CN109115904B

CN109115904B - 一种定坤丹uplc指纹图谱的构建方法及其应用

Info

Publication number: CN109115904B
Application number: CN201810825827.4A
Authority: CN
Inventors: 王佩义; 张爱荣; 郝晋琪; 秦雪梅; 王楠; 高晓霞
Original assignee: Shanxi Guangyuyuan Traditional Chinese Medicine Co ltd
Current assignee: Shanxi Guangyuyuan Traditional Chinese Medicine Co ltd
Priority date: 2018-07-25
Filing date: 2018-07-25
Publication date: 2021-02-02
Anticipated expiration: 2038-07-25
Also published as: CN109115904A

Abstract

本发明公开了一种定坤丹UPLC指纹图谱的构建方法及其应用，属于中药技术领域。将供试品溶液和对照品溶液分别进行超高效液相色谱分析，色谱条件为以0.1%甲酸水为流动相A，以0.1%甲酸甲醇为流动相B，进行梯度洗脱，柱温30℃，进样量5μL，流速0.2mL/min，检测波长280nm，分析定坤丹指纹图谱信息共获得22个共有峰。采用国家药典委员会制定的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，对供试品溶液、对照品溶液的液相色谱进行数据匹配，即得标准指纹图谱。本发明建立的定坤丹指纹图谱能够较全面的反映定坤丹的物质信息，可准确有效评价和控制定坤丹的质量。

Description

一种定坤丹UPLC指纹图谱的构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及中药指纹图谱的构建方法，特别涉及一种定坤丹UPLC指纹图谱的构建方法，及其在定坤丹质量监控方面的应用。

背景技术

定坤丹是由红参、鹿茸、西红花、三七、白芍、熟地黄、当归、白术、枸杞子、黄芩、香附、茺蔚子、川芎、鹿角霜、阿胶、延胡索等药味经加工制成的大蜜丸，可滋补气血，调经舒郁。该方组方十分复杂，药味众多，为保持这一中药大复方不同批次产品具有稳定的功效，就必须制定严格的企业内控质量标准。2015版《中国药典》规定定坤丹的质量控制标准包括：显微鉴别枸杞子、白术、黄芩、甘草；薄层鉴别当归、川芎、枸杞子、白芍、红参、三七对照药材以及芍药苷、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Re、人参皂苷Rg₁、三七皂苷R₁对照品；含量测定规定本品每丸含红参和三七以人参皂苷Rg₁（C₄₂H₇₂O₁₄）计，不得少于3.0mg。因定坤丹成分复杂，其中任何一种药材均不能评价整体复方的质量，一个或几个化学成分则更不能够准确评价复方的质量。现行质量控制标准并不能反映复方的整体质量。

从整体上综合分析评价定坤丹方可提升复方质量均一性，故可利用高效液相色谱建立定坤丹的指纹图谱，综合反映不同生产批次定坤丹主要成分差异，为其内在质量特征评价和等级分类提供科学依据。目前，关于定坤丹的高效液相色谱指纹图谱研究尚未见文献报道，为保障患者用药安全有效，本发明建立了一种适用于定坤丹质量控制的指纹图谱检测方法。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种定坤丹UPLC指纹图谱的构建方法及其应用，该方法可以客观、全面、准确的评价定坤丹的质量，具有方法简单、操作方便、耗时短的优势，对控制定坤丹的内在质量具有重要意义。

本发明采用的技术方案是：一种定坤丹UPLC指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：

（1）供试品溶液的制备

取定坤丹切碎，称取1g，精密称定，加等量硅藻土，研匀，加入甲醇50ml，超声处理至少30min，滤过，旋转蒸发回收溶剂，残渣加甲醇溶解并转移至10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；

（2）对照品溶液的制备

精密称取没食子酸、5-羟甲基糠醛、芍药内酯苷、芍药苷、阿魏酸、甘草苷、黄芩苷、藁本内酯对照品并溶于甲醇，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为对照品溶液；

（3）色谱条件

色谱柱：Water Acquity UPLC HSS T3，1.8μm；流动相以0.1%甲酸水为流动相A，以0.1%甲酸甲醇为流动相B，进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为：

0min时，流动相A 所占的体积比为98%，流动相B所占的体积比为2%；

5min时，流动相A 所占的体积比为93%，流动相B所占的体积比为7%；

16min时，流动相A所占的体积比为56%，流动相B所占的体积比为44%；

17.5min时，流动相A所占的体积比为56%，流动相B所占的体积比为44%；

38min时，流动相A所占的体积比为15%，流动相B所占的体积比为85%；

41min时，流动相A所占的体积比为5%，流动相B所占的体积比为95%；

45min时，流动相A所占的体积比为98%，流动相B所占的体积比为2%；

柱温：30℃；进样量：5μL；流速：0.2mL/min；紫外检测波长：280nm；

（4）分别精密吸取步骤（1）制备的供试品溶液和步骤（2）制备的对照品溶液5μL注入超高效液相色谱仪中按照步骤（3）的色谱条件进行测定，分别得到供试品和对照品UPLC图谱；

（5）采用国家药典委员会制定的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，对供试品溶液和对照品溶液的UPLC图谱进行数据匹配，得到标准指纹图谱。

进一步地，所述步骤（1）中甲醇加入量为每克定坤丹中加入50ml甲醇；所述步骤（1）中超声提取时间为30min。

进一步地，所述步骤（3）中梯度洗脱条件为：

0-5 min，流动相B与流动相A的体积比由2%：98%到7%：93%；

5-16 min，流动相B与流动相A的体积比由7%：93%到44%：56%；

16-17.5 min，流动相B与流动相A的体积比为44%：56%；

17.5-38 min，流动相B与流动相A的体积比由44%：56%到85%：15%；

38-41 min，流动相B与流动相A的体积比由85%：15%到95%：5%；

41-45 min，流动相B与流动相A的体积比由95%：5%到2%：98%。

进一步地，所述定坤丹UPLC指纹图谱中有22个共有峰，通过对照品对照及UPLC-MS指认，鉴别了定坤丹UPLC指纹图谱中8种成分，其中1号峰为没食子酸，2号峰为5-羟甲基糠醛，3号峰为芍药内酯苷，4号峰为芍药苷，5号峰为阿魏酸，6号峰为甘草苷，10号峰为黄芩苷，18号峰为藁本内酯。

进一步地，所述定坤丹UPLC指纹图谱可用于定坤丹品质评价和质量控制。

本发明的有益效果是：本发明提供的定坤丹成分指纹图谱构建方法，操作方便、方法简便快捷；所构建的指纹图谱可用于定坤丹的质量标准控制，较单独测定一个或几个成分的含量来判定复方整体质量的方法能更加全面的反映复方总体特征，科学评价定坤丹的质量，提升产品一致率，从而使产品的疗效得到保障；且经过流动相筛选，以及紫外全扫描和多波长对比，最终选择了相对全面表征的280nm波长下的指纹图谱，避免了因测单一波长、成分而判定制剂整体质量的片面性，减少了为质量达标而人为处理的可能性。

附图说明

图1是定坤丹UPLC对照特征图谱。

图2是对照品UPLC图谱。

图3是19批次定坤丹UPLC指纹图谱叠加图。

具体实施方式

为了能更清楚地理解本发明的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

本发明所述定坤丹，由山西广誉远国药有限公司提供。

实施例1：定坤丹UPLC指纹图谱的构建

1.1仪器

Waters Acquity UPLC H-Class 超高效液相色谱系统、Empower 工作站含四元梯度泵、自动进样器、PDA 检测器（Waters 公司）；超声清洗仪（KQ2200DB型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司）；万分之一天平（CPA225D电子分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司）；Milli-Q Integral Water Purification System（美国Millipore公司）。

1.2试药与试剂

样品：定坤丹（山西广誉远国药有限公司），批号为139170643、139170644、139170645、139170647、139170648、139170649、139170650、139170651、139170652、139170653、139170654、139170655、139170656、139170657、139170658、139170659、139170661、139170662、139170663。

试剂：超纯水；甲醇、甲酸为色谱纯（美国Fisher公司）；其他试剂均为分析纯。

1.3供试品溶液的制备

取不同生产批次的定坤丹切碎，分别称取1g，精密称定，加等量硅藻土，研匀，加入50ml甲醇，超声提取30min，滤过，旋转蒸发回收溶剂，残渣加甲醇溶解并转移至10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

1.4对照品溶液的制备

精密称取没食子酸、5-羟甲基糠醛、芍药内酯苷、芍药苷、阿魏酸、甘草苷、黄芩苷、藁本内酯对照品适量，溶于甲醇，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为对照品溶液。

1.5色谱条件

色谱柱：Water Acquity UPLC HSS T3，1.8μm；流动相为0.1%甲酸水（A）和0.1%甲酸甲醇（B），流速为0.2 mL/min，柱温30℃，紫外检测波长为280 nm；分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液5μL注入超高效液相色谱仪，进行梯度洗脱，梯度洗脱条件见下表：

1.6共有峰的确定

记录色谱图得到定坤丹指纹图谱，分析定坤丹指纹图谱信息（如图1所示），所得指纹图谱包括22个共有峰，通过对照品对照（如图2所示）及UPLC-MS指认，鉴别了定坤丹UPLC指纹图谱中8种成分，其中1号峰为没食子酸，2号峰为5-羟甲基糠醛，3号峰为芍药内酯苷，4号峰为芍药苷，5号峰为阿魏酸，6号峰为甘草苷，10号峰为黄芩苷，18号峰为藁本内酯。

实施例2：定坤丹对照特征图谱及相似度评价

取不同生产批次的定坤丹共19批，分别按照已建立的定坤丹指纹图谱分析方法进行分析，得到19批次样品的UPLC指纹图谱叠加图（如图3所示）。以上述19批次样品的色谱谱图为基础，使用药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2008版）进行数据处理得到共有模式特征图谱，即为定坤丹对照特征图谱R（如图1所示）。19批次样品各主要色谱峰保留时间基本一致，确定了该检测条件分离较好的22个峰为其共有色谱峰。计算19批次定坤丹指纹图谱和对照特征图谱之间的相似度，发现样品与对照图谱的相似度均大于0.92，结果见表1。

本发明建立的定坤丹指纹图谱操作方法具有良好的重复性和稳定性，因此本发明方案具有可行性，能够用于定坤丹的综合质量控制。

本发明提供的定坤丹成分指纹图谱构建方法，操作方便、方法简便快捷。所构建的指纹图谱可用于定坤丹的质量标准控制，较单独测定一个或几个成分的含量来判定复方整体质量的方法能更加全面的反映复方总体特征，科学评价定坤丹的质量，提升产品一致率，从而使产品的疗效得到保障。且经过流动相筛选，以及紫外全扫描和多波长对比，最终选择了相对全面表征的280nm波长下的指纹图谱，避免了因测单一波长、成分而判定制剂整体质量的片面性，减少了为质量达标而人为处理的可能性。

以上所述仅是本发明的较佳实施方式，故凡依本发明专利申请范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均包括于本发明专利申请范围内。

Claims

1.一种定坤丹UPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）供试品溶液的制备

（2）对照品溶液的制备

（3）色谱条件

2.根据权利要求1所述的定坤丹UPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述步骤（1）中甲醇加入量为每克定坤丹中加入50ml甲醇；所述步骤（1）中超声提取时间为30min。

3.根据权利要求1所述的定坤丹UPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述定坤丹UPLC指纹图谱中有22个共有峰，通过对照品对照及UPLC-MS指认，鉴别了定坤丹UPLC指纹图谱中8种成分，其中1号峰为没食子酸，2号峰为5-羟甲基糠醛，3号峰为芍药内酯苷，4号峰为芍药苷，5号峰为阿魏酸，6号峰为甘草苷，10号峰为黄芩苷，18号峰为藁本内酯。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的定坤丹UPLC指纹图谱构建方法的应用，其特征在于：所述定坤丹UPLC指纹图谱可用于定坤丹品质评价和质量控制。