SK279188B6 - Vakcínová kompozícia spôsob jej prípravy a použiti - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Tento vynález sa vzťahuje na formulácie vakcín, na postupy ich prípravy a na ich použitie v lekárstve. Vynález sa osobitne vzťahuje na vakcíny, obsahujúce QS21, netoxické a pomocou HPLC čistené podiely, získané z kôry Quillaja Saponaria Molina a 3-De-O-acylovaný monofos-foryllipid A(3D-MPL).

Doterajší stav techniky

3-De-O-acylovaný monofosforyllipid A je známy z GP 2220 211 (Ribi). Chemicky je to zmes 3-deacylovaného monofosforyllipidu A s 4, 5 alebo 6 acylovanými reťazcami a je vyrábaný spoločnosťou Ribi Immunochem Montana.

QS21 je netoxická, pomocou HPLC čistená frakcia saponínu z kôry juhoamerického stromu Quillaja Saponina Molina. Spôsob prípravy QS21 je zverejnený (ako QA21 v patente USA č. 5 057 540).

Tento vynález jc založený na prekvapivom zistení, že formulácie, ktoré obsahujú kombináciu QS21 a 3D-MPL, synergicky zvyšujú imunitnú odozvu k danému antigénu.

Napríklad formulácia vakcíny protilátky malárie, RTS,S v kombinácii s 3D-MPL a QS21 spôsobuje silné synergické vyvolanie CS proteínovej špecificky cytotoxickej T lymfocytovej (CTL) odozvy v slezine.

RTS je hybridný proteín pozostávajúci v podstate z C-koncových častí cirkumsporozoitového (CS) proteínu P.falciparum, spojeného prostredníctvom štyroch aminokyselín pre-S₂ podielu povrchového antigénu B-hepatitídy. Jeho úplná štruktúra je zverejnená v medzinárodnej prihláške vynálezu č. PCT/EP92/02591, publikovanej pod č. WO93/10152, nárokujúcej právo prednosti UK No. 912 4390.7. RTS sa pripraví ako lipoproteinová zložka vylisovaním kvasiniek a ak je lisovanie súčasne vykonávané s S antigénom z HBV, tak sa získa zmes zložiek známa ako RTS,S.

Pozorovanie, že je možné vyvolať silne cytolytické T-lymfocytové (CTL) odozvy je významné, nakoľko tieto odozvy sa u určitých živočišných modelov ukázali ako možnosť vyvolania ochrany proti chorobe.

Podstata vynálezu

Teraz sa ukázalo, že kombinácia dvoch adjuvansov QS21 a 3D-MPL s rekombinantnou zložkou antigénu RTS, vyvolá v slezine silnú CS proteínovú špecifickú CTL odozvu. Samotné QS21 tiež zvyšuje vyvolanie CTL, zatiaľ čo 3D-MPL nie. Môže sa povedať, že kombinácia účinkuje synergicky, nakoľko kombinácia má väčší vplyv ako je súčet jednotlivých vplyvov každého z adjuvansov. Synergia medzi týmito dvoma adjuvansmi na vyvolanie CTL je prekvapivá a má dôležité implikácie na použitie rekombinantných molekúl ako vakcín na vyvolanie CTL sprostredkovanej imunity.

Vyvolanie CTL je ľahko viditeľné, keď sa cieľový antigén syntetizuje intracellulárne, t. j. infekciou vírusom, vnútrobunkovými baktériami, alebo v tumoroch, pretože peptidy vytvárané proteolytickým štiepením protilátky sa môžu vhodnou reakčnou cestou spájať s molekulami typu I na membráne bunky. Vopred vytvorené rozpustné antigény mimo bunku vo všeobecnosti však nedosiahnu uvedenú reakčnú cestu a nespôsobia CTL odozvu. Preto aj keď bežné neživc vakcíny vyvolajú protilátku a T-pomocnú odozvu, nevyvolajú vo všeobecnosti pomocou CTL sprostredkovanú imunitu. Kombinácia dvoch adjuvansov QS21 a 3D-MPL môže prekonať toto vážne obmedzenie vakcín, založených na rekombinantných proteinoch a vyvolať širšie spektrum imunitných odoziev.

CTL špecifická pre CS proteín sa ukázala v modelovom systéme myši ako ochrana proti malárii (Romero et ah, Náture 341, 323 (1989)). Pri pokusoch s ľuďmi sa ukázalo vyvolanie CTL špecifickej pre CS epitópy, keď boli dobrovoľníci imunizovaní použitím ožiarených sporozoitov P. falciparum a tak boli ochránení proti následnému vyvolaniu malárie (Malik et. al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 88,3300(1991)).

Schopnosť vyvolať CTL špecifickú pre antigén, podávaný ako rekombinantné molekuly, je relevantná pre vývoj vakcíny proti malárii, ale použitie ožiarených sporozoitov by bolo nepraktické, ak sa vychádza z možnosti výroby a z podstaty imunitnej odozvy.

Popri vakcínach proti malárii je schopnosť vyvolať CTL odozvy výhodná pri vakcínach proti vírusu Herpes Simplex, cytomegalovírusu, ľudskému vírusu imunitnej nedostatočnosti a všeobecne vo všetkých prípadoch, v ktorých má patogén nejaký intracelulámy vývojový stupeň.

CTL špecifická pre známe nádorové antigény môže byť vyvolaná podobne kombináciou rekombinantných antigénov a dvoch adjuvant. To by umožnilo vývoj protirakovinových vakcín.

V určitých sústavách bola kombinácia 3D-MPL a QS21 schopná synergicky zvýšiť tvorbu gama-interferónu (INF). Autori tohto vynálezu ukázali synergickú schopnosť 3DMPL a QS21 s využitím antigénu proti Herpes Simplex, známemu ako gD2t. gD2t je rozpustný odbúraný glykoproteín D z HSV - 2 a tvorí sa v CHO bunkách podľa metodológie Bermana et al., Science 222, 524 až 527.

Vylučovanie gama-IFN je spojené s ochrannými odozvami proti intracelulámym patogenom vrátane parazitov, baktérií a vírusov. Aktivácia makrofágov pomocou gamaIFN zvyšuje vnútrobunkové hynutie mikróbov a zvyšuje výraznosť Fc receptorov. Tiež môže vzniknúť priama cytotoxicita, osobitne synergicky s lymfotoxínom (ďalší produkt TH1 buniek). Gama-IFN tiež vyvoláva a súčasne je aj produktom NK buniek, ktoré sú hlavným prirodzeným zdrojom ochrany. Odozvy typu TH1, či už gama-IFN alebo iným mechanizmom, výhodne podporujú IgG2a imunoglobulínové izotypy.

Glykoproteín D je lokalizovaný na obale vírusu a nachádza sa tiež v cytoplazme infikovaných buniek (Eisenberg R.J. et al., J.of Virol. 1980,35,428 - 435). Pozostáva z 393 aminokyselín vrátane signálneho peptidu a má molekulovú hmotnosť približne 60 kD. Tento je pravdepodobne najlepšie opísaný zo všetkých glykoproteinov z obalu HSV vírusu (Cohen et al., J.Virology 60, 157 - 166). Je známy tým, že má ústrednú úlohu in vivo pri pripájaní sa vírusov k membránam buniek. Navyše sa ukázalo, že glykoproteín D je schopný vybudiť neutralizujúce protilátky in vivo (Eing et al., J.Med.Virology 127, 59 - 65). Latentný HSV 2 vírus však stále môže byť reaktivovaný a môže vyvolať recidívu choroby napriek vysokému titru neutralizujúcich protilátok v pacientovom sére. Preto je zrejmé, že samotná schopnosť vyvolať neutralizujúce protilátky je na adekvátne zvládnutie choroby nedostatočná.

Aby sa zabránilo recidíve choroby, je nutná vakcína na stimuláciu nielen neutralizujúcich protilátok, ale aj na stimuláciu bunkovej imunity, sprostredkovanej T - bunkami, osobitne cytotoxickými T - bunkami.

V tomto prípade gD2t je glykoproteín D HSV 2 z 308 aminokyselín, ktorý zahŕňa amimokyseliny 1 až 306 prirodzene sa vykytujúceho glykoproteínu s prísadou asparagínu a glutamínu na C - termináloch odbúraného proteínu. Táto forma proteínu zahŕňa signálny peptid a štiepi sa, aby poskytla vhodný proteín, pozostávajúci z 283 aminokyselín. Príprava tohto proteínu vo vaječných bunkách čínskeho škrečka bola opísaná v Genentech's European patent EP-B-139 417.

Na formulácie vakcíny podľa tohto vynálezu sa prednostne používa vhodný odbúraný gylokoproteín D (rgD2t), alebo ekvivalentné proteíny, vylučované z buniek cicavcov.

Formulácie podľa tohto vynálezu veľmi účinne vyvolávajú obrannú imunitu morčiat proti modelovému vírusu genital herpes. Už veľmi nízke dávky antigénu (t. j. už 5 pg rgD2t) chránia morčatá proti primárnej infekcii a stimulujú tiež špecifickú neutralizujúcu odozvu protilátok. Využívajúc formuláciu podľa tohto vynálezu, ukázali autori vynálezu tiež odozvu, sprostredkovanú zdrojovou bunkou typu TH1 u myší.

Tento vynález teda predkladá vakcínu, alebo farmaceutickú formuláciu, obsahujúcu antigén v spojení s 3 deacylovaným monofosforyllipidom A a QS21. Taká formulácia je vhodná na široký rozsah mono a polyvalentných vakcín.

Vakcínové formulácie obsahujú výhodne antigén alebo antigénovú kompozíciu, schopnú vyvolať imunitnú odozvu proti ľudskému alebo inému živočíšnému patogénu, pričom antigén alebo antigénová kompozícia je odvodená od HIV - 1 (ako je gp 120 alebo gp 160), od vírusu imunitnej nedostatočnosti mačkovitých zvierat, ľudského alebo zvieracieho vírusu herpes ako je gD alebo jeho deriváty, alebo ranný proteín ako je ICP27 z HSV1 alebo HSV2, cytomegalovírus (osobitne ľudský) (ako je gB alebo jeho deriváty), vírus Varicella Zoster (ako je gpl, II alebo III), alebo z vírusu hepatitídy, ako je vírus hepatitídy B napríklad povrchový antigén hepatitídy B alebo jeho deriváty, vírus hepatitídy A, vírus hepatitídy C a hepatitídy E, alebo z ďalších vírusových patogénov ako je respiračný syncytiálny vírus, vírus ľudského papillómu a vírus chrípky, alebo odvodený z bakteriálnych patogénov ako sú salmonela, neisseria, borrelia (napríklad OspA alebo OspB, alebo ich deriváty), alebo chlamydia, alebo bordetella napríklad P.69, PT a FHA, alebo odvodená z parazitov ako je plasmodium alebo toxoplasma.

Formulácie môžu tiež obsahovať protinádorový antigén a môžu tak byť užitočné pri imunoterapeutickej liečbe rakovín.

Formulácia môže byť tiež užitočná na využitie s ľahkými zložkami ako je opísané v medzinárodnej prihláške vynálezu č. PCT/GB92/00824 a v medzinárodnej prihláške vynálezu č. PCT/GB92/00179.

Deriváty povrchového antigénu hepatitídy B sú v tejto oblasti známe a zahŕňajú medzi inými také PreSl, PreS2 S antigénové zostavy, bližšie opísané v prihláškach európskych patentov EP-A-414 374, EP-A-0304 578 a EP 198 474.

Z ďalšieho aspektu zahŕňa tento vynález vakcíny, ako sú v ňom opísané, na použitie v lekárstve.

Pomer QS21 : 3D-MPL bude typicky v rozsahu poriadkov 1 : 10 až 10 : 1, výhodne 1 : 5 až 5 : 1 a významne často 1:1. Výhodný rozsah z hľadiska optimálneho synergického účinkuje 2,5 : 1 až 1 : 1 3D MPL : QS21. QS21 a 3D MPL budú prítomné vo vakcíne v humánnej medicíne v rozsahu 1 pg až 100 pg, výhodne 10 pg až 50 pg v jednej dávke. Často nebude vakcína vyžadovať žiadny špecifický nosič a môže byť formulovaná vo vodnom alebo inom far maceutický prípustnom pufri. V niektorých prípadoch môže byť výhodné, ak vakcína podľa tohto vynálezu bude ďalej obsahovať aluminu, alebo môže byť tiež predložená ako emulzia oleja vo vode, alebo vo vhodnom rozpúšťadle. Môže obsahovať napríklad lipozómy, mikrosféry alebo enkapsulované protilátkové zložky.

Príprava vakcíny je vo všeobecnosti opísaná v New Trends and Developments in Vaccines, vydavateľ Voliér et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978. Enkapsulácia lipozómov je opísaná napríklad Fullerom,v patente USA 4 235 8777. Spájanie proteínov do makromolekúl je napríklad zverejnené Likhitom v patente US 4 372 945 a Armorom et al., v patente USA 4 474 757.

Množstvo proteínu v každej dávke vakcíny je zvolené tak, aby u typického očkovanca vyvolalo imunoochrannú odozvu bez významných vedľajších škodlivých účinkov. Toto množstvo sa bude meniť v závislosti od toho, aký špecifický imunogén sa použije a ako je predložený. Všeobecne sa predpokladá, že každá dávka bude pozostávať z 1 až 1000 pg proteínu, výhodne 2 až 100 pg, najviac výhodne 4 až 40 pg. Optimálne množstvo pre určitú vakcínu môže byť zistené bežnými štúdiami, zahrňujúcimi sledovanie príslušných imunitných odoziev u subjektov. Po prvotnej vakcinácii môže subjekt dostať jednu alebo viacej zvýšených a primerane nastavených imunizácií.

Formulácie podľa tohto vynálezu sa môžu použiť tak na profylaktické, ako aj na terapeutické účely.

Podľa ďalšieho aspektu zahŕňa vynález spôsob liečby, pozostávajúci z podávania účinného množstva vakcíny podľa tohto vynálezu pacientovi.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Synergia medzi 3D-MPL a QS21 na vyvolanie vylučovania gama-interferónu.

Aby sa vyskúšala schopnosť formulácií, založených na 3D-MPL a QS21 adjuvantách rgD2t, vyvolať zdrojovou bunkou sprostredkované imunitné odozvy·, vakcinovali sa skupiny Balb/c myši a skúšali sa ich bunky z lymfatických uzlín na vylučovanie gama-interferónu ako jc opísané ďalej.

Formulácie rgD2t

V tomto experimente sa porovnali tri formulácie adjuvansov:

i) rgD2tv3D-MPL ii) rgD2tvQS21 iii) rgD2tv3D-MPL/QS21

Tieto formulácie sa pripravili nasledovne. rgD2t sa vytvoril v CHO bunkách a zodpovedal 1 až 283 aminokyselinám HSV-2gD aje pripravený podľa metodológie Bermana (supra) a EP 0139417.

*rgD2t/3D-MPL pg rgD2t na dávku sa inkubovalo 1 hodinu za miešania pri teplote miestnosti. Potom sa miešalo s 3D-MPL suspenziou ( 25 pg/dávku). Objem sa upravil na 70 pl/dávku s použitím roztoku chloridu sodného (5 M, pH 6,5 ± 0,5) a vody pre injekcie, čím sa dosiahla konečná koncentrácia 0,15 M chloridu sodného. pH sa udržiavalo na hodnote 6,5 ±0,5.

*rgD2t/QS21 pg rgD2t na jednu dávku sa inkubovalo 1 hodinu pri teplote miestnosti za miešania. Pridal sa vodný roztok QS21 (lOpg na jednu dávku) a s použitím roztoku chloridu sodného (5 M, pH 6,5 ± 0,5) a vody pre injekcie sa upravil objem na 70 μΐ. pH sa udržiavalo na hodnote 6,5 ± 0,5 a konečná koncentrácia chloridu sodného na 0,15 M.

*rgD2t/3D-MPL/QS21 pg rgD2t na jednu dávku sa inkubovalo 1 hodinu pri teplote miestnosti za miešania. Pridalo sa 25 pg/dávku 3D-MPL vo forme vodnej suspenzie. Konečný objem 70 pl sa dosiahol prídavkom vodného roztoku QS21 (lOpg/dávku), vody pre injekcie a roztoku chloridu sodného (5 M, pH 6,5 ± 0,5). pH sa udržiavalo pri 6,5 ± 0,5 a koncentrácia chloridu sodného na 0,15 M.

Imunizácia

Do vankúšikov chodidiel zadných končatín myší sa injektovalo 35 pl formulácie na jednu končatinu. Každá myš teda obdržala 70 pl. Imunizácia sa vykonala v dňoch 0 a 14. Zvieratá boli utratené v 21. dni.

Gama-interferónová skúška

Popliteálne bunky lymfatických uzlín imunizovaných myší boli stimulované použitím rgD2t v množstve 10, 1, 0,1 a 0 pg/ml. Kultúry sa naniesli vždy paralelne trojmo na 96-jamkovú (s okrúhlym dnom) mikrotitračnú platničku s použitím 2.10⁵ zodpovedajúcich buniek a 2.10⁵ ožiarených (3000 rad) syngénych prirodzených buniek sleziny. Kultivačné médium bolo RPMI 1640 s 10 % zárodočného teľacieho séra. Použili sa alikvótne podiely po 100 pl kultivačného média z každého aj opakovaného pokusu a boli nakvapkané na stanovenie gama-interferónu. Kultúry sa skúšali v čase 72 hodín. Do všetkých pokusov sa zahrnula kontrolná skupina s použitím ConA (Boehringer Mannheim) v množstve 5 pg/ml. Táto bola vždy pozitívna.

Vylučovanie gama-intcrfcrónu sa stanovovalo s použitím komerčnej ELISA skúšobnej súpravy, vyrábanej firmou Holland Biotechnology (a distribuovanej firmou Gibco). Skúšky sa vykonali trojmo vždy na 100 pl nakvapkaného supernatantu z troch paralelných jamiek.

Pri skúškach sa pozorovala sekrécia gama-interferónu vyššia ako pozadie vo všetkých troch skupinách formulácií (pozri tabuľku). Navyše sa pozoroval synergický vplyv medzi QS21 a 3D-MPL. Zatiaľ čo každé z adjuvant osobitne indukuje bunky schopné sekrécie gama-IFN v odozve na rgD2t, ich kombinácia vyvoláva väčšiu sekréciu ako je dvojnásobok súčtu jednotlivých odoziev.

Výsledky

Synergia medzi QS21 a 3D-MPL na vyvolanie sekrécie gama-interferónu.

Imunizácia:		QS21/3D-MPL rgD2t	QS21 rgD2t	3D-MPL rgD2t
In vitro	10.0	1351	1105	515
stinulácia	1.0	914	116	192
(iig/nl gD2t):	0.1	335	<50	143
	0.0	101	<50	139

Gama-interferón je vyjadrený v jednotkách pg/ml.

Tabuľka jasne ukazuje synergický účinok kombinovanej vakcíny na vyvolanie sekrécie gama-interferónu.

Synergia medzi 3D-MPL a QS21 na vyvolanie CTL.

Na zhodnotenie schopnosti RTS,S zložiek vo formuláciách založených na adjuvantách 3D-MPL a QS21, imunizovali sa skupiny myší typu B10.BR a bunky ich sleziny sa stimulovali in vitro a skúšali cytotoxickou skúškou na L bunky, vyjadrujúce CS proteín.

Formulácia RTS,S zložiek.

RTS,S zložky sa formulovali v troch rozdielnych kompozíciách:

1. RTS.S zložky ((10 pg) s QS21 (10 pg) a 3D-MPL(25 Rg))·

2. RTS,S zložky ((10 pg) s QS21 (10 pg)),

3. RTS,S zložky s ( 3D-MPL(25 pg)).

Formulácie sa pripravili nasledovne: RTS,S/3D-MPL pg RTS,S zložiek na jednu dávku sa inkubovalo pri teplote miestnosti za miešania, potom sa zmiešalo s vodnou suspenziou 3D-MPL (25 pg na dávku). Objem sa upravil na 70 pl/dávku s použitím roztoku chloridu sodného (5 M, pH 6,5 ± 0,5) a vody pre injekcie, čím sa dosiahla konečná koncentrácia 0,15 M chloridu sodného (pH sa udržiavalo na hodnote 6,5 ± 0,5).

RTS,S/QS21 pg RTS,S zložiek na jednu dávku sa inkubovalo 1 hodinu pri teplote miestnosti za miešania. Pridal sa vodný roztok QS21 (lOpg na jednu dávku) a s použitím roztoku chloridu sodného (5 M, pH 6,5 ± 0,5) a vody pre injekcie sa upravil objem na 70 pl. pH sa udržiavalo na hodnote 6,5 ± 0,5 a konečná koncentrácia chloridu sodného na 0,15 M.

RTS,S/3D-MPL/QS21 pg RTS,S zložiek na jednu dávku sa inkubovalo 1 hodinu pri teplote miestnosti za miešania. Primiešalo sa 25 pg/dávku 3D-MPL vo forme vodnej suspenzie. Konečný objem 70 pl sa dosiahol prídavkom vodného roztoku QS21 (lOpg/dávku), vody pre injekcie a roztoku chloridu sodného (5 M, pH 6,5± 0,5) a pH sa udržiavalo pri 6,5 ± 0,5 a koncentrácia chloridu sodného na 0,15 M.

Imunizácia myší s RTS,S zložkami

Od štyroch do šiestich týždňov staré samičky myší druhu B10.BR(H-2^k) sa kúpili od IFFA CREDO (Francúzsko). Imunizovali sa skupiny po 3 zvieratách intra-injekciou 35 pl do vankúšika chodidla antigénovej formulácie do každého zadného údu. Zvieratá boli zaťažené aj druhou rovnakou dávkou antigénu injekciou dva týždne neskôr.

Stimulácia anti CS CTL in vitro.

Dva týždne po druhej injekcii sa oddelili slezinové bunky a stimulovali sa in vitro s použitím syngénnych fibroblastov, nakazených s circumsporozoitovými proteínovými génmi (kloň 7G8) baktérie P.falciparum. Tieto nakazené bunky sú opísané v článku Kumar, S. et al., Náture, 334,258-260(1988).

Kultivácia prebiehala v RPMI 1640 prostredí, doplnenom s 10 % zárodočného teľacieho séra, inaktivovaného teplom a zvyčajnými prísadami za podmienok bežne známych odborníkom v tejto oblasti.

Zodpovedajúce bunky sa kultivovali v koncentrácii 10⁶ buniek /ml za prítomnosti 10⁵ CS- transfektantov na ml. Na zabránenie rastu transfektantných buniek sa ožiarili s použitím dávky 2.10⁴ rad. Výživa kultúr sa uskutočňovala výmenou 1/2 kultivačného prostredia v dňoch 3 a 6. Skúšky cytolytickej aktivity sa vykonali v 7. dni.

Cytotoxická skúška na anti-CS CTL

Príslušné kultúry buniek sa oddelili, premyli a zmiešali v pomeroch, ktoré sa menili od 100 : 1 do 0,3 : 1 s konštantným počtom 2 000 cieľových buniek v objeme 200 pl média v 96-jamkových platničkách s tvarom jamiek V.

SK 279188 Β6

Ako cieľové bunky sa použili syngénne fibroblastové bunky, ktoré boli značkované s ⁵¹Cr.

Použili sa dva rozdielne druhy cieľových buniek;

1. L bunky

2. CS transfektantné L bunky.

Tieto sú opísané v: Kumar, S. et al., Náture 334, 258-260(1988).

Po šiestich hodinách inkubácie pri 37 °C sa stanovilo množstvo rádioaktivity uvoľnenej do prostredia lýziou cieľových buniek. Cytolytická aktivita sa vyjadrila ako % špecifickej lýzie:

Výsledky:

	% špecifickej lýzie pr	formulácii
delové bunky	Poaer	l.RTS.S/	2.RTS.S/	3.RTS.S/
	zdroj/ ciel	QS21/ 3D-MPL	OS21	3D-MFL
CS transfek-	100	58	17	1
tantné	30	53	10	0
bunky	10	47	5	1
	3	27	1	0
	1	11	0	0
	0,3	2	-2	-1
L bunky	100	3	-2	5
	30	-2	1	4
	10	0	-1	2
	3	0	3	4
	1	. ι	4	2
	0,3	3	1	2

Imunizácia myší typu B10.BR s RTS,S s prísadami QS21 a 3D-MPL (formulácia č.l) vyvolala vysokú úroveň CTL v slezine, špecifickú pre circumsporozoitovú zložku RTS,S. Imunizácia s RTS,S zložkami s prísadami QS21 (formulácia č.2) tiež vyvolala CTL v slezine, ale iba na úrovni 1/30 úrovne zistenej pre formuláciu č.l. RTS,S s 3D-MPL (formulácia č.3) nevyvolala CTL.

Pretože cieľové bunky použité pri tejto skúške nepredstavujú molekuly MHC II.triedy, môžu byť zdrojové bunky považované za CD8⁺, trieda I s obmedzenou CTL.

Ďalšie formulácie

Povrchový antigén hepatitídy B, alum, 3D-MPL a QS21.

Spôsob prípravy povrchového antigénu Hepatitis B (HBsAg) je dobre doložená. Pozri napríklad Harford et al.: Develop.Biol.Standard 54, 125(1984), Gregg et al., Biotechnology 5, 479(1987), EP-A-0 226 846 a

EP-A-299 108 a tam uvedené odkazy.

3D-MPL sa získal od firmy RIBI Immunochem. QS21 sa získal od Cambridge Biotech a hydroxid hlinitý (Alum) sa získal od firmy Superfos pod názvom Alhydrogel.

Pripravil sa značný počet formulácií na štúdiá bunkami sprostredkovanej imunity myší a opíc druhu Rhesus.

Formulácia 1 sa pripravila vo fosforečnanovom pufri (pH 6,8) tak, aby pozostávala z nasledujúcich zložiek, vzťahované na 60 pl dávku.

pg HBsAg pg A1(OH)₃ pg 3D - MPL pg QS21 lOmM PO₄ ³0,15 M NaCl

Formulácia sa pripravila nasledovne. 20 pg HBsAg/dávku sa inkubovalo s A1(OH)₃ počas 1 hodiny pri teplote miestnosti za mierneho pretrepávania. Pridal sa 3D-MPL vo forme vodnej suspenzie. Formulácia sa dokončila prídavkom QS21, fosforečnanového pufra a chloridu sodného. Inkubovala sa jednu hodinu pri teplote miestnosti. Výsledná formulácia mala pH medzi 6,5 a 7,0 a v štúdiách sa použila do chodidla myší.

Formulácia 2 sa pripravila vo fosforečnanovom pufri (pH 6,8) tak, aby obsahovala ďalej uvedené zložky na jednu 200 pl dávku.

pg HBsAG

100 pg A1(OH)₃ pg 3D-MPL pg QS21 mM PO₄ ³0,15 M NaCl

Formulácia sa pripravila ďalej uvedeným spôsobom. HBsAg a hydroxid hlinitý· sa spolu inkubovali počas jednej hodiny pri teplote miestnosti za mierneho pretrepávania. Formulácia sa dokončila prídavkom 3D-MPL vo forme vodnej suspenzie a QS21, fosforečnanového pufra a roztoku chloridu sodného. Formulácia sa znova inkubovala počas 30 minút. pH formulácie sa nastavilo medzi 6,5 a 7,0 a formulácia sa použila na štúdium humorálnej imunity myší.

Formulácia 3 sa pripravila podobným spôsobom vo fosforečnanovom pufri (pH 6,5 až 7,0) tak, aby obsahovala na jednu jednomililitrovú dávku zložky:

pg HBsAg

500 pg A1(OH)₃ pg 3D - MPL pg QS21

Formulácia sa použila pri štúdiách na opiciach.

Závery

Výsledkom kombinácie dvoch adjuvansov QS21 a3D-MPL s rekombinantnou zložkou antigénu RTS,S je vyvolanie mohutnej CS proteínovej špecifickej CTL v slezine. QS21 samotný zvyšuje vyvolanie CTL, zatiaľ čo 3D-MPL nie. Môže sa povedať, že pôsobia spôsobom synergie, pretože kombinácia oboch má taký vplyv, ktorý je väčší ako súčet jednotlivých vplyvov samostatných adjuvant. Synergia pre vyvolanie CTL medzi týmito dvoma adjuvantami je prekvapivé pozorovanie, ktoré podporuje pozorovanie autorov patentu o synergii medzi QS21 a 3D-MPL pri vyvolaní odozvy T buniek schopných vylučovania gamainterferónu. Táto odozva je odozvou na stimuláciu rozpustným rekombinantným proteínom gD2t. Uvedené zistenie má dôležité implikácie z hľadiska použitia rekombinantných molekúl ako vakcíny na vyvolávanie CTL sprostredkovanej imunity, pretože kombinácia dvoch adjuvant QS21 a 3D-MPL môže prekonať doterajšie vážne obmedzenia vakcín, založených na rekombinantných proteínoch a vyvoláva širšie spektrum imunitných odoziev ako doteraz.

Údaje o sprostredkovanej imunogenicite myšacích buniek poukazujú na to, že na QS21 založené formulácie rgD2t vyvolávajú synergickú odozvu TH1 typu T buniek (vylučovanie gama-IFN).

Ukázalo sa, že takéto TH1 typu T bunky sú zapojené do vyvolávania hypersensitívnej odozvy oneskoreného typu u myší. Vlastné údaje autorov vynálezu v profylaxii HSV chorôb poukazujú na to, že súčasné vyvolanie neutralizačných protilátkových titrov a antigénových špecifických DTH odoziev poskytuje najlepšiu ochranu proti chorobe Herpes Simplex.

Súhrnom možno uviesť, že uvedené údaje priviedli autorov k názoru, že QS21 formulácie rgD2t môžu byť účinné pri vyvolávaní ochranej odozvy proti HSV chorobe. Uvedené údaje poukazujú na nepredpokladaný synergický účinok medzi 3D-monofosforyllipidom A a QS21 na vyvolanie vylučovania gama-IFN z antigénových špecifických T buniek. Táto synergia môže byť vyjadrená ako zlepšená schopnosť vyvolať ochrannú odozvu proti HSV chorobe.

Pri ochrane morčiat proti chorobe sú tieto formulácie skutočne účinné.

Claims (10)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Vakcínová kompozícia pozostávajúca z antigénu a/alebo antigénovej kompozície, QS21 a 3-De-O-acylovaného monofosforyllipidu A (3D-MPL).
2. 2. Vakcína podľa nároku 1, v ktorej pomer QS21 : 3D-MPLjeod 1 : 10 do 10: 1.
3. 3. Vakcínová kompozícia podľa nároku 1 alebo 2, schopná u cicavcov vyvolať cytolytickú odozvu T buniek k antigénu alebo k antigénovej kompozícii.
4. 4. Vakcínová kompozícia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, schopná stimulovať tvorbu gama-interferónu.
5. 5. Vakcínová kompozícia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, v ktorom pomer QS21 : 3D-MPL je od 1 : 1 do 1 : 2,5.
6. 6. Vakcínová kompozícia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, pozostávajúca z antigénu alebo antigénovej kompozície získanej z ľudského vírusu imunitnej nedostatočnosti, vírusu imunitnej nedostatočnosti mačkovitých zvierat, vírusu Herpes simplex - typu 1, vírusu Herpes simplex - typu 2, ľudského cytomegalovírusu, vírusu Hepatitis A, B, C alebo E, respiračného syncytálneho vírusu, vírusu ľudského papillómu, vírusu chrípky, Salmonella, Neisseria, Borélia, Chlamýdia, Bordetela, Plasmodium alebo Toxoplasma.
7. 7. Spôsob prípravy vakcínovej kompozície podľa nárokov 1 až 5, zahrnujúci zmiesenie QS21 a 3D-MPL s antigénom alebo antigénovou kompozíciou.
8. 8. Vakcína podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, v ktorej antigén je tumorový antigén.
9. 9. Použitie kompozície podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, na výrobu vakcín na profylaktické liečenie vírusových, bakteriálnych alebo parazitámych nákaz.
10. 10. Použitie kompozície podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, na výrobu vakcín na imunoterapeutické liečenie vírusových, bakteriálnych, parazitámych nákaz alebo rakoviny.