[go: up one dir, main page]

RU2595424C2 - Способы конъюгации - Google Patents

Способы конъюгации Download PDF

Info

Publication number
RU2595424C2
RU2595424C2 RU2011153288/10A RU2011153288A RU2595424C2 RU 2595424 C2 RU2595424 C2 RU 2595424C2 RU 2011153288/10 A RU2011153288/10 A RU 2011153288/10A RU 2011153288 A RU2011153288 A RU 2011153288A RU 2595424 C2 RU2595424 C2 RU 2595424C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
antibody
conjugate
linker
dmx
reaction
Prior art date
Application number
RU2011153288/10A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2011153288A (ru
Inventor
Бренда А. КЕЛЛОГ
Раджиева Сингх
Рави В. Дж. Чари
Original Assignee
Иммьюноджен, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=43298108&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RU2595424(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Иммьюноджен, Инк. filed Critical Иммьюноджен, Инк.
Publication of RU2011153288A publication Critical patent/RU2011153288A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2595424C2 publication Critical patent/RU2595424C2/ru

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/38—Antigens from snakes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/42—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum viral
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68033—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a maytansine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6863—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from stomach or intestines cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6891—Pre-targeting systems involving an antibody for targeting specific cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D213/62—Oxygen or sulfur atoms
    • C07D213/70—Sulfur atoms
    • C07D213/71—Sulfur atoms to which a second hetero atom is attached
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D498/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D498/12—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains three hetero rings
    • C07D498/14—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ приготовления очищенного конъюгата в растворе, включающий приведения в контакт майтансиноидной молекулы, содержащей тиоловую группу, с гетеробифункциональным линкерным реагентом для ковалентного присоединения линкера к майтансиноидной молекуле, затем конъюгацию антитела с майтансиноидной молекулой, связанной с линкерами, путем реакции полученной неочищенной смеси с антителом в растворе, имеющем рН от примерно 4 до примерно 9, и применение к полученной смеси тангенциальной поточной фильтрации, диализа, гелевой фильтрации, адсорбционной хроматографии, селективного осаждения или их комбинации для получения очищенного конъюгата. Способ по настоящему изобретению не требует проведения очистки промежуточных соединений, дает высокий выход конъюгатов высокой чистоты и гомогенности без межцепочечных поперечных сшивок и инактивированных остатков линкера и может найти дальнейшее применение в получении лекарственных препаратов на основе соответствующих конъюгатов. 8 з.п. ф-лы, 25 ил., 1 табл., 8 пр.

Description

Область техники
Это изобретение относится к новому способу конъюгации эффекторной группы (напр., цитотоксичного агента) или репортерной группы (напр., радиоактивной метки) со связывающимся с клеткой агентом, таким как антитело или его фрагмент, с помощью биофункционального линкера. Более конкретно, это изобретение относится к новому способу конъюгации эффекторной группы (напр., майтансиноид) или репортерной группы (напр., радиоактивной метки) со связывающимся с клеткой агентом (напр., антителом или его фрагментом) при посредстве биофункционального линкера, таким образом, что способ исключает этапы, которые приводят к образованию нежелательных гидролизованных молекул или нежелательных поперечно-сшитых молекул, образовавшихся в результате внутримолекулярных или межмолекулярных реакций.
Уровень техники
Конъюгаты связывающихся с клетками агентов, таких как антитела, с эффекторными группами, такими как маленькие цитотоксичные агенты или цитотоксичные белки, представляют огромный интерес для развития антираковой терапии (Richart, A.D., and Tolcher, A.W., 2007, Nature Clinical Practice, 4, 245-25). Эти конъюгаты являются опухолеспецифичными благодаря высокой специфичности отобранных антител против антигенов, экспрессирующихся на клеточной поверхности опухолевых клеток. При специфичном связывании с опухолевой клеткой, конъюгат антитела с цитотоксичным агентом проникает внутрь и разрушается внутри раковой клетки-мишени, таким образом высвобождая активный цитотоксичный агент, который ингибирует жизненно важные клеточные функции, такие как динамику миктротрубочек или репликацию ДНК, что приводит к гибели раковой клетки. В связывании антител с цитотоксичными агентами принимают участие различные линкеры, с целью обеспечить доставку агента внутрь клетки путем интернализации и процессирования конъюгата, в то же время поддерживая желаемую стабильность конъюгата в плазме. Эти линкеры включают дисульфидные линкеры, разработанные с различными степенями стерического несоответствия, влияющими на кинетику их восстановления внутриклеточным тиолом, расщепляемые пептидные линкеры, такие как валин-цитруллиновое соединение, и нерасщепляемые линкеры, такие как тиоэфирное соединение (Widdison, W., et al., J.Med. Chem., 2006, 49, 4392-4408; Erickson, H., et al., Cancer Res., 2006, 66, 4426-4433).
Конъюгаты связывающихся с клетками агентов, таких как антитела, с метками или репортерными группами, полезны для применения для иммуносцинтиграфии опухолей у пациентов с раком, применения в иммунологических анализах для диагностики различных болезней, терапии рака с использованием связанных с радиоактивными нуклидами конъюгатов, и применения в аффинной хроматографии для очистки биоактивных агентов, таких как белки, пептиды и олигонуклеотиды. Метки репортерных групп, которые конъюгируют со связывающимся с клетками агентами, включают флюрофоры и аффинные метки, такие как биотин.
Традиционный способ конъюгации связывающихся с клетками агентов, таких как антитела (Ат), с эффекторной группой (напр., цитотоксичным агентом) или репортерной группой (напр., радиоактивной меткой) посредством нерасщепляемого соединения (такого как тиоэфирное соединение) состоит из двух различных этапов реакций с антителом и требует использования этапа очистки. В первом реакционном этапе антитело реагирует с гетеробифункциональным линкером, несущим две различные химически активные группы (например, Х и Y). Например, в одном подходе, реакция химически активных остатков антител (таких как остатки аминокислоты лизин) с Х реактивной группой (такой как N-гидроксисукцинимидный сложный эфир) гетеробифункционального реагента приводит к образованию линкера с Y реактивной группой из одного или более химически активных остатков антитела (такой как остаток аминокислоты лизин). Первично модифицированный продукт антитела должен быть очищен от избытка линкера или гидролизированного реагента линкера перед переходом на следующий этап. На втором этапе реакции модифицированное линкером антитело, содержащее Y-реактивную группу (такую как малеимид или галоацетамид) реагирует с эффектором, таким как эффекторная группа (С) (напр., цитотоксичный агент), содержащим химически активную группу, такую как тиол, для создания конъюгата антитело-эффектор, который снова очищают на дополнительном этапе очистки (см., напр., патент США 5,208,020, 5,416,064, или 5,024,834). Таким образом, при вышеописанном способе необходимы по крайней мере два этапа очистки.
Другой подход, который включает два этапа реакции и очистки для конъюгации антитела с эффекторной или репортерной группой, использует реакцию остатков тиола в антителе (образованных благодаря модификации антитела с тиол-образующими реагентами, такими как 2-иминотиолан, или благодаря мутагенезу для включения чужеродных цистеиновых остатков, или благодаря расщеплению нативных дисульфидных связей) с гомобифункциональным линкером Y-L-Y, содержащим Y-реактивные группы (такие как малеимид или галоацетамид).
Основным препятствием для включения химически активной группы Y, такой как малеимид (или галоацетамид) в антитело или пептид является склонность химически активных малеимидных (или галоацетамидных) групп подвергаться внутри- или межмолекулярной реакции с нативными остатками гистидина, лизина, тирозина или цистеина в антителе или пептиде (Papini, A. et al., Int. J.Pept. Protein Res., 1992, 39, 348-355; Ueda, T. et al.. Biochemistry, 1985, 24, 6316-6322), и водной инактивации Y-малеимидной группы. Нежелаемая внутри- или межмолекулярная реакция малеимидных (или галоацетамидных) групп Y, включенных в антитело с нативными остатками гистидина, лизина или цистеина в антителе, и водная инактивация Y-малеимидной группы перед второй реакцией с эффекторной или репортерной группой С приводят к образованию поперечно-сшитых белков или гетерогенных конъюгатов и снижают эффективность второй реакции с эффекторной или репортерной группой С.Гетерогенный продукт конъюгации - поперечно-сшитый белок или пептид, образовавшийся вследствие нежелаемой реакции первично включенной группы Y (такой как малеимидная группа) с нативными группами в антителе или пептидах (таких как гистидин, лизин, тиозин или цистеин) или с неактивными остатками малеимида, образованными при водной инактивации, может обладать худшей активностью и стабильностью, чем желаемый гомогенный продукт конъюгации.
Способы конъюгации антител с тиол-содержащими цитотоксичными агентами благодаря дисудьфидным связям описаны выше (см., напр., патенты США 5,208,020, 5,416,064, 6,441,163, Патент США Публикация No. 2007/0048314 A1). Эти способы включают первичную реакцию антитела с гетерофункциональным реагентом, за которой следует вторая реакция с тиол-содержащим цитотоксичным агентом. Альтернативный способ описан в патенте США 6,441,163 В1, в котором связанный с дисульфидом химически активный сложный эфир цитотоксического агента вначале очищается и затем реагирует с антителом, но это включает дополнительную реакцию и этап очищения из-за содержащего тиоловую группу цитотоксичного агента перед этапом реакции с антителом.
Следующее препятствие для современного способа создания конъюгатов со связывающимся с клетками агентами - необходимость двух этапов очищения, которые понижают общий выход и также делают способ громоздким и сравнительно дорогим.
Учитывая вышеизложенное, в данной области техники существует потребность в разработке улучшенных способов приготовления композиций конъюгатов связывающегося с клетками агента и препарата, которые обладают высокой степенью чистоты и при их приготовлении можно исключить трудоемкие этапы, что сокращает время и делает способ более экономным. Изобретение предоставляет такой способ. Эти и другие преимущества изобретения, а также дополнительные особенности изобретения, будут раскрыты в описании изобретения, предоставляемого здесь.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение описывает способ конъюгации для создания нерасщепляемых, соединенных тиэфирной связью конъюгатов с формулой C-L-CBA, где С представляет собой эффекторную или репортерную молекулу (напр., цитотоксичный агент или радиоактивную метку), L - линкер и СВА - связывающийся с клеткой агент (напр., антитело или его фрагмент), путем использования прямой реакции тиол-содержащего цитотоксичного агента (напр., майтансиноида) с гетеро- или гомо-бифункциональным реагентом (напр., расщепляемым или нерасщепляемым линкером), за которой следует смешивание неочищенной реакционной смеси со связывающимся с клеткой агентом (напр., антителом или его фрагментом), тем самым создавая неращепляемый соединенный тиэфирной связью конюъюгат путем способа, являющегося более эффективным, дающего больший выход и сравнительно более экономичного. Другое важное преимущество состоит в том, что такой способ конъюгации дает соединенный тиэфирной связью нерасщепляемый конъюгат, не имеющий внутри цепочки поперечно-сшитых белков или инактивированных остатков (напр., остатков малеимида или галоаетамида). Новые способы, раскрытые в этой заявке, могут применяться для приготовления любого конъюгата, представленного вышеупомянутой формулой.
Краткое описание чертежей
На фигуре 1 показана конъюгация антитела с реакционной смесью майтансиноида DM1 (или DM4) и Малеимида-PEGn-NHS линкера
На Фигуре 2 показан SDS-PAGE в восстанавливающих условиях Ат-(PEG4-Mal)-DM4 конъюгатов, приготовленных с использованием способа, описанного в этом изобретении, по сравнению с конъюгатами, приготовленными с использованием традиционного 2-этапного способа. Каждая дорожка с образцом содержала 10 мкг белка; гель был окрашен кумасси голубым (Coomassie blue). Дорожки 1 и 2 содержали маркеры молекулярной массы. Дорожка 3 содержала конъюгат, приготовленный традиционным двухэтапным способом с 6.1 DM4 на Ат. Дорожка 4 содержала конъюгат, приготовленный способом, описанным в этом изобретении, и содержащий 6.2 DM4 на Ат.
На Фигуре 3 показан белковый LabChip электрофорез конъюгата Ат-(PEG4-Mal)-DM4, приготовленного с использованием способа, описанного в этом изобретении, по сравнению с конъюгатом, приготовленным с использованием традиционного 2-этапного способа. А. Белковый LabChip электрофорез в восстанавливающих условиях (Agilent 2100 Bioanalyzer/Agilent Protein 230 kit) AT-(PEG4-Mal)-DM4 конъюгатов. Дорожка 1: маркер молекулярной массы; дорожка 2: AT-PEG4-Mal-DM4, 6.2 D/Ab, синтезированный с использованием способа, описанного в этом изобретении; лунка 3: AT-PEG4-Mal-DM4, 6.1 D/Ат, синтезированный с использованием 2 этапного способа конюъюгации; дорожка 4: неконъюгированное Ат (0,24 микрограмма общего белка на каждую дорожку). Полосы верхнего маркера, системного пика и нижнего маркера представляют дополнительные маркеры, добавленные из кита. В. Количественный анализ белковых полос из белкового LabChip электрофореза.
На Фигуре 4 показан MS конъюгата AT-(PEG4-Mal)-DM4, приготовленного с использованием способа, описанного в этом изобретении, по сравнению с конъюгатом, приготовленным с использованием традиционного 2-этапного способа. A. MS конъюгата, приготовленного по традиционному двухэтапному способу с 6.1 DM4 на Ат. Вследствие значительной гетерогенности конъюгата MS пики невозможно хорошо различить. В. MS конъюгата, приготовленного по способу, описанному в этом изобретении, и содержащего 6.2 DM4 на Ат. Вследствие гомогенности конъюгата,, MS пики хорошо различимы.
На Фигуре 5 показано связывание конъюгата анти-CanAg антитело-PEG4-Mal-DM1 с 6.7 DM1 на антитело (приготовленного с использованием способа, описанного в этом изобретении) по сравнению со связыванием немодифицированного антитела против CanAg антиген-экспрессирующих COL0205 клеток. Связывание было измерено в единицах флюоресценции.
На Фигуре 6 показана цитотоксичность in vitro конъюгата анти-CanAg Антитело-PEG4-Mal-DM1 с 6.7 DM1 на антитело (приготовленного с использованием способа, описанного в этом изобретении) против CanAg антиген-экспрессирующих COLO205 клеток. Конъюгат был добавлен к COLO205 клеткам и после 5 дней непрерывной инкубации с конъюгатом жизнеспособность клеток была подсчитана с использованием WST-оценки. Контрольный эксперимент для демонстрации специфичности конъюгата был проведен с использованием избытка неконъюгированных анти CanAg антител для блокирования связывания и цитотоксичности конъюгата против раковых клеток-мишеней.
На Фигуре 7 показана конъюгация антитела с реакционной смесью DM1 (или DM4) и Малеимид-сульфо-NHS линкером.
На Фигуре 8 показан SDS-PAGE в восстанавливающих условиях конъюгата Ат-(сульфо-Mal)-DM1, приготовленного с использованием способа, описанного в этом изобретении, по сравнению с конъюгатом, приготовленным с использованием традиционного 2-этапного способа. Каждая дорожка с образцом содержала 10 мкг белка; гель был окрашен кумасси голубым. Дорожка 1 содержала маркер молекулярной массы. Дорожки 3 и 5 содержали конъюгаты, приготовленные по способу, описанному в этом изобретении, и содержащие 3.6 и 5.6 DM1 на Ат, соответственно. Дорожки 2 и 4 содержали конъюгаты, приготовленные по традиционному двухэтапному способу и содержащие 4.0 и 5.7 DM1 на Ат, соответственно.
На Фигуре 9 показан белковый LabChip электрофорез конъюгата Ат-(сульфо-Mal)-DM1, приготовленного с использованием способа, описанного в этом изобретении, по сравнению с конъюгатом, приготовленным с использованием традиционного 2-этапного способа. А. Белковый LabChip электрофорез в восстанавливающих условиях (Agilent 2100 Bioanalyzer/Agilent Protein 230 kit) Ат-(сульфо-Mal)-DM1 конъюгатов. Дорожка 1: маркер молекулярной массы; дорожка 2: некогьюгировавшее Ат; дорожка 3: Ат-сульфо-Mal-DM1, 5.7 D/Ат, синтезированный с использованием 2-этапного способа конъюгации; дорожка 4: Ат-сульфо-Mal-DM1, 5.6 D/Ат, синтезированный с использованием способа, описанного в этом изобретении; 0,22 микрограмма общего белка, помещенного в лунку. Полосы верхнего маркера, системного пика и нижнего маркера представляют дополнительные маркеры, добавленные из набора. В. Количественный анализ белковых полос из белкового LabChip электрофореза.
На Фигуре 10 показано LC-MS сравнение конъюгата Антитело-(Сульфо-Mal)-DM1, приготовленного по способу, описанному в этом изобретении, и конъюгата, приготовленного по традиционному двухэтапному способу конъюгации. A. MS конъюгата с 3.6 DM1/Ab, приготовленного с использованием способа, описанного в этом изобретении, показывает гомогенный конъюгат с 1-6 DM1-несущим дискретным конъюгатными пиками. В. MS конъюгата с 4.0 DM1/Ab, приготовленного по традиционному двухэтапному способу конъюгации. MS для конъюгата, приготовленного по традиционному двухэтапному способу, показывает пики, соответствующие конъюгатам, и конъюгаты с гидролизованными или поперечно-сшитыми линкерами (такие как конъюгат с 2 DM1, плюс один L, 2L и 3L), указывающие на гетерогенный продукт.
На Фигуре 11 показано связывание анти-CanAg антитело-сульфо-Mal-DM1 конъюгата с 5.6 DM4 на антитело (приготовленного с использованием способа, описанного в этом изобретении) по сравнению со связыванием немодифицированного антитела против CanAg антиген-экспрессирующих COLO205 клеток. Связывание было измерено в единицах флюоресценции.
На Фигуре 12 показана цитотоксичность in vitro конъюгата анти-CanAg Антитело-сульфо-Mal-DM1 с 5.6 DM4 на антитело (приготовленного с использованием способа, описанного в этом изобретении) против CanAg антиген-экспрессирующих COLO205 клеток. Конъюгат был добавлен к COLO205 клеткам и после 5 дней непрерывной инкубации с конъюгатом жизнеспособность клеток была оценена с использованием WST-8 оценки. Контрольный эксперимент для демонстрации специфичности конъюгата был проведен с использованием избытка неконъюгированных анти CanAg антител для блокирования связывания и цитотоксичности конъюгата против раковых клеток-мишеней.
На Фигуре 13 показана конъюгация антитела с реакционной смесью DM1 или DM4) и сульфо-NHS SMCC линкер.
На Фигуре 14 показан SDS-PAGE в восстанавливающих условиях at-(SMCC)-DM1 конъюгата, приготовленного с использованием способа, описанного в этом изобретении, по сравнению с конъюгатом, приготовленным с использованием традиционного 2-этапного способа. Каждая дорожка с образцом содержала 10 микрограмм общего белка; гель был окрашен кумасси голубым (Coomassie blue). Дорожка 1 содержит маркер молекулярной массы, дорожка 2 содержит неконъюгированное Ат, дорожка 3 содержит конъюгат, приготовленный по традиционному двухэтапному способу с 3.1 DM1 на Ат и дорожка 4 содержит конъюгат, приготовленный по способу, описанному в этом изобретении с 3.1 DM1 на Ат.
На Фигуре 15 показан белковый LabChip электрофорез конъюгата At-(SMCC)-DM1, приготовленного с использованием способа, описанного в этом изобретении, по сравнению с конъюгатом, приготовленным с использованием традиционного 2-этапного способа. А. Белковый LabChip электрофорез в восстанавливающих условиях (Agilent 2100 Bioanalyzer/Agilent Protein 230 kit) Ат-SMCC-DMl конъюгатов. Дорожка 1: маркер молекулярной массы; дорожка 2: Ат-SMCC-DM1, 3.1 D/Ат, синтезированный с использованием способа, описанного в этом патенте; дорожка 3: неконъюгированное Ат; дорожка 4: Ат-SMCC-DM1, 3.1 D/Ат, синтезированный с использованием 2-этапного способа конъюгации; (0,24 микрограмма общего белка на каждую дорожку). Полосы верхнего маркера, системного пика и нижнего маркера представляют дополнительные маркеры, добавленные из набора. В. Количественный анализ белковых полос из белкового LabChip электрофореза.
На Фигуре 16 показано LC-MS сравнение конъюгата Антитело-(SMCC)-DM1, приготовленного по способу, описанному в этом изобретении, с конъюгатом, приготовленным по традиционному двухэтапному способу конъюгации. A. MS конъюгата, приготовленного по последовательному двухэтапному способу с 3.1 DM1 на Ат. Каждый основной пик конъюгата имеет связанные боковые пики, возникающие из-за присутствия гидролизованных и поперечно-сшитых линкерных фрагментов. В. MS конъюгата, приготовленного по способу, описанному в этом изобретении с 3.1 DM1 на Ат. Вследствие гомогенности конъюгата MS пики были хорошо различимы.
На Фигуре 17 показаны предполагаемые механизмы межцепочечного поперечного сшивания и инактивации малеимида во время конъюгации при традиционном 2-этапном способе.
На Фигуре 18 показан SDS PAGE в невосстанавливающих условиях конъюгата Ат-(сульфо-Mal)-ВМ4, приготовленного с использованием способа, описанного в этом изобретении, и погашение свободного DM4 тиола (после первичной реакции соединения DM4+NHS-сульфо-Mal гетеробифункциональный агент) с использованием 4-малеимидомасляной кислоты перед реакцией конъюгации с антителом. Каждый образец содержал 10 мкг белка; гель был окрашен кумасси голубым (Coomassie blue).. Дорожки 1 и 5 содержали маркеры молекулярной массы. Дорожка 2 содержала одно Ат. Дорожка 3 содержала конъюгат, приготовленный по способу, описанному в этом изобретении без добавления 4-малеимидомасляной кислоты. Дорожка 4 содержала конъюгат, приготовленный по способу, описанному в этом изобретении с добавлением 4-малеимидомасляной кислоты после первичного DM4+NHS-Сульфо-Mal гетеробифункционального реагента (предшествующего этапу конъюгации с антителом).
На Фигуре 19 показано приготовление конъюгата антитела с дисульфидной связью с использованием реакционной смеси DM1 (или DM4) и SPDB линкера.
На Фигуре 20 показано приготовление конъюгата антитело-майтансноид как с дисульфидным, так и с нерасщепляемым PEG4-Mal линкерами путем конъюгации антитела с неочищенной реакционной смесью DM1 (или DM4) и SPDB и NHS-PEG4-Mal линкерами.
На Фигуре 21 показан MS конъюгата антитело-майтансиноид как с дисульфидным, так и с нерасщепляемым PEG4-Mal линкерами (приготовленного путем конъюгации антитела с неочищенной реакционной смесью DM1, или DM4, и SPDB и NHS-PEG4-Mal линкерами).
На Фигуре 22 показана конъюгация антитела с реакционной смесью DM1 (или DM4) и SMCC линкером.
На Фигуре 23 показан MS конъюгата антитело - SMCC-DM1, приготовленного с использованием SMCC по способу, описанному в этом изобретении, содержащего в среднем 3.1 DM1 на антитело.
На Фигуре 24 показано приготовление конъюгата антитела с дисульфидной связью с использованием реакционной смеси DM1 (или DM4) и SSNPB линкера.
На Фигуре 25 показана конъюгация антитела с реакционной смесью DM1 (или DM4) и гетеробифункциональным линкером с алифатической линейной углеродной цепью
Детальное описание изобретения
Некоторые варианты воплощений изобретения детально описаны не будут, их примеры иллюстрируются в прилагаемых структурах и формулах. При том, что изобретение будет описано в сопровождении перечисленных вариантов воплощения это не означает, что изобретение ими ограничивается. Напротив, подразумевается, что изобретение покрывает все альтернативы, модификации и эквиваленты, которые можно включить в пределы притязаний настоящего изобретения, как определено объемом формулы изобретения. Специалист в данной области узнает многие способы и материалы, подобные или равноценные тем, что описаны здесь, которые можно использовать при осуществлении на практике данного изобретения.
Это изобретение описывает новый способ конъюгации тиол-содержащего эффектора (напр., цитотоксичного агента) или репортерной группы (напр., радиоактивной метки) со связывающимся с клеткой агентом (напр., антителом), в котором тиоловая группа, содержащая эффектор или репортер, вначале реагирует с бифункциональным линкерным реагентом в органическом, водном, или смешанным органическом/водном растворителе, после чего следует реакция с неочищенной реакционной смесью со связывающимся с клетками агентом в органическом, водном, или смешанным органическим/водном растворителях.
Сокращения
Сокращения, использованные в описаниях Схем и Примеров, следующие:
С = Эффектор или репортерная группа (напр., цитотоксичный агнет или радиоактивная метка)
L = Линкер (напр., расщепляемый или нерасщепляемый линкер)
Х = амин-реактивная группа (например, N-гидроксисукцимидный эфир (NHS сложный эфир), сульфо-NHS эфир, p-нитрофенола эфир, тетрафлюоросульфонат фенил эфир, 1-гидрокси-2-нитро-бензол-4-сульфокислоты эфир)
Y = Малеимид, или галоацетамид (йодацетамид, бромацетамид)
Yb - химически активная смешанная дисульфидная группа (напр., 2-пиридилдитио, 4-пиридилдитио, 2-нитро-пиридилдитио, 5-нитро-пиридилдитио, 2-карбокси-5-нитро-пиридилдитио)
X' = амидное соединение
Y' = тиоэфирное (R-S-R1) или селеноэфирное (R-Se-R1) соединение
Yb' = дисульфидное (R-S-S-R1) соединение
В одном варианте воплощения настоящего изобретения описан способ приготовления связанного тиэфирным линкером конъюгата связывающегося с клеткой агента с эффекторной или репортерной молекулой, способ включает в себя следующие этапы: а) контакт с гетеробифункциональным линкером формулы X-L-Y с тиол-содержащей эффекторной или репортерной молекулой С (например, а майтансиноид или радионуклид) в водном растворителе, органическом растворителе или смешанных органических/водных реакционных смесях, в результате чего получается промежуточный продукт с формулой X-L-Y'-C; b) смешивание реакционной смеси без очистки со связывающимся с клетками агентом, таким как антитело (Ат) для образования конъюгата с формулой AT-(X'-L-Y'-C)m, где L - замещенная или незамещенная линейная, разветвленная или цикличная алкильная, алкенильная, или алкинильная группа, несущая 1-10 атомов углерода, простая или замещенная арильная единица (заместитель выбирается из алкил, алкокси, галоген, нитро, флюоро, карбокси, сульфонат, фосфат, амино, карбонил, пиперидино) или полиэтиленгликоль содержащая единица (предпочтительно 1-500 PEG спейсер, или более предпочтительно 1-24 PEG спейсер, или еще более предпочтительно 2-8 PEG спейсер); Х и Y - амин- или тиол-реактивная группа, такая как N-гидроксисукцинимидный эфир и малеимид или галоацетамид; Ат - антитело; m - число от 1 до 20; X' - модифицированный Х сайт (напр., амидное соединение) реакции с антителом; Y' - модифицированный Y сайт (напр., тиоэфирное соединение) реакции с, например, цитотоксичным агентом или радиоактивной меткой эффекторной или репортерной группы; и с) очистка конъюгата путем тангенциальной поточной фильтрации, диализа или хроматографии (напр., гелевая фильтрация, ионообменная хроматография, хроматография с гидрофобным взаимодействием) или комбинация из этого. Предпочтительно, Y - тиол-реактивная группа, выбранная из малеимида или галоацетамида. Предпочтительно, L - линейная или разветвленная алкильная группа с 1-6 атомами углерода или 2-8 PEG спейсером. Предпочтительно, С - цитотоксичный агент, выбранный из майтансиноида, а СС-1065 аналога, таксана, а DHK-связывающего агента, и более предпочтительно это майтансиноид.
Эта реакционная последовательность представлена в формулах 1 и 2:
Figure 00000001
Figure 00000002
не включает никакой очистки промежуточного продукта X-L-Y'-C, и таким образом дает преимущество прямого смешивания его с антителом (неочищенный промежуточный продукт добавляется к антителу или антитело добавляется к неочищенному промежуточному продукту), тем самым делая способ предпочтительным для конъюгации, поскольку он исключает необходимость трудоемкого этапа очистки. Важно, что этот способ дает на выходе гомогенный конъюгат без поперечных сшивок между цепочками белка или инактивированных малеимидных остатков, в противоположность этому при традиционной двухэтапной реакции и последующей очистке наблюдаются поперечные сшивки между цепочками белка и инактивированные малеимидные остатки.
Реакция 1 может быть осуществлена при высоких концентрациях гетерофункционального линкера, X-L-Y, и эффекторная или репортерная группа С в водном растворителе, органическом растворителе или органических/водных реакционных смесях приводит к ускорению реакции по сравнению с более низкими концентрациями в водных растворителях для конъюгатов, приготовленных в ходе традиционной двухэтапной реакции и соответствующей очистки.
Промежуточный продукт X-L-Y'-C, образующийся в реакции 1, можно хранить неочищенном в замороженном виде, при низких температурах в водном растворителе с подходящим низким рН (напр., рН ~4-6), в органических растворителях, или в смешанных органических/водных реакционных смесях, или в лиофилизированном виде, в течение долгого периода, и можно позднее смешивать с раствором антитела для заключительной реакции конъюгации при более высоком уровне рН около 4-9, что добавляет преимущества такой последовательности реакций. Промежуточный продукт можно разводить, как указано, органическим растворителем или водным буфером, или смесью органического растворителя и водного буфере перед тем, как смешивать со связывающимся с клеткой агентом. Термин "около", используемый здесь в связи с численным значением, следует понимать как относящийся ко всем таким значениям, включая все числовые значения и незначительные их отклонения. Реакция промежуточного продукта X-L-Y'-C с антителом должна проводиться при значениях рН в промежутке от около 4 до около рН 9, предпочтительно при рН в промежутке от около 5 до 8,7, более предпочтительно при рН в промежутке от около 6,5 до около 8,5, при таких значениях рН как 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, и 8.5, в таком диапозоне значений рН или незначительных от них отклонениях. Буферы, используемые для реакции антитела с промежуточным продуктом X-L-Y'-C при предпочтительных значениях рН от около 6.5 до 8.5 являются такими буферами с величинами pKa входящими в этот промежуток значений рН, как фосфатный и HEPES буфер. Эти предпочтительные буферы не должны обладать первичными или вторичными амино группами, или другими химически активными группами, которые могут реагировать с линкером Х (таким как N-гидроксисукцимидный эфир).
Стехиометрический или слабый избыток С по сравнению с гетеробифункциональным линкером X-L-Y используется в первой реакции для гарантии того, что вся Y группа (такая как малеимид) прореагировала, перед тем как неочищенная сместь добавляется к антителу. Может быть сделана необязательная дополнительная обработка погашающим реагентом (таким как 4-малеимидомасляная кислота, 3-малеимидопропионовая кислота, или N-этилмалеимид, или йодацетамид, или йодацетамидопропионовая кислота) для гарантии того, что весь непрореагировавший С инактивирован перед тем, как сделают смесь с антителом, чтобы минимизировать всю нежелательную тиол-дисульфидную внутрицепочечную реакцию с нативными дисульфидными группами антитела. После погашения полярно заряженными тиол-блокирующими реагентами (такими как 4-малеимидомасляная кислота или 3-малеимидопропионовая кислота), избыточный непрореагировавший С превращается в полярно заряженный аддукт, который легко можно отделить от ковалентно связанного конъюгата. Необязательно, конечная реакционная смесь 2, до очистки, обрабатывается нуклеофилами, такими как аминогруппа, содержащая нуклеофилы (напр., лизин, таурин, гидроксиламин) для блокирования всего непрореагировавшего линкера (X-L-Y'-C).
Альтернативный способ для реакции антитела с неочищенной первичной реакционной смесью майтансиноидов (DMx) и гетеробифункционального линкера включает смешивание первичной реакционной смеси DMx и гетеробифункционального линкера (перед завершением DMx-линкерной реакции) с антителом при низком рН (рН ~5), после чего следует добавление буфера или основания для увеличения рН до около 6.5-8.5 для реакции конъюгации.
Этот новый способ применяется для приготовления конъюгата антитела с цитотоксичным препаратом майтансиноид. Конъюгаты антитело-майтансиноид, приготовленные с использованием этого способа, кратко описанного в реакционной последовательности 1-2, неожиданно оказались значительно более гомогенными по сравнению с конъюгатами, приготовленными по традиционной двухэтапной реакции и соответствующей очистке, основываясь на характеристике конъюгатов на SDS-PAGE в восстанавливающих условиях, белковом LabChip электрофорезе, и масс-спектрометрии. Способ конъюгации, описанный в этом изобретении, который включает последовательность реакций 1-2, также не требует никакого промежуточного этапа очистки и, следовательно, значительно более удобен, чем традиционный двухэтапный способ.
Во втором варианте воплощения изобретения, способ приготовления соединенного тиэфирной связью конъюгата связывающегося с клеткой агента с эффекторной или репортерной молекулой описывается, включая следующие этапы: а) контакт гомобифункционального линкера с формулой Y-L-Y с тиол- или амин-содержащей эффекторной или репортерной группой С (такой как цитотоксичный агент) в водном растворителе, органическом растворителе или смешанных водных/органических реакционных смесях для получения Y-L-Y'-C, b) смешивание реакционной смеси без очистки с антителом в водном растворе или водной/органической смеси для получения конъюгата с формулой AT-(Y'-L-Y'-C)m, где, L определено выше; Y - тиол- или амин-реактивная группа, такая как малеимид или галоцетамид, или N-гидроксисукцимид или сульфо N-гидроксисукцимид; Ат - антитело; m - число от 1 до 20; Y' -модифицированный Y сайт (такой как тиоэфирный или амидный линкер) для реакции с антителом или модифицированным Y-сайтом (таким как тиоэфирная или амидная связь) для реакции с цитотоксичным агентом или эфекторной или репортерной группой и с) очистка конъюгата при помощи тангенциальной проточной фильтрации, диализа или хроматографии (гелевая фильтрация, ионообменная хроматография, хроматография гидрофобных взаимодействий) или их комбинация. Реакционная последовательность представлена в формулах 3 и 4:
Figure 00000003
Figure 00000004
не включает никакой очистки промежуточного продукта Y-L-Y'-C, и следовательно является выгодным способом конъюгации.
В третьем варианте воплощения способ приготовления соединенного тиэфирной связью конъюгата связывающегося с клеткой агента с эффекторной или репортерной молекулой описывается, включая следующие этапы: а) контакт гетеробифункционального линкера с формулой X-L-Yb с эффекторной или репортерной группой С (такой как цитотоксичный агент) в водном растворителе, органическом растворителе или смешанных водных/органических реакционных смесях для получения промежуточного продукта X-L-Yb'-C; б) смешивание реакционной смеси без очистки с антителом в водном растворе или водной/органической смеси для получения конъюгата с формулой AT-(X'-L-Yb'-C)m, где L определено выше; Yb - химически активный дисульфид, такой как пиридилдисульфид или нитропиридил дисульфид, Х - амино-реактивная группа, такая как N-гидроксисукцинимидный эфир или сульфо-N-гидроксисукцинимидный эфир; Ат - антитело; m - число от 1 до 20; Yb - модифицированный Y сайт (такой как амидный линкер) для реакции с антителом; Yb - модифицированный Yb-сайт (дисульфидный) для реакции с цитотоксичным агентом или эффекторной или репортерной группой; и в) очистка конъюгата при помощи тангенциальной проточной фильтрации, диализа или хроматографии (гелевая фильтрация, ионообменная хроматография, хроматография гидрофобных взаимодействий) или их комбинация. Реакционная последовательность представлена в формулах 5 и 6:
Figure 00000005
Figure 00000006
В четвертом варианте воплощения способ приготовления конъюгатов антитела с эффекторной или репортерной группами с двумя типами линкеров - нерасщепляемым (тиоэфирный линкер) и расщепляемым (дисульфидный линкер) описывается, включая следующие этапы: а) контакт X-L-Y и X-L-Yb линкеров с цитотоксичным агентом С для получения промежуточных соединений с формулой X-L-Y'-C и X-L-Yb'-C, б) смешивание реакционных смесей без очистки с антителом или последовательно, или одновременно, как показано в реакционной формуле 7-9:
Figure 00000007
Figure 00000008
Figure 00000009
с получением конъюгата Ат-(X'-L-Y'-C)m(X'-L-Yb'-C)m-, где определения X, L, Y', С, Yb', и m даны выше, и m' - число от 1 до 20; и в) очистка конъюгата производится путем тангенциальной поточной фильтрации, диализа или хроматографии (напр., гелевая фильтрация, ионообменная хроматография, хроматография с гидрофобным взаимодействием) или их комбинации. Эти два линкерных эффекторных промежуточных продукта (X-L-Y'-C и X-L-Yb'-C) смешиваются без очистки с антителом в различной последовательности (вначале X-L-Y'-C, затем X-L-Yb'-C, или вначале X-L-Yb'-C, затем X-L-Y'-C, или одновременно) в различных пропорциях.
Реакции 1, 3, 5 и 7-8 можно проводить при высоких концентрациях бифункционального линкера (X-L-Y, X-L-Yb или Y-L-Y) и эффекторной или репортерной группы С в водном растворителе, органическом растворителе или органических/водных реакционных смесях, что приводит к ускорению реакции по сравнению с более низкими концентрациями в водных растворителях для конъюгата, приготовленного в ходе традиционной двухэтапной реакции и соответствующей очистки, где растворимость реагентов ограничена.
Промежуточные продукты X-L-Y'-C, или Y-L-Y'-C, или X-L-Yb'-C, получаемые в реакциях 1, 3, 5, и 7-8 можно хранить в неочищенном замороженном виде, при низких температурах в водном растворителе с подходящим рН, в органических растворителях, или в смешанных органических/водных реакционных смесях, или в лиофилизированном виде, в течение долгого периода, и можно позднее смешивать с раствором антитела для заключительной реакции конъюгации, что добавляет преимущества такой последовательности реакций.
Стехиометрический или слабый избыток С по сравнению с гетеробифункциональным линкером X-L-Y или Y-L-Y, или X-L-Yb используется в первой реакции для гарантии того, что вся Y группа (такая как малеимид) прореагировала, перед тем как неочищенная сместь добавляется к антителу. Может быть сделана необязательная дополнительная обработка блокирующим реагентом (таким как 4-малеимидомасляная кислота или 3-малеимидопропионовая кислота, или N-этилмалеимид, или йодацетамид, или йодуксусная кислота) для гарантии того, что весь непрореагировавшая группа (такая как тиол) в С инактивирована перед тем, как сделают смесь с антителом, чтобы минимизировать всю нежелательную тиол-дисульфидную реакцию взаимообмена с нативными дисульфидными группами антитела. Погашение избыточного С с использованием полярно заряженных тиол-блокирующих реагентов, после первичной реакции С с бифункциональным линкером, превращает избыточный С в очень полярный растворимый в воде аддукт, который легко отделяется от ковалентно связанного конъюгата путем гелевой фильтрации, диализа или TFF. Заключительный продукт конъюгации не содержит нековалентно связанного С.Необязательно, конечные реакционные смеси 2, 4, 6 и 9 до очистки обрабатываются нуклеофилами, такими как аминогруппа, содержащая нуклеофилы (напр., лизин, таурин, гидроксиламин) для блокирования всего непрореагировавшего линкера (X-L-Y'-C, Y-L-Y'-C, или X-L-Yb'-C).
Альтернативный способ реакции антитела с неочищенной первичной реакционной смесью DMx и бифункционального линкера включает смесь первичной реакционной смеси DMx и бифункционального линкера (для завершения реакции DMx-линкер) с антителом при низком рН (рН~5), за чем следует добавление буфера или основания для повышения рН до около 6,5-8,5 для реакции конъюгации.
Множественные копии более чем одного типа эффектора могут конъюгировать с антителом при добавлении двух или более промежуточных соединений линкер-эффектор, без очистки, к антителу или последовательно, или одновременно.
ЭФФЕКТОРНАЯ(ЫЕ) ГРУППА(Ы)
Термины Эффекторная группа или Эффекторная молекула являются взаимозаменяемыми и термин «Эффекторная(ые) группа(ы)» или «Эффекторная(ые) молекула(ы)», используемый здесь, включает цитотоксические агенты. В определенном отношении может быть желательно, чтобы эффекторные группы или молекулы прикреплялись спейсерами различной длины для уменьшения потенциального стерического препятствия. Множественные копии более чем одного типа эффектора могут конъюгировать с антителом путем добавления двух или более линкер-эффекторных промежуточных продуктов, образовавшихся от двух или более различных эффекторов, без очистки, с антителом или последовательно, или одновременно.
Цитотоксичные агенты, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают химиотерапевтические агенты или структурные аналоги химиотерапевтических агентов. «Химиотерапевтический агент» - это химическое соединение, применяемое в лечении рака. Примеры химиотерапевтических агентов включают алкилирующие агенты, такие как тиотепа и циклофосфамид (CYTOXAN™); алкил сульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан, азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метилмеламины, включая алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметиломеламин; ацетогенины (особенно буллатацин и буллатацинон); камптотецин (включая синтетический аналог топотекан); бриостатин; каллистатин; СС-1065 (включая его адозелезиновые, карзелезиновые и бизелезиновые синтетические аналоги); криптофицинсы (особенно криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая синтетические аналоги, KW-2189 и CBI-TMI); элеутеробин; панкратистатин; саркодистин; спонгистатин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлоретамин, мехлоретамина оксид гидрохлорид, мелфалан, новембичин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урамустин, нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорохотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин; антибиотики, такие как энедииновые антибиотики (напр., калихемицин, особенно калихемицин гамма 1 и калихемицин тета 1, см., напр., Angew Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186 (1994); динемицин, включая динемицин А; эсперамицин; а также неокарциностатин хромофор и родственные хромопротеин эндеиновые антибиотики хромомофоры), аклациномицины, актиномицин, аутрамицин, ацазерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карзинофилин; хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин (включая морфолино-доксорубицин, цианоморфолино-доксорубицин, 2-пирролино-доксорубицин и деоксидоксорубицин), эпирабицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, нитомицины, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорабицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, циностатин, зорабицин; анти-метаболиты, такие как метотрексат и 5-флюороурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флюдарабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидеоксиуридин, доксифлюоридин, эноцитабин, флоксуридин, 5-FU; андрогены, такие как калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; анти-адреналы, такие как аминоглутетимид, митотан, трилостан; заменители фолиевой кислоты, такие как фролиновая кислота; ацеглатон; алдофосфамида гликозид; аминолевулиновая кислота; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; элфомитин; ацетат эллиптиниума; эпотилон; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевина; лентинан; лонидамин; майтансиноиды, такие как майтансин и ансамитоцины; митогуазон; мопидамол; нитракрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; подофиллиновая кислота; 2-этилгидразид; прокарбазин; PSK®; разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманиум; тенуазониевая кислота; триазиквон; 2,2',2”-трихлортриэтиламин; трихотесцены (особенно Т-2 токсин, верракурин А, роридин А и ангуидин); уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид ("Ара-С"); циклофосфамид; тиотепа; таксоиды, напр. паклитаксел (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) и доксетаксел (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); хлорамбуцил; гемцитабин; 6-тиогуанин; меркаптоурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платина; этопозид (VP-16); ифосфамид; митомицин С; митоксантрон; винкристин; винорелбин; навелбин; новантрон; тенипозид; дауномицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; СРТ-11; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифлюорометиломитин (DMFO); ретиноевая кислота; капецитабин; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого вышеуказанного вещества. Также в это определение включены анти-гормональные агенты, которые регулируют или ингибируют действие гормонов на опухоль, такие как антиэстрогены, включая, например, тамоксифен, ралоксифен, 4(5)имидазолы, ингибирующие ароматазу, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон, и торемифен (Фастерон); и анти-андрогены, такие как флютамид, нилутамид, бикалутамид, деуполид, и гозерелин; siRNA и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого вышеуказанного вещества. Другие химиотерапевтические агенты, которые можно использовать в настоящем изобретении, раскрыты в Публикации США №20080171040 или в Публикации США №20080305044 и включены сюда в виде ссылки на полный текст.
В предпочтительном варианте воплощения, химиотерапевтические цитотоксичные агенты являются чрезвычайно низкомолекулярными цитотоксичными агентами. «Низкомолекулярный препарат» широко используется здесь в отношении органических, неорганических или органометаллических соединений, которые могут иметь молекулярную массу, например, от 100 до 1500, более предпочтительно от 120 до 1200, желательно от 200 до 1000 и обычно имеют молекулярную массу менее чем 1000. Низкомолекулярные цитотоксичные агенты изобретения охватывают олигопептиды и другие биомолекулы, имеющие молекулярную массу менее чем 1000. Низкомолекулярные цитотоксичные агенты, хорошо изученные в данной области, такие как WO 05058367 A2, Заявка на Европейский Патент №.85901495 и 8590319, и в Патенте США №.4,956,303, в числе других и включены сюда в виде ссылки на полный текст.
Предпочтительными низкомолекулярными цитотоксичными агентами являются те, которые способны соединиться со связывающимся с клетками агентом. Изобретение включает как известные цитотоксичные агенты, так и те, которые могут стать известными. Особенно предпочтительные низкомолекулярные цитотоксичные агенты включают цитотоксичные агенты.
Цитотоксичный агент может быть любым веществом, которое приводит к гибели клетки или вызывает гибель клетки, или каким-то образом уменьшает жизнеспособность клетки, где каждый цитотоксичный агент включает в себя тиоловый компонент.
Предпочтительными цитотоксичными агентами являются соединения майтансиноида, соединения таксана, соединения СС-1065, соединения даунорубицина и доксорубицина, димеры пирролобензодиазепина, калихимицины, ауристатины и их аналоги и производные, некоторые из которых описаны ниже.
Другие цитотоксичные агенты, которые необязательно являются низкомолекулярными, такие как миРНК, также охватываются в пределах настоящего изобретения. Например, миРНК может связываться с кросслинкерами настоящего изобретения по способам, обычно используемым для модификации олигонуклеотидов (см., например, Публикации Патента США 20050107325 и 20070213292). Таким образом миРНК в своей 3' илиг 5'-фосфорамидной форме реагирует с одним концом кросслинкера, несущего гидроксильную функцию, создавая эфирную связь между миРНК и кросслинкером. Подобная реакция миРНК фосформаида с кросслинкером, несущим терминальную аминогруппу, приводит к образованию связи кросслинкера с миРНК через амин. миРНК детально раскрыты в Публикации Патента США Номера: 20070275465, 20070213292, 20070185050, 20070161595, 20070054279, 20060287260, 20060035254, 20060008822, 20050288244, 20050176667, которые включены сюда в виде ссылки на полный текст.
Майтансиноиды
Майтансиноиды, которые можно использовать в настоящем изобретении, хорошо известны в области и могут быть выделены из природных источников в соответствии с известными способами или приготовлены синтетически в соответствии с известными способами.
Примеры подходящих майтансиноидов включают майтансинол и аналоги майтансинола. Примеры подходящих аналогов майтансинола включают те, у которых есть модифицированное ароматическое кольцо, и те, у которых есть модификации в других позициях.
Конкретные примеры подходящих аналогов майтансинола, имеющих модифицированное ароматическое кольцо, включают:
(1) С-19-дехлоро (Патент США No.4,256,746) (приготовлен путем LAH редукции анзамитоцина Р2);
(2) С-20-гидрокси (или С-20-деметил)+/-С-19-дехлоро (Патент США Nos.4,361,650 и 4,307,016) (приготовлен путем деметилирования с использованием Streptomyces или Actinomyces или дехлорирования с использованием LAH); и
(3) С-20-деметокси, С-20-ацилокси (-OCOR),+/-дехлоро (Патент США No.4,294,757) (приготовлен путем ацилирования с использованием ацил хлоридов).
Конкретные примеры подходящих аналогов майтансинола, имеющих модификации в других позициях, включают:
(1) C-9-SH (Патент США No.4,424,219) (приготовлен путем реакции майтансинола с H2S или P2S5);
(2) С-14-алкоксиметил (деметокси/СН20К) (Патент США No.4,331,598);
(3) С-14-гидроксиметил или ацилоксиметил (СН20Н или СН20Ас) (Патент США No.4,450,254) (приготовлен из Nocardid);
(4) С-15-гидрокси/ацитокси (Патент США No.4,364,866) (приготовлен путем трансформирования майтансинола Streptomyces);
(5) С-15-метокси (Патент США Nos.4,313,946 и 4,315,929) (выделен из Trewia nudiflora);
(6) C-18-N-деметил (Патент США Nos.4,362,663 и 4,322,348) (приготовлен путем деметилирования майтансинола Streptomyces); и
(7) 4,5-деокси (Патент США No.4,371,533) (приготовлен с помощью трихлорида титаниума / LAH редукции майтансинола).
Синтезы тиол-содержащих майтансиноидов, используемых в настоящем изобретении, полностью раскрыты в Патенте США Nos.5,208,020, 5,416,064, и Заявке на Патент США.
Предполагается, что будут использоваться все майтансиноиды с тиоловым компонентом в С-3 позиции. С-14 позиции, С-15 позиции или С-20 позиции. С-3 позиция предпочтительна и С-3 позиция майтансинола особенно предпочтительна. Также предпочтительны N-метил-аланин-содержащий С-3 тиоловый компонент майтансиноид, и N-метил-цистеин-содержащий С-3 тиоловый компонент майтансиноид, и их аналоги.
Конкретные примеры производных N-метил-аланин-содержащего С-3 тиоловый компонент майтансиноида, используемых в данном изобретении, представлены формулами M1, М2, М3, М6 и М7.
Figure 00000010
где:
l - значение от 1 до 10;
a May - майтансиноид.
Figure 00000011
где
Ri и R2 - H, СН3 или СН2СН3, и могут быть одинаковы или различны;
m - 0, 1, 2 или 3; и
May i - майтансиноид.
Figure 00000012
где:
n - значение от 3 до 8; и
May - майтансиноид.
Figure 00000013
где:
l - 1, 2 или 3;
Yo - С1 или Н;
и X3 - Н или CH3.
Figure 00000014
где:
Ri, R2, R3, R4 - Н, СН3 или СН2СН3, и могут быть одинаковыми или различными;
m - 0, 1, 2 или 3; и May - майтансиноид,
Специфичные примеры N-метил-цистеин-содержащих С-3 тиол компоненты дериватов майтансидоида, используемых в настоящем изобретении, представлены формулами М4 и М5.
Figure 00000015
где:
o - 1, 2 или 3;
p - значение от 0 до 10, и
May - майтансиноид
Figure 00000016
где:
o - 1, 2 или 3;
q - значение от 0 до 10;
Yo - С1 или Н; и
X3 - Н или СН3.
Предпочитаемыми майтансиноидами являются те, которые описаны в Патентах США №№.5,208,020; 5,416,064; 6,333.410; 6,441,163; 6,716,821; RE 39.151 и 7,276,497.
Таксаны
Цитотоксичным агентом в соответствии с настоящим изобретением может быть также таксан.
Таксаны, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, модифицированы и содержат тиоловый компонент. Некоторые таксаны, используемые в настоящем изобретении, имеют формулу Т1, показанную ниже:
Figure 00000017
Предпочитаемыми таксоидами являются те, которые раскрыты в Патентах США №№6,340,701; 6,372,738;
6.436,931; 6,596,757; 6,706,708; 7,008,942; 7,217,819 и 7,276,499.
СС-1065 аналоги
Цитотоксичный агент, в соответствии с настоящим изобретением, может также быть аналогом СС-1065.
В соответствии с настоящим изобретением, аналоги СС-1065 содержат А субъединицу и В или В-С субъединицу. Предпочитаемые СС-1065 аналоги описаны в Патентах США Nos.5,475,092; 5,595,499; 5,846,545; 6,534,660; 6,586,618; 6,756,397 и 7,049,316.
Аналоги Даунорубицина/Доксорубицина
Цитотоксичный агент в соответствии с настоящим изобретением может также быть аналогом даунорубицина или аналогом доксорубицина.
Аналоги даунорубицина и доксорубицина в настоящем изобретении могут быть модифицированы для содержания тиолового компонента. Модифицированные аналоги доксорубицина/даунорубицина настоящего изобретения, которые имеют тиоловый компонент, описаны в WO 01/38318. Модифицированные аналоги доксорубицина/даунорубицина могут быть синтезированы в соответствии с известными способами {см., напр., Патент США No.5,146,064).
Ауристатин включает ауристатин Е, ауристатин ЕВ (АЕВ), ауристатин EFP (AEFP), монометил ауристатин Е (ММАЕ), описанные в Патенте США No.5,635,483, Int. J. Oncol. 15: 367-72 (1999); Molecular Cancer Therapeutics, vol.3, No.8, pp.921-932 (2004); Заявка США Номер 11/134826. Публикация Патента США Nos.20060074008, 2006022925.
Цитотоксичные агенты в соответствии с настоящим изобретением включают димеры пирролобензодиазепина, известные в области (Патент США Nos 7,049,311; 7,067,511; 6,951,853; 7,189,710; 6,884,799; 6,660,856).
Аналоги и производные
Специалисты в области цитотоксичных агентов легко поймут, что каждый цитотоксичный агент, описанный здесь, можно модифицировать таким образом, что получившееся в результате соединение все еще будет сохранять специфичность и/или активность первоначального соединения. Специалисты также поймут, что множество подобных соединений можно использовать вместо цитотоксичных агентов, описанных здесь. Таким образом, цитотоксичные агенты настоящего изобретения включают аналоги и производные соединений, описанных здесь.
РЕПОРТЕРНАЯ(ЫЕ) ГРУППА(Ы)
Термины Репортерная группа или Репортерная молекула являются взаимозаменяемыми и термин "Репортерная(ые) группа(ы)" или "Репортерная(ые) молекула(ы)", используемый здесь, относится к веществам, которые доставляются к специфическому веществу или клеткам благодаря участку реагента со специфическим сродством, применяемым в диагностических или терапевтических целях, примерами являются радиоизотопы, парамагнитные контрастные агенты и антираковые агенты. Различные метки или репортерные группы используются в иммуносцинтиграфии опухолей у пациентов со злокачественным новообразованием, в иммунологическом анализе для диагностики различных болезней, терапии рака с использованием конъюгатов с радионуклидами, и аффинной хроматографии для очистки биоактивных агентов, таких как белки, пептиды и олигонуклеотиды. Метки или репортерные группы, которые конъюгируют со связывающимися с клетками агентами, включают флюорофоры, и аффинные метки, такие как биотин. Ссылки на такую репортерную группу можно найти в публикации США номер 2007/0092940. Репортерные группы, включающие, например, биотин или флюоресцин, можно также присоединить к компоненту PEG конъюгата. Некоторое количество подходящих репортерных групп известно специалистам в области, напр.. Патент США No.4,152,411 и Hirschfeld Патент США No.4,166,105, Патент США No.5,223,242, Патент США No.5,501,952, публикация США 20090136940, которые включены сюда в виде ссылки на полный текст.
ЛИНКЕРЫ
Конъюгаты можно приготовить способами in vitro. Чтобы соединить препарат со связывающимся с клеткой агентом, используется линкерная группа. Подходящие линкерные группы хорошо известны специалистам в области и включают нерасщепляемые или расщепляемые линкеры. Нерасщепляемым линкером является любой химический компонент, который способен образовать стабильную ковалентную связь между цитотоксичным агентом и связывающимся с клеткой агентом. Нерасщепляемые линкеры хорошо устойчивы к расщеплению, вызыванному кислотой, расщеплению, вызванному светом, расщеплению, вызванному пептидазой, расщеплению, вызванному эстеразой, и расщеплению дисульфидной связи. Примеры нерасщепляемых линкеров включают линкеры, имеющие N-сукцинимидил эфир, N-сульфосукцинимидил эфирную группу, основанный на малеимиде или галоацетиле компонент для реакции с препаратом, репортерную группу или связывающийся с клеткой агент. К поперечно-сшитым реагентам, включающим основанный на малеимиде компонет, относятся N-сукцинимидил 4-(малеимидометил)циклогексанекарбоксилат (SMCC), N-сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)-циклогексан-1-карбокси-(6-амидокапроат), который является "длинноцепочечным" аналогом SMCC (LC-SMCC), N-сукцинимидил эфир к-малеимидоундеканоидной кислоты (KMUA), N-сукцинимидил эфир y-малеимидобутировой кислоты (GMBS), N-гидроксисукцимидиновый эфир s-малеимидокапроновой кислоты (EMCS), m-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимид эфир (MBS), N-(a-малеимидоацетокси)-сукцинимид эфир (AMAS), сукцинимидил -6-(p-малеимидопропионамидо)гексаноат (SMPH), N-сукцинимидил 4-(p-малеимидофенил)-бутират (SMPB), и N-(р-малеимидофенил)изоцианат (PMPI). К соединенным кросс-связями реагентам относится основанный на галоацетиле компонент, включая N-сукцинимидил-4-(йодацетил)-аминобензоат (SLAB), N-сукцинимидил йодацетат (SIA), N-сукцинимидил бромацетат (SBA), и N-сукцинимидил 3-(бромацетамидо)пропионат (SBAP).
Другие поперечно-сшитые реагенты, у которых отсутствует атом серы, формирующие нерасщепляемые линкеры, также могут использоваться в способе исследования. Такие линкеры могут быть производными от компонентов, основанных на дикарбоксильной кислоте. Подходящие основанные на α, ώ дикарбоксильной кислоте компоненты включают, но не ограничиваются, α, ω - дикарбоксильными кислотами, общая формула которых показана ниже:
HOOC-XI-Yn-Zm-COOH
где Х - линейная или разветвленная алкильная, алкенильная или алкинильная группа, содержащая от 2 до 20 атомов углерода, Y - циклоалкильная или циклоалкенильная группа, несущая от 3 до 10 атомов углерода, Z - замещенная или незамещенная ароматическая группа, несущая от 6 до 10 атомов углерода, или замещенная или незамещенная гетероциклическая группа, где гетеро атом - N, О или S, и где I, m, и n либо 0, либо I, при условии, что I, m и n все одновременно не равняются нулю.
Многие из нерасщепляемых линкеров, раскрытых здесь, детально описаны в Патенте США Публикация номер 20050169933.
Расщепляемыми линкерами являются линкеры, которые можно расщепить при мягких условиях, то есть в условиях, при которых активность цитотоксического агента не проявляется. Многие известные линкеры попадают в эту категорию и описаны ниже.
Кислото-лабильными линкерами являются линкеры, расщепляемые при кислой рН. Например, определенные внутриклеточные компартменты, такие как эндосомы и лизосомы, имеют щелочную рН (рН 4-5) и предоставляют условия, подходящие для расщепления кислото-лабильных линкеров.
Линкеры, которые являются фотолабильными, используются на поверхности тела и во многих полостях тела, которые доступны для света. Кроме того, инфракрасный свет может проникнуть в ткань.
Некоторые линкеры можно расщепить пептидазами. Только определенные пептиды являются легко расщепляемыми внутри или вне клетки, см., напр., Trouet et al., 79 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 626-629 (1982), Umemoto et al. 43 Int. J. Cancer, 677-684 (1989), и расщепляемое лизосомной гидролазой соединение валин-цитруллин (Патент США 6,214,345 В1). Кроме того, сюда относятся пептиды, состоящие из альфа-аминокислот и пептидных связей, которые химически являются амидными связями между карбоксилатом одной аминокислоты и альфа-аминогруппой второй аминокислоты. Другие амидные связи, такие как связь между карбоксилатом и эпсилон-аминогруппой лизина, не рассматриваются как пептидные связи и считаются нерасщепляемыми.
Некоторые линкеры могут расщепляться эстеразами. Снова только некоторые эфиры могут расщепляться эстеразами, присутствующими внутри или вне клетки. Эфиры образуются при конденсации карбоксильной кислоты и спирта. Простыми эфирами являются эфиры, образованные простыми спиртами, такими как алифатические спирты, и низкоатомные цикличные и низкоатомные ароматические спирты. Например, в настоящем изобретении не обнаружено эстераз, которые расщепляют эфир С-3 майтансина, поскольку спиртовой компонент эфира, майтансинол, очень большой и сложный.
Предпочитаемые расщепляемые линкерные молекулы включают, например, N-сукцимидил 3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP) (см., напр., Carlsson et al, Biochem. J., 173:12Ъ-1Ъ1 (1978)), N-сукцимидил 4-(2-пиридилдитио)бутанат (SPDB) (см., напр., U.S. Patent 4,563,304), N-сукцимидил 1 4-(2-пиридилдитио)пентанат (SPP) (см., напр., CAS Registry number 341498-08-6), и другие кросс-линкеры, такие как описанные в Патенте США 6,913,748, который включен сюда в виде ссылки на полный текст.
Другие линкеры, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают заряженные линкеры или гидрофобные линкеры, описанные в Заявках на Патент США №№12/433,604 и 12/433,668 соответственно, которые включены сюда в виде ссылки на полный текст.
СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С КЛЕТКАМИ АГЕНТЫ
Связывающимися с клетками агентами, используемыми в этом изобретении, являются белки (напр., иммуноглобулиновые и неиммуноглобулиновые белки), которые специфически связываются с целевыми антигенами на раковых клетках. Эти связывающиеся с клетками агенты включают:
- антитела, включающие:
- антитела с измененной поверхностью (Патент США №.5,639,641);
- гуманизированные или полностью человеческие антитела (Гуманизированные или полностью человеческие антитела избираются из, но не ограничиваются, huMy9-6, huB4, huC242, huN901, DS6, CD38, IGF-IR, CNTO 95, B-B4, трастузумаб, биватузумаб, зибротузумаб, и ритуксимаб (см, напр. Патенты США №№5,639,641, 5,665,357 и 7,342,110, Заявка на Международный Патент WO 02/16,401, публикация США номер 20060045877, публикация США номер 20060127407, публикация США номер 20050118183, Pedersen et al, (1994) J. Mol. ВЫ. 235, 959-973, Roguska et al., (1994) Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol 91, 969-973, Colomer et al., Cancer Invest., 19: 49-56 (2001), Heider et al., Eur. J. Cancer, 31 A: 2385-2391 (1995), WeltetaL, J. din. Oncol, 12: 1193-1203 (1994) и Maloney et al., Blood, 90: 2188-2195 (1997)); и
- фрагменты антител, такие как sFv, Fab, Fab', и F(ab')2, которые предпочтительно связываются с клетками-мишенями (Parham, J. Immunol. 131: 2895-2902 (1983); Spring et al, J. Immunol. 113: 470-478 (1974); Nisonoff etal, Arch. Biochem. Biophys. 89: 230-244 (I960));
Дополнительные связывающиеся с клетками агенты включают другие связывающиеся с клетками белки и полипептиды, включающие, но не ограничивающиеся:
- Белки с анкириновым повтором (DARPins; Zahnd et al., J. Biol. Chem., 281,46, 35167-35175, (2006); Binz, H.K., Amstutz, P. & Pluckthun, A. (2005) Nature Biotechnology, 23, 1257-1268) или белки с анкиринподобными повторами, или синтетические пептиды описаны, например, в публикации США номер 20070238667; Патенте США №7,101,675; WO/2007/147213; WO/2007/062466);
- интерфероны (напр., a, P, y);
- лимфокины, такие как IL-2, IL-3, IL-4, IL-6;
- гормоны, такие как инсулин, TRH (тиротропин-релизинг-гормон), MSH (меланоцитстимулирущий гормон), стероидные гормоны, такие как андрогены и эстрогены, и
- факторы роста и колониестимулирующие факторы, такие как EGF, TGF-a, IGF-1, G-CSF, M-CSF and GM-CSF (Burgess, Immunology Today 5: 155-158 (1984)).
Если связывающийся с клетками агент является антителом, он связывается с антигеном, представляющим собой полипептид, который может быть трансмембранной молекулой (напр., рецептором) или лигандом, таким как фактор роста. Примеры антигенов включают молекулы, такие как ренин; гормон роста, включая человеческий гормон роста и бычий гормон роста; рилизинг-фактор гормона роста; паратиреоидный гормон; тиреотропный гормон; липропротеины; альфа-1-антитрипсин; инсулина цепь А; инсулина цепь В; проинсулин; фолликулостимулирующий гормон; кальцитонин; лютеинизирующий гормон; глюкагон; факторы коагуляции, такие как фактор vmc, фактор IX, тканевой фактор (TF) и фактор фон Виллебранда; антикоагуляционные факторы, такие как белок С; предсердный натрийуретический фактор; легочный сурфактант; плазмогенный активатор, такой как урокиназа или тканевой активатор плазминогена (t-РА); бомбезин; тромбин; гемопоэтический фактор роста; фактор некроза опухолей-α и β; энкефалиназа; RANTES (регуляция активности экспрессии и секреции нормальных Т-клеток); человеческий воспалительный белок макрофагов (MIP-1-альфа); сывороточный альбумин, такой как человеческий сывороточный альбумин; мюллеров ингибирующий фактор, релаксина цепь А; релаксина цепь В; прорелаксин; мышиный связанный с гонадотропином пептид; микробный белок, такой как бета-лактамаза; ДНКаза; IgE; цитотоксичный лимфоцит-связанный антиген (CTLA), такой как CTLA-4; ингибин; активин; фактор роста эндотелия сосудов (VEGF); рецепторы для гормонов или факторов роста; белок А или D; ревматоидные факторы; нейротрофический фактор, такой нейротрофический фактор костного происхождения (BDNF), нейротрофин-3, -4, -5, или -6 (NT-3, NT4, NT-5, или NT-6), или фактор роста нервов, такой как NGF-β; фактор роста тромбоцитов (PDGF); фактор роста фибробластов, такой как aFGF и bFGF; эпидермальный фактор роста (EGF); трансформирующий фактор роста (TGF) такой как TGF-альфа и TGF-бета, включая TGF-бета1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, или TGF-β5; инсулинподобный фактор роста - -I и -II (IGF-I и IGF-II); des(1-3)-IGF-I (мозговой IGF-I), инсулинподобный фактор роста связывающие белки; CD белки, такие как CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 и CD40; эритропоэтин; остеининдуцирующие факторы; иммунотоксины; костные морфогенетические белки (BMP); интерферон, такой как интерферон-альфа, -бета и -гамма; колониестимулирующий фактор (CSFs), напр., M-CSF, GM-CSF и G-CSF; интерлейкины (ILs), напр., от IL-1 до IL-10; пероксиддисмутаза; рецепторы Т-клеток; поверхностные белки мембраны; стимулятор гемолиза; вирусный антиген, такой как, например, часто оболочки HIV; транспортные белки; «хоминг»-рецепторы; адрессины; регуляторные белки; интегрины такие как CD1 1a, CD1 1b, CD1 1с, CD18, 1C AM, VLA-4 и VCAM, альфа-V субъединица гетеродимерного рецептора интегрина человека; опухолевый антиген, такой как HER2, HER3 или HER4 рецептор; и фрагменты любого из вышеперечисленных полипептидов.
Предпочитаемые антигены для антител, охваченных в настоящем изобретении, включают CD белки, такие как CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD34 и CD46; члены рецепторного семейства ErbB, такие как EGF рецептор, HER2, HER3 или HER4 рецептор; молекулы клеточной адгезии, такие как LFA-1, Мас1, р150.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, альфа4/бета7 интегрин, и альфа v/бета3 интегрин, включающий или альфа, или бета субъединицы (напр., анти-CD1 1a, анти-CD18 или анти-CD1 1b антитела); факторы роста, такие как VEGF; тканевой фактор (TF); TGF-p.; альфа интерферон (альфа-IFN); интерлейкин, такой как IL-8; IgE; антигены групп крови Аро2, рецептор смерти; flk2/flt3 рецептор; рецептор ожирения (OB); mpl рецептор; CTLA-4; белок С и т.д. Наиболее предпочитаемыми мишенями являются IGF-IR, CanAg, EGF-R, EphA2, MUC1, MUC16, VEGF, TF, CD19, CD20, CD22, CD33, CD37, CD38, CD40, CD44, CD56, CD138, СА6, Her2/neu, CRIPTO (белок, вырабатываемый в значительном количестве большинством раковых клеток опухоли молочной железы человека), альфа v/бета3 интегрин, альфа у/бета5 интегрин, TGF - (3, CD1 1a, CD 18, Аро2 и С24.
Техники моноклональных антител позволяют производить специфические связывающиеся с клетками агенты в форме моноклональных антител. В области чрезвычайно хорошо известны техники создания моноклональных антител, вырабатываемых иммунизированными мышами, крысами, хомяками или любыми другими млекопитающими к представляющим интерес антигенам, таким как интактная клетка-мишень, антигенам, изолированным от клетки-мишени, целым вирусам, ослабленным целым вирусам и вирусным белкам, таким как белки вирусной оболочки. Могут также использоваться сенсибилизированные клетки человека. Другим способом создания моноклональных антител является использование библиотеки фагов sFv (одноцепочечный вариабельный регион), особенно человеческого sFv (см., напр., Griffiths et al, U.S. патент №5,885,793; McCafferty et al, WO 92/01047; Liming et al, WO 99/06587.)
Выбор подходящих связывающихся с клетками агентов - вопрос предпочтения, которое зависит от определенной клеточной популяции, являющейся мишенью, но в основном предпочитаются моноклональные антитела и их фрагменты, которые избирательно связываются с клетками-мишенями, если подходящие антитела доступны.
Например, моноклональное антитело Му9 является мышиным IgG2a антителом, которое специфично к CD33 антигену, обнаруженному в клетках Острой Миелоидной Лейкемии (AML) (Roy et al. Blood 77: 2404-2412 (1991)) и может быть использовано в лечении пациентов с AML. Подобным образом моноклональное антитело анти-В4 является мышиным IgG1, который связывается с CD19 антигеном клеток В (Nadler et al, J. Immunol. 131: 244-250 (1983)) и может быть использован, если клетками-мишенями явлюятся В-клетки или больные клетки, которые экспрессируют этот антиген, такие как при неходжкинской лимфоме или хронической лимфобластической лейкемии. Подобным образом антитело N901 является мышиным моноклональным IgG1 антителом, которое связывается с CD56, обнаруженным в клетках мелкоклеточной карциномы легких и на клетках других опухолей нейроэндокринного происхождения (Roy et al. J. Nat. Cancer Inst. 88: 1136-1145 (1996)), huC242 антитело, которое связывается с CanAg антигеном, Trastuzumab, которое связывается с HER2/neu, и анти-EGF рецептор антитело, которое связывается с рецептором EGF.
СПОСОБЫ ОЧИСТКИ
[118] Конъюгат, то есть конечный продукт, в настоящем изобретении очищается для удаления всех непрореагировавших или неконъюгировавших эффекторных или репортерных молекул, или непрореагироавшего линкера или неконъюгировавшего, гидролизованного линкера. Способом очистки может быть тангенциальная поточная фильтрация (TFF, также известная как фильтрация в перекрестном потоке, ультрафильтрация или диафильтрация), гелевая фильтрация, адсорбционная хроматография, селективное осаждение, или их комбинация. Способы адсорбционной хроматографии включают ионообменную хроматографию, гидроксиапатитовую хроматографию, хроматографию гидрофобного взаимодействия (HIC), гидрофобную индукционную хроматографию (HCIC), смешанную ионообменную хроматографию, аффинную хромотографию с использованием иммобилизованных металлов (IMAC), афинной хроматографии на сорбентах, содержащих биоспецифические красители (dye-Ligand chromatography), аффинную хроматографию, обращено-фазовую хроматографию. Например, конъюгат Ат-(X'-L-Y'-C)m, описанный в формуле 2, очищен из непрореагировашего С или непрореагироавшего/гидролизованного линкера X-L-Y или X-L-Y'-C. Подобным образом очищаются конъюгаты, описанные в формуле 4, 6 и 9. Такие способы очистки известны специалистам в области и их можно найти, например, в Публикации США №2007/0048314.
НЕЖЕЛАЕМЫЙ ГИДРОЛИЗОВАННЫЙ ЛИНКЕР ИЛИ ПОПЕРЕЧНАЯ СШИВКА БЕЛКА В КОНЪЮГАТЕ
Традиционные способы конъюгации используют первичную реакцию белка с гетеробифункциональным линкером с химически активным малеимидом или остатком галоацетамида, у которой есть два основных недостатка (i) продукт конъюгации может содержать гидролизованный линкер, вследствие водной инактивации соединенного с антителом линкера до реакции с эффекторной или репортерной молекулой; и (ii) меж или внутрицепочечные поперечные сшивки в конъюгате, вследствие реакции малеимидной (или галоацетамидной) группы с нативными остатками гистидина, лизина, тирозина или цистеина в белке или пептиде (A. Papini et al., Int. J. Pept. Protein Res., 1992, 39, 348-355; Т. Ueda et al., Biochemistry, 1985, 24, 6316-6322). Такие межцепочечные поперечные сшивки в антителе приводят к различным нерасщепляемым ковалентным связям между тяжелой и легкой цепями, или между двумя тяжелыми цепями, которые будут видимы при SDS-PAGE анализе в восстанавливающих условиях как полосы более высокой молекулярной массы, чем ожидаемые полосы тяжелой и легкой цепи. Такие межцепочечные или внутрицепочечные поперечные сшивки в антителе также будут видимы на MS как пики аберрантных масс, отличные от ожидаемых масс антитела вместе со связанными репортерными или эффекторными группами. В отличие от традиционного способа конъюгации, описанный в этой заявке способ приводит к образованию конъюгатов с высокой гомогенностью без существенных цепочечных поперечных сшивок или гидролизованного линкера.
Все источники, цитируемые здесь и в последующих примерах, включены сюда в качестве ссылки на полный текст.
ПРИМЕРЫ
Для иллюстрации изобретения включены следующие примеры. Следует понимать, что эти Примеры не ограничивают изобретение.
Пример 1. Конююгация антитела с цитотоксичным агентом DM1/DM4 с использованием гетеробифункционального линкера Малеимид-PEGn-NHS по этому способу (Фигура 1) по сравнению с традиционным двухэтапным способом.
Исходные растворы DM1 [N2-деацетил-N2-(3-меркапто-1-оксопропил)-майтансин], или DM4 [N2-деацетил-N2-(4-меркапто-4-метил-1-оксопентил)майтансин] (DMx) тиол и Малеимид-PEGn-NHS бифункциональный линкер были приготовлены в N,N-диметилацетамиде (DMA) в концентрациях 30-60 мМ. Линкер и DMx тиол были смешаны в содержащем 50% DMA по объему 200 мМ сукцинатном буфере, 2 мМ EDTA, рН 5.0, молярное соотношение DMx к линкеру составляло 1.6:1 и конечная концентрация DMx была равна 15 мМ. После смешивания реакционная смесь была оставлена на 1-4 ч и затем аликвота реакционной смеси была разведена в 10 раз и его коэффициент поглощения оценивался при 302-320 нм для определения присутствия всего оставшегося непрореагировавшего малеимида с использованием коэффециента поглощения (Е) малеимида 302 нм = 620 М”1 см”1, и 320 нм ~ 450 М”1 см'1. (Дополнительный обратно фазовый HPLC анализ замороженной аликвоты реакционной смеси был осуществлен позже с мониторингом поглощения при 302 нм и 252 нм для подтверждения полного исчезновения линкера малеимида и образования желаемого реагента линкер-DMx во время добавления реакционной смеси к антителу). Когда малеимид больше не обнаруживался в УФ, аликвота реакционной смеси была добавлена без очистки к раствору антитела в фосфатном буфере (рН 7.5) при заключительных условиях конъюгации 4 мг/мл Ат, 90% фосфатный буфер /10% DMA, pH 7.5. Реакция конъюгации протекала при комнатной температуре в течение 2 ч. Конъюгат Ат-DMx был очищен от избыточного низкомолекулярного DMx и линкерных реагентов с использованием G25 гель-фильтрационных колонок, уравновешенных в фосфатном буфере рН 7.5, или используя тангенциальную поточную фильтрацию (TFF). Конъюгационная смесь в дальнейшем была оставлена при 4°С в течение 2 дней в рН 7.5 буфере, чтобы прошла диссоциация всех DMx частиц, соединенных с антителом нековалентными или лабильными связями. Конъюгат затем подвергался в течение одной ночи диализу в рН 5.5 буфере гистидин/глицин и затем фильтровался через 0,22 мкм фильтр для конечного хранения. Число молекул DMx на молекулу антитела (в среднем) в конечном конъюгате было оценено путем определения поглощения конъюгата при 252 и 280 нм с использованием известных коэффициентов поглощения для DMx и антитела на этих двух волнах.
Некоторые различные условия реакции были использованы для первичной реакции DMx тиола с гетеробифункциональным реагентом малеимид-PEG4-NHS: 50% DMA/50% водный 200 мМ сукцинатный буфер рН 5.0, 2 мМ EDTA (по объему); or 60% DMA/40% 200 мМ сукцинатный буфер рН 5,0, 2 мМ EDTA (по объему); или 100% DMA с 1,5 молярными эквивалентами органического основания (например N,N'-диизопропил этилламин, DIPEA, или 4-метилморфолин) на моль DM4 тиола.
В одной серии экспериментов молярный эквивалент соотношения DMx к малеимид-PEG4-MHS линкеру (очищенному Pierce Endogen) варьировал от 1,2 до 2,4, и время реакции составляло 30 мин.Число DMx/Ат, оцененное по очищенному конъюгату, было подсчитано как функция добавленных экввалентов DMx на линкер. В условиях 1,2-2,0 эквивалентов DM1/Ликер образовывался конъюгат с одинаковым соотношением DMx/Ат, что показывает, что нежелаемая реакция DMx тиола с NHS эфирным концом линкера не является значимой проблемой. Число поперечных сшивок, имеющееся в конечном конъюгате, также анализировалось SDS PAGE в восстанавливающих условиях, что показало, что присутствие поперечно сшитых контаминатов значительно уменьшается с возрастанием соотношения DM1/линкер.
Необязательный этап погашения с использованием реагентов малеимида или галоацетамида (таких как малеимидомасляная кислота, или малеимидопропионовая кислота, или N-этилмалеимид, или иодоацетамид, или иодоуксусная кислота) был проведен после завершения первичной реакции DMx и гетеробифункционального линкера (до добавления реакционной смеси к антителу) для погашения избыточной DMx тиоловой группы для того чтобы превратить какие-либо нежелательные реакции DMx тиола с антителом.
Альтернативный способ реакции антитела с неочищенной первичной реакционной смесью DMx и гетеробифункционального линкера включал смешивание реакционной смеси DMx и гетеробифункционального линкера (перед завершением реакции DMx-линкер) с антителом при низком рН (рН~5), после чего следовало добавление буфера или основания для повышения рН до 6,5-8,5 для реакции конъюгации.
Конъюгат антитело -PEG4-Mal-DM1 или DM4 был сделан по традиционному двухэтапному способу конъюгации для сравнения со способом конъюгации, описанном в этом изобретении. Гуманизированное антитело в концентрации 8 мг/мл в рН 7,5 фосфатном буфере (50 мМ фосфат калия, 50 мМ хлорид натрия, 2 мМ EDTA, рН 7,5) и 5% DMA были модифицированы с избытком гетеробифункционального линкерного реагента малеимид-PEG4-NHS (очищен Pierce Endogen). После 2 ч при 25°С модифицированное антитело было очищено в геле путем G25 хроматографии для удаления избыточного непрореагировавшего, несоединившегося линкера. Возврат очищенного Ат был определен при поглощении в УФ при 280 нм. Число связавшихся малеимидных групп в модифицированном Ат было определено с использованием маленькой аликвоты модифицированного антитела путем добавления известного количества тиола (такого как 2-меркаптоэтанол), добавленного в избытке по сравнению с малеимидом, для реакции с малеимидными остатками в модифицированном антителе, и затем оставшийся тиол оценивался по Элману с использованием реагента DTNB (коэффициент поглощения at 412 нм = 14150 М”1 см'1; Riddles, P.W. et al, Methods Enzymol., 1983, 91, 49-60; Singh, R., Bioconjugate Chem., 1994, 5, 348-351). Конъюгация модифицированного Ат с DM1 или DM4 тиолом была осуществлена при концентрации Ат 2,5 мг/мл в реакционной смеси, состоящей из 95% фосфатного буфера рН 7,5 (50 мМ фосфата калия, 50 мМ хлорида натрия, 2 мМ EDTA, pH 7,5) и 5% DMA. Избыток 1,7 молярных эквивалентов DM1 или DM4 тиола был добавлен на моль связанного малеимида Ат. После того как реакция была оставлена на одну ночь при 25°С, конъюгат был стерильно профильтрован с использованием 0,22 мкм фильтра и очищен в геле от избытка непрореагировавшего DM1 или DM4 в G25 колонках, уравновешенных в фосфатном буфере pH 7,5 (50 мМ фосфата калия, 50 мМ хлорида натрия, 2 мМ EDTA, pH 7,5). Очищенный конъюгат был оставлен при 4°С в течение 2 дней в фосфатном буфере с pH 7,5 (50 мМ фосфат калия, 50 мМ хлорид натрия, 2 мМ EDTA, pH 7,5) чтобы прошла диссоциация всех частиц DM1 или DM4, соединенных с антителом нековалентными или лабильными связями. Конъюгат затем подвергался в течение одной ночи диализу в pH 5,5 буфере гистидин/глицин и затем фильтровался через 0,22 мкм фильтр для конечного хранения. Число молекул DM1 или DM4 на молекулу Ат (в среднем) в конечном конъюгате было оценено путем определения поглощения конъюгата при 252 и 280 нм с использованием известных коэффициентов поглощения для DM1/DM4 и Ат на этих двух длинах волн.
Восстанавливающий SDS-PAGE был проведен с конъюгатом и образцами антител с использованием NuPage электрофорезной системы с 4-12% Bis Tris Gel (Invitrogen). Денатурированные нагреванием и восстановленные образцы были помещены по 10 мкг на дорожку. SDS-PAGE в восстанавливающих условиях конъюгатов, приготовленных с использованием способа, описанного в этом изобретении, показал в качестве основных полос только ожидаемые полосы тяжелой и легкой цепи (50 кДа и 25 кДа соответственно) (Фигура 2). Напротив, конъюгаты, приготовленные по традиционному двухэтапному способу, показали нежелаемые поперечно-сшитые полосы с молекулярным весом 75, 100, 125 и 150 кДа, предположительно соответствующие поперечным сшивкам между цепями у частиц HL, H2, H2L и H2L2 соответственно (Фигура 2).
Белковый LabChip электрофорезный анализ (в условиях восстановления) антитело-PEG4-Mal-DM4 конъюгата, приготовленный по способу, описанному в этом изобретении, показал ожидаемые полосы тяжелой и легкой цепи в процентном соотношении 58% и 30% (от общего белка), тогда как подобный анализ для неконъюгировавших антител показал 65 и 30% соответственно (Фигура 3). Напротив, конъюгат, приготовленный с использованием традиционного двухэтапного способа, показал тяжелые и легкие полосы только на 16% и 8% соответственно, а основные полосы высокой молекулярной массы в промежутке 94-169 кДа предположительно появились из-за межцепочечных поперечных сшивок. На основании оценки белкового LabChip анализа, конъюгат, приготовленный по способу, описанному в этой заявке, намного превосходит конъюгат, полученный с использованием традиционного двухэтапного способа (Фигура 3).
MS анализ конъюгатов, приготовленных по способу, описанному в этом изобретении, показал дискретные пики конъюгата DMx-антитело для антитела, несущего возрастающее число молекул майтансиноида на молекулу антитела (Фигура 4). Напротив, MS конъюгата, полученный с использованием традиционного 2-этапного способа, был почти неразличим из-за предполагаемой негомогенности продуктов конъюгации, вероятно, возникшей из-за поперечно-сшитого или инактивированного малеимидного линкера. Следовательно, основываясь на MS, конъюгат, приготовленный с использованием способа, описанного в этом изобретении, намного превосходит конъюгат, синтезированный по традиционному двухэтапному способу.
Связывание конъюгата анти-CanAg AT-PEG4-Mal-DM 1, приготовленного по способу, описанному в этом изобретении, было оценено по проточной цитометрии с использованием антиген-экспрессирующих COLO205 клеток, и было обнаружено, что эта величина подобна связыванию неконъюгироваших антител, что подтверждает, что конъюгация не оказывает вредного влияния на связывание антитела (Фигура 5). Цитотоксическая активность анти-CanAg AT-PEG4-Mal-DM 1 конъюгата, приготовленного по способу, описанному в этом изобретении, была оценена in vitro с использованием COLO205 клеток рака толстой кишки, экспрессирующих CanAg антиген (Фигура 6). Антиген-экспрессирующие раковые клетки были высеяны в количестве около 1000 клеток на лунку в 96-луночные плашки в культуральной клеточной среде, содержащей эмбриональную бычью сыворотку, и подвергались действию различных концентраций Ат-DMx конъюгата. После 5 дней воздействия конъюгата, жизнеспособные клетки, оставшиеся в каждой лунке, были подсчитаны с использованием WST-8 оценки (Dojindo Molecular Technologies). Как показано на Фигуре 6, анти-CanAg AT-PEG4-Mal-DM 1 конъюгат, приготовленный с использованием этого способа, был сильнодействующим в низкой концентрации по отношению к CanAg антиген-экспрессирующим COLO205 клеткам рака толстой кишки. Цитотоксичность анти-CanAg AT-PEG4-Mal-DMl конъюгата, приготовленного по способу, описанному в этом изобретении, была специфична для COLO205 клеток, поскольку ее можно было блокировать при добавлении при добавлении избыточного, неконъюгировавшего антитела.
Пример 2. Конъюгация антитела с цитотоксичным агентом DM1/DM4 с использованием малеимид-сульфо-NHS линкера (Фигура 7) по сравнению с традиционным двухэтапным способом.
Исходные растворы DMx тиола и малеимид-сульфо-NHS гетеробифункционального линкера были добавлены в N,N-диметилацетамид (DMA) в концентрации 30-60 мМ. Линкер и DMx тиол были смешаны вместе в содержащем 40% DMA no объему 200 мМ сукцинатном буфере, 2 мМ EDTA, рН 5.0, соотношение DMx к линкеру составляло 1.6, и конечная концентрация DMx была равна 15 мМ. После смешивания реакционная смесь была оставлена на 1-4 ч и затем аликвота реакционной смеси была разведена в 10 раз и с коэффициентом погашения, оцененным при 302-320 нм, для определения завершения реакции и отсутствия малеимида (Дополнительный обратно фазовый HPLC анализ замороженной аликвоты реакционной смеси был осуществлен позже с мониторингом поглощения при 302 нм и 252 нм для подтверждения полного исчезновения линкера малеимида и образования желаемого реагента линкер-DMx во время добавления реакционной смеси к антителу). Когда в UV малеимид больше не обнаруживался, аликвота реакционной смеси была добавлена без очистки к раствору антитела в фосфатном буфере (рН 7.5) при заключительных условиях конъюгации 4 мг/мл Ат, 90% фосфатный буфер / 10% DMA, pH 7,5. Реакция конъюгации протекала при комнатной температуре в течение 2 ч. Конъюгат Ат-DMx был очищен от избыточного низкомолекулярного DMx и непроконъюгировавших линкерных продуктов с использованием G25 гель-фильтрационных колонок, уравновешенных в фосфатном буфере рН 7.5, или используя тангенциальную поточную фильтрацию. Конъюгат в дальнейшем при 4°С в течение 2 дней в буфере рН 7.5, чтобы прошла диссоциация всех DMx частиц, соединенных с антителом нековалентными или лабильными связями. Конъюгат затем подвергался диализу в течение ночи в буфере гистидин/глицин рН 5.5 и затем фильтровался через 0,22 мкм фильтр для конечного хранения. Число молекул DMx на молекулу Ат (в среднем) в конечном конъюгате было оценено путем определения поглощения конъюгата при 252 и 280 нм с использованием известных коэффициентов поглощения для DM1/DM4 и Ат на этих двух длинах волн.
Для сравнения, Ат-сульфо-Mal-DMx конъюгаты были приготовлены с использованием традиционного 2-этапного способа. Антитело (Ат) в концентрации 8 мг/мл в фосфатном буфере рН 7.5/5% DMA буфере было модифицировано избыточным бифункциональным малеимид-сульфо-NHS линкером. Реакция проходила при 20°С в течение 2 ч, и затем модифицированные Ат были очищены от избыточного непрореагировавшего линкера с использованием G25 хроматографии. Восстановление очищенного Ат был определен анализом поглощения в УФ при 280 нм. Число связавшихся малеимидных групп в модифицированном Ат было определено с использованием маленькой аликвоты модифицированного антитела путем добавления известного количества тиола (такого как 2-меркаптоэтанол), добавленного в избытке по сравнению с малеимидом, для реакции с малеимидными остатками в модифицированном антителе, и затем оставшийся тиол подсчитывался по способу Элмана с использованием реагента DTNB. (коэффициент поглощения TNB тиолата на 412 нм 14150 М”1 cm”1; Riddles, P.W. et al, Methods Enzymol., 1983, 91, 4.9-60; Singh, R., Bioconjugate Chem., 1994, 5, 348-351). Конъюгация модифицированного Ат с DMx была осуществлена при концентрации Ат 2,5 мг/мл в 95% рН 7.5 фосфатном буфере / 5% DMA (объемное содержание), с 1,7 молярных эквивалентов DMx тиол добавленных на моль связанного малеимида в Ат. Реакция была оставлена на 8-24 ч при 18°С и конъюгат был отделен от избыточного, непрореагировавшего DMx путем G25 гель-проникающей хроматографии. После очистки конъюгат был оставлен при 4°С в течение 2 дней в буфере рН 7.5, чтобы прошла диссоциация всех DMx частиц, соединенных с антителом нековалентными или лабильными связями. Конъюгат затем подвергался в течение одной ночи диализу в буфере гистидин/глицин рН 5,5 и затем фильтровался через 0,22 мкм фильтр для конечного хранения. Число молекул DMx на молекулу Ат (в среднем) в конечном конъюгате было оценено путем определения поглощения конъюгата при 252 и 280 нм с использованием известных коэффициентов поглощения для DMx и Ат на этих двух длинах волн.
SDS-PAGE в восстанавливающих условиях был проведен с конъюгатом и образцами антител (10 мкг на дорожку) с использованием NuPage электрофорезной системы с 4-12% Bis Tris Gel и NuPAGE MOPS SDS электродным буфером (Фигура 8). Полосы в геле с молекулярной массой 75, 125 и 150 кДа указывали на наличие частиц (HL, H2L и H2L2 соответственно) с поперечными сшивками между цепями. Сравнение Ат-сульфо-Mal-DM1 конъюгатов с ~4 DM1/Ab (дорожка 3, по этому способу, и дорожка 2, по традиционному 2-этапному способу конъюгации, соответственно) и ~6 DM1/at (дорожка 5, по этому способу, и дорожка 4, по традиционному 2-этапному способу конъюгации, соответственно) четко показали, что конъюгаты, сделанные по способу, оисанному в этом изобретении (дорожки 3 и 5), имеют намного меньшую долю высокомолекулярных поперечно-сшитых частиц, чем конъюгаты, сделанные по<традиционному 2-этапному способу (дорожки 2 и 4).
Белковый LabChip электрофорезный анализ (в условиях восстановления) конъюгата антитело-сульфо-Mal-DM1, приготовленного по способу, описанному в этом изобретении, показал полосы тяжелой и легкой цепи в процентном соотношении 70% и 28% (от общего белка), тогда как подобный анализ для неконъюгировавших антител показал 70 и 30% соответственно (Фигура 9). Напротив, конъюгат, приготовленный с использованием традиционного двухэтапного способа, показал тяжелые и легкие полосы только на 53% и 23% соответственно, а основные полосы высокой молекулярной массы в промежутке 99-152 кДа предположительно появились из-за межцепочечного поперечного сшивания. На основании оценки белковых LabChip анализов, конъюгат, приготовленный по способу, описанному в этой заявке, намного превосходит конъюгат, полученный с использованием традиционного двухэтапного способа (Фигура 9).
Конъюгаты Ат-сульфо-mal-DM1 с подобными присоединенными препаратами, сделанные по способу, описанному в этом изобретении, и по традиционному двухэтапному способу сравнивались в эксклюзионных LC/MS анализах (Фигура 10). Конъюгаты, сделанные по способу, описанному в этом изобретении, показывали желаемый MS спектр, содержащий лишь ожидаемое распределение пиков с массой, равной Ат-(линкер-DMx)n. В случае конъюгатов, сделанных с использованием традиционного двухэтапного способа, основные пики в спектре все содержали один или более гидролизованных или поперечно-сшитых линкерных фрагментов в дополнение к ожидаемым долям Ат-(линкер-DMx)n. Предполагаемый механизм возникновения межцепочечных поперечных сшивок или водной инактивации малеимида в традиционной 2-этапной реакционной последовательности показан на Фигуре 17, где включенный остаток малеимида (или галоацетамида) от первичной реакции антитела с гетеробифункциональным линкером может реагировать с внутримолекулярными (или межмолекулярными) остатками гистидина, лизина, тирозина или цистеина, что приводит к возникновению межцепочечных поперечных сшивок или к тому, что первоначально образовавшие связь остатки малеимида (или галоацетамида) могут стать инактивированными (так, при гидролитическом расщеплении малеимидного кольца или при добавлении воды к малеимиду) и, следовательно, становятся бесполезны для быстрой реакции с тиол-несущей эффекторной или репортерной группой. Таким образом, LC-MS анализ четко показывает, что способ, описанный в этом изобретении, обладает преимуществом для создания гомогенных конъюгатов, у которых гидролизованных или поперечно-сшитых линкерных фрагментов, прикрепленных к антителу, мало или они отсутствуют.
Связывание анти-CanAg AT-PEG4-Mal-DM 1 конъюгата с 5,6 майтансиноида, приходящегося на молекулу антитела (в среднем), приготовленного по способу, описанному в этом изобретении, было оценено по проточной цитометрии с использованием антиген-экспрессирующих COLO205 клеток, и было обнаружено, что это значение такое же, как у неконъюгироваших антител, что подтверждает, что конъюгация не оказывает вредное влияние на связывание антителом антигена-мишени (Фигура 11). Цитотоксическая активность анти-CanAg Ат-Сульфо-Mal-DM1 конъюгата, приготовленного по способу, описанному в этом изобретении, была оценена in vitro с использованием COLO205 клеток рака толстой кишки, экспрессирующих CanAg антиген (Фигура 12). Антиген-экспрессирующие раковые клетки были высеяны в количестве около 1000 клеток на лунку в 96-луночные плашки в культуральной клеточной среде, содержащей эмбриональную бычью сыворотку, и подвергались действию различных концентраций Ат-DMx конъюгата. После 5 дней воздействия конъюгата оставшиеся жизнеспособные клетки были подсчитаны с использованием WST-8 оценки (Dojindo Molecular Technologies). Как показано на Фигуре 12, анти-CanAg Ат-сульфо-Mal-DM1 конъюгат, приготовленный с использованием этого способа, был сильнодействующим в низкой концентрации по отношению к CanAg антиген-экспрессирующим COLO205 клеткам рака толстой кишки. Цитотоксичность этого конъюгата была специфична, поскольку ее можно было блокировать при добавлении при добавлении избыточного, неконъюгировавшего антитела.
Альтернативный способ конъюгации с использованием способа, описанного в этом изобретении, включал этап погашения с использованием малеимидного или галоацетамидного реагентов (таких как 4-малеимидомасляная кислота, или 3-малеимидопропионовая кислота, или N-этилмалеимид, или иодоацетамид, или иодоуксусная кислота) после завершения первичной DMx и гетеробифункциональной линкерной реакции (перед добавлением реакционной смеси к антителу) для погашения избыточной DMx тиоловой группы для того чтобы предотвратить любую нежелаемую реакцию DMx тиол с антителом. В конкретном примере последующее завершение первичной реакции DMx и гетеробифункционального линкера (перед добавлением реакционной смеси к антителу), 4-малеимидомасляная кислота была добавлена для погашения избыточной DMx тиол группы для того чтобы предотвратить какую-либо нежелаемую реакцию DMx тиола с антителом во время реакции конъюгации. К реакционной смеси DM4 и сульфо-Mal-NHS гетеробифункционального реагента, которая содержала избыток DM4 (3 мМ), перез завершением желаемого DM4 тиол связывания с малеимидной группой гетеробифункционального реагента, двукратный молярный избыток 4-маимидомасляной кислоты (6 мМ) был добавлен к реакционной смеси при комнатной температуре на 20 минут для погашения DM4, оставшегося после первичной реакции связывания. Без очистки реакционной смеси аликвота была смешана с раствором антитела в фосфатном буфере (рН 7.5) при заключительных условиях конъюгации 4 мг/мл Ат, 90% водного фосфатного буфера / 10% DMA, рН 7.5. Реакция конъюгации протекала при комнатной температуре в течение 2 ч. Конъюгат антитело - DM4 был очищен от избыточного низкомолекулярного DM4 и линкерных реактантов с использованием G25 гель-фильтрационных колонок, уравновешенных в фосфатном буфере рН 7.5. Конъюгационную смесь в дальнейшем оставили при 4°С в течение 2 дней в буфере рН 7.5, чтобы прошла диссоциация всех DMx частиц, соединенных с антителом нековалентными или лабильными связями. Конъюгат затем подвергался в течение одной ночи диализу в буфере гистидин/глицин рН 5.5 и затем фильтровался через 0,22 мкм фильтр для конечного хранения. Число молекул DMx на молекулу Ат (в среднем) в конечном конъюгате было оценено путем определения поглощения конъюгата на 252 и 280 нм с использованием известных коэффициентов поглощения для DMx и антитела на этих двух длинах волн. Образцы конъюгата анализировались при помощи SDS PAGE в невосстанавливающих условиях с использованием NuPage электрофорезной системы с 4-12% Bis Iris Gel (Invitrogen). Денатурированные нагреванием образцы помещались в количестве 10 мкг на дорожку. SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях конъюгата, приготовленного с использованием способа, описанного в этом изобретении (без погашения) подтвердил наличие полосы легкой цепи (~25 кДа) и полосы половины антитела (тяжелая-легкая цепь; ~75 kDa) (Фигура 18). С другой стороны, конъюгат, приготовленный с использованием способа, описанного в этом изобретении, который был обработан 4-малеимидомасляной кислотой (для кэпирования избыточного DMx тиола), имел значительно меньшее количество этих нежелаемых полос (на уровнях, сравнимых с образцом немодифицированного антитела). Другое преимущество погашения первичной реакционной смеси DMx и гетеробифункционального реагента (перед конъюгацией с антителом) тиол-погашающими реагентами, такими как 4-малеимидомасляная кислота, состоит в том, что во время реакции конъюгации антитела нет «свободных» частиц DMx (DM1 или DM4) и, следовательно, конечный конъюгат после очистки не содержит «свободных» или неконъюгировавших частиц DMx. DMx-аддукт с 4-малеимидомасляной кислотой (или другими полярными тиол-погашающими реагентами) лучше растворим в воде, чем DMx и, следовательно, его можно легче отделить от ковалентно связанного конъюгата антитело-DMx.
Пример 3. Конъюгация антитела с майтансиноидом (DM1/DM4) с использованием сульфо-NHS-SMCC линкера (Фигура 13).
Исходные растворы DM1 или DM4 тиола и сульфо-SMCC гетеробифункционального линкера с сульфо-NHS группой (производство Pierce Endogen; Фигура 13) были приготовлены в (DMA) в концентрациях 30-60 мМ. Линкер и DM1 или DM4 тиол были смешаны в содержащем 40% DMA по объему водном 200 мМ сукцинатном буфере, 2 мМ EDTA, рН 5.0, соотношение DMx к линкеру составляло 1,6 и конечная концентрация DMx составляла 6 мМ. После смешивания реакционная смесь была оставлена на 1-4 ч и затем аликвота реакционной смеси была разведена в 10, чтобы измерить ее поглощение при 302-320 нм для определения того, весь ли малеимид прореагировал (Дополнительный обратно фазовый HPLC анализ замороженной аликвоты реакционной смеси была осуществлена позже с мониторингом поглощения при 302 нм и 252 нм для подтверждения полного исчезновения линкера малеимида и образования желаемого реагента сульфо-NHS-линкер-Mal-ВМх во время добавления реакционной смеси к антителу). Когда в У.Ф. малеимид больше не обнаруживался, аликвота реакционной смеси была добавлена без очистки к раствору антитела в фосфатном буфере (рН 7,5) при заключительных условиях конъюгации 4 мг/мл Ат, 90% фосфатный буфер (водный) / 10% DMA (по объему), рН 7,5. Реакция конъюгации протекала при комнатной температуре в течение 2 ч. Конъюгат Ат-DMx был очищен от избыточного непрореагировавшего реагента и избыточного DMx с использованием G25 гель-фильтрационных колонок, уравновешенных в фосфатном буфере рН 7.5 (водном). Конъюгационная смесь в дальнейшем была оставлена на 2 дня при 4°С в рН 7.5 буфере, чтобы прошла диссоциация всех DMx частиц, соединенных с антителом нековалентными или лабильными связями. Конъюгат затем подвергался в течение одной ночи диализу в буфере гистидин/глицин рН 5,5 и затем фильтровался через 0,22 мкм фильтр для конечного хранения. Число молекул DMx на молекулу антитела (в среднем) в конечном конъюгате было оценено путем определения поглощения конъюгата при 252 и 280 нм с использованием известных коэффициентов поглощения для DMx и антитела на этих двух волнах.
Для сравнения, конъюгаты Ат-SMCC-DMx сульфо-Mal-DMx были приготовлены с использованием традиционного 2-этапного способа. Антитело (Ат) в концентрации 8 мг/мл в 95% фосфатном буфере рН 6,5/5% DMA буфере было модифицировано избыточным бифункциональным сульфо-SMCC линкером с сульфо-NHS группой (производство Pierce Endogen). Реакция проходила при 25°С в течение 2 ч, и затем модифицированные Ат были очищены от избыточного непрореагировавшего линкера с использованием G25 хроматографии. Восстановление очищенного Ат был определен при поглощении в У.Ф. при 280 нм. Число связавшихся малеимидных групп в модифицированном Ат было определено с использованием маленькой аликвоты модифицированного антитела путем добавления известного количества тиола (такого как 2-меркаптоэтанол), добавленного в избытке по сравнению с малеимидом, для реакции с малеимидными остатками в модифицированном антителе, и затем оставшийся тиол подсчитывался по способу Элмана с использованием реагента DTNB. (коэффициент поглощения TNB тиолата 412 нм = 14150 М”1 см”1; Riddles, P.W. et al, Methods EnzymoL, 1983, 91, 4.9-60; Singh, R., Bioconjugate Chem., 1994, 5, 348-351). Конъюгация модифицированного Ат с DM1 или DM4 была осуществлена при концентрации Ат 2,5 мг/мл в 95% фосфатном буфере рН 6,5/5% DMA (объемное содержание), с 1,7 молярных эквивалентов DM1 или DM4 тиол, добавленных на моль связанного малеимида в Ат. Реакция была оставлена на 8-24 ч при 18°С и конъюгат был отделен от избыточного, непрореагировавшего DM1 (или DM4) путем G25 хроматографии. После очистки конъюгат был оставлен при 4°С на 2 дня в буфере рН 6,5, чтобы прошел гидролиз всех слабо соединенных DM1/DM4 частиц. Конъюгат затем подвергался в течение одной ночи диализу в буфере гистидин/глицин рН 5,5 и затем фильтровался через 0,22 мкм фильтр для окончательного хранения. Число молекул DMx на молекулу антитела (в среднем) в конечном конъюгате было оценено путем определения поглощения конъюгата при 252 и 280 нм с использованием известных коэффициентов поглощения для DMx и антитела на этих двух длинах волн.
SDS-PAGE в восстанавливающих условиях был проведен с конъюгатом и образцами антител (10 мкг на дорожку) с использованием NuPage электрофорезной системы (Invitrogen) с NuPage 4-12% Bis Tris Gel и NuPAGE MOPS SDS электродным буфером (Фигура 14). Полосы в геле с молекулярной массой 75, 125 и 150 кДа указывали наличие частиц (HL, H2L и H2L2 соответственно) с межцепочечными поперечными сшивками. Сравнение Ат-SMCC-DMI конъюгатов с 3.1 D/Ат (дорожка 4, по этому способу, и дорожка 3, по традиционному 2-этапному способу конъюгации, соответственно) четко показало, что конъюгаты, сделанные по способу, оисанному в этом изобретении (дорожка 4), имеют намного меньшую долю высокомолекулярных поперечно-сшитых частиц, чем конъюгаты, сделанные по традиционному 2-этапному способу (дорожка 3).
Белковый LabChip электрофорезный анализ (в условиях восстановления) конъюгата антитело - SMCC-DM1, приготовленного по способу, описанному в этом изобретении, показал полосы тяжелой и легкой цепи в процентном соотношении 67% и 30% (от общего белка), тогда как подобный анализ неконъюгировавших антител показал 68 и 30% соответственно (Фигура 15). Напротив, конъюгат, приготовленный с использованием традиционного двухэтапного способа, показал тяжелые и легкие полосы только на 54% и 24% соответственно, а основные полосы высокой молекулярной массы в промежутке 96-148 кДа предположительно появились из-за межцепочечных поперечных сшивок. На основании оценки белковых LabChip анализов, конъюгат, приготовленный по способу, описанному в этой заявке, намного превосходит конъюгат, полученный с использованием традиционного двухэтапного способа из-за отсутствия межцепочечных поперечных сшивок (Фигура 15).
Конъюгаты Ат-SMCC-DM1 с аналогичными прикрепленными препаратами, сделанные по способу, описанному в этом изобретении, и по традиционному двухэтапному способу, сравнивались при помощи эксклюзионного LC/MS анализа (Фигура 16). Конъюгат, сделанный по способу, описанному в этом изобретении, показывает желаемый MS спектр, содержащий только ожидаемое распределение пиков с маской, равной массе Ат-(линкер-DMx)n. В случае конъюгата, сделанного с использованием традиционного двухэтапного способа, спектр показывает гетерогенную смесь частиц, которая включает желаемые частицы Ат-(линкер-DMx)n, а также добавочные частицы, содержащие инактивированный малеимид и поперечно-сшитые линкерные фрагменты. Предполагаемые механизмы возникновения внутрицепочечных поперечных сшивок и малеимидной инактивации при традиционной 2-этапной реакционной последовательности показаны на Фигуре 17, где присоединенный малеимид (или остаток галоацетамида) от первичной реакции антитела с гетеробифункциональным линкером может реагировать с внутримолекулярными (или межмолекулярными) гистидином, лизином, тирозином или цистеином, что приводит к образованию межцепочечных поперечных сшивок, или же первоначально присоединенный остаток малеимида (или галоацетамида) может стать инактивированным при гидролизе или гидратации малеимидного остатка до реакционного этапа с тиол-несущим DM1 или DM4 (DMx) агентом. Таким образом LC-MS анализ четко показывает, что способ, описанный в этом изобретении, обладает преимуществом для получения гомогенного конъюгата, у которого мало или отсутствуют инактивированный малеимид или поперечно-сшитые фрагменты линкера, присоединенные к антителу.
Пример 4. Конъюгация антитела с DM1/DM4 (DMx) с расщепляемыми дисульфидными линкерами по этому способу (Фигура 19).
Исходные растворы, содержащие DM1 или DM4 тиол (DMx) и гетеробифункциональный линкер 4-(2-пиридилдитио)масляная кислота-N-гидроксисукцимидный эфир (SPDB), были приготовлены в DMA в концентрациях 30-60 мМ. Линкер и DMx тиол были смешаны в содержащем 50% DMA по объему 200 мМ сукцинатном буфере, 2 мМ EDTA, рН 5,0, соотношение DMx к линкеру составляло 1.6:1 и конечная концентрация DMx была равна 8 мМ. После смешивания реакционная смесь была оставлена на 1 ч при комнатной температуре и затем аликвота реакционной смеси была добавлена к водному раствору антитела в фосфатном буфере (рН 7,5) при заключительных условиях конъюгации 4 мг/мл Ат, 90% фосфатный буфер (водный) / 10% DMA (по объему), рН 7,5. Реакция конъюгации протекала при комнатной температуре в течение 2 ч. Конъюгат Ат-DMx был очищен от избыточного непрореагироавшего реагента и избыточного DMx с использованием G25 гель-фильтрационных колонок, уравновешенных в фосфатном буфере рН 7,5 (водном). Конъюгационная смесь в дальнейшем была оставлена при 4°С в течение 2 дней в рН 7,5 буфере, чтобы прошла диссоциация всех DMx частиц, соединенных с антителом нековалентными или лабильными связями. Конъюгат затем подвергался в течение одной ночи диализу в буфере гистидин/глицин рН 5.5 и затем фильтровался через 0,22 мкм фильтр для финального хранения. Число молекул DMx на молекулу антитела (в среднем) в конечном конъюгате было оценено путем определения поглощения конъюгата при 252 и 280 нм с использованием известных коэффициентов поглощения для DMx и антитела на этих двух длинах волн.
Пример 5. Приготовление антитело-DMI/DM4 (Ат-DMx) конъюгата с дисульфидными и нерасщепляемыми линкерами с использованием этого способа (Фигура 20).
Исходные растворы, содержащие DM1 или DM4 тиол и NHS-PEGn-Малеимид гетеробифункциональный линкер были приготовлены в iN,N-диметилацетарниде (DMA) в концентрациях 30-60 мМ. NHS-PEGn-Малеимид линкер и DMx тиол были смешаны в DMA содержащем 40% по объему 200 мМ сукцинатном буфере, 2 мМ EDTA, рН 5,0, соотношение DMx к линкеру составляло 1.6:1 и конечная концентрация DMx была равна 8 мМ. Реакционная смесь была оставлена на 2 ч при комнатной температуре. В отдельной параллельной реакции SPDB линкер и DMx тиол были смешаны вместе и реагировали подобным образом в условиях, используемых для NHS-PEG4-малеимид реакции, за исключением того, что время реакции составляло 1 ч. После завершения обеих реакций и без очистки одинаковые объемы PEG4-Mal-DM4 смеси и SPDB-DM4 смеси были соединены. Аликвоты комбинированных реакционных смесей были добавлены бе очистки к раствору антител в фосфатном буфере (рН 7,5) при заключительных условиях конъюгации 4 мг/мл Ат, 90% фосфатный буфер (водный) / 10% DMA (по объему), рН 7,5. Реакция конъюгации протекала при комнатной температуре в течение 2 ч. Конъюгат Ат-DMx был очищен от избыточного непрореагироавшего реагента и избыточного DMx с использованием G25 гель-фильтрационных колонок, уравновешенных в фосфатном буфере рН 7,5 (водном). Конъюгационная смесь была оставлена при 4°С в течение 2 дней в рН 7,5 буфере, чтобы прошла диссоциация всех DMx частиц, соединенных с Ат нековалентными или лабильными связями. Конъюгат затем подвергался в течение одной ночи диализу в буфере гистидин/глицин рН 5,5 и затем фильтровался через 0,22 мкм фильтр для финального хранения. Число молекул DMx на молекулу антитела (в среднем) в конечном конъюгате было оценено путем определения поглощения конъюгата при 252 и 280 нм с использованием известных коэффициентов поглощения для DMx и антитела на этих двух длинах волн.
Ат-(смешанный SPDB и PEG4-Mal линкер)-DMx конъюгат, сделанный по способу, описанному в этом изобретении, тестировался для определения процента включения расщепляемых линкеров по сравнению с нерасщепляемыми линкерами в Ат путем сравнения DMx на антитело (D/A) соотношения до и после DTT (дитиотриэтол) воздействия на конъюгат для восстановления дисульфидных линкеров. Для того чтобы поддержать рН реакции на уровне 7,5 во время DTT восстановления, конъюгат вначале подвергли диализу в 250 мМ HEPES буфере рН 7,5. Конъюгат затем восстанавливали путем реакции с 25 мМ DTT в течение 20 мин при 37°С. После DTT реакции, освободившиеся DMx и DTT были отделены от реакционной смеси с использованием G25 гель-фильтрационных колонок, уравновешенных в 250 мМ HEPES буфере рН 7.5. Среднее число DMx молекул на молекулу Ат в очищенном продукте было оценено путем определения коэффициента поглощения конъюгата при 252 280 нм и с использованием известного коэффициента поглощения для DMx и антитела при этих двух длинах волн. Соотношение между D/A DTT-обработанного конъюгата и D/A не обработанного DTT конъюгата было использовано для расчета процента DMx, присоединенного к Ат посредством нерасщепляемой связи. Два дополнительных образца, AT-SPDB-DM4 и Ат-PEG4-Mal-DM4 конъюгаты, были обработаны DTT в качестве позитивных и негативных контролей, соответственно. Сравнивая соотношение D/A до и после обработки DTT, контрольный нерасщепляемый AT-PEG4-Mal-DM4 конъюгат показал, что практически все линкерные связи оказались нерасщепляемыми (93%) как ожидалось. Ат-(смешанный SPDB и PEG4Mal линкер)-DMx конъюгат, содержащий как нерасщепляемые, так и дисульфидные линкеры, полученный по способу, описанному в этом изобретении, имел на 41% меньше DMx, расщепленных воздействием DTT, относительно количества DMx потери у Ат-SPDB-DMx конъюгата, который содержал только расщепляемые линкеры. Это демонстрирует, что Ат-(смешанный SPDB и PEG4-Mal)-DMx конъюгат, сделанный по способу, описанному в этом исследовании, состоял из приблизительно 40% нерасщепляемых и 60% расщепляемых линкеров. Изменяя первоначальное соотношение нерасщепляемых и расщепляемых линкерных реагентов, конъюгаты антитела с майтансиноидом или другими эффекторами можно приготовлять с различным соотношением нерасщепляемых и расщепляемых линкеров. Фигура 21 показывает масс-спектр дегликозилированного конъюгата, описанного выше, который содержит антитело с в среднем 3,5 молекулы майтансиноида на молекулу антитела, связанные как дисульфидными линкерами (SPDB), так и нерасщепляемыми линкерами (PEG). MS показывает дискретные конъюгатные частицы, несущие как расщепляемые, так и нерасщепляемые линкеры (Фигура 21). Например, пик конъюгата, обозначенный D2-PEG-SPDB, несет одну дисульфидно связанную и одну нерасщепляемо тиэфирно связанную молекулы майтансиноида; пик конъюгата, обозначенный D3-PEG-2SPDB, несет две дисульфидно-связанные и одну нерасщепляемо тиэфирно-связанную молекулы майтансиноида; а пик конъюгата, обозначенный D3-2PEG-SPDB, несет одну дисульфидно-связанную и две нерасщепляемо тиэфирно-связанные молекулы майтансиноида.
Пример 6. Конъюгация антитела с майтансиноидом с использованием SMCC линкера (Фигура 22).
Исходные растворы, содержащие DM1 тиол и SMCC гетероби функциональный линкер (Pierce) были приготовлены в DMA в концентрациях 30-60 мМ. Линкер и DM1 тиол были смешаны в содержащем 50% DMA по объему 200 мМ сукцинатном буфере, 2 мМ EDTA, рН 5,0, соотношение DMx к линкеру составляло 1.4:1 в молярном эквиваленте и конечная концентрация DMx составляла от 1 до 6 мМ. После смешивания реакционная смесь была оставлена на 4 ч при комнатной температуре и затем аликвота реакционной смеси была разведена в 10 раз для измерения поглощения при 302-320 нм для определения, весь ли малеимид прореагировал с тиолом. Когда малеимид больше не присутствовал в У.Ф., аликвота реакции была добавлена в водный раствор антител в фосфатном буфере (рН 7,5-8,5) при заключительных условиях конъюгации 2,5 мг/мл Ат, 70-80% фосфатный буфер (водный) /30-20% DMA (по объему). Реакция конъюгации протекала при комнатной температуре в течение 3 ч. Конъюгат Ат-DM1 был очищен от избыточного непрореагироавшего или гидролизованного реагента с использованием G25 гель-фильтрационных колонок, уравновешенных в фосфатном буфере рН 7,4 (водном). Конъюгат затем подвергался в течение одной ночи диализу в фосфатном буфере рН 7,4 и затем фильтровался через 0,22 мкм фильтр для финального хранения. Число молекул DMx на молекулу антитела (в среднем) в конечном конъюгате было оценено путем определения поглощения конъюгата при 252 и 280 нм с использованием известных коэффициентов поглощения для DMx и антитела на этих двух длинах волн. Подобным образом можно приготовить конъюгата антител с DM4 тиолом и SMCC. Эти конъюгата антитела с DM1 или DM4, использующие SMCC линкер, содержат тиоэфирный нерасщепляемый линкер.
Ат-SMCC-DM1 конъюгат, сделанный по способу, описанному в этом изобретении, был охарактеризован с помощью MS анализа дегликозилированного конъюгата (Фигура 23). Конъюгат, сделанный по способу, описанному в этом изобретении, показывает желаемый MS спектр, содержащий ожидаемое распределение пиков с массой, эквивалентной Ат-(линкер-DM1)n.
Пример 7. Конъюгация антитела с майтансиноидом с использованием гетеробифункциональных дисульфид-содержащих линкеров (SSNPB, SPP).
Дисульфид содержащие гетеробифункциональные линкеры SSNPB (N-сульфосукцинимидил-4-(5-нитро-2-пиридилдитио)бутират) и SPP (N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат) можно использовать для приготовления дисульфидно-связанных конъюгатов антитело-майтансиноид по способу, подобному тому, который описан для SPDB линкера в Примере 4. Структура дисульфид-связанного конъюгата, приготовленного с использованием SPDB (Фигура 19) идентична структуре конъюгата, приготовленного с использованием SSNPB (Фигура 24). MS дисульфид-связанного конъюгата, приготовленного с использованием SPDB, показывает дискретные пики с массами, соответствующими различному числу молекул майтансиноида, присоединенных к антителу.
Пример 8. Конъюгация антитела с майтансиноидом, содержащем нерасщепляемые линкеры с линейной алкил-углеродной цепью.
Конъюгаты, содержащие нерасщепляемый линкер с линейной алкил-углеродной цепью, были приготовлены с использованием реакционной смеси майтансиноида и гетеробифункциональных линкеров с линейной алкил углеродной цепью, так же как в способе, описанном для SMCC линкера в примере 6. Например, конъюгаты гуманизированного антитела с DM1 были приготовлены с использованием BMPS (N-[βмалеимидопропилокси]сукцинимидного эфира) или GMBS (N-[γ-малеимидобутирилоксисукцинимидного эфира) линкера, как показано на Фигуре 26. Первичная реакционная смесь, содержащая BMPS или GMBS (8 мМ) и DM1 тиол (10,4 мМ) в 60% DMA/40% (по объему) 200 мМ сукцинатном буфере, рН 5, показала полную реакцию половины малеимида (основываясь на ослаблении поглощения малеимида при 302-320 нм) через 15 мин. Эта реакционная смесь была добавлена в двух порциях за 30 мин, к раствору гуманизированного антитела 2,5 мг/мл в 80% водном EPPS буфере, рН 8,1, содержащем 20% DMA (по объему) с общим линкером, добавленным в 8-молярном эквиваленте к антителу. Смесь конъюгата была очищена в геле после 4 ч и подвергнута 2 циклам диализа. Конъюгаты с соотношением DM1/антитело 3,8 и 5,1 были приготовлены с 71-75% возвратом, и высоким % мономров (96,2-97,6%). Эти конъюгаты, приготовленные с GMBS или BMPS, показали отсутствие непроконъюгировавшего свободного препарата при HISEP HPLC анализе. Подобные конъюгаты, содержащие нерасщепляемые линкеры с линейными алкильными цепями можно приготовить, используя AMAS (N-[β-малеимидоацетоксисукцинимидный эфир) или EMCS (N-[β-малеимидокаприлокси]сукцинимидный эфир) или сульфо-N-дроксисукцинимидные эфиры (сульфо-GMBS, сульфо-EMCS) как показано на Фигуре 25. В Таблице 1 показан % мономеров для определенных конъюгатов, приготовленных по способу, описанному в этом изобретении, которые все показывают высокий % мономеров при эксклюзионном гель-хроматографическом анализе. Для сравнения показан также % мономеров для конъюгатов, приготовленных по традиционному двухэтапному способу конъюгации (при первичной реакции антитела с гетеробифункциональным линкером, за которой следует реакция с майтансиноида тиолом).
Таблица 1
% мономеров для определенных конъюгатов, сделанных по способу, описанному в этой заявке, по сравнению с традиционным двухэтапным способом
Конъюгат D/A Способ конъюгации % мономеров
Ab-PEG4-Mal-DM1 6,6 это изобретение 99,0
Ab-PEG4-Mal-DM1 6,8 Двухэтапный 98,0
       
Ab-Сульфо-Mal-DM1 3,6 это изобретение 99,0
Ab-Сульфо-Mal-DM1 4,0 Двухэтапный 96,7
       
Ab-SMCC-DM1 4,0 это изобретение 98,6
Ab-SMCC-DM1 3,8 Двухэтапный 97,0
       
Ab-PEG4-Mal-DM4 6,2 это изобретение 96,9
Ab-PEG4-Mal-DM4 6,1 Двухэтапный 84,5
       
Ab-SPDB-DM4 4,1 это изобретение 99,4
Ab-SPDB-DM4 3,9 двухэтапный, в одном реакционном сосуде 95,7

Claims (9)

1. Способ приготовления очищенного конъюгата в растворе, при этом конъюгат включает майтансиноидную молекулу, соединенную с антителом, включающий этапы:
(а) приведения в контакт майтансиноидной молекулы, содержащей тиоловую группу, с гетеробифункциональным линкерным реагентом для ковалентного присоединения линкера к майтансиноидной молекуле и приготовления таким образом неочищенной первой смеси, содержащей майтансиноидную молекулу, связанную с линкерами,
(б) конъюгацию антитела с майтансиноидной молекулой, связанной с линкерами, путем реакции неочищенной первой смеси с антителом в растворе, имеющем рН от примерно 4 до примерно 9 для приготовления второй смеси и
(в) воздействие на вторую смесь путем тангенциальной поточной фильтрации, диализа, гелевой фильтрации, адсорбционной хроматографии, селективного осаждения или их комбинации для получения очищенного конъюгата.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что вторая смесь на этапе (б) по большей части свободна от нежелаемых поперечно-сшитых гидролизованных частиц, образовавшихся в результате внутримолекулярных или межмолекулярных реакций.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что майтансиноид является DM1.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что майтансиноид является DM4.
5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что антитело является моноклональным антителом.
6. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что антитело является человеческим или гуманизированным моноклональным антителом.
7. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что антитело является MY9, анти-В4, С242 или антителом, которое связывается с антигеном, выбранным из группы, включающей: EpCAM, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD11, CD19, CD20, CD22, CD26, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD44, CD56, CD79, CD105, CD138, EphA рецепторы, EphB рецепторы, EGFR, EGFRvIII, HER2, HER3, мезотелин, крипто, альфаvбета3 интегрин, альфаvбета5 интегрин, альфаvбета6 интегрин.
8. Способ по п.6, отличающийся тем, что человеческое или гуманизированное антитело является huMy9-6, huB4, huC242, huN901, DS6, CNTO 95, B-B4, трастузумабом, пертузумабом, биватузумабом, зибротузумабом, ритуксимабом, или человеческим или гуманизированным антителом, которое связывается с антигеном, выбранным из группы, включающей: рецептор EphA2, CD38 и IGF-IR.
9. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что линкер является расщепляемым или нерасщепляемым линкером.
RU2011153288/10A 2009-06-03 2010-06-02 Способы конъюгации RU2595424C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US18377409P 2009-06-03 2009-06-03
US61/183,774 2009-06-03
PCT/US2010/037046 WO2010141566A1 (en) 2009-06-03 2010-06-02 Conjugation methods

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2016130501A Division RU2765240C2 (ru) 2009-06-03 2010-06-02 Способы конъюгации

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2011153288A RU2011153288A (ru) 2013-07-20
RU2595424C2 true RU2595424C2 (ru) 2016-08-27

Family

ID=43298108

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2016130501A RU2765240C2 (ru) 2009-06-03 2010-06-02 Способы конъюгации
RU2011153288/10A RU2595424C2 (ru) 2009-06-03 2010-06-02 Способы конъюгации

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2016130501A RU2765240C2 (ru) 2009-06-03 2010-06-02 Способы конъюгации

Country Status (27)

Country Link
US (7) US8624003B2 (ru)
EP (2) EP3480202A1 (ru)
JP (7) JP5784592B2 (ru)
KR (4) KR102444399B1 (ru)
CN (2) CN102448500A (ru)
AU (1) AU2010256659B2 (ru)
BR (1) BRPI1010620B8 (ru)
CA (1) CA2761959C (ru)
CY (1) CY1121992T1 (ru)
DK (1) DK2437790T3 (ru)
ES (1) ES2726945T3 (ru)
HK (1) HK1216508A1 (ru)
HR (1) HRP20190898T1 (ru)
HU (1) HUE043645T2 (ru)
IL (7) IL300840A (ru)
LT (1) LT2437790T (ru)
ME (1) ME03479B (ru)
MX (3) MX2011012794A (ru)
PL (1) PL2437790T3 (ru)
PT (1) PT2437790T (ru)
RS (1) RS58810B1 (ru)
RU (2) RU2765240C2 (ru)
SG (2) SG176068A1 (ru)
SI (1) SI2437790T1 (ru)
SM (1) SMT201900284T1 (ru)
TR (1) TR201907573T4 (ru)
WO (1) WO2010141566A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2644280C1 (ru) * 2016-12-12 2018-02-08 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) Способ получения противоопухолевого коньюгата на основе человеческого сывороточного альбумина, содержащего терапевтические и контрастирующий агенты

Families Citing this family (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7276497B2 (en) * 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids
US20110166319A1 (en) * 2005-02-11 2011-07-07 Immunogen, Inc. Process for preparing purified drug conjugates
BRPI0615049B1 (pt) 2005-08-24 2023-04-25 Immunogen, Inc Processo para a preparação de um conjugado de anticorpo- maitansinóide
AR076284A1 (es) 2009-04-29 2011-06-01 Bayer Schering Pharma Ag Inmunoconjugados de antimesotelina y usos de los mismos
CN102448500A (zh) 2009-06-03 2012-05-09 免疫基因公司 轭合方法
US20130295052A1 (en) * 2010-11-19 2013-11-07 Manu Chaudhary Novel conjugates for targeted drug delivery
CA2831467C (en) 2011-03-29 2020-03-24 Immunogen, Inc. Preparation of maytansinoid antibody conjugates by a one-step process
WO2012177837A2 (en) 2011-06-21 2012-12-27 Immunogen, Inc. Novel maytansinoid derivatives with peptide linker and conjugates thereof
US9915653B2 (en) * 2011-08-31 2018-03-13 Nikolai Vladimirovich Bovin Facile laboratory method for localising biomolecules to the surface of cells and viruses
JP2015504869A (ja) * 2011-12-13 2015-02-16 イミュノジェン・インコーポレーテッド 複合体安定性を改善するためのｎ−ヒドロキシスクシンイミドの使用
AU2013323572B2 (en) 2012-09-26 2017-12-07 Immunogen, Inc. Improved methods for the acylation of maytansinol
US20150306242A1 (en) * 2012-10-04 2015-10-29 Immunogen, Inc. Process for preparing stable antibody maytansinoid conjugates
RU2018122734A (ru) 2012-10-04 2018-07-24 Иммуноджен, Инк. Использование пвдф-мембраны для очистки конъюгатов клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент
IN2015DN03203A (ru) * 2012-10-04 2015-10-02 Immunogen Inc
WO2014082080A2 (en) * 2012-11-26 2014-05-30 Callidus Biopharma, Inc. Methods for coupling targeting peptides onto recombinant lysosomal enzymes for improved treatments of lysosomal storage diseases
US9353150B2 (en) 2012-12-04 2016-05-31 Massachusetts Institute Of Technology Substituted pyrazino[1′,2′:1 ,5]pyrrolo[2,3-b]-indole-1,4-diones for cancer treatment
EP3566750A3 (en) 2013-02-28 2020-04-08 ImmunoGen, Inc. Conjugates comprising cell-binding agents and cytotoxic agents
EP2961435B1 (en) 2013-02-28 2019-05-01 ImmunoGen, Inc. Conjugates comprising cell-binding agents and cytotoxic agents
US9498532B2 (en) 2013-03-13 2016-11-22 Novartis Ag Antibody drug conjugates
WO2014150937A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Novartis Ag Antibody drug conjugates
EP2994164B1 (en) 2013-05-08 2020-08-05 Zymeworks Inc. Bispecific her2 and her3 antigen binding constructs
WO2014194030A2 (en) 2013-05-31 2014-12-04 Immunogen, Inc. Conjugates comprising cell-binding agents and cytotoxic agents
CN104232576B (zh) 2013-06-14 2018-07-17 加思葆（北京）医药科技有限公司 蛋白-细胞偶联物、其制备方法和用途
US10208125B2 (en) 2013-07-15 2019-02-19 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Anti-mucin 1 binding agents and uses thereof
CN105940113A (zh) 2013-11-13 2016-09-14 酵活有限公司 靶向egfr和/或her2的单价抗原结合构建体及其用途
KR102357906B1 (ko) 2013-11-27 2022-02-03 자임워크스 인코포레이티드 Her2를 표적화하는 이중특이성 항원-결합 작제물
TWI541022B (zh) 2013-12-18 2016-07-11 應克隆公司 針對纖維母細胞生長因子受體－３（ｆｇｆｒ３）之化合物及治療方法
RU2685728C2 (ru) * 2014-01-29 2019-04-23 Шанхай Хэнжуй Фармасьютикал Ко., Лтд. Конъюгат лиганд - цитотоксическое лекарственное средство, способ его получения и его применения
CA2954934C (en) 2014-06-30 2023-09-26 Glykos Finland Oy Drug derivative and conjugates
KR20170040249A (ko) 2014-08-12 2017-04-12 노파르티스 아게 항-cdh6 항체 약물 접합체
GB201416960D0 (en) * 2014-09-25 2014-11-12 Antikor Biopharma Ltd Biological materials and uses thereof
GB201419184D0 (en) * 2014-10-28 2014-12-10 Adc Biotechnology Ltd Method of synthesising biomolecule-effector/reporter-conjugates using affinity resins
AU2015349985A1 (en) * 2014-11-19 2017-05-25 Immunogen, Inc. Process for preparing cell-binding agent-cytotoxic agent conjugates
DK3223848T3 (da) 2014-11-27 2025-03-03 Zymeworks Bc Inc Fremgangsmåder til anvendelse af bispecifikke antigenbindingskonstrukter målrettet her2
WO2016090157A1 (en) 2014-12-04 2016-06-09 Celgene Corporation Biomolecule conjugates
TW201711702A (zh) 2015-06-04 2017-04-01 應克隆公司 使用針對纖維母細胞生長因子受體３（ｆｇｆｒ３）之化合物的療法
US10449258B2 (en) * 2015-06-09 2019-10-22 Xdcexplorer (Shanghai) Co., Ltd. Antibody drug conjugate, intermediate, preparation method, pharmaceutical composition and uses thereof
EP3310813A1 (en) 2015-06-17 2018-04-25 Novartis AG Antibody drug conjugates
MX2018004285A (es) 2015-10-08 2018-11-09 Zymeworks Inc Construcciones polipeptidicas de union al antigeno que comprenden cadenas ligeras kappa y lambda y usos de estas.
CN106606784B (zh) * 2015-10-19 2020-01-21 泰州迈博太科药业有限公司 一种靶向表达egfr肿瘤细胞的前抗体偶联药物及其应用
WO2017197045A1 (en) 2016-05-11 2017-11-16 Movassaghi Mohammad Convergent and enantioselective total synthesis of communesin analogs
KR102617264B1 (ko) 2016-10-19 2023-12-29 인벤라 인코포레이티드 항체 구조물
EP3559039A1 (en) 2016-12-22 2019-10-30 Università Degli Studi Magna Graecia Catanzaro A monoclonal antibody targeting a unique sialoglycosilated cancer-associated epitope of cd43
ES2912266T3 (es) 2016-12-23 2022-05-25 Immunogen Inc Inmunoconjugados dirigidos a ADAM9 y procedimientos de uso de los mismos
JOP20190187A1 (ar) 2017-02-03 2019-08-01 Novartis Ag مترافقات عقار جسم مضاد لـ ccr7
WO2018185618A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 Novartis Ag Anti-cdh6 antibody drug conjugates and anti-gitr antibody combinations and methods of treatment
WO2018209239A1 (en) 2017-05-11 2018-11-15 Massachusetts Institute Of Technology Potent agelastatin derivatives as modulators for cancer invasion and metastasis
RU2019142330A (ru) 2017-06-30 2021-07-30 Займворкс, Инк. Стабилизированные химерные fab
US10640508B2 (en) 2017-10-13 2020-05-05 Massachusetts Institute Of Technology Diazene directed modular synthesis of compounds with quaternary carbon centers
CN111587125A (zh) 2018-01-12 2020-08-25 伊缪诺金公司 抗体药物缀合、纯化和调配的方法
KR20200138288A (ko) 2018-03-28 2020-12-09 미쓰비시 타나베 파마 코퍼레이션 cMET 모노클로날 결합제의 약물 접합체, 및 그의 용도
EP3552631A1 (en) 2018-04-10 2019-10-16 Inatherys Antibody-drug conjugates and their uses for the treatment of cancer
CN113227127A (zh) 2018-06-05 2021-08-06 伦敦大学国王学院 向胃肠系统递送酬载的btnl3/8导引构建体
EP3828206A4 (en) 2018-07-25 2022-04-20 Daiichi Sankyo Company, Limited METHOD OF PREPARING AN ANTIBODY DRUG CONJUGATE
AU2020241619A1 (en) * 2019-03-18 2021-11-11 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Non-hydrolyzable, non-cleavable, stable linkers for precision therapeutics and uses thereof
WO2020205465A1 (en) * 2019-03-29 2020-10-08 Purdue Research Foundation Ph-dependent composition matters useful for study and diagnosis of alzheimer's disease
WO2020247054A1 (en) 2019-06-05 2020-12-10 Massachusetts Institute Of Technology Compounds, conjugates, and compositions of epipolythiodiketopiperazines and polythiodiketopiperazines and uses thereof
CN114341162A (zh) 2019-07-10 2022-04-12 赛博克萨2公司 作为治疗剂的细胞毒素的肽缀合物
WO2021007402A1 (en) 2019-07-10 2021-01-14 Cybrexa 3, Inc. Peptide conjugates of microtubule-targeting agents as therapeutics
WO2021031930A1 (zh) * 2019-08-19 2021-02-25 沈阳药科大学 抗体的突变体及其应用
CN113121670B (zh) * 2020-01-15 2022-11-22 天津键凯科技有限公司 二取代peg化白细胞介素2及其制备方法、应用
US20230181756A1 (en) 2020-04-30 2023-06-15 Novartis Ag Ccr7 antibody drug conjugates for treating cancer
US11878986B2 (en) * 2020-06-22 2024-01-23 National Health Research Institutes Poly heterocyclic conjugates and their pharmaceutical uses
US12030888B2 (en) 2021-02-24 2024-07-09 Massachusetts Institute Of Technology Himastatin derivatives, and processes of preparation thereof, and uses thereof
WO2022217022A1 (en) 2021-04-10 2022-10-13 Profoundbio Us Co. Folr1 binding agents, conjugates thereof and methods of using the same
JP2024516631A (ja) 2021-04-23 2024-04-16 プロファウンドバイオ ユーエス カンパニー 抗ｃｄ７０抗体、そのコンジュゲートおよびこれを使用する方法
US20250090680A1 (en) 2021-11-19 2025-03-20 Ardeagen Corporation Gpc3 binding agents, conjugates thereof and methods of using the same
WO2023157989A1 (ko) 2022-02-17 2023-08-24 주식회사 노벨티노빌리티 항체-약물 접합체
WO2025019790A1 (en) 2023-07-19 2025-01-23 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with trop-2 targeting adc
EP4509142A1 (en) 2023-08-16 2025-02-19 Ona Therapeutics S.L. Fgfr4 as target in cancer treatment
WO2025072406A1 (en) 2023-09-26 2025-04-03 Profoundbio Us Co. Ptk7 binding agents, conjugates thereof and methods of using the same

Family Cites Families (190)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4166105A (en) 1973-07-30 1979-08-28 Block Engineering, Inc. Dye tagged reagent
SE430062B (sv) 1977-03-04 1983-10-17 Pharmacia Fine Chemicals Ab Kopplings- eller tioleringsreagens
US4152411A (en) 1977-07-27 1979-05-01 Akzona Incorporated High specific activity labeled substances
US4137230A (en) 1977-11-14 1979-01-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for the production of maytansinoids
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
US4563304A (en) 1981-02-27 1986-01-07 Pharmacia Fine Chemicals Ab Pyridine compounds modifying proteins, polypeptides or polysaccharides
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4664911A (en) 1983-06-21 1987-05-12 Board Of Regents, University Of Texas System Immunotoxin conjugates employing toxin B chain moieties
DE3587294T2 (de) 1985-01-22 1993-09-30 Saint Gobain Vitrage Verfahren zur Herstellung einer dünnen Metalloxidbeschichtung auf einem Substrat, insbesondere Glas und deren Verwendung als Verglasung.
US5223242A (en) 1985-11-05 1993-06-29 The General Hospital Corporation Negatively charged specific affinity reagents
GB8600582D0 (en) 1986-01-10 1986-02-19 Ca Minister Nat Defence Purifying biological materials
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US4956303A (en) 1986-04-28 1990-09-11 Antibody Technology Limited Secondary antibodies against complexes of small molecules and binding partners therefor, their preparation, and their use in diagnostic methods
US4859449A (en) * 1987-09-14 1989-08-22 Center For Molecular Medicine And Immunology Modified antibodies for enhanced hepatocyte clearance
US5241078A (en) 1988-06-14 1993-08-31 Cetus Oncology Coupling agents and sterically hindered disulfide linked conjugates prepared therefrom
JP2818827B2 (ja) 1988-06-24 1998-10-30 サンヨーファイン株式会社 鉄補給飲料
US5024834A (en) 1988-07-12 1991-06-18 Cetus Corporation Thioether linked immunotoxin conjugates
CA2006408A1 (en) 1988-12-27 1990-06-27 Susumu Iwasa Bispecific monoclonal antibody, its production and use
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5714149A (en) * 1989-02-10 1998-02-03 Celltech Therapeutics Limited Crosslinked antibodies and processes for their preparation
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5208020A (en) * 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US6316003B1 (en) 1989-12-21 2001-11-13 Whitehead Institute For Biomedical Research Tat-derived transport polypeptides
FR2656555B1 (fr) 1989-12-29 1994-10-28 Serimer Systeme mecanique de guidage automatique d'une ou plusieurs torches d'une unite de soudage a l'arc.
US5137877B1 (en) 1990-05-14 1996-01-30 Bristol Myers Squibb Co Bifunctional linking compounds conjugates and methods for their production
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
CA2048078A1 (en) 1990-11-15 1992-05-16 Wolfgang A. Wrasidlo Chemical modification of antibodies for creation of immunoconjugates
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
SE9102074D0 (sv) 1991-07-03 1991-07-03 Kabi Pharmacia Ab Tomour antigen specific antibody
SE470006B (sv) 1991-09-26 1993-10-25 Corline Systems Ab Nytt konjugat, dess framställning och användning samt substrat preparerat med konjugatet
DE69233782D1 (de) 1991-12-02 2010-05-20 Medical Res Council Herstellung von Autoantikörpern auf Phagenoberflächen ausgehend von Antikörpersegmentbibliotheken
CA2076465C (en) 1992-03-25 2002-11-26 Ravi V. J. Chari Cell binding agent conjugates of analogues and derivatives of cc-1065
US5501952A (en) 1992-07-17 1996-03-26 Aprogenex, Inc. Analogues of reporter groups as background reducers in hybridization assays
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5556623A (en) 1993-03-30 1996-09-17 Eli Lilly And Company Antibody-drug conjugates
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
GB9320575D0 (en) 1993-10-06 1993-11-24 Amp Gmbh Coaxial connector having improved locking mechanism
IL111748A0 (en) 1993-12-03 1995-01-24 Zeneca Ltd Proteins
US5919758A (en) 1994-03-22 1999-07-06 Beth Israel Deaconess Medical Center Modified polypeptides with altered biological activity
US5580853A (en) 1994-03-22 1996-12-03 New England Deaconess Hospital Modified polypeptides with increased biological activity
US5747446A (en) 1994-03-22 1998-05-05 Beth Israel Deaconess Medical Center Modified polypeptides with increased biological activity
US5612474A (en) 1994-06-30 1997-03-18 Eli Lilly And Company Acid labile immunoconjugate intermediates
US6355780B1 (en) 1995-02-22 2002-03-12 Yeda Research And Development Co. Ltd. Antibodies to the death domain motifs of regulatory proteins
WO1996039183A1 (en) 1995-05-31 1996-12-12 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for targeted delivery of effector molecules
US6265150B1 (en) 1995-06-07 2001-07-24 Becton Dickinson & Company Phage antibodies
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
WO1998026747A2 (en) * 1996-12-17 1998-06-25 Terman David S Superantigen based methods and compositions for treatment of diseases
US6462070B1 (en) 1997-03-06 2002-10-08 The General Hospital Corporation Photosensitizer conjugates for pathogen targeting
US6371975B2 (en) 1998-11-06 2002-04-16 Neomend, Inc. Compositions, systems, and methods for creating in situ, chemically cross-linked, mechanical barriers
EP1012280B1 (en) 1997-06-11 2004-11-10 Borean Pharma A/S Trimerising module
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
US5958677A (en) 1997-07-28 1999-09-28 The New York Blood Center, Inc. Method for purifying viral nucleic acids
CA2297070A1 (en) 1997-08-01 1999-02-11 Morphosys Ag Novel method and phage for the identification of nucleic acid sequences encoding members of a multimeric (poly)peptide complex
US5965714A (en) 1997-10-02 1999-10-12 Connaught Laboratories, Inc. Method for the covalent attachment of polysaccharides to protein molecules
WO1999017783A1 (en) 1997-10-03 1999-04-15 Galenica Pharmaceuticals, Inc. Imine-forming polysaccharides, preparation thereof and the use thereof as adjuvants and immunostimulants
US6121236A (en) 1998-03-24 2000-09-19 The Children's Medical Center Corporation Multivalent ligands which modulate angiogenesis
US6573245B1 (en) 1998-04-28 2003-06-03 Galenica Pharmaceuticals, Inc. Modified polysaccharide adjuvant-protein antigen conjugates, the preparation thereof and the use thereof
US5981564A (en) 1998-07-01 1999-11-09 Universite Laval Water-soluble derivatives of paclitaxel, method for producing same and uses thereof
US7067109B1 (en) 1998-07-13 2006-06-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Cancer treatment kits comprising therapeutic conjugates that bind to aminophospholipids
PT1193270E (pt) 1998-08-27 2003-10-31 Spirogen Ltd Pirrolobenzodiazepinas
AUPQ014799A0 (en) 1999-05-04 1999-05-27 Access Pharmaceuticals Australia Pty Limited Amplification of folate-mediated targeting to tumor cells using polymers
JP4776843B2 (ja) 1999-10-01 2011-09-21 イムノゲン インコーポレーティッド 免疫複合体及び化学療法剤を用いる癌治療用組成物及び方法
AU765588C (en) 1999-11-24 2004-12-16 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising taxanes and their therapeutic use
NZ518764A (en) 1999-12-29 2004-02-27 Immunogen Inc Cytotoxic agents comprising modified doxorubicins and daunorubicins and their therapeutic use
AU2001236892A1 (en) 2000-02-08 2001-08-20 The Penn State Research Foundation Immunotherapy using interleukin 13 receptor subunit alpha 2
US6632979B2 (en) * 2000-03-16 2003-10-14 Genentech, Inc. Rodent HER2 tumor model
US7097840B2 (en) 2000-03-16 2006-08-29 Genentech, Inc. Methods of treatment using anti-ErbB antibody-maytansinoid conjugates
US6596503B1 (en) 2000-08-18 2003-07-22 East Carolina University Monoclonal antibody DS6, tumor-associated antigen CA6, and methods of use thereof
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
US20060062786A1 (en) * 2000-11-08 2006-03-23 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to TRAIL receptors
US7767802B2 (en) 2001-01-09 2010-08-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
EA007388B1 (ru) 2001-01-29 2006-10-27 Идек Фармасьютикалз Корпорейшн Модифицированные антитела и способы применения
DE60214134T2 (de) 2001-02-07 2007-07-19 Beth Israel Deaconess Medical Center, Boston Modifizierte psma-liganden und deren verwendung
US20030003048A1 (en) * 2001-04-26 2003-01-02 Chun Li Diagnostic imaging compositions, their methods of synthesis and use
JP2004533449A (ja) 2001-05-11 2004-11-04 ボード　オブ　リージェンツ，　ザ　ユニバーシティ　オブ　テキサス　システム Ｃｄ２６を発現している細胞に関連する疾患の治療としての抗ｃｄ２６モノクローナル抗体
EP1258255A1 (en) 2001-05-18 2002-11-20 Boehringer Ingelheim International GmbH Conjugates of an antibody to CD44 and a maytansinoid
US6441163B1 (en) 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
CA2447695C (en) 2001-06-01 2015-02-24 Cornell Research Foundation, Inc. Modified antibodies to prostate-specific membrane antigen and uses thereof
TW593239B (en) 2001-06-04 2004-06-21 Kevin Dale Allen One-step production of 1,3-propanediol from ethylene oxide and syngas with a catalyst with a phospholanoalkane ligand
CA2469132A1 (en) 2001-12-11 2003-07-03 Merck & Co., Inc. Staphylococcus aureus exopolysaccharide and process
US6716821B2 (en) 2001-12-21 2004-04-06 Immunogen Inc. Cytotoxic agents bearing a reactive polyethylene glycol moiety, cytotoxic conjugates comprising polyethylene glycol linking groups, and methods of making and using the same
NZ533657A (en) 2002-01-03 2008-01-31 Smithkline Beecham Corp Methods for the preparation of immunoconjugates, in particular maytansinoids conjugated to a monoclonal antibody
DE10202419A1 (de) 2002-01-22 2003-08-07 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines durch eine Chromosomen-Aberration entstandenen Zielgens
US7591994B2 (en) 2002-12-13 2009-09-22 Immunomedics, Inc. Camptothecin-binding moiety conjugates
US8877901B2 (en) 2002-12-13 2014-11-04 Immunomedics, Inc. Camptothecin-binding moiety conjugates
US6660856B2 (en) 2002-03-08 2003-12-09 Kaohsiung Medical University Synthesis of pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepine analogues
US6756397B2 (en) 2002-04-05 2004-06-29 Immunogen, Inc. Prodrugs of CC-1065 analogs
US6534660B1 (en) 2002-04-05 2003-03-18 Immunogen, Inc. CC-1065 analog synthesis
WO2003102132A2 (en) 2002-04-26 2003-12-11 Genetech, Inc. Non-affinity purification of proteins
NZ573563A (en) * 2002-05-02 2010-10-29 Wyeth Corp Calicheamicin derivative-carrier conjugates with reduced low conjugated fraction (LCF)
US20090068178A1 (en) 2002-05-08 2009-03-12 Genentech, Inc. Compositions and Methods for the Treatment of Tumor of Hematopoietic Origin
US6596757B1 (en) 2002-05-14 2003-07-22 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising polyethylene glycol-containing taxanes and their therapeutic use
CA2490423A1 (en) 2002-06-21 2003-12-31 Biogen Idec Inc. Buffered formulations for concentrating antibodies and methods of use thereof
HUE027549T2 (hu) 2002-07-31 2016-10-28 Seattle Genetics Inc Hatóanyagot tartalmazó konjugátumok és alkalmazásuk rák, autoimmun betegség vagy fertõzéses betegség kezelésére
US7390898B2 (en) 2002-08-02 2008-06-24 Immunogen Inc. Cytotoxic agents containing novel potent taxanes and their therapeutic use
EP1542723B1 (en) 2002-08-16 2011-02-23 ImmunoGen, Inc. Cross-linkers with high reactivity and solubility and their use in the preparation of conjugates for targeted delivery of small molecule drugs
DE60323756D1 (de) 2002-10-08 2008-11-06 Fresenius Kabi De Gmbh Pharmazeutisch aktive oligosaccharid-conjugate
EP2348124B1 (en) 2002-10-30 2013-12-11 Nuevolution A/S Synthesis of a bifunctional complex
BR0316101A (pt) 2002-11-07 2005-09-27 Immunogen Inc Anticorpos anticd33 e processo para tratamento de leucemia melóide aguda usando os mesmos
AU2003215821B2 (en) 2003-03-31 2009-04-23 Council Of Scientific And Industrial Research Non-cross-linking pyrrolo(2,1-c)(1,4)benzodiazepines as potential antitumour agents and process thereof
ES2702942T3 (es) 2003-04-17 2019-03-06 Alnylam Pharmaceuticals Inc Agentes de ARNi modificados
CA2525553C (en) 2003-05-14 2011-07-05 Immunogen, Inc. Maytansinoid-antibody conjugate compositions
US8088387B2 (en) 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
EA010909B1 (ru) * 2003-05-20 2008-12-30 Иммьюноджен, Инк. Усовершенствованные цитотоксические агенты, содержащие новые мэйтансиноиды
US7276497B2 (en) * 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids
US7595306B2 (en) 2003-06-09 2009-09-29 Alnylam Pharmaceuticals Inc Method of treating neurodegenerative disease
ES2761262T3 (es) 2003-06-13 2020-05-19 Alnylam Europe Ag Acido ribonucleico bicatenario con elevada eficacia en un organismo
CN102558352A (zh) 2003-06-27 2012-07-11 艾默根佛蒙特有限公司 针对表皮生长因子受体的缺失突变体的抗体及其使用
US20050074425A1 (en) 2003-07-02 2005-04-07 Polycord, Inc. Method for delivering polymerized therapeutic agent compositions and compositions thereof
JP2007513072A (ja) 2003-11-05 2007-05-24 パリンゲン インコーポレーテッド Ｃｄｉｍ結合抗体における増強されたｂ細胞細胞傷害性
SI1694363T1 (sl) 2003-12-16 2014-03-31 Nektar Therapeutics Monodisperzni PEG-ilirani naloksolni sestavki
US20050175619A1 (en) 2004-02-05 2005-08-11 Robert Duffy Methods of producing antibody conjugates
US20110064754A1 (en) 2005-03-03 2011-03-17 Center For Molecular Medicine And Immunology Immunoconjugates Comprising Poxvirus-Derived Peptides and Antibodies Against Antigen-Presenting Cells for Subunit-Based Poxvirus Vaccines
EP1610818A4 (en) 2004-03-03 2007-09-19 Millennium Pharm Inc MODIFIED ANTIBODIES AGAINST A PROSTATE-SPECIFIC MEMBRANE-ANTIGEN AND USE THEREOF
US7189710B2 (en) 2004-03-30 2007-03-13 Council Of Scientific And Industrial Research C2-fluoro pyrrolo [2,1−c][1,4]benzodiazepine dimers
US6951853B1 (en) 2004-03-30 2005-10-04 Council Of Scientific And Industrial Research Process for preparing pyrrolo[2, 1-c] [1,4] benzodiazepine hybrids
WO2005115477A2 (en) 2004-04-13 2005-12-08 Quintessence Biosciences, Inc. Non-natural ribonuclease conjugates as cytotoxic agents
US7626014B2 (en) 2004-04-27 2009-12-01 Alnylam Pharmaceuticals Single-stranded and double-stranded oligonucleotides comprising a 2-arylpropyl moiety
EP3034510A1 (en) 2004-04-30 2016-06-22 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Oligonucleotides comprising a c5-modified pyrimidine
US20060073528A1 (en) 2004-05-14 2006-04-06 Jean-Michel Lecerf Measurement methods
US7691962B2 (en) * 2004-05-19 2010-04-06 Medarex, Inc. Chemical linkers and conjugates thereof
MXPA06013413A (es) 2004-05-19 2007-01-23 Medarex Inc Enlazadores quimicos y conjugados de los mismos.
RU2404810C9 (ru) 2004-06-01 2015-06-20 Дженентек, Инк. Конъюгаты антитело-лекарственное средство и способы
JP2008504840A (ja) 2004-06-30 2008-02-21 アルニラム ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド 非リン酸骨格結合を含むオリゴヌクレオチド
EP1828215A2 (en) 2004-07-21 2007-09-05 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Oligonucleotides comprising a modified or non-natural nucleobase
JP4193771B2 (ja) 2004-07-27 2008-12-10 セイコーエプソン株式会社 階調電圧発生回路及び駆動回路
EP1913011B1 (en) 2004-08-04 2016-11-02 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Oligonucleotides comprising a ligand tethered to a modified or non-natural nucleobase
AU2004224925C1 (en) 2004-08-30 2011-07-21 Biotest Ag Immunoconjugates targeting syndecan-1 expressing cells and use thereof
CN101065151B (zh) 2004-09-23 2014-12-10 健泰科生物技术公司 半胱氨酸改造的抗体和偶联物
SV2006002258A (es) * 2004-10-08 2006-09-19 Wyeth Corp Inmunoterapia de trastornos autoinmunes
AU2005316844A1 (en) 2004-11-29 2006-06-22 Seattle Genetics, Inc. Engineered antibodies and immunoconjugates
SG158119A1 (en) 2004-12-09 2010-01-29 Centocor Inc Anti-integrin immunoconjugates, methods and uses
US7408030B2 (en) 2005-01-13 2008-08-05 North Carolina State University Purification of immunoglobulins using affinity chromatography and peptide ligands
EP2468304A3 (en) 2005-02-11 2012-09-26 ImmunoGen, Inc. Process for preparing stable drug conjugates
US20110166319A1 (en) 2005-02-11 2011-07-07 Immunogen, Inc. Process for preparing purified drug conjugates
US20060233814A1 (en) 2005-04-15 2006-10-19 Immunogen Inc. Elimination of heterogeneous or mixed cell population in tumors
GB2427360A (en) 2005-06-22 2006-12-27 Complex Biosystems Gmbh Aliphatic prodrug linker
ES2744225T3 (es) 2005-07-15 2020-02-24 Angiochem Inc Uso de polipéptidos de aprotinina como portadores en conjugados farmacéuticos
EA014513B1 (ru) 2005-08-03 2010-12-30 Иммьюноджен, Инк. Композиция иммуноконъюгата
US20070213292A1 (en) 2005-08-10 2007-09-13 The Rockefeller University Chemically modified oligonucleotides for use in modulating micro RNA and uses thereof
BRPI0615049B1 (pt) 2005-08-24 2023-04-25 Immunogen, Inc Processo para a preparação de um conjugado de anticorpo- maitansinóide
JP2009508938A (ja) 2005-09-22 2009-03-05 ハダシット メディカル リサーチ サーヴィスィズ アンド ディベロップメント リミテッド 治療上活性な化合物の結合体
CA2623652C (en) * 2005-09-26 2013-11-26 Medarex, Inc. Antibody-drug conjugates and methods of use
JP5199108B2 (ja) 2005-11-14 2013-05-15 ユニヴァーシティー オブ サザン カリフォルニア インテグリン結合小分子
WO2007062466A1 (en) 2005-11-29 2007-06-07 The University Of Sydney Demibodies: dimerisation-activated therapeutic agents
EP1996612A4 (en) 2006-03-03 2010-10-20 Univ Kingston COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF CANCER
US7964415B2 (en) 2006-04-26 2011-06-21 Cardiogenics Inc. Stable water-soluble polyethylenimine conjugates and methods of use thereof
BRPI0711249A2 (pt) * 2006-05-30 2012-03-13 Genentech, Inc. Anticorpos, polinucleotídeos, vetores, células hospedeira, métodos para fabricar um anticorpo, para detectar a presença de cd2 em uma amostra biológica, para tratar uma disfunção proliferativa de células b, para inibir proliferaçõa de células b, para tratar câncer, para fabricar um composto conjugado anti-corpo-droga. imunoconjugados,composições farmacêuticas, formulações farmacêuticas, conjugado anticorpo-droga, compostos conjugados anti-corpo-droga, teste para detectar células b e artigo de fabricação
CA2655379A1 (en) 2006-06-22 2007-12-27 Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research Structure of the insulin receptor ectodomain
ES2673822T3 (es) 2006-07-18 2018-06-25 Sanofi Anticuerpo antagonista contra EphA2 para el tratamiento de cáncer
US20080213349A1 (en) 2006-09-11 2008-09-04 Deepak Ramesh Thakker Liposome Complexes Containing Pharmaceutical Agents and Methods
JP2010505874A (ja) 2006-10-03 2010-02-25 ノヴォ ノルディスク アー／エス ポリペプチドコンジュゲートの精製方法
PL2019104T3 (pl) 2007-07-19 2014-03-31 Sanofi Sa Środki cytotoksyczne obejmujące nowe pochodne tomaymycyny i ich zastosowanie terapeutyczne
US8084589B2 (en) 2007-08-31 2011-12-27 University Of Massachusetts Phosphoramidite nucleoside analogs
WO2009134976A1 (en) 2008-04-30 2009-11-05 Immunogen, Inc Potent conjugates and hydrophilic linkers
HUE034763T2 (en) 2008-04-30 2018-02-28 Immunogen Inc Crosslinkers and their use
GB0811743D0 (en) 2008-06-26 2008-07-30 Hemosol Biopharma Inc Composition
TW201021852A (en) 2008-11-17 2010-06-16 Enzon Pharmaceuticals Inc Releasable fusogenic lipids for nucleic acids delivery systems
AU2010210646B2 (en) 2009-02-05 2015-10-29 Immunogen, Inc. Novel benzodiazepine derivatives
CN102448500A (zh) 2009-06-03 2012-05-09 免疫基因公司 轭合方法
FR2947269B1 (fr) 2009-06-29 2013-01-18 Sanofi Aventis Nouveaux composes anticancereux
AR078470A1 (es) 2009-10-02 2011-11-09 Sanofi Aventis Anticuerpos que se unen especificamente al receptor epha2
TWI622402B (zh) 2010-02-24 2018-05-01 免疫遺傳股份有限公司 葉酸受體１抗體類和免疫共軛物類及彼等之用途
KR20110103182A (ko) 2010-03-12 2011-09-20 삼성전자주식회사 입체 영상 표시 장치
US20120149732A1 (en) 2010-12-14 2012-06-14 Alexander Chucholowski Multifunctional linkers and methods for the use thereof
KR20200140939A (ko) 2011-02-15 2020-12-16 이뮤노젠 아이엔씨 컨쥬게이트의 제조방법
CA2831467C (en) 2011-03-29 2020-03-24 Immunogen, Inc. Preparation of maytansinoid antibody conjugates by a one-step process
SG193997A1 (en) 2011-03-29 2013-11-29 Immunogen Inc Process for manufacturing conjugates of improved homogeneity
KR20140019415A (ko) 2011-03-29 2014-02-14 이뮤노젠 아이엔씨 향상된 균질성의 접합체를 제조하기 위한 방법
KR20200039843A (ko) 2011-04-01 2020-04-16 이뮤노젠 아이엔씨 Folr1 암 치료의 효능을 증가시키기 위한 방법
US20130071482A1 (en) 2011-09-20 2013-03-21 The University Of Kentucky Research Foundation Block copolymer cross-linked nanoassemblies as modular delivery vehicles
JP2015504869A (ja) 2011-12-13 2015-02-16 イミュノジェン・インコーポレーテッド 複合体安定性を改善するためのｎ−ヒドロキシスクシンイミドの使用
RU2018122734A (ru) 2012-10-04 2018-07-24 Иммуноджен, Инк. Использование пвдф-мембраны для очистки конъюгатов клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент
US20150306242A1 (en) 2012-10-04 2015-10-29 Immunogen, Inc. Process for preparing stable antibody maytansinoid conjugates
IN2015DN03203A (ru) 2012-10-04 2015-10-02 Immunogen Inc
US10253099B2 (en) 2012-12-05 2019-04-09 Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Conjugates of proteins and multivalent cell-penetrating peptides and their uses

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LUNDBERG P. et al., "Click Assisted One-Pot Multi-Step Reactions in Polymer Science: Accelerated Synthetic Protocols", Macromolecular rapid communications, 2008, 29, 998-1015. *
ФЕДОСЕЕНКО М.В. и др. "Эпоха конъюгированных вакцин: международный опыт успешного применения." Педиатрическая фармакология, 2008, 5(6):8-14. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2644280C1 (ru) * 2016-12-12 2018-02-08 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) Способ получения противоопухолевого коньюгата на основе человеческого сывороточного альбумина, содержащего терапевтические и контрастирующий агенты

Also Published As

Publication number Publication date
IL300840A (en) 2023-04-01
BRPI1010620B8 (pt) 2021-05-25
IL242589B (en) 2018-11-29
AU2010256659B2 (en) 2015-01-29
AU2010256659A1 (en) 2011-12-01
IL269580B (en) 2020-06-30
US9771432B2 (en) 2017-09-26
US20140179906A1 (en) 2014-06-26
RS58810B1 (sr) 2019-07-31
ES2726945T3 (es) 2019-10-10
KR101947176B1 (ko) 2019-02-12
KR20220144827A (ko) 2022-10-27
RU2016130501A (ru) 2018-12-07
IL274599A (en) 2020-06-30
SG176068A1 (en) 2011-12-29
JP2016006071A (ja) 2016-01-14
US20180079828A1 (en) 2018-03-22
PL2437790T3 (pl) 2019-09-30
IL259869B (en) 2019-10-31
JP2021113210A (ja) 2021-08-05
US20210163625A1 (en) 2021-06-03
SG10201810743WA (en) 2018-12-28
US20190263935A1 (en) 2019-08-29
RU2765240C2 (ru) 2022-01-27
IL286056B2 (en) 2023-08-01
JP2023075187A (ja) 2023-05-30
JP6114783B2 (ja) 2017-04-12
US10233257B2 (en) 2019-03-19
JP6873184B2 (ja) 2021-05-19
HK1216508A1 (zh) 2016-11-18
CN104984360A (zh) 2015-10-21
MX383013B (es) 2025-03-13
KR20190015590A (ko) 2019-02-13
US10815309B2 (en) 2020-10-27
MX349210B (es) 2017-07-18
HUE043645T2 (hu) 2019-08-28
JP2024099722A (ja) 2024-07-25
WO2010141566A1 (en) 2010-12-09
HRP20190898T1 (hr) 2019-08-09
CN102448500A (zh) 2012-05-09
IL269580A (en) 2019-11-28
TR201907573T4 (tr) 2019-06-21
RU2016130501A3 (ru) 2020-01-29
JP7262507B2 (ja) 2023-04-21
EP2437790A1 (en) 2012-04-11
US20230105468A1 (en) 2023-04-06
JP2012528874A (ja) 2012-11-15
PT2437790T (pt) 2019-06-04
KR20200090974A (ko) 2020-07-29
LT2437790T (lt) 2019-06-10
US20110003969A1 (en) 2011-01-06
IL259869A (en) 2018-07-31
SI2437790T1 (sl) 2019-07-31
EP3480202A1 (en) 2019-05-08
US20170002096A1 (en) 2017-01-05
JP2019163276A (ja) 2019-09-26
EP2437790A4 (en) 2015-06-24
IL286056A (en) 2021-10-31
ME03479B (me) 2020-01-20
KR102444399B1 (ko) 2022-09-16
JP2017128590A (ja) 2017-07-27
BRPI1010620A2 (pt) 2016-03-15
CA2761959A1 (en) 2010-12-09
US8624003B2 (en) 2014-01-07
US9376500B2 (en) 2016-06-28
US11498979B2 (en) 2022-11-15
IL274599B (en) 2021-09-30
DK2437790T3 (da) 2019-05-20
MX2011012794A (es) 2012-05-08
IL216583A0 (en) 2012-02-29
KR20120088549A (ko) 2012-08-08
RU2011153288A (ru) 2013-07-20
EP2437790B1 (en) 2019-02-20
CY1121992T1 (el) 2020-10-14
IL286056B1 (en) 2023-04-01
SMT201900284T1 (it) 2019-07-11
KR102139019B1 (ko) 2020-07-28
BRPI1010620B1 (pt) 2021-05-04
KR102560218B1 (ko) 2023-07-26
JP5784592B2 (ja) 2015-09-24
CA2761959C (en) 2018-09-11
JP7481521B2 (ja) 2024-05-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11498979B2 (en) Methods for preparing a purified maytansinoid conjugate in a solution
AU2019275619B2 (en) Conjugation methods