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CN111587125A - 抗体药物缀合、纯化和调配的方法 - Google Patents

抗体药物缀合、纯化和调配的方法 Download PDF

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CN111587125A
CN111587125A CN201980007969.2A CN201980007969A CN111587125A CN 111587125 A CN111587125 A CN 111587125A CN 201980007969 A CN201980007969 A CN 201980007969A CN 111587125 A CN111587125 A CN 111587125A
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antibody
adc
conjugation
ser
antigen
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CN201980007969.2A
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丹尼尔·F·米兰诺
迈克尔·R·里尔登
理查德·A·西尔瓦
本杰明·M·哈钦斯
罗伯特·W·赫布斯特
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Original Assignee
Immunogen Inc
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Abstract

本文提供产生、纯化和调配抗体药物缀合物(ADC)的方法。所述方法使用连续缀合过程、单程切向流过滤、逆流渗滤和/或在线过程自动化技术。所述方法减少过程时间和成本并且改进产物一致性。

Description

抗体药物缀合、纯化和调配的方法
技术领域
本发明的领域大体上涉及使用连续缀合过程、单程切向流过滤、逆流渗滤和/或在线过程自动化技术产生、纯化和调配抗体药物缀合物(ADC)的方法。
背景技术
与抗体药物缀合物(ADC)相关联的制造瓶颈是杂质的去除和ADC向稳定缓冲液中的交换。目前，这使用结合和洗脱柱色谱法或通过切向流过滤(TFF)的本体(常规)渗滤来实现。本体渗滤涉及以缓冲液A(即，缀合物最初所在的缓冲液)注入TFF系统。然后将ADC(于缓冲液A中)添加至渗余物容器中，在所述渗余物容器中与初始体积混合。渗余物容器的进料泵将来自渗余物的缀合物泵送于TFF膜上，在所述TFF膜上其经保留(并返回至渗余物)或丢弃。另一泵(渗滤泵)从所述容器进料至容纳于单独容器中的缓冲液B(即，ADC将交换至其中的缓冲液)，进料管线为从所述容器至渗余物容器中。将两个泵启动，并且渗余物容器中的缀合物开始通过TFF膜。在缓冲液经由废物流去除时，渗余物中的体积通过将缓冲液B(以相等体积)添加至渗余物容器中来维持。因此，缀合物缓慢地交换至缓冲液B中。此纯化方法成本高并且就大规模制造而言不是最佳的，因为需要使ADC在TFF膜上再循环多个循环。再循环导致高加工体积和时间以及ADC于潜在高剪切区域的暴露增加。使用大量加工的ADC制造需要约4-5天来生产一批经纯化、经调配的缀合物，通常产率低。据此，需要改进的ADC缀合过程。
发明内容
单程切向流过滤(SPTFF)系统诸如可购自Pall Life Sciences的系统用于生物加工平台，通常作为减少体积或浓缩生物分子例如抗体的方式。然而，本发明人意外地发现SPTFF可与抗体药物缀合反应相关联以不仅有助于抗体药物缀合物(ADC)的浓缩还有助于将未缀合产物从缀合反应去除并将纯化的ADC交换至调配缓冲液中，从而实现完全连续的ADC产生和加工方法。本发明人还发现逆流渗滤也可出于类似目的用于抗体药物缀合反应中。
在一些实施方案中，一种用于产生抗体药物缀合物(ADC)组合物的连续方法包括：(i)将抗体或其抗原结合片段与药物缀合以形成ADC，(ii)去除未缀合药物，和(iii)将所述ADC交换至稳定缓冲液中，其中(i)至(iii)是连续执行，并且其中单程切向流过滤(SPTFF)用于去除所述未缀合药物和/或将所述ADC交换至所述稳定缓冲液中。
在一些实施方案中，SPTFF用于去除所述未缀合药物以将所述ADC交换至所述稳定缓冲液中。在一些实施方案中，流过式柱色谱法用于去除所述未缀合药物并且SPTFF用于将所述ADC交换至所述稳定缓冲液中。
在一些实施方案中，一种用于产生抗体药物缀合物(ADC)组合物的连续方法包括：(i)将抗体或其抗原结合片段与药物缀合以形成ADC，(ii)去除未缀合药物，和(iii)将所述ADC交换至稳定缓冲液中，其中(i)至(iii)是连续执行，并且其中逆流渗滤用于去除所述未缀合药物和/或将所述ADC交换至所述稳定缓冲液中。
在一些实施方案中，逆流渗滤用于去除所述未缀合药物以将所述ADC交换至所述稳定缓冲液中。在一些实施方案中，流过式柱色谱法用于去除所述未缀合药物并且逆流渗滤用于将所述ADC交换至所述稳定缓冲液中。
在一些实施方案中，所述方法还包括预加工所述抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的所述预加工是以(i)至(iii)连续执行。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的所述预加工使用SPTFF执行。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的所述预加工使用逆流渗滤执行。在一些实施方案中，在预加工中仅使用一个SPTFF或逆流渗滤步骤。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的所述预加工是在(i)至(iii)之前大量执行。
在一些实施方案中，所述方法还包括预加工药物以供缀合。
在一些实施方案中，一种用于产生抗体药物缀合物(ADC)组合物的连续方法包括：(i)预加工抗体或其抗原结合片段，(ii)将所述抗体或其抗原结合片段与药物缀合以形成ADC，(iii)去除未缀合药物，和(iv)将所述ADC交换至稳定缓冲液中，其中(i)至(iv)是连续执行，并且其中单程切向流过滤(SPTFF)用于去除所述未缀合药物和/或将所述ADC交换至所述稳定缓冲液中。
在一些实施方案中，一种用于产生抗体药物缀合物(ADC)组合物的连续方法包括：(i)预加工抗体或其抗原结合片段，(ii)将所述抗体或其抗原结合片段与药物缀合以形成ADC，(iii)去除未缀合药物，和(iv)将所述ADC交换至稳定缓冲液中，其中(i)至(iv)是连续执行，并且其中逆流渗滤用于去除所述未缀合药物和/或将所述ADC交换至所述稳定缓冲液中。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的所述预加工包括将所述抗体或其抗原结合片段交换至缓冲液中以供缀合。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的所述预加工包括还原所述抗体或其抗原结合片段和/或氧化所述抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，在不使用SPTFF或逆流渗滤的情况下实现还原和/或氧化。在一些实施方案中，仅使用一个SPTFF或逆流渗滤步骤实现还原和/或氧化。在一些实施方案中，使用多于一个SPTFF或逆流渗滤步骤实现还原和/或氧化。
在一些实施方案中，一种用于在连续缀合过程中产生抗体药物缀合物(ADC)的方法包括在缀合反应进行的同时和在已形成至少一种缀合反应产物(ADC)之后将一种或多种缀合反应试剂添加至所述缀合反应。在一些实施方案中，所述缀合反应试剂包含抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述缀合反应试剂包含连接至接头的药物。在一些实施方案中，所述缀合反应试剂包含接头。在某一实施方案中，所述缀合反应试剂包含连接至接头的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述缀合反应试剂包含药物。
在一些实施方案中，所述缀合反应发生于流动反应器中。
在一些实施方案中，所述方法还包括预加工抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的所述预加工是以所述缀合反应连续执行。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的所述预加工使用SPTFF执行。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的所述预加工使用逆流渗滤执行。在一些实施方案中，在预加工中仅使用一个SPTFF或逆流渗滤步骤。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的所述预加工是在所述缀合反应之前大量执行。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的所述预加工包括将所述抗体或其抗原结合片段交换至缓冲液中以供缀合。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的所述预加工包括还原所述抗体或其抗原结合片段和/或氧化所述抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述ADC使用单程切向流过滤浓缩。在一些实施方案中，所述ADC使用单程切向流过滤纯化。在一些实施方案中，所述ADC使用单程切向流过滤来转移至调配缓冲液中。
在一些实施方案中，使用逆流渗滤浓缩ADC。在一些实施方案中，使用逆流渗滤纯化ADC。在一些实施方案中，使用逆流渗滤将ADC转移至调配缓冲液中。
在一些实施方案中，所述ADC使用流过式色谱法来浓缩、纯化和/或转移至调配缓冲液。
在一些实施方案中，一种用于浓缩抗体药物缀合物(ADC)的方法包括使用单程切向流过滤。在一些实施方案中，用于纯化抗体药物缀合物(ADC)的方法包括使用单程切向流过滤。在一些实施方案中，用于将抗体药物缀合物(ADC)转移至调配缓冲液的方法包括使用单程切向流过滤。在一些实施方案中，用于浓缩抗体药物缀合物(ADC)的方法包括使用逆流渗滤。在一些实施方案中，用于纯化抗体药物缀合物(ADC)的方法包括使用逆流渗滤。在一些实施方案中，用于将抗体药物缀合物(ADC)转移至调配缓冲液中的方法包括使用逆流渗滤。在一些实施方案中，所述ADC是在分批缀合过程中产生。在一些实施方案中，所述ADC是在连续缀合过程中产生。
在一些实施方案中，所述单程切向流过滤使用超滤膜。在一些实施方案中，所述单程切向流过滤使用渗滤膜。
在一些实施方案中，所述方法改进所述ADC产生的一致性。在一些实施方案中，所述方法减少ADC产生的时间。
在一些实施方案中，所述单程切向流过滤改进所述ADC产生的一致性。在一些实施方案中，所述单程切向流过滤减少ADC浓缩、纯化或转移的时间。在一些实施方案中，所述单程切向流过滤减少所使用的缓冲液的量。
在一些实施方案中，逆流渗滤改进所述ADC产生的一致性。在一些实施方案中，逆流渗滤减少ADC浓缩、纯化或转移的时间。在一些实施方案中，逆流渗滤减少所使用的缓冲液的量。
在一些实施方案中，所述方法还包括分析物的在线监测。
在一些实施方案中，一种用于产生抗体药物缀合物(ADC)的方法包括使用在线监测以测量组分至ADC缀合反应的添加。
在一些实施方案中，所述在线监测测量添加至所述ADC缀合反应的组分的浓度。
在一些实施方案中，所述在线监测测量添加至所述ADC缀合反应的组分的流率。在一些实施方案中，所述组分是抗体或其抗原结合片段、药物、接头、连接至接头的药物、连接至接头的抗体或其抗原结合片段和/或缀合缓冲液。
在一些实施方案中，所述方法还包括在线监测以测量组分至原位反应的添加。在一些实施方案中，所述组分是药物、接头和/或原位反应缓冲液。
在一些实施方案中，一种用于产生抗体药物缀合物(ADC)的方法包括分析物的在线监测以确定以下的时间：(i)停止向ADC缀合反应添加缀合缓冲液；(ii)停止缀合缓冲液于ADC缀合反应中的再循环；和/或(iii)开始冲洗来自ADC缀合反应的缀合缓冲液。在一些实施方案中，所述分析物是未缀合药物或连接至接头的未缀合药物。
在一些实施方案中，一种用于在ADC缀合过程之后纯化抗体药物缀合物(ADC)的方法包括分析物的在线监测。在一些实施方案中，所述纯化包括过滤。在一些实施方案中，所述过滤是超滤或渗滤。在一些实施方案中，所述过滤是切向流过滤。在一些实施方案中，所述切向流过滤是单程切向流过滤。在一些实施方案中，过滤为逆流渗滤。
在一些实施方案中，所述分析物是在渗余物中。在一些实施方案中，所述分析物是未缀合药物或连接至接头的未缀合药物的浓度。在一些实施方案中，所述分析物是ADC或抗体或其抗原结合片段的浓度。在一些实施方案中，所述分析物是缀合反应缓冲液或过滤缓冲液的组分的浓度。
在一些实施方案中，所述分析物是pH。
在一些实施方案中，所述分析物是在渗透物中。在一些实施方案中，所述分析物是ADC或抗体或其抗原结合片段的浓度。在一些实施方案中，所述分析物是未缀合药物或连接至接头的未缀合药物的浓度。
在一些实施方案中，所述纯化包括色谱法，并且所述分析物是在色谱柱的端部处测量。在一些实施方案中，所述分析物是ADC或抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述分析物是未缀合药物、连接至接头的未缀合药物、缀合反应缓冲液的组分或色谱缓冲液的组分。
在一些实施方案中，所述缀合反应是分批缀合反应。在一些实施方案中，所述缀合反应是连续缀合反应。
在一些实施方案中，所述在线监测使用可变光程技术、流通池装置、UV传感器、拉曼光谱法或傅里叶变换红外光谱法(FITR)执行。
在一些实施方案中，所述分析物的所述在线监测使用FlowVPE执行。
在一些实施方案中，所述在线监测改进ADC产率。在一些实施方案中，所述在线监测改进ADC回收率。在一些实施方案中，所述在线监测减少ADC产生的时间。在一些实施方案中，所述在线监测减少所使用的缓冲液的量。
在一些实施方案中，一种用于产生抗体药物缀合物(ADC)的方法包括分析物的在线监测以确定停止向ADC缀合反应添加缀合反应组分的时间。在一些实施方案中，所述组分是抗体或其抗原结合片段、药物、接头、连接至接头的药物和/或缀合反应缓冲液。
在一些实施方案中，所述ADC包含抗体。在一些实施方案中，其中所述ADC包含抗体的抗原结合片段。在一些实施方案中，所述ADC包含特异性结合至CD37、CD33、FOLR1、CD123、CD19、cMET、ADAM9或HER2的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含huMov19、Z4681A或G4732A的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3。在一些实施方案中，所述CDR为Kabat定义的CDR、Chothia定义的CDR或AbM定义的CDR。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含有包含以下序列的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列：分别SEQ ID NO:1-6、分别SEQ ID NO:7-12、分别SEQ ID NO:13-18、分别SEQ ID NO:19-24、分别SEQ ID NO:25-30或分别SEQ ID NO:31-36。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含有包含以下序列的VH和VL序列：分别SEQ ID NO:37和38、分别SEQ ID NO:37和39、分别SEQ ID NO:40和41、分别SEQ ID NO:42和43、分别SEQ ID NO:44和45、分别SEQ ID NO:46和47或分别SEQ ID NO:48和49。在一些实施方案中，所述抗体包含有包含以下序列的重链和轻链序列：分别SEQ ID NO:50和51、分别SEQ ID NO:50和52、分别SEQ ID NO:53和54或分别SEQ ID NO:55和56。
在一些实施方案中，所述ADC包含选自由以下组成的组的接头：SMCC、sSPDB和肽接头。在一些实施方案中，所述ADC包含美登木素(maytansinoid)或吲哚啉并-苯二氮
Figure BDA0002578586160000071
。在一些实施方案中，所述美登木素是DM1或DM4。在一些实施方案中，所述吲哚啉并-苯二氮
Figure BDA0002578586160000072
是DGN462或DGN549。
在一些实施方案中，所述ADC是IMGN529、IMGN779、IMGN853、IMGN632或Kadcyla。
在一些实施方案中，一种用于产生IMGN853的方法包括：(i)在连续缀合过程中混合huMov19抗体和连接至磺基-SPDB的DM4以形成IMGN853，任选地其中在线监测用于测量添加至缀合反应的huMov19抗体的浓度；(ii)任选地使用单程切向流过滤浓缩IMGN853，任选地其中在线监测用于测量渗余物中未缀合药物的浓度；(iii)使用单程切向流过滤纯化IMGN853，任选地其中在线监测用于测量渗余物中未缀合药物的浓度；和(iv)使用单程切向流过滤将所述IMGN853交换至调配缓冲液中，任选地其中在线监测用于测量渗余物中杂质的浓度。
在一些实施方案中，一种用于产生IMGN853的方法包括：(i)在连续缀合过程中混合huMov19抗体和连接至磺基-SPDB的DM4以形成IMGN853，任选地其中在线监测用于测量添加至缀合反应的huMov19抗体的浓度；(ii)任选地使用单程切向流过滤和/或逆流渗滤浓缩IMGN853，任选地其中在线监测用于测量渗余物中未缀合药物的浓度；(iii)使用单程切向流过滤和/或逆流渗滤纯化IMGN853，任选地其中在线监测用于测量渗余物中未缀合药物的浓度；和(iv)使用单程切向流过滤和/或逆流渗滤将所述IMGN853交换至调配缓冲液中，任选地其中在线监测用于测量渗余物中杂质的浓度。
在一些实施方案中，一种用于产生IMGN779的方法包括：(i)在连续缀合过程中混合Z4681A抗体和连接至磺基-SPDB的DGN462以形成IMGN779，任选地其中在线监测用于测量添加至缀合反应的Z4681A抗体的浓度；(ii)任选地使用单程切向流过滤浓缩IMGN779，任选地其中在线监测用于测量渗余物中未缀合药物的浓度；(iii)使用单程切向流过滤纯化IMGN779，任选地其中在线监测用于测量渗余物中未缀合药物的浓度；和(iv)使用单程切向流过滤将所述IMGN779交换至调配缓冲液中，任选地其中在线监测用于测量渗余物中杂质的浓度。
在一些实施方案中，一种用于产生IMGN779的方法包括：(i)在连续缀合过程中混合Z4681A抗体和连接至磺基-SPDB的DGN462以形成IMGN779，任选地其中在线监测用于测量添加至缀合反应的Z4681A抗体的浓度；(ii)任选地使用单程切向流过滤和/或逆流渗滤浓缩IMGN779，任选地其中在线监测用于测量渗余物中未缀合药物的浓度；(iii)使用单程切向流过滤和/或逆流渗滤纯化IMGN779，任选地其中在线监测用于测量渗余物中未缀合药物的浓度；和(iv)使用单程切向流过滤和/或逆流渗滤将所述IMGN779交换至调配缓冲液中，任选地其中在线监测用于测量渗余物中杂质的浓度。
在一些实施方案中，一种用于产生IMGN632的方法包括：(i)在连续缀合过程中混合G4732A抗体和磺化的DNG549C以形成IMGN632；(ii)任选地使用单程切向流过滤浓缩IMGN632，任选地其中在线监测用于测量渗余物中未缀合药物的浓度；(iii)使用单程切向流过滤纯化IMGN632，任选地其中在线监测用于测量渗余物中未缀合药物的浓度；和(iv)使用单程切向流过滤将所述IMGN632交换至调配缓冲液中，任选地其中在线监测用于测量渗余物中杂质的浓度。在一些实施方案中，在缀合过程之前于仅一个SPTFF步骤中还原和氧化G4732A抗体。
在一些实施方案中，一种用于产生IMGN632的方法包括：(i)在连续缀合过程中混合G4732A抗体和磺化的DNG549C以形成IMGN632；(ii)任选地使用单程切向流过滤和/或逆流渗滤浓缩IMGN632，任选地其中在线监测用于测量渗余物中未缀合药物的浓度；(iii)使用单程切向流过滤和/或逆流渗滤纯化IMGN632，任选地其中在线监测用于测量渗余物中未缀合药物的浓度；和(iv)使用单程切向流过滤和/或逆流渗滤将所述IMGN632交换至调配缓冲液中，任选地其中在线监测用于测量渗余物中杂质的浓度。在一些实施方案中，在缀合过程之前于仅一个SPTFF或逆流渗滤步骤中还原和氧化G4732A抗体。
在一些实施方案中，所述方法包括将缀合过程的第一温度增加至少5℃至高温，其中所述高温维持不多于20分钟。
在一些实施方案中，一种产生ADC的方法包括将缀合过程的第一温度增加至少5℃至高温，其中所述高温维持不多于20分钟。
在一些实施方案中，所述高温不多于55℃。在一些实施方案中，所述第一温度增加至少10℃、至少15℃、至少20℃或至少30℃。
在一些实施方案中，所述高温是35℃至55℃或是40℃至50℃。
在一些实施方案中，将所述第一温度增加至所述高温不需要长于2分钟或不需要长于1分钟。
在一些实施方案中，所述方法还包括将所述高温降低至任选地所述第一温度。在一些实施方案中，将所述高温降低至任选地所述第一温度不需要长于2分钟或不需要长于1分钟。
在一些实施方案中，将所述第一温度增加至所述高温然后降低所述高温的步骤重复至少两次或至少三次。在一些实施方案中，将所述第一温度增加至所述高温然后降低所述高温的步骤重复2-20次或5-10次。
在一些实施方案中，所述方法包括将缀合过程的第一温度降低至少5℃至低温，其中所述低温维持不多于20分钟。
在一些实施方案中，一种产生ADC的方法包括将缀合过程的第一温度降低至少5℃至低温，其中所述低温维持不多于20分钟。在一些实施方案中，所述第一温度降低不多于30℃。在一些实施方案中，所述温度降低至少10℃、至少15℃或至少20℃。
在一些实施方案中，将所述第一温度降低至所述低温不需要长于2分钟或不需要长于1分钟。
在一些实施方案中，所述方法还包括将所述低温增加至任选地所述第一温度。在一些实施方案中，将所述低温增加至任选地所述第一温度不需要长于2分钟或不需要长于1分钟。
在一些实施方案中，将所述第一温度降低至所述低温然后增加所述低温的步骤重复至少两次或至少三次。在一些实施方案中，将所述第一温度降低至所述低温然后增加所述低温的步骤重复2-20次或5-10次。
在一些实施方案中，其中所述高温或低温维持不多于15分钟。在一些实施方案中，所述高温或低温维持30秒至15分钟。在一些实施方案中，所述高温或低温维持15至20分钟。在一些实施方案中，所述高温或低温维持10至15分钟。在一些实施方案中，所述高温或低温维持5至10分钟。在一些实施方案中，所述高温或低温维持1至5分钟。
在一些实施方案中，所述方法包括将缀合过程的第一pH改变至少0.5至变化的pH，其中所述变化的pH维持不多于20分钟。
在一些实施方案中，一种产生ADC的方法包括将缀合过程的第一pH改变至少0.5至变化的pH，其中所述变化的pH维持不多于20分钟。
在一些实施方案中，所述第一pH增加至少1，任选地其中所述变化的pH不超过9。在一些实施方案中，所述第一pH增加至少2或至少3。
在一些实施方案中，所述第一pH降低至少1，任选地其中所述变化的pH不低于4。在一些实施方案中，所述第一pH降低至少2或至少3。
在一些实施方案中，所述方法还包括改变所述变化的pH任选地至所述第一pH。在一些实施方案中，将所述第一pH改变至所述变化的pH然后改变所述变化的pH的步骤重复至少两次或至少三次。在一些实施方案中，将所述第一pH改变至所述变化的pH然后改变所述变化的pH的步骤重复2-20次或5-10次。
在一些实施方案中，所述变化的pH维持不多于15分钟。在一些实施方案中，所述变化的pH维持30秒至15分钟。在一些实施方案中，所述变化的pH维持15至20分钟。在一些实施方案中，所述变化的pH维持10至15分钟。在一些实施方案中，所述变化的pH维持5至10分钟。在一些实施方案中，所述变化的pH维持1至5分钟。
本文还提供根据本文所提供的方法产生的ADC。
附图说明
图1显示以整合反馈控制机构的完全连续的抗体药物缀合物(ADC)制造过程(下图)和其与常规分批加工(上图)的关系。
图2为显示半分批操作(其并入实现连续的技术)(下图)和其与常规分批加工(上图)的关系的流程图。
图3为显示半分批单元操作(下图)的联接和其与常规分批加工(上图)的关系的流程图。
图4为显示实施例1中所述的抗体药物缀合物ADC“IMGN853”的缀合的连续缀合过程的流程图。“mAb”是指单克隆抗体(即，huMov19)。“D”是指药物(即，美登木素DM4)，并且“L”是指接头(即，sSPDB)。
图5显示实施例1A中所述的连续缀合研究的设置。第一注射泵(L/D/DMA)进料溶解于DMA中的原位组分。缓冲液(IS)注射泵进料原位反应缓冲液(与缀合反应缓冲液相同，但就原位反应而言pH为7.6)。第三注射器进料抗体和pH8.7缀合反应缓冲液。“mAb”是指单克隆抗体(即，huMov19)。“D”是指药物(即，美登木素DM4)，并且“L”是指接头(即，sSPDB)。“IS”是指原位。
图6显示实施例1B中所述的在ILC、ILDF1和ILDF2阶段取得的样品中四种主要杂质物质的游离药物杂质水平。
图7显示如实施例1B中所述在15mg/mL进料浓度下在ILDF1取得的样品中四种主要杂质物质的游离药物杂质水平。
图8显示连续和分批TFF纯化过程的游离药物杂质水平的比较。连续(条状条)缀合物材料是在15g/L起始浓度下加工，而分批(实心条)材料在30g/L下加工，如实施例1B中所述。
图9显示如实施例1B中所述在30mg/mL进料浓度下在ILDF1取得的样品中四种主要杂质物质的游离药物杂质水平。
图10为显示实施例2中所述的抗体药物缀合物(ADC)“IMGN632”的缀合的连续缀合过程的流程图。“mAb”是指单克隆抗体(即，G4723A)。
图11显示IMGN632的化学结构。IMGN632为于亚硫酸氢钠中包含含有连接至细胞毒性有效负载DGN549-C的抗CD123 G4723的ADC的组合物。组合物中大部分ADC为上图所示的磺化型式。下图显示未磺化形式的含有连接至细胞毒性有效负载DGN549-C的抗CD123G4723抗体的ADC(单亚胺结构)，其还可存在于IMGN632组合物中。
图12显示在线过程自动化技术(PAT)的使用可如何用于增加控制和可检测性。
图13显示可用于以高温脉冲缀合反应的加热和冷却反应器的示意图。在脉冲反应器(标记为“PR”)，护套温度升高，使得线圈内所容纳的反应组分暂时加热，诱导短暂的温度偏移。然后，在冷却反应器(标记为“CR”)中，护套温度保持在较冷的温度，以使线圈内的反应组分从高温冷却回来。这可减少反应期间发生的聚集的量。停留时间反应器(RTR)在脉冲完成后维持所要的反应温度，并且其体积可基于所要的反应时间。
图14显示在暴露于连续20℃温度或暴露于在较高温度下的重复脉冲的缀合反应中IMGN853缀合的速率(左图)和高分子量(HMW；聚集体)物质的累积。
具体实施方式
I.定义
如本文所用的术语“抗体药物缀合物”(ADC)和“免疫缀合物”是指连接至细胞结合剂(例如，抗体或其抗原结合片段)并且由以下通式定义的化合物或其衍生物：D-L-A，其中D＝细胞毒性药物，L＝接头，并且A＝抗体或抗体片段。ADC也可以相反次序由以下通式定义：A-L-D。ADC可包含每个抗体或其抗原结合片段多个药物和接头，例如，(D-L)4-A或A-(L-D)2。术语“抗体药物缀合物”和“免疫缀合物”在本文中可互换使用。
“接头”为能够以稳定、共价的方式将药物连接至细胞结合剂(例如，抗体或其抗原结合片段)的任何化学部分。在化合物或抗体保持活性的条件下，接头易受或实质上抵抗酸诱导的裂解、光诱导的裂解、肽酶诱导的裂解、酯酶诱导的裂解和二硫键裂解。合适的接头为所属领域中熟知的并且包括例如二硫基、硫醚基和肽接头。
术语“抗体”意指通过免疫球蛋白分子可变区内的至少一个抗原识别位点识别并且特异性结合至靶标的免疫球蛋白分子，所述靶标诸如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或前述者的组合。如本文所用，术语“抗体”涵盖完整的多克隆抗体、完整的单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的融合蛋白和任何其他经修饰免疫球蛋白分子，只要抗体表现出所要生物活性即可。基于免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ的识别，抗体可为五大类免疫球蛋白(IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)或其子类(同型)(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)的任一者。不同类别的免疫球蛋白具有不同并且熟知的亚单元结构和三维构型。抗体可为裸露的或缀合至诸如毒素、放射性同位素等的其他分子。
术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分。“抗原结合片段”是指结合至抗原的完整抗体的一部分。抗原结合片段可含有完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、线性抗体和单链抗体。抗体片段可为裸露的或缀合至诸如毒素、放射性同位素等的其他分子。
如本文所用，术语“可变区”或“可变结构域”可互换使用并且在所属领域中是常见的。可变区通常是指抗体的一部分，一般而言轻链或重链的一部分，通常成熟重链中氨基末端约110至120个氨基酸或110至125个氨基酸和成熟轻链中约90至115个氨基酸，其在抗体之间在序列上广泛不同并且用于特定抗体针对其特定抗原的结合和特异性中。序列的可变性集中在称为互补决定区(CDR)的那些区域中，而可变结构域中的更高度保守区称为构架区(FR)。不希望受任何特定机制或理论束缚，认为轻链和重链的CDR主要负责抗体与抗原的相互作用和特异性。在某些实施方案中，可变区为人可变区。在某些实施方案中，可变区包含啮齿动物或鼠科CDR和人构架区(FR)。在具体实施方案中，可变区为灵长类动物(例如，非人灵长类动物)可变区。在某些实施方案中，可变区包含啮齿动物或鼠科CDR和灵长类动物(例如，非人灵长类动物)构架区(FR)。
术语“VL”和“VL结构域”可互换使用以指代抗体的轻链可变区。
术语“VH”和“VH结构域”可互换使用以指代抗体的重链可变区。
术语“Kabat编号”和类似术语在所属领域中是公认的并且指代对抗体或其抗原结合片段的重链和轻链可变区的氨基酸残基进行编号的系统。在某些方面中，可根据Kabat编号系统确定CDR(参见例如，Kabat EA和Wu TT(1971)Ann NY Acad Sci 190:382-391以及Kabat EA等人,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH公布第91-3242号)。使用Kabat编号系统，抗体重链分子内的CDR通常存在于31至35氨基酸位(其任选地可在35之后包括一个或两个额外氨基酸(在Kabat编号方案中称为35A和35B))(CDR1)、50至65氨基酸位(CDR2)和95至102氨基酸位(CDR3)。使用Kabat编号系统，抗体轻链分子内的CDR通常存在于24至34氨基酸位(CDR1)、50至56氨基酸位(CDR2)和89至97氨基酸位(CDR3)。在一特定实施方案中，根据Kabat编号方案确定本文所述的抗体的CDR。
Chothia替代地提及结构环的位置(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。当使用Kabat编号惯例编号时，Chothia CDR-H1环的末端取决于环的长度而在H32与H34之间变化(这是由于Kabat编号方案将插入放置于H35A和H35B处；若35A或35B不存在，则环结束于32处；若仅35A存在，则环结束于33处；若35A和35B均存在，则环结束于34处)。AbM超变区表示Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷，并且通过Oxford Molecular的AbM抗体建模软件来使用。
Figure BDA0002578586160000151
如本文所用，术语“恒定区”或“恒定结构域”可互换并且具有其在所属领域中共同的意义。恒定区为抗体部分，例如，轻链和/或重链的羧基末端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合但可表现出各种效应功能，诸如与Fc受体的相互作用。免疫球蛋白分子的恒定区一般相对于免疫球蛋白可变结构域具有更保守的氨基酸序列。在某些方面中，抗体或抗原结合片段包含对于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)而言足够的恒定区或其部分。
如本文所用，术语“重链”在关于抗体使用时可指代基于恒定结构域的氨基酸序列的任何不同类型，例如，α、δ、ε、γ和μ，从而分别产生IgA、IgD、IgE、IgG和IgM类别的抗体，包括IgG的子类，例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。重链氨基酸序列在所属领域中为熟知的。在特定实施方案中，重链为人重链。
如本文所用，术语“轻链”在关于抗体使用时可指代基于恒定结构域的氨基酸序列的任何不同类型，例如，κ或λ。轻链氨基酸序列在所属领域中为熟知的。在特定实施方案中，轻链为人轻链。
如本文所用的术语“缀合过程”是指将缀合反应试剂(例如，细胞结合剂、药物和接头；细胞结合剂和连接至接头的药物；或连接至接头的细胞结合剂和药物)在允许试剂反应并且形成ADC的条件下混合的过程。
如本文所用的术语“分批缀合过程”是指以下缀合过程，在所述缀合过程中，将缀合反应试剂大量混合在一起，发生缀合反应以形成缀合反应产物(ADC)，然后大量去除缀合反应产物(ADC)。
如本文所用的术语“连续缀合过程”是指以下缀合过程，在所述缀合过程中一种或多种缀合反应试剂在缀合反应进行的同时和在已形成至少一种缀合反应产物(ADC)之后继续添加至缀合反应。在缀合反应进行时，可继续从缀合反应去除缀合反应产物(ADC)。
如本文所用的术语“原位反应”是指将药物和接头混合以形成连接至接头的药物的过程。然后，连接至接头的药物可用于与细胞结合剂(例如，抗体)的缀合反应中以形成ADC。
如本文所用的术语“流动反应器”是指用于连续反应化学的任何反应器容器，通常为管状。流动反应器可由不锈钢、玻璃、聚合物等制成。
如本文所用的术语“在线监测”是指例如在正发生缀合反应、浓缩过程、纯化过程或缓冲液交换过程的同时实时监测分析物。
如本文所用的术语“过滤器”是指允许流体中物质的分离的选择性屏障。分离是通过选择性地使一种或多种流体行进(渗透)通过过滤器，同时延迟一种或多种其他物质的通过来实现。
如本文所用的术语“进料流”是指经进料至过滤器或膜以供过滤器或膜中组分的分离的流体。
如本文所用的术语“渗余物”是指不行进通过过滤器的进料流的部分。
如本文所用的术语“渗透物”是指行进通过过滤器的进料流的部分。
如本文所用的术语“切向流过滤”(TFF)是指进料流平行于膜面行进的基于膜的过滤过程。一部分进料流行进通过膜(渗透物)，而其余部分(渗余物)再循环回到进料储存器。TFF还称为错流过滤(cross-flow filtration)。用于执行TFF的系统是已知的并且包括例如Pellicon型系统(Millipore,Billerica,MA)、Sartocon Cassette系统(Sartorius AG,Edgewood,NY)和Centrasette型系统(Pall Corporation,East Hills,NY)。
如本文所用的术语“单程切向流过滤”(SPTFF)是指进料流仅通过过滤膜一次的切向流过滤过程。用于执行SPTFF的系统是已知的并且包括例如Cadance型系统(PallCorporation,Westborough,MA)。用于执行SPTFF的系统和方法公开于例如美国专利第7,384,549号、美国专利第7,510,654号、美国专利第7,682,511号、美国专利第7,967,987号、美国专利第8,157,999号和美国专利第8,231,787号，其各自以全文引用的方式并入本文。
如本文所用的术语“连续渗滤”是指以连续的方式通过将进料流与稀释剂混合并在渗透物和渗余物被去除的情况下将其泵送穿过膜所实现的选择性分离溶质的渗滤过程。在过滤进行时，容器中未形成产物；而是在过滤的时程期间产物经连续地从系统抽出。“逆流渗滤”是指其中过程流(例如，渗透物或渗余物)在渗滤步骤中被回收的连续渗滤过程。
术语“在线监测”是指例如在生产或纯化过程期间实时监测分析物。在线监测与过程中取样或离线分析不同，后者不提供实时反馈。
术语“在线过程自动化技术”是指用于在过程期间监测分析物的任何在线测量装置。
如本文所用的术语“分析物”是广义的术语，并且其无限制地指代流体中可被分析的物质或化学组分。分析物可包括天然存在的物质、人工物质、代谢物和/或反应产物。在一些实施方案中，本文所公开的方法中用于测量的分析物是抗体或其抗原结合片段、药物、接头、结合至抗体或其抗原结合片段的接头、结合至药物的接头、抗体-药物缀合物(ADC)、药物-抗体比率(DAR)和/或杂质。
如本文所用的术语“反应缓冲液”是指可在其中发生反应的缓冲液。因此，如本文所用的术语“缀合反应缓冲液”或“缀合缓冲液”是指可在其中发生缀合反应(连续缀合反应或分批缀合反应)的缓冲液。类似地，如本文所用的术语“原位反应缓冲液”或“原位缓冲液”是指可在其中发生原位反应的缓冲液。
如本文所用的术语“调配缓冲液”是指允许活性成分的生物活性并且不含有对调配物所将施用的受试者有不可接受的毒性的额外组分。
如本文所用的术语“吲哚啉并苯二氮
Figure BDA0002578586160000181
”(IGN)是指具有吲哚啉并苯二氮
Figure BDA0002578586160000182
核结构的化合物。吲哚啉并苯二氮
Figure BDA0002578586160000183
可被取代或未取代。其还包括具有两个由接头连接的吲哚啉并苯二氮
Figure BDA0002578586160000184
核的化合物。可减少作为吲哚啉并苯二氮
Figure BDA0002578586160000185
核的一部分的亚胺官能团(-C＝N-)。在某些实施方案中，吲哚啉并苯二氮
Figure BDA0002578586160000186
化合物包含由
Figure BDA0002578586160000187
表示的核结构，其可任选地被取代。
在一些实施方案中，吲哚啉并苯二氮
Figure BDA0002578586160000188
化合物包含由
Figure BDA0002578586160000189
表示的核结构，其可进一步被取代。
如本文所用的术语“吡咯并苯二氮
Figure BDA00025785861600001810
”(PBD)是指具有吡咯并苯二氮
Figure BDA00025785861600001811
核结构的化合物。吡咯并苯二氮
Figure BDA0002578586160000191
可被取代或未取代。其还包括具有由接头连接的两个吡咯并苯二氮
Figure BDA0002578586160000192
核的化合物。可减少作为吲哚啉并苯二氮
Figure BDA0002578586160000193
核的一部分的亚胺官能团(-C＝N-)。在某些实施方案中，吡咯并苯二氮
Figure BDA0002578586160000194
化合物包含由
Figure BDA0002578586160000195
表示的核结构，其可任选地被取代。在某些实施方案中，吡咯并苯二氮
Figure BDA0002578586160000197
化合物包含由
Figure BDA0002578586160000196
表示的核结构，其可任选地被取代。
如本公开和权利要求中所使用，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“所述”包括复数形式。
应理解，无论什么情况下在本文用语言“包含”描述实施方案，还提供以“由…组成”和/或“基本上由…组成”的术语描述的其他类似实施方案。
如本文中诸如“A和/或B”的短语中所使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”和“B”。同样，如诸如“A、B和/或C”的短语中所使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方案中的各者：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
II.连续缀合、单程切向流过滤和逆流渗滤
本文提供用于执行和/或加工抗体药物缀合物(ADC)的连续方法。在分批形成和加工中，将组分添加至过程中，所述过程进行一段时间，然后大量去除所述过程的产物。相反，在本文所提供的连续方法中，继续将组分添加至正在进行的过程中，并且产物可在整个过程中经去除而不是在过程结束时大量去除。例如，在连续缀合过程中，在反应进行的同时和在已形成至少一种缀合反应产物(ADC)之后继续将一种或多种缀合反应试剂添加至缀合反应中。类似地，在下游连续浓缩、纯化和/或缓冲液交换过程中，继续将ADC、缓冲液和/或其他组分添加至浓缩纯化中，和/或在所述过程进行时进行缓冲液交换，并且可从所述正在进行的过程中去除经浓缩、经纯化和经缓冲液交换的ADC。据此，从ADC缀合至ADC调配的整个ADC过程可为连续的(参见例如图1(下图))。
本发明人已经证明，可使用流动反应器连续执行缀合过程。流动反应器允许在缀合反应进行的同时和在已形成至少一种缀合反应产物(ADC)之后继续将一种或多种缀合反应试剂添加至缀合反应中。在缀合过程中流动反应器的使用允许缀合反应的控制和缀合过程的多面性(例如，快速温度变化/较严格的温度控制、通过扩散介导的混合因此较均匀和不受容器或套件限制的限制)并且改进ADC缀合过程的可扩充性(即，分批加工的常规规模扩大风险不适用并且时空产率通过运行当前过程达较长时间来最佳化(例如，执行伪规模扩大(增加输出))。
本发明人进一步证明，连续ADC加工可使用单程切向流过滤(SPTFF)来完成，其可成功地将未缀合药物与ADC分离。本体(常规)渗滤涉及以第一缓冲液A(产物最初所在的缓冲液)注入切向流过滤(TFF)系统。然后将产物添加至渗余物容器中，在所述渗余物容器中与初始体积混合。渗余物容器的进料泵将来自渗余物的产物泵送于TFF膜上，在所述TFF膜上其经保留(并返回至渗余物)或丢弃。另一泵(渗滤泵)从所述容器进料至容纳于单独容器中的缓冲液B(产物将交换至其中的缓冲液)，进料管线为从所述容器至渗余物容器中。将两个泵启动，并且渗余物容器中的产物开始通过TFF膜。在缓冲液经由废物流去除时，渗余物中的体积通过将缓冲液B(以相等体积)添加至渗余物容器中来维持。因此，产物缓慢地交换至缓冲液B中。
SPTFF使用将最初于缓冲液A中的产物交换至缓冲液B中的相关概念。然而，产物仅在膜上通过一次，因此必须实现所有适当体积的缓冲液B均实现完全的缓冲液交换。为此，SPTFF可以在堆叠阶段添加缓冲液B。因此，产物仅通过膜一次：进入缓冲液A并离开缓冲液B中的模块。
类似地，连续ADC加工可使用逆流渗滤完成。
据此，与分批ADC加工相比，本文所提供的连续ADC加工方法(例如，使用SPTFF和/或逆流渗滤)可减少加工时间、改进产率和/或提高产品一致性。本文所提供的连续ADC加工方法(例如，使用SPTFF和/或逆流渗滤)还可消除分批缀合过程中所使用的保持步骤。本文所提供的连续ADC加工方法(例如，使用SPTFF和/或逆流渗滤)还可允许使用较小设备。SPTFF也是有利的，因为可能由剪切力引起的对氧化敏感的抗体可能更适合于SPTFF。
ADC加工可涉及ADC的缀合(形成)、ADC的浓缩、ADC的纯化和/或ADC的调配。尽管连续尤其可用于从ADC缀合至调配的整个过程(例如，如图1所示)，但是也可能将连续加工步骤与分配加工步骤组合(例如，如图2和图3所示)。此外，上游加工步骤(例如，抗体、接头和/或药物的制备)有可能为连续的并且连续进料至ADC缀合中。
据此，在本文所提供的一些方法中，用于形成抗体药物缀合物(ADC)的缀合过程为连续的。在连续缀合过程中，在缀合反应进行的同时和在已形成至少一种缀合反应产物(ADC)之后继续将一种或多种缀合反应试剂添加至缀合反应中。可将缀合反应试剂放入系统中，同时从系统去除经组装的ADC。例如，在本文所提供的一些连续缀合过程中，在缀合反应进行的同时和在形成至少一种ADC之后继续将细胞结合剂(例如，抗体或其抗原结合片段)、连接至接头的药物和缀合反应缓冲液添加至缀合反应中。在本文所提供的一些连续缀合过程中，在缀合反应进行的同时和在形成至少一种ADC之后继续将连接至接头的细胞结合剂(例如，抗体或其抗原结合片段)、药物和缀合反应缓冲液添加至缀合反应中。在本文所提供的一些连续缀合过程中，在缀合反应进行的同时和在形成至少一种ADC之后继续将细胞结合剂(例如，抗体或其抗原结合片段)、药物、接头和缀合反应缓冲液添加至缀合反应中。继续添加的试剂可以在单一进料流中一起添加，或可分开进料至收集容器中或直接添加至反应容器中。
在本文所提供的一些连续缀合过程中，在缀合反应进行的同时和在形成至少一种ADC之后继续将细胞结合剂(例如，抗体或其抗原结合片段)、连接至接头的细胞结合剂、药物、连接至接头的药物、接头或缀合反应缓冲液中的仅一者添加至缀合反应中。在本文所提供的一些连续缀合过程中，在缀合反应进行的同时和在形成至少一种ADC之后继续将选自由细胞结合剂(例如，抗体或其抗原结合片段)、连接至接头的细胞结合剂、药物、连接至接头的药物、接头和缀合反应缓冲液组成的组的两种试剂添加至缀合反应中。
使用SPTFF可允许连续添加组分和/或从缀合反应去除组分。因此，SPTFF可用于制备用于ADC缀合和用于加工经组装ADC的试剂。SPTFF可实现连续ADC加工，使得可同时发生具体ADC的所有加工步骤(或亚组)(例如，产生、浓缩、纯化和/或调配)。逆流渗滤也可用于制备用于ADC缀合和用于加工经组装ADC的试剂。
根据本文所提供的方法，SPTFF可用于浓缩ADC、纯化ADC和/或调配ADC(例如，通过将ADC交换至调配缓冲液中)。SPTFF可用于将ADC从第一缓冲液转移至第二缓冲液。逆流渗滤也可用于浓缩ADC、纯化ADC和/或调配ADC(例如，通过将ADC交换至调配缓冲液中)。逆流渗滤也可用于将ADC从第一缓冲液转移至第二缓冲液中。
在本文所提供的一些方法中，SPTFF用于整个ADC产生、纯化和调配中，使从ADC产生至调配的整个过程为连续的。在本文所提供的一些方法中，逆流渗滤用于整个ADC产生、纯化和调配中，使从ADC产生至调配的整个过程为连续的。因此，示范性图4和图10所示的整个过程可为连续的。
在本文所提供的一些方法中，SPTFF与常规TFF组合使用，使得示范性图4和图10所示的过程的一些部分为连续的，而其他部分为分批执行的。例如，可在缀合之前使用常规(分批)TFF(参见例如图4中的TFF1)对抗体或其抗原结合片段进行缓冲液交换，然后进料至连续过程中，其中SPTFF用于下游过程(参见例如图4中的TFF2阶段1和II)。在此类方法中可使用逆流渗滤来代替SPTFF或者将逆流渗滤与SPTFF组合使用。
在图4和图10中，以虚线所示的各方框表示可以分批或连续方式进行的过程的个别部分。例如，图4左上方框中所示的用于将抗体置于缓冲液中以供缀合的过程可使用SPTFF并且以连续方式执行或可使用常规TFF并且以分批方式执行。不论用于将抗体置于缓冲液中以供缀合的过程是以分批方式还是以连续方式执行，缀合反应下游的方框中所示的ADC浓缩和纯化过程可使用SPTFF并且以连续方式执行或可使用常规TFF并且以分批方式进行。类似地，不论用于将抗体置于缓冲液中以供缀合的过程是于分批过程中执行还是于连续过程中执行，并且不论ADC是使用分批过程还是连续过程进行浓缩和纯化，ADC可使用SPTFF以连续方式或使用常规TFF以分批方式执行。在此类方法中可使用逆流渗滤来代替SPTFF或者将逆流渗滤与SPTFF组合使用。
在一些实施方案中，使用SPTFF执行ADC方法中的至少两个步骤。例如，在一些实施方案中，SPTFF用于将抗体或其抗原结合片段转移至缀合缓冲液中并且用于在形成ADC之后浓缩并纯化ADC，同时SPTFF或TFF用于将ADC交换至调配缓冲液中。在一些实施方案中，SPTFF用于将抗体或其抗原结合片段转移至缀合缓冲液中并且用于将经纯化ADC交换至调配缓冲液中，同时SPTFF或TFF用于在形成ADC之后浓缩并且纯化ADC。在一些实施方案中，SPTFF用于浓缩并且纯化ADC并且用于将经浓缩并且经纯化ADC交换至调配缓冲液中，其中SPTFF或TFF用于将抗体或其抗原结合片段转移至缀合缓冲液中。
SPTFF可例如在浓缩ADC的方法中使用超滤膜。SPTFF可例如在纯化ADC的方法中和/或在将ADC转移至缓冲液(例如，调配缓冲液)的方法中使用渗滤膜。
在一些实施方案中，使用SPTFF和/或逆流渗滤执行ADC方法中的至少两个步骤。例如，在一些实施方案中，SPTFF和/或逆流渗滤用于将抗体或其抗原结合片段转移至缀合缓冲液中并且用于在形成ADC之后浓缩并纯化ADC，同时SPTFF、逆流渗滤和/或TFF用于将ADC交换至调配缓冲液中。在一些实施方案中，SPTFF和/或逆流渗滤用于将抗体或其抗原结合片段转移至缀合缓冲液中并且用于将经纯化ADC交换至调配缓冲液中，同时SPTFF、逆流渗滤和/或TFF用于在形成ADC之后浓缩并且纯化ADC。在一些实施方案中，SPTFF和/或逆流渗滤用于浓缩并且纯化ADC并且用于将经浓缩并且经纯化ADC交换至调配缓冲液中，其中SPTFF、逆流渗滤和/或TFF用于将抗体或其抗原结合片段转移至缀合缓冲液中。
柱色谱法还可在本文所提供的连续ADC加工方法(例如，与SPTFF和/或逆流渗滤组合)中以流过式模式使用。例如，缀合反应(例如，连续缀合反应)可进料至流过式柱色谱法中以去除缀合反应的未缀合药物(类似于TFF2的作用，图4中的阶段ILDF步骤)。然后经由流过式柱色谱法纯化的ADC可进料至SPTFF过程中以供向调配缓冲液中的缓冲液交换(例如，TFF2，图5中的阶段II ILDF步骤)。经由流过式柱色谱法纯化的ADC还可进料至逆流渗滤过程中以供向调配缓冲液中的缓冲液交换。
在一些情况下，本文所提供的连续流动缀合过程的反应参数可经快速变化或“脉冲”。例如，在连续流动缀合中，温度可例如通过水浴、封装反应器、加热器、热电源和/或使反应流动通过的线圈和/或管的节段绝缘来快速变化。此外，在连续流动缀合中，pH可例如通过添加酸或碱来快速变化。据此，在某些情况下，使用脉冲参数执行缀合反应。使用脉冲参数可例如减少反应时间(即，反应速度增加)，而不影响产物质量；通过快速降低温度来淬灭或短暂停止反应；在引入另一微扰(例如，添加另一化学试剂)之前稳定溶液中的缀合物，而较长暴露于所述参数可显著降低产物质量或产物稳定性。
在某些情况下，将缀合反应暴露于变化的温度(例如，增加或降低)达指定时间增量达指定次数。例如，在一种情况下，温度增加至少2℃、至少3℃、至少4℃或至少5℃。据此，温度可增加或降低至少5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃或35℃。例如，温度可增加或降低5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃或35℃。温度还可增加或降低约5℃至约10℃、约10℃至约15℃、约15℃至约20℃、约20℃至约25℃、约25℃至约30℃或约30℃至约35℃。因此，例如，温度可增加(例如，从约20℃)至25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃或55℃的高温。温度还可增加(例如，从约25℃)至30℃、35℃、40℃、45℃、50℃或55℃的高温。在某些情况下，温度不超过55℃。在某一情况下，温度增加(例如，从约20℃)至在约35℃至约55℃的范围内的高温或在约40℃至约50℃的范围内的高温。在某些情况下，温度增加(例如，从约20℃)至约60℃、至约70℃、至约80℃、至约90℃或至约100℃的高温(例如，达短时间增量诸如10秒)。在某些情况下，温度升高(例如，从约20℃)至在60℃至70℃的范围内、在70℃至80℃的范围内、在80℃至90℃的范围内或在90℃至100℃的范围内的高温(例如，达短时间增量诸如10秒)。在某些情况下，将温度升高或降低至高温或低温所需的时间不多于2分钟。在某些情况下，将温度升高或降低至高温或低温所需的时间不多于1分钟。
在某些情况下，将缀合反应暴露于变化的pH(例如，增加或降低)达指定时间增量达指定次数。例如，在一种情况下，pH增加或降低约1、约2、约3、约4或约5。在一种情况下，pH增加约1至约2、约2至约3、约3至约4或约4至约5。因此，例如，pH可增加(例如，从约4)至约5、约6、约7、约8或约9。PH还可增加(例如，从约5)至约6、约7、约8或约9。PH还可降低(例如，从约9)至约8、约7、约6、约5或约4。
在某些情况下，脉冲(例如，于变化的温度和/或pH的暴露)发生约30秒、约1分钟、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约1小时、约1.5小时或约2小时。脉冲(例如，于变化的温度和/或的暴露)还可发生例如约30秒至约1分钟、约1分钟至约2分钟，约2分钟至约3分钟、约3分钟至约4分钟、约4分钟至约5分钟、约6分钟至约7分钟、约7分钟至约8分钟，约8分钟至约9分钟或约9分钟至约10分钟。脉冲(例如，于变化的温度和/或的暴露)还可发生约1至10分钟、约1至15分钟、约1至30分钟、约1分钟至1小时、约1分钟至约1.5小时或约1分钟至约2小时。脉冲(例如，于变化的温度和/或的暴露)还可发生例如约1至5分钟或约5至10分钟、约10至约15分钟、约15分钟至约30分钟、约30分钟至约1小时、约1小时至约1.5小时或约1.5小时至约2小时。在某些情况下，脉冲(例如，于变化的温度和/或pH的暴露)不超过2小时、1小时、30分钟、20分钟或15分钟。
在某些情况下，脉冲(例如，于变化的温度和/或pH的暴露)发生一次。在某些情况下，脉冲(例如，于变化变的温度和/或的暴露)重复两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次或十次。在某些情况下，脉冲(例如，于变化的温度和/或的暴露)发生一至五次。在某些情况下，脉冲(例如，于变化的温度和/或的暴露)发生二至二十次或五至十次。
连续ADC加工方法(例如，使用SPTFF和/或逆流渗滤)可在有或没有在线监测过程(下文经讨论)的情况下使用。
III.在线过程自动化技术(在线PAT)
本文提供用于形成和加工抗体药物缀合物(ADC)的在线过程自动化技术。此类技术提供直接测量，其可消除离线测定并且减少操作员对材料的处理。在线监测可用于监测ADC(蛋白质)浓度以及游离药物的去除。这可允许基于获自在线读数的数据而不是基于过程(例如，纯化过程)中所使用的渗滤体积(diavolume)的特定体积或数目来以最终ADC浓度为目标。PAT实施允许增加控制和可检测性(例如，在稳态操作期间的改变可用于在产物质量受影响之前检测出问题)，并且使用多个PAT模块(例如，FlowVPE、UV传感器、pH计、电导率计、压力传感器或流量计)可确保在个别单元操作上稳健的过程性能。
在线监测可用于例如监测例如原位反应和/或ADC缀合反应(例如，连续缀合反应或分批缀合反应)中来自任何泵的进料流的流率。在线监测可用于例如监测添加至原位反应和/或ADC缀合反应(例如，连续缀合反应或分批缀合反应)的组分的浓度。这一监测可确保对反应的化学计量的充分控制。在线监测可监测例如抗体或其抗原结合片段、药物、接头、连接至接头的药物、连接至接头的抗体或其抗原结合片段和/或缀合缓冲液的流率或浓度。在线监测可监测至反应缓冲液中的抗体或其抗原结合片段的流率或浓度。
在线监测还可用于例如确定例如通过停止添加缀合缓冲液、通过停止缀合缓冲液的循环和/或开始冲洗或去除缀合缓冲液来停止缀合反应的时间。在本文所提供的一些实施方案中，可使用未缀合药物或连接至接头的未缀合药物的的在线监测。未缀合药物或连接至接头的未缀合药物的测量可用于推断缀合反应中所实现的每抗体药物的平均数(DAR)。因此，当达到目标DAR时，可停止缀合反应。
在线监测还可用于监测ADC的浓缩和/或纯化。例如，可在示范性图4所示的ILC和/或TFF2 ILDF过程之前或之后或者在示范性图10所示的ILC或TFF3 ILDF过程之前或之后使用在线监测。浓缩和/或纯化可使用过滤(例如，超滤、渗滤)。过滤可为切向流过滤，包括单程切向流过滤(SPTFF)。过滤可为逆流渗滤。当用于监测过滤时，可使用在线监测来测量渗余物或渗透物中的分析物。因此例如，可使用渗余物中未缀合药物或连接至接头的未缀合药物的在线监测来评估ADC的纯化程度。未缀合药物或连接至接头的未缀合药物的水平可在缀合反应后不久在渗余物中为高的，但在纯化后在渗余物中为低的(参见例如图12)。在线监测渗余物或渗透物中的ADC可用于评估浓缩和/或纯化过程期间的ADC损失(参见例如图12)。
纯化还可使用色谱法(例如，流过式柱色谱法)。在色谱柱端部处的在线监测可例如测量ADC水平并且可用于确定何时柱过载或何时ADC穿透。
在线监测还可用于测量pH，其可用于例如确定缓冲液交换的完全性(参见例如图12)。
示范性在线监测技术包括使用例如傅里叶变换红外(FTIR)流通池、高效液相色谱法(HPLC)或超高效液相色谱法(UPLC)。
在线监测技术可使用例如FlowVPE或UV传感器。在一些实施方案中，FlowVPE用于执行在线监视。FlowVPE使用流通池以供连续监测。
切向流过滤(例如，单程切向流过滤(SPTFF))的功效可使用FlowVPE、UV传感器、pH计、电导率计、压力传感器、流量计等进行在线监测。逆流渗滤的功效也可使用FlowVPE、UV传感器、pH计、电导率计、压力传感器、流量计等进行在线监测。
在线监测过程可与连续缀合过程(上文所讨论)(例如，使用单程切向流过滤和/或逆流渗滤)或与分批缀合过程(其为所属领域中已知的)组合使用。
IV.抗体药物缀合物(ADC)
如本文所提供，抗体药物缀合物(ADC)可包含细胞结合剂、接头和药物。
细胞结合剂可为抗体或其抗原结合片段，例如单克隆抗体或其抗原结合片段。细胞结合剂(例如，抗体或其抗原结合片段)可为人源化细胞结合剂。细胞结合剂(例如，抗体或其抗原结合片段)可为人细胞结合剂。
细胞结合剂(例如，抗体或其抗原结合片段)可特异性结合至人CD37、CD33、FOLR1、CD123、CD19、cMET、ADAM9或HER2。
细胞结合剂(例如，抗体或其抗原结合片段)可包含表1中所提供的抗体的六个CDR。
表1：抗体互补决定区序列
名称 CDR序列
huMov19 VH CDR1 GYFMN(SEQ ID NO:1)
huMov19VH CDR2 RIHPYDGDTFYNQKFQG(SEQ ID NO:2)
huMov19VH CDR3 YDGSRAMDY(SEQ ID NO:3)
huMov19VL CDR1 KASQSVSFAGTSLMH(SEQ ID NO:4)
huMov19VL CDR2 RASNLEA(SEQ ID NO:5)
huMov19VL CDR3 QQSREYPYT(SEQ ID NO:6)
Z4681A VH CDR1 SYYIH(SEQ ID NO:7)
Z4681A VH CDR2 VIYPGNDDISYNQKFQG(SEQ ID NO:8)
Z4681A VH CDR3 EVRLRYFDV(SEQ ID NO:9)
Z4681A VL CDR1 KSSQSVFFSSSQKNYLA(SEQ ID NO:10)
Z4681A VL CDR2 WASTRES(SEQ ID NO:11)
Z4681A VL CDR3 HQYLSSRT(SEQ ID NO:12)
G4723A VH CDR1 SSIMH(SEQ ID NO:13)
G4723A VH CDR2 YIKPYNDGTKYNEKFKG(SEQ ID NO:14)
G4723A VH CDR3 EGGNDYYDTMDY(SEQ ID NO:15)
G4723A VL CDR1 RASQDINSYLS(SEQ ID NO:16)
G4723A VL CDR2 RVNRLVD(SEQ ID NO:17)
G4723A VL CDR3 LQYDAFPYT(SEQ ID NO:18)
huCMET-27VH CDR1 SYDMS(SEQ ID NO:19)
huCMET-27VH CDR2 TINSNGVSIYYPDSVKG(SEQ ID NO:20)
huCMET-27VH CDR3 EEITTEMDY(SEQ ID NO:21)
huCMET-27VL CDR1 RASESVDSYGNSFIH(SEQ ID NO:22)
huCMET-27VL CDR2 RASNLES(SEQ ID NO:23)
huCMET-27VL CDR3 QQSNEEPLT(SEQ ID NO:24)
huB4 VH CDR1 SNWMH(SEQ ID NO:25)
huB4 VH CDR2 EIDPSDSYTN(SEQ ID NO:26)
huB4 VH CDR3 GSNPYYYAMDY(SEQ ID NO:27)
huB4 VL CDR1 SASSGVNYMH(SEQ ID NO:28)
huB4 VL CDR2 DTSKLAS(SEQ ID NO:29)
huB4 VL CDR3 HQRGSYT(SEQ ID NO:30)
huADAM9 VH CDR1 SYWMH(SEQ ID NO:31)
huADAM9 VH CDR2 EIIPIFGHTNYNEKFKS(SEQ ID NO:32)
huADAM9 VH CDR3 GGYYYYFNSGTLDY(SEQ ID NO:33)
huADAM9 VL CDR1 KASQSVDYSGDSYMN(SEQ ID NO:34)
huADAM9 VL CDR2 AASDLES(SEQ ID NO:35)
huADAM9 VL CDR3 QQSHEDPFT(SEQ ID NO:36)
细胞结合剂(例如，抗体或其抗原结合片段)可包含表2中所提供的抗体的可变重链和/或可变轻链。在一些实施方案中，细胞结合剂(例如，抗体或其抗原结合片段)包含表2中所提供的抗体的可变重链和可变轻链的CDR(例如，Kabat定义的CDR、AbM定义的CDR或Chothia定义的CDR)。
表2：抗体可变重链和可变轻链序列
Figure BDA0002578586160000291
细胞结合剂(例如，抗体或其抗原结合片段)可包含表3中所提供的抗体的重链和/或轻链。
表3：抗体重链和轻链序列
Figure BDA0002578586160000301
Figure BDA0002578586160000311
在某些实施方案中，抗FOLR1抗体由根据布达佩斯条约的条款于2010年4月7日寄存于美国典型培养物保藏中心(ATCC)(其位于10801University Boulevard,Manassas,VA20110)并且具有ATCC寄存号PTA-10772和PTA-10773或10774的质粒编码。
细胞结合剂(例如，抗体或其抗原结合片段)可为CD37-3、huMov19、Z4681A、G4732A、huB4、huCMET-27、huADAM9或Herceptin(曲妥珠单抗)。
药物可为细胞毒性剂。细胞毒剂可为导致细胞死亡或诱导细胞死亡或以某一方式降低细胞活力的任何化合物，并且包括例如美登木素、美登木素类似物，苯二氮
Figure BDA0002578586160000312
(例如吲哚啉并-苯二氮
Figure BDA0002578586160000313
(IGN)或吡咯并苯二氮
Figure BDA0002578586160000314
(PBD)、类紫杉醇、CC-1065和CC-1065类似物、倍癌霉素(duocarmycin)和倍癌霉素类似物、烯二炔诸如卡奇霉素(calicheamicin)、尾海兔素和尾海兔素类似物包括澳瑞他汀(auristatin)、茅屋霉素(tomaymycin)衍生物、细霉素(leptomycin)衍生物、胺甲喋呤、顺铂、卡铂、道诺霉素、阿霉素、长春新碱、长春碱、美法仑、丝裂霉素C、氮芥苯丁酸和吗啉代阿霉素。在一个实施方案中，美登木素可为DM1。在另一实施方案中，美登木素可为DM4。在一个实施方案中，吲哚啉并-苯二氮
Figure BDA0002578586160000315
可为DGN462。在另一实施方案中，吲哚啉并-苯二氮
Figure BDA0002578586160000316
可为DGN549。在其他实施方案中，吡咯并苯二氮
Figure BDA0002578586160000317
可为talirine、tesirine、SJG136或SGD1882。
合适连接基为所属领域中熟知的并且包括例如二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团和酯酶不稳定基团。接头分子包括例如N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)(参见例如Carlsson等人,Biochem.J.,173:723-737(1978))、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯(SPDB)(参见例如美国专利第4,563,304号)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫基)2-磺基丁酸酯(磺基-SPDB)(参见美国公布第20090274713号)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫基)戊酸酯(SPP)(参见例如CAS登记号341498-08-6)、2-亚氨基硫杂环戊烷或乙酰基琥珀酸酐。接头可为SMCC、sSPDB或肽接头。
ADC可含有每抗体多个药物。每抗体药物的数目常指代药物抗体比(DAR)。在一个方面中，可连接至细胞结合剂的药物分子的数目可平均为约2至约8。因此，例如，本文所提供的方法可以约3至约4的DAR为目标。
在一些实施方案中，ADC为“IMGN853”。如本文所用，“IMGN853”是指含有huMov19抗体、磺基SPDB接头和DM4美登木素的ADC。HuMov19(M9346A)含有：重链，其包含与作为PTA-10772寄存于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的质粒所编码的重链的氨基酸序列相同的氨基酸序列；和(ii)轻链，其包含与作为PTA-10774寄存于ATCC的质粒所编码的轻链的氨基酸序列相同的氨基酸序列。IMGN853描述于WO2011/106528中，其以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，ADC为“IMGN779”。如本文所用，“IMGN779”是指含有Z4681A抗体、磺基SPDB接头和吲哚啉并-苯二氮
Figure BDA0002578586160000321
DGN462的ADC。
在一些实施方案中，ADC为“IMGN632”。如本文所用，“IMGN632”是指图11所示的ADC组合物。ADC组合物包含以磺化型式的包含每huCD123-6Gv4.7(“G4723A”)抗体平均1.5至2.1个DGN549-C细胞毒性剂的ADC(图11，上图)。ADC组合物还可包含未磺化ADC(图11所示的单亚胺结构，下图)。
结合至ADAM9的示范性ADC公开于PCT/US2017/067823(以WO2018119196公开)中，其以全文引用的方式并入本文中。结合至ADAM9的示范性ADC公开于2018年6月28日提交的美国公布第62/691,342号中，其以全文引用的方式并入本文中。结合至cMET的示范性ADC公开于PCT/US2018/012168(以WO2018129029公开)中，其以全文引用的方式并入本文中。结合至CD19的示范性ADC公开于WO2012156455中，其以全文引用的方式并入本文中。
V.实施例
实施例1：用于IMGN853的缀合的连续缀合过程
为了减少加工时间并且改进大规模制造抗体药物缀合物(ADC)的产率，开发连续缀合过程。在连续缀合中，加工步骤同时发生。使用连续缀合消除在纯化和缓冲液交换步骤期间缀合物的再循环以及在分批缀合期间使用的中间保持步骤。以此方式，所述过程连续运行4-5天，并且在离开TFF纯化步骤后直接调配缀合物。此外，使用在线过程分析技术(PAT)系统以允许缀合物的直接测量，因此消除离线测定和操作员对材料的处理。此外，因为加工时间减少，所以不必需要大型设备来产生大量缀合物：较小设备和较短加工时间足以产生大量产物。此外，对于给定量的产生的最终缀合物，当使用连续加工生成时，产物质量概况更一致。相比之下，本体缀合中对多批次的需求引入产物质量的批次间变异性增加的可能。
用于ADC“IMGN853”的缀合的连续缀合过程详述于图4中表示的流程图。IMGN853含有通过磺基-SPDB接头与DM4美登木素药物缀合的抗FOLR1抗体(“huMov19”)。IMGN853描述于WO 2011/106528中，其以全文引用的方式并入本文中。
实施例1A：流动化学研究
常规IMGN853缀合涉及于70％N,N-二甲基乙酰胺(DMA)中美登木素药物DM4与N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫基)-2-磺基丁酸酯(sSPDB)接头之间的原位反应。将适当体积的DM4和sSPDB储备溶液添加至原位反应容器中。将额外DMA(溶剂)添加至原位容器中至按体积计70％DMA。添加至原位反应容器中的最终反应物为反应缓冲液。在添加反应缓冲液之后，原位反应开始并且混合60-120分钟。然后将原位组分添加至含有M9346A(huMov19)抗体的缀合容器中，所述抗体已渗滤至反应缓冲液中。将所有组分混合，并且在温和混合隔夜的情况下进行缀合反应，以生成目标药物-抗体比(DAR)为3.4的所要缀合物。
在此研究中，执行IMGN853的连续缀合。连续缀合反应使用所有相同的化学计量IMGN853参数，有一个值得注意的例外。将缀合反应的反应缓冲液的pH从7.6增加至8.7。原位反应缓冲液的pH没有改变并且维持在7.6。制定pH的增加以增加缀合反应动力学。代替针对缀合反应以18小时为目标，较高pH缓冲液在约4小时内生成缀合物，以实现较快读出和较灵活的实验方案。
对于连续缀合实验，使用注射泵连续添加试剂。设置如图5所示。使用三个注射泵。第一注射泵控制溶解于DMA中的原位组分的添加。这些组分包括DM4(有效负载)、sSPDB(接头)和DMA(额外溶剂)。将这三种组分以化学计量比组合，然后抽取至2.5mL HamiltonGastight注射器中。第二注射泵计量原位反应缓冲液的添加。使用5mL塑料BD注射器。将1/16”PEEK配管用于连续缀合研究。将原位反应缓冲液和DMA组分进料管线进料至在线静态混合器中以确保两种试剂的充分混合。这两种进料流通过单件配管组合并从相同配管材料的静态混合器离开。原位缓冲液和DMA组分的流率分别为952.9nL/min和2.2233μL/min。基于两种入口流的流率和所使用的配管的截面积，以90分钟原位反应为目标需要18.6厘米的PEEK配管。将这一长度的发生原位反应的PEEK配管进料至第二在线静态混合器中。第二静态混合器的另一入口来自第三注射泵。第三注射器控制抗体和缀合反应缓冲液(pH 8.7)的添加。将抗体和缀合反应缓冲液组合并且抽取至30mL塑料BD注射器中。使用相同的PEEK配管以在24.615μL/min的流率下进料抗体和缀合反应缓冲液。与原位静态混合器类似，第二静态混合器确保缀合反应组分充分混合并组合成单个离开流。缀合反应物将静态混合器留在一段4.3米长的相同PEEK配管中，以实现4小时的目标缀合反应持续时间。
通过在任何流动开始之前填充所有三个注射器来执行研究。首先，同时启动原位反应缓冲液(注射器2)和DMA组分(注射器1)泵。约90分钟后，启动泵三(抗体和缀合反应缓冲液)。从前两个泵启动约5小时后，从所述段4.3米长的PEEK配管中洗脱出缀合物。通过直接从端部收集执行样品分析(即，从充分混合的缀合物汇集物中收集汇集的样品)。为了测量原位和缀合进料流(来自任何泵)的流率，可进一步使用流量计。流量计用作确保对反应的化学计量的充分控制的过程分析技术(PAT)机制。
第一IMGN853连续缀合研究的结果显示于表4中。
表4：第一IMGN853连续缀合研究的结果。
Figure BDA0002578586160000351
研究显示，连续缀合产物质量与并排执行的对照(分批)产物质量相当。产物质量需要一些时间来达到稳态，如通过在“早期”时间点的较低药物-抗体比(DAR)所说明。这在第二研究中为一致的，在第二研究中30分钟样品还具有略低DAR。在第二研究中直到3小时，产物质量实现在目标DAR下的稳态(如与并排分批对照相比)。除DAR外，就单体和游离药物水平而言，产物质量也相当。总之，这些结果指示，连续缀合过程表现良好并且就产物质量而言与并排分批对照相当。
第二研究的结果显示于表5中。
表5：第二IMGN853连续缀合研究的结果。
Figure BDA0002578586160000352
Figure BDA0002578586160000361
此研究中使用与上文研究相同的参数，但所述过程连续运行40小时以显示100mg设备设置可用于通过使过程运行较长时间来生成多10x的产物。结果显示，在洗脱缀合物的30分钟与3小时之间，缀合物达到稳态并且通过SEC和游离药物分析与并排分批对照相当。在3小时下的产物质量与在40小时下洗脱的缀合物几乎一致，指示只要将进料试剂供应至反应配管中，连续过程便一致地执行。
在制造设定中，各个别试剂的泵可用于使储备溶液分开。不是将DM4、sSPDB或DMA组合成单一进料流，而是可将各储备溶液分别进料至收集容器中或直接进料至原位反应中。其可适用于抗体和缀合反应缓冲液。抗体的储备溶液可使用指定泵进料，而单独的泵控制缀合反应缓冲液在与其他缀合反应组分的适当体积比下的添加。
其他PAT机制可用于在其进行时监测原位或缀合反应。傅里叶变换红外(FTIR)流通池可在线用于监测原位或缀合反应性能。此外，可沿着原位和缀合反应配管在中间位置处放置多个FTIR流通池或类似的PAT工具以在发生反应时监测反应。可以从反应开始一直到结束测量所要缀合物的形成。然后可使用PAT信号的任何显著变化来识别在原位或缀合反应(开始、中间或结束)中发生错误的位置。对于缀合物，替代PAT机制可为具有或不具有UV传感器的基于快速高效液相色谱法(HPLC)的仪器(超高效液相色谱法(UPLC))。基于HPLC的分析可用于测量DAR，而在线放置的UV传感器可监测缀合反应中的抗体浓度。
实施例1B：单程切向流过滤研究
在IMGN853原料药过程期间使用常规切向流过滤(TFF)两次。首先，在缀合反应之前，执行TFF以将经调配抗体缓冲液交换至缀合反应缓冲液中(TFF1)。在缀合反应后，使用TFF从粗反应混合器中去除残余的杂质并且将缀合物从缀合反应缓冲液中缓冲液交换至基础调配缓冲液中(TFF2)。开发连续过程以用单程TFF(SPTFF)方法代替这两个常规TFF步骤。连续SPTFF利用Pall Life Sciences的在线浓缩(ILC)和在线渗滤(ILDF)技术。
对于TFF1，在常规加工期间将抗体在30mg/mL下渗滤达8个渗滤体积。在60mg/mL下调配进入的抗体并且在常规TFF1加工期间在渗滤之前进行稀释。在连续加工期间，将在60mg/mL下经调配抗体进料至T型连接器中，其中另一泵添加缀合反应缓冲液以将抗体稀释至30mg/mL的目标浓度。在T型连接器后，将30mg/mL抗体的单一进料流进料至ILDF模块中。ILDF渗滤缓冲液泵控制缀合反应缓冲液至ILDF模块的添加，使得在单程中实现缓冲液交换。缀合反应缓冲液中离开ILDF的抗体为30mg/mL。
PAT控制可在各种位置实施以监测并控制此单元操作。可对经调配抗体进料流(60mg/mL)、经稀释抗体进料流(30mg/mL)和/或缀合反应缓冲液中的经缓冲液交换抗体放置FlowVPE或UV传感器。FlowVPE或UV传感器可用于测量不同进料流中抗体的浓度。此外，所有进料流的流量计均可用于监测并调节任何组分的流率，以确保在30mg/mL下发生ILDF中的缓冲液交换。此外，ILDF后的电导率或pH探针可用于确保抗体至缀合反应缓冲液中的缓冲液交换完成。
在缀合后，常规TFF2通常以三个步骤执行，所有步骤均于单一单元操作中发生。首先经由超滤至30mg/mL(从缀合反应后的15mg/mL)浓缩缀合后粗反应混合物。然后在称为TFF2的阶段I的步骤中，针对缀合反应缓冲液将缀合物渗滤达4个渗滤体积。在阶段I期间，从粗反应混合物中去除残余的杂质。就在阶段I之后，通过针对8个渗滤体积的基础调配缓冲液渗滤缀合物来执行阶段II。阶段II被严格设计为缓冲液交换步骤，但对残余的杂质的额外清除没有促进作用。
对于利用SPTFF的连续过程，评估三个单独的步骤。首先，使用ILC模块以供浓缩。ILC沿循缀合反应配管。在单程中，将在15mg/mL下进入ILC的缀合物浓缩至30mg/mL，其中将去除的体积作为废物。用于IMGN853并且在此情况下所述的浓缩系数为二(2)，但是可适当地使用其他浓缩系数以实现在渗滤之前浓缩缀合物的相同结果。
在ILC后，将30mg/mL缀合物进料流进料至第一ILDF(ILDF1)中，其意指模仿阶段I。进料以供ILDF1的渗滤缓冲液为缀合反应缓冲液，并且其是在适当体积下添加以实现在单程中所要数目的渗滤体积。对于IMGN853，阶段I是以四个常规渗滤体积的形式实现。概念验证研究通过调节渗滤缓冲液进料泵的流率评估残余的杂质的随渗滤体积数变化的去除。
在ILDF1后，缀合物维持在30mg/mL但具有显著较低浓度的存在杂质。来自ILDF1的离开流进料至ILDF2，其中渗滤缓冲液为基础调配缓冲液。缀合物以于缀合反应缓冲液(pH7.6至8.7)中30mg/mL进入ILDF并且以于pH5.0缓冲液中30mg/mL离开ILDF2。
使用Pall Life Sciences ILDF模块执行的初步概念验证研究使用T01模块，其具有0.11m2的膜面积。对于缀合物进料，在1-4mL/min之间的流率下评估模块。改变渗滤缓冲液进料速率，使得渗滤体积数改变。使用ILDF评估在1与13之间个渗滤体积的加工。对于所有研究，使用常规分批加工生成缀合物材料并且冷冻成等分试样。在冷冻之前并且再次在解冻后(在加工之前)对游离美登木素物质进行定量。将粗反应混合物进料至ILC中。使用流量计测量渗余物流的流率，以计算在模块上实现的浓缩系数。使用目标浓缩系数2执行IMGN853过程和所有研究。
进行以ILDF的第一研究以评估残余的杂质从IMGN853缀合反应的清除。使用目标反应条件执行本体缀合以生成供研究的材料。将缀合后粗反应混合物过滤，等分并且在使用前冷冻。解冻后，使用以浓缩系数2为目标的单程ILC模块浓缩粗反应混合物。粗反应混合物为15mg/mL，并且ILC后缀合物的目标渗余物浓度为30mg/mL。然后使用缀合反应缓冲液将ILC后缀合物稀释至10mg/mL以在低起始浓度下测试ILDF模块。在ILDF之前从30mg/mL稀释至10mg/mL有效地减少缀合物进料中游离药物杂质的负载。这在图6中显而易见，所述图显示在ILC之前和之后四种主要杂质物质的药物杂质水平。缀合后粗反应混合物具有高杂质水平。在ILC上浓缩然后稀释至10mg/mL之后，杂质的浓度减少至起始浓度的约1/3。
在4mL/min下将10mg/mL缀合物进料至T01 ILDF模块中，对于阶段I目标为加工7个渗滤体积。阶段I渗滤缓冲液为缀合反应缓冲液(15mM磷酸钾，2mM EDTA，pH 8.7)。从渗余物管线取出样品并且分析其蛋白质浓度以确定缀合物从系统洗脱的时间。在浓度达到稳态后，从渗余物管线收集样品并且通过RP-HPLC进行分析以定量游离药物杂质水平并计算在ILDF上的清除率。图6显示取自ILDF1步骤的三个样品的结果：早期、后期和汇集。在ILDF上实现稳态后不久取得早期样品。所有三个样品的杂质水平均远低于规格限度。就过程性能而言，在ILDF上游离药物水平的减少为显著的并且可接受的。
在针对缀合反应缓冲液首次通过ILDF以模拟TFF2的阶段I后，然后使所得的汇集缀合物再次行进通过模块以模仿阶段II。在阶段II之前，冲洗模块，然后准备进行针对基础调配缓冲液(10mM乙酸盐，9％蔗糖，pH 5.0)的渗滤。在4mL/min下进料缀合物，并且将渗滤缓冲液进料流率设定为以在ILDF上13个渗滤体积为目标。选择此数目以匹配常规TFF加工的8个渗滤体积。
与ILDF1类似，从渗余物管线收集样品并且进行分析以测量抗体的浓度。当检测蛋白质浓度时，收集产物，并且定期从渗余物管线取出样品。在系统达到稳态后，通过RP-HPLC分析从渗余物管线收集的样品以定量残余的杂质水平并计算在ILDF2上的清除率。在产物穿过ILDF并且收集后，过滤汇集材料，然后通过SEC和RP-HPLC进行分析。来自ILDF2的所有样品的结果示出于图6，ILDF2模仿常规TFF2加工期间的阶段II缓冲液交换。所有游离药物水平均<1％，远低于经纯化原料药(DS)的最终规格。这些结果说明，通过SPTFF连续纯化IMGN853缀合物是可行的并且能够生成如通过SEC和RP-HPLC所测量，产物质量可接受的经纯化缀合物。
下一研究检查ILDF在15mg/mL的进料浓度下去除残余的杂质的清除能力。此浓度是在第一研究显示在10mg/mL下充分的清除之后所选择。在此研究期间，缀合物未经ILC加工。将来自本体缀合的粗缀合物反应混合物解冻并直接进料至ILDF。使用T01 ILDF模块并且进料流率为4mL/min。将缀合反应缓冲液用于渗滤缓冲液，并且将进料流率设定为初始以1个渗滤体积为目标。当通过测量浓度来检测渗余物中的缀合物时，从渗余物管线收集样品并且通过RP-HPLC进行分析以定量游离药物水平。结果显示于图7中。缀合后粗反应混合物具有高起始水平，所述水平与先前缀合一致。在等效于加工1个渗滤体积的单程后，总游离药物水平从进料中约26％降低至渗余物中7％。
然后增加渗滤进料流率以目标为7个渗滤体积，其与常规TFF加工的目标4个渗滤体积相当。在系统达到稳态后，测量渗余物中的游离药物水平。如图4所示，在这些加工条件下的单程后，游离药物水平显著降低。最终总游离药物水平低于1％，其在最终产物质量的接受范围内。这些结果指示，ILDF在15mg/mL进料缀合物浓度下表现良好并且当加工达7个渗滤体积时将杂质去除至低于规格限度的水平。
为了比较，来自分批TFF2纯化过程的游离药物杂质清除率值显示于图8中。在常规TFF2分批加工(实心条)4个渗滤体积后，总游离药物杂质水平为3.4％。在SPTFF加工(条纹条)7个渗滤体积(其等效于4个常规渗滤体积)后，总游离药物水平为0.7％。这两项研究之间的一个重要差异在于纯化期间缀合物的浓度。对于连续加工研究，进料至ILDF模块的缀合物为15mg/mL。常规分批TFF加工是在30mg/mL下执行。
ILDF在15mg/mL下表现良好，无需考虑压力或产物质量，所以在随后研究中增加进料的缀合物浓度以最佳化ILDF的产率。目标进料缀合物浓度为30mg/mL。首先使粗反应混合物行进通过ILC，以浓缩系数2为目标。缀合物在15mg/mL下进入ILC并且浓缩至30mg/mL的目标。在进料至ILDF之前，收集在30mg/mL下的所得缀合物。ILDF的渗滤缓冲液为缀合反应缓冲液，并且将进料流率设定为以7个渗滤体积为目标。在T01 ILDF模块上，在30mg/mL下的缀合物的进料流率为4mL/min。在渗余物流中检测出蛋白质后，收集缀合物并且收集样品。使系统达到稳态，之后通过RP-HPLC分析样品以定量游离药物水平并计算在ILDF上的清除率。结果显示于图9中。将ILDF后游离药物水平与在ILC之前(15mg/mL粗反应混合物)和ILC后(30mg/mL)取得的样品进行比较。ILC后游离药物水平略有增加，其归因于对缀合物的略微过浓缩。ILC后缀合物经测量为31mg/mL，指示使用了浓缩系数2.1。所得游离药物水平略高，但为了准确评估ILDF，通过在进料ILDF之前将适当体积的缀合反应缓冲液添加至汇集材料来将缀合物稀释至30mg/mL。
从在4mL/min下的ILDF收集并且通过RP-HPLC分析的样品显示从ILDF前/ILC后样品的游离药物物质的清除。然而，渗余物中缀合物的浓度经测量为约20mg/mL。据断定，缀合物浓度的下降是由于小盒中产物于膜上聚集并累积。为了减轻任何堵塞并且减小系统中的压力，将进料流率减小至3mL/min。据此，渗滤缓冲液进料泵流率也降低，使得以7个渗滤体积为目标以供加工。在减小ILDF的入口流率后，从渗余物收集样品并且分析其浓度和游离药物水平。样品的浓度经确定为22.5mg/mL，并且游离药物水平与在4mL/min下测量的样品相当。总体而言，这指示，加工7个渗滤体积足以纯化缀合物，但观察到渗余物中最大23mg/mL缀合物浓度。
实施例2：用于IMGN632的缀合的连续缀合过程
用于ADC IMGN632的缀合的连续缀合过程详述于图10中表示的流程图。IMGN632含有连接至细胞毒性有效负载DGN549-C的抗CD123抗体(“G4732A”)。IMGN632显示于图11中。
实施例2A：流动化学研究
反应设置与图5所示的设置类似。第一注射器含有溶解于DMA中的DNA-烷基化IGN有效负载“DGN549C”。第二注射器含有在适当体积比下的亚硫酸氢盐储备溶液和50mM琥珀酸盐，pH 3.3。这两种进料流于静态在线混合器中混合以起始磺化反应。DGN549C以于混合流中1mM的最终浓度为目标。所得混合物为50mM琥珀酸盐pH 3.3和50％DMA，其中亚硫酸氢盐与DGN比为1.4摩尔过剩。两个进料流以单一流的形式离开静态在线混合器。基于体积流率确定配管长度，使得配管中反应物至停留时间为3小时。磺化反应的温度为25℃并且通过将配管沉没至温度控制水浴中来维持。第三个注射器(图5的Ab+缓冲液注射器)含有经再氧化的抗CD123抗体(“G4723”)，其已用5％琥珀酸调节至pH 6.0。将适当体积的DMA和50mM磷酸钾添加至经再氧化的抗体混合物。将均质混合物抽出于单个注射器中以在线与磺化反应组合。
磺化进料流进入第二静态混合器，在第二静态混合器中其与经pH调节经再氧化抗体混合。调节体积流率，使得离开第二静态混合器的最终缀合流实现2.0mg/mL抗体浓度、15％DMA和3.5DGN与抗体的摩尔比的所要反应条件。缀合配管线圈长度经选择，使得停留时间的目标为20小时的缀合反应持续时间。与磺化配管类似，将缀合配管沉没于设定于25℃的温度控制水浴中。
实施例2B：单程切向流过滤研究
将在pH 4.2下的经pH调节粗缀合物混合物在2mg/mL的浓度下进料至ILC中，其以浓缩系数4为目标，使得渗余物为约8mg/mL。将在8mg/mL下的所得缀合物材料进料至ILDFSPTFF模块。第一ILDF的渗滤缓冲液为具有10％(v/v)DMA的10mM琥珀酸盐、50μM亚硫酸氢盐pH 4.2。将ILDF的流率调节至目标7个渗滤体积，与常规分批加工期间所使用的4个渗滤体积匹配。
在第一ILDF后，将材料在相同浓度下进料至第二ILDF模块，在所述模块中渗滤缓冲液为10mM琥珀酸盐、50μM亚硫酸氢盐pH 4.2。设定渗滤缓冲液进料和产物进料的流率，使得目标渗滤体积数为15以实现与常规分批TFF加工期间所目标的10个渗滤体积类似的缓冲液交换。
实施例3：脉冲处理改进IMGN853的缀合
本发明人已发现，连续流动缀合允许参数(例如，温度或pH)的脉冲变化。脉冲在连续流动缀合过程中为可能的，其中当试剂行进通过具有小体积的线圈和配管时反应发生。例如，短的线圈或配管节段可被快速加热(例如，通过绝缘)或冷却以产生短的温度偏移或“脉冲”。(参见例如图12)。
发明人进一步发现，反应参数的脉冲变化为有利的，例如，较长的对变化的参数的暴露可损害所述过程或导致对产物质量的负面影响。例如，增加缀合反应的温度达一段延长的时间可导致聚集增加。相反，如本文所说明，仅在短时间脉冲中增加缀合反应的温度可增加反应速度而不显著增加聚集体形成。
IMGN853的缀合是在温度脉冲的情况下于小瓶中执行，其涉及将含有缀合反应组分的小瓶放置于20℃下达约30分钟，然后通过将小瓶放置于在较高温度下的水浴中达指定脉冲时间，然后使小瓶返回至20℃才脉冲。在20℃下回收小瓶，直至发生下一脉冲，并且将所述过程重复指定数目个脉冲。评估四种不同的脉冲条件：在40℃下4个脉冲，各7分钟；在42.5℃下4个脉冲，各7分钟；在50℃下5个脉冲，各1分钟；并且在60℃下5个脉冲，各1分钟。在稳定20℃温度的情况下执行对照反应。
反应完成程度(％)用于确定反应速率。在稳定的20℃温度下，IMGN853缀合反应需要约8小时以达到完成。(参见图14，左图)。所测试的所有脉冲条件均减少反应时间(即，在较少时间内达到100％完成)。(参见图14，左图)。在60℃下脉冲(5次)达每次脉冲1分钟显著增加高分子量(HMW；聚集体)物质的出现。(参见图14，右图)。相反，所测试的所有其他脉冲条件对HWM(聚集体)物质的出现具有极少影响。
此数据说明，通过连续流动缀合所实现的反应条件可在不损害产物质量的情况下改进反应动力学和生产力。
实施例4：用于缀合的抗体的单步制备
在实施例2中，IMGN632原料药过程涉及两个步骤以制备用于缀合的G4723A抗体：还原和氧化(图10，左上方框)。G4723A抗体的还原减少了天然半胱氨酸之间的链间二硫键并且去除C442工程改造半胱氨酸残基上的加帽基团。此步骤涉及将25摩尔当量TCEP添加至G4723A抗体。在还原反应之后，对经还原抗体混合物进行缓冲液交换以去除任何残余TCEP并且制备用于再氧化反应的抗体。再氧化步骤涉及将8摩尔当量DHAA添加至经还原G4723A抗体以再形成抗体的链间二硫键。所述反应留下呈游离硫醇的C442工程改造半胱氨酸残基，其可经由顺丁烯二酰亚胺官能团缀合至有效负载。
为了说明以连续形式执行这些反应的可行性，使用小规模流动反应器执行小规模研究。
实施例4A：还原反应
执行还原反应以说明经调配G4723A抗体可于流动反应器中还原并且产生与并排分批反应一致的产物质量的抗体。
执行基于G4723A抗体的150mg还原规模以说明于流动反应器中的连续还原。将51.1mg/mL的经调配G4723A抗体用作一种进料流。将抗体溶液抽取至注射器中。将在100mM下于50mM磷酸钾pH 7.5中制备的TCEP-HCl储备溶液与额外50mM磷酸钾pH 7.5组合作为连续反应的第二进料流。如此进行是因为当保持TCEP-HCl储备溶液和50mM磷酸钾pH 7.5缓冲液进料流分开时，它们的流率和体积比是较小的。需要额外50mM磷酸钾pH 7.5缓冲液来将经调配G4723A抗体稀释至5mg/mL以供还原反应。
使用Harvard Apparatus注射泵和1/16th PEEK配管设置反应。选择两种进料流的体积比，使得混合之后的最终反应化学计量处于目标反应条件，即25摩尔当量TCEP-HCl对抗体，5mg/mL抗体。将两种进料流的合并体积流率用于计算所需PEEK配管的长度，使得反应持续时间或于流动反应器中的停留时间为16小时。对于此实验，在周围温度下执行并排分批对照和连续反应。
在20mg G4723A抗体规模下设置并排分批对照还原反应。所有反应参数均被匹配。在16小时反应持续时间之后，对对照和连续反应进行取样并且标记以供分析。从流动反应器的出口对连续还原反应进行取样。对主体对照分批反应进行取样以供分析。
为了表征还原反应，用Alexa-MAL 488荧光团标记样品，所述Alexa-MAL488荧光团与抗体上的游离硫醇反应并且可通过UV分光计检测。使样品与Alexa-MAL 488反应并且通过SE-HPLC分析以计算Alexa-抗体比率。连续和并排对照反应的结果示出于表6。
表6：分批对连续还原反应
样品 Alexa-抗体比率
经Alexa标记，还原(对照) 7.50
经Alexa标记，还原(连续) 7.92
表6中所示的数据指示，G4723A抗体通过传统分批和连续加工被还原。对于还原之前的经调配G4723A抗体，未观察到Alexa标记。在还原反应期间链间二硫键被还原以形成游离硫醇之后，Alexa-MAL 488能够与游离硫醇反应并且缀合游离硫醇。抗体的工程改造半胱氨酸和天然半胱氨酸的完全还原可导致10个标记。
在两种样品中检测到大约7-8个Alexa-MAL 488标记，指示G4723A抗体被还原。这些结果与先前对较小规模进行的开发研究一致，在所述研究中，在还原反应之后识别出8个Alexa-MAL 488标记。与10个标记的理论目标的差异可能是由于在小规模上发生一些再氧化，其由反应容器中的空气引起，导致游离硫醇再形成二硫键并且减少用于与Alexa-MAL488缀合的抗体上可用游离硫醇的数目。
在较大规模上重复后续研究，并且目标为缩短大约3小时的还原时间。类似地，用Alexa-MAL 488标记从这些研究生成的抗体，并且通过SE-HPLC进行表征以比较反应效率。后续研究的产物质量数据示出于表7中，在后续研究中，通过增加两种进料流的体积流率目标使还原反应时间为3小时。
表7：连续还原反应的产物质量评估
样品 Alexa:Ab比率 HMW(％，SEC) 单体(％，通过SEC)
对照_还原后 8.50 0.57 99.17
连续_还原后 8.14 0.11 99.58
除比较分批对照和连续反应的还原反应程度的Alexa:Ab比率之外，测量两种反应产物的单体和HMW值。表7中的数据显示，在以较高体积流率的较大规模下，连续还原反应与分批对照相当。此外，通过连续反应所产生的抗体的单体略有增加。
这些结果说明，还原反应可使用流动化学以连续形式成功执行。
实施例4B：再氧化反应
执行再氧化反应以说明经还原G4723A抗体可以连续形式再氧化。
归因于反应规模和流动反应器设备，将用于供应再氧化研究的经还原抗体进行NAP纯化。在IMGN632制造期间，将经还原抗体进行TFF纯化以去除还原溶液的任何残余TCEP-HCl。在去除TCEP-HCl之后，将DHAA添加至反应池中以再形成抗体的链间二硫键，同时使两个经工程改造C442半胱氨酸残基游离以供缀合。
对于再氧化研究，首先使用分批反应还原G4723A抗体，因为需要为再氧化反应条件设置流动反应器设备。在37℃下执行还原反应达1小时以相对于在5mg/mL的抗体浓度下的抗体使用相同25摩尔当量TCEP-HCl来完全还原抗体。在还原反应之后，将反应样品进行Alexa标记以确认抗体的还原。
然后将经还原抗体NAP纯化以在添加DHAA之前去除溶液的残余TCEP-HCl。测量经NAP纯化材料的浓度以确保再氧化反应设置的目标为适当的化学计量比。将经NAP纯化经还原抗体分裂，使得可将并排分批对照反应设置为以连续再氧化样品的对照。
对于连续再氧化反应，使用三种进料流。第一，将经还原抗体NAP纯化。第二，按需要将DMA中的100mM DHAA储备溶液与额外DMA组合，以对于反应而言目标为最终5％(v/v)目标。第三，以50mM磷酸钾pH 7.5缓冲液将经NAP纯化经还原抗体稀释至对于反应而言目标2.5mg/mL抗体浓度。基于经NAP纯化经还原抗体浓度确定这三种进料流的体积比。调整所述比率，使得经合并进料流在混合之后得到最终目标再氧化反应条件。还将体积流率用于计算将反应持续时间6小时为目标所需的1/16th PEEK配管的量。并排再氧化反应和连续再氧化反应均在周围温度下设置。
设置50mg再氧化反应以供连续和对照反应。基于这三种进料流的体积流率，目标为6小时需要总计19.9英尺1/16th PEEK配管。在开始反应之后的6.5小时开始，从流动反应器的出口间歇地对连续再氧化反应进行取样。基于流动反应器内的潜在背压，给出额外时间以确保反应达到稳态。所有取自流动反应器的出口或者分批再氧化反应的主体的样品均用Alexa-MAL 488荧光团标记并且通过SE-HPLC表征。随时间推移对再氧化反应反应进行取样以确保实现稳态。此外，在研究结束时还标记含于注射器内并且呈连续再氧化反应的进料流的一进料的经还原抗体。对此样品进行测试以确保经还原抗体不发生再氧化同时在研究持续时间内处于注射器中。将此样品与还原之后的样品比较，以理解可能由周围条件引起的经还原抗体的任何变化。此连续再氧化研究的结果示出于表8中。
表8：连续再氧化反应产物质量
样品 Alexa:Ab比率
经NAP纯化，还原后T0 8.15
经Alexa标记，连续再氧化(T＝7h) 2.37
经Alexa标记，连续再氧化(T＝8h) 2.36
经连续再氧化(T＝9h) 2.35
经对照再氧化 2.22
注射器的经还原抗体(末端) 7.36
这些数据指示，可使用连续加工成功执行再氧化反应。流动反应器中执行的再氧化反应表现出成功的再氧化，其具有大约2.4个Alexa-MAL 488标记。分批对照反应的数据与大约2.2个Alexa-MAL 488标记相当。再氧化之前的经还原抗体具有大约8个标记，其说明添加DHAA导致二硫键的再形成。与Alexa-MAL 488缀合的其余标记为可用于缀合的经工程改造半胱氨酸残基。此外，表8中所示的数据指示，经还原抗体在周围条件下经历极少量的再氧化。经还原抗体开始为8.15个标签并且在再氧化研究的持续时间之后仅减少至7.36。此数据指示，再氧化是通过与DHAA的反应驱动，而不是通过反应容器或缓冲液中存在的空气驱动。
总体而言，这些结果显示再氧化反应可于流动反应器中使用连续加工来成功实现。
***
应理解，具体实施方式部分但不是发明内容和摘要部分旨在用于解释权利要求。发明内容和摘要部分可阐述如发明人所预期的本发明的一个或多个但不是所有示范性实施方案，并且因此，不旨在以任何方式限制本发明和随附权利要求。
已借助于说明特定功能的实行方案和其关系的功能性建构基元在上文描述本发明。为便于描述，本文中将所述功能性建构基元的边界已任意地定义。可限定替代性边界，只要指定功能和其关系得到适当执行即可。
具体实施方案的前文描述将充分地公开本发明的一般性质，以使得其他人通过应用所属领域中的知识，在无不当实验并且不背离本发明的一般范围的情况下，可轻易地针对各种应用对这些具体实施方案进行修改和/或改变。因此，基于本文呈现的教义和指导，这些改变和修改旨在处于所公开实施方案的等效物的含义和范围内。应了解，本文的措辞或术语是出于描述而非限制的目的，以使得本说明书的术语或措辞应由所属领域技术人员根据教义和指导进行解释。
本发明的广度和范围不应受任何上述示范性实施方案限制，而应仅根据以下权利要求和其等效物定义。
本申请中的权利要求与母案或其他相关申请的权利要求不同。因此，申请人撤销在本申请或与本申请有关的任何前任申请中作出的任何权利要求范围的任何放弃声明。因此，建议审查员可能需要再审视任何此类先前放弃声明和为避免这样而引用的参考文献。此外，还提醒审查员，不应将本申请中做出的任何放弃声明读入母案或针对母案进行阅读。
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Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro
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<220>
<223> G4723A VL
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85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 44
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huCMET-27 VH
<400> 44
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asn Ser Asn Gly Val Ser Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Glu Ile Thr Thr Glu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 45
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huCMET-27 VL
<400> 45
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Glu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys Arg
100 105 110
<210> 46
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huB4 VH
<400> 46
Gln Val Gln Leu Val Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Val Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Asn Pro Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 47
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huB4 VL
<400> 47
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Gly Val Asn Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Arg Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Gly Ser Tyr Thr Phe Gly
85 90 95
Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 48
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huADAM9 VH
<400> 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Glu Ile Ile Pro Ile Phe Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Gly Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Phe Asn Ser Gly Thr Leu Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 49
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huADAM9 VL
<400> 49
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Ser
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asp Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His
85 90 95
Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 50
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huMov19重链
<400> 50
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala His
65 70 75 80
Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 51
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huMov19轻链1.00
<400> 51
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala
20 25 30
Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Lys Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile Ser
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg
85 90 95
Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 52
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huMov19轻链1.60
<400> 52
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala
20 25 30
Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Lys Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg
85 90 95
Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 53
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Z4681A重链
<400> 53
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Ile Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Ile Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Val Arg Leu Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 54
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Z4681A轻链
<400> 54
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Phe Phe Ser
20 25 30
Ser Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr Cys His Gln
85 90 95
Tyr Leu Ser Ser Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 55
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> G4723A重链
<400> 55
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Lys Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ser Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Gly Asn Asp Tyr Tyr Asp Thr Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Cys Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 56
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> G4723A轻链
<400> 56
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Val Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Asn Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Ala Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210

Claims (140)

1.一种用于产生抗体药物缀合物(ADC)组合物的连续方法，其包括：(i)将抗体或其抗原结合片段与药物缀合以形成ADC，(ii)去除未缀合药物，和(iii)将所述ADC交换至稳定缓冲液中，其中(i)至(iii)是连续执行，并且其中单程切向流过滤(SPTFF)和/或逆流渗滤用于去除所述未缀合药物和/或将所述ADC交换至所述稳定缓冲液中。
2.如权利要求1所述的方法，其中SPTFF和/或逆流渗滤用于去除所述未缀合药物以将所述ADC交换至所述稳定缓冲液中。
3.如权利要求1所述的方法，其中流过式柱色谱法用于去除所述未缀合药物并且SPTFF和/或逆流渗滤用于将所述ADC交换至所述稳定缓冲液中。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其还包括预加工所述抗体或其抗原结合片段。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段的所述预加工是以(i)至(iii)连续执行。
6.如权利要求4或5所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段的所述预加工使用SPTFF和/或逆流渗滤执行，任选地其中所述预加工中仅使用一个SPTFF或逆流渗滤步骤。
7.如权利要求4所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段的所述预加工是在(i)至(iii)之前大量执行。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述方法还包括预加工所述药物以供缀合。
9.一种用于产生抗体药物缀合物(ADC)组合物的连续方法，其包括：(i)预加工抗体或其抗原结合片段，(ii)将所述抗体或其抗原结合片段与药物缀合以形成ADC，(iii)去除未缀合药物，和(iv)将所述ADC交换至稳定缓冲液中，其中(i)至(iv)是连续执行，并且其中单程切向流过滤(SPTFF)和/或逆流渗滤用于去除所述未缀合药物和/或将所述ADC交换至所述稳定缓冲液中。
10.如权利要求4至9中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段的所述预加工包括将所述抗体或其抗原结合片段交换至缓冲液中以供缀合。
11.如权利要求4至10中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段的所述预加工包括还原所述抗体或其抗原结合片段和/或氧化所述抗体或其抗原结合片段，任选地其中(a)所述还原和/或所述氧化是在不使用SPTFF或逆流渗滤的情况下实现或(b)所述还原和/或所述氧化是仅使用一个SPTFF或逆流渗滤步骤实现。
12.一种用于在连续缀合过程中产生抗体药物缀合物(ADC)的方法，其包括在缀合反应进行的同时和在已形成至少一种缀合反应产物(ADC)之后将一种或多种缀合反应试剂添加至所述缀合反应。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述缀合反应试剂包含抗体或其抗原结合片段。
14.如权利要求12或13所述的方法，其中所述缀合反应试剂包含连接至接头的药物。
15.如权利要求12或13所述的方法，其中所述缀合反应试剂包含接头。
16.如权利要求12所述的方法，其中所述缀合反应试剂包含连接至接头的抗体或其抗原结合片段。
17.如权利要求12、13、15或16所述的方法，其中所述缀合反应试剂包含药物。
18.如权利要求12至17中任一项所述的方法，其中所述缀合反应发生在流动反应器中。
19.如权利要求12至18中任一项所述的方法，其还包括预加工抗体或其抗原结合片段。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段的所述预加工是以所述缀合反应连续执行。
21.如权利要求19或20所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段的所述预加工使用SPTFF和/或逆流渗滤执行，任选地其中所述预加工中仅使用一个SPTFF或逆流渗滤步骤。
22.如权利要求19所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段的所述预加工是在所述缀合反应之前大量执行。
23.如权利要求19至22中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段的所述预加工包括将所述抗体或其抗原结合片段交换至缓冲液中以供缀合。
24.如权利要求19至23中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段的所述预加工包括还原所述抗体或其抗原结合片段和/或氧化所述抗体或其抗原结合片段。
25.如权利要求5至10中任一项所述的方法，其中所述ADC使用单程切向流过滤和/或逆流渗滤来浓缩。
26.如权利要求5至11中任一项所述的方法，其中所述ADC使用单程切向流过滤和/或逆流渗滤来纯化。
27.如权利要求5至12中任一项所述的方法，其中所述ADC使用单程切向流过滤和/或逆流渗滤来转移至调配缓冲液。
28.如权利要求12至27中任一项所述的方法，其中所述ADC使用流过式色谱法来浓缩、纯化和/或转移至调配缓冲液。
29.一种用于浓缩抗体药物缀合物(ADC)的方法，其包括使用单程切向流过滤和/或逆流渗滤。
30.一种用于纯化抗体药物缀合物(ADC)的方法，其包括使用单程切向流过滤和/或逆流渗滤。
31.一种用于将抗体药物缀合物(ADC)转移至调配缓冲液中的方法，其包括使用单程切向流过滤和/或逆流渗滤。
32.如权利要求29至31中任一项所述的方法，其中所述ADC在分批缀合过程中产生。
33.如权利要求29至31中任一项所述的方法，其中所述ADC在连续缀合过程中产生。
34.如权利要求25、29、32和33中任一项所述的方法，其中所述单程切向流过滤使用超滤膜。
35.如权利要求26、27、30和31至33中任一项所述的方法，其中所述单程切向流过滤使用渗滤膜。
36.如权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述方法改进所述ADC产生的一致性。
37.如权利要求1至36中任一项所述的方法，其中所述方法减少ADC产生的时间。
38.如权利要求1至11、21、23至27和29至37中任一项所述的方法，其中所述单程切向流过滤和/或所述逆流渗滤改进所述ADC产生的一致性。
39.如权利要求1至11、21、23至27和29至38中任一项所述的方法，其中所述单程切向流过滤和/或所述逆流渗滤减少ADC浓缩、纯化或转移的时间。
40.如权利要求1至11、21、23至27和29至39中任一项所述的方法，其中所述单程切向流过滤和/或所述逆流渗滤减少所使用的缓冲液的量。
41.如权利要求1至40中任一项所述的方法，其中所述方法还包括分析物的在线监测。
42.一种用于产生抗体药物缀合物(ADC)的方法，其中在线监测用于测量组分至ADC缀合反应的添加。
43.如权利要求41或42所述的方法，其中所述在线监测测量添加至所述ADC缀合反应的组分的浓度。
44.如权利要求41至43中任一项所述的方法，其中所述在线监测测量添加至所述ADC缀合反应的组分的流率。
45.如权利要求42至44中任一项所述的方法，其中所述组分是抗体或其抗原结合片段、药物、接头、连接至接头的药物、连接至接头的抗体或其抗原结合片段，和/或缀合缓冲液。
46.如权利要求42至44中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在线监测以测量组分至原位反应的添加。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述组分是药物、接头和/或原位反应缓冲液。
48.一种用于产生抗体药物缀合物(ADC)的方法，其中分析物的在线监测用于确定以下的时间：(i)停止向ADC缀合反应添加缀合缓冲液；(ii)停止缀合缓冲液于ADC缀合反应中的再循环；和/或(iii)开始冲洗来自ADC缀合反应的缀合缓冲液。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述分析物是未缀合药物或连接至接头的未缀合药物。
50.一种用于在ADC缀合过程之后纯化抗体药物缀合物(ADC)的方法，其中所述方法包括分析物的在线监测。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述纯化包括过滤。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述过滤是超滤或渗滤，任选地其中所述渗滤是逆流渗滤。
53.如权利要求51所述的方法，其中所述过滤是切向流过滤。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述切向流过滤是单程切向流过滤。
55.如权利要求42至54中任一项所述的方法，其中所述分析物是在渗余物中。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述分析物是未缀合药物或连接至接头的未缀合药物的浓度。
57.如权利要求55或56所述的方法，其中所述分析物是ADC或抗体或其抗原结合片段的浓度。
58.如权利要求55至57中任一项所述的方法，其中所述分析物是缀合反应缓冲液或过滤缓冲液的组分的浓度。
59.如权利要求55至57中任一项所述的方法，其中所述分析物是pH。
60.如权利要求50至59中任一项所述的方法，其中所述分析物是在渗透物中。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述分析物是ADC或抗体或其抗原结合片段的浓度。
62.如权利要求60或61所述的方法，其中所述分析物是未缀合药物或连接至接头的未缀合药物的浓度。
63.如权利要求50至62中任一项所述的方法，其中所述纯化包括色谱法，并且所述分析物是在色谱柱的端部处测量。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述分析物是ADC或抗体或其抗原结合片段。
65.如权利要求63或65所述的方法，其中所述分析物是未缀合药物、连接至接头的未缀合药物、缀合反应缓冲液的组分或色谱缓冲液的组分。
66.如权利要求42至65中任一项所述的方法，其中所述缀合反应是分批缀合反应。
67.如权利要求42至65中任一项所述的方法，其中所述缀合反应是连续缀合反应。
68.如权利要求42至67中任一项所述的方法，其中所述在线监测使用可变光程技术、流通池装置、UV传感器、拉曼光谱法或傅里叶变换红外光谱法(FITR)执行。
69.如权利要求42至67中任一项所述的方法，其中所述分析物的所述在线监测使用FlowVPE执行。
70.如权利要求42至69中任一项所述的方法，其中所述在线监测改进ADC产率。
71.如权利要求42至70中任一项所述的方法，其中所述在线监测改进ADC回收率。
72.如权利要求42至71中任一项所述的方法，其中所述在线监测减少ADC产生的时间。
73.如权利要求42至72中任一项所述的方法，其中所述在线监测减少所使用的缓冲液的量。
74.一种用于产生抗体药物缀合物(ADC)的方法，其中分析物的在线监测用于确定停止向ADC缀合反应添加缀合反应组分的时间。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述组分是抗体或其抗原结合片段、药物、接头、连接至接头的药物，和/或缀合反应缓冲液。
76.如权利要求1至75中任一项所述的方法，其中所述ADC包含抗体。
77.如权利要求1至75中任一项所述的方法，其中所述ADC包含抗体的抗原结合片段。
78.如权利要求1至77中任一项所述的方法，其中所述ADC包含特异性结合至CD37、CD33、FOLR1、CD123、CD19、cMET、ADAM9或HER2的抗体或抗原结合片段。
79.如权利要求78所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含huMov19、Z4681A或G4732A的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
80.如权利要求79所述的方法，其中所述CDR为Kabat定义的CDR、Chothia定义的CDR或AbM定义的CDR。
81.如权利要求78所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含有包含以下序列的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列：分别SEQ ID NO:1-6、分别SEQ ID NO:7-12、分别SEQ ID NO:13-18、分别SEQ ID NO:19-24、分别SEQ ID NO:25-30或分别SEQ ID NO:31-36。
82.如权利要求78所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含有包含以下序列的VH和VL序列：分别SEQ ID NO:37和38、分别SEQ ID NO:37和39、分别SEQ ID NO:40和41、分别SEQ ID NO:42和43、分别SEQ ID NO:44和45、分别SEQ ID NO:46和47或分别SEQ IDNO:48和49。
83.如权利要求78所述的方法，其中所述抗体包含有包含以下序列的重链和轻链序列：分别SEQ ID NO:50和51、分别SEQ ID NO:50和52、分别SEQ ID NO:53和54或分别SEQ IDNO:55和56。
84.如权利要求1至83中任一项所述的方法，其中所述ADC包含选自由以下组成的组的接头：SMCC、sSPDB和肽接头。
85.如权利要求1至84中任一项所述的方法，其中所述ADC包含美登木素或吲哚啉并-苯二氮
Figure FDA0002578586150000091
86.如权利要求85所述的方法，其中所述美登木素是DM1或DM4。
87.如权利要求85所述的方法，其中所述吲哚啉并-苯二氮
Figure FDA0002578586150000092
是DGN462或DGN549。
88.如权利要求1至87中任一项所述的方法，其中所述ADC是IMGN529、IMGN779、IMGN853、IMGN632或Kadcyla。
89.一种用于产生IMGN853的方法，其包括：(i)在连续缀合过程中混合huMov19抗体和连接至磺基-SPDB的DM4以形成IMGN853，任选地其中在线监测用于测量添加至缀合反应的huMov19抗体的浓度；(ii)任选地使用单程切向流过滤和/或逆流渗滤浓缩IMGN853，任选地其中在线监测用于测量渗余物中未缀合药物的浓度；(iii)使用单程切向流过滤和/或逆流渗滤纯化IMGN853，任选地其中在线监测用于测量渗余物中未缀合药物的浓度；和(iv)使用单程切向流过滤和/或逆流渗滤将所述IMGN853交换至调配缓冲液中，任选地其中在线监测用于测量渗余物中杂质的浓度。
90.一种用于产生IMGN779的方法，其包括：(i)在连续缀合过程中混合Z4681A抗体和连接至磺基-SPDB的DGN462以形成IMGN779，任选地其中在线监测用于测量添加至缀合反应的Z4681A抗体的浓度；(ii)任选地使用单程切向流过滤和/或逆流渗滤浓缩IMGN779，任选地其中在线监测用于测量渗余物中未缀合药物的浓度；(iii)使用单程切向流过滤和/或逆流渗滤纯化IMGN779，任选地其中在线监测用于测量渗余物中未缀合药物的浓度；和(iv)使用单程切向流过滤和/或逆流渗滤将所述IMGN779交换至调配缓冲液中，任选地其中在线监测用于测量渗余物中杂质的浓度。
91.一种用于产生IMGN632的方法，其包括：(i)在连续缀合过程中混合G4732A抗体和磺化的DNG549C以形成IMGN632；(ii)任选地使用单程切向流过滤和/或逆流渗滤浓缩IMGN632，任选地其中在线监测用于测量渗余物中未缀合药物的浓度；(iii)使用单程切向流过滤和/或逆流渗滤纯化IMGN632，任选地其中在线监测用于测量渗余物中未缀合药物的浓度；和(iv)使用单程切向流过滤和/或逆流渗滤将所述IMGN632交换至调配缓冲液中，任选地其中在线监测用于测量渗余物中杂质的浓度，任选地其中所述G4732A抗体在所述缀合过程之前于仅一个SPTFF或逆流渗滤步骤中被还原和被氧化。
92.如权利要求1至28或34至91中任一项所述的方法，其中所述方法包括将缀合过程的第一温度增加至少5℃至高温，其中所述高温维持不多于20分钟。
93.一种产生ADC的方法，其包括将缀合过程的第一温度增加至少5℃至高温，其中所述高温维持不多于20分钟。
94.如权利要求92或93所述的方法，其中所述高温不多于55℃。
95.如权利要求94所述的方法，其中所述第一温度增加至少10℃。
96.如权利要求94所述的方法，其中所述第一温度增加至少15℃。
97.如权利要求94所述的方法，其中所述第一温度增加至少20℃。
98.如权利要求94所述的方法，其中所述第一温度增加至少30℃。
99.如权利要求92至98中任一项所述的方法，其中所述高温为35℃至55℃。
100.如权利要求99所述的方法，其中所述高温为40℃至50℃。
101.如权利要求92至100中任一项所述的方法，其中将所述第一温度增加至所述高温不需要长于2分钟。
102.如权利要求101所述的方法，其中将所述第一温度增加至所述高温不需要长于1分钟。
103.如权利要求92至100中任一项所述的方法，其还包括将所述高温降低至任选地所述第一温度。
104.如权利要求103所述的方法，其中将所述高温降低至任选地所述第一温度不需要长于2分钟。
105.如权利要求104所述的方法，其中将所述高温降低至任选地所述第一温度不需要长于1分钟。
106.如权利要求103至105中任一项所述的方法，其中将所述第一温度增加至所述高温然后降低所述高温的步骤重复至少两次或至少三次。
107.如权利要求103至105中任一项所述的方法，其中将所述第一温度增加至所述高温然后降低所述高温的步骤重复2-20次或5-10次。
108.如权利要求1至28或34至91中任一项所述的方法，其中所述方法包括将缀合过程的第一温度降低至少5℃至低温，其中所述低温维持不多于20分钟。
109.一种产生ADC的方法，其包括将缀合过程的第一温度降低至少5℃至低温，其中所述低温维持不多于20分钟。
110.如权利要求108或109所述的方法，其中所述第一温度降低不多于30℃。
111.如权利要求108至110中任一项所述的方法，其中所述温度降低至少10℃。
112.如权利要求108至110中任一项所述的方法，其中所述温度降低至少15℃。
113.如权利要求108至110中任一项所述的方法，其中所述温度降低至少20℃。
114.如权利要求108至113中任一项所述的方法，其中将所述第一温度降低至所述低温不需要长于2分钟。
115.如权利要求114所述的方法，其中将所述第一温度降低至所述低温不需要长于1分钟。
116.如权利要求108至115中任一项所述的方法，其还包括将所述低温增加至任选地所述第一温度。
117.如权利要求115所述的方法，其中将所述低温增加至任选地所述第一温度不需要长于2分钟。
118.如权利要求116所述的方法，其中将所述低温增加至任选地所述第一温度不需要长于1分钟。
119.如权利要求116至118中任一项所述的方法，其中将所述第一温度降低至所述低温然后增加所述低温的步骤重复至少两次或至少三次。
120.如权利要求116至118中任一项所述的方法，其中将所述第一温度降低至所述低温然后增加所述低温的步骤重复2-20次或5-10次。
121.如权利要求92至120中任一项所述的方法，其中所述高温或低温维持不多于15分钟。
122.如权利要求92至121中任一项所述的方法，其中所述高温或低温维持30秒至15分钟。
123.如权利要求122所述的方法，其中所述高温或低温维持5至10分钟或10至15分钟。
124.如权利要求122所述的方法，其中所述高温或低温维持1至5分钟。
125.如权利要求1至28或34至124中任一项所述的方法，其中所述方法包括改变缀合过程的第一pH至少0.5至变化的pH，其中所述变化的pH维持不多于20分钟。
126.一种产生ADC的方法，其包括将缀合过程的第一pH改变至少0.5至变化的pH，其中所述变化的pH维持不多于20分钟。
127.如权利要求125或126所述的方法，其中所述第一pH增加至少1，任选地其中所述变化的pH不超过9。
128.如权利要求127所述的方法，其中所述第一pH增加至少2。
129.如权利要求127所述的方法，其中所述第一pH增加至少3。
130.如权利要求125或126所述的方法，其中所述第一pH降低至少1，任选地其中所述变化的pH不低于4。
131.如权利要求130所述的方法，其中所述第一pH降低至少2。
132.如权利要求131所述的方法，其中所述第一pH降低至少3。
133.如权利要求125至132中任一项所述的方法，其还包括将所述变化的pH改变至任选地所述第一pH。
134.如权利要求133所述的方法，其中将所述第一pH改变至所述变化的pH然后改变所述变化的pH的步骤重复至少两次或至少三次。
135.如权利要求133所述的方法，其中将所述第一pH改变至所述变化的pH然后改变所述变化的pH的步骤重复2-20次或5-10次。
136.如权利要求125至135中任一项所述的方法，其中所述变化的pH维持不多于15分钟。
137.如权利要求125至136中任一项所述的方法，其中所述变化的pH维持30秒至15分钟。
138.如权利要求137所述的方法，其中所述变化的pH维持5至10分钟或10至15分钟。
139.如权利要求137所述的方法，其中所述变化的pH维持1至5分钟。
140.一种ADC，其根据权利要求1至139中任一项所述的方法产生。
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