JP6873184B2 - 抱合方法 - Google Patents

Description

本出願は、その全体の開示が参照によって明示的に本明細書に組み入れられる、２００９年６月３日に出願された米国特許仮出願第６１／１８３，７７４号の優先権を主張する。
本発明は、２官能性リンカーを介してエフェクター基（たとえば、細胞傷害剤）又はリポーター基（たとえば、放射性標識）を抗体又はその断片のような細胞結合剤に抱合させる新規の方法に関する。さらに具体的には、本発明は、分子内又は分子間の反応のために形成される望ましくない加水分解された種又は望ましくない架橋された種の形成を結果として生じる工程を製造過程が排除するように、２官能性リンカーを介してエフェクター基（たとえば、マイタンシノイド）又はリポーター基（たとえば、放射性標識）を細胞結合剤（抗体又はその断片）に抱合させる新規の方法に関する。

たとえば、抗体のような細胞結合剤の、たとえば、小型の細胞傷害剤又は細胞傷害性タンパク質のようなエフェクター基との抱合体は、抗癌治療剤の開発にとって計り知れない関心事である（Richart, A. D., and Tolcher, A. W., 2007, Nature Clinical Practice, 4, 245-25）。これらの抱合体は、腫瘍細胞の細胞表面に発現される抗原に向けた選択
された抗体の高い特異性のゆえに腫瘍特異的である。腫瘍細胞への特異的な結合の際、抗体／細胞傷害剤の抱合体は標的の癌細胞に内部移行され、分解され、それによって、たとえば、微小管動態又はＤＮＡ複製のような本質的な細胞機能を阻害する活性のある細胞傷害剤を放出し、その結果、癌細胞の殺傷を生じる。血漿における抱合体の所望の安定性を維持する一方で、内部移行の際、細胞内への剤の送達を高め、抱合体の処理を高めることを目的に、抗体を細胞傷害剤に連結するのに種々のリンカーが採用されている。これらのリンカーには、細胞内チオールによる還元動態に影響を及ぼすように様々な程度の立体障害とともに設計されるジスルフィドリンカー、バリン／シトルリン結合のような切断可能なペプチドリンカー、及びチオエーテル結合のような切断不能なリンカーが挙げられる（Widdison, W., et al., J. Med. Chem., 2006, 49, 4392-4408; Erickson, H., et al, Cancer Res., 2006, 66, 4426-4433）。

抗体のような細胞結合剤と標識又はリポーター基との抱合体は、癌患者における腫瘍画像化応用、種々の疾患の診断用の免疫アッセイの応用、放射性核種−リガンドの抱合体を用いた癌治療法、並びにタンパク質、ペプチド及びオリゴヌクレイドのような生物活性剤の精製用のアフィニティクロマトグラフィの応用に有用である。細胞結合剤に抱合される標識又はリポーター基には、蛍光色素分子、及びビオチンのようなアフィニティ標識が挙げられる。

非還元性結合（たとえば、チオエーテル結合）を介して連結されるエフェクター基（たとえば、細胞傷害剤）又はリポーター基（たとえば、放射性標識）にたとえば、抗体のような細胞結合剤を抱合させる従来の方法は、抗体との２つの別々の反応工程を採用し、精製工程の使用を必要とする。第１の反応工程では、異なった２つの反応基（たとえば、Ｘ及びＹ）を持つヘテロ２官能性リンカーに抗体を反応させる。たとえば、方法の１つでは、ヘテロ２官能性試薬のＸ反応基（たとえば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）との抗体の反応性残基（たとえば、リジンアミノ残基）の反応は、抗体の１以上の反応性残基（たとえば、リジンアミノ残基）にてＹ反応基を含有するリンカーの取り込みを生じる。最初に修飾された抗体生成物は、次の工程が生じる前に、過剰なリンカー又は加水分解されたリンカー試薬から精製されなければならない。第２の工程では、Ｙ反応基（たとえば、マレイミド又はハロアセトアミド）を含有するリンカーで修飾された抗体が、たと
えば、チオールのような反応基を含有するエフェクター基（Ｃ）（たとえば、細胞傷害剤）のようなエフェクターと反応して抗体／エフェクターの抱合体を生成し、それは、再び追加の精製工程にて精製される（米国特許第５，２０８，０２０号、同第５，４１６，０６４号又は同第５，０２４，８３４号を参照）。従って、上記製造過程では、少なくとも２つの精製工程を必要とする。

抗体をエフェクター基又はリポーター基に抱合するのに２つの反応及び精製の工程が関与する別の方法は、抗体（たとえば、２−イミノチオランのようなチオール生成試薬による抗体の修飾を介して、又は非天然のシステイン残基を組み入れる突然変異誘発を介して、又は天然のジスルフィド結合の還元を介して生成される）におけるチオール残基の、Ｙ反応基（たとえば、マレイミド又はハロアセトアミド）を含有するホモ２官能性リンカーＹ−Ｌ−Ｙとの反応を利用する。

マレイミド（又はハロアセトアミド）のような反応基Ｙを抗体又はペプチドに組み入れる主な欠点は、反応性マレイミド（又はハロアセトアミド）基の、抗体又はペプチドにおける天然のヒスチジン、リジン、チロシン、又はシステイン残基との分子内又は分子間の反応を受ける傾向（Papini, A. et al., Int. J. Pept. Protein Res., 1992, 39, 348-355; Ueda, T. et al., Biochemistry, 1985, 24, 6316-6322）、及びＹマレイミド基の水性の不活化である。抗体に取り込まれたマレイミド（又はハロアセトアミド）基Ｙの抗体における天然のヒスチジン、リジン又はシステイン残基との望ましくない分子内又は分子間の反応、及びエフェクター基又はリポーター基Ｃとの第２の反応の前のＹマレイミド基の水性の不活化は、架橋タンパク質又は非均質抱合体を生じ、エフェクター基又はリポーター基Ｃとの第２の反応の効率を低下させる。最初に組み入れられたＹ基（たとえば、マレイミド基）の抗体又はペプチドにおける天然の基（たとえば、ヒスチジン、リジン、チロシン、又はシステイン）との望ましくない反応から、又は水性の不活化によって生成された不活性のマレイミド残基によって生成される非均質抱合体生成物／架橋タンパク質又はペプチドは、所望の均質抱合体生成物に比べて劣った活性及び安定性を有し得る。

ジスルフィド結合を介してチオール含有の細胞傷害剤に抗体を抱合させる製造過程は以前記載されている（たとえば、米国特許第５，２０８，０２０号、同第５，４１６，０６４号、同第６，４４１，１６３号、米国特許公開第２００７／００４８３１４Ａｌ号を参照）。これらの製造過程には、ヘテロ２官能性試薬との抗体の第１の反応、その後のチオール含有の細胞傷害剤との第２の反応が関与する。代わりの方法は、米国特許第６，４４１，１６３Ｂｌ号に記載されており、先ず、細胞傷害剤のジスルフィド結合した反応性エステルを精製し、次いで抗体と反応させるが、それには、抗体との反応工程の前にチオール基含有の細胞傷害剤から出発する追加の反応及び精製工程が含まれる。

細胞結合剤の抱合体を作製する現在の方法のさらなる欠点は、２つの精製工程の必要性であり、それは全体的な収率を低下させ、規模拡大するには製造過程を繁雑で不経済なものにする。

前述の見地から見て、実質的に高い純度であり、ユーザーにとっての時間とコストを軽減することによって繁雑な工程を回避して調製することができる、細胞結合剤／薬剤の抱合体組成物を調製する改善された方法を開発するニーズが当該技術分野に存在する。本発明はそのような方法を提供する。本発明のこれら及びそのほかの利点は、追加の発明の特徴と共に、本明細書で提供される発明の説明から明らかになるであろう。

本発明は、チオール含有の細胞傷害剤（たとえば、マイタンシノイド）のへテロ又はホモの２官能性試薬（たとえば、切断可能又は切断不能なリンカー）との直接反応を利用し、次いで未精製の反応混合物を細胞結合剤（たとえば、抗体又はその断片）と混合し、それによって、さらに効率的であり、高い収率を有し、規模拡大に適する製造過程により非還元性のチオール結合の抱合体を生成することによって、式Ｃ−Ｌ−ＣＢＡの非還元性のチオール結合の抱合体を調製する抱合方法を記載し、式中、Ｃはエフェクター又はリポーターの分子（たとえば、細胞傷害剤又は放射性標識）を表し、Ｌはリンカーであり、ＣＢＡは細胞結合剤（たとえば、抗体又はその断片）である。別の重要な利点は、そのような抱合方法によって、鎖間タンパク質架橋又は不活化残基（たとえば、マレイミド又はハロアセトアミド残基）を伴わずにチオエーテル結合の非還元性抱合体が得られることである。本出願に開示される新規の方法は、上記式で表される任意の抱合体の調製に適用することができる。

マイタンシノイドＤＭ１（又はＤＭ４）とマレイミド−ＰＥＧ_ｎ−ＮＨＳリンカーの反応混合物による抗体の抱合を示す図である。 本発明に記載された方法を用いて調製したＡｂ−（ＰＥＧ_４−Ｍａｌ）−ＤＭ４抱合体と従来の２工程方法を用いて調製した抱合体の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。各試料レーンは１０μｇのタンパク質を含有した；ゲルはクマシーブルーで染色した。レーン１及び２は分子量マーカーを含有した。レーン３はＡｂ当たり６．１のＤＭ４を伴う従来の２工程方法によって調製した抱合体を含有した。レーン４は本発明に記載された方法によって調製した抱合体を含有し、Ａｂ当たり６．２のＤＭ４を含有した。 本発明に記載された方法を用いて調製したＡｂ−（ＰＥＧ_４−Ｍａｌ）−ＤＭ４抱合体と従来の２工程方法を用いて調製した抱合体のタンパク質ＬａｂＣｈｉｐ電気泳動を示す図である。（Ａ）Ａｂ−（ＰＥＧ_４−Ｍａｌ）−ＤＭ４抱合体の還元条件下でのタンパク質ＬａｂＣｈｉｐ電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ２１００Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ／Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ２３０キット）。レーン１：分子量マーカー；レーン２：本発明に記載された方法を用いて合成したＡｂ−（ＰＥＧ_４−Ｍａｌ）−ＤＭ４、６．２Ｄ／Ａｂ；レーン３：２工程方法を用いて調製したＡｂ−（ＰＥＧ_４−Ｍａｌ）−ＤＭ４、６．１Ｄ／Ａｂ；レーン４：非抱合Ａｂ（各レーンでは０．２４μｇの総タンパク質）。上部マーカー、システムピーク及び下部マーカーのバンドは、キットから加えられた外部マーカーを表す。（Ｂ）タンパク質ＬａｂＣｈｉｐ電気泳動からのタンパク質バンドの定量。 本発明に記載された方法を用いて調製したＡｂ−（ＰＥＧ_４−Ｍａｌ）−ＤＭ４抱合体と従来の２工程方法を用いて調製した抱合体のＭＳを示す図である。（Ａ）Ａｂ当たり６．１のＤＭ４を伴う従来の２工程方法によって調製した抱合体のＭＳ。抱合体の有意な不均質性のためにＭＳのピークを上手く分割することができなかった。（Ｂ）本発明に記載された方法によって調製した抱合体のＭＳで、Ａｂ当たり６．２のＤＭ４を含有した。抱合体の均質性のために、ＭＳピークは上手く分割された。 ＣａｎＡｇ抗原を発現するＣＯＬＯ２０５細胞への、抗体当たり６．７ＤＭ１を伴う抗ＣａｎＡｇ抗体／ＰＥＧ_４−Ｍａｌ−ＤＭ１抱合体（本発明に記載された方法を用いて調製した）結合と、非修飾抗体の結合を示す図である。結合は蛍光単位で測定した。 ＣａｎＡｇ抗原を発現するＣＯＬＯ２０５細胞に向けた、抗体当たり６．７ＤＭ１を伴う抗ＣａｎＡｇ抗体／ＰＥＧ_４−Ｍａｌ−ＤＭ１抱合体（本発明に記載された方法を用いて調製した）の試験管内細胞傷害性を示す図である。抱合体をＣＯＬＯ２０５細胞に加え、抱合体との５日間の連続インキュベートの後、ＷＳＴ−８アッセイを用いて細胞の生存率を測定した。抱合体の特異性を明らかにする対照実験は、過剰の非抱合の抗ＣａｎＡｇ抗体を用いて行い、標的癌細胞に向けた抱合体の結合と細胞傷害性を阻止した。 ＤＭ１（又はＤＭ４）とマレイミド−スルホ−ＮＨＳリンカーの反応混合物による抗体の抱合を示す図である。 本発明に記載された方法を用いて調製したＡｂ−（スルホ−Ｍａｌ）−ＤＭ１抱合体と従来の２工程方法を用いて調製した抱合体の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。各試料レーンは１０μｇのタンパク質を含有した；ゲルはクマシーブルーで染色した。レーン１は分子量マーカーを含有した。レーン３と５は本発明に記載された方法によって調製した抱合体を含有し、それぞれ、Ａｂ当たり３．６のＤＭ１及び５．６のＤＭ１を含有した。レーン２と４は従来の２工程方法によって調製した抱合体を含有し、それぞれ、Ａｂ当たり４．０のＤＭ１及び５．７のＤＭ１を含有した。 本発明に記載された方法を用いて調製したＡｂ−（スルホ−Ｍａｌ）−ＤＭ１抱合体と従来の２工程方法を用いて調製した抱合体のタンパク質ＬａｂＣｈｉｐ電気泳動を示す図である。（Ａ）Ａｂ−（スルホ−Ｍａｌ）−ＤＭ１抱合体の還元条件下でのタンパク質ＬａｂＣｈｉｐ電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ２１００Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ／Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ２３０キット）。レーン１：分子量マーカー；レーン２：非抱合Ａｂ；レーン３：２工程抱合方法を用いて合成されたＡｂ−スルホ−Ｍａｌ−ＤＭ１、５．７Ｄ／Ａｂ；レーン４：本発明に記載された方法を用いて合成したＡｂ−スルホ−Ｍａｌ−ＤＭ１、５．６Ｄ／Ａｂ；ウェル当たり０．２２ｇの総タンパク質を負荷した。上部マーカー、システムピーク及び下部マーカーのバンドは、キットから加えられた外部マーカーを表す（ウェル当たり０．２４ｇの総タンパク質）。（Ｂ）タンパク質ＬａｂＣｈｉｐ電気泳動からのタンパク質バンドの定量。 本発明に記載された方法を用いて調製した抗体−（スルホ−Ｍａｌ）−ＤＭ１抱合体と従来の２工程方法を用いて調製した抱合体のＬＣ−ＭＳの比較を示す図である。（Ａ）本発明に記載された方法を用いて調製した３。Ａｂ当たり６のＤＭ１／Ａｂを伴う抱合体は、１〜６のＤＭ１が持つ別々の抱合体ピークを伴った均質な抱合体を示す。（Ｂ）従来の２工程抱合方法によって調製したＡｂ当たり４．０のＤＭ１を伴う抱合体のＭＳ。従来の２工程方法によって調製した抱合体のＭＳは抱合体、及び加水分解されたリンカー又は架橋されたリンカーを伴う抱合体（たとえば、２ＤＭ１にＬ、２Ｌ及び３Ｌが１つ加わった抱合体）に相当するピークを示すということは、非均質な生成物を示す。 ＣａｎＡｇ抗原を発現するＣＯＬＯ２０５細胞への、抗体当たり５．６のＤＭ４を伴う抗ＣａｎＡｇ抗体／スルホ−Ｍａｌ−ＤＭ１抱合体（本発明に記載された方法を用いて調製した）の結合と、非修飾抗体の結合を示す図である。結合は蛍光単位で測定した。 ＣａｎＡｇ抗原を発現するＣＯＬＯ２０５細胞に向けた、抗体当たり５．６のＤＭ４を伴う抗ＣａｎＡｇ抗体／スルホ−Ｍａｌ−ＤＭ１抱合体（本発明に記載された方法を用いて調製した）の試験管内細胞傷害性を示す図である。抱合体をＣＯＬＯ２０５細胞に加え、抱合体との５日間の連続インキュベートの後、ＷＳＴ−８アッセイを用いて細胞の生存率を測定した。抱合体の特異性を明らかにする対照実験は、過剰の非抱合の抗ＣａｎＡｇ抗体を用いて行い、標的癌財棒に向けた抱合体の結合と細胞傷害性を阻止した。 ＤＭ１（又はＤＭ４）とスルホ−ＮＨＳ ＳＭＣＣリンカーの反応混合物による抗体の抱合体を示す図である。 本発明に記載された方法を用いて調製したＡｂ−（ＳＭＣＣ）−ＤＭ１抱合体と従来の２工程方法を用いて調製した抱合体の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。各試料レーンは１０μｇの総タンパク質を含有した；ゲルはクマシーブルーで染色した。レーン１は分子量マーカーを含有し、レーン２は非抱合Ａｂを含有し、レーン３はＡｂ当たり３．１のＤＭ１を伴う従来の２工程方法によって調製した抱合体を含有し、レーン４はＡｂ当たり３．１のＤＭ１を伴う本発明に記載された方法によって調製した抱合体を含有した。 本発明に記載された方法を用いて調製したＡｂ−（ＳＭＣＣ）−ＤＭ１抱合体と従来の２工程方法を用いて調製した抱合体のタンパク質ＬａｂＣｈｉｐ電気泳動を示す図である。Ａ）Ａｂ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１抱合体の還元条件下でのタンパク質ＬａｂＣｈｉｐ電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ２１００Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ／Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ２３０キット）。レーン１：分子量マーカー；レーン２：本発明に記載された方法を用いて合成したＡｂ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、３．１Ｄ／Ａｂ；レーン３：非抱合Ａｂ；レーン４：２工程抱合方法を用いて合成されたＡｂ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、３．１Ｄ／Ａｂ（各レーンにおける０．２４ｇの総タンパク質）。上部マーカー、システムピーク及び下部マーカーのバンドは、キットから加えられた外部マーカーを表す。（Ｂ）タンパク質ＬａｂＣｈｉｐ電気泳動からのタンパク質バンドの定量。 本発明に記載された方法を用いて調製した抗体−（ＳＭＣＣ）−ＤＭ１抱合体と従来の２工程方法を用いて調製した抱合体のＬＣ−ＭＳの比較を示す図である。（Ａ）Ａｂ当たり３．１ＤＭ１を伴う逐次２工程法によって調製した抱合体のＭＳ。主要な各抱合体ピークは、加水分解された及び架橋されたリンカーの断片の存在のためにそばのピークと関連している。（Ｂ）Ａｂ当たり３．１のＤＭ１を伴う本発明に記載された方法よって調製した抱合体のＭＳ。抱合体の均質性のゆえにＭＳピークは上手く分割された。 従来の２工程法による抱合の間での鎖間架橋及びマレイミド不活化の提唱されたメカニズムを示す図である。 本発明に記載された方法を用い、及び抗体の抱合反応の前に４−マレイミド酪酸を用いて遊離のＤＭ４チオールをクエンチして（最初のＤＭ４＋ＨＮＳスルホＭａｌへテロ２官能性試薬のカップリング反応の後）、調製したＡｂ−（スルホ−Ｍａｌ）−ＤＭ４抱合体の還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。各試料は１０μｇのタンパク質を含有した；ゲルはクマシーブルーで染色した。レーン１と５は分子量マーカーを含有した。レーン２はＡｂのみを含有した。レーン３は追加の４−マレイミド酪酸なしで本発明に記載された方法によって調製した抱合体を含有した。レーン４は最初のＤＭ４＋ＨＮＳスルホＭａｌへテロ２官能性試薬の後（抗体抱合工程の前）、４−マレイミド酪酸を添加して本発明に記載された方法によって調製した抱合体を含有した。 ＤＭ１（又はＤＭ４）とＳＰＤＢリンカーの反応混合物を用いた抗体の十スルフィド結合抱合体の調製を示す図である。 ＤＭ１（又はＤＭ４）とＳＰＤＢ及びＮＨＳ−ＰＥＧ_４−Ｍａｌ双方の未精製の反応混合物による抗体の抱合を介した、ジスルフィド−及び切断不能なＰＥＧ_４−Ｍａｌリンカー双方を伴った抗体／マイタンシノイドの抱合体の調製を示す図である。 ジスルフィド−及び切断不能なＰＥＧ_４−Ｍａｌリンカー双方を伴った抗体／マイタンシノイドの抱合体（ＤＭ１又はＤＭ４とＳＰＤＢ及びＮＨＳ−ＰＥＧ_４−Ｍａｌ双方の未精製の反応混合物による抗体の抱合によって調製される）のＭＳを示す図である。 ＤＭ１（又はＤＭ４）とＳＭＣＣリンカーの反応混合物による抗体の抱合を示す図である。 抗体当たり平均３．１のＤＭ１を含有する、本発明に記載された方法によってＳＭＣＣを用いて調製した抗体−ＳＭＣＣ−ＤＭ１抱合体のＭＳを示す図である。 ＤＭ１（又はＤＭ４）とＳＳＮＰＢリンカーの反応混合物を用いた抗体のジスルフィド結合抱合体の調製を示す図である。 ＤＭ１（又はＤＭ４）と、脂肪族直鎖炭素鎖を持つヘテロ２官能性リンカーの反応混合物による抗体の抱合を示す図である。

本発明の特定の実施形態について今や詳細な参照が行われ、その例は添付の構造及び式にて説明される。本発明は列挙される実施形態と併せて説明される一方で、それらは本発明をそれら実施形態に限定することを意図するものではないことが理解されるであろう。それに対して、本発明は、特許請求の範囲によって定義されるような本発明の範囲内に含まれてもよい代替物、改変物及び同等物すべてを網羅することが意図される。当業者は、本明細書で記載されるものと類似の又は同等の多数の方法及び物質を認識するであろうが
、それらは本発明の実施において使用され得る。

本発明は、チオール含有のエフェクター基（たとえば、細胞傷害剤）又はリポーター基（たとえば、放射性標識）を細胞結合剤（たとえば、抗体）に抱合する新規の方法を記載するが、その際、チオール含有のエフェクター又はリポーターが先ず、有機溶媒、水性溶媒又は有機溶媒／水性溶媒の混合溶媒中にて２官能性のリンカー試薬と反応し、次いで有機溶媒、水性溶媒又は有機溶媒／水性溶媒の混合溶媒中にて未精製の反応混合物を細胞結合剤と反応させる。

説明文の略語
スキーム及び実施例の説明に使用されている略語は以下のとおりである：
Ｃ＝エフェクター基又はリポーター基（たとえば、細胞傷害剤又は放射性標識）
Ｌ＝リンカー（切断可能又は切断不能なリンカー）
Ｘ＝アミン反応基（たとえば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）、スルホ−ＮＨＳエステル、ｐ−ニトロフェノールエステル、テトラフルオロスルホネートフェニルエステル、１−ヒドロキシ−２−ニトロ−ベンゼン−４−スルホン酸エステル）
Ｙ＝マレイミド又はハロアセトアミド（ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド）
Ｙ_ｂは、反応性の混合ジスルフィド基（たとえば、２−ピリジルジチオ、４−ピリジルジチオ、２−ニトロ−ピリジルジチオ、５−ニトロ−ピリジルジチオ、２−カルボキシ−５−ニトロ−ピリジルジチオ）である
Ｘ’＝アミド結合
Ｙ’＝チオエーテル（Ｒ−Ｓ−Ｒ’）又はセレノエーテル（Ｒ−Ｓｅ−Ｒ’）結合
Ｙ’_ｂ＝ジスルフィド（Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒ’）結合

本発明の一実施形態では、エフェクター分子又はリポーター分子との細胞結合剤のチオエーテル結合抱合体を調製する方法が記載され、該方法は、以下の工程：（ａ）水性溶媒、有機溶媒又は混合された有機／水性反応混合物にて式Ｘ−Ｌ−Ｙのヘテロ２官能性リンカーをチオール含有のエフェクター分子又はリポーター分子Ｃ（たとえば、マイタンシノイド又は放射性核種）と接触させて、式Ｘ−Ｌ−Ｙ’−Ｃの中間体生成物を得ること；（ｂ）未精製の反応混合物を、たとえば、抗体（Ａｂ）のような細胞結合剤と混合して式Ａｂ−（Ｘ’−Ｌ−Ｙ’−Ｃ）_ｍの抱合体を生成すること、（式中、Ｌは置換又は非置換の直鎖、分枝鎖又は環状の１〜１０の炭素原子を持つアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基、単純な又は置換されたアリール単位（アルキル、アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、フルオロ、カルボキシ、スルホネート、ホスフェート、アミノ、カルボニル、ピペリジノから選択される置換基）、又はポリエチレングリコール含有の単位（好ましくは１〜５００ＰＥＧスペーサー、又はさらに好ましくは１〜２４のＰＥＧスペーサー、又は一層さらに好ましくは２〜８のＰＥＧスペーサー）であり；Ｘ及びＹは、アミン又はチオール反応基、たとえば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、及びマレイミド又はハロアセトアミド）であり；Ａｂは抗体であり；ｍは１〜２０の整数であり；Ｘ’は抗体との反応の際、修飾されるＸ部位（たとえば、アミド結合）であり；Ｙ’は、たとえば、エフェクター基又はリポーター基の細胞傷害剤又は放射性標識との反応の際、修飾されるＹ部位（たとえば、チオエーテル結合）である）、及び（ｃ）接線流濾過、透析又はクロマトグラフィ（たとえば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ）又はそれらの組み合わせによって抱合体を精製することを含む。好ましくは、Ｙはマレイミド又はハロアセトアミドから選択されるチオール反応基である。好ましくは、Ｌは、１〜６の炭素を伴った直鎖若しくは分枝鎖のアルキル、又は２〜８のＰＥＧスペーサーである。好ましくは、Ｃは、マイタンシノイド、ＣＣ−１０６５類似体、タキサン、ＤＮＡ結合剤、から選択される細胞傷害剤であり、さらに好ましくは、それはマイタンシノイドである。

式１及び２によって表される本反応の順序：
Ｘ−Ｌ−Ｙ＋Ｃ→Ｘ−Ｌ−Ｙ’−Ｃ （１）
Ａｂ＋Ｘ−Ｌ−Ｙ’−Ｃ（反応１から未精製）→Ａｂ（Ｘ’−Ｌ−Ｙ’−Ｃ）_ｍ （２）
は、中間体生成物Ｘ−Ｌ−Ｙ’−Ｃの精製が関与しないので、抗体とそれをそのまま混合する（未精製の中間体生成物を抗体に加える、又は抗体を未精製の中間体生成物に加える）という利点を提供し、それによって繁雑な精製工程を排除するので方法が抱合に有利になる。重要なことに、従来の２工程法と精製順によって調製される抱合体で認められる鎖間タンパク質架橋又は不活化されたマレイミド残基とは対照的に、本方法によって鎖間タンパク質架橋又は不活化されたマレイミド残基を伴わない均質な抱合体が得られる。

反応１は、水性溶媒、有機溶媒又は有機／水性反応混合物にて高い濃度のヘテロ２官能性リンカー、及びエフェクター基又はリポーター基Ｃで実施することができ、その結果、従来の２工程法と精製順によって調製される抱合体についての水性溶液での低い濃度に比べて速い反応速度を生じる。

反応１で生成される中間体生成物Ｘ−Ｌ−Ｙ’−Ｃは、適当に低いｐＨの水性溶媒、有機溶媒、又は混合した有機／水性混合物、又は凍結乾燥状態にて長い間、低温にて凍結状態で未精製のまま保存することができ、その後、約４〜９の高いｐＨ値にて最終的な抱合反応のために抗体溶液と混合することができるので、この反応順の利便性に加えることができる。中間体生成物は、細胞結合剤と混合する前に、必要に応じて、有機溶媒又は水性緩衝液、又は有機溶媒と水性緩衝液の混合物で希釈することができる。用語「約」は、数字と併せて本明細書で使用されるとき、すべての数及びその小さな変動を含めてそのような数すべてを指すように理解されるべきである。中間体生成物Ｘ−Ｌ−Ｙ’−Ｃの抗体との反応は、約４〜約ｐＨ９、好ましくは約５〜８．７のｐＨ範囲、さらに好ましくは約６３５〜８．５のｐＨ範囲、たとえば、ｐＨ９．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４及び８．５のようなｐＨ値、その中でのｐＨ範囲又はその小さな変動にて実施することができる。約６．５〜８．５の優先的なｐＨ範囲での中間体生成物Ｘ−Ｌ−Ｙ’−Ｃとの抗体の反応に使用される緩衝液は、このｐＨ範囲のあたりでｐＫ値を持つ緩衝液、たとえば、リン酸緩衝液及びＨＥＰＥＳ緩衝液である。これらの好ましい緩衝液は、リンカーＸ（たとえば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）と反応することができる１級若しくは２級のアミノ基、又はそのほかの反応基を有するべきではない。

最初の反応で、ヘテロ２官能性リンカーＸ−Ｌ−Ｙに対して化学量論的な又はやや過剰なＣを用いて、未精製の混合物を抗体に加える前にＹ基（たとえば、マレイミド）すべてが確実に反応するようにする。クエンチ試薬（たとえば、４−マレイミド酪酸、３−マレイミドプロピオン酸、又はＮ−エチルマレイミド又はヨードアセトアミド又はヨードアセトアミドプロピオン酸）による最適な追加反応を行って、抗体と混合する前に未反応のＣをクエンチして天然の抗体のジスルフィド結合とのチオールジスルフィドの望ましくない交換反応をできるだけ抑えることができる。極性の荷電したチオールのクエンチ試薬（たとえば、４−マレイミド酪酸又は３−マレイミドプロピオン酸）によるクエンチの際、過剰な未反応のＣは、共有結合した抱合体から容易に分離することができる極性の荷電した付加体に変換される。任意で、精製前の最初の反応混合物２は、たとえば、アミノ基含有の求核試薬（たとえば、リジン、タウリン、ヒドロキシアミン）のような求核試薬で処理して未反応のリンカー（Ｘ−Ｌ−Ｙ’−Ｃ）をクエンチする。

マイタンシノイド（ＤＭｘ）とヘテロ２官能性リンカーの未精製の最初の反応混合物と
の抗体の反応についての代替方法には、ＤＭｘとヘテロ２官能性リンカーの最初の反応混合物（ＤＭｘ／リンカーの反応の完了時）を抗体と低いｐＨ（ｐＨ約５）で混合し、次いで抱合反応のために緩衝液又は塩基を添加してｐＨを約６．５〜８．５に上げることが含まれる。

この新しい方法は、細胞傷害性のマイタンシノイド薬剤との抗体抱合体の調製に適用される。反応順１〜２で概説されるこの方法を用いて調製される抗体／マイタンシノイドの抱合体は、還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、タンパク質ＬａｂＣｈｉｐ電気泳動及び質量分析に基づいて、従来の２工程法及び精製順によって調製した抱合体に比べて思いがけなく均質性に優れていた。反応順１〜２を含む本発明で記載される抱合方法はまた、中間体精製の工程を必要としないので、従来の２工程法よりも有意に好都合である。

本発明の第２の実施形態では、エフェクター分子又はリポーター分子との細胞結合剤のチオエーテル結合抱合体を調製する方法が記載され、該方法は、以下の工程：（ａ）水性溶媒、有機溶媒又は混合された有機／水性反応混合物にて式Ｘ−Ｌ−Ｙのヘテロ２官能性リンカーをチオール又はアミンを含有するエフェクター基又はリポーター基Ｃ（たとえば、細胞傷害剤）と接触させて、式Ｘ−Ｌ−Ｙ’−Ｃの中間体生成物を得ること；（ｂ）水性溶液又は水性／有機混合物にて未精製の反応混合物を抗体と混合して式Ａｂ−（Ｙ’−Ｌ−Ｙ’−Ｃ）_ｍの抱合体を生成すること（式中、Ｌは上記と同義であり、Ｙはチオール又はアミンの反応基、たとえば、マレイミド又はハロアセトアミド、又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド又はスルホＮ−ヒドロキシスクシンイミドであり；Ａｂは抗体であり；ｍは１〜２０の整数であり；Ｙ’は、抗体との反応の際、修飾されるＹ部位（たとえば、チオエーテル結合又はアミド結合）又は細胞傷害剤又はエフェクター基又はリポーター基との反応の際、修飾されるＹ部位（たとえば、チオエーテル結合又はアミド結合）である）、及び（ｃ）接線流濾過、透析又はクロマトグラフィ（たとえば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ）又はそれらの組み合わせによって抱合体を精製することを含む。式３及び４で表される反応順：
Ｙ−Ｌ−Ｙ＋Ｃ→Ｙ−Ｌ−Ｙ’−Ｃ （３）
Ａｂ＋Ｙ−Ｌ−Ｙ’−Ｃ（反応３から未精製）→Ａｂ（Ｙ’−Ｌ−Ｙ’−Ｃ）_ｍ （４）
は、中間体生成物Ｙ−Ｌ−Ｙ’−Ｃの精製を含まないので、抱合のために有利な方法である。

第３の実施形態では、エフェクター分子又はリポーター分子との細胞結合剤のジスルフィド結合抱合体を調製する方法が記載され、それは以下の工程：（ａ）水性溶媒、有機溶媒又は混合された有機／水性反応混合物にてエフェクター基又はリポーター基Ｃ（たとえば、細胞傷害剤）に式Ｘ−Ｌ−Ｙ_ｂのヘテロ２官能性リンカーを接触させて中間体生成物Ｘ−Ｌ−Ｙ_ｂ’−Ｃを得ること；（ｂ）水性溶液又は水性／有機混合物にて未精製の反応混合物を抗体と混合して式Ａｂ−（Ｘ’−Ｌ−Ｙ_ｂ’−Ｃ）_ｍの抱合体を生成すること（式中、Ｌは上記のとおりであり、Ｙ_ｂは反応性ジスルフィド、たとえば、ピリジルジスルフィド又はニトロ−ピリジルジスルフィドであり、Ｘはアミン反応基、たとえば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル又はスルホＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであり、Ａｂは抗体であり；ｍは１〜２０の整数であり；Ｘ’は抗体との反応の際、修飾されるＸ部位（たとえば、アミド結合）であり；Ｙ_ｂ’は細胞傷害剤又はエフェクター基又はリポーター基との反応の際、修飾されるＹ_ｂ部位（ジスルフィド）である）；及び（ｃ）接線流濾過、透析又はクロマトグラフィ（たとえば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ）又はそれらの組み合わせによって抱合体を精製することを含む。反応順は式５及び６にて表される：
Ｘ−Ｌ−Ｙｂ＋Ｃ→Ｘ−Ｌ−Ｙ_ｂ’−Ｃ （５）
Ａｂ＋Ｘ−Ｌ−Ｙ_ｂ’−Ｃ（反応５から未精製）→Ａｂ−（Ｘ’−Ｌ−Ｙ_ｂ’−Ｃ）_ｍ
（６）

第４の実施形態では、２種類のリンカー、切断不能な（チオエーテル結合）及び切断可能な（ジスルフィド結合）リンカーを伴ったエフェクター基又はリポーター基との抗体の抱合体を調製する方法が記載され、それは以下の工程を含む：
（ａ）Ｘ−Ｌ−ＹとＸ−Ｌ−Ｙ_ｂのリンカーを細胞傷害剤Ｃに接触させて式Ｘ−Ｌ−Ｙ’−ＣとＸ−Ｌ−Ｙ_ｂ’−Ｃの中間体生成物を生成すること、（ｂ）反応式７〜９に示すような順番で又は同時に、未精製の反応混合物を抗体と混合して、
Ｘ−Ｌ−Ｙ＋Ｃ→Ｘ−Ｌ−Ｙ’−Ｃ （７）
Ｘ−Ｌ−Ｙ_ｂ＋Ｃ→Ｘ−Ｌ−Ｙ_ｂ’−Ｃ （８）
Ａｂ＋Ｘ−Ｌ−Ｙ’−Ｃ＋Ｘ−Ｌ−Ｙ_ｂ’−Ｃ（反応７〜８から未精製）→Ａｂ−（Ｘ’−Ｌ−Ｙ’−Ｃ）_ｍ（Ｘ’−Ｌ−Ｙ_ｂ’−Ｃ）_ｍ’ （９）
抱合体Ａｂ−（Ｘ’−Ｌ−Ｙ’−Ｃ）_ｍ（Ｘ’−Ｌ−Ｙ_ｂ’−Ｃ）_ｍを提供すること（式中、Ｘ、Ｌ、Ｙ’、Ｃ、Ｙ_ｂ’及びｍは上記のとおりであり、ｍ’は１〜２０の整数である）、及び（ｃ）接線流濾過、透析又はクロマトグラフィ（たとえば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ）又はそれらの組み合わせによって抱合体を精製すること。これら２つのリンカーエフェクター中間体（Ｘ−Ｌ−Ｙ’−Ｃ及びＸ−Ｌ−Ｙ_ｂ’−Ｃ）は、種々の比率で異なった順にて（先ずＸ−Ｌ−Ｙ’−Ｃ、次いでＸ−Ｌ−Ｙ_ｂ’−Ｃ又は先ずＸ−Ｌ−Ｙ_ｂ’−Ｃ、次いでＸ−Ｌ−Ｙ’−Ｃ）精製せずに抗体と混合される。

反応１、３、５及び７〜８は、水性溶媒、有機溶媒又は有機／水性反応混合物にて、高い濃度の２官能性リンカー（Ｘ−Ｌ−Ｙ、Ｘ−Ｌ−Ｙ_ｂ又はＹ−Ｌ−Ｙ）とエフェクター基又はリポーター基Ｃで実施することができ、その結果、従来の２工程法及び試薬の溶解性が限定される精製順によって調製される抱合体についての水性溶液での低い濃度に比べて速い反応速度を生じる。

反応１、３、５及び７〜８にて生成される中間体生成物Ｘ−Ｌ−Ｙ’−Ｃ、Ｙ−Ｌ−Ｙ’−Ｃ又はＸ−Ｌ−Ｙ_ｂ’−Ｃは、低いｐＨの水性溶媒、有機溶媒、又は混合した有機／水性混合物、又は凍結乾燥状態にて長い間、低温にて凍結状態で未精製のまま保存することができ、その後、最初の抱合体反応のために抗体溶液に加えることができるので、この反応順の利便性に加えることができる。

最初の反応で、ヘテロ２官能性リンカーＸ−Ｌ−Ｙ、はＹ−Ｌ−Ｙ又はＸ−Ｌ−Ｙ_ｂに対して化学量論的な又はやや過剰なＣを用いて、未精製の混合物を抗体に加える前にＹ基（たとえば、マレイミド）すべてが確実に反応するようにする。クエンチ試薬（たとえば、４−マレイミド酪酸、３−マレイミドプロピオン酸、又はＮ−エチルマレイミド又はヨードアセトアミド又はヨード酢酸）による最適な追加処理を行って、抗体に添加する前にＣにおける未反応基（たとえばチオール）をクエンチして天然の抗体のジスルフィド結合との望ましくないチオールジスルフィド交換反応をできるだけ抑えることを保証することができる。２官能性リンカーとのＣの最初の反応後、荷電した極性のチオールクエンチ試薬を用いた過剰なＣのクエンチは、過剰なＣを高度に極性の水溶性付加体に変換し、それは、ゲル濾過、透析又はＴＦＦによって、共有結合した抱合体から容易に分離される。最終的な抱合体生成物は非共有結合で会合したＣを含有しない。任意で、精製前に、最終反応混合物２、４、６及び９をたとえば、アミノ基含有の求核試薬（たとえば、リジン、タウリン、ヒドロキシルアミン）のような求核試薬で処理して未反応のリンカー（Ｘ−Ｌ−Ｙ’−Ｃ、Ｙ−Ｌ−Ｙ’−Ｃ又はＸ−Ｌ−Ｙ_ｂ’−Ｃ）をクエンチする。

ＤＭｘと２官能性リンカーの未精製の最初の反応混合物との抗体の反応の代替方法には、ＤＭｘとヘテロ２官能性リンカーの最初の反応混合物（ＤＭｘ／リンカーの反応の完了
時）を抗体と低いｐＨ（ｐＨ約５）で混合し、次いで抱合反応のために緩衝液又は塩基を添加してｐＨを約６．５〜８．５に上げることが含まれる。

２以上の異なったエフェクターに由来する２以上のリンカー／エフェクターの中間体を未精製のままで順番に又は同時に抗体に加えることによって１を超える種類のエフェクターの複数コピーを抗体に抱合させることができる。
エフェクター基

用語エフェクター基又はエフェクター分子は相互交換可能に使用され、用語「エフェクター基」又は「エフェクター分子」は本明細書で使用されるとき、細胞傷害剤を含むものとする。特定の点では、エフェクター基又はエフェクター分子が種々の長さのスペーサーアームに連結されて立体障害の可能性を軽減することが望ましくてもよい。２以上の異なったエフェクターに由来する２以上のリンカー／エフェクターの中間体を未精製のままで順番に又は同時に抗体に加えることによって１を超える種類のエフェクターの複数コピーを抗体に抱合させることができる。

本発明で使用することができる細胞傷害剤には、化学療法剤又は化学療法剤の構造的類似体が挙げられる。「化学療法剤」は癌の治療で有用な化合物である。化学療法剤の例には、たとえば、チオテパ及びサイクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなアルキルスルホネート類；ベンゾドパ、カルボクオン、メツレドパ及びウレドパのようなアジリジン類；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスファオルアミド及びトリメチロロメラミンを含むエチレンイミン及びメチラメラミン；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；カプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（アドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドダスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９及びＣＢＩ−ＴＩＭＩ）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；クロラムブシル、クロロナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、酸化メクロレタミン塩酸塩、メルファラン、ノバムブチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタードのようなナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンのようなニトロソ尿素；たとえば、エネジン抗生剤（たとえば、カリケラミシン、特にカリケラミシンγ１及びカリケラミシンθ１、たとえば、Angew Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186 (1994)を参照；ダイネミシンＡを含むダイネミシン；エスペラミシン；同様にネオカルジノスタチンクロモフォア及び関連するクロモタンパク質エネジン抗生剤クロモモルフォア）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オートラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン；クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、ニトロマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、プロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシンのような抗生剤；たとえば、メソトレキセート及び５−フルオロ裏質（５−ＦＵ）のような抗代謝薬；葉酸類似体、たとえば、デノプテリン、メソトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート；プリン類縁体、たとえば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、たとえば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフ
ァ、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フルオクスウリジン、５−ＦＵ；アンドロゲン、たとえば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎薬、たとえば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充薬、たとえば、フォリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキセート；デフォファミド；ジアジクオン；エルフォミチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；マイタンシノイド類、たとえば、マイタンシン及びアンサミトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジン；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２、２’、２”−トリクロロトリエチルアミン；トリクロテセン（特にＴ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；サイクロホスファミド；チオテパ；タキソイド類、たとえば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、ニュージャージー州、プリンストンのブリストルマイヤーズスクイブオンコロジー）及びドキセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、フランス、アントニーのローヌプーラン）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メソトレキセート；白金類似体、たとえば、シスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イフォスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセロダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロミチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；カペシタビン；並びに上記の薬学上許容可能な塩、酸、又は誘導体が挙げられる。この定義で挙げられるのはまた、腫瘍におけるホルモンの作用を調節する又は阻害するように作用する抗ホルモン剤、たとえば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害の４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン及びトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含む抗エストロゲン、並びにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、レウプロリド及びゴセレリンのような抗アンドロゲン；ｓｉＲＮＡ並びに上記の薬学上許容可能な塩、酸、又は誘導体である。本発明と共に使用することができるそのほかの化学療法剤は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開第２００８０１７１０４０号及び同第２００８０３０５０４４号に開示されている。

好ましい実施形態では、化学療法の細胞傷害剤は、本質的に小分子の細胞傷害剤である。「小分子の薬剤」は本明細書で広く使用され、たとえば、１００〜１５００、さらに好適には１２０〜１２００、好ましくは２００〜１０００の分子量を有してもよい、通常、約１０００未満の分子量を有する有機、無機又は有機金属の化合物を指す。本発明の小分子の細胞傷害剤は、約１０００未満の分子量を有するオリゴペプチド及びそのほかの生体分子を包含する。小分子の細胞傷害剤は、たとえば、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＷＯ０５０５８３６７Ａ２、欧州特許第８５９０１４９５号及び同第８５９０３１９号、及び米国特許第４，９５６，３０３号のような当該技術で十分に性状分析されている。

好ましい小分子の細胞傷害剤は、細胞結合剤に結合できるものである。本発明は、既知の細胞傷害剤並びに既知になってもよいものも含む。特に好ましい小分子の細胞傷害剤には細胞傷害剤が挙げられる。

細胞傷害剤は、細胞の死を結果的に生じる、細胞死を誘導する、又は場合によっては細
胞の生存率を低下させる任意の化合物であってもよく、各細胞傷害剤はチオール部分を含む。

好ましい細胞傷害剤は、マイタンシノイド化合物、タキサン化合物、ＣＣ−１０６５化合物、ダウノルビシン化合物及びドキソルビシン化合物、ピロロベンゾジアゼピン二量体、カリケアミシン、アウリスタチン、及びそれらの類似体及び誘導体であり、その一部は以下に記載される。

必ずしも小分子ではない、たとえば、ｓｉＲＮＡのようなそのほかの細胞傷害剤も、本発明の範囲内で熟考される。たとえば、オリゴヌクレオチドの修飾に一般に使用される方法（たとえば、米国特許公開第２００５０１０７３２５号及び同第２００７０２１３２９２号）によってｓｉＲＮＡを本発明の架橋剤に連結することができる。従って、３’又は５’−ホスホロアミダイト形態でのｓｉＲＮＡは、ヒドロキシル官能性を持つ架橋剤の一方の末端と反応してｓｉＲＮＡと架橋剤の間にエステル結合を作る。同様に、末端アミノ基を持つ架橋剤とのｓｉＲＮＡホスホロアミダイトの反応によってアミンを介したｓｉＲＮＡへの架橋剤の結合を生じる。ｓｉＲＮＡは、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開第２００７０２７５４６５号、同第２００７０２１３２９２号、同第２００７０１８５０５０号、同第２００７０１６１５９５号、同第２００７００５４２７９号、同第２００６０２８７２６０号、同第２００６００３５２５４号、同第２００６０００８８２２号、同第２００５０２８８２４４号、同第２００５０１７６６６７に記載されている。
マイタンシノイド

本発明で使用することができるマイタンシノイドは当該技術で周知であり、既知の方法に従って天然の供給源から単離することができ、又は既知の方法に従って合成で調製することができる。

好適なマイタンシノイドの例には、マイタンシノール及びマイタンシノール類似体が挙げられる。好適なマイタンシノール類似体の例には、修飾された芳香族環を有するもの及びほかの位置で修飾を有するものが挙げられる。

修飾された芳香族環を有するマイタンシノールの好適な類似体の具体例には、
（１）Ｃ−１９のデクロロ（米国特許第４，２５６，７４６号）（アンサミトシンＰ２のＬＡＨ還元によって調製される）；
（２）Ｃ−２０ヒドロキシ（又はＣ−２０デメチル）＋／−Ｃ−１９デクロロ（米国特許第４，３６１，６５０号及び同第４，３０７，０１６号）（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ若しくはＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓを用いた脱メチル化又はＬＡＨを用いた脱塩素化によって調製される）；
（３）Ｃ−２０デメトキシ、Ｃ−２０アシルオキシ（−ＯＣＯＲ）＋／−デクロロ（米国特許第４，２９４，７５７号）（塩化アシルを用いたアシル化によって調製される）；
が挙げられる。

ほかの位置に修飾を有するマイタンシノールの好適な類似体の具体例には、
（１）Ｃ−９ＳＨ（米国特許第４，４２４，２１９号）（Ｈ２Ｓ又はＰ２Ｓ５とのマイタンシノールの反応によって調製される）；
（２）Ｃ−１４アルコキシメチル（デメトキシ／ＣＨ２ＯＲ）（米国特許第４，３３１，５９８号）；
（３）Ｃ−１４ヒドロキシメチル又はアシルオキシメチル（ＣＨ２ＯＨ又はＣＨ２ＯＡｃ）（米国特許第４，４５０，２５４）（ノカルジアから調製される）；
（４）Ｃ−１５ヒドロキシ／アシルオキシ（米国特許第４，３６４，８６６号）（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓによるマイタンシノールの変換によって調製される）；
（５）Ｃ−１５メトキシ（米国特許第４，３１３，９４６号）（Ｔｒｅｗｉａ ｎｕｄｉｆｌｏｒａから単離される）；
（６）Ｃ−１８Ｎ−デメチル（米国特許第４，３６２，６６３号及び同第４，３２２，３４８号）（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓによるマイタンシノールの脱メチル化によって調製される）；
（７）４，５−デオキシ（米国特許第４，３７１，５３３号）（マイタンシノールの三塩化チタン・ＬＡＨ還元によって調製される）が挙げられる。

本発明で有用なチオール含有のマイタンシノールの合成は、米国特許第５，２０８，０２０号、同第５，４１６，０６４号、及び米国特許出願第２００４０２３５８４０号に完全に開示されている。

Ｃ−３位、Ｃ−１４位、Ｃ−１５位又はＣ−２０位におけるチオール部分を持つマイタンシノイドはすべて有用であると期待される。Ｃ−３位が好ましく、マイタンシノールのＣ−３位が特に好ましい。好ましいのはまた、Ｎ−メチルアラニン含有のＣ−３チオール部分のマイタンシノイド及びＮ−メチルシステイン含有のＣ−３チオール部分のマイタンシノイド及びそれぞれの類似体である。

本発明で有用なＮ−メチルアラニン含有のＣ−３チオール部分のマイタンシノイド誘導体の具体例は式Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ６及びＭ７によって表される。

式中。ｌは１〜１０の整数であり、Ｍａｙはマイタンシノイドである。

式中、Ｒ_１及びＲ_２は、Ｈ、ＣＨ_３又はＣＨ_２ＣＨ_３であり、同一であっても異なっていてもよく；
ｍは０、１、２、又は３であり；
Ｍａｙはマイタンシノイドである。

式中、ｎは３〜８の整数であり；
Ｍａｙはマイタンシノイドである。

式中、ｌは１、２、又は３であり；
Ｙ_０はＣｌ又はＨであり；
Ｘ_３はＨ又はＣＨ_３である。

式中、
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４は、Ｈ、ＣＨ_３又はＣＨ_２ＣＨ_３であり、同一であっても異なっていてもよく；
ｍは０、１、２、又は３であり；
Ｍａｙはマイタンシノイドである。

本発明で有用なＮ−メチルシステイン含有のＣ−３チオール部分のマイタンシノイド誘導体の具体例は、式Ｍ４及びＭ５によって表される。

式中、
０は、１、２又は３であり；
ｐは、０〜１０の整数であり；
Ｍａｙはマイタンシノイドである。

式中、
０は、１、２又は３であり；
ｐは、０〜１０の整数であり；
Ｙ_０はＣｌ又はＨであり；
Ｘ_３はＨ又はＣＨ_３である。

好ましいマイタンシノイドは、米国特許第５，２０８，０２０号、同第５，４１６，０６４号、同第６，３３３．４１０号、同第６，４４１，１６３号、同第６，７１６，８２１号；ＲＥ３９，１５１号及び同第７，２７６，４９７号に記載されたものである。
タキサン類

本発明に係る細胞傷害剤は、またタキサンであってもよい。

本発明で使用することができるタキサンは、チオール部分を含有するように修飾されている。本発明で有用な一部のタキサンは以下に示す式Ｔ１を有する。

好ましいタキソイドは、米国特許第６，３４０，７０１号、同第６，３７２，７３８号、同第６．４３６，９３１号、同第６，５９６，７５７号、同第６，７０６，７０８号、同第７，００８，９４２号、同第７，２１７，８１９号及び同第７，２７６，４９９号に記載されたものである。
ＣＣ−１０６５類似体

本発明に係る細胞傷害剤は、またＣＣ−１０６５類似体であってもよい。

本発明によれば、ＣＣ−１０６５類似体はサブユニットＡとＢ又はサブユニットＢ−Ｃを含有する。好ましいＣＣ−１０６５類似体は、米国特許第５，４７５，０９２号、同第５，５９５，４９９号、同第５，８４６，５４５号、同第６，５３４，６６０号、同第６，５８６，６１８号、同第６，７５６，３９７号及び同第７，０４９，３１６号に記載されたものである。
ダウノルビシン／ドキソルビシン類似体

本発明に係る細胞傷害剤は、またダウノルビシン類似体又はドキソルビシン類似体であってもよい。

本発明のダウノルビシン及びドキソルビシンの類似体は、チオール部分を含むように修飾することができる。本発明の修飾されたダウノルビシン／ドキソルビシン類似体は、チオール部分を有し、ＷＯ０１／３８３１８に記載されている。修飾されたダウノルビシン／ドキソルビシン類似体は、既知の方法（たとえば、米国特許第５，１４６，０６４号を参照）に従って合成することができる。

アウリスタチンには、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＥＢ（ＡＥＢ）、アウリスタチンＥＦＰ（ＡＥＦＰ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）が挙げられ、米国特許第５，６３５，４８３号、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．１５：３６７−７２（１９９９);
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｖｏｌ．３，Ｎｏ．
８，ｐｐ．９２１−９３２（２００４）; 米国特許公開第１１／１３４８２６号、米国特許公開第２００６００７４００８号、同第２００６０２２９２５号に記載されている。

本発明に係る細胞傷害剤には、当該技術（米国特許第７，０４９，３１１号、同第７，０６７，５１１号、同第６，９５１，８５３号、同第７，１８９，７１０号、同第６，８８４，７９９号、同第６，６６０，８５６号）で既知であるピロロベンゾジアゼピン二量体が挙げられる。
類似体及び誘導体

細胞傷害剤の当業者は、本明細書で記載される細胞傷害剤のそれぞれは、得られる化合物が出発化合物の特異性及び／又は活性を依然として保持するような方法で修飾され得る
ことを容易に理解するであろう。当業者はまた、これらの化合物の多くが本明細書で記載される細胞傷害剤の代わりに使用され得ることも理解するであろう。従って。本発明の細胞傷害剤は、本明細書で記載される化合物の類似体及び誘導体を含む。
リポーター基

用語リポーター基又はリポーター分子は相互交換可能に使用され、用語「リポーター基」又は「リポーター分子」は本明細書で使用されるとき、診断又は治療の目的で試薬の特異的な親和性部分によって特定の物質又は細胞に送達される物質を指し；例は放射性同位元素、常磁性造影剤及び抗癌剤である。種々の標識又はリポーター基は、癌患者における腫瘍の画像化応用、種々の疾患の診断用の免疫アッセイ応用、放射性の核種／リガンド抱合体を用いた癌療法、及び生物活性剤、たとえば、タンパク質、ペプチド及びオリゴヌクレイドの精製のためのアフィニティクロマトグラフィ応用で有用である。細胞結合剤と抱合される標識又はリポーター基には、蛍光色素分子、及びたとえば、ビオチンのようなアフィニティ標識が挙げられる。そのようなリポーター基の参照は、米国特許公開第２００７／００９２９４０に見い出すことができる。たとえば、ビオチン又はフルオレセインを含むリポーター基は、ＰＥＧ抱合体部分にも連結することができる。多数の好適なリポーター基は、当該技術、たとえば、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第４，１５２，４１１号及びＨｉｒｓｃｈｆｅｌｄ米国特許第４，１６６，１０５号、米国特許第５，２２３，２４２号、米国特許第５，５０１，９５２号、米国特許公開第２００９０１３６９４０号で知られている。
リンカー

抱合体は、試験管内の方法によって調製されてもよい。薬剤を細胞結合剤に連結するために、連結基を使用する。好適な連結基は当該技術で既知であり、切断不能なリンカー及び切断可能なリンカーが挙げられる。切断不能なリンカーは、安定な共有結合で細胞傷害剤を細胞結合剤に連結することが可能である化学部分である。切断不能なリンカーは酸誘導の切断、光誘導の切断、ペプチダーゼ誘導の切断、エステラーゼ誘導の切断、及びジスルフィド結合の切断に実質的に耐性である。切断不能なリンカーの例には、薬剤、リポーター基又は細胞結合剤との反応について、Ｎ−スクシンイミジルエステル、Ｎ−スルホスクシンイミジルエステル部分、マレイミド−又はハロアセチル系の部分を有するリンカーが挙げられる。マレイミド系部分を含む架橋試薬には、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、ＳＭＣＣの「長鎖」類似体（ＬＣ−ＳＭＣＣ）であるＮ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロエート）、κ−マレイミドウンデカンＮ−スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）−スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート（ＳＭＰＢ）、及びＮ−（ｐ−マレイミドフェニル）イソシアネート（ＰＭＰＩ）が挙げられる。ハロアセチル系部分を含む架橋試薬には、Ｎ−スクシンイミジル−４−（ヨードアセチル）−アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジルブロモアセテート（ＳＢＡ）及びＮ−スクシンイミジル３−（ブロモアセトアミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）が挙げられる。

切断不能なリンカーを形成するイオウ原子を欠くそのほかの架橋試薬も本発明の方法で使用することができる。そのようなリンカーはジカルボン酸系の部分に由来することができる。好適なジカルボン酸系の部分には、以下に示す一般式のα、ω−ジカルボン酸が挙げられる：
ＨＯＯＣ−Ｘ_ｌ−Ｙ_ｎ−Ｚ_ｍ−ＣＯＯＨ
式中、Ｘは２〜２０の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基であり、Ｙは３〜１０の炭素原子を有するシクロアルキル基又はシクロアルケニル基であり、Ｚは６〜１０の炭素原子を有する置換若しくは非置換の芳香族基、又は置換若しくは非置換の複素環基であり、ヘテロ原子はＮ、Ｏ、又はＳから選択され、ｌ、ｍ及びｎが同時にすべてゼロではないという条件で、ｌ、ｍ及びｎはそれぞれ０又は１である。

本明細書で開示される切断不能なリンカーの多くは、米国特許公開第２００５０１６９９３３号で詳細に記載されている。

切断可能なリンカーは、穏やかな条件下、すなわち、細胞傷害剤の活性に影響を及ぼさない条件下で切断することができるリンカーである。多数の既知のリンカーはこのカテゴリーに入り、以下に記載される。

酸に不安定なリンカーは酸性ｐＨで切断可能かリンカーである。たとえば、特定の細胞内区画、たとえば、エンドソーム及びリソソームは酸性ｐＨ（ｐＨ４〜５）を有し、酸に不安定なリンカーを切断するのに好適な条件を提供する。

光に不安定なリンカーは、体表面及び光にアクセス可能な多数の体腔において有用である。さらに、赤外線は組織を貫通することができる。

一部のリンカーはペプチダーゼによって切断することができる。細胞内又は細胞外では特定のリンカーだけが切断され易く、たとえば、Ｔｒｏｕｅｔら、７９ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６２６−６２９（１９８２），Ｕｍｅｍｏｔｏら、４３ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６７７−６８４（１９８９）、及びリソソーム／加水分解酵素で切断可能なバリン／シトルリン結合（米国特許第６，２１４，３４５Ｂ１号）を参照のこと。さらに、ペプチドは、α−アミノ酸とペプチド結合から構成され、ペプチド結合は、１つのアミノ酸のカルボキシレートと２番目のアミノ酸のαアミノ基のあいだのアミド結合である。たとえば、カルボキシレートとリジンのε−アミノ基の間の結合のようなそのほかのアミド結合はペプチド結合ではないと理解され、切断不能であるとみなされる。

一部のリンカーはエステラーゼによって切断することができる。再び、細胞内又は細胞外に存在するエステラーゼによって一部の特定のエステルだけが切断される。エステルはカルボン酸とアルコールの縮合によって形成される。単純なエステルは、たとえば、脂肪族アルコール及び小型の環状アルコール及び小型の芳香族アルコールのような単純なアルコールで生成されるエステルである。たとえば、エステル、マイタンシノールのアルコール成分は非常に大きくて複雑なので、本発明者らは、マイタンシンのＣ−３でのエステルを切断するエステラーゼはないことを見い出した。

好ましい切断可能なリンカー分子には、たとえば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（たとえば、Carlsson et al, Biochem. J, 173: 723-737(1978)を参照）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）（たとえば、米国特許第４，５６３，３０４号を参照）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）（たとえば、ＣＡＳ登録番号３４１４９８−０８−６を参照）、及びその全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第６，９１３，７４８号に記載されたもののような反応性架橋剤が挙げられる。

本発明で使用することができるそのほかのリンカーには、荷電リンカー又は親水性リンカーが挙げられ、それぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許出願第１２／４３３，６０４号及び同第１２／４３３，６６８号に記載されている。
細胞結合剤

本発明で使用される細胞結合剤は、癌細胞上の標的抗原に特異的に結合するタンパク質（たとえば、免疫グロブリン及び非免疫グロブリンタンパク質）である。これらの細胞結合剤には、
再表面化する抗体（米国特許第５，６３９，６４１号）；
ヒト化抗体又は完全にヒトの抗体（ヒト化抗体又は完全にヒトの抗体は、ｈｕＭｙ９−６、ｈｕＢ４、ｈｕＣ２４２、ｈｕＮ９０１、ＤＳ６、ＣＤ３８、ＩＧＦ−ＩＲ、ＣＮＴＯ９５、Ｂ−Ｂ４、トラスツズマブ、ビバツズマブ、シブロツズマブ及びリツキシマブから選択されるが、これらに限定されない）（たとえば、米国特許第５，６３９，６４１号、同第５，６６５，３５７号及び同第７，３４２，１１０号、国際特許出願ＷＯ０２／１６，４０１号、米国特許公開第２００６００４５８７７号、同第２００６０１２７４０７号、同第２００５０１１８１８３号、Pedersen et al, (1994) J. MoI. Biol. 235, 959-973, Roguska et al., (1994) Proceedings of the National Academy of Sciences, VoI
91, 969-973, Colomer et al., Cancer Invest., 19: 49-56 (2001), Heider et al, Eur. J. Cancer, 3 IA: 2385-2391 (1995), Welt et al., ./. Clin. Oncol, 12: 1193-1203 (1994), and Maloney et al., Blood, 90: 2188-2195 (1997)を参照）；並びに
優先的に標的細胞に結合するｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２のような抗体断片（Parham, J. Immunol. 131 :2895-2902 (1983); Spring et al, J. Immunol. 113:470-478 (1974); Nisonoff et al, Λrc/z. Biochem. Biophys. 89:230-244 (I960)）
を含む抗体が挙げられる。

追加の細胞結合剤には、
アンキリン反復タンパク質（ARPins; Zahnd et al., J. Biol. Chem., 281, 46, 35167
-35175, (2006); Binz, H.K., Amstutz, P. & Pluckthun, A. (2005) Nature Biotechnology, 23, 1257-1268）又はたとえば、米国特許公開第２００７０２３８６６７号、米国
特許第７，１０１，６７５号、ＷＯ／２００７／１４７２１３，ＷＯ／２００７／０６２４６６に記載されたアンキリン様反復タンパク質又は合成ペプチド；
インターフェロン（たとえば、α、β、γ）；
リンホカイン、たとえば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６；
ホルモン、たとえば、インスリン、ＴＲＨ（甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン）、ＭＳＨ（色素形成細胞刺激ホルモン）、アンドロゲン及びエストロゲンのようなステロイドホルモン、並びに
増殖因子及びコロニー刺激因子、たとえば、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＩＧＦ−Ｉ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦ (Burgess, Immunology Today 5:155-158 (1984)）によって例示されるが、これらに限定されないそのほかの細胞結合タンパク質及びポリペプチドが挙げられる。

細胞結合剤が抗体である場合、それは、ポリペプチドであり、膜貫通分子（たとえば、受容体）であってもよく、又は増殖因子のようなリガンドであってもよい抗原に結合する。例となる抗原には、レニンのような分子；ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α１アンチトリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；たとえば、ｖｍｃ因子、第ＩＸ因子、組織因子（ＴＦ）及びフォン・ヴィレブランド因子のような凝固因子；たとえば、プロテインＣのような抗凝固因子；動脈ナトリウム利尿因子；肺界面活性剤；たとえば、ウロキナーゼ、ヒトの尿又は組織型のプラスミノーゲンアクチベータ（ｔ−
ＰＡ）のようなプラスミノーゲンアクチベータ；トロンビン；造血増殖因子：腫瘍壊死因子α及びβ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（発現された及び分泌された正常Ｔ細胞の活性化を調節する）；ヒトマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ−１α）；たとえば、ヒト血清アルブミンのような血清アルブミン；ミュラー管阻害物質；レラキシンＡ鎖；レラキシンＢ鎖；プロレラキシン；マウス性腺刺激関連ペプチド；たとえば、β−ラクタマーゼのような微生物タンパク質；ＤＮＡ分解酵素；ＩｇＥ；たとえば、ＣＴＬＡ−４のような細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモン又は増殖因子のための受容体；プロテインＡ又はＤ；リウマチ因子；たとえば、骨由来の神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロピン−３、−４、−５又は−６（ＮＴ３、ＮＴ４、ＮＴ５又はＮＴ６）のような神経栄養因子、又はＮＧＦ−βのような神経成長因子；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；たとえば、ＦＧＦ及びｂＦＧＦのような線維芽細胞増殖因子；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；たとえば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、又はＴＧＦ−β５を含むＴＧＦα及びＴＧＦβのような形質転換増殖因子；インスリン様増殖因子−Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）；デス（１〜３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ），インスリン様増殖因子結合タンパク質；たとえば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ４０のようなＣＤタンパク質；エリスロポイエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；たとえば、インターフェロンα、β及びγのようなインターフェロン；たとえば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＧ−ＣＳＦのようなコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；たとえば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０のようなインターロイキン；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；分解促進因子；たとえば、ＨＩＶエンベロープの一部のようなウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節性タンパク質；たとえば、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４及びＶＣＡＭ、ヘテロ二量体ヒトインテグリン受容体のαＶサブユニットのようなインテグリン；たとえば、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４受容体のような腫瘍関連抗原；並びに上記に列記されたポリペプチドの断片が挙げられる。

本発明によって包含される抗体について好ましい抗原には、たとえば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４及びＣＤ４６のようなＣＤタンパク質；たとえば、ＲＧＦ受容体、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４受容体のようなＥｒｂＢ受容体ファミリーのメンバー；たとえば、ＬＦＡ−Ｉ、Ｍａｃｌ、ｐｌ５０．９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−Ｉ、ＶＣＡＭ、そのα又はβサブユニットを含むα４／β７インテグリン、及びαｖ／β３インテグリンのような接着分子（たとえば、抗ＣＤ−１１ａ、抗ＣＤ−１８又は抗ＣＤ−１１ｂ抗体）；たとえば、ＶＥＧＦのような増殖因子；組織因子（ＴＦ）；ＴＧＦ−β；αインターフェロン（α−ＩＦＮ）；ＩＬ−８のようなインターロイキン；血液型抗原Ａｐｏ２、死の受容体；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ−４；プロテインＣ等が挙げられる。本明細書で最も好ましい標的は、ＩＧＦ−ＩＲ、ＣａｎＡｇ、ＥＧＦ−Ｒ、ＥｐｈＡ２、ＭＵＣｌ、ＭＵＣ１６、ＶＥＧＦ、ＴＦ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ１３８、ＣＡ６、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＣＲＩＰＴＯ（ヒト乳癌細胞の大半にて高いレベルで産生される）、αｖ／β３インテグリン、αｖ／β５インテグリン、ＴＧＦ−β、ＣＤｌＩａ、ＣＤ１８、Ａｐｏ２及びＣ２４である。

モノクローナル抗体技術によってモノクローナル抗体の形態で細胞結合剤を作製することが可能である。当該技術で特に周知であるのは、たとえば、標的細胞、標的細胞から単離された抗原、ウイルス全体、弱毒化したウイルス全体、及びウイルスコートタンパク質のようなウイルスタンパク質のような当該抗原によってマウス、ラット、ハムスター又はそのほかの哺乳類を免疫することにより産生されるモノクローナル抗体を創製する技法である。感作したヒト細胞を使用することもできる。モノクローナル抗体を創製する別の方法は、ｓＦｖ（短鎖可変領域）、特にヒトｓＦｖ（たとえば、Griffiths et al, U.S. pa
tent no. 5,885,793; McCafferty et al, WO 92/01047; Liming et al, ＷＯ ９９／０
６５８７を参照）のファージライブラリの使用である。

適切な細胞結合剤の選択は、標的とされるべき特定の細胞集団に左右される選択の問題であるが、一般に適切なものが入手可能であれば、標的細胞に優先的に結合するモノクローナル抗体及びその断片が好まれる。

たとえば、モノクローナル抗体Ｍｙ９は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）で見つかったＣＤ３３抗原に特異的であるマウスＩｇＧ_２ａ抗体（Roy et al. Blood 77:2404-2412 (1991)）であり、ＡＭＬ患者を治療するのに使用される。同様にモノクローナル抗体抗Ｂ４は、Ｂ細胞上のＣＤ１９抗原に結合し（Nadler et al, J. Immunol. 131 :244-250 (1983)
）、たとえば、標的細胞が、非ホジキンリンパ腫又は慢性リンパ性白血病でこの抗原を発現するＢ細胞又は冒された細胞である場合使用することができるマウスＩｇＧ_１である。同様に、抗体Ｎ９０１は、小細胞肺癌細胞及び神経内分泌起源のそのほかの腫瘍の細胞で見つかったＣＤ５６に結合するマウスのモノクローナルＩｇＧ_１抗体であり（Roy et al.
J Nat. Cancer Inst. 88:1136-1145 (1996)）、ｈｕ２４２抗体はＣａｎＡ抗原に結合し、トラスツズマブはＨＥＲ２／ｎｅｕに結合し、抗ＥＧＦ受容体抗体は、ＥＧＦ受容体に結合する。
精製方法

本発明の抱合体、すなわち、最終生成物を精製して、未反応又は非抱合のエフェクター分子又はリポーター分子、又は未反応のリンカー、又は非抱合で加水分解されたリンカーを取り除く。精製方法は、接線流濾過（ＴＦＦ、交差流濾過、限外濾過又は透析濾過としても知られる）、ゲル濾過、吸着クロマトグラフィ、選択的沈殿、又はこれらの組み合わせであり得る。吸着クロマトグラフィ法には、イオン交換クロマトグラフィ、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）、疎水性電荷誘導クロマトグラフィ（ＨＣＩＣ）、混合モードイオン交換クロマトグラフィ、不動化金属アフィニティクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）、色素リガンドクロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、及び逆相クロマトグラフィが挙げられる。たとえば、式２で記載された抱合体Ａｂ−（Ｘ’−Ｌ−Ｙ’−Ｃ）_ｍは、未反応のＣ，又は未反応／加水分解されたＸ−Ｌ−Ｙ又はＸ−Ｌ−Ｙ’−Ｃから精製される。同様に式４、６及び９で記載された抱合体が精製される。そのような精製方法は当業者に既知であり、米国特許公開第２００７／００４８３１４号に見い出すことができる。

抱合体における望ましくない加水分解されたリンカー又はタンパク質の架橋
反応性マレイミド残基又はハロアセトアミド残基とのヘテロ２官能性リンカーによるタンパク質の最初の反応を採用する従来の抱合方法は２つの主な欠点に悩まされている：（ｉ）エフェクター分子又はリポーター分子との反応の前に、抗体に取り込まれたリンカーの水性不活性化のために抱合体生成物が加水分解されたリンカーから成る可能性がある；及び（ｉｉ）タンパク質又はペプチドにおける天然のヒスチジン、リジン、チロシン又はシステインとのマレイミド（又はハロアセトアミド）の反応のために、抱合体の鎖間又は鎖内の架橋（A. Papini et al., Int. J. Pept. Protein Res., 1992, 39, 348-355; T. Ueda et al., Biochemistry, 1985, 24, 6316-6322）。抗体におけるそのような鎖間架橋は結果的に、重鎖と軽鎖の間又は重鎖間に非還元性の共有結合を生じ、それらは、予想される重鎖及び軽鎖のバンドよりも高い分子量のバンドとして還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥで明らかになる。抗体におけるそのような鎖間又は鎖内の架橋はまた、予想される抗体プラス連結されたリポーター基又はエフェクター基の質量とは異なった異常な質量のピークとしてＭＳによって明らかになる。従来の抱合方法とは異なって、本出願に記載される方法は、鎖間架橋又は加水分解されたリンカーを実質的に伴わない高い均質性で抱合体を生じる。

本明細書及び後に続く実施例で引用される文献はすべてその全体が参照によって明示的に本明細書に組み入れられる。

説明のみのためである以下の実施例は本発明を限定することを意図するものではない。

実施例１．この方法（図１）と従来の２工程法によるヘテロ２官能性リンカー、マレイミド−ＰＥＧ_ｎ−ＮＨＳを用いた細胞傷害剤、ＤＭ１／ＤＭ４による抗体の抱合

ＤＭ１［Ｎ^２’−デアセチル−Ｎ^２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシン］又はＤＭ４［Ｎ^２’−デアセチル−Ｎ^２’−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−マイタンシン］（ＤＭｘ）チオール及びマレイミド−ＰＥＧ_ｎ−ＮＨＳのストック溶液は、３０〜６０ｍＭの濃度にてＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）で作製した。５０％までの２００ｍＭコハク酸緩衝液、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ５を含有するＤＭＡにてリンカーとＤＭｘチオールを一緒に混合し、１．６：１のＤＭｚとリンカーのモル比及び１５ｍＭに等しいＤＭｘの最終濃度を得た。混合した後、反応混合物を１〜４時間放置し、次いで反応混合物のアリコートを１０倍に希釈し、その吸収を３０２〜３２０ｎｍにて測定して、マレイミドの吸光係数（ε）、３０２ｎｍ＝６２０Ｍ^−１ｃｍ^−１及びε３２０ｎｍ〜４５０Ｍ^−１ｃｍ^−１を用いて残っている未反応のマレイミドの存在を判定した。（３０２ｎｍと２５２ｎｍでモニターする吸収によって、反応混合物の凍結アリコートの追加の逆相ＨＰＬＣ解析を後で行って、抗体に反応混合物を添加した時点でのリンカーマレイミドの完全な消失と所望のリンカー／ＤＭｘ試薬の形成を検証した）。ＵＶによってさらなるマレイミドが存在しなかった場合、４ｍｇ／ｍＬのＡｂ、９０％のリン酸緩衝液／１０％ＤＭＡ、ｐＨ７．５という最終抱合条件下にてリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）における抗体溶液に、反応混合物のアリコートを精製せずに加えた。抱合反応を常温にて２時間進めた。ｐＨ７．５のリン酸緩衝液で平衡化したＧ２５ゲル濾過カラムを用いて、又は接線流濾過（ＴＦＦ）を用いて過剰な小分子ＤＭｘ及びリンカー反応物からＡｂ−ＤＭｘの抱合体を精製した。ｐＨ７．５の緩衝液で抱合混合物を４℃にて２日間保持して、非共有結合で又は不安定な結合で抗体に結合したＤＭｘ種を解離させた。次いでｐＨ５．５のヒスチジン／グリシン緩衝液で抱合体を一晩透析し、次いで最終保存のために０．２２μｍのフィルターで濾過した。２５２ｎｍと２８０ｎｍで抱合体の吸収を測定し、これら２つの波長でのＤＭｘと抗体の既知の吸光係数を用いて最終的な抱合体における抗体分子（平均）当たりのＤＭｘ分子の数を測定した。

ヘテロ２官能性マレイミド−ＰＥＧ_４−ＮＨＳ試薬とのＤＭｘチオールの最初の反応に幾つかの異なった反応条件を用いた：５０％ＤＭＡ／５０％水性２００ｍＭのコハク酸緩衝液ｐＨ５．０、２ｍＭのＥＤＴＡ（ｖ／ｖ）；又は６０％ＤＭＡ／４０％２００ｍＭコハク酸緩衝液ｐＨ５．０、２ｍＭのＥＤＴＡ（ｖ／ｖ）；又はＤＭ４チオールのモル当たり１．５モル当量の有機塩基（たとえば、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン、ＤＩＰＥＡ又はＡ−メチルモルフォリン）を伴った１００％ＤＭＡ。

実験のシリーズの１つでは、マレイミド−ＰＥＧ_４−ＮＨＳリンカー（Ｐｉｅｒｃｅ Ｅｎｄｏｇｅｎから購入）に対するＤＭｘのモル当量を１．２〜２．４で変化させ、反応時間は３０分間だった。精製された抱合体で測定したＤＭｘ／Ａｂの数は、リンカー当たりのＤＭｘの添加した当量の関数として測定した。１．２〜２．０当量のＤＭ１／リンカーの条件が同様のＤＭｘ／Ａｂの負荷を持つ抱合体を生じるということは、リンカーのＮＨＳエステル部位でのＤＭｘチオールの望ましくない反応が大きな問題ではないことを示している。還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって最終抱合体に存在する架橋の量を分析して、架橋の混入の存在が、ＤＭ１／リンカー比率の上昇と共に有意に低下することを示した。

ＤＭｘとヘテロ２官能性リンカーの最初の反応の完了後（抗体に反応混合物を加える前）、マレイミド又はハロアセトアミド試薬（たとえば、マレイミド酪酸、マレイミドプロピオン酸、Ｎ−エチルマレイミド又はヨードアセトアミド又はヨード酢酸）を用いた任意のクエンチ工程を１つ導入して抗体とＤＭｘチオールの望ましくない反応を防ぐために過剰なＤＭｘチオール基をクエンチした。

ＤＭｘとヘテロ２官能性リンカーの未精製の最初の反応混合物と抗体との反応の代替方法には、ＤＭｘとヘテロ２官能性リンカーの最初の反応混合物（ＤＭｘ／リンカーの反応の完了時）を低いｐＨ（ｐＨ約５）で抗体と混合し、次いで抱合反応のために緩衝液又は塩基を添加してｐＨを６．５〜６．８に上げることが含まれる。

本発明で記載される抱合方法との比較のために、従来の２工程抱合方法によって抗体−ＰＥＧ_４−Ｍａｌ−ＤＭ１又はＤＭ４の抱合体を作製した。ｐＨ７．５のリン酸緩衝液（５０ｍＭのリン酸カリウム、５０ｍＭの塩化ナトリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）と５％ＤＭＡにおける濃度８ｍｇ／ｍＬのヒト化抗体を過剰なヘテロ２官能性マレイミド−ＰＥＧ_４−ＮＨＳリンカー試薬（Ｐｉｅｒｃｅ Ｅｎｄｏｇｅｎから購入）によって修飾した。２５℃にて２時間後、修飾した抗体をＧ２５クロマトグラフィでゲル精製して過剰な未反応で取り込まれなかったリンカーを取り除いた。２８０ｎｍでのＵＶの吸収によって精製されたＡｂの回収を測定した。少量の修飾抗体アリコートを用いて、マレイミドに対して過剰に加えられる既知の量のチオール（たとえば、２−メルカプトエタノール）を添加して修飾抗体におけるマレイミド残基と反応させ、次いでＤＴＮＢ試薬を用いたＥｌｌｍａｎのアッセイによって残りのチオールを測定すること（４１２ｎｍでのＴＮＢチオレートの吸光係数は、１４１５０Ｍ^−１ｃｍ^−１：Riddles, P. W. et al, Methods Enzymol., 1983, 91, 49-60; Singh, R., Bioconjugate Chem., 1994, 5, 348-351）によって、修飾された抗体における架橋マレイミド基の数を測定した。９５％リン酸緩衝液（５０ｍＭのリン酸カリウム、５０ｍＭの塩化ナトリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）と５％ＤＭＡから成る反応混合物にて２．５ｍｇ／ｍＬのＡｂ濃度で修飾されたＡｂとＤＭ１又はＤＭ４チオールの抱合を行った。Ａｂ上の連結されたマレイミドのモル当たり、１．７モル当量の過剰のＤＭ１又はＤＭ４チオールを加えた。２５℃で一晩反応させた後、抱合体を０．２２μｍのフィルターで滅菌濾過し、リン酸緩衝液ｐＨ７．５（５０ｍＭのリン酸カリウム、５０ｍＭの塩化ナトリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）で平衡化したＧ２５カラムによって過剰な未反応のＤＭ１又はＤＭ４からゲルで精製した。精製した抱合体をリン酸緩衝液ｐＨ７．５（５０ｍＭのリン酸カリウム、５０ｍＭの塩化ナトリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）にて４℃で２日間保持して、非共有結合で又は不安定な結合で抗体に結合したＤＭ１種又はＤＭ４種を解離させた。その後、ヒスチジン／グリシン緩衝液ｐＨ５．５（１３０ｍＭのグリシン／１０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ５．５）に対して抱合体を２日間透析し、０．２２μｍのフィルターを用いて滅菌濾過した。２５２ｎｍと２８０ｎｍにて抱合体の吸収を測定し、これら２つの波長でのＤＭ１／ＤＭ４とＡｂについての既知の吸光係数を用いることによって最終的な抱合体におけるＡｂ分子当たりのＤＭ１又はＤＭ４の分子の数を測定した。

４〜１２％のＢｉｓＴｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にＮｕＰａｇｅ電気泳動システムを用いて抱合体と抗体の試料で還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。熱変性し、還元した試料を１０μｇ／レーンで負荷した。本発明で記載された方法を用いて調製した抱合体の還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、主なバンドとして予想される重鎖と軽鎖のバンド（それぞれ５０ｋＤａと２５ｋＤａ）のみを示した（図２）。それに対して、従来の２工程抱合方法によって調製した抱合体は、７５、１００、１２５及び１５０ｋＤａの分子量を持つ望ましくない架橋バンドを示したが、それらは多分、それぞれ、鎖間架橋種、ＨＬ、Ｈ_２、Ｈ_２Ｌ及びＨ_２Ｌ_２に相当する（図２）。

本発明で記載された方法を用いて調製した抗体−ＰＥＧ_４−Ｍａｌ−ＤＭ４抱合体のタンパク質ＬａｂＣｈｉｐ電気泳動解析（還元条件下）は、（総タンパク質の）５８％及び３０％の予想された重鎖バンド及び軽鎖バンドを示したが、それらは、それぞれ、６５％及び３０％の非抱合抗体についてのものに類似する（図３）。それに対して、従来の２工程抱合方法を用いて調製した抱合体は、それぞれ、たった１６％及び８％の重鎖バンド及び軽鎖バンドしか示さず、主要なバンドは多分鎖間架橋による９４〜１６９ｋＤａに及ぶ高い分子量のものだった。定量的なタンパク質ＬａｂＣｈｉｐ解析に基づいて、本出願で記載された方法によって調製した抱合体は、従来の２工程法を用いて調製したものよりも高度に優れている（図３）。

本発明で記載された方法によって調製した抱合体のＭＳ分析は、抗体分子当たり多くのマイタンシノイド分子を持つ抗体についての別々のＤＭｘ／抗体抱合体のピークを示した（図４）。それに対して、従来の２工程法を用いて得られた抱合体のＭＳ分析は、ほとんど解像されなかったということは、多分、架橋している又は不活性化されたマレイミドリンカーによる抱合体調製物の非均一性を示唆している。従って、ＭＳに基づいて、本発明で記載された方法を用いて調製した抱合体は、従来の２工程法によって合成されたものよりも優れている。

抗原を発現しているＣＯＬＯ２０５細胞を用いてフローサイトメトリーによって、本発明で記載された方法によって調製した抗ＣａｎＡｇ抗体−ＰＥＧ_４−Ｍａｌ−ＤＭ１抱合体の結合を測定し、非抱合の抗体のそれと類似していることが分かったということは、抱合体が、抗体の結合に有害な効果を有さなかったことを示唆している（図５）。ＣａｎＡｇ抗原を発現しているＣＯＬＯ２０５結腸癌細胞を用いて試験管内で、本発明で記載された方法によって調製した抗ＣａｎＡｇ抗体−ＰＥＧ_４−Ｍａｌ−ＤＭ１抱合体の細胞傷害性活性を測定した（図６）。ウシ胎児血清を含有する細胞培養培地にて９６穴プレートに約１０００個／ウェルで抗原発現癌細胞を入れ、種々の濃度のＡｂ−ＤＭｘ抱合体に暴露した。抱合体への暴露の５日後、ＷＳＴ−８アッセイ（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて各ウェルに残っている生細胞を測定した。図６に示されるように、本方法を用いて調製した抗ＣａｎＡｇ抗体−ＰＥＧ_４−Ｍａｌ−ＤＭ１抱合体は、ＣａｎＡｇ抗原を発現するＣＯＬＯ２０５結腸癌細胞に対して低濃度で高度に強力だった。本発明で記載された方法によって調製した抗ＣａｎＡｇ抗体−ＰＥＧ_４−Ｍａｌ−ＤＭ１抱合体の細胞傷害性は、過剰の非抱合抗体の添加によって阻止することができたので、ＣＯＬＯ２０５細胞に特異的だった。

実施例２．この方法（図７）と従来の逐次２工程法によるマレイミド−スルホ−ＮＨＳリンカーを用いたＤＭ１／ＤＭ４による抗体の抱合
３０〜６０ｍＭの濃度でＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）にてＤＭｘチオール及びマレイミド−スルホ−ＮＨＳ−ヘテロ２官能性リンカーのストック溶液を作製した。４０％ｖ／ｖまでの２００ｍＭのコハク酸緩衝液、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ５．０を含有するＤＭＡにてリンカーとＤＭｘチオールを一緒に混合して１．６のＤＭｘとリンカーの比率と１５ｍＭに等しいＤＭｘの最終濃度を得た。混合した後、反応物を１〜４時間放置し、次いで反応混合物のアリコートを１０倍に希釈して、反応の完了とマレイミドの非存在を評価するために３０２〜３２０ｎｍで吸収を測定した（３０２ｎｍと２５２ｎｍでモニターする吸収によって、反応混合物の凍結アリコートの追加の逆相ＨＰＬＣ解析を後で行って、抗体に反応混合物を添加した時点でのリンカーマレイミドの完全な消失と所望のリンカー／ＤＭｘ試薬の形成を検証した）。ＵＶによってさらなるマレイミドが存在しなかった場合、４ｍｇ／ｍＬのＡｂ、９０％のリン酸緩衝液／１０％ＤＭＡ、ｐＨ７．５という最終抱合条件下にてリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）における抗体の混合物に、反応混合物のアリコートを加えた。抱合反応を常温にて２時間進めた。ｐＨ７．５のリン酸緩衝液
で平衡化したＧ２５ゲル濾過カラムを用いて、又は接線流濾過によって過剰な未反応のＤＭｘ及び非抱合のリンカー生成物からＡｂ−ＤＭｘの抱合体を精製した。ｐＨ７．５の緩衝液で抱合混合物を４℃にて２日間保持して、非共有結合で又は不安定な結合で抗体に結合したＤＭｘ種を解離させた。次いでｐＨ５．５のヒスチジン／グリシン緩衝液で抱合体を一晩透析し、次いで最終保存のために０．２２μｍのフィルターで濾過した。２５２ｎｍと２８０ｎｍで抱合体の吸収を測定し、これら２つの波長でのＤＭｘと抗体の既知の吸光係数を用いて最終的な抱合体における抗体分子（平均）当たりのＤＭｘ分子の数を測定した。

比較のために、従来の２工程抱合方法を用いてＡｂ−スルホ−Ｍａｌ−ＤＭｘ抱合体を調製した。ｐＨ７．５のリン酸緩衝液／５％ＤＭＡにおける濃度８ｍｇ／ｍＬの抗体（Ａｂ）を過剰なヘテロ２官能性マレイミド−スルホ−ＮＨＳリンカーによって修飾した。２０℃にて２時間反応を進め、次いでＧ２５クロマトグラフィを用いて過剰な未反応のリンカーから修飾されたＡｂを精製した。２８０ｎｍでのＵＶ吸収によって精製されたＡｂの回収を測定した。少量の修飾抗体アリコートを用いて、マレイミドに対して過剰に加えられる既知の量のチオール（たとえば、２−メルカプトエタノール）を添加して修飾抗体におけるマレイミド残基と反応させ、次いでＤＴＮＢ試薬を用いたＥｌｌｍａｎのアッセイによって残りのチオールを測定すること（４１２ｎｍでのＴＮＢチオレートの吸光係数は、１４１５０Ｍ^−１ｃｍ^−１：Riddles, P. W. et al, Methods Enzymol., 1983, 91, 49-60; Singh, R., Bioconjugate Chem., 1994, 5, 348-351）によって、修飾されたＡｂにおける架橋マレイミド基の数を測定した。９５％リン酸緩衝液と５％ＤＭＡにおける２．５ｍｇ／ｍＬの抗体濃度で、Ａｂにおける架橋マレイミドのモル当たり添加された１．７モル当量の過剰のＤＭｘと共に、修飾されたＡｂとＤＭｘの抱合を行った。反応物を１８℃にて８〜２４時間放置し、Ｇ２５サイズ排除クロマトグラフィによって過剰で未反応のＤＭｘから抱合体を分離した。精製後、抱合体をｐＨ７．５の緩衝液中で４℃にて２日間保持して、非共有結合で又は不安定な結合で抗体に結合したＤＭｘ種を解離させた。その後、ヒスチジン／グリシン緩衝液ｐＨ５．５に対して抱合体を一晩透析し、次いで最終保存のために０．２２μｍのフィルターを介して濾過した。２５２ｎｍと２８０ｎｍにて抱合体の吸収を測定し、これら２つの波長でのＤＭｘと抗体についての既知の吸光係数を用いることによって最終的な抱合体におけるＡｂ分子当たりのＤＭｘの分子の数を測定した。

ＮｕＰａｇｅ４〜１２％、ＢｉｓＴｒｉｓミニゲル及びＮｕＰＡＧＥＭＯＰＳ−ＳＤＳ泳動緩衝液を伴ったＮｕＰａｇｅ電気泳動システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて抱合体と抗体の試料（１０μｇ／レーン）を用いた還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図８）。分子量７５、１２５及び１５０ｋＤａでのゲル上のバンドは、鎖間架橋種（それぞれＨＬ、Ｈ_２Ｌ及びＨ_２Ｌ_２）を示した。〜４ＤＭ１／Ａｂを持つＡｂ−スルホ−Ｍａｌ−ＤＭ１抱合体（それぞれ、本方法によるレーン３、及び従来の２工程抱合方法によるレーン３）と〜６ＤＭ１／Ａｂを持つもの（それぞれ、本方法によるレーン５、及び従来の２工程抱合方法によるレーン４）の比較は、本発明で記載された方法によって作製された抱合体（レーン３と５）は、従来の２工程法によって作製された抱合体（レーン２と４）よりも高分子量架橋種の比率がはるかに少ないことを明らかに示している。

本発明で記載された方法を用いて調製した抗体−スルホ−Ｍａｌ−ＤＭ１抱合体のタンパク質ＬａｂＣｈｉｐ電気泳動解析（還元条件下）は、（総タンパク質の）７０％及び２８％の比率で予想された重鎖及び軽鎖の主要バンドを示したが、それらは、それぞれ、６５％及び３０％の非抱合抗体についてのものに類似する（図９）。それに対して、従来の２工程抱合方法を用いて調製した抱合体は、それぞれ、たった５３％及び２３％の重鎖バンド及び軽鎖バンドしか示さず、主要なバンドは多分鎖間架橋による９９〜１５２ｋＤａに及ぶ高い分子量のものだった。定量的なタンパク質ＬａｂＣｈｉｐ解析に基づいて、本
出願で記載された方法によって調製した抱合体は、従来の２工程法を用いて調製したものに比べて、鎖間架橋の欠如という点ではるかに優れている（図９）。

サイズ排除ＬＣ／ＭＳ分析によって、本発明に記載された方法により作製された類似薬剤負荷を伴ったＡｂ−スルホ−Ｍａｌ−ＤＭ１抱合体と従来の２工程法によるものを比較した（図１０）。本発明に記載された方法により作製された抱合体は、Ａｂ−（リンカー−ＤＭｘ）_ｎに等しい質量を持つピークの予想された分布のみを含有する所望のＭＳスペクトルを示す。従来の２工程法を用いて作製された抱合体の場合、スペクトルにおける主要ピークはすべて、所望のＡｂ−（リンカー−ＤＭｘ）_ｎ部分に加えて、１以上の加水分解された又は架橋されたリンカー断片を含有する。従来の２工程反応の順序におけるマレイミドの鎖間架橋又は水性不活化の推定上のメカニズムを図１７に示すが、それによれば、ヘテロ２官能性リンカーとの抗体の最初の反応から取り込まれたマレイミド（又はハロアセトアミド）残基が、分子内（又は分子間）のヒスチジン、リジン、チロシン又はシステイン残基と反応し、その結果、鎖間架橋を生じ得る、又は最初に取り込まれたマレイミド（又はハロアセトアミド）残基が、不活化する（たとえば、加水分解的マレイミド環の切断若しくはマレイミドへの水性添加によって）ので、チオールを持ったエフェクター基若しくはリポーター基との迅速な反応に利用できなくなり得る。従って、ＬＣ−ＭＳ分析は、本発明で記載された方法が、抗体に結合する加水分解された又は架橋されたリンカーをほとんど含まない又は含まない均質な抱合体を産生する利点を有することを明らかに示す。

抗原を発現しているＣＯＬＯ２０５細胞を用いてフローサイトメトリーによって、本発明で記載された方法によって調製した、抗体分子（平均）当たり５．６のマイタンシノイド負荷を持った抗ＣａｎＡｇ抗体−スルホ−Ｍａｌ−ＤＭ１抱合体の結合を測定し、非抱合の抗体のそれと類似していることが分かったということは、抱合体が、抗体の標的抗原への結合に影響をおよぼさなかったことを示唆している（図１１）。ＣａｎＡｇ抗原を発現しているＣＯＬＯ２０５結腸癌細胞を用いて試験管内で、本発明で記載された方法によって調製した抗ＣａｎＡｇ抗体−スルホ−Ｍａｌ−ＤＭ１抱合体の細胞傷害性活性を測定した（図１２）。ウシ胎児血清を含有する細胞培養培地にて９６穴プレートに約１０００個／ウェルで抗原発現癌細胞を入れ、種々の濃度のＡｂ−ＤＭｘ抱合体に暴露した。抱合体への暴露の５日後、ＷＳＴ−８アッセイ（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、残っている生細胞を測定した。図１２に示されるように、本方法を用いて調製した抗ＣａｎＡｇ抗体−スルホ−Ｍａｌ−ＤＭ１抱合体は、ＣａｎＡｇ抗原を発現するＣＯＬＯ２０５結腸癌細胞に対して低濃度で高度に強力だった。この抱合体の細胞傷害性は、過剰の非抱合抗体との競合によって阻止され得たので、特異的だった。

本発明に記載された方法を用いた抱合の代替方法は、ＤＭｘとヘテロ２官能性リンカーの最初の反応の完了後（抗体に反応混合物を加える前）、マレイミド又はハロアセトアミド試薬（たとえば、４−マレイミド酪酸、３−マレイミドプロピオン酸、Ｎ−エチルマレイミド又はヨードアセトアミド又はヨード酢酸）を用いた任意のクエンチ工程を含んで、抗体とＤＭｘチオールの望ましくない反応を防ぐために過剰なＤＭｘチオール基をクエンチした。具体例では、ＤＭｘとヘテロ２官能性リンカーの最初の反応の完了後（抗体に反応混合物を加える前）、４−マレイミド酪酸を加えて、抱合反応の間、抗体とＤＭｘチオールの望ましくない反応を防ぐために過剰なＤＭｘチオール基をクエンチした。過剰なＤＭ４（３ｍＭ）を含有するＤＭ４とスルホ−Ｍａｌ−ＮＨＳへテロ２官能性試薬の反応混合物に、へテロ２官能性試薬のマレイミド基への所望のＤＭ４チオールのカップリングの完了の際、２倍モル過剰の４−マレイミド酪酸を常温で２０分間反応混合物に加えて、最初のカップリング反応から残ったＤＭ４をクエンチした。反応混合物を精製することなく、４ｍｇ／ｍＬのＡｂ、９０％の水性リン酸緩衝液／１０％ＤＭＡ、（ｐＨ７．５）とい
う最終抱合条件下にてリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）の抗体溶液とアリコートを混合した。常温にて２時間、抱合反応を進めた。ｐＨ７．５のリン酸緩衝液で平衡化したＧ２５ゲル濾過を用いて過剰の小分子ＤＭ４とリンカー反応物から抗体／ＤＭ４の抱合体を精製した。ｐＨ７．５の緩衝液で抱合混合物を４℃にて２日間保持して、非共有結合で又は不安定な結合で抗体に結合したＤＭｘ種を解離させた。次いでｐＨ５．５のヒスチジン／グリシン緩衝液で抱合体を一晩透析し、次いで最終保存のために０．２２μｍのフィルターで濾過した。２５２ｎｍと２８０ｎｍで抱合体の吸収を測定し、これら２つの波長でのＤＭ４と抗体の既知の吸光係数を用いて最終的な抱合体における抗体分子当たりのＤＭ４分子の平均数を測定した。４〜１２％のＢｉｓＴｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にＮｕＰａｇｅ電気泳動システムを用いた非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって抱合体試料を解析した。熱変性した試料を１０μｇ／レーンで負荷した。本発明で記載された方法を用い（クエンチなしで）調製した抱合体の非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、軽鎖バンド（約２５ｋＤａ）と半々抗体バンド（重鎖−軽鎖；約７５ｋＤａ）の証拠を示した（図１８）。他方、本発明で記載された方法で調製し、４−マレイミド酪酸で処理した（過剰のＤＭｘチオールを覆った）抱合体は、有意に低い量のこれら望ましくないバンドを有した（未修飾の抗体試料に匹敵するレベル）。４−マレイミド酪酸のようなチオールのクエンチ剤によるＤＭｘとヘテロ２官能性リンカーの最初の反応（抗体との抱合の前）のクエンチの別の利点は、抗体の抱合反応の間、「遊離の」ＤＭｘ種（ＤＭ１又はＤＭ４）がないので、精製後の最終抱合体が「遊離の」又は非抱合のＤＭｘ種を含有しないことである。４−マレイミド酪酸（又はそのほかの極性のチオールクエンチ試薬）とのＤＭｘ付加体はＤＭｘよりも水溶性なので、共有結合した抗体／ＤＭｘの抱合体からさらに分離し易い。

実施例３．スルホ−ＮＨＳ−ＳＭＣＣリンカー（図１３）を用いたマイタンシノイド（ＤＭ１／ＤＭ４）による抗体の抱合
３０〜６０ｍＭの濃度でＤＭＡにて、ＤＭ１又はＤＭ４チオール（ＤＭｘ）及びスルホ−ＮＨＳ基を伴ったスルホ−ＳＭＣＣへテロ２官能性リンカー（Ｐｉｅｒｃｅ Ｅｎｄｏｇｅｎから購入、図１３）のストック溶液を作製した。４０％ｖ／ｖまでの水性２００ｍＭのコハク酸緩衝液、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ５．０を含有するＤＭＡにてリンカーとＤＭ１又はＤＭ４チオールを一緒に混合して１．６：１のＤＭ１又はＤＭ４（ＤＭｘ）とリンカーの比率と６ｍＭの最終濃度を得た。混合した後、反応物を常温で１〜４時間放置し、次いで反応混合物のアリコートを１０倍に希釈して、マレイミドがすべて反応したかどうかを評価するために３０２〜３２０ｎｍで吸収を測定した（３０２ｎｍと２５２ｎｍでモニターする吸収によって、反応混合物の凍結アリコートの追加の逆相ＨＰＬＣ解析を後で行って、抗体に反応混合物を添加した時点でのリンカーマレイミドの完全な消失と所望のスルホ−ＮＨＳ−リンカー−Ｍａｌ−ＤＭｘ試薬の形成を検証した）。ＵＶによってさらなるマレイミドが存在しなかった場合、４ｍｇ／ｍＬのＡｂ、９０％のリン酸緩衝液／１０％ＤＭＡ、ｐＨ７．５という最終抱合条件下にてリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）における抗体の水溶液に、反応物のアリコートを加えた。抱合反応を常温にて２時間進めた。ｐＨ７．５のリン酸緩衝液（水性）で平衡化したＧ２５ゲル濾過カラムを用いて、過剰な未反応試薬と過剰なＤＭｘからＡｂ−ＤＭｘの抱合体を精製した。ｐＨ７．５の緩衝液で抱合体を４℃にて２日間保持して、非共有結合で又は不安定な結合で抗体に結合したＤＭｘ種を解離させた。次いでｐＨ５．５のヒスチジン／グリシン緩衝液で抱合体を一晩透析し、次いで最終保存のために０．２２μｍのフィルターで濾過した。２５２ｎｍと２８０ｎｍで抱合体の吸収を測定し、これら２つの波長でのＤＭｘと抗体の既知の吸光係数を用いて最終的な抱合体における抗体分子当たりのＤＭｘ分子の数を測定した。

比較のために、従来の２工程抱合方法を用いてＡｂ−ＳＭＣＣ−ＤＭｘ抱合体を調製した。スルホ−ＮＨＳ基を持つ過剰なヘテロ２官能性スルホ−ＳＭＣＣリンカー（Ｐｉｅｒｃｅ Ｅｎｄｏｇｅｎから購入）によって、９５％ｐＨ６．５のリン酸緩衝液／５％ＤＭＡにおける濃度８ｍｇ／ｍＬの抗体（Ａｂ）を修飾した。２５℃にて２時間、反応を進行
させた後、Ｇ２５クロマトグラフィを用いて、修飾した抗体を過剰な未反応リンカーから精製した。精製されたＡｂの回収を２８０ｎｍでのＵＶの吸収によって測定した。少量の修飾抗体アリコートを用いて、マレイミドに対して過剰に加えられる既知の量のチオール（たとえば、２−メルカプトエタノール）を添加して修飾抗体におけるマレイミド残基と反応させ、次いでＤＴＮＢを用いたＥｌｌｍａｎのアッセイによって残りのチオールを測定すること（４１２ｎｍでのＴＮＢチオレートの吸光係数は、１４１５０Ｍ^−１ｃｍ^−１：Riddles, P. W. et al, Methods Enzymol., 1983, 91, 49-60; Singh, R., Bioconjugate Chem., 1994, 5, 348-351）によって、修飾された抗体における結合したマレイミド基の数を測定した。９５％のｐＨ６．５リン酸緩衝液／５％ＤＭＡにおける２．５ｍｇ／ｍＬの抗体濃度にて、修飾されたＡｂのＤＭ１又はＤＭ４チオールによる抱合を行い、Ａｂにて結合したマレイミドのモル当たり、１．７モル当量のＤＭ１又はＤＭ４チオールを加えた。１８℃で８〜２４時間放置し、Ｇ２５クロマトグラフィを介して過剰で未反応のＤＭ１（又はＤＭ４）から抱合体を分離した。精製後、ｐＨ６．５の緩衝液にて４℃で２日間、抱合体を保持し、弱く結合したＤＭ１／ＤＭ４種を加水分解させた。その後、ヒスチジン／グリシン緩衝液ｐＨ５．５に対して抱合体を一晩透析し、最終保存のために０．２２μｍのフィルターで濾過した。２５２ｎｍと２８０ｎｍにて抱合体の吸収を測定し、これら２つの波長でのＤＭ１／ＤＭ４とＡｂについての既知の吸光係数を用いることによって最終的な抱合体におけるＡｂ分子当たりのＤＭ１又はＤＭ４の分子の数を測定した。

ＮｕＰａｇｅ４〜１２％、ＢｉｓＴｒｉｓミニゲル及びＮｕＰＡＧＥＭＯＰＳ−ＳＤＳ泳動緩衝液を伴ったＮｕＰａｇｅ電気泳動システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて抱合体と抗体の試料（１０μｇ／レーン）にて還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図１４）。分子量７５、１２５及び１５０ｋＤａでのゲル上のバンドは、鎖間架橋種（それぞれＨＬ、Ｈ_２Ｌ及びＨ_２Ｌ_２）を示した。３．１Ｄ／Ａｂを伴ったＡｂーＳＭＣＣ−ＤＭ１抱合体（それぞれ本方法によるレーン４、及び従来の２工程法によるレーン３）の比較は、本発明に記載された方法を介して作製された抱合体（レーン４）の方が、従来の２工程法によって作製された抱合体（レーン３）よりもはるかに少ない高分子量の架橋種を有することを明らかに示している。

本発明で記載された方法を用いて調製した抗体−ＳＭＣＣ−ＤＭ１抱合体のタンパク質ＬａｂＣｈｉｐ電気泳動解析（還元条件下）は、（総タンパク質の）６７％及び３０％の重鎖及び軽鎖の主要バンドを示したが、それらは、それぞれ、６８％及び３０％の非抱合抗体についてのものに類似する（図１５）。それに対して、従来の２工程抱合方法を用いて調製した抱合体は、それぞれ、たった５４％及び２４％の重鎖バンド及び軽鎖バンドしか示さず、主要なバンドは多分鎖間架橋による９６〜１４８ｋＤａに及ぶ高い分子量のものだった。定量的なタンパク質ＬａｂＣｈｉｐ解析に基づいて、本出願で記載された方法によって調製した抱合体は、従来の２工程法を用いて調製したものに比べて、鎖間架橋の欠如という点ではるかに優れている（図１５）。

サイズ排除ＬＣ／ＭＳ分析によって、本発明に記載された方法により作製された類似薬剤負荷を伴ったＡｂ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１抱合体と従来の２工程法によるものを比較した（図１６）。本発明に記載された方法により作製された抱合体は、Ａｂ−（リンカー−ＤＭｘ）_ｎに等しい質量を持つピークの予想された分布のみを含有する所望のＭＳスペクトルを示す。従来の２工程法を用いて作製された抱合体の場合、スペクトルは、所望のＡｂ−（リンカー−ＤＭｘ）_ｎ種に加えて、不活性化されたマレイミド及び架橋されたリンカー断片を含有する追加の種を含む種の非均質混合物を示す。従来の２工程反応の順序における鎖間架橋及びマレイミドの不活化の推定上のメカニズムを図１７に示すが、それによれば、ヘテロ２官能性リンカーとの抗体の最初の反応から取り込まれたマレイミド（又はハロアセトアミド）が、分子内（又は分子間）のヒスチジン、リジン、チロシン又はシステイン残基と反応し、その結果、鎖間架橋を生じ得る、又は最初に取り込まれたマレイミド
（又はハロアセトアミド）残基が、チオールを持つＤＭ１又はＤＭ４（ＤＭｘ）剤との反応工程の前にマレイミドの加水分解又は水和によって不活化され得る。従って、ＬＣ−ＭＳ分析は、本発明で記載された方法が、抗体に結合する不活化されたマレイミド又は架橋されたリンカーをほとんど含まない又は含まない均質な抱合体を産生する利点を有することを明らかに示す。

実施例４．本方法（図１９）による切断可能なジスルフィドリンカーを伴ったＤＭ１／ＤＭ４（ＤＭｘ）による抗体の抱合
３０〜６０ｍＭの濃度でＤＭＡにて、ＤＭ１又はＤＭ４チオール（ＤＭｘ）及びヘテロ２官能性リンカー、４−（２−ピリジルジチオ）ブタン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＰＤＢ）を含有するストック溶液を作製した。４０％ｖ／ｖまでの水性２００ｍＭのコハク酸緩衝液、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ５．０を含有するＤＭＡにてリンカーとＤＭｘチオールを一緒に混合して１．６：１のＤＭ１又はＤＭ４（ＤＭｘ）とリンカーの比率と８ｍＭの最終濃度を得た。混合した後、反応物を常温で１時間放置し、次いで反応物のアリコートを４ｍｇ／ｍＬのＡｂ、９０％のリン酸緩衝液（水性）／１０％ＤＭＡ、ｐＨ７．５という最終抱合条件下にてリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）における抗体の水溶液に加えた。抱合反応を常温にて２時間進めた。ｐＨ７．５のリン酸緩衝液（水性）で平衡化したＧ２５ゲル濾過カラムを用いて、過剰な未反応試薬と過剰なＤＭｘからＡｂ−ＤＭｘの抱合体を精製した。ｐＨ７．５の緩衝液で抱合体を４℃にて２日間保持して、非共有結合で又は不安定な結合で抗体に結合したＤＭｘ種を解離させた。次いでｐＨ５．５のヒスチジン／グリシン緩衝液で抱合体を一晩透析し、次いで最終保存のために０．２２μｍのフィルターで濾過した。２５２ｎｍと２８０ｎｍで抱合体の吸収を測定し、これら２つの波長でのＤＭｘと抗体の既知の吸光係数を用いて最終的な抱合体における抗体分子当たりのＤＭｘ分子の数を測定した。

実施例５．本方法（図２０）を用いたジスルフィドリンカーと切断不能なリンカーの双方による抗体−ＤＭ１／ＤＭ４（Ａｂ−ＤＭｘ）抱合体の調製
３０〜８０ｍＭの濃度でＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）にてＤＭ１又はＤＭ４（ＤＭｘ）チオール及びＮＨＳ−ＰＥＧ_ｎ−マレイミドヘテロ２官能性リンカーのストック溶液を作製した。４０％ｖ／ｖまでの水性２００ｍＭのコハク酸緩衝液、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ５．０を含有するＤＭＡにてＮＨＳ−ＰＥＧ_４−マレイミドリンカーとＤＭｘチオールを一緒に混合して１．６：１のＤＭｘとリンカーのモル比と８ｍＭに等しいＤＭｘの最終濃度を得た。反応混合物を常温で２時間放置した。別に並行した反応で、１時間の反応時間を除いてＮＨＳ−ＰＥＧ_４−マレイミドの反応に用いた条件と同様に、ＳＰＤＢとＤＭＸチオールを一緒に混合した。双方の反応の終了後、精製しないで、等量のＰＥＧ_４−Ｍａｌ−ＤＭ４混合物とＳＰＤＢ−ＤＭ４混合物を合わせた。合わせた反応混合物のアリコートを精製することなく、４ｍｇ／ｍＬのＡｂ、９０％のリン酸緩衝液（水性）／１０％ＤＭＡ、ｐＨ７．５という最終抱合条件下にてリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）における抗体の水溶液に加えた。抱合反応を常温にて２時間進めた。ｐＨ７．５のリン酸緩衝液（水性）で平衡化したＧ２５ゲル濾過カラムを用いて、過剰な未反応試薬と過剰なＤＭｘからＡｂ−ＤＭｘの抱合体を精製した。ｐＨ７．５の緩衝液で抱合体を４℃にて２日間保持して、非共有結合で又は不安定な結合で抗体に結合したＤＭｘ種を解離させた。次いでｐＨ５．５のヒスチジン／グリシン緩衝液で抱合体を一晩透析し、次いで最終保存のために０．２２μｍのフィルターで濾過した。２５２ｎｍと２８０ｎｍで抱合体の吸収を測定し、これら２つの波長でのＤＭｘと抗体の既知の吸光係数を用いて最終的な抱合体における抗体分子当たりのＤＭｘ分子の数を測定した。

抱合体をＤＴＴ（ジチオスレイトール）処理してジスルフィド結合を還元する前と後で抗体当たりのＤＭｘの比率（Ｄ／Ａ）を比較することによって、本発明に記載された方法によって作製されたＡｂ−（混合ＳＰＤＢとＰＥＧ_４−Ｍａｌリンカー）−ＤＭｘ抱合体
を調べ、切断不能なリンカーに対する切断可能なリンカーの取り込み比率を割り出した。ＤＴＴ還元の間、反応ｐＨを７．５に維持するために、抱合体を先ず、２５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５に対して透析した。次いで３７℃にて２０分間、２５ｍＭのＤＴＴと反応させることによって抱合体を還元した。ＤＴＴ反応の後、２５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５で平衡化したＧ２５ゲル濾過を用いて反応混合物から、放出されたＤＭｘとＤＴＴを分離した。２５２ｎｍと２８０ｎｍで抱合体の吸収を測定し、これら２つの波長でのＤＭｘと抗体の既知の吸光係数を用いて精製した生成物における抗体分子当たりのＤＭｘ分子の数を測定した。ＤＴＴ処理した抱合体のＤ／ＡとＤＴＴ処理しなかった抱合体のＤ／Ａの比率を用いて、切断不能な結合を介してＡｂに結合したＤＭｘの比率を算出した。２つの追加の試料、Ａｂ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４抱合体とＡｂ−ＰＥＧ_４−Ｍａｌ−ＤＭ４抱合体をそれぞれ、陽性対照と陰性対照としてＤＴＴで処理した。ＤＴＴ処理の前と後でのＤ／Ａを比較することによって、対照の切断不能なＡｂ−ＰＥＧ_４−Ｍａｌ−ＤＭ４抱合体は、ほぼすべてのリンカーが予想どおり切断不能であると思われることを示した。本発明に記載された方法によって作製された切断不能なリンカーとジスルフィドリンカーの双方を含有するＡｂ−（混合ＳＰＤＢとＰＥＧ_４−Ｍａｌリンカー）−ＤＭｘ抱合体は、すべて切断可能なリンカーから成るＡｂ−ＳＰＤＢ−ＤＭＸ抱合体からのＤＭｘ喪失の量に比べて、ＤＴＴ処理によって切断されるＤＭｘが４１％少なかった。このことは、本発明に記載された方法によって作製されたＡｂ−（混合ＳＰＤＢとＰＥＧ_４−Ｍａｌリンカー）−ＤＭｘ抱合体がほぼ４０％の切断不能なリンカーと６０％の切断可能なリンカーから構成されることを実証した。切断不能なリンカー試薬と切断可能なリンカー試薬の最初の比率を変えることによって、切断不能なリンカーと切断可能なリンカーの様々な比率で、マイタンシノイド又はそのほかのエフェクターとの抗体の抱合体を調製することができる。図２１は、上述の脱グリコシル化抱合体の質量スペクトルを示すが、それは、ジスルフィドリンカー（ＳＰＤＢ）と切断不能なリンカー（ＰＥＧ）の双方を介して結合した抗体分子当たり平均３．５のマイタンシノイド分子を伴った抗体で構成される。ＭＳは、切断可能なリンカーと切断不能なリンカーの双方を持つ別々の抱合体種を示す（図２１）。たとえば、Ｄ２−ＰＥＧ−ＳＰＤＢと名付けられた抱合体のピークは、ジスルフィド結合したマイタンシノイド分子１つと切断不能なチオエーテル結合したマイタンシノイド分子１つを持ち；Ｄ３−ＰＥＧ−２ＳＰＤＢと名付けられた抱合体のピークは、ジスルフィド結合したマイタンシノイド分子２つと切断不能なチオエーテル結合したマイタンシノイド分子１つを持ち；Ｄ３−２ＰＥＧ−２ＳＰＤＢと名付けられた抱合体のピークは、ジスルフィド結合したマイタンシノイド分子１つと切断不能なチオエーテル結合したマイタンシノイド分子２つを持つ。

実施例６．ＳＭＣＣリンカー（図２２）を用いたマイタンシノイドによる抗体の抱合
３０〜６０ｍＭの濃度でＤＭＡにて、ＤＭ１チオール及びＳＭＣＣへテロ２官能性リンカー（Ｐｉｅｒｃｅ）のストック溶液を作製した。５０％ｖ／ｖまでの２００ｍＭの水性コハク酸緩衝液、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ５．０を含有するＤＭＡにてリンカーとＤＭ１チオールを一緒に混合して１．４：１のＤＭ１とリンカーの比率と１〜６ｍＭのＤＭ１の最終濃度を得た。混合した後、反応物を常温で４時間まで放置し、次いで反応混合物のアリコートを１０倍に希釈して、マレイミドがすべてチオールと反応したかどうかを評価するために３０２〜３２０ｎｍで吸収を測定した。ＵＶによってさらなるマレイミドが存在しなかった場合、２．５ｍｇ／ｍＬのＡｂ、７０〜８０％のリン酸緩衝液（水性）／３０〜２０％％ＤＭＡ（ｖ／ｖ）という最終抱合条件下にてリン酸緩衝液（ｐＨ７．５〜８．５）における抗体の水溶液に、反応混合物のアリコートを加えた。抱合反応を常温にて３時間進めた。ｐＨ７．４のリン酸緩衝液（水性）で平衡化したＧ２５ゲル濾過カラムを用いて、過剰な未反応又は加水分解された試薬と過剰なＤＭ１からＡｂ−ＤＭ１の抱合体を精製した。ｐＨ７．４のリン酸緩衝液（水性）で抱合体を一晩透析し、次いで最終保存のために０．２２μｍのフィルターで濾過した。２５２ｎｍと２８０ｎｍで抱合体の吸収を測定し、これら２つの波長でのＤＭ１と抗体の既知の吸光係数を用いて最終的な抱合体に
おける抗体分子当たりのＤＭ１分子の数を測定した。同様に、ＤＭ４チオール及びＳＭＣＣによる抗体の抱合体を調製することができる。ＳＭＣＣリンカーを用いたＤＭ１又はＤＭ４による抗体の抱合体は、チオエーテルの切断不能なリンカーを含有する。

本発明に記載された方法によって作製されたＡｂ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１抱合体は、脱グリコシル化抱合体のＭＳ解析を特徴とした（図２３）。本発明に記載された方法によって作製された抱合体は、Ａｂ−（リンカー−ＤＭ１）_ｎに等しい質量を持つピークの予想された分布を含有する所望のＭＳスペクトルを示した。

実施例７．へテロ２官能性のジスルフィドを含有するリンカー（ＳＳＮＰＢ、ＳＰＰ）を用いたマイタンシノイドによる抗体の抱合
ジスルフィド含有のヘテロ２官能性リンカー、ＳＳＮＰＢ（Ｎ−スルホスクシンイミジル−４−（５−ニトロ−２−ピリジルジチオ）ブチレート）及びＳＰＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）を用いて、実施例４でＳＰＤＢリンカーについて記載されたものと似た方法によって、ジスルフィド結合の抗体／マイタンシノイド抱合体を調製した。ＳＰＤＢを用いて調製したジスルフィド結合の抱合体の構造（図１９）はＳＳＮＰＢによって調製した抱合体のそれ（図２４）と同一である。ＳＰＤＢを用いて調製したジスルフィド結合の抱合体のＭＳは、抗体に結合した様々な数のマイタンシノイド分子に相当する質量値を持つ別々のピークを示した。

実施例８．直鎖アルキル炭素鎖を持つ切断不能なリンカーを含有するマイタンシノイドによる抗体の抱合
実施例６でＳＭＣＣリンカーについて記載された方法に類似する、マイタンシノイドと直鎖アルキル炭素さを持つヘテロ２官能性リンカーの反応混合物を用いて、直鎖アルキル炭素鎖を持つ切断不能なリンカーを含有する抱合体を調製した。たとえば、図２６に示されたようなＢＭＰＳ（Ｎ−［β−マレイミドプロピルオキシ］スクシンイミドエステル）又はＧＭＢＳ（Ｎ−［γ−マレイミドブチルオキシ］スクシンイミドエステル）リンカーを用いてＤＭ１を伴ったヒト化抗体の抱合体を調製した。６０％のＤＭＡ／４０％（ｖ／ｖ）の２００ｍＭのコハク酸緩衝液、ｐＨ５におけるＢＭＰＳ又はＧＭＢＳ（８ｍＭ）とＤＭ１チオール（１０．４ｍＭ）を含有する最初の反応混合物は、１５分で確認した場合、マレイミド部分の完全な反応（３０２〜３２０ｎｍでのマレイミドの吸収の衰退に基づく）を示した。２０％のＤＭＡ（ｖ／ｖ）を含有する８０％の水性ＥＰＰＳ緩衝液、ｐＨ８．１における２．５ｍｇ／ｍＬのヒト化抗体溶液に、この反応混合物を２回に分けて、３０分間離して加え、リンカーは合計、抗体と等量の８モル加えた。４時間後、抱合体混合物をゲル精製し、２回の透析に供した。３．８及び５．１のＤＭ１／抗体の比率を持つ抱合体は、７１〜７５％の回収率で、高いモノマー比（９６．２〜９７．６％）で調製した。ＧＭＢＳ又はＢＭＰＳによって調製したこれら抱合体は、ＨＩＳＥＰ ＨＰＬＣ解析によって抱合されなかった遊離の薬剤を示さなかった。図２５に示されるようなＡＭＡＳ（Ｎ−［β−マレイミドアセトキシ］スクシンイミドエステル）又はＥＭＣＳ（Ｎ−［β−マレイミドカプロイルオキシ］スクシンイミドエステル）又はスルホ−Ｈ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＥＭＣＳ）を用いて直鎖アルキル鎖を持つ切断不能なリンカーを含有する類似の抱合体を調製することができる。表１は、本発明で記載された方法によって調製した精選抱合体のモノマー比率を示し、それらはすべてサイズ排除クロマトグラフィ解析によって高いモノマー比率を示した。比較のために、モノマー比率はまた、従来の２工程抱合方法（ヘテロ２官能性リンカーとの抗体の最初の反応、次いでマイタンシノイドチオールとの反応）によって調製した抱合体についても示す。

本明細書は以下の発明の開示を包含する。
［１］溶液における精製された抱合体を調製する方法であって、前記抱合体が、細胞結合剤に連結されたエフェクター分子又はリポーター分子を含み、前記方法が、（ａ）エフェクター分子又はリポーター分子を２官能性リンカー試薬に接触させて該リンカーをエフェクター分子又はリポーター分子に共有結合させ、それによってそれに結合したリンカーを有するエフェクター分子又はリポーター分子を含む未精製の第１の混合物を調製することと、（ｂ）未精製の第１の混合物を細胞結合剤と反応させることによって、それに結合したリンカーを有するエフェクター分子又はリポーター分子に細胞結合剤を抱合させて第２の混合物を調製することと、（ｃ）第２の混合物を接線流濾過、透析、ゲル濾過、吸着クロマトグラフィ、選択的沈殿、又はこれらの組み合わせに供して精製された抱合体を調製することを含む方法。
［２］工程（ｂ）が約４〜約９のｐＨでの溶液で行われる［１］の方法。
［３］工程（ｂ）における第２の混合物が、分子内又は分子間の反応によって形成される望ましくない架橋された、加水分解された種を実質的に含まない［１］の方法。
［４］エフェクター分子が細胞傷害剤である［１］の方法。
［５］細胞傷害剤が、マイタンシノイド、タキサン、ＣＣ１０６５又はこれらの類似体である［４］の方法。
［６］細胞傷害剤がマイタンシノイドである［４］の方法。
［７］マイタンシノイドがチオール基を含む［６］の方法。
［８］マイタンシノイドがＤＭ１である含む［６］の方法。
［９］マイタンシノイドがＤＭ４である含む［６］の方法。
［１０］細胞結合剤が、インターフェロン、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インスリン、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＦＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＭＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ又は抗体である［１］の方法。
［１１］細胞結合剤が抗体である［１０］の方法。
［１２］抗体がモノクローナル抗体である［１１］の方法。
［１３］抗体が、ヒトモノクローナル抗体又はヒト化モノクローナル抗体である［１１］の方法。
［１４］抗体が、ＭＹ９、抗Ｂ４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ１３８、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃｒｉｐｔｏ、アルファ_ｖベータ_３インテグリン、アルファ_ｖベータ_５インテグリン又はＣ２４２である［１０］の方法。
［１５］ヒト抗体又はヒト化抗体が、Ｍｙ９−６、Ｂ４、Ｃ２４２、Ｎ９０１、ＤＳ６、ＥｐｈＡ２、Ｃｄ３８、ＩＧＦ−ＩＲ、ＣＮＴＯ９５、Ｂ−Ｂ４、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ビバツズマブ、シブロツズマブ又はリツキシマブである［１３］の方法。
［１６］リンカーが、切断可能なリンカー又は切断不能なリンカーである［１］の方法。
［１７］リポーター分子が放射性同位元素である［１］の方法。

Claims (15)

1. 以下の式：
   Ｘ−Ｌ−Ｙ’−Ｃ
   （式中、
   Ｘは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）、スルホ−ＮＨＳエステル、ｐ−ニトロフェノールエステル、テトラフルオロスルホネートフェニルエステル、又は１−ヒドロキシ−２−ニトロベンゼン−４−スルホン酸エステルであり；
   Ｌは、置換又は非置換の直鎖、分枝鎖又は環状の１〜１０の炭素原子を持つアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基、単純な又は置換されたアリール単位、又はポリエチレングリコール含有の単位であり；
   Ｙ’は、非還元性チオエーテル結合であり；
   Ｙは、マレイミド又はハロアセトアミドから選択され；
   Ｃは、チオール含有マイタンシノイドである）
   で表される、溶液中の修飾されたマイタンシノイドを調製する方法であって、
   以下の式：
   Ｘ−Ｌ−Ｙ
   で表されるヘテロ２官能性リンカーを、水性溶媒、有機溶媒又は混合された有機／水性反応混合物中で、チオール含有マイタンシノイドと接触させることを含む、前記方法。
2. Ｘが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）、またはスルホ−ＮＨＳエステルである、請求項１に記載の方法。
3. Ｙが、マレイミド、ヨードアセトアミド、またはブロモアセトアミドから選択される、請求項１又は２に記載の方法。
4. チオエーテル結合が、
   

   

   である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. Ｌが、置換又は非置換の直鎖、分枝鎖又は環状のアルキル基であり、ここで当該置換基は、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、フルオロ、カルボキシ、スルホネート、ホスフェート、アミノ、カルボニル、ピペリジノから選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. Ｌが、非置換の直鎖アルキル基または置換の直鎖アルキル基であり、ここで当該置換基は、任意で、カルボニルおよびスルホネートである、請求項５に記載の方法。
7. Ｌが、
   

   

   である、請求項６に記載の方法。
8. Ｌが、置換の環状アルキル基であり、ここで当該置換基はカルボニルである、請求項７に記載の方法。
9. Ｌが、
   

   

   である、請求項８に記載の方法。
10. Ｌが、ポリエチレングリコール含有の単位である、請求項１に記載の方法。
11. ポリエチレングリコール含有の単位が、
    

    

    （式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２である）
    である、請求項１０に記載の方法。
12. マイタンシノイドが、
    

    

    である、請求項１に記載の方法。
13. マイタンシノイドが、
    

    

    である、請求項１に記載の方法。
14. 式Ｘ−Ｌ−Ｙ’−Ｃの修飾されたマイタンシノイドが、以下：
    

    

    から選択される、請求項１〜１１のいずれか1項に記載の方法。
15. 式Ｘ−Ｌ−Ｙ’−Ｃの修飾されたマイタンシノイドが、以下：
    

    

    である、請求項１４に記載の方法。
    

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