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PT2818483T - Composição medicinal para tratamento e/ou prevenção de cancro - Google Patents

Composição medicinal para tratamento e/ou prevenção de cancro Download PDF

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Publication number
PT2818483T
PT2818483T PT137523536T PT13752353T PT2818483T PT 2818483 T PT2818483 T PT 2818483T PT 137523536 T PT137523536 T PT 137523536T PT 13752353 T PT13752353 T PT 13752353T PT 2818483 T PT2818483 T PT 2818483T
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PT
Portugal
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antibody
ser
seq
caprin
gin
Prior art date
Application number
PT137523536T
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English (en)
Inventor
Okano Fumiyoshi
Ido Takayoshi
Minamida Yoshitaka
Saito Takanori
Original Assignee
Toray Industries
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Publication date
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Description

EP2818483B1
DESCRIÇÃO
COMPOSIÇÃO MEDICINAL PARA TRATAMENTO E/OU PREVENÇÃO DE
CANCRO
Campo Técnico A presente invenção relaciona-se com a nova utilização de um anticorpo contra CAPRIN-1 ou um fragmento do mesmo num fãrmaco, tal como um agente terapêutico e/ou preventivo para cancro.
Antecedentes da Técnica 0 cancro é a primeira causa principal de morte. Esta doença é atualmente tratada essencialmente por terapia cirúrgica em conjunto com radioterapia e/ou quimioterapia. Apesar do recente desenvolvimento de novas técnicas cirúrgicas ou da descoberta de novos agentes anticancerígenos, o tratamento existente de cancro tem uma consequência insuficientemente melhorada, exceto relativamente a alguns tipos de cancro. Com os recentes avanços da biologia molecular ou imunologia do cancro, os anticorpos que reagem especificamente com cancro, os antigénios de cancro que são reconhecidos por células T citotóxicas, os genes que codificam esses antigénios de cancro e afins foram identificados, aumentando as expectativas relativamente à terapia de cancro específica que visa os antigénios de cancro (Literatura de Não Patente 1) .
Para reduzir a reação adversa de terapia de cancro, é desejado que os péptidos, os polipéptidos ou as proteínas reconhecidas como antigénios do cancro existam raramente nas células normais e existam especificamente nas células cancerígenas. Em 1991, Boon et al. (Ludwig Institute for Cancer Research, Bélgica) isolaram um antigénio de melanoma humano MAGE1 reconhecido por células T CD8 positivas através de um método de clonagem de expressão ADNc EP2818483B1 utilizando linhas de células cancerígenas autólogas e células T reativas com cancro (Literatura de Não Patente 2) . Em seguida, foi apresentado um método SEREX (serological identification of antigens by recombinant expression cloning - identificação serológica de antigénios através de clonagem de expressão recombinante), que adota uma abordagem de clonagem de expressão de genes para identificar antigénios de tumor reconhecidos por anticorpos produzidos em resposta a cancro autólogo in vivo num paciente com cancro (Literatura de Mão Patente 3 e Literatura de Patente 1). De acordo com este método, alguns antigénios de cancro que são raramente expressados nas células normais e são especificamente expressados no cancro foram isolados (Literatura de Não Patente 4 a 9) . Além disso, ao utilizar uma parte do antigénio de cancro como um alvo, a terapia celular utilizando imunócitos que reagem especificamente com antigénios de cancro ou imunoterapia específica de cancro utilizando vacinas ou afins compreendendo antigénios de cancro encontra-se sob ensaio clínico que visa alguns dos antigénios de cancro isolados.
Nos últimos anos, emergiram no mundo vários fãrmacos de anticorpo para tratamento de cancro que visam proteínas antigénicas nas células cancerígenas. Estes fãrmacos receberam atenção por causa da respetiva eficácia certa como agentes terapêuticos específicos de cancro. Contudo, uma grande maioria de proteínas antigénicas visadas pelos fãrmacos é igualmente expressada nas células normais. Como consequência da administração dos anticorpos, as células normais que expressam os antigénios, bem como células cancerígenas, são danificadas, resultando desvantajosamente numa reação adversa. Deste modo, se os antigénios de cancro especificamente expressados na superfície de células cancerígenas puderem ser identificados e os anticorpos que visam os antigénios puderem ser utilizados como fármacos, é possível esperar que estes fármacos de anticorpo alcancem EP2818483B1 tratamento com menos reação adversa. A proteína de ativação citoplásmica e associada a proliferação 1 (CAPRIN-1) tem sido conhecida como uma proteína intracelular que é expressada após a ativação ou divisão celular de células normais de repouso e forma grânulos de stress citoplásmico com ARNs na célula para participar na regulação de transporte e tradução de ARNms. Constatou-se que esta proteína é especificamente expressada na superfície de células cancerígenas e encontra-se em estudo como um alvo de fármacos de anticorpo para tratamento de cancro (Literatura de Patente 2). A Literatura de Patente 3 divulga anticorpos anti-CAPRIN-1 que têm atividade anticancerígena e corresponde à fonte de alguns dos anticorpos comparativos utilizados nos exemplos aqui apresentados.
Lista de Citação Literatura de Patente
Literatura de Patente 1: Patente de Estados Unidos n.° 5698396
Literatura de Patente 2: W02010/016526
Literatura de Patente 3: W02011/096517 Literatura de Não Patente
Literatura de Não Patente 1: Tsuyoshi Akiyoshi, "Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy", 1997, Vol. 24, pãgs. 55 a 519 (Japanese Journal of Cancer and
Chemotherapy Publishers Inc., Japão)
Literatura de Não Patente 2: Bruggen P. et al., Science, 254: 1643 a 1647 (1991)
Literatura de Não Patente 3: Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A., 92: 11 810 a 11 813 (1995)
Literatura de Não Patente 4: Int. J. Cancer, 72: 965 a 971 (1997)
Literatura de Não Patente 5: Cancer Res., 58: 1034- 1041 (1998)
Literatura de Não Patente 6: Int. J. Cancer, 29: 652 a EP2818483B1 658 (1998)
Literatura de Não Patente 7: Int. J. Oncol., 14: 703 a 708 (1999)
Literatura de Não Patente 8: Cancer Res., 56: 4766 a 4772 (1996)
Literatura de Não Patente 9: Hum. Mol. Genet 6: 33 a 39, 1997
Sumário da Invenção Problema Técnico
Um objetivo da presente invenção é produzir um anticorpo que vise CAPRIN-1 especificamente expressada na superfície de células cancerígenas e seja superior na atividade antitumoral relativamente a anticorpos convencionais, e fornecer utilização do mesmo como um agente terapêutico e/ou preventivo para cancro.
Solução para o Problema
As funcionalidades da presente invenção são conforme apresentado em seguida. A presente invenção fornece um anticorpo ou um fragmento do mesmo que tem reatividade imunológica com um polipéptido CAPRIN-1 parcial que tem a sequência de aminoãcidos mostrada na SEQ ID NO: 5, e uma composição farmacêutica para tratamento e/ou prevenção de cancro, compreendendo o anticorpo ou fragmento do mesmo como um ingrediente ativo.
Na forma de realização acima, o cancro é cancro da mama, cancro do rim, cancro pancreãtico, cancro do intestino grosso, cancro do pulmão, tumor cerebral, cancro gástrico, cancro da cérvix uterina, cancro do ovário, cancro da próstata, cancro da bexiga urinária, cancro esofágico, leucemia, linfoma, fibrossarcoma, mastocitoma ou me1anoma.
Numa forma de realização, o anticorpo é um anticorpo monoclonal ou um anticorpo policlonal.
Noutra forma de realização, o anticorpo é um anticorpo EP2818483B1 humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo de cadeia única ou um anticorpo multiespecífico (p. ex, um anticorpo biespecífico).
Efeitos Vantajosos da Invenção 0 anticorpo contra CAPRIN-1 de acordo com a presente invenção danifica mais fortemente as células cancerígenas do que os anticorpos convencionais contra CAPRIN-1. Deste modo, o anticorpo contra CAPRIN-1 de acordo com a presente invenção é útil no tratamento ou na prevenção de cancro. Descrição das Formas de Realização 0 anticorpo de acordo com a presente invenção é um anticorpo que reconhece e se une a um polipéptido parcial predeterminado de CAPRIN-1 e tem atividade antitumoral. Mais especificamente, o anticorpo de acordo com a presente invenção é um anticorpo que reconhece (isto é, tem reatividade imunológica com) um polipéptido parcial de uma proteína CAPRIN-1 (polipéptido CAPRIN-1 parcial) que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 5. Na presente invenção, constatou-se que este anticorpo apresenta uma atividade antitumoral mais forte do que um anticorpo convencional contra uma proteína CAPRIN-1. A presente invenção relaciona-se com todos os anticorpos que se unem a fragmentos de proteínas CAPRIN-1 conforme descrito acima e apresentam atividade antitumoral. 0 anticorpo contra CAPRIN-1 de acordo com a presente invenção pode ser qualquer tipo de anticorpo que possa exercer atividade antitumoral e inclui, por exemplo, anticorpos recombinantes (p. ex., anticorpos sintéticos, anticorpos multiespecíficos (p. ex., anticorpos biespecíficos), anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos e anticorpos de cadeia única (scFv)), anticorpos humanos e respetivos fragmentos de anticorpo (p. ex., Fab, F(ab')2 e Fv). Estes anticorpos e fragmentos dos mesmos podem ser preparados através de métodos geralmente conhecidos dos peritos na técnica. Desejavelmente, o EP2818483B1 anticorpo de acordo com a presente invenção tem reatividade imunológica com uma proteína CAPRIN-1 ou um polipéptido parcial da mesma, isto ê, une-se (de preferência, une-se especificamente) à proteína CAPRIN-1 através de reação antigénio-anticorpo. Neste contexto, a expressão "une-se especificamente à proteína CAPRIN-1" significa que o anticorpo se une especificamente à proteína CAPRIN-1 sem se unir substancialmente a outras proteínas. 0 anticorpo de acordo com a presente invenção é preferencialmente um anticorpo monoclonal e, contudo, pode ser um anticorpo policlonal desde que os anticorpos homogéneos possam ser produzidos de forma estável. No caso de um sujeito de teste humano, é desejável um anticorpo humano ou um anticorpo humanizado para evitar ou suprimir uma reação adversa. 0 anticorpo contra um polipéptido CAPRIN-1 de acordo com a presente invenção pode ser avaliado relativamente à respetiva atividade antitumoral, conforme descrito mais à frente, examinando in vivo a inibição de crescimento do tumor num animal portador de cancro ou examinando ex vivo a presença ou ausência de atividade citotóxica mediada por imunócitos ou complementos apresentada pelo anticorpo contra células tumorais que expressam o polipéptido. 0 sujeito de teste a receber o tratamento e/ou a prevenção de cancro de acordo com a presente invenção é um mamífero, tal como um ser humano, um animal de estimação, gado ou um animal para a prática de desporto, e é preferencialmente um ser humano.
Em seguida, a presente invenção será descrita em mais detalhe. cPreparação de antigénio para a preparação de anticorpos>
As proteínas ou os fragmentos das mesmas utilizados como antigénios de sensibilização para a obtenção do anticorpo contra CAPRIN-1 de acordo com a presente invenção não são limitados pela espécie animal que serve como as respetivas origens, incluindo seres humanos, cães, gatos, EP2818483B1 gado bovino, cavalos, ratinhos, ratos e galinhas. Contudo, as proteínas ou os fragmentos das mesmas são preferencialmente selecionados considerando a compatibilidade com as células principais para a utilização na fusão celular. Em geral, são preferidas as proteínas derivadas de mamífero. Particularmente, são preferidas as proteínas derivadas de ser humano. Por exemplo, quando CAPRIN-1 é CAPRIN-1 humana, é possível utilizar proteínas CAPRIN-1 humanas, péptidos parciais das mesmas ou células que expressam CAPRIN-1 humana.
As sequências de nucleõtidos e as sequências de aminoãcidos de CAPRIN-1 humana e homólogos da mesma podem ser obtidas, por exemplo, acedendo a GenBank (NCBI, E.U.A.) e utilizando um algoritmo, tal como BLAST ou FASTA (Karlin e Altschul, Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A., 90: 5873 a 5877, 1993 ; e Altschul et al. , Nucleic Acids Res. 25: 3389 a 3402, 1997).
Na presente invenção, com referência à sequência de nucleõtidos (SEQ ID NO: 1 ou 3) ou à sequência de aminoácidos (SEQ ID MO: 2 ou 4) de CAPRIN-1 humana, a CAPRIN-1 alvo é um ácido nucleico ou uma proteína que consiste numa sequência que tem 70 % a 100 %, preferencialmente 80 % a 100 %, mais preferencialmente 90 % a 100 %, ainda mais preferencialmente 95 % a 100 %, por exemplo, 97 % a 100 %, 98 % a 100 %, 99 % a 100 % ou 99,5 % a 100 % de identidade de sequência relativamente à sequência de nucleõtidos ou sequência de aminoácidos da ORF ou porção madura da referência (as sequências de aminoãcidos de SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4 em comparação umas com as outras diferem em resíduos de aminoácidos na seguinte posição 690). Neste contexto, o termo "% de identidade de sequência" significa uma percentagem (%) do número de aminoácidos idênticos (ou bases) relativamente ao número total (incluindo o número de espaços) de aminoácidos (ou bases) quando duas sequências são alinhadas de modo a EP2818483B1 que o grau máximo de semelhança ou identidade possa ser alcançado com ou sem espaços introduzidos.
Um fragmento que compreende um epítopo (ou um determinante antigénico) que corresponde à unidade mínima reconhecida pelo anticorpo e tem um comprimento que varia entre o comprimento de aminoácido do epítopo e menos do comprimento completo da proteína CAPRIN-1 pode ser utilizado como um fragmento de proteína CAPRIN-1. 0 epítopo refere-se a um fragmento de polipéptido que tem antigenicidade ou imunogenicidade nos mamíferos, preferencialmente seres humanos. A respetiva unidade mínima consiste em aproximadamente 7 a 12 aminoãcidos, por exemplo, 8 a 11 aminoácidos. 0 fragmento de proteína CAPRIN-1 para a utilização na preparação do anticorpo de acordo com a presente invenção é preferencialmente um fragmento que é reconhecido pelo anticorpo da presente invenção e compreende a sequência de aminoãcidos mostrada na SEQ ID NO: 5 (que corresponde a uma sequência das posições 42 9 a 444 na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou 4) ou uma sequência de aminoácidos que tem 80 % ou mais, preferencialmente 85 % ou mais, mais preferencialmente 90 % ou mais, ainda mais preferencialmente 95 % ou mais de identidade de sequência relativamente à sequência de aminoãcidos, ou compreende pelo menos um epítopo que consiste em aproximadamente 7 a 12 aminoãcidos consecutivos, por exemplo, 8 a 11 aminoãcidos consecutivos em qualquer uma destas sequências de aminoãcidos.
As proteínas CAPRIN-1 humanas acima e fragmentos de polipéptido compreendendo péptidos parciais dos mesmos podem ser sintetizados de acordo com métodos de síntese química, por exemplo, métodos Fmoc (fluorenilmetiloxicarbonilo) e tBoc (t-butiloxicarbonilo) (Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experimentation Course in English) 1, a Japanese Biochemical Societyr ed., "Protein EP2818483B1
Chemistry IV, Chemical Modification and Peptide Synthesis", Tokyo Kagaku Dojin Co., Ltd. (Japão), 1981). Igualmente, estes polipêptidos podem ser sintetizados através de métodos habituais utilizando vários sintetizadores de péptidos comercialmente disponíveis.
Em alternativa, os polinucleótidos que codificam os polipêptidos podem ser preparados utilizando abordagens de manipulação genética conhecidas na técnica (Sambrook et al. , Molecular Cloning, a 2a edição, "Current Protocols in Molecular Biology" (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel et al., "Short Protocols in Molecular Biology", a 3a edição, "A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995)", John Wiley & Sons; etc.) e incorporados em vetores de expressão, que são depois introduzidos em células hospedeiras de modo a que as células hospedeiras produzam os polipêptidos. Desta forma, é possível obter as proteínas CAPRIN-1 humanas de interesse ou os fragmentos de polipêptidos das mesmas.
Os polinucleótidos que codificam os polipêptidos podem ser facilmente preparados mediante abordagens de manipulação genética conhecidas na técnica ou métodos habituais utilizando sintetizadores de ácido nucleico comercialmente disponíveis. Por exemplo, um ADN compreendendo a sequência de nucleõtidos de um gene CAPRIN-1 humano pode ser preparado por PCR utilizando uma biblioteca de ADNc ou ADN cromossómico humano como um modelo e um par de primers concebidos de modo a serem capazes de ampliar a sequência de nucleõtidos. As condições de reação para esta PCR podem ser apropriadamente determinadas. Os exemplos das condições podem incluir, mas não se limitam a, 30 ciclos cada um envolvendo etapas de reação de 94 °C durante 30 segundos (desnaturação) , 55 °C durante 30 segundos a 1 minuto (têmpera), e 72 °C durante 2 minutos (alongamento) utilizando ADN polimerase termoestável (p. ex., Taq polimerase ou Pfu polimerase) e EP2818483B1 um tampão PCR que contém Mg2+, seguindo-se a reação a 72 °C durante 7 minutos. A abordagem PCR, as condições, etc. são descritas em, por exemplo, Ausubel et al. , "Short Protocols in Molecular Biology", 3a Edição, "A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology" (1995), John Wiley & Sons (particularmente, o Capítulo 15).
Igualmente, as sondas apropriadas ou os primers podem ser preparados com base nas informações sobre as sequências de nucleótidos de genes CAPRIN-1 e as sequências de aminoãcidos de proteínas CAPRIN-1, e utilizados no rastreio de, por exemplo, uma biblioteca de ADNc humano, para isolar o ADN desejado. Preferencialmente, essa biblioteca de ADNc é produzida a partir de células, órgãos ou tecidos que expressam proteínas CAPRIN-1. Os exemplos dessas células ou desses tecidos incluem células ou tecidos derivados de cancros ou tumores, tais como testículo, leucemia, cancro da mama, linfoma, tumor cerebral, cancro do pulmão, cancro pancreãtico, cancro do intestino grosso, cancro do rim, cancro gástrico, cancro da cérvix uterina, cancro do ovário, cancro da próstata, cancro da bexiga urinária, cancro esofágico, fibrossarcoma, mastocitoma ou melanoma. Estas operações, incluindo a preparação de sondas ou primers, a construção de uma biblioteca de ADNc, o rastreio da biblioteca de ADNc e a clonagem do gene de interesse, são conhecidas dos peritos na técnica e podem ser efetuadas de acordo com métodos descritos em, por exemplo, Sambrook et al. , "Molecular Cloning", a 2a edição, "Current Protocols in Molecular Biology" (1989), e Ausubel et al. (supra). Os ADNs que codificam as proteínas CAPRIN-1 humanas e os péptidos parciais das mesmas podem ser obtidos a partir do ADN assim obtido.
As células hospedeiras para receber os vetores de expressão podem ser qualquer célula capaz de expressar os polipéptidos acima. Os exemplos de células procarióticas incluem, mas não se limitam a, E. coli. Os exemplos de EP2818483B1 células eucarióticas incluem, mas não se limitam a: células de mamífero, tais como células de rim de macaco COSI, células de ovário de hamster chinês CHO, uma linha celular de rim embrionário humano HEK293, uma linha celular de pele embrionãria de ratinho NIH3T3, células de levedura, tais como levedura de produção e células de levedura de fissão, células de bicho-da-seda e óvulos Xenopus.
No caso da utilização de células procariõticas como as células hospedeiras, os vetores de expressão utilizados têm uma origem que permite a replicação nas células procarióticas, um promotor, um sítio de união de ribossoma, um sítio de multiclonagem, um terminador, um gene de resistência ao fãrmaco, um gene complementar auxotrófico, etc. Os exemplos de vetores de expressão para E. coli podem incluir série pUC, pBluescript II, sistemas de expressão pET e sistemas de expressão pGEX. Os ADNs que codificam os polipéptidos acima podem ser incorporados nesses vetores de expressão, com os quais as células hospedeiras procarióticas são depois transformadas, seguindo-se a cultura dos transformantes obtidos, de modo a que os polipéptidos codificados pelos ADNs sejam expressados nas células hospedeiras procariõticas. A este respeito, os polipéptidos podem ser expressados como proteínas de fusão com outras proteínas.
No caso da utilização de células eucarióticas como células hospedeiras, os vetores de expressão para células eucarióticas que têm um promotor, uma região de excisão-junção {splicing) , um sítio de adição de poli(A), etc. são utilizados como os vetores de expressão. Os exemplos desses vetores de expressão podem incluir vetores pKAl, pCDMS, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV, pRS, pcDNA3 e pYES2. Da mesma forma como apresentado acima, os ADNs que codificam os polipéptidos acima podem ser incorporados nesses vetores de expressão, com os quais as células hospedeiras eucarióticas são depois transformadas, EP2818483B1 seguindo-se a cultura dos transformantes obtidos, de modo a que os polipéptidos codificados pelos ADNs sejam expressados nas células hospedeiras eucarióticas. No caso de utilização de vetores de expressão, tais como pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-Nl ou pEGFP-Cl, os polipéptidos podem ser expressados como várias proteínas de fusão marcadas com etiqueta His (p. ex. , (His)6 a (His)i0), etiqueta FLAG, etiqueta myc, etiqueta HA, GFP ou afins.
Os vetores de expressão podem ser introduzidos nas células hospedeiras utilizando métodos bem conhecidos, tais como eletroporação, um método de fosfato de cálcio, um método de lipossoma, um método de DEAE dextrano, microinjeção, infeção virai, lipofeção e união a péptidos que penetram nas células. 0 polipéptido de interesse pode ser isolado e purificado a partir das células hospedeiras através de uma combinação de operações de separação conhecidas na técnica. Os exemplos das mesmas incluem, mas não se limitam a, tratamento com um desnaturante (p. ex., ureia) ou um tensioativo, aplicação de ultrassons (sonicação), digestão enzimática, salificação, precipitação e fracionamento de solventes, diálise, centrifugação, ultrafiltração, filtração em gel, SDS-PAGE, eletroforese de focalização isoelétrica, cromatografia de troca iónica, cromatografia hidrofóbica, cromatografia de afinidade e cromatografia de fase reversa.
Os antigénios assim preparados podem ser utilizados como antigénios de sensibilização conforme descrito posteriormente para a produção do anticorpo de acordo com a presente invenção. <Estrutura de anticorpo
Os anticorpos (imunoglobulinas) são normalmente glicoproteínas heteromultiméricas, cada uma compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. As imunoglobulinas, exceto para IgM, são glicoproteínas EP2818483B1 heterotetraméricas de aproximadamente 150 kDa, cada uma composta por duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Habitualmente, cada cadeia leve é ligada a uma cadeia pesada através de um único enlace de dissulfureto covalente, apesar de o número de enlaces de dissulfureto entre cadeias pesadas variar entre diferentes isotipos de imunoglobulina. Cada uma das cadeias pesadas e leves tem igualmente um enlace de dissulfureto intracadeia. Cada cadeia pesada tem um domínio variável (região VH) numa extremidade seguido por uma série de regiões constantes. Cada cadeia leve tem um domínio variável (região VL) numa extremidade e tem uma única região constante na outra extremidade. A região constante de cadeia leve é alinhada com a primeira região constante de cadeia pesada, enquanto o domínio variável de cadeia leve é alinhado com o domínio variável de cadeia pesada. Regiões específicas denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDRs) nos domínios variáveis de anticorpo apresentam uma variabilidade específica e transmitem especificidade de união ao anticorpo. As porções relativamente conservadas nas regiões variáveis denominam-se regiões marco conservadas (framework) (FRs). Cada um dos domínios variáveis completos de cadeia pesada e leve compreende quatro FRs ligadas através de três CDRs. Estas três CDRs denominam-· se CDRH1, CDRH2 e CDRH3 por esta ordem a partir do N-terminal da cadeia pesada. Igualmente, as CDRs denominam-se CDRL1, CDRL2 e CDRL3 na cadeia leve. A CDRH3 é mais importante para a especificidade de união do anticorpo relativamente ao respetivo antigénio. Além disso, as CDRs em cada cadeia são mantidas perto umas das outras pelas regiões FR e contribuem para a formação de um sítio de união ao antigénio no anticorpo, juntamente com CDRs na outra cadeia. As regiões constantes não contribuem diretamente para a união anticorpo-antigénio, mas apresentam várias funções efetoras, por exemplo, EP2818483B1 envolvimento na citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC), fagocitose mediada por união a um recetor Fcy, taxa de meia-vida/eliminação mediada por um recetor Fc neonatal (FcRn) e citotoxicidade dependente do complemento (CDC) mediada por um componente Clq na cascata de complementos. cPreparação de anticorpo> 0 anticorpo anti-CAPRIN-1 de acordo com a presente invenção significa um anticorpo com reatividade imunológica com uma proteína CAPRIN-1 de comprimento completo ou um fragmento da mesma. Particularmente, o anticorpo anti-CAPRIN-1 da presente invenção é um anticorpo que se une imunologicamente a um polipéptido parcial de uma proteína CAPRIN-1 (polipéptido CAPRIN-1 parcial) que corresponde a um péptido que consiste na sequência de aminoãcidos que contém epí topos mostrada na SEQ ID NO: 5.
Preferencialmente, o anticorpo da presente invenção reconhece um epítopo que consiste aproximadamente em 7 a 12 aminoãcidos consecutivos, por exemplo 8 a 11 aminoãcidos consecutivos, na sequência de aminoãcidos mostrada na SEQ ID NO: 5. Este anticorpo anti-CAPRIN-1 da presente invenção é capaz de se unir especificamente à proteína CAPRIN-1 de comprimento completo. 0 anticorpo da presente invenção pode ser obtido mediante seleção de um anticorpo que se une imunologicamente ao polipéptido que consiste na sequência de aminoãcidos mostrada na SEQ ID NO: 5 de acordo com um método habitual de entre anticorpos obtidos com proteínas CAPRIN-1 ou fragmentos das mesmas como antigénios.
Neste contexto, a "reatividade imunológica" significa a propriedade do anticorpo que se une ao antigénio CAPRIN-1 (proteína CAPRIN-1 de comprimento completo ou polipéptido parcial da mesma) in vivo. Através dessa união a CAPRIN-1, o anticorpo da presente invenção exerce a função de danificar (p. ex., matar, suprimir ou regredir) células tumorais. 0 anticorpo da presente invenção pode danificar EP2818483B1 tumores, por exemplo, cancro da mama, cancro do rim, cancro pancreãtico, cancro do intestino grosso (p. ex. , cancro do cólon), cancro do pulmão, tumor cerebral, cancro gástrico, cancro da cérvix uterina, cancro do ovário, cancro da próstata, cancro da bexiga urinária, cancro esofágico, leucemia, linfoma, fibrossarcoma, mastocitoma ou melanoma através de união à proteína CAPRIN-1. 0 anticorpo da presente invenção pode ser qualquer tipo de anticorpo. Os exemplos do tipo do anticorpo da presente invenção incluem anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos sintéticos, anticorpos multiespecíficos, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, anticorpos de cadeia única e fragmentos de anticorpo (p. ex., Fab, F(ab')2 e Fv). Igualmente, o anticorpo corresponde a qualquer classe de molécula de imunoglobulina, por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgA, IgD ou IgY, ou qualquer subclasse, por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl ou IgA2. 0 anticorpo pode ser ainda modificado por acetilação, formilação, amidação, fosforilação, PEGuilação ou afins, além de glicosilação.
Em seguida, serão mostrados exemplos de preparação de vários anticorpos.
Quando o anticorpo da presente invenção é um anticorpo monoclonal, por exemplo, uma linha celular de cancro da mama SK-BR-3 que expressa CAPRIN-1 é administrada a cada ratinho para imunização. 0 baço é extraído deste ratinho. Após a separação de células de baço, as células fundem-se com células de mieloma de ratinho. Os clones que produzem anticorpos que têm um efeito inibidor de crescimento de células cancerígenas são selecionados entre as células de fusão obtidas (hibridomas). Em alternativa, podem ser selecionados clones que produzem anticorpos que se unem a um polipéptido consistindo na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 5. Os hibridomas que produzem EP2818483B1 anticorpos monoclonais que têm um efeito inibidor de crescimento de células de cancro ou os hibridomas que produzem anticorpos monoclonais contra o polipêptido da SEQ ID NO: 5 ou afins são isolados e cultivados. 0 anticorpo da presente invenção pode ser preparado mediante purificação a partir do sobrenadante da cultura de acordo com um método de purificação de afinidade geral.
Os hibridomas de produção de anticorpos monoclonais podem ser preparados, por exemplo, conforme apresentado em seguida: primeiro, os animais são imunizados com antigénios de sensibilização de acordo com um método conhecido na técnica. Este método de imunização envolve geralmente a injeção de forma intraperitoneal ou subcutânea dos antigénios de sensibilização nos mamíferos. Especificamente, os antigénios de sensibilização são diluídos com, ou suspensos em, PBS (soro fisiológico tamponado com fosfato), soro fisiológico ou afins numa quantidade apropriada e depois misturados, se desejado, com uma quantidade apropriada de um adjuvante convencional, por exemplo, um adjuvante de Freund completo. Após a emulsificação, a emulsão resultante é administrada em cada mamífero diversas vezes a cada 4 a 21 dias. Em alternativa, pode ser utilizado um portador apropriado para a imunização com antigénios de sensibilização.
Após a confirmação de uma subida no nível do anticorpo desejado no soro do mamífero assim imunizado, são recolhidos imunócitos do mamífero e submetidos a fusão celular. Os exemplos preferidos dos imunócitos incluem particularmente células de baço.
As células de mieloma de mamífero são utilizadas como células principais parceiras para se fundirem com os imunócitos. Várias linhas celulares conhecidas na técnica, por exemplo, P3U1 (P3-X63AgSUl), P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123, 1548 a 1550), P3x63Ag8U.l ("Current Topics in Microbiology and Immunology" (1978) 81, 1 a 7), EP2818483B1 NS-1 (Kohler. G. e Mil stein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511 a 519), MPC-11 (Margulies. D. H. et al. , Cell (1976) 8,405 a 415), 5P2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269 a 270), FO (deSt. Groth, S.F. et al. , J. Immunol.
Methods (1980) 35, la 21), S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313 a 323), R210 (Galfre, G. et al.,
Nature (1979) 277, 131 a 133), 240E-1 e 240E-W são preferencialmente utilizadas como as células de mieloma. A fusão celular entre os imunócitos e as células de mieloma pode ser efetuada basicamente de acordo com um método conhecido na técnica, por exemplo, o método de Kohler e Milstein (Kohler, G. e Milstein, C. Methods
Enzymol. (1981) 73, 3 a 46).
Mais especificamente, a fusão celular é realizada, por exemplo, na presença de um promotor de fusão celular num meio de nutrientes convencional. Por exemplo, é utilizado polietilenoglicol (PEG) ou vírus senndai (HVJ) como o promotor de fusão. Se necessário, um auxiliar, tal como dimetilsulfóxido, pode ser ainda adicionado para utilização de modo a melhorar a eficácia da fusão. A relação entre os imunócitos e as células de mieloma utilizadas pode ser arbitrariamente definida. Por exemplo, a quantidade dos imunócitos é preferencialmente definida para 1 a 10 vezes a quantidade das células de mieloma. Os exemplos do meio que podem ser utilizados na fusão celular incluem meios RPMI1640 e MEM adequados para o crescimento das linhas celulares de mieloma bem como meios convencionais para a utilização neste tipo de cultura de células. Além disso, pode ser utilizado um suplemento de soro, tal como soro fetal de vitelo (FCS) em conjunto com estes meios.
Para a fusão celular, os imunócitos e as células de mieloma são bem misturados numa quantidade predeterminada do meio. Uma solução PEG (peso molecular médio: por exemplo, aproximadamente 1000 a 6000) pré-aquecida até EP2818483B1 aproximadamente 37 °C é habitualmente adicionada a mistura numa concentração de 3 0 a 6 0 % (em peso por volume) e misturada com a mesma para formar os hibridomas de interesse. Subsequentemente, os procedimentos de adição de forma sequencial de um meio apropriado e remoção do sobrenadante mediante centrifugação são preferencialmente repetidos para remover agentes de fusão celular ou afins desfavoráveis para o crescimento dos hibridomas.
Os hibridomas assim obtidos são cultivados num meio seletivo convencional, por exemplo, um meio HAT (meio contendo hipoxantina, aminopterina e timidina) para seleção. Esta cultura no meio HAT prolonga-se durante um período (habitualmente diversos dias a diversas semanas) suficiente para a morte de células (células não fundidas) diferentes dos hibridomas de interesse. Subsequentemente, os hibridomas que produzem o anticorpo de interesse são rastreados e clonados como clones únicos através de um método de diluição de limitação convencional.
Além dessa obtenção dos hibridomas através da imunização de animais não humanos com antigénios, os hibridomas que produzem anticorpos humanos com a atividade desejada (p. ex. , atividade inibidora de crescimento celular) podem ser obtidos sensibilizando linfócitos humanos, por exemplo, linfócitos humanos infetados por vírus EB, com proteínas, células de expressão de proteínas ou lisados dos mesmos in vitro e fundindo os linfócitos sensibilizados com células de mieloma derivadas de ser humano capazes de se dividirem permanentemente, por exemplo, U266 (N.° de Registo TIB 196).
Os hibridomas de produção de anticorpos monoclonais assim preparados podem ser subcultivados num meio convencional e podem igualmente ser armazenados durante um longo período em azoto líquido.
Especificamente, os antigénios desejados ou as células que expressam os antigénios desejados são utilizados como EP2818483B1 antigénios de sensibilização na imunização de acordo com um método de imunização convencional. Os imunócitos obtidos são fundidos com células principais conhecidas na técnica de acordo com um método de fusão celular convencional. As células de produção de anticorpos monoclonais (hibridomas) podem ser rastreadas através de um método de rastreio convencional para preparar o anticorpo de interesse.
Outro exemplo do anticorpo que pode ser utilizado na presente invenção é um anticorpo policlonal. 0 anticorpo policlonal pode ser obtido, por exemplo, conforme apresentado em seguida. 0 soro é obtido a partir de pequenos animais, tais como ratinhos, ratinhos de produção de anticorpos humanos ou coelhos imunizados com proteínas CAPRIN-1 naturais ou proteínas CAPRIN-1 recombinantes expressadas como proteínas de fusão com GST ou afins em micro-organismos, tal como E. coli, ou péptidos parciais das mesmas. Em alternativa, o soro pode ser obtido a partir de mamíferos imunizados com fragmentos CAPRIN-1 que servem como antigénios de sensibilização, isto é, um polipéptido compreendendo a sequência de aminoãcidos mostrada na SEQ ID NO: 5 ou uma sequência de aminoãcidos com 80 % ou mais, preferencialmente 85 % ou mais, mais preferencialmente 90 % ou mais, ainda mais preferencialmente 95 % ou mais de identidade de sequência relativamente à sequência de aminoãcidos (preferencialmente, um polipéptido que consiste em qualquer uma destas sequências de aminoãcidos), ou um polipéptido compreendendo um epítopo (preferencialmente, consistindo no epítopo) consistindo em aproximadamente 7 a 12 aminoãcidos consecutivos, por exemplo, 8 a 11 aminoãcidos consecutivos, na sequência de aminoãcidos mostrada na SEQ ID NO: 5 ou a sequência de aminoãcidos com 80 % ou mais, preferencialmente 85 % ou mais, mais preferencialmente 90 % ou mais, ainda mais preferencialmente 95 % ou mais de identidade de sequência EP2818483B1 relativamente à sequência de aminoácidos. 0 soro assim obtido pode ser purificado utilizando, por exemplo, precipitação de sulfato de amónio, colunas de proteína A ou proteína G, cromatografia de troca iónica DEAE ou colunas de afinidade acopladas com proteínas CAPRIN-1 ou péptidos sintéticos para preparar anticorpos policlonais anti-CAPRIN-1. 0 anticorpo policlonal da presente invenção inclui anticorpos obtidos a partir de animais de produção de anticorpos humanos (p. ex., ratinhos) imunizados com proteínas CAPRIN-1.
Neste contexto, por exemplo, os ratinhos KM (Kirin Pharma Co., Ltd./Medarex) e ratinhos Xeno (Amgen Inc.) são conhecidos como os ratinhos de produção de anticorpos humanos (p. ex., Publicações Internacionais N.° WO02/43478 e WOQ2/092812). Os anticorpos policlonais humanos completos podem ser obtidos a partir do sangue através da imunização desses ratinhos com proteínas CAPRIN-1 ou fragmentos das mesmas. Em alternativa, as células de baço podem ser isoladas dos ratinhos assim imunizados e fundidas com células de mieloma. Desta forma, é possível obter anticorpos monoclonais humanos.
Os antigénios podem ser preparados de acordo com, por exemplo, um método utilizando células animais (Publicação de Patente JP (Kohyo) N.° 2007-530068 A) ou um método utilizando baculovírus (p. ex., Publicação Internacional N.° W098/46777). Os antigénios que têm baixa imunogenicidade podem ser unidos a macromoléculas imunogénicas, tal como albumina para imunização. Os antigénios podem ser administrados juntamente com adjuvantes para imunização.
Em alternativa, o anticorpo da presente invenção pode ser obtido como um anticorpo geneticamente recombinante que é produzido utilizando uma técnica de recombinação de genes que envolve: clonagem de um gene do anticorpo a partir de hibridomas; incorporação do gene de anticorpo em vetores EP2818483B1 apropriados; e introdução dos vetores em hospedeiros (consulte, p. ex. , Carl, A.K. Borrebaeck, James, W. Larrick, "THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES", Publicado no Reino Unido por MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). Especificamente, os ADNcs de região variável de anticorpo (região V) são sintetizados a partir dos ARNms de hibridomas utilizando transcriptase reversa. Após a obtenção de ADNs que codificam as regiões V de anticorpo de interesse, os ADNs são laqueados a ADNs que codificam as regiões constantes de anticorpo desejadas (regiões C) . Os produtos de laqueação resultantes são incorporados em vetores de expressão. Em alternativa, os ADNs de codificação de região V de anticorpo podem ser incorporados em vetores de expressão que contêm ADNs de região C de anticorpo. Estes ADNs são incorporados nos vetores de expressão, de modo a serem expressados sob o controlo de regiões de controlo de expressão, por exemplo, um intensificador e um promotor. Em seguida, as células hospedeiras podem ser transformadas com os vetores de expressão resultantes e podem expressar anticorpos. 0 anticorpo anti-CAPRIN-1 da presente invenção é preferencialmente um anticorpo monoclonal. Em alternativa, o anticorpo anti-CAPRIN-1 da presente invenção pode ser um anticorpo policlonal, um anticorpo geneticamente manipulado (anticorpo quimérico, anticorpo humanizado, etc.) ou afins. 0 anticorpo monoclonal inclui anticorpos monoclonais humanos, anticorpos monoclonais de animais não humanos (p. ex., anticorpos monoclonais de ratinho, rato, coelho e galinha) e anticorpos monoclonais quiméricos. 0 anticorpo monoclonal pode ser preparado pela cultura de hibridomas obtidos mediante a fusão entre células de baço de mamíferos não humanos (p. ex., ratinhos, ratinhos de produção de anticorpos humanos, galinhas ou coelhos) imunizados com proteínas CAPRIN-1 ou fragmentos das mesmas e células de mieloma. 0 anticorpo quimérico é um anticorpo preparado a EP2818483B1 partir de uma combinação de sequências derivadas de diferentes animais e é, por exemplo, um anticorpo composto por regiões variáveis de cadeia pesada e leve de anticorpo de ratinho e regiões constantes de cadeia pesada e leve de anticorpo humano. 0 anticorpo quimérico pode ser preparado utilizando um método conhecido na técnica que envolve, por exemplo, a laqueação de ADNs que codificam regiões V de anticorpo de ratinho a ADNs que codificam regiões C de anticorpo humano; a incorporação dos produtos de laqueação resultantes em vetores de expressão; e a introdução dos vetores em hospedeiros, de modo a que sejam produzidos anticorpos.
Os anticorpos monoclonais que têm reatividade imunológica com o polipéptido CAPRIN-l parcial consistindo na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 5 e têm um efeito antitumoral são preparados através de um método descrito mais à frente nos Exemplos. 0 anticorpo humanizado, igualmente denominado anticorpo humano remodelado, é um anticorpo manipulado. 0 anticorpo humanizado é construído enxertando regiões determinantes de complementaridade de anticorpo humano com CDRs de anticorpo derivadas de um animal imunizado. É igualmente conhecida uma abordagem de recombinação de genes geral para esse fim.
Especificamente, as sequências de ADN concebidas de modo a vincular, por exemplo, CDRs de anticorpo de ratinho, coelho ou galinha e regiões marco conservadas (FRs) de anticorpo humano são sintetizadas por PCR utilizando diversos oligonucleótidos preparados com porções de terminal que se sobrepõem umas às outras. Os ADNs obtidos são laqueados a ADNs que codificam regiões constantes de anticorpo humano. Subsequentemente, os produtos de laqueação resultantes são incorporados em vetores de expressão, que são depois introduzidos em hospedeiros para produção de anticorpos de modo a obter o anticorpo de EP2818483B1 interesse (consulte Publicação de Pedido de Patente Europeia N.° EP239400 e Publicação Internacional N. 0 WO96/02576).
As FRs de anticorpo humano ligadas através de CDRs são selecionadas de modo a que as regiões determinantes de complementaridade formem um sítio de união ao antigénio favorável. Se necessário, os aminoãcidos nas regiões marco conservadas de regiões variáveis de anticorpo podem ser substituídas de modo a que as regiões determinantes de complementaridade do anticorpo humano remodelado resultante formem um sítio de união ao antigénio apropriado (Sato K. et al. , Cancer Research 1993, 53: 851 a 856) . Além disso, estas FRs podem ser substituídas por regiões marco conservadas derivadas de anticorpos humanos de classe ou subclasse diferente das mesmas (consulte a Publicação Internacional N.° W099/51743).
Os aminoãcidos nas regiões variáveis (p. ex., FRs) ou regiões constantes do anticorpo quimérico ou do anticorpo humanizado assim preparado podem ser substituídos, por exemplo, por outros aminoácidos. A substituição de aminoãcidos é a substituição de, por exemplo, menos de 15, menos de 10, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos ou 2 ou menos aminoácidos, preferencialmente 1 a 5 aminoácidos, mais preferencialmente 1 ou 2 aminoácidos. 0 anticorpo substituído deve ser funcionalmente equivalente a um anticorpo não substituído. A substituição é desejavelmente uma substituição de aminoácidos conservadora, que corresponde à substituição entre aminoácidos semelhantes em propriedades, tais como carga, cadeias laterais, polaridade e aromaticidade. Os aminoácidos podem ser classificados em termos de propriedades semelhantes em, por exemplo: aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina); aminoãcidos ácidos (ácido aspãrtico e ácido glutâmico); aminoãcidos polares não carregados (glicina, asparagina, EP2818483B1 glutamina, serina, treonina, cisteina e tirosina); aminoãcidos não polares (leucina, isoleucina, alanina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina); aminoãcidos ramificados (leucina, valina e isoleucina); e aminoãcidos aromáticos (fenilalanina, tirosina, triptofano e histidina).
Os exemplos de anticorpos modificados podem incluir anticorpos unidos a várias moléculas, tais como polietilenoglicol (PEG). No anticorpo modificado da presente invenção, a substancia a ser unida nao é limitada. Para obter esse anticorpo modificado, o anticorpo obtido pode ser quimicamente modificado. Um método para esse fim jã foi estabelecido na técnica.
Neste contexto, a expressão "funcionalmente equivalente" significa que um anticorpo relacionado tem atividade biológica ou bioquímica semelhante à do anticorpo da presente invenção, especificamente, o anticorpo relacionado tem a função de danificar o tumor e essencialmente não causa nenhuma reação adversa quando aplicado nos seres humanos, por exemplo. Os exemplos dessa atividade podem incluir atividade de união e atividade inibidora de crescimento celular.
Um método para a preparação de uma funcionalidade de polipéptido equivalente a um certo polipéptido, que envolve a introdução de uma mutação num polipéptido, é bem conhecido dos peritos 11a técnica. Por exemplo, os peritos na técnica podem apropriadamente introduzir uma mutação no anticorpo da presente invenção utilizando mutagénese direcionada para o sítio (Hashimoto-Gotoh, T. et al. , (1995) Gene 152, 271 a 275; Zoller, MJ., e Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468 a 500; Kramer, W. et al(1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441 a 9456; Kramer, W. e Fritz, HJ., (1987) Methods Enzymol. 154, 350 a 367; Kunkel, TA. , (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 82, 488 a 492; e Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763 a 2766) ou afins, EP2818483B1 preparando assim uma funcionalidade de anticorpo equivalente ao anticorpo da presente invenção. 0 anticorpo que reconhece um epítopo de uma proteína CAPRIN-1 ou um polipéptido de fragmento CAPRIN-1 compreendendo o epítopo pode ser obtido através de um método geralmente conhecido do perito na técnica. Por exemplo, o anticorpo pode ser obtido através de um método que envolve a determinação do epítopo da proteína CAPRIN-1 reconhecida pelo anticorpo anti-CAPRIN-1 obtido com um efeito inibidor de crescimento de células de cancro através de um método convencional (p. ex., mapeamento de epítopos ou um método de identificação de epítopos descritos mais à frente) e a preparação de um anticorpo utilizando um polipéptido com uma sequência de aminoãcidos contida no epítopo como um imunogénio, ou um método que envolve a determinação de um epítopo para um anticorpo preparado através de um método convencional e seleção de um anticorpo que reconhece o mesmo epítopo como o epítopo para o anticorpo anti-CAPRIN-1, Neste contexto, o "epítopo" refere-se a um fragmento de polipéptido que tem antigenicidade ou imunogenicidade nos mamíferos, preferencialmente nos seres humanos. A respetiva unidade mínima consiste em aproximadamente 7 a 12 aminoãcidos, preferencialmente 8 a 11 aminoãcidos. 0 anticorpo da presente invenção é um anticorpo que tem reatividade imunológica com CAPRIN-1, um anticorpo que reconhece especificamente CAPRIN-1, ou um anticorpo que se une especificamente a CAPRIN-1 e apresenta atividade citotóxica contra cancro ou um efeito inibidor do crescimento do tumor. 0 anticorpo é preferencialmente um anticorpo com uma estrutura que causa pouca ou nenhuma reação adversa nos animais recetores. Os exemplos desses anticorpos incluem anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos (p. ex., anticorpos quiméricos de ser humano-ratinho), anticorpos de cadeia EP2818483B1 única e anticorpos biespecíficos quando os animais recetores são seres humanos. Estes anticorpos têm regiões variáveis de cadeia pesada e leve derivadas de um anticorpo humano ou têm regiões variáveis de cadeia pesada e leve com regiões determinantes de complementaridade (CDR1, CDR2 e CDR3) derivadas de um anticorpo animal não humano e regiões marco conservadas (FR1, FR2, FR3 e FR4) derivadas de um anticorpo humano. Em alternativa, estes anticorpos são anticorpos recombinantes que têm regiões variáveis de cadeia pesada e leve derivadas de um anticorpo de animal não humano e regiões constantes de cadeia pesada e leve derivadas de um anticorpo humano. 0 anticorpo da presente invenção corresponde preferencialmente aos anteriores dois anticorpos.
Esses anticorpos recombinantes podem ser preparados conforme apresentado em seguida: os ADNs que codificam anticorpos monoclonais (p. ex. , anticorpos monoclonals de ser humano, ratinho, rato, coelho e galinha) contra CAPRIN-1 humana são clonados a partir de células de produção de anticorpos, tais como hibridomas, e utilizados como modelos em RT-PCR ou afins para preparar ADNs que codificam as regiões variáveis de cadeia leve e pesada dos anticorpos. As respetivas sequências das regiões variáveis de cadeia leve e pesada, as respetivas sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 em cada região, ou as respetivas sequências de FR1, FR2, FR3 e FR4 em cada região podem ser determinadas com base, por exemplo, no sistema de numeração UE Rabat (Rabat et ai., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5a Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)).
Esse ADN que codifica cada região variável ou um ADN que codifica cada CDR é preparado utilizando uma técnica de recombinação de genes (Sambrook et al. , "Molecular Cloning A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) ou urn sintetizador de ADN. Neste contexto, os EP2818483B1 hibridomas de produção de anticorpos monoclonals humanos podem ser preparados imunizando animais de produção de anticorpos humanos (p. ex., ratinho) com CAPRIN-1 humana, e depois fundindo células de baço excisadas dos animais imunizados com células de mieloma. À parte disto, os ADNs que codificam regiões variáveis e constantes de cadeia leve ou pesada derivadas de anticorpos humanos são preparados, se necessário, utilizando uma técnica de recombinação de genes ou um sintetizador de ADN.
Para o anticorpo humanizado, um ADN que codifica o anticorpo humanizado pode ser preparado substituindo as sequências de codificação CDR em ADNs que codificam regiões variáveis de cadeia leve ou pesada derivadas de anticorpos humanos correspondendo sequências de codificação CDR de um anticorpo derivado de animal não humano (p. ex., ratinho, rato, coelho ou galinha).
Para o anticorpo quimérico, os ADNs que codificam regiões variáveis de cadeia leve ou pesada de um anticorpo derivado de animal não humano (p. ex., ratinho, rato, coelho ou galinha) podem ser laqueados a ADNs que codificam regiões constantes de cadeia leve ou pesada derivadas de anticorpos humanos para preparar um ADN que codifica o anticorpo quimérico. 0 anticorpo de cadeia única refere-se a um anticorpo compreendendo regiões variáveis de cadeia pesada e leve linearmente vinculadas umas às outras através de um ligante. Um ADN que codifica o anticorpo de cadeia única pode ser preparado laqueando um ADN que codifica a região variável de cadeia pesada, um ADN que codifica o ligante e um ADN que codifica a região variável de cadeia leve. Neste contexto, as regiões variáveis de cadeia pesada e leve derivam ambas de um anticorpo humano ou derivam de um anticorpo humano com CDRs sozinhas substituídas por CDRs de um anticorpo derivado de animal não humano (p. ex., ratinho, rato, coelho ou galinha). 0 ligante consiste em 12 EP2818483B1 a 19 aminoãcidos. Os exemplos dos mesmos incluem (G4S)3 consistindo em 15 aminoãcidos (G.B. Kim et al., "Protein Engineering Design and Selection" 2007, 20 (9) : 425 a 432) , 0 anticorpo biespecífico (p. ex. , diacorpo) refere-se a um anticorpo capaz de se unir especif icamente a dois epítopos diferentes. Um ADN que codifica o anticorpo biespecífico pode ser preparado laqueando, por exemplo, um ADN que codifica uma região variável de cadeia pesada A, um ADN que codifica uma região variável de cadeia leve B, um ADN que codifica uma região variável de cadeia pesada B e um ADN que codifica uma região variável de cadeia leve A por esta ordem (desde que o ADN que codifica uma região variável de cadeia leve B e o ADN que codifica uma região variável de cadeia pesada B sejam laqueados através de um ADN que codifica um ligante conforme descrito acima). Neste contexto, as regiões variáveis de cadeia pesada e leve derivam todas de um anticorpo humano ou derivam de um anticorpo humano com CDRs sozinhas substituídas por CDRs de um anticorpo derivado de animal não humano (p. ex,, ratinho, rato, coelho ou galinha).
Os ADNs recombinantes assim preparados acima podem ser incorporados num ou em mais vetores apropriados, que são depois introduzidos nas células hospedeiras (p. ex., células de mamífero, células de levedura e células de inseto), de modo a que os ADNs sejam (co) expressados para produzir anticorpos recombinantes (P.J. Delves., "ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES", 1997 WILEY, P. Shepherd e C. Dean., "Monoclonal Antibodies", 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS; e J. W. Coding,, "Monoclonal Antibodies: principles and practice", 1993 ACADEMIC PRESS).
Os exemplos do anticorpo da presente invenção preparados através de qualquer um dos métodos descritos acima incluem os seguintes anticorpos (a) a (i): (a) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo regiões determinantes de EP2818483B1 complementaridade consistindo nas SEQ ID NOs: 8, 9 e 10 e uma região variável de cadeia leve compreendendo regiões determinantes de complementaridade consistindo nas SEQ ID NOs: 11, 12 e 13; (b) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo regiões determinantes de complementaridade consistindo nas SEQ ID NOs: 8, 9 e 14 e uma região variável de cadeia leve compreendendo regiões determinantes de complementaridade consistindo nas SEQ ID NOs: 11, 12 e 13; (c) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada consistindo na SEQ ID NO: 52 e uma região variável da cadeia leve consistindo na SEQ ID NO: 54; (d) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada consistindo na SEQ ID NO: 16 e uma região variável da cadeia leve consistindo na SEQ ID NO: 18; (e) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada consistindo na SEQ ID NO: 21 e uma região variável da cadeia leve consistindo na SEQ ID NO: 23; (f) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada consistindo na SEQ ID NO: 25 e uma região variável da cadeia leve consistindo na SEQ ID NO: 23; (g) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo regiões determinantes de complementaridade consistindo nas SEQ ID NOs: 26, 27 e 28 e uma região variável de cadeia leve compreendendo regiões determinantes de complementaridade consistindo nas SEQ ID NOs: 30, 31 e 32; (p. ex., um anticorpo constituído por uma região variável de cadeia pesada consistindo na SEQ ID NO: 2 9 e uma região variável da cadeia leve consistindo na SEQ ID NO: 33); (h) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo regiões determinantes de complementaridade consistindo nas SEQ ID NOs: 36, 37 e 38 e uma região variável de cadeia leve compreendendo EP2818483B1 regiões determinantes de complementaridade consistindo nas SEQ ID NOs: 40, 41 e 42; (p. ex. , um anticorpo constituído por uma região variável de cadeia pesada consistindo na SEQ ID NO: 3 9 e uma região variável da cadeia leve consistindo na SEQ ID NO: 43); e (i) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo regiões determinantes de complementaridade consistindo nas SEQ ID NOs: 46, 47 e 48 e uma região variável de cadeia leve compreendendo regiões determinantes de complementaridade consistindo nas SEQ ID NOs: 40, 41 e 42; (p. ex. , um anticorpo constituído por uma região variável de cadeia pesada consistindo na SEQ ID NO: 4 9 e uma região variável da cadeia leve consistindo na SEQ ID NO: 43).
Neste contexto, as sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs: 8, 9 e 10 correspondem a CDR1, CDR2 e CDR3, respetivamente, de uma região variável de cadeia pesada de anticorpo derivado de coelho. As sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOS: 11, 12 e 13 correspondem a CDR1, CDR2 e CDR3, respetivamente, de uma região variável de cadeia leve de anticorpo derivado de coelho. A sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 14 corresponde a CDR3 de uma região variável de cadeia pesada de anticorpo derivado de coelho.
Igualmente, as sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOS: 26, 27 e 28, SEQ ID NOs: 36, 37 e 38 OU SEQ ID NOs: 46, 47 e 48 correspondem a CDR1, CDR2 e CDR3, respetivamente, de uma região variável de cadeia pesada derivada de anticorpo de ratinho. As sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOS: 30, 31 e 32 ou SEQ ID NOs: 40, 41 e 42 correspondem a CDR1, CDR2 e CDR3, respetivamente, de uma região variável de cadeia leve de anticorpo derivado de ratinho.
Os exemplos do anticorpo humanizado, do anticorpo quimérico, do anticorpo de cadeia única ou do anticorpo EP2818483B1 biespecífico da presente invenção incluem os seguintes anticorpos (I) a (II) , por exemplo, na forma de (b) : (I) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 consistindo nas sequências de aminoãcidos das SEQ ID NOs: 8, 9 e 14, respetivamente, regiões marco conservadas derivadas de anticorpo humanizado ou sequências de aminoácidos com porções das mesmas substituídas e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 consistindo nas sequências de aminoãcidos das SEQ ID NOs: 11, 12 e 13, respetivamente, regiões marco conservadas derivadas de anticorpo humano ou sequências de aminoãcidos com porções das mesmas substituídas; e (II) um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16 e uma região constante de cadeia pesada derivada de anticorpo humano, e uma cadeia leve compreendendo uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18 e uma região constante de cadeia leve derivada de anticorpo humano.
As sequências das regiões constantes e variáveis de cadeias pesadas e leves de anticorpo humano encontram-se disponíveis, por exemplo, em NCBI (E.U.A.; GenBank, UniGene, etc.). Por exemplo, as seguintes sequências podem ser referidas como: N.° de Registo J00228 para uma região constante de cadeia pesada de IgGl humano; N.° de Registo J00230 para uma região constante de cadeia pesada de IgG2 humano; N.° de Registo X03604 para uma região constante de cadeia pesada de IgG3 humano; N.° de Registo K01316 para uma região constante de cadeia pesada de IgG4 humano,* N. °s de Registo V00557, X64135, X64133, etc. para uma região constante κ de cadeia leve humana,· e N.°s de Registo X64132, X64134, etc. para uma região constante λ de cadeia leve humana. EP2818483B1
Preferencialmente, estes anticorpos têm atividade citotóxica e podem assim exercer um efeito antitumoral.
As sequências específicas acima das regiões variáveis de cadeia pesada e leve e CDRs em cada anticorpo são fornecidas meramente para fins ilustrativos. É óbvio que o anticorpo da presente invenção não é limitado pelas sequências específicas. Os hibridomas capazes de produzir anticorpos humanos de CAPRIN-1 anti-humana ou anticorpos de animal não humano (p. ex. , anticorpos de ratinho) diferentes dos descritos acima são preparados, e os anticorpos monoclonais produzidos pelos hibridomas são recuperados e avaliados como sendo (ou não sendo) os anticorpos de interesse com atividade de união imunológica contra atividade citotóxica e de CAPRIN-1 humana como índices. Os hibridomas de produção de anticorpos monoclonais de interesse são assim identificados. Em seguida, os ADNs que codificam as regiões variáveis de cadeia pesada e leve dos anticorpos de interesse são produzidos a partir dos hibridomas e sequenciados, conforme descrito acima. Os ADNs são utilizados para a preparação dos diferentes anticorpos.
Cada um dos anticorpos acima pode ter a substituição, deleção ou adição de um ou diversos aminoácidos, particularmente numa sequência de região marco conservada e/ou uma sequência de região constante, desde que o anticorpo tenha essa especificidade para que o mesmo possa especificamente reconhecer CAPRIN-1. Neste contexto, o termo "diversos" significa preferencialmente 2 a 5, mais preferencialmente 2 ou 3. A constante de afinidade Ka (kon/koff) do anticorpo da presente invenção para uma proteína CAPRIN-1 ou um fragmento da mesma corresponde preferencialmente a, pelo menos, 10? M'1, pelo menos 108 M'1, pelo menos 5 x 108 M_1, pelo menos 109 M”1, pelo menos 5 x ΙΟ9 pelo menos 101U M‘ 1, pelo menos 5 x IO10 M-1, pelo menos IO11 MT1, pelo menos 5 EP2818483B1 χ ΙΟ11 Μ"1, pelo menos ΙΟ12 Μ'1 ou pelo menos ΙΟ13 Μ'1. Ο anticorpo da presente invenção pode ser conjugado com um agente antitumoral. A conjugação do anticorpo com o agente antitumoral pode ser efetuada através de um espaçador com um grupo (p. ex., um grupo succinimidilo, um grupo formilo, um grupo 2-piridilditio, um grupo maleimidila, um grupo alcóxi carbonilo ou um grupo hidróxi) reativo com um grupo amino, um grupo carboxilo, um grupo hidróxi, um grupo tiol ou afins.
Os exemplos do agente antitumoral incluem os seguintes agentes antitumorais publicamente conhecidos nas literaturas, etc.: paclitaxel, doxorrubicina, daunorrubicina, ciclofosfamida, metotrexato, 5- fluorouracili, tiotepa, bussulfano, improssulfano, pipossulfano, benzodopa, carboquono, meturedopa, uredopa, altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida, trimetilolomelamina, bulatacina, bulatacinona, camptotecina, briostatina, calistatina, criptoficina 1, criptoficina 8, dolastatina, duocarmicina, eleuterobina, pancratistatina, sarcodictina, espongistatina, clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracilo, carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina, caliqueamicina, dinemicina, clodronato, esperamicina, aclacinomicina, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicina, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicina, dactinomicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, adriamicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicina, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, EP2818483B1 zorrubicina, denopterina, pteropterina, trimetrexato, fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina, ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, andrógenos (p. ex., calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano e testolactona), aminoglutetimida, mitotano, trilostano, ácido frolinico, aceglatona, glicõsido de aldofosfamida, ácido aminolevulinico, eniluracil, amsacrina, bestrabucil, bisantreno, edatraxato, defofamina, demecolcina, diaziquono, elfornitina, acetato de eliptinio, epotilona, etoglucido, lentinano, lonidamina, maitansina, ansamitocina, mitoguazona, mitoxantrona, mopidanmol, nitraerina, pentostatina, fenamet, pirarrubicina, losoxantrona, ácido podofilinico, 2-etil-hidrazida, procarbazina, razoxano, rizoxina, esquizofilano, espirogermânio, ácido tenuazónico, triaziquono, roridina A, anguidina, uretano, vindesina, dacarbazina, manomustina, mitobronitol, mitolactol, pipobromano, gacitosina, docetaxel, clorambucil, gemcitabina, 6-tioguanina, mercaptopurina, cisplatina, oxaliplatina, carboplatina, vinblastina, etoposido, ifosfamida, mitoxantrona, vincristina, vinorrelbina, novantrona, teniposido, edatrexato, daunomicina, aminopterina, xeloda, ibandronato, irinotecano, inibidores da topoisomerase, difluorometilornitina (DMFO), ácido retinoico, capecitabina e sais farmaceuticamente aceitáveis e derivados dos mesmos.
Quando o anticorpo é conjugado com o agente antitumoral, é possível avaliar se este anticorpo conjugado exerce atividade antitumoral através de um método que envolve a reação, por exemplo, de um anticorpo anti-CAPRIN-1 derivado de ratinho, simultaneamente com um anticorpo secundário fixado ao fármaco capaz de se unir a um anticorpo de ratinho, e a avaliação do efeito antitumoral nas células cancerígenas humanas ex vivo. Esta avaliação EP2818483B1 pode ser realizada utilizando, por exemplo, um anticorpo IgG anti-humano unido a saporina (Hum-ZAP (Advanced Targeting Systems, Inc.)).
Em alternativa, o anticorpo da presente invenção pode ser administrado em conjunto com um agente antitumoral para produzir um efeito terapêutico superior. Esta abordagem é adaptável a um paciente com cancro que expressa CAPRIN-1 antes ou após a operação cirúrgica. Esta abordagem pode ser aplicada, particularmente após a cirurgia, a cancro de expressão de CAPRIN-1, que foi tratado convencionalmente apenas com agente antitumoral, para produzir uma maior prevenção de recorrência de cancro ou um prolongamento do tempo de sobrevivência.
Os exemplos do agente antitumoral utilizado na administração combinada com o anticorpo da presente invenção incluem igualmente os seguintes agentes antitumorais publicamente conhecidos nas literaturas, etc.: paclitaxel, doxorrubicina, daunorrubicina, ciclofosfamida, metotrexato, 5-fluorouracili, tiotepa, bussulfano, improssulfano, pipossulfano, benzodopa, carboquono, meturedopa, uredopa, altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida, trimetilolomelamina, bulatacina, bulatacinona, camptotecina, briostatina, calistatina, criptoficina 1, criptoficina 8, dolastatina, duocarmicina, eleuterobina, pancratistatina, sarcodictina, espongistatina, clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracilo, carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina, caliqueamicina, dinemicina, clodronato, esperamicina, aclacinomicina, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicina, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicina, dactinomicina, EP2818483B1 detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, adriamicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicina C, ácido micofenõlico, nogalamicina, olivomicina, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina, denopterina, pteropterina, trimetrexato, fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina, ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, c i tarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona, aminoglutetimida, mitotano, trilostano, ácido frolinico, aceglatona, glicõsido de aldofosfamida, ácido aminolevulinico, eniluracil, amsacrina, bestrabucil, bisantreno, edatraxato, defofamina, demecolcina, diaziquono, elfornitina, acetato de eliptmio, epotilona, etoglLicido; leritinano, ionidainiiia; maitansina, ansamitocina, mitoguazona, mitoxantrona, mopidanmol, nitraerina, pentostatina, fenamet, pirarrubicina, losoxantrona, ácido podofilinico, 2-etil-hidrazida, procarbazina, razoxano, rizoxina, esquizofilano, espirogermânio, ácido tenuazónico, triaziquono, roridina A, anguidina, uretano, vindesina, dacarbazina, manomustina, mitobronitol, mitolactol, pipobromano, gacitosina, docetaxel, cloratnbucil, gemcitabina, 6-tioguanina, mercaptopurina, cisplatina, oxaliplatina, carboplatina, vinblastina, etoposido, ifosfamida, mitoxantrona, vincristina, vinorrelbina, novantrona, teniposido, edatrexato, daunomicina, aminopterina, xeloda, ibandronato, irinotecano, inibidores da topoisomerase, difluorometilornitina (DMFO), ácido retinoico, capecitabina e sais farmaceuticamente aceitáveis (conhecidos na técnica) e derivados (conhecidos na técnica) dos mesmos. Destes agentes antitumorais, particularmente, são preferencialmente utilizados ciclofosfamida, paclitaxel, EP2818483B1 docetaxel ou vinorrelbina.
Em alternativa, o anticorpo da presente invenção pode ser unido a um radioisótopo publicamente conhecido nas literaturas, etc., tais como 211At, 131I, *25I, 90Y, 186Re, 188Re, i53Sm, 212Bi, 32P, 175Lu, 176Lu, 89Sr, 64Cu ou li:LIn (Hideo Saji, YAKUGAKU ZASSHI 128 (3) 323 a 332, 8 (2008), Jpn). É desejável um radioisótopo eficaz para o tratamento ou diagnóstico do tumor. Um radioisótopo assim é igualmente incluído no agente antitumoral de acordo com a presente invenção. ddentificação de epítopo>
Conforme mostrado nos Exemplos abaixo, o anticorpo da presente invenção une-se a um epítopo na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 5. Um exemplo de um método para a confirmação de um epítopo para o anticorpo da presente invenção inclui um método que envolve a imobilização de um epítopo no polipéptido da SEQ ID NO: 5 para uma placa e a avaliação do anticorpo relativamente à respetiva reatividade com este epítopo. Especificamente, um epítopo no polipéptido da SEQ ID NO: 5 é imobilizado através de reação para uma placa fixa a grupos funcionais de remoção de eletrões através de espaçadores, tal como oligoetilenoglicol. 0 anticorpo da presente invenção pode reagir com a placa e ser avaliado relativamente à respetiva reatividade com o epítopo através de reação com um anticorpo secundário marcado (p. ex. , marcado com peroxidase de rábano (HRP) ) que se une ao anticorpo da presente invenção, isto é, o epítopo ao qual o anticorpo da presente invenção se une pode ser confirmado. 0 epítopo no polipéptido da SEQ ID NO: 5 utilizado na imobilização para uma placa corresponde a uma sequência que compreende pelo menos o epítopo na sequência da SEQ ID NO: 5 ou uma porção modificada da mesma (p. ex., resíduos N-terminal ou C-terminal modificados com diversos aminoácidos arbitrários ou uma proteína, tal como KLH ou um (poli) péptido EP2818483B1 modificado com uma proteína MAP) . 0 anticorpo da presente invenção apenas necessita de unir-se a qualquer um destes (poli)pêptidos.
Por outro lado, mesmo o anticorpo da presente invenção pode não ser reativo com o polipéptido da SEQ ID NO: 5, isto é, o epítopo pode não ser confirmado no método acima. Neste caso, o anticorpo reage com um antigénio em condições de solução que facilitam a união entre o antigénio e o anticorpo. Após a obtenção de um complexo de antigénio-anticorpo através de um método de imunoprecipitação, um polipéptido parcial unido ao anticorpo pode ser separado e examinado relativamente à respetiva sequência de aminoãcidos para confirmar o epítopo para o anticorpo da presente invenção. Neste contexto, o antigénio é, por exemplo, o polipéptido da própria SEQ ID NO: 5 ou uma porção modificada do mesmo. Em alternativa, mesmo uma proteína CAPRIN-1 pode ser utilizada desde que o epítopo reativo com o anticorpo da presente invenção possa ser confirmado pelo método acima. <Efeito antitumoral> 0 efeito antitumoral do anticorpo anti-CAPRIN-1 utilizado na presente invenção nas células cancerígenas de expressão de CAPRIN-1 parece ser provocado através do seguinte mecanismo: citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) mediada por células efetoras e citotoxicidade dependente do complemento (CDC) contra as células de expressão de CAPRIN-1. Contudo, este mecanismo não pretende limitar o âmbito da presente invenção. 0 efeito antitumoral baseado no mecanismo é conhecido por se correlacionar com o número de moléculas alvo expressadas na superfície de células cancerígenas às quais o anticorpo se une (Niwa R., Clinical Cancer Research 15 de março de 2005; 1 (6) : 2327-2336) . 0 número de moléculas alvo expressadas na superfície de células cancerígenas pode ser examinado utilizando um kit de ensaio existente capaz EP2818483B1 de medir o número de moléculas de superfície celular. Especificamente, o número de moléculas alvo às quais o anticorpo se une pode ser determinado por: reação de anticorpos primários, tais como anticorpos contra as moléculas alvo com células cancerígenas; reação com os mesmos de anticorpos marcados de forma fluorescente contra os anticorpos primários juntamente com pérolas para uma curva de calibração com o número conhecido de moléculas; e medição da intensidade de fluorescência média das amostras para obter uma curva de calibração.
Deste modo, o anticorpo anti-CAPRIN-1 utilizado na presente invenção pode ser avaliado relativamente à respetiva atividade, conforme especificamente mostrado nos Exemplos abaixo, ensaiando a atividade ADCC ou CDC contra células cancerígenas de expressão de CAPRIN-1 ex vivo ou examinando o número de moléculas CAPRIN-1 expressadas na superfície de células cancerígenas utilizando o anticorpo anti-CAPRIN-1 de acordo com a presente invenção como um anticorpo primário. 0 anticorpo anti-CAPRIN-1 utilizado na presente invenção une-se a uma proteína CAPRIN-1 nas células cancerígenas e apresenta um efeito antitumoral através da atividade. Deste modo, o anticorpo anti-CAPRIN-1 da presente invenção é presumivelmente útil no tratamento ou na prevenção de cancro. Especificamente, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica para o tratamento e/ou a prevenção de cancro, compreendendo o anticorpo anti-CAPRIN-1 como um ingrediente ativo. 0 anticorpo anti-CAPRIN-1 utilizado para fins de administração a corpos humanos (terapia de anticorpo) é preferencialmente um anticorpo humano ou um anticorpo humanizado para a redução de imunogenicidade.
Um anticorpo anti-CAPRIN-1 com maior afinidade de união para uma proteína CAPRIN-1 na superfície de células cancerígenas exerce uma atividade antitumoral mais forte. EP2818483B1
Deste modo, o anticorpo da presente invenção tem elevada afinidade de união relativamente à proteína CAPRIN-1 e, por conseguinte, pode esperar-se que o mesmo tenha um efeito antitumoral mais forte. Em conformidade, o anticorpo da presente invenção é adaptável a uma composição farmacêutica destinada ao tratamento e/ou à prevenção de cancro. Essa afinidade de união elevada do anticorpo da presente invenção corresponde preferencialmente a, pelo menos, 107 M"1, pelo menos 108 M'1, pelo menos 5 x 108 M'1, pelo menos 109 M"1, pelo menos 5 x 109 M"1, pelo menos IO10 M"1, pelo menos 5 x IO10 M"1, pelo menos 1011 M'1, pelo menos 5 x IO1* M"1, pelo menos 1012 M"1 ou pelo menos 1CTJ M"1, em termos de uma constante de associação (constante de afinidade) Ka (kon/K0ff) , conforme descrito acima. 0 anticorpo anti-CAPRIN-1 que se une a um número maior de moléculas CAPRIN-1 na superfície de células cancerígenas produz atividade antitumoral mais forte. Desejavelmente, o número de moléculas CAPRIN-1 no ensaio utilizando o anticorpo anti-CAPRIN-1 da presente invenção corresponde a 104 ou mais, preferencialmente 103 ou mais, por célula cancerígena à qual o anticorpo se une contando com o efeito antitumoral. 0 tumor (células cancerígenas) que tem um grande número de moléculas CAPRIN-1 na superfície celular é particularmente preferido como cancro para receber o anticorpo da presente invenção. <União à célula de expressão de antigénios> A capacidade do anticorpo para se unir a CAPRIN-1 pode ser determinada através da utilização do ensaio de união utilizando, por exemplo, ELISA, transferência de Western, imunofluorescência e análise por citometria de fluxo, conforme descrito nos Exemplos. cColoração imuno-histoquímica> 0 anticorpo que reconhece CAPRIN-1 pode ser testado relativamente à respetiva reatividade com CAPRIN-1 através de um método imuno-histoquímico bem conhecido dos peritos EP2818483B1 na técnica utilizando uma secção congelada fixada em paraformaldeído ou acetona ou secção fixada em paraformaldeído ou embebida em parafina de um tecido obtido de um paciente durante a operação cirúrgica ou de um animal que transporta um tecido de xenoenxerto inoculado com uma linha celular que expressa CAPRIN-1 quer espontaneamente quer após transfeção.
Para a coloração imuno-histoquímica, o anticorpo reativo com CAPRIN-1 pode ser colorido através de vários métodos. Por exemplo, o anticorpo pode ser visualizado através de reação com um anticorpo antirratinho de cabra conjugado com peroxidase de rábano, anticorpo anticoelho de cabra ou anticorpo antigalinha de cabra. cComposição farmacêutica e método para tratamento e/ou prevenção de cancro
Um alvo da composição farmacêutica para tratamento e/ou prevenção de cancro da presente invenção não é particularmente limitado, desde que o alvo seja cancro (células) que expressa um gene CAPRIN-1.
Os termos "tumor" e "cancro" aqui utilizados significam neoplasma maligno e são utilizados alternadamente entre si . 0 cancro visado na presente invenção corresponde a cancro que expressa um gene que codifica uma proteína CAPRIN-1 e é preferencialmente cancro da mama, cancro do rim, cancro pancreático, cancro do intestino grosso, cancro do pulmão, tumor cerebral, cancro gástrico, cancro da cérvix uterina, cancro do ovário, cancro da próstata, cancro da bexiga urinária, cancro esofágico, leucemia, linfoma, fibrossarcoma, mastocitoma ou melanoma.
Os exemplos específicos destes cancros incluem, mas não se limitam a, adenocarcinoma da mama, adenocarcinoma da mama tipo complexo, tumor misto maligno de glândula mamária, adenocarcinoma papilar intraductal, adenocarcinoma do pulmão, cancro de células escamosas, cancro de pequenas EP2818483B1 células, cancro de grandes células, glioma que é um tumor de tecido neuroepitelial, ependimoma, tumor neuronal, tumor neuroectodêrmico embrionário, neurilemoma, neurofibroma, meningioma, leucemia linfocítica crónica, linfoma, linfoma gastrointestinal, linfoma alimentar, linfoma tipo células pequenas a médias, cancro do ceco, cancro do cólon ascendente, cancro do cólon descendente, cancro do cólon transverso, cancro do cólon sigmoide, cancro retal, cancro do ovário epitelial, tumor de células germinativas, tumor de células estromais, carcinoma ductal pancreãtico, carcinoma ductal pancreático invasivo, adenocarcinoma pancreático, carcinoma de células acinares, carcinoma adenoescamoso, tumor de células gigantes, neoplasma mucinoso-papilar intraductal, neoplasma cístico mucinoso, pancreatoblastoma, eistoadenocarcinoma seroso, tumor sólido pseudopapilar, gastrinoma, glucagonoma, insulinoma, neoplasia endócrina múltipla tipo 1 (síndrome de Wermer), tumor de células das ilhotas nâo funcionais, somatostatinoma e VIPoma.
Os sujeitos de teste recetores (pacientes) são preferencialmente mamíferos, por exemplo, mamíferos que incluem primatas, animais de estimação, gado e animais para a prática de desporto, e são particularmente de preferência seres humanos, cães e gatos.
No caso da utilização do anticorpo da presente invenção como uma composição farmacêutica, a composição farmacêutica pode ser formulada através de um método geralmente conhecido dos peritos na técnica. Por exemplo, a composição farmacêutica pode ser utilizada na forma de uma injeção parentérica de uma solução assética ou suspensão com água ou qualquer outro líquido farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, a composição farmacêutica pode ser formulada com o anticorpo misturado numa forma de dosagem unitária necessária para a prática farmacêutica geralmente aceite, numa combinação apropriada com portadores ou meios EP2818483B1 farmaceuticamente aceitáveis, especificamente, água esterilizada, soro fisiológico, óleo vegetal, um emulsionante, um agente de suspensão, um tensioativo, um estabilizador, um agente aromatizante, um excipiente, um veículo, um conservante, um aglutinante, etc. A quantidade do ingrediente ativo nessa preparação é determinada de modo a que seja possível alcançar uma dose apropriada dentro da variação prescrita.
Uma composição assética para injeção pode ser formulada de acordo com a prática farmacêutica convencional utilizando um veículo, tal como água destilada injetável.
Os exemplos de soluções aquosas para injeção incluem soro fisiológico, soluções isotónicas que contêm glicose e outros adjuvantes, por exemplo D-sorbitol, D-manose, D-manitol e cloreto de sódio. Estas soluções podem ser utilizadas em conjunto com um solubilizante apropriado, por exemplo um álcool (especificamente etanol) ou um poliálcool (p. ex. , propilenoglicol e polietilenoglicol), ou um tensioativo não iónico, por exemplo, polissorbato 80 (TM) ou HCO-60.
Os exemplos de soluções oleosas incluem óleo de sésamo e óleo de soja. Estas soluções podem ser utilizadas em conjunto com benzoato de benzilo ou álcool benzílico como um solubilizante. As soluções podem ser ainda misturadas com um tampão (p. ex., uma solução tampão fosfato e uma solução tampão acetato de sódio), um agente calmante (p. ex., cloridrato de procaína), um estabilizador (p. ex., álcool benzílico e fenol) e um antioxidante. As soluções de injeção assim preparadas são normalmente carregadas em ampolas apropriadas. A composição farmacêutica da presente invenção é administrada de forma oral ou parentérica, preferencialmente de forma parentérica. Os exemplos específicos das respetivas formas de dosagem incluem injeções, agentes de administração intranasal, agentes de EP2818483B1 administração transpulmonar e agentes de administração percutânea. Os exemplos das injeções incluem injeção intravenosa, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal e injeção subcutânea, através das quais a composição farmacêutica pode ser administrada de forma sistemática ou local.
Igualmente, o método de administração pode ser apropriadamente selecionado dependendo da idade, do peso, do sexo, dos sintomas, etc. de um paciente. A dose de uma composição farmacêutica contendo o anticorpo ou um polinucleõtido que codifica o anticorpo pode ser selecionada dentro de uma variação de, por exemplo, 0,0001 a 1000 mg/kg de peso corporal por dose. Em alternativa, a dose pode ser selecionada dentro de uma variação de, por exemplo, 0,001 a 100 000 mg/corpo de um paciente, apesar de a dose não se limitar necessariamente a estes valores numéricos. Embora a dose e o método de administração variem dependendo do peso, da idade, do sexo, dos sintomas, etc. de um paciente, os peritos na técnica podem apropriadamente selecionar a dose e o método. A composição farmacêutica compreendendo o anticorpo da presente invenção ou o fragmento do mesmo pode ser administrada num sujeito de teste para tratar e/ou prevenir cancro, preferencialmente cancro da mama, cancro do rim, cancro pancreãtico, cancro do intestino grosso, cancro do pulmão, tumor cerebral, cancro gástrico, cancro da cérvix uterina, cancro do ovário, cancro da próstata, cancro da bexiga urinária, cancro esofágico, leucemia, linfoma, fibrossarcoma, mastocitoma ou melanoma. A presente invenção abrange ainda um método para o tratamento e/ou a prevenção de cancro compreendendo a administração a um sujeito de teste da composição farmacêutica da presente invenção em conjunto com o agente antitumoral conforme exemplificado acima ou de uma composição farmacêutica compreendendo o agente antitumoral. EP2818483B1 0 anticorpo da presente invenção ou o fragmento do mesmo pode ser administrado em simultâneo com o, ou separadamente do, agente antitumoral ao sujeito de teste. No caso de administração em separado destas composições farmacêuticas, qualquer uma pode ser administrada primeiro ou mais tarde. Os respetivos intervalos de dosagem, as doses, as vias de administração e o número de doses podem ser apropriadamente selecionados por um especialista. As formas de dosagem de fãrmacos separados para serem administradas em simultâneo incluem igualmente, por exemplo, composições farmacêuticas, cada uma formulada misturando o anticorpo da presente invenção ou o fragmento do mesmo ou o agente antitumoral num portador (ou meio) farmacologicamente aceitável. As descrições acima sobre prescrição, formulação, vias de administração, doses, cancro, etc. relativamente às composições farmacêuticas e formas de dosagem contendo o anticorpo da presente invenção são igualmente aplicáveis a qualquer uma das formas de dosagem e composições farmacêuticas descritas acima contendo o agente antitumoral.
Deste modo, a presente invenção fornece igualmente um fármaco de combinação para tratamento e/ou prevenção de cancro, compreendendo a composição farmacêutica da presente invenção e uma composição farmacêutica compreendendo o agente antitumoral conforme exemplificado acima, e um método para tratamento e/ou prevenção de cancro, compreendendo a administração do fármaco de combinação. A presente invenção fornece igualmente uma composição farmacêutica para tratamento e/ou prevenção de cancro, compreendendo o anticorpo da presente invenção ou o fragmento do mesmo e o agente antitumoral juntamente com um portador farmacologicamente aceitável. <Polipéptido e ADN> A presente invenção fornece ainda um ADN que codifica o anticorpo da presente invenção ou o fragmento (fragmento EP2818483B1 de união de anticorpo) do mesmo. Esse ADN pode ser um ADN que codifica as cadeias pesadas e/ou leves do anticorpo ou pode ser um ADN que codifica as regiões variáveis de cadeia pesada e/ou leve do anticorpo. Esse ADN pode igualmente ser um ADN que codifica cada uma ou uma combinação das regiões determinantes de complementaridade do anticorpo. Esse ADN inclui, por exemplo, um ADN de codificação de região variável de cadeia pesada compreendendo sequências de nucleótidos que codificam as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 8, 9 e 14 e um ADN de codificação de região variável de cadeia leve compreendendo as sequências de nucleótidos que codificam as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOS: 11, 12 e 13, no caso do anticorpo (b).
As regiões determinantes de complementaridade (CDRs) codificadas pelo ADN que têm estas sequências servem como regiões que determinam a especificidade do anticorpo. As sequências que codificam as outras regiões (isto é, regiões constantes e regiões marco conservadas) do anticorpo podem, por conseguinte, ser sequências derivadas de outros anticorpos. Neste contexto, "outros anticorpos" incluem igualmente anticorpos derivados de organismos não humanos e são preferencialmente os que derivam de seres humanos do ponto de vista de redução de reações adversas. Especificamente, no ADN descrito acima, as regiões que codificam cada região marco conservada e cada região constante nas cadeias pesadas e leves compreendem preferencialmente sequências de nucleótidos que codificam sequências de aminoácidos correspondentes derivadas de um anticorpo humano ou um derivado do mesmo com uma substituição de aminoácidos parcial.
Outros exemplos do ADN que codifica o anticorpo da presente invenção incluem um ADN de codificação de região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 16, e um ADN de codificação de região variável de EP2818483B1 cadeia leve compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18, no caso do anticorpo (b) . Neste contexto, a sequência de nucleótidos que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16 corresponde, por exemplo, à sequência de nucleótidos da SEQ ID No: 15. A sequência de nucleótidos que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18 corresponde, por exemplo, à sequência de nucleótidos da SEQ ID NO: 17. Quando esse ADN compreende uma região que codifica cada região constante nas cadeias pesadas e leves, esta região preferencialmente compreende uma sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos derivada de anticorpo humano correspondente (sequência de aminoácidos de cada região constante nas cadeias pesadas e leves).
Estes ADNs de anticorpo podem ser obtidos, por exemplo, através dos métodos descritos acima ou do método seguinte: primeiro, os ARNs totais são preparados a partir de hibridomas que produzem o anticorpo da presente invenção utilizando um kit de extração de ARN comercialmente disponível, e os ADNcs são sintetizados utilizando transcriptase reversa e primers aleatórios ou afins. Subsequentemente, os ADNcs de codificação de região variável são ampliados por PCR utilizando primers de oligonucleótidos para sequências conservadas de cada região variável em genes de cadeia pesada e leve de anticorpo de ratinho e coelho conhecidos. As sequências que codificam as regiões constantes podem ser obtidas pela ampliação PCR de sequências conhecidas. A sequência de nucleótidos do ADN pode ser incorporada num plasmídeo ou num fago para sequenciação, por exemplo, e determinada de acordo com um método habitual. A presente invenção fornece ainda os seguintes polipéptidos e ADNs relacionados com o anticorpo (a) ou (i) : EP2818483B1 (i) um polipéptido selecionado a partir do grupo que
consiste nas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 52 e 54, SEQ ID NOs: 16 e 18, SEQ ID NOs: 21 e 23, SEQ ID NOs: 25 e 23, SEQ ID NOs: 29 e 33, SEQ ID NOs: 39 e 43 e SEQ ID NOs: 49 e 43, e um ADN que codifica o polipéptido; (ii) um polipéptido CDR de cadeia pesada selecionado a partir do grupo que consiste nas sequências de
aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs: 8, 9 e 10, SEQ ID NOs: 8, 9 e 14, SEQ ID NOs: 26, 27 e 28, SEQ ID NOs: 36, 37 e 38 e SEQ ID NOs: 46, 47 e 48, e um ADN que codifica o polipéptido; e (iii) um polipéptido CDR de cadeia leve selecionado a partir do grupo que consiste nas sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs: 11, 12 e 13, SEQ ID NOs: 30, 31 e 32 e SEQ ID NOs: 40, 41 e 42, e um ADN que codifica o polipéptido.
Estes polipéptidos e ADNs podem ser preparados utilizando técnicas de recombinação de genes conforme descrito acima. <Sumãrio da presente invenção>
Os aspetos da presente invenção descritos acima são resumidos abaixo. (1) Um anticorpo ou um fragmento do mesmo que tem reatividade imunolõgica com um polipéptido CAPRIN-1 parcial que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 5. (2) 0 anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com (1), em que o anticorpo ou fragmento do mesmo tem uma atividade citotóxica contra uma célula cancerígena que expressa uma proteína CAPRIN-1. (3) Q anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com (1) ou (2), em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal ou um anticorpo policlonal, (4) 0 anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (3) , em que o anticorpo é um EP2818483B1 anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo de cadeia única ou um anticorpo muitiespecífico. (5) 0 anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (4), em que o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo regiões determinantes de complementaridade que consistem nas SEQ ID NOs: 8, 9 e 10 (CDR1, CDR2 e CDR3, respetivamente) e uma região variável de cadeia leve compreendendo regiões determinantes de complementaridade consistindo nas SEQ ID NOs: 11, 12 e 13 (CDR1, CDR2 e CDR3, respetivamente) e tem reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1. (6) 0 anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (4), em que o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo regiões determinantes de complementaridade que consistem nas SEQ ID NOs: 8, 9 e 14 (CDR1, CDR2 e CDR3, respetivamente) e uma região variável de cadeia leve compreendendo regiões determinantes de complementaridade consistindo nas SEQ ID NOs: 11, 12 e 13 (CDR1, CDR2 e CDR3, respetivamente) e tem reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1. (7) 0 anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com (5), em que o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada que consiste na SEQ ID NO: 52 e uma região variável de cadeia leve que consiste na SEQ ID NO: 54 e tem reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1. (8) 0 anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com (5) , em que o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada que consiste na SEQ ID NO: 21 e uma região variável da cadeia leve que consiste na SEQ ID NO: 23 e tem reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1. EP2818483B1 (9) 0 anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com (5) , em que o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada que consiste na SEQ ID NO: 25 e uma região variável da cadeia leve que consiste na SEQ ID NO: 23 e tem reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1. (10) 0 anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com (6), em que o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada que consiste na SEQ ID NO: 16 e uma região variável da cadeia leve que consiste na SEQ ID NO: 18 e tem reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1. (11) 0 anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (4) , em que o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo regiões determinantes de complementaridade que consistem nas SEQ ID NOs: 26, 27 e 28 (CDR1, CDR2 e CDR3, respetivamente) e uma região variável de cadeia leve compreendendo regiões determinantes de complementaridade que consistem nas SEQ ID NOs: 30, 31 e 32 (CDR1, CDR2 e CDR3, respetivamente) e tem reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1. (12) 0 anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (4), em que o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo regiões determinantes de complementaridade que consistem nas SEQ ID NOs: 36, 37 e 38 (CDR1, CDR2 e CDR3, respetivamente) e uma região variável de cadeia leve compreendendo regiões determinantes de complementaridade que consistem nas SEQ ID NOs: 40, 41 e 42 (CDR1, CDR2 e CDR3, respetivamente) e tem reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1. (13) 0 anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (4), em que o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada EP2818483B1 compreendendo regiões determinantes de complementaridade que consistem nas SEQ ID NOs: 46, 47 e 48 (CDR1, CDR2 e CDR3, respetivamente) e uma região variável de cadeia leve compreendendo regiões determinantes de complementaridade que consistem nas SEQ ID NOs: 40, 41 e 42 (CDR1, CDR2 e CDR3, respetivamente) e tem reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1. (14) O anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com (11) , em que o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada que consiste na SEQ ID NO: 2 9 e uma região variável da cadeia leve que consiste na SEQ ID NO: 33 e tem reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1. (15) 0 anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com (12) , em que o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada que consiste na SEQ ID NO: 3 9 e uma região variável da cadeia leve que consiste na SEQ ID NO: 43 e tem reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1. (16) 0 anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com (13) , em que o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada que consiste na SEQ ID NO: 4 9 e uma região variável da cadeia leve que consiste na SEQ ID NO: 43 e tem reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1. (17) 0 anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (16), em que o anticorpo ou fragmento do mesmo é conjugado com um agente antitumoral. (18) Uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (17) como um ingrediente ativo. (20) Um fármaco de combinação para tratamento e/ou prevenção de cancro, compreendendo uma composição farmacêutica de acordo com (18) e uma composição farmacêutica compreendendo um agente antitumoral. EP2818483B1 (21) Um ADN que codifica um anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (16). (22) 0 anticorpo, o fragmento, a composição farmacêutica ou o fármaco de combinação de acordo qualquer um de (1) a (20) para a utilização num método de tratamento e/ou prevenção de cancro, em que o cancro é opcionalmente cancro da mama, cancro do rim, cancro pancreático, cancro do intestino grosso, cancro do pulmão, tumor cerebral, cancro gástrico, cancro da cérvix uterina, cancro do ovário, cancro da próstata, cancro da bexiga urinária, cancro esofágico, leucemia, linfoma, fibrossarcoma, mastocitoma ou melanoma.
Exemplos
Em seguida, a presente invenção será descrita mais especificamente com referência aos Exemplos. Contudo, o âmbito da presente invenção não pretende ser limitado por estes exemplos específicos.
Exemplo 1 Análise da expressão de CAPRIN-1 em cada tecido A expressão de genes CAPRIN-1 em tecidos normais humanos e caninos e várias linhas celulares foi examinada por RTPCR de acordo com o Exemplo 1(4) de W02010/016526. Como consequência, a respetiva forte expressão foi observada no testículo entre os tecidos caninos saudáveis, ao passo que a expressão foi observada em tecidos de adenocarcinoma e cancro da mama caninos. Como consequência da confirmação igualmente da expressão nos tecidos humanos, a expressão foi confirmada apenas no testículo entre tecidos normais, tal como com o gene CAPRIN-1 canino. Em oposição, a expressão foi detetada em muitos tipos de linhas celulares de cancro, incluindo 8 linhas celulares de cancro da mama humano (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231V e MRK-nu-1) e 4 linhas celulares de cancro pancreático (Capan-2, MIAPaCa-2, Panc-1 e BxPc-3), entre células cancerígenas. Estes resultados demonstraram que CAPRIN-1 é expressada nas linhas celulares de cancro da EP2818483B1 mama e nas linhas celulares de cancro pancreãtico, apesar de a respetiva expressão não ser observada em tecidos normais que não o testículo.
Exemplo 2 Preparação de anticorpo monoclonal de ratinho contra CAPRIN-1 (1) Preparação de anticorpo anti-CAPRIN-1 de ratinho #1 100 pg de uma proteína CAPRIN-1 humana tendo a sequência de aminoãcidos de SEQ ID No: 2 conforme preparado no Exemplo 3 de W02010/016526 foram misturados com uma quantidade igual de adjuvante MPL+TDM (fabricado por Sigma-Aldrich Corp.). Esta mistura foi utilizada como uma solução de antigénio por ratinho. A solução de antigénio foi administrada de forma intraperitoneal a cada ratinho Balb/c de seis anos de idade (fabricado por Japan SLC, Inc.) . Em seguida, foram efetuados 7 reforços a cada 1 semana para concluir a imunização. Três dias após a descarga final, o baço de cada ratinho foi excisado e moído entre duas lamelas de vidro esterilizadas. Os procedimentos de lavagem com PBS(-) (fabricado por Nissui Pharmaceutical Co,, Ltd.) e remoção do sobrenadante mediante centrifugação a 1500 rpm durante 10 minutos foram repetidos três vezes para obter células de baço. As células de baço obtidas foram misturadas com células de mieloma de ratinho SP2/0 (adquiridas em ATCC) numa relação de 10:1. 200 μΐ de um meio RPMI1640 contendo 10 % de FBS foram aquecidos até 37 °C e misturados com 800 μΐ de PEG1500 (fabricado por Boehringer Ingelheim GmbH), e a solução PEG assim preparada foi adicionada à mistura de células, que foi depois deixada assentar durante 5 minutos para a fusão celular. Após a remoção do sobrenadante mediante centrifugação a 1700 rpm durante 5 minutos, as células foram suspensas em 150 ml de um meio RPMI1640 contendo 15 % de FBS complementados com 2 % de equivalente de uma solução HAT (fabricado por Life Technologies, Inc./Gibco) (meio seletivo HAT) . Esta suspensão foi inoculada para quinze placas de 96 poços EP2818483B1 (fabricado por Thermo Fisher Scientific Inc./Nunc) numa concentração de 100 μΐ/poço. As células de baço e as células de mieloma foram fundidas mediante cultura a 37 °C durante 7 dias em condições de 5 % de C02 para obter hibridomas.
Os hibridomas preparados foram rastreados relativamente à afinidade de união de anticorpos produzidos pelos hibridomas contra proteínas CAPRIN-1 como um índice. Uma solução de 1 ug/ml das proteínas CAPRIN-1 preparada através da abordagem descrita no Exemplo 3 de W02010/016526 foi adicionada a uma placa de 96 poços numa concentração de 100 μΐ/poço e deixada assentar a 4 °C durante 18 horas. Cada poço foi lavado três vezes com PBS-T. Em seguida, foi aí adicionada uma solução de 0,5 % de soroalbumina bovina (BSA) (fabricado por Sigma-Aldrich Corp.) numa concentração de 400 μΐ/poço e deixada assentar à temperatura ambiente durante 3 horas. A solução em cada poço foi deitada fora, e cada poço foi lavado três vezes com 400 μΐ de PBS-T. Em seguida, o sobrenadante da cultura de cada hibridoma obtido acima foi aí adicionado numa concentração de 100 μΐ/poço e deixado assentar à temperatura ambiente durante 2 horas. Cada poço foi lavado três vezes com PBS-T. Em seguida, anticorpos IgG (H+L) antirratinho marcados com HRP (fabricado por Invitrogen Corp.) diluídos 5000 vezes com PBS foram aí adicionados numa concentração de 100 μΐ/poço e deixados assentar à temperatura ambiente durante 1 hora. Cada poço foi lavado três vezes com PBS-T. Em seguida, uma solução de substrato TMB (fabricado por Thermo Fisher Scientific Inc.) foi aí adicionada numa concentração de 100 μΐ/poço e deixada assentar durante 15 a 30 minutos para causar reação de cor. Após o desenvolvimento de cor, a reação foi terminada através da adição de 1 N de ácido sulfúrico numa concentração de 100 μΐ/poço. A absorvância foi medida a 450 nm e 595 nm utilizando um espetrõmetro de absorção. Como consequência, foram selecionados diversos EP2818483B1 hibridomas que produzem anticorpos com elevada absorvância.
Os hibridomas selecionados foram adicionados a uma placa de 96 poços numa densidade de 0,5 cêlulas/poço e cultivados na placa. Após uma semana, foram observados hibridomas que formam colónias únicas nos poços. As células nestes poços foram ainda cultivadas, e os hibridomas clonados foram rastreados relativamente à afinidade de união de anticorpos produzidos pelos hibridomas contra proteínas CAPRIN-1 como um índice. Uma solução de 1 ug/ml das proteínas CAPRIN-1 preparada através da abordagem descrita no Exemplo 3 de W02010/016526 foi adicionada a uma placa de 96 poços numa concentração de 100 μΐ/poço e deixada assentar a 4 °C durante 18 horas. Cada poço foi lavado três vezes com PBS-T. Em seguida, foi aí adicionada uma solução de 0,5 % de BSA numa concentração de 400 μΐ/poço e deixada assentar à temperatura ambiente durante 3 horas. A solução em cada poço foi deitada fora, e cada poço foi lavado três vezes com 400 μΐ de PBS-T. Em seguida, o sobrenadante da cultura de cada hibridoma obtido acima foi aí adicionado numa concentração de 100 μΐ/poço e deixado assentar à temperatura ambiente durante 2 horas. Cada poço foi lavado três vezes com PBS-T. Em seguida, anticorpos IgG (H+L) antirratinho marcados com HRP (fabricado por Invitrogen Corp.) diluídos 5000 vezes com PBS foram aí adicionados numa concentração de 100 μΐ/poço e deixados assentar à temperatura ambiente durante 1 hora. Cada poço foi lavado três vezes com PBS-T. Em seguida, uma solução de substrato TMB (fabricado por Thermo Fisher Scientific Inc.) foi aí adicionada numa concentração de 100 μΐ/poço e deixada assentar durante 15 a 30 minutos para causar reação de cor. Após o desenvolvimento de cor, a reação foi terminada através da adição de 1 N de ácido sulfúrico numa concentração de 100 μΐ/poço. A absorvância foi medida a 450 nm e 595 nm utilizando um espetrómetro de absorção. Como consequência, foram obtidas 61 linhas de hibridoma que EP2818483B1 produzem anticorpos monoclonais reativos com proteínas CAPRIN-1.
Em seguida, estes anticorpos monoclonais foram rastreados relativamente a anticorpos reativos com a superfície de células de cancro da mama que expressam CAPRIN-1. Especificamente, 10b células de uma linha celular de cancro da mama humano MDA-MB-231V foram centrifugadas num tubo de microcentrifugação de 1,5 ml. 100 μΐ do sobrenadante da cultura de cada hibridoma obtido acima foram aí adicionados e deixados assentar durante 1 hora em gelo. Após a lavagem com PBS, anticorpos IgG antirratinho de cabra marcados com FITC (fabricado por Invitrogen Corp.) diluídos 500 vezes com PBS contendo 0,1 % de FBS foram aí adicionados e deixados assentar durante 1 hora em gelo. Após a lavagem com PBS, a intensidade de fluorescência foi medida utilizando FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). Por outro lado, a mesma operação conforme acima foi efetuada utilizando o soro de cada ratinho Balb/c com 6 semanas de idade não tratado diluído 500 vezes com um meio para cultura de hibridoma, em vez dos anticorpos, para preparar um controlo. Como consequência, foi selecionado um anticorpo monoclonal de ratinho (anticorpo anti-CAPRIN-1 de ratinho #1) com uma intensidade de fluorescência mais forte em comparação com a do controlo, isto é, reativo com a superfície de células de cancro da mama. (2) Identificação de epítopo CAPRIN-1 reconhecido por anticorpo anti-CAPRIN-1 de ratinho #1 0 anticorpo monoclonal reativo à superfície de células cancerígenas contra CAPRIN-1 (anticorpo anti-CAPRIN-1 de ratinho #1) obtido no parágrafo (1) foi utilizado para identificar uma região de epítopo CAPRIN-1 reconhecida desse modo. 93 péptidos candidatos, cada um consistindo em 12 a 16 aminoácidos na sequência de aminoãcidos da proteína CAPRIN-! humana, foram sintetizados, e cada um foi dissolvido numa concentração de 1 mg/ml em DMSO. EP2818483B1
Cada péptido foi dissolvido numa concentração de 30 pg/rnl numa solução tampão carbonato de sódio de 0,1 M (pH 9,6) , A solução foi adicionada numa concentração de 100 μΐ/poço a uma placa de 96 poços (fabricado por Thermo Fisher Scientific Inc./Nunc, N. 0 de produto: 436006) e deixada assentar durante a noite a 4 °C. A solução em cada poço foi deitada fora, e 10 mM de etanolamina/0,1 M de solução tampão carbonato de sódio (pH 9,6) foram aí adicionados numa concentração de 200 μΐ/poço e deixados assentar à temperatura ambiente durante 1 hora. Em seguida, a solução em cada poço foi deitada fora, e cada poço foi lavado duas vezes com PBS contendo 0,5 % de Tween 20 (PBST) para preparar um placa imobilizada com péptido. 0 sobrenadante da cultura de células contendo o anticorpo anti-CAPRIN-1 #1 foi adicionado numa concentração de 50 μΐ/poço a cada placa assim obtida. Após a agitação à temperatura ambiente durante 1 hora, a solução em cada poço foi deitada fora, e cada poço foi lavado três vezes com PBST. Em seguida, uma solução de anticorpo secundário contendo anticorpos IgG antirratinho marcados com HRP (fabricado por Invitrogen Corp.) diluída 3000 a 4000 vezes com PBST foi aí adicionada numa concentração de 50 μΐ/poço. Em seguida, a solução em cada poço foi deitada fora, e cada poço foi lavado seis vezes com PBST.
Uma solução de substrato TMB (fabricado por Thermo Fisher Scientific Inc.) foi aí adicionada numa concentração de 100 μΐ/poço e deixada assentar durante 15 a 30 minutos para causar reação de cor. Após o desenvolvimento de cor, a reação foi terminada através da adição de 1 N de ácido sulfúrico numa concentração de 100 μΐ/poço. A absorvância foi medida a 450 nm e 595 nm utilizando um espetrõmetro de absorção.
Como consequência, o polipéptido da SEQ ID NO: 5 foi identificado como uma sequência parcial de CAPRIN-1 reconhecida pelo anticorpo anti-CAPRIN-1 de ratinho #1 EP2818483B1 obtido no Exemplo 2(1). (3) Preparação de anticorpos anti-CAPRIN-1 de ratinho #2 e #3
Tal como no parágrafo anterior (1) , uma proteína de fusão de um polipéptido com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 identificada no parágrafo (2) e uma proteína transportadora KLH (hemocianina de lapa californiana) foram misturadas como um imunogénio com uma quantidade igual de um adjuvante TiterMax Gold (marca comercial registada) (CytRx Corp.), e esta mistura foi administrada de forma intraperitoneal numa dose de 100 pg por descarga a cada ratinho em intervalos de 7 dias. Após um total de 4 descargas, as células de baço foram obtidas do ratinho 3 dias após a imunização final e fundidas com células de mieloma de ratinho tal como no parágrafo (1) para preparar hibridomas. Em seguida, os anticorpos contidos nos sobrenadantes de cultura dos hibridomas preparados foram rastreados utilizando, como um índice, a respetiva reatividade com uma solução de proteína CAPRIN-1 de 1 pg/ml preparada no Exemplo 3 de W02010/016526 e a proteína de fusão da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 e uma proteína transportadora BSA utilizada como um imunogénio. Uma solução de proteína CAPRIN-1 de 1 pg/ml preparada no Exemplo 3 de W02010/016526 e uma proteína de fusão de 30 pg/ml da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 e uma proteína transportadora BSA foram, cada uma delas, adicionadas a uma placa de 96 poços numa concentração de 100 μΐ/poço e deixadas assentar a 4 °C durante 18 horas. Cada poço foi lavado com PBS-T. Em seguida, foi aí adicionada uma solução Block Ace (DS Pharma Biomedical Co., Ltd) numa concentração de 400 μΐ/poço e deixada assentar à temperatura ambiente durante 3 horas. A solução em cada poço foi deitada fora, e cada poço foi lavado com PBS-T. Em seguida, o sobrenadante da cultura de cada hibridoma obtido acima foi aí adicionado numa concentração de 100 μΐ/poço e EP2818483B1 deixado assentar à temperatura ambiente durante 2 horas. Cada poço foi lavado com PBS-T. Em seguida, anticorpos IgG (H+L) antirratinho marcados com HRP (fabricado por Invitrogen Corp.) diluídos 5000 vezes com PBS foram aí adicionados numa concentração de 100 μΐ/poço e deixados assentar à temperatura ambiente durante 1 hora. Cada poço foi lavado com PBS-T. Em seguida, uma solução de substrato TMB (fabricado por Thermo Fisher Scientific Inc.) foi aí adicionada numa concentração de 100 μΐ/poço e deixada assentar durante 5 a 30 minutos para causar reação de cor. Após o desenvolvimento de cor, a reação foi terminada através da adição de 1 N de ácido sulfúrico numa concentração de 100 μΐ/poço. A absorvância foi medida a 450 nm e 595 nm utilizando um espetrómetro de absorção. Como consequência, foram selecionados hibridomas que produzem anticorpos com elevada absorvância.
Os hibridomas selecionados foram adicionados a uma placa de 96 poços numa densidade de 0,3 células/poço e cultivados na placa. Após uma semana, foram observados hibridomas que formam colónias únicas nos poços. As células nestes poços foram ainda cultivadas. Os hibridomas que produzem anticorpos contra a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 foram obtidos tal como acima com a afinidade de união de anticorpos produzidos pelos hibridomas clonados contra a sequência CAPRIN-1 parcial (sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5) como um índice.
Os anticorpos monoclonais produzidos pelos hibridomas obtidos foram rastreados relativamente a anticorpos reativos com a superfície de células de cancro da mama que expressam CAPRIN-1. Especificamente, 106 células de uma linha celular de cancro da mama humano MDAMB-231V foram centrifugadas num tubo de microcentrifugação de 1,5 ml. 100 μΐ do sobrenadante da cultura de cada hibridoma obtido acima foram aí adicionados e deixados assentar durante 1 hora em gelo. Após a lavagem com PBS, anticorpos IgG EP2818483B1 antirratinho de cabra marcados com FITC (fabricado por Invitrogen Corp.) diluídos 500 vezes com PBS contendo 0,1 % de FBS foram aí adicionados e deixados assentar durante 1 hora em gelo. Após a lavagem com PBS, a intensidade de fluorescência foi medida utilizando FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). Por outro lado, a mesma operação como acima foi efetuada utilizando, em vez dos anticorpos, uma amostra contendo o soro de cada ratinho Balb/c com 6 semanas de idade não tratado diluído 500 vezes com um meio para cultura de hibridomas, e uma amostra reagiu apenas com anticorpos secundários como um controlo negativo. Como consequência, foram obtidos dois anticorpos monoclonais de ratinho (anticorpos anti-CAPRIN-1 de ratinho #2 e #3) com uma intensidade de fluorescência mais forte em comparação com a do controlo negativo, isto é, reativo com a superfície de células de cancro da mama.
Os anticorpos anti-CAPRIN-1 de ratinho #2 e #3 obtidos foram examinados relativamente à respetiva reatividade específica com o polipéptido imunogénico com a sequência CAPRIN-1 parcial (sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5). Uma solução contendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 ajustada a 3 0 pg/ml com uma solução de carbonato de sódio aquoso de 0,1 M e uma sequência CAPRIN-1 parcial livre da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 foram, cada uma delas, adicionadas a uma placa de 96 poços Immobilizer Amino para ELISA (Nunc/Thermo Fisher Scientific Inc.) numa concentração de 100 pg/ml e reagiram a 4 °C toda a noite e todo o dia para unir os péptidos aos poços. Uma solução de carbonato de sódio aquosa de 0,1 M contendo 10 mM de etanolamina foi adicionada a cada poço unido a péptido e deixada assentar à temperatura ambiente durante 1 hora. A solução em cada poço foi deitada fora, e cada poço foi depois lavado com PBS-T. Em seguida, uma solução Block Ace foi aí adicionada numa concentração de 400 μΐ/poço e deixada assentar à temperatura ambiente durante 3 horas. A EP2818483B1 solução em cada poço foi deitada fora, e cada poço foi lavado com PBS-T. Em seguida, o sobrenadante da cultura contendo os anticorpos anti-CAPRIN-1 de ratinho #2 ou #3 foi aí adicionado numa concentração de 50 μΐ/poço e reagiu à temperatura ambiente durante 1 hora. Em seguida, cada poço foi lavado com PBS-T. Os anticorpos IgG (H+L) antirratinho marcados com HRP (fabricado por Invitrogen Corp.) diluídos 5000 vezes com uma solução Block Ace foram aí adicionados numa concentração de 50 μΐ/poço e deixados assentar à temperatura ambiente durante 1 hora. Cada poço foi lavado cuidadosamente com PBS-T. Em seguida, uma solução de substrato TMB (fabricado por Thermo Fisher
Scientific Inc.) foi aí adicionada numa concentração de 100 μΐ/poço e deixada assentar durante 5 a 30 minutos para causar reação de cor. Após o desenvolvimento de cor, a reação foi terminada através da adição de 1 N de ácido sulfúrico numa concentração de 100 μΐ/poço. A absorvância foi medida a 450 nm e 595 nm utilizando um espetrõmetro de absorção. Como consequência, os anticorpos anti-CAPRIN-1 de ratinho #2 e #3 não reagiram com a sequência CAPRIN-1 parcial livre da sequência de aminoãcidos da SEQ ID NO: 5 e especificamente reagiram apenas com o polipéptido que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5. Deste modo, o polipéptido da SEQ ID NO: 5 foi confirmado como contendo uma região de epítopo para os anticorpos monoclonais de ratinho #2 e #3. (2) Caracterização de anticorpos anti-CAPRIN-1 de ratinho #1, #2 e #3
Fragmentos ampliados de genes de codificação de região variável foram obtidos a partir dos anticorpos anti-CAPRIN-1 de ratinho #1, #2 e #3 obtidos nos Exemplos 2(1) e 2(3) e analisados relativamente às respetivas sequências de genes e sequências de aminoácidos dos mesmos de acordo com o método descrito no Exemplo 5 de W02010/016526. A sequência de genes resultante que codifica a região variável de EP2818483B1 cadeia pesada do anticorpo anti-CAPRIN-l de ratinho #1 é mostrada na SEQ ID NO: 34, e a sequência de aminoácidos do mesmo ê mostrada na SEQ ID NO: 29. A sequência de genes que codifica a região variável de cadeia leve do anticorpo anti-CAPRIN-1 de ratinho #1 é igualmente mostrada na SEQ ID NO: 35, e a sequência de aminoácidos do mesmo é mostrada na SEQ ID NO: 33. A sequência de genes resultante que codifica a região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-CAPRIN-1 de ratinho #2 é mostrada na SEQ ID NO: 44, e a sequência de aminoácidos do mesmo é mostrada na SEQ ID NO: 39. A sequência de genes que codifica a região variável de cadeia leve do anticorpo anti-CAPRIN-1 de ratinho #2 é mostrada na SEQ ID NO: 45, e a sequência de aminoácidos do mesmo é mostrada na SEQ ID NO: 43. A sequência de genes resultante que codifica a região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-CAPRIN-1 de ratinho #3 é ainda mostrada na SEQ ID NO: 50, e a sequência de aminoácidos do mesmo é mostrada na SEQ ID NO: 49. A sequência de genes que codifica a região variável de cadeia leve do anticorpo anti-CAPRIN-1 de ratinho #3 é mostrada na SEQ ID NO: 45, e a sequência de aminoácidos do mesmo é mostrada na SEQ ID NO: 43.
Especificamente, foi confirmado que o anticorpo anti-CAPRIN-1 de ratinho #1 compreende uma região variável de cadeia pesada que consiste na SEQ ID NO: 2 9 e uma região variável da cadeia leve que consiste na SEQ ID NO: 33, em que CDR1, CDR2 e CDR3 na região variável de cadeia pesada consistem nas sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 26, 2 7 e 28, respetivamente, e CDR1, CDR2 e CDR3 na região variável de cadeia leve consistem nas sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 30, 31 e 32, respetivamente. Igualmente, foi confirmado que o anticorpo anti-CAPRIN-1 de ratinho #2 compreende uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 3 9 e uma região variável de cadeia leve que consiste na SEQ ID NO: 43, em que CDR1, CDR2 e CDR3 na EP2818483B1 região variável de cadeia pesada consistem nas sequências de aminoãcidos das SEQ ID NOs: 36, 37 e 38, respetivamente, e CDR1, CDR2 e CDR3 na região variável de cadeia leve consistem nas sequências de aminoãcidos das SEQ ID NOs: 40, 41 e 42, respetivamente. Além disso, foi confirmado que o anticorpo anti-CAPRIN-1 de ratinho #3 compreende uma região variável de cadeia pesada que consiste na SEQ ID NO: 49 e uma região variável da cadeia leve que consiste na SEQ ID NO: 43, em que CDR1, CDR2 e CDR3 na região variável de cadeia pesada consistem nas sequências de aminoãcidos das SEQ ID NOs: 46, 4 7 e 48, respetivamente, e CDR1, CDR2 e CDR3 na região variável de cadeia leve consistem nas sequências de aminoãcidos das SEQ ID NOs: 40, 41 e 42, respetivamente.
Exemplo 3 Preparação de anticorpo policlonal contra polipéptido CAPRIN-1 parcial presente na superfície de células cancerígenas
Para obter anticorpos policlonais contra polipêptidos de CAPRIN-1 parciais presentes na superfície de células cancerígenas, um polipéptido (péptido derivado de CAPRIN-1 mostrado na SEQ ID NO: 5) compreendendo a região de epítopo para o anticorpo anti-CAPRIN-1 #1 obtido no Exemplo 1 (1) , um polipéptido com uma região de números de resíduos de aminoãcidos 50 a 98 na sequência de aminoãcidos CAPRIN-1 humana da SEQ ID NO: 2 e um polipéptido com uma região de números de resíduos de aminoãcidos 233 a 305 da SEQ ID NO: 2 foram sintetizados. 1 mg de cada um destes péptidos foi misturado como um antigénio com um volume igual de uma solução de adjuvante incompleto de Freund (IFA). Esta mistura foi administrada de forma subcutânea em cada coelho quatro vezes a cada duas semanas. Em seguida, foi recolhido sangue para obter antissoro contendo cada anticorpo policlonal. Este antissoro foi ainda purificado utilizando um portador de proteína G (fabricado por GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.) e substituído por PBS para obter anticorpos EP2818483B1 policlonais contra polipéptidos CAPRIN-1 parciais presentes na superfície de células cancerígenas. Além disso, o soro de um coelho que não recebeu nenhum antigénio foi purificado utilizando um portador de proteína G tal como acima e utilizado como anticorpos de controlo.
Exemplo 4 Análise de expressão de proteínas CAPRIN-1 na superfície da membrana de células cancerígenas utilizando anticorpos policlonais contra polipéptidos CAPRIN-1 parciais
Em seguida, 8 linhas celulares de cancro da mama humano (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-Í57, BT-20, MDA-MB-231V e MRK-nu-1) confirmadas como tendo um grande nível de expressão de genes CAPRIN-l foram examinadas relativamente à respetiva expressão de proteínas CAPRIN-l na superfície celular. 5 x 105 células de cada linha celular de cancro da mama humano assim confirmadas como tendo expressão de genes foram centrifugadas num tubo de microcentrifugação de 1,5 ml. 2 pg (5 μΐ) cada dos anticorpos policlonais contra péptidos derivados de CAPRIN-1 (SEQ ID MO: 5) preparados como descrito acima no Exemplo 3 e 95 μΐ de PBS contendo 0,1 % de soro bovino fetal foram aí adicionados e misturados, e deixados assentar durante 1 hora em gelo. Após a lavagem com PBS, a solução resultante foi misturada através da adição de 1 μΐ de anticorpos IgG anticoelho de cabra marcados com Alexa 488 (fabricado por Invitrogen Corp.) e 98 μΐ de PBS contendo 0,1 % de soro bovino fetal (FBS) e deixada assentar durante 30 horas em gelo. Após a lavagem com PBS, a intensidade de fluorescência foi medida utilizando FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). Por outro lado, a mesma operação como acima foi efetuada utilizando os anticorpos de controlo preparados conforme descrito acima no Exemplo 3 em vez dos anticorpos policlonais contra péptidos derivados de CAPRIN-l para preparar um controlo. Como consequência, todas as células cancerígenas complementadas com os EP2818483B1 anticorpos anti-CAPRIN-1 apresentaram intensidade de fluorescência pelo menos 35 % mais forte em comparação com a do controlo. Isto demonstrou que as proteínas CAPRIN-1 são expressadas na superfície da membrana celular das linhas celulares de cancro humano. A taxa acima de melhoramento na intensidade de fluorescência foi indicada pela taxa de aumento na intensidade de fluorescência média (MFI) em cada linha celular e calculada de acordo com a seguinte expressão:
Taxa de aumento na intensidade de fluorescência média (Taxa de melhoramento na intensidade de fluorescência) (%) = ((HFI de células que reagiram com os anticorpos anti-CAPRIN-1) - (HFI de Controlo))/(HFI de Controlo) x 100.
Igualmente, a intensidade de fluorescência foi medida em 2 linhas celulares de cancro do rim (Caki-1 e Caki-2), uma linha celular de cancro da bexiga urinária (T24), uma linha celular de cancro do ovário (SKOV3), 2 linhas celulares de cancro do pulmão (QG56 e A549), uma linha celular de cancro da próstata (PC3), uma linha celular de cancro da cérvix uterina (SW756), uma linha celular de fibrossarcoma (HT1080), 2 linhas celulares de tumor cerebral (T98G e U87MG), uma linha celular de cancro gástrico (MNK28), 3 linhas celulares de cancro do intestino grosso (Lovo, DLD-1 e HCT-116) e 4 linhas celulares de cancro pancreático (Capan-2, MIAPaCa-2, Panc-1 e BxPC-3) utilizando a mesma abordagem de acima. Como consequência, todas as células cancerígenas tinham uma intensidade de fluorescência pelo menos 35 % mais forte em comparação com a do controlo.
Tal como com os resultados obtidos acima, a expressão de proteínas CAPRIN-1 na superfície da membrana de células cancerígenas foi igualmente confirmada utilizando o anticorpo anti-CAPRIN-1 #1 obtido no Exemplo 2.
Exemplo 5 Preparação de anticorpo anti-CAPRIN-1 quimérico de ser humano-ratinho EP2818483B1 0 fragmento de ampliação de genes compreendendo o gene da região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-CAPRIN-1 de ratinho #1 obtido no Exemplo 2 foi tratado em ambas as extremidades com enzimas de restrição, depois purificado e inserido de acordo com um método habitual num vetor pcDNA4/myc-His (fabricado por Invitrogen Corp.) que jã tem inserções de gene de uma sequência líder derivada de anticorpo de ratinho e uma região constante de cadeia H de IgGi humano compreendendo a sequência de aminoãcidos da SEQ ID NO: 6. Igualmente, o fragmento de ampliação de genes compreendendo o gene da região variável de cadeia leve do anticorpo anti-CAPRIN-1 de ratinho #1 foi tratado em ambas as extremidades com enzimas de restrição, depois purificado e inserido de acordo com um método habitual num vetor pcDNA3.1/myc-His (fabricado por Invitrogen Corp.) que já tem inserções de gene de uma sequência líder derivada de anticorpo de ratinho e uma região constante de cadeia L de IgGl humano compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7.
Em seguida, o vetor recombinante com a inserção de gene da região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-CAPRIN-1 de ratinho #1 e o vetor recombinante com a inserção de gene da região variável de cadeia leve foram introduzidos nas células CH0-K1 (obtido em Riken Cell Bank). Especificamente, 2 x 103 células CH0-K1 foram cultivadas em 1 ml de um meio F12 de Ham (fabricado por Invitrogen Corp.) contendo 10 % de FBS por poço de uma placa de cultura de 12 poços e lavadas com PBS(-) . Em seguida, foi aí adicionado 1 ml de um meio F12 de Ham novo contendo 10 % de FBS por poço. 2 50 ng cada dos vetores lisados em 30 μΐ de QptiMEM (fabricado por Invitrogen Corp.) foram misturados com 30 μΐ de reagente de transfeção Polyfect (fabricado por Qiagen N.V.), e esta mistura foi adicionada a cada poço. As células CH0-K1 cotransfetadas com os vetores recombinantes foram cultivadas num meio F12 EP2818483B1 de Ham contendo 10 % de FBS complementados com 200 pg/ml de Zeocina (fabricado por Invitrogen Corp.) e 200 pg/ml de Geneticina (fabricado por Roche Diagnostics K.K.) e depois inoculadas para uma placa de 96 poços numa densidade de 0,5 células/poço para preparar linhas celulares que produzem de forma estável um anticorpo anti-CAPRIN-1 quimérico de ser humano-ratinho #1 com as regiões variáveis do anticorpo anti-CAPRIN-1 de ratinho #1 obtido no Exemplo 2. A mesma operação como acima foi efetuada utilizando os anticorpos anti-CAPRIN-1 de ratinho #2 e #3 em vez do anticorpo anti-CAPRIN-1 de ratinho #1 para preparar linhas celulares que produzem de forma estável qualquer um dos anticorpos monoclonais quiméricos de ser humano-ratinho #2 e #3 com as regiões variáveis dos anticorpos anti-CAPRIN-1 #2 e #3, respetivamente, obtidos no Exemplo 2. A linha celular preparada foi cultivada durante 5 dias num matraz de 150 cm2 numa densidade de 5 x 105 células/ml utilizando 30 ml de um meio OptiCHO livre de soro (fabricado por Invitrogen Corp.) para obter sobrenadantes de cultura contendo o anticorpo anti-CAPRIN-1 quimérico de ser humano-ratinho #1. Os sobrenadantes de cultura contendo qualquer um dos anticorpos anti-CAPRIN-1 quiméricos de ser humano-ratinho #2 e #3 foram igualmente obtidos através da mesma abordagem de acima.
Igualmente, as linhas celulares que produzem de forma estável anticorpos comparativos quiméricos de ser humano-ratinho 1 a 26 foram preparadas como amostras comparativas tal como acima respetivamente utilizando os seguintes anticorpos comparativos: anticorpos monoclonais derivados de ratinho anti-CAPRIN-1 descritos em W02010/016526 [um anticorpo comparativo 1 com a região variável de cadeia pesada que consiste na SEQ ID NO: 26 (aqui descrito; o mesmo é válido para a descrição abaixo) e a região variável de cadeia leve que consiste na SEQ ID NO: 27; um anticorpo comparativo 2 tendo a região variável de cadeia pesada que EP2818483B1 consiste na SEQ ID NO: 28 e a região variável de cadeia leve que consiste na SEQ ID NO: 29; um anticorpo comparativo 3 tendo a região variável de cadeia pesada que consiste na SEQ ID NO: 30 e a região variável de cadeia leve que consiste na SEQ ID NO: 31; um anticorpo comparativo 4 tendo a região variável de cadeia pesada que consiste na SEQ ID NO: 32 e a região variável de cadeia leve que consiste na SEQ ID NO: 33; um anticorpo comparativo 5 tendo a região variável de cadeia pesada que consiste na SEQ ID NO: 34 e a região variável de cadeia leve que consiste na SEQ ID NO: 35; um anticorpo comparativo 6 tendo a região variável de cadeia pesada que consiste na SEQ ID NO: 36 e a região variável de cadeia leve que consiste na SEQ ID NO: 37; um anticorpo comparativo 7 tendo a região variável de cadeia pesada que consiste na SEQ ID NO: 38 e a região variável de cadeia leve que consiste na SEQ ID NO: 39; um anticorpo comparativo 8 tendo a região variável de cadeia pesada que consiste na SEQ ID NO: 40 e a região variável de cadeia leve que consiste na SEQ ID NO: 41; um anticorpo comparativo 9 tendo a região variável de cadeia pesada que consiste na SEQ ID NO: 42 e a região variável de cadeia leve que consiste na SEQ ID NO: 43; um anticorpo comparativo 10 tendo a região variável de cadeia pesada que consiste na SEQ ID NO: 44 e a região variável de cadeia leve que consiste na SEQ ID NO: 45; e um anticorpo comparativo 11 tendo a região variável de cadeia pesada que consiste na SEQ ID NO: 46 e a região variável de cadeia leve que consiste na SEQ ID NO: 47], anticorpos monoclonals anti-CAPRIN-1 descritos em W02011/096517 [um anticorpo comparativo 12 tendo a região variável de cadeia pesada que consiste na SEQ ID NO: 43 (aqui descrito; o mesmo é válido para a descrição abaixo) e a região variável de cadeia leve que consiste na SEQ ID NO: 47; e um anticorpo comparativo 13 tendo a região variável de cadeia pesada que consiste na EP2818483B1 SEQ ID NO: 43 e a região variável de cadeia leve que consiste na SEQ ID NO], anticorpos monoclonais anti-CAPRIN-1 descritos em WO2011/096528 [um anticorpo comparativo 14 tendo a região variável de cadeia pesada que consiste na SEQ ID NO: 43 (aqui descrito; o mesmo é válido para a descrição abaixo) e a região variável de cadeia leve que consiste na SEQ ID NO: 47; um anticorpo comparativo 15 tendo a região variável de cadeia pesada que consiste na SEQ ID NO: 51 e a região variável de cadeia leve que consiste na SEQ ID NO: 55; um anticorpo comparativo 16 tendo a região variável de cadeia pesada que consiste na SEQ ID NO: 5 9 e a região variável de cadeia leve que consiste na SEQ ID NO: 63; um anticorpo comparativo 17 tendo a região variável de cadeia pesada que consiste na SEQ ID NO: 7 6 e a região variável de cadeia leve que consiste na SEQ ID NO: 80; um anticorpo comparativo 18 tendo a região variável de cadeia pesada que consiste na SEQ ID NO: 84 e a região variável de cadeia leve que consiste na SEQ ID NO: 88; e um anticorpo comparativo 19 tendo a região variável de cadeia pesada que consiste na SEQ ID NO: 92 e a região variável de cadeia leve que consiste na SEQ ID NO: 96], um anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 descrito em W02011/096519 [um anticorpo comparativo 20 tendo a região variável de cadeia pesada que consiste na SEQ ID NO: 42 (aqui descrito; o mesmo é válido para a descrição abaixo) e a região variável de cadeia leve que consiste na SEQ ID NO: 46], anticorpos monoclonais anti-CAPRIN-1 descritos em WO2011/096533 [um anticorpo comparativo 21 tendo a região variável de cadeia pesada que consiste na SEQ ID NO: 43 (aqui descrito; o mesmo é válido para a descrição abaixo) e a região variável de cadeia leve que consiste na SEQ ID NO: 51; um anticorpo comparativo 22 tendo a região variável de cadeia pesada que consiste na SEQ ID NO: 4 7 e a região variável de cadeia leve que consiste na SEQ ID NO: 51; e um anticorpo comparativo 23 EP2818483B1 tendo a região variável de cadeia pesada que consiste na SEQ ID NO: 63 e a região variável de cadeia leve que consiste na SEQ ID NO: 67], e anticorpos monoclonais anti-CAPRIN-1 descritos em WO2011/096534 [um anticorpo comparativo 24 tendo a região variável de cadeia pesada que consiste na SEQ ID NO: 43 (aqui descrito; o mesmo é válido para a descrição abaixo) e a região variável de cadeia leve que consiste na SEQ ID NO: 47; um anticorpo comparativo 25 tendo a região variável de cadeia pesada que consiste na SEQ ID NO: 43 e a região variável de cadeia leve que consiste na SEQ ID NO: 51; e um anticorpo comparativo 26 tendo a região variável de cadeia pesada que consiste na SEQ ID NO: 63 e a região variável de cadeia leve que consiste na SEQ ID NO: 67] . Cada linha celular preparada foi cultivada durante 5 dias num matraz de 150 cm2 numa densidade de 5 x 10b células/ml utilizando 30 ml de um meio OptiCHO livre de soro (fabricado por Invitrogen Corp.) para obter sobrenadantes de cultura contendo qualquer um dos anticorpos monoclonais comparativos quiméricos de ser humano-ratinho 1 a 26.
Exemplo 6 Avaliação de expressão de CAPRIN-1 na superfície de várias células cancerígenas utilizando anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1
Em seguida, as 8 linhas celulares de cancro da mama humano (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231V e MRK-nu-1), as 2 linhas celulares de cancro do rim (Caki-1 e Caki-2), a linha celular de cancro da bexiga urinária (T24), a linha celular de cancro do ovário (SK0V3), as 2 linhas celulares de cancro do pulmão (QG56 e A549), a linha celular de cancro da próstata (PC3), a linha celular de cancro da cérvix uterina (SW756), a linha celular de fibrossarcoma (HT1080), as 2 linhas celulares de tumor cerebral (T98G e U87MG), a linha celular de cancro gástrico (MNK28), as 3 linhas celulares de cancro do intestino grosso (Lovo, DLD-1 e HCT-116) e as 4 linhas EP2818483B1 celulares de cancro pancreãtico (Capan-2, MIAPaCa-2, Panc-1 e BxPC-3) confirmadas como tendo expressão de genes CAPRIN-1 foram examinadas relativamente à respetiva expressão de proteínas CAPRIN-1 na superfície celular utilizando o sobrenadante da cultura contendo o anticorpo anti-CAPRIN-l de ratinho #1 obtido no Exemplo 2. 106 células de cada linha celular foram centrifugadas em cada tubo de microcentrifugação de 1,5 ml. Cada sobrenadante da cultura (100 μΐ) contendo o anticorpo foi adicionado ao tubo e deixado assentar durante 1 hora em gelo. Após a lavagem com PBS, anticorpos IgG (H+L) antirratinho de cabra marcados com FITC (fabricado por Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) diluídos com PBS contendo 0,1 % de FBS foram aí adicionados e deixados assentar a 4 °C durante 30 minutos. Após a lavagem com PBS, a intensidade de fluorescência foi medida utilizando FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). 0 controlo negativo utilizado correspondia a células que reagiram apenas com anticorpos secundários. Como consequência, o anticorpo anti-CAPRIN-1 de ratinho #1 apresentou reatividade com intensidade de fluorescência pelo menos 30 % mais forte em comparação com a do controlo negativo. Os anticorpos anti-CAPRIN-1 de ratinho #2 e #3 produziram igualmente os mesmos resultados em comparação com os do anticorpo anti-CAPRIN-l de ratinho #1. Além disso, os anticorpos anti-CAPRIN-1 quiméricos de ser humano-ratinho #1, #2 e #3 preparados no Exemplo 5 foram purificados de acordo com um método habitual utilizando Proteína A Sefarose FF Hitrap (fabricado por GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.). Após a substituição por PBS(-), cada solução foi filtrada através de um filtro de 0,22 pm (fabricado por Millipore Corp.) e depois avaliada relativamente à respetiva reatividade com as linhas celulares de cancro. Os resultados foram iguais aos obtidos acima. Na avaliação dos anticorpos quiméricos de ser humano-ratinho, foram utilizados anticorpos IgG (H+L) anti- EP2818483B1 humanos de cabra marcados com FITC como anticorpos secundários. Isto demonstrou que as proteínas CAPRIN-1 são expressadas na superfície da membrana celular das linhas celulares de cancro humano. A taxa acima de melhoramento na intensidade de fluorescência foi indicada pela taxa de aumento na intensidade de fluorescência média (MFI) em cada linha celular e calculada de acordo com a seguinte expressão:
Taxa de aumento na intensidade de fluorescência média (Taxa de melhoramento na intensidade de fluorescência) (¾) = [(MFI de células que reagiram com os anticorpos anti-CAPRIII-l) - (MFI de Controlo) )/(MFI de Controlo) x 100.
Exemplo 7 Atividade antitumoral contra células cancerígenas de anticorpo anti-CAPRIN-1
Para avaliar cada anticorpo contra o péptido derivado de CAPRIN-1 (SEQ ID NO: 5) relativamente à força da respetiva citotoxicidade contra células cancerígenas que expressam CAPRIN-1, foi determinada a atividade ADCC. Os anticorpos policlonais de coelho contra o péptido (SEQ ID NO: 5) preparados no Exemplo 3 foram utilizados nesta avaliação. Foi realizada uma avaliação semelhante utilizando anticorpos policlonais de coelho contra outros péptidos derivados de CAPRIN-1 humana (anticorpos policlonais contra números de resíduos de aminoãcidos 50 a 98 na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 de anticorpos policlonais de coelho e de CAPRIN-1 humana contra números de resíduos de aminoácidos 233 a 305, que foram preparados no Exemplo 3) como anticorpos a serem comparados e os anticorpos de controlo derivados de soro de coelho normal sem tratamento preparados no Exemplo 3 como um controlo negativo. 106 células cada da linha celular de cancro da mama humano MDA-MB-231V, da linha celular de cancro do intestino grosso humano DLD-1, da linha celular de cancro pancreático humano Capan-2 e da linha celular de cancro do pulmão EP2818483B1 humano QG56 confirmadas como tendo expressão de CAPRIN-1 foram recolhidas num tubo de centrifugação de 50 ml, ao qual foram adicionados 100 pCi de crómio 51, seguindo-se a incubação a 37 °C durante 2 horas. Em seguida, as células foram lavadas três vezes com um meio RPMI1640 contendo 10 % de soro fetal de vitelo e adicionadas numa densidade de 2 x 103 células/poço a cada placa de fundo em V de 96 poços. Os anticorpos policlonais de coelho contra o péptido derivado de CAPRIN-1 humana (SEQ ID NO: 5) e dois tipos de anticorpos policlonais de coelho contra outros péptidos derivados de CAPRIN-1 humana (anticorpos policlonais de coelho contra números de resíduos de aminoãcidos 50 a 98 na SEQ ID NO: 2 de anticorpos policlonais de coelho e de CAPRIN-1 humana contra números de resíduos de aminoácidos 233 a 305) conforme descrito acima foram aí adicionados separadamente numa concentração de 1 pg/poço. Os linfócitos separados de sangue periférico de coelho ou humano de acordo com um método habitual foram ainda aí adicionados numa densidade de 4 x 103 células/poço e cultivados a 37 °C durante 4 horas em condições de 5 % de C02. Após a cultura, a quantidade de crómio (Cr) 51 libertada a partir de células cancerígenas danificadas foi medida no sobrenadante da cultura para calcular a atividade ADCC contra as células cancerígenas dos anticorpos policlonais de coelho contra cada péptido derivado de CAPRIN-1 humana. Como consequência, todos os anticorpos policlonais de coelho obtidos através de imunização com os péptidos parciais de CAPRIN-1 humana com uma sequência de aminoãcidos de números de resíduos de aminoácidos 50 a 98 ou números de resíduos de aminoácidos 233 a 305 da SEQ ID NO: 2 de CAPRIN-1 humana tinham uma atividade inferior a 8 % contra a linha celular de cancro da mama humano MDA-MB-231V, a linha celular de cancro do intestino grosso humano DLD-1, a linha celular de cancro pancreático humano Capan-2 e a linha celular de cancro do pulmão humano QG56. Em oposição, os grupos EP2818483B1 complementados com os anticorpos policlonais de coelho contra o péptido derivado de CAPRIN-1 humana (SEQ ID NO: 5) foram confirmados como tendo 28 % ou mais de atividade citotóxica contra todas as linhas celulares de cancro. Os anticorpos de controlo negativo tinham uma atividade inferior a 5 % contra todas as células cancerígenas. Estes resultados demonstraram que o anticorpo contra CAPRIN-1 mostrado na SEQ ID NO: 5 exerce uma atividade citotóxica forte contra células cancerígenas que expressam CAPRIN-1.
Estes resultados sobre a atividade citotóxica foram obtidos através de: mistura do anticorpo contra CAPRIN-1 utilizado na presente invenção, linfõcitos e 2 x 103 células de cada linha celular de cancro com crómio 51 incorporado, conforme descrito acima: cultura das células durante 4 horas; após a cultura, medição da quantidade de crómio 51 libertada no meio; e cálculo da atividade citotóxica contra cada linha celular de cancro de acordo com a seguinte expressão*: ^Expressão: Atividade citotóxica (%) = Quantidade de crómio 51 libertada a partir: das células alvo complementada com o anticorpo contra CAPHIlí-1 e linfócitos/Quantidade de crómio 51 libertada a partir de células alvo complementada com 1 If de ácido clorídrico x 100.
De forma semelhante, os anticorpos anti-CAPRIN-1 quiméricos de ser humano-ratinho #1, #2 e #3 contra uma sequência parcial (SEQ ID NO: 5) de CAPRIN-1 obtidos no Exemplo 5 foram avaliados relativamente à respetiva atividade citotóxica contra células de cancro humano. 0 sobrenadante da cultura de cada linha celular que produz qualquer um dos anticorpos foi purificado utilizando
Proteína A Sefarose FF Hitrap (fabricado por GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.) de acordo com um método habitual. Após a substituição por PBS(-), a solução foi filtrada através de um filtro de 0,22 pm (fabricado por Millipore Corp.). Q anticorpo resultante foi utilizado para ensaio de atividade. 106 células cada da linha celular de cancro da mama humano MDA-MB-231V, da linha celular de cancro do EP2818483B1 intestino grosso humano DLD-1, da linha celular de cancro pancreãtico humano Capan-2 e da linha celular de cancro do pulmão humano QG56 foram recolhidas num tubo de centrifugação de 50 ml, ao qual foram adicionados 100 uCi de crómio 51, seguindo-se a incubação a 37 °C durante 2 horas. Em seguida, as células foram lavadas três vezes com um meio RPMI1640 contendo 10 % de FBS e adicionadas numa densidade de 2 x 103 células/poço a cada placa de fundo em V de 96 poços para preparar células alvo. Os anticorpos purificados (anticorpos ant.i-CAPRIN-1 quiméricos de ser humano-ratinho #1, #2 e #3) e os anticorpos monoclonals comparativos quiméricos de ser humano-ratinho 1 a 26 obtidos no Exemplo 5 foram, cada um deles, aí adicionados numa concentração de 0,75 pg/poço. Uma população de células contendo células NK humanas foi separada utilizando um método habitual a partir de linfócitos de sangue periférico humano preparados de acordo com um método habitual. A população de células contendo células NK humanas que foi utilizada nesta avaliação foi preparada conforme apresentado em seguida: células mononucleares de sangue periférico humano separadas utilizando uma solução Histopaque de separação de gravidade específica para separação de células mononucleares de sangue periférico (Sigma-Aldrich Corp.) reagiram com anticorpos marcados com corante fluorescente FITC (anticorpo CD3 anti-humano, anticorpo CD20 anti-humano, anticorpo CD19 anti-humano, anticorpo CDllc anti-humano ou anticorpo anti-HLA-DR (Becton, and Dickinson and Company)) , e uma população de células contendo células NK não coloridas com os anticorpos foi separada como células efetoras utilizando um separador de células (FACS Vantage SE (Becton, and Dickinson and Company)) ou kit de separação de células NK humanas (fabricado por Miltenyi Biotec K.K.). A população de células separadas contendo células NK foi adicionada à placa numa densidade de 2 x 105 células/poço e cultivada a EP2818483B1 37 °C durante 4 horas em condições de 5 % de C02. Após a cultura, a quantidade de crómio 51 libertada a partir de células de tumor danificadas foi medida no sobrenadante da cultura para calcular a atividade citotóxica de cada anticorpo anti-CAPRIN-1 contra as células cancerígenas. 0 controlo negativo utilizado correspondia a células complementadas com anticorpos de controlo de isotipo. Como consequência, os anticorpos de controlo de isotipo utilizados tinham atividade citotóxica inferior a 5 % contra todas as linhas celulares de cancro, e os anticorpos monoclonals comparativos quiméricos de ser humano-ratinho 1 a 26 utilizados tinham atividade citotóxica inferior a 5 % contra MDA-MB-231V, inferior a 10 % contra DLD-1, inferior a 10 % contra Capan-2 e inferior a 10 % contra QG56. Em oposição, os anticorpos anti-CAPRIN-1 quiméricos de ser humano-ratinho #1, #2 e #3 tinham atividade citotóxica de 20 % ou superior contra MDA-MB-231V, 25 % ou superior contra DLD-1, 3 5 % ou superior contra Capan-2 e 3 0 % ou superior contra QG56. Igualmente, os anticorpos de controlo de isotipo utilizados e os anticorpos comparativos 1 a 26 utilizados tinham atividade citotóxica inferior a 4 % contra todas as outras células cancerígenas, linhas celulares de cancro da mama T47D, Hs578T, BT-20, SK-BR-3, MCF7 e MRK-nu-1, uma linha celular de glioma T98G, uma linha celular de cancro do pulmão A549, uma linha celular de cancro do pulmão Caki-1, uma linha celular de cancro da cérvix uterina SW756, uma linha celular de cancro da bexiga urinária T24, uma linha celular de cancro gástrico MKN28, uma linha celular de cancro do intestino grosso SW480, uma linha celular de leucemia AML5 e uma linha celular de linfoma Ramos. Em oposição, os anticorpos anti-CAPRIN-1 quiméricos de ser humano-ratinho #1, #2 e #3 foram confirmados como tendo 12 % ou mais de atividade citotóxica contra estas linhas celulares. Estes resultados mostraram que os anticorpos contra o péptido derivado de CAPRIN-1 EP2818483B1 mostrado na SEQ ID NO: 5 danificam células cancerígenas de expressão de CAPRIN-1 através da respetiva atividade ADCC, e demonstraram que os anticorpos anti-CAPRIN-1 quiméricos de ser humano-ratinho #1, #2 e #3 apresentam uma atividade citotóxica mais forte contra células de cancro humano em comparação com a dos anticorpos comparativos 1 a 26.
Estes resultados sobre a atividade citotóxica foram obtidos através de: mistura do anticorpo contra CAPRIN-1 utilizado na presente invenção, linfócitos (população de células contendo células NK) e 2 x 103 células de cada linha celular de cancro com crómio 51 incorporado, conforme descrito acima: cultura das células durante 4 horas; após a cultura, medição da quantidade de crómio 51 libertada no meio; e cálculo da atividade citotóxica contra cada linha celular de cancro de acordo com a seguinte expressão*: ♦Expressão: Atividade citotóxica (¾) = Quantidade de crómio 51 libertada a partir das células alvo complementada com o anticorpo contra CAPRIN-1 e linfócitos (população de células contendo células NK)/Quantidade de crómio 51 libertada a partir de células alvo complementada com 1 N de ácido clorídrico x 100.
Exemplo 8 O número de moléculas CAPRIN-1 na superfície de várias células cancerígenas reconhecidas pelo anticorpo anti-CAPRIN-1 #1
Uma linha celular de cancro da mama humano (MDA-MB-231V), uma linha celular de cancro do rim (Caki-1), uma linha celular de cancro da bexiga urinária (T24), uma linha celular de cancro do ovário (SKOV3), linhas celulares de cancro do pulmão (QG56 e A549), uma linha celular de cancro pancreático (Capan-2), uma linha celular de cancro da próstata (PC3), uma linha celular de cancro da cérvix uterina (SW756), uma linha celular de fibrossarcoma (HT1080), uma linha celular de tumor cerebral (T98G), uma linha celular de cancro gástrico (MKN28), linhas celulares de cancro do intestino grosso (Lovo e DLD-1) , uma linha celular de leucemia (AML5) e uma linha celular de linfoma EP2818483B1 (Ramos) foram examinadas utilizando um kit de ensaio "QIFIKIT" relativamente ao número de moléculas (fabricado por Dako Japan Inc.) e relativamente ao número de moléculas CAPRIN-1 na respetiva superfície celular reconhecida pelos anticorpos anti-CAPRIN-1 de ratinho #1, #2 e #3. De forma semelhante, o número de moléculas CAPRIN-1 na superfície destas várias células cancerígenas foi igualmente examinado utilizando os anticorpos monoclonais comparativos anti-CAPRIN-1 1 a 26 preparados no Exemplo 5.
De acordo com o protocolo fixado ao kit, cada anticorpo (anticorpos anti-CAPRIN-1 #1 e anticorpos comparativos 1 a 26) foi diluído em 5 pg/ml (em termos de concentração final) com PBS, e esta diluição foi adicionada a cada linha celular e reagiu durante 30 minutos. Após a lavagem com PBS, anticorpos IgG antirratinho marcados de forma fluorescente fixados ao kit foram adicionados como anticorpos secundários, juntamente com pérolas de calibração fixadas ao kit, a cada linha celular e deixados assentar durante 45 minutos em gelo. Cada linha celular e as pérolas de calibração foram lavadas com PBS. Em seguida, a intensidade de fluorescência foi medida utilizando FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company) para obter um valor médio de intensidade de fluorescência (média). Igualmente, um valor médio de intensidade de fluorescência (média) foi obtido através do mesmo ensaio conforme apresentado acima relativamente aos anticorpos comparativos. 0 controlo negativo utilizado correspondia a células que reagiram com anticorpos de controlo de isotipo, e foi igualmente obtida uma média. Cada valor médio de intensidade de fluorescência (média) foi utilizado para calcular o número de moléculas de acordo com o protocolo fixado ao kit. Como consequência, o número de moléculas CAPRIN-1 na superfície de várias células cancerígenas reconhecidas pelos anticorpos anti-CAPRIN-1 de ratinho #1, #2, #3 e os anticorpos comparativos 12 a 26 foi de 1Q5 ou EP2818483B1 mais por célula relativamente a todas as linhas celulares de cancro humano examinadas. Por outro lado, o número de moléculas reconhecidas pelos anticorpos comparativos 1 a 11 foi inferior a 105 por célula.
Exemplo 9 Preparação de anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 utilizando coelho (1) Preparação de anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de coelho #1 300 pg de uma proteína antigénica (proteína CAPRIN-1 humana) foram misturados com uma quantidade igual de um adjuvante de Freund completo. Esta mistura foi utilizada como uma solução de antigénio por coelho. Uma mistura do antigénio com um adjuvante de Freund incompleto foi utilizada para reforços. A solução de antigénio foi administrada de forma intraperitoneal a cada coelho com 7 semanas de idade. Em seguida, foram efetuados 7 reforços a cada 4 semanas para concluir a imunização. Quatro dias após a descarga final, o baço de cada coelho foi excisado e moído entre duas lamelas de vidro esterilizadas. Os procedimentos de lavagem com PBS(-) (fabricado por Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) e remoção do sobrenadante mediante centrifugação a 1500 rpm durante 10 minutos foram repetidos três vezes para obter células de baço. As células de baço obtidas foram misturadas com células de mieloma de coelho numa relação de 5:1. 200 μΐ de um meio IMDM contendo 10 % de FBS foram aquecidos até 37 °C e misturados com 800 μΐ de PEG1500 (fabricado por Boehringer Ingelheim GmbH), e a solução PEG assim preparada foi adicionada à mistura de células, que foi depois deixada assentar durante 5 minutos para a fusão celular. Após a remoção do sobrenadante mediante centrifugação a 1700 rpm durante 5 minutos, as células foram suspensas em 300 ml de um meio IMDM contendo 10 % de FBS complementados com 2 % de equivalente de uma solução HAT (fabricado por Life Technologies, Inc./Gibco) (meio seletivo HAT) . Esta suspensão foi inoculada para EP2818483B1 trinta placas de 96 poços (fabricado por Thermo Fisher Scientific Inc./Nunc) numa concentração de 100 μΐ/poço. As células de baço e as células de mieloma de coelho foram fundidas mediante cultura a 3 7 °C durante 7 dias em condições de 5 % de C02 para obter hibridomas.
Os hibridomas preparados foram rastreados com a reatividade de anticorpos produzidos pelos hibridomas com proteínas CAPRIN-1 como um índice. Uma solução de proteína CAPRIN-1 de 1 pg/ml foi adicionada a uma placa de 96 poços numa concentração de 100 μΐ/poço e deixada assentar a 4 °C durante 18 horas. Cada poço foi lavado três vezes com PBS-T. Em seguida, foi aí adicionada uma solução de soroalbumina bovina (BSA) de 0,5 % (fabricado por Sigma-Aldrich Corp.) numa concentração de 400 μΐ/poço e deixada assentar à temperatura ambiente durante 3 horas. A solução em cada poço foi deitada fora, e cada poço foi lavado três vezes com 4 00 μΐ de PBS-T. Em seguida, o sobrenadante da cultura de cada hibridoma obtido acima foi aí adicionado numa concentração de 100 μΐ/poço e deixado assentar à temperatura ambiente durante 2 horas. Cada poço foi lavado três vezes com PBS-T. Em seguida, anticorpos antirratinho marcados com HRP diluídos 5000 vezes com PBS foram aí adicionados numa concentração de 100 μΐ/poço e deixados assentar à temperatura ambiente durante 1 hora. Cada poço foi lavado três vezes com PBS-T. Em seguida, uma solução de substrato TMB (fabricado por Thermo Fisher Scientific Inc.) foi aí adicionada numa concentração de 100 μΐ/poço e deixada assentar durante 15 a 30 minutos para causar reação de cor. Após o desenvolvimento de cor, a reação foi terminada através da adição de 1 N de ácido sulfúrico numa concentração de 100 μΐ/poço. A absorvância foi medida a 450 nm e 595 nm utilizando um espetrómetro de absorção. Como consequência, foram selecionados diversos hibridomas que produzem anticorpos com elevada absorvância.
Os hibridomas selecionados foram adicionados a uma EP2818483B1 placa de 96 poços numa densidade de 0,5 células/poço e cultivados na placa. Após uma semana, foram observados hibridomas que formam colónias únicas nos poços. As células nestes poços foram ainda cultivadas, e os hibridomas clonados foram rastreados relativamente à reatividade de anticorpos produzidos pelos hibridomas com proteínas CAPRIN-1 como um índice. Uma solução de proteína CAPRIN-1 de 1 pg/ml foi adicionada a uma placa de 96 poços numa concentração de 100 μΐ/poço e deixada assentar a 4 °C durante 18 horas. Cada poço foi lavado três vezes com PBS-T. Em seguida, foi aí adicionada uma solução de BSA de 0,5 % numa concentração de 400 μΐ/poço e deixada assentar à temperatura ambiente durante 3 horas. A solução em cada poço foi deitada fora, e cada poço foi lavado três vezes com 400 μΐ de PBS-T. Em seguida, o sobrenadante da cultura de cada hibridoma obtido acima foi aí adicionado numa concentração de 100 μΐ/poço e deixado assentar à temperatura ambiente durante 2 horas. Cada poço foi lavado três vezes com PBS-T. Em seguida, anticorpos IgG antirratinho marcados com HRP diluídos 5000 vezes com PBS foram aí adicionados numa concentração de 100 μΐ/poço e deixados assentar à temperatura ambiente durante 1 hora. Cada poço foi lavado três vezes com PBS-T. Em seguida, uma solução de substrato TMB (fabricado por Thermo Fisher Scientific Inc.) foi aí adicionada numa concentração de 100 μΐ/poço e deixada assentar durante 15 a 30 minutos para causar reação de cor. Após o desenvolvimento de cor, a reação foi terminada através da adição de 1 N de ácido sulfúrico numa concentração de 100 μΐ/poço. A absorvância foi medida a 450 nm e 595 nm utilizando um espetrómetro de absorção. Como consequência, foram obtidas diversas linhas de hibridoma que produzem anticorpos monoclonais de coelho reativos com proteínas CAPRIN-1.
Em seguida, estes anticorpos monoclonais de ratinho reativos com proteínas CAPRIN-1 foram rastreados EP2818483B1 relativamente a anticorpos reativos com a superfície de células cancerígenas que expressam CAPRIN-1. Especificamente, 2 x 105 células cada de uma linha celular de cancro da mama humano MDA-MB-231V e uma linha celular de cancro do pulmão humano QG56 foram centrifugadas num tubo de centrifugação de 1,5 ml. 100 μΐ do sobrenadante da cultura de cada hibridoma obtido acima foram aí adicionados e deixados assentar durante 1 hora em gelo. Após a lavagem com PBS, anticorpos IgG (H+L) anticoelho marcados com FITC ou IgG (H+L) anticoelho marcado com Alexa 488 diluídos 100 vezes com PBS(-) contendo 0,05 % de FBS foram aí adicionados e deixados assentar durante 1 hora em gelo. Após a lavagem com PBS, a intensidade de fluorescência foi medida utilizando FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). Por outro lado, a mesma operação conforme apresentado acima foi efetuada utilizando um meio para cultura de hibridoma para preparar uma amostra de controlo negativo. Como consequência, foi selecionado um anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de coelho (anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de coelho #1) com uma intensidade de fluorescência mais forte em comparação com a do controlo negativo, isto é, reativo com a superfície das células cancerígenas MDA-MB-231 e QG56 que expressam CAPRIN-1.
Em seguida, foi identificado um epítopo CAPRIN-1 reconhecido pelo anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de coelho #1 selecionado. 93 péptidos candidatos, cada um consistindo em 12 a 16 aminoácidos na sequência de aminoãcidos da proteína CAPRIN-1 humana, foram sintetizados, e cada um foi dissolvido numa concentração de 1 mg/ml em DMSO. Cada péptido foi dissolvido numa concentração de 30 pg/ml numa solução tampão carbonato de sódio de 0,1 M (pH 9,6) . A solução foi adicionada numa concentração de 100 μΐ/poço a uma placa de 96 poços (fabricado por Thermo Fisher Scientific Inc./Nunc, N.° de produto: 436006) e deixada assentar durante a noite a 4 °C. EP2818483B1 A solução em cada poço foi deitada fora, e 10 mM de etanolamina/0,1 M de solução tampão carbonato de sódio (pH 9,6) foram aí adicionados numa concentração de 200 pL/poço e deixados assentar à temperatura ambiente durante 1 hora. Em seguida, a solução em cada poço foi deitada fora, e cada poço foi lavado duas vezes com PBS contendo 0,5 % de Tween 20 (PBST) para preparar um placa imobilizada com péptido.
Para verificação, as proteínas CAPRIN-1 foram imobilizadas em poços desta placa para preparar outra placa de acordo com o método descrito acima. 0 anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-! de coelho #1 com uma concentração de 0,1 pg/mL purificado através de um método habitual foi adicionado a 50 pL/poço a cada placa. Após a agitação à temperatura ambiente durante 1 hora, a solução em cada poço foi deitada fora, e cada poço foi lavado três vezes com PBST. Em seguida, uma solução de anticorpo secundário contendo anticorpos IgG de anticoelho marcados com HRP diluída 3000 a 4000 vezes com PBST foi aí adicionada numa concentração de 50 pL/poço. Em seguida, a solução em cada poço foi deitada fora, e cada poço foi lavado seis vezes com PBST. Uma solução de substrato TMB (fabricado por Thermo Fisher Scientific Inc.) foi aí adicionada numa concentração de 100 pL/poço e deixada assentar durante 15 a 30 minutos para causar reação de cor. Após o desenvolvimento de cor, a reação foi terminada através da adição de 1 N de ácido sulfúrico numa concentração de 100 pL/poço. A absorvância foi medida a 450 nm e 595 nm utilizando um espetrómetro de absorção. Como consequência, o anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de coelho (anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de coelho #1) apresentou reatividade apenas com um polipéptido com a sequência de aminoãcidos mostrada na SEQ ID NO: 5, entre os 93 péptidos sintetizados como sequências CAPRIN-1 parciais, e não apresentou reatividade com qualquer um dos outros polipéptidos. Igualmente, o anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de coelho #1 apresentou especificamente EP2818483B1 reatividade com a proteína CAPRIN-1. Este resultado demonstrou que o epítopo para o anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de coelho #1 ê contido no polipêptido da SEQ ID NO: 5 .
Em seguida, foram obtidos fragmentos ampliados de genes de codificação de região variável a partir do anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de coelho #1 obtido acima e analisados relativamente às respetivas sequências de genes e sequências de aminoácidos dos mesmos de acordo com o método descrito no Exemplo 5 de W02010/016526. Especificamente, ARNm foi extraído do hibridoma que produz o anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de coelho #1. Os genes de região variável de cadeia pesada (VH) e de região variável de cadeia leve (VL) deste anticorpo foram obtidos através de RT-PCR utilizando primers específicos para sequências de regiões variáveis de coelho. Para a sequenciação, estes genes foram clonados para vetores pCR2.1 (fabricado por Invitrogen Corp.). Cada uma das sequências de genes das regiões VH e VL em cada plasmídeo obtido mediante clonagem foi determinada utilizando um primer direto M13 e um primer reverso M13, e um sequenciador de fluorescência.
Como consequência, foi confirmado que o anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-· 1 de coelho #1 obtido compreende uma região variável de cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 52, em que CDR1, CDR2 e CDR3 na região variável de cadeia pesada consistem nas sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 8, 9 e 10, respetivamente, e uma região variável de cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 54, em que CDR1, CDR2 e CDR3 na região variável de cadeia leve consistem nas sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 11, 12 e 13, respetivamente. (2) Preparação de anticorpo anti-CAPRIN-1 quimérico de ser humano-ratinho #1
Um gene mostrado na SEQ ID NO: 51 para a expressão da EP2818483B1 região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de coelho #1 obtido acima e um gene mostrado na SEQ ID MO: 53 para a expressão da região variável de cadeia leve do mesmo foram inseridos num vetor para a expressão nas células de mamífero que têm uma inserção de gene de uma região constante de cadeia pesada de IgGl humano e num vetor para a expressão em células de mamífero que têm uma inserção de gene de uma região constante de cadeia leve de IgGl humano, respetivamente. Estes dois vetores de expressão recombinante preparados foram introduzidos em células de mamífero de acordo com um método habitual para obter um sobrenadante da cultura que contém um anticorpo ant.i-CAPRIN-1 de coelho humanizado (anticorpo anti-CAPRIN-1 quimérico de ser humano-ratinho #1). (3) Especificidade de antigénio, reatividade com célula cancerígena e atividade antitumoral de anticorpo anti-CAPRIN-1 quimérico de ser humano-ratinho #1 0 sobrenadante da cultura do anticorpo anti-CAPRIN-1 quimérico de ser humano-coelho #1 obtido no Exemplo 9(2) foi purificado de acordo com um método habitual utilizando Proteína A Sefarose FF Hitrap (fabricado por GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.). Após a substituição por PBS(-), a solução foi filtrada através de um filtro de 0,22 pm (fabricado por Millipore Corp.) e depois avaliada relativamente à respetiva especificidade de antigénio, reatividade com células cancerígenas e efeito antitumoral.
Primeiro, o anticorpo anti-CAPRIN-1 quimérico de ser humano-coelho #1 foi examinado tal como no Exemplo 9(1) relativamente à respetiva especificidade de reação para a proteína CAPRIN-1 e um polipéptido com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 como um epítopo para o anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de coelho #1. Como consequência, o anticorpo anti-CAPRIN-1 quimérico de ser humano-coelho #1 foi confirmado como tendo especificidade de reação relativamente à proteína CAPRIN-1 e ao EP2818483B1 polipéptido que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5, tal como com o anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de coelho #1.
Em seguida, o anticorpo anti-CAPRIN-1 quimérico de ser humano-coelho #1 foi examinado relativamente à respetiva reatividade com proteínas CAPRIN-1 na superfície celular das 9 linhas celulares de cancro da mama humano (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231, MRK-nu-1 e MDA-MB-468), as 3 linhas celulares de cancro do rim (Caki-1, Caki-2 e ACHM), a linha celular de cancro da bexiga urinária (T24), as 3 linhas celulares de cancro do ovário (SK0V3, IGR0V1 e 0VCAR3), as 2 linhas celulares de cancro do pulmão (QG56 e A549), as linhas celulares de cancro da próstata (PC3 e DU-145), a linha celular de cancro da cérvix uterina (SW756), a linha celular de fibrossarcoma (HT1080) , as 2 linhas celulares de tumor cerebral (T98G e U87MG), a linha celular de cancro gástrico (MNK28), as 3 linhas celulares de cancro do intestino grosso (Lovo, DLD-1 e HCT-116), as 4 linhas celulares de cancro pancreãtico (Capan-2, MIAPaCa-2, Panc-1 e BxPC-3), a linha celular de leucemia AML5 e a linha celular de linfoma Ramos confirmadas como tendo expressão de genes CAPRIN-1. 106 células de cada linha celular foram centrifugadas num tubo de microcentrifugação de 1,5 ml. Cada sobrenadante da cultura de células (100 μΐ) contendo o anticorpo foi adicionado ao tubo e deixado assentar durante 1 hora em gelo. Após a lavagem com PBS, anticorpos IgG (H+L) anti-humanos de cabra marcados com Alexa 488 (fabricado por Invitrogen Corp.) diluídos 100 vezes com PBS contendo 0,1 % de FBS foram aí adicionados e deixados assentar a 4 °C durante 60 minutos. Após a lavagem com PBS(-), a intensidade de fluorescência foi medida utilizando FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). 0 controlo negativo utilizado correspondia a células que reagiram apenas com anticorpos secundários. Como consequência, o EP2818483B1 anticorpo anti-CAPRIN-l quimérico de ser humano-coelho #1 apresentou reatividade com intensidade de fluorescência pelo menos 30 % mais forte em comparação com a do controlo negativo. Isto demonstrou que uma porção da proteína CAPRIN-1 mostrada na SEQ ID NO: 5 é expressada na superfície da membrana celular das linhas celulares de cancro humano. A taxa acima de melhoramento na intensidade de fluorescência foi indicada pela taxa de aumento na intensidade de fluorescência média (MFI) em cada linha celular e calculada de acordo com a seguinte expressão: Taxa de aumento na intensidade de fluorescência média (Taxa de melhoramento na intensidade de fluorescência) (%) ( (MFI de células que reagiram com os anticorpos anti-CAPRIN-1) - (MFI de Controlo))/(MFI de Controlo) x 100.
Em seguida, um gene mostrado na SEQ ID NO: 51 para a expressão da região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-CAPRIN-1 de coelho #1 e um gene mostrado na SEQ ID NO: 53 para a expressão da região variável de cadeia leve do mesmo foram inseridos num vetor para a expressão nas células de mamífero que têm uma inserção de gene de uma região constante de cadeia pesada de IgGl de ratinho e num vetor para a expressão em células de mamífero que têm uma inserção de gene de uma região constante de cadeia leve de IgGl de ratinho, respetivamente. Estes dois vetores de expressão recombinante preparados foram introduzidos nas células de mamífero de acordo com um método habitual para obter um sobrenadante da cultura contendo um anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 quimérico de ratinho-coelho #1, que foi depois purificado tal como acima para obter um anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 quimérico de ratinho-coelho #1 purificado. Q anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 quimérico de ratinho-coelho obtido #1 foi utilizado para medir o número de moléculas da SEQ ID NO: 5 nas células de cancro humano reconhecidas pelo anticorpo anti-CAPRIN-1 quimérico de ser humano-coelho #1 utilizando um kit de EP2818483B1 ensaio comercialmente disponível "QIFIKIT" (fabricado por Dako Japan Inc.). Como consequência, a linha celular de leucemia AML5 e a linha celular de linfoma Ramos tinham 105 moléculas por célula. As outras linhas celulares de cancro humano tinham 105 ou mais moléculas por célula.
Em seguida, o anticorpo anti-CAPRIN-1 quimérico de ser humano-coelho #1 foi avaliado relativamente à respetiva atividade antitumoral contra células de cancro humano que expressam CAPRIN-1. 10b células cada das linhas celulares de cancro da mama humano MDA-MB-231, MCF7 e SK-Br-3, a linha celular de cancro do intestino grosso humano DLD-1, a linha celular de cancro pancreático humano Capan-2, a linha celular de cancro do pulmão humano QG56, a linha celular de cancro do rim Caki-2, a linha celular de cancro do ovário SK0V3, as linhas celulares de cancro da próstata PC3 e DU-145, a linha celular de tumor cerebral T98G, a linha celular de cancro gástrico MKN28, a linha celular de leucemia AML5 e a linha celular de linfoma Ramos foram recolhidas num tubo de centrifugação de 50 ml, ao qual 100 pCi de crómio 51 foram depois adicionados, seguindo-se a incubação a 37 °C durante 2 horas. Em seguida, as células foram lavadas três vezes com um meio RPMI1640 contendo 10 % de FBS para preparar células alvo. 0 anticorpo anti-CAPRIN-1 quimérico de ser humano-coelho #1 purificado e os anticorpos monoclonais comparativos quiméricos de ser humano-ratinho 1 a 26 obtidos no Exemplo 5 foram, cada um deles, adicionados a uma placa de fundo em V de 96 poços numa concentração final de 5 pg/ml. Subsequentemente, as células NK humanas foram separadas de linfócitos de sangue periférico humano preparados de acordo com um método habitual, e aí adicionadas numa densidade de 2 x 10b células/poço. As células NK humanas utilizadas foram separadas utilizando um kit de separação de células NK (fabricado por Miltenyi Biotec K.K.) de células mononucleares de sangue periférico humano separadas EP2818483B1 utilizando uma solução Histopaque de separação de gravidade específica para separação de células mononucleares de sangue periférico (Sigma-Aldrich Corp.). As células NK foram misturadas numa densidade de 2 x 10J células/poço com o alvo e cada anticorpo adicionado à placa de fundo em V de 96 poços e cultivadas a 37 °C durante 4 horas em condições de 5 % de C02. Após a cultura, a quantidade de crómio 51 libertada a partir de células de tumor danificadas foi medida no sobrenadante da cultura para calcular a atividade citotóxica de cada anticorpo anti-CAPRIN-1 contra as células cancerígenas. 0 controlo negativo utilizado correspondia a células complementadas com anticorpos de controlo de isotipo. Como consequência, os anticorpos de controlo de isotipo utilizados tinham atividade citotóxica inferior a 6 % contra todas as linhas celulares de cancro, e os anticorpos monoclonais comparativos quiméricos de ser humano-ratinho 1 a 26 utilizados tinham atividade citotóxica inferior a 5 % contra MDA-MB-231V, inferior a 8 % contra MCF7 e SK-Br-3, inferior a 10 % contra a linha celular de cancro do intestino grosso humano DLD-1, inferior a 8 % contra a linha celular de cancro pancreãtico humano Capan-2, inferior a 5 % contra a linha celular de cancro do pulmão humano QG56, inferior a 11 % contra a linha celular de cancro do rim Caki-2, inferior a 12 % contra a linha celular de cancro do ovário SK0V3, inferior a 10 % contra as linhas celulares de cancro da próstata PC3 e DU-145, inferior a 7 % contra a linha celular de tumor cerebral T98G, inferior a 12 % contra a linha celular de cancro gástrico MKN28 e inferior a 3 % contra a linha celular de leucemia AML5 e a linha celular de linfoma Ramos. Em oposição, o anticorpo anti-CAPRIN-1 quimérico de ser humano-coelho #1 apresentou atividade antitumoral de 23 % contra MDA-MB-231V, 38 % contra MCF7, 23 % contra SK-Br-3, 28 % contra a linha celular de cancro do intestino grosso humano DLD-1, 35 % contra a linha celular de cancro EP2818483B1 pancreático humano Capan-2, 25 % contra a linha celular de cancro do pulmão humano QG56, 23 % contra a linha celular de cancro do rim Caki-2, 24 % contra a linha celular de cancro do ovário SK0V3, 18 % contra a linha celular de cancro da próstata PC3, 20 % contra DU-145, 15 % contra a linha celular de tumor cerebral T98G, 20 % contra a linha celular de cancro gástrico MKN28 e 9 % contra a linha celular de leucemia AML5 e a linha celular de linfoma Ramos. Estes resultados demonstraram que o anticorpo anti-CAPRIN-1 quimérico de ser humano-coelho #1 contra o péptido derivado de CAPRIN-1 mostrado na SEQ ID NO: 5 exerce atividade antitumoral contra células cancerígenas de expressão de CAPRIN-1 através da respetiva atividade ADCC, e demonstraram igualmente que o anticorpo anti-CAPRIN-1 quimérico de ser humano-coelho #1 apresenta uma atividade citotóxica mais forte contra células de cancro humano em comparação com a dos anticorpos comparativos 1 a 26.
Estes resultados sobre a atividade citotóxica foram obtidos através de: mistura do anticorpo contra CAPRIN-1 utilizada na presente invenção, células NK, e 2 x 103 células de cada linha celular de cancro com crómio 51 incorporado, conforme descrito acima: cultura das células durante 4 horas; após a cultura, medição da quantidade de crómio 51 libertada no meio,· e cálculo da atividade citotóxica contra cada linha celular de cancro de acordo com a seguinte expressão*: ^Expressão: Atividade citotóxica (¾) = Quantidade de crómio 51 libertada a pattit das células alvo complementada com o anticorpo contra CAPRIH-1 e linfócitos (células HK) / Quantidade de crómio 51 libertada a partir de células alvo complementada com 1 II de ácido clorídrico x 100 (estas quantidades de crómio 51 excluem todas a quantidade de um crómio 51 espontaneamente libertado). (4) Atividade antitumoral de anticorpo anti-CAPRIN-1 #1 conjugado com agente antitumoral
Um anticorpo anti-CAPRIN-1 conjugado com um agente EP2818483B1 antitumoral foi examinado relativamente ao respetivo efeito através do seguinte estudo: um anticorpo IgG anti-humano unido a saporina como um fãrmaco modelo de um agente antitumoral (Hum-ZAP (Advanced Targeting Systems, Inc.)) foi utilizado para avaliar se um conjugado do anticorpo anti-CAPRIN-1 quimérico de ser humano-coelho #1 e Hum-ZAP pode exercer um efeito antitumoral nas linhas celulares de cancro. A saporina exerce um efeito de morte de células apenas quando incorporada nas células.
Uma linha celular de cancro da mama humano SK-BR-3, uma linha celular de cancro pancreático humano Capan-2 e células de cancro da próstata humano PC-3 foram, cada uma deles, inoculadas num meio RPMI contendo 10 % de FBS numa placa de 96 poços numa densidade de 5 x 102 células/poço. Ao mesmo tempo, o anticorpo anti-CAPRIN-1 quimérico de ser humano-coelho #1 ou um anticorpo IgGl humano de controlo de isotipo foi aí adicionado como um anticorpo primário numa concentração final de 300 ng/ml. Subsequentemente, Hum-ZAP foi aí adicionado como um anticorpo secundário numa concentração final de 300 ng/ml, e as células foram cultivadas a 37 °C durante 5 dias. Após a cultura de 5 dias, a absorvância foi medida utilizando o Kit 8 de Contagem de Células (Dojindo Laboratories) e um leitor de microplacas para avaliar o crescimento celular.
Como consequência, a média da absorvância (O.D.) obtida utilizando o anticorpo de controlo de isotipo foi de 0,77 para SKBr-3, 1,93 para Capan-2 e 2,01 para PC-3, ao passo que a média da absorvância obtida utilizando o anticorpo anti-CAPRIN-1 quimérico de ser humano-coelho #1 foi de 0,34 para SK-Br-3, 1,62 para Capan-2 e 1,62 para PC-3. Estes resultados demonstraram que o conjugado do anticorpo anti-CAPRIN-1 quimérico de ser humano-coelho #1 e do anticorpo IgG anti-humano unido a saporina é incorporado nas células cancerígenas após a união do anticorpo anti-CAPRIN-1 quimérico de ser humano-coelho #1 a CAPRIN-1 na EP2818483B1 superfície da mertíbrana de células cancerígenas para apresentar atividade antitumoral mediada por saporina. (5) Preparação de anticorpos anti-CAPRIN-1 humanizados #1, #2 e #3
Em seguida, foi preparado um anticorpo humanizado do anticorpo anti-CAPRIN-1 de coelho #1. Com base nas informações de sequência de aminoãcidos sobre a região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de coelho #1 confirmado no Exemplo 9(2), a sequência de nucleótidos da SEQ ID NO: 15 foi concebida de modo a ser capaz de expressar uma região variável de cadeia pesada (SEQ ID NO: 16) contendo CDR1, CDR2 e CDR3 que consistem nos aminoãcidos das SEQ ID NOs: 8, 9 e 14, respetivamente, e as regiões marco conservadas derivadas das sequências de anticorpo humano. Esta sequência de nucleótidos foi inserida num vetor para a expressão nas células de mamífero que têm uma inserção de gene de uma região constante de cadeia pesada de IgGl humano. Igualmente, a sequência de nucleótidos da SEQ ID NO: 17 foi concebida de modo a ser capaz de expressar uma região variável de cadeia leve (SEQ ID NO: 18) contendo CDR1, CDR2 e CDR3 que consistem nos aminoãcidos das SEQ ID NOs: 11, 12 e 13, respetivamente, e as regiões marco conservadas derivadas das sequências de anticorpos humanos. Esta sequência de nucleótidos foi inserida num vetor para a expressão nas células de mamífero que têm uma inserção de gene de uma região constante de cadeia leve de IgGl humano. Estes dois vetores de expressão recombinante foram introduzidos em células de mamífero de acordo com um método habitual para obter um sobrenadante da cultura que contém um anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de coelho humanizado #1 (anticorpo anti-CAPRIN-1 humanizado #1).
Com base nas informações de sequência de aminoãcidos sobre a região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de coelho #1, a sequência de EP2818483B1 nucleótidos da SEQ ID NO: 20 foi igualmente concebida de modo a ser capaz de expressar uma região variável de cadeia pesada (SEQ ID NO: 21) contendo CDR1, CDR2 e CDR3 que consistem nos aminoãcidos das SEQ ID NOs: 8, 9 e 10, respetivamente, e as regiões marco conservadas derivadas das sequências de anticorpos humanos. Esta sequência de nucleótidos foi inserida num vetor para a expressão nas células de mamífero que têm uma inserção de gene de uma região constante de cadeia pesada de IgGl humano. Igualmente, a sequência de nucleótidos da SEQ ID NO: 22 foi concebida de modo a ser capaz de expressar uma região variável de cadeia leve (SEQ ID NO: 23) contendo CDR1, CDR2 e CDR3 que consistem nos aminoãcidos das SEQ ID NOs: 11, 12 e 13, respetivamente, e as regiões marco conservadas derivadas das sequências de anticorpos humanos. Esta sequência de nucleótidos foi inserida num vetor para a expressão nas células de mamífero que têm uma inserção de gene de uma região constante de cadeia leve de IgGl humano. Estes dois vetores de expressão recombinante foram introduzidos em células de mamífero de acordo com um método habitual para obter um sobrenadante da cultura contendo um anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de coelho humanizado #2 (anticorpo anti-CAPRIN-1 humanizado #2),
Com base nas informações de sequência de aminoãcidos sobre a região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de coelho #1, a sequência de nucleótidos da SEQ ID NO: 24 foi ainda concebida de modo a ser capaz de expressar uma região variável de cadeia pesada (SEQ ID NO: 25) contendo CDR1, CDR2 e CDR3 que consistem nos aminoãcidos das SEQ ID NOs: 8, 9 e 10, respetivamente, e as regiões marco conservadas derivadas das sequências de anticorpo humano. Esta sequência de nucleótidos foi inserida num vetor para a expressão nas células de mamífero que têm uma inserção de gene de uma região constante de cadeia pesada de IgGl humano. Igualmente, a sequência de EP2818483B1 nucleótidos da SEQ ID NO: 22 foi concebida de modo a ser capaz de expressar uma região variável de cadeia leve (SEQ ID NO: 23) contendo CDR1, CDR2 e CDR3 que consistem nos aminoãcidos das SEQ ID NOs: 11, 12 e 13, respetivamente, e as regiões marco conservadas derivadas das sequências de anticorpos humanos. Esta sequência de nucleótidos foi inserida num vetor para a expressão nas células de mamífero que têm uma inserção de gene de uma região constante de cadeia leve de IgGl humano. Estes dois vetores de expressão recombinante foram introduzidos em células de mamífero de acordo com um método habitual para obter um sobrenadante da cultura contendo um anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de coelho humanizado #3 (anticorpo anti-CAPRIN-1 humanizado #3) . (6) Especificidade de antigénio, reatividade com célula cancerígena e atividade antitumoral de anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 humanizado
Estes 3 anticorpos humanizados (anticorpos monoclonais anti-CAPRIN-1 humanizados #1 a #3) assim obtidos foram avaliados relativamente à respetiva reatividade com CAPRIN-1 tal como no Exemplo 9(3). Como consequência, estes anticorpos tinham reatividade com a proteína CAPRIN-1, o péptido de epítopo mostrado na SEQ ID NO: 5, e várias células cancerígenas no mesmo nível das do anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 quimérico de ser humano-coelho #1. Estes 3 anticorpos monoclonais anti-CAPRIN-1 humanizados foram ainda avaliados relativamente à respetiva atividade antitumoral contra várias células cancerígenas (linhas celulares de cancro da mama humano MDA-MB-231, MCF7 e SK-Br-3, linha celular de cancro do intestino grosso humano DLD-1, linha celular de cancro pancreático humano Capan-2, linha celular de cancro do pulmão humano QG56, linha celular de cancro do rim Caki-2, linha celular de cancro do ovário SK0V3, linhas celulares de cancro da próstata PC3 e DU-145, linha celular de tumor cerebral T98G, linha celular EP2818483B1 de cancro gástrico MKN28, linha celular de cancro pancreãtico Capan-2, linha celular de leucemia AML5 e linha celular de linfoma Ramos), tal como no Exemplo 9(3) . Como consequência, todos os anticorpos apresentaram atividade antitumoral ao mesmo nível da do anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 quimérico de ser humano-coelho #1.
Aplicabilidade Industrial 0 anticorpo da presente invenção é útil para o tratamento e/ou a prevenção de cancro.
LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Toray Industries, Inc. <120> Composição Farmacêutica para Tratamento e Prevenção de Cancro
<130> PH-55Q9-PCT <150> JP 2012-035238 <151> 21-02-2012 <160> 54 <170> Patentln versão 3.1
<210> 1 <211> 5562 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>
<221> CDS <222> ( 190) . . (2319) <223 > <400> 1 EP2818483B1 cagagggctg ctggctggct aagtcccfccc cgctcccggc tctcgcctca ctaggagcgg 60 ctctcggtgc agcgggacag ggcgaagcgg cctgcgccca cggagcgcgc gacactgccc 120 ggaagggacc gccacccttg ccccctcagc tgcccactcg tgatttccag cggcctccgc 180 gcgcgoacg atg ccc tcg gcc acc age cac age ggg age ggc age aag teg 231
Met Pro Ser Ala Thr Ser Eis Ser Gly Ser Gly Ser Lys Ser 15 10 tee gga ccg cca ccg ccg teg ggt tee tee ggg agt gag gcg gcc gcg 279
Ser Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Gly Ser Glu Ala Ala Ala 15 20 25 30 gga gee ggg gee gee gcg ccg get tet cag cac ccc gea acc ggc acc 327
Gly Ala Gly Ala Ala Ala Pro Ala Ser Gin His Pro Ala Thr Gly Thr 35 40 45 ggc get gtc cag acc gag gee atg aag cag att etc ggg gtg ate gac 375
Gly Ala Vai Gin Thr Glu Ala Met Lys Gin lie Leu Gly Vai lie Asp 50 55 60 aag aaa ctt cgg aac ctg gag aag aaa aag ggt aag ctt gat gat tac 423
Lys Lys Leu Axg Asn Leu Glu Lys Lys Lys Gly Lys Leu Asp Asp Tyr 65 70 " 75 cag gaa cga atg aac aaa ggg gaa agg ctt aat caa gat cag ctg gat 471
Gin Glu Arg Met Asn Lys Gly Glu Arg Leu Asn Gin Asp Gin Leu Asp 80 85 90 gee gtt tet aag tac cag gaa gtc aca aat aat ttg gag ttt gea aaa 519
Ala Vai Ser Lys Tyr Gin Glu Vai Thr Asn Asn Leu Glu Phe Ala Lys 95 100 105 110 gaa tta cag agg agt ttc atg gea cta agt caa gat att cag aaa aca 567
Glu Leu Gin Arg Ser Phe Met. Ala Leu Ser Gin Asp Ile Gin Lys Thr 115 120 125 EP2818483B1 ata aag aag aca gca cgt egg gag cag ctt atg aga gaa gaa get gaa 615 lie Lys Lys Thr Ala Arg Arg Glu Gin Leu Met Arg Glu Glu Ala Glu 130 135 140 cag aaa cgt tta aaa act gfca ctt gag cta cag tat gtt ttg gac aaa 663
Gin Lys Arg Leu Lys rhr Vai Leu Glu Leu Gin Tyr Vai Leu Asp Lys 145 150 155 ttg gga gat gat gaa gtg egg act gac ctg aaa caa ggt ttg aat gga 711
Leu Gly Asp Asp Glu Vai Arg Thr Aep Leu lys Gin Gly Leu Asn Gly 160 165 170 gtg cca ata ttg tcc gaa gag gag ttg tea ttg ttg gat gaa ttc tat 759 val Pro lie Leu Ser Glu Glu Glu Leu Ser Leu leu Asp Glu Phe Tyr 175 ISO 185 190 aag cta gta gac cct gaa egg gac atg age ttg agg ttg aat gaa cag 807
Lys leu val Asp Pro Glu Arg Asp Met Ser Leu Arg Leu Asn Glu Gin 195 200 205 tat gaa cat gaa tcc att cac ctg tgg gac ctg ctg gaa ggg aag gaa 855
Tyr Glu His Ala Ser Ile His Leu Trp Asp Leu leu Glu Gly Lys Glu 210 215 220 aaa cct gta tgt gga acc acc tat aaa gtt cta aag gaa att gtt gag 903
Lys Pro Val Cys Gly Thr Thr Tyr Lys Val Leu Lys Glu Ile Val Glu 225 230 235 cgt gtt ttt cag tea aac tac ttt gac age acc cac aac cac cag aat 951
Arg val Phe Gin Ser Asn Tyr Phe Asp Ser Thr His Asn His Gin Asn 240 245 250 ggg ctg tgt gag gaa gaa gag gca gee tea gca cct gca gtt gaa gac 999
Gly Leu Cys Glu Glu Glu Glu Ala Ala Ser Ala Pro Ala Val Glu Asp Ξ55 260 265 270 cag gta cct gaa get gaa cct gag cca gca gaa gag tac act gag caa L047
Gin Val Pro Glu Ala Glu Pro Glu Pro Ala Glu Glu Tyr Thr Glu Gin 275 280 285 agt gaa gtt gaa tea aca gag tat gta aat aga cag ttc atg gca gaa L095
Ser Glu Val Glu Ser Thr Glu Tyr Val Asn Arg Gin Phe Met Ala Glu 290 295 300 aca cag ttc acc agt ggt gaa aag gag cag gta gat gag tgg aca gtt L143
Thr Gin Phe Thr Ser Gly Glu Lys Glu Gin Val Asp Glu Trp Thr Val 305 310 315 gaa aeg gtt gag gtg gta aat. tea etc cag cag caa cct cag get gca LL91
Glu Thr val Glu Val Val Asn Ser Leu Gin Gin Gin Pro Gin Ala Ala 320 325 330 tcc cct tea gta cca gag ccc cac tet ttg act cca gtg get cag gca L239
Ser Pro Ser Val Pro Glu Pro His Ser Leu Thr Pro Val Ala Gin Ala 335 340 345 350 gat ccc ctt gtg aga aga cag ega gta caa gac ctt atg gca caa atg L287
Asp Pro Leu Val Arg Arg Gin Arg Val Sin Asp Leu Met Ala Gin Met 355 360 365 cag ggt ccc tat aat ttc ata cag gat tea atg ctg gat ttt gaa aat L335
Gin Gly Pro Tyr Asn Phe Ile Gin Asp Ser Met Leu Asp Phe Glu Asn EP2818483B1 370 375 380 cag aca ctt gat cct gcc att gta tct gca cag cat atg aat cca aca 1383
Gin Thr Leu Asp Pro Ala lie Val Ser Ala Gin Pro Met Asn Pro Thr 385 390 395 caa aac atg gac atg ccc cag ctg gtt tgc cct cca gtt cat tct gaa 1431
Gin Asn Met Asp Met Pro Gin Leu Val Cys Pro Pro Val His Ser Glu 400 405 410 tct aga ctt get cag cct aat caa gtt cct gta caa cca gaa geg aca 1479
Ser Arg Leu Ala Gin Pro Asn Gin Val Pro Val Gin Pro Glu Ala Thr 415 420 425 430 cag gtt cct ttg gta tea toe aca agt gag ggg tac aca gca tct caa 1527
Gin Val Pro Leu Val Ser Ser Thr Ser Glu Gly Tyr Thr Ala Ser Gin 435 440 445 ccc ttg tac cag cct tct cat get aca gag caa ega cca cag aag gaa 1575
Pro Leu Tyr Gin Pro Ser His Ala Thr Glu Gin Arg Pro Gin Lys Glu 450 455 450 cca att gat cag att cag gca aca ate tct tta aat aca gac cag act 1623
Pro He Asp Gin He Gin Ala Thr He Ser Leu Asn Thr Asp Gin Thr 465 470 475 aca gca tea tea tcc ctt cct get geg tct cag cct caa gta ttt cag 1671
Thr Ala Ser Ser Ser Leu Pro Ala Ala Ser Gin Pro Gin Val Phe Gin 480 4S5 490 get ggg aca age aaa cct tta cat age agt gga ate aat gta aat gca 1719
Ala Gly Thr Ser Lys Pro Leu His Ser Ser Gly He Asn Val Asn Ala 495 500 505 510 get cca tte caa tcc atg caa aeg gtg ttc aat atg aat gcc cca gtt 1767
Ala Pro Phe Gin Ser Met Gin Thr Val Phe Asn Met Asn Ala Pro Val 515 520 525 cct cct gtt aat gaa cca gaa act tta aaa cag caa aat cag tac cag 1815
Pro Pro Val Asn Glu Pro Glu Thr Leu Lys Gin Gin Asn Gin Tyr Gin 530 535 540 gcc agt tat aac cag age ttt tct agt cag cct cac caa gta gaa caa 1863
Ala Ser Tyr Asn Gin Ser Phe Ser Ser Gin Pro His Gin Val Glu Gin 545 550 555 aca gag ctt cag caa gaa cag ctt caa aca gtg gtt ggc act tac cat 1911
Thr Glu Leu Gin Gin Glu Gin Leu Gin Thr Val Val Gly Thr Tyr His 560 565 570 ggt tcc cca gac cag tcc cat caa gtg act ggt aac cac cag cag cct 1959
Gly Ser Pro Asp Gin Ser His Gin Val Thr Gly Asn His Gin Gin Pro 575 580 585 590 cct cag cag aac act gga ttt cca cgt age aat cag ccc tat tac aat 2007
Pro Gin Gin Asn Thr Gly Phe Pro Arg Ser Asn Gin Pro Tyr Tyr Asn 595 600 605 agt cgt ggt gtg tct cgt gga ggc tcc cgt ggt get aga ggc ttg atg 2055
Ser Arg Gly val Ser Arg Gly Gly Ser Arg Gly Ala Arg Gly Leu Met 61.0 615 620 aat gga tac egg ggc cct gcc aat gga ttc aga gga gga tat gat ggt 2103 EP2818483B1
Asn Gly Tyr Arg Gly Pro Ala Asn Gly Phe Arg Gly Gly Tyr Asp Gly 625 630 635 tac cgc cct tea ttc tot aac act cca aac agt ggt tat aca eag tet 2151
Tyr Arg Pro Ser Phe Ser Asn Thr Pro Asn Ser Gly Tyr Thr Gin Ser 640 645 650 cag ttc agt get ccc egg gat tac tet ggc tat caa egg gat gga tat 2199
Gin Phe Ser Ala Pro Arg Asp Tyr Ser Gly Tyr Gin Arg Asp Gly Tyr 655 660 ~ 665 670 cag cag aat ttc aag cga ggc tet ggg cag agt gga cca cgg gga gee 2247
Gin Gin Asn Phe Lys Arg Gly Ser Gly Gin Ser Gly Pro Arg Gly Ala 675 680 685 cca cga ggt cgt gga ggg ccc cca aga ccc aac aga ggg atg ccg caa 2295
Pro Arg Gly Arg Gly Gly Pro Pro Arg Pro Asn Arg Gly Met Pro Gin 690 695 700 atg aac act cag caa gtg aat taa tctgattcac aggattatgt ttaatcgcca 2349 Met Asn Thr Gin Gin Vai Asn 705 aaaacacact ggccagtgta ccataatatg ttaccagaag agttattatc tatttgttct 2409 ccctttcagg aaacttattg taaagggact gttttcatcc cataaagaca ggactacaat 2469 tgtcagcttt ctattacctg gatatggaag gaaactattt ttactctgca tgttctgtcc 2529 taagcgtcat cttgagcctt gcacatgata ctcagattcc tcacccttgc ttaggagtaa 2589 aacaatatac tttacagggt gataataatc tccatagtta tttgaagtgg cttgaaaaag 2649 gcaagattga cttttatgac attggataaa atctacaaat cagccctcga gttattcaat 2709 gataactgac aaactaaatt atttccctag aaaggaagat gaaaggagtg gagtgtggtt 2769 tggcagaaca actgcatttc acagcttttc cagttaaatt ggagcactga acgttcagat 2829 gcataccaaa ttatgcatgg gtectaatca caeatataag gctggctaec agctttgaca 2889 cagcactgtt catctggcca aacaactgtg gttaaaaaca catgtaaaat gcthtttaac 2949 agctgatact gtataagaca aagccaagat gcaaaattag gctttgattg gcactttttg 3009 aaaaatat.gc aacaaatatg ggatgtaatc cggatggccg cttctgtact taatgtgaaa 3069 tatttagata cctttttgaa cacttaacag tttatttgag acaatgaett ttgtaaggat 3129 tggtactatc tatcattcct tatgacatgt acattgtctg tcactaatcc ttggattttg 3189 ctgtattgtc acctaaattg gtacaggtac tgatgaaaat ctctagtgga taatcataac 3249 aetctcggtc acatgttttt ccttcagctt gaaagctttt ttttaaaagg aaaagatacc 3309 aaatgcctgc tgctaccacc cttttcaatt gctatctttt gaaaggcacc agtatgtgtt 3369 ttagattgat ttccctgttt cagggaaatc acggacagta gtttcagttc tgatggtata 3429 agcaaaacaa ataaaacgtt tataaaagfct gtatcttgaa acactggtgt tcaacagcta 3489 gcagcttatg tgattcaccc catgccacgt tagtgtcaca aattttatgg tttatctcca 3549 EP2818483B1 gcaaeatttc tctagfcaett gcactfcatta tettttgtct aatttaaect taaotgaatt 3609 ctccgfcttct cctggaggca tttatattca gtgataattc cttcccttag atgcataggg 3669 agagtctcta aatttgatgg aaatggacac ttgagtagtg acttagcctt atgtactctg 3729 ttggaatttg tgctagcagfc ttgagcacta gttctgtgtg cctaggaagt taatgctgct 3789 tattgtctca ttctgacttc atggagaatt aatcccacct ttaagcaaag gctactaagt 3849 taatggtatt ttctgtgcag aaattaaatt ttattttcag catttagcec aggaattctt 3909 ccagtaggtg ctcagctatt taasaacaaa actattctca ascattcatc attagacaac 3969 tggagttttt gctggttttg taacctaeca aaatggatag gctgttgaae attccacatt 4029 eaaaagtttt gtagggtggt gggaaatggg ggatcttcaa tgtttatttt aaaataaaat 4089 aaaataagtt cttgactttt ctcatgtgtg gttgtggtac atcatattgg aagggttaac 4149 ctgttacttt ggcaaatgag tatttttttg ctagcacctc cccttgcgtg ctttaaatga 4209 catctgcctg ggatgtacca caaccatatg ttacctgtat cttaggggaa tggataaaat 4269 atttgtggtt tactgggtaa tccctagatg atgtatgctt gcagtcctat ataaaautaa 4329 atttgctatc tgtgtagaaa ataatttcat gacatttaca atcaggactg aagtaagttc 4389 ttcacacagt gacctctgaa tcagtttcag agaagggatg ggggagaaaa tgccttctag 4449 gttttgaact tctatgcatt agt.gcagatg ttgtgaatgt gtaaaggtgt tcatagtttg 4509 actgtttcta tgtatgtttt ttcaaagaat tgttcctttt tttgaactat aatttttctt 4569 tttttggtta ttttaccatc acagtttaaa tgtatatctt ttatgtctct actcagacca 4629 tatttttaaa ggggtgcotc attatggggc agagaaettt tcaataagtc teattaagat 4689 ctgaatcttg gttctaagca ttctgtataa tatgtgattg cttgtcctag ctgcagaagg 4749 ccttttgttt ggtcaaatgc atattttagc agagtttcaa ggaaatgatt gtcacacatg 4809 tcactgtagc ctcttggtgt agcaaçctca catacaaaat acttttgtat atgcataata 4869 iaaatcatct catgtggata tg&amp;aacttct tttttaaaac ttaaaaaggt. agaatgtfcat 4929 tgattacctt gattagggca gttt.tatt.tc cagatcctaa taattcctaa aaaatatgga 4989 aaagtttttt ttcaatcatt gtaccttgat attaaaacaa atatccttta agtatttcta 5049 atcagttagc ttctacagtt cttttgtctc cttttatatg cagctcttac gtgggagact 5109 tttccactta aaggagacat agaatgtgtg cttattctca gaaggttcat taactgaggt 5169 gatgagttaa. caactagttg agcagtcagc ttcctaagtg ttttagçaca tttgttcatt 5229 atattttccg teatataact agaggaagtg gaatgeagat aagtgccgaa ttcaaaccct 5289 tcattttatg tttaagctec tgaatctgca ttccacttgg gttgttttta agcattctaa 5349 atttfcagttg attataagtt agatttcaca gaatcagtat tgcccttgat cttgtccttt 5409 ttatggagtt aaoggggagg aagacccetc aggaaaacga aagtaaattg ttaaggctoa 5469 tctteatacc tttttccatt ttgaatccta caaaaatact goaaaagact agtgaatgtt 5529 taaaattaca ctagattaaa taatatgaaa gtc 5562 <210> 2 <211> 709 EP2818483B1
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2
Met Pro Ser Ala Thr Ser His Ser Gly Ser Gly Ser Lys Ser Ser Gly 15 10 15
Pro Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Gly Ser Glu Ala Ala Ala Gly Ala 20 25 30
Gly Ala Ala Ala Pro Ala Ser Gin His Pro Ala Thr Gly Thr Gly Ala 35 40 45
Val Gin Thr Glu Ala Met Lys Gin lie Leu Gly Val lie Asp Lys Lys 50 55 60
Leu Arg Asn Leu Glu Lys Lys Lys Gly Lys Leu Asp Asp Tyr Gin Glu 65 70 75 30
Arg Met Asn Lys Gly Glu Arg Leu Asn Gin Asp Gin Leu Asp Ala Val 85 90 95
Ser Lys Tyr Gin Glu Val Thr Asn Asn Leu Glu Phe Ala Lys Glu Leu 100 105 110
Gin Arg Ser Phe Met Ala Leu Ser Gin Asp lie Gin Lys Thr lie Lys 115 120 125
Lys Thr Ala Arg Arg Glu Gin Leu Met Arg Glu Glu Ala Glu Gin Lvs 130 ~ 135 140
Arg Leu Lys Thr Val Leu Glu Leu Gin Tyr Val Leu Asp Lys Leu Gly 145 150 155 160
Asp Asp Glu Val Arg Thr Asp Leu Lys Gin Gly Leu Asn Gly Val Pro 165 170 175 lie Leu Ser Glu Glu Glu Leu Ser Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Lys Leu 180 185 190
Val Asp Pro Glu Arg Asp Met Ser Leu Arg Leu Asn Glu Gin Tyr Glu 195 200 205 EP2818483B1
His Ala Ser He His Leu Trp Asp Leu Leu Glu Gly Lys Glu Lys Pro 210 215 220 val Cys Gly Thr Thr Tyr Lys val Leu Lys Glu lie val Glu Arg val 225 230 235 240
Phe Gin Ser Asn Tyr Phe Asp Ser Thr His Asn His Gin Asn Gly Leu 245 250 255
Cys Glu Glu Glu Glu Ala Ala Ser Ala Pro Ala Val Glu Asp Gin Val 260 265 270
Pro Glu Ala Glu Pro Glu Pro Ala Glu Glu Tyr Thr Glu Gin Ser Glu 275 280 285
Val Glu Ser Thr Glu Tyr Val Asn Arg Gin Phe Met. Ala Glu Thr Gin 290 295 300
Phe Thr Ser Gly Glu Lys Glu Gin Val Asp Glu Trp Thr Val Glu Thr 305 310 315 320
Val Glu Val Val Asn Ser Leu Gin Gin Gin Pro Gin Ala Ala Ser Pro 325 330 335
Ser Val Pro Glu Pro His Ser Leu Thr Pro Val Ala Gin Ala Asp Pro 340 345 350
Leu Val Arg Arg Gin Arg Val Gin Asp Leu Met Ala Gin Met Gin Gly 355 360 365
Pro Tyr Asn Phe He Gin Asp Ser Met Leu Asp Phe Glu Asn Gin Thr 370 375 380
Leu Asp Pro Ala II® Val Ser Ala Gin Pro Met Asn Pro Thr Gin Asn 385 390 395 400
Met Asp Met Pro Gin Leu Val Cys Pro Pro Val His Ser Glu Ser Arg 405 410 415
Leu Ala Gin. Pro Asn Gin Val Pro Val Gin Pro Glu Ala Thr Gin Val 420 425 430
Pro Leu Val Ser Ser Thr Ser Glu Gly Tyr Thr Ala Ser Gin Pro Leu 435 440 445
Tyr Gin Pro Ser His Ala Thr Glu Gin Arg Pro Gin Lys Glu Pro lie EP2818483B1 450 455 460
Asp Gin lie Gin Ala Thr lie Ser Leu Asn Thr Asp Gin Thr Thr Ala 465 470 475 480
Ser Ser Ser Leu Pro Ala Ala Ser Gin Pro Gin Val Phe Gin Ala Gly 405 490 495
Thr Ser Lys Pro Leu His Ser Ser Gly lie Asn Val Asn Ala Ala Pro 500 505 510
Phe Gin Ser Met Gin Thr Val Phe Asn Met Asn Ala Pro Val Pro Pro 515 520 525
Val Asn Glu Pro Glu Thr Leu Lys Gin Gin Asn Gin Tyr Gin Ala Ser 530 535 540
Tyr Asn Gin Ser Phe Ser Ser Gin Pro His Gin Val Glu Gin Thr Glu 545 550 555 560
Leu Gin Gin Glu Gin Leu Gin Thr Val Val Gly Thr Tyr His Gly Ser 565 570 575
Pro Asp Gin Ser His Gin Val Thr Gly Asn His Gin Gin Pro Pro Gin 580 585 590
Gin Asn Thr Gly Phe Pro Arg Ser Asn Gin Pro Tyr Tyr Asm Ser Arg 595 600 605
Gly Val Ser Arg Gly Gly Ser Arg Gly Ala Arg Gly Leu Met Asn Gly 610 615 620
Tyr Arg Gly Pro Ala Asn Gly Phe Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Tyr Arg 625 630 635 640
Pro Ser Phe Ser Asn Thr Pro Asn Ser Gly Tyr Thr Gin Ser Gin Phe 645 650 655
Ser Ala Pro Arg Asp Tyr Ser Gly Tyr Gin Arg Asp Gly Tyr Gin Gin 660 665 670
Asn Phe Lys Arg Gly Ser Gly Gin Ser Gly Pro Arg Gly Ala Pro Arg 675 6B0 685
Gly Arg Gly Gly Pro Pro Arg Pro Asn Arg Gly Met Pro Gin Met Asn 690 695 700
Thr Gin Gin Val Asn 705 EP2818483B1
< 2 10 > 3 <211> 3553 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (190) . . (2274) <223 > <400> 3 EP2818483B1 cagagggctg ctggctggct aagtccctcc cgctcccggc tctcgcctca ctaggagcgg 60 ctctcggtgc agcgggacag ggcgaagcgg cctgcgccca cggagcgcgG gacactgccc 120 ggaagggacc gccaecettg cecectcagc tgcccacteg tgatttccag cggcctccgc 180 gcgcgcacg atg ccc teg gee acc age cac age ggg age ggc age aag teg 231
Mfet Pro Sec Ala Thr Set His Set Gly Ser Gly Ser Lys Ser 15 10 tcc gga ccg cca ccg ccg teg ggt tee tec ggg agt gag geg gee geg 27 9
Ser Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Gly Ser Glu Ala Ala Ala 15 20 25 30 gga gee ggg gcc gcc geg ccg get tet cag cac ccc gca ace ggc acc 327
Gly Ala Gly Ala Ala Ala Pro Ala Ser Gin His Pro Ala Thr Gly Thr 35 40 45 ggc get gtc cag acc gag gcc atg aag cag att etc ggg gtg ate gac 375
Gly Ala Val Gin Thr Glu Ala Met Lys Gin lie Leu Gly Val lie Asp 50 55 60 aag aaa ett egg sac ctg gag aag aaa aag ggt aag c-tt gat gat tac 42 3
Lys Lys Leu Arg Asn Leu Glu Lys Lys Lys Gly Lys Leu Asp Asp Tyr 65 70 75 cag gaa ega atg aac aaa ggg gaa agg ett aat caa gat cag ctg gat 471
Gin Glu Arg Met Asn Lys Gly Glu Arg Leu Asn Gin Asp Gin Leu Asp 80 85 90 gee gtt tet aag tac cag gaa gtc aea aat aat ttg gag ttt gca aaa 519
Ala Val Ser Lys Tyr Gin Glu Val Thr Asn Asn Leu Glu Phe Ala Lys 95 100 105 110 gaa tta cag agg agt ttc atg gca eta agt caa gat att cag aaa aca 567
Glu Leu Gin Arg Ser Phe Met Ala Leu Ser Gin Asp lie Gin Lys Thr 115 120 125 ata aag aag aca gca cgt egg gag cag ett atg aga gaa gaa get gaa 615 lie Lys Lys Thr Ala Arg Arg Glu Gin Leu Met Arg Glu Glu Ala Glu 130 135 140 cag aaa cgt tta aaa act gta ett gag eta cag tat gtt ttg gae aaa 663
Gin Lys Arg Leu Lys Thr Val Leu Glu Leu Gin Tyr Val Leu Asp Lys 145 150 155 ttg gga gat gat gaa gtg egg act gac ctg aaa caa ggt ttg aat gga 711
Leu Gly Asp Asp Glu Val Arg Thr Asp Leu Lys Gin Gly Leu Asn Gly EP2818483B1 160 165 170 gtg cca ata ttg tcc gaa gag gag ttg tea ttg ttg gat gaa ttc tat 759
Val Pro He Leu Ser Glu Glu Glu Leu Ser Leu Leu Asp Glu Phe Tyr 175 180 185 190 aag eta gta gac cct gaa egg gac atg age ttg agg ttg aat gaa cag 807
Lys Leu Val Asp Pro Glu Arg Asp Met Ser Leu Arg Leu Asn Glu Gin 135 200 205 tat gaa cat gcc tcc att cac ctg tgg gac ctg ctg gaa ggg aag gaa 855
Tyr Glu His Ala Ser lie His Leu Trp Asp Leu Leu Glu Gly Lys Glu 210 215 220 aaa cct gta tgt gga acc acc tat aaa gtt eta aag gaa att gtt gag 903
Lys Pro Val Cys Gly Thr Thr Tyr Lys Val Leu Lys Glu He Val Glu 225 230 235 cgt gtt ttt cag tea aac tae ttt gac age acc cac aac cac cag aat 951
Arg Val Phe Gin Ser Asn Tyr Phe Asp Ser Thr His Asn His Gin Asn 240 245 250 ggg ctg tgt gag gaa gaa gag gca gcc tea gca cct gca gtt gaa gac 999
Gly Leu Cys Glu Glu Glu Glu Ala Ala Ser Ala Pro Ala Val Glu Asp 255 260 265 270 cag gta cct gaa get gaa cct gag cca gca gaa gag tac act gag caa 1047
Gin Val Pro Glu Ala Glu Pro Glu Pro Ala Glu Glu Tyr Thr Glu Gin 275 280 285 agt gaa gtt gaa tea aca gag tat gta aat aga cag ttc atg gca gaa 1095
Ser Glu Val Glu Ser Thr Glu Tyr Val Asn Arg Gin Phe Met Ala Glu 290 295 300 aca cag ttc acc agt ggt gaa aag gag cag gta gat gag tgg aca gtt 1143
Thr Gin Phe Thr Ser Gly Glu Lys Glu Gin Val Asp Glu Trp Thr Val 305 310 315 gaa aeg gtt gag gtg gta aat tea etc cag cag caa cct cag get gca 1191
Glu Thr Val Glu Val Val Asn Ser Leu Gin Gin Gin Pro Gin Ala Ala 320 325 330 tcc cct tea gta cca gag ccc cac tet ttg act cca gtg get cag gca 1239
Ser Pro Ser Val Pro Glu Pro His Ser Leu Thr Pro Val Ala Gin Ala 335 340 345 350 gat ccc ett gtg aga aga cag ega gta eaa gac ett atg gca caa atg 1287
Asp Pro Leu Val Arg Arg Gin Arg Val Gin Asp Leu Met Ala Gin Met 355 360 365 cag ggt cec tat aat ttc ata cag gat tea atg ctg gat ttt gaa aat 1335
Gin Gly Pro Tyr Asn Phe lie Gin Asp Ser Met Leu Asp Phe Glu Asn 370 375 380 cag aca ett gat cct gcc att gta tet gca cag cct atg aat cca aca 1383
Gin Thr Leu Asp Pro Ala He Val Ser Ala Gin Pro Met Asn Pro Thr 385 390 395 caa aac atg gac atg ccc cag ctg gtt tgc cct cca gtt cat tet gaa 1431
Gin Asn Met Asp Met Pro Gin Leu Val Cys Pro Pro Val His Ser Glu 400 4Q5 410 tet aga ett get cag cct aat caa gtt ect gta caa cca gaa geg aca 1479 EP2818483B1
Ser Arg Leu Ala Gin Pro Asn Gin val Pro vai Gin Pro Glu Ala Thr 415 420 425 430 cag gtt cct ttg gta tea tcc aca agt gag ggg tac aca gea tet caa 1527
Gin Vai Pro Leu Vai Ser Ser Thr Ser Glu Gly Tyr Thr Ala Ser Gin 435 440 445 ccc ttg tac cag cct tet cat get aca gag caa cga cca cag aag gaa 1575
Pro Leu Tyr Gin Pro Ser His Ala Thr Glu Gin Arg Pro Gin Lys Glu 450 455 460 cca att gat cag att cag gea aca ate tet tta aat aca gac cag act 1623
Pro lie Asp Gin lie Gin Ala Thr lie Ser Leu Asn Thr Asp Gin Thr 465 470 475 aca gca tea tea tec ett cct get geg tet cag cct caa gta ttt cag 1671
Thr Ala Ser Ser Ser Leu Pro Ala Ala Ser Gin Pro Gin Val Phe Gin 480 485 490 get ggg aca age aaa cct tta cat age agt gga ate aat gta aat gca 1719
Ala Gly Thr Ser Lye Pro Leu His Ser Ser Gly He Asn Val Asn Ala 495 500 505 510 get cca ttc caa tec atg caa aeg gtg ttc aat atg aat gee cca gtt 1767
Ala Pro Phe Gin Ser Met Gin Thr Val Phe Asn Met Asn Ala Pro Val 515 520 525 cct cct gtt aat gaa cca gaa act tta aaa cag caa aat cag tac cag 1815
Pro Pro Val Asn Glu Pro Glu Thr Leu Lys Gin Gin Asn Glr. Tyr Gin 530 535 540 gee agt tat aac cag age ttt tet agt cag cct cac caa gta gaa caa 1863
Ala Ser Tyr Asn Gin Ser Phe Ser Ser Gin Pro His Gin Val Glu Gin 545 550 555 aca gag ett cag caa gaa cag ett caa aca gtg gtt ggc act tac cat 1911
Thr Glu Leu Gin Gin Glu Gin Leu Gin Thr Val Val Gly Thr Tyr His 560 565 570 ggt tee cca gac cag tec eat caa gtg act ggt aac eae cag cag cot 1959
Gly Ser Pro Asp Gin Ser His Gin Val Thr Gly Asn His Gin Gin Pro 575 580 585 590 cct cag cag aac act gga ttt cca cgt age aat cag ccc tat tac aat 2007
Pro Gin Gin Asn Thr Gly Phe Pro Arg Ser Asn Gin Pro Tyr Tyr Asn 595 600 605 agt cgt g~gt ghc[ tot cgt gga iggfc tec egt ggt g*et aga gpgc Her ratc^ 2055
Ser Arg Gly Val Ser Arg Gly Gly Ser Arg Gly Ala Arg Gly Leu Met 610 615 620 aat gga tac egg ggc cct gee aat gga ttc aga gga gga tat gat ggt 2103
Asn Gly Tyr Arg Gly Pro Ala Asn Gly Phe Arg Gly Gly Tyr Asp Gly 625 630 635 tac ege cct tea ttc tet aac act cca aac agt ggt tat aca cag tet 2151
Tyr Arg Pro Ser Phe Ser Asn Thr Pro Asn Ser Gly Tyr Thr Gin Ser 640 645 650 cag ttc agt get ccc egg gat tac tet ggc tat caa egg gat gga tat 2199
Gin Phe Ser Ala Pro Arg Aap Tyr Ser Gly Tyr Gin Arg Asp Gly Tyr 655 660 665 " 670 EP2818483B1 cag cag aat ttc aag cga ggc tct ggg cag agt gga cea egg gga gee 2247
Gin Gin &amp;sn Phe Lys Arg Gly Ser Gly Gin Sen Gly Pro &amp;rg Gly Ala 675 680 " 685 cca cga ggt aat att ttg tgg tgg tga tcctagctcc taagtggagc 2294
Pro Arg Gly Asn lie Leu Trp Trp 690 ttctgttctg geettggaag agctgttaat agtctgeatg ttaggaatac atttatcctt 2354 tccagaettg ttgctaggga tt.aaat.gaaa tgetetgrfctt ctaaaactta atcttggace 2414 caaattttaa tttttgaatg atttaatttt ccctgttact atataaactg tcttgaaaac 2474 tagaacatat tctcttctca gaaaaagtgt ttttccaact gaaaattatt tttcaggtcc 2534 taaaacctgc taaatgtttt taggaagtac ttactgaaac atttttgtaa gaeatttttg 2594 gaatgagatt gaacatttat ataaatttat tattcctctt tcattttttt gaaacatgcc 2654 tattatattt tagggccaga caccctttaa tggaeggata agacatagtt aacatttaga 2714 gaaccattta gaagtgatag aactaatgga atttgcaatg ccttttggac ctctattagt 2774 cr'.c5.5ttf-co vcssic-tt-s^fc-fcÇj 233-1¾ agetataett aaaaaaaatt acaggtttag agagtttttt gtttttcttt tactgttgga 2894 aaactacttc ccattttggc aggaagttaa cctatttaac aattagaget ageattteat 2954 gtagtctgaa attctaaatg gttctctgat ttgagggagg ttaaacatca aacaggtttc 3014 ctctattgge eataaeatgt. ataaaatgtg tgttaaggag gaattaeaae gtaetttgat 3074 ttgaatacta gtagaaactg gccaggaaaa aggtacattt ttctaaaaat taatggatca 3134 cttgggaatt actgacttga ctagaagtat caaaggatgt ttgcatgtga atgtgggtta 3194 tgttctttcc caccttgtag catattcgat gaaagttgag ttaactgata gctaaaaatc 3254 tgtt.tt.aaea gcatgt.aaaa agt.tatt.tta tctgttaaaa gtcattatac agttttgaat 3314 gttatgtagt ttctttttaa cagtttaggt aataaggtct gtttteatte tggtgctttt 3374 attaattttg atagtatgat gttacttact aetgaaatgt, aagetagagt gtaeaetaga 3434 atgtaagctc eatgagagea ggtacettgt etgtettcfce tgcfcgfcafccfc attcecaaeg 3494 ettgatgatg gtgcctggca catagtaggc acteaataaa tatttgttga atgaatgaa 3553
<210> 4 <211> 694 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 EP2818483B1
Mat Pro Sar Ala Thr Sar His Sar Gly Sar Gly Sar Lys Sar Sar Gly 15 10 15
Pro Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Gly Ser Glu Ala Ala Ala Gly Ala EP2818483B1 20 25 30
Gly Ala Ala Ala Pro Ala Ser Gin His Pro Ala Thr Gly Thr Gly Ala 35 40 45
Val Gin Thr Gin Ala Met Lys Gin lie Leu Gly Val lie Asp Lys Lys 50 55 60
Leu Arg Asn Leu Glu Lys Lys Lys Gly Lys Leu Asp Asp Tyr Gin Glu 65 70 ” 75 80
Arg Met. Asn Lys Gly Glu Arg Leu Asn Gin Asp Gin Leu Asp Ala Val 85 90 95
Ser Lys Tyr Gin Glu Val Thr Asn Asn Leu Glu Phe Ala Lys Glu Leu 100 105 110
Gin Arg Ser Phe Met Ala Leu Ser Gin Asp lie Gin Lys Thr lie Lys 115 120 125
Lys Thr Ala Arg Arg Glu Gin Leu Met Arg Glu Glu Ala Glu Gin Lys 130 135 140
Arg Leu Lys Thr val Leu Glu Leu Gin Tyr val Leu Asp Lys Leu Gly 145 150 155 160
Asp Asp Glu Val Arg Thr Asp Leu Lys Gin Gly Leu Asn Gly Val Pro 165 170 175 lie Leu Ser Glu Glu Glu Leu Ser Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Lys Leu 180 185 190
Val Asp Pro Glu Arg Asp Met Ser Leu Arg Leu Asn Glu Gin Tyr Glu 195 200 205
His Ala Ser lie His Leu Trp Asp Leu Leu Glu Gly Lys Glu Lys Pro 210 215 220
Val Cys Gly Thr Thr Tyr Lys Val Leu Lys Glu lie Val Glu Arg Val 225 230 235 240
Phe Gin Ser Asn Tyr Phe Asp Ser Thr His Asn His Gin Asn Gly Leu 245 250 255
Cys Glu Glu Glu Glu Ala Ala Ser Ala Pro Ala Val Glu Asp Gin Val 260 265 270 EP2818483B1
Pro Glu Ala Glu Pro Glu Pro Ala Glu Glu Tyr Thr Glu Gin Ser Glu 275 280 285
Val Glu Ser Thr Glu Tyr Val Asn Arg Gin Phe Met Ala Glu Thr Gin 290 295 300
Phe Thr Ser Gly Glu lys Glu Gin Val Asp Glu Trp Thr Val Glu Thr 305 310 315 320
Val Glu Val Val Asn Ser Leu Gin Gin Gin Pro Gin Ala Ala Ser Pro 325 330 335
Ser Val Pro Glu Pro His Ser Leu Thr Pro Val Ala Gin Ala Asp Pro 340 345 350
Leu Val Arg Arg Gin Arg Val Gin Asp Leu Met Ala Gin Met Gin Gly 355 360 365
Pro Tyr Asn Phe lie Gin Asp Ser Met Leu Asp Phe Glu Asn Gin Thr 370 375 380
Leu Asp Pro Ala lie Val Ser Ala Gin Pro Met Asn Pro Thr Gin Asn 385 390 395 400
Met Asp Met Pro Gin Leu Val Cys Pro Pro Val His Ser Glu Ser Arg 405 410 415
Leu Ala Gin Pro Asn Gin Val Pro Val Gin Pro Glu Ala Thr Gin Val 420 425 430
Pro Leu Val Ser Ser Thr Ser Glu Gly Tyr Thr Ala Ser Gin Pro Leu 435 440 445
Tyr Gin Pro Ser His Ala Thr Glu Gin Arg Pro Gin Lys Glu Pro lie 450 455 460
Asp Gin lie Gin Ala Thr lie Ser Leu Asn Thr Asp Gin Thr Thr Ala 465 470 475 480
Ser Ser Ser Leu Pro Ala Ala Ser Gin Pro Gin Val Phe Gin Ala Gly 485 490 495
Thr Ser Lys Pro Leu Hie Ser Ser Gly lie Asn val Asn Ala Ala Pro 500 505 510
Phe Gin Ser Met Gin Thr Val Phe Asn Met Asn Ala Pro Val Pro Pro 515 520 525 EP2818483B1
Vai Asn Glu Pro Glu Thr Leu Lys Gin Gin Asn Gin Tyr Gin Ala Ser 530 535 540
Tyr Asn Gin Ser Phe Ser Ser Gin Pro His Gin vai Glu Gin Thr Glu 545 550 555 560
Leu Gin Gin Glu Gin Leu Gin Thr Vai Vai Gly Thr Tyr His Gly Ser 565 570 575
Pro Asp Gin Ser His Gin Val Thr Gly Asn His Gin Gin Pro Pro Gin 580 585 590
Gin Asn Thr Gly Phe Pro Arg Ser Asn Gin Pro Tyr Tyr Asn Ser Arg 595 600 605
Gly Val Ser Arg Gly Gly Ser Arg Gly Ala Arg Gly Leu Met Asn Gly 610 615 620
Tyr Arg Gly Pro Ala Asn Gly Phe Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Tyr Arg 625 630 635 640
Pro Ser Phe Ser Asn Thr Pro Asn Ser Gly Tyr Thr Gin Ser Gin Phe 645 650 655
Ser Ala Pro Arg Asp Tyr Ser Gly Tyr Gin Arg Asp Gly Tyr Gin Gin 660 665 670
Asn Phe Lys Arg Gly Ser Gly Gin Ser Gly Pro Arg Gly Ala Pro Arg 675 680 685
Gly Asn lie Leu Trp Trp 690
<210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5
Ala Thr Gin Val Pro Leu Val Ser Ser Thr Ser Glu Gly Tyr Thr Ala 1 5 10 15 < 210 > 6 EP2818483B1 < 211> 330
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 EP2818483B1
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 15 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80
Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175
Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190
His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 20!) 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr He ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220
Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gin val Ser Leu Thr Cys Leu val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 EP2818483B1
Pro Ser Asp lie Ale Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 290 295 300 val Phe Ser Cys Ser val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320
Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330
<210> 7 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7
Thr val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 15 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser 35 40 45
Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 EP2818483B1
< 2 10 > 8 <211> 6 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 8
Gly Ser Tyr Tyr Met Ser 1 5
<210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 9
Tyr lie Tyr lie Gly Asp Gly Val Thr Ala Tyr Ala Asn Trp Ala Lys 1 5 10 15
Sly <210> 10
< 211 > 4 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus < 4 0 0 > 10
Gly Asn Lys Leu 1
<210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus EP2818483B1 < 4 Ο Ο > 11
Gin Ala Ser Gin Ser lie Ser Ser Tyr Leu Ala 15 10
<210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 12
Asp Ala Ser Asn Leu Asp Ser 1 5
<210> 13 <211> 14 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 13
Gin Cys Thr Ala Vai Ser Ser Ala Thr Ile Tyr Gly Asn Ala 15 10 < 210 > 14 <211> 4 <212> PRT <213> Airtificisl <220> <223> humanizado <400> 14 EP2818483B1
Gly Asn Arg L«u 1 < 210 > 15 <211> 399 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> humanizado <220> <221> signal_sequence <222> (1) . . (57) <223 > < 2 2 0 >
<221> CDS <222 > (58) , . (399) < 2 2 3 > <400> 15 EP2818483B1 atggagttcg ggctgagctg ggtctttctg gtcgctatta tcaaaggtgt ccagtgt 57 cag gtg cag ttg gtc gag tcc ggg gga ggc ctg gtc aag cct ggg gga 105
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 toe ctg aga etc tet tgc get gee tet gga ttc tcc ttc agt ggc age 153
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Fhe Ser Gly Ser 20 25 30 tac tac atg too tgg gtc ege cag get cca ggg aag ggg ctg gag tgg 201
Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 ate gca tac att tat att ggt gac ggt gtc act gcc tac gag aac tgg 249 lie Ala Tyr lie Tyr He Gly Asp Gly Val Thr Ala Tyr Ala Asn Trp 50 55 60 geg aaa ggc ega ttc acc ate tcc aga gat aac gca aag aat age ctg 297
Ala Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu 65 70 75 80 tac eta caa atg aac agt ctg egc gcc gag gac aeg gee gtt tat tte 345
Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe S5 90 95 tgt geg agg ggt aat agg ttg tgg ggc cag ggc acc ctg gtc acc gte 393
Cys Ala Arg Gly Asn Arg Leu Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 tcc tea 399
Ser Ser <210> 16 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanizado <400> 16 EP2818483B1
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cy* Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Gly Ser 20 25 30
Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 lie Ala Tyr lie Tyr He Gly Asp Gly Val Thr Ala Tyr Ala Asn Trp 50 55 60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu
65 70 75 SO
Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe 85 SO 95
Cys Ala Arg Gly Asn Arg Leu Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110
Ser Ser <210> 17 <211> 402 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> humanizado <220> <221> signal_sequence <222> (1) . . (66) <223 > <22G>
< 2 21> CDS <222> (67) . . (402) <223 > EP2818483B1 <4QG> 17 atggacatga gggtgcccgc acagctgcfcg gggcteetgc tgctctggct ctctggtgcc 60 agatgt gat att cag atg acc cag age cca age tee etc age gca get 108
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Sec Ser Leu Ser Ala Ala 15 10 gtg gga gae ege gtc acc ate aag tgc cag gee agt cag age att agt 156
Val Gly Asp Arg Val Thr lie Lys Cys Gin Ala Ser Gin Ser lie Ser 15 20 25 30 age tac tta gee tgg tat cag cag aaa cca ggg aag ect ccc aag ege 204
Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Arg 35 40 45 ctg ate tat gat gca toe aat ctg gat fcet ggg gtc cca teg egg ttc 252
Leu He Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 tee ggc agt gga tet ggg aca gae ttc act ttt acc ate age age ctg 300
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu 65 70 75 cag cct gag gat ate gee act tac tac tgt caa tgc act get gtt agt 348
Gin Pro Glu Asp He Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Cys Thr Ala Val Ser 80 85 90 agt get act att tat gga aat get ttc ggc gga ggg ace aag gtg gag 396
Ser Ala Thr lie Tyr Gly Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lye val Glu 95 100 105 110 ate aaa 402
He Lys <210> 18 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanizado <400> 18 EP2818483B1
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser leu Ser Ala Ala Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Lys Cys Gin Ala Ser Gin Ser lie Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Arg Leu lie 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 €0
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Cys Thr Ala Val Ser Ser Ala 85 90 95
Thr lie Tyr Gly Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 110 < 210 > 19 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanizado < 4 0 0 > 19
He Ser Gin Ala Val His Ala Ala Hxs Ala Glu Xle Asn Glu Ala Gly 15 10 15
Arg <210> 20 <211> 399 <212> ADN <213> Artificial EP2818483B1 < 2 2 Ο > <223> humanizado <220> <221> signal_sequence <222> (1) . . (57) <223 > <220>
<221> CDS <222 > (58) . . (399) <223 > <400> 20 atggagtfctg ggctgagetg αgν.t1'.τ:.c:ctt gtfcgctattt fcaaaaggfcgt ccagfcgt 57 gag gtg cag etc gtg gaa tcc gga ggc ggc etc gtg cag cct ggc gge 105
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15 age ctg agg etc tec tgc gee get tec ggc ttc tec ttc age ggc age 153
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Gly Ser 20 25 30 tac tac atg age tgg gtg agg cag get ccc gga aag ggc etc gag tgg 201
Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 att gee tac att tac ate ggc gae ggc gtc acc gee tac get aae tgg 249
He Ala Tyr He Tyr He Gly Asp Gly Val Thr Ala Tyr Ala Asn Trp 50 55 60 gee aaa ggc agg ttc aca ate age aag gat aae age aag aat ace etc 297
Ala Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80 tac ctg cag atg aae tec ctg agg gee gaa gae aca gee gtc tac ttt 345
Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe 85 90 95 tgc get egg ggc aae aaa ctg tgg ggc cct gge aca ctg gtg aca gtg 393
Cys Ala Arg Gly Asn Lys Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 age tec 399
Ser Ser <210> 21 <211> 114 EP2818483B1
<212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanizado <400> 21
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Sly Phe Ser Fhe Ser Sly Ser 20 25 30
Tyr Tyr Met Ser Trp val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Sly Leu Glu Trp 35 40 45 lie Ala Tyr He Tyr He Gly Asp Gly Val Thr Ala Tyr Ala Asn Trp 50 55 60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80
Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe 85 90 95
Cys Ala Arg Gly Asn Lys Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110
Ser Ser <210> 22 <211> 402 <212> ADN <213> Artificial <220 < 2 2 3 > humani z ado <220> <221> signal_sequence EP2818483B1 <222 > (1)..(66) <223 > <220>
< 2 21> CDS <222> (67) . . (402) <223 > <400> 22 atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 60 agatgt gac ate cag atg ace cag age ccc age age ctg age gee age 108
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 15 10 gtg ggc gac aga gtg acc ate aag tgc cag gee age cag age ate age 156
Val Gly Asp Arg Val Thr lie Lys Cys Gin Ala Ser Gin Ser lie Ser 15 20 25 30 age tac ctg gee t.gg tac cag cag aag ccc ggc aag gee ccc aag aga 204
Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg 35 40 45 ctg ate tac gac gee age aac ctg gac age ggc gtg cec age aga ttc 252
Leu lie Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 age ggc age ggc age ggc acc gac ttc acc ttc acc ate age age ctg 300
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu 65 70 75 cag ccc gag gac ate gee acc tac tac tgc cag tgc acc gee gtg age 348
Gin Pro Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Cys Thr Ala Val Ser
80 85 SO age gee aec ate tao ggc aac gee ttc ggc ggc ggc acc aag gtg gag 396
Ser Ala Thr lie Tyr Gly Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 110 ate aag 402 lie Lys <210> 23 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanizado EP2818483B1 <4QG> 23
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Lys Cys Gin Ala Ser Gin Ser lie Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Peo Lys Arg Leu lie 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Cys Thr Ala Val Ser Ser Ala 85 90 95
Thr lie Tyr Gly Asn Ala Phe Gly Glv Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 110 < 210 > 24 <211> 399 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> humanizado <220> <221> signal_sequence <222> (1) . . (57) <223 > <220>
<221> CDS <222 > (58) ,. (399) < 2 2 3 > EP2818483B1 <4QG> 24 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctt gt.tgctat.tt taaaaggtgt ccagtgt 57 gag gtg cag etc gtg gaa tee gga ggc ggc etc gtg cag cct ggc ggc 105
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15 age ctg agg etc tee tgc gee get tee ggc ttc tee ttc age ggc age 153
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Gly Ser 20 25 30 tac tac atg age tgg gtg agg cag get ccc gga aag ggc etc gag tgg 201
Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 att gee tac att tac ate gge gae ggc gtc acc gee tac get aac tgg 24 9 lie Ala Tyr lie Tyr lie Gly Asp Gly Val Thr Ala Tyr Ala Asn Trp 50 55 60 gee aaa ggc agg ttc aca ate age agg gat aac age aag aat acc etc 297
Ala Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80 tac ctg cag atg aac tec ctg agg gee gaa gae aca gee gtc tae tae 345
Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 tgc get egg ggc aac aaa ctg tgg ggc cct ggc aca ctg gtg aca gtg 393
Cys Ala Arg Gly Asn Lys Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 age tee 399
Ser Ser < 210 > 2 5 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanizado <400> 25 EP2818483B1
Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Gly Ser 20 25 30
Tyr Tyr Hat Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 lie Ala Tyr lie Tyr lie Gly Asp Gly Vai Thr Ala Tyr Ala Asn Trp 50 55 60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80
Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Gly Asn Lys Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Vai Thr Vai iço 105 no
Ser Ser
<210> 26 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 26
Gly Tyr Phe Met Asn 1 5
<210> 27 < 211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 27 EP2818483B1
Arg lie Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gin Lys Phe Lys 15 10 15
Giy
<210> 28 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 28
Arg lie His Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Tyr 15 10
<210> 29 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 29 EP2818483B1
Gly Pro Glu Leu val Lys Pro Gly Ala Ser val Lys He Ser Cys lys 15 10 15
Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Phe Met Asn Trp Val Met Gin 20 25 30
Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp He Gly Arg He Asn Pro Tyr Asn 35 40 45
Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gin Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr 50 55 60
Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala His Met Glu Leu Arg Ser Leu Ala
65 70 75 SO
Ser Glu Asp Ser Ala val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg He His Tyr Tyr 85 90 95
Tyr Gly Ser Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Glu Pro His
100 105 HO
His
<210> 30 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30
Arg Ala Ser Lys Ser lie Ser Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Glu 15 10 15
< 210 > 31 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 31
Ser Gly Ser Thr Leu Gin Ser 1 5 EP2818483B1
<210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 32
Gin Gin His Asn Gin Tyr Pro Trp Thr 1 5
<210> 33 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 33
Asp Val Gin lie Thr Gin Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Thr lie Thr II· Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser lie Ser Lys Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gin Ser Gly lie Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gin Gin His Asn Glu Tyr Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 34 <211> 339 EP2818483B1
< 212 > ADN <213> Mus musculus <400> 34 ggaectgage tggtgaagcc tggggcttca gtgaagatat cctgcaaggc ttctggttac Ê0 tcatttactg gctactttat gaactgggtg atgcagagec atggaaagag ccttgagtgg 120
attggaogta ttaatcctta caatggtgat actttctaca accagaagtt caagggcaag ISO gccacattga ctgtagacaa atcctctagc acagcccaca tggagctccg gagcctggca 240 tctgaggact ctgcagtcta ttattgtgca agacgcatcc attactacta cggtagtagc 300 tactatgcta tggactactg gggtcaagaa cctcatcac 339
< 210 > 3 5 <211> 324 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 35 gatgtccaga taacccagtc tccatcttat cttgctgcat ctcctggaga aaccattact 60 attaattgca gggcaagtaa gagcattagc aaatatttag cctggtatea agagaaacct 120 gggaaaacta ataagcttot tatctactct ggatccactt tgcaatctgg aattccatca 180 a g g· 11.cωqtg gc&amp;gtggafcc cgçt.acaga 1 fcfccactcfcca ccafccagfcag ccfcggagccfc 240 gaagattttg caatgtatta ctgtcaacag cataatgaat acccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa acgg 324
< 210 > 3 6 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 36 EP2818483B1
Glu Tyr lie lie His 1 5
<210> 37 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 37
Trp Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Ser lie Lys Tyr Asn Glu lys Phe Lys 1 5 10 15
Asp
< 210 > 3 8 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 38
His Glu Val Tyr Tyr Asp Tyr Asp Lys Ser Met 15 10
<210> 39 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 39 EP2818483B1
Gly Ala Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys 15 10 15
Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr He lie His Trp val Lys Gin 20 25 30
Arg Ser Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Ser 35 40 45
Gly Ser II© Lys Tyr Asn Glu Lys Ph© Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr 50 55 60
Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr val Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr 65 70 75 80
Sex Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg His Glu Val Tyr Tyr 85 90 95
Asp Tyr Asp Lys Ser Met Leu Trp Thr Thr Gly Val Lys Asn Leu He 100 105 110
Arg
<210> 40 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 40
Leu Tyr Ser Ser Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin 1 5 10 15
< 210 > 41 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 41 EP2818483B1
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5
< 210 > 4 2 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 42
Gin Gin Tyr Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr 1 5
<210> 43 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 43 EP2818483B1
Ser Pro Ser Ser Leu Ala Vai Ser Vai Gly Glu Lya Vai Thr Met Ser 15 10 15
Cys Lya Sar Sar Gin Sar Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gin Lya Asn Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60
Sar Gly Sar Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Sar Sar Vai Lys Ala 65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Tyr Ser Tyr Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 44 <211> 339
< 212 > ADN <213> Mus musculus <400> 44 ggagetgggc tggtgaaacc cggggcatca gtgaagctgt cetgcaaggc ttctggctac 60 accttcactg agtatattat acactgggta aagcagaggt ctggacaggg tcttgagtgg 120
attgggtggt tttaccctgg aagtggtagt ataaagtaca atgagaaatt caaggacaag ISO gccacattga otgcggacaa atcctccagc acagtctata tggagcttag tagattgaca 240 tctgaagact ctgcggtcta tttctgtgca agacacgagg tctactatga ttacgacaag 300 tctatgctat ggactactgg ggtcaagaac ctcatccgc 339 <210> 45 <211> 324
< 212 > ADN <213> Mus musculus EP2818483B1 <400> 45 tctccatcct cccfc&amp;gcrfcgt: glcagfct:gga gagaaggfcfca cfcabgagctg caagfcccagfc 60 cagagccttt tatatagtag caatcaaaag aactacttgg cctggtacca gcagaaacca 120 gggcagtctc ctaaactgct gatttactgg gcatccacta gggaatctgg ggtccctgat 180 cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tgtgaaggct 240 gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa tattatagct atccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tggaaataaa acgg 324
<210> 46 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 46
Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn 1 5
<210> 47 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 47
Tyr lie Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn 15 10 15
Arg
< 210 > 4 8 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus EP2818483B1 <4QG> 48
Gly Met Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Ala Lys Asp 15 10
<210> 49 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 9
Gly Pro Gly Leu val Lys Pro Ser Gin Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser 15 10 15
Val Thr Gly Tyr Ser lie Thr Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn Trp lie Arg 20 25 30
Gin Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr lie Ser Tyr Asp 35 40 45
Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg lie Ser lie Thr 50 55 60
Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr 65 70 75 80
Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Thr Gly Met Ala Trp Phe 85 90 95
Ala Tyr Trp Ala Lys Asp Ser Val Thr Pro Pro 100 105 <210> 50 <211> 321
< 212 > ADN <213> Mus musculus <400> 50 EP2818483B1 ggacctggcc tcgtgaaacc ttctcagtct ctgtctctce cctgcfcctgt cactggctac 60 fcccafccacca gtggfcfcatta ctggaactgg atccggcagt ttccaggaaa caaactggaa 120 tggafcgggct acataagcta cgacggtagc aataaotaca acccatctct caaaaatcga 180 atctccatca etcgtgacac atetaagaae cagtttttcc tgaagttgaa ttctgtgact 240 actgaggaea cagctacata ttactgtget actgggatgg cctggtttgc ttactgggcc 300 aaggactctg toacgccgcc t 321 < 210 > 51 <211> 393 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> humanizado <220> <221> signal_sequence <222> (1) . . (57) <223 > <220>
<221> CDS <222 > (58) . . (393) <223 > <400> 51 EP2818483B1 atggagactg ggctgcgctg gcttctcetg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgt 57 cag tea ttg gag gag tee ggg gga gac ctg gtc aag cot ggg gca tee 105
Gin San Leu Glu Glu San Gly Gly Asp Leu val Lys Pro Gly Ala San 1 5 10 15 ctg aca etc acc tgc aca gee tet gga ttc tec ttc agt ggc age tac 153
Lau Thr Lais Thr Cys Thn Ala San Gly Pha San Phe San Gly San Tyn 20 25 30 tac atg tee tgg gtc ege cag get cca ggg aag ggg ctg gag tgg ate 201
Tyr Met Sen Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tsrp lie 35 40 45 gca tac att tat att ggt gac ggt gtc act gee tac geg aac tgg geg 249
Ala Tyr lie Tyr lie Gly Asp Gly Val Thr Ala Tyr Ala Asn Trp Ala 50 55 60 aaa ggc ega ttc acc ate tee aag gee teg teg ace aeg gtg act eta 297
Lys Gly Arg Pha Thr lie San Lys Ala San San Thn Thn val Thr Lau 65 70 75 80 caa atg ace agt ctg aca gee geg gac aeg gee acc tat ttc tgt geg 345
Gin Met Thn Sen Leu Thn Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 agg ggt aat aag ttg tgg ggc cca ggc acc ctg gtc acc gtc tee tea 393
Arg Gly Asn Lye Lau Trp Gly Pro Gly Thn Lau Val Thn Val San San loo 105 no <210> 52 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanizado <400> 52 EP2818483B1
Gin Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Vai Lys Pro Gly Ala Ser 15 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Gly Ser Tyr 20 25 30
Tyr Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45
Ala Tyr Ile Tyr Ile Gly Asp Gly Vai Thr Ala Tyr Ala Asn Trp Ala 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr ile Ser Lys Ala Ser Ser Thr Thr vai Thr Leu 65 70 75 80
Gin Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 85 90 95
Arg Gly Asn Lys Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 100 105 110 <210> 53 <211> 402 < 212 > ADN <213> Artificial <220> <223> humanizado <220> <221> signal__sequence <222> (1) . . (66) <223 > <220>
<221> CDS <222 > (67) . , (402) <223 > <400> 53 EP2818483B1 atggacacga gggcccecac tcagetgetg gggctcctgc tgctctggct occaggtgcc €0 agatgt gat gtt gtg atg acc cag act cca gcc tcc gtg gag gca get 108
Asp Val Val Met Thr Gin Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala 15 10 gtg gga ggc aca gtc acc ate aag tgc cag gcc agt cag age att agt 156
Val Gly Gly Thr Val Thr lie Lys Cys Gin Ala Ser Gin Ser lie Ser 15 20 25 30 age tae tta gcc tgg tat cag cag aaa cca ggg cag cct ccc aag ege 204 S®r Tyr Lsu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Arg 35 40 45 ctg ate tat gat gca tec aat ctg gat tet ggg gtc cca teg egg tto 252
Leu He Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Asp Ser Gly val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 aaa ggc agt gga tet ggg aca gac fete act ate acc ate age gac ctg 300
Lys Gly See Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr lie Thr lie Ser Asp Leu 65 70 75 gag tgt gcc gat get gcc act tae tae tgt caa tgc act get gtt agt 343
Glu Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Cys Thr Ala val Ser 80 85 90 agt get act att tat gga aat get ttc ggc gga ggg acc gag gtg gtg 396
Ser Ala Thr lie Tyr Gly Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val 95 100 105 110 gtc aaa 402
Val Lys <210> 54 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanizado <400> 54 EP2818483B1
Asp Val Val Met Thr Gin Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly 15 10 15
Gly Thr Val Thr lie Lys Cys Gin Ala Ser Gin Ser lie Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Arg Leu lie 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lye Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr He Thr lie Ser Asp Leu Glu Cys 65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Cys Thr Ala Val Ser Ser Ala 85 90 95
Thr He Tyr Gly Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 EP2818483B1
DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.
Documentos de patente referidos na descrição • US 5698396 A [0007] • WO 2010016526 A [0007] [0126] [0127] [0128] [0129] [0136] [0140] [0149] [0163] • WO 2011096517 A [0007] [0149] • WO 0243478 A [0055] • WO 02092812 A [0055] • JP 2007530068 A [0056] • WO 9846777 A [0056] • EP 239400 A [0062] • WO 9602576 A [0062] • WO 9951743 A [0063] • WO 2011096528 A [0149] • WO 2011096519 A [0149] • WO 2011096533 A [0149] • WO 2011096534 A [0149] • PH 5509 W [0180] • JP 2012035238 A [0180]
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Claims (4)

  1. EP2818483B1 REIVINDICAÇÕES
    1. Um anticorpo ou um fragmento do mesmo que tem reatividade imunológica com um polipéptido CAPRIN-1 parcial que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 5 . 2. 0 anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo ou fragmento do mesmo tem atividade citotóxica contra uma célula cancerígena que expressa uma proteína CAPRIN-1. 3. 0 anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal ou um anticorpo policlonal. 4. 0 anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o anticorpo é um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo de cadeia única ou um anticorpo multiespecífico. 5. 0 anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende: (i) uma região variável de cadeia pesada compreendendo regiões determinantes de complementaridade consistindo na sequência de aminoácidos mostrada nas SEQ ID NOs: 8, 9 e 10 (CDR1, CDR2 e CDR3, respetivamente) e uma região variável de cadeia leve compreendendo regiões determinantes de complementaridade consistindo na sequência de aminoácidos mostrada nas SEQ ID NOs: 11, 12 e 13 (CDR1, CDR2 e CDR3, respetivamente), e tem reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1; ou (ii) uma região variável de cadeia pesada compreendendo EP2818483B1 regiões determinantes de complementaridade consistindo na sequência de aminoãcidos mostrada nas SEQ ID NOs: 8, 9 e 14 (CDR1, CDR2 e CDR3, respetivamente) e uma região variável de cadeia leve compreendendo regiões determinantes de complementaridade consistindo na sequência de aminoãcidos mostrada nas SEQ ID NOs: 11, 12 e 13 (CDR1, CDR2 e CDR3, respetivamente), e tem reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1; ou (iii) uma região variável de cadeia pesada compreendendo regiões determinantes de complementaridade tendo as sequências de aminoãcidos mostradas nas SEQ ID NOs: 26, 27 e 28 (CDR1, CDR2 e CDR3, respetivamente) e uma região variável de cadeia leve compreendendo regiões determinantes de complementaridade tendo as sequências de aminoãcidos mostradas nas SEQ ID NOs: 30, 31 e 32 (CDR1, CDR2 e CDR3, respetivamente), e tem reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1; ou (iv) uma região variável de cadeia pesada compreendendo regiões determinantes de complementaridade tendo as sequências de aminoãcidos mostradas nas SEQ ID NOs: 36, 37 e 38 (CDR1, CDR2 e CDR3, respetivamente) e uma região variável de cadeia leve compreendendo regiões determinantes de complementaridade tendo as sequências de aminoãcidos mostradas nas SEQ ID NOs: 40, 41 e 42 (CDR1, CDR2 e CDR3, respetivamente), e tem reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1; ou (v) uma região variável de cadeia pesada compreendendo regiões determinantes de complementaridade tendo as sequências de aminoãcidos mostradas nas SEQ ID NOs: 46, 47 e 48 (CDR1, CDR2 e CDR3, respetivamente) e uma região variável de cadeia leve compreendendo regiões determinantes de complementaridade tendo as sequências de aminoãcidos mostradas nas SEQ ID NOs: 40, 41 e 42 (CDR1, CDR2 e CDR3, respetivamente), e tem reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1. EP2818483B1 6. 0 anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 5 parte (i), em que o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende: (i) uma região variável de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoãcidos mostrada na SEQ ID NO: 52 e uma região variável de cadeia leve consistindo na sequência de aminoãcidos mostrada na SEQ ID NO: 54, e tem reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-l; ou (ii) uma região variável de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoãcidos mostrada na SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve consistindo na sequência de aminoãcidos mostrada na SEQ ID NO: 23, e tem reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1; ou (iii) uma região variável de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoãcidos mostrada na SEQ ID NO: 25 e uma região variável de cadeia leve consistindo na sequência de aminoãcidos mostrada na SEQ ID NO: 23, e tem reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1. 7. 0 anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 5 parte (ii), em que o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoãcidos mostrada na SEQ ID NO: 16 e uma região variável de cadeia leve consistindo na sequência de aminoãcidos mostrada na SEQ ID NO: 18, e tem reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1, 8. 0 anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 5 parte (iii), em que o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoãcidos mostrada na SEQ ID NO: 29 e uma região variável de cadeia leve consistindo na sequência de aminoãcidos mostrada na SEQ ID NO: 33, e tem reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1. EP2818483B1 9. 0 anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 5 parte (iv), em que o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoãcidos mostrada na SEQ ID NO: 39 e uma região variável de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 43, e tem reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1. 10. 0 anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 5 parte (v), em que o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 49 e uma região variável de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 43, e tem reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1. 11. 0 anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que o anticorpo ou fragmento do mesmo é conjugado com um agente antitumoral.
  2. 12. Uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11 como um ingrediente ativo.
  3. 13. Um fármaco de combinação compreendendo uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 12 e uma composição farmacêutica compreendendo um agente antitumoral. 14. 0 anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, ou a composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 12, ou a combinação farmacêutica de acordo com a reivindicação 13, para a utilização num método de tratamento e/ou prevenção EP2818483B1 de cancro. 15. 0 anticorpo, fragmento, composição farmacêutica ou fãrmaco de combinação para a utilização num método de tratamento e/ou prevenção de cancro de acordo com a reivindicação 14, em que o cancro é cancro da mama, cancro do rim, cancro pancreãtico, cancro do intestino grosso, cancro do pulmão, tumor cerebral, cancro gástrico, cancro da cérvix uterina, cancro do ovário, cancro da próstata, cancro da bexiga urinária, cancro esofágico, leucemia, linfoma, fibrossarcoma, mastocitoma ou melanoma.
  4. 16. Um ADN codificando um anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10.
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