PT2606064E - Processos para a geração de anticorpos poliespecíficos e polivalentes - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

PROCESSOS PARA A GERAÇÃO DE ANTICORPOS POLI-ESPECÍFICOS E POLIVALENTES

Domínio da invenção A presente invenção tem por objecto a geração de novos anticorpos monoclonais bi-especificos, que comportam uma especificidade diferente para cada sitio de ligação da molécula de imunoglobulina. Os anticorpos da presente invenção são compostos por uma única cadeia pesada e duas cadeias leves diferentes, uma contendo um domínio constante kapa e a outra um domínio constante lambda. A presente invenção tem por objecto, em particular, o isolamento de anticorpos com especificidades diferentes mas que partilham uma cadeia pesada comum. A presente invenção também tem por objecto a co-expressão controlada de duas cadeias leves e uma única cadeia pesada única, que levam à junção dos anticorpos mono-específicos e bi-especificos. A presente invenção tem por objecto um meio de produção de um anticorpo completamente humano, bi-especifico e bivalente, que tem a sua sequência inalterada e não envolve a utilização de ligantes ou de outras sequências não humanas, assim como, misturas de anticorpos de dois anticorpos mono-específicos e um anticorpo bi-especifico. A presente invenção também tem por objecto meios de purificação eficazes do anticorpo bi-especifico.

Antecedentes da invenção

Um anticorpo é composto por quatro polipéptidos: duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. A porção de um anticorpo que se liga a um antigénio é formada pelo domínio variável de cadeia leve (VL) e o domínio variável de cadeia pesada (VP) . Numa extremidade destes domínios, seis anéis formam o sítio de ligação ao antigénio e também são referidos como regiões de determinação de complementaridade (RDC). Três RDC estão localizadas no domínio VP (PI, P2 e P3) e as outras três estão no domínio VL (LI, L2 e L3) . Durante o desenvolvimento de células B, forma-se uma única região de imunoglobulina por uma recombinação somática, conhecida como recombinação V(D)J. A região variável da cadeia pesada ou da cadeia leve de imunoglobulina está codificada por diferentes segmentos de genes. A cadeia pesada está codificada por três segmentos designados por segmentos variáveis (V) , diversificados (D) e de junção (J) , em que a cadeia variável leve é formada pela recombinação de apenas dois segmentos V e J. Há um grande número de paratopos de anticorpo que podem ser gerados por recombinação entre uma das várias cópias dos segmentos V, D e J que estão presentes no genoma. 0 segmento V codifica a RDC1 e a RDC2, enquanto a RDC3 é gerada por eventos de recombinação. No decurso de uma resposta imunitária ainda se introduz mais diversidade no sítio de ligação do antigénio por meio de um processo designado por hipermutação somática (HMS). Durante este processo, as mutações de pontos são introduzidas em genes variáveis das cadeias pesadas e leves e, em particular, nas regiões que codificam as RDC. Esta variabilidade adicional permite a selecção e a expansão de células B, que expressam variantes de anticorpos com uma maior afinidade para o seu antigénio cognato. A grande maioria das imunoglobulinas são moléculas bivalentes e mono-específicas, que têm a mesma especificidade em ambos os ramos, dado que são compostas por dois polipéptidos de cadeia pesada idênticos e dois polipéptidos de cadeia leve idênticos. Contudo, reconhece-se muito facilmente no início do desenvolvimento da tecnologia de hibridomas que os hibridomas híbridos podem ser criados por um evento de fusão entre dois hibridomas (Suresh MR et ai., Methods Enzymol 1986; 121: 210-228). Estes "quadromas" expressam duas cadeias pesadas diferentes e duas cadeias leves diferentes e, por isso, produzem uma variedade de espécies de anticorpos diferentes, que resultam do emparelhamento aleatório das cadeias pesadas e leves. Entre estas diferentes espécies, geram-se anticorpos bi-específicos (Acbs), comportando uma especificidade diferente em cada ramo. Outra excepção de ocorrência natural é a imunoglobulina do isotipo IgG4, que é capaz de sofrer uma alteração da cadeia pesada devido a uma dimerização menos estável, mediada por uma região charneira desse isotipo (van der Neut Kolfschoten M et ai., Science. 2007 317 (5844):1554-7). Embora esta permuta pareça acontecer in vivo, o seu significado biológico permanece pouco claro.

Os anticorpos monoclonais têm emergido como uma classe de moléculas atractiva e com sucesso para intervenção terapêutica em várias áreas de doenças humanas. Contudo, a capacidade para atingir ou neutralizar uma única proteína nem sempre é suficiente para se conseguir eficácia em certas doenças, o que limita a utilização terapêutica de anticorpos monoclonais. É cada vez mais claro que existe um certo número de indicações de neutralização de um componente no sistema biológico que não é suficiente para alcançar eficácia. Uma solução para este problema consiste na co-administração de vários anticorpos monoclonais. Contudo, esta abordagem é complicada por aspectos reguladores se estes anticorpos que se querem combinar forem previamente aprovados individualmente. Além disso, as abordagens de combinação são caras, de uma perspectiva da produção. De acordo com isto, existe uma necessidade de anticorpos e de terapêuticas que permitam atingir vários antigénios com uma única molécula.

Sumário da invenção A presente invenção permite a identificação, a produção e a purificação de anticorpos bi-especificos que não se distinguem, nas suas sequências, dos anticorpos-padrão. A presente invenção também permite a produção e a purificação de uma mistura única de anticorpos, de três ou mais anticorpos, comportando todos a mesma cadeia pesada. A natureza não modificada dos anticorpos da presente invenção faz com que eles sejam providenciados com caracteristicas de fabrico favoráveis semelhantes às dos anticorpos monoclonais-padrão.

Os anticorpos bi-especificos da presente invenção são gerados utilizando as seguintes etapas: - Isolam-se dois anticorpos com especificidades diferentes e que partilham o mesmo domínio variável de cadeia pesada, mas diferentes domínios variáveis de cadeia leve. Esta etapa é facilitada pela utilização de bibliotecas de anticorpos, que têm uma cadeia pesada fixa ou de animais transgénicos contendo um único gene VP. - Funde-se o domínio variável de cadeia pesada com o domínio de uma região constante de uma cadeia pesada, um domínio de uma região constante de cadeia leve se estiver fundido com um domínio constante kapa e o outro domínio variável de cadeia leve estiver fundido com um domínio constante lambda. Preferencialmente, o domínio variável de cadeia leve fundido com o domínio constante kapa, é do tipo kapa e o domínio variável de cadeia leve é fundido com o domínio constante lambda, é do tipo lambda. Contudo, a presente invenção também permite a geração de cadeias leves híbridas, de tal maneira que se podem utilizar dois domínios variáveis de cadeia leve do mesmo tipo para gerar os anticorpos bi-específicos da presente invenção. - As três cadeias são co-expressas em células de mamífero o que leva à junção e à secreção no sobrenadante de uma mistura de três anticorpos: dois anticorpos mono-específicos e um anticorpo bi-específico comportando duas cadeias leves diferentes. A proporção entre os anticorpos diferentes depende da expressão relativa das cadeias e da sua junção numa

IgG. A presente invenção tem por objecto processos para afinar estas proporções e maximizar a produção de anticorpo bi-específico. - Purifica-se a mistura de anticorpos utilizando técnicas convencionais de cromatografia utilizadas para a purificação de anticorpos. A mistura de anticorpos pode ser caracterizada e utilizada com um agente de vários alvos. - 0 anticorpo bi-específico é purificado utilizando um meio de cromatografia de afinidade feita de forma consecutiva, que liga especificamente a regiões contantes humanas kapa e lambda. Este processo de purificação é independente da sequência dos domínios variáveis de cadeia leve e é assim genérico para todos os anticorpos bi-específicos da presente invenção. - 0 anticorpo bi-específico isolado, que comporta um domínio constante kapa contendo uma cadeia leve e um domínio constante lambda contendo uma cadeia leve é caracterizado utilizando processos bioquímicos e imunológicos diferentes. - 0 anticorpo bi-específico da presente invenção pode ser utilizado para intervenção terapêutica ou como um reagente de diagnóstico ou de investigação. A presente invenção tem por objecto anticorpos mono-clonais com especificidade diferente em cada sítio de combinação e incluindo duas cópias de um único polipéptido de cadeia pesada e uma primeira cadeia leve e uma segunda cadeia leve, em que a primeira e a segunda cadeias leves são diferentes.

Nalguns anticorpos, pelo menos uma primeira porção da primeira cadeia leve é do tipo kapa e pelo menos uma porção da segunda cadeia leve é do tipo lambda. Nalguns anticorpos, a primeira cadeia leve inclui pelo menos uma região constante kapa. Nalguns anticorpos, a primeira cadeia leve inclui ainda uma região variável kapa. Nalguns anticorpos, a primeira cadeia leve inclui uma região variável lambda. Nalguns anticorpos, a segunda cadeia leve inclui pelo menos uma região constante lambda. Nalguns anticorpos, a segunda cadeia leve contém ainda uma região variável lambda. Nalguns anticorpos, a segunda cadeia leve inclui ainda uma região variável kapa. Nalguns anticorpos, a primeira cadeia leve inclui uma região constante kapa e uma região variável kapa e a segunda cadeia leve inclui uma região constante lambda e uma região variável lambda.

Nalgumas modalidades, as sequências das regiões estruturais constantes e variáveis são sequências humanas. A presente invenção também tem por objecto processos para produzir e gerar um anticorpo bi-específico por a) o isolamento de um anticorpo ou de uma região de um fragmento de anticorpo com uma especificidade determinada, por meio de um domínio variável de cadeia pesada combinado com um primeiro domínio variável de cadeia leve; b) o isolamento de um anticorpo ou de uma região de um fragmento de anticorpo com uma especificidade diferente, determinada pelo mesmo domínio variável de cadeia pesada do anticorpo da alínea a) , combinado com um segundo domínio variável de cadeia leve; c) a co-expressão numa célula: (i) do domínio variável de cadeia pesada comum fundido com uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina; (ii) o primeiro domínio variável de cadeia leve fundido quer com um domínio constante de cadeia leve do tipo kapa, quer fundido com um domínio constante de cadeia leve do tipo lambda; e (iii) o segundo domínio variável de cadeia leve fundido com um domínio constante de cadeia leve de um tipo diferente do primeiro domínio constante variável.

Alguns processos também incluem uma etapa adicional de d) isolamento dos anticorpos bi-específicos produzidos a partir dos anticorpos mono-específicos já produzidos. Por exemplo, nalguns processos, o isolamento faz-se utilizando uma etapa de purificação por cromatografia de afinidade. Nalguns processos, a etapa de purificação realiza-se utilizando um domínio constante kapa específico, um domínio constante lambda ou tanto um domínio constante kapa específico como um domínio constante lambda específico, por meio de cromatografia de afinidade.

Nalguns processos, funde-se um domínio variável de cadeia leve kapa com uma região constante do tipo kapa. Nalguns processos, funde-se um domínio variável de cadeia leve kapa com uma região constante do tipo lambda. Nalguns processos, funde-se um domínio variável de cadeia leve lambda com uma região constate do tipo kapa. Nalguns processos, funde-se um domínio variável de cadeia leve lambda com uma região constante do tipo lambda.

Nalguns processos, as etapas a) e b) são facilitadas pela utilização de bibliotecas de anticorpos, com uma cadeia pesada comum e uma diversidade confinada ao domínio variável de cadeia leve. 0 domínio variável de cadeia pesada incluído numa dessas bibliotecas, pode ter por base diferentes genes de linhas germinativas, variáveis, diferentes e ter diferentes sequências tanto na RDC como nas regiões estruturais. Nalguns processos, essas bibliotecas foram concebidas utilizando tipos diferentes de domínios variáveis de cadeia pesada e poderão ser utilizadas para gerar os anticorpos da presente invenção.

Nalguns processos, a biblioteca de anticorpos é exibida em bacteriófagos filamentosos, na superfície de leveduras, em células bacterianas ou de mamíferos ou utilizada para ribossomas ou outros tipos de exibição in vitro. A presente invenção também tem por objecto processos de preparação de um anticorpo bi-específico, que se liga especificamente a um primeiro antigénio e a um segundo antigénio, em que o primeiro e o segundo antigénios são diferentes, por meio de a) providenciar uma primeira molécula de ácido nucleico, que codifica um primeiro polipéptido, que contém uma região variável de cadeia pesada de um polipéptido de imunoglobulina ou de um seu fragmento, que liga o primeiro antigénio acoplado a uma região constante de imunoglobulina; b) providenciar uma segunda molécula de ácido nucleico que codifica um segundo polipéptido, que contém uma região variável de cadeia leve de um polipéptido de imunoglobulina ou de um seu fragmento, que liga o primeiro antigénio acoplado a uma região constante de cadeia leve do tipo kapa ou do tipo lambda; c) providenciar uma terceira molécula de ácido nucleico, que codifica um terceiro polipéptido, que contém uma região variável de cadeia leve de um polipéptido de imunoglobulina ou de um seu fragmento, que liga o segundo antigénio acoplado a uma segunda região constante de cadeia leve do tipo kapa ou do tipo lambda, em que o primeiro e o segundo domínios constantes de cadeia leve são de tipos diferentes; e d) fazendo uma cultura de uma célula hospedeira, que contém a primeira, a segunda e a terceira molécula de ácidos nucleicos, em condições que permitam a expressão do primeiro, do segundo e do terceiro polipéptidos.

Alguns processos também incluem mais uma etapa e) de recuperação do anticorpo bi-específico. Por exemplo, nalguns processos, o anticorpo bi-específico é recuperado na etapa e), utilizando uma etapa de purificação por cromatografia de afinidade. Nalguns processos, a etapa de purificação realiza-se utilizando um domínio constante específico kapa, um domínio constante lambda ou tanto um domínio constante e específico kapa como um domínio constante e específico lambda, por meio de cromatografia de afinidade.

Nalguns processos, o segundo ácido nucleico codifica um domínio variável de cadeia leve do tipo kapa. Nalguns processos, o segundo ácido nucleico codifica uma região constate do tipo kapa. Nalguns processos, o segundo ácido nucleico codifica uma região contante do tipo lambda. Nalguns processos, o segundo ácido nucleico codifica um domínio variável de cadeia leve do tipo kapa. Nalguns processos, o segundo ácido nucleico codifica uma região constante do tipo kapa. Nalguns processos, o segundo ácido nucleico codifica uma região constante do tipo lambda. Nalguns processos, o terceiro ácido nucleico codifica um domínio variável de cadeia leve do tipo kapa. Nalguns processos, o terceiro ácido nucleico codifica uma região constante do tipo kapa. Nalguns processos, o terceiro ácido nucleico codifica uma região constante do tipo lambda. Nalguns processos, o terceiro ácido nucleico codifica um domínio variável de cadeia leve do tipo lambda. Nalguns processos, o terceiro ácido nucleico codifica uma região constante do tipo kapa. Nalguns processos, o terceiro ácido nucleico codifica uma região constante do tipo lambda. A presente invenção também tem por objecto uma mistura de anticorpos que inclui dois anticorpos mono-específicos e um anticorpo bi-específico, tendo todos uma cadeia pesada comum. Por exemplo, o anticorpo bi-específico é qualquer um dos anticorpos bi-específicos aqui descritos ou produzidos utilizando os processos aqui descritos. A presente invenção ainda tem por objecto processos para gerar essa mistura de anticorpos por meio de a) o isolamento de um anticorpo ou de uma região de um fragmento de anticorpo com uma especificidade determinada, por meio de um domínio variável de cadeia pesada combinado com um primeiro domínio variável de cadeia leve; b) o isolamento de um anticorpo ou de uma região de um fragmento de anticorpo com uma especificidade diferente, determinada pelo mesmo domínio variável de cadeia pesada que o do anticorpo da etapa a) combinado com um segundo domínio variável de cadeia leve; c) a co-expressão numa célula: (i) do domínio variável de cadeia pesada comum fundido com uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina; (ii) o primeiro domínio variável de cadeia leve fundido quer com um domínio constante de cadeia leve do tipo kapa, quer fundido com um domínio constante de cadeia leve do tipo lambda; e (iii) o segundo domínio variável de cadeia leve fundido quer com um domínio constante de cadeia leve de tipo kapa ou fundido com um domínio constante de cadeia leve do tipo lambda. Alguns processos também incluem uma etapa adicional d) de isolamento da mistura de anticorpos produzidos na alínea c) , a partir do sobrenadante da cultura de células. A presente invenção também tem por objecto processos para dois ou mais, por exemplo, três ou mais anticorpos não idênticos, numa única célula hospedeira recombinante, por meio de a) a expressão na célula hospedeira recombinante única, de uma ou mais sequências de ácidos nucleicos que codificam uma cadeia pesada comum de imunoglobulina e pelo menos duas, por exemplo, pelo menos três, cadeias leves diferentes de imunoglobulina que são capazes de se emparelhar com a cadeia pesada comum de imunoglobulina para formar domínios funcionais de ligação ao antigénio, para produzir dois ou mais, por exemplo, três ou mais anticorpos não idênticos que contêm a cadeia pesada comum. Alguns processos também incluem a etapa de recolha ou de alguma forma de purificação de dois ou mais, por exemplo, três ou mais anticorpos não idênticos, a partir de células hospedeiras recombinantes ou a partir de uma cultura de células hospedeiras. A célula hospedeira é, por exemplo, uma célula de mamífero. Nalguns processos, os anticorpos não idênticos incluem anticorpos mono-específicos e bi-específicos .

Nalguns processos, os anticorpos não idênticos atingem diferentes epítopos do mesmo antigénio-alvo. Nalguns processos, os anticorpos não idênticos têm afinidades diferentes para o mesmo epítopo-alvo. Nalguns processos, os anticorpos não idênticos ligam-se a antigénios diferentes.

Nalguns processos, dois ou mais, por exemplo, três ou mais anticorpos não idênticos seleccionam-se, independentemente, no grupo que consiste em: IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2, IgD, IgE e IgM.

Nalguns processos, dois ou mais, por exemplo, três ou mais anticorpos não idênticos contém uma região Fc modificada, que modifica as funções efectoras dos anticorpos, tais como, a citotoxicidade mediada por células dependentes do antigénio (CCDA), a citotoxicidade dependente do complemento (CDC), a fagocitose celular dependente do antigénio (FCDA) ou as suas propriedades farmacocinéticas, por meio da alteração da sua ligação aos receptores neonatais de Fc.

Nalguns processos, duas ou mais, por exemplo, três ou mais imunoglobulinas diferentes estão no formato F(ab')2.

Nalguns processos, uma ou mais sequências de ácidos nucleicos são expressas de forma estável nas células hospedeiras.

Nalguns processos, dois ou mais, por exemplo, três ou mais anticorpos não idênticos são produzidos pela célula hospedeira in vitro.

Alguns processos também incluem etapas adicionais de selecção de, pelo menos, uma célula hospedeira, por meio do ensaio de dois ou mais, por exemplo, três ou mais anticorpos não idênticos produzidos pela célula hospedeira recombinante, quanto à sua capacidade de se ligar a um antigénio-alvo; a cultura da célula hospedeira recombinante; e o isolamento de três ou mais anticorpos não idênticos. Os anticorpos podem ser isolados utilizando qualquer uma das técnicas aqui descritas ou qualquer outro processo apropriado reconhecido na técnica.

Nalguns processos, as diferentes cadeias leves de imunoglobulina têm regiões constantes idênticas. Nalguns processos, as diferentes cadeias leves de imunoglobulina têm regiões constantes diferentes.

Breve descrição dos desenhos A figura 1 é uma representação esquemática de diferentes formatos de anticorpos bi-específicos. A. Formatos com base em fragmentos de anticorpo: Fab ligado a X, fragmentos de Fab reticulados; tascFv/BiTE, tandem-scFv/iniciador de células T bi-específicas; Dc, diacorpo; Dcta, diacorpo em tandem. B. Formatos à base de fusões de Fc: Dc-Fc, fusão de diacorpo-Fc; fusão de Dcta-Fc, fusão de diacorpo em tandem-Fc; Dcta-CP3, fusão de diacorpo em tandem-CP3; (scFv)4-Fc, fusão de scFv tetra-Fc; Ig-DDV, imunoglobulina de domínio duplo variável. C. Formatos de IgG: "knob-hole" e SEED, domínio de permuta de hélice tratado por engenharia; Acm reticulado, "knob-hole" combinado com permuta do domínio de cadeia pesada e leve; Acbs, anticorpo bi-específico derivado de quadroma; Acdu, anticorpo à base de um domínio único. A figura 2 é uma representação esquemática de modos de acção específicos possíveis permitidos pelos anticorpos bi-específicos. 2A. Atingindo os dois antigénios. 2B. Atingindo de novo uma parte tóxica ou uma actividade em relação à célula-alvo. 2C. Selectividade aumentada mediada pela avidez.

As figuras 3A-3C são representações esquemáticas da estrutura de diferentes anticorpos bi-específicos da presente invenção, compostos por duas cópias de um polipéptido com uma única cadeia pesada e dois polipéptidos com cadeias leves diferentes. As localizações e/ou os arranjos da cadeia leve kapa e da cadeia leve lambda (ou as suas porções) ilustrados nesta figura não pretendem ser limitativos. Um especialista nesta técnica saberá que a cadeia leve kapa e a cadeia leve lambda (ou as suas porções) também podem estar arranjados de forma a produzir uma imagem no espelho dos anticorpos bi-especificos ilustrados nas figuras 3A-3C. Um especialista nesta técnica saberá que os anticorpos bi-especificos que estão representados num formato de IgG completa nas figuras 3A-3C também podem ser gerados utilizando outros isotipos de imunoglobulina ou outros formatos de imunoglobulina, tais como, F(ab')2· 3A. Domínio variável kapa fundido com um domínio constante kapa e domínio variável lambda fundido com um domínio constante lambda. 3B. Domínios variáveis kapa fundidos com um domínio constante lambda e um domínio constante lambda. 3C. Domínios variáveis lambda fundidos com um domínio constante kapa e um domínio constante lambda. A figura 4 é uma ilustração de um ensaio de ELISA para analisar clones específicos para hCXCLIO-NusA ou RC-IL-6h e que comportam o mesmo domínio variável de cadeia pesada. Cada clone foi ensaiado em função de ambos os alvos para demonstrar a uma especificidade.

As figuras 5A-C são ilustrações em série que descrevem os três tipos de bibliotecas utilizadas nos exemplos, para cada tipo de biblioteca, mantendo separadas as bibliotecas Vk e VÀ. Figuras 5A e C: dois conjuntos de bibliotecas que contêm um domínio variável fixo VP3-23, que difere apenas na sua sequência P3 de RDC, que está indicada abaixo de P3 (definição de RDC de acordo com o IMGT) . 0 reportório da cadeia leve era diversificado quer pela inserção de sequências aleatórias na L3 de RDC dos genes variáveis de cadeia leve seleccionados (figuras 5A e 5C) ou por captura de domínios variáveis de cadeia leve rearranjados naturalmente, isolados de dadores humanos que podem incluir todos os genes variáveis humanos e contém uma diversidade em todas as 3 RDC (figura 5B) . As diferentes estratégias de diversificação estão ilustradas pelas linhas horizontais abaixo da região diversificada dos reportórios de cadeia leve.

As figuras 6A-6B são gráficos que descrevem os resultados de ELISA utilizando IgGÀ e IgGx mono-específicas seleccionadas em função de IFNhY e RC-IL-6, respectivamente e comportando uma cadeia pesada comum. Os formatos de ELISA estão representados esquematicamente a seguir de cada gráfico. Na figura 6A, o INFy foi imobilizado na placa, incubado com uma IgGÀ anti-INFY ou o RC-anti-IL-6 (isto é, o complexo de receptor R de IL-6/IL-6 solúvel), IgGx e ambos foram detectados com anticorpos Ck anti-humanos ou CÀ anti-humanos acoplados a peroxidase de rábano-silvestre. 0 sinal foi revelado por colorimetria e quantificado utilizando um leitor de placas microtituladoras. A figura 7 é uma representação esquemática de vectores utilizada para a co-expressão de uma cadeia pesada e duas cadeias leves em células de mamíferos. Ambos os vectores contêm três promotores para accionar a expressão dos genes, um gene de glutamina-sintetase para uma selecção estável de uma linha de células. No segundo vector, pNovI κΗλκ, a expressão de uma cadeia leve kapa adicional é accionada por um sitio interno de entrada da ribossoma (SIER). Os diferentes genes e os elementos de controlo genético também estão indicados. Promotor de citomegalovirus humano, CMVh; SV40, promotor de V40; pa, sinal de poliadenilação; VP, domínio variável de cadeia pesada; VK, domínio variável de cadeia leve kapa; CK domínio constante de cadeia leve kapa; VL, domínio variável de cadeia leve lambda; CL2, domínio constante de cadeia leve lambda 2; GS ADNc, ADNc de glutamina-sintetase; RAmp; marcador seleccionável para a resistência a ampicilina. Indica-se um certo número de sítios de restrição. A figura 8A é uma representação esquemática do processo de purificação para anticorpos bi-específicos da presente invenção. A figura 8B é uma ilustração que descreve a co-expressão, purificação e análise por EGPA-SDS de anticorpos bi-específicos da presente invenção. Corou-se o gel utilizando apenas azul. PA: proteína A; K: kapa seleccionado; λ: lambda seleccionado; FT: coluna de fluxo; E: fracção de eluição. A figura 9 é uma ilustração de uma análise por EGPA-SDS da IgG total purificada a partir de células de mamífero transfectadas com vectores, que permitem diferentes níveis de expressão da cadeia leve kapa, utilizando diferentes elementos SIER dentro do vector pNovI κΗλκ (colunas 1-5) e em comparação com o vector pNovI κΗλ. As intensidades relativas das cadeias leves kapa e lambda indicam que os níveis de expressão podem ser regulados. A figura 10A é uma ilustração que descreve a análise em gel IEF de IgG mono-específica purificada (kk e XX) e de IgG bi-específica (κλ). A figura 10B é uma ilustração da análise de IEX-CLAR de anticorpos mono-específicos e bi-específicos. Injectaram-se os três anticorpos, independentemente, e sobrepôs-se o seu perfil de eluição no gráfico. 0 gradiente utilizado na experiência também está ilustrado. A figura 11 ilustra os ensaios de ELISA utilizados para determinar a capacidade do anticorpo bi-especifico para se ligar a ambos os alvos e a presença das cadeias leves kapa e lambda na molécula. A figura 11A é uma representação esquemática do formato de ELISA. A figura 11B é um gráfico que descreve os resultados de ELISA com INFy imobilizado na placa. A figura 11C é um gráfico que descreve os resultados de ELISA com RC-IL-6 imobilizado na placa. IgGx, anticorpo mono-especifico anti-RC-IL-6; IgGÀ, anticorpo mono-especifico anti-ΙΝΕγ; IgGKÀ, anticorpo bi-especifico anti-RC-IL-6/anti-INFY. Indicam-se anticorpos de detecção secundária lambda-PRS de lambda anti-humano e PRS de kapa anti-humano. A figura 12 é uma ilustração da análise por PRS dos anticorpos bi-especificos IgGKÀ. Na figura 12A, imobilizou-se INFy na superfície de um chip da Biacore e injectaram-se o anticorpo mono-específico anti-RC-IL-6 (IgGx), o anticorpo mono-específico anti-INFY (IgGÀ) e o anticorpo bi-especifico anti-RC-IL-6/anti-INFY (IgGKÀ) na superfície, seguido da injecção RC-IL-6. Na figura 12B, imobilizou-se o anticorpo bi-especifico anti-RC-IL-6/anti-INFY (IgGKÀ) na superfície do chip e injectaram-se os anticorpos anti-humano kapa e anti-humano lambda na mesma concentração. Repetiu-se a experiência invertendo a ordem de injecção do anticorpo com resultados idênticos. A figura 13 é uma representação esquemática de uma vista global de um processo de geração de anticorpos bi- específicos e poli-específicos aqui descrito, em células de OHC. A figura 14A é um gráfico que descreve o crescimento e os perfis de produção de anticorpos de conjunto de células de OHC, numa escala de produção pequena, num frasco de Erlenmeyer. Os níveis de produção de anticorpo foram determinados por uma análise de proteína A-CLAR. CCV indica a concentração de células viáveis e Ac indica o anticorpo. A figura 14B é um gráfico que descreve o crescimento e o perfil de produção do anticorpo em comparação entre uma fermentação em pequena escala e em escala média. Os níveis de produção do anticorpo foram determinados pela análise da proteína A-CLAR. CCV indica a concentração de células viáveis e Ac indica o anticorpo.

As figuras 15A e 15B são uma série de gráficos que descrevem a produtividade do anticorpo numa placa de 96 poços (pl96p) para um anticorpo mono-kapa (KK), mono-lambda (LL) e um anticorpo bi-específico kapa e lambda (KL), que expressam linhas de células cinco semanas após a transfecção em duas experiências independentes. Os níveis de produção do anticorpo foram determinados por ELISA. Acm indica anticorpo monoclonal. As figuras 15C e 15D são séries de gráficos que descrevem a produtividade do anticorpo numa placa agitada de 24 poços (pl24p) que cresceram em culturas em lotes de mono-kapa (KK), mono-lambda (LL) e kapa bi-específico. A figura 16A é uma ilustração que descreve os resultados de uma análise reduzida de EGPA-SDS de moléculas mono-específicas de IgG κ (isto é, moléculas mono-específicas com cadeias leves kapa, também referidas aqui como moléculas "mono-kapa"), moléculas mono-específicas de IgG λ (isto é, moléculas mono-específicas com cadeias leves lambda, também referidas aqui como moléculas "mono-λ") e anticorpos κλ (isto é, anticorpos com cadeias leves kapa e lambda), através das etapas de purificação descritas antes. A figura 16B é uma ilustração que descreve os resultados de uma análise reduzida de EGPA-SDS de anticorpos mono-κ, mono-λ e κλ, obtidos no seguimento das etapas de eluição descritas antes. Nas figuras 16A e 16B, corou-se o gel utilizando apenas azul e E indica a fracção de eluição, FT indica o fluxo da coluna e MM indica o marcador de peso molecular. A figura 16C é uma ilustração que descreve a análise em gel de foco iso-eléctrico (FIE) de moléculas mono-especif icas de IgG purificadas (kk e XX) e a de moléculas bi-especificas de IgG (κλ).

As figuras 17A-D são uma série de gráficos e ilustrações que descrevem os processos de geração de anticorpos dos anticorpos bi-especificos da presente invenção, que incluem tanto uma cadeia leve kapa como uma cadeia leve lambda e os anticorpos purificados que exibem bi-especif icidade . Os gráficos descrevem os resultados de ELISA utilizando um corpo κλ modificado em função de IFNYh e de RC-IL-6. Realizou-se o ensaio de ELISA utilizando anticorpos de detecção anti-kapa ou anti-lambda conforme indicado. As figuras 17A-D ilustram que a cadeia leve lambda se liga a IFNYh, enquanto a cadeia leve kapa se liga a RC-IL-6. NI-0501 é um anticorpo de controlo da cadeia leve lambda anti-IFNYh e NI-1201 é um anticorpo de controlo da cadeia leve kapa anti-RC-IL-6. A figura 18 é uma ilustração de um gel de FIE de diferentes anticorpos mono-especificos e bi-especificos, indicando que a diferença na pi pode variar consoante a sequência variável leve do anticorpo. Coluna 1, IgGK anti-NusA; coluna 2, IgGnA anti-NusA/antí-INFy; coluna 3, IgGA anti-INFY; coluna 4, IgGK anti-RC-IL-6; coluna 5, IgGnA anti-RC-IL-6/anti-RC-IL-6; coluna 6, IgGA anti-RC-IL-6. A figura 19 é uma representação esquemática de três proteínas híbridas diferentes obtidas combinando um gene variável lambda e um gene constante kapa. Os pontos de fusão diferem entre os diferentes híbridos: na figura 19A, Vlambda funde-se com Ckapa; na figura 19B, Vlambda até RDC3 funde-se com Vkapa, RE4 e Ckapa; e na figura 19C, Vlambda e os primeiros quatro aminoácidos de Clambda e de Ckapa excluem os primeiros quatro aminoácidos. RDC, região de determinação de complementaridade; RE, região estrutural. A figura 20 é uma ilustração da análise de duas estruturas híbridas de cadeia leve num sistema Bionalyzer 2100 utilizando um chip Protein 80 (Agilent Technologies). Indicam os electroferogramas correspondentes à imagem em gel. A figura 21 é uma série de gráficos que descrevem os resultados da resposta à dose analisadas por ELISA, utilizando scFv específico para INFy (A) ou RC-IL-6 (B), em que o domínio VP ou era o VP comum seleccionado originalmente (curvas do topo) ou outros domínios VP que permitem a expressão de scFv e a sua purificação (curvas do fundo). A figura 22 é um gráfico que descreve os resultados obtidos para a quantificação do anticorpo bi-específico IgGKÀ, utilizando um formato de ELISA em sandwich. Fez-se a resposta à dose utilizando quer apenas anticorpo bi-específico purificado, quer misturado com anticorpos mono-específicos kapa ou lambda, em diferentes proporções, conforme indicado, para avaliar a interferência destas moléculas no ensaio.

Descrição detalhada

Para ultrapassar os limites das terapêuticas com anticorpos monoclonais e monovalentes que apenas podem atingir um único antigénio ou para ultrapassar as limitações de combinações de terapêuticas com anticorpos monovalentes, têm sido feitos grandes esforços para se atingir múltiplos antigénios utilizando formatos de anticorpos bi-especificos. Esses anticorpos que comportam mais do que uma especificidade são de interesse na biotecnologia e têm um grande potencial como agentes terapêuticos, permitindo novas abordagens terapêuticas (Fischer e Léger, Pathobiology 2007; 74: 3-14; Morrison SL Nature Biotechnol 2007; 25: 1233-1234). Os anticorpos bi-especificos são vantajosos porque permitem um direccionamento múltiplo, aumentam o potencial terapêutico, dirigem-se à redundância dos sistemas biológicos e providenciam novos mecanismos de acção através de capacidades, tais como, re-atingir e/ou aumentar a especificidade. Como os alvos terapêuticos únicos validados se esgotam cada vez mais, as combinações permitidas por anticorpos bi-especificos providencia um novo e mais alargado universo de alvos para os agentes terapêuticos e as suas aplicações. Têm sido utilizadas várias estratégias para gerar essas moléculas bi-especificas, tais como, reticulação química de fragmentos de anticorpos, heterodimerização forçada, tecnologia de quadroma, fusão de fragmentos de anticorpos por via de ligantes de polipéptidos e utilização de anticorpos de domínio único. A disponibilidade das tecnologias de ADN recombinante tem levado à geração de muitos formatos de anticorpos bi-especificos (ver, por exemplo, Ridgway JB et ai. (1996) Protein Eng 9: 617-621). Têm-se introduzido frequentemente ligantes e mutações nas diferentes regiões do anticorpo para forçar a formação de heterodímeros ou para ligar diferentes partes de ligação numa única molécula. Contudo, estas moléculas tratadas por engenharia muitas vezes têm umas características pobres em termos de produção, assim como têm um risco acrescido de imunogenicidade, o que limita ou evita o seu progresso em direcção ao tratamento clínico.

Além disso, as tentativas anteriores para desenvolver formatos bi-específicos têm sido limitadas devido a factores, tais como, uma fraca estabilidade e/ou expressão. Estas abordagens vão ser descritas a seguir e os formatos descritos estão ilustrados na figura 1.

Reticulação química. A utilização de reagentes de reticulação química para a ligação covalente de dois anticorpos é uma abordagem conceptualmente aceite. Os fragmentos de anticorpos gerados a partir dos seus respectivos anticorpos parentais por digestão enzimática ou geração através de tecnologias recombinantes são conjugados utilizando reagentes bifuncionais (Glennie MJ et al. , J Exp Med 1992; 175: 217-225) . A homogeneidade do produto é a principal limitação desta abordagem, dado que as espécies bi-específicas têm de ser purificadas a partir de homodímeros e as etapas de modificação podem alterar a integridade e a estabilidade das proteínas. As várias etapas envolvidas tornam esta abordagem desafiante em termos de produção e de homogeneidade do produto.

Quadromas. Os quadromas e os triomas podem ser gerados por fusão quer de dois hibridomas, quer de um hibridoma com um linfócito B, respectivamente (Suresh MR et al., Methods Enzymol 1986; 121: 210-228). Neste caso, a expressão simultânea de duas cadeias pesadas e de duas cadeias leves leva a uma junção aleatória de 10 combinações de anticorpos e aos desejados Acbs representado apenas uma pequena fracção dos anticorpos segregados. Os Acbs têm de ser purificados utilizando uma combinação de técnicas cromatográficas o que reduz drasticamente o rendimento da produção. A principal limitação é que os quadromas produzem Acbs com origem em roedores, o que limita o seu potencial terapêutico devido a questões de imunogeneicidade.

Anticorpos bi-específicos recombinantes. A maior parte dos formatos de anticorpos bi-especificos têm sido gerados por técnicas de engenharia genética utilizando fragmentos de anticorpos, tais como, os fragmentos scFv ou Fab como blocos de construção ligados por via de ligantes polipeptidicos. Os formatos com base nos fragmentos de anticorpos ligados incluem scFv em tandem (BiTE), diacorpos e diacorpos em tandem (Kipriyanov SM. Methods Mol Biol 2003; 207: 323-333; Korn T et ai., Int J Cancer 2002; 100: 690-697). Estes blocos de construção podem ainda estar ligados a uma região Fc de imunoglobulina dando origem a moléculas "semelhantes a IgG". Estes formatos incluem diacorpo-Fc, diacorpo-Fc em tandem, diacorpo-CP3 em tandem, (scFv)4-Fc e DDV-Ig (Lu D et ai., J Immunol Methods 2003; 279: 219-232 ; Lu D et ai., J Biol Chem 2005; 280: 19665-19672 ; Lu D et al., J Biol Chem 2004; 279: 2856-2865; Wu C et al., Nat Biotechnol 2007 25: 1290-7). Uma limitação potencial da utilização de ligantes reside no facto da natureza flexível destes péptidos torná-los propensos a uma clivagem proteolítica, levando potencialmente a uma fraca estabilidade do anticorpo, a uma agregação e a um acréscimo de imunogeneicidade. Além disso, estes péptidos exógenos podem provocar uma resposta imunitária contra a junção entre a proteína e o ligante ou no próprio ligante. Em geral, os Acbs com base em blocos de construção ligados são moléculas desafiantes em termos de produção, o que limita o seu potencial terapêutico.

Uma molécula bi-especifica ideal para terapêutica em seres humanos não se deve distinguir de uma IgG normal. As estratégias que se baseiam em forçar a heterodimerização de duas cadeias pesadas também têm sido exploradas. Uma primeira abordagem tem sido o "knob into hole", o que tem por objectivo forçar o emparelhamento de duas cadeias pesadas diferentes de IgG, por meio da introdução de mutações nos domínios CP3 para modificar a interface de contacto (Ridgway JB et al., Protein Eng 1996; 9: 617-621). Introduziu-se numa cadeia de aminoácidos, com grandes cadeias laterais, para criar um "knob". Inversamente, os aminoácidos de grande volume foram substituídos por aminoácidos com cadeias laterais curtas para criar um "hole" no outro domínio CP3. Por co-expressão destas duas cadeias pesadas, observou-se mais do que 90 % de formação de heterodímeros ("knob-hole") versus a formação de homodímeros ("hole-hole" ou "knob-knob"). Desenvolveu-se um conceito semelhante utilizando um domínio tratado por engenharia de permuta de hélices (SEED), domínios humanos de CP3 com base em sequências de IgG humana e de IgA humana (Davis JH et al. , 2010, PEDS 23: 195-202) . Estes domínios, tratados por engenharia, levam à formação de moléculas heterodiméricas que podem comportar duas especificidades diferentes. Estas duas abordagens são atractivas dado que favorecem a produção do heterodímero de interesse (até 95 %), mas não evitam totalmente a formação de homodímeros. Por isso, são ainda necessários procedimentos de purificação a jusante, capazes de eliminar os homodímeros dos heterodímeros. Outra questão potencial destas abordagens reside no facto de os domínios mutados não serem completamente humanos e poderem levar a imunogeneicidade e poderem também afectar a estabilidade do domínio e a tendência para a agregação das moléculas. Como estas estratégias permitem um emparelhamento forçado das cadeias pesadas, as cadeias leves diferentes podem emparelhar-se aleatoriamente com qualquer uma das duas cadeias pesadas e originar a geração de diferentes anticorpos, que têm de ser purificados uns dos outros. Recentemente, foi descrita uma melhoria na abordagem de "knob into hole" para resolver a questão do emparelhamento das cadeias leves (patente WO 2009/080253 Al) . Este processo envolve a permuta de alguns domínios de cadeia leve e de cadeia pesada para além das mutações de "knob into hole". A principal vantagem deste processo é que o anticorpo bivalente bi-especifico, com dois domínios variáveis de cadeias pesadas diferentes e dois domínios variáveis de cadeias leves diferentes podem assim ser gerados e isto foi designado por "CrossMab". Contudo, as sequências deste anticorpo bi-especifico não são completamente humanas dado que contêm tanto mutações em Fc, para forçar a heterodimerização, como pontos de junção não naturais entre os diferentes domínios de imunoglobulina. Além disso, estas modificações levam a níveis de expressão reduzidos do formato bi-especifico, em comparação com um anticorpo monoclonal padrão (Schaefer et ai., PNAS 2011; 108: 11187-11192).

Anticorpos baseados num único domínio. Os sistemas imunitários dos camelídeos (lamas e camelos) e os peixes cartilaginosos (tubarões de aquário) utilizam domínios únicos V fundidos com uma Fc, demonstrando que um único domínio pode conferir uma elevada afinidade de ligação a um antigénio. Os domínios V de camelídeos, de tubarões e mesmo de seres humanos representam alternativas aos anticorpos, mas também têm sido utilizados para a geração de Acbs. Podem ser reformatados numa IgG clássica, em que cada ramo tem o potencial para se ligar a dois alvos, quer por via do seu domínio VP, quer VL. Esta IgG de domínio único terá propriedades bioquímicas semelhantes a uma IgG e, potencialmente, resolve problemas encontrados com outros formatos de Acbs em termos de produção e de heterogeneidade. Contudo, é provável que as articulações estéricas irão muitas vezes prevenir a ligação simultânea de ambos os antigénios aos dois ramos do anticorpo.

Uma representação de formatos de anticorpos bi-especif icos descrita antes está ilustrada na figura 1.

Algumas destas representações de formatos derivam de Fischer e Léger, Pathobiology 2007; 74: 3-14; e Morrison SL Nature Biotechnol 2007; 25: 1233-1234.

Ao contrário destes formatos anteriores, os anticorpos, bi-específicos, os anticorpos multi-específicos, as composições e os processos aqui providenciados ultrapassam alguns dos obstáculos de desenvolvimento. Os anticorpos bi-específicos aqui providenciados têm uma cadeia pesada comum, duas cadeias leves - uma kapa (k), uma Lambda (λ) - que tem cada uma uma especificidade diferente (isto é, duas cadeias leves, duas especificidades). Preferencialmente, os anticorpos bi-especificos não contêm quaisquer ligantes ou outras modificações, incluindo mutações de aminoácidos. Os processos aqui providenciados produzem moléculas que têm uma ligação especifica quando a sua diversidade está restrita à região VL. Estes processos produzem anticorpos bi-especificos através da co-expressão controlada de três cadeias (uma cadeia VP, duas cadeias VL) e da purificação do anticorpo bi-específico. Os anticorpos bi-especificos e/ou multi-especificos aqui descritos exibem afinidades semelhantes para um dado alvo, em comparação com as afinidades dos anticorpos mono-especificos para o mesmo alvo. Preferencialmente, os anticorpos bi-especificos e/o multi-especificos aqui descritos praticamente não se distinguem das moléculas-padrão de IgG.

Os processos aqui providenciados, providenciam também meios de geração de misturas de anticorpos simples de dois anticorpos mono-especificos e de um anticorpo bi-especifico, que são úteis, por exemplo, para atingir vários alvos sem purificação do anticorpo bi-especifico a partir da mistura.

Possíveis modos de actuação dos anticorpos bi-específicos

Inibição simultânea de dois alvos. Por definição, os anticorpos bi-especificos comportam duas especificidades e podem por isso inibir mais do que um alvo. Estes alvos podem ser factores solúveis ou estar localizados na superfície de uma célula. Já se gerou, com sucesso, um certo número de formatos que atingem citocinas múltiplas (Wu C et ai., Nat Biotechnol 2007 25: 1290-7).

Impacto duplo. Dado que a maioria dos formatos de anticorpos bi-específicos são capazes de se ligar simultaneamente a duas moléculas, eles podem assim ser utilizados como moléculas de ligação através de pontes a células efectoras citotóxicas de impacto duplo, que se pretendem atingir duplamente ou como agentes citotóxicos para essas células envolvidas num processo de doença. Esta aplicação tem sido explorada em oncologia. Nalguns casos, uma das especificidades de um anticorpo foi dirigida contra marcadores de células tumorais, tais como, CD19, CD20, HER2, antigénio carcino-embriónico (ACE). O segundo ramo do anticorpo bi-especifico comporta uma parte tóxica muito próxima ou traz a actividade desses fármacos, toxinas, citotoxinas ou uma célula efectora do sistema imunitário (células T, células AN (assassinas naturais), monócitos e neutrófilos, ao atingir CD3, CD16, CD64 e CD89, respectivamente) (Thielemans K, Blood 1996; 87: 4390-4398; Goldstein J et al., J Immunol 1997; 158: 872-879).

Especificidade aumentada por via da avidez. No formato clássico de IgG, a ligação do anticorpo é dirigida tanto pela afinidade de cada sítio de combinação para o seu antigénio, como nos efeitos da avidez providenciados pela ligação bivalente. O efeito da avidez aumenta drasticamente a afinidade aparente do anticorpo para os marcadores da superfície das células porque dois eventos de dissociação têm que ocorrer para que o anticorpo seja libertado. Alguns dos formatos bi-especificos descritos antes são bivalentes (isto é, um sítio de ligação para cada alvo) , enquanto outros são tetravalentes. Estes últimos têm quatro sítios de ligação ou mais e têm potencial para se ligar a cada um dos alvos de uma maneira bivalente. Os agentes bi-especificos bivalentes, como agentes terapêuticos, atingem selectivamente populações celulares, que expressam uma combinação de marcadores da superfície das células. Este modo único de acção é um princípio restrito a moléculas que podem beneficiar de uma componente de avidez, para discriminar células que expressam ambos os antigénios e aquelas que expressam apenas um marcador.

Uma representação de modos possíveis de acção mediados pelos anticorpos específicos está ilustrada na figura 2. Esta representação deriva de Fischer e Léger, Pathobiology 2007; 74: 3-14.

Características e limites dos formatos de anticorpos bi-específicos

As características-chave dos formatos de anticorpos bi-especif icos actuais estão resumidas no quadro I. Todos os formatos, excepto os que se baseiam em domínios humanos, contêm sequências que não são de origem humana ou contêm sequências de proteínas não humanas geradas pela fusão de diferentes domínios de proteínas. A maioria dos formatos que utilizam ligantes leva a questões do fabrico potencial devido à agregação do domínio. A presença de sequências exógenas e de características de estabilidade desfavoráveis podem potencialmente significar o aumento do risco de imuno- geneicidade. Uma diferença-chave entre os formatos é a valência dos seus sítios de ligação que está directamente ligada à sua capacidade para mediar um duplo direccionamento ou uma ligação selectiva mediada pela avidez. Assim, nem todos os formatos podem funcionar em todos os modos de acção. Em particular, o único formato que não se distingue de uma imunoglobulina completamente humana não pode mediar um duplo alvejamento ou actividades com selectividade acrescida. Há por isso uma necessidade de gerar novos anticorpos bi-específicos com propriedades favoráveis para o desenvolvimento de terapêuticas, isto é, que não se possam distinguir de moléculas de imunoglobulina completamente humanas, tenham boas propriedades de produção e permitam um espectro completo dos possíveis modos de acção.

Processos melhorados para gerar anticorpos bi-específicos e bivalentes. A presente invenção tem por objecto processos para gerar anticorpos bi-específicos que são idênticos, na sua estrutura, a uma imunoglobulina humana. Este tipo de molécula é composto por duas cópias de um único polipéptido de cadeia pesada, uma primeira região variável de cadeia leve fundida com um domínio constante kapa e uma segunda região variável de cadeia leve fundida com um domínio constante lambda. Cada sítio de combinação exibe uma especificidade diferente do antigénio para o qual contribuem tanto a cadeia pesada como a cadeia leve. As regiões variáveis de cadeia leve podem ser da família lambda ou kapa e estão, preferencialmente, fundidas com domínios constantes lambda e kapa, respectivamente. Prefere-se assim, para evitar a geração de junções polipeptídicas não naturais. Contudo, é também possível obter anticorpos bi-específicos da presente invenção por fusão de um domínio variável de cadeia leve kapa com um com domínio constante lambda para uma primeira especificidade e a fusão de um domínio variável de cadeia leve lambda com um domínio constante kapa para a segunda especificidade (figura 3) . Os anticorpos bi-específicos aqui descritos também são descritos como anticorpos IgGxÀ ou "corpos κλ", um novo formato bi-especí fico de IgG, completamente humano. Este formato de corpo κλ permite a purificação por afinidade de um anticorpo bi-específico que não se distingue de uma molécula-padrão de IgG com características que não se distinguem do anticorpo monoclonal-padrão e, por isso, são favoráveis quando comparados com os formatos anteriores.

Uma etapa essencial do processo consiste na identificação de duas regiões Fv do anticorpo (cada uma delas composta por um domínio variável de cadeia leve e um domínio variável de cadeia pesada) com diferentes especificidades para os antigénios que partilham o mesmo domínio variável de cadeia pesada. Já foram descritos numerosos processos para a geração de anticorpos monoclonais e os seus fragmentos. (Ver, por exemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, e Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold

Spring Harbor, NY, incorporadas aqui como referência). Os anticorpos completamente humanos são moléculas de anticorpos nas quais a sequência tanto da cadeia leve como da cadeia pesada incluem as RDC 1 e 2, com origem em genes humanos. A região RDC3 pode ser de origem humana ou concebida por meios sintéticos. Esses anticorpos são designados aqui por "anticorpos humanos" ou "anticorpos completamente humanos". Os anticorpos monoclonais humanos podem ser preparados utilizando a técnica do trioma; a técnica de hibridoma de células B humanas (ver Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72) ; e a técnica de hibridoma EBV para produzir anticorpos monoclonais humanos (ver Cole, et al. , 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Os anticorpos monoclonais humanos podem ser utilizados e podem ser produzidos utilizando hibridomas humanos (ver Cote, et al. , 1983. Proc Natl Acad Sei USA 80: 2026-2030) ou por transformação de células B humanas com o virus de Epstein Barr in vitro (ver Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-9 6) .

Os anticorpos monoclonais são gerados, por exemplo, por imunização de um animal com um antigénio-alvo ou um fragmento imunogénico, um seu derivado ou variante. Alternativamente, o animal é imunizado com células transfectadas com um vector contendo uma molécula de ácido nucleico, que codifica o antigénio-alvo, de tal forma que o antigénio-alvo é expresso e associado com a superfície das células transfectadas. Conhece-se uma variedade de técnicas para a produção de animais xenogénicos não humanos. Por exemplo, ver as patentes norte-americanas N2. 6 075 181 e N2. 6 150 584, que se incorporam aqui como referência na sua totalidade.

Alternativamente, obtêm-se os anticorpos por rastreio de uma biblioteca que contém sequências de anticorpos ou sequências de domínios de ligação do antigénio para a ligação ao antigénio-alvo. Prepara-se esta biblioteca, por exemplo, em bacteriófagos, sob a forma de fusões de proteínas ou péptidos com uma proteína com um revestimento de bacteriófago, que é expressa na superfície das partículas de fago reunidas e a codificação das sequências de ADN contidas dentro das partículas de fago (isto é, "uma biblioteca de exibição de fagos").

Os hibridomas que resultam das fusões de mieloma/células B são rastreados quanto à reactividade com o antigénio-alvo. Preparam-se anticorpos monoclonais, por exemplo, utilizando os processos de hibridoma, tais como os descritos por Kohler e Milstein, Nature, 256: 495 (1975). Num processo de hibridoma, normalmente imuniza-se um murganho, um hamster ou outro animal hospedeiro apropriado, com um agente de imunização, para fazer com que os linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos, que se vão ligar especificamente ao agente de imunização. Alternativamente os linfócitos podem ser imunizados in vitro.

Embora não seja estritamente impossível, a identificação descoberta acidentalmente de diferentes anticorpos com o mesmo domínio variável de cadeia pesada, mas dirigido contra antigénios diferentes, é altamente improvável. Na verdade, na maior parte dos casos, a cadeia pesada contribui fortemente para a superfície de ligação do antigénio e é também a mais variável na sequência. Em particular, a RDC3 na cadeia pesada é a RDC mais diversa na sequência, em comprimento e na estrutura. Assim, dois anticorpos específicos para diferentes antigénios comportarão invariavelmente diferentes domínios variáveis de cadeia pesada. 0 processo da presente invenção ultrapassa esta limitação e facilita em grande parte o isolamento de anticorpos que têm o mesmo domínio variável de cadeia pesada, por meio da utilização de bibliotecas de anticorpos, em que o domínio variável de cadeia pesada é o mesmo para todos os elementos da biblioteca e assim a diversidade está confinada ao domínio variável de cadeia leve. Essas bibliotecas estão descritas, por exemplo, no pedido de patente co-pendente PCT/US2010/035619, registado em 20 de Maio de 2010 e publicado em 25 de Novembro de 2010 como publicação PCT N2. WO 2010/135558 e o pedido de patente co-pendente PCT/ US2010/057780, registado em 23 de Novembro de 2010 como publicação PCT N2. WO 2011/084255. Contudo, como o domínio variável de cadeia leve é expresso em conjunto com o domínio variável de cadeia pesada, ambos os domínios podem contribuir para a ligação ao antigénio. Para facilitar mais o processo, as bibliotecas de anticorpos contêm o mesmo domínio variável de cadeia pesada e quer uma diversidade de cadeias variáveis leves lambda, quer cadeias variáveis leves kapa, que podem ser utilizadas em paralelo para selecção, in vitro, de anticorpos contra diferentes antigénios. Esta abordagem permite a identificação de dois anticorpos com uma cadeia pesada comum mas comportando um domínio variável de cadeia leve lambda e o outro domínio variável de cadeia leve kapa que podem ser utilizados como blocos de construção para a geração de um anticorpo bi-específico no formato completo de imunoglobulina da presente invenção. Os anticorpos bi-específicos da presente invenção podem ser de isotipos diferentes e a sua porção Fc pode ser modificada de modo a alterar as propriedades da ligação com os diferentes receptores de Fc e, desta maneira, modificar as funções efectoras do anticorpo, assim como as suas propriedades farmacocinéticas. Já foram descritos numerosos processos para a modificação da porção Fc e são aplicáveis aos anticorpos da presente invenção (ver, por exemplo, Strohl, WR Curr Opin Biotechnol 2009 (6): 685-91; patentes de invenção norte-americanas N2s. 6 528 624; US2009/0191199, registada em 9 de Janeiro de 2009). Os processos da presente invenção também podem ser utilizados para gerar anticorpos bi-especificos e misturas de anticorpos num formato de F (ab')2 a que falta a porção Fc.

Outra etapa-chave da presente invenção é a optimização da co-expressão da cadeia pesada comum e as duas diferentes cadeias leves, numa única célula, para permitir a junção de um anticorpo bi-especifico da presente invenção. Se todos os polipéptidos forem expressos ao mesmo nivel e forem reunidos de forma igual para formar uma molécula de imunoglobulina, então a proporção entre mono-especifico (as mesmas cadeias leves) e bi-especifico (duas cadeias leves diferentes) deve ser de 50 %. Contudo, é provável que as diferentes cadeias leves sejam expressas em niveis diferentes e/ou não se reúnam com a mesma eficácia. Por isso, os processos da presente invenção também providenciam meios para regular a expressão relativa dos polipéptidos diferentes para compensar as suas caracteristicas intrínsecas de expressão ou as diferentes tendências para se juntarem à cadeia pesada comum. Esta regulação pode ser conseguida por via de uma força promotora, a utilização de sítios internos de entrada de ribossoma (SIER), que caracterizam eficiências diferentes ou outros tipos de elementos reguladores que podem actuar aos níveis transcricional ou translacional, assim como, actuar na estabilidade do ARNm. Promotores diferentes de potências diferentes podem incluir CMV (promotor imediato precoce do vírus citomegalovírus) ; EFl-Ια (promotor da subunidade la do factor de elongação humano); Cub (promotor C da ubiquitina humana); VS40 (promotor do vírus de símio 40). Os diferentes SIER também têm sido descritos como tendo origem em mamíferos ou origem viral. (Ver, por exemplo, Hellen CU e Sarnow P. Genes Dev 2001 15: 1593-612). Estes SIER podem diferir imenso no seu comprimento e na eficácia de recrutamento de ribossoma. Além disso, é possível ainda afinar a actividade por meio da introdução de múltiplas cópias de um SIER (Stephen et ai. 2000 Proc Natl Acad Sei EUA 97: 1536-1541). A regulação da expressão também pode ser conseguida por várias transfecções sequenciais de células para aumentar o número de cópias de genes individuais, que expressam uma ou a outra cadeia leve e assim modificam as suas expressões relativas. Os exemplos que aqui se dão demonstram que o controlo da expressão relativa das diferentes cadeias é crítico para maximizar a junção e o rendimento global dos anticorpos bi-específicos. A co-expressão da cadeia pesada e das duas cadeias leves gera uma mistura de três anticorpos diferentes no sobrenadante da cultura de células: dois anticorpos bivalentes mono-específicos e um anticorpo bivalente bi-específico. Este último tem de ser purificado a partir da mistura para se obter a molécula de interesse. O processo aqui descrito facilita muitíssimo o procedimento de purificação, por meio da utilização de um meio de cromatografia por afinidade, que interage especificamente com os domínios constantes das cadeias leves kapa ou lambda, tais como, as matrizes de afinidade de selecção de captura de kapa de Fab e de selecção da captura de lambda de Fab (BAC BV, Holanda). Esta abordagem de purificação cromatográfica por afinidade em várias fases é eficiente e é geralmente aplicável aos anticorpos da presente invenção. Isto está em total contraste com os processos específicos de purificação que têm de ser desenvolvidos e optimizados para cada um dos anticorpos bi-específicos derivados de quadromas ou de outras misturas de anticorpos que expressam linhas de células. Na verdade, se as características bioquímicas dos diferentes anticorpos nas misturas forem semelhantes, a sua separação utilizando técnicas convencionais de cromatografia, tais como, cromatografia de permuta iónica, podem ser complicadas se não mesmo impossíveis. A presente invenção também tem por objecto novos meios de produção de misturas de anticorpos simples de dois ou mais anticorpos mono-específicos e de um ou mais anticorpos bi-específicos, que partilham a mesma cadeia pesada e podem ser purificados utilizando técnicas convencionais de cromatografia, para a purificação de anticorpos monoclonais. (Ver, por exemplo, Lowy, I et ai. N Engl J Med 2010; 362: 197-205; Goudsmit, J. et ai. J Infect Dis. 2006. 193, 796-801). Essas misturas simples podem ser utilizadas como agentes de acção múltipla para utilizações terapêuticas.

Nos exemplos demonstra-se a co-expressão, purificação e caracterização com sucesso de anticorpos de cadeia pesada e de duas cadeias leves e a purificação de anticorpos bi-específicos. Os genes que codificam a cadeia pesada comum e as duas cadeias leves foram clonados num vector contendo três promotores. Depois de uma transfecção temporária, recolheu-se o sobrenadante das células PEAK. A co-expressão das três cadeias leva à junção de três anticorpos diferentes: dois anticorpos mono-específicos e um anticorpo bi-específico. As suas proporções teóricas relativas devem ser de 1:1:2 desde que os níveis de expressão e as taxas de junção sejam semelhantes para ambas as cadeias leves. Purificaram-se os anticorpos bi-específicos utilizando um procedimento de cromatografia de afinidade em três etapas: (1) proteína A: captura de IgG (mono- e bi-), (2) selecção de kapa: captura de IgG contendo cadeias leves kapa e (3) selecção de lambda: captura de IgG contendo uma cadeia leve lambda. Kapaselect e Lambdaselect são meios de cromatografia de afinidade desenvolvidos pela BAC, BV and GE Healthcare.

Os anticorpos bi-específicos purificados foram caracterizados como se segue. Analisou-se cada fluxo e cada produto de eluição de cada etapa de purificação por afinidade por meio de EGPA-SDS. Os resultados indicam que, em cada etapa, os anticorpos bi-específicos são enriquecidos (figura 8) . 0 corpo κλ continha quantidades equivalentes das cadeias leves kapa e lambda. 0 corpo κλ exibiu um modelo de migração intermédio num gel de focagem iso-eléctrico e numa cromatografia de permuta iónica, em comparação com os dois anticorpos mono-específicos (figura 10). A especificidade e a afinidade dos corpos κλ foram determinadas por ELISA e por ressonância plasmónica de superfície. Os processos da presente invenção permitem a identificação de anticorpos com afinidades nos intervalos sub-nanomolar a nanomolar, sem optimização. Isto não é óbvio dado que a diversidade das bibliotecas de anticorpos aqui descritas está restrita à cadeia leve, que contribui menos para a energia de ligação em anticorpos-padrão.

Para evitar o requisito de ter acesso a dois anticorpos com domínios variáveis de cadeias leves do tipo kapa e lambda, que no fundo constitui um limite à presente invenção, os processos aqui descritos permitem a geração de cadeias leves hibridas em que um domínio variável lambda pode estar fundido com um domínio constante kapa e, inversamente, um domínio variável kapa pode estar fundido com um domínio constante lambda, tal como se descreve na figura 3. Isto alarga as aplicações da presente invenção a pares de anticorpos que partilham uma cadeia leve do mesmo tipo. Tal como está descrito nos exemplos que se dão aqui, o ponto de fusão entre os domínios variáveis e constantes é importante e pode afectar o processo de purificação do anticorpo bi-específico.

Uma visão geral de um processo de produção dos anticorpos bi-específicos e/ou poli-específicos da presente invenção está ilustrada na figura 13. Nalgumas modalidades, os processos de geração de anticorpos bi-específicos e/ou poli-específicos utilizam um processo completo definido quimicamente como isento de soro. Estes processos incorporam as linhas de células de mamíferos mais amplamente utilizadas na indústria farmacêutica, a linha de células de ovário de hamster chinês (OHC). Os processos aí descritos são utilizados para gerar tanto linhas de células semi-estáveis como estáveis. Os processos podem ser utilizados para produzir anticorpos bi-específicos e/ou poli-específicos da presente invenção a uma escala pequena (por exemplo, num frasco de Erlenmeyer) e a uma escala média (por exemplo, num saco de Wave de 25 L). Os processos são facilmente adaptáveis para a produção em maior escala dos anticorpos bi-específicos e/ou poli-específicos, assim como, misturas dos anticorpos da presente invenção.

Os processos de geração de anticorpos bi-específicos e/ou multi-específicos da presente invenção são vantajosos porque utilizam processos de purificação genéricos, tal como se demonstra na figura 8A. A figura 16 demonstra a purificação e o ensaio de integridade do produto de anticorpos bi-específicos purificados a partir de uma linha de células semi-estável. Os anticorpos bi-específicos foram purificados utilizando o procedimento de cromatografia de afinidade em três etapas que se seguem: (i) purificação da proteína A para capturar moléculas de IgG, incluindo tanto mono-específicas como bi-específicas; (ii) purificação por

KapaSelect para capturar igG contendo cadeias leves kapa; (iii) purificação por LambdaSelect para capturar IgG contendo uma cadeia leve lambda. 0 fluxo e a eluição de cada uma das etapas de purificação por afinidade foram analisados por EGPA-SDS. Os resultados demonstraram a eliminação de cada uma das formas mono-especificas (isto é, moléculas mono-específicas de IgG com cadeias leves kapa e moléculas mono-específicas de IgG com cadeias leves lambda) durante o processo de purificação (figura 16A) . Os anticorpos contendo κλ purificados (isto é, os anticorpos tanto com cadeias leves kapa como lambda) continham quantidades equivalentes de cadeias leves kapa e lambda (figura 16B) . Os anticorpos contendo κλ purificados apresentados num modelo intermédio de migração num gel de focagem iso-eléctrico foram comparados com os dois anticorpos mono-específicos (figura 16C).

Os processos definidos quimicamente para a produção de anticorpos bi-específicos e/ou multi-específicos da presente invenção podem ser utilizados quer com conjuntos de células de OHC ou com linhas de células estabelecidas. Os resultados obtidos com os processos definidos quimicamente utilizando quer os conjuntos de linhas de células, quer as linhas de células estabelecidas demonstram produtividades comparáveis e características de crescimento comparáveis aos que expressam os correspondentes anticorpos mono-específicos kapa ou lambda. Assim, o corpo κλ conserva tanto a estrutura como as características de produção de uma IgG humana clássica.

Abordagens anteriores para produzir formatos de anticorpos bi-específicos levaram a forçar a produção de uma molécula bi-específica homogénea utilizando diferentes abordagens de engenharia genética de anticorpos descritas antes e foram feitas à custa da produtividade, do aumento da escala e da estabilidade do produto. A presente invenção é uma nova abordagem que permite a produção de uma mistura simples de anticorpos, que têm caracteristicas-padrão de produtividade e de aumento de escala dos anticorpos monoclonais e providencia meios eficazes e genéricos para purificar o anticorpo bi-especifico a partir da mistura ou para purificar a mistura de anticorpos.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: Geração de bibliotecas de anticorpos com cadeias pesadas fixas

As bibliotecas de anticorpos em que o domínio variável pesado é idêntico para todos os elementos da biblioteca, foram geradas como se segue. Em primeiro lugar, o domínio variável de cadeia pesada VP3-23 contendo uma RDC3 definida AKSYGAFDY (SEQ ID N2. 1) (nomenclatura das RDC de acordo com o IMGT) e uma sequência de RE4 definida foi clonado num vector pNDS utilizando os sítios de restrição Sfil e Xhol para se obter o vector de fagemido pNDS_VP fixo. A sequência de aminoácidos da RE4 de VK corresponde à região RE4 codificada pela linha germinativa dos genes J, JK1. A sequência de aminoácidos de RE4 de VÀ corresponde à região de RE4 codificada pela linha germinativa de genes J, JL2 e JL3. Geraram-se duas variantes da sequência de RE4 de Vk com uma única substituição de aminoácidos na posição 106 (arginina ou glicina). Clonou-se um total de 6 genes de domínios variáveis kapa (VK1-33, VK1-39, VK3-11, VK3-15, VK3-20, VK4-1) e 5 genes de domínios variáveis lambda (VÀ1-44, VÀ1-51, VÀ6-57, VÀ2-14, VÀ1-40) contendo um fragmento barreira em vez de uma sequência de codificação de RDC3 e fez-se a clonagem em pNDS_VP fixo para gerar 17 vectores receptores, em que a diversidade de origem sintética ou natural pode ser clonada e podem gerar-se bibliotecas com elevada diversidade, de acordo com os processos descritos no pedido de patente co-pendente PCT/US2010/035619, registado em 20 de Maio de 2010, publicado como WO2010/135558 e os processos descritos em Ravn et ai. (2010) Nucl Acid Res 38(21): el93, cada um dos quais é aqui incorporado, na sua totalidade, como referência. Este processo resultou na geração de 17 bibliotecas tendo todas um domínio VP3-23 comum e domínios Vkapa ou Vlambda diversificados na região 3 de determinação de complementaridade da cadeia leve variável (região RDCL3) contendo um total de 6,9 x 109 variantes (figura 5A) . A sequenciação de 180 transformantes recolhidos aleatoriamente indicou que > 90 % dos clones tinham integrada uma sequência de RDCL3 que estava em linha e por isso era potencialmente funcional. EXEMPLO 2: Recuperação de fagos das bibliotecas

Cada biblioteca foi recuperada independentemente de acordo com os procedimentos convencionais de exibição de fagos resumidos sumariamente a seguir. Adicionou-se um certo volume de células a partir de alíquotas congeladas da biblioteca, suficientes para cobrir pelo menos 10 vezes a

diversidade teórica da biblioteca, a 500 mL de 2x TYAG (100 pg/mL de ampicilina; glicose a 2 %) e cresceram, a 37 2C, com agitação (240 rpm), até se atingir uma D050o de 0,3 a 0,5. Depois super-infectou-se a cultura com um fago auxiliar MK13K07 e incubou-se, durante uma hora, a 37 2C (150 rpm) . Depois mudou-se o meio por centrifugação das células a 2 000 rpm, durante 10 minutos, eliminando o meio e suspendendo novamente os péletes em 500 mL de 2x TY-AK (100 pg/mL de ampicilina; 50 pg/mL de canamicina). Depois a cultura cresceu durante a noite, a 30 2C (240 rpm). Centrifugou-se a cultura a 4 000 rpm, durante 20 minutos, para transformar as células em péletes. Recolheu-se o sobrenadante e adicionou-se 30 % (vol/vol) de PEG 8000 (20 %)/NaCl 2,5 M para precipitar as partículas de fago por incubação da mistura, durante 1 hora, em gelo. Recolheram-se as partículas de fagos por centrifugação, a 10 000 rpm, durante 30 minutos e suspenderam-se novamente em 10 mL de tampão de TE (tris-HCl 10 mM, a pH 8,0; EDTA 1 mM). Centrifugou-se a solução novamente suspensa a 10 000 rpm para a purificar dos resíduos bacterianos e repetiu-se o procedimento de precipitação. Após uma nova suspensão final, titularam-se os fagos por infecção com E. coll e absorção a 260 nm. O nível de exibição de scFv na superfície dos fagos foi também avaliado por uma análise de "Western blot" utilizando um anticorpo monoclonal anti-c-mic. Armazenaram-se os fagos purificados a partir das diferentes bibliotecas, congelados, a -80 2C, após a adição de glicerol, a uma concentração final de 15 % (p/v). EXEMPLO 3: Selecções de exibição de fagos utilizando bibliotecas fixas de cadeia pesada

Selecções em fase liquida em função da proteína de fusão A hCXCLIO-NusA biotinilada (hCXCLl0-NusA) e do complexo do receptor de IL-6h biotinilado (RC-IL-6h): Mantiveram-se separadas alíquotas de bibliotecas de fagos de VP-Vk e de VP-VÀ (1011-1012 Ufp) e bloquearam-se com STF contendo leite desnatado a 3 % (p/v) , durante uma hora, à temperatura ambiente, num misturador rotativo. Depois desseleccionaram-se os fagos bloqueados em pérolas magnéticas de estreptavidina (Dynal M-280), durante uma hora, à temperatura ambiente, num misturador rotativo. Depois incubaram-se os fagos desseleccionados com hCXCLIO-NusA ou RC-IL-6h biotinilados (100 nM), in vivo, durante duas horas, à temperatura ambiente, num misturador rotativo. Adicionaram-se pérolas ao alvo e capturaram-se utilizando um suporte magnético seguido de quatro lavagens com STF/Tween 20 a 0,1 % e 3 lavagens com STF. Depois adicionaram-se directamente as pérolas a 10 mL de células TG1 de crescimento exponencial e incubaram-se, durante uma hora, a 37 2C, com uma ligeira agitação (100 rpm) . Diluiu-se em série uma alíquota de TG1 infectada, para titular a selecção resultante. As restantes TG1 infectadas foram centrifugadas a 3 000 rpm, durante 15 minutos e novamente suspensas em 0,5 mL de 2x TYAG (meio de 2 x TY contendo 100 pg/mL de ampicilina e glicose a 2 %) e espalharam-se em placas de agar 2x TYAG da Bioassay. Após incubação, durante a noite, a 30 2C, adicionou-se 10 mL de 2x TYAG às placas e rasparam-se as células da superfície e depois transferiram-se para um tubo de polipropileno de 50 mL. Adicionou-se à suspensão de células 2x TYAG contendo glicerol a 50 %, para se obter uma concentração final de glicerol a 17 %. Mantiveram-se as alíquotas do ciclo de selecção a -80 2C.

Recuperação de fagos: Adicionou-se 100 pL da suspensão de células obtidas dos primeiros ciclos de selecção, a 20 mL de 2x TYAG e deixou-se crescer, a 37 2C, com agitação (240 rpm), até se atingir uma D06oo de 0,3 a 0,5. Depois a cultura foi super-inf ectada com 3,3 x 1010 do fago auxiliar MK13K07 e incubou-se, durante uma hora, a 37 2C (150 rpm) . Depois mudou-se o meio centrifugando as células a 3 800 rpm, durante 10 minutos, eliminando o meio e suspendendo novamente os péletes em 20 mL de 2x TY-AK (100 pg/mL de ampicilina; 50 pg/mL de canamicina). Depois a cultura cresceu, durante a noite, a 30 2C (240 rpm) . No dia seguinte, utilizou-se uma alíquota do sobrenadante centrifugado como a entrada para o ciclo seguinte de selecção.

Recuperação de fagos monoclonais por ELISA: Recolheram-se clones simples para uma placa microtituladora contendo 150 pL de meio 2x TYAG (glicose a 2 %) por poço e deixou-se crescer, a 37 2C (100-120 rpm), durante 5-6 h. Adicionou-se o fago auxiliar M13K07 a cada um dos poços, para se obter uma multiplicidade de infecções (MDI) de 10 (isto é, 10 fagos por cada célula da cultura) e incubou-se, a 37 2C (100 rpm), durante 1 h. No seguimento do crescimento, centrifugaram-se as placas a 3 200 rpm, durante 10 min. Eliminou-se cuidadosamente o sobrenadante, fez-se uma nova suspensão das células em 150 pL de meio 2x TYAK e deixou-se crescer, durante a noite, a 30 2C (120 rpm) . Para o ensaio de ELISA, bloquearam-se os fagos por adição de 150 pL de STF concentrado 2x, contendo leite desnatado em pó a 5 %, seguido de uma hora de incubação, à temperatura ambiente. Depois centrifugaram-se as placas, durante 10 minutos, a 3 000 rpm e utilizou-se para o ensaio de ELISA o sobrenadante contendo os fagos.

Ensaio de ELISA dos fagos: Revestiram-se placas de ELISA (Maxisorp, NUNC), durante a noite, com 2 pg/mL de hCXCLlO-NusA, em STF ou 2 pg/mL de RC-IL-6h em STF. Depois bloquearam-se as placas com leite desnatado a 3 %/STF, à temperatura ambiente, durante 1 h. Lavaram-se as placas, 3 vezes, com STF a 0,05 % em Tween 20, antes de se transferir os sobrenadantes de fagos pré-bloqueados e incubou-se, durante uma hora, à temperatura ambiente. Analisou-se cada clone em função de ambos os alvos para ensaiar a sua especificidade. Depois lavaram-se as placas, 3 vezes, com STF a 0,05 %, em Tween 20. Adicionou-se a cada poço 50 pL de leite desnatado a 3 %/STF contendo anticorpo anti-M13 conjugado com PRS (Amersham, diluído a 1:10 000). No seguimento da incubação, à temperatura ambiente, durante 1 h, lavaram-se as placas, 5 vezes, com STF a 0,05 % em Tween 20. O ensaio de ELISA foi revelado por meio da adição de 50 pL de TMB (Sigma) e 50 pL de H2SO4 2 N para parar a reacção. Leu-se a intensidade de absorção a 450 nm. Puderam identificar-se clones específicos para hCXCLIO-NusA ou RC-IL-6h comportando 0 mesmo domínio variável de cadeia pesada (figura 4).

Sequenciação dos clones de fagos: Cresceram clones simples em 5 mL de meio 2x TYAG (glicose a 2 %), por poço, a 37 2C (120 rpm), durante a noite. No dia seguinte, purificou-se o ADN do fagemido e utilizou-se para a sequenciação de ADN utilizando um iniciador específico para pNDSl: micseq, 5'- CTCTTCTGAGATGAGTTTTTG. (SEQ ID N2. 2).

Purificação de scFv em larga escala: Inoculou-se uma cultura de iniciador de 1 mL de 2x TYAG com uma colónia simples de uma placa de agar de 2x TYAG recentemente removida e incubou-se, com agitação (240 rpm), a 37 2C, durante 5 horas. Utilizou-se 0,9 mL desta cultura para inocular uma cultura de 400 mL do mesmo meio e deixou-se crescer, durante a noite, a 30 2C, com agitação vigorosa (300 rpm) . No dia

seguinte, induziu-se a cultura por adição de 400 pL de IPTG 1 M e continuou-se a incubação, durante mais 3 horas.

Recolheram-se as células por centrifugação a 5 000 rpm, durante 10 minutos, a 4 2C. Fez-se uma nova suspensão das células peletizadas em 10 mL de tampão de TES arrefecido com gelo, complementado com inibidores de protease, tal como descrito antes. Conseguiu-se um choque osmótico por adição de 15 mL de tampão de TES diluído a 1:5 e fez-se a incubação, durante 1 hora, em gelo. Centrifugaram-se as células a 10 000 rpm, durante 20 minutos, a 4 2C, para peletizar os

fragmentos de células. O sobrenadante foi transferido cuidadosamente para um tubo novo. Adicionou-se imidazol ao sobrenadante até a uma concentração final de 10 mM. Adicionou-se 1 mL de resina Ni-NTA (Qiagen), equilibrada em STF, a cada tubo e incubou-se num misturador rotativo, a 4 2C (20 rpm), durante 1 hora. Centrifugaram-se os tubos a 2 000 rpm, durante 5 minutos e retirou-se cuidadosamente o sobrenadante. Fez-se uma nova suspensão da resina peletizada em 10 mL de tampão 1 de lavagem (NaH2P04 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM, a pH até 8,0) frio (4 2C) . Adicionou-se a suspensão a uma coluna polyprep (Biorad). Utilizou-se para lavar a coluna, por um fluxo de gravidade, 8 mL de tampão de lavagem 2 (NaH2P04 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, a pH até 8,0) frio. Eluiu-se o scFv da coluna com 2 mL de tampão de eluição (NaH2P04 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM, a pH até 8,0). Analisaram-se as fracções por absorção a 280 nm e reuniram-se as fracções contendo proteína antes de trocar o tampão numa coluna de dessalinização NAP5 (Amersham) equilibrada com STF. Analisou-se o scFv em STF por meio de EGPA-SDS e quantificou-se por absorção a 280 nm. Transformou-se em aliquotas os scFv purificados e armazenaram-se a -20 2C e a 4 2C. Os scFv purificados foram utilizados num aparelho ELISA para confirmar a ligação específica ao alvo em função do qual tinham sido seleccionados.

EXEMPLO 4: Selecções adicionais utilizando diferentes bibliotecas fixas de VP

Também se geraram bibliotecas de anticorpos capturando reportórios de cadeia leve rearranjados naturalmente e clonando-os no contexto de um único domínio de VP descrito no exemplo 1. Neste caso, amplificou-se toda a região variável de cadeia leve do gene a partir de ADNc humano, utilizando iniciadores que correspondem à região 5' e 3' das regiões variáveis humanas rearranjadas e clonaram-se em vectores pNDS_VP fixos descritos no exemplo 1. Gerou-se um outro conjunto de bibliotecas, conforme descrito no exemplo 1, mas utilizando um domínio fixo de VP3-23 contendo uma sequência diferente de P3 da RDC ARGDDVS (SEQ ID N2. 3). As bibliotecas descritas antes estão representadas esquematicamente na figura 5. Estas bibliotecas fixas de VP foram utilizadas em função de um painel de proteínas-alvo utilizando a metodologia da selecção e do rastreio descritas nos exemplos 2 e 3. As selecções tinham sido realizadas utilizando os seguintes alvos: hCXCLl0-NusA, RC-IL-6, CD47, CD16, CD8 e hlFNY. Os candidatos que foram identificados e demonstraram ser específicos para os seus alvos estão listados no quadro II. Estes resultados demonstram que podem ser gerados anticorpos que se ligam a alvos diferentes e que têm uma cadeia pesada comum e que a diversidade restrita à cadeia leve é suficiente para conferir a especificidade em relação ao antigénio. Os candidatos podiam ser gerados a partir de bibliotecas contendo um domínio VP3-23, com diferentes sequências P3 de RDC ou tendo reportórios de VL diversificados, utilizando estratégias diferentes. Por isso, os resultados demonstram que a abordagem não se restringe à estratégia de diversificação de uma sequência particular de VP ou a um domínio variável particular de cadeia leve.

EXEMPLO 5: Candidatos fixos de VP reformatados em IgG e expressão temporária em células de mamiferos

Após o rasteio, reformataram-se os candidatos de scFv em IgG e foram expressos por transfecção temporária em células PEAK. Geraram-se, tal como se segue, várias IgGÀ (n=5) e IgGx (n=9) com uma cadeia pesada comum e específicas para IFNy e

RC-IL-6, respectivamente e tendo sequências de cadeia leve diferentes. As sequências de VP e VL dos scFv seleccionados foram amplificadas com oligonucleótidos específicos e clonadas num vector de expressão contendo as regiões constantes de cadeia pesada e de cadeia leve e verificaram-se os resultados por sequenciação. Os vectores de expressão foram transfectados em células de mamíferos utilizando o reagente de transfecção Fugene 6 (Roche, Basileia, Suíça). Em resumo, fez-se uma cultura de células Peak em placas de 6 poços, a uma concentração de 6 x 105 células por poço, em 2 mL de meio de cultura contendo soro bovino fetal. Os vectores de expressão que codificam as sequências candidatas de VP e VL foram co-transfectados em células utilizando o reagente de transfecção Fugene 6, de acordo com as instruções do fabricante. No dia a seguir da transfecção, aspirou-se o meio de cultura e adicionou-se 3 mL de meio fresco isento de soro às células e fez-se a sua cultura, durante três dias, a 37 2C. No seguimento do período de três dias de cultura, recolheu-se o sobrenadante para IgG purificada em colunas de proteína G-sefarose 4B de fluxo rápido (Sigma, St. Louis, MO), de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, os sobrenadantes das células transfectadas foram incubados, durante a noite, a 4 2C, com tampão de ligação de IgG ImmunoPure (G) (Pierce, Rockford IL). Depois fez-se passar as amostras em colunas de proteína G-sefarose 4B de fluxo rápido e purificou-se em seguida IgG utilizando tampão de eluição. A fracção de IgG eluída foi depois dializada em função de STF e quantificou-se o teor de IgG por absorção a 280 nm. Verificou-se a pureza e a integridade de IgG por EGPA-SDS. Depois analisou-se a IgG quanto à ligação por meio de IFNy e o complexo de IL-6/receptor de R-IL-6, referido aqui como RC-IL-6, por meio de ELISA. Imobilizou-se IFNy e RC-IL-6 biotinilados em microplacas tituladas com estreptavidina (Streptawell, Roche) e bloquearam-se depois as placas com STF complementado com ASB a 2 %, à temperatura ambiente, durante 1 h. Lavaram-se as placas, 3 vezes, com STF a 0,05 % em Tween 20 antes de se adicionar a IgGÀ anti-INFY purificada ou a IgGK anti-RC-IL-6, em poços revestidos com cada um dos alvos. Passada uma hora de incubação, à temperatura ambiente e a lavagem das placas detectaram-se os anticorpos ligados com anticorpos Ck anti-humano ou CÀ anti-humano, acoplados a peroxidase de rábano-silvestre. O exame de ELISA foi revelado por meio da adição de 50 pL de TMB (Sigma) e 50 pL de H2S04 2 N para parar a reacção. Leu-se a intensidade da absorção a 450 nm. Os resultados indicam que a especificidade da ligação do scFv isolado das bibliotecas fixas de VP foi mantido no formato de IgG e demostraram que duas IgG com a mesma cadeia pesada mas diferentes cadeias leves podem ser específicas para alvos distintos (figura 6).

As sequências de aminoácidos de cadeias pesada e leve de IgGÀ anti-INFY ou da IgGx anti-RC-IL-6, estão indicadas a seguir:

Cadeia leve de Vkapa anti-RC-IL-6 E ΓVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVS SYLAWYQQKPGQAPRLLIYDAS NRATGIFARF5G SGSGTDFTLTIS SLE PE DFA VYY C QQKTL P TTP ATFG Q GTKVEIKRTVÂAPSVFIFPFSDSQLKS GTASWCLLIffiFYPREAKVQWKVDlLALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKÂDYEKHKV YACEVYBQGLSSFVTKSFNRGEC (SEQ ID MO: 4)

Cadeia leve de Vlambda anti-INFY

NFMLTQFHSVSSSFGKTVTISCTRS SGSIASNYVQWY QQRPGSS PTTVIYEDNQRPSGVPDSFS GSIDSSSNSA8LTIS61KTEDEADYYCQSQSWDGNHIVFGGGTKLTVLGQFKAAFSVTLFFFSS EELQ ANKATLVCLIS DFYPGAVTVASKADSSFVKAGVETTTP SKQSNNKYAASS YLS LTPEQWK SHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAFTECS{SEQ ID NO: 5)

Cadeia pesada comum E VQL1ES GG GL VQ P GG S LRLS CAAS GFT F S S Y AMS W VRQAPGKG L EW V S AISGSGGSTYY ADS V KGKFTISRDMSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA P S S KS T S GG TAAL G CL· VKD Y F PE P VT VS WM SG ALT S G VHT F P AVL QS SGL Y S L S S WT VP S S S L GTQTYlCWNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPEVFLFFPKPKDTLMlSRfF iVTCVWOVSaSDPEVKFNWYVDGVEVHNÃKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEyKC KVSHKALPAFIEKTISKAKGQPREFQVYTLPP SREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDXAVEWESEG Q P Em YKT T P PVL D s DG S FFL YSKL5VDKS RMQQGN VF S C S VMHE A L HN8 YT QKS L S LS PG lSRC> ID MO: 6) . EXEMPLO 6: Co-expressão de uma única cadeia pesada e duas cadeias leves em células de mamiferos A expressão simultânea de uma cadeia pesada e de duas cadeias leves na mesma célula pode levar à junção de três anticorpos diferentes (figura 8A) . A expressão simultânea pode ser conseguida de diferentes maneiras, tais como, a transfecção de vários vectores que expressam uma das cadeias a ser co-expressa ou utilizando vectores que originam uma expressão de vários genes. Concebeu-se um vector, pNovi κΗλ, para permitir a co-expressão de uma cadeia pesada, uma cadeia leve kapa e uma cadeia leve lambda (figura 7A) . A expressão de três genes é originada pelos promotores de citomegalovírus humano (CMVh) e o vector também contém um gene de glutamina-sintase (GS), que permite a selecção e o estabelecimento de linhas de células estáveis. Também se construiu outro vector, pNovi κΗλκ, em que uma segunda cópia de uma cadeia leve kapa foi inserida após a cadeia leve lambda e a sua expressão foi originada por um sitio interno de entrada de um ribossoma (SIER). Utilizando esta concepção bicistrónica, pode aumentar-se a expressão relativa da cadeia leve kapa. Os dois vectores estão representados esquematicamente na figura 7. EXEMPLO 7: Co-expressão temporária de uma única cadeia pesada e de duas cadeias leves em células de mamiferos e purificação da IgG total 0 gene de VP e de VL da IgGÀ anti-INFY ou da IgGx anti-RC-IL-6 foram clonados num vector pNovi κΗλ, descrito no exemplo 5, para a expressão temporária em células de mamífero. Fez-se uma cultura de células Peak em placas de 6 poços, a uma concentração de 6 x 105 células por poço, em 2 mL de meio de cultura, contendo soro bovino fetal. Transfectou-se 2 pg de ADN de plasmido nas células utilizando um reagente de transfecção TransIT-LTl (Mirus), de acordo com as instruções do fabricante. No dia a seguir à transfecção, aspirou-se o meio de cultura e adicionou-se 3 mL de meio fresco isento de soro às células e fez-se a sua cultura durante cinco dias, a 37 2C. No seguimento de um período de cultura de cinco dias, colheu-se o sobrenadante, centrifugou-se a 4 000 rpm e aplicou-se numa resina MabSelect Sure PA (GE Healthcare), de acordo com as instruções do fabricante. Eluíram-se todas as IgG, em condições ácidas, seguidas de neutralização e permuta do tampão em STF. Quantificou-se o teor de IgG por absorção a 280 nm e analisou-se por EGPA-SDS. A presença de duas bandas correspondentes às duas cadeias leves e uma banda correspondente à cadeia pesada indicou que as três cadeias podiam ser expressas simultaneamente na mesma célula (figura 8B). EXEMPLO 8: Purificação de anticorpos bi-específicos comportando uma cadeia leve kapa e uma lambda A co-expressão de uma cadeia pesada e de duas cadeias leves nas mesmas células pode levar à junção de três anticorpos diferentes: dois anticorpos mono-específicos comportando a mesma cadeia leve nos dois ramos e um anticorpo bi-específico comportando uma cadeia leve diferente, associada com a cadeia pesada em cada ramo. Este último pode ser isolado dos anticorpos mono-específicos por técnicas cromatográficas que têm em conta a vantagem das diferentes propriedades bioquímicas dos anticorpos mono-específicos e bi-específicos. Para desenvolver uma abordagem genérica de purificação que seja aplicável a toda a geração de anticorpos bi-específicos, utilizou-se uma abordagem de cromatografia por afinidade, descrita esquematicamente na figura 8A. Transfectaram-se os sobrenadantes da cultura a partir de células transfectadas aplicadas a uma coluna de resina MabSelect Sure PA (GE Healthcare) e purificou-se a IgG total, tal como descrito no exemplo 7. Depois aplicou-se a IgG total a uma coluna contendo uma matriz de afinidade CaptureSelect Fab Kapa (BAC BV, Holanda) equilibrada com dez volumes de STF. Depois lavou-se a coluna com 5-10 volumes da coluna de STF. As moléculas de imunoglobulina comportando uma cadeia leve kapa foram eluídas da coluna por aplicação de 5 volumes da coluna de glicina 0,1 M, a pH 2,0 e recolheram-se e neutralizaram-se as fracções. As fracções contendo o anticorpo foram reunidas antes da permuta do tampão, numa coluna de dessalinização PD10 (Amersham) equilibrada com STF. Depois aplicou-se o anticorpo a uma segunda coluna contendo uma matriz de afinidade CaptureSelect Fab Lambda, equilibrada com dez volumes de STF. Depois lavou-se a coluna com 5-10 volumes da coluna de STF. As moléculas de imunoglobulina comportando apenas cadeias leves kapa ligaram-se à coluna e encontraram-se no fluxo. Os anticorpos comportando uma cadeia leve lambda foram eluídos da coluna por aplicação de 5 volumes da coluna de glicina 0,1 M, a pH 3,0 e recolheram-se as fracções. As fracções contendo o anticorpo bi-específico foram reunidas antes da permuta do tampão numa coluna de dessalinização PD10 (Amersham), equilibrada com STF. As moléculas de imunoglobulina comportando uma cadeia leve kapa foram eluídas da coluna por aplicação de 5 volumes da coluna de glicina 0,1 M, a pH 2,0 e recolheram-se e neutralizaram-se as fracções. As fracções contendo o anticorpo foram reunidas antes da permuta do tampão, numa coluna de dessalinização PD10 (Amersham), equilibrada com STF. As moléculas de imunoglobulina comportando apenas uma cadeia leve kapa ligam-se à coluna e encontraram-se no fluxo. Os anticorpos comportando uma cadeia leve lambda foram eluídos da coluna por aplicação de 5 volumes da coluna de glicina 0,1 M, a pH 3,0 e recolheu-se a fracção. As fracções contendo o anticorpo bi-específico foram reunidas antes da permuta do tampão, numa coluna de dessalinização PD10 (Amersham) , equilibrada com STF. O fluxo e a fracção de eluição de cada etapa de purificação foram analisadas por EGPA-SDS e essa análise indicou que os anticorpos comportando cadeias leves lambda eram encontrados no fluxo da matriz de afinidade CaptureSelect Fab Kapa e, inversamente, os anticorpos comportando cadeias leves kapa encontraram-se no fluxo da matriz de afinidade CaptureSelect Fab Lambda (figura 8B). Tal como se esperava, na fracção final de eluição, as intensidades das bandas correspondentes às duas cadeias leves eram equivalentes. Assim, esta abordagem em três etapas permite a purificação de anticorpos bi-específicos, tanto de cadeia leve kapa como lambda. A recuperação final do anticorpo bi-específico comportando uma cadeia leve kapa e lambda foi de, aproximadamente, 10-21 % nas diferentes experiências. A fracção de eluição da proteína A também indicou que mais cadeia leve lambda e cadeia leve kapa estava reunida à IgG purificada, sugerindo que um aumento da expressão da cadeia leve kapa podia aumentar a junção e a recuperação do anticorpo bi-específico. EXEMPLO 9: Regulação da expressão da cadeia leve para optimizar a junção de anticorpos bi-especificos

Para aumentar a expressão da cadeia leve kapa, clonou-se o gene comum de VP, o gene de VLambda do anticorpo anti-INFY e duas cópias de Vkapa do anti-RC-IL-6, no vector pNovi κΗλκ, descrito no exemplo 6. A expressão da segunda cópia da cadeia leve Vkapa é originada por um SIER. Analisaram-se diferentes elementos de SIER para se conseguir diferentes niveis de expressão da cadeia leve Vkapa. Isto resultou na construção de cinco vectores independentes: pNovi κΗλκ 1 a 5. Estes vectores foram utilizados para transfecções temporárias em células de mamíferos, tal como descrito no exemplo 7 e purificou-se a IgG total a partir do sobrenadante utilizando a purificação por afinidade da proteína A. A análise por EGPA-SDS indica que os diferentes vectores pNovi κΗλκ aumentaram a expressão e a junção da cadeia leve kapa na IgG em comparação com a expressão utilizando o vector pNovi κΗλ (figura 9). As fracções de IgG total obtidas após a purificação de proteína A para cada uma destas estruturas foram depois purificadas em duas etapas consecutivas utilizando CaptureSelect Fab Kapa e CaptureSelect Fab Lambda, tal como descrito no exemplo 8. 0 rendimento em anticorpos bi-específicos foi de 20 % para pNovi κΗλ e variou entre 33 e 41 % para as estruturas de pNovi κΗλκ, indicando que uma expressão acrescida da cadeia leve kapa leva a um aumento da formação de anticorpos bi-específicos. Para confirmar melhor estas verificações, realizaram-se co-transfecções utilizando pNovi κΗλ e o vector de expressão que expressa a IgGx anti-RC-IL-6 mono-específica. Desta maneira, os níveis relativos da cadeia leve kapa, assim como, os rendimentos em anticorpo bi-específico foram aumentados, indicando que podem utilizar-se as várias abordagens para ajustar a expressão relativa da cadeia leve. EXEMPLO 10: Caracterização do anticorpo bi-especifico purificado

Os anticorpos bi-específicos purificados isolados, tal como descrito nos exemplos anteriores, foram caracterizados utilizando técnicas diferentes.

Focalização iso-eléctrica (FIE) em gel. Isolaram-se os anticorpos bi-especificos purificados, tal como descrito no exemplo 9 e analisaram-se utilizando placas de FIE de IsoGel-Agarose, com um pH variando de 3-10 (Lonza) e compararam-se com os anticorpos mono-especificos IgGÀ anti-INFY e IgGx anti-RC-IL-6. Após a focagem, colocou-se o gel numa solução de fixação, durante 30 min, lavou-se com água, durante 5 min e depois secou-se à TA. Corou-se o gel com corante de Coomassie, durante 15 min, lavou-se rapidamente com água e com uma solução de descoloração, durante 2 x 15 min. Finalmente secou-se o gel, à TA, antes da imagiologia. Os resultados ilustrados na figura 10A indicam que o anticorpo bi-especifico IgGxÀ tem um pi diferente e intermédio em comparação com o pi dos dois anticorpos mono-especificos, tal como previsto para o formato de anticorpo e os cálculos teóricos. A coloração também demonstrou que o anticorpo bi-específico é altamente puro após um processo de purificação entre as etapas descritas no exemplo 8.

Cromatografia de permuta iónica (CPI, em inglês IEX) . Analisou-se 50 pg de anticorpos mono-especificos e bi-específicos purificados por cromatografia liquida de alta resolução, de permuta iónica (CLAR-CPI) (CLAR Waters e2695/detector 2489) utilizando uma coluna Bio Mab, NP5, da Agilent (Agilent) : as fases móveis foram as seguintes: A: Na2HP04/NaH2P04 10 mM, a pH 6,5; B: Na2HP04/NaH2P04 10 mM, NaCl 100 mM, a pH 6,5; utilizando um fluxo de 0,8 mL/min e um gradiente de 20 % - 60 %, ao longo de 133 minutos. Os três anticorpos tinham tempos de retenção diferentes com um pico correspondente ao anticorpo bi-especifico, com um perfil intermédio comparado com os anticorpos mono-especificos (figura 10B). ELISA. Fez-se uma análise por ELISA do anticorpo mono-específico IgGX anti-INFY, IgGn anti-RC-IL-6 e o anticorpo bi-específico IgGnX, quanto à ligação a INFy e RC-IL-6. Os resultados, ilustrados na figura 11, indicam que a IgGKÀ bi-específica é capaz de se ligar a ambos os alvos e pode ser detectada com os anticorpos secundários tanto Ck anti-humano como CX anti-humano.

Ressonância plasmónica de superfície (RPS). Caracterizou-se a afinidade e a cinética de ligação dos anticorpos mono-específicos IgGÀ anti-INFY, IgGK anti-RC-IL-6 e do anticorpo bi-específico IgGnX num equipamento Biacore 2000 (Biacore AB, Uppsala, Suécia) . Imobilizou-se 200 UR de uma IgG policlonal anti-humana de cabra (IgGah; Biacore) por química de EDC/NHS, num chip CM5 da Biacore. Utilizou-se esta superfície para capturar IgG humana mono-específica ou bi-específica. Regenerou-se a superfície após cada ciclo por injecção de glicina 10 mM, a pH = 1,5, a 30 yL/min, durante 30 s, seguido de um período de estabilização de 1 min, em tampão de HBS-EP. Os dados foram ajustados de acordo com o modelo de Langmuir a 1:1 e determinaram-se os valores de Kon, K0ff e KD (quadro III) . Obtiveram-se valores de afinidade semelhantes para os anticorpos mono-específicos e os anticorpos bi-específicos IgGKX. Os dados indicam que os dois anticorpos combinam sítios de ligação a IFNyh e RC-IL-6 de uma forma semelhante no formato mono-específico e bi-especí fico . A capacidade da IgGnX bi-específica para interagir com ambos os alvos simultaneamente foi avaliada por RPS. Imobilizou-se INFy biotinilado num chip CM5 da Biacore, revestido com estreptavidina. Os anticorpos mono-especificos e bi-especificos foram injectados nesta superfície seguidos da injecção de RC-IL-6. 0 sensorgrama ilustrado na figura 11A mostra que o anticorpo bi-especifico IgGKÀ foi capaz de se ligar a INFy imobilizado e também foi capaz de capturar simultaneamente RC-IL-6. Também se utilizou a RPS para avaliar as quantidades relativas das cadeias leves kapa e lambda no anticorpo bi-especifico purificado. IgGKÀ foi directamente imobilizado por via do acoplamento da amina na superfície de um chip CM5 da Biacore e injectou-se um anticorpo Ckapa anti-humano seguido de um anticorpo Clambda anti-humano, na mesma concentração. Obtiveram-se respostas equivalentes com ambos os anticorpos de cadeia leve indicando que, tal como previsto para o formato, estão presentes quantidades equivalentes de cadeias leves kapa e lambda no anticorpo bi-especifico IgGKÀ (figura 12B).

Quadro III. Análise da cinética de ligação para os anticorpos mono-específicos e bi-especificos IgGKÀ para IFNy e RC-IL-6 medida num sistema Biacore 2000

EXEMPLO 11: Produção de anticorpos bi-especificos IçGkX

Também se realizou a expressão do anticorpo bi- específico IgGKÀ em células de ovário de hamster chinês (OHC), que são amplamente utilizadas para a produção de anticorpos monoclonais. No exemplo que aqui se apresenta, ambos os conjuntos semi-estáveis de células de OHC transfectadas, assim como as linhas de células de OHC estáveis foram geradas para a produção de anticorpos bi- específicos IgGxÀ. Nos estudos que aqui se apresentam, as linhas de células de OHC estáveis foram geradas e cresceram utilizando um processo de produção isento de componentes animais, definido quimicamente (CDACF). Todo o processo está descrito na figura 13.

Conjuntos de OHC. Fez-se a electroporação de células de OHC com o vector linearizado pNovi κΗλκ codificando o anticorpo bi-específico IgGKÀ anti-INFY/anti-RC-IL-6, descrito nos exemplos anteriores, assim como com plasmidos que originam a expressão do anticorpo mono-específico IgGÀ anti-INFY e IgGx anti-RC-IL-6. Após a electroporação, os conjuntos de células transfectadas cresceram em condições de crescimento durante 10 dias sem alimentação. As células transfectadas com as estruturas bi-específicas apresentavam perfis de crescimento semelhantes quando comparadas às células transfectadas com vectores de expressão mono-específicos. Além disso, as produtividades também foram comparáveis e atingiram um intervalo típico de produtividade de anticorpo: entre 100-200 mg/L para culturas com um hiper-crescimento não alimentadas (figura 14A). O aumento de escala entre a produção em pequena escala num frasco de Erlenmeyer (100 mL) e a produção numa escala média num saco de Wave de 25 L, foi conseguida com sucesso (figura 14B). Estes resultados indicam que podem obter-se curvas de crescimento semelhantes e produtividades semelhantes durante a expressão do anticorpo bi-específico IgGKÀ, em linhas de células de OHC e os correspondentes anticorpos mono-específicos.

Linhas de células estáveis de OHC. Geraram-se linhas de células recombinantes produzindo o anticorpo bi-específico por electroporação de células de OHC com o vector pNovi κΗλκ. Após a transfecção, seleccionaram-se linhas de células recombinantes por meio da diluição da cultura de células, na presença de uma concentração final de metionina-sulfoximina (MSX) 50 μΜ. Passadas 6 semanas de incubação, rastrearam-se as colónias de linhas de células recombinantes para analisar a produtividade total de IgG por meio FastELISA® (R&D Biotech) (figura 15A-B). As linhas de células seleccionadas foram expandidas em meio de cultura de células contendo MSX 25 μΜ, foram transferidas para placas microtituladoras de 24 poços e foram rastreadas quanto à produtividade e às caracteristicas de crescimento em cultura de suspensão (figura 15C-D). Os resultados revelaram que o anticorpo bi-específico IgGKÀ pode ser produzido num banho agitado, em condições de hiper-crescimento, a um nivel comparável ao das linhas de células que expressão anticorpos-padrão mono-específicos. As linhas de células da produção de topo foram seleccionadas e utilizadas em lotes de 50 mL de culturas de hiper-crescimento, em frascos de agitação, durante um máximo de 10 dias. Utilizou-se a CLAR de proteína A para a quantificação da IgG total no sobrenadante. A IgG total dos sobrenadantes de 10 linhas de células de produção de topo, foram purificadas por cromatografia de MabSelect SuRE, utilizando colunas pré-cheias HiTrap de 1 mL (GE Healthcare). Avaliaram-se as quantidades relativas de anticorpos mono-específicos e bi-específicos na IgG total purificada, por CLAR-SPI, tal como descrito no exemplo 10. Para a maioria das linhas de células, a fracção do anticorpo bi-específico IgGKÀ variou entre 37-42 % da IgG total e as duas linhas de células tinham expresso quantidades inferiores de IgGKÀ (22 e 25 %) . Os resultados das 10 linhas de células de OHC estão resumidos no quadro IV.

Purificação e caracterização do anticorpo bi-específico IgGKÀ expresso em OHC. 0 sobrenadante dos conjuntos de células de OHC transfectadas com estruturas bi-específicas e mono-específicas foi utilizado para a purificação. Purificou-se IgGÀ mono-específica anti-INFY e IgGn anti-RC-IL-6 utilizando a cromatografia por afinidade da proteína A e dessalinizou-se em STF, ao mesmo tempo que se purificavam os anticorpos bi-específicos IgGKÀ utilizando o processo de cromatografia por afinidade em três etapas descrito no exemplo 8. Analisaram-se as fracções da eluição e o fluxo das diferentes etapas, assim como, as amostras finais purificadas por EGPA-SDS e por FIE (figura 16). Monitorizou-se a especificidade de IgGKÀ após cada etapa de purificação por ELISA (figura 17). Os resultados demonstram que o processo de purificação era robusto e compatível com a expressão em OHC e que originava anticorpos bi-específicos IgGKÀ altamente puros.

EXEMPLO 12: Exemplos adicionais de anticorpos bi-especificos IgGxX

Isolaram-se outros exemplos de anticorpos bi-específicos IgGKÀ, expressos e purificado, tal como descrito nos exemplos anteriores. Inclui-se aqui um anticorpo bi-especifico IgGKÀ anti-NusA/antí-INFy e um anticorpo bi-especifico IgGKÀ anti-RC-IL-6/anti-RC-IL-6, em que ambos os sitios de combinação se ligam a RC-IL-6 mas comportam uma cadeia leve kapa e uma cadeia leve lambda. Estes anticorpos bi-especificos purificados foram analisados por FIE, em conjunto com as suas contrapartes respectivas mono-especificas (figura 18) . Os resultados mostram que o pi do anticorpo bi-especifico é sempre intermédio entre o pi dos anticorpos mono-especificos, mas as diferenças podem variar significativamente consoante a sequência do domínio variável de cadeia leve. Isto ilustra que a purificação do anticorpo bi-especifico com base nas diferenças de carga pode ser difícil se as duas cadeias leves tiverem propriedades bioquímicas semelhantes e sublinha a vantagem da abordagem da purificação por afinidade da presente invenção. EXEMPLO 13: Geração de anticorpos bi-especificos IgGxX utilizando dois dominios variáveis kapa ou dois dominios variáveis lambda

Também se podem gerar anticorpos bi-especificos utilizando dois domínios variáveis do mesmo tipo (lambda ou kapa). Como as etapas de purificação por afinidade requerem a presença de domínios constantes kapa e domínios constantes lambda de cadeias leves, qualquer domínio variável de cadeia leve pode, em princípio, ser fundido com estes domínios constantes para gerar cadeias leves híbridas, conforme ilustrado na figura 3. Isto foi demonstrado pela utilização de dois anticorpos dirigidos contra INFy e RC-IL-6 isolados de bibliotecas fixas de anticorpos VP, descritos no exemplo 1. Neste caso, ambos os anticorpos partilham a mesma VP e têm um domínio variável de cadeia leve lambda. 0 domínio Vlambda do anticorpo anti-INFY foi combinado com o domínio constante de lambda, enquanto o domínio Vlambda do anticorpo anti-RC-IL-6 foi combinado com o domínio constante kapa. Para este último, geraram-se três estruturas diferentes incluindo diferentes pontos de fusão entre os domínios Vlambda e o domínio Ckapa. Numa estrutura (híbrido 1), o ponto de fusão estava na extremidade da região da estrutural 4 (RE4) do domínio Vlambda e incluía todo o domínio constante kapa (figura 19A) . Noutra estrutura (híbrido 2), a região RE4 lambda estava substituída com uma região RE4 kapa (figura 19B). Na terceira estrutura (híbrido 3), os primeiros quatro aminoácidos do domínio constante kapa estavam substituídos por quatro aminoácidos do domínio constante lambda (figura 19C). Estas diferentes cadeias leves híbridas de lambda-kapa foram clonadas em conjunto com a cadeia comum pesada e a cadeia leve lambda num vector pNovi κΗλ vector. Realizou-se a transfecção de células de mamíferos, a expressão de proteínas e a purificação por afinidade em três etapas de IgGxX, tal como descrito nos exemplos anteriores. A análise das fracções de eluição indicou que a cadeia leve do híbrido 3 não se ligava à resina Kappaselect e, por isso, não permitia uma purificação eficiente do anticorpo bi-específico. 0 híbrido 1 e o híbrido 2 permitiram uma purificação eficiente do anticorpo bi-específico IgGxX. Estas IgGxX purificadas comportavam uma cadeia leve híbrida analisada num Bionalyzer 2100 da Agilent, utilizando um chip Protein 80 (Agilent Technologies) e os picos no electroferograma, que correspondiam às cadeias leves, mostraram ser equivalentes (figura 20) . Os resultados mostram que os anticorpos bi-específicos da presente invenção podem ser gerados utilizando dois anticorpos com uma cadeia pesada comum e duas cadeias leves com domínios variáveis do mesmo tipo (kapa ou lambda). EXEMPLO 14: Tanto VP como VL dos anticorpos descritos estão envolvidos na ligação do antigénio

Para analisar o contributo de VP comum para a ligação ao antigénio, combinaram-se cadeias leves diferentes de scFv comportando uma VP comum seleccionada nos exemplos 1 e 4, com duas VP diferentes que são diferentes quanto à origem comum de VP. Os scFv diferentes podiam ser expressos e purificados, tal como se descreveu no exemplo 3 e analisados quanto à sua ligação em função do alvo para o qual tinham sido seleccionados. Os exemplos ilustrados na figura 21 mostram que o scFv específico para INFy e um scFv específico contra RC-IL-6 podem ligar-se apenas com os respectivos alvos quando combinados com o domínio VP com o qual tinham sido originalmente seleccionados e não se observou nenhuma ligação quando combinados com dois outros domínios VP, que permitiam a sua expressão e purificação. Os resultados indicam que, apesar do facto da diversidade se restringir ao domínio VL, tanto VP comum como VL contribuem para a ligação ao antigénio.

EXEMPLO 15: Desenvolvimento de ELISA para a quantificação do anticorpo bi-específico IgGxX

Desenvolveu-se um ensaio ELISA em sanduíche para quantificar os anticorpos bi-específicos IgGKÀ. Revestiram-se placas Maxisorp (Nunc) de 96 poços com 10 pg/mL de anticorpos lambda anti-humano de murganho (Southern Biotech) e fez-se a sua incubação, a 4 2C, durante a noite. Após a lavagem (STF e Tween 20, a 0,05 %, 3 lavagens), bloqueou-se a placa com STF-ASB a 3 % (Sigma), durante 2 horas, à temperatura ambiente. O padrão de IgGKÀ purificado foi diluído em série em STF-ASB a 1 % entre 500 ng/mL e 1 ng/mL, para se obter um bom grau de linearidade para a quantificação da amostra. Consoante a sua origem, diluíram-se as amostras para iniciar o intervalo de quantificação, tal como se segue: sobrenadante impuro de OHC a 1/1 500; proteína A purificada a 1/15 000. Depois, diluíram-se as amostram em série a 1:2. Após a lavagem das placas, adicionou-se 50 uL de cada uma das diluições preparadas, em duplicado e incubou-se, durante 1 hora, à temperatura ambiente. Lavaram-se as placas novamente e incubaram-se, durante 1 hora, à temperatura ambiente, com 50 uL de anticorpo kapa anti-humano a 1:2 000 (Southern

Biotech). Após a última lavagem (PBST a 0,05 %, 5 lavagens), a reacção foi revelada com 50 uL de substrato de TMB (Sigma) e parada, após 15 min, por adição de 50 uL de H2SO4 (hidróxido de sódio 2 N) . Registou-se a densidade óptica a 450 nm utilizando um leitor de microplacas de precisão (Epoch, Witec). Como os anticorpos mono-específicos podem afectar o ensaio pela ligação ao anticorpo de captura revestido, realizaram-se experiências de recolha por adição de quantidades crescentes dos anticorpos IgGx mono-específica e IgGÀ mono-específica, ao padrão bi-específico de IgGKÀ. Ensaiaram-se diferentes proporções: (IgGKÀ bi-específico a 50 %, IgGx mono-específico a 25 %, IgGÀ mono-específico a 25 %) ; (IgGKÀ bi-específico a 67 %; IgGÀ mono-específico a 33 %) ; (IgGKÀ bi-específico a 50 %, IgGÀ mono-específico a 50 %) ; (IgGKÀ bi-específico a 25 %, IgGÀ mono-específico a 75 %) ; (IgGKÀ bi-específico a 50 %, IgGK mono-específico a 50 %) .

Os resultados, ilustrados na figura 22, indicam que o ensaio não foi afectado significativamente pelos anticorpos mono-específicos e, por isso, pode ser utilizado para a quantificação do anticorpo bi-específico IgGKÀ em amostras de complexos, tais como, as dos sobrenadantes de culturas de células. Utilizou-se ELISA para quantificar o anticorpo bi-específico IgGKÀ no sobrenadante de linhas de células estáveis de OHC e depois para quantificar a IgG total purificada a partir dos mesmos sobrenadantes, por cromatografia de afinidade da proteína A. A quantificação por ELISA resulta quando comparada com o teor total de IgG determinado por CLAR de proteína A ou por absorção a 280 nm e está resumida no quadro V. As concentrações obtidas por ELISA correspondem a 30-40 % da IgG total, uma porporção de anticorpo bi-específico que era esperada. Os dados mostram que este ensaio pode ser utilizado para determinar a quantidade do anticorpo bi-específico IgGKÀ num sobrenadante de cultura de células e facilita o rastreio de linhas de células estáveis quanto à sua produtividade em anticorpos bi-específicos IgGKÀ.

Outras modalidades

Embora a presente invenção tenha sido descrita com uma descrição detalhada, a descrição anterior pretende ser ilustrativa e não limitativa do âmbito da presente invenção, que é definida pelo âmbito das reivindicações em anexo. Outros aspectos, vantagens e modificações estão dentro do âmbito das reivindicações que se seguem.

Lisboa, 13 de Maio de 2013.

Claims (27)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo monoclonal isolado, comportando uma especificidade diferente em cada sitio de combinação e consistindo em duas cópias de um polipéptido de cadeia pesada única e uma primeira cadeia leve e uma segunda cadeia leve, caracterizado pelo facto de a primeira e a segunda cadeia leve serem diferentes.
2. 2. Anticorpo monoclonal isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de pelo menos uma porção da primeira cadeia leve ser do tipo kapa e pelo menos uma porção da segunda cadeia leve ser do tipo lambda.
3. 3. Anticorpo monoclonal isolado, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de a primeira cadeia leve compreender pelo menos uma região constante kapa.
4. 4. Anticorpo monoclonal isolado, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de a primeira cadeia leve compreender ainda uma região variável kapa ou uma região variável lambda.
5. 5. Anticorpo monoclonal isolado, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de a segunda cadeia leve compreender pelo menos uma região constante lambda.
6. 6. Anticorpo monoclonal isolado, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de a segunda cadeia leve compreender ainda uma região variável lambda ou uma região variável kapa.
7. 7. Anticorpo monoclonal isolado, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de a primeira cadeia leve compreender uma região constante kapa e uma região variável kapa e em que a segunda cadeia leve compreende uma região constante lambda e uma região variável lambda.
8. 8. Anticorpo monoclonal isolado, de acordo com uma qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado pelo facto de as sequências das regiões estruturais constantes e variáveis serem humanas.
9. 9. Processo para gerar um anticorpo bi-especifico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de compreender: a. o isolamento de um anticorpo ou de uma região de um fragmento de anticorpo com uma especificidade determinada por meio de um domínio variável de cadeia pesada combinado com um primeiro domínio variável de cadeia leve; b. o isolamento de um anticorpo ou de uma região de um fragmento de anticorpo com uma especificidade diferente determinada pelo mesmo domínio variável de cadeia pesada que o do anticorpo da etapa a), combinado com um segundo domínio variável de cadeia leve; c. a co-expressão, numa célula, de: i. o domínio variável comum de cadeia pesada fundido com uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina; ii. o primeiro domínio variável de cadeia leve fundido quer com um domínio constante de cadeia leve do tipo kapa ou fundido com um domínio constante de cadeia leve do tipo lambda; e iii. o segundo domínio variável de cadeia leve fundido com o domínio constante de cadeia leve de um tipo diferente do domínio constante da primeira cadeia leve.
10. 10. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de: a. um domínio variável de cadeia leve kapa estar fundido com uma região constante do tipo kapa ou b. um domínio variável de cadeia leve kapa estar fundido com uma região constante do tipo lambda ou c. um domínio variável de cadeia leve lambda estar fundido com uma região constante do tipo kapa ou d. um domínio variável de cadeia leve lambda estar fundido com uma região constante do tipo lambda.
11. 11. Processo, de acordo com uma qualquer das reivindicações 9 a 10, caracterizado pelo facto de compreender ainda a etapa (d) de purificação dos anticorpos bi-específicos produzidos na etapa c) , a partir dos anticorpos mono-específicos produzidos na etapa c), em que a etapa d) é, eventualmente, uma etapa de purificação por cromatografia de afinidade.
12. 12. Processo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de a etapa de purificação ser uma etapa de purificação por cromatografia de afinidade realizada utilizando um domínio constante específico kapa, um domínio constante específico lambda ou ambos os domínios constante específico kapa e constante específico lambda, por meio de cromatografia de afinidade.
13. 13. Processo, de acordo com uma qualquer das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo facto de as etapas a) e b) serem facilitadas pela utilização de bibliotecas de anticorpos com uma cadeia pesada comum e a diversidade confinada ao domínio variável de cadeia leve, em que a biblioteca de anticorpos é, eventualmente, exibida em bacteriófagos filamentosos, na superfície de levedura, em células de bactérias ou de mamíferos ou utilizada para exibição de ribossomas ou de outros tipos de exibição, in vitro.
14. 14. Processo de preparação de um anticorpo bi-específico, que se liga especificamente a um primeiro antigénio e a um segundo antigénio, caracterizado pelo facto de o primeiro e o segundo antigénio serem diferentes e o processo compreender: a. providenciar uma primeira molécula de ácido nucleico que codifica um primeiro polipéptido, que compreende uma região variável de cadeia pesada de um polipéptido de imunoglobulina ou um seu fragmento, que se liga ao primeiro antigénio acoplado a uma primeira região constante de imunoglobulina; b. providenciar uma segunda molécula de ácido nucleico que codifica um segundo polipéptido, que compreende uma região variável de cadeia leve do polipéptido de imunoglobulina ou de um seu fragmento, que liga ao primeiro antigénio acoplado a uma primeira região constante de cadeia leve do tipo kapa ou do tipo lambda; c. providenciar uma terceira molécula de ácido nucleico que codifica um terceiro polipéptido, que compreende uma região variável de cadeia leve do polipéptido de imunoglobulina ou de um seu fragmento, que partilha a mesma região variável de cadeia pesada do polipéptido de imunoglobulina ou de um seu fragmento da etapa (a) e que se liga ao segundo antigénio, acoplado a uma segunda região constante de cadeia leve do tipo kapa ou do tipo lambda, em que o primeiro e o segundo domínios constantes de cadeia leve são de tipos diferentes; e d. fazer a cultura de células hospedeiras, que compreendem a primeira, a segunda e a terceira moléculas de ácido nucleico, em condições que permitem a expressão do primeiro, do segundo e do terceiro polipéptidos.
15. 15. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo facto de compreender ainda a etapa (e) de recuperação do anticorpo bi-específico.
16. 16. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo facto de o segundo ácido nucleico codificar um domínio variável de cadeia leve do tipo kapa.
17. 17. Processo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo facto de o segundo ácido nucleico codificar uma região constante do tipo kapa ou uma região constante do tipo lambda ou um domínio variável de cadeia leve do tipo lambda.
18. 18. Processo, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo facto de o segundo ácido nucleico codificar um domínio variável de cadeia leve do tipo lambda, em que o segundo ácido nucleico codifica uma região constante do tipo kapa ou uma região constante do tipo lambda.
19. 19. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo facto de o terceiro ácido nucleico codificar um domínio variável de cadeia leve do tipo kapa.
20. 20. Processo, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo facto de o terceiro ácido nucleico codificar uma região constante do tipo kapa ou uma região constante do tipo lambda.
21. 21. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo facto de o terceiro ácido nucleico codificar um domínio variável de cadeia leve do tipo lambda.
22. 22. Processo, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo facto de o terceiro ácido nucleico codificar uma região constante do tipo kapa ou uma região constante do tipo lambda.
23. 23. Processo, de acordo com uma qualquer das reivindicações 14 a 22, caracterizado pelo facto de o anticorpo bi-específico ser recuperado na etapa (e) utilizando uma etapa de purificação por cromatografia de afinidade, em que a etapa de purificação se realiza, eventualmente, por meio de cromatografia de afinidade, utilizando um domínio específico constante kapa, um domínio específico constante lambda ou ambos os domínios específicos constantes kapa e lambda.
24. 24. Mistura de anticorpos, caracterizada pelo facto de compreender dois anticorpos mono-específicos e um anticorpo bi-específico, tendo todos uma cadeia pesada comum.
25. 25. Processo para gerar uma mistura de anticorpos, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo facto de compreender: a. o isolamento de uma região de um anticorpo ou de um fragmento de um anticorpo com uma especificidade determinada por um domínio variável de cadeia pesada combinado com um primeiro domínio variável de cadeia leve; b. o isolamento de uma região de anticorpo ou de um fragmento de anticorpo com uma determinada especificidade diferente, por meio do mesmo domínio variável de cadeia pesada que o do anticorpo da etapa a) , combinado com um segundo domínio variável de cadeia leve; c. a co-expressão numa célula de: i. o domínio variável comum de cadeia pesada fundido com uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina; ii. o primeiro domínio variável de cadeia leve fundido quer com um domínio constante de cadeia leve do tipo kapa ou fundido com um domínio constante de cadeia leve do tipo lambda; e iii. o segundo domínio variável de cadeia leve fundido quer com o domínio constante de cadeia leve do tipo kapa ou fundido com um domínio constante de cadeia leve do tipo lambda; e, eventualmente, d. a purificação da mistura de anticorpos produzida na etapa c) a partir do sobrenadante de uma cultura de células.
26. 26. Mistura de anticorpos, caracterizada pelo facto de compreender três ou mais anticorpos mono-específicos e três ou mais anticorpos bi-específicos, todos com uma cadeia pesada comum.
27. 27. Processo para gerar uma mistura de anticorpos, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo facto de compreender: a. o isolamento de um anticorpo ou de uma região de um fragmento de anticorpo com uma especificidade determinada por meio de um domínio variável de cadeia pesada combinado com um primeiro domínio variável de cadeia leve; b. o isolamento de vários anticorpos ou de regiões de fragmentos de anticorpos com uma especificidade diferente, determinada pelo mesmo domínio variável de cadeia pesada que o do anticorpo da etapa a), combinado com diferentes domínios variáveis de cadeia leve; c. a co-expressão numa célula de: i. o domínio variável comum de cadeia pesada fundido com uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina; ii. todas as cadeias leves de anticorpos isolados nas etapas a) e b) , fundidas quer com um domínio constante de cadeia leve do tipo kapa ou fundido com um domínio constante de cadeia leve do tipo lambda; e, eventualmente, d. a purificação da mistura de anticorpos produzida na etapa c) , a partir do sobrenadante de uma cultura de células. Lisboa, 13 de Maio de 2015.