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CN118549647B - 一种mmp7检测试剂盒、制备方法及其检测方法 - Google Patents

一种mmp7检测试剂盒、制备方法及其检测方法 Download PDF

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CN118549647B CN202410391353.2A CN202410391353A CN118549647B CN 118549647 B CN118549647 B CN 118549647B CN 202410391353 A CN202410391353 A CN 202410391353A CN 118549647 B CN118549647 B CN 118549647B
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Abstract

本发明提供了一种MMP7检测试剂盒及其在制备用于对MMP7相关疾病进行诊断的产品中的用途，所述试剂盒包括磁性微球溶液M、生物素化抗体溶液R1和发光标记物R2，在对MMP7的检测中表现出了性能稳定、灵敏度高、线性范围宽、操作便捷、临床实用性强等优点。

Description

一种MMP7检测试剂盒、制备方法及其检测方法
技术领域
本发明属于体外诊断技术领域，具体涉及MMP7检测试剂盒、制备方法及检测方法。
背景技术
基质金属蛋白酶7（MMP7）是一种锌离子依赖性的内肽酶，其基因位于11q21-q22，cDNA总长达1094bp，分子量为28KD。MMP7以酶原形式分泌，正常生理条件下，MMP7联合其特异的基质金属蛋白酶抑制物（TIMP），共同维持细胞外基质的稳态。MMP7是多条促纤维化通路的靶点及产物，如TGF-β/Smad、Rho/ROCK、Notch、MAPK和P13等信号通路。MMP7的异常表达与肝脏的纤维化有关，MMP7可用于胆道闭锁的非入侵性诊断。而且，MMP7可能参与肿瘤转移和炎症过程，上调的MMP7与许多恶性肿瘤有关。
目前，MMP7的检测主要采用酶联免疫吸附法。在该检测方法中，将特异性的抗人MMP7抗体预包被在高亲和力的酶标板上。酶标板的孔中加入标准品、待测样本和生物素化的检测抗体，经过孵育，样本中存在的MMP7与固相抗体和检测抗体结合。洗涤去除未结合的物质后，加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。洗涤后，加入显色底物TMB，避光显色。颜色反应的深浅与样本中MMP7的浓度成正比。加入终止液终止反应，在450 nm波长（参考波长570-630 nm）测定吸光度值。样本中的人基质金属蛋白酶7浓度与OD值成正比，通过绘制标准曲线计算出样本中人基质金属蛋白酶7的浓度。
酶联免疫吸附法通常依靠手工操作，比较耗费人力和时间。而且操作者的操作规范程度和熟练程度在很大程度上影响检测结果的准确性和重复性，导致不准确的结果。同时酶联免疫吸附法的检测灵敏度和线性范围也较低，主要应用于科研场景，在临床检测上的应用具有一定的局限性，限制了MMP7检测在临床上的应用和推广。
目前市场上仍缺乏快速、便捷、稳定性好、灵敏度高、可在仪器上进行自动化操作的MMP7检测试剂盒和使用其的检测方法。
发明内容
本发明提供了一种MMP7检测试剂盒、其制备方法及检测方法。试剂盒可用于仪器自动检测，并且可以更加快速精准测量体外样本中的MMP7浓度。本发明通过对单克隆MMP7抗体的制备以及各种实际试剂组分的调整，使得试剂盒性能稳定、灵敏度高、特异性强、线性范围宽、操作便捷、检测时间短、临床实用性强。
为解决上述技术问题，本发明提供一种MMP7检测试剂盒、以及其制备方法和使用其检测样本中的MMP7浓度的方法。
试剂盒组成
在一个方面，本发明提供一种MMP7检测试剂盒，包括：
磁性微球溶液M，其包含链霉亲和素偶联的磁珠；
生物素化抗体溶液R1，其包含生物素化多克隆MMP7抗体；
发光标记物R2，其包含吖啶酯标记的单克隆MMP7抗体。
进一步地，本发明采用自行制备的单克隆MMP7抗体作为捕获抗体，经证实，与现有技术相比，具有优异的反应性，提高了试剂盒的检测灵敏度。
在一些优选的实施方案中，所述的单克隆MMP7抗体包括：
（1）HCDR1，其包含如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；
（2）HCDR2，其包含如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；
（3）HCDR3，其包含如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；
（4）LCDR1，其包含如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；
（5）LCDR2，其包含如SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；以及
（6）LCDR3，其包含如SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成。
在一些优选的实施方案中，所述的单克隆MMP7抗体包括：
(a)HCDR1，其包含如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:10中任一项所示的氨基酸序列或由其组成；
(b)HCDR2，其包含如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11中任一项所示的氨基酸序列或由其组成；
(c)HCDR3，其包含如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:12中任一项所示的氨基酸序列或由其组成；
(d)LCDR1，其包含如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:22中任一项所示的氨基酸序列或由其组成；
(e)LCDR2，其包含如SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:23中任一项所示的氨基酸序列或由其组成；以及
(f)LCDR3，其包含如SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:24中任一项所示的氨基酸序列或由其组成。
在一些优选的实施方案中，所述的单克隆MMP7抗体包括：
（a）如SEQ ID NO:1所示的HCDR1，如SEQ ID NO:2所示的HCDR2，如SEQ ID NO:3所示的HCDR3，如SEQ ID NO:13所示的LCDR1，如SEQ ID NO:14所示的LCDR2，如SEQ ID NO:15所示的LCDR3；
（b）如SEQ ID NO:4所示的HCDR1，如SEQ ID NO:5所示的HCDR2，如SEQ ID NO:6所示的HCDR3，如SEQ ID NO:16所示的LCDR1，如SEQ ID NO:17所示的LCDR2，如SEQ ID NO:18所示的LCDR3；
（c）如SEQ ID NO:7所示的HCDR1，如SEQ ID NO:8所示的HCDR2，如SEQ ID NO:9所示的HCDR3，如SEQ ID NO:19所示的LCDR1，如SEQ ID NO:20所示的LCDR2，如SEQ ID NO:21所示的LCDR3；或者
（d）如SEQ ID NO:10所示的HCDR1，如SEQ ID NO:11所示的HCDR2，如SEQ ID NO:12所示的HCDR3，如SEQ ID NO:22所示的LCDR1，如SEQ ID NO:23所示的LCDR2，如SEQ ID NO:24所示的LCDR3。
在一些优选的实施方案中，所述的单克隆MMP7抗体包括：
重链可变区，其包含SEQ ID NOs:25-28中任一项所示的氨基酸序列，或与SEQ IDNOs:25-28中任一项所示的氨基酸序列相比具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NOs:25-28中任一项所示的氨基酸序列相比具有一个或多个（例如2个、3个或以上）保守氨基酸突变（优选置换、插入或缺失）的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；和/或
轻链可变区，其包含SEQ ID NOs:29-32中任一项所示的氨基酸序列，或与SEQ IDNOs:29-32中任一项所示的氨基酸序列相比具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NOs:29-32中任一项所示的氨基酸序列相比具有一个或多个（例如2个、3个或以上）保守氨基酸突变（优选置换、插入或缺失）的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成。
在一些优选的实施方案中，所述的单克隆MMP7抗体包括：
（1）具有如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列的重链可变区，和具有如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区；
（2）具有如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列的重链可变区，和具有如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区；
（3）具有如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列的重链可变区，和具有如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区；或者
（4）具有如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列的重链可变区，和具有如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，与SEQ ID NOs:25-28中任一项所示的氨基酸序列相比，具有至少80%序列同一性的氨基酸序列中的差别氨基酸均位于FR区。在一些实施方案中，与SEQID NOs:29-32所示的氨基酸序列相比，具有至少80%序列同一性的氨基酸序列中的差别氨基酸均位于FR区。
在一些实施方案中，所述的单克隆MMP7抗体还包含重链恒定区、轻链恒定区或其组合。在一些实施方案中，所述重链恒定区为IgG（包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4）重链恒定区或其变体（例如现有技术已知的LALA突变、AAA突变、DLE突变、YTE突变和LS突变），例如鼠IgG、人IgG或猴IgG重链恒定区或其变体。在一些实施方案中，所述轻链恒定区是κ或λ链恒定区或其变体。在一些实施方案中，所述重链恒定区具有如SEQ ID NO: 47所示的氨基酸序列，所述轻链恒定区具有如SEQ ID NO: 48所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述的单克隆MMP7抗体包括：
重链，其包含SEQ ID NOs:33-36中任一项所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NOs:33-36中任一项所示的氨基酸序列相比具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列，或与SEQ IDNOs:33-36中任一项所示的氨基酸序列相比具有一个或多个（例如2个、3个或以上）保守氨基酸突变（优选置换、插入或缺失）的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；以及
轻链，其包含SEQ ID NOs:37-40中任一项所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NOs:37-40中任一项所示的氨基酸序列相比具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列，或与SEQ IDNOs:37-40中任一项所示的氨基酸序列相比具有一个或多个（例如2个、3个或以上）保守氨基酸突变（优选置换、插入或缺失）的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，所述的单克隆MMP7抗体包括：
（1）具有如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列的重链，和具有如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列的轻链；
（2）具有如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列的重链，和具有如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列的轻链；
（3）具有如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列的重链，和具有如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列的轻链；或者
（4）具有如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列的重链，和具有如SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，与SEQ ID NOs:33-40中任一项所示的氨基酸序列相比，具有至少80%序列同一性的氨基酸序列中的差别氨基酸位于FR区、重链恒定区、轻链恒定区或其组合。
在一些实施方案中，所述磁性微球溶液M还包含磁珠保存液，例如pH为6.5~7.8的磁珠保存液。
在一些实施方案中，所述磁性微球溶液M包含：浓度为0.2-2mg/mL的链霉亲和素偶联的磁珠和pH为6.5~7.8的磁珠保存液。
在一些实施方案中，所述磁珠保存液包含：缓冲液、惰性蛋白质、表面活性剂、和防腐剂。在一些优选的实施方案中，所述磁珠保存液包含：pH为7~7.5的1-20mM缓冲液、0.5wt%-3wt%惰性蛋白质、0.1wt%-3wt%表面活性剂、和0.05wt%-0.3wt%防腐剂。
在一些实施方案中，所述缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液、磷酸盐（PBS）缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液中的一种或多种。
在一些优选的实施方案中，所述惰性蛋白质为选自BSA(牛血清白蛋白)、酪蛋白酸钠、鱼皮明胶等中的一种或多种。
在一些优选的实施方案中，所述表面活性剂为选自Tween-20、Tween-80、TritonX-100、SDS、Brij-35等中的一种或多种。
在一些优选的实施方案中，所述防腐剂为选自Proclin-300、Proclin-150、叠氮化钠、ProClean 150、ProClean 300等中的一种或多种。
在一些优选的实施方案中，磁珠保存液包含：10mM PB缓冲液、0.5wt%-3wt% BSA、0.1wt%-3wt% Tween-20、0.05wt%-0.3wt% Proclin-300。
在一些优选的实施方案中，磁珠保存液包含：10mM PB缓冲液、1wt% BSA、0.4wt%Tween-20、0.1wt% Proclin-300。
在一些优选的实施方案中，PB缓冲液的pH为7.4±0.05。
在一些优选的实施方案中，所述链霉亲和素偶联的磁珠的粒径为1μm-4μm，更优选地，磁珠的粒径为1.5μm-3μm。
在一些实施方案中，所述生物素化抗体溶液R1还包含生物素化抗体稀释液，例如pH为6.5~7.8的生物素化抗体稀释液。
在一些实施方案中，所述生物素化抗体溶液R1包含：生物素化多克隆MMP7抗体和pH为6.5~7.8的生物素化抗体稀释液。
在一些实施方案中，所述生物素化抗体稀释液包括：缓冲液、惰性蛋白质、糖、防腐剂。在一些优选的实施方案中，所述生物素化抗体稀释液包括：pH为7.0~7.5的1-20mM缓冲液、0.5wt%-3wt%惰性蛋白质、5wt%-15wt%糖类、0.05wt%-0.3wt%防腐剂。
在一些实施方案中，所述缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液、磷酸盐（PBS）缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述惰性蛋白质为选自BSA(牛血清白蛋白)、酪蛋白酸钠（casein）、鱼皮明胶等中的一种或多种。
在一些优选的实施方案中，所述糖为选自蔗糖、海藻糖、葡萄糖等中的一种或多种。
在一些优选的实施方案中，所述防腐剂为选自Proclin-300、Proclin-150、叠氮化钠、ProClean 150、ProClean 300等中的一种或多种。
在一些优选的实施方案中，所述生物素化抗体稀释液包括：10mM PB缓冲液、0.5wt%-3wt% casein、5wt%-15wt%蔗糖、0.05wt%-0.3wt% Proclin-300。
在一些优选的实施方案中，所述生物素化抗体稀释液包括：10mM PB缓冲液、1wt%casein、10wt%蔗糖、0.1wt% Proclin-300。
在一些优选的实施方案中，所述PB缓冲液的pH为7.4±0.05。
在一些优选的实施方案中，在所述生物素化抗体溶液R1中，生物素化抗体稀释液与生物素化多克隆MMP7抗体的体积比为1000-3000。在一些优选的实施方案中，生物素化抗体稀释液与生物素化多克隆MMP7抗体的体积比为1000-2000。
在一些优选的实施方案中，所述多克隆MMP7抗体来源于小鼠、大鼠、猪、猴、羊驼、骆驼、人。在一些优选的实施方案中，所述多克隆MMP7抗体为IgG同种型，例如IgG1同种型、IgG2同种型、IgG3同种型、IgG4同种型。
在本文中，所述多克隆MMP7抗体可为本领域已知的任何可商购得到的抗体，例如antibodies-online MMP 7、CUSABIO MMP 7、MyBioSource MMP 7等。
在一些实施方案中，所述发光标记物R2包含：标记保存液和吖啶酯标记的单克隆MMP7抗体。
在一些实施方案中，所述标记保存液包括：缓冲液、惰性蛋白质、糖、防腐剂。在一些优选的实施方案中，所述标记保存液包括：pH为6.0~6.5的1-20mM缓冲液、0.5wt%-3wt%惰性蛋白质、1wt%-5wt%糖、0.05wt%-0.3wt%防腐剂。
在一些实施方案中，所述缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液、磷酸盐（PBS）缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液中的一种或多种。
在一些优选的实施方案中，所述惰性蛋白质为选自BSA(牛血清白蛋白)、酪蛋白酸钠、鱼皮明胶等中的一种或多种。
在一些优选的实施方案中，所述糖为选自海藻糖、海藻糖、葡萄糖等中的一种或多种。
在一些优选的实施方案中，所述防腐剂为选自Proclin-300、Proclin-150、叠氮化钠、ProClean 150、ProClean 300等中的一种或多种。
在一些优选的实施方案中，所述标记保存液包括：10mM PB缓冲液、0.5wt%-3wt%BSA、1wt%-5wt%海藻糖、0.05wt%-0.3wt% Proclin-300。
在一些优选的实施方案中，所述标记保存液包括：10mM PB缓冲液、1wt% BSA、2wt%海藻糖、0.1wt% Proclin-300。
在一些优选的实施方案中，PB缓冲液的pH为6.3±0.05。
在一些优选的实施方案中，所述标记保存液与吖啶酯标记的单克隆MMP7抗体的体积比为50-800。
在一些优选的实施方案中，所述的单克隆MMP7抗体是由杂交瘤细胞系产生的。在一些优选的实施方案中，所述单克隆MMP7抗体为IgG同种型，例如IgG1同种型、IgG2同种型、IgG3同种型、IgG4同种型。
在一些实施方案中，所述MMP7检测试剂盒还包括MMP7质控品和任选的MMP7校准品。
在本文中，校准品用于校准检测系统，通常在启动检测系统时使用，如果检测系统保持不变，则不必要每次使用。质控品主要用于测量精密度的检测，确保检测的均匀性和稳定性。
在一些实施方案中，所述MMP7校准品包括MMP7蛋白和抗原稀释液。在一些实施方案中，所述MMP7蛋白为人MMP7蛋白，例如UniProt ID:P09237，或从人离体样本中分离得到。
在一些优选的实施方案中，在所述MMP7校准品中，MMP7蛋白的浓度为4.25-230ng/mL中的一个或多个，优选4.5-220ng/mL中的一个或多个，例如两个。
在一些优选的实施方案中，在所述MMP7校准品中，MMP7蛋白的浓度为4.25-5.75ng/mL、和/或170-230ng/mL。在一些优选的实施方案中，MMP7蛋白的浓度为4.5-5.5ng/mL、和/或180-220ng/mL，例如5±0.75ng/mL、和200±30.00ng/mL。
在一些优选的实施方案中，抗原稀释液包含：缓冲液、惰性蛋白质、防腐剂。
在一些优选的实施方案中，抗原稀释液包含：1-20mM缓冲液、0.5wt%-3wt%牛血清白蛋白、0.05wt%-0.3wt%防腐剂。
在一些实施方案中，所述缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液、磷酸盐（PBS）缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液中的一种或多种。
在一些优选的实施方案中，所述惰性蛋白质为选自BSA(牛血清白蛋白)、酪蛋白酸钠、鱼皮明胶等中的一种或多种。
在一些优选的实施方案中，所述防腐剂为选自Proclin-300、Proclin-150、叠氮化钠、ProClean 150、ProClean 300等中的一种或多种。
在一些优选的实施方案中，抗原稀释液包含：10mM PB缓冲液、0.5%-3wt% BSA、0.05wt%-0.3wt% Proclin-300。
在一些优选的实施方案中，抗原稀释液包含：10mM PB缓冲液、1wt% BSA、0.1%Proclin-300。
在一些优选的实施方案中，PB缓冲液的pH为7.4±0.05。
在一些实施方案中，所述MMP7质控品包括MMP7蛋白和抗原稀释液。在一些实施方案中，所述MMP7蛋白为人MMP7蛋白，例如UniProt ID:P09237，或从人离体样本中分离得到。
在一些优选的实施方案中，在所述MMP7质控品中，MMP7蛋白的浓度为8.5-287.5ng/mL中的一个或多个，优选为9-275ng/mL中的一个或多个，例如两个。
在一些优选的实施方案中，在所述MMP7质控品中，MMP7蛋白的浓度为8.5-11.5ng/mL、和/或212.5-287.5ng/mL。在一些优选的实施方案中，MMP7蛋白的浓度为9-11ng/mL、和/或225-275ng/mL，例如10±1.50ng/mL、和250±37.50ng/mL。
在一些优选的实施方案中，抗原稀释液包含缓冲液、惰性蛋白质、防腐剂。
在一些优选的实施方案中，抗原稀释液包含：pH为7~7.5的1-20mM缓冲液、0.5wt%-3wt%惰性蛋白质、0.05%-0.3wt%防腐剂。
在一些实施方案中，所述缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液、磷酸盐（PBS）缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液中的一种或多种。
在一些优选的实施方案中，所述惰性蛋白质为选自BSA(牛血清白蛋白)、酪蛋白酸钠、鱼皮明胶等中的一种或多种。
在一些优选的实施方案中，所述防腐剂为选自Proclin-300、Proclin-150、叠氮化钠、ProClean 150、ProClean 300中的一种或多种。
在一些优选的实施方案中，抗原稀释液包含：10mM PB缓冲液、0.5wt%-3wt% BSA、0.05wt%-0.3wt% Proclin-300。
在一些优选的实施方案中，抗原稀释液包含：10mM PB缓冲液、1wt% BSA、0.1wt%Proclin-300。
在一些优选的实施方案中，PB缓冲液的pH为7.4±0.05。
在一些实施方案中，所述MMP7检测试剂盒还包括预激发液和/或激发液。
在本文中，所述预激发液、激发液可以使用本领域已知的、包括市售的能够使吖啶酯产生光子的任意预激发液和激发液。
作为示例，以体积百分比计，上述预激发液可以包括0.05%-2%的浓度为60wt%-90wt%的浓HNO3、3%-6%的以g/mL计为30%的H2O2、0.1wt%-2% Triton-X100、0.1%-0.4%无水乙醇。
作为示例，以体积百分比计，上述激发液可以包括1%-2% NaOH、1%-4% Triton-X100、0.1%-0.4%无水乙醇、0.1%-0.3% EDTA-Na。
MMP7检测试剂盒的制备
本发明还提供了MMP7检测试剂盒的制备方法，包括：分别制备磁性微球溶液M、生物素化抗体溶液R1和发光标记物R2，然后将它们分别包装并放置在同一或不同的检测试剂盒内。
在一些实施方案中，上述的制备方法还包括制备MMP7质控品和任选的MMP7校准品。
在一些实施方案中，将磁性微球溶液M的制备、生物素化抗体溶液R1的制备、发光标记物R2的制备以及MMP7校准品和MMP7质控品的制备分别在下文中示出，可以组合或者单独使用。
1）磁性微球溶液M的制备
将链霉亲和素偶联的磁珠原液置于磁分离器上静置，弃去上清液，用磁珠保存液清洗磁珠1-3次，向清洗后的磁珠中加入磁珠保存液将磁珠稀释至预定浓度（例如0.3mg/mL）待用。
在一些实施方案中，所述磁珠保存液包含：缓冲液、惰性蛋白质、表面活性剂、和防腐剂。在一些优选的实施方案中，所述磁珠保存液包含：pH为7~7.5的1-20mM缓冲液、0.5wt%-3wt%惰性蛋白质、0.1wt%-3wt%表面活性剂、和0.05wt%-0.3wt%防腐剂。
在一些实施方案中，所述缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液、磷酸盐（PBS）缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液中的一种或多种。
在一些优选的实施方案中，所述惰性蛋白质为选自BSA(牛血清白蛋白)、酪蛋白酸钠、鱼皮明胶等中的一种或多种。
在一些优选的实施方案中，所述表面活性剂为选自Tween-20、Tween-80、TritonX-100、SDS、Brij-35等中的一种或多种。
在一些优选的实施方案中，所述防腐剂为选自Proclin-300、Proclin-150、叠氮化钠、ProClean 150、ProClean 300等中的一种或多种。
在一些优选的实施方案中，磁珠保存液包含：10mM PB缓冲液、0.5wt%-3wt% BSA、0.1wt%-3wt% Tween-20、0.05wt%-0.3wt% Proclin-300。
在一些优选的实施方案中，磁珠保存液包含：10mM PB缓冲液、1wt% BSA、0.4wt%Tween-20、0.1wt% Proclin-300。
在一些优选的实施方案中，PB缓冲液的pH为7.4±0.05。
在一些优选的实施方案中，所述链霉亲和素偶联的磁珠的粒径为1μm-4μm，更优选地，磁珠的粒径为1.5μm-3μm。
2）生物素化抗体溶液R1的制备
将购买的生物素化抗体（母液）按照制造商说明书充分混匀，加入生物素化抗体稀释液将抗体（母液）稀释至预定浓度（例如0.2μg/mL）待用。
在一些实施方案中，所述生物素化抗体稀释液包括：缓冲液、惰性蛋白质、糖、防腐剂。在一些优选的实施方案中，所述生物素化抗体稀释液包括：pH为7.0~7.5的1-20mM缓冲液、0.5wt%-3wt%惰性蛋白质、5wt%-15wt%糖类、0.05wt%-0.3wt%防腐剂。
在一些实施方案中，所述缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液、磷酸盐（PBS）缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述惰性蛋白质为选自BSA(牛血清白蛋白)、酪蛋白酸钠（casein）、鱼皮明胶等中的一种或多种。
在一些优选的实施方案中，所述糖为选自蔗糖、海藻糖、葡萄糖等中的一种或多种。
在一些优选的实施方案中，所述防腐剂为选自Proclin-300、Proclin-150、叠氮化钠、ProClean 150、ProClean 300等中的一种或多种。
在一些优选的实施方案中，所述生物素化抗体稀释液包括：10mM PB缓冲液、0.5wt%-3wt% casein、5wt%-15wt%蔗糖、0.05wt%-0.3wt% Proclin-300。
在一些优选的实施方案中，所述生物素化抗体稀释液包括：10mM PB缓冲液、1wt%casein、10wt%蔗糖、0.1wt% Proclin-300。
在一些优选的实施方案中，所述PB缓冲液的pH为7.4±0.05。
在一些优选的实施方案中，将生物素化多克隆MMP7抗体用生物素化抗体稀释液按照1000-3000的体积比进行稀释。在一些优选的实施方案中，将生物素化多克隆MMP7抗体用生物素化抗体稀释液按照1000-2000的体积比进行稀释。
3）发光标记物R2的制备
通过将单克隆MMP7抗体与NHS酯化的吖啶酯在缓冲液中孵育，得到吖啶酯标记的单克隆MMP7抗体，并随后将所述吖啶酯标记的单克隆MMP7抗体用标记保存液稀释，得到发光标记物R2。具体而言，例如，可通过如下制备发光标记物R2：
将单克隆MMP7抗体与缓冲液1（例如，1×PBS缓冲液，pH为8.5）充分混匀，转移至7kD透析管中，缓冲液1中旋转透析，换液6次，每次1-2h；
在离心管中，将NHS酯化的吖啶酯（NSP-SA-NHS）与上述得到的待包被的单克隆MMP7抗体反应液按照分子摩尔比20:1的比例室温混匀并进行标记反应0.5-1h；
用缓冲液1配制浓度为0.01wt%至0.1wt%的赖氨酸缓冲液，向上述离心管中加入20μL 0.01wt%至0.1wt%的赖氨酸缓冲液，继续震荡混匀0.5h；在包含吖啶酯的溶液中加入0.01wt%至0.1wt%的赖氨酸缓冲液有效地封闭了未占据的结合位点，提高了检测的灵敏度。
反应结束后将混合液转移至7kD透析管中，缓冲液2（例如，1×PBS缓冲液，pH为6.3）中旋转透析，换液6次，每次1-2h，得到标记液；
透析过夜后取出标记液，添加标记保存液至1mL，充分混匀后可置于2-8℃保存。
在一些实施方案中，所述单克隆MMP7抗体通过如下方法制备得到，所述方法包括，在使得所述的抗体表达的条件下，培养宿主细胞。例如，可通过使用本领域已知的任意适当的常规培养基、适当的温度和培养时间等，可由本领域技术人员根据宿主细胞的具体类型常规确定。所述宿主细胞包括核酸分子或包含该核酸分子的重组表达载体，所述核酸分子包含编码所述的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。优选地，所述宿主细胞为真核细胞，更优选为哺乳动物细胞，例如CHO细胞、CHO-S细胞、293细胞、猴肾细胞。
在一些实施方案中，所述标记保存液包括：缓冲液、惰性蛋白质、糖、防腐剂。在一些优选的实施方案中，所述标记保存液包括：pH为6.0~6.5的1-20mM缓冲液、0.5wt%-3wt%惰性蛋白质、1wt%-5wt%糖、0.05wt%-0.3wt%防腐剂。
在一些实施方案中，所述缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液、磷酸盐（PBS）缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液中的一种或多种。
在一些优选的实施方案中，所述惰性蛋白质为选自BSA(牛血清白蛋白)、酪蛋白酸钠、鱼皮明胶等中的一种或多种。
在一些优选的实施方案中，所述糖为选自海藻糖、海藻糖、葡萄糖等中的一种或多种。
在一些优选的实施方案中，所述防腐剂为选自Proclin-300、Proclin-150、叠氮化钠、ProClean 150、ProClean 300等中的一种或多种。
在一些优选的实施方案中，所述标记保存液包括：10mM PB缓冲液、0.5wt%-3wt%BSA、1wt%-5wt%海藻糖、0.05wt%-0.3wt% Proclin-300。
在一些优选的实施方案中，所述标记保存液包括：10mM PB缓冲液、1wt% BSA、2wt%海藻糖、0.1wt% Proclin-300。
在一些优选的实施方案中，PB缓冲液的pH为6.3±0.05。
在一些优选的实施方案中，将吖啶酯标记的单克隆MMP7抗体用所述标记保存液以50-800的体积比进行稀释，得到发光标记物R2。
4）MMP7校准品的制备
通过向抗原稀释液中添加MMP7蛋白制备得到MMP7校准品。
在一些实施方案中，所述MMP7蛋白为人MMP7蛋白，例如UniProt ID:P09237，或从人离体样本中分离得到。
在一些优选的实施方案中，在所述MMP7校准品中，MMP7蛋白的浓度为4.25-230ng/mL，优选4.5-220ng/mL。
在一些优选的实施方案中，在所述MMP7校准品中，MMP7蛋白的浓度为4.25-5.75ng/mL、或170-230ng/mL。在一些优选的实施方案中，MMP7蛋白的浓度为4.5-5.5ng/mL、或180-220ng/mL。
在一些优选的实施方案中，抗原稀释液包含：缓冲液、惰性蛋白质、防腐剂。
在一些优选的实施方案中，抗原稀释液包含：1-20mM缓冲液、0.5wt%-3wt%牛血清白蛋白、0.05wt%-0.3wt%防腐剂。
在一些实施方案中，所述缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液、磷酸盐（PBS）缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液中的一种或多种。
在一些优选的实施方案中，所述惰性蛋白质为选自BSA(牛血清白蛋白)、酪蛋白酸钠、鱼皮明胶等中的一种或多种。
在一些优选的实施方案中，所述防腐剂为选自Proclin-300、Proclin-150、叠氮化钠、ProClean 150、ProClean 300等中的一种或多种。
在一些优选的实施方案中，抗原稀释液包含：10mM PB缓冲液、0.5wt%-3wt% BSA、0.05wt%-0.3wt% Proclin-300。
在一些优选的实施方案中，抗原稀释液包含：10mM PB缓冲液、1wt% BSA、0.1wt%Proclin-300。
在一些优选的实施方案中，PB缓冲液的pH为7.4±0.05。
5）MMP7质控品的制备
通过向抗原稀释液中添加MMP7蛋白制备MMP7质控品。
在一些实施方案中，所述MMP7蛋白为人MMP7蛋白，例如UniProt ID:P09237，或从人离体样本中分离得到。
在一些优选的实施方案中，在所述MMP7质控品中，MMP7蛋白的浓度为8.5-287.5ng/mL，优选为9-275ng/mL。
在一些优选的实施方案中，在所述MMP7质控品中，MMP7蛋白的浓度为8.5-11.5ng/mL、或212.5-287.5ng/mL。在一些优选的实施方案中，MMP7蛋白的浓度为9-11ng/mL、或225-275ng/mL。
在一些优选的实施方案中，抗原稀释液包含缓冲液、惰性蛋白质、防腐剂。
在一些优选的实施方案中，抗原稀释液包含：pH为7~7.5的1-20mM缓冲液、0.5wt%-3wt%惰性蛋白质、0.05wt%-0.3wt%防腐剂。
在一些实施方案中，所述缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液、磷酸盐（PBS）缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液中的一种或多种。
在一些优选的实施方案中，所述惰性蛋白质为选自BSA(牛血清白蛋白)、酪蛋白酸钠、鱼皮明胶等中的一种或多种。
在一些优选的实施方案中，所述防腐剂为选自Proclin-300、Proclin-150、叠氮化钠、ProClean 150、ProClean 300中的一种或多种。
在一些优选的实施方案中，抗原稀释液包含：10mM PB缓冲液、0.5wt%-3wt% BSA、0.05wt%-0.3wt% Proclin-300。
在一些优选的实施方案中，抗原稀释液包含：10mM PB缓冲液、1wt% BSA、0.1wt%Proclin-300。
在一些优选的实施方案中，PB缓冲液的pH为7.4±0.05。
检测方法
采用本发明试剂盒检测MMP7的方法，将磁性微球溶液M、生物素化抗体溶液R1、发光标记物R2放入全自动化学发光免疫分析仪后，全自动化学发光免疫分析仪对样本中的MMP7蛋白浓度进行自动检测。
在本发明试剂盒检测MMP7的方法中，将磁性微球溶液M、发光标记物R2、生物素化抗体溶液R1依次放入全自动化学发光免疫分析仪，全自动化学发光免疫分析仪对样本中的MMP7蛋白浓度进行自动检测，磁性微球溶液M、发光标记物R2、生物素化抗体溶液R1的加入顺序为在加入样本后，先加入生物素化抗体溶液R1、发光标记物R2，再加入磁性微球溶液M。
优选地，磁性微球溶液M在生物素化抗体溶液R1和发光标记物R2加入15-30分钟后加入。
优选地，在磁性微球溶液M加入5-10分钟后加入预激发液及激发液。
以体积百分比计，上述预激发液包括0.05%-2%的浓度为60wt%-90wt%的浓HNO3、3%-6%的以g/mL计为30%的H2O2、0.1%-2% Triton-X100、0.1%-0.4%无水乙醇。
以体积百分比计，上述激发液包括1%-2% NaOH、1%-4% Triton-X100、0.1%-0.4%无水乙醇、0.1%-0.3% EDTA-Na。
本试剂盒采用双抗体夹心法，以包含生物素化多克隆MMP7抗体的溶液作为试剂R1，以包含吖啶酯标记的单克隆MMP7抗体的溶液作为试剂R2，以表面偶联有链霉亲和素官能团的磁微粒作为固相载体。
检测反应包括以下步骤：第一步将样本与试剂R1及试剂R2进行孵育，MMP7抗体能够特异性识别样本中的MMP7抗原，形成抗体-抗原-抗体的三明治样免疫复合物。第二步加入磁性微球溶液M，借助生物素和链霉亲和素之间的强大亲和力将免疫复合物固定在固相载体表面，通过清洗去除其余未反应物质。最后加入预激发液和激发液，使吖啶酯产生光子，其光子数与样本中的MMP7蛋白含量呈线性相关。将光子数代入校准曲线（预先通过全自动化学发光免疫分析仪测定校准品的发光值构建）内即可计算出样本内MMP7的浓度。
本发明的磁性微球溶液M采用上文提到的磁珠保存液稀释磁珠配制，具有良好的分散性及稳定性，本底低且信噪比好，与检测项目有着良好的适配性。
吖啶酯分子作为发光物在加入激发液后生成极不稳定的N-甲基吖啶酮，释放光子回到基态，其释放的光子作为反应信号被收集。
应用
在一个方面，本发明提供了如上所述的MMP7检测试剂盒在对MMP7相关疾病进行诊断中的用途。
在一个方面，本发明提供了如上所述的MMP7检测试剂盒在制备用于对MMP7相关疾病进行诊断的产品中的用途。
在本文中，MMP7相关疾病是指与健康人类相比，使患者在发病和疾病发展过程中表现出异常的MMP7表达量的疾病或病症。在一些实施方案中，所述MMP7相关疾病可为炎性疾病（例如慢性炎症）、自身免疫性疾病、癌症、纤维化疾病、心血管疾病、神经病症、眼部疾病、肺部疾病、肝胆疾病、肾病，但不限于此。
在一些实施方案中，所述MMP7相关疾病可选自胆道闭锁及胆道闭锁引起的肝纤维化、梗阻性黄疸、胆管炎、胆汁淤积、肝纤维化、肾纤维化、慢性肾病、肝内胆管细胞癌、坏死性小肠结肠炎（NEC）或败血症、卵巢癌、疼痛、膀胱炎、关节炎、干眼症、肝炎、肝纤维化、非酒精性脂肪肝、巨结肠、红斑狼疮、急性呼吸窘迫综合征（ARDS）、肺动脉高压、特发性肺纤维化（IPF）。
采用本发明的检测试剂盒检测MMP7蛋白时，特别是使用本发明制备的单克隆MMP7抗体作为捕获抗体，特异性好、检测灵敏度高。
采用本发明的试剂盒测定样本时，不需要对样本进行手动稀释，患儿的真空采血管可直接上机进行检测，进一步避免了人工稀释样本造成的误差。
本发明试剂盒性能稳定、灵敏度高、线性范围宽、操作便捷、临床实用性强、能够帮助检验科人员迅速的测定体外血清样本中MMP7蛋白的浓度，有力的推广了该标志物在临床上的检测应用。检测过程只需要28分钟即可得到检测报告，全程无需人员操作，且数据无需人工处理。
附图说明
图1为本发明试剂盒在全自动化学发光免疫分析仪上的校准曲线。
图2为本发明试剂盒的性能评估曲线（线性范围）。
图3为本发明试剂盒的临床符合率曲线。
图4为本发明试剂盒与市售酶联免疫检测试剂盒测定人血清中MMP7含量结果的相关性。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另外定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。参见如Singleton等，Dictionary of Microbiologyand Molecular Biology 2nd ed.，J. Wiley & Sons （New York，NY 1994）；Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Press（Cold SpringsHarbor，NY 1989）；Current Protocols in Molecular Biology or Current Protocolsin Immunology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.(2009)；Perbal, A PracticalGuide to Molecular Cloning (1984)。
在本文中，除非上下文另有明确指示，术语“或”意在包括“和”，反之亦然。在本文中，除非另有说明，否则单数术语涵盖复数指代物，反之亦然。
在本文中，除非另有说明，术语“包含、包括和含有（comprise、comprises和comprising）”或其等同物（例如contain、containing、include、including）为开放式表述，应理解为“包括但不限于”，意味着除所列出的要素、组分和步骤外，还可涵盖其它未指明的要素、组分和步骤。
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5%的下限和比指定数字数值大5%的上限的范围内的数字数值。
本文中的术语“序列同一性”是指将待比对的两条以上的序列进行比对并且如有必要的话为达到最大序列同一性百分数而引入空位后，在不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分时，待比对序列之间的相同氨基酸残基的百分比。氨基酸序列同一性的比对可以采用本领域已知的多种方式进行，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign（DNASTAR）软件。
在本文中，除非另有说明，术语“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可以发生或不发生。例如，“MMP7检测试剂盒包括任选的MMP7校准品”意味着MMP7检测试剂盒包括或不包括MMP7校准品。
除非另有说明，本发明中的CDR序列是指根据Kabat编号方案定义的，但是采用kabat、AbM、Chothia、Contact和IMGT等已知编号方案定义的CDR的区域也落在了本发明的保护范围内。
实施例
接下来，通过实施例对本发明进行进一步详细地说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。除非另有说明，如下实施例中采用的各试剂、材料和设备为可根据本领域已知的常规手段制备或者可商购得到的那些。
在未给出特别说明的情况下，下述实施例中提及的样本均为在患者的监护人签署知情同意书后，收集自在医院肝胆外科接受肝胆手术的胆道闭锁的患儿的血清样本。
实施例1 试剂盒的制备与检测
1. 磁性微球溶液M的制备步骤
（1）配制磁珠保存液，包括pH为7.4的10mM PBS缓冲液、1% BSA、0.4% Tween-20、0.1% Proclin-300；
（2）取0.5mL链霉亲和素磁珠原液（粒径为1.5μm，购自JSR）于离心管内，置于磁分离器上静置3分钟，随后弃去上清液，加入2mL磁珠保存液将磁珠重悬，并反复颠倒混匀20次，再次静置混匀后弃去上清，重复清洗步骤一次；
（3）加入磁珠保存液稀释到0.3mg/mL的工作浓度，即得到磁性微球溶液。
2. 生物素化抗体溶液R1的制备步骤
（1）配制生物素化抗体稀释液，包括pH为7.4的10mM PB缓冲液、1% casein、10%蔗糖、0.1% Proclin-300；
（2）用生物素化抗体稀释液将生物素化多克隆MMP7抗体（小鼠IgG1型抗体CUSABIOMMP 7，购自CUSABIO）复溶、稀释至多克隆MMP7抗体的浓度为0.2μg/mL，即得到生物素化抗体溶液。
3. 发光标记物R2的制备步骤：
3.1 单克隆MMP7抗体的合成
用hMMP7免疫6-8周龄的雌性Balb/c小鼠，在初次免疫2-3周后进行再次免疫，然后约3周后进行加强免疫。之后取小鼠尾静脉血液样本通过ELISA进行效价测定，从其中选择效价高的小鼠摘除脾脏制备脾淋巴细胞，将脾淋巴细胞和骨髓瘤细胞（Sp2/0细胞）进行融合。用HAT选择培养液培养，筛选出杂交瘤细胞，同时用ELISA测定培养上清液，通过确定和MMP7蛋白是否有效结合的方式筛选杂交瘤，阳性的杂交瘤通过有限稀释进一步亚克隆，得到稳定的单克隆杂交瘤细胞，最终筛选得到4株单克隆杂交瘤细胞株。
根据文献中提到的方法（Bradbury, A. (2010). Cloning Hybridoma cDNA byRACE. Antibody Engineering. R. Kontermann and S. Dübel. Springer-VerlagBerlin Heidelberg：15-20），合成特异性引物（通过生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列如下表1所示），使用RNA提取试剂盒和反转录试剂盒（均购自北京全式金生物技术有限公司），克隆杂交瘤细胞抗体目的基因。将扩增到的重链和轻链的目的片段分别克隆到平端克隆载体（购自北京全式金生物技术有限公司）中，然后分别涂布LB琼脂平板（氨苄抗性）平板；待克隆长出后，每个平板分别挑取克隆进行Sanger测序。
表1 引物序列
正向引物 反向引物
重链可变区 GACAGTGGATARACMGATGG（SEQ ID NO:49） GAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG(M和R表示简并碱基)（SEQ ID NO:50）
轻链可变区 GGATACAGTTGGTGCAGCATC（SEQ ID NO:51） GAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG（SEQ ID NO:52）GATATTGTGATGACGCAGGCT（SEQ ID NO:53）GATATTGTGATAACCCAG（SEQID NO:54）GACATTGTGCTGACCCAATCT（SEQ ID NO:55）GACATTGTGATGACCCAGTCT（SEQ ID NO:56）GATATTGTGCTAACTCAGTCT（SEQ ID NO:57）GATATCCAGATGACACAGACT（SEQ ID NO:58）GACATCCAGCTGACTCAGTCT（SEQ ID NO:59）CAAATTGTTCTCACCCAGTCT（SEQ ID NO:60）
获得抗体的重链可变区序列与轻链可变区序列的基因，利用密码子优化软件进行密码子优化并委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成后，利用EcoRI/HinDIII限制性内切酶将基因克隆至pcDNA3.1表达载体中，构建单克隆抗体表达质粒，利用所述质粒转染293F细胞，于37℃、5% CO2下培养后，离心收集细胞上清，经protein A亲和柱纯化，获得单克隆MMP7抗体M1-M4。
在下表2中示出本发明中涉及的各抗体的序列信息。
表2 抗体序列信息
重链可变区
M1 QVQLQQSGAELMKPGASVKLSCKASGYTFTDYYMNWVKQRPGQGLEWIGRINPKGGSTGSVPKFRSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGRIGTPLDYWGQGTLVTVSSVL（SEQ ID NO:25）
M2 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMYWVRQAPGQGLEWIGEIMPSWGDTIFNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRMPFLGAMDYWGQGTTVTVSS（SEQ ID NO:26）
M3 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTYYDMYWVRQAPGQGLEWIGWINPSMGDTVFNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREPRYGAMDYWGQGTTVTVSS（SEQ ID NO:27）
M4 QVQLQQSGAELMKPGASVKLSCKASGYTFTSYYMYWVKQRPGQGLEWIGEINPSNADTEFNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRWPLYGAMDYWGQGTSVTVSS（SEQ ID NO:28）
轻链可变区
M1 DVQITQSPSYLAASPGETITINCRASRDISKRLAWYQEKPGKTNKLLIYKTSNLQSGIPSRFSGSGSGSDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQLKNYPRTFGQGTNLEIK（SEQ ID NO:29）
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M4 DVQITQSPSYLAASPGETITINCRASKSISKYLAWYQEKPGKTNKLLIYSGHWLQSGIPSRFSGSGSGSDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHFEYPWTFGAGTKLELK（SEQ ID NO:32）
重链
M1 QVQLQQSGAELMKPGASVKLSCKASGYTFTDYYMNWVKQRPGQGLEWIGRINPKGGSTGSVPKFRSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGRIGTPLDYWGQGTLVTVSSVLAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK（SEQID NO:33）
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M3 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTYYDMYWVRQAPGQGLEWIGWINPSMGDTVFNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREPRYGAMDYWGQGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK（SEQ IDNO:35）
M4 QVQLQQSGAELMKPGASVKLSCKASGYTFTSYYMYWVKQRPGQGLEWIGEINPSNADTEFNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRWPLYGAMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK（SEQ IDNO:36）
轻链
M1 DVQITQSPSYLAASPGETITINCRASRDISKRLAWYQEKPGKTNKLLIYKTSNLQSGIPSRFSGSGSGSDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQLKNYPRTFGQGTNLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC（SEQ ID NO:37）
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M4 DVQITQSPSYLAASPGETITINCRASKSISKYLAWYQEKPGKTNKLLIYSGHWLQSGIPSRFSGSGSGSDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHFEYPWTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC（SEQ ID NO:40）
3.2 发光标记物R2的制备
（1）配制吖啶酯标记用缓冲液1（浓度为0.01M的磷酸缓冲液，pH为8.5）；
（2）配制吖啶酯标记用缓冲液2（浓度为0.01M的磷酸缓冲液，pH为6.3）；
（3）配制标记保存液，包括pH为6.3的10mM PB缓冲液、1% BSA、2%海藻糖、0.1%Proclin-300；
（4）用吖啶酯标记用缓冲液1将抗MMP7的单克隆抗体M1稀释至单克隆MMP7抗体溶液浓度为0.1mg/mL，转移至7kD透析管中，缓冲液1中旋转透析，换液6次，每次1-2h；
（5）随后将得到的单克隆MMP7抗体反应液转移至离心管内，将NHS酯化的吖啶酯（NSP-SA-NHS）与抗体反应液按照分子摩尔比20:1的比例室温混匀并进行标记反应0.5-1h；
（6）用吖啶酯标记用缓冲液1配制浓度为0.05%的赖氨酸缓冲液，向步骤（5）的离心管中加入20μl 0.05%的赖氨酸缓冲液，继续震荡混匀0.5h；
（7）反应结束后将得到的混合液转移至7kD透析管中，吖啶酯标记用缓冲液2中旋转透析，换液6次，每次1-2h；
（8）将得到的吖啶酯标记的单克隆MMP7抗体用标记保存液缓冲液进行稀释，稀释比例100倍，即得到发光标记物溶液R2。
4. MMP7校准品的制备步骤：
校准品由抗原稀释液中添加MMP7蛋白（根据UniProt ID:P09237重组制备得到）制备而成。配制抗原稀释液（包括pH为7.4的10mM PB缓冲液、1% BSA、0.1% Proclin-300），使用该抗原稀释液溶解MMP7蛋白并配制成不同浓度的溶液，基质效应小。
用抗原稀释液将MMP7蛋白进行稀释，稀释后的浓度为5ng/mL、200ng/mL。使用企业工作校准品（用抗原稀释液将MMP7蛋白稀释至浓度为0.1ng/mL、0.6ng/mL、3ng/mL、15ng/mL、75ng/mL、300ng/mL而得到）对配好的校准品进行赋值，得到MMP7校准品，以该校准品校准用户测量程序，给临床样本赋值。
5. MMP7质控品的制备步骤：
质控品由抗原稀释液中添加MMP7蛋白（根据UniProt ID:P09237重组制备得到）制备而成。配制抗原稀释液（包括pH为7.4的10mM PB缓冲液、1% BSA、0.1% Proclin-300），使用该抗原稀释液溶解MMP7蛋白并配制成不同浓度的溶液，基质效应小。
用抗原稀释液将MMP7蛋白进行稀释，稀释后的浓度为10ng/mL、250ng/mL。
6. 试剂盒的检测过程
将上述制备的试剂盒装入重庆科斯迈生物技术有限公司生产的SMART 500S全自动化学发光免疫分析仪。通过扫描读取试剂盒的主曲线信息，通过校准品1（5ng/mL）、校准品2（200ng/mL）校正该项目的校准主曲线（如图1所示）。
检测步骤为：
1）将校准品和质控品放入试剂架内，进行校准和质控（如果不是当天首次启动检测系统，在检测系统保持不变时可以不必每次进行校准），校准通过且质控合格后，将待测血清样本放入试剂架内，其中，前述各样品（包括质控品、校准品和待测样本）的加样量设置为10μL，加样顺序依次为样品→生物素化抗体溶液R1→发光标记物R2（R1和R2的顺序可以颠倒），孵育15分钟后，再加入磁性微球溶液M，孵育5分钟后，通过清洗去除其余未反应物质，加入激发液及预激发液；
2）编辑检测指令后点击确定即可进行检测；
3）选择数据导出或是直接打印检测报告，即可对结果进行分析。
实施例2 试剂盒的方法学指标
按照实施例1中的试剂盒的检测过程，对实施例1的试剂盒测定各方法学指标。
1. 线性实验
将接近线性范围上限的高值样本按照一定比例稀释为至少5种浓度，其中低值浓度的样本需接近线性范围的下限，每一浓度的样本重复检测3次，计算其平均值，将结果平均值和稀释比例用最小二乘法进行直线拟合，并计算线性相关系数（r）。下表3、图2为实施例1的试剂盒的线性范围。由结果可知，在0.1~300ng/mL范围内，线性相关系数r为1.0000。
表3 试剂盒的线性范围
2. 重复性实验
检测三个浓度水平的血清样本，各重复10次，计算变异系数（CV），分别计算每个样本测量结果的平均值M、标准差SD、变异系数（CV），下表4为实施例1的试剂盒的重复性测定结果，其结果表明该试剂盒变异系数CV均≤5%。
表4 试剂盒的重复性测定结果
检测序号 样本1（ng/mL） 样本2（ng/mL） 样本3（ng/mL）
1 1.94 59.52 248.85
2 1.93 62.44 246.39
3 1.98 58.15 251.78
4 2.08 57.00 248.33
5 2.11 62.44 244.54
6 1.97 60.34 253.09
7 2.04 61.89 252.13
8 2.06 59.19 244.17
9 1.88 54.88 252.57
10 1.95 59.08 246.91
M 2.00 59.49 248.88
SD 0.08 2.43 3.36
CV 3.8% 4.1% 1.35%
3. 干扰性实验
针对浓度为0ng/mL的血清样本（即，经灭活处理的样本），检测33g/L脂肪乳、200mg/L胆红素、2g/L血红蛋白、100U/mL类风湿因子、68ng/mL抗鼠异嗜性抗体（HAMA）对测定结果的干扰情况，各重复检测3次，这些试剂的反应值均低于0.1ng/mL。下表5为实施例1的试剂盒的抗干扰评估，由结果可知本发明的试剂盒在上述干扰物的存在下对测定结果无影响。
表5 抗干扰评估结果
4. 稳定性实验
将实施例1的试剂盒置于37℃条件下加速老化7天，取出后与在4℃条件下保存的试剂同时上机检测校准品，计算信号保留率。下表6为实施例1的试剂盒的稳定性评估结果，由结果可知本发明的试剂盒稳定性优越，37℃加速7天后信号值未出现明显下降，平均信号保留率达95.34%。
表6 稳定性评估结果
5.特异性和敏感性检测：
由图3可知，使用实施例1的试剂盒对临床样本进行检测并与临床诊断结果进行比较时，共检测200份临床样本（均有明确临床诊断结果），当取CUTOFF值15-25 ng/mL时，灵敏度达95.7%，特异性达97.4%，AUC为0.9830。
实施例3 试剂盒在临床测定方面的性能
采用实施例1的试剂盒与购自美国R&D公司的酶联免疫检测试剂盒进行性能比对，结果如下表7所示，本发明试剂盒的如下性能优于酶联免疫吸附法试剂盒。
表7 本发明试剂盒与酶联免疫检测试剂盒性能比对
本发明的MMP7化学发光检测试剂盒与购自美国R&D公司的酶联免疫检测试剂盒测定血清样本中MMP7的含量的测定值进行比较，数据结果如图4所示。相关系数R2为0.9992，说明本发明的试剂盒与酶联免疫检测试剂盒在血清中MMP7测值上具有良好的相关性。

Claims (31)

1.一种MMP7检测试剂盒，包括：
磁性微球溶液M，其包含链霉亲和素偶联的磁珠；
生物素化抗体溶液R1，其包含生物素化多克隆MMP7抗体；
发光标记物R2，其包含吖啶酯标记的单克隆MMP7抗体；
其中，所述的单克隆MMP7抗体包括：
如SEQ ID NO:1所示的HCDR1，如SEQ ID NO:2所示的HCDR2，如SEQ ID NO:3所示的HCDR3，如SEQ ID NO:13所示的LCDR1，如SEQ ID NO:14所示的LCDR2，如SEQ ID NO:15所示的LCDR3。
2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其中，所述的单克隆MMP7抗体包括：
具有如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列的重链可变区，和具有如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的轻链可变区。
3.如权利要求2所述的检测试剂盒，其中，所述的单克隆MMP7抗体还包含重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区为IgG重链恒定区，所述轻链恒定区为κ或λ链恒定区。
4.如权利要求1所述的检测试剂盒，其中，所述的单克隆MMP7抗体包括：
具有如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列的重链，和具有如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的轻链。
5.如权利要求1-4中任一所述的检测试剂盒，其中，所述发光标记物R2包含：标记保存液和所述吖啶酯标记的单克隆MMP7抗体。
6.如权利要求5所述的检测试剂盒，其中，所述标记保存液与所述吖啶酯标记的单克隆MMP7抗体的体积比为50-100。
7.如权利要求6所述的检测试剂盒，其中，所述标记保存液包括：10mM PB缓冲液、0.5wt%-3wt% BSA、1wt%-5wt%海藻糖、0.05wt%-0.3wt% Proclin-300。
8.如权利要求1所述的检测试剂盒，其中，所述磁性微球溶液M还包含磁珠保存液。
9.如权利要求8所述的检测试剂盒，其中，所述磁性微球溶液M包含：浓度为0.2-2mg/mL的所述链霉亲和素偶联的磁珠和pH为6.5~7.8的所述磁珠保存液。
10.如权利要求8所述的检测试剂盒，其中，所述磁珠保存液包含：10mM PB缓冲液、0.5wt%-3wt% BSA、0.1wt%-3wt% Tween-20、0.05wt%-0.3wt% Proclin-300。
11.如权利要求1和8-10中任一项所述的检测试剂盒，其中，所述链霉亲和素偶联的磁珠的粒径为1μm-4μm。
12.如权利要求1所述的检测试剂盒，其中，所述生物素化抗体溶液R1还包含生物素化抗体稀释液。
13.如权利要求12所述的检测试剂盒，其中，所述生物素化抗体溶液R1包含：所述生物素化多克隆MMP7抗体和pH为6.5~7.8的所述生物素化抗体稀释液。
14.如权利要求12所述的检测试剂盒，其中，所述生物素化抗体稀释液包括：10mM PB缓冲液、0.5wt%-3wt% casein、5wt%-15wt%蔗糖、0.05wt%-0.3wt% Proclin-300。
15.如权利要求12-14中任一项所述的检测试剂盒，其中，所述生物素化抗体稀释液与所述生物素化多克隆MMP7抗体的体积比为1000-3000。
16.如权利要求1和12-14中任一项所述的检测试剂盒，其中，所述多克隆MMP7抗体来源于小鼠、大鼠、猪、猴、羊驼、骆驼、人。
17.如权利要求16所述的检测试剂盒，其中，所述多克隆MMP7抗体为IgG同种型。
18.如权利要求17所述的检测试剂盒，其中，所述多克隆MMP7抗体为antibodies-online MMP 7、CUSABIO MMP 7或MyBioSource MMP 7。
19.如权利要求1所述的检测试剂盒，其中，所述MMP7检测试剂盒还包括MMP7质控品。
20.如权利要求19所述的检测试剂盒，其中，所述MMP7检测试剂盒还包括MMP7校准品。
21.如权利要求20所述的检测试剂盒，其中，所述MMP7校准品包括MMP7蛋白和抗原稀释液，所述抗原稀释液包含：10mM PB缓冲液、0.5wt%-3wt% BSA、0.05wt%-0.3wt% Proclin-300，所述PB缓冲液的pH为7.0-7.5。
22.如权利要求21所述的检测试剂盒，其中，所述MMP7蛋白的浓度为4.25-230ng/mL中的一个或多个。
23.如权利要求19所述的检测试剂盒，其中，所述MMP7质控品包括MMP7蛋白和抗原稀释液，所述抗原稀释液包含：10mM PB缓冲液、0.5wt%-3wt% BSA、0.05wt%-0.3wt% Proclin-300，所述PB缓冲液的pH为7.0-7.5。
24.如权利要求23所述的检测试剂盒，其中，所述MMP7蛋白的浓度为8.5-287.5ng/mL中的一个或多个。
25.如权利要求21或23所述的检测试剂盒，其中，所述MMP7蛋白为人MMP7蛋白。
26.如权利要求1-3中任一项所述的检测试剂盒，其中，所述MMP7检测试剂盒还包括预激发液和/或激发液。
27.如权利要求26所述的检测试剂盒，其中，以体积百分比计，所述预激发液包括0.05%-2%的浓度为60wt%-90wt%的浓HNO3、3%-6%的以g/mL计为30%的H2O2、0.1wt%-2%Triton-X100、0.1%-0.4%无水乙醇。
28.如权利要求26所述的检测试剂盒，其中，以体积百分比计，所述激发液包括1%-2%NaOH、1%-4% Triton-X 100、0.1%-0.4%无水乙醇、0.1%-0.3% EDTA-Na。
29.权利要求1-28中任一项所述的MMP7检测试剂盒在制备用于对MMP7相关疾病进行诊断的产品中的用途，其中，所述MMP7相关疾病选自肾病、肝内胆管细胞癌、卵巢癌、肺动脉高压或特发性肺纤维化、胆道闭锁、梗阻性黄疸、肝纤维化、肝炎、非酒精性脂肪肝、胆管炎、胆汁淤积、坏死性小肠结肠炎或败血症、膀胱炎、关节炎、红斑狼疮。
30.如权利要求29所述的用途，其中，所述MMP7相关疾病选自胆道闭锁引起的肝纤维化、肾纤维化、或慢性肾病。
31.一种制备权利要求1-28中任一项所述的MMP7检测试剂盒的方法，包括：分别制备磁性微球溶液M、生物素化抗体溶液R1和发光标记物R2，然后将它们分别包装并放置在同一或不同的检测试剂盒内。
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