CN112794911B - 人源化抗叶酸受体1抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种人源化抗叶酸受体1抗体及其应用。本发明揭示了一种含有独特序列的人源化的抗叶酸受体(Folate Receptor α；FOLR1)的抗体，其能与FOLR1特异性结合并有效抑制FOLR1，可以应用于抑制与FOLR1过表达相关或者是受到FOLR1功能影响的疾病，例如肿瘤。

Description

人源化抗叶酸受体1抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术和药物学领域，更具体地，本发明涉及人源化抗叶酸受体1抗体及其应用。

背景技术

叶酸是DNA合成和修复，以及细胞分裂过程所需的一种必要维生素。叶酸通过结合到细胞表面的叶酸受体，引起受体的内吞从而进入细胞。叶酸受体是一种与糖基化磷脂酰肌醇连接的跨膜单链糖蛋白，与叶酸有高度亲和性，它含有三种亚型，分别是FolateReceptor α(FOLR1)，Folate Receptor β(FOLR2)和Folate Receptor γ(FOLR3)。由于叶酸受体在正常细胞中很少表达，甚至不表达，但是由于肿瘤细胞比正常的体细胞更依赖于叶酸，因此肿瘤细胞上叶酸受体具有明显的高度表达，尤其是FOLR1，在卵巢癌，肺癌，子宫癌，胰腺癌以及睾丸癌等恶性肿瘤中均发现过量表达，因此FOLR1成为了抗癌药物的热门靶点之一。

开发针对FOLR1的抗体相关药物，可以特异地识别肿瘤细胞，从而达到直接或间接杀死肿瘤的作用。Mov19是一个抗人FOLR1的小鼠单克隆抗体，在1987年从杂交瘤细胞中被分离出来(Int J Cancer. 1987 Mar 15;39(3):297-303)，并在1998年其相关的氨基酸序列已经得到了披露(Cancer Res. 1998 Mar 1;58(5):991-996)。本发明是在已有的基础上，对该鼠源的抗体进行人源化改造，主要目的是降低其免疫原性，减少用药过程中在患者体内产生抗药抗体的发生几率，另外，进一步提高了其稳定性，使其具有更好的成药性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人源化抗叶酸受体1抗体及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种抗叶酸受体1抗体，其具有SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的重链可变区，SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的轻链可变区。

在一个优选例中，所述抗叶酸受体1抗体还包括：重链可变区氨基酸序列与SEQ IDNO: 1所示序列具有85%以上(如88%、90%、93%、95%、97%或99%以上)相同性、轻链可变区氨基酸序列与SEQ ID NO: 2所示序列具有85%以上(如88%、90%、93%、95%、97%或99%以上)相同性的抗体，且其具有本发明实施例所述抗体相同功能的抗体；较佳地，该人源化抗体的重链可变区/轻链可变区中，相应于表1中所列举的位点的氨基酸是保守的。

在另一优选例中，所述抗叶酸受体1抗体为人源化的抗体。

在本发明的另一方面，提供一种多核苷酸，其编码所述的抗叶酸受体1抗体。

在本发明的另一方面，提供一种构建体(如表达载体)，其包含所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种抗体表达系统，所述表达系统含有所述的构建体或基因组中整合有外源的所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述抗体表达系统为细胞表达系统。

在本发明的另一方面，提供一种制备所述的抗叶酸受体1抗体的方法，包括：在适合表达所述抗体的条件下，利用所述的抗体表达系统进行表达，从而表达出所述的抗体。

在一个优选例中，所述制备方法还包括：纯化分离出所述抗体。

在本发明的另一方面，提供一种免疫缀合物，其包括：所述的抗体；以及与之连接(包括但不限于共价连接、偶联、附着、吸附)的功能性分子。

在一个优选例中，所述功能性分子包括(但不限于)：细胞毒素，放射性同位素，生物活性蛋白质，靶向肿瘤表面标志物的分子，抑制肿瘤的分子，靶向免疫细胞的表面标志物的分子或可检测标记物，基于嵌合抗原受体技术(CAR)的胞外铰链区、跨膜区及胞内信号区，或其组合。

在另一优选例中，所述靶向肿瘤表面标志物的分子是结合肿瘤表面标志物的抗体或配体。

在另一优选例中，所述的抑制肿瘤的分子是抗肿瘤的细胞因子或抗肿瘤的毒素。

在另一优选例中，所述的抗肿瘤的毒素包括(但不限于)：作用于微管蛋白的毒素，如单甲基澳瑞他汀 (Monomethyl auristatin相关化合物及其衍生物，美登木素生物碱(maytansinoid)相关化合物及其衍生物；作用于DNA的毒素，如duocarmycin，calicheamicin，pyrrolobenzodiazepines(PBDs)，SN-38，Dxd等相关化合物及其衍生物；以及作用于细胞内如代谢，转录，翻译，信号转导等其它功能的相关化合物及其衍生物。

在另一优选例中，所述的细胞因子包括(但不限于)：IL-2、IL-12、IL-15、IFN-beta、TNF-alpha或其变体。

在另一优选例中，所述的可检测标记物包括(但不限于)：荧光标记物、显色标记物。

在另一优选例中，所述的结合肿瘤表面标志物的抗体是识别叶酸受体1以外的其它抗原的抗体，所述的其它抗原包括(但不限于)：EGFR，EGFRvIII，mesothelin，HER2，EphA2，Her3，cMet，EpCAM，MUC1，MUC16，CEA，Claudin 18.2，Claudin 6，WT1，NY-ESO-1，MAGE3，ASGPR1或CDH16。

在另一优选例中，所述的胞内信号区包括(但不限于)：CD3ζ链，FcεRIγ酪氨酸激活基序，共刺激信号分子CD27、CD28、CD137、CD134、MyD88、CD40等的胞内信号区。

在另一优选例中，所述跨膜区包括(但不限于)：CD8或CD28的跨膜区。

在另一优选例中，所述的抗肿瘤的毒素与所述的抗体通过连接子连接，连接子包括(但不限于)mc-vc-PAB（maleimidocaproyl valine-citrulline para-aminobenzyloxycarbonyl）。

在本发明的另一方面，提供一种药物组合物(包括诊断组合物，如诊断试剂)，其包括：所述的抗体或所述的免疫缀合物。

在一个优选例中，所述的药物组合物中还包括药学上可接受的载体。

在本发明的另一方面，提供所述的抗体、所述的免疫缀合物或所述的药物组合物在制备用于诊断或治疗肿瘤的制剂、试剂盒或药盒中的用途。

在一个优选例中，所述的肿瘤是表达叶酸受体1的肿瘤。

在另一优选例中，所述肿瘤包括：卵巢癌，子宫内膜癌，乳腺癌，宫颈癌等。

在本发明的另一方面，提供一种试剂盒或药盒，其中包括所述的抗体、或所述的免疫缀合物、或所述的药物组合物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、本发明对Mov19重链可变区的人源化。

图2、本发明对Mov19轻链可变区的人源化。

图3、本发明人源化Mov19在ELISA上对FOLR1的亲和力。

图4、本发明人源化Mov19在Octet对FOLR1的亲和力。

图5、本发明人源化Mov19在流式细胞术上对FOLR1的亲和力。

图6、本发明人源化Mov19的ADCC功能。

图7、本发明人源化Mov19的DLS结果。

图8、本发明人源化Mov19对于肿瘤细胞的内吞功能。

图9、本发明人源化Mov19的抗体偶联药物对于KB肿瘤细胞的杀伤功能。

图10、本发明人源化Mov19的抗体偶联药物对于T-47D肿瘤细胞的杀伤功能。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，揭示了一种含有独特序列的人源化的抗叶酸受体(Folate Receptor α；FOLR1)的抗体，其能与FOLR1特异性结合并有效抑制FOLR1，可以应用于抑制与FOLR1过表达相关或者是受到FOLR1功能影响的疾病，例如肿瘤。

现有的抗FOLR1抗体Mov19作为一种鼠源抗体，开发成药物时，因其免疫原性的问题，会影响药物在病人体内的药效。本发明人基于该Mov19进行人源化处理及优化改造，尽可能地降低了药物在体内的免疫原性；并且人源化后的抗体，在功能和稳定性上都要显著优于出发抗体。

术语

如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”在本文中用作一般术语，包括全长抗体、单链抗体以及其所有部分、结构域或片段(包括但不限于抗原结合结构域或片段)。此外，本文所用的术语“序列”(例如在“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“单一可变结构域序列”、“VHH序列”或“蛋白序列”等的术语中)一般应理解为既包括相关氨基酸序列，又包括编码所述序列的核酸序列或核苷酸序列，除非本文需要更限定的解释。

术语“单克隆抗体”指单分子组成的抗体分子制备物。单克隆抗体显示对特定表位的单结合特异性和亲和性。

术语“人源化抗体”指具有基本来自非人物种免疫球蛋白的抗原结合位点的分子，其中所述分子其余的免疫球蛋白结构是基于人免疫球蛋白的结构和/或序列。所述抗原结合位点可包含融合到恒定结构域上的完整可变结构域，或者仅包含移植到可变结构域中适当构架区的互补性决定区(CDR)。抗原结合位点可以是野生型的，或者通过一个或多个氨基酸替换进行修饰，例如进行修饰以与人免疫球蛋白更为相近。某些形式的人源化抗体保留了全部CDR序列。其他形式具有一个或多个相对于原始抗体而言发生了改变的CDR。

两个多肽序列之间的“序列相同性”指示序列之间相同氨基酸的百分比。“序列相似性”指示相同或代表保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。用于评价氨基酸或核苷酸之间的序列相同性程度的方法是本领域技术人员已知的。例如，氨基酸序列相同性通常使用序列分析软件来测量。例如，可使用NCBI数据库的BLAST程序来确定相同性。

药剂的“有效量”指引起接受其施用的细胞或组织中的生理学变化所必需的量。

药剂例如药物组合物的“治疗有效量”指在必需的剂量和时间段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。治疗有效量的药剂例如消除、降低、延迟、最小化或预防疾病的不良效果。

“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，驯养的动物( 例如母牛、羊、猫、犬和马)、灵长类( 例如人和非人灵长类如猴)、家兔和啮齿动物( 例如小鼠和大鼠)。优选地，所述个体或受试者是人。

术语“药物组合物”指其形式使得其中含有的活性成分的生物学活性有效，且不含对会接受该组合物施用的受试者有不可接受的毒性的别的成分的制剂。

“药学可接受载体”指药物组合物中活性成分以外对受试者无毒的成分。药学可接受载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

术语“治疗/预防”(及其语法变体)指试图改变治疗个体中疾病的自然进程，并且可以是为了预防或在临床病理学的过程期间实施的临床干预。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓解症状、降低疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、减缓疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态、及免除或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病的形成或延缓病症的进展。

术语“可检测标记物”是指可连接于抗体上的，用于确定待待测对象中特定靶标的存在与否以及存在的量的标志物。所述“可检测标记物”可以是，但不限于：酶、荧光标记、核素、量子点、胶体金等。更具体地例如可选自：辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酯酶(AP)、葡萄糖氧化酶、β–D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶。

本发明中，所述肿瘤为表达叶酸受体1的肿瘤；较佳地，所述肿瘤包括但不仅限于：卵巢癌，子宫内膜癌，乳腺癌，宫颈癌等，或其组合。

抗体

本发明提供一种抗FOLR1抗体，所述抗FOLR1抗体具有SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的重链可变区，SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的轻链可变区。本发明也包括了：重链可变区氨基酸序列与SEQ ID NO: 1所示序列具有85%以上(如88%、90%、93%、95%、97%或99%以上)相同性、轻链可变区氨基酸序列与SEQ ID NO: 2所示序列具有85%以上(如88%、90%、93%、95%、97%或99%以上)相同性的抗体，且其具有本发明实施例所述抗体相同功能的抗体；较佳地，该人源化抗体的重链可变区/轻链可变区中，相应于表1中所列举的位点的氨基酸是保守的。

抗体的抗原结合特性通常由3个互补决定区CDR来决定，所述的CDR区与FR区有序排列，FR区不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，构成了抗体的抗原结合位点。CDR区是免疫学感兴趣的蛋白质的序列，本发明的抗体包括了针对CDR区以及框架区的序列改造。

本发明所提供的抗FOLR1的抗体，可以高效地与人FOLR1特异性结合，可以高效地阻断FOLR1的作用，可以高效地将与之偶联的另一物质携带到目标细胞。

本发明也包括一种抗FOLR1抗体的融合蛋白，包括如本发明所述的抗体的第一结构域和用于延长体内半衰期和/或对效应细胞具有结合作用的第二结构域。所述融合蛋白可以是一种结合分子，所述结合分子能够与表达FOLR1的细胞特异性结合。

所述第二结构域中，用于延长体内半衰期的片段可以包括血清白蛋白或其片段、聚乙二醇、结合血清白蛋白的结构域(如抗血清白蛋白的抗体)、聚乙二醇-脂质体复合体等。所述第二结构域中，对效应细胞具有结合作用的片段可以包括免疫球蛋白Fc区等，优选选自人免疫球蛋白Fc区。所述人免疫球蛋白Fc区中包括用于改变Fc介导的效应功能的突变，所述效应功能包括CDC活性、ADCC活性、ADCP活性中的一种或多种的组合。所述免疫球蛋白可以选自IgG、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM等中的一种或多种的组合，所述IgG具体可以选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型等中的一种或多种的组合。抗体融合蛋白中包含的免疫球蛋白Fc区可以使所述融合蛋白形成二聚体，同时延长所述融合蛋白的体内半衰期和增加Fc介导的相关活性。在本发明一具体实施方式中，所述免疫球蛋白Fc区可以是人IgG1的Fc区，更具体可以是野生型IgG1 Fc序列，所述序列可以被引入用于改变Fc介导的效应功能的突变，例如，a)改变Fc介导的CDC活性的突变；b).改变Fc介导的ADCC活性的突变；或c).改变Fc介导的ADCP活性的突变。此类突变描述于下列文献中：Leonard G Presta，Current Opinion inImmunology 2008，20:460-470;Esohe E.Idusogie et al.，J Immunol 2000，164:4178-4184; RAPHAEL A. CLYNES et al.，Nature Medicine，2000，Volume 6，Number 4:443-446; Paul R. Hinton et al.，J Immunol，2006，176:346-356。

本发明所提供的抗FOLR1抗体的融合蛋白中，所述第一结构域和第二结构域之间可以设有连接肽。所述连接肽可以是通过由丙氨酸(A)和/或丝氨酸(S)和/或甘氨酸(G)组成的柔性多肽链，连接肽的长度可以为3～30个氨基酸，优选为3-9个、9-12个、12-16个、16～20个，在本发明另一具体实施方式中，连接肽的长度可以为8个或15个。

在本发明的具体实施例中，本发明人将鼠源抗体Mov19进行人源化，去掉了抗体CDR以外的鼠源序列。人源化的Mov19虽然在亲和力上跟鼠源的Mov19没有差异，但是在热稳定性，ADCC和内吞等功能上要显著优于鼠源的Mov19。本发明人将所述人源化的Mov19与单甲基澳瑞他汀 (Monomethyl auristatin；MMAE)偶联、制备成抗体偶联药物，结果显示，其对于肿瘤细胞有显著的杀伤效果。

本发明也提供了一种分离的多核苷酸，编码本发明的抗体、或编码所述的融合蛋白，所述多核苷酸可以是RNA、DNA或cDNA等。提供所述分离的多核苷酸的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以通过自动DNA合成和/或重组DNA技术等制备获得，也可以从适合的天然来源加以分离。

构建体及抗体表达系统

本发明也提供了一种构建体，所述构建体含有本发明所述的分离的多核苷酸。所述构建体的构建方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，所述构建体可以通过体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等方法构建获得，更具体的，可以由所述的分离的多核苷酸插入到表达载体的多克隆位点构建而成。本发明中的表达载体通常指本领域熟知的各种市售表达载体等，例如可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。所述载体还可以包括与这所述多核苷酸序列操作性连接的一个或多个调控序列，所述调控序列可以包括合适的启动子序列。启动子序列通常与待表达氨基酸序列的编码序列操作性连接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。调控序列还可以包括合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3’末端相连，在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。

通常来说，合适的载体可以包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记。例如，这些启动子可以是包括但不限于大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、毕赤酵母的甲醇氧化酶启动子和其它一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。标记基因可用于提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，例如，可以是包括但不限于真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性等。当所述的多核苷酸被表达时，表达载体中还可以包括增强子序列，如果在载体中插入增强子序列，则将会使转录得到增强，增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本发明也提供了一种抗体的表达系统，所述表达系统含有本发明所述的构建体或基因组中整合有外源的本发明所述的多核苷酸。任何适用于表达载体进行表达的细胞都可以作为宿主细胞，例如，所述宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞，具体可以是包括但不限于大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母、丝状真菌、植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、HEK293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等中的一种或多种的组合。构建所述表达系统的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以是包括但不限于显微注射法、基因枪法、电穿孔法、病毒介导的转化法、电子轰击法、磷酸钙沉淀法等中的一种或多种的组合。

免疫缀合物

本发明也提供了一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包括本发明所述的抗体、或本发明所述的融合蛋白。所述免疫缀合物通常还包括与所述抗体活融合蛋白连接(包括但不限于共价连接、偶联、附着、吸附)的功能性分子，所述功能性分子可以是包括但不限于可检测标记物、细胞毒素、放射性同位素、生物活性蛋白质、靶向肿瘤表面标志物的分子，抑制肿瘤的分子，靶向免疫细胞的表面标志物的分子等，或它们的组合。

制备所述免疫缀合物的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以将所述抗体和/或融合蛋白与功能性分子直接或通过合适长度的间隔物进行连接，连接方式可以是化学交联或基因工程融合表达，从而获得所述免疫缀合物。

为了治疗目的，与治疗效应物基团例如放射性基团可能是合适的，这些放射性基团即由放射性同位素或放射性核素(例如³H、¹⁴C、¹⁵N、³³P、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹ln、¹²³l、¹²⁵l、¹³¹l、²⁰¹TI、²¹³Bi)、毒素或细胞毒性基团例如细胞生长抑制剂组成或包括其的基团。

所述免疫缀合物可包含本发明的抗体或融合蛋白以及可检测标记物。所述的可检测标记物包括但不限于：荧光标记物、显色标记物、蛋白标签；如：酶、辅基、荧光材料、发光材料，生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属以及非放射性顺磁性金属离子。也可包含一个以上的标记物。为了检测和/或分析和/或诊断目的用于标记抗体的标记依赖于使用的特定检测/分析/诊断技术和/或方法例如免疫组织化学染色(组织)样品、流式细胞计量术等。对于本领域已知的检测/分析/诊断技术和/或方法合适的标记为本领域技术人员所熟知。

本发明的抗体或融合蛋白可以与标记基团(标记的多肽)偶联，然后可以使用其例如用于诊断目的。合适的标记基团可以选自放射性同位素(例如上文提到的那些)或含有放射性同位素、放射性核素的基团、荧光基团(例如荧光蛋白例如GFP、RFP等、染料、罗丹明、荧光素及其衍生物例如FITC、花青染料)、酶基团(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶)、化学发光基团、生物素基团、金属颗粒(例如金颗粒)、磁性颗粒(例如具有含有磁铁矿(Fe₃O₄)和/或磁赤铁矿(Fe₂O₃)的核心)、预定的多肽基团等。

所述免疫缀合物可包含本发明的抗体或融合蛋白以及靶向免疫细胞的表面标志物的分子。所述靶向免疫细胞的表面标志物的分子可识别免疫细胞，其携带本发明的抗体达到免疫细胞，同时本发明的抗体可将免疫细胞靶向于肿瘤细胞，从而在利用本发明的抗体的杀伤效应的同时，还引发免疫细胞特异性地杀伤肿瘤。

所述免疫缀合物可包含本发明的抗体或融合蛋白以及至少一种靶向肿瘤表面标志物的分子或抑制肿瘤的分子。所述的抑制肿瘤的分子可以是抗肿瘤的细胞因子，或抗肿瘤的毒素。例如，所述的细胞因子可以是但不限于：IL-2、IL-12、IL-15、IFN-beta、TNF-alpha等。所述的靶向肿瘤表面标志物的分子例如可以与本发明的抗体协同作用，更精准地靶向肿瘤细胞。

所述免疫缀合物还可以是嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)，所述嵌合抗原受体可表达于免疫细胞。所述的“免疫细胞”与“免疫效应细胞”可互换使用，其包括：T淋巴细胞，NK细胞或NKT细胞等，优选的，为NK细胞和T淋巴细胞。所述的嵌合抗原受体一般包含顺序连接的：胞外结合区、跨膜区和胞内信号区，其中所述胞外结合区包含本发明的抗体或融合蛋白。基于CAR技术的跨膜区和胞内信号区的设计是本领域公知的：例如跨膜区采用CD8，CD28等分子的跨膜区，胞内信号区采用免疫受体酪氨酸活化基序 (ITAM)CD3ζ链或FcεRIγ酪氨酸激活继续及共刺激信号分子CD28、CD27、CD137、CD134、MyD88、CD40等的胞内信号区。更具体地，针对T淋巴细胞，胞内信号区仅包含ITAM的为第一代CAR T淋巴细胞，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-ITAM，可以激发抗肿瘤的细胞毒性效应；第二代CAR T淋巴细胞加入了CD28或CD137(又名4-1BB)的胞内信号区，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-CD28 -ITAM或scFv-TM-/CD137-ITAM；胞内信号区发生的B7/CD28或4-1BBL/CD137共刺激作用引起T淋巴细胞的持续增殖，并能够提高T淋巴细胞分泌IL-2和IFN-γ等细胞因子的水平，同时提高CAR T在体内的存活周期和抗肿瘤效果；第三代CAR T淋巴细胞，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-CD28-CD137-ITAM或scFv-TM-CD28-CD134-ITAM，进一步提高了CAR T在体内的存活周期和其抗肿瘤效果。

根据上述，应用本发明的抗体或融合蛋白制备的嵌合抗原受体可以是包括如下的顺序连接的胞外结合区、跨膜区和胞内信号区：本发明的抗体或融合蛋白、CD8和CD3ζ；本发明的抗体或融合蛋白、CD8、CD137和CD3ζ；本发明的抗体或融合蛋白、CD28分子的跨膜区(CD28a)、CD28分子的胞内信号区(CD28b)和CD3ζ；或本发明的抗体或融合蛋白、CD28分子的跨膜区、CD28分子的胞内信号区、CD137和CD3ζ。

将该嵌合抗原受体表达于免疫效应细胞的表面，在利用本发明的抗体的杀伤效应的同时，还可使得免疫效应细胞对表达FOLR1的肿瘤细胞具有高度特异性的细胞毒性作用。

作为本发明的优选方式，可将本发明的抗体与抑制肿瘤的分子相连接，较佳地所述抑制肿瘤的分子为抗肿瘤的毒素，包括作用于微管蛋白的毒素，如单甲基澳瑞他汀(Monomethyl auristatin)相关化合物及其衍生物，美登木素生物碱(maytansinoid)相关化合物及其衍生物；作用于DNA的毒素，如duocarmycin，calicheamicin，pyrrolobenzodiazepines(PBDs)，SN-38，Dxd等相关化合物及其衍生物；以及作用于细胞内如代谢，转录，翻译，信号转导等其它功能的相关化合物及其衍生物。本发明也包括这些作为毒素的小分子化合物的类似物、异构体、前体等。

药物组合物及试剂盒

本发明也提供了一种药物组合物，包括本发明的抗FOLR1抗体、或本发明的抗FOLR1抗体的融合蛋白、或本发明的免疫缀合物。

所述药物组合物中还可以包括各种本领域药学上可接受的载体。药学上可接受的载体在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，具体可以是包括但不限于：缓冲剂，如乙酸盐、Tris、磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯己双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烃基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；蛋白质，如血清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；张力调节剂，诸如海藻糖和氯化钠；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；表面活性剂，如聚山梨醇酯；成盐抗衡离子，如钠；金属复合物(如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，如TWEE®、PLURONICS®或聚乙二醇(PEG)。用于体内施用的药物制剂一般是无菌的，实现药物制剂无菌的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以通过无菌滤膜过滤等方法来实现。本领域技术人员还可以根据药物组合物所需的剂型选择合适的药学上可接受的载体，以将其制备成不同的剂型，例如，本发明的药物组合物可以是包括但不限于片剂、注射剂、冻干剂等各种剂型。

所述药物组合物中，所述融合蛋白和免疫缀合物的含量通常是有效量的，所述有效量所对应的活性成分的含量可以根据所治疗的对象和特定给药方式来确定。例如，以药物组合物的总质量计，所述融合蛋白和免疫缀合物的含量范围可以是大约0.01～99%、0.1～70%、1～30%、0.01～0.05%、0.05～0.1%、0.1～0.3%、0.3～0.5%、0.5～1%、1～3%、3～5%、5～10%、10～20%、20～30%、30～50%、50～70%、或70～99%。

本发明的融合蛋白、免疫缀合物和药物组合物可以作为单一有效成分施用，也可以在联合治疗中施用，即与其他药剂联用。例如，所述联合治疗可以是所述融合蛋白、免疫缀合物、药物组合物联合其他至少一种抗肿瘤药物。再例如，所述联合治疗可以是所述融合蛋白、免疫缀合物、药物组合物与靶向其它肿瘤特异性抗原的抗体联合使用，所述靶向其它肿瘤特异性抗原的抗体例如但不限于：抗EGFR抗体、抗VEGF抗体、抗HER2抗体、或抗Claudin18A2抗体等中的一种或多种的组合，所述抑制剂优选可以是单克隆抗体。

本发明也提供了一种检测试剂盒，包括本发明所述的抗体、融合蛋白或免疫缀合物。所述试剂盒中还可根据需要包括：容器、对照物(阴性或阳性对照)、缓冲剂、助剂等，本领域技术人员可根据具体情况对其进行选择。所述试剂盒中也可包括使用说明书，以便于本领域技术人员操作。

本发明还进一步提供利用所述的抗体检测FOLR1蛋白的检测方法，包括但不限于定性检测、定量检测和定位检测。具体地，所述检测方法包括但不限于免疫荧光测定、免疫组化和放射免疫测定等。

一种检测样品中是否存在FOLR1蛋白的方法可以包括：将样品与本发明的抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在FOLR1蛋白。所述的样品可以是细胞和/或组织样品；可以将样品固定或溶解在介质中；检测在所述固定或溶解的样品中FOLR1蛋白的水平。在一些实施方式中，检测对象可以是存在于细胞保存液中的含细胞的样本。在另一些实施方式中，所述抗体还缀合有可用于检测或可被其他试剂检测到的荧光染料、化学物质、多肽、酶、同位素、标签等。

用途

本发明也提供了本发明的抗体、融合蛋白、免疫缀合物或药物组合物在制备用于诊断、治疗或预防与表达(或过表达)FOLR1的细胞相关的疾病的用途。

本发明所提供的融合蛋白、免疫缀合物、药物组合物的“治疗有效量”优选地导致疾病症状的严重性降低，疾病无症状期的频率和持续时间增加，或者防止因疾病痛苦而引起的损伤或失能。例如，对于FOLR1相关肿瘤的治疗(包括如卵巢癌，子宫内膜癌，乳腺癌，宫颈癌等)，相对于未接受治疗的对象，“治疗有效量”优选地将细胞生长或肿瘤生长抑制至少约10%，优选至少约20%，更优选至少约30%，更优选至少约40%，更优选至少约50%，更优选至少约60%，更优选至少约70%，更优选至少约80%。抑制肿瘤生长的能力可以在预测对人类肿瘤的疗效的动物模型系统中评价。或者，也可以通过检查抑制细胞生长的能力来评价，这种抑制可以通过本领域技术人员公知的试验在体外测定。治疗有效量的融合蛋白、免疫缀合物、药物组合物通常能够减小肿瘤大小，或者以其他方式缓解对象的症状。本领域技术人员可以根据实际情况选择合适的治疗有效量，例如，可以是对象的大小、对象症状的严重性和选择的特定组合物或给药途径。治疗的处方(例如，对剂量的决定等)可以是由医生确定的，通常考虑的因素包括但不限于所治疗的疾病、患者个体的情况、递送部位、施用方法以及其它因素等。预防有效量指在必需的剂量和时间上有效实现期望的预防效果的量。通常而非必然，由于预防剂量是在疾病发作之前或在疾病的早期用于受试者的，因此“预防有效量”通常低于“治疗有效量”。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明。

实施例1、抗体氨基酸序列的改造

Mov19重链和轻链的可变区氨基酸序列来自于NCBI数据库，其重链可变区氨基酸序列GenBank登录号：CAA68252，轻链可变区氨基酸序列GenBank登录号：CAA68253。

本发明人对Mov19重链和轻链的可变区采用了IMGT的方法进行了分析，其中与抗原结合起决定作用的CDR1，CDR2和CDR3区域如图1和图2中Mov19_VH和Mov19_VL相应的虚线框标示区所示。

通过综合分析，本发明人对Mov19的重链和轻链进行了序列改造，主要如表1。

表 1

上述序列改造后，本发明人获得人源化的Mov19单克隆抗体，其重链可变区序列如下：

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYFMNWVRQAPGQGLEWIGRIHPYDGDTFYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTRYDGSRAMDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO: 1)

其轻链可变区序列如下：

DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASQSVSFAGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLEAGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDAANYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO: 2)

本发明人分别对Mov19和人源化的Mov19重链和轻链可变区氨基酸序列相应的编码核酸进行密码子优化，并进行基因合成。

同时，本发明人合成人的抗体的重链恒定区(其氨基酸序列的GenBank登录号：AXN93653.1)和轻链恒定区(其氨基酸序列的GenBank登录号：AWK57456.1)的编码核酸，分别组合成Mov19和人源化的Mov19重链和轻链的全长基因。

之后，本发明人将全长基因构建到pCGS3(Merck)表达载体上，转染到ExpiCHO细胞中表达，通过纯化获得嵌合的Mov19和人源化的Mov19的抗体蛋白。

实施例2、人源化后的Mov19的亲和力测定

1、ELISA检测

首先，本发明人利用ELISA检测Mov19和人源化的Mov19与FOLR1的亲和力。

先将FOLR1-His蛋白(Acro)吸附在酶标板上，脱脂牛奶封闭后再分别加入梯度稀释的Mov19和人源化的Mov19的抗体，室温孵育1小时后洗去未结合的抗体。然后加入带HRP标记的羊抗人Fc二抗(Jackson)，室温孵育1小时后洗去未结合的二抗。最后用TMB显色，用酶标仪记录450nm处的吸收值。

通过分析，结果如图3所示，人源化后的Mov19对于FOLR1的亲和力与鼠源的Mov19相似，说明本发明的人源化操作没有改变Mov19与FOLR1的亲和力。

2、Octet检测

其次，本发明人利用Octet检测Mov19和人源化的Mov19与FOLR1的亲和力。

结果如图4所示，Mov19的KD为3.11pM，人源化的Mov19的KD为3.44pM，说明两者对FOLR1的亲和力非常相近。从Ka和Kdis的值上看，两者也是非常相近，说明本发明的人源化操作没有改变Mov19与FOLR1的亲和力。

3、流式细胞术检测

接着，本发明人利用流式细胞术检测Mov19和人源化的Mov19的抗体对于细胞膜上FOLR1的亲和力。

选取高表达FOLR1的SK-OV-3细胞株，分别加入梯度稀释的Mov19和人源化的Mov19的抗体，4℃孵育1小时后洗去未结合的抗体。然后加入带PE标记的羊抗人Fc二抗(Jackson)，4℃孵育1小时后洗去未结合的二抗。最后用流式细胞仪检测。

通过分析，结果如图5所示，人源化后的Mov19对于肿瘤细胞上FOLR1的亲和力与鼠源的Mov19相似，说明本发明的人源化操作没有影响Mov19对于肿瘤细胞上FOLR1的亲和力。

实施例3、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)的检测

本实施例中，本发明人检测Mov19和人源化的Mov19对于肿瘤细胞的ADCC功能。

以高表达FOLR1的KB细胞株为靶细胞，按每孔10000个细胞接种到96孔培养板里，37℃培养过夜。将Mov19和人源化的Mov19进行梯度稀释，加入到有靶细胞的96孔培养板中，37℃孵育半小时。将从人的PBMC细胞中分离出NK细胞，按每孔10000个细胞加入到含有靶细胞和抗体的96孔培养板里，37℃孵育20-24个小时。最后用LDH试剂盒(Invitrogen)检测抗体的ADCC功能。

结果如图6所示，Mov19和人源化的Mov19对肿瘤细胞均具有显著的ADCC功能，其中Mov19的EC50为15.2pM，人源化的Mov19的EC50为4.811pM。

上述结果说明，人源化后的Mov19具有显著更强的ADCC功能。

实施例4、抗体热稳定性检测

本实施例中，利用动态光散射(Dynamic Light Scattering，DLS)的方法来检测Mov19和人源化的Mov19的抗体的热稳定性。

具体地，本发明人利用DLS(wyatt)仪器，检测Mov19和人源化的Mov19抗体从25℃加热到85℃时的光散射，从而得到Mov19和人源化的Mov19的聚合温度Tagg的值。

检测结果如图7所示，Mov19的Tagg的值为66.54℃，而人源化的Mov19的Tagg值为78.85℃。

上述结果说明，人源化后的Mov19抗体具有显著更高的热稳定性。

实施例5、抗体的内吞能力检测

本实施例中，检测Mov19和人源化的Mov19的抗体结合到细胞膜上的FOLR1后，发生内吞的能力。

本发明人将5μg/ml的Mov19和人源化的Mov19的抗体分别与SK-OV-3细胞株混合，4℃孵育1小时后洗去未结合的抗体，然后将细胞放到37℃培养箱中进行孵育，分别在0h，0.5h，1h和2h不同时间点取出样品置4℃放置。待所有时间点样品取完之后，加入带PE标记的羊抗人Fc二抗(Jackson)到样品中，4℃孵育1小时后洗去未结合的二抗。最后用流式细胞仪检测。

通过分析，结果如图8所示，人源化后的Mov19相比鼠源的Mov19，更快发生内吞，在0.5h时就有10%的抗体发生明显的内吞，在1h时发生内吞的抗体也明显对于鼠源的Mov19，说明人源化后的Mov19的内吞的能力要优于鼠源的Mov19。

实施例6、肿瘤细胞的杀伤力测定

本实施例中，将人源化的Mov19抗体制备成抗体偶联药物，检测对肿瘤细胞的杀伤效果。

本发明人将人源化的Mov19先与TCEP(sigma)孵育，打开链间的二硫键，然后加入mc-vc-PAB-MMAE(medchemexpress)进行偶联，最后用脱盐柱进行纯化，去除多余的小分子药物，将得到的抗体偶联药物命名为humanized Mov19-vc-MMAE。将KB细胞株或者T-47D细胞株按5000个每孔接种到96孔细胞板中，37℃培养过夜。将humanized Mov19-vc-MMAE与阴性对照的IgG-vc-MMAE进行梯度稀释，分别加入到含有KB细胞或者T-47D细胞的96孔细胞板中，37℃培养5天。用CellTiter-Glo(Promega)检测细胞活率，从而得到抗体偶联药物对细胞的杀伤效果。

如图9所示，显示humanized Mov19-vc-MMAE对表达FLOR1的KB细胞具有显著的杀伤效果，IC50为1.243nM，而阴性对照IgG-vc-MMAE以及单独的小分子药物vc-MMAE要在很高浓度时才会对肿瘤细胞有一定的杀伤效果。

如图10所示，显示humanized Mov19-vc-MMAE对表达FLOR1的T-47D细胞同样具有显著的杀伤效果，而阴性对照IgG-vc-MMAE要在很高浓度时才会对肿瘤细胞有一定的杀伤效果。

综上所述，说明将人源化的Mov19抗体制备成抗体偶联药物，能够对表达FLOR1的肿瘤细胞起到显著的杀伤效果，证明了其对于治疗FLOR1高表达的肿瘤患者，具有良好的药效。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海偌妥生物科技有限公司

<120> 人源化抗叶酸受体1抗体及其应用

<130> 210644

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)..(118)

<223> 改造的抗体重链

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)..(111)

<223> 改造的抗体轻链

<400> 2

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala

20 25 30

Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asn Asp Ala Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg

85 90 95

Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Claims (16)

1.一种抗叶酸受体1抗体，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。

2.如权利要求1所述的抗叶酸受体1抗体，其特征在于，所述抗叶酸受体1抗体为人源化的抗体。

3.一种多核苷酸，其编码权利要求1或2所述的抗叶酸受体1抗体。

4.一种构建体，其包含权利要求3所述的多核苷酸。

5.一种抗体表达系统，所述表达系统含有权利要求4所述的构建体或基因组中整合有外源的权利要求3所述的多核苷酸。

6.一种制备权利要求1所述的抗叶酸受体1抗体的方法，包括：在适合表达所述抗体的条件下，利用权利要求5所述的抗体表达系统进行表达，从而表达出所述的抗体。

7.一种免疫缀合物，其包括：权利要求1所述的抗体；以及与之连接的功能性分子。

8.如权利要求7所述的免疫缀合物，其特征在于，所述功能性分子包括：细胞毒素，放射性同位素，生物活性蛋白质，靶向肿瘤表面标志物的分子，抑制肿瘤的分子，靶向免疫细胞的表面标志物的分子或可检测标记物，基于嵌合抗原受体技术的胞外铰链区、跨膜区及胞内信号区，或其组合。

9.如权利要求8所述的免疫缀合物，其特征在于，所述靶向肿瘤表面标志物的分子是结合肿瘤表面标志物的抗体或配体；或

所述的抑制肿瘤的分子是抗肿瘤的细胞因子或抗肿瘤的毒素。

10.如权利要求8所述的免疫缀合物，其特征在于，所述的可检测标记物包括：荧光标记物、显色标记物；或

所述的胞内信号区包括：CD3ζ链，FcεRIγ酪氨酸激活基序，共刺激信号分子CD27、CD28、CD137、CD134、MyD88、CD40的胞内信号区；或

所述跨膜区包括：CD8或CD28的跨膜区。

11.如权利要求9所述的免疫缀合物，其特征在于，所述抗肿瘤的毒素包括：作用于微管蛋白的毒素；作用于DNA的毒素或其衍生物；作用于细胞内代谢、转录、翻译或信号转导的化合物或其衍生物；或

所述的抗肿瘤的细胞因子包括：IL-2、IL-12、IL-15、IFN-beta、TNF-alpha或其变体；或

所述的结合肿瘤表面标志物的抗体是识别叶酸受体1以外的其它抗原的抗体，所述的其它抗原包括：EGFR，EGFRvIII，mesothelin，HER2，EphA2，Her3，cMet，EpCAM，MUC1，MUC16，CEA，Claudin 18.2，Claudin 6，WT1，NY-ESO-1，MAGE 3，ASGPR1或CDH16。

12.如权利要求11所述的免疫缀合物，其特征在于，所述抗肿瘤的毒素与权利要求1所述抗体通过连接子连接，所述连接子包括mc-vc-PAB；或

所述作用于微管蛋白的毒素包括：单甲基澳瑞他汀类化合物或其衍生物，美登木素生物碱类化合物或其衍生物。

13.一种药物组合物，其包括：权利要求1所述的抗体或权利要求7～12任一所述的免疫缀合物。

14.权利要求1所述的抗体、权利要求7～12任一所述的免疫缀合物或权利要求13所述的药物组合物在制备用于诊断或治疗肿瘤的制剂、试剂盒或药盒中的用途。

15.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤是表达叶酸受体1的肿瘤。

16.一种试剂盒或药盒，其中包括权利要求1所述的抗体、或权利要求7～12任一所述的免疫缀合物、或权利要求13所述的药物组合物。

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