WO2005087242A1

WO2005087242A1 - Traditional chinese medicine preparation for cardio-cerebral blood vessel diseases and its preparing method

Info

Publication number: WO2005087242A1
Application number: PCT/CN2005/000333
Authority: WO
Inventors: Yiyu Cheng; Haijiang Zhang; Zhengliang Ye
Original assignee: Tianjin Tasly Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2004-03-17
Filing date: 2005-03-17
Publication date: 2005-09-22
Also published as: ES2635869T3; JP2007529431A; NO345093B1; AP2006003788A0; DK1741439T3; NO20064572L; HUE036016T2; CN1669573A; UA88162C2; AU2005221260A1; US7396545B2; PT1741439T; EP1741439B1; ZA200608606B; US20070071834A1; CA2559826A1; JP5567763B2; EP1741439A4; EP1741439A1; LT1741439T

Description

一种治疗心脑血管疾病的中药制剂及其制备方法技术领域

本发明涉及药物，尤其指一种治疗心脑血管疾病的中药制剂。背景技术

心脑血管疾病是严重危害人类的常见疾病。近年来，由于社会的发展，工作、生活、饮食结构及环境等的变化，心脑血管疾病呈上升趋势。中药虽然单一靶点的作用强度低于西药，但其多途径、多靶点、动态整体治疗、毒^作用小的特性则远非西药所能及，疗效确切的中成药的综合治疗效应要超过西药。治疗心脑血管疾病的中药制剂很多，例如复方丹参片、中药制剂、冠心丹参滴丸、心可舒片等。这些中药制剂（均含有丹参、三七）因其配方不同，或者配方比例不同，或者提取精制方法不同，或者剂型不同，治疗效果也有所差异。另外，由于未找到有效的质量检测方法来全面表征这些中药制剂的物理化学特征，目前仅用一两个成分，例如丹参素或丹参酮 ΠΑ的含量来表征这些中药制剂中复杂的生物活性成分，实际上难以控制这些中药制剂的质量。因此，对这些中药制剂的提取精制方法、质量控制方法进行改进成为人们积极研究的课题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种更有效地治疗心脑血管疾病的中药制剂，并提供一种检测方法对其物理化学特征进行了较全面、准确的表征。

本发明的另一目的在于提供一种上述中药制剂的制备方法。

本发明通过以下方案予以实施。本发明的中药制剂的一种制备方法如下：

将丹参、三七，和重量为药材总量 0·⁵ % -4.0 %的氢氧化钠、或者碳酸氢钠、或者碳酸钠、或者氢氧化钾、或者碳酸氢钾、或者碳酸钾，或者它们的混合物混合，加 3-6倍量水，煎煮 2-4次，过滤，滤液合并，浓缩，加高浓度乙醇（> 70%)至乙醇含量为 65-70 % , 静置，分离上清液，回收乙醇，浓缩至药液相对密度为 1.20-1.50(55-60°C), 得丹参三七浸膏。将丹参三七浸膏与冰片（或者降香油）混合，加入一种或一种以上药剂学上辅料如淀粉、糊精、乳糖、微晶纤维素、羟丙甲基纤维素、聚乙二醇、硬脂酸镁、微粉硅胶、木糖醇、乳糖醇、葡萄糖、甘氨酸、甘露醇、甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、交联聚乙烯吡咯烷酮等混合制成各种剂型，例如，注射剂、片剂、緩释片、滴丸、颗粒剂、粉针剂、胶嚢剂、微粒剂、口腔崩解剂。

上述中药制剂的优选制备方法为：称取丹参、三七，加重量为药材总量 1.4 % -1.9 %的碳酸氢钠，煎煮二次，第一次 4-5倍量水 2-3小时，第二次 3-4 倍量水 1-2 小时，过滤，滤液合并，浓缩至 ^重为 1.16-1.20(80±5°C)时，加高浓度乙醇（> 70%)至乙醇含量为 65-70 % (20°C), 静置 8-12小时以上，分离上清液，回收乙醇，浓缩至药液相对密度为 1.32-1.40(55-60°C),得丹参三七浸膏。将丹参三七浸膏与水片（或者降香油）混合，加入以下一种或一种以上药剂学辅料，如淀粉、糊精、乳糖、微晶纤维素、羟丙曱基纤维素、聚乙二醇、硬脂酸镆、微粉硅胶、木糖醇、乳糖醇、葡萄糖、甘氨酸、甘露醇、甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、交联聚乙烯吡咯烷酮等制成片剂、滴丸、 '粉针剂、胶嚢剂、颗粒剂、微粒剂、口腔崩解剂。

其中水片为人工水片或天然水片，降香油为降香经蒸馏所得。上述中药制剂的优选剂型为滴丸。本发明的中药制剂具有如下理化参数： HPLC图谱中单峰面积占总峰面积的百分比超过 2%的有 8个峰，该 8个峰的平均保留时间为 6.04、 9.90、 16.89、 17.84、 20.31、 23.74、 27.73、 31.02，其保留时间 RSD%分别为 0.31、 0.25 , 0.61、 0.70、 0.96、 0.76、 0.50、 1.18，其平均峰面积分别为 1627.92、 2575.54、 366.89、 381.40、 186.08、 555.35、 281.91、 1852.33 , 其峰面积 RSD%分别为 5.91、 13.53、 10.92、 13.81、 12.04、 10.48、 18.08、 14.84 , 其单峰面积占总峰面积的百分比分别为 19.6%-22.0% , 28.5%-37.4% , 4·2%-5·2%、 4·2%-5·5%、 2.1%-^.7% > 6.4%-7.8% , 3.0%-4.3% 20.2%-27.2%。

上述理化参数的检测条件如下：

(1)高效液相色谱条件

色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，流速 1.000ml/min , 检测波长 280nm , 洗脱条件：流动相 A为 0.02%的磷酸水溶液，流动相 B为 80%乙腈 0.02%的磷酸水溶液，从 0到 8min ,流动相 A从 90% 均匀变化成 78% , 流动相 B从 10%均匀变化成 22% ;从 8到 15min , 流动相 A从 78%均匀变化成 74% ,流动相 B从 22%均匀变化成 26% ; 从 15到 55min ,流动相 A从 74%均匀变化成 48% ,流动相 B λ . 26% 均匀变化成 52%。

(2)供试品溶液制备与测定

取本发明的中药制剂 10粒，精密称定，置 10ml容量瓶中，加蒸馏水超声 15min , 溶解，定容，离心或过滤，得到供试品溶液；精密吸取供试品溶液 10μ1，注入液相色谱仪，使用高效液相色谱法测定，得高效液相图谱。

上述平均保留时间为 6.04、 9.90 , 16.89、 17.84、 20.31、 23.74、 27.73、 31.02的 8个峰，经标准品对照和质谱法等分析方法检测，确认其分别属于丹参素、原儿茶醛、异紫草酸、异紫草酸^ 丹酚酸

D、迷迭香酸、丹酚酸 B、丹酚酸 A。见图 1。

采用特定的 HPLC-MS (液质联用）方法检测本发明的中药制剂，证明其含有丹参素（Danshensu)、原儿茶酸（Protocatechualdehyde)、异紫草酸 A(IsoIithospermic acid A)、异紫草酸 B(IsoIithospermic acid B)、丹酚酸 D (Salvianolic acid D)、丹酚酸 E(Salvianolic acid E)、迷迭香酸（ Rosmarinic acid), 丹酚酸 B(Salvianolic acid B)、丹酚酸 G (Salvianolic acid G)、丹酚酸 A(Salvianolic acid A)、丹参酮 I、丹参酮 IIA、三七皂苷 ΐ 、人参皂苷 Re、人参皂苷 Rgl、人参皂苷 Rbl、三七皂苷 R2、三七皂苷 R2 iso.、人参皂苷 Rg2、人参皂苷 Rhl、人参皂苷 Rhl iso.、人参皂苷 Rd、人参皂苷 Rd iso.、人参皂苷 Rf-H20、三七皂苷 2-H20、人参皂苷 Rg6或 F4、人参皂苷 Rk3、人参皂苷 (Rh4)、人参皂苷 20(R)-Rg3、人参皂苷 20(S)-Rg3、人参皂苷（Rkl)、人参皂苷（Rg5)等成分。

·丹参素（Danshensu) MW=198

. 儿茶酸（Protocatechualdehyde) MW=138·. ^"酚酸 A (Salvianolic acid A) MW=494.丹酚酸 B (Salvianolic acid B) MW=718 .丹酚酸 C(Salvianolic acid C) MW=492.丹酚酸 D (Salvianolic acid D) MW=418.丹酚酸 E (Salvianolic acid E) MW=718.丹酚酸 G (Salvianolic acid G) MW=340.异草酸 A (Isolithospermic acid A) MW=5380.异紫草酸 B (Isolithospermic acid B) MW=538 1.迷迭香酸（Rosmarinic acid) W=360

结人参惠武 Ginsenoside Ri R₂ 分子量 MW 构人参皂甙 Rbj Glc-Glc Glc-Glc 1108 类人参皂甙 Rd Glc-Glc Glc 946

人参皂戒 Rg₃ Glc-Glc H 784

A 人参皂甙 F₂ Glc Glc 784

结人参 _%武 Ginsenoside i R₂ 夯手量 MW 构

人参皂甙 Rg₅ Glc-Glc- H 766

类

人参皂甙 Rh₄ H Glc-O- 620

型

C 人参皂甙 F₄ H Rham-Glc-O- 766 结人参鬼武 Ginsenoside i R₂ 分子量 MW

构

人参皂武 Rg6 H Rham-Glc-O- 766

类

人参皂甙 Rk, Glc-Glc H 766

型

D 人参皂甙 Rk₃ H Glc-O- 620

Glc=p-D-葡萄糖（β-D-glucose)

Rham=a-L-鼠李糖 (α-L-rhamnose)

Xyl=p-D-木糖 (β-D-xylose)

本发明的提取分析方法，以指紋图谱的方式比较全面地表征了本发明的中药制剂中丹参和三七的物理化学特征。这种表征方式与仅用一两个成分来表征中药制剂中复杂的生物活性成分的现有技术比较，更加适合用于控制中药制剂的质量。

采用本发明的液质联用 H3PLC-MS 分析方法对本发明的中药制剂生物活性成分进行鉴定，共计鉴定了 12种来自丹参的成分和 21种来自三七的皂苷成分。对化合物的鉴定主要是基于对 1\18¹¹数据的解析以及与文献数据的比较而进行。最终，通过与对照品比较，使大部分成分结构得到完全确认。由此可见，采用本发明的液质联用 HPLC-MS分析方法，对本发明的中药制剂进行化学成分分析，可以得到丰富的生物活性成分的结构信息，由此来表征本发明的中药制剂中丹参和三七的物理化学特征，其效果大大优于现有技术方法。以下试验证明了本发明的中药制剂在治疗心脑血管方面的效果 1、本发明的中药制剂对麻醉犬心肌缺血、心肌梗塞的影响

采用心外膜电图标测心肌缺血范围及程度，定量组织学 (N-BT染色法）测定心肌梗塞范围，同时测定冠脉血流量、心肌耗氧量血清 CK：、 LDH和血浆 ET、 TXB₂、 6-Keto-PGF_la活性的变化，就本发明的中药制剂通过消化道给药对试验性犬急性心肌缺血、心肌梗塞及相关指标的影响进行研究。试验结果表明，本发明的中药制剂具有明显改善犬急性心肌缺血和心肌梗塞的作用，减轻由心外膜电图标测的心肌缺血程度

(∑-ST) (与生理盐水对照组比较 Ρ<0.001) , 明显减小经 N-ST染色所显示的梗塞区（与生理盐水对照组比较 P<0.001); 显著增加缺血心脏的冠脉血流量（与生理盐水对照组比较 PO.001); 抑制心肌缺血及心肌梗塞引起的血清乳酸脱氢酶 (LDH)的释放 (相对变化率明显低于生理盐水对照組 PO.001) ,并对肌酸磷酸激酶 (CK)活性升高有一定抑制作用（相对变化率明显低于生理盐水对照组 PO.05); 降低血浆 ET水平 (与生理盐水对照组较 P<0.001) , 降低 TXB₂水平（与生理盐水对照组比较 Ρ<0·001 , 与中药制剂比较？<0.05) , 提高 6-Keto-PGF_la/TXB₂ 的比值 (与生理盐水对照组比较 PO.001 , 与中药制剂比较 P<0.05)。

2、本发明的中药制剂对缺血再灌注所致心肌梗塞的影响

通过对大鼠心肌缺血再灌注损伤模型的观察发现，本发明的中药制剂能够明显减轻心肌损伤程度，心肌梗塞面积缩小（与模型组比较 P<0.05-0.01)，梗塞区重量减轻 (与模型组比较 P<0.05); 并能明显增加超氧化物歧化酶 (SOD)活性 (与模型组比较 P<0.01)。

3、本发明的中药制剂对犬心脏血流动力学及心肌耗氧量的影响

试验观察本发明的中药制剂对正常麻醉犬心脏血流动力学及心肌耗氧量的影响。结果显示，本发明的中药制剂可明显增加冠脉血流量（与药前及生理盐水对照組比较 PO.01-0.001) , 扩张冠脉血管、增加冠状静脉窦血氧含量（与药前及生理盐水对照组比较 PO.05-0.001) , 降低心肌耗氧指数，改善心肌供血供氧，在不增加左室作功的情况下，增加心脏每博输出量和心输出量 (与药前及生理盐水对照組比较 PO.05-0.01) , 调整心脏顺应性，对心脏血管系 ^起到调整和改善作用。 4、本发明的中药制剂对家兔血小板凝集的影响

试验采用 born氏比浊法，观察本发明的中药制剂对家兔血小板聚集的影响。结果表明，连续 7天灌胃给药，本发明的中药制剂明显降低花生四烯酸 (AA) (与蒸馏水对照组比较 PO.05-0.01)和胶原诱导的家兔血小板凝聚率 (与蒸馏水对照组比较 P<0.01)。提示本发明的中药制剂具有抑制血小板凝聚的作用。

5、本发明的中药制剂对大鼠体外血栓形成及血液黏度的影响

试验观察本发明的中药制剂对大鼠体外血栓形成及血液黏度的影响。结果表明：续 7天灌胃给药，本发明的中药制剂可明显缩短血栓长度 (与蒸馏水对照组比较卩<0.01)、明显减轻血栓湿重和干重（与蒸馏水对照组比较 PO.05); 显著降低血浆黏度 (与蒸镏水对照组比较 P<0.001)，并明显降低各切变率下的全血黏度 (与蒸镏水对照组比较 P<0.05) o 提示本发明的中药制剂具有抑制血栓形成、降低血浆黏度和全血黏度的作用。

6、本发明的中药制剂对家兔高脂血症及动脉粥样硬化的影响

通过给家兔喂饲高胆固醇饲料，建立实验性高脂血症及动脉硬化 (AS)模型，观察本发明的中药制剂对其影响及作用机制。结果奉明：本发明的中药制剂明显降低家兔血清 TC、 TG、 LDL-C , VLDL-C浓度及 TC/HDL-C比值 (与高脂对照組比较 PO.05-0.001) , 明显升高家兔 HDL-C浓度 (与高脂对照组比较 P<0.05) , 降低家兔主动脉 TC含量 (与高脂对照组比较 P<0.05)、降低肝脏 TG含量 (与高脂对照组比较 P<0.05) , 降低肝脏 MDA含量 (与高脂对照组比较 P<0.001) , 对肝脏 SOD活性有明显升高作用（与高脂对照組比较 P<0.01); 此外，本发明的中药制剂能明显減少主动脉斑块厚度及泡沫细胞形成量 (与高脂对照组比较 PO.05) , 对主动脉斑块面积有減少趋势。提示本发明的中药制剂具有调整血脂的作用，同时在一定程度上具有抗脂质过氧化及防治动脉硬化的作用。

7、本发明的中药制剂对大鼠局灶性脑缺血的影响

应用大鼠大脑中动脉血栓模型，测定了对 MCAT大鼠脑梗塞范围的影响。结果表明，本发明的中药制剂具有明显的抗脑缺血作用。

附图说明

图 1 : 本发明中药制剂之一滴丸剂中的丹参成分指纹图谱，图中峰 1 为丹参素、峰 2为原儿茶醛、峰 3为异紫草酸 A、峰 4为异紫草酸 B、峰 5为丹酚酸0、峰 6为迷迭香酸、峰 7为丹酚酸8、峰 8为丹酚酸 A。

图 2: 本发明的中药制剂的丹参水溶性成分 HPLC谱图，图中峰 1为丹参素、峰 2为原儿茶醛、峰 3为异紫草酸 A、峰 4为异紫草酸 B、峰 5为丹酚酸0、峰 6为丹酚酸£、峰 7为迷迭香酸、峰为 8丹酚酸 B 、峰 9为丹酚酸0、峰 10为丹酚酸。

图 3: 本发明的中药制剂的丹参水溶性成分 MS-TIC谱图。图 4: 本发明的中药制剂的丹参脂溶性成分的 HPLC谱图，图中峰 1 为丹参酮 I、峰 2为丹参酮 IIA。

图 5: 本发明的中药制剂的丹参脂溶性成分的 MS-TIC谱图。图 6: 本发明的中药制剂的三七成分的 MS-TIC谱图。

具体实施方式

下面列举实施例进一步详细说明本发明，下述实施例仅用于说明本发明，对本发明并不构成限制。实施例

实施例一 (制备例）

称取丹参 41.06g、三七 8.03g, 加入重量相当于药材总量 1.8%的碳酸氢钠，煎煮二次，第一次 4倍量水 2小时，第二次 3倍量氷 1小时，过滤，滤液合并，浓缩至比重为 1.19-1.20(75±1°C)时，加 95%乙醇至乙醇含量为 65% (20"C),静置 12小时，分离上清液，回收乙醇，浓缩至药液相对密度为 1.37(55-60°C), 得丹参三七浸膏。取上述丹参三七浸膏和冰片 0.46g, 与聚乙二醇 -600018g混和均勾，加热至温度 85°C, 化料 80min后，移至罐温保持在 86°C的滴丸机滴罐中。药液滴至 8°C液体石蜡中，取出滴丸，除油，筛网选丸，即得。实施例二 (制备例）

称取丹参 59.36g、三七 6.38g, 加入重量相当于药材总量 1.0% 的碳酸钾，煎煮二次，第一次 4倍量水 2.5小时，第二次 3倍量水 1.5 小时，过滤，滤液合并，浓缩至比重为 1.19-1.20(75±1。C)时，加 85% 乙醇至乙醇含量为 70% (20°C), 静置 10小时，分离上清液，回收乙醇，浓缩至药液相对密度为 1.35(55-60 °C), 得丹参三七浸膏。取上述丹参三七浸膏和冰片 0.34g, 与聚乙二醇 -600023g混和均匀，加热至温度 89。C，化料 lOOmin后，移至罐温保持在 85°C的滴丸机滴罐中。药液滴至 8°C甲基硅油中，取出滴丸，除油，筛网选丸，即得。实施例三 (制备例）

称取丹参 12.60g、三七 56.15g，加入重量相当于药材总量 1.0% 的碳酸氢钾，煎煮二次，第一次 4倍量水 2.5小时，第二次 3倍量水 1.5 小时，过滤，滤液合并，浓缩至比重为 1.19-1.20(75±1°C)时，加 95%乙醇至乙醇含量为 70% (20°C), 静置 10小时，分离上清液，回收乙醇，浓缩至药液相对密度为 1.35(55-60°C), 得丹参三七浸膏。取上述丹参三七浸膏和水片 0.34g, 与聚乙二醇 -600023g混和均匀，加热至温度 89°C,化料 lOOmin后，移至罐温保持在 85°C的滴丸机滴罐中。药液滴至 8°C甲基硅油中，取出滴丸，除油，筛网选丸，即得。实施例四（制备例）

称取丹参 31.12g、三七 9.21g, 加入重量相当于药材总量 0.5% 的氢氧化钠，煎煮二次，第一次 4倍量水 1.5小时，第二次 3倍量水 1.5 小时，过滤，滤液合并，浓缩至比重为 1.19-1.20(75±1°C)时，加浓度为 88%乙醇至乙醇含量为 66% (20。C),静置 10小时，分离上清液，回收乙醇，浓缩至药液相对密度为 1.40(55-60°C)，得丹参三七浸膏。取上述丹参三七浸膏和水片 0.50g, 甘露醇 90g、依地酸钙钠 15g和蒸馏水 15ml, 上述组分混勾后，冷冻干燥，制成粉针剂。实施例五 (制备例）

称取丹参 116.35g、三七 58.21g，加入重量相当于药材总量 2.0 %的碳酸氢钠，煎煮二次，第一次 4倍量水 2小时，第二次 3倍量水 1.5 小时，过滤，滤液合并，浓缩至比重为 1.19-1.20(75±1°C)时，加浓度为 88%乙醇至乙醇含量为 66% (20°C),静置 10小时，分离上清液，回收乙醇，浓缩至药液相对密度为 1.40(55-60°C), 得丹参三七浸膏。取上述丹参三七浸膏和降香油 1.80g, 与 40g微晶纤维素混合均匀，加 3%聚维酮乙醇溶液制软材，过 18 目筛制颗粒， 60°C干燥 35min, 整粒，加入 4g滑石粉，混匀，充于胶嚢中，即得。实施例六 (制备例）

称取丹参 116.35g、三七 58.21g，加入重量相当于药材总量 2.0 %的碳酸氢钠，煎煮二次，第一次 4倍量水 2小时，第二次 3倍量水 1.5 小时，过滤，滤液合并，浓缩至比重为 1.19-1.20(75±1 °C)时，加浓度为 88%乙醇至乙醇含量为 66 % (20°C) ,静置 10小时，分离上清液，回收乙醇，浓缩至药液相对密度为 1.40(55-60°C) , 得丹参三七浸膏。取上述丹参三七浸膏和冰片 0.90g，与微晶纤维素 120g、羟丙甲基纤维素 40g、木糖醇 5g、硬脂酸镁 2g混合均匀，压片，即得。实施例七（制备例）

称取丹参 140.35g、三七 36.42g, 加重量相当于药材总量 2.5 % 的碳酸氢钠，煎煮二次，第一次 4倍量水 2小时，第二次 3倍量水 1.5 小时，过滤，滤液合并，浓缩至比重为 1.19-1.20(75士 1 °C)时，加浓度为 90%乙醇至乙醇含量为 65 % (20°C) , 静置 8小时，分离上清液，回收乙醇，浓缩至药液相对密度为 1.35(55-60°C) , 得丹参三七浸膏。取上述丹参三七浸膏和冰片 l.OOg, 与 46_g微晶纤维素混合均匀，加 3%聚维酮乙醇溶液制软材，过 18目筛制颗粒， 60°C干燥 30min，整粒，加入 4_g滑石粉，混勾，压片，即得。实施例八 (有效成分检测例）

1、样品制备

(1) 本发明的中药制剂中的丹参水溶性成分

分别准确称取本发明实施例一中药滴丸、实施例二中药滴丸、实施例三中药滴丸、实施例四中药粉针剂、实施例五中药胶嚢、实施例六中药口腔崩解片、实施例七中药片各 148.4mg，分别以 6ml水超声 15min溶解，经 0.45μιη尼龙膜过滤后分别得到黄色溶液样品。

(2) 本发明的中药制剂中的三七成分和丹参脂溶性成分

分别准确称取本发明实施例一中药滴丸、实施例二中药滴丸、实施例三中药滴丸、实施例四中药粉针剂、实施例五中药胶嚢、实施例六中药口腔崩解片、实施例七中药片各 1003.8mg , 分别以 10ml4%氨水超声 15min溶解，经 0.45μιη尼龙膜过滤后，滤液以 Extract-Clean C₁₈(Alltech Associates, Inc, U.S.)小柱进行预处理。样品上柱后，先以 10ml水洗涤，再以 2ml甲醇洗脱分别得黄色洗脱液为待测样品。

2、样品的分析.

(1) 仪器与试剂

Agilent Series-1100型液相色谱仪 (Agilent); G1315A型二极管阵列检测器； G1313A型自动进样器； G1316A型恒温箱； G1322A型脱气机及二元泵； HP Instrument色谱工作站。

G2445A型 1100 系列 LC-MSD/Trap质谱仪 (Bruker); 离子化方式为电喷雾； Extract-Clean C₁₈小柱（100mg/ml, Alltech Associates, Inc, U.S.) . 乙腈为色谱纯试剂（TEDIA) , 水为重蒸水，乙酸为分析纯。

(2) 仪器测试奈件

采用 Agilent Zorbax SB-C18 色谱柱 (5μιη， 4.6mmx25cm , Agilent SN: USCL009296) 进行 HPLC分析，各样品的梯度洗脱方法及质潘检测条件如下：

① 本发明各实施例中药制剂中的丹参水溶性成分

HPLC洗脱条件:

时间（min) 流动相 A( % ) 流动相 B( % ) 流动相 A: 水乙酸：水 =0.01 : 100

0 95.0 5.0 流动相 B: 冰乙酸：乙猗 =0.01 :100

15 78.3 21.7 流速： 0.5 ml/min

33 78.3 21.7 温度： 30 。C

38 65.0 35.0 检测波长：多波长检测（显示波长 280 nm) 质谱分析条件:

② 各实施例中药制剂中的三七成

HPLC洗脱条件:'

质谱分析条件:

3、分析结果和谱峰鉴定

成分的鉴定工作分为以下两个方面：（1)采用对照品鉴定；（2)根据紫外吸收特性和 MSⁿ得到的离子碎片信息，结合文献资料进行鉴定；

4、鉴定结果如下：

(1)本发明各实施例丹参制剂中的丹参水溶性成分，见附表 1、附表 2;. 图 2、图 3。附表 1. HPLC-MS数据及鉴定结果

附表 2. HPLC-MSⁿ数据

从 MSⁿ结果看，第二和第三号峰具有与紫草酸很相似的结构，但是二者的紫外吸收情况却存在较大差异。紫草酸由于具有苯基苯骈二氢呋喃骨架而在 253nm 附近有较强吸收，第二和第三号峰则不具有这一吸收特性。与丹酚酸 E相比，二者的紫外吸收情况基本一致。这表明，这两个化合物很可能与丹酚酸 E具有相同的骨架，即羧二苯乙烯的骨架结构。由此推测它们的结构为前述成分结构图中异紫草酸 A 和异紫草酸 B所示结构。这一结构尚未见过相关报道，因此暂命名为异紫草酸 A和异紫草酸 B。

(2)本发明的中药制剂中的丹参脂溶性成分，见附表 3; 图 4、图 5。附表 3 HPLC-MS数据及鉴定结果

(3)本发明丹参滴丸中的三七成分，见附表 4、附表 5; 图 6。

附表 4 HPLC-MS数据及鉴定结果

20 69.53 765 人参皂苷 Rlq/Rgs (Rg₅) 附表 5. HPLC-MSⁿ数据

通过以上研究，建立了本发明的中药制剂的提取和分析方法，包括：

(1)富集丹参滴丸中丹参脂溶性成分和三七皂苷成分的固相萃取方法；

(2)各样品的 HPLC-MS分析方法

共计鉴定了 12种来自丹参的成分和 21种来自三七的皂苷成分。其中通过与对照品比较，确认了 4种丹参水溶性成分、 2种丹参脂溶性成分和 9种皂苷。其余化合物的鉴定则主要是基于对 MSⁿ数据的解析以及与文献数据的比较而进行的。

实施例九（中药制剂丹参组分指紋图谱检测例）

1、仪器与试剂

仪器：采用 Agilent 1100液相色谱，包括四元泵，在线脱气装置，自动进样器， DAD 检测器，柱温箱， Chemstation 工作站； BS210S 电子天平（l/l(T⁴g) (北京塞多利斯公司）、 METTLER AE240电子天平 (l/10"⁴g 或 l/l(T⁵g)(梅特勒-托利多（上海)有限公司）、 LD4-2 离心机 (4000 r/min) (北京医,用离心机厂）、数显恒温水浴锅（天津长风有限公司）、 RE-52AA旋转蒸发器 (上海亚荣生化仪器厂）、 SHE- (ΠΙ)循环水式真空泵 (巩义英峪予华仪器厂）、 KQ-250B 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、 HENGAO T&D过滤器 (HENGGAO T&D)、合成纤维过滤膜 (孔径 0.45μηι) (上海兴亚净化材料厂）；

试剂：乙膪（色谱纯，美国墨克公司），磷酸 (优级纯），娃哈哈纯净水。

2、供试品制备：

取本发明实施例一各批次中药制剂 10粒，精密称定，置 10ml容量瓶中，加蒸镏水超声 15min , 溶解，定容，离心或过滤，即为供试 3、 HPLC分析条件

Agilent ZoRBAx SB-Ci₈(4.6x250mm , 5μπι)色谱柱，流动相： Α相为 0.02%的磷酸水溶液； B相为 80%乙腈 0.02%的磷酸水溶液。流速 1.000ml/min , 检测波长 280nm , 柱温 30 °C，进样体积 10μ1。色谱流动相洗脱梯度如下表: 保留时间流动相 A(v/v) 流动相 Β(ν/ν)

Omin 90% 10%

8min 78% 22%

15min 74% 26%

55min 48% 52%

4、检测结果 (见附表 7)

附表 7 200批上述中药滴丸丹参成分的检测结果

注：峰 1为丹参素、峰 2为原儿茶醛、峰 3为异紫草酸 A、峰 4为异紫草酸 B、峰 5为丹盼酸 D、峰 6为迷迭香酸、峰 7为丹盼酸8、峰 8为丹酚酸。见图 1。从附表 7 可看出 8 个峰的相对位置和面积比例 (保留时间和峰面积），其中单峰面积占总峰面积的百分比超过 10%的有 3个峰， 8个峰的单峰面积占总峰面积的百分比全部超过 2%。

Claims

权利要求书

1、一种治疗心脑血管疾病的中药制剂，其特征在于，它含有准分子离子质峰质荷比 [Μ-ΗΓ均为 537的 2个成分，该 2个成分的二级碎片离子质荷比均为 493[M-H-C0₂r，295[M-C0₂-R-H₂Or, 三级碎片离子质荷比均为 159， 109，最大吸收波长均为 327nm; 其质 i普分析条件如下：

HPLC-MS 条件：离子检测方式为负离子检测，干燥气流速 lOL/min, 雾化气压力 60psi, 干燥气温度 350 °C , 毛细管压力 3500 伏，质荷比扫描范围 100-1200;

HPLC-MSⁿ条件：离子检测方式为负离子检测，干燥气流速 10L/min, 雾化气压力 60psi，干燥气温度 350 "C , 毛细管压力 3500 伏，质荷比扫描范围 100-800, 碰撞断裂振幅 1.5-3.0伏。

2、根据权利要求 1所述的中药制剂，其特征在于，所述中药制剂含有异紫草酸 A和异紫草酸 B。

3、根据权利要求 1所述的中药制剂，其特征在于，它含有准分子离子质峰质荷比 [M-H]-为 417， 717, 359, 717, 339, 493 的成分，其中：

所述 [M-H]-为 417成分的二级碎片离子质荷比为 175[M- C0₂-R-H₂0]- 373[M-H-C0₂]-，三级碎片离子质荷比为 147， 157, 133;

所述 [M-H]-为 717 成分的二级碎片离子质荷比为 519[M- R-^O]-, 321[M-2R-2H₂0]- , 三级碎片离子质荷比为 321[M-R-H₂0〗-， 339[M-R]^_, 三级碎片离子质荷比为 279, 293, 249, 223, 185; 所述 [M-H]-为 359 成分的二级碎片离子质荷比为 161[M-R-H₂0】-， 179[M-R] -， 195;

所述 [M-H]-为 717 成分的二级碎片离子质荷比为 519[M- R-H₂0]", 321[M- 2R-2H₂0]^_ , 三级碎片离子质荷比为 321[M- R-H₂0]-， 339[M-R]^_, 四級碎片离子质荷比为 279， 293, 249, 233, 185;

所述 [M-H]-为 339 成分的二级碎片离子质荷比为 321[M-H-H₂0】-， 295[M-H-C0₂r，三级碎片离子庸荷比为 279， 267, 四级碎片离子质荷比为 251;

所述 [M-H]-为 493 分的二级碎片离子质荷比为 295[M- R-H₂0]-，三级碎片离子质荷比为 159, 109;

其盾谱分析条件如下：

HPLC-MS 条件：离子检测方式为负离子检测，干燥气流速 10L/min, 雾化气压力 60psi，干燥气温度 350 "C , 毛细管压力 3500 伏，质荷比扫描范围 100-1200;

HPLC-MSⁿ条件：离子检测方式为负离子检测，干燥气流速 10L/min, 雾化气压力 60psi, 干燥气温度 350 °C , 毛细管压力 3500 伏，质量即质荷比扫描范围 100-800，碰撞断裂振幅 1.5-3.0伏。

4、根据权利要求 1所述的中药制剂，其特征在于，所述中药制剂含有准分子离子质峰质荷比 [Μ-ΗΓ为 931、 945、 799、 1107、 769、 769、 783、 637、 637、 945 > 945、 781、 751、 751、 765、 783、 783、 765、 765的成分，其中：

所述 [Μ-ΗΓ为 931 成分的碎片离子质荷比为 799[M-H-Xyl]-， 637 [M-H-Xy l-Glc]， 475 [M-H-X l-2Glc] -；

所述 [M-H]-为 945 成分的碎片离子质荷比为 799[M-H-Rhamr， 783[M-H-Glc]"; 637[M-H-Rham-Glc]^_, 475[M-H-Rham-2Glc]-;

所述 [M-H]-为 799 成分的碎片离子质荷比为 637[M-H-Glc]-，

475[M-H-2Glc]';

所述 [Μ-ΗΓ为 1107 成分的碎片离子质荷比为 945[M-H-Glc]-， 783[M-H-2GIc]% 621 [M-H-3Glc]% 459[M-H-4Glc]";

所述 [M-H]-为 769 成分的碎片离子质荷比为 637[M-H-Xyl]-， 475[M-H-Xyl-Glc]";

所述 [M-H]-为 783 成分的碎片离子质荷比为 637[M-H-Rham]-， 475[M-H-Rham-Glc]";

所述 [M-H]-为 637成分的碎片离子质荷比为 475[M-H-Glc]-;

所述 [Μ-ΗΓ为 637成分的碎片离子质荷比为 475[M-H-Glc]_;

所述 [M-H]—为 945 成分的碎片离子质荷比为 783[M-H-Glc] -， 621[M-H-2Glc]", 459[M-H-3Glc]-;

所述 [M-H]-为 945 成分的碎片离子质荷比为 783[M-H-Glc]-， 621[M-H-2Glc]-, 459[M-H-3Glc]^_;

所述 [M-H]-为 781 成分的碎片离子质荷比为 619[M-H-Glcr， 457[M-H-2Glc]；

所述 [M-H]-为 751成分的碎片离子质荷比为 619[M-H-Xyl]-;

所述 [M-H]-为 751成分的碎片离子质荷比为 619[M-H-Xyl]_;

所述 [Μ-ΗΓ为 765 成分的碎片离子廣荷比为 619[M-H-Rham]-， 457[M-H-Rham-Glc]-;

所述 [M-H]—为 783 成分的碎片离子质荷比为 621[M-H-Glc] -， 459[M-H-2Glc]'; 所述 [M-H]-为 783 成分的碎片离子质荷比为 621 [M-H-Glc】- , 459[M-H-2GIc]-;

所述 [M-H]-为 765 成分的碎片离子质荷比为 603[M-H-Glc] -， 441 [M-H-2Glc]^_;

所述【M-H】-为 765 成分的碎片离子质荷比为 603iM-H-Glc〗- , 441 [M-H-2Glc]；

其质谱分析条件如下：

HPLC-MS 条件：离子检测方式为负离子检测，干燥气流速 10L/min , 雾化气压.力 60psi, 干燥气温度 350 °C , 毛细管压力 3500 伏，质荷比扫描范围 400-1500;

HPLC-MSⁿ条件：离子检测方式为负离子检测，干燥气流速 10L/min , 雾化气压力 60psi, 干燥气温度 350。C，毛细管压力 3500 伏，质荷比扫描范围 400-1200 , 碰撞断裂振幅 1.2-1.5伏。 5、根据权利要求 1所述的中药制剂，其特征在于，所述中药制剂含有准分子离子质峰质荷比 [Μ-ΗΓ为 417 , 717 , 359 , 717 , 339 , 493 的成分，其中：

所述 [M-H]-为 417成分的二級碎片离子质荷比为 175[M- C0₂-R-H₂0]- 373[M-H-C0₂】-，三级碎片离子质荷比为 147， 157， 133；

所述 [Μ-ΗΓ为 717 成分的二级碎片离子质荷比为 519[M- R-H₂0]^_, 321 [M-2R-2H₂0]" , 三级碎片离子质荷比为 321 [M-R，H₂0]-， 339 [M-R]", 三級碎片离子质荷比为 279， 293， 249， 223, 185;

所述 [Μ-ΗΓ为 359 成分的二级碎片离子质荷比为 161 [M-R-H₂0〗-， 179[M-R]^_, 195;

所述 [Μ-ΗΓ为 717 成分的二级碎片离子质荷比为 519[M- R-H₂0]", 321[M- 2R-2H₂0]" , 三级碎片离子质荷比为 321[M- R-H₂0]^_, 339[M-R]^_, 四级碎片离子质荷比为 279, 293, 249, 233， 185;

所述 [M-H]-为 339 成分的二级碎片离子质荷比为 321[M-H-H₂0】-， 295[M-H-C0₂]% 三级碎片离子质荷比为 279， 267, 四级碎片离子质荷比为 251；

所述 [M-H]-为 493成分的二级碎片离子质荷比为 295【M- R-H₂Or, 三级碎片离子质荷比为 159, 109;

其质谱分析条件如下：

HPLC-MS 条件,：离子检测方式为负离子检测，干燥气流速 10L/min, 雾化气压力 60psi，干燥气温度 350 毛细管压力 3500 伏，质荷比扫描范围 100-1200;

HPLC-MSⁿ条件：离子检测方式为负离子检测，干燥气流速 lOL/min, 雾化气压力 60psi, 干燥气温度 350 °C , 毛细管压力 3500 伏，质荷比扫描范围 100-800，碰撞断裂振幅 1.5-3.0伏；

所述中药制剂还含有准分子离子质峰质荷比 [Μ-ΗΓ为 931、 945、 799、 1107、 769、 769、 783、 637、 637、 945、 945、 781、 751、 751、 765、 783 > 783、 765、 765的成分，其中：

所述 [M-H]-为 931 成分的碎片离子质荷比为 ⁷99[M-H-Xyl]- , 637[M-H-Xyl-Glc]", 475[M-H-Xyl-2Glc]";

所述 [M-H】-为 945 成分的碎片离子质荷比为 799[M-H-Rham] -， 783[M-H-Glc]^_; 637[M-H-Rham-GIc]-, 475[M-H-Rham-2Glc]-;

所述 [M-H]-为 799 成分的碎片离子质荷比为 637[M-H-Glc]- , 475[M-H-2Glc]';

所述 [M-H]-为 1107 成分的碎片离子质荷比为 945[M-H-01c〗-， 783[M-H-2Glc]-, 621[M-H-3Glc]", 459[M-H-4Glc]"; 所述 [Μ-Η】·为 769 成分的碎片离子质荷比为 637[M-H-Xyl]-， 475[M-H-Xyl-Glc]-;

所述〖M-H]-为 769 成分的碎片离子质荷比为 637[M-H-Xyl]-， 475[M-H-Xyl-Glc]^_;

所述 [M-H]-为 637成分的碎片离子质荷比为 475【M-H-Glc]-; .

所述〖M-H〗-为 637成分的碎片离子质荷比为 475[M-H-Glc】-;

所述 [M-H]-为 945.成分的碎片离子质荷比为 783[M-H-Glc】- , 621 [M-H-2Glc]" , 459[M-H-3Glc]^_;

所述 [M-H]-为 945 成分的碎片离子质荷比为 783[M-H-Glc]_， 621 [M-H-2Glc]^_, 459[M-H-3Glc]";

所述 [M-H]-为 781 成分的碎片离子质荷比为 619[M-H-Glc] -， 457[M-H-2Glc]-;

所述 [M-H】-为 751 成分的碎片离子质荷比为 619[M-H-Xyl]-; 所述 [M-H]-为 751成分的碎片离子质荷比为 619[M-H-Xyl]-;

所述 [M-H]-为 765 成分的碎片离子质荷比为 619[M-H-Rl^m]- , 457[M-H-Rham-Glc]-;

所述 [M-H]-为 783 成分的碎片离子质荷比为 621[M-H-Gkr , 459[M-H-2Glc]；

所述 [Μ-ΗΓ为 783 成分的碎片离子质荷比为 621 [M-H-Glc]-， 459[M-H-2Glc]-;

所述 [M-H]-为 765 成分的碎片离子质荷比为 603[M-H-Glc] -， 441 [M-H-2GlcT;

所述 [M-H】-为 765 成分的碎片离子质荷比为 603[M-H-Gk]- , 441 [M-H-2Glc]^_;

其质谱分析条件如下：

HPLC-MS 条件：离子检测方式为负离子检测，干燥气流速 lOL/min , 雾化气压力 60psi, 千燥气温度 350 °C , 毛细管压力 3500 伏，质荷比扫描范围 400-1500;

HPLC-MSⁿ奈件：离子检测方式为负离子检测，干燥气流速 10L/min , 雾化气压力 60psi，干燥气温度 350 °C , 毛细管压力 3500 伏，质荷比扫描范围 400-1200，碰撞断裂振幅 1.2-1.5伏。

6、根据权利要求 5所述的中药制剂，其特征在于，所述中药剂含有丹酚酸0、丹酚酸 E、迷迭香酸、丹酚酸 B 、丹酚酸 G、丹酚酸 A、丹参素、原儿茶醛、异紫草酸 A、异紫草酸 B、丹参酮 I、丹参酮 ΠΑ、三七皂苷、人参皂苷 Re、人参皂苷 R_gl、人参皂苷 Rbl、三七皂苷 R2、三七皂苷 R2 iso.、人参皂苷 Rg2、人参皂苷 Rhl、人参皂苷 Rhl iso. 、人参皂苷 Rd、人参皂苷 Rd iso.、人参皂苷 Rf-H20、三七皂苷 R2-H20、人参皂苷 Rg6或 F4、人参皂苷 20(R)-Rg3、人参皂苷 20(S)-Rg3、人参皂苷 Rkl、人参皂苷 Rg5、人参皂苷 Rk3、人参皂苷 Rh4。

7、根据权利要求 1所述的中药制剂，其特征在于，它具有如下理化参数： HPLC图谱中单峰面积占总峰面积的百分比超过 2%的有 8个峰，该 8个峰的平均保留时间为 6.04、 9.90、 16.89、 17.84、 20.31、 23.74、 27.73、 31.02 , 其保留时间 RSD%分别为 0.31、 0.25、 0.61、 0.70 , 0.96、 0.76、 0.50、 1.18 ,其平均峰面积分别为 1627.92、 2575.54、 366.89、 381.40、 186.08、 555.35、 281.91、 1852.33，其峰面积 RSD% 分别为 5.91、 13.53、 10.92、 13.81、 12.04、 10.48、 18.08、 14.84，其单峰面积占总峰面积的百分比的范围分别为 19.6%-22.0%、 28.5%-37.4%、 4·2%-5·2%、 4·2%-5·5%、 2.1%-2.7%, 6.4%-7.8% 3.0%-4.3%. 20.2%-27.2%；

上述理化参数的检测条件如下：

高效液相色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，流速 1.000ml/min，检测波长 280nm;

洗脱条件：流动相 A为. 0.02%的磷酸水溶液, 流动相 B为 80%乙腈 0.02%的磷酸水溶液，从 0到 8min, 流动相 A从 90%均匀变化成 78%, 流动相 B从 J0%均匀变化成 22%; 从 8到 15min，流动相 A 从 78%均匀变化成 74%, 流动相 B从 22%均匀变化成 26%; 从 15 到 55mm，流动相 A从 74%均匀变化成 48%, 流动相 B从 26%均匀变化成 52%;

供试品溶液制备与测定：取中药制剂 10粒，精密称定，置 10ml 容量瓶中，加蒸镏水超声 15min, 溶解，定容，离心或过滤，得到供试品溶液；精密吸取供试品溶液 ΙΟμΙ, 注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，即得高效液相图谱。

8、根据权利要求 7所述的中药制剂，其特征在于，所述平均保留时间为 6.04、 9.90、 16.89、 17.84、 20.31、 23.74、 27.73、 31.02的 8个峰，分别为丹参素、原儿茶醛、异紫草酸、异紫草酸8、丹酚酸 D、迷迭香酸、丹酚酸 B、丹酚酸 A。

9、根据权利要求 1-8任一所述的中药制剂的制备方法，其特征在于，该方法为称取丹参、三七，加入重量相当于药材总量 0.5 % -4.0 %的氢氧化钠或者碳酸氢钠或者碳酸钠或者氢氧化钾或者碳酸氢钾或者碳酸钾或者它们的混合物，加 3-6倍量水，煎煮 2-4次，过滤，滤液合并，浓缩，加浓度大于 70%乙醇至乙醇含量为 65-70 %，静置，分离上清液，回收乙醇，浓缩至药液相对密度为 1.20-1.50，得丹参三七浸膏；将丹参三七浸膏与冰片或者降香油混合，加入辅料制成制剂。

10、根据权利要求 9所述的中药制剂的制备方法，其特征在于，所述辅料为淀粉、糊精、乳糖、微晶纤维素、羟丙甲基纤维素、聚乙二醇、硬脂酸镁、微粉硅胶、木糖醇、乳糖醇、葡萄糖、甘氨酸、甘露醇、甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、水中的任何一种辅料或一种以上混合辅料；所述制剂为注射剂、片剂、緩释片、滴丸、颗粒剂、粉针剂、胶嚢剂、微粒剂、口腔崩解剂。

11、根据权利要求 10所述的中药制剂的制备方法，其特征在于，所述制剂为滴丸。

12、根据权利要求 11所述的中药制剂的制备方法，其特征在于，所述方法为称取丹参、三七，加药材总量 1.4 % -1.9 %的碳酸氢钠，煎煮二次，第一次 4-5倍量水 2-3小时，第二次 3-4倍量水 1-2小时，过滤，滤液合并，浓缩至比重为 1.16-1.20时，加浓度大于 70%乙醇至乙醇含量为 65-70 %，静置 8-12小时以上，分离上清液，回收乙醇，浓缩至药液相对密度为 1.32-1.40，得丹参三七浸膏；将丹参三七浸膏与水片或者降香油混合，加入辅料聚乙二醇 -6000 , 混和均勾，，加热化料，用滴丸机将药液滴至冷却液液体石蜡或甲基硅油中，取出滴丸，除油，选丸，即得。