CN110907581B - 复方丹参制剂七种成分血浆或组织浓度的质谱检测方法 - Google Patents
复方丹参制剂七种成分血浆或组织浓度的质谱检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种复方丹参制剂七种成分血浆或组织浓度的质谱检测方法。该方法包括以下步骤：(1)储备液的制备：取标准品丹参酮I、丹参酮IIA、丹酚酸B、丹参素、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和Rb1，分别溶解于(80±5)％甲醇水溶液中，制得标准品储备溶液；取卡马西平溶解于(80±5)％甲醇水溶液中，制得卡马西平储备溶液；(2)工作溶液的制备；(3)待测样品溶液的制备；(4)将步骤(3)所得待测样品溶液进行液相色谱分离；将液相色谱分离后的样品进行质谱分析。本发明方法的检测过程中色谱峰形极佳，每个化合物的通道都只有唯一的目标峰，避免了其他如溶剂效应等的干扰，操作简单、分析快速、特异性高、分离度高。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，特别是涉及一种复方丹参制剂七种成分血浆或组织浓度的质谱检测方法。
背景技术
复方丹参制剂由丹参、三七和冰片3味中药组成，剂型共有9种：复方丹参口服液、复方丹参气雾剂、复方丹参含片、复方丹参胶囊、复方丹参片、复方丹参颗粒、复方丹参滴丸、复方丹参喷雾剂、复方丹参软胶囊。复方丹参制剂具有活血化瘀、理气止痛之功效，用于气滞血瘀所致的胸痹，症见胸闷、心前区刺痛、冠状动脉粥样硬化性心脏病心绞痛见上述证候者。临床应用中单用复方丹参制剂发生不良反应的发生率约为5～7％。其不良反应表现复杂多样，体内代谢个体差异大,主要为胃肠道反应、头痛和出血等。大部分不良反应为病人可耐受的轻微损伤、出血等；少部分不良反应需要停药对症处理；且复方丹参制剂的疗效和不良反应与血浆中药物浓度密切相关，需要根据血药浓度调整给药方案，故有必要对其进行血药浓度监测。
药典中规定的复方丹参制剂的含量测定方法为高效液相色谱法，包括丹参酮IIA和丹酚酸B的含量测定方法和三七项下的人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1和人参皂苷Re的测定方法。但是，上述药典中规定分析方法涉及大量的化学预处理步骤，操作相对繁琐，特别是丹参酮IIA的含量测定供试品前处理和标定，耗时较长，给实际工作带来许多不便。
目前，复方丹参制剂血药浓度测定的常见方法有：高效液相色谱法和液相色谱-质谱联用法。由于复方丹参制剂七种成分性质差异较大，包含水溶性成分(丹酚酸B、丹参素、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1)和脂溶性成分(丹参酮I和丹参酮IIA)，而且含量相差较大，因此很难用一种前处理方法进行处理并检测。导致现在对复方丹参制剂主要成分检测方法的研究通常采取对于不同成分分开进行前处理和检测的方法，过程复杂，步骤繁琐。
发明内容
基于此，本发明的目的之一是提供一种复方丹参制剂七种成分的血浆浓度或组织分布的高效液相色谱串联质谱检测方法，该检测方法操作简单、分析快速、特异性高、分离度高。
具体技术方案如下：
一种复方丹参制剂七种成分的血浆浓度或组织分布的高效液相色谱串联质谱检测方法，包括以下步骤：
(1)储备溶液的制备：
取标准品丹参酮I、丹参酮IIA、丹酚酸B、丹参素、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和Rb1，分别溶解于(80±5)％甲醇水溶液中，制得标准品储备溶液；将标准品储备溶液混合，得到混合标准品储备溶液；
取卡马西平溶解于(80±5)％甲醇水溶液中，制得卡马西平储备溶液；
(2)工作溶液的制备：
分别用(80±5)％甲醇水溶液稀释所述混合标准品储备溶液，制得混合标准曲线样本工作溶液和混合质控样本工作溶液；
用(80±5)％甲醇水溶液稀释所述卡马西平储备溶液，制得内标工作溶液；
(3)待测样品溶液的制备：
待测血浆样品溶液的制备：取血浆样品，加入内标工作溶液和甲醇，离心，取所得上清液作为待测血浆样品溶液；
待测组织样品溶液的制备：取组织样品，匀浆，在所得匀浆液中加入内标工作溶液和甲醇，离心，取所得上清液作为待测组织样品溶液；
(4)将步骤(3)所得待测样品溶液进行液相色谱分离；将液相色谱分离后的样品进行质谱分析。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明方法选择卡马西平作为内标物加入待测血浆样本中，再用甲醇沉淀蛋白，经离心取上清进行分析，之后只需要极少的微升级进样量进行分析就可以满足定量要求，样本预处理过程被大大简化。本发明方法的检测过程中色谱峰形极佳，每个化合物的通道都只有唯一的目标峰，避免了其他如溶剂效应等的干扰；前处理采用蛋白沉淀法，操作简单；每一个样本的进样时间为3分钟，分析快速；在空白血浆中未发现待检测的化合物峰，特异性高；采用的是LC-MS/MS-MRM方法，化合物通道相互独立，分离度高。
本发明可以在一种方法里同时检测复方丹参制剂七种成分的含量，除了包含药典规定的五种成分之外，还可以另外检测丹参酮I和丹参素的含量，能够给复方丹参制剂的含量测定提供更加快速高效的方法，具有良好的现实意义。
附图说明
图1为丹参酮I在血浆样品中的液相色谱图(保留时间1.87min)：
图2为丹参酮IIA在血浆样品中的液相色谱图(保留时间1.92min)：
图3为丹酚酸B在血浆样品中的液相色谱图(保留时间1.56min)：
图4为丹参素在血浆样品中的液相色谱图(保留时间0.62min)：
图5为三七皂苷R1在血浆样品中的液相色谱图(保留时间1.63min)：
图6为人参皂苷Rg1在血浆样品中的液相色谱图(保留时间1.65min)：
图7为人参皂苷Rb1在血浆样品中的液相色谱图(保留时间1.74min)；
图8为卡马西平在血浆样品中的液相色谱图(保留时间1.68min)。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本实施方式提供一种复方丹参制剂七种成分的血浆浓度或组织分布的高效液相色谱串联质谱检测方法，包括以下步骤：
(1)储备溶液的制备：
取标准品丹参酮I、丹参酮IIA、丹酚酸B、丹参素、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和Rb1，分别溶解于(80±5)％甲醇水溶液中，制得标准品储备溶液；将标准品储备溶液混合，得到混合标准品储备溶液；
取卡马西平溶解于(80±5)％甲醇水溶液中，制得卡马西平储备溶液；
(2)工作溶液的制备：
分别用(80±5)％甲醇水溶液稀释所述混合标准品储备溶液，制得混合标准曲线样本工作溶液和混合质控样本工作溶液；
用(80±5)％甲醇水溶液稀释所述卡马西平储备溶液，制得内标工作溶液；
(3)待测样品溶液的制备：
待测血浆样品溶液的制备：取血浆样品，加入内标工作溶液和甲醇，离心，取所得上清液作为待测血浆样品溶液；
待测组织样品溶液的制备：取组织样品，匀浆，在所得匀浆液中加入内标工作溶液和甲醇，离心，取所得上清液作为待测组织样品溶液；
(4)将步骤(3)所得待测样品溶液进行液相色谱分离；将液相色谱分离后的样品进行质谱分析。
其中，各成分的性质如下：
丹参酮I游离态分子式与分子量为C18H12O/276.29，具体结构式如式(I)所示。
丹参酮IIA游离态分子式与分子量为C19H18O3/294.34，具体结构式如式(II)所示。
丹酚酸B可溶于水，游离态分子式与分子量为C36H30O16/718.62，具体结构如式(III)所示。
丹参素可溶于甲醇、水，不溶于氯仿、乙醚。游离态分子式与分子量为C5H10O5/198.7，钠盐分子式与分子量为C9H9O5Na/220.04，具体结构式如式(IV)所示。
三七皂苷R1微溶于无水乙醇，几乎不溶于水。游离态分子式与分子量为C47H80O18/933.13，具体结构式如式(V)所示。
人参皂苷Rg1溶于甲醇、吡啶、热丙酮，稍溶于乙酸乙酯及氯仿。其乙酰化物溶于甲醇、吡啶、热丙酮，稍溶于乙酸乙酯及氯仿。游离态分子式与分子量为C42H72O14/801.01，具体结构式如式(VI)所示。
人参皂苷Rb1游离态分子式与分子量为C54H92O23/1109.29，具体结构式如式(VII)所示。
本发明方法所选用内标为卡马西平(Carbamazepine)，为易溶于三氯甲烷，略溶于乙醇，几乎不溶于水和乙醚。游离态分子式与分子量为C15H12N2O/236.27，具体结构如式(VIII)所示。
表1
在其中一些实施例中，所述液相色谱分离所采用的洗脱方式为：以(0.1±0.02)％甲酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，进行梯度洗脱。
在其中一些实施例中，所述梯度洗脱的过程包括：0～0.5分钟，(10±5)％流动相A-(90±5)％流动相B；0.5～2.0分钟，(5±5)％流动相A-(95±5)％流动相B；2～2.2分钟，(90±5)％流动相A-(10±5)％流动相B；2.2～3.0分钟，(90±5)％流动相A-(10±5)％流动相B；2.4～3分钟，(90±5)％流动相A-(10±5)％流动相B。
优选地，所述梯度洗脱的过程为：0～0.5分钟，10％流动相A-90％流动相B；0.5～2.0分钟，5％流动相A-95％流动相B；2～2.2分钟，90％流动相A-10％流动相B；2.2～3.0分钟，90％流动相A-10％流动相B；2.4～3分钟，90％流动相A-10％流动相B。
在其中一些实施例中，所述液相色谱的色谱条件包括：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
流速为0.3±0.1mL/min；
进样体积为3.00±0.5μL；
柱温设置为40±5℃；
自动进样器温度为15±3℃；
洗针液：(50±5)％甲醇；
洗冲速度：30-40μL/sec；
洗针液体积：400-600μL。
在其中一些实施例中，所述质谱分析的条件包括：
离子化模式：电喷雾离子源；正离子模式；多反应监测；
离子源参数：气帘气：25psi；离子源气体1：50psi；离子源气体2：50psi；离子源喷雾电压：5500±10V；离子源温度：550±10℃；分辨率Q1/Q3：Unit/Unit；碰撞气：Medium；暂停时间：20±1msec；质谱采集时间为3.00±0.2min。
在其中一些实施例中，所述质谱分析中，各成分的四级杆质谱条件为：
丹参酮I：离子对：277→249；去簇电压：120.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：28.00eV；停留时间：100.0msec；
丹参酮IIA：离子对：295→277；去簇电压：120.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：21.00eV；停留时间：100.0msec；
丹酚酸B：离子对：717.3→519.2；去簇电压：-50.0V；入口电压：-10.00V；出口电压：-16.00V；碰撞能量：-25.00eV；停留时间：100.0msec；
丹参素：离子对：197→135；去簇电压：-50.0V；入口电压：-10.00V；出口电压：-16.00V；碰撞能量：-23.00eV；停留时间：100.0msec；
三七皂苷R1：离子对：935.3→755.5；去簇电压：120.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：28.00eV；停留时间：100.0msec；
人参皂苷Rg1：离子对：823.2→643.3；去簇电压：120.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：45.00eV；停留时间：100.0msec；
人参皂苷Rb1：离子对：1131.5→365.1；去簇电压：120.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：53.00eV；停留时间：100.0msec；
卡马西平：离子对：237→1954；去簇电压：120.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：25.00eV；停留时间：100.0msec。
在其中一些实施例中，步骤(3)中，所述甲醇与所述血浆样品或所述匀浆液的体积比为4-6：1；在样品预处理过程中，沉淀剂的量远大于血浆量，进样溶液体系与初始流动相比例接近，且进样量十分低，完全可以忽略溶剂效应的影响，使得分离效果极佳。
和/或，步骤(3)中，所述离心的温度为3-5℃；所述离心的转速为8000-12000rpm；所述离心的时间为8-12min。
在其中一些实施例中，所采用的液相色谱质谱联用仪的型号为Shimadzu LC30AD液相色谱仪联合Sciex Qtrap 5500质谱仪，所采用的操作系统为Analyst1.6.3；所采用的液相色谱柱为：XBridge BEH C18 UPLC Column。其规格为1.7μm，2.1x100mm；本发明使用的Sciex Qtrap5500型质谱仪，其灵敏度较以前的仪器有了数量级的提升。
在其中一个实施例中，步骤(2)中，所述混合标准曲线样本工作溶液中，丹参酮I、丹参酮IIA、丹酚酸B、丹参素、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和Rb1的浓度分别为20.0ng/mL、40.0ng/mL、80.0ng/mL、160ng/mL、400ng/mL、1600ng/mL、4000ng/mL、16000ng/mL、32000ng/mL和40000ng/mL。
在其中一个实施例中，步骤(2)中，所述混合质控样本工作溶液中，丹参酮I、丹参酮IIA、丹酚酸B、丹参素、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和Rb1的浓度分别为：定量下限质控20.0ng/mL、低浓度质控50.0ng/mL、几何平均值中浓度质控1000ng/mL、算术平均值中浓度质控10000ng/mL、高浓度质控15000ng/mL。
在其中一些实施例中，所述高效液相色谱串联质谱检测方法中标准曲线样本和质控样本的制备方法包括：
在空白血浆中加入所述混合标准曲线样本工作溶液制备标准曲线样本；在空白血浆中加入所述混合质控样本工作溶液，制备质控样本。
在其中一个实施例中，所述标准曲线样本中，丹参酮I、丹参酮IIA、丹酚酸B、丹参素、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和Rb1的浓度分别为1.00ng/mL、2.00ng/mL、4.00ng/mL、8.00ng/mL、20.0ng/mL、80.0ng/mL、200ng/mL、800ng/mL、1600ng/mL和2000ng/mL。
在其中一个实施例中，所述质控样本中，丹参酮I、丹参酮IIA、丹酚酸B、丹参素、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和Rb1的浓度分别为定量下限质控1.00ng/mL、低浓度质控2.50ng/mL、几何平均值中浓度质控50.0ng/mL、算术平均值中浓度质控500ng/mL、高浓度质控750ng/mL。
在其中一个实施例中，所述待测血浆样品溶液的制备为：精密吸取血浆样品50μL，依次加入内标(卡马西平)20μL(50ng/mL)、甲醇230μL，涡旋5min，充分混匀，10000rpm下4℃离心10min，取上清液200μL进样分析；所述待测组织样品溶液的制备为：取冷冻脏器在室温自然解冻，在冰浴中剪碎，按照1:2(w/v)比例加入生理盐水、匀浆，精密吸取100μL匀浆液，依次加入内标(卡马西平)20μL(50ng/mL)、甲醇460μL，涡旋5min，充分混匀，以10000rpm、4℃离心10min，取上清液200μL进样分析。
在其中一些实施例中，所述复方丹参制剂由包括丹参、三七和冰片的原料制备而成；所述复方丹参制剂包括复方丹参口服液、复方丹参气雾剂、复方丹参含片、复方丹参胶囊、复方丹参片、复方丹参颗粒、复方丹参滴丸、复方丹参喷雾剂或复方丹参软胶囊。
在其中一些实施例中，所述血浆为人或动物的血浆。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
(1)溶液的配制
储备溶液的制备：
称取适量复方丹参制剂各主要成分丹参酮I、丹参酮IIA、丹酚酸B、丹参素、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的标准品，分别溶解于适量80％甲醇水溶液中，制得浓度分别为1.00mg/mL的标准品储备溶液。将七份浓度皆为1.00mg/mL的标准品储备溶液等体积混合，加入适量80％甲醇水溶液，制得七种成分浓度皆为0.100mg/mL的混合标准品储备溶液。
取适量的卡马西平标准品，溶解于80％甲醇水溶液中，制得浓度为1.00mg/mL的卡马西平储备溶液。
标准曲线工作溶液的制备：
用80％甲醇水溶液稀释七种成分浓度皆为0.100mg/mL混合标准品储备溶液，得到浓度分别为20.0ng/mL、40.0ng/mL、80.0ng/mL、160ng/mL、400ng/mL、1600ng/mL、4000ng/mL、16000ng/mL、32000ng/mL和40000ng/mL的混合标准曲线样本工作溶液；
质控工作溶液的制备：
用80％甲醇水溶液稀释七种成分浓度皆为0.100mg/mL混合标准品储备溶液，得到浓度分别为定量下限质控20.0ng/mL、低浓度质控50.0ng/mL、几何平均值中浓度质控1000ng/mL、算术平均值中浓度质控10000ng/mL、高浓度质控15000ng/mL的混合质控样本工作溶液。
用80％甲醇水溶液稀释上述卡马西平储备溶液，制得浓度为50.0ng/mL的内标工作溶液。
标准曲线血浆样本的制备：
向380μL的空白血浆中加入20.0μL上述混合标准曲线工作溶液，混合均匀，得到复方丹参制剂各成分(丹参酮I、丹参酮IIA、丹酚酸B、丹参素、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和Rb1)的浓度分别为：1.00ng/mL、2.00ng/mL、4.00ng/mL、8.00ng/mL、20.0ng/mL、80.0ng/mL、200ng/mL、800ng/mL、1600ng/mL和2000ng/mL的标准曲线血浆样本。
质控血浆样本的制备：
向380μL的空白血浆中加入20.0μL上述混合质控工作溶液，混合均匀。得到复方丹参制剂各成分(丹参酮I、丹参酮IIA、丹酚酸B、丹参素、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和Rb1)的浓度分别为：定量下限质控1.00ng/mL、低浓度质控2.50ng/mL、几何平均值中浓度质控50.0ng/mL、算术平均值中浓度质控500ng/mL、高浓度质控750ng/mL的质控血浆样本。
(2)样本前处理
血浆样本前处理(待测血浆样品溶液的制备)：精密吸取大鼠血浆样本50μL，依次加入内标(卡马西平)20μL(50ng/mL)、甲醇230μL，涡旋5min，充分混匀，10000rpm下4℃离心10min，取上清液200μL，待进样分析。
组织分布样本前处理(待测组织样品溶液的制备)：将大鼠的脏器(心、肝、脾、肺、肾、脑)在冰浴中剪碎、按照1：2(w/v)比例加入生理盐水、匀浆，精密吸取100μL匀浆液，依次加入内标(卡马西平)20μL(50ng/mL)、甲醇460μL，涡旋5min，充分混匀，以10000rpm、4℃离心10min，取上清液200μL，待进样分析。
(3)液相色谱条件
仪器设备：Shimadzu LC-30AD液相色谱系统。
色谱柱：UPLC XBridge BEH C18超高效色谱柱(1.7μm，2.1x100mm)，Waters；柱温设置为40℃，自动进样器温度设置为15℃。
流动相A为0.1％甲酸水溶液；流动相B为100％甲醇。总流速为0.30mL/min。
流动相洗脱程序为：0～0.5分钟，10％流动相A-90％流动相B；0.5～2.0分钟，5％流动相A-95％流动相B；2～2.2分钟，90％流动相A-10％流动相B；2.2～3.0分钟，90％流动相A-10％％流动相B；2.4～3分钟，90％流动相A-10％流动相B。
质谱切换阀程序为：0至1分钟，B阀(进入废液)；1至2分钟，A阀(进入质谱)；2至3分钟，B阀(进入废液)。
洗针液：50％甲醇。洗针模式为外部冲洗；冲洗速度：35μL/sec；冲洗端口液体：R1；冲洗液体积：500μL；冲洗模式：进针前后冲洗；冲洗浸润时间：0秒；冲洗方法：仅端口冲洗；冲洗时间：2秒；
进样体积为3.00μL，丹参酮I、丹参酮IIA、丹酚酸B、丹参素、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、IS(卡马西平)的保留时间分别为1.87，1.92，1.56，0.62，1.63，1.65，1.74，1.68min。
(4)质谱条件
仪器设备：Sciex Qtrap5500质谱系统。
离子化模式：电喷雾离子源(ESI)；正离子模式(Positive)；多反应监测(MRM)。
离子源参数：气帘气(CUR)：25psi；离子源气体1(Gas1)：50psi；离子源气体2(Gas2)：50psi；离子源喷雾电压(IS)：5500V；离子源温度(TEM)：550℃；分辨率Q1/Q3(Resolution Q1/Q3)：Unit/Unit；碰撞气(CAD)：Medium；暂停时间(MR Pause)：20msec；质谱采集时间为3.00min。
监测离子对四极杆参数：
丹参酮I：离子对：277→249；去簇电压：120.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：28.00eV；停留时间：100.0msec；
丹参酮IIA：离子对：295→277；去簇电压：120.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：21.00eV；停留时间：100.0msec；
丹酚酸B：离子对：717.3→519.2；去簇电压：-50.0V；入口电压：-10.00V；出口电压：-16.00V；碰撞能量：-25.00eV；停留时间：100.0msec；
丹参素：离子对：197→135；去簇电压：-50.0V；入口电压：-10.00V；出口电压：-16.00V；碰撞能量：-23.00eV；停留时间：100.0msec；
三七皂苷R1：离子对：935.3→755.5；去簇电压：120.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：28.00eV；停留时间：100.0msec；
人参皂苷Rg1：离子对：823.2→643.3；去簇电压：120.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：45.00eV；停留时间：100.0msec；
人参皂苷Rb1：离子对：1131.5→365.1；去簇电压：120.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：53.00eV；停留时间：100.0msec；
卡马西平：离子对：237→1954；去簇电压：120.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：25.00eV；停留时间：100.0msec。
1.方法学验证
①专属性
结果显示大鼠空白血浆中内源性杂质不干扰七种有效成分的测定，大鼠空白血浆在七种有效成分处无色谱峰。
②最低定量限和线性范围
大鼠血浆中复方丹参制剂所含七种化合物的最低定量限为1.00ng/mL，线性范围为1.00-2000ng/mL，七种化合物的R2在0.9912～0.9961之间。
③准确度和精密度
配置定量下限质控1.00ng/mL、低浓度质控2.50ng/mL、几何平均值中浓度质控50.0ng/mL、算术平均值中浓度质控500ng/mL、高浓度质控750ng/mL的质控血浆样本，每一浓度6样本分析，连续测定3天，根据当日标准曲线计算QC(质控)样品浓度，求得每一浓度的RE值及RSD值，具体如表2所示。
表2
④回收率
低浓度、中浓度、高浓度质控样本分别配制6个样品，并同时提取18个不含待测物但含有内标的对照样本(混合基质)。对照样本提取完后，将在提取液中加入化合物保证与低中高提取样本理论浓度一致。待测物提取回收率的计算：R(％)＝100％×C/S，C为QC样品中待测物的峰面积，S为对照样中待测物的峰面积，具体如表3所示。
表3
2.检测结果
大鼠口服灌胃给药复方丹参制剂1小时后，测得大鼠血浆样本和组织样本中丹参酮I、丹参酮IIA、丹酚酸B、丹参素、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Rb1的浓度如表4所示，七种化合物标准品和卡马西平标准品的标准色谱图如图1-8所示。
表4
| 血浆样本(ng/mL) | 组织分布样本(肝脏，ng/g) | |
| 丹参酮I | 6.98 | 23.7 |
| 丹参酮IIA | 32.3 | 193 |
| 丹酚酸B | 673 | 0.00 |
| 丹参素 | 283 | 25.1 |
| 三七皂苷R<sub>1</sub> | 88.1 | 86.2 |
| 人参皂苷Rg<sub>1</sub> | 156 | 311 |
| 人参皂苷Rb<sub>1</sub> | 3050 | 151 |
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (7)
1.一种复方丹参制剂七种成分血浆或组织浓度的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述复方丹参制剂由包括丹参、三七和冰片的原料制备而成；包括以下步骤：
（1）储备溶液的制备：
取标准品丹参酮I、丹参酮IIA、丹酚酸B、丹参素、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和Rb1，分别溶解于80±5%甲醇水溶液中，制得标准品储备溶液；将标准品储备溶液混合，得到混合标准品储备溶液；
取卡马西平溶解于80±5%甲醇水溶液中，制得卡马西平储备溶液；
（2）工作溶液的制备：
分别用80±5%甲醇水溶液稀释所述混合标准品储备溶液，制得混合标准曲线样本工作溶液和混合质控样本工作溶液；
用80±5%甲醇水溶液稀释所述卡马西平储备溶液，制得内标工作溶液；
（3）待测样品溶液的制备：
待测血浆样品溶液的制备：取血浆样品，加入内标工作溶液和甲醇，离心，取所得上清液作为待测血浆样品溶液；
待测组织样品溶液的制备：取组织样品，匀浆，在所得匀浆液中加入内标工作溶液和甲醇，离心，取所得上清液作为待测组织样品溶液；
（4）将步骤（3）所得待测样品溶液进行液相色谱分离；将液相色谱分离后的样品进行质谱分析；
所述液相色谱分离所采用的洗脱方式为：以0.1±0.02%甲酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，进行梯度洗脱；所采用的液相色谱柱为：XBridge BEH C18 UPLC Column；
所述梯度洗脱的过程包括：
0～0.5分钟， (10±5)%流动相A-(90±5)流动相B；
0.5～2.0分钟， (5±5)%流动相A-(95±5)流动相B；
2～2.2分钟， (90±5)%流动相A-(10±5)流动相B；
2.2～3.0分钟，(90±5)%流动相A-(10±5)流动相B；
其中，所述质谱分析的条件包括：
离子化模式：电喷雾离子源；正离子模式；多反应监测；
离子源参数：气帘气：25psi；离子源气体1：50psi；离子源气体2：50psi；
离子源喷雾电压：5500±10V；
离子源温度：550±10℃；
分辨率Q1/Q3：Unit/Unit；
碰撞气：Medium；
暂停时间：20±1 msec；
质谱采集时间为3.00±0.2min。
2.根据权利要求1所述的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述液相色谱的色谱条件包括：
流速：0.3±0.1mL/min；
进样体积：3.00±0.5μL；
柱温：40±5℃；
自动进样器温度：15±3℃；
洗针液： 50±5%甲醇水溶液；
洗冲速度：30-40μL/sec；
洗针液体积：400-600μL。
3.根据权利要求1所述的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述质谱分析中，各成分的四级杆质谱条件为：
丹参酮I：离子对：277→249；去簇电压：120.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：28.00eV；停留时间：100.0 msec；
丹参酮IIA：离子对：295→277；去簇电压：120.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：21.00eV；停留时间：100.0 msec；
丹酚酸B：离子对：717.3→519.2；去簇电压：-50.0V；入口电压：-10.00V；出口电压：-16.00V；碰撞能量：-25.00eV；停留时间：100.0 msec；
丹参素：离子对：197→135；去簇电压：-50.0V；入口电压：-10.00V；出口电压：-16.00V；碰撞能量：-23.00eV；停留时间：100.0 msec；
三七皂苷R1：离子对：935.3→755.5；去簇电压：120.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：28.00eV；停留时间：100.0 msec；
人参皂苷Rg1：离子对：823.2→643.3；去簇电压：120.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：45.00eV；停留时间：100.0 msec；
人参皂苷Rb1：离子对：1131.5→365.1；去簇电压：120.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：53.00eV；停留时间：100.0 msec；
卡马西平：离子对：237→194；去簇电压：120.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：25.00eV；停留时间：100.0 msec。
4.根据权利要求1-3任一项所述的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，步骤（3）中，所述甲醇与所述血浆样品或所述匀浆液的体积比为4-6：1；
和/或，步骤（3）中，所述离心的温度为3-5℃；所述离心的转速为8000-12000rpm；所述离心的时间为8-12min。
5.根据权利要求1-3任一项所述的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所采用的液相色谱质谱联用仪的型号为Shimadzu LC 30AD液相色谱仪联合Sciex Qtrap 5500质谱仪，所采用的操作系统为Analyst 1.6.3。
6.根据权利要求1-3任一项所述的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述复方丹参制剂为复方丹参口服液、复方丹参气雾剂、复方丹参胶囊、复方丹参片、复方丹参颗粒、复方丹参滴丸或复方丹参喷雾剂。
7.根据权利要求1-3任一项所述的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述血浆为人或动物的血浆；和/或，所述高效液相色谱串联质谱检测方法中标准曲线样本和质控样本的制备方法包括：
在空白血浆中加入所述混合标准曲线样本工作溶液，制备标准曲线样本；在空白血浆中加入所述混合质控样本工作溶液，制备质控样本。
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