CN119173279A - 抗体-药物缀合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抗体‑药物缀合物，其中所述抗体与叶酸受体α特异性结合，并且其中所述药物优选地选自细胞毒性药物。此类抗体‑药物缀合物可特别用于治疗增殖性疾病包括癌症例如卵巢癌、乳腺癌和非小细胞肺癌。
Description
技术领域
下文公开了抗体-药物缀合物，其中所述抗体与叶酸受体α(FRα)特异性结合，并且其中所述药物优选地选自拓扑异构酶I的抑制剂，例如喜树碱类似物如依喜替康。此类抗体-药物缀合物可特别用于治疗增殖性疾病包括癌症例如卵巢癌、乳腺癌或肺癌。
背景技术
抗体-药物缀合物(下文被称为“ADC”)是一类新型治疗剂，尤其是癌症治疗剂。此类ADC至少包含抗体和有效载荷(例如细胞毒性药物)，两者通过接头共价键合。因此，ADC设计为将抗体靶的特异性与有效载荷的效率(例如化学治疗剂的细胞毒活性)组合。有效的ADC应该显示出高特异性和低全身毒性。
在毒性背景下，ADC中使用的抗体需要准确且有效地与其抗原结合，意味着合适的靶抗原优先或唯一地在靶细胞上表达。
在设计ADC时，需要将最终活性药物共价附着到配体靶向单元，同时允许在细胞内化后或在患病组织微环境中通过选择性酶促机制的活性药物单元的最终释放。在这方面，开发了几种肽酶和糖苷酶敏感的可切割接头化学策略(与自毁化学(self-immolativechemistries)相关)。这些可切割接头及其相应的切割机制是众所周知的，并且已在多篇出版物(例如Bargh JG等人，Chem.Soc.Rev.，2019，48，4361，Toki等人J.Org.Chem.2002，67，6，1866-1872，Scott等人Bioconjugate Chem.2006，17，3，831-840)中进行描述。这种酶敏感的可切割实体的选择是ADC的关键设计属性，影响缀合物的功效和耐受性。
已用于将细胞毒素或药物与抗体缀合的接头类型的实例包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽接头。接头例如选自易受通过溶酶体区室内的低pH的切割或易受通过蛋白酶的切割的那些接头，所述蛋白酶例如优先在肿瘤组织中表达的蛋白酶，例如组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B、C、D)。有效的接头可以确保准确和及时的有效载荷释放。在毒性的背景下，看起来接头的稳定性也可以影响由有效载荷发挥的毒性，即使接头本身似乎并不驱动毒性。事实上，稳定的接头可以以靶特异性的方式释放有效载荷，而不稳定的接头更有可能经历不准确的有效载荷释放(例如由于非特异性切割)，导致非特异性全身毒性。
ADC中使用的有效载荷是高度有效的，经常是具有在皮摩尔范围内的体外抑制浓度的细胞毒性药物。常见的有效载荷例如是微管抑制剂(例如美登素衍生物(DM1/DM4)、奥瑞他汀(MMAE/MMAF)、艾日布林)和DNA烷化剂(例如卡利奇霉素、吡咯并苯并二氮杂卓、吲哚并苯并二氮杂卓或倍癌霉素)。
尽管ADC似乎是有前途的治疗剂，但一些ADC可能毒性太大，这限制了这些化合物的治疗窗口或阻碍了进一步的临床开发。此外，目前获批或处于临床调查下的大多数ADC都是如上文引用的基于微管和DNA靶向剂的。像这样，需要基于具有其它作用机制的有效载荷的新型差异化ADC，以便有效治疗对微管和DNA靶向剂抗性或变得对其抗性的肿瘤。
显示出高特异性、最大效率和低毒性的有效ADC因此需要其组分各自的适当组合。关于可能策略的综述，参见例如Khongorzul等人2019(Molecular cancer research，DOI：10.1158/1541-7786.MCR-19-0582)。WO2019081455和Conilh等人(2021，Pharmaceuticals，14(3)，247)进一步报道了特别是基于拓扑异构酶I抑制剂有效载荷依喜替康，并且使用亲水性单分散性聚肌氨酸(PSAR)药物-接头平台的HER2靶向抗体-药物缀合物。
Cheng等人(2018，DOI：10/1158/1535-7163.MCT-17-1215)和WO2017151979报道了具有与通常3至4个艾日布林(MORAb-202)分子缀合的法妥组单抗的ADC及其在治疗肿瘤中的用途。这种ADC的艾日布林有效载荷的作用机制是微管抑制。
Moore等人(2018，Future Oncol.14(17)1669-1678)报道了使用ADC索米妥昔单抗用于治疗卵巢癌的III期研究结果，所述ADC索米妥昔单抗包含与平均3至4个美登素分子缀合的人源化抗FRα抗体米妥昔单抗作为有效载荷。这种ADC的美登素有效载荷的作用机制是微管抑制。
因此，仍然需要包含抗FRα抗体的抗体-药物缀合物，其是有效的，具有高特异性、低毒性(改善的治疗指数)和差异化的有效载荷的作用机制。
如实施例中显示的，本公开提供了特别是当与靶向表达FRα的抗体的参考现有技术ADC相比时，在实体瘤癌症模型中具有极佳体内功效和低毒性的基于拓扑异构酶I抑制剂的抗FRα抗体-药物缀合物，所述参考现有技术ADC具有其它有效载荷和药物-接头，例如索米妥昔单抗。
发明概述
相应地，本公开的第一目的涉及式(I)的抗体-药物缀合物(ADC)：
Ab-[L-D]p (I)，
其中：
Ab是与SEQ ID NO：12特异性结合的抗叶酸受体α(FRα)抗体，
L是优选经由硫醇残基与所述抗叶酸受体α(FRα)抗体键合的可切割的接头部分，
D是与L键合的细胞毒性药物部分，
p是1至8，优选6至8，且更优选地p是8。
在具体实施方案中，Ab是包含人IgG1同种型恒定区的抗体。
在一个优选实施方案中，Ab是包含人IgG1同种型的突变型或化学修饰的恒定区的抗体，其中当与具有野生型人IgG1同种型恒定区的相应抗体相比时，所述突变型或化学修饰的恒定区并不对所述抗体赋予ADCC活性或赋予减少的ADCC活性。
在其它具体实施方案中，Ab是包含人IgG4同种型恒定区或者突变型或化学修饰的IgG4恒定区的抗体，其中当与具有野生型IgG4同种型恒定区的相应抗体相比时，所述突变型或化学修饰的恒定区并不对所述抗体赋予ADCC活性或赋予减少的ADCC活性。
在优选实施方案中，Ab是包含以下任一的抗FRα抗体：
(a)包含SEQ ID NO：1的HCDR1、SEQ ID NO：2的HCDR2、SEQ ID NO：3的HCDR3的可变重链多肽，以及包含SEQ ID NO：4的LCDR1、SEQ ID NO：5的LCDR2和SEQ ID NO：6的LCDR3的可变轻链多肽；或，
(b)包含SEQ ID NO：7的VH的可变重链多肽，以及包含SEQ ID NO：8的VL的可变轻链多肽。
在具体实施方案中，所述Ab包含SEQ ID NO：9的重链和SEQ ID NO：10的轻链或者基本上由其组成；
在具体实施方案中，所述Ab包含SEQ ID NO：11的重链和SEQ ID NO：10的轻链或者基本上由其组成。
在具体实施方案中，D是拓扑异构酶I的抑制剂，优选地选自喜树碱类似物，并且更优选地D是下式(II)的依喜替康的药物部分
在具体实施方案中，L是式-A-W-的可切割的接头部分，其中A是与Ab连接的任选延伸单元，并且W是与D连接的可切割部分。在一个更具体的实施方案中，L是溶酶体蛋白酶敏感的接头，并且W包含例如选自缬氨酸-瓜氨酸(Val-Cit)、丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺(Ala-Ala-Asn)、缬氨酸-丙氨酸(Val-Ala)和苯丙氨酸-赖氨酸(Phe-Lys)的可切割的肽部分。在另一个具体实施方案中，L是蛋白酶敏感的可切割接头，并且W包含优选地选自β-葡糖苷酸或β-半乳糖苷部分的糖可切割单元。在另一个具体实施方案中，L是谷胱甘肽敏感的接头，并且W包含二硫化物部分。在一个具体实施方案中，W具有下式(III)
其中
每个R2独立地选自吸电子基团和C1-C4烷基；
n是0、1或2；
T是糖可切割单元或多肽可切割单元；
当T是糖可切割单元时，Y是O，或者当T是多肽可切割单元时，Y是NR3；和
R3选自H、C1-C24烷基、C2-C6烯基；任选取代的聚醚、具有6至10个环原子的芳基、C3-C8环烷基、具有3至10个环原子的杂环烷基、具有5至10个环原子的杂芳基及其任何组合，
所述烷基和烯基任选地被选自以下的一个或多个杂原子或者化学基团中断：-O-、-S-、-C(O)-、-NR″-、-C(O)NR″-、-NR″-C(O)-、-NR″-C(O)-NR′″-、-NR″-C(O)-O-、-O-C(O)NR″-和三唑，
R″和R″′独立地选自H和C1-C6烷基，
及其药学上可接受的盐
在一个优选实施方案中，L对应于式(IV)的接头-A-W-
其中
X1是连接器单元；
Z是任选的间隔物；
X2是连接器单元；
K是任选的疏水性掩蔽实体，优选地选自聚肌氨酸和聚乙二醇；
R1选自H、C1-C24烷基、C2-C6烯基；任选取代的聚醚、具有6至10个环原子的芳基、C3-C8环烷基、具有3至10个环原子的杂环烷基、具有5至10个环原子的杂芳基及其任何组合，
所述烷基和烯基任选地被选自以下的一个或多个杂原子或者化学基团中断：-O-、-S-、-C(O)-、-NR″-、-C(O)NR″-、-NR″-C(O)-、-NR″-C(O)-NR″′-、-NR″-C(O)-O-、-O-C(O)NR″-和三唑；
R4选自H、C1-C6烷基和C2-C6烯基，所述烷基和烯基任选地被选自以下的一个或多个杂原子或者化学基团中断：-O-、-S-、-C(O)-和-NR″-；
R5选自H、C1-C6烷基和C2-C6烯基，所述烷基和烯基任选地被选自以下的一个或多个杂原子或者化学基团中断：-O-、-S-、-C(O)-和-NR″-。
在一个更具体的实施方案中，X1和X2独立地选自一个或多个氨基酸、一个或多个N取代的氨基酸、任选取代的聚醚、C1-C12亚烷基、具有6至10个环原子的亚芳基、C3-C8环亚烷基、具有5至10个环原子的杂环亚烷基、具有5至10个环原子的杂亚芳基、C2-C10亚烯基及其任何组合，
所述亚烷基和亚烯基任选地被选自以下的一个或多个杂原子或者化学基团中断：-O-、-S-、-C(O)-、-NR″-、-C(O)NR″-、-NR″-C(O)-、-NR″-C(O)-NR″′-、-NR″-C(O)-O-、-O-C(O)NR″-和三唑，
并且所述亚烷基、亚芳基、环亚烷基、杂环亚烷基、杂亚芳基和亚烯基任选地被选自以下的一个或多个取代基取代：卤素、氧代、-OH、-NO2、-CN、C1-C6烷基、C3-C6环烷基、具有5至10个环原子的杂环基、具有6至10个环原子的芳基、具有5至10个环原子的杂芳基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、-(CO)-R′、-O-(CO)-R′、-(CO)-O-R′、-(CO)-NR″R″′、-NR″-(CO)-R′和-NR″R″′；
R′、R″′和R″′独立地选自H和C1-C6烷基。
在一个更具体的实施方案中，Z独立地选自一个或多个氨基酸、一个或多个N取代的氨基酸、任选取代的聚醚、C1-C12亚烷基、具有6至10个环原子的亚芳基、C3-C8环亚烷基、具有5至10个环原子的杂环亚烷基、具有5至10个环原子的杂亚芳基、C2-C10亚烯基及其任何组合，
所述亚烷基和亚烯基任选地被选自以下的一个或多个杂原子或者化学基团中断：-O-、-S-、-C(O)-、-NR″-、-C(O)NR″-、-NR″-C(O)-、-NR″-C(O)-NR″′-、-NR″-C(O)-O-、-O-C(O)NR″-和三唑，
并且所述亚烷基、亚芳基、环亚烷基、杂环亚烷基、杂亚芳基和亚烯基任选地被选自以下的一个或多个取代基取代：卤素、氧代、-OH、-NO2、-CN、C1-C6烷基、C3-C6环烷基、具有5至10个环原子的杂环基、具有6至10个环原子的芳基、具有5至10个环原子的杂芳基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、-(CO)-R′、-O-(CO)-R′、-(CO)-O-R′、-(CO)-NR″R″′、-NR″-(CO)-R′和-NR″R″′；
R′、R″′和R″′独立地选自H和C1-C6烷基。
在具体实施方案中，K是聚肌氨酸，优选下式(V)
其中k是在2和50之间，优选在4和30之间的整数，
并且R6对应于OH或NH2。
在具体实施方案中，T是糖可切割单元，其为葡糖苷酸或半乳糖苷。
在其它具体实施方案中，T是优选地选自Val-Cit、Val-Ala和Phe-Lys的二肽。
在具体实施方案中，L与所述抗体的一个或多个硫醇残基共价键合，优选地，所述L对应于式(V1)的接头：
在具体实施方案中，Ab包括全长抗体或含有抗原结合部分的抗体片段。
在具体实施方案中，抗体一药物缀合物对应于下式(VII)
其中Ab是抗FRα抗体，例如法妥组单抗，或其沉默IgG1变体，通常包含在IgG1 Fc恒定区的亮氨酸234和亮氨酸235中的丙氨酸取代，并且p是4至8。
在一个优选实施方案中，抗体-药物缀合物对应于下式(VII)
其中Ab是抗FRα抗体，例如法妥组单抗，或其沉默IgG1变体，通常为包含在IgG1 Fc恒定区的亮氨酸234和亮氨酸235中的丙氨酸取代的人IgG1的突变型变体，也通常称为LALA突变，并且p是8。
在式(I)的ADC的一个更优选实施方案中，
Ab是抗叶酸受体α抗体或其抗原结合片段，其包含
(i)包含SEQ ID NO：1的HCDR1、SEQ ID NO：2的HCDR2、SEQ ID NO：3的HCDR3的可变重链多肽，和
(ii)包含SEQ ID NO：4的LCDR1、SEQ ID NO：5的LCDR2和SEQ ID NO：6的LCDR3的可变轻链多肽；
L是式-A-W-的可切割接头，其中A是与Ab连接的任选延伸单元，并且W是与D连接的可切割部分
D是依喜替康；
p是1至8，例如在4和8之间，优选在6和8之间，并且例如p在7和8之间。
本公开的另一个目的涉及用于用作药剂的上述ADC，优选用于治疗肿瘤，例如实体瘤，更具体地选自卵巢癌、乳腺癌、肺癌或间皮瘤。
本公开的另一个目的涉及上述ADC在制备用于治疗肿瘤的药剂或药物组合物中的用途，所述肿瘤例如实体瘤，更具体地选自卵巢癌、乳腺癌、肺癌或间皮瘤。
在具体实施方案中，ADC可以优选用于治疗选自卵巢癌、三阴性乳腺癌和非小细胞肺癌的癌症。
本公开进一步涉及药物组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体组合的如本文公开的抗体-药物缀合物，任选地包含其它活性成分，例如抗癌药物或免疫治疗药物例如免疫检查点抑制剂。
本公开还涉及用于获得本公开的ADC的方法，其中所述方法包括：
(a)在适合于产生如本文定义的抗FRα抗体的条件下培养宿主细胞，
(b)分离所述抗FRα抗体，
(c)合成与式(VIII)的接头L键合的依喜替康：
(d)使所述抗FRα抗体与式(VIII)的化合物缀合；
从而获得本公开的ADC。
附图说明
图1表示根据实施例4，缀合物的临床前啮齿类动物功效、药代动力学和耐受性数据。
图2表示根据实施例5，叶酸受体α细胞外表达的流式细胞术评价。
图3表示根据实施例6，化合物甲磺酸依喜替康对几种叶酸受体α阳性癌细胞系的体外细胞毒性数据。
图4表示根据实施例7，缀合物针对重组人叶酸受体α蛋白的体外ELISA结合实验。
图5表示根据实施例8，缀合物针对重组人叶酸受体α蛋白的体外表面等离子体共振(SPR)结合实验。
图6表示根据实施例9，缀合物的体外叶酸受体α阳性癌细胞结合亲和力。
图7表示根据实施例10，缀合物的离体人血浆稳定性。
图8表示根据实施例11，缀合物对叶酸受体α阴性乳腺癌细胞系BT-474的体外细胞毒性测定。
图9表示根据实施例12，缀合物在叶酸受体α阳性SW-620异种移植癌症模型中的体内功效评价。
图10表示根据实施例12，缀合物在第二个叶酸受体α阳性SW-620异种移植癌症模型中的体内功效评价。
图11表示根据实施例12，缀合物在叶酸受体α阳性OV-90异种移植癌症模型中的体内功效评价。
图12表示根据实施例12，缀合物在第二个叶酸受体α阳性OV-90异种移植癌症模型中的体内功效评价。
图13表示根据实施例12，缀合物在叶酸受体α阳性KB异种移植癌症模型中的体内功效评价。
图14表示根据实施例12，缀合物在叶酸受体α阳性PA-1异种移植癌症模型中的体内功效评价。
图15表示根据实施例12，缀合物在第三个叶酸受体α阳性OV-90异种移植癌症模型中的体内功效评价。
图16表示根据实施例12，缀合物在叶酸受体α阳性IGROV-1异种移植癌症模型中的体内功效评价和肿瘤再植入挑战。
图17表示根据实施例12，缀合物在叶酸受体α阴性BT-474异种移植乳腺癌模型中的体内功效评价。
图18表示根据实施例13，缀合物在高剂量下的体内SCID和CD-1小鼠耐受性评价。
图19表示根据实施例14，缀合物的总mAb、总ADC和游离依喜替康亚组分的体内大鼠药代动力学评价。
图20和21表示根据实施例15，缀合物的体内小鼠肺部炎症评估。
图22表示根据实施例16，体内食蟹猴剂量范围发现毒理学研究。
详述
定义
为了使本公开可以更容易理解，首先定义了某些术语。在详述自始至终阐述了另外的定义。
除非另有描述，否则术语“FRα”或“叶酸受体α”指如SEQ ID NO：12中定义的人叶酸受体α。该序列对应于如由FOLR1基因(智人(Homo sapiens))编码的叶酸受体α的氨基酸序列，其也可在条目P15328(FOLR1_HUMAN)下在UniprotKB中获得。
如本文提及的，术语“抗体”包括整个抗体和任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或其单链。天然存在的“抗体”是包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白。每条重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3构成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区可以进一步细分成称为互补决定区(CDR)的高变区，其间散布着称为框架区(FR)的更保守的区域。每个VH和VL由从氨基末端到羧基末端按以下次序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”(或简单地“抗原部分”)指保留与抗原(例如FRα的一部分)特异性结合的能力的抗体的全长或者一个或多个片段。已显示了抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。在术语抗体的“抗原结合部分”内涵盖的结合片段的实例包括Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段；包含在铰链区处通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；由在铰链区具有修饰的IgG重链例如IgG4的单臂组成的UniBody、结构域抗体片段(Ward等人，1989 Nature 341：544-546)或由VH结构域组成的纳米抗体片段；以及分离的互补决定区(CDR)；或包含此类抗原结合部分的任何融合蛋白。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头进行连接，所述合成接头允许它们制备为单链蛋白，其中VL和VH区域配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人，1988Science 242：423-426；以及Huston等人，1988Proc.Natl.Acad.Sci.85：5879-5883)。此类单链抗体也预期涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体片段使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且以与完整抗体相同的方式筛选片段的效用。
如本文所用，“分离的抗体”指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如，与FRα特异性结合的分离的抗体基本上不含与除FRα外的其它抗原特异性结合的抗体)。然而，与FRα特异性结合的分离的抗体可能与其它抗原例如来自其它物种的FRα分子具有交叉反应性。此外，分离的抗体可能基本上不含其它细胞材料和/或化学制品。
短语“识别抗原的抗体”和“对于抗原特异性的抗体”在本文中可与术语“与抗原特异性结合的抗体”互换使用。
如本文所用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指具有单分子组成的抗体分子制剂。单克隆抗体组合物展示对于特定表位的单一结合特异性和亲和力。
如本文所用，“同种型”指由重链恒定区基因提供的抗体类别(例如IgM、IgE、IgG如IgG1或IgG4)。
如本文所用，术语″KD″预期指平衡解离常数，其得自koff/kon的比率(即koff/kon)，并且表示为摩尔浓度(M)。KD值与抗体浓度(特定实验所需的抗体量)相关，并且因此KD值越低(浓度越低)，抗体的亲和力就越高。关于抗体的KD值可以使用本领域充分建立的方法进行确定。用于确定mAb的KD值的优选方法可以在Harlow等人，Antibodies：ALaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1988)，Coligan等人，编辑，Current Protocols in Immunology，Greene Publishing Assoc.和Wiley Interscience，N.Y.，1992，1993，以及Muller，Meth Enzymol 1983中找到，所述参考文献通过引用全部并入本文。用于确定抗体的KD的方法是通过使用表面等离子体共振，或通过使用生物传感器系统例如(关于亲和力评价的详细信息，还，参见Rich RL，Day YS，Morton TA，Myszka DG.High-resolution and high-throughput protocols formeasuring drug/human serum albumin interactions usingAnalBiochem.2001)。
如本文所用，术语″kassoc″或″ka″或“kon”预期指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而如本文所用，术语″kdis″或″kd″或koff预期指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。
如本文所用，术语“亲和力”指在单个抗原位点处在抗体和抗原之间的相互作用强度。在每个抗原位点内，抗体“臂”的可变区通过弱非共价力与抗原在众多位点处相互作用；相互作用越多，亲和力越强。
如本文所用，“与抗原特异性结合”，例如“与FRα特异性结合”的抗体或蛋白质预期指可检测地结合抗原，例如本公开中的FRα上存在的表位的抗体。它通常预期指与人FRα结合的抗体或ADC，其KD为200nM或更低，100nM或更低，50nM、40nM或更低，或约30nM。通常，KD介于10-3pM和200nM之间，特别是0.1pM和100nM之间，特别是0.1pM和50nM之间，或1pM和50nM之间，特别是1pM和30nM之间、10pM和50nM之间、0.1nM和200nM之间或0.1nM和100nM之间，或1nM和50nM之间，特别是1nM和30nM之间。通常，本公开的ADC对于FRα是特异性的，并且具有如上文定义的KD。
如本文所用，术语“宿主细胞”指原核细胞或真核细胞。真核细胞，例如哺乳动物宿主细胞、酵母或丝状真菌是优选的，并且特别是哺乳动物细胞，因为它们比原核细胞更有可能组装且分泌正确折叠且具有免疫活性的抗体。
如本文所用，术语“ADCC”或“抗体依赖性细胞的细胞毒性”活性指细胞耗尽活性。ADCC活性可以通过商购可得的ADCC测定，例如如通过Promega在Ref#G7015下商业化的ADCCReporter Bioassay进行测量。
如本文所用，术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类动物、绵羊、犬、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物。术语“受试者”还涵盖了术语“患者”。
如本文所用，术语ADC的式(I)中的“药物”或D还指“有效载荷”，即与抗体(或片段)缀合的部分。药物D不应被解释为限于经典化学治疗剂。例如，D可以涵盖具有所需生物活性的蛋白质、肽或多肽。优选地，它指治疗部分，例如细胞毒素。“细胞毒素”或“细胞毒素剂”包括对细胞有害(例如杀死)的任何药剂。
除非另有指定，否则本公开涵盖了如本文所述的化合物或药物或细胞毒素以及它们的互变异构体、对映异构体、非对映异构体、外消旋物或其混合物，以及它们的水合物、酯、溶剂化物或药学上可接受的盐。
本文给出的任何式也预期表示化合物的未标记形式以及同位素标记形式，如氘标记的化合物或14C标记的化合物。
术语“药学上可接受的盐”指这样的盐，其保留本公开的化合物的生物学有效性和性质，并且通常不是生物学或在其它方面不期望的。在许多情况下，本公开的化合物能够通过氨基和/或羧基基团或与其类似的基团的存在而形成酸和/或碱盐。药学上可接受的酸加成盐可以由有机酸和/或无机酸形成。药学上可接受的碱加成盐可以由有机碱和/或无机碱形成。此类盐是本领域技术人员众所周知的。
术语连接器单元指将化合物的不同部分连接在一起的组分，例如，连接器可以将Ab连接到间隔物，或将间隔物连接到酰胺官能团-CO-NR1-。连接器是携带关于抗体-药物缀合物的组分(即Ab、间隔物、疏水性掩蔽实体和/或酰胺官能团-CO-NR1-)的附着位点的支架。
根据其知识，本领域技术人员能够选择适当的连接器。连接器的非详尽列表包括：氨基酸，例如赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、甘氨酸、高丙氨酸；氨基醇；氨基醛；多胺或其任何组合。有利地，连接器单元X1和/或X2是一个或多个天然或非天然氨基酸。在一个实施方案中，连接器单元X1和/或X2选自谷氨酸、赖氨酸和甘氨酸。连接器单元X1和X2可以独立地选自一个或多个氨基酸、一个或多个N取代的氨基酸、任选取代的聚醚、C1-C12亚烷基、具有6至10个环原子的亚芳基、C3-C8环亚烷基、具有5至10个环原子的杂环亚烷基、具有5至10个环原子的杂亚芳基、C2-C10亚烯基及其任何组合，所述亚烷基和亚烯基任选地被选自以下的一个或多个杂原子或者化学基团中断：-O-、-S-、-C(O)-、-NR″-、-C(O)NR″-、-NR″-C(O)-、-NR″-C(O)-NR″′-、-NR″-C(O)-O-、-O-C(O)NR″-和三唑，
并且所述亚烷基、亚芳基、环亚烷基、杂环亚烷基、杂亚芳基和亚烯基任选地被选自以下的一个或多个取代基取代：卤素、氧代、-OH、-NO2、-CN、C1-C6烷基、C3-C6环烷基、具有5至10个环原子的杂环基、具有6至10个环原子的芳基、具有5至10个环原子的杂芳基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、-(CO)-R′、-O-(CO)-R′、-(CO)-O-R′、-(CO)-NR″R″′、-NR″-(CO)-R′和-NR″R″′；R′、R″和R″′独立地选自H和C1-C6烷基。
连接器单元的实例包括任选取代的聚醚、氨基酸、苄基基团、胺、酮、
特别地，连接器单元可以是二价或三价的。例如，当存在疏水性掩蔽实体K时，X2可以是三价连接器单元。
术语“氨基酸”指天然或非天然氨基酸。当X2由一个或多个氨基酸组成时，-CONR1-或-CONR1′-基团的CO部分可以被视为X2连接器单元的部分。氨基酸的非详尽列表包括赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、甘氨酸和高丙氨酸。
间隔物是共价结合抗体-药物-缀合物的两个组分例如2个连接器单元的二价臂。
间隔物单元的非详尽列表包括：亚烷基、杂亚烷基(即被选自Si、N、O和S的至少一个杂原子中断的亚烷基)；烷氧基；聚醚，例如聚亚烷基二醇且通常是聚乙二醇；一个或多个天然或非天然氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、N-甲基甘氨酸；C3-C8杂环；C3-C8碳环；亚芳基及其任何组合。例如，间隔物是二价线性亚烷基基团，优选(CH2)4。
例如，间隔物可以选自-C1-C10亚烷基-、-C1-C10杂亚烷基-、-C3-C8碳环-、-O-(C1C8烷基)-、-亚芳基-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环)-、-(C3-C8碳环)-C1-C10亚烷基-、-C3-C8杂环-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环)-、-(C3-C8杂环)-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C1-C10杂亚烷基-C(＝O)-、-C3-C8碳环-C(＝O)-、-O-(C1-C8烷基)-C(＝O)-、-亚芳基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-C(＝O)-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环)-C(＝O)-、-(C3-C8碳环)-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C3-C8杂环-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环)-C(＝O)-、-(C3-C8杂环)-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-NH-、-C1-C10杂亚烷基-NH-、-C3-C8碳环-NH-、-O-(C1-C8烷基)-NH-、-亚芳基-NH-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-NH-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-NH-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环)-NH-、-(C3-C8碳环)-C1-C10亚烷基-NH-、-C3-C8杂环-NH-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环)-NH-、-(C3-C8杂环)-C1-C10亚烷基-NH-、-C1-C10亚烷基-S-、-C1-C10杂亚烷基-S-、-C3-C8碳环-S-、-O-(C1-C8烷基)-)-S-、-亚芳基-S-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-S-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-S-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环)-S-、-(C3-C8碳环)-C1-C10亚烷基-S-、-C3-C8杂环-S-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环)-S-、-(C3-C8杂环)-C1-C10亚烷基-S-、-C1-C10亚烷基-O-C(＝O)-、-C3-C8碳环-O-C(＝O)-、-O-(C1-C8烷基)-O-C(＝O)-、-亚芳基-O-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-O-C(＝O)-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-O-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环)-O-C(＝O)-，-(C3-C8碳环)-C1-C10亚烷基-O-C(＝O)-、-C3-C8杂环-O-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环)-O-C(＝O)-和-(C3-C8杂环)-C1-C10亚烷基-O-C(＝O)-。
上文提到的任何基团任选地被选自以下的一个或多个取代基取代：-X、-R′、-O-、-OR′、＝O、-SR′、-S-、-NR′2、-NR′3 +、＝NR′、-CX3、-CN、-OCN、-SCN、-N＝C＝O、-NCS、-NO、-NO2、＝N2、-N3、-NR′C(＝O)R′、-C(＝O)R′、-C(＝O)NR′2、-SO3 -、-SO3H、-S(＝O)2R′、-OS(＝O)2OR′、-S(＝O)2NR′、-S(＝O)R′、-OP(＝O)(OR′)2、-P(＝O)(OR′)2、-PO3-、-PO3H2、-C(＝O)X、-C(＝S)R′、-CO2R′、-CO2、-C(＝S)OR′、C(＝O)SR′、C(＝S)SR′、C(＝O)NR′2、C(＝S)NR′2和C(＝NR′)NR′2，其中每个X独立地为卤素：-F、-CI、-Br或-I；并且每个R’独立地为-H、-C1-C20烷基、-C6-C10芳基或-C3-C10杂环。
如本文所用，术语“烷基”指单价饱和烃链(具有直链或支链)。例如，烷基指C1-C20烷基。优选地，烷基是“低级烷基”，即具有1、2、3、4、5或6个碳的烷基基团(直链或支链C1-C20烷基基团)。例如，这包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正己基等等。
单独使用或作为亚烷基二醇的部分使用的亚烷基例如指如本文定义的二价饱和的直链或分支烷基基团。
烯基和炔基指具有2-20个，优选2-12个，更优选2-6个，尤其是2-4个碳原子的至少部分不饱和的、直链或分支的烃基团。烯基基团包含至少一个C＝C双键；炔基基团包含至少一个C≡C三键。
如本文所用，术语“C3-C8环烷基”或“碳环”指具有3至8个，优选3至6个碳原子的饱和或不饱和的环状基团。环烷基可以具有单个环或稠合在一起的多重环。环烷基还可以包括螺环。合适的环烷基基团包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
如本文所用，术语“C3-C8环亚烷基”或“碳环”指如本文定义的二价环烷基。
如本文所用，术语“卤素”指氟(-F)、氯(-C1)、溴(-Br)或碘(-I)基团。
如本文所用，术语“C1-C6卤代烷基”指如本文定义的C1-C6烷基，其被如本文定义的一个或多个卤素基团取代。合适的C1-C6卤代烷基基团包括三氟甲基和二氯甲基。
如本文所用，术语“杂烷基”指由1至12个碳原子，优选1至10个，更优选1至6个碳原子以及选自O、N、Si和S的一至三个杂原子组成的直链或分支烃链，并且其中所述氮和硫原子可以任选地是氧化的(例如：亚砜或砜)，并且氮杂原子可以任选地是季铵化的。杂原子O、N和S可以置于杂烷基基团的任何内部位置或在其处烷基基团与分子的剩余部分附着的位置处。
杂亚烷基指如上定义的二价杂烷基。对于杂亚烷基基团，杂原子也可以占据链末端中任一或两者。
如本文所用，术语“C1-C6烷氧基”指-O-烷基基团，其中所述烷基基团是如本文定义的C1-C6烷基。合适的C1-C6烷氧基基团包括甲氧基、乙氧基、丙氧基。
如本文所用，术语“C1-C6卤代烷氧基”指如本文定义的C1-C6烷氧基基团，其被如本文定义的一个或多个卤素基团取代。合适的卤代烷氧基包括三氟甲氧基。
如本文所用，术语“具有6至10个环原子的芳基”指具有含有6至10个环原子的单个环或稠合在一起的多重芳环的多不饱和、芳香族烃基团，其中至少一个环是芳香族的。芳环可以任选地包括与其稠合的一至两个另外的环(如本文定义的环烷基、杂环基或杂芳基)。合适的芳基基团包括与杂环基稠合的苯环、萘环和苯环，如苯并吡喃基、苯并二氧杂环戊烯基(benzodioxolyl)、苯并二噁烷基(benzodioxanyl)等等。
亚芳基指如上文定义的二价芳基基团。
如本文所用，术语“具有5至10个环原子的杂芳基”指含有5至10个原子、具有单个环或稠合在一起或共价连接的多重芳环的多不饱和的芳环系统，其中至少一个环是芳香族的，并且至少一个环原子是选自N、O和S的杂原子。氮和硫杂原子可以任选地是氧化的，并且氮杂原子可以任选地是季铵化的。此类环可以稠合到芳基环、环烷基环或杂环基环。此类杂芳基的非限制性实例包括：呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、三唑基、噁二唑基、噻二唑基、四唑基、噁三唑基、噻三唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、噁嗪基、二噁英基(dioxinyl)、噻嗪基、三嗪基、吲哚基、异吲哚基、苯并呋喃基、异苯并呋喃基、苯并噻吩基、异苯并噻吩基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、嘌呤基、苯并噻二唑基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、喹唑啉基和喹喔啉基。
如本文所用，术语“具有3至10个环原子的杂环基”、“具有3至10个环原子的杂环烷基”或“杂环基”指具有3至10个环原子，优选3至8个环原子的饱和或不饱和的环状基团，其中至少一个环原子是选自N、O和S的杂原子。氮和硫杂原子可以任选地是氧化的，并且氮杂原子可以任选地是季铵化的。杂环可以包括稠环或桥环以及螺环。杂环的实例包括但不限于四氢吡啶基、哌啶基、吗啉基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、哌嗪基、1-氮杂环庚烷基、咪唑啉基、1，4-二噁烷基等等。
如本文所用，术语“杂环”或“杂环亚烷基”指如本文定义的二价杂环。
此外，术语烷基、烯基、炔基、芳基、亚烷基、亚芳基、杂烷基、杂亚烷基、C3-C8碳环、C3-C8碳环、C3-C8杂环、C3-C8杂环、聚醚指具有选自以下的一个或多个取代基的任选地取代的基团：-X、-R′、-O-、-OR′、＝O、-SR′、-S-、-NR′2、-NR′3、＝NR′、-CX3、-CN、-OCN、-SCN、-N＝C＝O、-NCS、-NO、-NO2、＝N2、-N3、-NRC(＝O)R′、-C(＝O)R′、-C(＝O)NR′2、-SO3 -、-SO3H、-S(＝O)2R′、-OS(＝O)2OR′、-S(＝O)2NR′、-S(＝O)R′、-OP(＝O)(OR′)2、-P(＝O)(OR′)2、-PO3 -、-PO3H2、-C(＝O)R′、-C(＝O)X、-C(＝S)R′、-CO2R′、-CO2、-C(＝S)OR′、C(＝O)SR′、C(＝S)SR′、C(＝O)NR′2、C(＝S)NR′2和C(＝NR′)NR′2，其中每个X独立地为卤素：-F、-CI、-Br或-I；并且每个R′独立地为-H、-C1-C20烷基、-C6-C10芳基或-C3-C10杂环。
如本文所用，术语“聚醚”指含有醚键合的聚合物。聚醚中的醚部分的数目可以介于2和100之间，优选2和25之间，特别是2和10之间。聚醚的实例包括聚乙二醇。
吸电子基团指通常通过共振或诱导效应将电子密度从相邻原子拉向自身的原子或基团。吸电子基团包括卤素、卤代烷基(如-CF3)、-CN、-SO3H、-NO2和-C(O)R基团，其中R＝H、OH或烷氧基。有利地，吸电子基团是-NO2。在一个实施方案中，吸电子基团相对于苯环的Y-T取代基处于邻位。
如本文所用，术语“保护基团”指可以通过可容易获得的试剂选择性去除的化学取代基，所述试剂并不攻击分子中的再生的官能团或其它官能团。合适的保护基团是本领域已知的并且将继续开发。合适的保护基团可以例如在Wutz等人(″Greene′s ProtectiveGroups in Organic Synthesis，Fourth Edition，″Wiley-Interscience，2007)中找到。在某些实施方案中，使用如通过Wutz等人(第696-927页)描述的用于保护氨基基团的保护基团。氨基保护基团的代表性实例包括但不限于叔丁氧羰基(Boc)、9-芴基甲氧羰基(Fmoc)、乙酰基(Ac)、羧基苄基基团(Cbz)、苄基基团(Bn)、烯丙基、三氟乙酰基、烯丙氧羰基(Alloc)基团和2，2，2-三氯乙氧基羰基(Troc)。
疏水性掩蔽实体指可以降低化合物的表观疏水性的基团。疏水性掩蔽实体可以选自聚肌氨酸和聚乙二醇。乙二醇或肌氨酸部分的数目可以在宽范围内变化。例如，疏水性掩蔽实体中的乙二醇或肌氨酸部分的数目可以介于2和500之间，优选5和100之间，特别是5和25之间。在一个实施方案中，疏水性掩蔽实体是包含6至24个肌氨酸部分，优选包含10至12个肌氨酸部分的聚肌氨酸。
如本文所用，术语“键合的”指键合。该键合也由式(I)中的破折号“-”表示。键合可以是共价键，或例如通过静电力的非共价相互作用。优选地，键是共价键。如本文所用，式上的“波浪线”表示本公开的ADC的每个部分(Ab、L、Z、X和D)之间的附着位点。
如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”指以下一种或多种：(1)抑制疾病；例如，抑制正在经历或展示疾病、状况或病症的病理学或症状学的个体中的疾病、状况或病症(即，阻止病理学和/或症状学的进一步发展)；和(2)改善疾病；例如，改善正在经历或展示疾病、状况或病症的病理学或症状学的个体中的疾病、状况或病症(即，逆转病理学和/或症状学)，例如减少疾病的严重程度或者降低或减轻疾病的一种或多种症状。特别地，关于肿瘤的治疗，术语“治疗”可以指肿瘤生长的抑制或肿瘤大小的缩减。
如本文所用，ADC的“治疗有效量”或“有效量”是足以执行特别陈述的目的的量，例如以在施用后产生疗效，例如抑制或降低肿瘤生长率或肿瘤体积，减轻癌症症状或治疗功效的一些指标。在癌症的情况下，治疗有效量的ADC可以减少癌细胞的数目，缩减肿瘤大小，抑制(例如减缓或停止)肿瘤转移，抑制(例如减缓或停止)肿瘤生长，和/或缓解一种或多种症状。
如本文所用，两个序列之间的百分比同一性是由序列共享的相同位置数目的函数(即，％同一性＝相同位置的数目/位置的总数目x 100)，考虑到空位的数目和每个空位的长度，所述空位需要引入用于两个序列的最佳比对。可以使用数学算法来完成序列的比较和两个序列之间的百分比同一性的确定，如下文所述。
两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用Needleman和Wunsch算法(NEEDLEMAN和Wunsch)进行确定。
两个核苷酸序列或氨基酸序列之间的百分比同一性还可以使用例如算法如EMBOSS Needle(成对比对；可在WWW.ebi.ac.uk处获得)进行确定。例如，EMBOSS Needle可以与BLOSUM62矩阵，“空位开放罚分”10，“空位延伸罚分”0.5，假“末端空位罚分”，“端部空位开放罚分”10和“端部空位延伸罚分”0.5一起使用。一般而言，“同一性百分比”是匹配位置的数目除以比较位置的数目并乘以100的函数。例如，如果比对后10个序列位置中的6个在两个比较序列之间是相同的，则同一性为60％。％同一性通常在对其执行分析的查询序列的整个长度上进行确定。具有相同的一级氨基酸序列或核酸序列的两个分子是相同的，不管任何化学和/或生物学修饰如何。
用于制备本公开的ADC的抗体Ab
用于制备本公开的ADC的抗体Ab是抗叶酸受体α(FRα)抗体，其与SEQ ID NO：12特异性结合。
优选地，此类抗体包括如下表1中所述的分离的且结构特征在于其可变重链和轻链氨基酸序列和人恒定同种型的下述抗体：
表1：可变重链和轻链氨基酸序列
IgG1 LALA对应于突变型IgG1 Fc区，包括在残基234和235处从亮氨酸到丙氨酸的氨基酸取代，其还公开于通过Hezareh等人的J.Virol 2001年12月；75(24)：12161-8中。
mAb1的全长轻链和重链以及相应的编码序列显示于下表2中。
表2：全长重链和轻链氨基酸和DNA编码序列
mAb1抗体的VH CDR1(也称为HCDR1)、VH CDR2(也称为HCDR2)、VH CDR3(也称为HCDR1)、VL CDR1(也称为LCDR1)、VL CDR2(也称为LCDR2)、VL CDR3(也称为HCDR3)的氨基酸序列的实例显示于表3中。
在表3中，使用Kabat系统划定了本公开的一些抗体的CDR区。为便于阅读，CDR区在下文中分别称为HCDR1、HCDR2、HCDR3、L，CDR 1、L，CDR2、L，CDR3。
表3：根据Kabat的mAb 1的CDR区(也公开于WO2017151979中)
下表4和5提供了相对于ADC的抗体的有用的氨基酸序列和核苷酸序列。
表4：用于实践本发明的有用的氨基酸序列和核苷酸序列的简述
*aa为氨基酸序列
nt为核苷酸序列
表5：用于实践本发明的有用的氨基酸序列和核苷酸序列
在一个实施方案中，Ab是分离的重组抗体，其具有：
(i)包含SEQ ID NO：1的HCDR1、SEQ ID NO：2的HCDR2、SEQ ID NO：3的HCDR3的重链可变区；和，
(ii)包含SEQ ID NO：4的LCDR1；SEQ ID NO：5或8的LCDR2；和SEO ID NO：6的LCDR3的轻链可变区；
其中所述抗体与SEQ ID NO：12的叶酸受体α特异性结合。
在具体实施方案中，Ab是包含以下任一的重组抗体：
(a)包含SEQ ID NO：1的HCDR1、SEQ ID NO：2的HCDR2、SEQ ID NO：3的HCDR3的可变重链多肽，以及包含SEQ ID NO：4的LCDR1、SEQ ID NO：5的LCDR2和SEQ ID NO：6的LCDR3的可变轻链多肽；或，
(b)包含SEQ ID NO：7的VH的可变重链多肽，以及包含SEQ ID NO：8的VL的可变轻链多肽。
在具体实施方案中，Ab是重组抗体，其包含SEQ ID NO：9的重链和SEQ ID NO：10的轻链或者基本上由其组成。
在具体实施方案中，Ab是重组抗体，其包含SEQ ID NO：11的重链和SEQ ID NO：10的轻链或者基本上由其组成。
在具体实施方案中，Ab是重组抗体，其包含SEQ ID NO：16的重链和SEQ ID NO：17的轻链或者基本上由其组成。
在一个具体实施方案中，Ab是具有以下性质中的一种或多种的抗FRα抗体：
(i)如通过表面等离子体共振例如测定测量的，它以100nM或更低的KD，优选50nM或更低的KD与叶酸受体a(FRα)结合；
(ii)它是一种内化抗体，特别地，它在表达FRα的肿瘤细胞中内化；
(iii)它允许4至8个有效载荷/抗体的缀合，特别是没有稳定性问题或聚集。
在可以与先前实施方案组合的某些实施方案中，Ab是上文限定的重组抗体的内化抗体片段。
如本文提及抗体使用的“内化”指这样的抗体，其在与细胞特异性结合后，能够穿过细胞的脂质双层外膜到内部区室(即“内化”)，优选进入细胞中的降解区室内。
抗体片段包括但不限于Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2、Fv、UniBody和scFv片段、双抗体、单结构域或纳米抗体和其它片段。术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包含在同一多肽链(VH-VL)中与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短而不允许同一链上的两个结构域之间的配对的接头，结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合位点。单结构域抗体是包含抗体重链可变结构域的全部或一部分或者轻链可变结构域的全部或一部分的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，MA；参见例如美国专利号6,248,516 B1)。抗体片段可以通过各种技术进行制备，所述技术包括但不限于完整抗体的蛋白酶解消化以及如本文所述的通过重组宿主细胞的产生。
在某些实施方案中，Ab是人源化抗体。通常，非人抗体进行人源化以降低对人的免疫原性，同时具有至少亲本非人抗体相同的亲和力(或更高的亲和力)。在优选实施方案中，本公开的抗体是人源化抗体。一般地，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中CDR(或其各部分)衍生自非人抗体，例如鼠抗FRα内化抗体，并且框架区(或其各部分)衍生自人抗体序列。人源化抗体任选地还包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些框架残基被来自非人抗体(例如，CDR残基由其衍生的抗FRα鼠抗体)的相应残基取代，例如，以恢复或改善抗体特异性或亲和力。在一些具体实施方案中，人源化抗体中的一些CDR残基也被取代，例如，以恢复或改善抗体特异性或亲和力。人源化抗体及其制备方法例如在Almagro和Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008)中进行综述，并且例如在以下中进行进一步描述：Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；Queen等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人，Methods 36：25-34(2005)(描述特异性决定区(SDR)移植)；Padlan，Mol.Immunol.28：489-498(1991)(描述“表面重塑”)；Dall′Acqua等人，Methods 36：43-60(2005)（描述“FR改组”)；以及Osbourn等人，Methods 36：61-68(2005)和Klimka等人，Br.J.Cancer，83：252-260(2000)(描述FR改组的“引导选择”方法)。
优选地，Ab是人源化或人沉默抗体，优选人源化沉默IgG1抗体。
如本文所用，术语“沉默”抗体指如在ADCC活性测定中测量的，并未显示出ADCC活性或显示出低ADCC活性的抗体。
在一个实施方案中，术语“无或低ADCC活性”意指沉默抗体显示出的ADCC活性至少低于10％，例如低于用具有野生型相应IgG同种型的相应抗体观察到的ADCC活性的50％。
沉默的效应子功能可以通过抗体的Fc恒定部分中的突变获得，并且已在本领域中进行描述：Strohl 2009(AA&N297A)；Baudino 2008，D265A(Baudino等人，J.Immunol.181(2008)：6664-69，Strohl，CO Biotechnology 20(2009)：685-91)，或者在Saunders 2019(Front.Immunol.，07 June 2019，doi：10.3389/fimmu.2019.01296)中进行综述。沉默IgG1抗体的实例包括所谓的LALA突变，其包含在IgG1 Fc氨基酸序列中的L234A和L235A突变，或与Leu235Glu配对的Ser228Pro。还可以使用任选地与Ledu234Glu和Leu235Phe(LALA-PG)组合的Pro331Ser，以生成沉默IgG1抗体。沉默IgG1抗体的另一个实例包含N297A突变，其导致无糖基化或非糖基化抗体。沉默IgG4抗体的实例包含Ser228Pro。
在具体实施方案中，Ab是法妥组单抗，或者如WO2005080431或WO2017151979中公开的其它抗FRα抗体。
在其它具体实施方案中，Ab是米妥昔单抗或米妥昔单抗的沉默LALA突变体形式。
在优选实施方案中，Ab是法妥组单抗的沉默LALA突变体形式，或者如WO2005080431或WO2017151979中公开的其它抗FRα抗体。
可以通过编码核酸分子的诱变(例如定点诱变或PCR介导的诱变)来获得具有突变型氨基酸序列的抗体，随后为使用本文所述的功能测定关于保留的功能(即上文阐述的功能)测试所编码的改变抗体。
具有保守修饰的抗体
在某些实施方案中，Ab具有包含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区，以及包含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区，其中这些CDR序列之一或全部具有基于本文所述的mAb 1(法妥组单抗的沉默LALA突变体形式)抗体的指定氨基酸序列，或者具有与法妥组单抗的CDR序列相差1、2或3个氨基酸保守修饰的类似CDR序列的所述抗体的功能变体，并且其中特别是当用作ADC时，所述抗体或蛋白质保留了mAb1抗体的所需功能性质。
在某些实施方案中，Ab具有包含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区，以及包含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区，其中这些CDR序列中的一个或多个具有基于本文所述的米妥昔单抗(或米妥昔单抗的沉默LALA突变体形式)抗体的指定氨基酸序列，或者具有与法妥组单抗的CDR序列相差1、2或3个氨基酸保守修饰的类似CDR序列的所述抗体的功能变体，并且其中特别是当用作ADC时，所述抗体或蛋白质保留了mAb1抗体的所需功能性质。
抗FRα抗体的所需功能性质包括但不限于以下：
(i)如通过Elisa测定(如实施例中描述的)确定的，它以低于5nM，例如约0.5nM的EC50与叶酸受体受体a(FRα)结合。
(ii)如通过表面等离子体共振例如测定测量的；例如如使用实施例中描述的SPR Biacore亲和力测定确定的，它以100nM或更低的KD，优选50nM或更低的KD与叶酸受体a(FRα)结合，
(iii)它是一种内化抗体，特别地，它在表达FRα的肿瘤细胞中内化；
(iv)它允许4至8个有效载荷/抗体的缀合，特别是没有稳定性问题或聚集，其中所述药物抗体比例如通过如实施例中描述的RPLC-MS进行确定；
(v)例如使用如实施例中使用的FRα阴性细胞系中的体外功效测定，具有此类变体抗FRα抗体的ADC在FRα阴性细胞系(例如BT-474乳腺癌细胞系)中提供了与具有mAb1作为抗FRα抗体的相应对照ADC相似或更低的体外功效；和/或，
(vi)例如使用如实施例中使用的异种移植模型之一，具有此类变体抗FRα抗体的ADC在荷瘤小鼠异种移植模型中提供了与具有mAb1作为抗FRa抗体的相应对照ADC相似或更高的体内功效。
如本文所用，术语“保守序列修饰”预期指其中氨基酸残基由具有相似侧链的氨基酸残基替换的氨基酸取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域已得到限定。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本公开的抗体的CDR区内的一个或多个氨基酸残基可以由来自相同侧链家族的其它氨基酸残基替换，并且改变的抗体可以使用本文所述的功能测定对于保留的功能进行测试。
修饰可以通过本领域已知的标准技术，例如定点诱变和PCR介导的诱变引入本公开的抗体内。
在具体实施方案中，Ab是抗FRα抗体，其包含与SEQ ID NO：1-6的相应CDR具有100％同一性的6个CDR，以及分别与SEQ ID NO：7和8中指定的相应框架氨基酸区域具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的框架氨基酸区域，其中所述抗FRα抗体具有以下性质：
(i)如通过Elisa测定(如实施例中描述的)确定的，它以低于5nM，例如约0.5nM的EC50与叶酸受体受体a(FRα)结合。
(ii)如通过表面等离子体共振例如测定测量的，它以100nM或更低的KD，优选50nM或更低的KD与叶酸受体a(FRa)结合；
(iii)它是一种内化抗体，特别地，它在表达FRα的肿瘤细胞中内化；
(iv)它允许4至8个有效载荷/抗体的缀合，特别是没有稳定性问题或聚集，其中所述药物抗体比例如通过如实施例中描述的RPLC-MS进行确定；
(v)例如使用如实施例中使用的FRα阴性细胞系中的体外功效测定，具有此类变体抗FRα抗体的ADC在FRα阴性细胞系(例如BT-474乳腺癌细胞系)中提供了与具有mAb1作为抗FRα抗体的相应对照ADC相似或更低的体外功效；和/或，
(vi)例如使用如实施例中使用的异种移植模型之一，具有此类变体抗FRα抗体的ADC在荷瘤小鼠异种移植模型中提供了与具有mAb1作为抗FRa抗体的相应对照ADC相似或更高的体内功效。
在具体实施方案中，Ab是抗FRα抗体，其包含与米妥昔单抗的相应CDR具有100％同一性的6个CDR，以及与米妥昔单抗的相应框架氨基酸区域具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的框架氨基酸区域，其中所述抗FRα抗体具有以下性质：
(i)如通过Elisa测定(如实施例中描述的)确定的，它以低于5nM，例如约0.5nM的EC50与叶酸受体受体a(FRα)结合。
(ii)如通过表面等离子体共振例如测定测量的，它以100nM或更低的KD，优选50nM或更低的KD与叶酸受体a(FRa)结合；
(iii)它是一种内化抗体，特别地，它在表达FRα的肿瘤细胞中内化；
(iv)它允许4至8个有效载荷/抗体的缀合，特别是没有稳定性问题或聚集，其中所述药物抗体比例如通过如实施例中描述的RPLC-MS进行确定；
(v)例如使用如实施例中使用的FRα阴性细胞系中的体外功效测定，具有此类变体抗FRα抗体的ADC在FRα阴性细胞系(例如BT-474乳腺癌细胞系)中提供了与具有mAb1作为抗FRα抗体的相应对照ADC相似或更低的体外功效；和/或，
(vi)例如使用如实施例中使用的异种移植模型之一，具有此类变体抗FRα抗体的ADC在荷瘤小鼠异种移植模型中提供了与具有mAb1作为抗FRα抗体的相应对照ADC相似或更高的体内功效。
框架或Fc改造
为了在本公开的ADC中使用，Ab还可以包含先前节段中公开的抗体的改造形式，并且包括其中已对VH和/或VL内的框架残基进行修饰例如以改善抗体的性质的那些。通常，进行此类框架修饰以减少抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个框架残基“回复突变”为相应的种系序列。更具体地，已经历体细胞突变的抗体可能含有与抗体由其衍生的种系序列不同的框架残基。可以通过将抗体框架序列与抗体由其衍生的种系序列进行比较来鉴定此类残基。为了将框架区序列恢复到其种系配置，体细胞突变可以通过例如定点诱变或PCR介导的诱变“回复突变”为种系序列。此类“回复突变的”抗体也预期由本发明涵盖。
另一种类型的框架修饰涉及使框架区内或者甚至一个或多个CDR区内的一个或多个残基突变，以去除T细胞表位，从而降低抗体的潜在免疫原性。
加上或替代在框架或CDR区内进行的修饰，抗体可以被改造为包括Fc区内的修饰，通常以改变抗体的一种或多种功能性质，例如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞的细胞毒性。
此外，Ab是这样的抗体，其可以进行化学修饰(例如，一个或多个化学部分可以附着到抗体)或进行修饰以改变其糖基化，再次以改变抗体的一种或多种功能性质。这些实施方案各自在下文进一步详细地进行描述。
如本文所用，术语“同种型恒定区”或“Fc区”可互换使用，以限定免疫球蛋白重链的C末端区域，包括天然序列Fc区和变体Fc区。人IgG重链Fc区一般定义为包含从IgG抗体的位置C226或P230到羧基末端的氨基酸残基。Fc区中的残基编号是Kabat的EU索引的残基编号。Fc区的C末端赖氨酸(残基K447)可以例如在抗体的生产或纯化过程中被去除。相应地，本公开的抗体组合物可以包含其中去除所有K447残基的抗体群体、其中并未去除K447残基的抗体群体、以及具有和不具有K447残基的抗体混合物的抗体群体。
在一个具体实施方案中，CH1的铰链区这样进行修饰，使得铰链区中的半胱氨酸残基数目被改变，例如增加或减少。这种方法在通过Bodmer等人的美国专利号5,677,425中进行进一步描述。CH1的铰链区中的半胱氨酸残基数目被改变，例如，以促进轻链和重链的组装或者增加或减少抗体的稳定性。
在其它实施方案中，Fc区通过修饰一个或多个氨基酸进行修饰，以减少抗体介导抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)的能力和/或减少抗体对于Fcγ受体的亲和力。具有减少的效应子功能且特别是减少的ADCC的此类抗体包括沉默抗体。
在某些实施方案中，使用IgG1同种型的Fc结构域。在一些具体实施方案中，使用IgG1 Fc片段的突变型变体，例如沉默的IgG1 Fc，其降低或消除ADC介导抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和/或与Fcγ受体结合的能力。IgG1同种型沉默突变体的一个优选实例是IgG1，其中在氨基酸位置234和235处的亮氨酸被丙氨酸替换(所谓的LALA突变)，如通过Hezareh等人在J.Virol 2001年12月；75(24)：12161-8中所述的。另一个实例是具有LALA-PG三重突变的IgG1同种型沉默突变体，其中除了LALA突变外，在位置329处的脯氨酸也被甘氨酸替换。
在某些实施方案中，Fc结构域是阻止在Fc结构域的位置297处的糖基化的沉默Fc突变体。例如，Fc结构域含有在位置297处的天冬酰胺的氨基酸取代。此类氨基酸取代的实例是N297被甘氨酸或丙氨酸的替换。
在另外一个实施方案中，抗体的糖基化被修饰。例如，可以制备无糖基化抗体(即抗体缺乏糖基化)。可以改变糖基化，例如，以增加抗体对于抗原的亲和力。此类碳水化合物修饰可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，其导致一个或多个可变区框架糖基化位点的消除，从而消除在该位点处的糖基化。此类无糖基化可以增加抗体对于抗原的亲和力。此类方法在通过Co等人的美国专利号5,714,350和6,350,861中进一步详细地进行描述。
由本公开考虑的本文抗体的另一种修饰是聚乙二醇化或hesylation或相关技术。抗体可以进行聚乙二醇化，例如，以增加抗体的生物学(例如，血清)半衰期。为了使抗体聚乙二醇化，在其中一个或多个PEG基团变得附着到抗体或抗体片段的条件下，抗体或其片段通常与聚乙二醇(PEG)，例如PEG的反应性酯或醛衍生物反应。聚乙二醇化可以通过酰化反应或烷基化反应用反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)来进行。如本文所用，术语“聚乙二醇”预期涵盖已用于衍生其它蛋白质的任何形式的PEG，例如单(C1-C10)烷氧基或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中，待聚乙二醇化的抗体是无糖基化抗体。用于使蛋白质聚乙二醇化的方法是本领域已知的，并且可以应用于本公开的抗体。参见例如通过Nishimura等人的EP 0 154 316和通过Ishikawa等人的EP 0 401 384。
由本公开考虑的抗体的另一种修饰是本公开的抗体的至少抗原结合区与血清蛋白质例如人血清白蛋白或其片段的缀合或蛋白质融合物，以增加所得到的分子的半衰期。此类方法例如在Ballance等人EP 0 322 094中进行描述。
用于制备本公开的ADC的抗体的产生
本公开的抗体可以使用本领域技术人员已知的常规技术来获得。关于编码本公开的抗体的核酸以及生成产生这些抗体的转染瘤的更多信息，本领域技术人员还可以参考国际申请号WO2005080431。
例如，为了表达抗体或其抗体片段，可以通过标准分子生物学或生物化学技术(例如，DNA化学合成、PCR扩增或使用表达感兴趣抗体的杂交瘤的cDNA克隆)获得编码部分或全长轻链和重链的DNA，并且可以将DNA插入表达载体内，使得基因可操作地连接到转录和翻译控制序列。在此背景下，术语“可操作地连接的”预期意指抗体基因连接到载体内，使得载体内的转录和翻译控制序列发挥其调控抗体基因的转录和翻译的预期功能。选择表达载体和表达控制序列以与所使用的表达宿主细胞相容。抗体轻链基因和抗体重链基因可以插入分开的载体内，或者更通常地，将两个基因插入同一表达载体内。通过标准方法(例如，抗体基因片段和载体上的互补限制位点的连接，或者如果不存在限制位点，则平端连接)将抗体基因插入表达载体内。本文所述的抗体的轻链和重链可变区可以通过以下用于产生任何抗体同种型的全长抗体基因：将它们插入已经编码所需同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体内，使得VH区段可操作地连接到载体内的CH区段，并且VL区段可操作地连接到载体内的CL区段。另外或可替代地，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞中的分泌的信号肽。可以将抗体链基因克隆到载体内，使得信号肽与抗体链基因的氨基末端在框内连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。
除了抗体链基因外，本文公开的重组表达载体还携带控制抗体链基因在宿主细胞中的表达的调控序列。术语“调控序列”预期包括控制抗体链基因的转录或翻译的启动子、增强子和其它表达控制元件(例如，多聚腺苷酸化信号)。本领域技术人员应了解，表达载体的设计，包括调控序列的选择，可能取决于此类因素如待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白质的表达水平等。用于哺乳动物宿主细胞表达的调控序列包括指导哺乳动物细胞中的高水平蛋白质表达的病毒元件，例如衍生自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。可替代地，可以使用非病毒调控序列，例如泛素启动子或P-珠蛋白启动子。再进一步地，由来自不同来源的序列构成的调控元件，例如SRa启动子系统，其含有来自SV40早期启动子的序列和人T细胞白血病病毒1型的长末端重复。
除了抗体链基因和调控序列外，本公开的重组表达载体还可以携带另外的序列，例如调控载体在宿主细胞中的复制的序列(例如，复制起点)和可选择标记物基因。可选择标记物基因促进载体已引入其内的宿主细胞的选择(参见例如都通过Axel等人的美国专利号4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，可选择标记物基因通常赋予载体已引入其内的宿主细胞针对药物例如G418、潮霉素或氨甲蝶呤的抗性。可选择标记物基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(与氨甲蝶呤选择/扩增一起用于dhfr-宿主细胞中)和neo基因(用于G418选择)。
为了表达轻链和重链，编码重链和轻链的表达载体通过标准技术转染到宿主细胞内。术语“转染”的各种形式预期涵盖通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞内的广泛多样的技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-右旋糖酐转染等等。在原核或真核宿主细胞中表达本公开的抗体理论上是可能的。讨论抗体在真核细胞例如哺乳动物宿主细胞、酵母或丝状真菌中的表达，因为此类真核细胞，且特别是哺乳动物细胞，比原核细胞更有可能组装且分泌正确折叠且具有免疫活性的抗体。
表3和表4中已描述了编码用于制备本公开的ADC的优选抗体的重链和轻链的核苷酸序列(特别参见SEQ ID NO 13-15)。
用于表达本公开的重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)，包括与DHFR可选择标记物(如Kaufman和Sharp，1982中描述的)一起使用的dhfr-CHO细胞(Urlaub和Chasin，1980中描述的)、CHO K1 dhfr+细胞系、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞内时，通过将宿主细胞培养一段时间来产生抗体，所述时间段足以在宿主细胞中表达抗体，并且任选地，将抗体分泌到宿主细胞在其中生长的培养基内。抗体可以进行回收，并且使用标准蛋白质纯化方法在其分泌后例如从培养基中进行纯化。
接头L
如本文所用，“接头”或“接头部分”指能够将化合物例如药物部分与另一部分例如抗体部分共价连接的任何化学部分。
本公开的ADC含有在一侧上与Ab(如先前节段中公开的所述抗FRα抗体)键合，并且在另一侧上与药物D键合的可切割的接头部分L。
在具体实施方案中，接头L与抗体Ab的一个或多个硫醇残基共价键合，所述硫醇残基例如来自抗体序列的天然或人工半胱氨酸残基。
如本文所用，词语“可切割的”指可以在特定环境条件(例如氧化还原电位或pH)下或特定溶酶体酶响应细胞内环境(例如，ADC在细胞中内化后)切割的接头。
在具体实施方案中，L是式-A-W-的可切割的接头部分，其中A是与Ab连接的任选延伸单元，并且w是与D连接的可切割部分。
在具体实施方案中，任选延伸单元A可以选自一个或多个氨基酸、一个或多个N取代的氨基酸、任选取代的聚醚、C1-C12亚烷基、具有6至10个环原子的亚芳基、C3-C8环亚烷基、具有5至10个环原子的杂环亚烷基、具有5至10个环原子的杂亚芳基、C2-C10亚烯基及其任何组合，
所述亚烷基和亚烯基任选地被选自以下的一个或多个杂原子或者化学基团中断：-O-、-S-、-C(O)-、-NR″-、-C(O)NR″-、-NR″-C(O)-、-NR″-C(O)-NR″′-、-NR″-C(O)-O-、-O-C(O)NR″-和三唑，
并且所述亚烷基、亚芳基、环亚烷基、杂环亚烷基、杂亚芳基和亚烯基任选地被选自以下的一个或多个取代基取代：卤素、氧代、-OH、-NO2、-CN、C1-C6烷基、C3-C6环烷基、具有5至10个环原子的杂环基、具有6至10个环原子的芳基、具有5至10个环原子的杂芳基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、-(CO)-R′、-O-(CO)-R′、-(CO)-O-R′、-(CO)-NR″R″′、-NR″-(CO)-R′和-NR″R″′；
R′、R″和R″′独立地选自H和C1-C6烷基。
可以用于本公开的ADC的可切割接头的实例包括酸敏感或酸不稳定的接头，例如酸不稳定的腙接头、溶酶体蛋白酶敏感的接头、b-葡糖苷酸接头或谷胱甘肽敏感的二硫键接头。
在其中L是溶酶体蛋白酶敏感的接头的具体实施方案中，w包含可切割的肽部分，其可以选自缬氨酸-瓜氨酸(Val-Cit)、丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺(Ala-Ala-Asn)、缬氨酸-丙氨酸(Val-Ala)和苯丙氨酸-赖氨酸(Phe-Lys)。优选地，W包含缬氨酸-丙氨酸肽部分。
在其中L是蛋白酶敏感的接头的其它具体实施方案中，w包含优选地选自b-葡糖苷酸或b-半乳糖苷部分的糖可切割单元。
在其中L是谷胱甘肽敏感的接头的其它具体实施方案中，w包含二硫键部分。
在优选实施方案中，L是式-A-W-的可切割的接头部分，其中w具有下式(III)
其中
每个R2独立地选自吸电子基团和C1-C4烷基；
n是0、1或2；
T是糖可切割单元或多肽可切割单元；
当T是糖可切割单元时，Y是O，或者当T是多肽可切割单元时，Y是NR3；和
R3选自H、C1-C24烷基、C2-C6烯基；任选取代的聚醚、具有6至10个环原子的芳基、C3-C8环烷基、具有3至10个环原子的杂环烷基、具有5至10个环原子的杂芳基及其任何组合，
所述烷基和烯基任选地被选自以下的-个或多个杂原子或者化学基团中断：-O-、-S-、-C(O)-、-NR″-、-C(O)NR″-、-NR″-C(O)-、-NR″-C(O)-NR″′-、-NR″-C(O)-O-、-O-C(O)NR″-和三唑，
R″和R″′独立地选自H和C1-C6烷基，
及其药学上可接受的盐
在具体实施方案中，T是糖可切割单元，其为葡糖苷酸或半乳糖苷。
在其它具体实施方案中，T是优选地选自Val-Cit、Val-Ala和Phe-Lys的二肽。
在一个更具体的实施方案中，L对应于式(IV)的接头-A-W-
其中
X1是连接器单元；
Z是任选的间隔物；
X2是连接器单元；
K是任选的疏水性掩蔽实体，优选地选自聚肌氨酸和聚乙二醇；
R1选自H、C1-C24烷基、C2-C6烯基；任选取代的聚醚、具有6至10个环原子的芳基、C3-C8环烷基、具有3至10个环原子的杂环烷基、具有5至10个环原子的杂芳基及其任何组合，
所述烷基和烯基任选地被选自以下的一个或多个杂原子或者化学基团中断：-O-、-S-、-C(O)-、-NR″-、-C(O)NR″-、-NR″-C(O)-、-NR″-C(O)-NR″′-、-NR″-C(O)-O-、-O-C(O)NR″-和三唑；
R4选自H、C1-C6烷基和C2-C6烯基，所述烷基和烯基任选地被选自以下的一个或多个杂原子或者化学基团中断：-O-、-S-、-C(O)-和-NR″-；
R5选自H、C1-C6烷基和C2-C6烯基，所述烷基和烯基任选地被选自以下的一个或多个杂原子或者化学基团中断：-O-、-S-、-C(O)-和-NR″-。
在式(IV)的接头的一个优选实施方案中，X1和X2独立地选自一个或多个氨基酸、一个或多个N取代的氨基酸、任选取代的聚醚、C1-C12亚烷基、具有6至10个环原子的亚芳基、C3-C8环亚烷基、具有5至10个环原子的杂环亚烷基、具有5至10个环原子的杂亚芳基、C2-C10亚烯基及其任何组合，
所述亚烷基和亚烯基任选地被选自以下的一个或多个杂原子或者化学基团中断：-O-、-S-、-C(O)-、-NR″-、-C(O)NR″-、-NR″-C(O)-、-NR″-C(O)-NR″′-、-NR″-C(O)-O-、-O-C(O)NR″-和三唑，
并且所述亚烷基、亚芳基、环亚烷基、杂环亚烷基、杂亚芳基和亚烯基任选地被选自以下的一个或多个取代基取代：卤素、氧代、-OH、-NO2、-CN、C1-C6烷基、C3-C6环烷基、具有5至10个环原子的杂环基、具有6至10个环原子的芳基、具有5至10个环原子的杂芳基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、-(CO)-R′、-O-(CO)-R′、-(CO)-O-R′、-(CO)-NR″R″′、-NR″-(CO)-R′和-NR″R″′；
R′、R″和R″′独立地选自H和C1-C6烷基。
在式(IV)的接头的其它优选实施方案中，Z独立地选自一个或多个氨基酸、一个或多个N取代的氨基酸、任选取代的聚醚、C1-C12亚烷基、具有6至10个环原子的亚芳基、C3-C8环亚烷基、具有5至10个环原子的杂环亚烷基、具有5至10个环原子的杂亚芳基、C2-C10亚烯基及其任何组合，
所述亚烷基和亚烯基任选地被选自以下的一个或多个杂原子或者化学基团中断：-O-、-S-、-C(O)-、-NR″-、-C(O)NR″-、-NR″-C(O)-、-NR″-C(O)-NR″′-、-NR″-C(O)-O-、-O-C(O)NR″-和三唑，
并且所述亚烷基、亚芳基、环亚烷基、杂环亚烷基、杂亚芳基和亚烯基任选地被选自以下的一个或多个取代基取代：卤素、氧代、-OH、-NO2、-CN、C1-C6烷基、C3-C6环烷基、具有5至10个环原子的杂环基、具有6至10个环原子的芳基、具有5至10个环原子的杂芳基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、-(CO)-R′、-O-(CO)-R′、-(CO)-O-R′、-(CO)-NR″R″′、-NR″-(CO)-R′和-NR″R″′；
R′、R″和R″′独立地选自H和C1-C6烷基。
在式(IV)或(V)的接头L的其它实施方案中，K是聚肌氨酸，优选下式(V)
其中k是在2和50之间，优选在4和30之间的整数，
并且R6对应于OH或NH2。
在式(IV)或(V)的接头L的其它实施方案中，K是优选包含2至50个乙二醇部分的聚乙二醇部分(PEG)。
在一个优选实施方案中，L对应于式(VI)的接头：
优选地，所述接头L共价键合至抗体Ab的一个或多个硫醇残基，例如抗体Ab的八个硫醇残基。
有效载荷
在一个实施方案中，本公开的D是在X的羰基官能团的一侧上与X连接的有效载荷。在一个实施方案中，在X和D之间的键合在X的羰基官能团和D的氨基基团之间发生。
有效载荷D是ADC设计的重要组分。有效载荷可以是治疗剂或药物。术语“药物”特别指能够调节生物过程和/或具有生物活性的药剂。
在具体实施方案中，有效载荷D是细胞毒性药物，其在从肿瘤细胞的细胞质内的内化ADC中释放后被激活。它应该理想地能够破坏肿瘤细胞，而不影响非肿瘤细胞(当与抗体连接时)。有效载荷还应该理想地在体循环和溶酶体中具有高稳定性。它优选应该对于癌细胞系具有体外亚纳摩尔IC50值以及在水环境中足够的溶解度。
在具体实施方案中，细胞毒性药物选自微管破坏剂或抗有丝分裂剂例如奥瑞他汀(包括单甲基奥瑞他汀E(MMAE)、单甲基奥瑞他汀F(MMAF))、美登素类(例如美登素)，DNA损伤剂例如卡利奇霉素、倍癌霉素和蒽环类(例如柔红霉素、多柔比星、二羟基蒽二酮(dihyrdroxyanthracindione))，或拓扑异构酶I的抑制剂例如喜树碱或其类似物。
在具体实施方案中，D选自：泰素(taxon)、细胞松弛素B、奥瑞他汀(包括单甲基奥瑞他汀)、短杆菌肽D、溴化乙啶、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同源物。
在具体实施方案中，D选自抗代谢物(例如氨甲蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪)、消融剂(例如氮芥、噻替派(thioepa)、苯丁酸氮芥(chloraxnbucil)、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺二胺二氯铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类(例如柔红霉素(以前的道诺霉素)和多柔比星))、抗生素(例如更生霉素(以前的放线菌素)、博来霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))和抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)。
优选地，D是拓扑异构酶I的抑制剂，包括但不限于喜树碱类似物、吲哚并咔唑类似物、菲啶类似物、氟喹诺酮类似物、喹噁啉、吴茱萸胺、吖啶、萘啶、脱氧尼波霉素类似物、augustine类似物、芪噻唑类似物、吡咯喹啉醌(pyrroloquinazolinoquinoline)生物碱或茚并异喹啉类似物(关于综述参见：Selas等人，A patent review of topoisomerase Iinhibitors(2016-present)，2021，Expert Opinion on Therapeutic Patents，31(6)，473-508)；优选地选自喜树碱及其类似物，包括但不限于伊立替康、拓扑替康、喜树碱、SN-38、依喜替康、DXd、斯拉替康(silatecan)、可司替康(cositecan)、勒托替康、吉马替康、贝洛替康、鲁比替康(关于综述参见：Sriram等人，Camptothecin and its analogues：areview on their chemotherapeutic potential，2005，Natural Product Research，14(9)，393-412)。
在一个优选实施方案中，D是下式(II)的依喜替康的药物部分
本公开的ADC
在一个实施方案中，本公开提供了ADC，其中抗FRα抗体与药物(特别是依喜替康)连接。接头L如上文定义的。
优选地，此类ADC可以将有效剂量的药物例如拓扑异构酶I的抑制剂，优选依喜替康选择性地递送至表达FRα的肿瘤细胞。
在一个实施方案中，本公开提供了式(I)的ADC
Ab-[L-D]p (I)，
其中：
-Ab是与SEQ ID NO：12特异性结合的抗叶酸受体α(FRα)抗体，
-L是经由硫醇残基与所述抗体键合的可切割的接头部分，
-D是与L键合的细胞毒性药物部分，例如拓扑异构酶I的抑制剂，
-p是1至8，优选6至8，且更优选地p是8。
Ab、L和D已在先前节段中进行定义。
术语“p”也被称为药物抗体比或“DAR”，对应1式(I)的ADC中的每个抗体部分的药物部分数目或每个抗体Ab的-L-D部分数目。
虽然药物抗体比原则上具有关于单个ADC的精确值，但应理解，当用于描述含有许多ADC的组合物时，由于通常与缀合步骤相关的一定程度的不均匀性，该值经常是平均值。关于ADC的样品的平均负载在本文中也被称为药物抗体比或“DAR”。在一些实施方案中，DAR(p)在约1和约8之间(即1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5和8)，优选在约4和约8之间，更优选在约6和约8之间，且甚至更优选约8。
因此，在包含式(I)的ADC的多重拷贝的组合物中，“p”指每个抗体Ab的-L-D部分的平均数目。对于接近于8的平均p数目，ADC将被见为“DAR8”。
用于测量药物抗体比的方法在实施例中得到公开或例如在Conilh等人(Pharmaceuticals 2021，14(3)，247)中进行描述。
经由接头L加载到抗体的药物可能受到抗体部分上的附着位点数目的限制。在一些实施方案中，ADC的接头部分(L)通过抗体部分上的一个或多个氨基酸残基上的化学活性基团附着到抗体部分。例如，接头可以经由游离氨基酸、亚氨基、羟基、硫醇或羧基基团附着到抗体部分(例如N-或C-末端、一个或多个赖氨酸残基的ε氨基基团、一个或多个谷氨酸或天冬氨酸残基的游离羧基基团、或者一个或多个半胱氨酸残基的巯基基团)。接头与之附着的位点可以是抗体部分的氨基酸序列中的天然残基，或者它可以例如通过DNA重组技术(例如，通过将半胱氨酸或非天然氨基酸残基引入氨基酸序列内)或通过蛋白质生物化学(例如，通过还原、pH调整或水解)引入抗体部分内。
当附着位点是链间半胱氨酸硫醇基团时，抗体可能仅具有接头可以通过其附着的一个或几个半胱氨酸硫醇基团。事实上，大多数反应性半胱氨酸硫醇一般作为链间二硫桥存在。接头-毒素与抗体的过度附着可能通过减少可用于形成链间二硫桥的半胱氨酸残基而使抗体不稳定。因此，最佳药物抗体比应该增加ADC的效力(通过增加每个抗体附着的药物部分的数目)，而不使抗体部分不稳定且不降低药代动力学性质。
在具体实施方案中，-L-D与抗体的链间反应性硫醇残基键合。具有全长重链和轻链的典型抗体包含8个可用的链间反应性硫醇残基。因此，在具体实施方案中，ADC是DAR8ADC，其中八个-L-D部分与抗体Ab的8个链间反应性硫醇残基共价键合，并且最优选地，其中-L-对应于式(VI)。
在具体实施方案中，本公开的ADC对应于下式(VII)
其中Ab是如先前节段中定义的抗FRα，并且p是4至8，优选6至8。
在一个更优选的实施方案中，本公开的ADC对应于下式(VII)
其中Ab是如先前节段中定义的抗FRα。
在一个具体实施方案中，本公开的ADC对应于式(I)，其中
(i)Ab是抗叶酸受体α抗体或其抗原结合片段，其包含
·包含SEQ ID NO：1的HCDR1、SEQ ID NO：2的HCDR2、SEQ ID NO：3的HCDR3的可变重链多肽，和
·包含SEQ ID NO：4的LCDR1、SEQ ID NO：5的LCDR2和SEQ ID NO：6的LCDR3的可变轻链多肽；
(ii)L是式-A-W-的可切割接头，其中A是与Ab连接的任选延伸单元，并且W是与D连接的可切割部分
(iii)D是拓扑异构酶I的抑制剂，例如依喜替康；
(iv)p是1至8，优选8。
在一个具体实施方案中，本公开的ADC对应于式(I)，其中
(i)Ab是包含SEQ ID NO：9的重链和SEQ ID NO：10的轻链的抗体；
(ii)L是式-A-W-的可切割接头，其中A是与Ab连接的任选延伸单元，并且W是与D连接的可切割部分
(iii)D是拓扑异构酶I的抑制剂，例如依喜替康；
(iv)p是1至8，优选在6和8之间，例如约8。
在一个具体实施方案中，本公开的ADC是式(I)的ADC，其中
(i)Ab是包含SEQ ID NO：11的重链和SEQ ID NO：10的轻链的抗体；
(ii)L是式-A-W-的可切割接头，其中A是与Ab连接的任选延伸单元，并且W是与D连接的可切割部分
(iii)D是拓扑异构酶I的抑制剂，例如依喜替康；
(iv)p是1至8，优选在6和8之间，例如约8。
在一个优选实施方案中，本公开的ADC是式(VII)的ADC，其中Ab是包含SEQ ID NO：9的重链和SEQ ID NO：10的轻链的抗体。
在另一个具体实施方案中，本公开的ADC是式(VII)的ADC，其中Ab是包含SEQ IDNO：11的重链和SEQ ID NO：10的轻链的抗体。
药物组合物-制剂
在另一个方面，本公开提供了组合物，例如药物组合物，其含有连同药学上可接受的载体一起配制的本文公开的ADC(例如，与式(VI)的接头L结合的mAb1，其本身与药物例如依喜替康结合)之一或组合。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。本公开的药物制剂可以进一步包含选自以下的一种或多种药学上可接受的赋形剂：稳定剂、表面活性剂、缓冲剂、抗微生物防腐剂、保护剂、抗氧化剂、螯合剂、填充剂。
如本文所用，“溶剂”是用于制备液体制剂例如水性制剂的任何药学上可接受的(即，对于施用于人或另一种哺乳动物安全且无毒)和有用的成分。示例性溶剂包括水，例如无菌注射用水(WFI)或抑菌注射用水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液及其组合。优选地，溶剂是用于本公开的无菌水或抑菌注射用水(BWFI)。
如本文所用，稳定剂是尤其针对蛋白质解折叠和聚集增加蛋白质稳定性的化合物。优选地，稳定剂被当局认可为药物制剂中的合适添加剂或赋形剂。
稳定剂可以是糖。在本文中的“糖”包含一般组成(CH2O)n及其衍生物，包括单糖、二糖、三糖、多糖、糖醇、还原糖、非还原糖等。在本文中的糖的实例包括葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、果糖、麦芽糖、右旋糖酐、丙三醇、右旋糖酐、赤藓糖醇、甘油、阿拉伯糖醇、木糖醇(sylitol)、山梨糖醇、甘露糖醇、蜜二糖、松三糖、棉子糖、甘露三糖、水苏糖、麦芽糖、乳果糖、麦芽酮糖、葡萄糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、异麦芽酮糖等。
本公开的药物制剂中的稳定剂浓度介于1和500mM之间。
如本文所用，“表面活性剂”指表面活性试剂。表面活性剂一般加入蛋白质制剂中，以便降低疏水区的暴露，并且因此减少蛋白质-蛋白质相互作用和界面诱导的聚集，这也通过竞争吸附位点得到预防。
在本文中的表面活性剂的实例包括聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80)；泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂基硫酸钠；辛基糖苷钠；月桂基、肉豆蔻基、亚油基或硬脂酰基磺基甜菜碱；月桂基、肉豆蔻基、亚油基或硬脂酰基肌氨酸；亚油基、肉豆蔻基或鲸蜡基甜菜碱；月桂酰胺丙基、椰油酰胺丙基、亚油酰胺丙基、肉豆蔻酰胺丙基、棕榈酰胺丙基或异硬脂酰胺丙基甜菜碱(例如月桂酰胺丙基)；肉豆蔻酰胺丙基、棕榈酰胺丙基或异硬脂酰胺丙基二甲胺；椰油酰基甲基牛磺酸钠或油酰基甲基牛磺酸二钠；聚乙二醇、聚丙二醇和乙二醇与丙二醇的共聚物(例如Pluronics、PF68等)。药学上可接受的表面活性剂的其它实例包括聚氧乙烯-脱水山梨糖醇脂肪酸酯(Tween)、聚乙二醇-聚丙二醇、聚氧乙烯-硬脂酸酯、聚氧乙烯烷基醚例如聚氧乙烯单月桂基醚、烷基酚聚氧乙烯醚(Triton-X)、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆、Pluronic)和十二烷基硫酸钠(SDS)。最合适的聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯是聚山梨醇酯20(以商标Tween20TM出售)和聚山梨醇酯80(以商标Tween 80TM出售)。
最合适的聚乙烯-聚丙烯共聚物是以名称F68或Poloxamer 188TM出售的那些共聚物。最合适的聚氧乙烯烷基醚是以商标BrijTM出售的那些聚氧乙烯烷基醚。最合适的烷基酚-聚氧乙烯醚以商品名称Triton-X出售。
本公开的药物制剂中的表面活性剂浓度可以介于0.01和0.1％(w/v)之间。
如本文所用，术语“缓冲剂”指通过其酸/碱共轭组分的作用使包含其的溶液抵抗pH变化的药剂。将pH控制在此范围内的缓冲剂的实例包括乙酸盐、琥珀酸盐、葡糖酸盐、组氨酸、柠檬酸盐、甘氨酰甘氨酸和其它有机酸缓冲液。
“防腐剂”是可以加入本文的制剂中，以降低通过细菌、真菌或另一种传染剂的污染和/或其作用的化合物。例如，防腐剂的添加可以促进多次使用(多剂量)制剂的生产。潜在防腐剂的实例包括十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六甲双铵、苯扎氯铵(其中烷基基团是长链的烷基苄基二甲基氯化铵的混合物)和苄索氯铵。其它类型的防腐剂包括芳香醇，例如苯酚、丁醇和苯甲醇、对羟基苯甲酸烷基酯例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和w-甲酚。
如本文一般使用的，“保护剂”是当与蛋白质组合时，在冻干和/或后续冷冻贮存时显著降低蛋白质的化学和/或物理不稳定性的物质。示例性保护剂包括糖及其相应的糖醇，例如蔗糖、乳糖、海藻糖、右旋糖酐、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇；氨基酸，例如精氨酸或组氨酸；易溶盐(lyotropic salt)，例如硫酸镁；多元醇，例如丙二醇、甘油、聚(乙二醇)或聚(丙二醇)；及其组合。保护剂的另外示例包括明胶、糊精、改性淀粉和羧甲基纤维素。
保护剂可以以“冻干保护量”加入预冻干制剂中。这意味着，在冻干保护量的保护剂的存在下的蛋白质冻干后，蛋白质基本保持其物理和化学稳定性和完整性。
如本文一般使用的，“抗氧化剂”是一般用于限制氧化反应并且维持蛋白质的稳定性和安全性的药学上可接受的赋形剂。抗氧化剂的实例是抗坏血酸、焦亚硫酸钠、组胺、甲硫氨酸、抗坏血酸、谷胱甘肽、维生素E、聚乙烯亚胺。
本公开的药物制剂中的抗氧化剂浓度可以介于5和25mM之间。
“螯合剂”是一般用于维持蛋白质的稳定性的药学上可接受的赋形剂。螯合剂的实例包括依地酸二钠、二乙撑三胺五乙酸、柠檬酸、六磷酸盐、巯基乙酸、锌。
如本文一般使用的，“填充剂”是一般用于增加冻干混合物的质量并促成冻干饼的物理结构(例如，促进维持开孔结构的基本均匀的冻干饼的生产)的药学上可接受的赋形剂。示例性的填充剂包括甘露糖醇、甘氨酸、乳糖、改性淀粉、聚乙二醇)和山梨糖醇。
药物组合物的形式、施用途径、剂量和方案自然取决于待治疗的状况，病的严重程度，患者的年龄、重量和性别。
本公开的药物组合物可以配制用于局部、经口、肠胃外、腹膜内、鼻内、静脉内、肌内、皮下或眼内施用等等，优选腹膜内或静脉内。
优选地，药物组合物含有媒介物，其对于能够注射的制剂是药学上可接受的。这些可以特别是等渗的、无菌的盐水溶液(磷酸一钠或磷酸二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等等或者此类盐的混合物)，或干燥的、尤其是冷冻干燥的组合物，取决于情况，在添加无菌水或生理盐水后，所述组合物可以允许可注射溶液的构建。
用于施用的剂量可以根据各种参数进行调整，且特别是根据所使用的施用模式、相关病理学或可替代地所需的治疗持续时间进行调整。
为了制备药物组合物，可以将有效量的ADC溶解或分散在药学上可接受的载体或水性介质中。
适合于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体；包括芝麻油、花生油或水性丙二醇的制剂；以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末或冻干物。在所有情况下，形式必须是无菌的，并且必须流动至存在容易注射性的程度。它必须在制造和贮存条件下是稳定的，并且必须针对微生物例如细菌和真菌的污染作用进行防腐。
作为游离碱或药理学上可接受的盐的活性化合物的溶液可以在水中与表面活性剂例如羟丙基纤维素适当地混合进行制备。分散体也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中进行制备。在通常的贮存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以预防微生物的生长。
本公开的ADC可以配制成以中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(由蛋白质的游离氨基基团形成)，并且由无机酸例如如盐酸或磷酸或者此类有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等等形成。由游离羧基基团形成的盐也可以衍生自无机碱，例如如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及此类有机碱如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等等。
无菌可注射溶液通过以下进行制备：需要时，将以所需量的活性化合物与上文列举的各种其它成分一起掺入适当的溶剂中，随后为过滤灭菌。一般地，分散体通过将各种灭菌活性成分掺入无菌媒介物内进行制备，所述媒介物含有基本分散介质和来自上文列举的所需其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，所述技术从其先前无菌过滤的溶液得到活性成分加上任何另外所需成分的粉末。
还考虑了用于直接注射的更浓缩或高度浓缩的溶液的制备，其中设想了使用DMSO作为溶剂，以导致极快速的渗透，将高浓度的活性剂递送到小肿瘤区域。
在配制后，溶液以与剂量制剂相容的方式以及治疗上有效的此类量进行施用。制剂易于以各种剂型，例如上述可注射溶液的类型进行施用，但也可以采用药物释放胶囊等等。
对于水溶液中的肠胃外施用，例如，必要时，溶液应该适当地进行缓冲，并且液体稀释剂首先用足够的盐水或葡萄糖致使等渗。这些特定的水溶液尤其适合于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。在这方面，按照本公开，可以采用的无菌水性介质将是本领域技术人员已知的。例如，一个剂量可以溶解于1ml等渗NaCl溶液中，并且或者加入1000ml皮下注射液中或在提议的输注部位处注射(参见例如，″Remington′s Pharmaceutical Sciences″第15版，第1035-1038页和第1570-1580页)。取决于待治疗的受试者的状况，将必然发生剂量中的一些变动。无论如何，负责施用的个人将确定用于各个受试者的适当剂量。
本公开的ADC可以配制在治疗混合物内，以包含约0.0001至1.0毫克、或约0.001至0.1毫克、或约0.1至1.0或甚至1.0至约10毫克/剂量。还可以施用多重剂量。
包含本公开的ADC的药物制剂可以是“即用型”可注射制剂或冻干制剂。
在一个具体实施方案中，包含本公开的ADC的药物制剂可以以预填充式注射器供应。
本公开的ADC的用途和方法
本公开的ADC具有治疗效用。例如，这些分子可以在受试者中，例如体内施用，以治疗或预防各种病症。
本文考虑了使用本公开的ADC作为药剂，特别是用于治疗有此需要的受试者中的癌症，特别是具有表达FRα的肿瘤细胞的癌症，更具体地，具有实体瘤的癌症，且更具体地选自卵巢癌、乳腺癌、肺癌或间皮瘤。
术语“癌症”指或描述哺乳动物中的生理状况，其通常特征在于不受调控的细胞生长。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤(包括髓母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)、肉瘤(包括脂肪肉瘤和滑膜细胞肉瘤)、神经内分泌肿瘤(包括类癌瘤、胃泌素瘤和胰岛细胞癌)、间皮瘤、神经鞘瘤(包括听神经瘤)、脑膜瘤、腺癌、黑色素瘤和白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更具体实例包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌或胃的癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌或肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食道癌、胆道肿瘤以及头颈癌。
本公开的ADC可特别用于治疗选自卵巢癌、三阴性乳腺癌和非小细胞肺癌的癌症。
因此，本公开涉及治疗癌症的方法，特别是上文列出的癌症之一，且更优选地选自卵巢癌、三阴性乳腺癌和非小细胞肺癌的癌症，所述方法包括施用治疗有效量的如本文公开的式(I)的ADC。
用于如上文公开使用的ADC可以作为唯一活性成分进行施用，或者与其它药物结合例如作为佐剂或以组合进行施用，所述其它药物例如抗病毒剂、抗炎剂或细胞毒素剂、抗增殖剂、化学疗法或抗肿瘤剂，例如用于治疗或预防上文提到的疾病。
例如，用于如上文公开使用的ADC可以与AZT、IFN-α、抗CD20 mAb、抗CD25 mAb、抗PD1 mAb、抗PDL-1 mAb、抗CTLA4 mAb、化学治疗剂组合进行使用。
此类抗PD1或抗PDL1抗体的实例包括但不限于纳武单抗、派姆单抗、阿维鲁单抗、度伐利尤单抗、西米普利单抗或阿特珠单抗。
合适的抗肿瘤剂可以包括但不限于烷化剂(例如环磷酰胺、氮芥、苯丁酸氮芥、美法仑、亚硝基脲、替莫唑胺)、蒽环类(例如柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、戊柔比星)、紫杉烷类(例如紫杉醇、多西他赛)、埃博霉素类、拓扑异构酶I的抑制剂(例如伊立替康或拓扑替康)、拓扑异构酶II的抑制剂(例如依托泊苷、替尼泊苷或他氟泊苷)、核苷酸类似物和前体类似物(例如阿扎胞苷、硫唑嘌呤、卡培他滨、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、巯基嘌呤、氨甲蝶呤或硫鸟嘌呤)、肽抗生素(例如博来霉素、粘菌素、短杆菌肽)、基于铂的抗肿瘤药(例如卡铂、顺铂和奥沙利铂)、类视黄酸(例如维甲酸、阿利维甲酸、贝沙罗汀)、长春花生物碱和衍生物(例如长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨)、抗VEGF剂(例如贝伐珠单抗、雷珠单抗、舒尼替尼、索拉非尼、帕唑帕尼、靶向疗法例如激酶抑制剂(例如伊布替尼、艾代拉利司(idelalisib)、厄洛替尼、吉非替尼、伊马替尼、维莫非尼、维莫德吉)、蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米、卡非佐米)、组蛋白去乙酰化酶抑制剂(例如伏立诺他或罗米地辛)。
按照前文，本公开在一个再进一步的方面提供了一种方法，其包括治疗有效量的本公开的ADC和至少一种第二原料药的例如伴随或依次共施用，所述第二原料药是抗病毒剂、抗炎剂或细胞毒素剂、抗增殖剂、化学疗法或其它抗肿瘤剂，例如如上文指示的。
还在本公开的范围内的是由本文公开的组合物(例如包含ADC)和使用说明书组成的试剂盒。试剂盒可以进一步含有至少一种另外的试剂，或者一种或多种另外的抗体或蛋白质(例如具有互补活性的抗体，其与靶抗原上不同于第一抗体的表位结合)。试剂盒通常包括指示试剂盒的内容物的预期用途的标签。术语标签包括在试剂盒上或随试剂盒供应，或者以其它方式伴随试剂盒的任何书写或记录材料。试剂盒可以进一步包含用于诊断患者是否属于响应ADC治疗的群体(如上文定义的)，特别是具有FRα表达肿瘤的群体的工具。
制备本公开的ADC的方法
本公开的抗体可以通过本领域已知的任何技术通过接头L与至少一种药物缀合。此类技术例如在Greg T.Hermanson，Bioconjugate Techniques，第3版，2013，AcademicPress(eBook ISBN：9780123822406)中进行描述。关于相对于用于将治疗剂与抗体缀合的方法的更多信息，参见Lyon等人，“Chapter six-Conjugation of Anticancer DrugsThrough Endogenous Monoclonal Antibody Cysteine Residues”，2012，Methods inEnzymology，502，123-138(doi：10.1016/B978-0-12-416039-2.00006-9)；“Antibody-DrugConjugates：Fundamentals，Drug Development，and Clinical Outcomesto TargetCancer”的第2-7章，2016年11月3日，eBook ISBN：9781119060727，doi：10.1002/9781119060727和Panowksi S等人2014年1月1日；6(1)：34-45。
在一个实施方案中，用于获得式(I)的ADC的方法包括以下步骤：
-在适合于表达编码如先前节段中定义的抗体Ab的核酸的条件下培养宿主细胞，
-分离抗体，
-合成与式(VIII)的接头L键合的依喜替康：
-使所述抗体与式(VIII)的化合物缀合，从而获得式(I)的ADC。
抗体可以如上文说明的获得。抗体含有四个可接近的链间二硫键，其可以用作潜在的缀合位点。四个链间二硫键可以例如通过三(2-羧乙基)膦(TCEP)或二硫苏糖醇(DTT)进行还原，其导致可用于缀合的八个硫醇基团。
式(VIII)中的部分-L-D可以遵循有机合成领域已知的程序(化学反应、萃取、蒸发、沉淀、层析、过滤、研磨、结晶等等)，以及分析化学领域的普通技术人员已知的分析程序进行制备。此类反应和技术的细节可以在许多论文中找到，包括Richard Larock，Comprehensive Organic Transformations，A Guide to Functional GroupPreparations，第二版(2010)，以及通过Michael B.Smith及其他人编辑的多卷系列Compendium of Organic Synthetic Methods(1974年及以后)。原材料和试剂可以从商业来源获得，或可以使用文献方法进行制备。
依喜替康化合物可以遵循已知程序进行合成(参见US5834476；WO2019044946或Sugimori等人，1998，J.Med.Chem.，41(13)，2308-2318 doi：10.1021/jm970765q)。依喜替康也可以从信誉良好的来源(例如MedChemExpress目录#HY-13631A或Carbosynth目录#FE72401)购买。
遵循已知程序，在-L-D组分与抗体的天然或改造的半胱氨酸硫醇残基缀合后，获得式(I)的最终ADC。参见例如Lyon等人，“Chapter six-Conjugation of AnticancerDrugs Through Endogenous Monoclonal Antibody Cysteine Residues”，2012，Methodsin Enzymology，502，123-138(doi：10.1016/B978-0-12-416039-2.00006-9)或SJ Walsh等人，Site-selective modification strategies in antibody-drug conjugates，Chem.Soc.Rev.，2021，50，1305-1353，doi：10.1039/D0CS00310G。通常，抗体组分用还原剂例如三(2-羧乙基)膦(TCEP)或二硫苏糖醇(DTT)进行还原；添加-L-D组分并且允许与抗体的半胱氨酸硫醇残基共价反应；纯化最终的ADC化合物并进行缓冲液交换。
已充分描述的本发明现在通过以下实施方案和实施例进行进一步说明，所述实施方案和实施例仅是说明性的，并不意味着是进一步的限制。
具体实施方案
1.一种抗体-药物缀合物，其具有分子式(I)：
Ab-[L-D]p (I)，
其中：
-Ab是与SEQ ID NO：12特异性结合的抗叶酸受体α(FRα)抗体，
-L是优选经由硫醇残基与所述抗体键合的可切割的接头部分，
-D是与L键合的细胞毒性药物部分，
-p是1至8，优选6至8，且更优选地p是8。
2.根据实施方案1的抗体-药物缀合物，其中D是拓扑异构酶I的抑制剂，优选地选自喜树碱类似物，并且更优选地D是下式(II)的依喜替康的药物部分
3.根据实施方案1-2中任何一个的抗体-药物缀合物，其中L是式-A-W-的可切割的接头部分，其中A是与Ab连接的任选延伸单元，并且W是与D连接的可切割部分。
4.根据实施方案3的抗体-药物缀合物，其中L是溶酶体蛋白酶敏感的接头，并且W包含例如选自缬氨酸-瓜氨酸(Val-Cit)、丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺(Ala-Ala-Asn)、缬氨酸-丙氨酸(Val-Ala)和苯丙氨酸-赖氨酸(Phe-Lys)的可切割的肽部分。
5.根据实施方案3的抗体-药物缀合物，其中L是蛋白酶敏感的可切割接头，并且W包含优选地选自β-葡糖苷酸或β-半乳糖苷部分的糖可切割单元。
6.根据实施方案3的抗体-药物缀合物，其中L是谷胱甘肽敏感的接头，并且W包含二硫化物部分。
7.根据实施方案3的抗体-药物缀合物，其中W具有下式(III)
其中
每个R2独立地选自吸电子基团和C1-C4烷基；
n是0、1或2；
T是糖可切割单元或多肽可切割单元；
当T是糖可切割单元时，Y是O，或者当T是多肽可切割单元时，Y是NR3；和
R3选自H、C1-C24烷基、C2-C6烯基；任选取代的聚醚、具有6至10个环原子的芳基、C3-C8环烷基、具有3至10个环原子的杂环烷基、具有5至10个环原子的杂芳基及其任何组合，
所述烷基和烯基任选地被选自以下的一个或多个杂原子或者化学基团中断：-O-、-S-、-C(O)-、-NR″-、-C(O)NR″-、-NR″-C(O)-、-NR″-C(O)-NR″′-、-NR″-C(O)-O-、-O-C(O)NR″-和三唑，
R″和R″′独立地选自H和C1-C6烷基，
及其药学上可接受的盐。
8.根据实施方案7的抗体-药物缀合物，其中L对应于式(IV)的接头-A-W-
其中
X1是连接器单元；
Z是任选的间隔物；
X2是连接器单元；
K是任选的疏水性掩蔽实体，优选地选自聚肌氨酸和聚乙二醇；
R1选自H、C1-C24烷基、C2-C6烯基；任选取代的聚醚、具有6至10个环原子的芳基、C3-C8环烷基、具有3至10个环原子的杂环烷基、具有5至10个环原子的杂芳基及其任何组合，
所述烷基和烯基任选地被选自以下的一个或多个杂原子或者化学基团中断：-O-、-S-、-C(O)-、-NR″-、-C(O)NR″-、-NR″-C(O)-、-NR″-C(O)-NR″′-、-NR″-C(O)-O-、-O-C(O)NR″-和三唑；
R4选自H、C1-C6烷基和C2-C6烯基，所述烷基和烯基任选地被选自以下的一个或多个杂原子或者化学基团中断：-O-、-S-、-C(O)-和-NR″-；和
R5选自H、C1-C6烷基和C2-C6烯基，所述烷基和烯基任选地被选自以下的一个或多个杂原子或者化学基团中断：-O-、-S-、-C(O)-和-NR″-。
9.根据实施方案8的抗体-药物缀合物，其中X1和X2独立地选自一个或多个氨基酸、一个或多个N取代的氨基酸、任选取代的聚醚、C1-C12亚烷基、具有6至10个环原子的亚芳基、C3-C8环亚烷基、具有5至10个环原子的杂环亚烷基、具有5至10个环原子的杂亚芳基、C2-C10亚烯基及其任何组合，
所述亚烷基和亚烯基任选地被选自以下的一个或多个杂原子或者化学基团中断：-O-、-S-、-C(O)-、-NR″-、-C(O)NR″-、-NR″-C(O)-、-NR″-C(O)-NR″′-、-NR″-C(O)-O-、-O-C(O)NR″-和三唑，
并且所述亚烷基、亚芳基、环亚烷基、杂环亚烷基、杂亚芳基和亚烯基任选地被选自以下的一个或多个取代基取代：卤素、氧代、-OH、-NO2、-CN、C1-C6烷基、C3-C6环烷基、具有5至10个环原子的杂环基、具有6至10个环原子的芳基、具有5至10个环原子的杂芳基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、-(CO)-R′、-O-(CO)-R′、-(CO)-O-R′、-(CO)-NR″R″′、-NR″-(CO)-R′和-NR″R″′；
R′、R″和R″′独立地选自H和C1-C6烷基。
10.根据实施方案8-9中任何一个的抗体-药物缀合物，其中Z独立地选自一个或多个氨基酸、一个或多个N取代的氨基酸、任选取代的聚醚、C1-C12亚烷基、具有6至10个环原子的亚芳基、C3-C8环亚烷基、具有5至10个环原子的杂环亚烷基、具有5至10个环原子的杂亚芳基、C2-C10亚烯基及其任何组合，
所述亚烷基和亚烯基任选地被选自以下的一个或多个杂原子或者化学基团中断：-O-、-S-、-C(O)-、-NR″-、-C(O)NR″-、-NR″-C(O)-、-NR″-C(O)-NR″′-、-NR″-C(O)-O-、-O-C(O)NR″-和三唑，
并且所述亚烷基、亚芳基、环亚烷基、杂环亚烷基、杂亚芳基和亚烯基任选地被选自以下的一个或多个取代基取代：卤素、氧代、-OH、-NO2、-CN、C1-C6烷基、C3-C6环烷基、具有5至10个环原子的杂环基、具有6至10个环原子的芳基、具有5至10个环原子的杂芳基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、-(CO)-R′、-O-(CO)-R′、-(CO)-O-R′、-(CO)-NR″R″′、-NR″-(CO)-R′和-NR″R″′；
R′、R″和R″′独立地选自H和C1-C6烷基。
11.根据实施方案8-10中任何一个的抗体-药物缀合物，其中K是聚肌氨酸，优选下式(V)
其中k是在2和50之间，优选在4和30之间的整数，
并且R6对应于OH或NH2。
12.根据实施方案7-11中任何一个的抗体-药物缀合物，其中T是糖可切割单元，其为葡糖苷酸或半乳糖苷。
13.根据实施方案7-11中任何一个的抗体-药物缀合物，其中T是二肽，优选地选自Val-Cit、Val-Ala和Phe-Lys。
14.根据实施方案1-3中任何一个的抗体-药物缀合物，其中L与所述抗体的一个或多个硫醇残基共价键合，
优选地，所述L对应于式(VI)的接头：
15.根据实施方案1-14中任何一个的抗体-药物缀合物，其中所述抗体包括全长抗体或含有抗原结合部分的抗体片段。
16.根据实施方案1-15中任何一个的抗体-药物缀合物，其对应于下式(VII)
其中Ab是抗FRα抗体，例如法妥组单抗，或其沉默IgG1变体通常包含在IgG1 Fc恒定区的亮氨酸234和亮氨酸235中的丙氨酸取代，并且p是4至8，优选8。
17.根据实施方案1-16中任何一个的抗体-药物缀合物，其中：
-Ab是包含人IgG1同种型恒定区或者突变型或化学修饰的恒定区的抗体，其中当与具有野生型人IgG1同种型恒定区的相应抗体相比时，所述突变型或化学修饰的恒定区并不对所述抗体赋予ADCC活性或赋予减少的ADCC活性；或，
-Ab是包含人IgG4同种型恒定区或者突变型或化学修饰的恒定区的抗体，其中当与具有野生型IgG4同种型恒定区的相应抗体相比时，所述突变型或化学修饰的恒定区并不对所述抗体赋予ADCC活性或赋予减少的ADCC活性。
18.根据实施方案1-17中任何一个的抗体-药物缀合物，其中Ab是包含以下任一的抗FRα抗体：
(i)包含SEQ ID NO：1的HCDR1、SEQ ID NO：2的HCDR2、SEQ ID NO：3的HCDR3的可变重链多肽，以及包含SEQ ID NO：4的LCDR1、SEQ ID NO：5的LCDR2和SEQ ID NO：6的LCDR3的可变轻链多肽；或，
(ii)包含SEQ ID NO：7的VH的可变重链多肽，以及包含SEQ ID NO：8的VL的可变轻链多肽。
19.根据实施方案1-18中任何一个的抗体-药物缀合物，其中Ab包含以下或基本上由以下组成：
(i)SEQ ID NO：9的重链和SEQ ID NO：10的轻链；或，
(ii)SEQ ID NO：11的重链和SEQ ID NO：10的轻链。
20.根据实施方案1-19中任何一个的抗体-药物缀合物，其中
(i)Ab是抗叶酸受体α抗体或其抗原结合片段，其包含
·包含SEQ ID NO：1的HCDR1、SEQ ID NO：2的HCDR2、SEQ ID NO：3的HCDR3的可变重链多肽，和
·包含SEQ ID NO：4的LCDR1、SEQ ID NO：5的LCDR2和SEQ ID NO：6的LCDR3的可变轻链多肽；
(ii)L是式-A-W-的可切割接头，其中A是与Ab连接的任选延伸单元，并且W是与D连接的可切割部分
(iii)D是拓扑异构酶I的抑制剂，例如依喜替康；和
(iv)p是1至8，优选8。
21.根据实施方案20的抗体-药物缀合物，其中Ab是
(i)包含SEQ ID NO：9的重链和SEQ ID NO：10的轻链的抗体或抗原结合片段，或
(ii)包含SEQ ID NO：11的重链和SEQ ID NO：10的轻链的抗体或抗原结合片段。
22.根据实施例1-21中任何一个的抗体-药物缀合物，其用作药剂，优选用于治疗有此需要的受试者中的肿瘤，例如实体瘤，更具体地选自卵巢癌、乳腺癌、肺癌或间皮瘤。
23.根据实施例1-21中任何一个的抗体-药物缀合物，其用于治疗有此需要的受试者中的选自卵巢癌、三阴性乳腺癌和非小细胞肺癌的癌症。
24.一种药物组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体组合的根据实施例1-21中任何一个的抗体-药物缀合物，任选地包含其它活性成分。
25.一种用于获得根据权利要求1-23中任何一个的抗体-药物缀合物的方法，其中所述方法包括：
-在适合于产生如实施方案1-21中任何一个中定义的抗FRα抗体的条件下培养宿主细胞，
-分离所述抗FRα抗体，
-合成与式(VIII)的接头L键合的依喜替康：
-使所述抗FRα抗体与式(VIII)的化合物缀合，
从而获得如实施方案1-21中任何一个中定义的ADC。
实施例
功能测定
通过ELISA的人FRα结合亲和力
使用96孔高结合ELISA板(Corning Inc.，New York，NY，USA，目录#3590)执行夹心ELISA测定。板使用100μL/孔的以2μg/mL在PBS(pH 7.4)中的重组人FRa蛋白(SinoBiological目录#11241-H08H)进行包被，并且在4℃下温育过夜。在用PBS-T(PBS+0.05％Tween-20)的2次洗涤后，板在室温下用200μL/孔的温育缓冲液(PBS-T+0.1％BSA)封闭1小时。板用PBS-T洗涤4次，并且加入100μL的三倍稀释系列的测试化合物(抗体或抗体-药物缀合物)。然后，使板在室温下黑暗中温育2小时。在用PBS-T的5次洗涤后，使板在室温下与100μL/孔的山羊抗人IgG(H+L)HRP缀合抗体(Jackson Immunoresearch目录#109-035-088)一起温育1小时，所述抗体先前在温育缓冲液中稀释1∶250 000。在用PBS-T的5次洗涤后，添加TMB底物溶液(Thermo-Fisher目录#N301)。用0.18M H2SO4终止过氧化物酶活性，并且使用Thermo Scientific MultiSkan EX微孔板阅读器在450nm(参考波长650nm)处读取吸光度。使用GraphPad Prism 9软件执行S形拟合。
SPR Biacore亲和力
在25℃下，在Biacore T200仪器上执行表面等离子体共振(SPR)实验。测试抗体或ADC以低密度(300-500RU)在CM5系列S传感器芯片上进行捕获，所述传感器芯片事先用人抗体捕获(Human Antibody Capture)试剂盒(Cytiva目录#BR100839)进行功能化。使用类似处理但省略配体的功能化表面/流动池作为参考。为了测量动力学速率和亲和力，使用单循环动力学策略以及以恒定的70μL/mL流速的运行缓冲液(HBS-EP+，Cytiva目录#BR100669)，伴随300秒的接触脉冲，以一系列5个浓度(0.5、1、2、4、8nM)一式两份注入重组人FRα(SinoBiological目录#11241-H08H)分析物样品。通过注入运行缓冲液900秒来测量解离阶段。在一式两份之间，表面/流动池用3M MgCl2进行再生，以去除分析物和配体两者，并且使用相同条件完成新鲜配体捕获。在扣除参考表面和分析物零浓度信号后，使用BiacoreEvaluation软件执行数据分析。数据进行处理并且与1∶1结合模型拟合，以确定结合动力学速率常数、ka(结合速率)和kd(解离速率)以及KD(平衡解离常数，也被称为“亲和力”)。报告了重复的平均值和标准差。
通过流式细胞术的细胞结合亲和力
通过流式细胞术评价抗体或ADC与癌细胞系上表达的细胞外人FRα的结合。根据制造商的方案(Bio-Rad，目录#LNK032APC)，使用LYNX Rapid APC Antibody ConjugationKit，使测试的抗体或ADC与APC荧光团缀合。向500 000个细胞(悬浮于流式细胞术塑料管中的100μL PBS中)内加入5μL 10μg/mL测试APC标记的抗体或ADC的溶液。使细胞在黑暗中温育20分钟，通过离心用PBS洗涤3次，并且重悬浮于200μL PBS中用于分析。使用通过BDFACSDiva软件(BD Biosciences)控制的BD Fortessa流式细胞仪执行流式细胞术，并且使用FlowJo软件(BD Bioscience)分析数据。
人血浆中的稳定性测定
ADC样品(＞6mg/mL的PBS溶液)用纯无菌人血浆(GeneTex目录#GTX73265)在具有螺旋盖的离心管中进行稀释，以产生200μg/mL的最终ADC浓度(残留PBS体积低于5％v/v)。使样品在37℃下温育，并且在5分钟、6小时、1天、2天、3天和7天的时间点获取等分试样(等分试样保持冷冻在-80℃下直至分析)。使用DynabeadsTM M-280Streptavidin(ThermoScientific)磁珠，通过免疫捕获从血浆中分离ADC，所述磁珠先前用生物素化的人叶酸受体α重组蛋白(Sino Biologicals目录#11241-H08H)进行包被。简言之，600μL商业珠溶液用HBS-EP缓冲液(Cytiva，目录#BR100188)洗涤两次，并且重悬浮于1.2mL HBS-EP缓冲液中。加入65μL(48μg蛋白质量)生物素化的重组FRα溶液，并且溶液在室温下搅动2小时。珠然后用HBS-EP缓冲液洗涤3次，并且重悬浮于1.2mL HBS-EP缓冲液中。对于一次免疫捕获，将100μL先前的珠溶液加入微量离心管中的100μL HBS-EP上。加入10μL血浆中的ADC溶液(理论2μg ADC量)，并且溶液在室温下搅动2小时。在温育后，珠-ADC复合物用HBS-EP缓冲液洗涤两次，用200μL HBS-EP缓冲液进行重悬浮，并且通过在37℃下加入2μL/1000U PNGase F(NewEngland Biolabs目录#P0705L)伴随轻轻搅动过夜进行脱糖基化。珠然后用HBS-EP缓冲液洗涤两次，用蒸馏水洗涤两次，并且用10％乙腈水溶液(v/v)洗涤一次。使珠与50μL含有0.1％(v/v)甲酸的30％乙腈水溶液(v/v)一起在室温下伴随轻轻搅动温育30分钟。然后使用配备Bruker Impact IITM Q-ToF质谱仪的Thermo UltiMate 3000UHPLC系统，通过变性反相层析-质谱法分析含有脱糖基化的ADC的洗脱样品。流动相A为水+0.1％甲酸，并且流动相B为乙腈+0.1％甲酸。柱为Agilent PEEK PLRP-S2.1x100mm 5μm(80℃)。线性梯度为在25分钟内20％B至50％B。流速为0.4mL/分钟。在280nm处监测UV检测。Q-ToF质谱仪在m/z范围500-5000(ESI+)内使用。使用Bruker软件中包括的MaxEnt算法，对数据进行解卷积。对于稳定性数据分析，实施原始光谱在选择的轻链(LC)和重链(HC)洗脱时间窗口内的解卷积。根据来自起始ADC材料的相应的质量偏移来鉴定药物-接头丧失或修饰。通过将特定ADC亚种的强度除以来自总ADC种类的强度来计算具有不同DAR的ADC的相对比率。最终DAR值如Xu等人，Anal.Biochem.，2011，412(1)，56-66中所述进行计算。
在FRa阴性细胞系(BT-474细胞系)中的体外功效
为了评价ADC的非特异性(脱靶)细胞毒性，在BT-474(FRa阴性)癌细胞系中实现体外细胞毒性测定。细胞以取决于细胞系的适当密度在96孔板中铺平板(100μL适当培养基中1000至10 000个细胞/孔)，并且在37℃下温育24小时。加入先前溶解于培养基(50μL)中的测试化合物的连续稀释物，并且温育在37℃下进行144小时。将MTT(5mg/mL，20μL，Sigma-Aldrich)加入孔内，并且温育在37℃下继续1至2小时。然后小心地去除培养基，并且用酸化异丙醇均匀地溶解孔内容物。使用570nm的波长(伴随690nm的参考波长)，在MultiskanTMSky微孔板阅读器(Thermo Scientific)上测量吸光度值。使用抑制剂量应答曲线拟合(GraphPad Prism 9)确定与未处理的对照细胞相比的IC50浓度值。
癌症异种移植模型中的体内功效
在研究开始前，获得四至五周龄的雌性CB-17严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠并隔离7天。小鼠用悬浮于PBS(OV-90、SW-620、KB、BT-474细胞系)或50％BD Matrigel的PBS溶液(PA-1、IGROV-1、OVCAR-3、NCI-H2110细胞系)中的细胞进行皮下接种。当平均肿瘤体积达到约120-150mm3时，小鼠进行随机化(通常为7只小鼠/组)，并且通过PBS(阴性对照)或调查的抗体-药物缀合物的单次(除非另有说明)静脉内注射进行治疗。肿瘤体积每3-5天使用卡尺装置进行测量(长度x宽度)，并且使用下式V＝4/3×π×R3进行计算，其中R代表半径。当肿瘤体积超过1500mm3时或在肿瘤溃疡的情况下，将小鼠处死。
通过反相液相层析-质谱法(RPLC-MS)的药物抗体比(DAR)评价：
变性RPLC-QToF分析用于评价缀合物的药物抗体比(DAR)。简言之，ADC使用水/乙腈+0.1％甲酸(0.4mL/分钟)的流动相梯度，在Agilent PLRP-S2.1x150mm 8μm(80℃)上进行洗脱，并且使用Bruker Impact IITM Q-ToF质谱仪扫描500-3500m/z范围(ESI+)进行检测。使用Bruker软件中包括的MaxEnt算法，对数据进行解卷积。
实施例1：基于依喜替康的化学药物-接头的合成
材料和一般有机合成方法
所有溶剂和试剂都得自信誉良好的商业来源(Sigma-Aldrich、Fluorochem、TCIChemicals、Acros Organics、Alfa Aesar、Enamine、Thermo Fisher、Carbosynth、WuXiAppTec、Iris Biotech)，并且除非另有说明，否则无需进一步纯化而使用。无水溶剂购自Sigma-Aldrich。Fmoc-氨基酸、2-氯三苯甲基、Wang和Rink酰胺聚苯乙烯1％DVB 100-200目树脂(预装载有第一个Fmoc-肌氨酸氨基酸)购自Christof Senn Laboratories和Sigma-Aldrich。甲磺酸依喜替康购自MedChemExpress。
树脂上合成在配备20μm聚乙烯熔块(Sigma-Aldrich)的空SPE塑料管中执行。使用Titramax 101平台振荡器(Heidolph)用于搅动。除非另有说明，否则所有化学反应都在室温下在惰性氩大气下进行。
液体核磁共振波谱在Bruker Fourier 300HD或Bruker AVANCE III HD400光谱仪上进行记录，使用残留溶剂峰用于校准。质谱法分析已通过University Claude BernardLyon 1的UMR5246 CNRS研究所的Centre Commun de Spectrométrie de Masse(CCSM)执行。
正相快速层析在Teledyne IscoRf200装置上执行，使用Macherey-Nagel快速层析柱(flash cartridges)(40-63μm)。反相层析使用Teledyne IscoRf200装置上的 C18 Duo30μm层析柱或Interchim PuriFlash RP-AQ(30μm)层析柱；或使用Agilent 1100制备型二元HPLC系统来执行。
化学反应和化合物表征分别通过以下进行监测且分析：使用预包被的40-63μm硅胶的薄层层析(Macherey-Nagel)、HPLC-UV(Agilent 1100系统)或UHPLC-UV/MS(配备Bruker Impact IITMQ-ToF质谱仪的Thermo UltiMate 3000UHPLC系统或配备BrukerMicrOTOF-QII质谱仪的Agilent 1260HPLC系统)。
HPLC方法1：配备DAD检测的Agilent 1100HPLC系统。流动相A为水+0.1％TFA，并且流动相B为乙腈。柱为Agilent Zorbax SB-Aq4.6x150mm 5μm(室温)。线性梯度为在30分钟内0％B至50％B，随后为在50％B下的5分钟保持。流速为1.0mL/分钟。
HPLC方法2：配备DAD检测的Agilent 1100HPLC系统。流动相A为水+0.1％TFA，并且流动相B为乙腈。柱为Agilent Poroshell 120EC-C18 3.0x50mm 2.7μm(室温)。线性梯度为在9分钟内5％B至80％B，随后为在80％B下的1分钟保持。流速为0.8mL/分钟。
HPLC方法3：配备DAD检测的Agilent 1100HPLC系统。流动相A为水+0.1％TFA，并且流动相B为乙腈。柱为Agilent Poroshell 120EC-C18 3.0x50mm 2.7μm(室温)。线性梯度为在20分钟内5％B至80％B，随后为在80％B下的2分钟保持。流速为0.8mL/分钟。
HPLC方法4：Thermo UltiMate 3000UHPLC系统+Bruker Impact IITM Q-ToF质谱仪。流动相A为水+0.1％甲酸，并且流动相B为乙腈+0.1％甲酸。柱为Agilent PLRP-S2.1x150mm 8μm(80℃)。线性梯度为在25分钟内10％B至50％B。流速为0.4mL/分钟。在280nm处监测UV检测。Q-ToF质谱仪在m/z范围500-3500(ESI+)内使用。使用Bruker软件中包括的MaxEnt算法，对数据进行解卷积。
HPLC方法5(制备方法)：配备DAD检测的Teledyne Isco Rf200二元MPLC系统。流动相A为水+0.1％TFA，并且流动相B为乙腈。可重复使用的层析柱为 C18 Duo30μm(30g)。线性梯度为在35分钟内10％B至50％B，随后为在50％B下的5分钟保持。流速为25mL/分钟。
HPLC方法6(制备方法)：配备双环自动进样器、DAD检测和馏分收集器的Agilent1100制备型二元HPLC系统。流动相A为水+0.1％TFA，并且流动相B为乙腈。柱为WatersSunFire C18 OBD Prep Column，5μm，19mm x 250mm(室温)。线性梯度为在40分钟内10％B至60％B，随后为在60％B下的5分钟保持。流速为25mL/分钟。
1.1)单分散聚肌氨酸中间体
1.1.1)一般方法
单分散聚肌氨酸的树脂上合成对于Rink酰胺和2-氯三苯甲基树脂使用亚单体合成迭代程序(如WO2019081455中所述的)来实现，或对于Wang树脂遵循经典Fmoc/SPPS方法使用商业Fmoc-Sar-Sar-OH二类肽构建块(CAS#2313534-20-0)来实现。由于二酮哌嗪的形成，避免了树脂上二聚阶段(n＝2)。所有合成产率都基于由制造商指示的初始Fmoc-肌氨酸负载报告。除非另有说明，否则所有反应都在室温下进行。使用预装载有第一个Fmoc-肌氨酸残基的Rink酰胺、2-氯三苯甲基或Wang聚苯乙烯1％DVB 100-200目树脂(Christof SennLaboratories)(通常初始负载为0.6-1mmol/g)。
1.1.2)聚肌氨酸的延长
预装载有Fmoc-肌氨酸的Rink酰胺、2-氯三苯甲基或Wang树脂在室温下用20％哌啶的DMF溶液(每100mg树脂1mL)处理2次15分钟。然后用DMF(4次)和DCM(4次)洗涤树脂。向树脂中加入Fmoc-Sar-Sar-OH(3当量)、HATU(2.9当量)和DIPEA(6当量)的DMF溶液(每100mg树脂1mL)。将反应容器搅动2小时，并且用DMF(4次)和DCM(4次)洗涤树脂。树脂在室温下用20％哌啶的DMF溶液(每100mg树脂1mL)处理2次15分钟。然后用DMF(4次)和DCM(4次)洗涤树脂。
对于Rink酰胺或2-氯三苯甲基树脂上的合成，然后使用经典的亚单体合成程序，如WO2019081455中所述的。通过交替进行溴乙酰化和胺置换步骤，执行n＝3聚肌氨酸寡聚体的延长，直到获得所需长度。溴乙酰化步骤通过加入10当量溴乙酸和13当量二异丙基碳二亚胺的DMF溶液(每100mg树脂2mL)来执行。将混合物搅动30分钟，排干并且用DMF(4次)进行洗涤。对于胺置换步骤，加入40％(wt)甲胺水溶液(每100mg树脂1.5mL)，并且使容器振荡30分钟，排干并且用DMF(4次)和DCM(4次)进行洗涤。
对于Wang树脂上的合成，使用经典Fmoc/SPPS程序。通过Fmoc-Sar-Sar-OH二类肽构建块(CAS#2313534-20-0)的迭代偶联来执行n＝3聚肌氨酸寡聚体的延长。向树脂中加入Fmoc-Sar-Sar-OH(3当量)、HATU(2.9当量)和DIPEA(6当量)的DMF溶液(每100mg树脂1mL)。将反应容器搅动90分钟，并且树脂用DMF(4次)和DCM(4次)进行充分洗涤。树脂然后在室温下用20％哌啶的DMF溶液(每100mg树脂1mL)处理2次15分钟。用DMF(4次)和DCM(4次)洗涤树脂。重复此偶联/Fmoc脱保护循环，直到获得所需的聚肌氨酸长度。必要时，最后一次偶联使用商业Fmoc-Sar-OH氨基酸代替Fmoc-Sar-Sar-OH二类肽单元来进行，以便获得均匀长度的最终聚肌氨酸。
1.1.3)聚肌氨酸的最终树脂上侧官能化、任选封端、树脂切割和纯化
当达到所需的树脂上聚肌氨酸单分散寡聚体长度时，执行正交化学官能化。它任选地随后为用Fmoc-氨基酸(例如Fmoc-Gly-OH、Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-氨基-3，6二氧杂辛酸、Fmoc-9-氨基-4，7-二氧杂壬酸)的最终封端。封端最终化合物的N末端的Fmoc保护基团可以在树脂切割之前或之后去除，取决于所使用的正交官能化化学(参见下文)。
1.1.3.1)2-叠氮乙-1-胺侧官能化的聚肌氨酸
向Rink或2-氯三苯甲基树脂中加入10当量溴乙酸和13当量二异丙基碳二亚胺的DMF溶液(每100mg树脂2mL)。将混合物搅动30分钟，排干并且用DMF(4次)进行洗涤。加入3摩尔2-叠氮乙-1-胺的DMF溶液(每100mg树脂1mL)，并且使容器振荡45分钟，排干并且用DMF(4次)和DCM(4次)进行洗涤。它随后为1小时的Fmoc-Gly-OH偶联(5当量Fmoc-Gly-OH、4.9当量HATU、10当量DIPEA的DMF溶液(每100mg树脂1mL)，以及在室温下用20％哌啶的DMF溶液(每100mg树脂1mL)的Fmoc脱保护2次15分钟。用DMF(4次)和DCM(4次)洗涤树脂。
从树脂中切割最终聚肌氨酸化合物(对于Rink和Wang树脂，100％TFA 2次30分钟，对于2-氯三苯甲基树脂，20％TFA的DCM溶液2次15分钟)。过滤树脂，并且在减压下去除挥发物，以提供在RP-AQ(30μm)层析柱上进行纯化的粗制品。流动相A为水+0.1％TFA，并且流动相B为乙腈。
1.1.3.2)谷氨酸侧官能化的聚肌氨酸
向Rink、Wang或2-氯三苯甲基树脂中加入Fmoc-Glu(OAll)-OH(3当量)、HATU(2.9当量)和DIPEA(6当量)的DMF溶液(每100mg树脂1mL)。将反应容器搅动90分钟，并且树脂用DMF(4次)和DCM(4次)进行充分洗涤。树脂然后在室温下用20％哌啶的DMF溶液(每100mg树脂1mL)处理2次15分钟。用DMF(4次)和DCM(4次)洗涤树脂。它随后为用Fmoc-氨基-3，6二氧杂辛酸(3当量)、HATU(2.9当量)、DIPEA(6当量)的DMF溶液(每100mg树脂1mL)的1小时偶联。用DMF(4次)、DCM(4次)洗涤树脂。Alloc保护基团通过用含有0.25当量Pd(PPh3)4和20当量苯基硅烷的DCM溶液(在氩流下轻轻搅动)的2次30分钟处理得到去除。然后用DMF(5次)和DCM(5次)洗涤树脂。任选地，通过用含有50当量DIC和60当量N-羟基琥珀酰亚胺的DMF溶液(每100mg树脂1.5mL)的90分钟处理，将N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯引入最终聚肌氨酸化合物的羧酸侧链。然后用DMF(4次)和DCM(4次)洗涤树脂。
从树脂中切割最终聚肌氨酸化合物(对于Rink和Wang树脂，100％TFA 2次30分钟，对于2-氯三苯甲基树脂，20％TFA的DCM溶液2次15分钟)。过滤树脂，并且在减压下去除挥发物，以提供在RP-AQ(30μm)层析柱上进行纯化的粗制品。流动相A为水+0.1％TFA，并且流动相B为乙腈。
1.1.4)最终的聚肌氨酸中间体
下表6列出了所得到的化合物。
1.2)中间体化合物合成
1.2.1)化合物INT1的合成
化合物INT1遵循专利申请WO2019081455中描述的程序进行合成。该化合物是等摩尔非对映异构体混合物(立体异构源中心通过星号指示)。
1.2.2)化合物INT2、INT2-S和INT2-R的合成
1.2.2.1)叔丁基(2-羟基-2-(4-羟基-3-硝基苯基)乙基)氨基甲酸酯的合成
将(±)-章鱼胺盐酸盐(1690mg/11mmol)称重到圆底烧瓶中，并且悬浮于4mL蒸馏水中。使烧瓶在0℃下冷却，并且缓慢加入4mL预冷的65％硝酸溶液。反应在0℃下保持20分钟，如通过HPLC评价的显示了原材料的完全单硝化。将烧瓶的内容物转移到250mL预冷的锥形瓶中，并且在0℃下用饱和NaHCO3溶液(大约50mL)缓慢中和，直至达到8-9的pH值。然后加入30mL二噁烷，随后为Boc2O(7202mg/13.2mmol)。然后允许反应达到室温并搅拌过夜。反应物然后用EtOAc进行稀释，并且用饱和柠檬酸溶液洗涤3次，且用饱和NaCl溶液洗涤1次。有机相在MgSO4上进行干燥，过滤且在真空下蒸发以提供粗制品，其通过硅胶上的层析(石油醚/EtOAc，梯度从70∶30到20∶80)进行纯化，以得到作为稠厚的黄色至棕色油的标题化合物(1320mg/40％)。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ10.79(s，1H)，7.79(d，J＝2.1Hz，1H)，7.47(dd，J＝8.6，2.1Hz，1H)，7.08(d，J＝8.6Hz，1H)，6.74(t，J＝5.9Hz，1H)，4.56(t，J＝6.3Hz，1H)，3.07(td，J＝6.1，1.6Hz，2H)，1.31(s，9H)。MS m/z(ESI+)：Calc[M+H]+＝299.1；Exp[M+H]+＝299.1。HPLC方法2保留时间＝5.5分钟。
1.2.2.2)(2S，3R，4S，5S，6S)-2-(4-(2-((叔丁氧羰基)氨基)-1-羟乙基)-2-硝基苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氢-2H-吡喃-3，4，5-三基三乙酸酯的合成
在圆底烧瓶中，将Ag2CO3(1500mg/5.4mmol)和1，1，4，7，10，10-六甲基三亚乙基四胺(251mg/1.1mmol)溶解于4mL无水乙腈中，并且在室温下在2小时过程中进行搅拌。在0℃下加入先前的化合物叔丁基(2-羟基-2-(4-羟基-3-硝基苯基)乙基)氨基甲酸酯(292mg/0.98mmol)和1-溴-2，3，4-三-O-乙酰基-α-D-葡糖苷酸甲酯(583mg/1.46mmol)，并且溶液混合物在室温下搅拌4小时。反应然后在硅藻土上进行过滤，用EtOAc进行稀释，并且用饱和柠檬酸溶液洗涤3次，且用饱和NaCl溶液洗涤1次。有机相在MgSO4上进行干燥，过滤且在真空下蒸发以提供粗制品，其通过硅胶上的层析(石油醚/EtOAc，梯度从70∶30到30∶70)进行纯化，以提供作为黄色泡沫的标题化合物(244mg/48％)。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ7.76(dd，J＝3.3，2.1Hz，1H)，7.60(t，J＝7.6Hz，1H)，7.36(dd，J＝8.7，2.6Hz，1H)，6.77(s，1H)，5.71(d，J＝7.8Hz，1H)，5.61(s，1H)，5.46(td，J＝9.5，1.1Hz，1H)，5.21-5.02(m，3H)，4.75(dd，J＝9.9，1.4Hz，1H)，4.62(s，1H)，3.65(s，3H)，3.17(s，2H)，3.10(t，J＝6.1Hz，2H)，2.81-2.59(m，6H)，2.05-1.96(m，9H)，1.30(d，J＝1.7Hz，9H)。MS m/z(ESI+)：Calc[M+Na]+＝637.2；Exp[M+Na]+＝637.2。HPLC方法2保留时间＝6.75分钟。
1.2.2.3)(2S，3R，4S，5S，6S)-2-(4-(2-((叔丁氧羰基)氨基)-1-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)乙基)-2-硝基苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氢-2H-吡喃-3，4，5-三基三乙酸酯的合成
先前的化合物(2S，3R，4S，5S，6S)-2-(4-(2-((叔丁氧羰基)氨基)-1-羟乙基)-2-硝基苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氢-2H-吡喃-3，4，5-三基三乙酸酯(334mg/0.54mmol)和4-硝基苯基氯甲酸酯(219mg/1.09mmol)在0℃下溶解于6mL无水DCM中。加入无水吡啶(112mg/1.41mmol)，并且混合物在室温下搅拌30分钟。反应在0.45μm PTFE过滤器上进行过滤，并且通过硅胶上的层析(石油醚/EtOAc，梯度从85∶15到30∶70)进行纯化，以提供作为黄色泡沫的标题化合物(380mg/90％)。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.39-8.26(m，2H)，7.93(d，J＝2.2Hz，1H)，7.75(d，J＝8.8Hz，1H)，7.55(dd，J＝9.2，1.2Hz，2H)，7.46(d，J＝8.8Hz，1H)，7.20(d，J＝4.8Hz，1H)，5.77(dd，J＝7.7，3.7Hz，1H)，5.47(t，J＝9.5Hz，1H)，5.11(q，J＝9.6Hz，2H)，4.77(d，J＝9.9Hz，1H)，3.73-3.59(m，3H)，3.59-3.37(m，2H)，2.05-1.96(m，9H)，1.48-1.35(m，1H)，1.32(s，9H)。MS m/z(ESI+)：Calc[M+Na]+＝802.15；Exp[M+Na]+＝802.15。HPLC方法2保留时间＝8.5分钟。
1.2.2.4)化合物INT2的合成
将381mg(0.49mmol)先前的化合物(2S，3R，4S，5S，6S)-2-(4-(2-((叔丁氧羰基)氨基)-1-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)乙基)-2-硝基苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氢-2H-吡喃-3，4，5-三基三乙酸酯、200mg(0.38mmol)甲磺酸依喜替康和51mg(0.38mmol)HOBt溶解于5mL无水DMF/吡啶的85∶15(v/v)混合物中。加入53.5mg(0.51mmol)DIPEA。反应在40℃下搅拌2小时，并且在减压下蒸发挥发物。通过硅胶上的层析(从99∶1到95∶5的DCM/MeOH梯度)纯化粗残渣，以提供360mg(87％)作为黄色/浅绿色固体的中间体化合物(2S，3R，4S，5S，6S)-2-(4-(2-((叔丁氧羰基)氨基)-1-((((1R，9R)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10，13-二氧代-2，3，9，10，13，15-六氢-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3′，4′：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰基)氧基)乙基)-2-硝基苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氢-2H-吡喃-3，4，5-三基三乙酸酯。ESI+[M+Na]+＝1098.3。HPLC方法3保留时间＝14.7和14.9分钟(非对映异构体混合物)。
355mg(0.33mmol)这种中间体化合物在0℃下溶解于8mL MeOH/THF 75∶25中。将LiOH一水合物(138mg/3.3mmol)溶解于水(1mL)中，并且加入反应容器中。在0℃下搅拌30分钟后(反应随后为HPLC)，混合物用乙酸(258mg/4.3mmol)进行中和并且在减压下进行浓缩。所得到的粗制品在0℃下用TFA/DCM(30∶70v/v)溶液重新溶解，并且在室温下搅拌20分钟。挥发物在减压下进行蒸发，将粗残渣溶解于水/ACN(1∶1v/v)溶液中，并且使用HPLC制备方法5进行纯化，以提供作为黄色固体的172mg(62％)化合物INT2。ESI+[M+H]+＝836.2。HPLC方法3保留时间＝7.3和7.8分钟(非对映异构体混合物)。
1.2.2.5.1)叔丁基(2-羟基-2-(4-羟基-3-硝基苯基)乙基)氨基甲酸酯的外消旋混合物的手性分离
在Teledyne IscoRf200系统上，使用IC MPLC柱30x100mm，20μm(Daicel目录#83M73)，执行外消旋叔丁基(2-羟基-2-(4-羟基-3-硝基苯基)乙基)氨基甲酸酯(如先前所述的合成)的手性分离。流动相为DCM+0.2％(v/v)EtOH(等度梯度)。流速为12mL/分钟。样品溶剂为DCM+0.2％(v/v)EtOH。在分离后两种对映体的质量回收率超过80％。
叔丁基(S)-(2-羟基-2-(4-羟基-3-硝基苯基)乙基)氨基甲酸酯的保留时间为15分钟，而叔丁基(R)-(2-羟基-2-(4-羟基-3-硝基苯基)乙基)氨基甲酸酯的保留时间为25分钟。
为了确定绝对构型，两种对映体的酚位用1.2摩尔当量的4-硝基苯甲酰氯和2摩尔当量的三乙胺的无水THF溶液进行酯化。化合物通过硅胶上的层析(石油醚/EtOAc，梯度从90∶10到10∶90)进行纯化，以提供4-(2-((叔丁氧羰基)氨基)-1-羟乙基)-2-硝基苯基4-硝基苯甲酸酯。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.51(d，J＝9.1Hz，2H)，8.44(d，J＝9.1Hz，2H)，8.19(d，J＝1.9Hz，1H)，7.88(d，J＝10.2Hz，1H)，7.72(d，J＝8.4Hz，1H)，6.93(t，J＝5.9Hz，1H)，5.84(d，J＝4.7Hz，1H)，4.86-4.76(m，1H)，3.24(t，J＝6.1Hz，2H)，1.38(s，9H)。ESI+[M+Na]+＝470.1。通过X射线晶体学确认了对映体(先前溶解于庚烷/二氯甲烷的1∶1混合物中，并且允许缓慢蒸发3周以诱导晶体的形成)的绝对构型。将块状晶体固定到全氟醚油中的尼龙环上。使用配备在T＝150.00(5)K下运行的Oxford Cryosystems低温装置的Xcalibur、Atlas、Gemini超衍射仪收集数据。使用Cu Kα辐射使用ω扫描测量数据。使用双重方法并且通过使用Olex2(O.V.Dolomanov等人，Olex2：A complete structuresolution，refinement and analysis program，J.Appl.Cryst.，2009，42，339-341)作为图形界面，用ShelXT解决方案程序来分辨结构。使用在F2上的全矩阵最小二乘法最小化，用ShelXL 2018/3(Sheldrick，G.M.，Crystal structure refinement with ShelXL，ActaCryst.，2015，C71，3-8)，对模型进行细化。
1.2.2.5.2)立体纯INT2-S和INT2-R化合物的合成
立体纯化合物INT2-S和INT2-R如先前节段1.2.2中所述的进行合成，而无反应条件、反应性或总体产率中的任何明显变化。
使用HPLC制备方法5的最终纯化提供33mg作为黄色固体的化合物INT2-S。ESI+[M+H]+＝836.2。HPLC方法3保留时间＝7.3分钟。
使用HPLC制备方法5的最终纯化提供21mg作为黄色固体的化合物INT2-R。ESI+[M+H]+＝836.2。HPLC方法3保留时间＝7.8分钟。
1.2.3)化合物INT3的合成
1.2.3.1)Ac-Val-Ala-OH(乙酰基-L-缬氨酰-L-丙氨酸)的合成
向30mL DCM中的L-丙氨酸苄酯盐酸盐(542mg/2.5mmol)溶液中序贯地加入三乙胺(254mg/2.5mmol)、蒸馏水(30mL)、N-α-乙酰基-L-缬氨酸(400mg/2.5mmol)和HOBt(339mg/2.5mmol)。然后将混合物冷却至0℃并且加入EDC-HCl(530mg/2.75mmol)。所得到的混合物在0℃下搅拌过夜。用20mL 2M HCl稀释反应并且分离各层。有机相用2M HCl洗涤2次，用饱和NaHCO3溶液洗涤2次，并且用饱和NaCl溶液洗涤1次。有机相在MgSO4上进行干燥，过滤并且在真空下蒸发，以提供714mg(89％)作为白色固体中间体的乙酰基-L-缬氨酰-L-丙氨酸苄酯。
将这种中间体溶解于10mL EtOAc/MeOH 1∶1(v/v)中，并且转移到不锈钢氢化反应器内。在第一次氩吹扫后，加入催化量的5％wt Pd/C。反应器然后用H2吹扫两次，并且在室温下在10巴的H2压力下保持过夜。在用0.45μm PTFE过滤器过滤反应以及在真空下的溶剂去除后，得到作为白色固体的定量的纯乙酰基-L-缬氨酰-L-丙氨酸。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ12.45(s，1H)，8.23(d，J＝6.9Hz，1H)，7.85(d，J＝9.0Hz，1H)，4.25-4.11(m，2H)，1.94(dt，J＝13.6，6.8Hz，1H)，1.85(s，3H)，1.26(d，J＝7.3Hz，3H)，0.85(dd，J＝12.1，6.8Hz，6H)。
1.2.3.2)(2S)-2-乙酰氨基-N-((2S)-1-((4-(1-羟基丁-3-炔-1-基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)-3-甲基丁酰胺的合成
在圆底烧瓶中，将420mg(2.60mmol)1-(4-氨基苯基)丁-3-炔-1-醇(遵循SharmaA.等人，Chem 2018，4(10)，2370-2383中描述的程序合成)和600mg(2.60mmol)先前的化合物Ac-Val-Ala-OH悬浮于20mL无水THF中。然后将先前溶解于5mL无水DMF中的676mg(2.74mmol)2-乙氧基-1-乙氧羰基-1，2-二氢喹啉(EEDQ)加入烧瓶内，并且浑浊的反应混合物在室温下搅拌过夜。然后在减压下蒸发挥发物，并且将粗残渣干装载并且通过硅胶上的层析(从99∶1到85∶15的DCM/MeOH梯度)进行纯化，以提供809mg(83％)作为白色固体的标题化合物。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.84(s，1H)，8.18(d，J＝7.0Hz，1H)，7.90(d，J＝8.6Hz，1H)，7.53(d，J＝8.6Hz，2H)，7.28(d，J＝8.6Hz，2H)，5.44(d，J＝4.4Hz，1H)，4.62(q，J＝6.2Hz，1H)，4.39(p，J＝7.6，7.2Hz，1H)，4.17(dd，J＝8.5，6.8Hz，1H)，2.70(t，J＝2.6Hz，1H)，1.96(dt，J＝13.2，6.6Hz，1H)，1.88(s，3H)，1.30(d，J＝7.1Hz，3H)，0.86(dd，J＝10.9，6.8Hz，6H)。ESI+[M+H]+＝374.2。HPLC方法2保留时间＝3.95分钟。
1.2.3.3)1-(4-((S)-2-((S)-2-乙酰氨基-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苯基)丁-3-炔-1-基(4-硝基苯基)碳酸酯的合成
将94mg(0.25mmol)(2S)-2-乙酰氨基-N-((2S)-1-((4-(1-羟基丁-3-炔-1-基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)-3-甲基丁酰胺和153mg(0.50mmol)双(4-硝基苯基)碳酸酯溶解于2mL无水DMF中。加入98mg(0.76mmol)DIPEA，并且将反应混合物在室温下搅拌过夜。在减压下去除挥发物，并且通过硅胶上的层析(从99∶1到90∶10的DCM/MeOH梯度)纯化粗残渣，以提供118mg(87％)作为黄色固体的标题化合物。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.99(s，1H)，8.35-8.26(m，2H)，8.22(d，J＝7.0Hz，1H)，7.89(d，J＝8.6Hz，1H)，7.63(d，J＝8.7Hz，2H)，7.58-7.48(m，2H)，7.43(d，J＝8.7Hz，2H)，5.74(d，J＝7.5Hz，1H)，4.39(p，J＝7.2Hz，1H)，4.17(dd，J＝8.5，6.9Hz，1H)，3.01-2.84(m，3H)，1.99-1.91(m，1H)，1.88(s，3H)，1.31(d，J＝7.1Hz，3H)，0.86(dd，J＝11.2，6.8Hz，6H)。ESI+[M+H]+＝539.1。HPLC方法2保留时间＝6.48分钟。
1.2.3.4)化合物INT3的合成
将43mg(0.081mmol)先前的化合物1-(4-((S)-2-((S)-2-乙酰氨基-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苯基)丁-3-炔-1-基(4-硝基苯基)碳酸酯、55.5mg(0.11)甲磺酸依喜替康和11.0mg(0.08mmol)HOBt溶解于2mL无水DMF/吡啶的85∶15(v/v)混合物中。加入11.5mg(0.09mmol)DIPEA。反应在40℃下搅拌3小时。在减压下去除挥发物后，反应混合物通过硅胶上的层析(从99∶1到95∶5的DCM/MeOH梯度)进行纯化，以提供42mg(62％)作为黄色/浅绿色固体的化合物INT3。ESI+[M+H]+＝835.3。HPLC方法2保留时间＝6.50和6.60分钟(非对映异构体混合物)。
1.2.4)化合物INT4、INT4-S和INT4-R的合成
1.2.4.1)叔丁基(2-(4-氨基苯基)-2-羟乙基)氨基甲酸酯的合成
将含有911mg(3.23mmol)商购可得的叔丁基(2-羟基-2-(4-硝基苯基)乙基)氨基甲酸酯(CAS#939757-25-2)的MeOH溶液转移到不锈钢氢化反应器内。在第一次氩吹扫后，加入催化量的5％wt Pd/C。反应器然后用H2吹扫两次，并且在室温下在10巴的H2压力下保持5小时，同时保持反应搅拌。在用0.45μm PTFE过滤器过滤反应以及在真空下的MeOH去除后，获得749mg(92％)作为白色固体的标题化合物。ESI+[M+H]+＝253.2。HPLC方法2保留时间＝2.73分钟。
1.2.4.2)叔丁基(2-(4-((S)-2-((S)-2-乙酰氨基-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苯基)-2-羟乙基)氨基甲酸酯的合成
将150mg(0.60mmol)先前的化合物叔丁基(2-(4-氨基苯基)-2-羟乙基)氨基甲酸酯、222mg(0.71mmol)Fmoc-Ala-OH和81mg(0.62mmol)DIPEA溶解于5mL无水DMF中。加入181mg(0.71mmol)HATU，并且将反应在室温下搅拌过夜。然后在减压下去除挥发物，并且通过硅胶上的层析(DCM/MeOH梯度从100∶0到90∶10)纯化粗残渣，以定量提供第一中间体叔丁基(2-(4-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙酰氨基)苯基)-2-羟乙基)氨基甲酸酯，其直接参与Fmoc脱保护。HPLC方法2保留时间＝7.7分钟。
将叔丁基(2-(4-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙酰氨基)苯基)-2-羟乙基)氨基甲酸酯溶解于5mL DMF/哌啶9∶1(v/v)中，并且在室温下搅拌15分钟。然后在减压下去除挥发物，并且通过硅胶上的层析(从99∶1到80∶20的DCM/MeOH梯度)纯化粗残渣，以提供130mg(在两步内68％)作为白色泡沫状固体的第二中间体叔丁基(2-(4-((S)-2-氨基丙酰氨基)苯基)-2-羟乙基)氨基甲酸酯。HPLC方法2保留时间＝3.75分钟。
将130mg(0.40mmol)叔丁基(2-(4-((S)-2-氨基丙酰氨基)苯基)-2-羟乙基)氨基甲酸酯和124mg(0.48mmol)商购可得的Ac-Val-OSu(CAS#56186-37-9)溶解于3mL无水DMF中，并且将反应混合物在室温下搅拌过夜。然后在减压下去除挥发物并且将粗残渣与3mLDCM一起研磨，以提供95mg(51％)作为白色固体的标题化合物。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.82(s，1H)，8.16(d，J＝7.1Hz，1H)，7.88(d，J＝8.6Hz，1H)，7.53(d，J＝8.4Hz，2H)，7.22(d，J＝8.5Hz，2H)，6.73-6.58(m，1H)，5.27(d，J＝4.4Hz，1H)，4.58-4.47(m，1H)，4.40(q，J＝7.1Hz，1H)，4.17(dd，J＝8.4，6.8Hz，1H)，3.15-2.90(m，2H)，1.88(s，4H)，1.35(s，9H)，1.30(d，J＝7.1Hz，3H)，0.92-0.73(m，6H)。ESI+[M+H]+＝487.3。HPLC方法2保留时间＝4.50分钟。
1.2.4.3)叔丁基(2-(4-((S)-2-((S)-2-乙酰氨基-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苯基)-2-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)乙基)氨基甲酸酯的合成
将286mg(0.62mmol)叔丁基(2-(4-((S)-2-((S)-2-乙酰氨基-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苯基)-2-羟乙基)氨基甲酸酯和375mg(1.23mmol)双(4-硝基苯基)碳酸酯溶解于3mL无水DMF中。加入318mg(2.46mmol)DIPEA，并且将反应混合物在室温下搅拌3小时。在减压下去除挥发物，并且通过硅胶上的层析(从99∶1到90∶10的DCM/MeOH梯度)纯化粗残渣，以提供336mg(87％)作为黄色固体的标题化合物。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.99(s，1H)，8.36-8.26(m，2H)，8.22(d，J＝6.9Hz，1H)，7.89(d，J＝8.6Hz，1H)，7.63(d，J＝8.6Hz，2H)，7.56-7.46(m，2H)，7.34(d，J＝8.6Hz，2H)，7.22(t，J＝5.6Hz，1H)，5.68(t，J＝6.0Hz，1H)，4.38(p，J＝7.1Hz，1H)，4.17(dd，J＝8.5，6.9Hz，1H)，3.49-3.34(m，2H)，2.01-1.90(m，1H)，1.87(s，3H)，1.37(s，9H)，1.30(d，J＝7.1Hz，3H)，0.86(dd，J＝11.1，6.8Hz，6H)。ESI+[M+Na]+＝652.2。HPLC HPLC方法2保留时间＝7.13分钟。
1.2.4.4)化合物INT4的合成
将231mg(0.37mmol)先前的化合物叔丁基(2-(4-((S)-2-((S)-2-乙酰氨基-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苯基)-2-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)乙基)氨基甲酸酯、150mg(0.28)甲磺酸依喜替康和38mg(0.28mmol)HOBt溶解于5mL无水DMF/吡啶的85∶15(v/v)混合物中。加入40mg(0.31mmol)DIPEA。反应在40℃下搅拌3小时，并且在减压下蒸发挥发物。通过硅胶上的层析(从99∶1到90∶10的DCM/MeOH梯度)纯化粗残渣。220mg(85％)中间体化合物1-(4-((S)-2-((S)-2-乙酰氨基-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苯基)-2-((叔丁氧羰基)氨基)乙基((1R，9R)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10，13-二氧代-2，3，9，10，13，15-六氢-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3′，4′：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-1-基)氨基甲酸酯作为棕黄色固体获得。ESI+[M+H]+＝926.4。HPLC方法2保留时间＝6.7和6.8分钟(非对映异构体混合物)。
所得到的固体在0℃下用TFA/DCM(30∶70v/v)溶液进行重新溶解，并且在室温下搅拌20分钟。在减压下蒸发挥发物，将粗残渣溶解于水/ACN(1∶1 v/v)溶液中，并且使用HPLC制备方法5进行纯化，以提供171.4mg(73％)作为黄色固体的化合物INT4。ESI+[M+H]+＝826.4。HPLC方法3保留时间＝8.3和8.75分钟(非对映异构体混合物)。
1.2.4.5.1)叔丁基(2-(4-氨基苯基)-2-羟乙基)氨基甲酸酯的外消旋混合物的手性分离
在Teledyne IscoRf200系统上，使用IC MPLC柱30x100mm，20μm(Daicel目录#83M73)，执行外消旋叔丁基(2-(4-氨基苯基)-2-羟乙基)氨基甲酸酯的手性分离。流动相为DCM+0.2％(v/v)EtOH(等度梯度)。流速为12mL/分钟。样品溶剂为DCM+0.2％(v/v)EtOH。在分离后两种对映体的质量回收率超过75％。
叔丁基(S)-(2-(4-氨基苯基)-2-羟乙基)氨基甲酸酯的保留时间为21分钟，而叔丁基(R)-(2-(4-氨基苯基)-2-羟乙基)氨基甲酸酯的保留时间为29分钟。通过X射线晶体学确认了对映体(先前溶解于庚烷/乙醇的1∶1混合物中，并且允许缓慢蒸发1周以诱导晶体的形成)的绝对构型。将块状晶体固定到全氟醚油中的尼龙环上。使用配备在T＝150.00(10)K下运行的Oxford Cryosystems低温装置的Xcalibur、Atlas、Gemini超衍射仪收集数据。使用Cu Kα辐射使用ω扫描测量数据。使用双重方法并且通过使用Olex2(O.V.Dolomanov等人，Olex2：A complete structure solution，refinement and analysis program，J.Appl.Cryst.，2009，42，339-341)作为图形界面，用ShelXT解决方案程序来分辨结构。使用在F2上的全矩阵最小二乘法最小化，用ShelXL 2018/3(Sheldrick，G.M.，Crystalstructure refinement with ShelXL，Acta Cryst.，2015，C71，3-8)，对模型进行细化。
1.2.4.5.2)立体纯INT4-S和INT4-R化合物的合成
立体纯化合物INT4-S和INT4-R如先前节段1.2.4中所述的进行合成，而无反应条件、反应性或总体产率中的任何明显变化。
使用HPLC制备方法5的最终纯化提供54mg作为黄色固体的化合物INT4-S。ESI+[M+H]+＝826.4。HPLC方法3保留时间＝8.45分钟。
使用HPLC制备方法5的最终纯化提供46mg作为黄色固体的化合物INT4-R。ESI+[M+H]+＝826.4。HPLC方法3保留时间＝8.90分钟。
1.3)药物-接头的合成
1.3.1)基于葡糖苷酸的药物-接头的合成
1.3.1.1)化合物LNK1的合成
将44.5mg(0.049mmol)化合物PSR1(叠氮化物-聚肌氨酸中间体)和27.5(0.033mmol)化合物INT1(炔烃-有效载荷)溶解于100mM PBS(pH＝7.5)和DMSO的1∶1(v/v)溶液中，以便达到0.060M浓度的化合物INT1。然后将新鲜制备的CuSO4五水合物和抗坏血酸钠溶液(大约250mg/mL)序贯地加入反应小瓶内，以便达到0.08摩尔当量Cu和1摩尔当量的抗坏血酸钠(基于反应混合物中的化合物INT 1摩尔当量)。反应用氩进行吹扫并且在40℃下进行搅拌。反应通过HPLC进行监测，并且在不到2小时内完成。反应混合物然后用在水/ACN 1∶1(v/v)中的0.1％TFA溶液进行稀释，并且使用HPLC制备方法5进行纯化，以提供44mg(基于起始化合物INT1的77％)作为黄色固体的中间体化合物(2S，3S，4S，5R，6S)-6-(4-(2-(1-(35-氨基-3-甘氨酰-6，9，12，15，18，21，24，27，30，33-十甲基-5，8，11，14，17，20，23，26，29，32，35-十一氧代-3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33-十一氮杂三十五烷基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)-1-((((1R，9R)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10，13-二氧代-2，3，9，10，13，15-六氢-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3′，4′：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰基)氧基)乙基)-2-硝基苯氧基)-3，4，5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸。ESI+[M+H]+＝1755.7。HPLC方法3保留时间＝7.51分钟和7.82分钟(非对映异构体混合物)。
将26.0mg(0.015mmol)这种化合物和4.11mg(0.016mmol)马来酰亚胺基乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯溶解于无水DMF(0.1M浓度的马来酰亚胺化合物)中。加入2.25mg(0.022mmol)三乙胺，并且将反应搅拌2小时，直至通过HPLC观察到反应的完全转换。反应混合物然后用在水/ACN 1∶1(v/v)中的1％TFA溶液进行稀释，并且使用HPLC制备方法6进行纯化，以提供16.0mg(57％)作为黄色固体的化合物LNK1。ESI+[M+H]+＝1892.7。HPLC方法3保留时间＝7.95分钟和8.20分钟(等摩尔非对映异构体混合物)。
1.3.1.2)化合物LNK2的合成
将409mg(0.31mmol)化合物PSR3(NHS激活的聚肌氨酸中间体)和172mg(0.21mmol)化合物INT2(NH2有效载荷)溶解于小瓶中的无水DMF中(0.080M浓度的化合物INT2)。加入83.5mg(0.83mmol)三乙胺，并且反应在室温下搅拌30分钟。在如通过HPLC观察到的反应的完全转换后，将哌啶直接加入反应小瓶内，以便达到8％(v/v)哌啶的DMF溶液。反应然后在室温下搅拌5-10分钟，直到通过HPLC观察到Fmoc完全脱保护。反应用水/ACN 1∶1(v/v)中的10％TFA溶液进行缓慢中和，并且使用HPLC制备方法5进行纯化，以提供254mg(基于起始化合物INT2的67％产率)作为黄色固体的中间体化合物(2S，3S，4S，5R，6S)-6-(4-((9S)-40-氨基-9-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙酰氨基)-1-(((1S，9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10，13-二氧代-2，3，9，10，13，15-六氢-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3′，4′：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-1-基))氨基)-11，14，17，20，23，26，29，32，35，38-十甲基-1，6，10，13，16，19，22，25，28，31，34，37，40-十三氧代-2-氧杂-5，11，14，17，20，23，26，29，32，35，38-十一氮杂四十烷-3-基)-2-硝基苯氧基)-3，4，5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸。ESI+[M+H]+＝1819.7。HPLC方法2保留时间＝4.60分钟和4.69分钟(等摩尔非对映异构体混合物)。
将254mg(0.14mmol)这种化合物和39.1mg(0.15mmol)马来酰亚胺基乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯溶解于无水DMF(0.1M浓度的马来酰亚胺化合物)中。加入22.6mg(0.22mmol)三乙胺，并且将反应搅拌1小时，直至如通过HPLC观察到的反应的完全转换。反应混合物然后用在水/ACN 1∶1(v/v)中的1％TFA溶液进行稀释，并且使用HPLC制备方法6进行纯化，以提供161mg(58％)作为黄色固体的最终化合物LNK2。HRMS m/z(ESI+)：Calc[M+2H]2+＝985.8900；Exp[M+2H]2+＝985.8896；误差＝0.4ppm。HPLC方法2保留时间＝7.9分钟和8.1分钟(等摩尔非对映异构体混合物)。
1.3.1.3)化合物LNK2-S和LNK2-R的合成
化合物LNK-2-S和LNK2-R如上所述进行合成，使用与用于化合物LNK2相同的程序。原材料分别为化合物INT2-S和INT2-R(NH2有效载荷)以及化合物PSR3(NHS激活的聚肌氨酸中间体)。
53.4mg化合物LNK2-S作为黄色固体获得。ESI+[M+2H]2+＝985.9。HPLC方法3保留时间＝7.8分钟。
44.0mg化合物LNK2-R作为黄色固体获得。ESI+[M+2H]2+＝985.9。HPLC方法3保留时间＝8.1分钟。
1.3.2)基于二肽的药物-接头的合成
1.3.2.1)化合物LNK3的合成
最终化合物LNK3如上所述进行合成，使用与用于化合物LNK1相同的程序。原材料是化合物PSR2(叠氮化物-聚肌氨酸中间体)和化合物INT3(炔烃-有效载荷)。
14.0mg(在两步内36％)化合物LNK3作为黄色固体获得。ESI+[M+H]+＝1883.8。HPLC方法3保留时间＝8.82分钟和9.07分钟(等摩尔非对映异构体混合物)。
1.3.2.2)化合物LNK4的合成
化合物LNK4如上所述进行合成，使用与用于化合物LNK2相同的程序。原材料是化合物PSR4(NHS激活的聚肌氨酸中间体)和化合物INT4(NH2有效载荷)。
34.9mg(在两步内46％)化合物LNK4作为黄色固体获得。HRMS m/z(ESI+)：Calc[M+2H]2+＝981.4394；Exp[M+2H]2+＝981.4398；误差＝-0.4ppm。HPLC方法3保留时间＝8.81分钟和8.94分钟(等摩尔非对映异构体混合物)。
1.3.2.3)化合物LNK4-S和LNK4-R的合成
化合物LNK4-S和LNK4-R如上所述进行合成，使用与用于化合物LNK2相同的程序。原材料分别为化合物INT4-S和INT4-R(NH2有效载荷)以及化合物PSR4(NHS激活的聚肌氨酸中间体)。
18.1mg化合物LNK4-S作为黄色固体获得。ESI+[M+2H]2+＝981.4。HPLC方法3保留时间＝8.78分钟。
16.3mg化合物LNK4-R作为黄色固体获得。ESI+[M+2H]2+＝981.4。HPLC方法3保留时间＝8.96分钟。
实施例2：抗体-药物缀合物的制备和表征
2.1)抗体生产
从文献中获得单克隆抗体的氨基酸序列。法妥组单抗轻链(SEQ ID.10)和重链(SEQ ID.11)序列得自世界卫生组织(World HealthOrganization)(WHO)药物信息第23卷，第3期，2009中公布的国际非专利药品名称(International Nonproprietary Names forPharmaceutical Substances)(INN)列表62和WO2017151979。还生产了在法妥组单抗的重链(Wines等人The Journal of Immunology 2000年5月15日，164(10)5313-5318)上包括Fc沉默突变L234A和L235A(“LALA”)的法妥组单抗LALA(重链”LALA”SEQ ID.9序列)。米妥昔单抗轻链(SEQ ID.17)和重链(SEQ ID.16)序列得自专利申请WO2011106528。人IgG1k非结合同种型对照是来自Sino Biologicals的目录#HG1K(专有氨基酸序列)。曲妥珠单抗(150mg)购自Roche。(德曲妥珠单抗)购自Daiichi Sankyo/AstraZeneca。
单克隆抗体使用领域公认的技术(外包给Evitria AG，瑞士)通过CHO K1细胞的瞬时转染进行生产。使用常规(非基于PCR的)克隆技术，将cDNA克隆到Evitria的载体系统内。基于阴离子交换层析，在低内毒素条件下制备pDNA。通过测量在260nm的波长下的吸光度来确定DNA浓度。用桑格测序(每个质粒至多两次测序反应)验证序列的正确性。悬浮适应的CHO K1细胞(最初从ATCC收到，并且在Evitria处适应悬浮培养中的无血清生长)用于抗体生产。种子在Evitria的专有无动物组分和血清培养基中生长。用Evitria的专有转染试剂转染细胞。通过离心和后续过滤(0.2μm过滤器)收获上清液。使用MabSelect SuRe蛋白A纯化树脂(Cytiva)和SEC制备型树脂纯化抗体。抗体材料的纯度通过SDS-PAGE和尺寸排阻层析进行确认并且超过95％。使用Charles River Endosafe PTS系统测量内毒素含量。
2.2)半胱氨酸缀合的抗体-药物缀合物的制备
抗体溶液(PBS 7.4+1mM EDTA中的10mg/mL)用所需量(2.2摩尔当量用于最终的～DAR4 ADC或14摩尔当量用于最终的DAR8 ADC)的三(2-羧乙基)膦(TCEP)在37℃下处理1-2小时。通过使用Amicon 30K离心过滤装置(Millipore)的三轮稀释/离心，还原的抗体用磷酸钾100mM pH 7.4+1mM EDTA进行缓冲液交换。对于最终的～DAR4 ADC，将6摩尔当量的药物-接头(来自12mM DMSO原液)加入抗体中。对于最终的DAR8 ADC，添加了10-12摩尔当量的药物-接头。使溶液在室温下温育30分钟。通过使用Amicon 30K离心过滤装置的四轮稀释/离心，最终缀合物用PBS pH 7.4缓冲液或组氨酸蔗糖缓冲液(20mM组氨酸缓冲液pH 6.0、4％(w/v)蔗糖+75mM NaCl)进行缓冲液交换/纯化，并且进行无菌过滤(0.20μm PES过滤器)。
使用Nanodrop One装置(Thermo Fisher Scientific)在280nm处通过分光光度法评价最终蛋白质浓度。
2.3)半胱氨酸缀合的抗体-药物缀合物的表征
所得到的缀合物如下进行表征：
通过反相液相层析-质谱法(RPLC-MS)的药物抗体比(DAR)评价：
使用上文实施例1中所述的HPLC方法4执行变性RPLC-QToF分析。简言之，使用水/乙腈+0.1％甲酸(0.4mL/分钟)的流动相梯度，在Agilent PLRP-S2.1x150mm 8μm(80℃)上洗脱缀合物，并且使用Bruker Impact IITM Q-ToF质谱仪扫描500-3500m/z范围(ESI+)进行检测。使用Bruker软件中包括的MaxEnt算法，对数据进行解卷积。
反相液相层析(RPLC-UV)：
变性RPLC-UV分析也在Agilent 1100 HPLC-DAD系统上进行，使用上述HPLC方法4的略微修饰形式。流动相改性剂0.1％甲酸由0.1％TFA替换，并且仅使用DAD UV吸光度进行检测(无质谱仪检测器)。
尺寸排阻层析(SEC)：
SEC在柱外体积低于15μL的Agilent 1100 HPLC系统(配备0.12mm内径peek管道的短段和微量UV流动池)上执行。柱为Agilent AdvanceBioSEC4.6x150mm 2.7μm(在30℃下维持)。流动相为100mM磷酸钠和200mM氯化钠(pH 6.8)。将10％乙腈(v/v)加入流动相中，以使与固定相的二次疏水相互作用降到最低并且防止细菌生长。流速为0.35mL/分钟。在280nm或任何其它相关波长下监测UV检测。
2.4)赖氨酸缀合的抗体-药物缀合物的制备
抗体米妥昔单抗或法妥组单抗的溶液(在100mM KH2PO4 pH 8.0中10mg/mL)用磺基-SPDB-DM4 CAS#1626359-59-8(MedChemExpress)的12mM DMSO溶液进行处理，达到7.5摩尔当量的磺基-SPDB-DM4的最终浓度。使溶液在室温下温育3小时，并且使用0.20μm PES过滤器进行过滤。通过使用Amicon 30K离心过滤装置的五轮稀释/离心，最终缀合物用PBS pH7.4缓冲液或组氨酸蔗糖缓冲液(20mM组氨酸缓冲液pH 6.0、4％(w/v)蔗糖+75mM NaCl)进行缓冲液交换/纯化，并且进行无菌过滤(0.20μm PES过滤器)。
使用Nanodrop One装置(Thermo Fisher Scientific)在280nm处通过分光光度法评价最终蛋白质浓度。
2.5)赖氨酸缀合的抗体-药物缀合物的表征
所得到的缀合物如下进行表征：
通过天然SEC-MS的平均药物抗体比(DAR)评价：
在分析前，ADC通过对于50μg ADC添加50U(Genovis)酶进行去糖基化。ADC在30℃下维持的Agilent AdvanceBio SEC 200A 1.9μm 2.1x150mm PEEK柱(目录#PL1980-3201PK)上进行分离。该柱在50mM乙酸铵+10％(v/v)HPLC级异丙醇中进行平衡。流速在运行期间维持在0.075mL/分钟下，并且ADC通常在3.5至4.5分钟之间洗脱。流量和缓冲液组成在mAb或ADC的洗脱之后得到维持。将柱洗脱物导入扫描300-8000m/z范围(ESI+)的Bruker Impact IITM Q-ToF质谱仪内。源毛细管电压设定为4500V。源干燥气体和雾化气体分别设定为8.0L/分钟和25Psi。源干燥温度设定为200℃。使用Bruker 软件中包括的MaxEnt算法，对ADC质谱进行解卷积，并且DAR使用每个ADC亚种的离子强度峰高进行计算。
尺寸排阻层析(SEC)：
SEC在柱外体积低于15μL的Agilent 1100 HPLC系统(配备0.12mm内径peek管道的短段和微量UV流动池)上执行。柱为Agilent AdvanceBioSEC4.6x150mm 2.7μm(在30℃下维持)。流动相为100mM磷酸钠和200mM氯化钠(pH 6.8)。将10％异丙醇(v/v)加入流动相中，以使与固定相的二次疏水相互作用降到最低并且防止细菌生长。流速为0.35mL/分钟。在280nm或任何其它相关波长下监测UV检测。
实施例3：一般细胞培养实践和动物实验
本项目中使用的人癌细胞系购自美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)(ATCC)、莱布尼茨研究所DSMZ德国微生物和细胞培养物保藏中心(The Leibniz Institute DSMZ German Collection of Microorganisms and CellCultures GmbH)(DSMZ)或欧洲认证细胞培养物保藏中心(European Collection ofAuthenticated Cell Cultures)(ECACC)。为了在实验中使用，遵循来自原始ATCC/DSMZ/ECACC供应商关于细胞培养基和补充剂、冷冻保存和传代培养程序的说明，细胞遵循良好且建立的细胞培养实践进行培养。细胞在5％CO2大气下在37℃下温育不超过2个月。
所有动物程序都按照欧盟指令86/609/EEC执行。实验在个人许可下以及在由法国农业部(French Ministry of Agriculture)认可的动物护理设施中执行。该研究获得了当地动物伦理委员会(CECCAPP)的批准。
实施例4：葡糖苷酸或二肽药物-接头设计的啮齿类动物治疗指数比较
评价了药物-接头构建体LNK1(葡糖苷酸-依喜替康)和LNK3(二肽Val-Ala-依喜替康)的小鼠治疗指数，以比较两种酶可切割模式葡糖苷酸和二肽Val-Ala的小鼠治疗指数。使用模型人HER2靶向曲妥珠单抗单克隆抗体作为靶向部分，配制了T-GLC-EXA ADC和T-VA-EXA ADC。这些ADC按照在HER2+胃癌模型中的体内功效且按照耐受性(治疗指数)进行比较。由于曲妥珠单抗在小鼠中并不交叉反应，因此该测定给出了关于ADC的药物-接头组分的表观毒性的有用信息(排除可能的靶介导的毒性)。
体内功效的评价：将NCI-N87胃癌细胞皮下植入雌性SCID小鼠(4周龄)中。当肿瘤已生长至大约150mm3时，ADC以1mg/kg的亚治愈剂量静脉内给药一次(每组6只动物，分配以使各组间的初始肿瘤体积的差异降到最低)。肿瘤体积每3-5天通过卡尺装置进行测量，并且使用式(L x W2)/2进行计算。当肿瘤体积超过1000mm3时，将小鼠处死。
药代动力学概况的评价：在缀合物的单次静脉内3mg/kg剂量之后，在大鼠中的PK概况(随着时间过去基于mAb组分的抗体-药物缀合物总浓度)。ADC经由尾静脉以3mg/kg注射到雌性Sprague-Dawley大鼠(4-6周龄，Charles River)中(每组3只动物，随机分配)。在各个时间点经由眶后放血将血液抽取到柠檬酸盐管内，加工成血浆并且贮存于-80℃下直至分析。根据制造商的方案，使用人IgG ELISA试剂盒(StemcellTM Technologies)评价基于抗体组分的ADC浓度。使用相应单克隆抗体的标准曲线用于定量。使用掺入PK功能的软件(由Usansky等人，Department of Pharmacokinetics and DrugMetabolism，Allergan，Irvine，USA开发的插件)，通过二室分析来计算PK参数(清除率、半衰期和AUC)。
体内耐受性的评价：雌性SCID小鼠(n＝3)用200mg/kg ADC化合物的单次腹膜内高剂量进行治疗。在12天的过程中就重量减轻或明显的毒性迹象观察小鼠。在本实验中，使用(德曲妥珠单抗)作为阳性对照。
本研究的结果显示于图1中。T-GLC-EXA和T-VA-EXA显示了相似的体内功效(图1A)和相似的大鼠PK概况(图1B)，但在高剂量下显示出小鼠耐受性中的显著差异(图1C)。得出结论至少对于与依喜替康有效载荷一起使用，二肽Val-Ala可切割模式提供了更好的功效/耐受性概况。像这样，这种实体对于其它ADC构建体是优选的。
实施例5：叶酸受体α(FRa)细胞外结合位点的流式细胞术评价
对于FRa细胞表面定量，使细胞在室温下与PE抗FOLR1抗体(BioLegend目录#908304)一起温育20分钟。遵循制造商的说明，使用eBioscienceTM Fixable Viability DyeeFluorTM 780试剂盒(Thermo Fisher Scientific目录#65-0865-18)评价细胞活力。使用通过BD FACSDiva软件(BD Biosciences)控制的BD Fortessa流式细胞仪执行分析，并且使用FlowJo软件(BD Bioscience)分析数据。
结果显示于图2中。本研究计划的细胞系呈现不同水平的FRa细胞外表达。BT-474乳腺癌细胞并不表达细胞外FRa，并且因此在本研究计划的背景下被视为阴性对照细胞系。
实施例6：甲磺酸依喜替康对FRa+癌细胞系的体外细胞毒性测定
化合物甲磺酸依喜替康的体外细胞毒性在几种FRa阳性癌细胞系上进行评价。细胞以取决于细胞系的适当密度在96孔板中铺平板(100μL适当培养基中1000至10000个细胞/孔)，并且在37℃下温育24小时。加入先前溶解于培养基(50μL)中的测试化合物的连续稀释物，并且温育在37℃下进行144小时。将MTT(5mg/mL，20μL，Sigma-Aldrich)加入孔内，并且温育在37℃下继续1至2小时。然后小心地去除培养基，并且用酸化异丙醇均匀地溶解孔内容物。使用570nm的波长(伴随690nm的参考波长)，在MultiskanTM Sky微孔板阅读器(Thermo Scientific)上测量吸光度值。使用抑制剂量应答曲线拟合(GraphPad Prism 9)确定与未处理的对照细胞相比的IC50浓度值。
结果显示于图3中。甲磺酸依喜替康显示出亚nM至低nM IC50的体外效力，促使我们调查这种化合物作为用于FRa表达恶性肿瘤的ADC有效载荷的用途。
实施例7：通过ELISA的重组FRα结合亲和力
使用96孔高结合ELISA板(Corning Inc.，New York，NY，USA，目录#3590)执行夹心ELISA测定。板使用100μL/孔的以2μg/mL在PBS(pH 7.4)中的重组人FRa蛋白(SinoBiological目录#11241-H08H)；重组食蟹猴FRa蛋白(SinoBiological目录#90950-C08H)；重组大鼠FRa蛋白(Sino Biological目录#81073-R08H)或重组小鼠FRa蛋白(SinoBiological目录#50573-M08H)进行包被，并且在4℃下温育过夜。在用PBS-T(PBS+0.05％Tween-20)的2次洗涤后，板在室温下用200μL/孔的温育缓冲液(PBS-T+0.1％BSA)封闭1小时。板用PBS-T洗涤4次，并且加入100μL的三倍稀释系列的测试化合物(抗体或抗体-药物缀合物)。然后，使板在室温下黑暗中温育2小时。在用PBS-T的5次洗涤后，使板在室温下与100μL/孔的山羊抗人IgG(H+L)HRP缀合抗体(Jackson Immunoresearch目录#109-035-088)一起温育1小时，所述抗体先前在温育缓冲液中稀释1∶250 000。在用PBS-T的5次洗涤后，添加TMB底物溶液(Thermo-Fisher目录#N301)。用0.18M H2SO4终止过氧化物酶活性，并且使用Thermo Scientibic MultiSkan EX微孔板阅读器在450nm(参考波长650nm)处读取吸光度。使用GraphPad Prism 9软件执行S形拟合。
结果显示于图4中。图4A：所有抗体和ADC都显示出大约EC50＝0.1nM的相似的重组人FRα结合亲和力。在天然抗体和分别的ADC构建体之间并未观察到结合损失。在法妥组单抗和法妥组单抗LALA与它们分别的ADC构建体之间并未观察到结合损失。在米妥昔单抗和M-SORAV ADC构建体之间并未观察到显著的结合损失。对于阴性对照ADC NEG-VA-EXA并未检测到人FRα结合。图4B：F-LALA-VA-EXA与人和食蟹猴重组FRa蛋白同等地结合，并不与大鼠和小鼠重组FRa蛋白结合。像这样，F-LALA-VA-EXA并非啮齿类动物交叉反应的，而是食蟹猴交叉反应的。
实施例8：通过SPR的人FRα结合亲和力
在25℃下，在Biacore T200仪器上执行表面等离子体共振(SPR)实验。测试抗体或ADC以低密度(300-500RU)在CM5系列S传感器芯片上进行捕获，所述传感器芯片事先用人抗体捕获(Human Antibody Capture)试剂盒(Cytiva目录#BR100839)进行功能化。使用类似处理但省略配体的功能化表面/流动池作为参考。为了测量动力学速率和亲和力，使用单循环动力学策略以及以恒定的70μL/mL流速的运行缓冲液(HBS-EP+，Cytiva目录#BR100669)，伴随300秒的接触脉冲，已以一系列5个浓度(0.5、1、2、4、8nM)一式两份注入重组人FRa(Sino Biological目录#11241-H08H)分析物样品。通过注入运行缓冲液900秒来测量解离阶段。在一式两份之间，表面/流动池用3M MgCl2进行再生，以去除分析物和配体两者，并且使用相同条件完成新鲜配体捕获。在扣除参考表面和分析物零浓度信号后，使用BiacoreEvaluation软件执行数据分析。数据进行处理并且与1∶1结合模型拟合，以确定结合动力学速率常数、ka(结合速率)和kd(解离速率)以及KD(平衡解离常数，也被称为“亲和力”)。报告了重复的平均值和标准差。
结果显示于图5中。在天然抗体和分别的ADC构建体之间并未观察到重组人FRa结合的损失。在法妥组单抗和法妥组单抗LALA与分别的ADC构建体之间并未观察到结合损失。令人惊讶的是，与米妥昔单抗和基于米妥昔单抗的构建体相比，对于基于法妥组单抗和法妥组单抗LALA的构建体观察到减少～1/10的KD值(亲和常数)。这是与米妥昔单抗和基于米妥昔单抗的构建体相比，关于基于法妥组单抗和法妥组单抗LALA的构建体的kd值(解离速率常数)增加的后果(考虑到结合速率常数ka是相似的)。对于阴性对照IgG1(SinoBiologicals目录#HG1K)，并未检测到人FRα结合事件。
实施例9：通过流式细胞术的细胞结合亲和力
通过流式细胞术评价抗体或ADC与癌细胞系上表达的细胞外人FRa的结合。根据制造商的方案(Bio-Rad，目录#LNK032APC)，使用LYNX Rapid APC Antibody ConjugationKit，使测试的抗体或ADC与APC荧光团缀合。向500000个细胞(悬浮于流式细胞术塑料管中的100μL PBS中)内加入5μL 10μg/mL测试APC标记的抗体或ADC的溶液。使细胞在黑暗中温育20分钟，通过离心用PBS洗涤3次，并且重悬浮于200μL PBS中用于分析。使用通过BDFACSDiva软件(BD Biosciences)控制的BD Fortessa流式细胞仪执行流式细胞术，并且使用FlowJo软件(BD Bioscience)分析数据。
结果显示于图6中。在法妥组单抗和法妥组单抗LALA与分别的ADC构建体之间观察到可比较的人FRα细胞结合。天然米妥昔单抗和天然法妥组单抗结合亲和力似乎相同。与其亲本抗体米妥昔单抗相比，对于米妥昔单抗的ADC衍生物(M-SORAV)观察到令人惊讶地结合的显著丧失。这可以通过以下任一加以解释：(1)磺基-SPDB-DM4药物-接头的异质随机缀合，所述磺基-SPDB-DM4药物-接头可以与其为抗体可变区的部分的赖氨酸氨基酸反应，因此减少结合亲和力；(2)M-SORAV的较低APC标记效率，因为LYNX Rapid APC缀合试剂盒与赖氨酸氨基酸如磺基-SPDB-DM4反应，或(3)(1)和(2)的组合。对于所有测试的化合物，在FRa阴性对照细胞系BT-474上并未观察到结合。
实施例10：离体ADC人血浆稳定性
F-VA-EXA和F-LALA-VA-EXA ADC样品(＞6mg/mL的PBS溶液)用纯无菌人血浆(GeneTex目录#GTX73265)在具有螺旋盖的离心管中进行稀释，以产生200μg/mL的最终ADC浓度(残留PBS体积低于5％v/v)。使样品在37℃下温育，并且在5分钟、6小时、1天、2天、3天和7天的时间点获取等分试样(等分试样保持冷冻在-80℃下直至分析)。使用DynabeadsTMM-280Streptavidin(Thermo Scientibic)磁珠，通过免疫捕获从血浆中分离ADC，所述磁珠先前用生物素化的人叶酸受体α重组蛋白(Sino Biologicals目录#11241-H08H)进行包被。简言之，600μL商业珠溶液用HBS-EP缓冲液(Cytiva，目录#BR100188)洗涤两次，并且重悬浮于1.2mL HBS-EP缓冲液中。加入65μL(48μg蛋白质量)生物素化的重组FRa溶液，并且溶液在室温下搅动2小时。珠然后用HBS-EP缓冲液洗涤3次，并且重悬浮于1.2mL HBS-EP缓冲液中。对于一次免疫捕获，将100μL先前的珠溶液加入微量离心管中的100μL HBS-EP上。加入10μL血浆中的ADC溶液(理论2μg ADC量)，并且溶液在室温下搅动2小时。在温育后，珠-ADC复合物用HBS-EP缓冲液洗涤两次，用200μL HBS-EP缓冲液进行重悬浮，并且通过在37℃下加入2μL/1000U PNGase F(New England Biolabs目录#P0705L)伴随轻轻搅动过夜进行脱糖基化。珠然后用HBS-EP缓冲液洗涤两次，用蒸馏水洗涤两次，并且用10％乙腈水溶液(v/v)洗涤一次。使珠与50μL含有0.1％(v/v)甲酸的30％乙腈水溶液(v/v)一起在室温下伴随轻轻搅动温育30分钟。然后使用配备Bruker Impact IITM Q-ToF质谱仪的Thermo UltiMate3000UHPLC系统，通过变性反相层析-质谱法分析含有脱糖基化的ADC的洗脱样品。流动相A为水+0.1％甲酸，并且流动相B为乙腈+0.1％甲酸。柱为Agilent PEEK PLRP-S2.1x100mm 5μm(80℃)。线性梯度为在25分钟内20％B至50％B。流速为0.4mL/分钟。在280nm处监测UV检测。Q-ToF质谱仪在m/z范围500-5000(ESI+)内使用。使用Bruker软件中包括的MaxEnt算法，对数据进行解卷积。对于稳定性数据分析，实施原始光谱在选择的轻链(LC)和重链(HC)洗脱时间窗口内的解卷积。根据来自起始ADC材料的相应的质量偏移来鉴定药物-接头丧失或修饰。通过将特定ADC亚种的强度除以来自总ADC种类的强度来计算具有不同DAR的ADC的相对比率。最终DAR值如Xu等人，Anal.Biochem.，2011，412(1)，56-66中所述进行计算。
结果显示于图7中。对于F-VA-EXA和F-LALA-VA-EXA ADC两者均观察到＞90％的药物-接头人血浆稳定性。在本研究期间并未观察到药物-接头质量偏移(无过早的依喜替康释放或代谢)，除了来自马来酰亚胺基团的自稳定水解(其在48-72小时ADC温育时间后完成)的+18Da(+H2O)质量偏移之外。唯一观察到的不稳定性由ADC的重链上的整个药物-接头的逆向迈克尔马来酰亚胺去缀合引起(在轻链上并未观察到去缀合)。
实施例11：对FRa阴性细胞系的体外细胞毒性实验
为了评价ADC的非特异性(脱靶)细胞毒性，在BT-474(FRa阴性)癌细胞系中实现体外细胞毒性测定。细胞以取决于细胞系的适当密度在96孔板中铺平板(100μL适当培养基中1000至10 000个细胞/孔)，并且在37℃下温育24小时。加入先前溶解于培养基(50μL)中的测试化合物的连续稀释物，并且温育在37℃下进行144小时。将MTT(5mg/mL，20μL，Sigma-Aldrich)加入孔内，并且温育在37℃下继续1至2小时。然后小心地去除培养基，并且用酸化异丙醇均匀地溶解孔内容物。使用570nm的波长(伴随690nm的参考波长)，在MultiskanTMSky微孔板阅读器(Thermo Scientific)上测量吸光度值。使用抑制剂量应答曲线拟合(GraphPad Prism 9)确定与未处理的对照细胞相比的IC50浓度值。
结果显示于图8中。与基于VA-EXA(LNK4-S药物-接头)的ADC相比，基于Soravtansine(磺基-SPDB-DM4)的ADC显示出更高水平的脱靶(非FRa介导的)细胞杀伤效力。对于基于米妥昔单抗和法妥组单抗的ADC均已观察到这一点。与soravtansine药物-接头相比，VA-EXA药物-接头组分产生更小的脱靶毒性，这是在临床设置中增加ADC的耐受性的良好先决条件。
表8：
实施例12：体内功效异种移植模型
在研究开始前，从Janvier labs(Le Genest-Saint-Isle，法国)获得四至五周龄的雌性CB-17严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠并隔离7天。小鼠用悬浮于PBS(OV-90、SW-620、KB、BT-474细胞系)或50％BD Matrigel的PBS溶液(PA-1、IGROV-1、OVCAR-3、NCI-H2110细胞系)中的细胞进行皮下接种。当平均肿瘤体积达到约120-150mm3时，小鼠进行随机化(通常为7只小鼠/组)，并且通过PBS(阴性对照)或调查的抗体-药物缀合物的单次(除非另有说明)静脉内注射进行治疗。肿瘤体积每3-5天使用卡尺装置进行测量(长度x宽度)，并且使用下式V＝4/3×π×R3进行计算，其中R代表半径。当肿瘤体积超过1500mm3时或在肿瘤溃疡的情况下，将小鼠处死。
在IGROV-1肿瘤模型中，在研究的第94天执行肿瘤再植入挑战。用F-LALA-VA-EXA(12mg/kg IV一次)治疗的小鼠使用与研究开始时使用的相同程序用IGROV-1细胞重新植入(对于动物的另一胁腹)。5只新的SCID动物的对照组也遵循确切相同的程序重新植入。
在图9中呈现了SW-620癌症模型中的肿瘤异种移植实验。F-VA-EXA和M-SORAV缀合物以5、10或15mg/kg IV注射一次。F-VA-EXA在5mg/kg及以上的剂量下是高度活性的，而比较物M-SORAV即使以15mg/kg给药时也是无活性的。
在图10中呈现了SW-620癌症模型中的肿瘤异种移植实验。F-VA-EXA和F-LALA-VA-EXA以1、3和6mg/kg IV注射一次。非靶向同种型匹配的阴性对照ADC NEG-VA-EXA以6mg/kgIV注射一次。F-VA-EXA和F-LALA-VA-EXA在1mg/kg及以上的剂量下是同样高度活性的。非靶向缀合物NEG-VA-EXA在6mg/kg的最高测试剂量下是无活性的，证实了缀合物的抗肿瘤活性是靶选择性的。
在图11中呈现了OV-90癌症模型中的肿瘤异种移植实验。F-VA-EXA、F-LALA-VA-EXA和M-SORAV缀合物以30mg/kg IV注射一次。所有缀合物都是高度活性的，在所有组中具有100％的缓解率。然而，用M-SORAV缀合物观察到显著毒性：6只小鼠中的6只显示了蓬乱的外观(毛发暗淡且缠结)，6只小鼠中的3只呈现虚脱迹象，并且6只小鼠中的2只患有腹泻。对于F-VA-EXA和F-LALA-VA-EXA缀合物并未观察到毒性。这些数据提示了，与M-SORAV相比，关于F-VA-EXA和F-LALA-VA-EXA构建体更佳的临床前治疗窗口。
在图12中呈现了OV-90癌症模型中的肿瘤异种移植实验。F-VA-EXA、F-LALA-VA-EXA和M-SORAV缀合物以5和10mg/kg的亚治愈剂量IV注射一次。在5mg/kg下，当与M-SORAV比较时，F-VA-EXA和F-LALA-VA-EXA显示了相似的功效和改善的功效。在10mg/kg下，F-VA-EXA和M-SORAV显示了相似的功效(尽管在M-SORAV组内观察到更多的异质性)。在10mg/kg下，F-LALA-VA-EXA的表现优于F-VA-EXA和M-SORAV两者。
在图13中呈现了KB癌症模型中的肿瘤异种移植实验。F-VA-EXA、F-LALA-VA-EXA和M-SORAV缀合物以3、6和12mg/kg IV注射一次。非靶向同种型匹配的阴性对照ADC NEG-VA-EXA以12mg/kg IV注射一次。F-VA-EXA、F-LALA-VA-EXA和M-SORAV在3mg/kg及以上的剂量下是同样活性的。非靶向缀合物NEG-VA-EXA在12mg/kg的最高测试剂量下是无活性的，证实了缀合物的抗肿瘤活性是靶选择性的。
在图14中呈现了PA-1癌症模型中的肿瘤异种移植实验。F-LALA-VA-EXA和M-SORAV缀合物以3、6和12mg/kg的亚治愈剂量IV注射一次。非靶向同种型匹配的阴性对照ADC NEG-VA-EXA以12mg/kg IV注射一次。在3mg/kg下，F-LALA-VA-EXA的表现优于M-SORAV。在6mg下，F-LALA-VA-EXA的表现略优于M-SORAV。在12mg下，M-SORAV的表现优于F-LALA-VA-EXA。总体而言，两种缀合物均显示出相似的功效水平。在12mg/kg的最高测试剂量下，与未治疗的对照组相比，非靶向缀合物NEG-VA-EXA显示出略微减少的肿瘤生长率。
在图15中呈现了OV-90癌症模型中的肿瘤异种移植实验。F-LALA-VA-EXA和M-SORAV缀合物以3、6和12mg/kg剂量IV注射一次。在3、6和12mg/kg下，F-LALA-VA-EXA的表现优于M-SORAV。
在图16中呈现了IGROV-1癌症模型中的肿瘤异种移植实验。F-LALA-VA-EXA和M-SORAV缀合物以3、6和12mg/kg剂量IV注射一次。非靶向同种型匹配的阴性对照ADC NEG-VA-EXA以12mg/kg IV注射一次。在3、6和12mg/kg下，F-LALA-VA-EXA和M-SORAV显示了相似的功效水平，伴随强烈的肿瘤消退。在12mg/kg的最高测试剂量下，非靶向缀合物NEG-VA-EXA显示出一定的功效水平，尽管不如研究中的其它FRa靶向ADC明显。在研究的第94天后执行的肿瘤再生长再挑战确认了，F-LALA-VA-EXA能够诱导保护性免疫记忆应答，因为在用F-LALA-VA-EXA以12mg/kg IV治疗一次的组的重新植入后，并未观察到肿瘤生长(具有新的未治疗的SCID小鼠的阳性对照组在植入后显示了肿瘤生长)。
在图17中呈现了叶酸受体α阴性(FRa neg)BT-474乳腺癌模型中的肿瘤异种移植实验。F-LALA-VA-EXA和M-SORAV缀合物以5和10mg/kg剂量IV注射一次。(HER2靶向德曲妥珠单抗)用作阳性对照，并且以10mg/kg剂量IV注射一次。在两个剂量下对于F-LALA-VA-EXA和M-SORAV均未观察到功效，确认了这些缀合物的功效是FRa选择性的。如预计的且如先前观察到的(Conilh等人，2021，Pharmaceuticals，14(3)，247，doi：10.3390/ph14030247)，在这种HER2阳性BT-474癌症模型中是有效的。
表9：
实施例13：小鼠耐受性实验
为了评价小鼠的临床前治疗指数，使用F-VA-EXA、F-LALA-VA-EXA和M-SORAV缀合物执行小鼠耐受性实验。雌性SCID小鼠(n＝5只小鼠/组)用F-VA-EXA(200mg/kg)、F-LALA-VA-EXA(200mg/kg)或M-SORAV(100mg/kg)的单次腹膜内剂量进行治疗。在21天的过程中就重量减轻或明显的毒性迹象小心地监测小鼠。
还在用F-LALA-VA-EXA 0、50、100、150或200mg/kg IV治疗一次的雌性CD-1小鼠中执行了相同的实验。
结果显示于下文和图18(用于SCID小鼠实验)中。F-VA-EXA和F-LALA-VA-EXA是良好耐受的，在200mg/kg剂量下没有明显的毒性迹象。相反，用以100m/kg剂量的M-SORAV治疗的所有小鼠都显示出明显的毒性迹象(具有蓬乱毛发的不整洁外观、腹泻、虚脱、闭眼、行为呆滞)，并且在第2-3天被发现死亡或不得不实施安乐死。这些结果连同上文提到的异种移植功效数据显示了，与比较物M-SORAV相比，F-VA-EXA和F-LALA-VA-EXA构建体的优异临床前治疗指数。
在雌性CD-1小鼠中，MBK-103在调查的每一个剂量水平(至多200mg/kg IV一次)下都不引起任何剂量依赖性不良全身或局部效应。并未观察到重量减轻或行为改变。唯一值得注意的观察是在最后的尸检过程中，与对照组相比，所有组中的胸腺和脾脏重量的略微减少。
表10：
实施例14：Sprague-Dawley大鼠药代动力学研究
F-VA-EXA和F-LALA-VA-EXA缀合物经由尾静脉以5mg/kg注射到雌性Sprague-Dawley大鼠(4-6周龄-Charles River)中(每组6只动物，随机分配)。在5分钟、4小时、1天、2天、4天、7天、14天和21天，经由眶后放血将血液抽取到柠檬酸盐管内；加工成血浆；并且贮存于-80℃下直至分析。
使用山羊多克隆抗人IgG(H+L)一级抗体(Jackson Immunoresearch)作为捕获试剂和小鼠多克隆抗人IgG(H+L)HRP缀合物(Jackson Immunoresearch)作为二级检测抗体，通过ELISA评价总mAb浓度。使用兔多克隆抗依喜替康抗体(ref#6294/00000920，在Biotem，Apprieu，法国定制)作为捕获试剂和小鼠多克隆抗人IgG(H+L)HRP缀合物(JacksonImmunoresearch)作为二级检测抗体，通过ELISA评价总ADC浓度。使用ADC的标准曲线用于定量。
使用掺入PK功能的Microsoft Excel软件(由Usansky等人，Department ofPharmacokinetics and Drug Metabolism，Allergan，Irvine，CA，USA开发的插件)，通过二室分析来计算药代动力学参数(清除率、半衰期、Vss和AUC)。
使用Agilent 1100HPLC系统和Sciex API 4000MS/MS系统，使用LC/MS-MS方法评价游离依喜替康浓度。使用由80∶20(v/v)乙腈/甲醇+1％甲酸+d5-依喜替康(20ng/mL)构成的有机溶液作为内部标准，使大鼠血浆样品进行蛋白质沉淀。使用梯度洗脱模式在45℃下维持的PhenomenexC8 2.1x30mm 2.6μm 100A柱(Phenomenex目录#00D-4497-AN)上分析样品。流动相A为水+0.15％甲酸，并且流动相B为乙腈/异丙醇80∶20(v/v)+0.15％甲酸。流速为0.8mL/分钟。对于检测，在正离子模式下使用MRM扫描。使用采1/x加权的线性最小二乘回归，使用峰面积比分析物/氘代内部标准相对于标称分析物浓度绘制校准曲线。校准曲线范围为0.2(LLOQ)至500ng/mL。
结果显示于图19中。F-VA-EXA和F-LALA-VA-EXA在循环中显示出双相PK概况(快速分布阶段随后为较慢的消除阶段)，具有相似的分布体积、缓慢的清除率以及在13-15天范围内的半衰期。总mAb和总ADC曲线在强度、斜率和形状方面是相似的，提示了良好的ADC稳定性(随着时间过去没有主要的有效载荷去缀合)。仅在实验的0-48小时时期过程中检测到游离依喜替康有效载荷(浓度是亲本ADC组分的1/106)，提示了良好的ADC稳定性以及没有依喜替康的过早去缀合。
实施例15：小鼠中的肺部炎症和毒性评估
博来霉素已广泛用于啮齿类动物中，以模拟肺纤维化，用于研究纤维化中涉及的机制和用于评估潜在疗法。为了评价ADC肺毒性，遵循如通过Walter和Kleeberger，MouseModels of Bleomycin-Induced Pulmonary Fibrosis，2008，Curr.Protoc.Pharmacol.40：5.46.1-5.46.17描述的已知程序，在小鼠中诱发博来霉素诱发的肺纤维化。在第0、4和8天，雌性C57/BL6小鼠(Janvier Labs，Le Genest-Saint-Isle，法国)用异氟烷进行轻度麻醉，并且用20μL 1mg/kg博来霉素PBS溶液(Bleomycine Bellon，15mg用于注射)或PBS(阴性对照小鼠)进行鼻内施用。包括非博来霉素条件化的小鼠作为阴性对照组。在第11天，小鼠(n＝6只/组)用测试的缀合物(10mg/kgi.p.)进行治疗，并且在实验的持续时间期间监测明显的毒性迹象和重量减轻。包括用临床批准的缀合物(10mg/kgi.p.)进行治疗的阳性对照组，所述缀合物已知在临床前和在少数患者中诱发间质性肺病和肺炎。在第25天处死所有小鼠，(通过支气管肺泡灌洗)获得支气管肺泡上清液，并且收获肺器官，称重，且在0.1％(w/v)甲醛的PBS溶液中进行固定。在固定后，肺用0.02％(w/v)叠氮化钠的PBS溶液进行冲洗，并且在石蜡中包埋用于组织学染色。载玻片用抗CD45抗体(Abcam目录#ab10558，1∶500)进行染色，以定量肺中的白细胞浸润水平。使用二级生物素化的山羊抗兔抗体(Vector Laboratories目录#BA-1000，1∶300)和抗生物素蛋白-HRP(VectorLaboratories目录#A-2004)用于检测。组织学实验和成像外包给Centre d′ImagerieQuantitative Lyon-Est(CiQLE)平台(Lyon，法国)。使用Fiji软件(由University ofWisconsin-Madison，USA的Laboratory for Optical and ComputationalInstrumentation开发且维护)的本地功能性处理IHC图像的随机部分(放大30％)，以计数载玻片内的CD45阳性细胞(1个载玻片/肺)，并且评价白细胞浸润水平。通过流式细胞术完成得自非博来霉素条件化的小鼠的支气管肺泡上清液中的淋巴细胞(CD3/CD4)、嗜酸性粒细胞(CCR3/SiglecF)、嗜中性粒细胞(Ly6g/Ly6C)和巨噬细胞(F4/80)总计数的监测。通过ELISA定量得自非博来霉素条件化的小鼠的支气管肺泡上清液中的炎症细胞因子水平。遵循制造商的说明，使用Bio-Plex ProTM Mouse Cytokine Th2 Panel(Bio-Rad目录#L60000UKVT)来定量IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13。遵循制造商的说明，分别使用Mouse TGF-beta 1DuoSet和Mouse IL-17 DuoSet ELISA试剂盒(R&D systems目录#DY1679和DY421)来定量TGF-β和IL-17。
使用GraphPad Prism 9软件，使用单因素ANOVA(Tukey方法)评估统计学显著性。p值表示为*(p＜0.033)、**(p＜0.002)、***(p＜0.0002)和****(p＜0.0001)，并且“ns”代表不显著(p＞0.123)。
IHC CD45定量结果显示于图20中。当与未治疗的(***)和博来霉素条件化的(****)阴性对照组相比时，阳性对照ADC引起白细胞炎症浸润的显著增加。当与未治疗的组相比时，F-VA-EXA ADC并未引起白细胞炎症浸润的显著增加，并且当与博来霉素条件化的(****)对照组相比时，引起显著增加。当与未治疗的和博来霉素条件化的阴性对照组两者相比时，F-LALA-VA-EXA并未引起白细胞炎症浸润的显著增加。基于这些临床前结果，可以假设F-VA-EXA且尤其是F-LALA-VA-EXA(Fc沉默变体)在临床设置中很少诱发或不诱发间质性肺病或肺炎。
支气管肺泡上清液中的炎症细胞因子水平显示于图21A中。与未治疗的组相比，阳性对照ADC引起IL-13、IL-17和TGF-β细胞因子水平的显著增加。当与未治疗的组相比时，F-VA-EXA和F-LALA-VA-EXA ADC并未引起细胞因子水平的显著增加。
支气管肺泡上清液中的淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞的总计数显示于图21B中。与未治疗的对照组相比，阳性对照引起淋巴细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞计数的显著增加。与未治疗的对照组相比，F-VA-EXA和F-LALA-VA-EXA显示了淋巴细胞计数的显著增加，但与未治疗的对照组相比，并未显示巨噬细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的统计学显著增加。
表11：
实施例16：食蟹猴中的剂量范围发现毒理学研究
使用专门培育的越南起源的本土雌性食蟹猴(食蟹猕猴(Macaca fascicularis))进行非人灵长类动物剂量范围发现毒理学研究。该研究在Cynbiose SAS(Marcy-l′法国)处执行。研究方案获得了测试设施机构动物护理和使用委员会(InstitutionalAnimal Care and Use Committee)的批准。F-LALA-VA-EXA ADC以三周间隔(总共3个剂量)以30、40、50或60mg/kg的剂量水平进行静脉内施用(5mL/kg/h，在30分钟的注射期内)。研究中使用了两只雌性猴/组(总共8只动物)。在最后一次施用后5天的终末处死后，进行了肉眼尸检、器官重量的测量和组织病理学检查。在研究期间评估的参数包括死亡率、临床体征(包括食物消耗的估计)、体重、眼科检查、体温、血液学、凝血、临床化学、尿分析、器官重量以及组织的广泛列表的宏观和微观检查。ADC制剂缓冲液为20mM组氨酸pH 6.0，4％(w/v)蔗糖和75mM NaCl。媒介物为0.9％盐水。
结果显示于图22中。F-LALA-VA-EXA ADC是良好耐受的，具有50mg/kg三次的估计最高非严重毒性剂量(HNSTD)。由于两只动物之一中的急性肾衰竭(很可能是靶相关的，由于叶酸受体α在肾中内源性表达)，因此以60mg/kg的给药是无法耐受的。F-LALA-VA-EXA的临床前治疗窗口似乎是有利的，因为食蟹猴HNSTD远高于啮齿类动物癌症模型中的有效治疗剂量(在剂量的异速缩放(allometric scaling)后)。
Claims (15)
1.一种式(I)的抗体-药物缀合物：
Ab-[L-D]p (I)，
其中：
-Ab是与SEQ ID NO：12特异性结合的抗叶酸受体α(FRα)抗体，
-L是与所述抗体键合的可切割的接头部分，优选经由硫醇残基键合，
-D是与L键合的细胞毒性药物部分，
-p是1至8，优选6至8，且更优选地p是8。
2.根据权利要求1所述的抗体-药物缀合物，其中D是拓扑异构酶I的抑制剂，优选地选自喜树碱类似物，并且更优选地D是下式(II)的依喜替康的药物部分
3.根据权利要求1-2中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中L是式-A-W-的可切割的接头部分，其中A是与Ab连接的任选延伸单元，并且W是与D连接的可切割部分。
4.根据权利要求3所述的抗体-药物缀合物，其中W具有下式(III)
其中
每个R2独立地选自吸电子基团和C1-C4烷基；
n是0、1或2；
T是糖可切割单元或多肽可切割单元；
当T是糖可切割单元时，Y是O，或者当T是多肽可切割单元时，Y是NR3；和
R3选自H、C1-C24烷基、C2-C6烯基；任选取代的聚醚、具有6至10个环原子的芳基、C3-C8环烷基、具有3至10个环原子的杂环烷基、具有5至10个环原子的杂芳基及其任何组合，
所述烷基和烯基任选地被选自以下的一个或多个杂原子或者化学基团中断：-O-、-S-、-C(O)-、-NR″-、-C(O)NR″-、-NR″-C(O)-、-NR″-C(O)-NR″′-、-NR″-C(O)-O-、-O-C(O)NR″-和三唑，
R″和R″′独立地选自H和C1-C6烷基，
及其药学上可接受的盐。
5.根据权利要求4所述的抗体-药物缀合物，其中L对应于式(IV)的接头-A-W-
其中
X1是连接器单元；
Z是任选的间隔物；
X2是连接器单元；
K是任选的疏水性掩蔽实体，优选地选自聚肌氨酸和聚乙二醇；
R1选自H、C 1-C24烷基、C2-C6烯基；任选取代的聚醚、具有6至10个环原子的芳基、C3-C8环烷基、具有3至10个环原子的杂环烷基、具有5至10个环原子的杂芳基及其任何组合，
所述烷基和烯基任选地被选自以下的一个或多个杂原子或者化学基团中断：-O-、-S-、-C(O)-、-NR″-、-C(O)NR″-、-NR″-C(O)-、-NR″-C(O)-NR″′-、-NR″-C(O)-O-、-O-C(O)NR″-和三唑；
R4选自H、C1-C6烷基和C2-C6烯基，所述烷基和烯基任选地被选自以下的一个或多个杂原子或者化学基团中断：-O-、-S-、-C(O)-和-NR″-；和
R5选自H、C1-C6烷基和C2-C6烯基，所述烷基和烯基任选地被选自以下的一个或多个杂原子或者化学基团中断：-O-、-S-、-C(O)-和-NR″-。
6.根据权利要求5所述的抗体-药物缀合物，其中K是聚肌氨酸，优选下式(V)：
其中k是在2和50之间的整数，优选在4和30之间，
并且R6对应于OH或NH2。
7.根据权利要求5-6中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中T是糖可切割单元，其为葡糖苷酸或半乳糖苷。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中T是二肽，优选地选自Val-Cit、Val-Ala和Phe-Lys。
9.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中L对应于式(VI)的接头：
并且L与所述抗体的一个或多个硫醇残基共价键合。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的抗体-药物缀合物，其对应于下式(VII)
其中Ab是抗FRα抗体，例如法妥组单抗，或其沉默IgG1变体，通常包含在IgG1 Fc恒定区的亮氨酸234和亮氨酸235中的丙氨酸取代，并且p是4至8。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中Ab是包含以下任一的抗FRα抗体：
(i)包含SEQ ID NO：1的HCDR1、SEQ ID NO：2的HCDR2、SEQ ID NO：3的HCDR3的可变重链多肽，以及包含SEQ ID NO：4的LCDR1、SEQ ID NO：5的LCDR2和SEQ ID NO：6的LCDR3的可变轻链多肽；或，
(ii)包含SEQ ID NO：7的VH的可变重链多肽，以及包含SEQ ID NO：8的VL的可变轻链多肽。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中
(i)Ab是抗叶酸受体α抗体或其抗原结合片段，其包含
·包含SEQ ID NO：1的HCDR1、SEQ ID NO：2的HCDR2、SEQ ID NO：3的HCDR3的可变重链多肽，和
·包含SEQ ID NO：4的LCDR1、SEQ ID NO：5的LCDR2和SEQ ID NO：6的LCDR3的可变轻链多肽；
(ii)L是式-A-W-的可切割接头，其中A是与Ab连接的任选延伸单元，并且W是与D连接的可切割部分
(iii)D是拓扑异构酶I的抑制剂，例如依喜替康；和
(iv)p是1至8，优选4至8，更优选约8。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的抗体-药物缀合物，其用作药剂，优选用于治疗有此需要的受试者中的肿瘤，例如实体瘤，更具体地选自卵巢癌、乳腺癌、肺癌或间皮瘤。
14.根据权利要求1-12中任一项所述的抗体-药物缀合物，其用于治疗有此需要的受试者中的癌症，所述癌症选自卵巢癌、三阴性乳腺癌和非小细胞肺癌。
15.一种药物组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体组合的根据权利要求1-12中任一项所述的抗体-药物缀合物，任选地包含其它活性成分。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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