpo FR-1-57 é conjugado à DM1 ou DM4. Em outra modalidade, o anticorpo FR-1-65 é conjugado à DM1 ou DM4.
[000186] Assim, em um aspecto, um imunocongugado compreende um maitansinoide por anticorpo. Em outro aspecto, um imunocongugado compreende 2 maitansinoides por anticorpo. Em outro aspecto, um imunocongugado compreende 3 maitansinoides por anticorpo. Em outro aspecto, um imunocongugado compreende 4 maitansinoides por anticorpo. Em outro aspecto, um imunocongugado compreende 5 maitansinoides por anticorpo. Em outro aspecto, um imunocongugado compreende 6 maitansinoides por anticorpo. Em outro aspecto, um imunocongugado compreende 7 maitansinoides por anticorpo. Em outro aspecto, um imunocongugado compreende 8 maitansinoides por anticorpo.
[000187] Em um aspecto, um imunoconjugado compreende cerca de 1 a cerca de 8 maitansinoides por anticorpo. Em outro aspecto, um imunoconjugado compreende cerca de 2 a cerca de 7 maitansinoides por anticorpo. Em outro aspecto, um imunoconjugado compreende cerca de 2 a cerca de 6 maitansinoides por anticorpo. Em outro aspecto, um imunoconjugado compreende cerca de 2 a cerca de 5 maitansinoides por anticorpo. Em outro aspecto, um imunoconjugado compreende cerca de 3 a cerca de 5 maitansinoides por anticorpo. Em outro aspecto, um imunoconjugado compreende cerca de 3 a cerca de 4 maitansinoides por anticorpo.
[000188] Em um aspecto, uma composição compreendendo imunoconjugados tem uma média de cerca de 2 a cerca de 8 (por exemplo, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2 , 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7 , 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1) moléculas da fármaco (por exemplo, maitansinoides) ligado por anticorpos. Em um aspecto, uma composição compreendendo imunoconjugados tem uma média de cerca de 1 a cerca de 8 moléculas de fármaco (por exemplo, maitansinoides) por anticorpo. Em um aspecto, uma composição compreendendo imunoconjugados tem uma média de cerca de 2 a cerca de 7 moléculas de fármaco (por exemplo, maitansinoides) por anticorpo. Em um aspecto, uma composição compreendendo imunoconjugados tem uma média de cerca de 2 a cerca de 6 moléculas de fármaco (por exemplo, maitansinoides) por anticorpo. Em um aspecto, uma composição compreendendo imunoconjugados tem uma média de cerca de 2 a cerca de 5 moléculas de fármaco (por exemplo, maitansinoides) por anticorpo. Em um aspecto, uma composição compreendendo imunoconjugados tem uma média de cerca de 3 a cerca de 5 moléculas de fármaco (por exemplo, maitansinoides) por anticorpo. Em um aspecto, uma composição compreendendo imunoconjugados tem uma média de cerca de 3 a cerca de 4 moléculas de fármaco (por exemplo, maitansinoides) por anticorpo. Em um aspecto, uma composição compreendendo imunoconjugados tem uma média de cerca de 3,5 a cerca de 4 moléculas de fármaco (por exemplo, maitansinoides) por anticorpo.
[000189] Em um aspecto, uma composição compreendendo imunoconjugados tem uma média de cerca de 2 ± 0,5, cerca de 2,5 ± 0,5, cerca de 3 ± 0,5, cerca de 3,5 ± 0,5, cerca de 4 ± 0,5, cerca de 4,5 ± 0,5, cerca de 5 ± 0,5, cerca de 5,5 ± 0,5, cerca de 6 ± 0,5, cerca de 6,5 ± 0,5, cerca de 7 ± 0,5, cerca de 7,5 ± 0,5, ou cerca de 8 ± 0,5 moléculas de fármaco (por exemplo, maitansinoides) ligadas por anticorpo. Em um aspecto, uma composição compreendendo imunoconjugados tem uma média de cerca de 3,5 ± 0,5 moléculas de fármaco (por exemplo, maitansinoides) por anticorpo.
[000190] O anticorpo anti-FOLR1 ou um fragmento do mesmo pode ser modificado por meio de reação de um reagente de reticulação bifuncional com o anticorpo anti-FOLR1 ou um fragmento do mesmo, resultando assim na fixação covalente de uma molécula de ligante ao anticorpo anti-FOLR1 ou um fragmento do mesmo. Tal como usado aqui, um "reagente de reticulação bifuncional" é qualquer fração química que liga covalentemente um agente de ligação a células para um fármaco, tal como os fármacos aqui descritos. Em um outro método, uma porção da fração de ligação é fornecida pelo fármaco. A este respeito, o medicamento compreende uma fração de ligação que faz parte de uma molécula de ligante maior que é usada para unir o agente de ligação a células com o fármaco. Por exemplo, para formar o DM1 maitansinoide, a cadeia lateral no grupo hidroxilo C-3 de maitansina é modificada para ter um grupo sulfidril livre (SH). Esta forma de tiolada de maitansina pode reagir com um agente de modificação de ligação celular para formar um conjugado. Assim, o ligante final é montado a partir de dois componentes, um dos quais sendo fornecido pelo reagente de reticulação, enquanto o outro é fornecido pela cadeia lateral de DM1.
[000191] As moléculas de fármaco podem também ser ligadas às moléculas de anticorpos através de uma molécula carreadora intermediária tal como albumina sérica.
[000192] Tal como usada aqui, a expressão "ligada a um agente de ligação a células" ou "ligada a um fragmento ou anticorpo anti-FOLR1" refere-se à molécula de conjugado compreendendo pelo menos um derivado de fármaco ligado a um fragmento ou anticorpo anti-FOLR1 de agente de ligação a células por meio de um grupo de ligação adequado, ou um precursor do mesmo. Em determinadas modalidades, o grupo de ligação é SMCC.
[000193] Em certas modalidades, os agentes citotóxicos úteis na presente invenção são maitansinoides e análogos de maitansinoide. Exemplos de maitansinoides adequados incluem ésteres de análogos de maitansinol e maitansinol. São incluídas todas as fármacos que inibem a formação de microtúbulos e que são altamente tóxicas para células de mamíferos, tal como os análogos de maitansinol e maitansinol.
[000194] Exemplos de ésteres de maitansinol adequados incluem os que têm um anel aromático modificado e aqueles que têm modificações em outras posições. Tais maitansinoides adequados são descritos nas Patentes US 4.424.219; 4.256.746; 4.294.757; 4.307.016; 4.313.946; 4.315.929; 4.331.598; 4.361.650; 4.362.663; 4.364.866; 4.450.254; 4.322.348; 4.371.533; 5.208.020; 5.416.064; 5.475.092; 5.585.499; 5.846.545; 6.333.410; 7.276.497 e 7.473.796.
[000195] Em uma determinada modalidade, os imunoconjugados da invenção utilizam o maitansinoide contendo tiol (DM1), anteriormente chamado de N2-deacetil- N2'-(3-mercapto-1-oxopropil)-maitansina, como o agente citotóxico. DM1 é representado pela fórmula estrutural a seguir (III):
Figure img0004
[000196] Em outra modalidade, os conjugados da presente invenção utilizam o maitansinoide contendo tiol N2'-deacetil- N2' (4-metil-4- mercapto-1- oxopentil)-maitansina (por exemplo, DM4) como o agente citotóxico. DM4 é representado pela fórmula estrutural a seguir (IV):
Figure img0005
[000197] Outro maitansinoide compreendendo uma cadeia lateral que contém uma ligação de tiol impedido estericamente é N2'-deacetil-N2'-(4- mercapto-1-oxopentil)-maitansina (chamado DM3), representado pela fórmula estrutural a seguir (V):
Figure img0006
[000198] Cada um dos maitansinoides ensinados nas Patentes US 5.208.020 e US 7.276.497, também podem ser usados no conjugado da presente invenção. A este respeito, a divulgação completa de 5.208.020 e 7.276.697 é aqui incorporada aqui por referência.
[000199] Muitas posições nos maitansinoides podem servir como a posição para ligar quimicamente a fração de ligação. Por exemplo, a posição C-3 tendo um grupo hidroxila, a posição C-14 modificada com hidroximetila, a posição C-15 modificada com hidróxi e a posição C-20 tendo um grupo hidróxi são todos esperados por serem úteis. Em determinadas modalidades, a posição C-3 é usada. Em determinadas modalidades, a posição C-3 de maitansinol é usada.
[000200] Representações estruturais de certos conjugados são mostradas abaixo:
Figure img0007
Figure img0008
Figure img0009
[000201] Em uma determinada modalidade, o anticorpo é huMovl 9. Em outra modalidade, o anticorpo é FR1-21.
[000202] Várias descrições para a produção de tais conjugados de anticorpos - maitansinoides são fornecidas nas Patentes US 6.333.410, 6.441.163, 6.716.821, e 7.368.565, cada uma das quais sendo aqui incorporada na sua totalidade.
[000203] Em geral, uma solução de anticorpo em tampão aquoso pode ser incubada com um excesso molar de maitansinoides tendo uma fração de dissulfeto portadora de um grupo reativo. A mistura reacional pode ser parada através da adição de excesso de amina (por exemplo, etanolamina, taurina, etc.) O conjugado de maitansinoide- anticorpo pode, então, ser purificado por filtração em gel. O número de moléculas de maitansinoide ligadas por molécula de anticorpo pode ser determinado medindo espectrofotometricamente a razão entre a absorbância a 252 nm e 280 nm. Uma média de 1 a 10 moléculas de maitansinoide / molécula de anticorpo é usada e uma média de 2 a 5 também é usada em determinadas modalidades. O número médio de moléculas de maitansinoide/anticorpo pode ser, por exemplo, cerca de 1 a 10, 2 a 5, 3 a 4, 3,5 a 4 ou 3,5. Em um aspecto, o número médio de moléculas de maitansinoide/anticorpo é cerca de 3,5 ± 0,5. Em um aspecto, o número médio de moléculas de maitansinoide/anticorpo é cerca de 3,5 a 4.
[000204] Os conjugados de anticorpos com fármacos de maitansinoide podem ser avaliados quanto à sua capacidade para suprimir a proliferação de várias linhagens de células indesejáveis in vitro. Por exemplo, as linhagens de células tais como a linhagem de células KB humanas, podem ser facilmente usadas para a avaliação da citotoxicidade destes compostos. As células a serem avaliadas podem ser expostas aos compostos durante 4 a 5 dias e as frações remanescentes de células medidas nos ensaios diretos por métodos conhecidos. Os valores de IC50 podem então ser calculados a partir dos resultados dos ensaios.
[000205] Compostos de benzodiazepina descritos, por exemplo, na Publicação do Pedido de Patente US. 2010/0203007 (por exemplo, indolinobenzodiazepinas ou oxazolidinobenzodiazepinas), derivados dos mesmos, intermediários dos mesmos, também podem ser usados para preparar o fragmento de anticorpo anti-FOLR1 ou conjugados.
[000206] Benzodiazepinas úteis incluem compostos de fórmula (XIV), (XV) e (XVI), nos quais os compostos de dímero opcionalmente portam um grupo de ligação que permite a ligação aos agentes de ligação de célula.
Figure img0010
[000207] em que a linha dupla -- entre N e C representa uma ligação única ou uma ligação dupla, visto que quando é uma ligação dupla X está ausente e Y é H, e quando é uma ligação única, X é H ou uma fração de proteção de amina que converte o composto em um profármaco;
[000208] Y é selecionado a partir de -OR, um éster representado por -OCOR', um carbonato representado por -OCOOR', um carbamato representado por -OCONR'R", uma amina ou uma hidroxil amina representada por NR'R", amida representada por -NRCOR', um peptídeo representado por NRCOP, em que P é um aminoácido ou um polipeptídeo contendo entre 2 a 20 unidades de aminoácido, um tioéter representado por SR', um sulfóxido representado por SOR', uma sulfona representada por -SO2R', um sulfito -SO3, um bissulfito - OSO3, um halogênio, ciano, um azido, ou um tiol, em que R, R' e R" são os mesmos ou diferentes e são selecionados a partir de H, alquila, alquenila ou alquinila substituída ou não substituída linear, ramificado ou cíclico tendo de 1 a 10 átomos de carbono, uma unidade de polietileno glicol (-OCH2CH2)n, em que n é um número inteiro a partir de 1 a 2000, arila tendo de 6 a 10 átomos de carbono, anel heterocíclico tendo de 3 a 10 átomos de carbono em que o substituinte é selecionado a partir de halogênio, OR7, NR8R9, NO2, NRCOR', SR10,um sulfóxido representado por SOR', uma sulfona representada por -SO2R', um sulfito -SO3, um bissulfito -OSO3, uma sulfonamida representada por SO2NRR', ciano, um azido, -CORn, OCORn ou OCONRnR12, em que as definições de R7, Rg, R9, R10, R11 e R12 são dadas acima, opcionalmente R" é OH; W é CO, C=S, CH2, BH, SO ou SO2;
[000209] R1, R2, R3, R4, R1', R2', R3' e R4' são, cada um, independentemente selecionados a partir de H, alquila, alquenila ou alquinila substituída ou não substituída linear, ramificado ou cíclico tendo de 1 a 10 átomos de carbono, a unidade de polietileno glicol (- OCH2CH2)n, em que n é um número inteiro a partir de 1 a 2000, ou um substituinte selecionado a partri de um halogênio, guanidinio [- NH(C=NH)NH2], OR-, NR8R9, NO2, NRCOR', SR10,um sulfóxido representado por SOR', uma sulfona representada por -SO2R', um sulfito -SO3, um bissulfito -OSO3, uma sulfonamida representada por SO2NRR', ciano, um azido, -COR11, OCOR11 ou OCONR11R12 em que R7, R8, R9, R10, R11 e R12 são, cada um, independentemente selecionados a partir de H, alquila, alquenila ou alquinila linear, ramificada ou cíclica tendo de 1 a 10 átomos de carbono, a unidade de polietileno glicol (-OCH2CH2)n, em que n é um número inteiro a partir de 1 a 2000, arila tendo de 6 a 10 átomos de carbono, anel heterocíclico tendo de 3 a 10 átomos de carbono, opcionalmente R10 é SR13 ou COR13 , em que R13 é selecionado a partir de alquila, alquenila ou alquinila linear, ramificada ou cíclica tendo de 1 a 10 átomos de carbono, a unidade de polietileno glicol (-OCH2CH2)n, em que n é um número inteiro a partir de 1 a 2000, arila tendo de 6 a 10 átomos de carbono, anel heterocíclico tendo de 3 a 10 átomos de carbono, opcionalmente R11 é OR14, em que R14 tem a mesma definição que R, opcionalmente, qualquer um de R1, R2, R3, R4, R1', R2', R3' , ou R/j' é um grupo de ligação que permite a ligação a um agente de ligação de célula através de uma ligação covalente ou é selecionado a partir de uma unidade de polipirrol, poli-indolila, poli- imidazolila, polipirol-imidazolila, poli-pirol-indolila ou poliimidazol-indolil opcionalmente carregando um grupo de ligação que permite a ligação a um agente de ligação de célula;
[000210] Z é selecionado a partir de (CH2)n, em que n é 1, 2 ou 3, CR15R16, NR17, O ou S, em que R15, R16 e R17 são, cada um, independentemente selecionados a partir de H, alquila linear, ramificado ou cíclico tendo de 1 a 10 átomos de carbono, a unidade de polietileno glicol (-OCH2CH2)n, em que n é um número inteiro a partir de 1 a 2000;
[000211] R6 é OR, SR ou NRR', em que R e R' tem a mesma definição como dado acima;
[000212] X' é selecionado a partir de CH2, NR, CO, BH, SO ou SO2 em que R tem a mesma definiçao que a dada acima;
[000213] Y' é O, CH2, NR ou S, em que R tem a mesma definição que a dada acima;
[000214] Z' é CH2 ou (CH2)n, em que n é 2, 3 ou 4, visto que X', Y" e /,' não são todos CH2 ao mesmo tempo;
[000215] A e A' são os mesmo ou diferentes e são selecionados a partir de O, -CRR'O, S, -CRR'S, -NR15 ou CRR'NHR15, em que R e R' tem a mesma definição como dada acima e em que R15 tem a mesma definiçao que a dada acima para R;
[000216] D e D' são os mesmos ou diferentes e independentemente selecionados de alquila, alquenila ou alquinila linear, ramificada ou cíclica tendo 1 a 10 átomos de carbono, opcionalmente substituído com qualquer um dentre halogênio, OR7, NR8R9, NO2, NRCOR', SR10,um sulfóxido representado por SOR', uma sulfona representada por -SO2R', um sulfito -SO3, um bissulfito -OSO3, uma sulfonamida representada por SO2NRR', ciano, um azido, -COR11, OCOR11 ou OCONR11R12, em que as definições de R7, R8, R9, R10, R11 e R12 são dadas acima, a unidade de polietileno glicol (-OCH2CH2)n, em que n é um número inteiro a partir de 1 a 2000; L é um grupo fenila opcional ou um anel heterociclo tendo de 3 a 10 átomos de carbono que é opcionalmente substituído, em que o substituinte é um grupo de ligação que permite a ligação a um agente de ligação de célula através de uma ligação covalente, ou é selecionado a partir de alquila, alquenila ou alquinila linear, ramificada ou cíclica tendo de 1 a 10 átomos de carbono, opcionalmente substituído com qualquer um dentre halogênio, OR7, NR8R9, NO2, NRCOR". SR10,um sulfóxido representado por SOR". Uma sulfona representada por -SO2R', um sulfito -SO3, um bissulfito -OSO3, uma sulfonamida representada por SO2NRR', ciano, um azido, -CORn, OCOR11 ou OCONR11R12, em que as definições de R7, R8, R9, R10, R11 e R12 são dadas acima, a unidade de polietileno glicol (-OCH2CH2)n, em que n é um número inteiro a partir de 1 a 2000; opcionalmente, L por si só é um grupo de ligação que permite a ligação a um agente de ligação de célula através de uma ligação covalente; ou seus solvatos farmaceuticamente aceitáveis, sais, hidratos ou sais hidratados, seus isômeros óticos, racematos, diastereômeros, enantiômeros ou as estruturas cristalinas polimórficas destes compostos; visto que o composto tem não mais de um grupo de ligação que permite a ligação a um agente de ligação de célula através da ligação covalente.
[000217] Em um aspecto, a linha dupla “ entre N e C representa uma ligação única ou uma ligação dupla, visto que quando é uma ligação dupla X está ausente e Y é H, e quando é uma ligação única, X é H ou um grupo de proteção de amina que converte o composto em uma profármaco;
[000218] Y é selecionado a partir de -OR, NR'R", um sulfito -SO3, ou um bissulfito -OSO3, em que R é selecionado a partir de H, alquila, alquenila ou alquinila linear, ramificada ou cíclica tendo de 1 a 10 átomos de carbono, a unidade de polietileno glicol (-OCH2CH2)n, em que n é um número inteiro a partir de 1 a 2000, arila tendo de 6 a 10 átomos de carbono, anel heterocíclico tendo de 3 a 10 átomos de carbono;
[000219] W é C=O, CH2 ou SO2;
[000220] R1, R2, R3, R4, R1', R2', R3' e R4' são, cada um, independentemente selecionados a partir de H, NO2 ou um grupo de ligação que permite a ligação a um agente de ligação de célula via a ligação covalente;
[000221] R6 é OR18, em que R18 tem a mesma definição que R;
[000222] Z é selecionado a partir de (CH2)n, em que n é 1, 2 ou 3, CR15R16, NR17, O ou S, em que R15, R16 e R17 são, cada um, independentemente selecionados a partir de H, alquila linear, ramificado ou cíclico tendo de 1 a 10 átomos de carbono, a unidade de polietileno glicol (-OCH2CH2)n, em que n é um número inteiro a partir de 1 a 2000;
[000223] X' é selecionado a partir de CH2, ou C=O;
[000224] Y' é O, NR, ou S, em que R é definido como acima;
[000225] Z' é CH2 ou (CH2)2;
[000226] A e A' são cada O;
[000227] D e D' são os mesmos ou diferentes e independentemente selecionados de alquila, alquenila ou alquinila linear, ramificada ou cíclica tendo de 1 a 10 átomos de carbono;
[000228] L é um grupo fenila opcional ou um anel heterociclo tendo de 3 a 10 átomos de carbono que é opcionalmente substituído, em que o substituinte é um grupo de ligação que permite a ligação a um agente de ligação de célula através da ligação covalente, ou é selecionado a partir de alquila, alquenila ou alquinila linear, ramificada ou cíclica tendo de 1 a 10 átomos de carbono, opcionalmente substituído com qualquer um dentre halogênio, OR7, NR8R9, NO2, NRCOR', SR10, um sulfóxido representado por SOR', uma sulfona representada por -SO2R', um sulfito -SO3, um bissulfito -OSO3, uma sulfonamida representada por SO2NRR', ciano, um azido, -COR11, OCOR11 ou OCONR11R12, a unidade de polietileno glicol (-OCH2CH2)n, em que n é um número inteiro a partir de 1 a 2000; opcionalmente, o próprio L é um grupo de ligação que permite a ligação a um agente de ligação de célula através da ligação covalente; ou seus solvatos farmaceuticamente aceitáveis, sais, hidratos ou sais hidratados, seus isômeros óticos, racematos, diastereômeros, enantiômeros ou as estruturas cristalinas polimórficas destes compostos.
[000229] Em outro aspecto o composto é representado pela fórmula (XVII):
Figure img0011
[000230] em que a linha dupla entre N e C representa uma ligação única ou uma ligação dupla, visto que quando é uma ligação dupla X está ausente e Y é H, e quando é uma ligação única, X é H ou uma grupo de proteção de amina que converte o composto em um profármaco, e Y é selecionado a partir de OH, um éter representado por -OR, um sulfito -SO3, ou um bissulfito -OSO3, em que R é selecionado a partir de alquila, alquenila ou alquinila linear, ramificada ou cíclica carregando de 1 a 10 átomos de carbono um de R2, R3 é um grupo de ligação que permite a ligação a um agente de ligação de célula através da ligação covalente e o outro é H, um de L', L" ou L'" é um grupo de ligação que permite a ligação a um agente de ligação de célula, enquanto os outros são H; L' podem ser o grupo de ligação e G é CH ou N. Outros exemplos são descritos no Pedido de Patente US. No. 61/150.201, o teor inteiro do qual é incorporado aqui a título de referência. Assim, em uma determinada modalidade, o anticorpo huMovl 9 é conjugado a um benzodiazepeno tendo uma estrutura mostrada em XIX-XXII acima. Em outra modalidade, o anticorpo FR-1- 21 é conjugado a um benzodiazepeno tendo uma estrutura mostrada em XIX-XXII acima. IV. Polinucleotídeos
[000231] Em certas modalidades, a invenção engloba polinucleotídeos compreendendo polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo que se liga especificamente ao receptor FOLR1 humano ou um fragmento de tal polipeptídeo. Por exemplo, a invenção fornece um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um anticorpo para um FOLR1 humano ou codifica um fragmento de tal anticorpo. Os polinucleotídeos da invenção podem estar na forma de RNA ou na forma de DNA. O DNA inclui cDNA, DNA genômico, e DNA sintético; e pode ser de fita dupla ou de fita única e, se de fita única, pode ser a fita codificadora ou fita não codificadora (antissenso).
[000232] Em certas modalidades, os polinucleotídeos são isolados. Em certas modalidades, os polinucleotídeos são substancialmente puros.
[000233] A presente invenção fornece um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs:4, 10, 11, 41, 42 e 88 a 103. Também é fornecido um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%>, ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência para SEQ ID NOs: 4, 10, 11, 41, 42, e 88 a 103.
[000234] Os polinucleotídeos SEQ ID NOs: 5, 14, e 15 compreendem a sequência de codificação para huMov19 de cadeia pesada de domínio variável, de cadeia leve de domínio variável versão 1.00, e de cadeia leve de domínio variável versão 1.60, respectivamente.
[000235] A invenção ainda fornece um polinucleotídeo compreendendo uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:5, 14, 15, 37, 38, 43, 44, 47, 48, e 120-127. Também é fornecido um polinucleotídeo tendo pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência a SEQ ID NOs: 5, 14, 15, 37, 38, 43, 44, 47, 48, e 120-127. Assim, em determinadas modalidades, o polinucleotídeo compreende (a) um polinucleotídeo tendo pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência a SEQ ID NO:5, e/ou (b) um polinucleotídeo tendo pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência a SEQ ID NO: 14 ou 15. Em determinadas modalidades, o polinucleotídeo compreende (a) um polinucleotídeo tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 5; e/ou (b) um polinucleotídeo tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 15.
[000236] Em certas modalidades o polinucleotídeo compreende a sequência de codificação para o polipeptídeo maduro fundida na mesma estrutura de leitura a um polinucleotídeo que auxilia, por exemplo, na expressão e secreção de um polipeptídeo a partir de uma célula hospedeira (por exemplo a uma sequência líder que funciona como uma sequência secretora para controlar o transporte de um polipeptídeo a partir da célula). O polipeptídeo que possui uma sequência líder é uma pré-proteina e pode ter a sequência líder clivada pela célula hospedeira para formar a forma madura do polipeptídeo. Os polinucleotídeos podem também codificar uma pró-proteina que é a proteína madura e resíduos de aminoácidos 5' adicionais. Uma proteína madura com uma pró-sequência é uma pró-proteína e é uma forma inativa da proteína. Uma vez que a pró-sequência é clivada uma proteína madura ativa permanece.
[000237] Em certas modalidades os polinucleotídeos compreendem uma sequência de codificação para o polipeptídeo maduro fundida na mesma estrutura de leitura a uma sequência marcadora, que permite, por exemplo, a purificação do polipeptídeo codificado. Por exemplo, a sequência marcadora pode ser um tag de hexa-histidina fornecido por um vetor pQE-9 para permitir a purificação do polipeptídeo maduro fundido com o marcador no caso de um hospedeiro bacteriano, uo a sequência marcadora pode ser um tag de hemaglutinina (HA ) derivado da proteína hemaglutinina da influenza, quando um hospedeiro mamífero (por exemplo, células COS-7) é usado.
[000238] A presente invenção diz respeito ainda às variantes dos polinucleotídeos descritas aqui anteriormente que codificam, por exemplo, fragmentos, análogos, e derivados.
[000239] As variantes de polinucleotídeos podem conter alterações nas regiões codificadoras, regiões não codificadoras, ou ambas. Em algumas modalidades as variantes de polinucleotídeos contêm alterações que produzem substituições, adições, ou deleções silenciosas, mas não alteram as propriedades ou ativities do polipeptídeo codificado. Em algumas modalidades, as variantes de nucleotídeos são produzidas por substituições silenciosas, devido à degenerescência do código genético. As variantes de polinucleotídeos podem ser produzidas por uma variedade de razões, por exemplo, para otimizar a expressão de códons para um hospedeiro particular (mudança de códons no RNAm humano para os preferidos por um hospedeiro bacteriano tal como E. coli).
[000240] Os vetores e células que compreendem os polinucleotídeos aqui descritos são também fornecidos.
V. Métodos de Uso e Composições Farmacêuticas
[000241] Os agentes de ligação a FOLR1 (incluindo anticorpos, imunoconjugados e polipeptídeos) da presente invenção são úteis em uma variedade de aplicações, incluindo, mas não limitado a, métodos de tratamento terapêutico, tais como o tratamento de câncer, tais como malignidades de células-B. Em certas modalidades, os agentes são úteis para inibir o crescimento do tumor, induzindo diferenciação, reduzindo o volume do tumor, e/ou reduzindo a tumorigenicidade de um tumor. Os modos de uso podem ser métodos, in vitro, ex vivo, ou in vivo. Em certas modalidades, o agente de ligação a FOLR1 ou anticorpo ou imunoconjugado, ou polipeptídeo é um antagonista de FOLR1 humano ao qual o mesmo se liga.
[000242] Em um aspecto, anticorpos e imunoconjugados anti-FOLR1 da invenção são úteis para detectar a presença de FOLR1 em uma amostra biológica. O termo "detecção" tal como usado aqui engloba a detecção quantitativa ou qualitativa. Em certas modalidades, uma amostra biológica compreende uma célula ou tecido. Em certas modalidades, tais tecidos incluem tecidos cancerosos e/ou normais que expressam FOLR1 em níveis mais elevados relativamente a outros tecidos. Em determinadas modalidades, a superexpressão de FOLR1 detecta a presença do câncer ovariano, câncer de pulmão, câncer de cérebro, câncer de mama, câncer uterino, câncer renal ou câncer pancreático.
[000243] Em um aspecto, a invenção fornece um método para detectar a presença de FOLR1 em uma amostra biológica. Em certas modalidades, o método compreende contatar a amostra biológica com um anticorpo anti-FOLR1 em condições permissivas para a ligação do anticorpo anti-FOLR1 a FOLR1, e detectar se um complexo é formado entre o anticorpo anti-FOLR1 e FOLR1.
[000244] Em um aspecto, a invenção fornece um método para diagnosticar um distúrbio associado a uma expressão aumentada de FOLR1. Em certas modalidades, o método compreende o contato de uma célula de teste com um anticorpo anti-FOLR1, determinando o nível de expressão (quantitativa ou qualitativamente) de FOLR1 pelas células de teste através da detecção da ligação do anticorpo anti- FOLR1 a FOLR1, e comparando-se o nível de expressão de FOLR1 por célula de teste com o nível de expressão de FOLR1 por uma célula de controle (por exemplo, uma célula normal do mesmo tecido de origem que a célula de teste, ou uma célula que expressa FOLR1 em níveis comparáveis aos de uma tal célula normal) , em que um nível mais elevado de expressão de FOLR1 pela célula de teste, em comparação com a célula de controle indica a presença de um distúrbio associado com aumento da expressão de FOLR1. Em certas modalidades, a célula de teste é obtida a partir de um sujeito suspeito de ter um distúrbio associado com a expressão aumentada de FOLR1. Em certas modalidades, o distúrbio é um distúrbio da proliferação celular, tal como um câncer ou um tumor.
[000245] Em certas modalidades, um método de diagnóstico ou detecção, tais como os descritos acima, compreende a detecção de ligação de um anticorpo anti-FOLR1 a FOLR1 expressa sobre a superfície de uma célula ou em uma preparação de membrana obtida a partir de uma célula que expressa FOLR1 na sua superfície. Em certas modalidades, o método compreende contatar uma célula com um anticorpo anti-FOLR1 em condições permissivas para a ligação do anticorpo anti-FOLR1 a FOLR1, e detectar se um complexo é formado entre o anticorpo anti-FOLR1 e FOLR1 na superfície celular. Um ensaio exemplar para detectar a ligação de um anticorpo anti-FOLR1 a FOLR1 expresso sobre a superfície de uma célula é um ensaio de "FACS".
[000246] Alguns outros métodos podem ser usados para detectar a ligação de anticorpos anti-FOLR1 para FOLR1. Tais métodos incluem, mas não estão limitados a, ensaios de ligação ao antígeno, que são bem conhecidos na técnica, tais como western blots, radioimunoensaios, ELISA (ensaio de imunoabsorção de ligação a enzima), imunoensaios tipo "sanduiche", ensaios de imunoprecipitação, imunoensaios fluorescentes, imunoensaios de proteína A, e imuno-histoquímica (IHQ).
[000247] Em certas modalidades, os anticorpos anti-FOLR1 são marcados. Os marcadores incluem, mas não estão limitadas a, marcadores ou frações que são detectadas diretamente (por exemplo, marcadores fluorescentes, cromóforos, elétrons-densos, quimioluminescentes, e radioativos), assim como frações, tais como enzimas ou ligantes, que são detectados indiretamente, por exemplo, por meio de uma reação enzimática ou interação molecular.
[000248] Em certas modalidades, os anticorpos anti-FOLR1 são imobilizados em uma matriz insolúvel. Imobilização envolve a separação do anticorpo anti-FOLR1 a partir de qualquer FOLR1 que permanece livre na solução. Isto é realizado convencionalmente quer por insolubilização do anticorpo anti-FOLR1 antes do procedimento de ensaio, tal como por adsorção a uma matriz insolúvel em água ou superfície (Bennich et al., Patente US 3.720.760), ou por acoplamento covalente (por exemplo, usando reticulação com glutaraldeído), ou por insolubilização do anticorpo anti-FOLR1 após a formação de um complexo entre o anticorpo anti-FOLR1 e FOLR1, por exemplo, por imunoprecipitação.
[000249] Qualquer uma das modalidades acima de diagnóstico ou detecção pode ser realizada utilizando um imunoconjugado da invenção em vez de, ou além de, um anticorpo anti-FOLR1.
[000250] Em certas modalidades, a doença tratada com o agente de ligação a FOLR1 ou antagonista (por exemplo, um anticorpo huMov19 ou imunoconjugado) é um câncer. Em certas modalidades, o câncer caracteriza-se por tumores que expressam o receptor de folato 1 ao qual o agente de ligação a FOLR1 (por exemplo, anticorpo) se liga.
[000251] A presente invenção fornece métodos de tratamento de câncer, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de ligação a FOLR1 a um sujeito (por exemplo, um sujeito em necessidade de tratamento). Em determinadas modalidades, o câncer é um câncer selecionado do grupo consistindo em câncer colorretal, câncer de pâncreas, câncer de pulmão, câncer de ovário, câncer de fígado, câncer de mama, câncer de cérebro, câncer de rim, câncer de próstata, câncer gastrointestinal, melanoma, câncer cervical, câncer de bexiga, glioblastoma, câncer de pescoço e cabeça. Em determinadas modalidades, o câncer é câncer de ovário. Em determinadas modalidades, o câncer é câncer de pulmão. Em determinadas modalidades, o sujeito é um humano.
[000252] A presente invenção fornece ainda métodos para a inibição do crescimento tumoral utilizando os anticorpos ou outros agentes descritos aqui. Em certas modalidades, o método para inibir o crescimento do tumor compreende o contato da célula com um agente de ligação a FOLR1 (por exemplo, anticorpo) in vitro. Por exemplo, uma linhagem de células imortalizada ou uma linhagem de células de câncer que expressa FOLR1 é cultivada no meio ao qual se adiciona o anticorpo ou outro agente para inibir o crescimento do tumor. Em algumas modalidades, as células de tumor são isoladas a partir de uma amostra do paciente, tais como, por exemplo, um tecido de biopsia, derrame pleural, ou amostra de sangue, e cultivados em meio ao qual é adicionado um agente de ligação a FOLR1 para inibir o crescimento do tumor.
[000253] Em algumas modalidades, o método para inibir o crescimento do tumor consiste em contatar as células do tumor ou tumor com o agente de ligação a FOLR1 (por exemplo, anticorpo) in vivo. Em certas modalidades, o contato de uma célula tumoral ou tumor com um agente de ligação a FOLR1 é realizado em um modelo animal. Por exemplo, os agentes de ligação a FOLR1 podem ser administrados para xenoenxertos que expressam um ou mais FOLR1s que foram crescidos em camundongos imunocomprometidos (por exemplo, NOD/SCID) para inibir o crescimento do tumor. Em algumas modalidades, as células-tronco de câncer são isoladas a partir de uma amostra do paciente, tais como, por exemplo, um tecido de biopsia, derrame pleural, ou amostra de sangue e injetadas em camundongos imunocomprometidos que são, então, administrados com um agente de ligação a FOLR1 para inibir o crescimento de células de tumor. Em algumas modalidades, o agente de ligação a FOLR1 é administrado ao mesmo tempo ou pouco depois da introdução de células de tumor dentro do animal para impedir o crescimento do tumor. Em algumas modalidades, o agente de ligação a FOLR1 é administrado como um agente terapêutico após as células de tumor terem crescido a um tamanho especificado.
[000254] Em certas modalidades, o método de inibição do crescimento tumoral compreende a administração a um sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de ligação a FOLR1. Em certas modalidades, o sujeito é um humano. Em certas modalidades, o sujeito tem um tumor ou teve um tumor removido.
[000255] Em certas modalidades, o tumor expressa o receptor de folato para o qual o agente de ligação a FOLR1 ou o anticorpo se liga. Em certas modalidades, o tumor superexpressa o FOLR1 humano.
[000256] Em certas modalidades, o tumor é um tumor selecionado a partir do grupo consistindo em tumor de cérebro, tumor coloretal, tumor de pâncreas, tumor de pulmão, tumor de ovário, tumor de fígado, tumor de mama, tumor de rim, tumor da próstata, tumor gastrointestinal, melanoma, tumor cervical, tumor de bexiga, glioblastoma, tumor de pescoço e cabeça. Em determinadas modalidades, o tumor é um tumor de ovário.
[000257] Além disso, a invenção fornece um método de redução da tumorigenicidade de um tumor em um sujeito, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de ligação a FOLR1 ao sujeito. Em certas modalidades, o tumor compreende células-tronco cancerosas. Em certas modalidades, a frequência de células-tronco cancerosas no tumor é reduzida pela administração do agente.
[000258] Assim, em determinadas modalidades a invenção fornece métodos para tratar o câncer usando o anticorpo huMov19 e imunoconjugados. Em determinadas modalidades, o imunoconjugado de huMovl9 é huMovl 9-SPDB-DM4; huMov19-sul ib-SPP-DM 1 ; huMov l 9-SPP-DM l ; ou huMov 19-PEG4-Mal-DM4.
[000259] A invenção fornece ainda métodos de diferenciação das células tumorigênicas em células não tumorigênicas compreendendo o contato das células tumorigênicas com um agente de ligação a FOLR1 (por exemplo, através da administração do agente de ligação a FOLR1 a um sujeito que tem um tumor compreendendo as células tumorigênicas ou que tenha tido tal tumor removido). Em determinadas modalidades, as células tumorigênicas são células do tumor de ovário.
[000260] A presente invenção fornece ainda métodos para reduzir a ativação de miofibroblasto no estroma de um tumor sólido, compreendendo o contato do estroma com uma quantidade eficaz do agente de ligação ao FOLR1, polipeptídeo ou anticorpo.
[000261] A presente invenção fornece ainda composições farmacêuticas compreendendo um ou mais dos agentes de ligação a FOLR1 aqui descritos. Em certas modalidades, as composições farmacêuticas compreendem ainda um veículo farmaceuticamente aceitável. Estas composições farmacêuticas encontram uso na inibição do crescimento tumoral e no tratamento de câncer em pacientes humanos.
[000262] Em certas modalidades, as formulações são preparadas para armazenamento e uso pela combinação de um anticorpo ou um agente purificado da presente invenção com um veículo farmaceuticamente aceitável (por exemplo, carreador, excipiente) (Remington, The Science e Practice of Pharmacy 20a Edição, Editora Mack, 2000). Os veículos f armaceuticamente aceitáveis adequados incluem, mas não estão limitados a, tampões não tóxicos, tais como de fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; sais tais como cloreto de sódio; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (por exemplo, cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, butila ou benzil álcoois; alquil parabenos tais como metila ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol, 3-pentanol, e m- cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (por exemplo, menos do que cerca de 10 resíduos de aminoácidos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas, polímeros hidrófilos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; carboidratos, tais como monossacarídeos, dissacáridos, glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contraíons formadores de sais tais como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos de Zn-proteína), e surfactantes não iônicos, tais como TWEEN ou polietilenoglicol (PEG).
[000263] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas em qualquer número de formas para o tratamento local ou sistêmico. A administração pode ser tópica (por exemplo, para as membranas da mucosa, incluindo a distribuição vaginal e retal) tal como adesivos transdérmicos, unguentos, loções, cremes, géis, gotas, supositórios, sprays, líquidos e pós; pulmonar (por exemplo, por inalação ou por insuflação de pó ou aerossóis, incluindo por nebulizador; intratraqueal, intranasal, transdérmica e epidérmica), por via oral, ou parenteral, incluindo injeção ou infusão intravenosa, intra-arterial, subcutânea, intraperitoneal ou intramuscular, ou administração intracraniana (por exemplo, intratecal ou intraventricular).
[000264] Um anticorpo ou imunoconjugado da invenção pode ser combinado em uma formulação de combinação farmacêutica, ou regime de dosagem como terapia de combinação com um segundo composto tendo as propriedades anticancerígenas. O segundo composto da formulação ou regime de dosagem de combinação farmacêutica pode ter atividades complementares a ADC da combinação de tal forma que eles não afetem adversamente uns aos outros. As composições farmacêuticas que compreendem o agente de ligação a FOLR1 e o segundo agente anticâncer são também fornecidas.
[000265] Para o tratamento da doença, a dosagem apropriada de um anticorpo ou um agente da presente invenção depende do tipo de doença a ser tratada, da gravidade e curso da doença, da capacidade de resposta da doença, se o anticorpo ou agente é administrado para fins terapêuticos ou preventivos, da terapia anterior, da história clínica do paciente, e assim por diante, tudo a critério do médico assistente. O anticorpo ou agente pode ser administrado uma vez ou durante uma série de tratamentos com duração de alguns dias a vários meses, ou até que a cura seja efetuada, ou uma diminuição do estado de doença seja conseguida (por exemplo, redução do tamanho do tumor). Esquemas de dosagens ótimas podem ser calculados a partir de medições de acumulação da fármaco no corpo do paciente e irá variar de acordo com a potência relativa de um anticorpo ou agente individual. O médico que administra pode facilmente determinar as dosagens ideais, metodologias de dosagem e as taxas de repetições. Em certas modalidades, a dosagem é de 0,01 μg a 100 mg por kg de peso corporal, e pode ser dada uma vez ou mais diariamente, semanalmente, mensalmente ou anualmente. Em certas modalidades, o anticorpo ou outro agente de ligação a FOLR1 é administrado uma vez a cada duas semanas ou uma vez a cada três semanas. Em certas modalidades, a dosagem do anticorpo ou outro agente de ligação a FOLR1 é partir de cerca de 0,1 mg até cerca de 20 mg por kg de peso corporal. O médico assistente pode estimar as taxas de repetição de dosagem com base nos tempos de residência medidos e nas concentrações da fármaco nos fluidos ou tecidos corporais.
[000266] A terapia de combinação pode fornecer "sinergia" e provar ser "sinérgica", ou seja, o efeito conseguido quando os ingredientes ativos são usados em conjunto é maior do que a soma dos efeitos que resulta do uso dos compostos separadamente. Um efeito sinérgico pode ser atingido quando os ingredientes ativos são: (1) coformulados e administrados ou distribuídos simultaneamente em uma formulação de dosagem unitária combinada, (2) distribuídos por alternância ou em paralelo como formulações separadas, ou (3) por algum outro regime. Quando distribuídos em terapia alternada, um efeito sinérgico pode ser atingido quando os compostos são administrados ou distribuídos sequencialmente, por exemplo, por injeções diferentes em seringas separadas. Em geral, durante a terapia alternada, uma dosagem eficaz de cada ingrediente ativo é administrada sequencialmente, isto é, em série, ao passo que na terapia de combinação, as dosagens eficazes de dois ou mais ingredientes ativos são administradas em conjunto.
VI. Kits compreendendo agentes de ligação a FOLR1
[000267] A presente invenção fornece kits que compreendem os anticorpos, imunoconjugados ou outros agentes aqui descritos e que podem ser usados para realizar os métodos aqui descritos. Em certas modalidades, um kit compreende pelo menos um anticorpo contra receptor de folato 1 purificado em um ou mais recipientes. Em algumas modalidades, os kits contêm todos os componentes necessários e/ou suficientes para realizar um ensaio de detecção, incluindo todos os controles, instruções para a realização de ensaios, bem como qualquer software necessário para a análise e apresentação dos resultados. Um versado na técnica reconhecerá facilmente que os anticorpos, imunoconjugados ou outros agentes da presente invenção descritos podem ser facilmente incorporados em um dos formatos de kits estabelecidos que são bem conhecidos na técnica.
[000268] Além disso, são fornecidos kits que compreendem um agente de ligação a FOLR1 (por exemplo, um anticorpo FOLR1 de ligação), bem como um segundo agente anticâncer. Em certas modalidades, o segundo agente anticâncer é um agente quimioterapêutico (por exemplo, gencitabina ou irinotecano).
[000269] As modalidades da presente descrição podem ser ainda ser definidas por referência aos exemplos não limitativos seguintes, os quais descrevem em detalhe a preparação de certos anticorpos da presente divulgação e métodos para o uso dos anticorpos da presente divulgação. Será evidente para os versados na técnica que muitas modificações, tanto em materiais quanto nos métodos, podem ser praticadas sem se afastar do escopo da presente divulgação.
EXEMPLOS
[000270] Entende-se que os exemplos e modalidades aqui descritos são apenas para fins ilustrativos e que várias modificações ou mudanças à luz dos mesmos serão sugeridas aos versados na técnica e devem ser incluídas dentro do espírito e alcance deste documento.
Exemplo 1 Quimerização do anticorpo monoclonal de murino Mov19
[000271] As sequências de aminoácido de região variável para Movl 9 foram obtidas a partir do banco de dados NCBI (acessos CAA68253 para a cadeia leve (SEQ ID NO:24) e CAA68252 para a cadeia pesada (SEQ ID NO:23)) e depois o códon otimizado e sintetizado por Blue Heron Biotechnology. A região variável da cadeia leve foi clonada nos sítios EcoRI e BsiWI do plasmídeo pAbKZeo e a região variável da cadeia pesada foi clonada nos sítios Hindlll e Apal do plasmídeo pAbGlNeo.
Exemplo 2 Humanização de anticorpos monoclonais de murinos Mov19 e FR1-21
[000272] O anticorpo Mov19 foi humanizado seguindo os métodos de recomposição de superfície de estrutura descritos anteriormente (Roguska M. et. al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994 Feb; 91 :969-973) e (Roguska et al., Protein Eng. 9(10):895-904 (1996)). Em resumo, a acessibilidade média do solvente para cada resíduo de estrutura de região variável foi calculada usando estruturas de anticorpo dissolvidas relacionadas muito proximamente a partir do banco de dados PDB, e posições com mais de 30% de acessibilidade média foram marcadas como resíduos de superfície (Pedersen J.T. et. Al, J. Mol. Biol. 1994; 235: 959-973). A sequência de substituição de superfície humana foi selecionada pelo alinhamento das posições de superfície das sequências de anticorpo murino com as posições correspondentes das sequências de linhagem germinativa do anticorpo humano no banco de dados Kabat (Johnson, G. e Wu, T. T. (2001) Nucleic Acids Research, 29: 205-206). A superfície de região variável de cadeia leve humana mais homóloga (clone DPK19, IMGT local IGKV2D-30*01 para Mov19 e IMGT local IGKV1/OR2-0*01 para FR1-21) e a superfície de região variável de cadeia pesada humana mais homóloga (clone 8M27, IMGT local IGHV1 -69*08 para Mov19 e IMGT local IGHV5-51 *02 para FR1-21) foi selecionada para substituir as posições de superfície da estrutura de Mov19 murino, deixando as 6 CDRs (Tabela 1) inalteradas. As posições de superfície de Mov19 murino e humano e FR1-21 e resíduos são dados nas Figuras 1A-D.
Figure img0012
[000273] Nenhuma das mudanças de resíduo ocasionou questões para impactar as interações de ambas as CDRs Movl9 ou FR1-21 com seus epítopos alvo no receptor de folato 1, assim nenhuma mutação de superfície dorsal foi considerada para as sequências humanizadas de ambos os anticorpos. A sequência de Mov19 revestida, no entanto, introduziu um sítio de glicosilação ligado a N de consenso na N74 de cadeia leve (versão de cadeia leve 1.00), assim uma segunda versão da cadeia leve humanizada foi feita para remover este sítio. Uma revisão do banco de dados da sequência de cadeia leve humana de Kabat revelou que a treonina é o resíduo mais comum encontrado na posição de cadeia leve 74 de modo que a versão de cadeia leve Mov19 humanizada 1.60 foi construída com uma treonina na posição 74. A posição 74 não é um resíduo de superfície assim esta substituição de resíduo não teve impacto na humanização pela recomposição da superfície. Alinhamentos das sequências de região variável de Mov19 murino e humanizado, e FR1-21 são dados na Figura 2.
[000274] As sequências de região variável para Mov19 humanizado e FR 1 -21 foram otimizadas no códon e sintetizadas por Blue Heron Biotechnology. As sequências são flanqueadas pelos sítios de enzima de restrição para facilitar a clonagem no quadro com as respectivas sequências constantes em plasmídeos de expressão mamíferos de cadeia única. A região variável da cadeia leve foi clonada nos sítios EcoRI e BsiWI do plasmídeo pAbKZeo. Os DNAs do plasmídeo resultante codificando a huMovl 9 de cadeia leve foram depositados com o ATCC como Depósito ATCC Nos. PTA- 10773 e PTA-10774 e o DNA de plasmídeo resultante codificando huFR1-21 de cadeia leve foi depositado como Depósito ATCC No. PTA-10776. A região variável da cadeia pesada foi clonada nos sítios HindIII e Apa1 do plasmídeo pAbGlNeo. O DNA de plasmídeo resultante codificando huMov19 de cadeia pesada foi depositado com o ATCC como Depósito ATCC No. PTA- 10772 e o DNA de plasmídeo resultante codificando huFR1-21 de cadeia pesada foi depositado como Depósito ATCC N.° PTA- 10775. Estes plasmídeos, foram então transfectados como descrito no Exemplo 3 para produzir huMov19. O plasmídeo codificando ambos huMovl 9 de cadeia leve (i.e., que depositaram como Depósito ATCC N.° PTA- 10773 ou PTA-10774) pode ser pareado com o plasmídeo codificando huMov19 de cadeia pesada para criar um anticorpo huMov19 de acordo com os métodos fornecidos aqui e como são bem conhecidos por uma pessoa versada na técnica.
Exemplo 3 Expressão do anticorpo recombinante
[000275] Os constructos de anticorpo quimérico e humanizado foram transientemente produzidos em ambas as células HEK-293T aderentes usando um procedimento de fosfato de cálcio padrão (BD Biosciences, CalPhos Mammalian Transfection Kit, Cat # 631312) ou em células HEK-293T adaptadas por suspensão usando um procedimento de PEI modificado [Durocher Y, Perret S, Kamen A High-level e high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic Acids Res. 2002 Jan 15;30(2):E9] em frascos giratórios. As transfecções transientes de PEI foram realizadas como descrito anteriormente (Durocher, Y. et al., Nucleic Acids Res. 30(2):E9 (2002)), exceto as células HEK-293T que foram cultivadas em Freestyle 293 (Invitrogen) e o volume da cultura foi deixado não diluído após a adição dos complexos de PEI-DNA. Ambas as transfecções transientes aderentes e de suspensão foram incubadas por uma semana e depois o sobrenadante limpo foi purificado por uma coluna de Proteína A seguida por uma cromatografia de troca de íons de coluna CM como descrito abaixo. Como mostrado na Figura 3, a expressão de huMov19 foi pelo menos 10-vezes maior do que a expressão de Mov19 quimérico em células transfectadas.
Exemplo 4 Purificação do anticorpo
[000276] Os anticorpos foram purificados a partir dos sobrenadantes da cultura da célula limpa usando métodos padrões, como, por exemplo, Proteína A ou cromatografia G (HiTrap Proteína A ou G HP, 1 mL, Amersham Biosciences). Em resumo, o sobrenadante foi preparado por cromatografia pela adição de 1/10 volume de 1 M de tampão de Tris/HCl, pH 8,0. O sobrenadante com pH ajustado foi filtrado através de uma membrana de filtro de 0,22 μm e carregado sobre uma coluna equilibrada com tampão de ligação (PBS, pH 7,3). A coluna foi lavada com tampão de ligação até uma linha base estável ser obtida com nenhuma absorbância a 280 nm. O anticorpo foi eluído com 0,1 M de tampão de ácido acético contendo 0,15 M de NaCl, pH 2,8, usando uma vazão de 0,5 mL/min. Frações de aproximadamente 0,25 mL foram coletadas e neutralizadas pela adição de 1/10 volume de 1M Tris/HCl, pH 8,0. A fração(ões) pico foi dialisasa durante a noite duas vezes contra 1 x PBS e esterelizada pela filtragem através de uma membrana de filtro de 0,2 μm. O anticorpo purificado foi quantificado pela absorbância a A280/
[000277] As frações purificadas de Proteína A foram ainda purificadas usando cromatografia de troca iônica (IEX) com cromatografia de carboximetil (CM). Em resumo, amostras a partir da purificação da proteína A foram trocadas no tampão no tampão de partida (10 mM de fosfato de potássio, 10 mM cloreto de sódio, pH 7,5) e filtradas através de um filtro de 0.22 μm. A amostra preparada foi então carregada sobre uma resina de fluxo rápido CM (GE Lifesciences) que foi equilibrada com o tampão de partida a uma vazão de 120 cm/hr. O tamanho da coluna foi escolhido para ter capacidade suficiente de ligar todos os anticorpos na amostra. A coluna foi então lavada com tampão de ligação até uma linha base estável ser obtida com nenhuma absorbância a 280 nm. Anticorpo foi eluído pela iniciação de um gradiente a partir de 10 mM a 500 mM de cloreto de sódio no volume de coluna 20 (CV). Frações com a leitura de UV acima 50 raAu do pico maior foram coletadas. A pureza (a porcentagem de monômeros e agregados de peso molecular alto solúvel) foi avaliada com a cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) em um TSK gel G3000SWXL, 7,8 300 mm com uma coluna de guarda SWXL, 6,0 x 40 mm (Tosoh Bioscience, Montgomeryville, PA) usando um sistema Agilent HPLC 1100 (Agilent, Santa Clara, CA ). Frações com a pureza desejada (>95%) foram agrupadas, o tampão trocado para PBS (pH 7,4) usando o sistema TFF, e esterelizadas pela filtragem através de uma membrana de filtro de 0,2 μm. O anticorpo purificado foi ainda testado para sua pureza por SEC e a concentração de IgG foi determinada pela medição da absorbância a 280 nm usando um coeficiente de extinção de 1,47. A diluição foi feita se necessário. Alternativamente, a hidroxiapatita de cerâmica (CHT) pode ser usada para polir ambos os anticorpos murinos e humanizados com seletividade aprimorada. Resina CHT tipo II com tamanho de partícula de 40 μm (Bio-Rad Laboratories) foi aplicada para o poliimento de anticorpos com protocolo similar como cromatografia IEX. O tampão de partida para CHT foi 20 mM de fosfato de sódio, pH 7,0 e anticorpo foi eluído com um gradiente de 20-160 mM fosfato de sódio durante 20 CV.
Exemplo 5 Desenvolvimento de anticorpos murinos anti-FOLR1
[000278] Havia duas séries de imunização/triagem diferentes. A primeira série levou à geração do clone de FR1-21, a segunda série resultou na geração de clones de FR1-48, FR1-49, FR1-57 e FR1-65. Na primeira série os camundongos foram subcutaneamente imunizados com aproximadamente 5 x 106 de células KB expressando FOLR1 (American Tissue Culture Collection, ATCC CCL-17). Na segunda série 300-19 células expressando FOLR1 humano sobre sua superfície foram usadas para imunizar os camundongos. Para fazer essas células, a sequência de aminoácido FOLR1 humano foi obtida a partir do site da web NCBI (acesso NP_057937), então foi otimizada no códon e sintetizada por Blue Heron Biotechnologies, flanqueada pelos sítios de restrição EcoR1 e Xba1 para facilitar a clonagem no vetor de expressão mamífero pSRa. As células 300-19, uma linhagem celular pre-B a partir de um camundongo Balb/c (Reth et al., Nature, 317:353-355 (1985)), foram transfectadas com o plasmídeo de expressão pSRa-FOLR1 para de modo estável expressar altos níveis de FOLR1 humano sobre uma superfície celular. Protocolos de imunização padrão conhecidos por aqueles versados na técnica, por exemplo, como aqueles usados em ImmunoGen, Inc foram aplicados para ambas as séries. Os camundongos imunizados foram estimulados com antígeno três dias antes de serem sacrificados para geração de hibridoma. Os baços dos camundongos foram coletados de acordo com os protocolos animais padrão, como, por exemplo, moagem do tecido entre duas lâminas de microscópio estéreis para obter uma suspensão celular única no meio RPMI-1640. As células do baço foram centrifugadas, peletizadas, lavadas, e fundidas com um mieloma murino, como, por exemplo, células P3X63Ag8.653 (Kearney et al., J. Immunol., 123: 1548-1550 (1979)) usando polietileno glicol- 1500 (Roche 783 641). As células funcidas foram resuspensas no meio de seleção RPMI-1640 contendo hipoxantina-aminopterina- timidina (HAT) (Sigma H-0262) e selecionadas para crescimento em placas de cultura de fundo plano de 96 poços (Corning-Costar 3596, 0,2 ml de suspensão de célula por poço) a 37°C com 5% CO2. Após 5 dias de incubação, 0,1 ml do sobrenadante da cultura foram removidos a partir de cada poço e substituído com 0,1 ml de meio RPMI-1640 contendo suplemento de hipoxantina-timidina (HT) (Sigma H-0137). A incubação a 37°C com 5% de CO2 foi contínua até os clones do hibridoma estarem prontos para a triagem de anticorpo. Outras técnicas de imunização de produção de hibridoma também podem ser usadas, incluindo aquelas descritas em Langone et al. (Eds., "Immunochemical Techniques, Part I", Methods in Enzymology, Academic Press, volume 121 , Florida) e Harlow et al. ("Antibodies: A Laboratory Manual"; Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1988)).
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Exemplo 6 Triagem e seleção de hibridoma
[000279] As células FOLR1 -300- 19 transfectadas com FOLR1 humano e células KB foram usadas na primeira e segunda série de triagens correspondentemente. Os sobrenadantes da cultura a partir do hibridoma foram triados pela citometria de fluxo para secreção de anticorpos monoclonais de camundongo que se ligam às células positivas de FOLR1, como as células 300-19 expressando FOLR1 ou células KB, mas não às células negativas FOLR1, como as células 300-19 não transfectadas. 0,1 ml dos sobrenadantes do hibridoma foi incubado por 3 h ou com células positivas de FOLR1 ou as células 300-19 não transfectadas (1 x 105 células por amostra) em 0,1 ml de tampão FACS (meio RPMI-1640 suplementado com 2% de soro de cabra normal). Então, as células foram centrifugadas, peletizadas, lavadas, e incubadas por 1 hora com 0,1 ml de anticorpo IgG anti camundongo de cabra com PE conjugado (como passível de ser obtido a partir de, por exemplo Jackson Laboratory, 6 μg/mL no tampão FACS). As células foram centrifugadas, peletizadas novamente, lavadas com tampão FACS e resuspensas em 0,2 ml de PBS contendo 1 % de formaldeído. A fluorescência associada à célula foi medida usando um citômetro de fluxo FACSCalibur com o amostrador de multipoço HTS ou um citômetro de fluxo de arranjo FACS e analisadas usando CellQuest Pro (todos da BD Biosciences, San Diego, US). Os clones do hibridoma positivos foram subclonados pela limitação da diluição. Um subclone a partir de cada hibridoma, que mostrou a mesma reatividade contra FOLR1 como as células parentais pela citometria de fluxo, fois escolhido para análise subsequente. Subclones estáveis foram cultivados e o isótopo de cada anticorpo anti-FOLR1 secretado foi identificado usando reagentes de isotipagem comerciais (Roche 1493027). Anticorpos murinos foram purificados pela proteína A a partir do meio do hibridoma limpo como descrito acima. Estes anticorpos foram designados anticorpos FR-1.
Exemplo 7 Purificação do anticorpo monoclonal de murino
[000280] Os anticorpos foram purificados a partir dos sobrenadantes do subclone do hibridoma usando métodos padrões, como, por exemplo, Proteína A ou cromatografia G (HiTrap Proteína A ou G HP, 1 mL, Amersham Biosciences). Em resumo, o sobrenadante foi preparado por cromatografia pela adição de 1/10 volume de 1 M de tampão Tris/HCl, pH 8,0. O sobrenadante com pH ajustado foi filtrado através de uma membranda de filtro de 0,22 μm e carregado sobre uma coluna equilibrada com tampão de ligação (PBS, pH 7,3). A coluna foi lavada with tampão de ligação até uma linha base estável ser obtida com nenhuma absorbância a 280 nm. O anticorpo foi eluído com 0,1 M tampão de ácido acético contendo 0,15 M de NaCl, pH 2,8, usando um vazão de 0,5 mL/min. Frações de aproximadamente 0,25 mL foram coletadas e neutralizadas pela adição de 1/10 volume de 1M Tris/HCl, pH 8,0. A fração(ões) pico foi dialisasa durante a noite duas vezes contra 1 x PBS e esterelizada pela filtragem através de uma membrana de filtro de 0,2 μm. O anticorpo purificado foi quantificado pela absorbância a A280.
Exemplo 8 Caracterização de ligação pela citometria de fluxo
[000281] A especificidade de ligação foi testada pela citometria de fluxo usando anticorpos purificados. Os histogramas FACS demonstrando a ligação do anti-FOLR1 a células 300-19 expressando FOLR1 e a ausência da ligação às células 300-19 parentais são mostrados na Figura 4. Cada anticorpo foi incubado por 3 horas com ambas as células 300-19 expressando FOLR1 ou as células 300-19 não transfectadas (1 x 105 células por amostra) em 0,1 ml de tampão FACS (meio RPMI-1640 suplementado com 2% de soro de cabra normal). Então, as células foram peletizadas, lavadas, e incubadas por 1 hora com 0,1 ml de Anticorpo IgG anti-camundongo de cabra conjugado a FITC (como é passível de ser obtido a partir de, por exemplo Jackson Laboratory, 6 μg/mL no tampão FACS). As células foram peletizadas novamente, lavadas com tampão FACS e resuspensas em 200 de PBS contendo 1% de formaldeído. As amostras foram adquiridas usando um citômetro de fluxo FACSCalibur com o amostrador de multipoço HTS ou um citômetro de fluxo de arranjo FACS e analisadas usando CellQuest Pro (todos da BD Biosciences, San Diego, US). Os histogramas de FACS dos anticorpos anti-FOLR1 mostraram um deslocamento fluorescente, enquanto as células 300-19 parentais não. Também, nenhum deslocamento fluorescente significativo foi detectado quando uma das linhagens celulares for incubada somente com Anticorpo IgG anti humano de cabra com FITC conjugado.
Exemplo 9 Clonagem e sequenciamento das regiões de VL e VH de muFR1-21
[000282] O RNA total celular foi preparado a partir de 5 x 106 células de hibridoma usando um kit RNeasy (QIAgen) de acordo com o protocolo do fabricante. O cDNA foi subsequentemente sintetizado a partir do RNA total usando o kit de síntese Superscript II cDNA (Invitrogen). O procedimento para a primeira rodada degenera a reação PCR no cDNA derivado a partir das células de hibridoma foi baseado nos métodos descritos em Wang et al. ((2000) J Immunol Methods. Jan 13; 233(1-2): 167-77) e Co et al. ((1992) J Immunol. Feb 15; 148(4): 1 149-54). As sequências VH foram amplificadas por PCR usando os iniciadores de degeneração a seguir: EcoMUl CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC (SEQ ID NO:50) EcoMRl CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG (SEQ ID NO:5 1 ) e BamIgGl GGAGGATCCATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC (SEQ ID NO:52). As sequências VL foram amplificadas por PCR usando os iniciadores de degeneração a seguir: SacIMK GGAGCTCGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA (SEQ ID NO:53) e HindKL TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTG C (SEQ ID NO:54). (Bases misturadas são definidas como segue: N=G+A+T+C, S=G+C, Y=C+T, M=A+C, R=A+G, W=A+T).
[000283] As misturas de reação de PCR foram então executadas em um gel de agarose de baixa fusão a 1%, as bandas de 300 a 400 foram cortadas, purificadas usando mini colunas Zymo DNA, e enviadas para Agencourt Biosciences para sequenciamento. Os respectivos iniciadores de PCR 5' e 3' foram usados como iniciadores de sequenciamento para gerar os cDNAs de região variável a partir de ambas as direções. As sequências de aminoácido das regiões VH e VL foram obtidas pela tradução dos resultados do sequenciamento de DNA com o software VectorNTI.
[000284] Para identificar os artefatos de sequenciamento do iniciador de extremidade 5' nas sequências de cDNA de região variável preliminarmente, o sítio NCBI IgBlast (www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) foi usado para pesquisar pelas sequências de linhagem germinativa murinas a partir das quais as sequências de anticorpo foram derivadas. As sequências de região variável limpas foram então combinadas com as sequências de referência NCBI para as regiões constantes de anticorpo específico para montar as sequências de anticorpo de murino de comprimento completo esperadas. O peso molecular de murino Fr1-21 esperado de cadeias leve e pesada foi então calculado e comparado com a massa medida pelas análises de cromatografia líquida/espectofotométricas de massa (LC/MS). O Murino FR1-21 de cadeia pesada correspondeu a massa medida, mas a cadeia leve necessitou de um acompanhamento de reforço do sequenciamento para determinar a sequência de extremidade 5'. O iniciador CD37-1LClead1 PCR (ttttgaattcgccaccatgaagtttccttctcaacttct) foi designado para hibridizar com a sequência líder ligada a linhagem germinativa do anticorpo murino de modo que esta nova reação PCR renderia uma sequência de cDNA de região variável completa, inalterada pelos iniciadores. As reações de PCR, purificações de banda, e sequenciamento foram realizadas como descritos above e a nova sequência completa codificou a cadeia leve que correspondeu à massa de Fr1-21 de cadeia medida por LC/MS.
Exemplo 10 Expressão de anticorpos de referência
[000285] O anticorpo anti-FOLR1 da Morphotech, MorAb-003 (Farletuzumab), sequência de aminoácido foi obtida a partir da lista da World Health Organization (WHO) International Nonproprietary Names for Pharmaceutical Substances (INN) e foi otimizada no códon e sintetizada por Blue Heron Biotechnology. A sequência da região variável de cadeia leve é flanqueada pelos sítios EcoRI e BsiWI de enzima de restrição e a sequência da região variável da cadeia pesada flanqueada pelos sítios de enzima de restrição HindIII e Apa1 para clonagem no quadro com as respectivas sequências constantes em plasmídeos de expressão mamíferos de cadeia única. A clonagem, expressão e purificação foram realizadas como descrito para Mov19 e FR1-21 humanizados acima.
Exemplo 11 Atividade ADCC de huMov19
[000286] Um ensaio de liberação de lactato dehidrogenase (LDH) foi usado para medir a citotoxidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) de linhagens celulares de tumor usando células assassinas naturais humanas isoladas recentemente (NK) como células efetoras (por exemplo, Shields, J. Biol. Chem., 276(9):6591 - 6604 (2001)). As células NK foram primeiramente isoladas a partir do sangue humano de um doador normal (Research Blood Components, Inc., Brighton, MA) usando um protocolo modificado para o Kit de Isolamento de NK 11 (Miltenyi Biotech, 130-091 - 152). O sangue foi diluído 2-vezes com 1x PBS. 25 mL do sangue diluído foi cuidadosamente depositado sobre 25 mL de Ficoll Paque em um tubo cônico de 50mL e centrifugado a 400 g por 45 min a RT. As células mononucleares de sangue periférico (PBMC) foram coletadas a partir da interface, transferidas para um novo tubo cônico de 50mL, e lavadas uma vez com 1 x PBS. As PBMC foram resuspensas em 2 mL do tampão de isolamento de NK (1 x PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA), e então 500 μL de Coquetel do Anticorpo Biotina foram adicionados a uma suspensão de célula. O Coquetel do Anticorpo de Biotina contém anticorpos biotinilados que se ligam aos linfócitos, exceto para células NK, resultando em uma seleção negativa de células NK. A mistura foi incubada a 4°C por 10 minutos, e então 1,5 mL do tampão de isolamento de NK e 1 mL de Micro Esferas Anti-Biotina foi adicionado. Uma mistura de anticorpo da célula foi incubada por mais 15 minutos a 4°C. Depois, as células foram lavadas uma vez com 50 mL do tampão de isolamento de NK e resuspensas em 3 mL do tampão de isolamento de NK. Então, uma coluna MACS LS foi montada sobre o separador autoMACS (Miltenyi Biotech) e pre-lavada com 3 mL do tampão de isolamento de NK. A suspensão de células foi automaticamente aplicada sobre a coluna, lavada e a fração de efluente com as células NK não marcadas foi coletada em um novo tubo cônico de 50mL. As células de NK resultantes foram colocadas em placa de 30 mL do meio RPMI completo (RPMI-1640 suplementado com 5% de soro bovino fetal, 1 % de penicilina- estreptomicina, 1 raM HEPES, 1 mM Piruvato de Sódio, 1 % de 100X MEM Solução de Aminoácido não essencial) durante a noite. O ensaio subsequente e todas as diluições foram realizadas no meio RHBP (meio RPMI 1640 suplementado com 20 mM HEPES, pH 7,4, 0,1 % BSA e 1 % de penicilina estreptomicina). Várias concentrações de anticorpos no meio RHBP foram aliquotadas em duplicata a 50 μl/poço em uma placa de 96 poços de fundo redondo. As células alvo foram resuspensas a 106 células/mL no meio RHBP e adicionadas a 100 μl/poço a cada poço contendo diluições de anticorpo. A placa contendo as células alvo e diluições de anticorpo foi incubada por 30 minutos a 37°C. As células NK foram então adicionadas aos poços contendo as células alvo a 50 μl/poço. A razão típica foi cerca de 1 célula alvo para 3-4 células NK. Pelo menos os controles a seguir foram definidos para cada experimento: As células NK sozinhas, células alvo sozinhas (liberação de LDH espontânea), células alvo com células NK (liberação de LDH independente de anticorpo), células alvo com 10% de TritonX- 100 (liberação de LDH máxima). As misturas foram incubadas a 37°C por 4 horas para permitir a lise celular. As placas foram centrifugadas por 10 minutos a 1200 rpm, e 100 μl do sobrenadante foi cuidadosamente transferido para uma nova placa de 96 poços de fundo plaN.° A mistura reacional LDH (100 μl/poço) do Kit de Detecção de Citotoxidade (Roche 1 644 793) foi adicionada a cada poço e incubada a temperatura ambiente por 5 a 30 min. A densidade ótica das amostras foi medida a 490 nm (OD490). A lise específica percentual de cada amostra foi determinada usando a seguinte fórmula: lise específica percentual = (valor de amostra - liberação espontânea)/ (liberação máxima - liberação espontânea) *100.
[000287] A incubação com huMov19 levou a boa atividade de ADCC contra células IGROV-1 na presença de células efetoras NK humanas. A atividade de ADCC nas células IGROV-1 foi comparada para huMov19, huFR-1-21, Mor003, e chTKl (controle de isotipo) (Figura 6). O tratamento com 0,9 ng/ml huMov19 resultou em aproximadamente 30% da lise celular de IGROV-1, similar à atividade que foi observada com os outros anticorpos anti-FOLR1. A atividade de ADCC por huMov19 teve uma EC50 de 0,20 ng/mL, huFr-1 -21 teve uma EC50 de 0,11 ng/mL, Mor003 de 0,16 ng/mL e chTKl dID NO:1 não mostrou qualquer atividade contra as células IGROV-1.
Exemplo 12 Preparação de imunoconjugados anti-FOLR1 Preparação de huMO V 19v 1.6-sulfo-SPDB-DM4
[000288] O ligante 2-sulfo-SPDB exemplar foi dissolvido em DMA. O anticorpo huMOV19v1.6 foi incubado a 8 mg/mL com um excesso molar de 12 vezes do ligante 2-sulfo-SPDB por aproximadamente 2 horas a 25 °C a pH 7,5. A mistura reacional foi purificada usando uma coluna SEPilADEX™ G25F equilibrada com 50 mM de tampão de fosfato de potássio contendo 50 mM de NaCl, 2 mM de EDTA, pH 6,5. A maitansinoide DM4 foi dissolvida em dimetilacetamida (DMA, concentração final é 5%) e um excesso molar de 1,7 vezes em comparação ao ligante foi adicionadado gota a gota ao anticorpo modificado sulfo-SPDB. A mistura reacional foi ajustada para o pH 7,5 com tampão HEPES 1 M. Após incubação durante a noite a temperatura ambiente, o anticorpo conjugado foi purificado por cromatografia em SEPHADEX™ G25F equilibrada com 10 mM de histidina, 250 mM de glicina, 1% sucrose, pH 5,5. O número de moléculas DM4 ligadas por molécula de anticorpo foi determinado usando os coeficientes de extinção relatados anteriormente para anticorpo e maitansinoide (Widdison, WC, et al.] Med Chem, 49:43924408 (2006)). A porcentagem das espécies de maitansinoide livres total foi determinada como descrito acima. Os conjugados com 3,5-4 moléculas de DM4 por anticorpo huMov19v1.6 foram obtidos com <1% presente como maitansinoide não conjugado. Preparação de huMOV19vl .6-SPP-DM1
[000289] O ligante 4-(2-piridilditio)pentanoato de N-succinimidila (SPP) exemplar foi dissolvido em etanol. O anticorpo huMOV19v1.6 foi incubado a 8 mg/mL com um excesso molar de 6,5 a 6-vezes do ligante SPP por aproximadamente 2 horas a temperatura ambiente em 50 mM de tampão de fosfato de potássio (pH 6,5) contendo 50 mM de NaCl, 2 mM de EDTA, e 5% de etanol. O anticorpo SPP modificado foi diluído 2-vezes em PBS, pH 6,5 e modificado com um excesso molar de 1.5 vezes de maitansinoide DM1 pela adição de uma solução concentrada (15-30 mM) de DM1 em dimetilacetamida (DMA). A concentração de DMA foi ajustada para 5% e após a incubação durante a noite a temperatura ambiente, o anticorpo conjugado foi purificado pela cromatografia em SEPHADEX™ G25F equilibrado com 10 mM, 250 mM glicina, 1% sucrose pH 5,5. O número de moléculas de DM1 ligadas por molécula de anticorpo foi determinada usando os coeficientes de extinção relatados anteriormente para o anticorpo e DM1 (Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 8618-8623 (1996)). A porcentagem do maitansinoide livre presente após a reação de conjugação foi determinada pela injeção de 20 a 50 μg do conjugado sobre uma coluna de HiSepTM equilibrada em 25% de acetonitrila em 100 mM de tampão de acetado de amônio, pH 7,0, e eluição em acetonitrila. A área de pico das espécies de maitansinoide livres total (eluídas no gradiente e identificadas pela comparação do tempo de eluição com padrões conhecidos) foi medida usando um detector de absorbância ajustado para um comprimento de onda de 252 nm e em comparação com a área de pico relacionada ao maitansinoide ligado (eluído no pico do conjugado nas frações através do fluxo) para calcular a porcentagem das espécies de maitansinoide livres totais. Os conjugados com 3,5-4 de moléculas DM1 por huMOV19v1.6 foram obtidos com <1% presente como maitansinoide não conjugado. Preparação de huMOV19v1.6 SPDB-DM4
[000290] O ligante 4-(2-piridilditio)butanoato de N-succinimidila (SPDB) exemplar foi dissolvido em etanol. O anticorpo huMOV19v1.6 foi incubado a 8 mg/mL com um excesso molar de 5,5-5 vezes do ligante SPDB por aproximadamente 2 horas a temperatura ambiente em 50 mM de tampão de fosfato de potássio (pH 6.5) contendo 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, e 3% etanol. O anticorpo SPDB modificado foi diluído 2-vezes em PBS, pH 6,5 e modificado com um excesso molar de 1,5 vezes de maitansinoide DM4 pela adição de uma solução concentrada (15-30 mM) de DM4 em dimetilacetamida (DMA). Após a incubação durante a noite a temperatura ambiente, o anticorpo conjugado foi purificado pela cromatografia em SEPHADEX™ G25F equilibrada com 10 mM histidina, 250 mM glicina, 1 % sucrose pH 5,5. O número de moléculas de DM4 ligadas por molécula de anticorpo foi determinada usando os coeficientes de extinção relatados anteriormente para anticorpo e maitansinoide (Widdison, WC, et al.] Med Chem, 49:4392-4408 (2006)). A porcentagem das espécies de maitansinoide livres total foi determinada como descrito acima. Conjugados com 3,5-4 moléculas DM4 por anticorpo huMOV19v 1.6 foram obtidos com <1 % presente como maitansinoide não conjugado. Preparação de huMov19v1.0-3-sulfo-mal-DM4
[000291] O ligante NHS-3-sulfo-mal e DM4 foi dissolvido separadamente em DMA. O ligante e DM4 tiol foram misturados juntos em uma solução de DMA contendo 40% de 200mM de tampão de succinato, 2mM de EDTA, pH5,0 para fornecer uma razão molar de DM4 para o ligante de 1.6:1 e uma concentração final de DM4 igual a 10 mM. A mistura foi reagida por 2 horas a 25°C. Sem purificação, a mistura reacional foi adicionada de modo que um equivalente de 9,6 de excesso molar do ligante para o anticorpo foi adicionado a uma solução de huMOV19v1 .O anticorpo no tampão de fosfato (pH7,5) sob condições de conjugação finais de 4mg/mL por anticorpo, 90% de tampão de fosfato/10% de DMA pH7,5 (v/v). Após uma incubação durante a noite a temperatura ambiente, a mistura de conjugação foi purificada por cromatografia em SEPHADEX G25 equilibrada em PBS pH7,5. O huMOV 19v1.0-3-sulfo-mal-DM4 foi então dialisado em um tampão contendo 9,55mM de Fosfato, 139,6mM NaCl, pH6,5. O número de moléculas de DM4 ligadas por molécula de anticorpo foi determinada usando os coeficientes de extinção relatados anteriormente para o anticorpo e maitansinoide (Widdison, WC, et al.] Med Chem, 49:4392-4408 (2006)). A porcentagem das espécies de maitansinoide livres total foi determinada como descrito acima. Conjugados com 3,5-4 moléculas de DM4 por anticorpo huMOV19v1.0 foram obtidos com <1 % presente como maitansinoide não conjugado. Preparação de huMOV19v1.0-SMCC-DM1
[000292] O ligante NHS-sulfo-SMCC e DM1 foram dissolvidos separadamente em DMA. O ligante e DM1 tiol foram misturados juntos em uma solução de DMA contendo 40% de 200mM de tampão de succinato, 2mM EDTA, pH5,0 para fornecer uma razão molar de DM1 um ligante de 1.2: 1 e a concentração final de DM1 igual a 3.75mM. A mistura foi reagida por 75 minutos a 20°C. Sem purificação, a mistura reacional foi adicionada de modo que um equivalente de excesso molar de 6,4 do ligante para anticorpo foi adicionado a uma solução de anticorpo huMOV19v1.0 no tampão de fosfato (pH7.5) sob condições de conjugação finais do anticorpo de 4mg/mL, 88% de 50mM Fosfato de potássio, 50mM de NaCl, 2mM EDTA, pH 7,5/12% DMA pH7,5 (v/v). Após incubação de 2 horas a 20°C, a mistura de conjugação foi purificada pela cromatografia em SEPHADEX G25 equilibrada em PBS pH7,5. O huMOV19v1.0-SMCC-DM1 foi então dialisado em um tampão contendo 250 mM de Glicina, 10 mM de Histidina pH5,5. O número de moléculas de DM1 ligadas por molécula de anticorpo foi determinado usando os coeficientes de extinção relatados anteriormente para anticorpo e maitansinoide (Widdison, WC, et al.] Med Chem, 49:4392-4408 (2006)). A porcentagem das espécies de maitansinoide livres total foi determinada como descrito acima. Os conjugados com 3,5-4 de moléculas DM1 por anticorpo huMOV19v1.0 foram obtidos com <2,8% presente como maitansinoide não conjugado. Preparação de huMOV19v1.0-PEG4-mal-DM1
[000293] O reagente de 1 etapa NHS-PEG4-mal-DM1 foi dissolvido em DMA. O anticorpo huMov19v1.0 foi incubado a 5mg/mL com um excesso molar de 5,7 vezes de NHS-PEG4-mal-DM1 durante a noite a 25°C em 50mM de KPi, 50mM de NaCl, 2 mM de EDTA, pH 7,5 e 10% de DMA por volume. A mistura reacional foi purificada pela coluna SEPHADEX G25 equilibrada em PBS pH7,5. O huMOV19v1.0-PEG4- mal-DM1 foi dialisado no tampão contendo 250 mM de Glicina, 10 mM de Histidina pH5,5. O número de moléculas de DM1 ligadas por molécula de anticorpo foi determinado usando os coeficientes de extinção relatados anteriormente por anticorpo e maitansinoide (Widdison, WC, et al.] Med Chem, 49:4392-4408 (2006)). A porcentagem das espécies de maitansinoide livres total foi determinada como descrito acima. Conjugados com 3,5-4 moléculas de DM1 por anticorpo huMov19v1.0 foram obtidos com <1,1 % presente como maitansinoide não conjugado.
Exemplo 13 Afinidade de ligação dos anticorpos e conjugados
[000294] Afinidades de ligação de anticorpos anti-FOLR1 e de seus conjugados SPDB-DM4, PEG4Mal-DM4, SMCC-DM1 , ou anti-FOLR1 -sulfo-SPDB-DM4 foram testados pela citometria de fluxo. Células SKOV3 expressando FOLR1 foram incubadas com concentrações variantes de anticorpos anti-FOLR1 ou seus conjugados e processados como descrito acima para análise de citometria de fluxo. A análise de dados foi realizada usando CellQuest Pro (BD Biosciences, San Diego, US) e para cada amostra a intensidade de fluorescência média para FL1 (MFI) foi exportada e plotada contra a concentração do anticorpo em um gráfico de semi-log. Uma curva de dose-resposta foi gerada pela regressão não linear e o valor para a cosntante de dissociação de equilíbrio aparente (%) das amostras de teste para a ligação às células SKOV3 foi calculada usando GraphPad Prism v4 (GraphPad software, San Diego, CA) e apresentada na Figura 5. Os resultados demonstram que a conjugação ou a DM1 ou a DM4 através de ambos os ligantes usados, não notavelmente alteram a afinidade de ambos os anticorpos (por exemplo, huMov19).
Exemplo 14 Ensaios de Citotoxidade in vitro
[000295] A capacidade dos conjugados muFR1-9, muFR1-13, muFRl-22, muFR1-23, huFR1-23, muFR1-21, e huFR1-21 exemplares de inibir o crescimento celular foi medida usando ensaios de citotoxidade in vitro pelo método descrito em Kovtun YV et al. (Cancer Res 66: 3214-3221 (2006)). Um conjugado PEG4-mal-DM4 em várias concentrações foi aidiconado às células KB expressando FOLR1 em uma placa de 96 poços a 1.000 células por poço em 100 μL no meio RPMI completo (RPMI-1640, 10% de soro bovino fetal, 2 mM glutamina, 1 % gentamicina, todos os reagentes da Invitrogen). Os anticorpos e conjugados foram diluídos no meio RPMI completo usando séries de diluição de 3-vezes e 100 μL foram adicionados por poço. A concentração final variou tipicamente de 3 x 10-8 M a 4,6 x 1012 M. Poços de controle contendo células e o meio mas sem os conjugados, e poços contendo meio somente foram incubados em cada placa de ensaio. As placas foram incubadas de quatro a seis dias a 37°C em uma atmosfera umidificada contendo 5% CO2. O reagente WST-8, 10% v/v (Dojindo Molecular Technologies, Gaithersburg, MD, US) foi então adicionado aos poços e as placas foram incubadas a 37°C por 2-6 h. WST-8 é reduzido pelas dehidrogenases em células vivas para um meio de cultura laranja (produto de formazan máximo que é solúvel no meio de cultura do tecido. A quantidade de formazan produzida é diretamente proporcional ao número de células vivas. As placas foram analisadas pela medição da absorbância a 450 nm (A450) e a 650 nm (A650) em um leitor de placa de multi poço. Primeiro, o fundo da opalescência das células (A650) foi subtraído de A650. O A*450 resultante foi então usado para determinar uma fração de sobrevivência das células. A absorbância de fundo A*450 foi aquela dos poços com o meio e WST-8 somente. A fração de sobrevivência foi calculada como segue: Viabilidade percentual = 100 x (A*450 amostra tratada - A*450 fundo)/ (A*450 amostra não tratada - A*450 fundo). Os valores de fração de sobrevivência foram plotados contra o anticorpo ou concentração de conjugado em um gráfico de semi-log para cada tratamento. A partir destes dados valores de IC50 foram então determinados usando GraphPad Prism v4 (GraphPad software, San Diego, CA) e apresentados na Figura 5. Os resultados mostrados na Figura 5 demonstraram que todos os conjugados são similarmente ativos em sua potência de citotoxidade contra células KB expressando FOLR1. Para verificar adicionalmente a especificidade dos conjugados maitansinoide anti-FOLR1 em direção ao FOLR1, suas atividades foram avaliadas na presença de um excesso dos anticorpos não conjugados contra as células KB. A adição de um excesso do anticorpo não conjugado competidor para os conjugados suprimiu sua citotoxicidade, como visto na Figura 7. Estes dados indicam que os conjugados matam as células KB em uma maneira dependente de antígeN.° Os dados adicionais demonstraram que huMov19-SPDB- DM4 induziu a apreensão do ciclo celular na fase G2/M em células KB em ensaios in vitro.
Exemplo 15 Eficácia in vivo dos conjugados de huMov19-PEG4Mal-DM4 e huMov19-SPDB-DM4 em comparação com conjugados não alvos similares em um modelo de xenoenxerto KB
[000296] O conjugado clivável direcionada o FOLR1 huMov 19- SPDB-DM4 em comparação com huC242-SPDB-DM4 não alvo, e conjugado não clivável huMov19-PEG4-Mal-DM4 em comparação com huC242-PEG4Mal-DM4 não alvo foram testados usando um modelo de xenoenxerto estabelecido de células KB implantadas subcutaneamente no camundongo SCID. Os camundongos foram randomizados por peso corporal em grupos de tratamento e tratados ou unicamente (conjugados SPDB) no dia 3 após a inoculação da célula, ou três vezes por semana nos dias 3, 10, e 17 após a inoculação da célula com 5 e 10 mg/kg de um conjugado, respectivamente. O volume de tumor médio dos diferentes grupos de tratamento é plotado na Figura 8. Os tratamentos com ou huMov19- SPDB-DM4, ou huMov19-PEG4Mal-DM4 resultaram em um diminuição no volume de tumor médio em comparação com o controle PBS, enquanto os tratamentos com um dos respectivos conjugados não-alvo não produziu qualquer efeito significante.
Exemplo 16 Eficácia in vivo dos conjugados de anti-FOLR1-PEG4Mal-DM4 em um modelo de xenoenxerto KB
[000297] Conjugados PEG4Mal-DM4 dos anticorpos anti-FOLR1 exemplares huMov19, muFR-1-9, muFR-1-13, muFR-1-22, muFR-1- 23, e huFR-1-21 foram testados usando um modelo de xenoenxerto estabelecido de células KB implantadas subcutaneamente no camundongo SCID. Os camundongos foram randomizados por peso corporal em grupos de tratamento e tratados um vez no dia 3 após a inoculação da célula com 10 mg/kg de um dos conjugados listados acima ou com PBS somente. HuMov19-PEG4Mal-DM4 foi mostrado acima por ser similar aos conjugados PEG4Mal-DM4 de muFR-1-9, muFR-1-13, muFR-1-22, muFR-1-23, e huFR-1-21 em sua potência citotóxica in vitro. HuMov 19-PEG4Mal-DM4 e huFR-1-21-PEG4Mal- DM4 foram significativamente mais potentes in vivo do que qualquer um dos outros conjugados, resultando em uma diminuição mais pronuncioada no volume de tumor médio (Figuras 9 e 10). A potência também foi demonstrada por ser dependente da dose (Figura 11) e a escolha do ligante também desenpenhou um papel (Figuras 12 e 13).
Exemplo 17 Eficácia in vivo dos conjugados anti-FOLR 1 -sulfo-SPDB-DM4 em um modelo de xenoenxerto
[000298] Conjugados anti-FOLR1 huMov19-sulfo-SPDB-DM4 foram testados em três xenoenxertos de adenocarcinoma seroso ovariano: OVCAR-3, IGROV-1, e OV-90. Cada um destes tumores de xenoenxerto mostrou níveis de expressão de FOLR1 comparáveis aos tumores do paciente quando medido usando um método de tingimento imunohistoquímico calibrado (IHC) em seções embutidas com formalina fixas com parafina. Os camundongos portadores dos tumores de xenoenxerto subcutâneos estabelecidos (aproximadamente 100 mm3) foram tratados com uma injeção intravenosa única do conjugado huMov19-sulfo-SPDB-DM4 a 1,2, 2,5, e 5,0 mg/kg (com base na concentração do anticorpo; as Figuras 14 a 16 mostram a concentração do conjugado maitansanoide em μg/kg. O conjugado foi ativo em todos os três modelos avaliados. Em xenoenxertos OVCAR-3, a dose minimamente eficaz (MED) foi 1,2 mg/kg (Figura 14). Os níveis de dose mais elevados foram altamente ativos, resultando em regressões completas (CR) em 4/6 e 2/6 camundongos em 2,5 e 5,0 mg/kg de grupos de tratamento, respectivamente. O tratamento com o conjugado resultou em forte atividade anti-tumoral em ambos os modelos de xenoenxerto IGROV-1 e OV-90, com um MED de 2,5 mg/kg, injeção única (Figuras 15 e 16). Estes dados demonstram a forte atividade anti-tumoral dos conjugados huMov19-sulfo-SPDB-DM4 contra tumores de xenoenxerto de ovário com níveis de expressão de FOLR1 comparáveis aos tumores do paciente.
Exemplo 18 Efeito de Ligantes na Eficácia do Imunoconjugado
[000299] O anticorpo anti-FOLR1 huMov19 foi ligado ao DM1 ou DM4 através de um ligante clivável contendo dissulfeto SPP, SPDB, ou sulfo-SPDB, ou através do ligante não-clivável SMCC. As atividades citotóxicas in vitro destes conjugados nas linhagens celulares KB, IGROV-1 e JEG-3 foram examinadas. As análises FACS indicaram que as células KB (cervical) tiveram > 2.000.000 sítios de ligação de anticorpo por célula. As células IGROV-1 (ovarianas) tiveram 260.000 sítios de ligação de anticorpo por célula, e as células JEG-3 (coriocarcinoma) tiveram 40.000 sítios de ligação de anticorpo por célula. Os resultados da citotoxicidade in vitro são resumidos na Tabela 2 abaixo. Os conjugados cliváveis exibiram marcadamente maiores atividades in vitro em comparação com aquelas do conjugado de SMCC. Tabela 2: Efeito de ligantes de imunoconjugado na citotoxicidade in vitro.
Figure img0014
[000300] As atividades in vivo dos conjugados em modelos de tumor FOLR1 KB- e OVCAR-3- -positivos também foram testados. Os resultados mostrados na Figura 17 demonstram que os conjugados SPDB-DM4 e sulfo-SPDB-DM4 cliváveis são mais potentes do que os conjugados SMCC-DM1 não-cleaváveis in vivo. Além disso, dentro os conjugados cliváveis, o conjugado SPP-DM1 foi menos ativo do que ambos os conjugados SPDB-DM4 ou sulfo-SPDB-DM4 em ambos os modelos de xenoenxerto (Figura 18). Os dois últimos conjugados foram similarmente ativos contra tumores KB, enquanto que o conjugado sulfo-SPDB-DM4 foi mais ativo contra o modelo OVCAR-3. Os dados obtidos usando o modelo OVCAR-3 são resumidos na Tabela 3 abaixo. Tabela 3: Efeito dos ligantes de imunoconjugado no tamanho do tumor no modelo de xenoenxerto OVCAR-3 .
Figure img0015
[000301] Estes dados demonstram que os imunoconjugados contendo um ligante clivável mostram eficácia aumentada tanto in vitro quanto in vivo, e imunoconjugados anti-FOLR1 contendo sulfo-SPDB são altamente ativos nos modelos de tumor.
Exemplo 19 Eficácia in vitro e in vivo do conjugado do anticorpo huFRl SMCC-DM1
[000302] O conjugado anti-FOLR1 huFR1-48, huFR1-49, huFRl-57, e huFRl-65 foram avaliados com o ligante SMCC e DM1 e os efeitos em células KB, e in vivo usando os modelos de xenoenxerto descritos acima foram analisados como descrito acima. Enquanto cada um dos anticorpos mostrou eficácia similar no modelo de célula KB, os imunoconjugados huFR1-48, huFR1-49, huFR1-57, e huFR1-65 mostraram uma eficácia in vivo variável, mas significante, a uma dose de 200 μg/kg em um sistema de modelo de xenoenxerto (Tabela 4 e Figura 19). Tabela 4: Eficácia in vitro e in vivo do conjugado do anticorpo huFRl SMCC-DM1
Figure img0016
[000303] Todas as publicações, patentes, pedidos de patentes, sites da internet, sequências de bancos de dados/número de acessão (incluindo ambas as sequências de polipeptídeo e polinucleotídeo) citados aqui são aqui incorporados por referência na íntegra para todos os efeitos, na mesma medida como se cada publicação individual, patente, pedido de patente, site da internet, ou sequência de banco de dados/número de acessão fosse especificamente e individualmente indicada para então ser incorporada por referência.

Claims (26)

1. Anticorpo humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a um receptor de folato humano 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende: (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo GYFMN (SEQ ID NO:1); uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo RIHPYDGDTFYNQKFQG (SEQ ID NO: 2); e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo YDGSRAMDY (SEQ ID NO:3); e (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo KASQSVSFAGTSLMH (SEQ ID NO:7); uma CDR2 de cadeia leve compreendendo RASNLEA (SEQ ID NO:8); e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo QQSREYPYT (SEQ ID NO:9).
2. Anticorpo humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que é codificado pelo DNA de plasmídeo depositado na ATCC em 7 de Abril de 2010 e tendo depósito ATCC n.° PTA-10772, PTA-10773, ou 10774.
3. Anticorpo humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável de cadeia pesada compreende SEQ ID NO:4, e um domínio variável de cadeia leve compreende SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:11.
4. Anticorpo humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende (i) uma cadeia pesada compreendendo a mesma sequência de aminoácidos que a sequência de aminoácidos da cadeia pesada codificada pelo plasmídeo depositado no American Type Culture Collection (ATCC) como PTA-10772 e (ii) uma cadeia leve compreendendo a mesma sequência de aminoácidos que a sequência de aminoácidos da cadeia leve codificada pelo plasmídeo depositado no ATCC como PTA-10774.
5. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é um fragmento de ligação ao antígeno.
6. Fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o referido fragmento de ligação ao antígeno compreende um Fab, um Fab', um F(ab')2, um Fv de cadeia única (scFv), um Fv ligado a dissulfeto, um intracorpo, um IgG-CH2, um minicorpo, um tetracorpo, um triacorpo, um diacorpo, DVD-Ig, mAb2, um (scFv)2, ou um scFv-Fc.
7. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que se liga a um receptor de folato humano 1 com um Kd de 1,0 nM ou mais, ou entre 1,0 e 10 nM.
8. Método para preparar um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende (a) cultivar uma célula que expressa o referido anticorpo; e (b) isolar o anticorpo a partir da referida célula cultivada.
9. Imunoconjugado, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula (A) - (L) - (C) ou (C)-(L)-(A), em que: (A) é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7; (L) é um ligante; e (C) é um agente citotóxico; em que o referido ligante (L) liga (A) a (C).
10. Imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o referido ligante é um ligante clivável.
11. Imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o referido ligante é selecionado dentre o grupo que consiste em um ligante não clivável, um ligante hidrofílico e um ligante à base de ácido dicarboxílico.
12. Imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o referido ligante é selecionado dentre o grupo consistindo em: N-succinimidil 4-(2-piridilditio)pentanoato (SPP) ou N-succinimidil 4-(2-piridilditio)-2-sulfopentanoato (sulfo-SPP); N- succinimidil 4-(2-piridilditio)butanoato (SPDB) ou N-succinimidil 4-(2- piridilditio)-2-sulfobutanoato (sulfo-SPDB); N-succinimidil 4- (maleimidometil) ciclohexanecarboxilato (SMCC); N-sulfosuccinimidil 4-(maleimidometil) ciclohexanecarboxilato (sulfoSMCC); N- succinimidil-4-(iodoacetil)-aminobenzoato (SIAB); e N-succinimidil-[(N- maleimidopropionamido)-tetraetilenoglicol] éster (NHS-PEG4- maleimida).
13. Imunoconjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que o referido agente citotóxico é selecionado dentre o grupo consistindo em um maitansinoide, análogo de maitansinoide, benzodiazepina, taxoide, CC-1065, análogo de CC-1065, duocarmicina, análogo de duocarmicina, caliqueamicina, dolastatina, análogo de dolastatina, auristatina, derivado de tomaimicina, e derivado de leptomicina ou uma pró-droga do agente.
14. Imunoconjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que o referido agente citotóxico é N(2')-deacetil-N(2')-(3-mercapto-1-oxopropil)-maitansina (DM1) ou N(2')-deacetil-N(2')-(4-mercapto-4-metil-1-oxopentil) maitansina (DM4).
15. Imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o referido imunoconjugado compreende (A) um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo o domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO:4 e o domínio variável de cadeia ligeira de SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:11; e (C) um maitansinoide.
16. Imunoconjugado, caracterizado pelo fato de que compreende: (A) um anticorpo humanizado compreendendo o domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO:4, e o domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:11; (L) N-succinimidil-[(N-maleimidopropionamido)- tetraetilenoglicol] éster (NHS-PEG4-maleimida); N-succinimidil 4-(2- piridilditio)butanoato (SPDB); ou N-succinimidil 4-(2-piridilditio)-2- sulfobutanoato (sulfo-SPDB); e (C) N(2')-deacetil-N(2')-(4-mercapto-4-metil-1-oxopentil) maitansina (DM4); em que (L) liga (A) a (C).
17. Imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 16, caracterzado pelo fato de que o referido imunoconjugado compreende (A) um anticorpo humanizado compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a mesma sequência de aminoácidos que a sequência de aminoácidos da cadeia pesada codificada pelo plasmídeo depositado na American Type Culture Collection (ATCC) como PTA-10772 e uma cadeia leve compreendendo a mesma sequência de aminoácidos que a sequência de aminoácidos da cadeia leve codificada pelo plasmídeo depositado na ATCC como PTA-10774; (L) N-succinimidil 4-(2-piridilditio)-2-sulfobutanoato (sulfo- SPDB); e (C) N(2')-deacetil-N(2')-(4-mercapto-4-metil-1-oxopentil) maitansina (DM4).
18. Imunoconjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 17, caracterizado pelo fato de que compreende ainda 2 a 6 agentes citotóxicos.
19. Reagente de diagnóstico, caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, como definido qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que o referido anticorpo é marcado.
20. Reagente de diagnóstico, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a referida marcação é selecionada dentre o grupo consistindo em um marcador radioativo, um fluoróforo, um cromóforo, um agente de imagem e um íon de metal.
21. Uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou imunoconjugado, como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 e 9 a 18, caracterizado pelo fato de que é na preparação de uma composição farmacêutica para inibir crescimento de tumor em um indivíduo.
22. Uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz do imunoconjugado tendo a fórmula (A) - (L) - (C) ou (C)-(L)-(A), em que: (A) é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, que se liga especificamente a um receptor de folato humano 1; (L) é um ligante; e (C) é uma citotoxina selecionada dentre o grupo consistindo em um maitansinoide e um análogo de maitansinoide; em que o referido ligante (L) liga (A) a (C), o referido uso sendo caracterizado pelo fato de que é na preparação de uma composição farmacêutica para tratar câncer em um indivíduo.
23. Uso de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o referido imunoconjugado compreende: (A) um anticorpo humanizado compreendendo o domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO:4, e o domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:11; (L) N-succinimidil-[(N-maleimidopropionamido)- tetraetilenoglicol] éster (NHS-PEG4-maleimida); N-succinimidil 4-(2- piridilditio)butanoato (SPDB); ou N-succinimidil 4-(2-piridilditio)-2- sulfobutanoato (sulfo-SPDB); e (C) N(2')-deacetil-N(2')-(4-mercapto-4-metil-1-oxopentil) maitansina (DM4).
24. Uso de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o referido imunoconjugado compreende: (A) um anticorpo humanizado compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a mesma sequência de aminoácidos que a sequência de aminoácidos que a cadeia pesada codificada pelo plasmídeo depositado na American Type Culture Collection (ATCC) como PTA-10772 e uma cadeia leve compreendendo a mesma sequência de aminoácidos que a sequência de aminoácidos da cadeia leve codificada pelo plasmídeo depositado na ATCC como PTA-10774; (L) N-succinimidil 4-(2-piridilditio)-2-sulfobutanoato (sulfo- SPDB); e (C) N(2')-deacetil-N(2')-(4-mercapto-4-metil-1-oxopentil) maitansina (DM4).
25. Uso de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o referido imunoconjugado compreende (A) um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo o domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO:4 e o domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:11; (C) um maitansinoide.
26. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 25, caracterizado pelo fato de que o tumor ou câncer é selecionado dentre o grupo consistindo em câncer de ovário, câncer de cérebro, câncer de mama, câncer de útero, câncer de endométrio, câncer pancreático, câncer renal, câncer de peritônio e câncer de pulmão.
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