ES2618026T3 - Composición farmacológica para el tratamiento y/o la prevención del cáncer - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo o un fragmento del mismo que tienen reactividad inmunologica con una proteina CAPRIN-1, comprendiendo el anticuerpo o el fragmento del mismo una region variable de cadena pesada que comprende las regiones determinantes de complementariedad de SEQ ID NO: 5, 6 y 7 y una region variable de cadena ligera que comprende las regiones determinantes de complementariedad de SEQ ID NO: 9, 10 y 11.

Description

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del sobrenadante de cultivo de cada hibridoma y se dejó en reposo durante 1 hora en hielo. Tras lavar con PBS, se añadieron anticuerpos anti-IgG de ratón marcados con FITC (Invitrogen Corp.) diluidos 500 veces con PBS que contenía un 0,1 % de FBS y se dejó en reposo durante 1 hora en hielo. Tras lavar con PBS, se midió la intensidad de fluorescencia utilizando un FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company). Por otra parte, se llevó a cabo la

5 misma operación anterior utilizando el suero de cada ratón Balb/c de 6 semanas de edad sin tratar diluido 500 veces con un medio para cultivo de hibridomas, en vez de los anticuerpos, para preparar un control. Como resultado, se seleccionó un anticuerpo monoclonal (nº 1) que tenía una intensidad de fluorescencia más fuerte que la del control, es decir, era reactivo con la superficie de las células de cáncer de mama.

Ejemplo 3. Caracterización del anticuerpo monoclonal seleccionado

Los anticuerpos monoclonales obtenidos en el Ejemplo 2 se analizaron de acuerdo con un método descrito en el Ejemplo 5 del documento WO2010/016526 en cuanto a sus secuencias de nucleótidos y las secuencias de aminoácidos codificados por estas. El anticuerpo monoclonal nº 1 resultante estaba compuesto por una región variable

15 de cadena pesada de SEQ ID NO: 8 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 12. La secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal nº 1 se muestra en la SEQ ID NO: 13, y la secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 8. La secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de cadena ligera de la misma se muestra en SEQ ID NO: 14, y la secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 12.

Específicamente, se confirmó que el anticuerpo monoclonal nº 1 estaba compuesto por la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 8 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 12, en el que la región variable de cadena pesada tiene una CDR1, CDR2 y CDR3 que consisten en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, 6, y 7, respectivamente, y la región variable de cadena ligera tenía una CDR1, CDR2, y CDR3 que consistían en las

25 secuencias de aminoácido de SEQ ID NO: 9, 10, y 11, respectivamente.

Ejemplo 4 Preparación del anticuerpo monoclonal quimérico humanode ratón

Ambos extremos del fragmento de la amplificación genética que comprendía el nucleótido que codifica la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal nº 1 de ratón que se obtuvo en el Ejemplo 3, que está representada por SEQ ID NO: 13, se trató con enzimas de restricción, a continuación se purificó y se insertó de acuerdo con un método de rutina en un vector pcDNA4/myc-His (Invitrogen Corp.) que ya tenía inserciones genéticas de una secuencia líder derivada de un anticuerpo de ratón y una región constante de cadena H de IgG1 humana que comprende SEQ ID NO: 37. También se trató el fragmento de amplificación genética que comprende el gen de la

35 región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal nº 1 de ratón en ambos extremos con enzimas de restricción, a continuación se purificó, y se insertó de acuerdo con un método de rutina en un vector pcDNA3.1/myc-His que ya tenía inserciones de una secuencia líder derivada de un anticuerpo de ratón y una región constante de cadena L de IgG1 humana que comprende SEQ ID NO: 38.

A continuación, el vector recombinante que tiene la inserción de la región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 13) del anticuerpo monoclonal nº 1 de ratón y el vector recombinante que tenía la inserción de la región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 14) del anticuerpo monoclonal nº 1 de ratón se introdujeron en células CHO-K1 (obtenidas en Riken Cell Bank). Específicamente, se cultivaron 2 x 105 células de CHO-K1 en un medio F12 de Ham (Invitrogen Corp.) que contenía 1 ml de FBS al 10 % por pocillo de una placa de cultivo de 12 pocillos, y se lavaron con PBS (-).

45 Después, se añadió un medio F12 de Ham reciente que contenía 1 ml de FBS al 10 % por pocillo. Se mezclaron 250 ng de cada uno de los vectores lisados en 30 µl de OptiMEM (Invitrogen Corp.) con 30 µl de reactivo de transfección Polifect (Qiagen N.V.), y se añadió la mezcla a cada pocillo. Las células CHO-K1 co-transfectadas con los vectores recombinantes se cultivaron en un medio F12 de Ham que contenía FBS al 10 % suplementado con 200 µg/ml de Zeocin (Invitrogen Corp.) y 200 µg/ml de Geneticin (Roche Diagnostics K.K.) y entonces se inocularon en una placa de 96 pocillos a una densidad de 0,5 células/pocillo para preparar una línea celular que producía establemente un anticuerpo monoclonal quimérico humano-de ratón nº 1 (nº 1) que tenía las regiones variables del anticuerpo monoclonal de ratón nº 1.

Cada línea celular preparada se cultivó durante 5 días en un matraz de 150 cm2 a una densidad de 5 x 105

55 células/ml utilizando 30 ml de un medio OptiCHO libre de suero (Invitrogen Corp.) para obtener los sobrenadantes de los cultivos que contenían el anticuerpo monoclonal quimérico humano-de ratón nº 1.

También, se prepararon las líneas celulares que producían establemente los anticuerpos monoclonales quiméricos humanos-de ratón de comparación 1 a 11 de la misma manera que anteriormente utilizando los siguientes anticuerpos monoclonales anti-CAPRIN-1 derivados del ratón que se describen en el documento WO2010/016526 como anticuerpos de comparación: un anticuerpo de comparación 1 que consistía en la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 15 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 16; un anticuerpo de comparación 2 que consistía en la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 17 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 18; un anticuerpo de comparación 3 que consistía en la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 19 y 65 la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 20; un anticuerpo comparativo 4 que consistía en la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 21 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 22; un anticuerpo

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