KR20230065256A

KR20230065256A - 코로나바이러스 s 단백질용 결합제

Info

Publication number: KR20230065256A
Application number: KR1020237007648A
Authority: KR
Inventors: 카르스텐 베크만; 안나 카를; 산드라 프라슬; 클라우디아 파울만; 크리스티아네 슈타틀러; 게오르그 팔크; 레일라 피셔; 알렉산더 무이크; 우구르 사힌; 카롤리네 샤르프
Original assignee: 비온테크 에스이
Priority date: 2020-08-06
Filing date: 2021-07-29
Publication date: 2023-05-11
Also published as: CN116194477A; CA3187061A1; US20230287088A1; JP2023536340A; AU2021322046A1; WO2022029011A1; EP4192859A1

Abstract

본 개시내용은 제1 및 제2 결합 도메인을 포함하는 결합제에 관한 것으로, 여기서 제1 결합 도메인은 코로나바이러스 스파이크 단백질(S 단백질)에 결합할 수 있고 제2 결합 도메인은 코로나바이러스 S 단백질에 결합할 수 있으며, 여기서 제1 및 제2 결합 도메인은 코로나바이러스 S 단백질의 상이한 에피토프에 결합한다. 또한, 본 개시내용은 코로나바이러스 스파이크 단백질(S 단백질)에 결합할 수 있는 항체에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 본원에 개시된 결합제, 특히 항체를 인코딩하는 RNA와 같은 핵산 및 상기 핵산으로 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 개시내용은 상기 결합제, 항체 또는 핵산의 의학적 용도에 관한 것이다. 본원에 기재된 제제 및 의학적 용도는 특히 대상체에서 코로나바이러스 감염을 예방 또는 치료하는데 유용하다.

Description

코로나바이러스 S 단백질용 결합제

본 개시내용은 제1 및 제2 결합 도메인을 포함하는 결합제에 관한 것으로, 여기서 제1 결합 도메인은 코로나바이러스 스파이크 단백질(S 단백질)에 결합할 수 있고 제2 결합 도메인은 코로나바이러스 S 단백질에 결합할 수 있으며, 여기서 제1 및 제2 결합 도메인은 코로나바이러스 S 단백질의 상이한 에피토프에 결합한다. 또한, 본 개시내용은 코로나바이러스 스파이크 단백질(S 단백질)에 결합할 수 있는 항체에 관한 것이다. 일 구체예에서, 결합제, 특히 본원에 기술된 항체는 S 단백질의 S1 서브유닛, 특히 S 단백질의 S1 서브유닛의 수용체 결합 도메인(RBD)에 결합한다. 본 개시내용은 또한 본원에 개시된 결합제, 특히 항체를 인코딩하는 RNA와 같은 핵산 및 상기 핵산으로 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 개시내용은 상기 결합제, 항체 또는 핵산의 의학적 용도에 관한 것이다. 본원에 기재된 제제 및 의학적 용도는 특히 대상체에서 코로나바이러스 감염의 예방 또는 치료에 유용하다. 구체적으로, 일 구체예에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 결합제, 특히 항체를 코딩하는 RNA를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 본 명세서에 개시된 결합제 또는 항체를 인코딩하는 RNA의 대상체에 대한 투여는 (적절한 표적 세포에 의한 RNA의 발현 후) 본 명세서에 개시된 결합제를 제공하여 코로나바이러스를 차단 또는 중화할 수 있다.

2019년 12월 중국 우한에서 원인 불명의 폐렴이 발생하여 신종 코로나바이러스(중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2; SARS-CoV-2)가 기저 원인임이 밝혀졌다. SARS-CoV-2의 유전자 서열이 WHO와 대중에게 공개되었고(MN908947.3) 이 바이러스는 β코로나바이러스 아과로 분류되었다. 염기서열 분석을 통해 계통수는 인간을 감염시키는 또 다른 코로나바이러스, 즉 중동호흡기증후군(MERS) 바이러스보다 중증급성호흡기증후군(SARS) 바이러스 분리주와 더 밀접한 관계가 있는 것으로 밝혀졌다. 2월 2일, 독일을 포함한 24개국에서 전 세계적으로 총 14,557건의 사례가 확인되었고 이후 자급자족식의 인간 대 인간 바이러스 확산으로 SARS-CoV-2가 전 세계적인 유행병이 되었다.

코로나바이러스는 총 4개의 구조 단백질인 스파이크 단백질(S), 외피 단백질(E), 막 단백질(M) 및 뉴클레오캡시드 단백질(N)을 인코딩하는, 양성 센스 단일 가닥 RNA((+)ssRNA) 외피 바이러스이다. 스파이크 단백질(S 단백질)은 수용체-인식, 세포에 대한 부착, 엔도솜 경로를 통한 감염, 바이러스와 엔도솜 막의 융합에 의해 구동되는 게놈 방출을 담당한다. 서로 다른 가족 구성원 사이의 서열은 다양하지만, S 단백질 내에 보존된 영역과 모티프가 있어 S 단백질을 S1과 S2의 두 하위 도메인으로 나눌 수 있다. 막관통 도메인이 있는 S2는 막 융합을 담당하는 반면, S1 도메인은 바이러스-특이 수용체를 인식하고 표적 숙주 세포에 결합한다. 여러 코로나바이러스 분리주에서 수용체 결합 도메인(RBD)이 확인되었다.

SARS-CoV-2에 대한 치료제는 현재 구할 수 없으나 시급히 필요한 실정이다.

발명의 개요

본 발명은 코로나바이러스 스파이크 단백질(S 단백질)에 대한 결합에 대해 적어도 이중특이적인 결합제를 제공하며, 즉 이들은 코로나바이러스 S 단백질의 적어도 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 추가로, 본 발명은 코로나바이러스 S 단백질에 결합하는 단일특이적, 2가 항체와 같은 항체를 제공한다. 본원에 기술된 항체를 비롯한 결합제는 코로나바이러스 S 단백질과 표적 수용체인 ACE2의 상호작용을 차단할 수 있다. 결합제 및 이들 결합제를 인코딩하는 핵산은 대상체에서 코로나바이러스 감염의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다. 특히, 본원에 개시된 결합제를 인코딩하는 RNA는 (적절한 표적 세포에 의한 RNA의 발현 후) 코로나바이러스 S 단백질, 특히 SARS-CoV-2 S 단백질을 표적화하기 위한 결합제를 제공하기 위해 투여될 수 있다.

따라서, 본원에 기술된 의약 조성물은 수용자의 세포에 들어갈 때 각각의 단백질로 번역될 수 있는 활성 성분 단일 가닥 RNA를 포함할 수 있다. 결합제의 서열을 코딩하는 야생형 또는 코돈-최적화된 서열에 더하여, RNA는 안정성 및 번역 효율과 관련하여 RNA의 최대 효능을 위해 최적화된 하나 이상의 구조적 요소를 함유할 수 있다(5' 캡, 5' UTR, 3' UTR, 폴리(A)-꼬리). 일 구체예에서, RNA는 이들 요소 모두를 함유한다.

본원에 기재된 RNA는 단백질 및/또는 지질, 좋기로는 지질과 복합화되어 투여용 RNA-입자를 생성할 수 있다. 상이한 RNA의 조합이 사용되는 경우, RNA는 투여를 위한 RNA-입자를 생성하기 위해 단백질 및/또는 지질과 함께 복합화되거나 개별적으로 복합화될 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 코로나바이러스 스파이크 단백질(S 단백질)에 결합하는 적어도 하나의 제1 결합 도메인 및 코로나바이러스 S 단백질에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 결합제를 제공하며, 여기서 제1 및 제2 결합 도메인은 코로나바이러스 S 단백질의 상이한 에피토프에 결합한다.

일 구체예에서, 결합제는 이중특이적 결합제 처럼 다중특이적이다.

일 구체예에서, 제1 결합 도메인은 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다.

일 구체예에서, VH는 SEQ ID NO: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 92, 100, 108, 116, 및 124로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 HCDR3을 포함한다. 일 구체예에서, VH는 SEQ ID NO: 3, 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 91, 99, 107, 115, 및 123로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 HCDR2를 포함한다. 일 구체예에서, VH는 SEQ ID NO: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 98, 106, 114 및 122로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 HCDR1을 포함한다.

일 구체예에서, VH는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:

(i) SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;

(ii) SEQ ID NO: 10의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 11의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 12의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;

(iii) SEQ ID NO: 18의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 19의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 20의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;

(iv) SEQ ID NO: 26의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 27의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 28의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;

(v) SEQ ID NO: 34의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 35의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;

(vi) SEQ ID NO: 42의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 43의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 44의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;

(vii) SEQ ID NO: 50의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 51의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 52의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;

(viii) SEQ ID NO: 58의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 59의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 60의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;

(ix) SEQ ID NO: 66의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 67의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 68의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;

(x) SEQ ID NO: 74의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 75의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 76의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;

(xi) SEQ ID NO: 82의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 83의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 84의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;

(xii) SEQ ID NO: 90의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 91의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 92의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;

(xiii) SEQ ID NO: 98의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 99의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 100의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;

(xiv) SEQ ID NO: 106의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 107의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 108의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;

(xv) SEQ ID NO: 114의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 115의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 116의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH; 및

(xvi) SEQ ID NO: 122의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 123의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 124의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH.

일 구체예에서, 제1 결합 도메인은 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 일 구체예에서, VL은 SEQ ID NO: 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88, 96, 104, 112, 120, 및 128로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 LCDR3을 포함한다. 일 구체예에서, VL은 SEQ ID NO: 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 87, 95, 103, 111, 119 및 127로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 LCDR2를 포함한다. 일 구체예에서, VL은 SEQ ID NO: 6, 14, 22, 30, 38, 46, 54, 62, 70, 78, 86, 94, 102, 110, 118 및 126으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 LCDR1을 포함한다. 일 구체예에서, VL은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:

(i) SEQ ID NO: 6의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 7의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 8의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;

(ii) SEQ ID NO: 14의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 15의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 16의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;

(iii) SEQ ID NO: 22의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 23의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 24의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;

(iv) SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 31의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 32의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;

(v) SEQ ID NO: 38의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 39의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 40의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;

(vi) SEQ ID NO: 46의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 47의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 48의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;

(vii) SEQ ID NO: 54의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 55의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 56의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;

(viii) SEQ ID NO: 62의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 63의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 64의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;

(ix) SEQ ID NO: 70의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 71의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 72의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;

(x) SEQ ID NO: 78의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 79의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 80의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;

(xi) SEQ ID NO: 86의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 87의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 88의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;

(xii) SEQ ID NO: 94의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 95의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 96의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;

(xiii) SEQ ID NO: 102의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 103의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 104의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;

(xiv) SEQ ID NO: 110의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 111의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 112의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;

(xv) SEQ ID NO: 118의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 119의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 120의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL; 및

(xvi) SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 127의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 128의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL.

일 구체예에서, 제1 결합 도메인은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 및 VL을 포함한다:

(i) SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 6의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 7의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 8의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;

(ii) SEQ ID NO: 10의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 11의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 12의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 14의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 15의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 16의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;

(iii) SEQ ID NO: 18의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 19의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 20의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 VH SEQ ID NO: 22의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 23의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 24의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;

(iv) SEQ ID NO: 26의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 27의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 28의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 31의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 32의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;

(v) SEQ ID NO: 34의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 35의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 38의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 39의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 40의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;

(vi) SEQ ID NO: 42의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 43의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 44의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 46의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 47의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 48의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;

(vii) SEQ ID NO: 50의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 51의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 52의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 54의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 55의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 56의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;

(viii) SEQ ID NO: 58의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 59의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 60의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 62의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 63의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 64의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;

(ix) SEQ ID NO: 66의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 67의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 68의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 70의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 71의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 72의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;

(x) SEQ ID NO: 74의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 75의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 76의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 78의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 79의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 80의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;

(xi) SEQ ID NO: 82의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 83의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 84의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 86의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 87의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 88의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;

(xii) SEQ ID NO: 90의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 91의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 92의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 94의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 95의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 96의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;

(xiii) SEQ ID NO: 98의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 99의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 100의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 102의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 103의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 104의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;

(xiv) SEQ ID NO: 106의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 107의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 108의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 110의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 111의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 112의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;

(xv) SEQ ID NO: 114의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 115의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 116의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 118의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 119의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 120의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;

(xvi) SEQ ID NO: 122의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 123의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 124의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 127의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 128의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL.

일 구체예에서, 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 97, 105, 113 및 121로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH를 포함한다.

일 구체예에서, 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 5, 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85, 93, 101, 109, 117 및 125로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함한다.

(i) SEQ ID NO: 1의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 5의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;

(ii) SEQ ID NO: 9의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 13의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;

(iii) SEQ ID NO: 17의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 21의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;

(iv) SEQ ID NO: 25의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 29의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;

(v) SEQ ID NO: 33의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 37의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;

(vi) SEQ ID NO: 41의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 45의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;

(vii) SEQ ID NO: 49의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 53의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;

(viii) SEQ ID NO: 57의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 61의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;

(ix) SEQ ID NO: 65의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 69의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;

(x) SEQ ID NO: 73의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 77의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;

(xi) SEQ ID NO: 81의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 85의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;

(xii) SEQ ID NO: 89의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 93의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;

(xiii) SEQ ID NO: 97의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 101의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;

(xiv) SEQ ID NO: 105의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 109의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;

(xv) SEQ ID NO: 113의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 117의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL; 및

(xvi) SEQ ID NO: 121의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 125의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL.

일 구체예에서, 제1 결합 도메인은 전술한 VH 또는 VL 또는 이들의 조합을 포함하는 항체의 코로나바이러스 S 단백질에 대해 특이성을 갖거나 및/또는 코로나바이러스 S 단백질 결합에 대해 경쟁하는 항체의 VH 및 VL 을 포함한다.

일 구체예에서, 제2 결합 도메인은 ACE2 단백질의 세포외 도메인(ECD) 또는 그의 변이체, 또는 ACE2 단백질의 ECD 또는 그의 변이체의 단편을 포함한다. 일 구체예에서, ACE2 단백질의 ECD의 변이체 또는 ACE2 단백질의 ECD의 단편 또는 그의 변이체는 코로나바이러스 S 단백질에 결합한다. 일 구체예에서, 제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 129의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는다.

일 구체예에서, 제2 결합 도메인은 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다. 일 구체예에서, 제2 결합 도메인의 VH는 SEQ ID NO: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 92, 100, 108, 116 및 124로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 HCDR3을 포함한다. 일 구체예에서, 제2 결합 도메인의 VH는 SEQ ID NO: 3, 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 91, 99, 107, 115 및 123로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 HCDR2를 포함한다. 일 구체예에서, 제2 결합 도메인의 VH는 SEQ ID NO: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 98, 106, 114 및 122로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 HCDR1을 포함한다.

일 구체예에서, 제2 결합 도메인의 VH는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:

일 구체예에서, 제2 결합 도메인은 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 일 구체예에서, 제2 결합 도메인의 VL은 서열 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88, 96, 104, 112, 120 및 128로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 LCDR3을 포함한다. 일 구체예에서, 제2 결합 도메인의 VL은 SEQ ID NO: 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 87, 95, 103, 111, 119 및 127로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 LCDR2를 포함한다. 일 구체예에서, 제2 결합 도메인의 VL은 SEQ ID NO: 6, 14, 22, 30, 38, 46, 54, 62, 70, 78, 86, 94, 102, 110, 118 및 126으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 LCDR1을 포함한다. 일 구체예에서, 제2 결합 도메인의 VL은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:

일 구체예에서, 제2 결합 도메인은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 및 VL을 포함한다:

일 구체예에서, 제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 97, 105, 113, 및 121로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH를 포함한다.

일 구체예에서, 제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 5, 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85, 93, 101, 109117, 및 125로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함한다.

일 구체예에서, 제2 결합 도메인은 전술한 VH 또는 VL 또는 이들의 조합을 포함하는 항체의 코로나바이러스 S 단백질에 대해 특이성을 갖거나 및/또는 코로나바이러스 S 단백질 결합에 대해 경쟁하는 항체의 VH 및 VL 을 포함한다.

본원에 기술된 결합제의 일 구체예에서:

(i) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 122의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 123의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 124의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 127의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 128의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,

제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 34의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 35의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 38의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 39의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 40의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하며; 또는

(ii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 122의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 123의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 124의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 127의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 128의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,

제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 6의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 7의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 8의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하며; 또는

(iii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 122의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 123의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 124의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 127의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 128의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,

제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 10의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 11의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 12의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 14의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 15의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 16의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하며; 또는

(iv) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 122의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 123의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 124의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 127의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 128의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,

제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 26의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 27의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 31의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 32의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하며; 또는

(v) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 122의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 123의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 124의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 127의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 128의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,

제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 42의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 43의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 44의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 46의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 47의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 48의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하며; 또는

(vi) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 34의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 35의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 38의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 39의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 40의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,

제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 122의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 123의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 124의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 127의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 128의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하며; 또는

(vii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 26의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 27의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 28의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 31의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 32의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,

(viii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 42의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 43의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 44의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 46의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 47의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 48의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,

(ix) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 6의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 7의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 8의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,

(x) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 10의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 11의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 12의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 14의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 15의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 16의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,

(xi) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 122의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 123의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 124의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 127의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 128의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,

제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 18의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 19의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 20의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 22의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 23의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 24의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하며; 또는

(xii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 122의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 123의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 124의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 127의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 128의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,

제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 50의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 51의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 52의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 54의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 55의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 56의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하며; 또는

(xiii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 122의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 123의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 124의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 127의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 128의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,

제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 106의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 107의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 108의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 110의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 111의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 112의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하며; 또는

(xiv) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 18의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 19의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 20의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 22의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 23의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 24의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,

(xv) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 50의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 51의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 52의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 54의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 55의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 56의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,

(xvi) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 106의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 107의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 108의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 110의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 111의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 112의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,

(xvii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 106의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 107의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 108의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 110의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 111의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 112의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,

(xviii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 106의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 107의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 108의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 110의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 111의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 112의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,

(xix) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 106의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 107의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 108의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 110의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 111의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 112의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,

(xx) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 18의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 19의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 20의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 22의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 23의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 24의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,

(xxi) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 50의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 51의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 52의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 54의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 55의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 56의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,

(xxii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 42의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 43의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 44의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 46의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 47의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 48의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,

(xxiii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 122의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 123의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 124의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 127의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 128의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,

제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 129의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 또는

(xxiv) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 18의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 19의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 20의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 22의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 23의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 24의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,

제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 82의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 83의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 84의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 86의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 87의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 88의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하며; 또는

(xxv) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 82의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 83의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 84의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 86의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 87의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 88의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,

(xxvi) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 82의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 83의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 84의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 86의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 87의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 88의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,

(xxvii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 50의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 51의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 52의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 54의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 55의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 56의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,

제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 82의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 83의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 84의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 86의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 87의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 88의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함한다.

본원에 기술된 결합제의 일 구체예에서:

(i) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 121의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 125의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,

제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 33의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 37의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하며; 또는

(ii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 121의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 125의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,

제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 1의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 5의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하며; 또는

(iii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 121의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 125의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,

제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 9의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 13의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하며; 또는

(iv) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 121의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 125의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,

제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 25의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 29의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하며; 또는

(v) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 121의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 125의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,

제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 41의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 45의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하며; 또는

(vi) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 33의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 37의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,

제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 121의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 125의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하며; 또는

(vii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 25의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 29의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,

(viii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 41의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 45의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,

(ix) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 1의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 5의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,

(x) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 9의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 13의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,

(xi) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 121의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 125의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,

제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 17의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 21의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하며; 또는

(xii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 121의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 125의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,

제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 49의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 53의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하며; 또는

(xiii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 121의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 125의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,

제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 105의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 109의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하며; 또는

(xiv) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 17의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 21의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,

(xv) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 49의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 53의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,

(xvi) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 105의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 109의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,

(xvii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 105의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 109의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,

(xviii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 105의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 109의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,

(xix) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 105의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 109의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,

(xx) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 17의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 21의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,

(xxi) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 49의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 53의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,

(xxii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 41의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 45의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,

(xxiii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 121의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 125의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,

제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 129의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 또는

(xxiv) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 17의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 21의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,

제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 81의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 85의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하며; 또는

(xxv) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 81의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 85의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,

(xxvi) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 81의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 85의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,

(xxvii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 49의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 53의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,

제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 81의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 85의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함한다.

일 구체예에서, 본원에 기재된 결합제는 제1 결합 도메인을 형성하는 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 일 구체예에서, 본원에 기재된 결합제는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하고, 여기서 각각의 중쇄는 경쇄 중 하나와 함께 제1 결합 도메인을 형성한다. 일 구체예에서, 중쇄는 VH를 포함한다. 일 구체예에서, 경쇄는 VL을 포함한다. 일 구체예에서, 중쇄는 단편 결정화가능(Fc) 영역을 포함한다. 일 구체예에서, 중쇄는 경쇄와 회합된다. 일 구체예에서, 중쇄는 공유 및/또는 비공유 결합된다. 일 구체예에서, 2개의 중쇄는 동일하고 2개의 경쇄는 동일하다.

일 구체예에서, 결합제는 전장 항체 또는 제1 결합 도메인을 포함하는 전장 항체 유사 분자를 포함한다.

일 구체예에서, 결합제는 2개의 제1 결합 도메인을 포함한다. 일 구체예에서, 2개의 제1 결합 도메인은 동일한 에피토프에 결합한다.

일 구체예에서, 제2 결합 도메인은 단일 사슬 가변 단편(scFv)을 포함한다.

일 구체예에서, 제1 및 제2 결합 도메인은 직접적으로 또는 링커를 통해 공유적으로 연결된다. 일 구체예에서, 링커는 글리신-세린(GS) 링커를 포함한다. 일 구체예에서, 글리신-세린 링커는 (G₄S)₁링커를 포함한다. 일 구체예에서, 글리신-세린 링커는 (G₄S)₂ 링커를 포함한다. 일 구체예에서, 글리신-세린 링커는 (G₄S)₃링커를 포함한다. 일 구체예에서, 글리신-세린 링커는 (G₄S)₄링커를 포함한다. 일 구체예에서, 글리신-세린 링커는 (G₄S)₅링커를 포함한다.

일 구체예에서, 결합제는 2개의 제1 결합 도메인을 포함하는 전장 항체 또는 전장 항체 유사 분자를 형성하는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하고, 여기서 각각의 경쇄는 제2 결합 도메인에 연결된다. 일 구체예에서, 각각의 경쇄의 C-말단은 제2 결합 도메인의 N-말단에 연결된다. 일 구체예에서, 각각의 경쇄의 N-말단은 제2 결합 도메인의 C-말단에 연결된다.

일 구체예에서, 결합제는 다음을 포함한다:

(i) 중쇄(HC)를 포함하는 제1 폴리펩타이드 및

(ii) 경쇄(LC)를 포함하고 ACE2 단백질의 세포외 도메인(ECD) 또는 이의 변이체 또는 ACE2 단백질의 세포외 도메인(ECD) 또는 이의 변이체의 단편을 추가로 포함하는 제2 폴리펩타이드.

일 구체예에서, 결합제는 다음을 포함한다:

(i) 중쇄(HC)를 포함하는 제1 폴리펩타이드 및

(ii) 경쇄(LC)를 포함하고 scFv 를 추가로 포함하는 제2 폴리펩타이드.

일 구체예에서, 결합제는 제1 결합 아암 및 제2 결합 아암을 포함하는 항체를 포함하고, 여기서

a. 제1 결합 아암은:

(i) 중쇄(HC)를 포함하는 제1 폴리펩타이드 및

(ii) 경쇄(LC)를 포함하고 ACE2 단백질의 세포외 도메인(ECD) 또는 이의 변이체 또는 ACE2 단백질의 세포외 도메인(ECD) 또는 이의 변이체의 단편을 추가로 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하고 및;

b. 제2 결합 아암은:

(i) 중쇄(HC)를 포함하는 제1 폴리펩타이드 및

(ii) 경쇄(LC)를 포함하고 ACE2 단백질의 세포외 도메인(ECD) 또는 이의 변이체 또는 ACE2 단백질의 세포외 도메인(ECD) 또는 이의 변이체의 단편을 추가로 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함한다.

a. 제1 결합 아암은:

(i) 중쇄(HC)를 포함하는 제1 폴리펩타이드 및

(ii) 경쇄(LC)를 포함하고 추가로 scFv를 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하고, 및;

b. 제2 바인딩 아암은:

(i) 중쇄(HC)를 포함하는 제1 폴리펩타이드 및

(ii) 경쇄(LC)를 포함하고 추가로 scFv를 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함한다.

일 구체예에서, 제1 결합 아암의 제1 폴리펩타이드 및 제2 결합 아암의 제1 폴리펩타이드는 동일하다. 일 구체예에서, 제1 결합 아암의 제2 폴리펩타이드 및 제2 결합 아암의 제2 폴리펩타이드는 동일하다.

결합제의 바람직한 특정 구체예에서:

(i) 제1 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 133의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고,

제2 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 134의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며; 또는

(ii) 제1 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 135의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고,

제2 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 136의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며; 또는

(iii) 제1 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 137의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고,

제2 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 138의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며; 또는

(iv) 제1 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 139의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고,

제2 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 140의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며; 또는

(v) 제1 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 143의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고,

제2 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 144의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며; 또는

(vi) 제1 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 145의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고,

제2 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 146의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며; 또는

(vii) 제1 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 147의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고,

제2 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 148의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며; 또는

(viii) 제1 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 149의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고,

제2 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 150의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며; 또는

(ix) 제1 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 153의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고,

제2 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 154의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며; 또는

(x) 제1 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 155의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고,

제2 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 156의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며; 또는

(xi) 제1 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 157의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고,

제2 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 158의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며; 또는

(xii) 제1 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 159의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고,

제2 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 160의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며; 또는

(xiii) 제1 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 161의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고,

제2 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 162의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며; 또는

(xiv) 제1 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 163의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고,

제2 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 164의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며; 또는

(xv) 제1 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 165의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고,

제2 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 166의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며; 또는

(xvi) 제1 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 167의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고,

제2 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 168의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며; 또는

(xvii) 제1 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 169의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고,

제2 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 170의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며; 또는

(xviii) 제1 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 171의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고,

제2 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 172의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며; 또는

(xix) 제1 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 173의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고,

제2 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 174의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며; 또는

(xx) 제1 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 175의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고,

제2 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 176의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며; 또는

(xxi) 제1 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 177의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고,

제2 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 178의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며; 또는

(xxii) 제1 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 179의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고,

제2 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 180의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며; 또는

(xxiii) 제1 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 181의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고,

제2 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 182의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며; 또는

(xxiv) 제1 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 183의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고,

제2 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 184의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며; 또는

(xxv) 제1 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 185의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고,

제2 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 186의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며; 또는

(xxvi) 제1 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 187의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고,

제2 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 188의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며; 또는

(xxvii) 제1 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 189의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고,

제2 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 190의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며; 또는

(xxviii) 제1 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 191의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고,

제2 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 192의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며; 또는

(xxix) 제1 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 193의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고,

제2 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 194의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며; 또는

(xxx) 제1 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 195의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고,

제2 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 196의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며; 또는

(xxxi) 제1 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 205의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고,

제2 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 206의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며; 또는

(xxxii) 제1 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 207의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고,

제2 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 208의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며; 또는

(xxxiii) 제1 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 209 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고,

제2 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 210의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며; 또는

(xxxiv) 제1 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 211의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고,

제2 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 212의 서열 또는 이의 단편에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

일 구체예에서, 중쇄(HC)는 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역(CH)을 포함한다. 일 구체예에서, 중쇄 불변 영역(CH)은 불변 영역 도메인 1 영역(CH1), 힌지 영역, 불변 영역 도메인 2 영역(CH2) 및 불변 영역 도메인 3 영역(CH3)을 포함한다. 일 구체예에서, 경쇄(LC)는 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역(CL)을 포함한다.

일 구체예에서, 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)은 함께 제1 결합 도메인을 제공한다. 일 구체예에서, 동일한 결합 아암 상의 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)은 함께 제1 결합 도메인을 제공한다. 일 구체예에서, ACE2 단백질의 세포외 도메인(ECD) 또는 그의 변이체, 또는 ACE2 단백질의 세포외 도메인(ECD) 또는 그의 변이체의 단편은 제2 결합 도메인을 제공한다. 일 구체예에서, scFv는 제2 결합 도메인을 제공한다.

추가 측면에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 항체를 제공하며, 여기서 VH는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다:

(i) SEQ ID NO: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 92, 100, 108 및 116으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 HCDR3;

(ii) SEQ ID NO: 3, 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 91, 99, 107 및 115로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 HCDR2; 및

(iii) SEQ ID NO: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 98, 106 및 114로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 HCDR1.

일 구체예에서, VH는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:

(xiv) SEQ ID NO: 106의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 107의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 108의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH; 및

(xv) SEQ ID NO: 114의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 115의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 116의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH.

추가 측면에서, 본 발명은 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항체를 제공하며, 여기서 VL은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다:

(i) SEQ ID NO: 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88, 96, 104, 112 및 120으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 LCDR3;

(ii) SEQ ID NO: 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 87, 95, 103, 111 및 119로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 LCDR2; 및

(iii) SEQ ID NO: 6, 14, 22, 30, 38, 46, 54, 62, 70, 78, 86, 94, 102, 110 및 118로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 LCDR1.

일 구체예에서, VL은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:

(xiv) SEQ ID NO: 110의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 111의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 112의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL; 및

(xv) SEQ ID NO: 118의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 119의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 120의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL.

본원에 설명된 항체의 일 구체예에서, 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 및 VL을 포함한다:

(iii) SEQ ID NO: 18의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 19의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 20의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 22의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID No: 23의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 24의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;

(xiv) SEQ ID NO: 106의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 107의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 108의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 110의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID No: 111의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 112의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL; 및

(xv) SEQ ID NO: 114의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 115의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 116의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 118의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID No: 119의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 120의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL.

본원에 설명된 항체의 일 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO. 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 97, 105, 및 113으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH를 포함한다.

본원에 설명된 항체의 일 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO: 5, 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85, 93, 101, 109, 및 117로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함한다.

(xiv) SEQ ID NO: 105의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 109의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL; 및

(xv) SEQ ID NO: 113의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 117의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL.

일 구체예에서, 항체는 다음을 포함한다:

(i) 중쇄(HC)를 포함하는 제1 폴리펩타이드 및

(ii) 경쇄(LC)를 포함하는 제2 폴리펩타이드.

일 구체예에서, 항체는 제1 결합 아암 및 제2 결합 아암을 포함하며, 여기서

a. 제1 결합 아암은 다음을 포함한다:

(i) 중쇄(HC)를 포함하는 제1 폴리펩타이드 및

(ii) 경쇄(LC)를 포함하는 제2 폴리펩타이드 및;

b. 제2 결합 아암은 다음을 포함한다:

(i) 중쇄(HC)를 포함하는 제1 폴리펩타이드 및

(ii) 경쇄(LC)를 포함하는 제2 폴리펩타이드.

일 구체예에서, 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)은 함께 제1 결합 도메인을 제공한다. 일 구체예에서, 동일한 결합 아암 상의 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)은 함께 제1 결합 도메인을 제공한다.

일 구체예에서, 본원에 기재된 결합 분자의 일부일 수 있는 본원에 기재된 항체는 모 항체에 비해 더 적은 정도로 Fc-매개 이펙터 기능을 유도하도록 변형될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 중쇄 불변 영역은 변형되지 않은 중쇄를 포함하는 것을 제외하고는 동일한 항체와 비교하여 항체가 Fc-매개 이펙터 기능을 보다 적은 정도로 유도하도록 변형된다. 일 구체예에서, Fc-매개 이펙터 기능은 IgG Fc(Fcγ) 수용체에 대한 결합, C1q에 대한 결합 또는 FcR의 Fc-매개 가교결합의 유도에 의해 측정된다. 일 구체예에서, 상기 Fc-매개 이펙터 기능은 C1q에 대한 결합에 의해 측정된다. 일 구체예에서, 중쇄 불변 영역은 상기 항체에 대한 C1q의 결합이 모 항체에 비해 감소되도록, 좋기로는 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95%, 97% 이상 또는 100% 감소되도록 변형되며, 여기서 C1q 결합은 좋기로는 ELISA에 의해 결정된다. 일 구체예에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 불변 영역 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치에 있는 하나 이상의 아미노산은 각각 L 및 L이 아니다. 일 구체예에서, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치는 상기 제1 및 제2 중쇄 불변 영역에서 각각 A 및 A이다.

추가 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 결합제 또는 본원에 기재된 항체를 인코딩하는 재조합 핵산을 제공한다. 일 구체예에서, 재조합 핵산은 RNA이다.

추가 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 재조합 핵산으로 형질감염된 세포를 제공한다. 일 구체예에서, 세포는 결합제 또는 항체를 발현한다.

추가 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 결합제, 본원에 기재된 항체 또는 본원에 기재된 재조합 핵산을 포함하는 의약 조성물을 제공한다.

추가 측면에서, 본 발명은 치료용으로 본원에 기술된 결합제, 본원에 기술된 항체, 또는 본원에 기술된 재조합 핵산을 제공한다. 일 구체예에서, 치료적 용도는 대상체에서 코로나바이러스 감염의 치료적 또는 예방적 치료를 포함한다. 일 구체예에서, 치료적 용도는 대상체에서 코로나바이러스를 중화시키는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 대상체는 인간이다.

본원에 기재된 결합제, 본원에 기재된 항체, 본원에 기재된 재조합 핵산, 본원에 기재된 세포 또는 본원에 기재된 의약 조성물의 일 구체예에서, 코로나바이러스는 베타코로나바이러스이다.

본원에 기재된 결합제, 본원에 기재된 항체, 본원에 기재된 재조합 핵산, 본원에 기재된 세포 또는 본원에 기재된 의약 조성물의 일 구체예에서, 코로나바이러스는 사르베코바이러스이다.

본원에 기재된 결합제, 본원에 기재된 항체, 본원에 기재된 재조합 핵산, 본원에 기재된 세포 또는 본원에 기재된 의약 조성물의 일 구체예에서, 코로나바이러스는 SARS-CoV-1 및/또는 SARS-CoV-2이다..

추가 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 결합제, 본원에 기재된 항체, 본원에 기재된 재조합 핵산 또는 본원에 기재된 의약 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 코로나바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 코로나바이러스의 구체예는 본 명세서에 기술된 바와 같다.

일 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 본원에 기재된 제제 또는 조성물에 관한 것이다.

IgG-scFv 이중특이적 결합제가 RNA 투여에 의해 생체내(in vivo)에서 발현될 수 있고 IgG-scFv 이중특이적 결합제가 올바르게 조립되고 폴딩된다는 것이 본원 에서 입증된다. 따라서, 본 발명은 또한 다음의 예시적인 구체예에 관한 것이다:

1. 다음을 포함하는 조성물 또는 의약 제제:

(i) 면역글로불린 중쇄를 포함하는 제1 폴리펩타이드 사슬을 인코딩하는 제1 RNA; 그리고

(ii) 면역글로불린 경쇄 및 단일 사슬 Fv(scFv)를 포함하는 제2 폴리펩타이드 사슬을 인코딩하는 제2 RNA.

2. 구체예 1에 있어서, scFv가 경쇄의 N-말단 또는 C-말단에 연결된, 조성물 또는 의약 제제.

3. 구체예 1 또는 2에 있어서, scFv가 경쇄의 C-말단에 연결된, 조성물 또는 의약 제제.

4. 구체예 1 내지 3 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 면역글로불린 중쇄가 중쇄(VH)의 가변 영역을 포함하고 면역글로불린 경쇄가 경쇄(VL)의 가변 영역을 포함하는, 조성물 또는 의약 제제.

5. 구체예 1 내지 4 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 면역글로불린 중쇄가 면역글로불린 경쇄와 상호작용하여 제1 결합 도메인을 형성하는, 조성물 또는 의약 제제.

6. 구체예 1 내지 5 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 면역글로불린 중쇄의 중쇄 가변 영역(VH)이 면역글로불린 경쇄의 경쇄 가변 영역(VL)과 상호작용하여 제1 결합을 형성하는, 조성물 또는 의약 제제.

7. 구체예 1 내지 6 중 어느 일 구체예에 있어서, 면역글로불린 중쇄 중 2개와 면역글로불린 경쇄 중 2개가 전장 항체를 형성하는, 조성물 또는 의약 제제.

8. 구체예 1 내지 7 중 어느 일 구체예에 있어서, scFv가 면역글로불린의 중쇄(VH)의 가변 영역 및 면역글로불린의 경쇄(VL)의 가변 영역을 포함하는, 조성물 또는 의약 제제.

9. 구체예 1 내지 8 중 어느 일 구체예에 있어서, scFv의 VH가 scFv의 VL과 상호작용하여 제2 결합 도메인을 형성하는, 조성물 또는 의약 제제.

10. 구체예 9에 있어서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인이 상이한 에피토프에 결합하고, 상기 상이한 에피토프들은 동일하거나 상이한 항원 상에 존재하는 것인 조성물 또는 의약 제제.

11. 구체예 1 내지 10 중 어느 일 구체예에 있어서, 제1 폴리펩타이드 사슬 중 2개 및 제2 폴리펩타이드 사슬 중 2개가 전장 항체를 형성하고, scFv가 각각의 경쇄에 연결된 것인 조성물 또는 의약 제제.

12. 구체예 1 내지 11 중 어느 일 구체예에 있어서, 제1 폴리펩타이드 사슬이 중쇄의 불변 영역 1(CH1) 또는 그의 기능적 변이체를 포함하고, 제2 폴리펩타이드 사슬이 경쇄(CL)의 불변 영역 또는 그의 기능적 변이체를 포함하는 조성물 또는 의약 제제.

13. 구체예 12에 있어서, 제1 폴리펩타이드 사슬이 중쇄의 불변 영역 2(CH2) 또는 그의 기능적 변이체를 추가로 포함하고 선택적으로 중쇄의 불변 영역 3(CH3) 또는 그의 기능적 변이체를 추가로 포함하는 조성물 또는 의약 제제.

14. 구체예 1 내지 13 중 어느 일 구체예에 있어서, 면역글로불린이 항체인, 조성물 또는 의약 제제.

15. 구체예 1 내지 15 중 어느 일 구체예에 있어서, 면역글로불린이 IgG인, 조성물 또는 의약 제제.

16. 구체예 15에 있어서, IgG는 인간 IgG인 조성물 또는 의약 제제.

17. 구체예 1 내지 16 중 어느 일 구체예에 있어서, 제1 폴리펩타이드 사슬이 N-말단에서 C-말단으로 VH-CH1의 순서로 포함하고, 여기서 CH는 선택적으로 변형될 수 있는 것인, 조성물 또는 의약 제제.

18. 구체예 1 내지 17 중 어느 일 구체예에 있어서, 제1 폴리펩타이드 사슬이 N-말단에서 C-말단으로 VH-CH1-CH2의 순서로 포함하고, 여기서 CH는 선택적으로 변형될 수 있는 것인, 조성물 또는 의약 제제.

19. 구체예 1 내지 18 중 어느 일 구체예에 있어서, 제1 폴리펩타이드 사슬이 N-말단에서 C-말단으로 VH-CH1-CH2-CH3의 순서로 포함하고, 여기서 CH는 선택적으로 변형될 수 있는 것인, 조성물 또는 의약 제제.

20. 구체예 1 내지 19 중 어느 일 구체예에 있어서, 제2 폴리펩타이드 사슬이 N-말단에서 C-말단으로

VL-CL-VH(scFv)-VL(scFv); 또는

VL-CL-VL(scFv)-VH(scFv)

의 순서로 포함하는, 조성물 또는 의약 제제..

21. 구체예 20에 있어서, VH가 VL과 상호작용하여 결합 도메인을 형성하고 VH(scFv)가 VL(scFv)와 상호작용하여 결합 도메인을 형성하는, 조성물 또는 의약 제제.

22. 구체예 1 내지 21 중 어느 일 구체예에 있어서, scFv가 펩타이드 링커에 의해 경쇄에 연결된, 조성물 또는 의약 제제.

23. 구체예 20 내지 22 중 어느 일 구체예에 있어서, CL이 펩타이드 링커에 의해 VH(scFv) 또는 VL(scFv)에 연결된, 조성물 또는 의약 제제.

24. 구체예 22 또는 23에 있어서, 펩타이드 링커가 GS 링커를 포함하는, 조성물 또는 의약 제제.

25. 구체예 1 내지 24 중 어느 일 구체예에 있어서, scFv의 VH 및 VL이 펩타이드 링커에 의해 서로 연결된, 조성물 또는 의약 제제.

26. 구체예 25에 있어서, 펩타이드 링커가 GS 링커를 포함하는, 조성물 또는 의약 제제.

27. 구체예 26에 있어서, 펩타이드 링커는 아미노산 서열 (G₄S)₄또는 이의 기능적 변이체를 포함하는, 조성물 또는 의약 제제.

28. 구체예 20 내지 27 중 어느 일 구체예에 있어서, 제1 폴리펩타이드 사슬 상의 CH1이 제2 폴리펩타이드 사슬 상의 CL과 상호작용하는, 조성물 또는 의약 제제.

29. 구체예 1 내지 28 중 어느 일 구체예에 있어서, 제1 RNA 및/또는 제2 RNA가 우리딘 대신에 변형된 뉴클레오사이드를 포함하는, 조성물 또는 의약 제제.

30. 구체예 29에 있어서, 변형된 뉴클레오사이드가 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ) 및 5-메틸-우리딘(m5U)으로부터 선택되는, 조성물 또는 의약 제제.

31. 구체예 1 내지 30 중 어느 일 구체예에 있어서, 제1 RNA 및/또는 제2 RNA가 캡을 포함하는 것인 조성물 또는 의약 제제.

32. 캡이 m₂ ^7,3'-OGppp(m₁ ^2'-O)ApG를 포함하는, 구체예 31의 조성물 또는 의약 제제.

33. 구체예 1 내지 32 중 어느 일 구체예에 있어서, 제1 RNA 및/또는 제2 RNA가 5' UTR을 포함하는, 조성물 또는 의약 제제.

34. 구체예 33에 있어서, 5' UTR이 SEQ ID NO: 199의 뉴클레오타이드 서열, 또는 SEQ ID NO: 199에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%%, 85% 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 조성물 또는 의약 제제.

35. 구체예 1 내지 34 중 어느 일 구체예에 있어서, 제1 RNA 및/또는 제2 RNA가 3' UTR을 포함하는, 조성물 또는 의약 제제..

36. 구체예 35에 있어서, 3' UTR이 SEQ ID NO: 201의 뉴클레오타이드 서열, 또는 SEQ ID NO: 201에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%%, 85% 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 조성물 또는 의약 제제.

37. 구체예 1 내지 36 중 어느 일 구체예에 있어서, 제1 RNA 및/또는 제2 RNA가 폴리-A 서열을 포함하는, 조성물 또는 의약 제제.

38. 구체예 37에 있어서, 폴리-A 서열이 적어도 100개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물 또는 의약 제제.

39. 구체예 37 또는 38에 있어서, 폴리-A 서열이 SEQ ID NO: 202의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 조성물 또는 의약 제제.

40. 구체예 1 내지 39 중 어느 일 구체예에 있어서, RNA가 액체로 제제화되거나, 고체로 제제화되거나 이들의 조합인, 조성물 또는 의약 제제.

41. 구체예 1 내지 40 중 어느 일 구체예에 있어서, RNA가 주사용으로 제제화되거나 제제화될 예정인, 조성물 또는 의약 제제.

42. 구체예 1 내지 41 중 어느 일 구체예에 있어서, RNA가 정맥내 투여용으로 제제화되거나 제제화될 예정인, 조성물 또는 의약 제제.

43. 구체예 1 내지 42 중 어느 일 구체예에 있어서, RNA가 입자로서 제제화되거나 제제화될 예정인, 조성물 또는 의약 제제.

44. 구체예 50에 있어서, 입자가 지질 나노입자(LNP)인, 조성물 또는 의약 제제.

45. 구체예 44에 있어서, LNP 입자가 양이온성 지질, 중성 지질(예를 들어, 인지질), 폴리머-접합 지질(예를 들어, 페길화 지질) 및 스테로이드(예를 들어, 콜레스테롤)를 포함하는, 조성물 또는 의약 제제.

46. 구체예 1 내지 45 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 의약 조성물인, 조성물 또는 의약 제제.

47. 구체예 46에 있어서, 의약 조성물이 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제를 추가로 포함하는, 조성물 또는 의약 제제.

48. 구체예 1 내지 47 중 어느 일 구체예에 있어서, 상기 의약 제제는 키트인 조성물 또는 의약 제제.

49. 구체예 48에 있어서, RNA 및 선택적으로 입자 형성 성분은 별도의 바이알에 있는, 조성물 또는 의약 제제.

50. 구체예 1 내지 49 중 어느 일 구체예에 있어서, 약학적 용도를 위한, 조성물 또는 의약 제제.

51. 구체예 50에 있어서, 약학적 용도는 질병 또는 장애의 치료적 또는 예방적 치료를 포함하는, 조성물 또는 의약 제제.

52. 구체예 1 내지 51 중 어느 일 구체예에 있어서, 대상체에서 결합제를 발현하는데 사용하기 위한, 조성물 또는 의약 제제.

53. 구체예 52에 있어서, 결합제는 적어도 이중특이적인 결합제인, 조성물 또는 의약 제제.

54. 구체예 52 또는 53에 있어서, 결합제는 본원에 기재된 결합제인, 조성물 또는 의약 제제.

55. 구체예 1 내지 54 중 어느 일 구체예에 기재된 제1 RNA 및 제2 RNA를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 결합제를 발현시키는 방법.

56. 구체예 54에 있어서, 제1 RNA 및 제2 RNA가 동시에 또는 순차적으로 투여되는 것인 방법.

57. 대상체에게 구체예 1 내지 54 중 어느 일 구체예의 조성물 또는 의약 제제를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 결합제를 발현시키는 방법.

58. 구체예 55 내지 57 중 어느 일 구체예에 있어서, 결합제가 본원에 기재된 결합제인 방법.

59. 구체예 55 내지 58 중 어느 일 구체예의 방법에 사용하기 위한, 구체예 1 내지 54 중 어느 일 구체예에 제시된 제1 RNA 및 제2 RNA 또는 구체예 1 내지 54 중 어느 일 구체예의 조성물 또는 의약 제제.

도 1: 인간 ACE-2 세포외 도메인을 갖는 항-S1-항체 융합 작제물의 개요
돌연변이 R273Q, H345L, H374N, H378N을 포함하는 ACE-2(aa 18-615)의 ECD는 항-S1 항체의 경쇄에 N- 또는 C-말단으로 융합되고 항-S1 중쇄는 LS(M428L/N434S) 돌연변이를 함유하거나 함유하지 않는다(A). 또 다른 작제물에서, 변형된 ACE-2 ACD는 LS(M428L/N434S) 돌연변이를 포함하거나 포함하지 않는 Fc(CH2-CH3) 도메인에 융합된다(B).
도 2: 항-S1-항체-ACE2 융합 단백질을 사용한 SARS-CoV2-S1-RBD ELISA
고정화된 SARS-CoV2-S1-RBD 단백질에 대한 항-S1-항체-ACE2 융합 단백질의 결합을 ELISA에서 테스트하였다. (A) 대조군으로서 ACE-2-hFc(402/403), 항-S1-항체(408/413) 및 항-S1-항체-ACE2 융합 단백질을 20,000 ~ 0.013 ng/ml의 농도 범위로 계대 희석하여 시험하였다. (B) EC50 값은 XLfit을 사용하여 곡선 피팅 후 결정된 것으로 표시된다.
도 3: 항-S1-항체-ACE2 융합 단백질을 사용한 SARS-CoV2-S1-RBD - ACE-2 중화 분석
항-S1-항체-ACE2 융합 단백질에 의한 ACE-2 - SARS-CoV2-S1-RBD 상호작용의 억제가 중화 ELISA에서 테스트되었다. (A) 대조군으로서 ACE-2-hFc(402/403), 항-S1-항체(408/413) 및 항-S1-항체-ACE2 융합 단백질을 각각 30,000~3.7 또는 0.019 ng/ml의 농도 범위로 계대 희석하여 시험하였다. (B) IC50 값은 XLfit을 사용한 커브 피팅 후 결정된 것으로 표시된다.
도 4: 항-S1-항체-ACE2 융합 작제물에 의한 슈도바이러스 중화 활성
항-S1-항체(413), ACE-2-hFc(402) 및 항-S1-항체-ACE2 융합 단백질을 슈도바이러스 중화 시험(pVNT)에서 시험하였다. 그래프는 GFP의 발현으로 측정된 감염된 세포의 수를 나타낸다(Y축). 테스트 샘플의 농도 범위는 100 ~ 0.046 μg/ml이다. IC50 값은 GraphPad Prism을 사용하여 곡선 맞춤 후 결정된 대로 표시된다.
도 5: 활성 트라이머 SARS-CoV-2 S 및 SARS-CoV-2 S1-RBD 단백질에 대한 항-S1-항체-ACE2 융합 단백질의 친화도
2 가지 상이한 밀도의SARS-CoV-2 S 활성 트라이머 단백질(A) 또는 SARS-CoV-2 S1-RBD 단백질(B)를 이용하여 SPR에 의해 측정된 항-S1-항체(413), ACE-2-hFc(402) 및 항-S1-항체-ACE2 융합 단백질의 온- 및 오프-레이트 및 K^D를 나타낸다.
도 6: B 세포 상등액에서 항체를 사용한 SARS-CoV2-S1 ELISA
B 세포 상등액 중 고정된 SARS-CoV2-S1 단백질에 대한 항-SARS-CoV2-S1 항체 결합을 ELISA로 테스트하였다. (A) 정량화 ELISA로 측정한 각 B 세포 상등액에 대한 토끼 항체 농도를 나타낸다. (B) B-세포 상등액 및 대조군으로서 ACE-2-mFc를 1:3의 계대 희석으로 시험하고 결정된 rIgG 함량에 따라 농도를 플롯하였다(실시예 6A 참조). (C) 표 1: 코팅 농도가 3 μg/ml인 SARS-CoV-2 S1 결합 ELISA에서 B 세포 상등액의 항-S1 토끼 항체의 EC50 데이터. 표 2: 코팅 농도가 0.85 μg/ml인 SARS-CoV-2 S1 결합 ELISA에서 B 세포 상등액의 항-S1 토끼 항체의 EC50 데이터. EC50 값은 XLfit을 사용한 곡선 맞춤 후 결정된 것으로 표시된다.
도 7: B 세포 상등액에서 항체를 사용한 SARS-CoV2-S1 - ACE-2 중화 분석
B 세포 상등액에서 항-SARS-CoV2-S1 항체에 의한 ACE-2 - SARS-CoV2-S1 상호작용의 억제를 중화 ELISA로 테스트하였다. (A) B-세포 상등액 및 대조군으로서 ACE-2-mFc를 1:3의 계대 희석으로 시험하고 결정된 rIgG 함량에 따라 농도를 표시하였다(실시예 6A 참조). (B) IC50 값은 XLfit을 사용한 커브 피팅 후 결정된 것으로 표시된다.
도 8: 본 발명의 정제된 항체를 사용한 SARS-CoV2-S, SARS-CoV2-S1-RBD 및 SARS-CoV-S1-RBD ELISA
고정된 SARS-CoV2-S 활성 트라이머, SARS-CoV2-S1-RBD 또는 SARS-CoV-S1-RBD에 대한 본 발명의 정제된 키메라 항체의 결합을 ELISA로 테스트하였다. (A) 대조군으로서 항-S1-항체(408), 정제된 키메라 항체 및 ACE-2-hFc(402/403), 및 항-S1-항체-ACE2 융합 단백질(406)을 1,000 ~ 0.0006 ng/ml의 농도로 계대 희석하여 테스트하였다. (B) EC50 값은 XLfit을 사용하여 곡선 피팅 후 결정된 것으로 표시된다.
도 9: 본 발명의 정제된 항체를 사용한 SARS-CoV2-S1-RBD - ACE-2 중화 분석
본 발명의 정제된 키메라 항체에 의한 ACE-2 - SARS-CoV2-S1-RBD 상호작용의 억제를 중화 ELISA로 테스트하였다. (A) 대조군으로서 항-S1-항체(408), 정제된 키메라 항체 및 ACE-2-hFc(402/403), 항-S1-항체-ACE2 융합 단백질(406)을 30,000 ~ 0.019 ng/ml의 농도로 계대 희석하여 테스트하였다. (B) IC50 값은 XLfit을 사용한 커브 피팅 후 결정된 것으로 표시된다.
도 10: 본 발명의 정제된 항체에 의한 슈도바이러스 중화 활성
본 발명의 정제된 키메라 항체를 슈도바이러스 중화 테스트(pVNT)로 시험하였다. (A) 항-S1-항체(413), ACE2-hFc(403) 및 항-S1-항체-ACE2 융합 단백질(411)뿐만 아니라 키메라 항체를 100~0.049 μg/ml 또는 30 ~ 0.01 μg/ml의 농도로 계대 희석하여 테스트하였다. 그래프는 GFP(Y축)의 발현으로 측정된 웰당 감염된 세포의 수를 나타낸다. 본 발명의 선택된 항체에 대한 IC50 및 IC90 값은 (B)에 요약되어 있다.
도 11: 본 발명의 항체들 간의 SARS-CoV2-S1-RBD 에피토프 경쟁
SARS-CoV2-S1-RBD 상의 에피토프 결합에 대한 정제된 키메라 항체의 경쟁을 경쟁 ELISA로 테스트하였다. 하나의 키메라 항체와 다른 키메라 항체의 다양한 조합이 표에 요약되어 있다. 경쟁 항체는 +로, 비경쟁 항체는 -로, 결정되지 않은 쌍은 nd로 표시된다.
도 12: 이중특이적 항-S1 항체 개요
항-S1 항체 또는 본 발명의 항체(New-scFv)로부터 유도된 scFv는 각각 항-S1 항체 또는 본 발명의 항체의 경쇄에 커플링된다. 대안적으로, New-scFv는 본 발명의 또 다른 항체의 경쇄에 결합된다.
도 13: RNA-작제물 및 인코딩된 항-S1-항체-ACE2 융합 리보Mab를 예시하는 모듈 도식.
(A) IVT-mRNA 수준에서의 중쇄(HC, 상단) 및 경쇄 ACE2 세포외 도메인(ECD) 융합체(LC-ACE2, 하단)의 설계. (B) 번역된 항-S1-항체-ACE2-리보Mab의 도해, 좌측, 리보Mab_411, 우측, 리보Mab_406. 곡선은 글리신-세린[(Gly4Ser)4] 링커를 상징한다.
ACE2, 안지오텐신 전환 효소 2; a-S1, 항-스파이크 단백질 1; CL, 불변 경쇄 영역; CH, 불변 중쇄 영역; ECD, 세포외 도메인; Fc, 단편 결정화 가능 영역; GS, (Gly4Ser)4 링커; HC, 중쇄; LC, 경쇄; LS, 메티오닌 428 류신 및 아스파라긴 434 세린 치환; 폴리(A), 폴리(A) 꼬리; Sec, 분비 신호; UTR, 번역되지 않은 영역; VH, 가변 중쇄 도메인; VL, 가변 경쇄 도메인.
도 14: 시험관내 항-S1-항체-ACE2 융합 리보Mab의 발현.
인간 배아 신장 세포주 HEK 293T/17을 리보Mab_411 또는 리보Mab_406에 대한 중쇄(HC) 및 경쇄 ACE2 ECD 융합체(LC-ACE2)의 표시된 IVT-mRNA 질량 관련 비율로 또는 RNA 완충액 단독(Mock)으로 전기천공을 통해 일시적으로 형질감염시켰다. 분비된 리보Mab를 함유하는 HEK 293T/17 세포 배양 상등액(SN)을 전기천공 후 48시간에 수확하고 (A) Gyros 면역분석 정량화 및 (B, C) 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. (A) 지시된 바와 같은 HC:LC-ACE2 비율(x축)의 형질감염 후 SN에서 리보Mab 농도를 Gyros 샌드위치 면역분석을 통해 형광 표지된 항-인간 IgG 검출 항체로 분석하였다. (B, C) 번역된 리보Mab의 검출을 위해 Western Blot 분석을 수행하였다. 22.5 ng의 정제된 참조 단백질 ID 411(참조 단백질), 7.5 μL Mock 또는 7.5 μL 리보Mab 함유 SN을 로드하고 (B) 비환원 조건 및 (C) 환원 조건에서 폴리아크릴아미드 구배 겔 전기영동(4-15% 폴리아크릴아미드)으로 분리하였다. 두 가지 상이한 분자량 표준(MW std. 1 및 2)이 적용되었다. 2가지 폴리클로날 고추냉이 과산화효소-접합된 염소 항-인간 IgG, Fcy-단편 특이적(1:2,000) 및 카파 LC-특이적(1:200) 항체의 혼합물로 단백질을 검출하였다.
Fc, IgG의 단편 결정화 가능 영역; HC, 중쇄; IB, 면역블롯; IgG; 면역글로불린 G; LC, 경쇄; MW 표준, 분자량 표준; SN, 상등액.
도 15: 항-S1-항체-ACE2 융합 리보Mab의 생체내 약동학 추정.
그룹당 12마리의 암컷 Balb/cJRj 마우스에 리보Mab_406, 리보Mab_411 또는 루시페라제(음성 대조군)를 인코딩하는 30 ㎍의 RNA-LNP를 단일 정맥 주사하였다. 시점 당 4마리 마우스의 혈액 샘플을 채취하였다. 도시된 바와 같이 투여 후 6, 24, 48, 96 및 240시간(0.25 내지 10일)에 Gyros 면역분석을 통해 리보Mab 농도를 혈청 샘플에서 측정하였다. 농도를 y축에 log10 스케일로 나타내었다. 오차 막대는 평균의 표준 오차이다(n = 4).
도 16: 생체내 발현된 항-S1-항체-ACE2 융합 리보Mab의 웨스턴 블롯 분석.
투여 6시간 후 리보Mab_406 또는 리보Mab_411을 인코딩하는 30 ㎍ RNA-LNP를 주사한 암컷 Balb/cJRj 마우스로부터 혈청을 샘플링하고 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 완충액(Ref. 단백질) 또는 처리되지 않은 마우스의 혈청(혈청 내 Ref. 단백질)에 희석된 정제된 참조 단백질 ID 411이 양성 대조군으로 사용되었다. 루시페라제-인코딩 RNA-LNP를 주사한 마우스의 혈청을 음성 대조군으로 사용하였다. 10 ng 참조 단백질 또는 5 μL의 혈청 샘플을 (A) 비환원 조건 및 (B) 환원 조건 하에서 폴리아크릴아미드 구배 겔 전기영동(4-15%)으로 분리하였다. 두 가지 다른 분자량 표준(MW std. 1 및 2)이 적용되었다. 단백질은 2개의 폴리클로날 고추냉이 과산화효소-접합된 염소 항-인간 IgG, Fcy-단편 특이적(1:2,000) 및 카파 LC-특이적(1:200) 항체의 혼합물로 검출되었다.
Fc, IgG의 단편 결정화 가능 영역; h, 인간; HC, 중쇄; IB, 면역 블롯; IgG; 면역글로불린 G; LC, 경쇄; MW 표준, 분자량 표준; SN, 상등액.
도 17: 리보Mab_411 및 406에 의한 슈도바이러스 중화 활성.
HEK 293T/17 세포 배양 SN에서 리보Mab_406 및 리보Mab_411을 슈도바이러스 중화 시험에서 시험하였다. HC만으로 형질감염된 세포의 SN을 Mock 대조군(Mock 1, 리보Mab_406의 HC, Mock 2, 리보Mab_411의 HC)으로 사용하였다. 샘플은 30 ~ 0.23 μg/mL 범위의 최종 농도로 일련의 희석으로 테스트되었다. 그래프는 GFP(Y축)의 발현으로 측정된 웰당 감염된 세포의 수를 보여준다. 아래 표는 IC50 값( μg/mL)을 보여준다.
도 18: 재조합 SARS-CoV2 S1-RBD 단백질에 대한 이중특이적 항-S1-항체-scFv 융합 단백질의 결합
고정된 SARS-CoV2-S1-RBD 단백질에 대한 항-S1-항체-scFv 융합 단백질의 결합을 ELISA에서 테스트하였다. (A) 항-S1-항체(408), 본 발명의 항체 및 항-S1-항체-scFv 융합 단백질을 1,000 내지 0.001 ng/ml의 농도 범위를 포괄하는 계대 희석으로 시험하였다. (B) EC50 값은 XLfit을 사용하여 곡선 피팅 후 결정된 것으로 표시된다.
도 19: 항-S1-항체-scFv 융합 단백질을 사용한 SARS-CoV2-S1-RBD - ACE-2 중화 분석
항-S1-항체-scFv 융합 단백질에 의한 ACE-2 - SARS-CoV2-S1-RBD 상호작용의 억제를 중화 ELISA로 테스트하였다. (A) 항-S1-항체(408), 본 발명의 항체 및 항-S1-항체-scFv 융합 단백질을 각각 30,000 내지 0.019 ng/ml의 농도 범위로 계대 희석하여 시험하였다. (B) IC50 및 IC90 값은 XLfit을 사용하여 곡선 피팅 후 결정된 것으로 표시된다.
도 20: SARS-CoV-2 S1-RBD 단백질에 대한 본 발명의 S1 표적화 항체의 친화도
고정화된 SARS-CoV-2 S1-RBD 단백질을 사용하여 SPR에 의해 측정된 항-S1-항체(413) 및 본 발명의 항체의 온- 및 오프-레이트 및 K_D를 나타내었다.
도 21: 이중특이적 항체의 슈도바이러스 중화
정제된 이중특이적 항체 작제물 465 및 467을 슈도바이러스 중화 시험(pVNT)으로 시험하였다. (A) 그래프는 GFP(Y축)의 발현으로 측정된 웰당 감염된 세포의 수를 보여준다. 본 발명의 선택된 항체에 대한 IC50 및 IC90 값은 (B)에 요약되어 있다.
도 22: 이중특이적 항체의 슈도바이러스 중화
정제된 이중특이적 항체 작제물을 슈도바이러스 중화 시험(pVNT)으로 시험하였다. (A) 그래프는 GFP(Y축)의 발현으로 측정된 웰당 감염된 세포의 수를 보여준다. 본 발명의 항체에 대한 IC50 및 IC90 값은 (B)에 요약되어 있다.
도 23: 이중특이적 항체의 슈도바이러스 중화
정제된 이중특이적 항체 작제물 498, 500, 501 및 502를 슈도바이러스 중화 시험(pVNT)으로 시험하였다. (A) 그래프는 GFP(Y축)의 발현으로 측정된 웰당 감염된 세포의 수를 보여준다. 본 발명의 항체에 대한 IC50 및 IC90 값은 (B)에 요약되어 있다.
도 24: SARS-CoV-2 S1-RBD 단백질에 대한 본 발명의 S1 표적화 항체 470의 친화도
고정화 SARS-CoV-2 S1-RBD 단백질을 사용하여 다중 사이클 동역학 SPR 분석에서 측정된 본 발명의 항-S1-항체(470)의 온- 및 오프-레이트 및 K_D가 도시되어 있다_.다중 사이클 동역학은 2개의 서로 다른 플로우 셀에서 각각 3회 반복하여 기록되었다.
도 25: IgG 리보Mab를 인코딩하는 RNA-작제물을 설명하는 모듈 방식.
(A) IVT-mRNA 수준에서 IgG 리보Mab를 인코딩하는 중쇄(HC, 상단) 및 경쇄(LC, 하단) 항-SARS-CoV-2의 설계. (B) 번역된 IgG 리보Mab 단백질의 도해.
CL, 불변 경쇄 영역; CH, 불변 중쇄 영역; Fc, 단편 결정화 가능 영역; HC, 중쇄; LC, 경쇄; LALA, 류신-알라닌(코돈 234) 및 류신-알라닌(코돈 235) 치환; LS, 메티오닌-류신(코돈 428) 및 아스파라긴-세린(코돈 434) 치환; 폴리(A), 폴리(A) 꼬리; Sec, 분비 신호; UTR, 번역되지 않은 영역; VH, 가변 중쇄 도메인; VL, 가변 경쇄 도메인.
도 26: 시험관내 항-SARS-CoV-2 IgG 리보Mab의 발현.
인간 배아 신장 세포주 HEK 293T/17을 지시된 리보Mab에 대해 1.5:1의 중쇄(HC) 및 경쇄의 IVT-mRNA 질량 관련 비율로 전기천공을 통해 일시적으로 형질감염시켰다. 분비된 리보Mab를 함유하는 HEK 293T/17 세포 배양 상등액(SN)을 전기천공 후 48시간에 수확하고 Gyros 면역분석 정량을 수행하였다. 지시된 바와 같은 HC:LC 비율(x-축)의 형질감염 후 SN에서 리보Mab 농도를 Gyros 샌드위치 면역분석을 통해 형광 표지된 항-인간 IgG 검출 항체로 분석하였다.
참조, 참조(LALA 및 LS 돌연변이를 포함하는 항-S1 IgG 항체).
도 27: 시험관내 발현된 항-SARS-CoV-2 IgG 리보Mab 후보에 의한 슈도바이러스 중화 활성.
각 그래프의 x축에 표시된 항-SARS-CoV-2 리보Mab를 포함하는 HEK 293T/17 세포 배양 SN을 슈도바이러스 중화 테스트에서 테스트하였다. 샘플을 30,000 ~ 7.3 ng/ml 범위의 최종 농도로 계대 희석하여 테스트하였다. (A) 그래프는 상대 발광 단위(RLU)에서 루시페라제(Y축)의 발현에 의해 측정된 웰당 감염된 세포의 수를 보여준다. 오차 막대는 평균의 표준 오차이다(기술적 삼중). 가로 점선은 바이러스 제어에 대한 벤치마크(RLU)를 나타낸다. (B) 리보Mab 및 리보Mab IgG 참조 단백질의 IC50 및 IC90 값(ng/ml)을 보여주는 표.
IC50, 최대 억제 농도의 절반; IC90, 슈도바이러스 복제의 90%를 억제하는 데 필요한 농도; ID, 식별 번호; IgG, 면역글로불린 감마; NC, 계산 불가능; 참조, 참조; RLU, 상대 발광 단위.
도 28: 선택된 항-SARS-CoV-2 IgG 리보Mab의 생체내 약동학 추정.
그룹당 4마리의 암컷 Balb/cJRj 마우스는 리보Mab_445, 리보Mab_447, 리보Mab_470, 리보Mab_472, 항-SARS-CoV-2 리보Mab IgG 참조 또는 루시페라제(음성 대조군)를 인코딩하는 30 ㎍ RNA-LNP의 단일 정맥 주사를 받았다. 항-S1 항체(단백질 ID 408) 참조는 단백질 참조로서 100 μg의 용량으로 투여되었다. 시점당 4마리 마우스의 혈액 샘플을 채취하였다. 리보Mab 농도는 투여 후 24, 96, 168, 216, 336 및 504시간(x축에 표시된 대로 1일 내지 21일)에 준비된 혈청 샘플에서 Gyros 면역분석을 통해 측정되었다. 음성 대조군(루시페라제 RNA-LNP, 데이터 미제시)에서는 단백질이 검출되지 않았다. 농도는 y축에 log10 스케일로 표시된다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다(생물학적 4배수).
ID, 식별 번호; IgG, 면역글로불린 감마.
도 29: 생체내 발현된 항-SARS-CoV-2 IgG 리보Mab 후보에 의한 슈도바이러스 중화 활성.
각 그래프의 x축에 표시된 SARS-CoV-2 리보Mab를 함유하는 Balb/cJRj 마우스 혈청 샘플을 야생형 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 사용하여 슈도바이러스 중화 테스트로 시험하였다. 샘플을 12-포인트, 2배(리보Mab_447) 또는 3배(리보Mab_445/470/472) 계대 희석으로 테스트하였다. 시작 농도는 샘플마다 다르며 약 30~60 μg/mL 범위였다. 그래프는 루시페라제의 발현(Y축)에 의해 측정된 웰당 감염된 세포의 수를 보여준다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다(기술적 3중). (B) 혈청 내 리보Mab 및 단백질 참조(단백질 ID 408)의 IC50 및 IC90 값(ng/ml)을 보여주는 표.
IC50, 최대 억제 농도의 절반; IC90, 슈도바이러스 복제의 90%를 억제하는 데 필요한 농도; ID, 식별 번호; 참조, 참조; RLU, 상대 발광 단위.
도 30: RNA-작제물 및 인코딩된 이중특이적 IgG-scFv 리보Mab를 설명하는 모듈 도식.
(A) IVT-mRNA 수준에서 이중특이적 IgG-scFv 리보Mab를 인코딩하는 중쇄(HC, 상단) 및 경쇄(LC-scFv, 하단) 항-SARS-CoV-2의 설계. VH#1 및 VL#1은 첫 번째 항-SARS-CoV-2 항체의 코딩 서열을 사용하는 반면, VH#2 및 VL#2 코딩 서열은 두 번째 항-SARS-CoV-2 특이적 항체에서 파생된다. (B) 번역된 IgG-scFv 리보Mab 단백질의 예시. 곡선은 글리신-세린(GS) 링커를 상징한다. VH#2와 VL#2 사이의 굵은 선은 scFv를 안정화하는 이황화 결합을 나타낸다.
CL, 불변 경쇄 영역; CH, 불변 중쇄 영역; ds, 디설파이드 결합; Fc, 단편 결정화 가능 영역; HC, 중쇄; GS, 글리신-세린 링커; LC, 경쇄; LALA, 류신-알라닌(코돈 234) 및 류신-알라닌(코돈 235) 치환; LS, 메티오닌-류신(코돈 428) 및 아스파라긴-세린(코돈 434) 치환; 폴리(A), 폴리(A) 꼬리; Sec, 분비 신호; scFv, 단일 사슬 가변 단편; UTR, 번역되지 않은 영역; VH, 가변 중쇄 도메인; VL, 가변 경쇄 도메인.
도 31. 선택된 항-SARS-CoV-2 이중특이적 IgG-scFv 리보Mab의 생체내 약동학 추정.
그룹당 4마리의 암컷 Balb/cJRj 마우스에 리보Mab_498, 리보Mab_500, 리보Mab_502 또는 루시페라제(음성 대조군)를 인코딩하는 30 ㎍의 RNA-LNP를 단일 정맥 주사하였다. 항-S1 항체(단백질 ID 408) 참조를 250 μg의 용량으로 단백질 참조로 투여되었다. 시점당 4마리 마우스의 혈액 샘플을 채취하였다. 리보Mab 농도는 투여 후 6, 24, 48, 96, 168, 336 및 504시간(x축에 표시된 대로 0.25일 내지 21일)에 제조된 혈청 샘플에서 Gyros 면역분석을 통해 측정되었다. 음성 대조군(루시페라제 RNA-LNP, 데이터 미제시)에서는 단백질이 검출되지 않았다. 농도는 y축에 log10 스케일로 표시된다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다(생물학적 4배수).
ID, 식별 번호; IgG, 면역글로불린 감마.
도 32. 생체내 발현된 항-SARS-CoV-2 이중특이적 IgG-scFv 리보Mab 후보에 의한 슈도바이러스 중화 활성.
그룹당 2마리의 암컷 Balb/cJRj 마우스에 리보Mab_498, 리보Mab_500, 리보Mab_502 또는 루시페라제(음성 대조군)를 인코딩하는 30 ㎍의 RNA-LNP를 단일 정맥 주사하였다. 항-S1 항체(단백질 ID 408) 참조는 250 μg의 용량으로 단백질 참조로 투여되었다. 투여 후 24시간 후에 2마리의 마우스로부터 혈액 샘플을 채취하였다. 항-SARS-CoV-2 리보Mab를 포함하는 마우스 혈청 샘플을, 야생형, B.1.1.7, B.1.351 및 B.1.617의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 변이체를 사용하여 슈도바이러스 중화 테스트로 테스트하였다. 야생형, B.1.1.7 및 B.1.351 변이체의 샘플을 5,000 ~ 0.0012 ng/ml 범위의 최종 농도로 12포인트, 4배 계대 희석으로 테스트하였다. B.1.617 변이체 샘플을 20,000 ~ 0.0003 ng/ml 범위의 농도로 14포인트, 4배 계대 희석하여 테스트되었다. (A) 표시된 리보Mab의 pVNT 분석 및 표시된 슈도바이러스 변이체에 대한 IC50 값을 보여주는 그래프. 오차 막대는 평균의 표준 오차이다(기술적 삼중). (B) 표시된 슈도바이러스 변이체에 대한 혈청 내 리보Mab의 IC50 및 IC90 값(ng/ml)을 보여주는 표. IC50, 최대 억제 농도의 절반; IC90, 슈도바이러스 복제의 90%를 억제하는 데 필요한 농도; RLU, 상대 발광 단위; WT, 야생형.
도 33: 마우스 혈청에서 이중특이적 IgG-scFv 리보Mab 단백질 무결성
리보Mab_498, 리보Mab_500 또는 리보Mab_502를 인코딩하는 30 ㎍의 RNA-LNP를 투여한 지 24시간 후에 암컷 Balb/cJRj 마우스로부터 혈청을 샘플링하였다. (A) 혈청 샘플의 웨스턴 블롯 분석. 루시페라제-인코딩 RNA-LNP를 주사한 마우스의 혈청을 음성 대조군(neg. control)으로서 사용하였다. 10 ng 참조 단백질 또는 각 혈청 샘플의 11.25 μL를 비환원 조건에서 폴리아크릴아미드 구배 젤(4-15%) 전기영동으로 분리하였다. 단백질은 모노클로날 고추냉이 과산화효소-접합된 염소 항-인간 IgG 항체(H+L)로 검출되었다. (B) ImageLab 소프트웨어를 사용한 정량화에 기반한 생체내-발현 리보Mab IgG-scFv 단백질의 품질 분석(모노머 대 고분자량 대 저분자량 단백질 종)을 보여주는 표. 모노머 IgG-scFv는 원하는 단백질 제품이다.
H, 중쇄; ID, 식별 번호; IgG, 면역글로불린 감마; kD, 킬로 달톤; L, 경쇄; MW, 분자량; scFv, 단일 사슬 가변 단편; 표준. 표준.

서열에 대한 설명

본원에서 참조되는 특정 서열의 목록을 다음 표에 나타내었다.

상세한 설명

본 발명이 하기에 상세히 기재되어 있지만, 본 발명은, 그들이 달라질 수 있으므로 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약으로 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본원에서 사용되는 용어는 단지 특정 구체예를 설명하기 위한 것이며, 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아님을 또한 이해해야 한다. 자가 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.

좋기로는, 본원에서 사용되는 용어는 ["A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Koelbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995)]에 기재되는 바와 같이 정의된다.

본 발명의 실시는, 자가 지시되지 않는 한, 해당 분야의 문헌 (참고로, 예를 들어, [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989])에 설명되는 화학, 생화확, 세포 생물학, 면역학 및 재조합 DAN 기술의 관용적 방법을 채용할 것이다.

이하, 본 발명의 구성요소가 설명될 것이다. 이러한 요소는 특정 구체예와 함께 나열되지만, 추가적인 구체예를 생성하기 위해 임의의 방식 및 임의의 수로 조합될 수 있음을 이해해야 한다. 다양하게 설명된 실시예 및 구체예는 본 발명을 명시적으로 설명된 구체예로만 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 설명은, 명시적으로 설명된 구체예를 임의의 수의 개시된 요소와 결합하는 구체예를 개시하고 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 설명된 모든 요소의 순열 및 조합이, 문맥상 자가 나타나지 않는 한 본 설명에 의해 공개되는 것으로 간주되어야 한다. 용어 "약"은 대략 또는 거의를 의미하고, 일부 구체예에서 본원에 기재된 수치 또는 범위의 맥락에서, 이는 기재된 또는 청구된 수치 또는 범위의 ± 20%, ± 10%, ± 5%, 또는 ± 3%를 의미한다.

본 발명을 설명하는 맥락에서 (특히 청구범위의 맥락에서) 사용되는 용어 "a" 및 "an" 및 "the" 및 유사한 참조는 본원에서 자가 표시되지 않는 한 또는 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 단수 및 복수를 모두 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본원의 수치 범위에 대한 언급은 단지 그 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 언급하는 속기 방법으로서의 역할을 하도록 의도된다. 본원에 자가 명시되지 않는 한, 각각의 개별 값은 본원에 개별적으로 인용된 것처럼 명세서 내에 포함된다. 본원에 기재된 모든 방법은 본원에서 자가 표시되지 않는 한 또는 문백상 명백히 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공되는 임의의 모든 실시예 또는 예시적인 언어 (예컨대 "예컨대")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 설명하기 위한 것으로 의도되며 청구범위에 제한을 두는 것이 아니다. 명세서의 어떤 언어도 본 발명의 실시에 필수적인, 비-청구 구성요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 아니된다.

명시적으로 표현되지 않는 한, "포함하는"이라는 용어는 "포함하는"에 의해 도입된 목록의 구성원에 더하여 추가 구성원이 선택적으로 존재할 수 있음을 나타내기 위해 본 문서의 맥락에서 사용된다. 그러나, "포함하는"이라는 용어가 더 이상의 추가적인 구성원이 존재하지 않을 가능성을 포함한다는 것이 본 발명의 특정 구체예로서 고려되는데, 즉, "포함하는"이 "...로 구성된" 또는 "...로 본질적으로 구성된"의 의미를 갖는 것으로 이해되어야 하는 이러한 구체예의 목적으로 그러하다.

이 명세서 전체에 걸쳐 여러 문서가 인용된다. 먼저든 나중이든, 본원에 인용되는 각각의 문서 (모든 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 제조업체의 명세서, 지침 등을 포함)는 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다. 본원의 어떠한 내용도 본 발명이 그러한 내용보다 선행할 자격이 없었다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 아니된다.

정의

하기에서, 본 발명의 모든 측면에 적용되는 정의가 제공될 것이다. 다음 용어는 자가 명시되지 않는 한 다음과 같은 의미를 갖는다. 정의되지 않은 모든 용어는 당해 기술분야에서 인정되는 의미를 갖는다.

본원에서 사용되는 "감소시키다", "감소시키다", "억제하다" 또는 "손상시키다"와 같은 용어는 전체적인 감소 또는 좋기로는 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 75% 또는 그 이상의 감소이다. 이들 용어는 완전한 또는 본질적으로 완전한 억제, 즉 0으로 또는 본질적으로 0으로의 감소를 포함한다.

"증가하다", "강화하다" 또는 "초과하다"와 같은 용어는 좋기로는 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 80%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 또는 그 이상의 증가 또는 강화에 관련된다.

본 개시내용에 따르면, 용어 "펩타이드"는 올리고- 및 폴리펩타이드를 포함하고

약 2개 이상, 약 3개 이상, 약 4개 이상, 약 6개 이상, 약 8개 이상, 약 10개 이상, 약 13개 이상, 약 16개 이상, 약 20개 이상 및 최대 약 50개, 약 100개 또는 약 150개의 연속 아미노산이 서로 펩타이드 결합을 통해 연결된 물질을 가리킨다. 용어 "단백질" 또는 "폴리펩타이드"는 큰 펩타이드, 특히 약 150개 이상의 아미노산을 갖는 펩타이드를 지칭하지만, 용어 "펩타이드", "단백질" 및 "폴리펩타이드"는 일반적으로 동의어로 사용된다.

아미노산 서열(펩타이드 또는 단백질)과 관련하여 "단편"은 아미노산 서열의 일부, 즉 N-말단 및/또는 C-말단에서 단축된 아미노산 서열을 나타내는 서열에 관한 것이다.

C-말단에서 단축된 단편(N-말단 단편)은 예를 들어 절단된 오픈 리딩 프레임이 번역을 개시하는 역할을 하는 개시 코돈을 포함하는 한, 오픈 리딩 프레임의 3'-말단이 결여된 절단 오픈 리딩 프레임의 번역에 의해 얻을 수 있다.

N-말단에서 단축된 단편(C-말단 단편)은 예를 들어 절단된 오픈 리딩 프레임이 번역을 개시하는 역할을 하는 개시 코돈을 포함하는 한, 오픈 리딩 프레임의 5'-말단이 결여된 절단 오픈 리딩 프레임의 번역에 의해 얻을 수 있다. 아미노산 서열의 단편은 아미노산 서열로부터 아미노산 잔기의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%를 포함한다. 아미노산 서열의 단편은 좋기로는 아미노산 서열로부터 적어도 6개, 특히 적어도 8개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 50개 또는 적어도 100개의 연속 아미노산을 포함한다.

본원에서 "변이체"는 적어도 하나의 아미노산 변형으로 인해 모(parent) 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 의미한다. 모 아미노산 서열은 자연 발생 또는 야생형(WT) 아미노산 서열일 수 있거나, 야생형 아미노산 서열의 변형된 버전일 수 있다. 좋기로는, 변이체 아미노산 서열은 모 아미노산 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 변형, 예를 들어, 비교하여 1 내지 약 20개의 아미노산 변형, 좋기로는 1 내지 약 10개 또는 1 내지 약 5개의 아미노산 변형을 갖는다. 부모에게.

본원에서 "야생형" 또는 "WT" 또는 "천연"은 대립형질 변이를 포함하여 자연에서 발견되는 아미노산 서열을 의미한다. 야생형 아미노산 서열, 펩타이드 또는 단백질에는 의도적으로 변형되지 않은 아미노산 서열이 있다.

본 발명의 목적상, 아미노산 서열(펩타이드, 단백질 또는 폴리펩타이드)의 "변이체"는 아미노산 삽입 변이체, 아미노산 부가 변이체, 아미노산 결실 변이체 및/또는 아미노산 치환 변이체를 포함한다. 용어 "변이체"는 모든 돌연변이, 스플라이스 변이체, 번역 후 변형된 변이체, 형태, 이소형, 대립형질 변이체, 종 변이체 및 종 상동체, 특히 자연적으로 발생하는 것들을 포함한다. 용어 "변이체"는 특히 아미노산 서열의 단편을 포함한다.

아미노산 삽입 변이체는 특정 아미노산 서열에서 단일 또는 2개 이상의 아미노산 삽입을 포함한다. 삽입을 갖는 아미노산 서열 변이체의 경우, 하나 이상의 아미노산 잔기가 아미노산 서열의 특정 부위에 삽입되지만, 결과물의 적절한 스크리닝을 통한 무작위 삽입도 가능하다. 아미노산 부가 변이체는 1개, 2개, 3개, 5개, 10개, 20개, 30개, 50개 이상의 아미노산과 같은 하나 이상의 아미노산의 아미노- 및/또는 카르복시-말단 융합을 포함한다. 아미노산 결실 변이체는 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50개 이상의 아미노산을 제거하는 것과 같이 서열로부터 하나 이상의 아미노산을 제거하는 것을 특징으로 한다. 결실은 단백질의 임의의 위치에 있을 수 있다. 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단 말단에서 결실을 포함하는 아미노산 결실 변이체는 또한 N-말단 및/또는 C-말단 절단 변이체로 불린다. 아미노산 치환 변이체는 서열에서 적어도 하나의 잔기가 제거되고 다른 잔기가 그 자리에 삽입되는 것을 특징으로 한다. 상동 단백질 또는 펩타이드 간에 보존되지 않는 아미노산 서열의 위치에 있는 변형 및/또는 아미노산을 유사한 특성을 갖는 다른 것으로 대체하는 것이 바람직하다. 좋기로는, 펩타이드 및 단백질 변이체의 아미노산 변화는 보존적 아미노산 변화, 즉 유사하게 하전되거나 하전되지 않은 아미노산의 치환이다. 보존적 아미노산 변화는 측쇄와 관련된 아미노산 계열 중 하나의 치환을 포함한다. 자연적으로 발생하는 아미노산은 일반적으로 산성(아스파르테이트, 글루타메이트), 염기성(라이신, 아르기닌, 히스티딘), 비극성(알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 비하전 극성(글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신) 아미노산의 4가지 계열로 나뉜다. 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신은 때때로 함께 방향족 아미노산으로 분류된다. 일 구체예에서, 보존적 아미노산 치환은 하기 그룹 내의 치환을 포함한다:

글리신, 알라닌;

발린, 이소류신, 류신;

아스파르트산, 글루탐산;

아스파라긴, 글루타민;

세린, 트레오닌;

라이신, 아르기닌; 및

페닐알라닌, 티로신.

좋기로는 주어진 아미노산 서열과 상기 주어진 아미노산 서열의 변이체인 아미노산 서열 사이의 유사성, 좋기로는 동일성의 정도는 적어도 약 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%일 것이다. 유사성 또는 동일성의 정도는 좋기로는 참조 아미노산 서열의 전체 길이의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 약 100%인 아미노산 영역에 대해 주어진다. 예를 들어, 참조 아미노산 서열이 200개의 아미노산으로 구성되는 경우, 유사성 또는 동일성의 정도는 좋기로는 적어도 약 20, 적어도 약 40, 적어도 약 60, 적어도 약 80, 적어도 약 100, 적어도 약 120, 적어도 약 140, 적어도 약 160, 적어도 약 180, 또는 약 200개 아미노산, 일부 구체예에서 연속 아미노산에 대해 주어진다. 일부 구체예에서, 유사성 또는 동일성의 정도는 참조 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 주어진다. 서열 유사성, 좋기로는 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 좋기로는 최선의 서열 정렬을 사용하여, 예를 들어 Align을 사용하여 표준 설정, 좋기로는 EMBOSS::needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5를 사용하여 당업계에 알려진 도구를 이용하여 수행될 수 있다.

"서열 유사성"은 동일하거나 보존적 아미노산 치환을 나타내는 아미노산의 백분율을 나타낸다. 두 아미노산 서열 간의 "서열 동일성"은 서열 간에 동일한 아미노산의 백분율을 나타낸다. 2개의 핵산 서열 간의 "서열 동일성"은 서열 간에 동일한 뉴클레오타이드의 백분율을 나타낸다.

용어 "% 동일한", "% 동일" 또는 이와 유사한 용어는 특히 비교될 서열 사이의 최적 정렬에서 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 백분율을 나타내는 것으로 의도된다. 상기 백분율은 순전히 통계적이며, 2개의 서열 사이의 차이는 비교될 서열의 전체 길이에 걸쳐 무작위로 분포될 수 있지만 반드시 그런 것은 아니다. 2개의 서열의 비교는 일반적으로 상응하는 서열의 국소 영역을 확인하기 위해 분절 또는 "비교 창"에 대해 최적 정렬 후 서열을 비교함으로써 수행된다. 비교를 위한 최적의 정렬은 수동으로 또는 Smith 및 Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482에 의한 국소 상동성 알고리듬의 도움으로, Neddleman 및 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443에 의한 국소 상동성 알고리듬의 도움으로, Pearson 및 Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 88, 2444에 의한 유사성 조사 알고리듬의 도움으로, 또는 상기 알로리듬들을 이용하는 컴퓨터 프로그램(GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N 및 TFASTA in Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.)의 도움을 받아 결정된다. 일부 구체예에서, 2개 서열의 퍼센트 동일성은 미국 국립 생명공학 정보 센터(NCBI) 웹사이트(예를 들어, blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_ SPEC=blast2seq&LINK_LOC=align2seq)에서 이용 가능한 BLASTN 또는 BLASTP 알고리즘을 사용하여 결정된다. 일부 구체예에서, NCBI 웹사이트에서 BLASTN 알고리즘에 사용되는 알고리즘 매개변수는 다음을 포함한다: (i) 10으로 설정된 예상 임계값; (ii) 28로 설정된 단어 크기; (iii) 0으로 설정된 쿼리 범위의 최대 일치; (iv) 1, -2로 설정된 일치/불일치 점수; (v) 선형으로 설정된 갭 비용; 및 (vi) 사용되는 복잡도가 낮은 영역에 대한 필터. 일부 구체예에서, NCBI 웹사이트에서 BLASTP 알고리즘에 사용되는 알고리즘 매개변수는 다음을 포함한다: (i) 10으로 설정된 예상 임계값; (ii) 3으로 설정된 단어 크기; (iii) 0으로 설정된 쿼리 범위의 최대 일치; (iv) BLOSUM62로 설정된 매트릭스; (v) 존재로 설정된 갭 비용: 11 확장: 1; 및 (vi) 조건부 구성 점수 매트릭스 조정.

백분율 동일성은 비교할 서열이 대응하는 동일한 위치의 수를 결정하고 이 수를 비교된 위치의 수(예컨대 참조 서열의 위치 수)로 나누고 이 결과에 100을 곱하여 얻는다.

일부 구체예에서, 유사성 또는 동일성의 정도는 참조 서열의 전체 길이의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 약 100%인 영역에 대해 주어진다. 예를 들어, 참조 핵산 서열이 200개의 뉴클레오타이드로 구성된 경우, 동일성 정도는 적어도 약 100, 적어도 약 120, 적어도 약 140, 적어도 약 160, 적어도 약 180, 또는 약 200개 뉴클레오타이드, 일부 구체예에서 연속 뉴클레오타이드에 대해 주어진다. 일부 구체예에서, 유사성 또는 동일성의 정도는 참조 서열의 전체 길이에 대해 주어진다.

상동 아미노산 서열은 본 개시내용에 따라 아미노산 잔기의 적어도 40%, 특히 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 및 좋기로는 적어도 95%, 적어도 98 또는 적어도 99% 동일성을 나타낸다.

본원에 기재된 아미노산 서열 변이체는 예를 들어 재조합 DNA 조작에 의해 당업자에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 치환, 부가, 삽입 또는 결실을 갖는 펩타이드 또는 단백질을 제조하기 위한 DNA 서열의 조작은 예컨대 Sambrook et al. (1989)에 설명되어 있다. 또한, 본원에 기재된 펩타이드 및 아미노산 변이체는 예를 들어 고상 합성 및 유사한 방법과 같은 공지된 펩타이드 합성 기술의 도움으로 쉽게 제조될 수 있다.

일 구체예에서, 아미노산 서열(펩타이드 또는 단백질)의 단편 또는 변이체는 좋기로는 "기능적 단편" 또는 "기능적 변이체"이다. 아미노산 서열의 "기능적 단편" 또는 "기능적 변이체"라는 용어는 이것이 유래된, 즉 기능적으로 동등한 아미노산 서열의 기능적 특성과 동일하거나 유사한 하나 이상의 기능적 특성을 나타내는 임의의 단편 또는 변이체에 관한 것이다. 항체와 같은 결합제의 서열과 관련하여, 하나의 특정 기능은 단편 또는 변이체가 유래된 아미노산 서열에 의해 나타나는 하나 이상의 결합 활성이다. 본원에서 사용되는 용어 "기능적 단편" 또는 "기능적 변이체"는 특히 모 분자 또는 서열의 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산이 변경되면서, 예컨대 표적 분자에 대한 결합과 같은 면역 반응과 같은 모 분자 또는 서열의 기능 중 하나 이상을 여전히 수행할 수 있는 아미노산 서열을 포함하는 변이체 분자 또는 서열을 지칭한다. 일 구체예에서, 모 분자 또는 서열의 아미노산 서열에서의 변형은 그 분자 또는 서열의 특성에 유의미한 영향을 미치거나 변경하지 않는다. 다른 구체예에서, 기능적 단편 또는 기능적 변이체의 기능은 감소될 수 있지만 여전히 유의미하게 존재할 수 있으며, 예컨대 기능적 변이체의 결합은 모 분자 서열의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%일 수 있다. 그러나, 다른 구체예에서, 기능적 단편 또는 기능적 변이체의 결합은 모 분자 또는 서열에 비해 향상될 수 있다.

지정된 아미노산 서열(펩타이드, 단백질 또는 폴리펩타이드)로부터 "유래된(derived from)" 아미노산 서열(펩타이드, 단백질 또는 폴리펩타이드)은 첫 번째 아미노산 서열의 기원을 의미한다. 좋기로는, 특정 아미노산 서열로부터 유도된 아미노산 서열은 그 특정 서열 또는 이의 단편과 동일하거나 본질적으로 동일하거나 상동인 아미노산 서열을 갖는다. 특정 아미노산 서열로부터 유도된 아미노산 서열은 그 특정 서열의 변이체 또는 이의 단편일 수 있다. 예를 들어, 본원에서 사용하기에 적합한 서열은 원하는 활성을 유지하면서, 이들이 유래된 자연발생적인 또는 천연 서열과 서열이 달라지도록 변경될 수 있음을 당업자는 이해할 것이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "지침 자료" 또는 "지침서"는 본 발명의 조성물 및 방법의 유용성을 전달하기 위해 사용될 수 있는 간행물, 기록물, 다이어그램 또는 임의의 다른 표현 매체를 포함한다. 본 발명의 키트의 교육 자료는 예를 들어 본 발명의 조성물을 함유하는 용기에 부착되거나 조성물을 함유하는 용기와 함께 수송될 수 있다. 대안적으로, 교육 자료는 수용자가 교육 자료와 구성물을 협력적으로 사용할 의도로 컨테이너와 별도로 배송될 수 있다.

"단리된(isolated)"은 자연 상태에서 변경되거나 제거된 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 자연적으로 존재하는 핵산 또는 펩타이드는 "단리된" 것이 아니며, 자연 상태의 공존하는 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 동일한 핵산 또는 펩타이드는 "단리된" 것이다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 예를 들어 숙주 세포와 같은 비천연 환경에 존재할 수 있다.

본 발명의 맥락에서 용어 "재조합"은 "유전공학을 통해 만들어진"을 의미한다. 좋기로는, 본 발명의 맥락에서 재조합 핵산과 같은 "재조합 개체"는 자연적으로 발생하지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 "자연적으로 발생하는/자연발생적인"이라는 용어는 개체가 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 의미한다. 예를 들어, 유기체(바이러스 포함)에 존재하고 자연의 공급원으로부터 단리될 수 있으며 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않은 펩타이드 또는 핵산은 자연발생적이다.

본원에서 사용되는 "생리학적 pH"는 약 7.5의 pH를 의미한다.

"유전적 변형" 또는 간단히 "변형"이라는 용어는 핵산으로 세포를 형질감염시키는 것을 포함한다. "형질감염"이라는 용어는 핵산, 특히 RNA를 세포에 도입하는 것과 관련이 있다. 본 발명의 목적을 위해, 용어 "형질감염"은 또한 핵산을 세포로 도입하는 것 또는 이러한 세포에 의한 핵산의 흡수를 포함하며, 여기서 세포는 대상체, 예를 들어 환자에 존재할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면, 본원에 기술된 핵산의 형질감염을 위한 세포는 시험관내 또는 생체내에 존재할 수 있고, 예를 들어, 세포는 환자의 장기, 조직 및/또는 유기체의 일부를 형성할 수 있다. 본 발명에 따르면, 형질감염은 일시적이거나 안정적일 수 있다. 형질감염의 일부 응용 분야에서 형질감염된 유전 물질은 일시적으로만 발현된다면 충분하다. RNA는 인코딩된 단백질을 일시적으로 발현하기 위해 세포에 형질감염될 수 있다. 형질감염 과정에서 도입된 핵산은 일반적으로 핵 게놈에 통합되지 않기 때문에 외부 핵산은 유사분열을 통해 희석되거나 분해된다. 핵산의 에피좀 증폭을 허용하는 세포는 희석률을 크게 감소시킨다. 형질감염된 핵산이 실제로 세포 및 그 딸세포의 게놈에 남아있는 것이 바람직하다면, 안정적인 형질감염이 일어나야 한다. 이러한 안정적인 형질감염은 형질감염을 위해 바이러스 기반 시스템 또는 트랜스포존 기반 시스템을 사용하여 달성할 수 있다. 일반적으로 항체와 같은 결합제를 인코딩하는 핵산은 일시적으로 세포에 형질감염된다. RNA는 인코딩된 단백질을 일시적으로 발현하기 위해 세포에 형질감염될 수 있다.

코로나바이러스

코로나바이러스는 외피가 있는 양성-센스 단일 가닥 RNA((+) ssRNA) 바이러스이다. 이들은 알려진 RNA 바이러스 중에서 가장 큰 게놈(26-32 kb)을 가지고 있으며 계통발생학적으로 4개의 속(α, β, γ 및 δ)으로 나뉘며, 베타코로나바이러스는 다시 4개의 계통(A, B, C 및 D)으로 세분된다. 코로나바이러스는 인간을 포함한 광범위한 조류 및 포유류 종을 감염시킨다. 일부 인간 코로나바이러스는 일반적으로 경미한 호흡기 질환을 유발하지만 영유아, 노인 및 면역력이 약한 사람에게는 중증도가 더 높을 수 있다. 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)와 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV)는 각각 베타코로나바이러스 계통 C와 B에 속하며 병원성이 매우 높다. 두 바이러스 모두 지난 15년 이내에 동물 보유숙주로부터 인간 집단으로 출현했으며 높은 치사율로 발병하였다. 비정형 폐렴(코로나바이러스 질병 2019; COVID-19)을 유발하는 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)의 발생은 2019년 12월 중순 이후 중국에서 격렬해졌으며 국제적 우려 속에 관심 공중보건 비상사태에 직면하게 되었다. SARS-CoV-2(MN908947.3)는 베타코로나바이러스 계통 B에 속한다. 이것은 SARS-CoV와 최소 70%의 서열 유사성을 갖는다.

일반적으로 코로나바이러스는 외피(E), 막(M), 뉴클레오캡시드(N) 및 스파이크(S)의 네 가지 구조 단백질을 가지고 있다. E 및 M 단백질은 바이러스 어셈블리에서 중요한 기능을 가지며 N 단백질은 바이러스 RNA 합성에 필요하다. 중요한 당단백질 S는 바이러스 결합 및 표적 세포로의 진입을 담당한다. S 단백질은 생산 세포에서 퓨린 유사 숙주 프로테아제에 의해 두 개의 비공유 결합 서브유닛인 S1 및 S2로 절단되는 단일 사슬 비활성 전구체로 합성된다. S1 서브유닛은 숙주 세포 수용체를 인식하는 수용체 결합 도메인(RBD)을 포함한다. S2 서브유닛은 융합 펩타이드, 2개의 헵타드 반복 및 막관통 도메인을 포함하며, 이들 모두는 대규모 구조적 재배열을 거쳐 바이러스 및 숙주 세포 막의 융합을 매개하는 데 필요하다. S1 및 S2 서브유닛체는 삼량체화하여 커다란 융합전(prefusion) 스파이크를 형성한다.

SARS-CoV-2의 S 전구체 단백질은 단백질 분해에 의해 절단되어 S1(685aa) 및 S2(588aa) 서브유닛으로 될 수 있다. S1 서브유닛은 숙주 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2) 수용체를 통해 민감한 세포로 바이러스 유입을 매개하는 수용체 결합 도메인(RBD)을 포함한다. "RBD 도메인"은 일반적으로 SEQ ID NO: 197의 아미노산 327 내지 528의 아미노산 서열을 포함한다.

결합제

본 개시내용은 코로나바이러스 스파이크 단백질(S 단백질)의 에피토프에 결합할 수 있는 단일특이적, 2가 항체와 같은 항체를 기술한다. 또한, 본 개시내용은 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 또는 다중특이적 결합제를 기술하며, 여기서 제1 결합 도메인은 코로나바이러스 스파이크 단백질(S 단백질)에 결합할 수 있고 제2 결합 도메인은 코로나바이러스 S에 결합할 수 있으며, 여기서 제1 및 제2 결합 도메인은 코로나바이러스 S 단백질의 상이한 에피토프에 결합한다. 본원에 기재된 항체를 포함하는 결합제는 특히 코로나바이러스 S 단백질의 RBD 도메인에 결합한다.

일 구체예에서, 본원에 기술된 결합제 또는 항체는 분리된다. 일 구체예에서, 본원에 기술된 결합제 또는 항체는 재조합 분자이다.

"에피토프"라는 용어는 결합제에 의해 인식되는 코로나바이러스 S 단백질과 같은 분자 또는 항원의 일부 또는 단편을 의미한다. 예를 들어, 에피토프는 항체 또는 임의의 다른 결합 단백질에 의해 인식될 수 있다. 에피토프는 항원의 연속적 또는 불연속적 부분을 포함할 수 있고 약 5 내지 약 100개, 예를 들어 약 5 내지 약 50개, 보다 좋기로는 약 8 내지 약 30개, 가장 좋기로는 약 8 내지 약 25개의 아미노산 길이일 수 있다. 예를 들어, 에피토프는 좋기로는 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 아미노산 길이일 수 있다. 일 구체예에서, 에피토프는 길이가 약 10 내지 약 25개 아미노산이다. 용어 "에피토프"는 구조적 에피토프를 포함한다.

용어 "면역글로불린"은 두 쌍의 폴리펩타이드 사슬, 한 쌍의 저분자량 경쇄(L) 및 한 쌍의 중쇄(H)로 구성된 구조적으로 관련된 당단백질 부류를 말하며, 4개 모두 이황화 결합으로 상호 연결되어 있다. 면역글로불린의 구조는 잘 규명되어 있다. 예를 들어 기초 면역학 Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, NY (1989)). 간략하게, 각각의 중쇄는 전형적으로 중쇄 가변 영역(본원에서는 V_H 또는 VH로 약칭함)및 중쇄 불변 영역(본원에서는 C_H또는 CH로 약칭함)으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 전형적으로 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 힌지 영역은 중쇄의 CH1과 CH2 도메인 사이의 영역으로 매우 유연하다. 힌지 영역의 이황화 결합은 IgG 분자의 두 중쇄 간 상호작용의 일부이다. 각각의 경쇄는 전형적으로 경쇄 가변 영역(본원에서는 V_L 또는 VL로 약칭함)및 경쇄 불변 영역(본원에서는 C_L 또는 CL로 약칭함)으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 전형적으로 하나의 도메인인 CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 초가변 영역(또는 서열 및/또는 구조적으로 정의된 루프의 형태가 초가변 영역일 수 있는 초가변 영역)으로 추가로 세분될 수 있으며, 상보성 결정 영역(CDR)이라고도 하며, 프레임워크 영역(FR)이라 칭하는, 보다 보존된 영역이 산재되어 있다. 각각의 VH 및 VL은 전형적으로 다음 순서로 아미노 말단에서 카르복시 말단으로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4(Chothia 및 Lesk J. Mol. Biol. 196, 901-917 (1987) 참조). 달리 언급되거나 문맥상 모순되지 않는 한, 본 발명에서 불변 영역의 아미노산 위치에 대한 언급은 EU 번호에 따른다(Edelman et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1969 May;63(1):78-85; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. 1991 NIH Publication No. 91-3242). 일반적으로, 본원에 기술된 CDR은 Kabat 정의된 것이다.

본 발명에서 사용된 용어 "... 위치에 상응하는 아미노산"은 인간 IgG1 중쇄의 아미노산 위치 번호를 가리킨다. 다른 면역글로불린의 상응하는 아미노산 위치는 인간 IgG1과 정렬하여 찾을 수 있다. 따라서, 다른 서열의 아미노산 또는 세그먼트에 "상응하는" 한 서열의 아미노산 또는 세그먼트는 ALIGN, ClustalW 또는 이와 유사한 것과 같은 표준 서열 정렬 프로그램을 사용하여 다른 아미노산 또는 세그먼트와 일반적으로 디폴트 세팅으로 정렬된, 그리고 인간 IgG1 중쇄와 50% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상의 동일성을 갖는 것이다. 서열 또는 서열 내의 세그먼트를 정렬하여 서열 내의 상응하는 위치를 본 발명에 따른 아미노산 위치로 결정하는 방법은 당업계에 널리 공지된 것으로 간주된다.

본 발명의 맥락에서 용어 "항체"(Ab)는 항원에 결합하는, 좋기로는 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 면역글로불린 분자, 면역글로불린 분자의 단편 또는 이들의 유도체를 지칭한다. 일 구체예에서, 결합은 적어도 약 30분, 적어도 약 45분, 적어도 약 1시간, 적어도 약 2시간, 적어도 약 4시간, 적어도 약 8시간, 적어도 약 12시간, 약 24시간 이상, 약 48시간 이상, 약 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 이상, 또는 기능적으로-정의된 임의의 다른 - 하당한 기간(예컨대 항원에 대한 항체 결합과 관련된 생리학적 반응을 유도, 촉진, 향상 및/또는 조절하기에 충분한 시간)과 같은 상당한 기간의 반감기를 갖는 전형적인 생리학적 조건 하에 일어난다. 면역글로불린 분자의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에는 항원과 상호작용하는 결합 도메인이 포함되어 있다. 본원에서 사용되는 용어 "항원-결합 영역", "결합 영역" 또는 "결합 도메인"은 항원과 상호작용하고 전형적으로 VH 영역 및 VL 영역 모두를 포함하는 영역 또는 도메인을 지칭한다. 본원에서 항체라는 용어는 단일특이성 항체뿐만 아니라 다수, 예를 들어 2개 이상, 예를 들어 3개 이상의, 상이한 항원-결합 영역을 포함하는 다중특이성 항체를 포함한다. 항체(Abs)의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(이펙터 세포와 같은) 및 보체 활성화의 고전적 경로에서 제1 성분인 C1q와 같은 보체 시스템의 구성요소를 비롯한, 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 전술한 바와 같이, 본원에서 사용되는 항체라는 용어는 달리 언급되지 않거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 항원-결합 단편인 항체의 단편, 즉 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체 단편, 및 항체 유도체, 즉, 항체에서 파생된 작제물을 포함한다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있음이 밝혀졌다. "항체"라는 용어에 포함되는 항원 결합 단편의 예에는 다음이 포함된다: (i) Fab' 또는 Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편, 또는 WO2007059782(Genmab)에 설명된 1가 항체; (ii) F(ab')₂단편, 힌지 영역에서 이황화 브리지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) 본질적으로 VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 본질적으로 구성된 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 본질적으로 구성되고, 도메인 항체(Holt et al; Trends Biotechnol -. 2003 Nov; 21(11):484-90)라고도 칭해지는 dAb 단편(Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989); (vi) 카멜리드(camelid) 또는 나노바디 분자(Revets et al; Expert Opin Biol Ther. 2005 Jan; 5(1):111-24) 및 (vii) 분리된 상보성 결정 영역(CDR). 또한, Fv 단편의 두 도메인인 VL과 VH는 별도의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들을 단일 단백질 사슬(단일 사슬 항체 또는 단일 사슬 Fv(scFv)로 알려짐)(여기서 VL 및 VH 영역은 쌍을 이루어 1가 분자를 형성함)로서 만들어질 수 있도록 하는 합성 링커에 의한 재조합 방법을 사용하여 연결될 수 있다. 예를 들어 문헌 [Bird et al., Science 242, 423-426 (1988) and Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988)] 참조. 이러한 단일 사슬 항체는 문맥상 달리 언급되거나 명확하게 나타내지 않는 한 항체라는 용어에 포함된다. 이러한 단편은 일반적으로 항체의 의미 내에 포함되지만, 이들은 총체적으로 그리고 각각 독립적으로 상이한 생물학적 특성 및 유용성을 나타내는 본 발명의 독특한 특징이다. 본 발명의 맥락에서 이들 및 다른 유용한 항체 단편뿐만 아니라 이러한 단편의 이중특이적 형식은 본원에서 추가로 논의된다. 달리 명시되지 않는 한 항체라는 용어는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체(mAb), 키메라 항체 및 인간화 항체와 같은 항체 유사 폴리펩타이드 및 효소 절단, 펩타이드 합성 및 재조합 기술과 같은 임의의 공지된 기술에 의해 제공되는, 항원(항원-결합 단편)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체 단편도 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

"단일 사슬 Fv" 또는 "scFv"라는 어구는 전통적인 2개 사슬 항체의 중쇄 및 경쇄(VH 및 VL)의 가변 도메인이 결합되어 하나의 사슬을 형성한 항체를 의미한다. 선택적으로 링커(일반적으로 펩타이드)가 두 사슬 사이에 삽입되어 활성 결합 부위의 적절한 폴딩 및 생성을 허용한다.

항체는 모든 이소형(isotype)을 가질 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 인코딩되는 면역글로불린 부류(예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE 또는 IgM)를 의미한다. 특정 이소형, 예를 들어 IgG1이 본원에서 언급될 때, 이 용어는 특정 이소형 서열, 예를 들어 특정 IgG1 서열로 제한되지 않으며, 항체가 다른 이소형보다 그 이소형, 예를 들어 IgG1에 서열상 보다 더 가깝다는 것을 나타내기 위해 사용된다. 따라서, 예를 들어 본 발명의 IgG1 항체는 불변 영역의 변이를 포함하는 천연 발생 IgG1 항체의 서열 변이체일 수 있다. (즉, IgG1, κ, λ), IgG2a 항체(예컨대 IgG2a, κ, λ), IgG2b 항체(예컨대 IgG2b, κ, λ), IgG3 항체(예컨대 IgG3, κ, λ) 또는 IgG4 항체(예컨대 IgG4, κ, λ).

본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 단일 분자 조성의 항체 분자 제제를 의미한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다. 따라서, 용어 "인간 모노클로날 항체"는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 지칭한다. 인간 모노클로날 항체는 인간 중쇄 형질전환유전자 및 불멸 세포에 융합된, 경쇄 형질전환유전자를 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 마우스와 같은 트랜스제닉 또는 트랜스염색체 비인간 동물로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생성될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "키메라 항체"는 가변 영역이 비-인간 종(예를 들어, 설치류로부터 유래)으로부터 유래되고 불변 영역이 인간과 같은 상이한 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다. 항체 면역원성을 감소시키기 위해 치료용 키메라 모노클로날 항체가 개발되었다. 키메라 항체와 관련하여 사용되는 용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 모두의 CDR 및 프레임워크 영역을 포함하는 영역을 의미한다. 키메라 항체는 문헌 [Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Ch. 15]에 설명된 표준 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다. 키메라 항체는 유전적으로 또는 효소적으로 조작된 재조합 항체일 수 있다. 키메라 항체를 생성하는 것은 당업자의 지식 범위 내에 있으며, 따라서 본 발명에 따른 키메라 항체의 생성은 본원에 기술된 것 이외의 다른 방법에 의해 수행될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "인간화 항체"는 인간 항체 불변 도메인 및 인간 가변 도메인에 대해 높은 수준의 서열 상동성을 포함하도록 변형된 비인간 가변 도메인을 함유하는 유전자 조작된 비인간 항체를 지칭한다. 이는 항원 결합 부위를 함께 형성하는 6개의 비인간 항체 상보성 결정 영역(CDR)을 상동 인간 수용자 프레임워크 영역(FR)에 이식함으로써 달성될 수 있다(WO92/22653 및 EP0629240 참조). 모 항체의 결합 친화도 및 특이성을 완전히 재구성하기 위해, 모 항체(즉, 비인간 항체)로부터의 프레임워크 잔기의 인간 프레임워크 영역으로의 치환(역돌연변이)이 필요할 수 있다. 구조 상동성 모델링은 항체의 결합 특성에 중요한 프레임워크 영역의 아미노산 잔기를 확인하는 데 도움이 될 수 있다. 따라서, 인간화 항체는 비인간 CDR 서열, 비인간 아미노산 서열에 대한 하나 이상의 아미노산 역돌연변이를 선택적으로 포함하는 주로 인간 프레임워크 영역, 및 완전 인간 불변 영역을 포함할 수 있다. 선택적으로, 반드시 역돌연변이가 아닐 수 있는 추가 아미노산 변형을 적용하여 친화도 및 생화학적 특성과 같은 바람직한 특성을 가진 인간화 항체를 얻을 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "인간 항체"는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 인코딩되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이 유발 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이). 그러나, 본원에서 사용되는 용어 "인간 항체"는 마우스 또는 래트와 같은 다른 포유동물 종의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 이식된 항체를 포함하는 것으로는 의도되지 않는다. 인간 모노클로날 항체는 종래의 모노클로날 항체 방법론, 예를 들어 Kohler 및 Milstein의 표준 체세포 혼성화 기술(Nature 256: 495 (1975))을 비롯한 다양한 기술에 의해 생성될 수 있다. 체세포 혼성화 절차가 바람직하지만, 원칙적으로는 모노클로날 항체를 생산하기 위한 다른 기술, 예를 들어 B-림프구의 바이러스 또는 발암성 형질전환 또는 인간 항체 유전자의 라이브러리를 사용하는 파지 디스플레이 기술을 사용할 수 있다. 인간 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 제조하기 위한 적합한 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 마우스에서 하이브리도마 생산은 매우 잘 확립된 절차이다. 융합을 위한 면역화된 비장세포의 분리를 위한 면역화 프로토콜 및 기술은 당업계에 공지되어 있다. 융합 파트너(예컨대 뮤린 골수종 세포) 및 융합 절차도 알려져 있다. 따라서 인간 모노클로날 항체는 예를 들어 마우스 또는 래트 시스템이 아닌 인간 면역 시스템의 일부를 보유하는 트랜스제닉 또는 트랜스염색체 마우스 또는 래트를 사용하여 생성될 수 있다. 따라서, 일 구체예에서, 인간 항체는 동물 면역글로불린 서열 대신에 인간 생식계열 면역글로불린 서열을 보유하는 마우스 또는 래트와 같은 트랜스제닉 동물로부터 수득된다. 이러한 구체예에서, 항체는 동물에 도입된 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래하지만, 최종 항체 서열은 내인성 동물 항체 기구에 의한 체세포 초돌연변이 및 친화성 성숙에 의해 추가로 변형되는 상기 인간 생식계열 면역글로불린 서열의 결과이다(예를 들어 문헌 [Mendez et al. 1997 Nat Genet. 15(2):146-56] 참조.

본원에서 사용될 때, 문맥에 의해 모순되지 않는 한, 용어 "Fab-아암", "결합 아암" 또는 "아암"은 하나의 중쇄-경쇄 쌍을 포함하고 본원에서 "반분자(half-molecule)"와 상호교환적으로 사용된다.

항체와 관련하여 사용될 때 "전장"이라는 용어는 항체가 단편이 아니라 자연에서 해당 이소형에 대해 일반적으로 발견되는 특정 이소형의 모든 도메인, 예를 들어 IgG1 항체의 경우 VH, CH1, CH2, CH3, 힌지, VL 및 CL 도메인을 함유한다는 맥락으로 사용된다.

본원에서 사용될 때, 문맥에 의해 모순되지 않는 한, 용어 "Fc 영역"은 면역글로불린 중쇄의 2개의 Fc 서열로 구성된 항체 영역을 지칭하며, 상기 Fc 서열은 적어도 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다.

항체가 소정의 항원 또는 에피토프에 결합하는 맥락에서 본원에 사용된 용어 "결합" 또는 "결합할 수 있는"은 Bio-Layer Interferometry(BLI)로 측정시, 또는 예컨대 항원을 리간드로 사용하고 항체를 분석물로 사용하는 BIAcore 3000 장비에서 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기술을 사용하여 측정시, 전형적으로 약 10^-7 M 이하, 예컨대 약 10^-8M 이하, 예컨대 약 10^-9 M 이하, 약 10^-10 M 이하, 또는 약 10^-11 M 이하의 K_D에 상응하는 친화성을 갖는 결합이다. 항체는 소정의 항원 또는 밀접하게 관련된 항원 이외의 비특이적 항원(예컨대, BSA, 카제인)에 대한 결합 친화도보다 적어도 10배, 예컨대 적어도 100배, 예컨대 적어도 1,000배, 예컨대 적어도 10,000배, 예컨대 적어도 100,000배 더 낮은 K_D에 해당하는 친화도로 소정의 항원에 결합한다. 친화력이 더 낮은 양은 항체의 K_D에 따라 다르므로 항체의 K_D가 매우 낮으면 (즉, 항체가 매우 특이적일 때), 항원에 대한 친화성의 정도는 비특이적 항원에 대한 친화도보다 적어도 10,000배 더 낮을 수 있다.

본원에서 용어 "k_d"(sec^-1)는, 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도 상수를 의미한다. 상기 값은 또한 k_off값으로도 지칭된다.

본원에서 용어 "K_D"(M)는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 의미한다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 항체의 VL 영역, VH 영역 또는 하나 이상의 CDR의 기능적 변이체를 포함하는 항체를 구상한다. 항체와 관련하여 사용되는 VL, VH 또는 CDR의 기능적 변이체는 "참조" 또는 "모" 항체의 친화도 및/또는 특이성/선택성을 여전히 적어도 상당한 비율(적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상)로 유지하며 일부 경우, 이러한 항체는 모 항체보다 더 큰 친화성, 선택성 및/또는 특이성과 연관될 수 있다.

그러한 기능적 변이체는 전형적으로 모 항체에 대해 상당한 서열 동일성을 유지한다.

예시적인 변이체는 모 항체 서열의 VH 및/또는 VL 및/또는 CDR 영역과 주로 보존적 치환이 다른 것들을 포함하고; 예를 들어, 변이체에서 치환의 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개와 같이 최대 10개는 보존적 아미노산 잔기 대체이다.

VL 영역 또는 VH 영역과 같은 본원에 기재된 항체 서열의 기능적 변이체, 또는 VL 영역 또는 VH 영역과 같은 본원에 기재된 항체 서열에 대해 어느 정도의 상동성 또는 동일성을 갖는 항체 서열은 좋기로는 비-CDR에서의 변형 또는 변이를 포함하는 한편, CDR 서열은 변경되지 않고 유지되는 것이 바람직하다.

본원에서 사용된 "특이성"이라는 용어는 문맥상 모순되지 않는 한 다음과 같은 의미를 갖는 것으로 의도된다. 두 개의 항체가 동일한 항원과 동일한 에피토프에 결합하는 경우 이들은 "동일한 특이성"을 갖는다.

용어 "경쟁하다" 및 "경쟁"은 동일한 항원에 대한 제1 항체와 제2 항체 간의 경쟁을 의미할 수 있다. 대안적으로 "경쟁하다" 및 "경쟁"은 항체와 내인성 리간드간의, 내인성 리간드의 상응하는 수용체에 대한 결합을 두고 벌어지는 경쟁을 의미할 수도 있다. 항체가 내인성 리간드와 그 수용체의 결합을 막는 경우, 그러한 항체는 리간드와 그의 수용체의 내인성 상호작용을 차단한다고 말하며 따라서 내인성 리간드와 경쟁한다. 표적 항원에 결합하기 위한 항체의 경쟁을 테스트하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 그러한 방법의 예는 예를 들어 ELISA로서 또는 유세포 분석법에 의해 수행될 수 있는 소위 교차 경쟁 검정이다. 별법으로 경쟁은 생물층 간섭계를 사용하여 결정할 수 있다.

표적 항원에 대한 결합에 대해 경쟁하는 항체는 항원 상의 상이한 에피토프에 결합할 수 있으며, 여기서 에피토프는 서로 너무 가까워서 하나의 에피토프에 결합하는 제1 항체가 다른 에피토프에 대한 제2 항체의 결합을 방지한다. 그러나 다른 상황에서는 두 개의 다른 항체가 항원의 동일한 에피토프에 결합할 수 있으며 경쟁 결합 분석에서 결합을 위해 경쟁할 수 있다. 동일한 에피토프에 결합하는 이러한 항체는 본원에서 동일한 특이성을 갖는 것으로 간주된다. 따라서, 일 구체예에서, 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 표적 분자 상의 동일한 아미노산에 결합하는 것으로 간주된다. 항체가 표적 항원 상의 동일한 에피토프에 결합한다는 것은 당업자에게 공지된 표준 알라닌 스캐닝 실험 또는 항체-항원 결정화 실험에 의해 결정될 수 있다. 좋기로는 코로나바이러스 S 단백질의 다른 에피토프에 결합하는 항체 또는 결합 도메인은 각각의 에피토프에 대한 결합에 있어서는 서로 경쟁하지 않는다.

전술한 바와 같이, 다양한 형태의 항체가 당업계에 설명되어 있다. 본 발명의 결합제는 원칙적으로 임의의 이소형의 항체를 포함할 수 있다. 이소형의 선택은 전형적으로 원하는 Fc-매개 이펙터 기능, 예컨대 ADCC 유도 또는 Fc-매개 이펙터 기능이 없는 항체("비활성" 항체)에 대한 요건에 의해 안내될 것이다. 예시적인 이소형은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4이다. 인간 경쇄 불변 영역, 카파 또는 람다 중 하나를 사용할 수 있다. 본 발명의 항체의 이펙터 기능은 다양한 치료 용도를 위해 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE 또는 IgM 항체로의 이소형 전환에 의해 변경될 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명의 항체의 중쇄 두 개 모두는 IgG1 이소형, 예를 들어 IgG1,κ이다. 임의로, 중쇄는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같이 힌지 및/또는 CH3 영역에서 변형될 수 있다.

좋기로는, 각각의 항원-결합 영역 또는 도메인은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, 여기서 상기 가변 영역은 각각 3개의 CDR 서열인, CDR1, CDR2 및 CDR3을 각각 포함하고, 4개의 프레임워크 서열인, FR1, FR2, FR3 및 FR4를 각각 포함한다. 또한, 좋기로는 항체는 2개의 중쇄 불변 영역(CH) 및 2개의 경쇄 불변 영역(CL)을 포함한다.

일 구체예에서, 결합제는 전장 IgG1 항체와 같은 전장 항체를 포함한다.

다른 구체예에서, 결합제는 항체 단편, 예컨대 Fab' 또는 Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편, WO2007059782(Genmab)에 기재된 바와 같은 1가 항체, F(ab')₂단편, Fd 단편, Fv 단편, dAb 단편, 카멜리드 또는 나노바디, 또는 분리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다.

본 발명의 맥락에서 용어 "결합제"는 원하는 항원에 결합할 수 있는 임의의 제제를 지칭한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 결합제는 항체, 항체 단편, 또는 임의의 다른 결합 단백질, 또는 이들의 임의의 조합이거나 이를 포함한다. 하나의 바람직한 조합은 코로나바이러스 S 단백질의 첫 번째 에피토프에 결합된 항체, 예컨대 전장 항체가, 코로나바이러스 S 단백질의 상이한 에피토프에 결합하는 하나 이상, 예컨대 두 개의 결합 단백질에 특히 공유적으로 커플링된 조합이다. 일 구체예에서, 결합 단백질은 ACE2 단백질의 세포외 도메인(ECD) 또는 그의 변이체, 또는 ACE2 단백질의 ECD 또는 그의 변이체의 단편을 포함한다. 일 구체예에서, 결합 단백질은 scFv와 같은 항체 단편을 포함한다. 결합제는 또한 합성, 변형 또는 비-천연 발생 모이어티, 특히 비펩타이드 모이어티를 포함할 수 있다. 이러한 모이어티는 예를 들어 원하는 항원 결합 기능 또는 항체 또는 항체 단편과 같은 영역을 연결할 수 있다. 일 구체예에서, 결합제는 항원-결합 CDR 또는 가변 영역을 포함하는 합성 작제물이다.

자연적으로 발생하는 항체는 일반적으로 단일 특이성이며, 즉, 이들은 단일 항원에 결합한다. 본 발명은 코로나바이러스 S 단백질 상의 상이한 에피토프에 결합하는 결합제를 제공한다. 이러한 결합제는 적어도 이중특이적 또는 삼중특이성, 사중특이성 등과 같은 다중특이성이다. 따라서, 결합제는 본원에 기재된 바와 같은 2개 이상의 항체 또는 그의 단편을 포함할 수 있다. 특히, 본원에 기재된 결합제는 2개의 상이한 항체, 항체 및 상이한 항체의 단편, 및 2개의 상이한 항체의 단편(2개의 결합 도메인을 형성하는 상기 2개의 상이한 항체의 단편)으로 구성된 인공 단백질일 수 있다.

본 발명에 따르면, 이중특이적 결합제, 특히 이중특이적 단백질, 예컨대 이중특이적 항체는 2개의 상이한 결합 특이성을 가지며 따라서 2개의 에피토프에 결합할 수 있는 분자이다. 특히, 본 명세서에서 용어 "이중특이적 항체"는 2개의 항원 결합 부위, 즉 제1 에피토프에 대한 친화성을 갖는 제1 결합 부위 및 제1 에피토프와 구별되는 제2 에피토프에 대한 결합 친화성을 갖는 제2 결합 부위를 포함하는 항체를 의미한다.

본 발명의 맥락에서 용어 "이중특이적"은 상이한 에피토프, 특히 동일한 항원, 예를 들어 코로나바이러스 S 단백질 상의 상이한 에피토프에 결합하는 2개의 상이한 항원-결합 영역을 갖는 제제를 지칭한다.

"다중특이적 결합제"는 2개 이상의 상이한 결합 특이성을 갖는 분자이다.

이중특이적 항체의 많은 상이한 형식 및 용도가 당업계에 공지되어 있고 검토된 바 있다[Kontermann; Drug Discov Today, 2015 Jul;20(7):838-47 및; MAbs, 2012년 3월-4월;4(2):182-97].

본 발명에 따른 이중특이적 결합제는 임의의 특정 이중특이적 형식 또는 이를 생성하는 방법에 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용될 수 있는 이중특이적 항체 분자의 예에는 (i) 상이한 항원-결합 영역을 포함하는 2개의 아암을 갖는 단일 항체; (ii) 예를 들어 여분의 펩타이드 링커에 의해 나란히 연결된 2개의 scFv를 통해 2개의 상이한 에피토프에 대해 특이성을 갖는 단일 사슬 항체; (iii) 이중 가변 도메인 항체(DVD-Ig), 여기서 각 경쇄 및 중쇄는 짧은 펩타이드 연결을 통해 나란히 두 개의 가변 도메인을 포함함(Wu et al., Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig??) Molecule, In: Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010)); (iv) 화학적으로 연결된 이중특이적 (Fab')2 단편; (v) 각각의 표적 항원에 대해 2개의 결합 부위를 갖는 4가 이중특이적 항체를 생성하는 2개의 단일 사슬 디아바디의 융합체인 Tandab; (vi) 다가 분자를 생성하는 디아바디와 scFv의 조합인 플렉시바디; (vii) Fab에 적용시, 상이한 Fab 단편에 연결된 2개의 동일한 Fab 단편으로 구성된 3가 이중특이적 결합 단백질을 생성할 수 있는, 단백질 키나아제 A의 "다이머화 및 도킹 도메인"에 기반한 소위 "도킹 및 잠금" 분자; (viii) 예를 들어, 인간 Fab-아암의 양쪽 말단에 융합된 2개의 scFv를 포함하는 소위 스콜피온 분자; 및 (ix) 디아바디.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 결합제는 디아바디 또는 크로스바디이다. 일 구체예에서, 본 발명의 결합제는 제어된 Fab-아암 교환(예컨대 WO2011131746(Genmab)에 기술됨)을 통해 수득된 이중특이적 항체이다.

본 발명에 따른 상이한 부류의 결합제의 예는 (i) 헤테로다이머화를 강제하기 위한 상보적 CH3 도메인을 갖는 IgG-유사 분자; (ii) 재조합 IgG-유사 이중 표적화 분자, 여기서 분자의 2개의 측면은 각각 적어도 2개의 상이한 항체의 Fab 단편 또는 Fab 단편의 일부를 함유함; (iii) 전장 IgG 항체가 여분의 Fab 단편 또는 Fab 단편의 일부에 융합된 IgG 융합 분자; (iv) 단일 사슬 Fv 분자 또는 안정화된 디아바디가 중쇄 불변 도메인, Fc 영역 또는 이의 일부에 융합된 Fc 융합 분자; (v) 상이한 Fab-단편이 함께 융합되고, 중쇄 불변-도메인, Fc 영역 또는 그의 일부에 융합된 Fab 융합 분자; 및 (vi) ScFv- 및 디아바디 기반 및 중쇄 항체(예컨대 도메인 항체, 나노바디)로서, 여기서 상이한 단일 사슬 Fv 분자 또는 상이한 디아바디 또는 상이한 중쇄 항체(예컨대 도메인 항체, 나노바디)가 서로 융합되거나 중쇄 불변 도메인, Fc 영역 또는 이의 일부에 융합된 또 다른 단백질 또는 운반체 분자에 융합됨.

상보적인 CH3 도메인 분자를 갖는 IgG 유사 분자의 비제한적인 예로는 Triomab/Quadroma 분자(Trion Pharma/Fresenius Biotech; Roche, WO2011069104), 소위 Knobs-into-Holes 분자(Genentech, WO9850431), CrossMAb(Roche, WO2011117329) 및 정전기적으로 매칭된 분자(Amgen, EP1870459 및 WO2009089004; Chugai, US201000155133; Oncomed, WO2010129304), LUZ-Y 분자(Genentech, Wranik et al. J. Biol. Chem. 2012, 287(52): 43331-9, doi: 10.1074/jbc.M112.397869. Epub 2012 Nov 1), DIG-바디 및 PIG-바디 분자(Pharmabcine, WO2010134666, WO2014081202), Strand Exchange E ngineered Domain body(SEEDbody) 분자(EMD Serono, WO2007110205), Biclonics 분자(Merus, WO2013157953), FcΔAdp 분자(Regeneron, WO201015792), 이중특이적 IgG1 및 IgG2 분자(Pfizer/Rinat, WO11143545), Azymetric 스캐폴드 분자(Zymeworks/Merck, WO2012058768), mAb-Fv 분자(Xencor, WO2011028952), 2가 이중특이적 항체 (WO2009080254) 및 DuoBody® 분자(Genmab, WO2011131746)를 들 수 있다.

재조합 IgG 유사 이중 표적화 분자의 비제한적인 예로는 이중 표적화(DT)-Ig 분자(WO2009058383), 투인원 항체(Genentech; Bostrom, et al 2009. Science 323, 1610-1614.)를 들 수 있다. 가교된 Mabs(Karmanos Cancer Center), mAb2(F-Star, WO2008003116), Zybody 분자(Zy ngenia; LaFleur et al. MAbs. 2013 Mar-Apr;5(2):208-18), 공통 경쇄로 접근(Crucell/Merus, US7,262,028), κλBodies(NovImmune, WO2012023053) 및 CovX-바디(CovX/Pfizer; Doppalapudi, VR, et al 2007. Bioorg. Med. Chem. Lett. 17,501-506.)를 들 수 있다.

IgG 융합 분자의 비제한적인 예로는 이중 가변 도메인(DVD)-Ig 분자(Abbott, US7,612,181), 이중 도메인 이중 머리 항체(Unilever; Sanofi Aventis, WO20100226923), IgG 유사 이중특이적 분자(ImClone/ Eli Lilly, Lewis et al. Nat Biotechnol. 2014 Feb;32(2):191-8), Ts2Ab(MedImmune/AZ; Dimasi et al. J Mol Biol. 2009 Oct 30;393(3):672-92) 및 BsAb 분자(Zymogenetics, WO2010111625), HERCULES 분자(Biogen Idec, US007951918), scFv 융합 분자(Novartis), scFv 융합 분자(Changzhou Adam Biotech Inc, CN 102250246) 및 TvAb 분자(Roche, WO2012025525, WO2012025530)를 들 수 있다.

Fc 융합 분자의 비제한적인 예로는 ScFv/Fc 융합체(Pearce et al., Biochem Mol Biol Int. 1997 Sep;42(6):1179-88), SCORPION 분자(Emergent BioSolutions/Trubion, Blankenship JW, 외 AACR 100th Annual meeting 2009(Abstract # 5465), Zymogenetics/BMS, WO2010111625), Dual Affinity Retargeting Technology(Fc-DART) 분자(MacroGenics, WO2008157379, WO2010080538) 및 Dual(ScFv)2-Fab 분자(National Research 항체 의학 센터-중국)를 들 수 있다.

Fab 융합 이중특이적 항체의 비제한적인 예로는 F(ab)2 분자(Medarex/AMGEN; Deo et al J Immunol. 1998 Feb 15;160(4):1677-86.), Dual-Action 또는 Bis- Fab 분자(Genentech, Bostrom, et al 2009. Science 323, 1610-1614.), Dock-and-Lock(DNL) 분자(ImmunoMedics, WO2003074569, WO2005004809), 2가 이중특이적 분자(Biotecnol, Schoonjans, J Immunol. 2000 Dec 15;165(12):7050-7.) 및 Fab-Fv 분자(UCB-Celltech, WO 2009040562 A1)를 들 수 있다.

ScFv-, 디아바디-기반 및 도메인 항체의 비제한적인 예로는 Bispecific T Cell Engager (BiTE) 분자(Micromet, WO2005061547), Tandem Diabody 분자(TandAb) (Affimed) Le Gall et al., Protein Eng Des Sel. 2004 Apr;17(4):357-66.), Dual Affinity Retargeting Technology (DART) 분자(MacroGenics, WO2008157379, WO2010080538), Single-chain Diabody 분자(Lawrence, FEBS Lett. 1998 Apr 3;425(3): 479-84), TCR-유사 항체(AIT, ReceptorLogics), 인간 혈청 알부민 ScFv 융합(Merrimack, WO2010059315) 및 COMBODY 분자(Epigen Biotech, Zhu et al. Immunol Cell Biol. 2010 Aug;88(6):667-75.), 이중 표적화 나노바디(Ablynx, Hmila et al., FASEB J. 2010) 및 이중 표적화 중쇄 전용 도메인 항체를 들 수 있다.

일 측면에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 제1 CH3 영역을 포함하는 제1 Fc 서열, 및 제2 CH3 영역을 포함하는 제2 Fc 서열을 포함하며, 여기서 제1 및 제2 CH3 영역의 서열은 상이하고 상기 제1 및 제2 CH3 영역 사이의 헤테로다이머 상호작용이 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 각각의 호모다이머 상호작용보다 더 강하다. 이러한 상호작용 및 이들이 달성될 수 있는 방법에 대한 더 자세한 내용은 본원에 참조로 포함된 WO2011131746 및 WO2013060867(Genmab)에 제공되어 있다.

하이브리드 하이브리도마 및 화학적 컨쥬게이션 방법(Marvin and Zhu (2005) Acta Pharmacol Sin 26:649)과 같은 전통적인 방법이 본 발명의 이중특이적 항체의 제조에 사용될 수 있다. 상이한 중쇄 및 경쇄로 구성된 2개의 항체의 숙주 세포에서의 공동-발현은 원하는 이중특이적 항체에 더하여 가능한 항체 생성물의 혼합물을 유도하며, 이는 이후 예를 들어 친화성 크로마토그래피 또는 유사한 방법에 의해 분리될 수 있다.

상이한 항체 작제물의 공동-발현보다, 기능성 이중특이적 산물의 형성을 선호하는 전략, 예를 들어 문헌 [Lindhofer et al. (1995 J Immunol 155:219)에 설명된 방법 역시도 사용가능하다. 상이한 항체를 생성하는 래트 및 마우스 하이브리도마의 융합은 우선적인 종-제한 중쇄/경쇄 페어링 때문에 제한된 수의 헤테로다이머 단백질로 이어진다. 호모다이머보다 헤테로다이머의 형성을 촉진하는 또 다른 전략은 돌기가 첫 번째 중쇄 폴리펩타이드에 도입되고 두 번째 중쇄 폴리펩타이드에 상응하는 공동이 도입되어, 상기 동기가 이들 두 중쇄의 경계면에 있는 공동에 위치할 수 있음으로 해서, 헤테로다이머 형성이 촉진되고 호모다이머 형성은 방해되는, "놉-인투-홀(knob-into hole)" 전략이다. "돌기"는 첫 번째 폴리펩타이드의 인터페이스에서 나온 작은 아미노산 측쇄를 더 큰 측쇄로 교체함으로써 작제된다. 돌출부와 동일하거나 유사한 크기의 상보적인 "공동"은 두 번째 폴리펩타이드의 경계면에 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 측쇄로 교체함으로써 작제된다(미국 특허 5,731,168). EP1870459(Chugai) 및 WO2009089004(Amgen)는 숙주 세포에서 상이한 항체 도메인의 공동-발현 시 헤테로다이머 형성을 선호하는 다른 전략을 기술한다. 이들 방법에서는, 두 개의 CH3 도메인 모두에서 CH3-CH3 계면을 구성하는 하나 이상의 잔기가 하전된 아미노산으로 대체되어, 호모다이머 형성이 정전기적으로 불리하고 헤테로다이머화가 정전기적으로 선호된다. WO2007110205(Merck)는 IgA와 IgG CH3 도메인 간의 차이를 이용하여 헤테로다이머화를 촉진하는 또 다른 전략을 설명한다.

이중특이적 항체를 생성하기 위한 또 다른 시험관내 방법이 WO2008119353(Genmab)에 설명된 바 있으며, 여기서는 환원 조건 하에 인큐베이션시, 2개의 단일특이적 IgG4- 또는 IgG4-유사 항체들 간에 "Fab-아암" 또는 "절반-분자" 교환중쇄와 부착된 경쇄의 교환)에 의해 형성된다. 얻어진 생성물은 상이한 서열을 포함할 수 있는 두 개의 Fab 아암을 갖는 이중특이적 항체이다.

용어 "이중특이적 항체"는 디아바디를 포함한다. 디아바디는 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩타이드 사슬에서 발현되는 2가, 이중특이적 항체이지만, 동일한 사슬 상의 두 도메인 사이의 페어링을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 해당 도메인들이 다른 사슬의 상보적 도메인과 페어링되도록 강제하여, 2개의 항원 결합 부위를 생성한다(예를 들어, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2: 1121-1123 참조). 이중특이적 항체는 또한 이중특이적 단일 사슬 항체를 포함한다. 용어 "이중특이적 단일 사슬 항체"는 2개의 결합 도메인을 포함하는 단일 폴리펩타이드 사슬을 의미한다. 특히, 본 발명에 따른 용어 "이중특이적 단일 사슬 항체" 또는 "단일 사슬 이중특이적 항체" 또는 본 발명에 따른 관련 용어는 좋기로는, 전체 면역글로불린에 존재하는 불변부 및/또는 Fc 부분(들)이 없는 단일 폴리펩타이드 사슬 내의 적어도 두 개의 항체 가변 영역을 연결시킴으로써 생성되는 항체 작제물을 의미한다. 예를 들어, 이중특이적 단일 사슬 항체는 예를 들어 2개의 VH 영역과 같은 총 2개의 항체 가변 영역을 갖는 작제물일 수 있으며, 여기서 이들 두 개의 VH 영역 각각은 별도의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있고 짧은 폴리펩타이드 스페이서를 통해 서로 연결되어 상기 두 개의 항체 가변 영역은 그들의 개재된 스페이서와 함께 단일 연속 폴리펩타이드 사슬로서 존재한다. 이중특이적 단일 사슬 항체의 또 다른 예는 3개의 항체 가변 영역을 갖는 단일 폴리펩타이드 사슬일 수 있다. 여기서, 2개의 항체 가변 영역, 예를 들어 1개의 VH 및 1개의 VL이 scFv를 구성할 수 있으며, 여기서 2개의 항체 가변 영역은 합성 폴리펩타이드 링커를 통해 서로 연결되고, 후자는 종종 단백질 분해에 대한 최대 내성을 유지하면서, 최소 면역원성이 되도록 유전적으로 조작된다. 이 scFv는 특정 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있고, scFv에 의해 결합된 것과 다른 에피토프에 결합할 수 있는 추가 항체 가변 영역, 예를 들어 VH 영역에 연결된다. 이중특이적 단일 사슬 항체의 또 다른 예는 4개의 항체 가변 영역을 갖는 단일 폴리펩타이드 사슬일 수 있다. 여기서, 처음 두 개의 항체 가변 영역, 예를 들어 VH 영역 및 VL 영역은 하나의 에피토프에 결합할 수 있는 하나의 scFv를 형성할 수 있는 반면, 두 번째 VH 영역 및 VL 영역은 다른 에피토프에 결합할 수 있는 두 번째 scFv를 형성할 수 있다. 단일 연속 폴리펩타이드 사슬 내에서, 한 가지 특이성의 개별 항체 가변 영역은 유리하게는 합성 폴리펩타이드 링커에 의해 분리될 수 있는 반면, 각각의 scFv는 상기 기재된 바와 같은 짧은 폴리펩타이드 스페이서에 의해 분리될 수 있는 것이 유리하다. 일 구체예에 따르면, 이중특이적 항체의 제1 결합 도메인은 하나의 항체 가변 도메인, 좋기로는 VHH 도메인을 포함한다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 이중특이적 항체의 제1 결합 도메인은 2개의 항체 가변 도메인, 좋기로는 scFv, 즉 VH-VL 또는 VL-VH를 포함한다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 이중특이적 항체의 제2 결합 도메인은 하나의 항체 가변 도메인, 좋기로는 VHH 도메인을 포함한다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 이중특이적 항체의 제2 결합 도메인은 2개의 항체 가변 도메인, 좋기로는 scFv, 즉 VH-VL 또는 VL-VH를 포함한다. 최소 형태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체에서 항체 가변 영역의 총 수는 따라서 단지 2개이다. 예를 들어, 이러한 항체는 2개의 VH 또는 2개의 VHH 도메인을 포함할 수 있다. 일 구체예에 따르면, 이중특이적 항체의 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인은 각각 하나의 항체 가변 도메인, 좋기로는 VHH 도메인을 포함한다. 일 구체예에 따르면, 이중특이적 항체의 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인은 각각 2개의 항체 가변 도메인, 좋기로는 scFv, 즉 VH-VL 또는 VL-VH를 포함한다. 이 구체예에서, 결합제는 좋기로는 (i) 제1 항체의 중쇄 가변 도메인(VH), (ii) 제1 항체의 경쇄 가변 도메인(VL), (iii) 제2 항체의 중쇄 가변 도메인(VH) 및 (iv) 제2 항체의 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 것이 바람직하다.

일 구체예에서, 본 발명에 따른 이중특이적 분자는 코로나바이러스 S 단백질의 상이한 에피토프에 대해 각각 지시되는 2개의 Fab 영역을 포함한다. 일 구체예에서, 본 발명의 분자는 항원 결합 단편 (Fab)2 복합체이다. Fab2 복합체는 2개의 Fab 단편으로 구성되는데, 하나의 Fab 단편은 코로나바이러스 S 단백질의 하나의 에피토프에 특이적인 Fv 도메인, 즉 VH 및 VL 도메인을 포함하고 다른 Fab 단편은 코로나바이러스 S 단백질의 또 다른 에피토프에 특이적인 Fv 도메인을 포함한다.. 각각의 Fab 단편은 VL-CL 모듈과 VH-CH 모듈의 두 개의 단일 사슬로 구성될 수 있다. 대안적으로, 각각의 개별 Fab 단편 각각은 단일 사슬, 좋기로는 VL-CL-CH-VH로 배열될 수 있고, 개별 가변 및 불변 도메인은 펩타이드 링커로 연결될 수 있다. 일반적으로 개별 단일 사슬 및 Fab 단편은 이황화 결합, 접착 도메인을 통해 연결되거나, 화학적으로 연결되거나 및/또는 펩타이드 링커를 통해 연결될 수 있다. 이중특이적 분자는 또한 2개 초과의 Fab 단편을 포함할 수 있으며, 특히 분자는 Fab3, Fab4, 또는 2, 3, 4개 이상의 상이한 에피토프에 대한 특이성을 갖는 멀티머 Fab 복합체일 수 있다. 본 발명은 또한 화학적으로 연결된 Fab를 포함한다.

일 구체예에서, 본 발명에 따른 결합제는 다양한 유형의 2가 및 3가 단일 사슬 가변 단편(scFv), 2개의 항체의 가변 도메인을 모방하는 융합 단백질을 포함한다. 2가(또는 2가) 단일 사슬 가변 단편(di-scFvs, bi-scFvs)은 2개의 scFv를 연결하여 조작할 수 있다. 이것은 2개의 VH 및 2개의 VL 영역을 갖는 단일 펩타이드 사슬을 생성하여 탠덤 scFv를 생성함으로써 수행될 수 있다. 본 발명은 또한 2개 초과의 scFvs 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 분자를 포함한다. 이는 분자가 다중 항원 특이성을 포함하고 삼중특이성, 사중특이성 또는 다중특이성 분자이거나 분자가 동일한 항원에 대한 특이성을 갖는 하나 이상의 scFv 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 분자임을 가능하게 한다. 특히, 본 발명의 분자는 다중특이적 단일 사슬 Fv일 수 있다.

또 다른 가능성은 2개의 가변 영역이 함께 접히기에는 너무 짧은(약 5개의 아미노산) 링커 펩타이드로 scFv를 생성하여 scFv가 다이머화되도록 하는 것이다. 이 유형은 디아바디로 알려져 있다. 더 짧은 링커(1개 또는 2개의 아미노산)는 트라이머, 소위 트리아바디 또는 트리바디를 형성한다. 테트라바디도 생산되었다. 이들은 디아바디보다 표적에 더 높은 친화력을 보이다.

이중특이적 항체 단편의 특히 바람직한 예는 작은 2가 및 이중특이적 항체 단편인 디아바디(Kipriyanov, Int. J. Cancer 77 (1998), 763-772)이다. 디아바디는 너무 짧아서 동일한 사슬에 있는 두 도메인 사이의 페어링을 허용하지 않는, 펩타이드 링커에 의해 연결된 동일한 폴리펩타이드 사슬(VH-VL) 상의 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 이것은 다른 사슬의 상보적인 도메인과 강제로 페어링하고 두 개의 기능적 항원 결합 부위를 가진 다이머 분자의 조립을 촉진한다.

일 구체예에서, 본 발명에 따른 이중특이적 또는 다중특이적 분자는 면역글로불린의 가변(VH, VL) 및 불변 도메인(C)을 포함한다. 일 구체예에서 이중특이적 분자는 미니바디이며, 좋기로는 각 사슬의 불변 도메인(C)을 통해 서로 연결된 2개의 단일 VH-VL-C 사슬을 포함하는 미니바디이다. 이 측면에 따르면, 상응하는 가변 중쇄 영역(VH), 상응하는 가변 경쇄 영역(VL) 및 불변 도메인(C)은 VH(에피토프 1)-VL(에피토프 1)-(C) 및 VH(에피토프 2)-VL(에피토프 2)-C의 순서로 N-말단에서 C-말단으로 배열되며, 여기서 C는 좋기로는 CH3 도메인이고, 에피토프 1은 코로나바이러스 S 단백질의 첫 번째 에피토프를 나타내고, 에피토프 2는 코로나바이러스 S 단백질의 두 번째 에피토프를 가리킨다. 불변 도메인의 페어링에 의해 미니바디가 형성된다.

또 다른 측면에 따르면, 본 발명의 이중특이적 결합제는 이중특이적 단일 사슬 항체 작제물의 형식이며, 여기서 상기 작제물은 적어도 2개의 결합 도메인을 포함하거나 이로 구성된다. 일 구체예에서, 각각의 결합 도메인은 항체 중쇄로부터의 하나의 가변 영역("VH 영역")을 포함하며, 여기서 제1 결합 도메인의 VH 영역은 코로나바이러스 S 단백질의 에피토프 1에 특이적으로 결합하고, 제2 결합 도메인의 VH 영역은 결합 도메인은 코로나바이러스 S 단백질의 에피토프 2에 특이적으로 결합한다. 2개의 결합 도메인은 짧은 폴리펩타이드 스페이서에 의해 선택적으로 상호 연결된다. 각각의 결합 도메인은 항체 경쇄로부터의 하나의 가변 영역("VL 영역")을 추가로 포함할 수 있으며, 각각의 제1 및 제2 결합 도메인 내의 VH 영역 및 VL 영역은 제1 결합 도메인의 VH 영역 및 VL 영역과 제2 결합 도메인의 VH 영역 및 VL 영역이 서로 페어링하는데 충분히 긴 폴리펩타이드 링커를 통해 서로 연결된다.

일 구체예에서, 본원에 기재된 결합제는 제1 결합 도메인을 포함하는 항체, 예를 들어 전장 항체를 포함한다. 일 구체예에서, 본원에 기재된 결합제는 제1 결합 도메인을 포함하는 항체에 공유 결합된 제2 결합 도메인을 포함하는 scFv와 같은 항체 단편을 포함한다. 일 구체예에서, 결합제는 항체의 경쇄의 N-말단 또는 C-말단에 공유 결합된 scFv와 같은 항체 단편을 포함한다.

일 구체예에서, 본원에 기재된 결합제는 제1 결합 도메인을 포함하는 항체, 예를 들어 전장 항체를 포함한다. 일 구체예에서, 본원에 기술된 결합제는 제1 결합 도메인을 포함하는 항체에 공유적으로 연결된 제2 결합 도메인을 포함하는, ACE2 단백질의 세포외 도메인(ECD) 또는 그의 변이체, 또는 ACE2 단백질의 ECD 또는 그의 변이체의 단편을 포함한다. 일 구체예에서, 결합제는 항체 경쇄의 N-말단 또는 C-말단에 공유 결합된 ACE2 단백질의 세포외 도메인(ECD) 또는 그의 변이체, 또는 ACE2 단백질의 ECD 또는 그의 변이체의 단편을 포함한다.

항체 또는 항체 단편 또는 ACE2 단백질의 세포외 도메인(ECD) 또는 그의 변이체, 또는 ACE2 단백질의 ECD 또는 그의 변이체의 단편은 (Gly4Ser)1, (Gly4Ser)2, (Gly4Ser)3, (Gly4Ser)4 또는 (Gly4Ser)5와 같은 GS-링커에 의해 연결될 수 있다.

안지오텐신 전환 효소 2(ACE2)는 디펩티딜 카르복시펩티다제의 안지오텐신 전환 효소 계열에 속하며 대부분의 장기에 존재하는 막관통 단백질로, 심혈관계, 장, 신장 및 폐에서 가장 높은 수준의 ACE2가 검출된다. 가장 두드러지게 ACE2는 폐 유형 II 폐포 세포, 소장의 장세포, 동맥 및 정맥 내피 세포, 동맥 평활근 세포의 세포막에 부착된다. ACE2는 레닌-안지오텐신 시스템(RAS)의 주요 조절자이며 안지오텐신 전환 효소 1(ACE) 활동에 대한 균형을 잡는 역할을 한다. ACE 활성에 의한 안지오텐신 I의 절단은 강력한 혈관 수축, 염증, 세포 증식, 비대 및 섬유증을 유발하는 안지오텐신 II의 생산을 야기한다. ACE2는 안지오텐신 II의 안지오텐신 1-7로의 절단을 촉매하며, 안지오텐신 1-7 활성은 혈관 확장 및 심장 보호를 촉진하여 안지오텐신 II의 유해한 효과에 대한 균형을 이룬다. 따라서 ACE2는 RAS로 인한 손상으로부터 보호하고 ACE2의 부분적 소실은 심장 질환에 대한 감수성 증가와 관련이 있는 반면, 폐동맥 고혈압 환자에게 재조합 인간 ACE2를 정맥 주사한 임상 시험에서는 혈장 안지오텐신 II/ 안지오텐신 1-7 비율이 감소되어 치료 효과가 나타났다. 또한 ACE2는 폐 손상에서 보호 역할을 하는 것으로 나타났다. 뮤린 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS) 모델은 ACE2 발현의 손실이 혈관 투과성 증가, 폐 부종 증가 및 폐 기능 악화를 초래하는 반면, 촉매 활성 재조합 ACE2 단백질로 치료하자 야생형 및 ACE2 녹아웃 마우스에서 급성 폐 손상의 증상이 개선된 것으로 나타났다. 또한, ACE2 및 레닌-안지오텐신 시스템의 다른 구성 요소는 일단 호흡기 질환 과정이 시작되면 급성 폐 부전의 중증도를 조절하는 데 중심적인 역할을 할 수 있다.

ACE2는 805개 아미노산으로 구성된 유형 I 막관통 단백질이며 짧은 세포질 도메인, 막관통 도메인 및 큰 엑토도메인을 포함한다. ACE2의 촉매 도메인은 엑토도메인의 세포외 도메인(ECD)에서 발견되며, 그 결과 ACE2 활성 부위가 안지오텐신 II와 같은 순환 펩타이드를 대사할 준비가 된다. 인간 ACE2의 세포외 영역은 아연 메탈로펩티다아제 도메인(잔기 19~611)과 C-말단에 위치한 두 번째 도메인(잔기 612~740)의 두 도메인으로 구성된다. 메탈로펩티다제 도메인은 2개의 촉매 서브도메인, 즉 N-말단 서브도메인 I 및 C-말단 서브도메인 II로 더 나뉠 수 있으며, 이 두 서브도메인은 활성 부위 갈라진 틈의 바닥에서 연결된다. 여러 아미노산 잔기가 ACE2 기질 결합 및 활성에 중요한 역할을 하는 것으로 확인되었다. 예를 들어, Arg273은 ACE2 억제제인 MLN-4760의 C-말단과 염다리를 형성하므로 ACE2 기질의 C-말단 결합에 관여하는 것으로 제안된다. Arg273을 글루타민(R273Q)으로 돌연변이시키면 이 위치에서 측쇄의 양전하에서 중성 전하로 변경되어 ACE2 활성이 손실되는데 이는 Arg273의 양전하 측쇄가 기질 결합에 중요함을 보여준다. 또 다른 아미노산 잔기인 His345는 주요 수소 결합 공여체/수용체 역할을 하여 ACE2 활성에서 중요한 역할을 하며 MLN-4760의 C-말단 및 2차 아민 그룹 모두와 수소 결합을 형성하는 것으로 나타났다. His345를 류신(H345L)으로 돌연변이시키면 야생형 ACE2에 비해 활성이 약 300배 감소한다. 마지막으로, 2개의 다른 아미노산 잔기인 His374 및 His378은 아연 배위 구(zinc coordination sphere)를 구성하는 3개의 아미노산 중 2개이므로 ACE2의 아연 결합 부위를 배위하는 데 중요한 역할을 한다.

2003년에 ACE2는 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV-1)의 수용체이자 중증급성호흡기증후군(SARS) 발병의 중요한 인자로 확인되었다. 첫 번째 α- 나선 및 Lys353과 β-시트 5 의 N-말단의 근위 잔기를 포함하는 ACE2 ECD의 영역은 SARS-CoV-1 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD)과 높은 친화력으로 상호 작용한다. SARS-CoV-1 스파이크 단백질과 세포 관련 ACE2 단백질 사이의 이러한 상호 작용은 SARS-CoV-1 활동의 핵심 구성 요소이며 SARS-CoV-1에 의한 인간 기도 상피 감염과 관련이 있다. 또한 SARS-CoV-1과 ACE2의 결합은 SARS-CoV-1 및 ACE2 발산과 함께 ACE2 엔도사이토시스에 의해 세포 표면 ACE2의 감소로 이어져 ACE2 매개 조직 보호의 손실을 초래한다. 신종 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)는 SARS-CoV-1 RBD와 비교할 때 RBD에서 73% 유사성을 나타내며, ACE2에 결합하여 바이러스의 세포 내 진입을 촉진하는 것으로 나타났다. SARS-CoV-1과 유사하게 SARS-CoV-2는 그의 스파이크 단백질의 RBD를 통해 ACE2 단백질에 결합한다. 그러나 SARS-CoV-1과 SARS-CoV-2의 수용체 결합 모티프(RBM) 사이에는 ACE2 결합 능선의 루프 형태에 구조적 차이가 있다. 이러한 구조적 차이로 인해 SARS-CoV-2 RBM에서 Asn487과 Ala475 사이에 추가 주쇄 수소 결합이 형성되어 능선이 더 조밀한 형태를 취하고 Ala475를 포함하는 루프가 ACE2에 더 가깝게 이동한다. 이 차이는 SARS-CoV-1 RBM과 비교할 때 훨씬 더 많은 추가 수소 결합을 통해 SARS-CoV-2 RBM과 ACE2의 N-말단 나선 사이에 더 많은 접촉을 생성한다. 결과적으로 SARS-CoV-1 RBM과 ACE2의 상호작용과 비교하여 SARS-CoV-2 RBM은 더 큰 결합 인터페이스를 형성하고 ACE2와 더 많은 접촉을 형성하며 더 유리한 결합을 형성합니. 몇몇 연구 결과 이것은 SARS-CoV-1 RBM과 비교할 때 ACE2에 대한 결합 친화도가 10-20배 더 높은 것으로 시사되었다.

일 구체예에서, 용어 "ACE2" 또는 "ACE2 단백질"은 인간 ACE2 또는 그의 변이체, 또는 ACE2의 단편 또는 그의 변이체에 관한 것이다. 일 구체예에서, "ACE2" 또는 "ACE2 단백질"은 SEQ ID NO: 130의 아미노산 서열, SEQ ID NO: 130의 아미노산 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 130의 아미노산 서열의 단편, 또는 SEQ ID NO: 130의 아미노산 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열의 단편을 포함한다. 일 구체예에서, "ACE2" 또는 "ACE2 단백질"은 SEQ ID NO: 130의 아미노산 서열을 포함한다.

일 구체예에서, 용어 "ACE2의 세포외 도메인", "ACE2 단백질의 세포외 도메인", "ACE2 세포외 도메인" 또는 유사한 용어는 ACE2의 세포외 도메인 또는 그의 변이체, 또는 ACE2의 세포외 도메인 또는 그의 변이체의 단편에 관한 것이다.

일 구체예에서, "ACE2의 세포외 도메인"이라는 용어는 인간 ACE2의 세포외 도메인 또는 그의 변이체, 또는 인간 ACE2의 세포외 도메인 또는 그의 변이체의 단편에 관한 것이다. 일 구체에서, ACE2의 세포외 도메인은 SEQ ID NO: 130의 아미노산 18 내지 615의 아미노산 서열, SEQ ID NO: 130의 아미노산 18 내지 615의 아미노산 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 130의 아미노산 18 내지 615의 아미노산 서열의 단편, 또는 SEQ ID NO: 130의 아미노산 18 내지 615의 아미노산 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 구체예에서, ACE2의 세포외 도메인은 SEQ ID NO: 130의 아미노산 18 내지 615의 아미노산 서열을 포함한다.

ACE2의 세포외 도메인 또는 그의 변이체, 또는 ACE2의 세포외 도메인 또는 그의 변이체의 단편은 예를 들어 효소 활성 및/또는 기질 결합을 피하는 변형을 포함할 수 있다.

따라서, 일 구체예에서,

ACE2의 세포외 도메인 또는 그의 변이체, 또는 ACE2의 세포외 도메인 또는 그의 변이체의 단편은 상기 ACE2의 세포외 도메인 또는 그의 변이체, 또는 ACE2의 세포외 도메인 또는 그의 변이체의 단편이 효소 활성을 발휘하고/발휘하거나 상기 변형을 포함하지 않는 것을 제외하고는 동일한, ACE2의 세포외 도메인 또는 그의 변이체, 또는 ACE2의 세포외 도메인 또는 그의 변이체의 단편에 비해 덜한 정도로 기질에 결합하도록 변형된다.

변형될 수 있는 아미노산 위치의 예는 위치 R273, H345, H374 및 H378을 포함한다.

따라서, 일 구체예에서, R273, H345, H374 및 H378에 상응하는 적어도 하나의 위치에서의 아미노산은 각각 Q, L, N 및 N일 수 있다. 일 구체예에서, R273, H345, H374 및 H378에 상응하는 위치의 아미노산은 Q, L, N 및 N이다.

한 실시예에서, ACE2의 세포외 도메인은 SEQ ID NO: 129의 아미노산 서열, SEQ ID NO: 129의 아미노산 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 129의 아미노산 서열의 단편, 또는 SEQ ID NO: 129의 아미노산 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 구체예에서, ACE2의 세포외 도메인은 SEQ ID NO: 129의 아미노산 서열을 포함한다.

일 구체예에서, ACE2의 세포외 도메인 또는 그의 변이체, 또는 ACE2의 세포외 도메인 또는 그의 변이체의 단편은 코로나바이러스 S 단백질에 결합한다.

본 발명의 일부 구체예에서, 본 발명에 따른 결합제는 항원-결합 영역에 더하여 2개의 중쇄의 Fc 서열로 구성된 Fc 영역을 포함한다.

제1 및 제2 Fc 서열은 각각 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 이소형일 수 있고, 하나 이상의 돌연변이 또는 변형을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 각각의 제1 및 제2 Fc 서열은 IgG4 이소형의 서열이거나 그로부터 유래하며, 선택적으로 하나 이상의 돌연변이 또는 변형을 갖는다. 다른 구체예에서, 각각의 제1 및 제2 Fc 서열은 IgG1 이소형의 서열이거나 그로부터 유래하며, 선택적으로 하나 이상의 돌연변이 또는 변형을 갖는다. 또 다른 구체예에서, Fc 서열 중 하나는 IgG1 이소형이고 다른 하나는 IgG4 이소형이거나, 선택적으로 하나 이상의 돌연변이 또는 변형을 갖는 이러한 각각의 이소형으로부터 유래된다.

본 발명의 일 구체예에서, 하나 또는 두 가지 모두의 Fc 서열은 이펙터-기능-결핍이다. 예를 들어, Fc 서열(들)은 ADCC와 같은 이펙터 기능을 매개하는 능력이 감소되거나 심지어 제거되도록 돌연변이된 IgG4 이소형 또는 비-IgG4 유형, 예를 들어 IgG1, IgG2 또는 IgG3일 수 있다. 이러한 돌연변이는 예를 들어 문헌 [Dall'Acqua WF et al., J Immunol. 177(2):1129-1138 (2006) and Hezareh M, J Virol.; 75(24):12161-12168 (2001)]에 설명되어 있다. 또 다른 구체예에서, 하나 또는 둘 모두의 Fc 서열은 IgG1 야생형 서열을 포함한다.

본 발명의 맥락에서 용어 "이펙터 기능"은 예를 들어 종양 세포와 같은 질병 세포의 사멸 또는 종양 성장의 억제 및/또는 종양 전파 및 전이의 억제를 포함하는 종양 발달의 억제를 야기하는 면역계의 구성성분에 의해 매개되는 임의의 기능을 포함한다. 좋기로는, 본 발명의 맥락에서 이펙터 기능은 T 세포 매개 이펙터 기능이다. 그러한 기능은 ADCC, ADCP 또는 CDC를 포함한다.

항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)는 세포독성 과립의 내용물의 방출 또는 세포 사멸 유도 분자의 발현을 특징으로 하는 비식세포 과정을 통해 세포독성 이펙터 세포에 의해 항체로 코팅된 표적 세포를 죽이는 것이다. ADCC는 또한 표적을 용해하지만 다른 세포를 필요로 하지 않는 면역 보체 시스템과 독립적이다. ADCC는 면역글로불린(Ig)의 Fc 영역에 결합하는 이펙터 세포 표면에 존재하는 당단백질인 특정 Fc 수용체(FcR)와 표적 결합 항체(IgG 또는 IgA 또는 IgE 클래스에 속함)의 상호작용을 통해 유발된다. ADCC를 매개하는 이펙터 세포에는 자연 살해(NK) 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구, 호산구 및 수지상 세포가 포함된다. ADCC는 그 효능이 여러 매개변수(표적 세포 표면 상의 항원의 밀도 및 안정성; 항체 친화성 및 FcR 결합 친화성)에 따라 달라지는 신속한 이펙터 메커니즘이다. 치료용 항체에 가장 많이 사용되는 IgG 하위 클래스인 인간 IgG1과 관련된 ADCC는 Fc 부분의 글리코실화 프로필과 Fcγ 수용체의 다형성에 크게 의존한다.

항체 의존성 세포 식균작용(ADCP)은 많은 항체 요법의 중요한 작용 메커니즘 중 하나이다. 그것은 항체가 Fc 도메인을 식세포의 특정 수용체에 연결하고 식균 작용을 유도하여 결합된 표적을 제거하는 고도로 조절된 과정으로 정의된다. ADCC와 달리 ADCP는 FcγRIIa, FcγRI, 및 FcγRIIIa를 통해 단핵구, 대식세포, 호중구 및 수지상 세포에 의해 매개될 수 있으며, 이 중 대식세포의 FcγRIIa(CD32a)가 주요 경로를 나타낸다.

보체 의존성 세포독성(CDC)은 항체에 의해 지시될 수 있는 또 다른 세포 살해 방법이다. IgM은 보체 활성화에 가장 효과적인 이소형이다. IgG1과 IgG3은 또한 고전적인 보체 활성화 경로를 통해 CDC를 지시하는 데 매우 효과적이다. 좋기로는, 이 캐스케이드에서 항원-항체 복합체의 형성은 IgG 분자(C1q는 보체 C1의 3개의 하위 구성요소 중 하나임)와 같은 참여 항체 분자의 C_H2 도메인에 매우 근접한 여러 C1q 결합 부위의 클로킹을 해제한다. 좋기로는 이러한 클로킹되지 않은 C1q 결합 부위는 이전의 낮은 친화도의 C1q-IgG 상호작용을, 일련의 다른 보체 단백질이 관여하는 사건을 유발하여, 이펙터 세포 화학주성/활성화제 C3a 및 C5a의 단백질 분해 방출을 유도하는, 높은 결합력 중 하나로 변환시킨다. 좋기로는, 보체 캐스케이드는 세포 안팎으로 물과 용질의 자유로운 통과를 촉진하는 세포막에 기공을 생성하는 막 공격 복합체의 형성으로 종결된다.

본 발명에 따른 항체(선택적으로 이중특이적 또는 다중특이성 결합제의 일부로서)는 Fc 영역에서 변형을 포함할 수 있다. 항체가 이러한 변형을 포함하는 경우, 이는 불활성 또는 비활성화 항체가 될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "비활성", "비활성" 또는 "비활성화"는 적어도 임의의 Fcγ 수용체에 결합할 수 없거나, FcR의 Fc-매개 가교결합을 유도하거나, 개별 항체의 2개의 Fc 영역을 통해 표적 항원의 FcR-매개된 교차 결합을 유도하거나, 또는 C1q에 결합할 수 없는 Fc 영역을 의미한다. 인간화 또는 키메라 CD137 또는 PD-L1 항체의 Fc 영역의 불활성은 단일특이성 형식의 항체를 사용하여 유리하게 테스트된다.

치료용 항체 개발을 위해 Fcγ(감마) 수용체 및 C1q와의 상호작용에 대해 항체의 Fc 영역을 불활성화하기 위해 여러 변이체를 구성할 수 있다. 이러한 변형의 예는 본 명세서에 기술되어 있다.

따라서, 일 구체예에서, 항체는 제1 및 제2 중쇄를 포함하고, 여기서 하나 또는 둘 모두의 중쇄는 항체가 변형되지 않은 제1 및 제2 중쇄를 포함하는 것을 제외하고는 동일한 항체에 비해 Fc-매개 이펙터 기능을 더 적은 정도로 유도하도록 변형된다. 상기 Fc-매개 이펙터 기능은 Fcγ 수용체에 대한 결합, C1q에 대한 결합 또는 FcR의 Fc-매개 가교결합의 유도를 결정함으로써 측정될 수 있다.

일 구체예에서, 중쇄 및 경쇄 불변 서열은 상기 항체에 대한 C1q의 결합이 변형되지 않은 항체와 비교하여 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 100% 만큼 감소되도록 변형된 것이며, 여기서 C1q 결합은 ELISA에 의해 결정된다.

따라서, C1q 및 Fcγ 수용체와의 상호작용에서 지배적인 역할을 하는 Fc 영역의 아미노산이 변형될 수 있다.

예를 들어, IgG1 이소형 항체에서 변형될 수 있는 아미노산 위치의 예는 위치 L234 및 L235를 포함한다.

따라서, 일 구체예에서, L234 및 L235에 상응하는 적어도 하나의 위치에서의 아미노산은 각각 A 및 A일 수 있다. 또한, L234F 및 L235E 아미노산 치환은 Fcγ 수용체와 C1q와의 상호작용이 없어진 Fc 영역을 야기할 수 있다(Canfield et al., 1991, J. Exp. Med. (173):1483-91; Duncan et al., 1988, Nature (332):738-40). 따라서, 일 구체예에서, L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 F 및 E일 수 있다. D265A 아미노산 치환은 모든 Fcγ 수용체에 대한 결합을 감소시키고 ADCC를 방지할 수 있다(Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. (276):6591-604). 따라서, 일 구체예에서, D265에 상응하는 위치의 아미노산은 A일 수 있다. C1q에 대한 결합은 위치 D270, K322, P329 및 P331을 돌연변이시킴으로써 제거될 수 있다. 이들 위치를 D270A 또는 K322A 또는 P329A 또는 P331A로 돌연변이시키면 항체d의 CDC 활성이 결핍될 수 있다(Idusogie EE, et al., 2000, J Immunol. 164: 4178-84). 따라서, 일 구체예에서, D270, K322, P329 및 P331에 상응하는 적어도 하나의 위치의 아미노산은 각각 A, A, A 및 A일 수 있다.

Fc 영역과 Fcγ 수용체 및 C1q의 상호작용을 최소화하기 위한 대안적 접근법은 항체의 글리코실화 부위를 제거하는 것이다. 위치 N297을 예를 들어 Q, A 또는 E로 돌연변이시키면 IgG-Fc 감마 수용체 상호작용에 중요한 글리코실화 부위가 제거된다. 따라서, 일 구체예에서, N297에 상응하는 위치의 아미노산은 G, Q, A 또는 E일 수 있다(Leabman et al., 2013, MAbs; 5(6):896-903). Fc 영역과 Fcγ 수용체의 상호작용을 최소화하기 위한 또 다른 대안적 접근법은 다음 돌연변이에 의해 얻어질 수 있다; P238A, A327Q, P329A 또는 E233P/L234V/L235A/G236del(Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. (276):6591-604).

대안적으로, 인간 IgG2 및 IgG4 서브클래스는 Fcγ 수용체와의 상호작용은 보고되었지만 C1q 및 Fc 감마 수용체와의 상호작용에서 자연적으로 손상된 것으로 간주된다(Parren et al., 1992, J. Clin Invest. 90: 1537-1546; Bruhns et al., 2009, Blood 113: 3716-3725). 이러한 잔류 상호작용을 제거하는 돌연변이는 두 이소형 모두에서 만들어질 수 있으며, FcR 결합과 관련된 원치 않는 부작용을 감소시킨다. IgG2의 경우 여기에는 L234A 및 G237A가 포함되고 IgG4의 경우 L235E가 포함된다. 따라서, 일 구체예에서, 인간 IgG2 중쇄에서 L234 및 G237에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 A 및 A일 수 있다. 일 구체예에서, 인간 IgG4 중쇄에서 L235에 상응하는 위치의 아미노산은 E일 수 있다.

IgG2 항체에서 Fcγ 수용체 및 C1q와의 상호작용을 추가로 최소화하기 위한 또 다른 접근법은 WO2011066501 및 문헌 [Lightle, S., et al., 2010, Protein Science (19):753-62]에 기술된 것을 포함한다.

항체의 힌지 영역은 또한 Fcγ 수용체 및 보체와의 상호작용과 관련하여 중요할 수 있다(Brekke et al., 2006, J Immunol 177:1129-1138; Dall'Acqua WF, et al., 2006, J Immunol 177). :1129-1138). 따라서, 힌지 영역의 돌연변이 또는 결실은 항체의 이펙터 기능에 영향을 미칠 수 있다.

일 구체예에서, 항체는 제1 및 제2 면역글로불린 중쇄를 포함하고, 여기서 상기 제1 및 제2 면역글로불린 중쇄 중 적어도 하나에서 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234, L235, D265, N297 및 P331에 상응하는 위치 중 하나 이상은 각각 L, L, D, N 및 P가 아니다.

일 구체예에서, 제1 및 제2 중쇄 모두에서 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234, L235, D265, N297 및 P331에 상응하는 위치의 하나 이상의 아미노산은 각각 L, L, D, N, 및 P가 아니다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 모두에서 인간 IgG1 중쇄의 위치 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 D가 아니다.

따라서, 본 발명의 일 구체예에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 모두에서 인간 IgG1 중쇄의 위치 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 A 및 E로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명의 추가 구체예에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 L 및 L이 아니다.

본 발명의 특정 구체예에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 F 및 E이다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 모두에서 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 F 및 E이다.

본 발명의 특정 구체예에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234, L235 및 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 F, E 및 A이다.

본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 모두에서 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234, L235 및 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 F, E 및 A이다.

본 발명에 따른 항체는 특히 Fc 영역에서 항체의 안정성을 증가시키는 변형을 포함할 수 있다. 따라서, 일 구체예에서, 항체는 제1 및 제2 중쇄를 포함하고, 여기서 하나 또는 두 개의 중쇄 모두는, 변형되지 않은 제1 및 제2 중쇄를 포함하는 것을 제외한 동일한 항체에 비해 항체의 안정성이 증가되도록 변형된다. 예를 들어, IgG1 이소형 항체에서 변형될 수 있는 아미노산 위치의 예는 위치 M428 및 N434를 포함한다.

따라서, 일 구체예에서, M428 및 N434에 상응하는 적어도 하나의 위치에서의 아미노산은 각각 L 및 S일 수 있다. 일 구체예에서, M428 및 N434에 상응하는 위치의 아미노산은 L 및 S이다.

특정 구체예에 따르면, 본원에 기술된 결합제 또는 항체의 폴리펩타이드 사슬(들)은 신호 펩타이드를 포함할 수 있다.

이러한 신호 펩타이드는 전형적으로 길이가 약 15 내지 30개의 아미노산이고, 좋기로는 폴리펩타이드 사슬의 N-말단에 위치하는 서열이지만, 이에 한정되지 않는다. 본원에 정의된 바와 같은 신호 펩타이드는 좋기로는 예를 들어 RNA에 의해 인코딩되는 것과 같은 폴리펩타이드 사슬(들)을 정의된 세포 구획, 좋기로는 세포 표면, 소포체(ER) 또는 엔도좀-리소솜 구획으로 수송할 수 있게 한다.

본원에서 정의된 바와 같은 신호 펩타이드 서열은 면역글로불린의 신호 펩타이드 서열, 예를 들어 면역글로불린 중쇄 가변 영역의 신호 펩타이드 서열 또는 면역글로불린 경쇄 가변 영역의 신호 펩타이드 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 여기서 면역글로불린은 인간 면역글로불린일 수 있다.

추가 구체예에서, 본원에 기술된 결합제 또는 항체는 사이토카인, 면역 억제제, 면역 자극 분자 및/또는 방사성동위원소와 같은 하나 이상의 치료 모이어티에 연결되거나 접합된다. 이러한 접합체는 본원에서 "면역접합체" 또는 "약물 접합체"로 지칭된다. 하나 이상의 세포독소를 포함하는 면역접합체를 "면역독소"라고 한다.

일 구체예에서, 제1 및/또는 제2 Fc 서열은 약물 또는 전구약물에 접합되거나 이에 대한 억셉터 그룹을 함유한다. 이러한 억셉터 그룹은 예를 들어 비천연 아미노산일 수 있다.

핵산

본원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"은 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 재조합 생산 및 화학적 합성 분자와 같은 DNA 및 RNA를 포함하는 것으로 의도된다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. RNA는 시험관내 전사 RNA(IVT RNA) 또는 합성 RNA를 포함한다. 본 발명에 따르면, 폴리뉴클레오타이드는 단리되는 것이 바람직하다.

핵산은 벡터에 포함될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "벡터"는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 람다 파지와 같은 파지 벡터, 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 바큘로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터, 또는 박테리아 인공 염색체(BAC)와 같은 인공 염색체 벡터, 효모 인공 염색체(YAC) 또는 P1 인공 염색체(PAC)를 포함하는 당업자에게 공지된 임의의 벡터를 포함한다. 상기 벡터는 발현 및 클로닝 벡터를 포함한다. 발현 벡터는 플라스미드 및 바이러스 벡터를 포함하고 일반적으로 특정 숙주 유기체(예를 들어, 박테리아, 효모, 식물, 곤충 또는 포유동물)에서 또는 시험관내 발현 시스템에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 원하는 코딩 서열 및 적절한 DNA 서열을 함유한다. 클로닝 벡터는 일반적으로 원하는 특정 DNA 단편을 조작하고 증폭하는 데 사용되며 원하는 DNA 단편의 발현에 필요한 기능적 서열을 결여할 수 있다.

본 발명의 모든 측면의 일 구체예에서, 본원에 기재된 결합제, 예를 들어 항체 또는 이중특이적 또는 다중특이적 결합제를 인코딩하는 RNA는 결합제를 제공하도록 치료된 대상체의 세포에서 발현된다. 결합제가 두 개 이상의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 경우, 상이한 폴리펩티드 사슬은 동일하거나 상이한 RNA 분자에 의해 인코딩될 수 있다.

본원에 기술된 핵산은 재조합 및/또는 단리된 분자일 수 있다.

본 개시내용에서 용어 "RNA"는 리보뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, RNA는 리보뉴클레오타이드 잔기의 전부 또는 대부분을 함유한다. 본원에 사용된 "리보뉴클레오타이드"는 β-D-리보푸라노실기의 2'-위치에 히드록실기를 갖는 뉴클레오타이드를 의미한다. RNA는 제한 없이 이중 가닥 RNA, 단일 가닥 RNA, 단리된 RNA, 예를 들어 부분적으로 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합으로 생산된 RNA, 그리고 부가, 결실, 치환 및/또는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 변경에 의해 자연발생적인 RNA와는 상이한 변형된 RNA를 포함한다. 이러한 변경은 내부 RNA 뉴클레오타이드 또는 RNA 말단(들)에 비뉴클레오타이드 물질의 추가를 의미할 수 있다. 또한 RNA의 뉴클레오타이드는 화학적으로 합성된 뉴클레오타이드 또는 데옥시뉴클레오타이드와 같은 비표준 뉴클레오타이드일 수 있음이 고려된다. 본 개시내용에서, 이들 변경된 RNA는 자연발생 RNA의 유사체로 간주된다.

본 개시내용의 특정 구체예에서, RNA는 펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 RNA 전사물에 관한 메신저 RNA(mRNA)이다. 당업계에 확립된 바와 같이, mRNA는 일반적으로 5' 비번역 영역(5'-UTR), 펩타이드 코딩 영역 및 3' 비번역 영역(3'-UTR)을 함유한다. 일부 구체예에서, RNA는 시험관내 전사 또는 화학적 합성에 의해 생성된다. 일 구체예에서, mRNA는 DNA가 데옥시리보뉴클레오타이드를 함유하는 핵산을 지칭하는 DNA 주형을 이용하는 시험관내 전사에 의해 생성된다.

일 구체예에서, RNA는 시험관내 전사된 RNA(IVT-RNA)이고 적절한 DNA 주형의 시험관내 전사에 의해 수득될 수 있다. 전사 조절을 위한 프로모터는 임의의 RNA 폴리머라제에 대한 임의의 프로모터일 수 있다. 시험관내 전사를 위한 DNA 주형은 핵산, 특히 cDNA를 클로닝하고 이를 시험관내 전사를 위한 적절한 벡터에 도입함으로써 얻을 수 있다. cDNA는 RNA의 역전사에 의해 얻을 수 있다.

본 개시내용의 특정 구체예에서, RNA는 "레플리콘 RNA" 또는 단순히 "레플리콘", 특히 "자가 복제 RNA" 또는 "자가 증폭 RNA"이다. 특히 바람직한 일부 구체예에서, 레플리콘 또는 자가-복제 RNA는 ssRNA 바이러스, 특히 알파바이러스와 같은 양성-가닥 ssRNA 바이러스로부터 유래되거나 유래된 요소를 포함한다. 알파바이러스는 양성-가닥 RNA 바이러스의 전형적인 대표자이다. 알파바이러스는 감염된 세포의 세포질에서 복제한다 (알파바이러스 수명 주기에 대한 리뷰는, [Jose et al., Future Microbiol., 2009, vol. 4, pp. 837-856] 참조). 많은 알파바이러스의 총 게놈 길이는 일반적으로 11,000 내지 12,000개의 뉴클레오타이드 범위이며, 그 게놈 RNA는 일반적으로 5' 캡과 3' 폴리(A) 꼬리를 가지고 있다. 알파바이러스의 게놈은 비구조적 단백질 (바이러스 RNA의 전사, 변형 및 복제에 및 단백질 변형에 관여) 및 구조적 단백질 (바이러스 입자 형성)을 인코딩한다. 게놈에는 일반적으로 두 개의 ORF (오픈 리딩 프레임)가 있다. 4개의 비-구조 단백질 (nsP1-nsP4)은 통상 게놈의 5' 말단 근처에서 시작하는 첫 번째 ORF에 의해 함께 인코딩되는 반면, 알파바이러스의 구조 단백질은 상기 첫 번째 ORF의 다운스트림에서 발견되고 게놈의 3' 말단 근처로 연장되는 두 번째 ORF에 의해 함께 인코딩된다. 통상 첫 번째 ORF는 두 번째 ORF보다 크며 비는 대략 2:1이다. 알파바이러스에 감염된 세포에서, 비-구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열만이 게놈 RNA에서 번역되는 반면, 구조 단백질을 인코딩하는 유전 정보는 서브게놈 전사체로부터 번역될 수 있는데, 이는 진핵생물 메신저 RNA 와 유사한 RNA 분자이다 (mRNA; Gould et al., 2010, Antiviral Res., vol. 87 pp. 111-124). 감염 후, 즉 바이러스 수명 주기의 초기 단계에서, (+) 가닥 게놈 RNA는 비-구조적 폴리-단백질 (nsP1234)을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임의 번역을 위해 메신저 RNA처럼 직접 작용한다. 알파바이러스-유래 벡터는 외래 유전 정보를 표적 세포 또는 표적 유기체로 전달하기 위해 제안되었다. 간단한 접근 방식에 있어서, 알파바이러스 구조 단백질을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임은 관심 대상 단백질을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임으로 대체된다. 알파바이러스-기반의 트랜스-복제 시스템은 두 개의 개별 핵산 분자 상의 알파바이러스 뉴클레오타이드 서열 요소에 의존한다: 한 핵산 분자는 바이러스 레플리카제를 인코딩하고, 다른 핵산 분자는 트랜스로 상기 레플리카제에 의해 복제될 수 있다 (따라서, 명칭 트랜스-복제 시스템). 트랜스-복제는 주어진 숙주 세포에서 이들 두 핵산 분자 모두의 존재를 필요로 한다. 트랜스로 레플리카제에 의해 복제될 수 있는 핵산 분자는, 알파바이러스 레플리카제에 의한 인식 및 RNA 합성을 가능케 하기 위하여 특정한 알파바이러스 서열 요소를 포함해야 한다.

일 구체예에서, 본원에 기재되는 RNA는 변형된 뉴클레오사이드를 가질 수 있다. 일부 구체예에서, RNA는, 적어도 하나의 (예를 들어, 모든) 우리딘 대신에 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "우라실"은 RNA의 핵산에 존재할 수 있는 핵염기들 중 하나를 설명한다. 우라실의 구조는 다음과 같다:

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본원에서 사용되는 바, 용어 "우리딘"은 RNA에 존재할 수 있는 뉴클레오사이드 중 하나를 설명한다. 우리딘의 구조는 다음과 같다:

.

UTP (우리딘 5'-트리포스페이트)는 다음의 구조를 갖는다:

.

슈도-UTP (슈도우리딘-5'-트리포스페이트)는 다음의 구조를 갖는다:

.

"슈도우리딘"은 우리딘의 이성질체인 변형된 뉴클레오사이드의 한 예이며, 여기서 우라실은, 질소-탄소 글리코시드 결합 대신 탄소-탄소 결합을 통해 펜토오스 고리에 부착된다.

또 다른 예시적인 변형된 뉴클레오사이드는 다음 구조를 갖는 N1-메틸-슈도우리딘 (m1Ψ)이다:

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N1-메틸-슈도-UTP는 다음의 구조를 갖는다:

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또 다른 예시적 변형 뉴클레오사이드는 5-메틸-우리딘 (m5U)이고, 이는 다음의 구조를 갖는다:

.

일부 구체예에서, 본원에 기재되는 RNA에서 하나 이상의 우리딘은 변형된 뉴클레오사이드로 대체된다. 일부 구체예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 변형된 우리딘이다.

일부 구체예에서, RNA는 적어도 하나의 우리딘 대신에 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 일부 구체예에서, RNA는 각각의 우리딘 대신에 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다.

일부 구체예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 슈도우리딘 (Ψ), N1-메틸-슈도우리딘 (m1Ψ), 및 5-메틸-우리딘 (m5U)으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구체예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 슈도우리딘 (Ψ)을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 N1-메틸-슈도우리딘 (m1Ψ)을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 5-메틸-우리딘 (m5U)을 포함한다. 일부 구체예에서, RNA는 1 유형 이상의 변형된 뉴클레오사이드를 포함할 수 있고, 변형된 뉴클레오사이드는 슈도우리딘 (Ψ), N1-메틸-슈도우리딘 (m1Ψ), 및 5-메틸-우리딘 (m5U)으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구체예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 슈도우리딘 (Ψ) 및 N1-메틸-슈도우리딘 (m1Ψ)을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 슈도우리딘 (Ψ) 및 5-메틸-우리딘 (m5U)을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 N1-메틸-슈도우리딘 (m1Ψ) 및 5-메틸-우리딘 (m5U)을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 슈도우리딘 (Ψ), N1-메틸-슈도우리딘 (m1Ψ), 및 5-메틸-우리딘 (m5U)을 포함한다.

일부 구체예에서, RNA 내 하나 이상의, 예컨대 모든 우리딘을 대체하는 변형된 뉴클레오사이드는 3-메틸-우리딘 (m³U),5-메톡시-우리딘 (mo⁵U),5-아자-우리딘, 6-아자-우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오-우리딘 (s²U),4-티오-우리딘 (s⁴U),4-티오-슈도우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 5-하이드록시-우리딘 (ho⁵U),5-아미노알릴-우리딘, 5-할로-우리딘 (예컨대, 5-요오도-우리딘 또는 5-브로모-우리딘), 우리딘 5-옥시아세트산 (cmo⁵U),우리딘 5-옥시아세트산 메틸 에스터 (mcmo⁵U), 5-카르복시메틸-우리딘 (cm⁵U),1-카르복시메틸-슈도우리딘, 5-카르복시하이드록시메틸-우리딘 (chm⁵U), 5-카르복시하이드록시메틸-우리딘 메틸 에스터 (mchm⁵U),5-메톡시카르보닐메틸-우리딘 (mcm⁵U), 5-메톡시카르보닐메틸-2-티오-우리딘 (mcm⁵s²U),5-아미노메틸-2-티오-우리딘 (nm⁵s²U),5-메틸아미노메틸-우리딘 (mnm⁵U),1-에틸-슈도우리딘, 5-메틸아미노메틸-2-티오-우리딘 (mnm⁵s²U), 5-메틸아미노메틸-2-셀레노-우리딘 (mnm⁵se²U), 5-카르바모일메틸-우리딘 (ncm⁵U),5-카르복시메틸아미노메틸-우리딘 (cmnm⁵U),5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오-우리딘 (cmnm⁵s²U),5-프로피닐-우리딘, 1-프로피닐-슈도우리딘, 5-토리노메틸-우리딘 (τm⁵U), 1-토리노메틸-슈도우리딘, 5-토리노메틸-2-티오-우리딘 (τm5s2U), 1-토리노메틸-4-티오-슈도우리딘), 5-메틸-2-티오-우리딘 (m⁵s²U), 1-메틸-4-티오-슈도우리딘 (m¹s⁴Ψ), 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 3-메틸-슈도우리딘 (m³Ψ), 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 디하이드로우리딘 (D), 디하이드로슈도우리딘, 5,6-디하이드로우리딘, 5-메틸-디하이드로우리딘 (m⁵D),2-티오-디하이드로우리딘, 2-티오-디하이드로슈도우리딘, 2-메톡시-우리딘, 2-메톡시-4-티오-우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, N1-메틸-슈도우리딘, 3-(3-아미노-3-카르복시프로필)우리딘 (acp³U), 1-메틸-3-(3-아미노-3-카르복시프로필)슈도우리딘 (acp³Ψ), 5-(이소펜테닐아미노메틸)우리딘 (inm⁵U),5-(이소펜테닐아미노메틸)-2-티오-우리딘 (inm⁵s²U),α-티오-우리딘, 2'-O-메틸-우리딘 (Um), 5,2'-O-디메틸-우리딘 (m⁵Um), 2'-O-메틸-슈도우리딘 (Ψm), 2-티오-2'-O-메틸-우리딘 (s²Um), 5-메톡시카르보닐메틸-2'-O-메틸-우리딘 (mcm⁵Um), 5-카르바모일메틸-2'-O-메틸-우리딘 (ncm⁵Um), 5-카르복시메틸아미노메틸-2'-O-메틸-우리딘 (cmnm⁵Um), 3,2'-O-디메틸-우리딘 (m³Um), 5-(이소펜테닐아미노메틸)-2'-O-메틸-우리딘 (inm⁵Um), 1-티오-우리딘, 데옥시티미딘, 2'-F-아라-우리딘, 2'-F-우리딘, 2'-OH-아라-우리딘, 5-(2-카보메톡시비닐) 우리딘, 5-[3-(1-E-프로페닐아미노)우리딘, 또는 이 기술 분야에 알려진 임의의 다른 변형된 우리딘 중 임의의 하나 이상일 수 있다.

일 구체예에서, RNA는 다른 변형된 뉴클레오사이드를 포함하거나 추가로 변형된 뉴클레오사이드, 예를 들어 변형된 시티딘을 포함한다. 예를 들어, 일 구체예에서, RNA에서 5-메틸시티딘이, 시티딘에 대해, 부분적으로 또는 완전히, 좋기로는 완전히, 치환된다. 일 구체예에서, RNA는 5-메틸시티딘, 및 슈도우리딘 (Ψ), N1-메틸-슈도우리딘 (m1Ψ), 및 5-메틸-우리딘 (m5U)으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다. 일 구체예에서, RNA는 5-메틸시티딘 및 N1-메틸-슈도우리딘 (m1Ψ)을 포함한다. 일부 구체예에서, RNA는, 각각의 시티딘 대신에 5-메틸시티딘을 포함하고 및 각각의 우리딘 대신에 N1-메틸-슈도우리딘 (m1Ψ)을 포함한다.

일부 구체예에서, 본 개시내용에 따른 RNA는 5'-캡을 포함한다. 일 구체예에서, 본 개시내용의 RNA는 캡핑되지 않은 5'-트리포스페이트를 갖지 않는다. 일 구체예에서, RNA는 5'-캡 유사체에 의해 변형될 수 있다. 용어 "5'-캡"은 mRNA 분자의 5'-말단에서 발견되는 구조를 말하며 일반적으로 5'-에서 5'-트리포스페이트 연결을 통해 mRNA에 연결된 구아노신 뉴클레오타이드로 구성된다. 일 구체예에서, 이 구아노신은 7-위치에서 메틸화된다. RNA에 5'-캡 또는 5'-캡 유사체를 제공하는 것은 시험관내 전사에 의해 달성될 수 있으며, 여기서 5'-캡은 RNA 가닥으로 공동 전사적으로 발현되거나 캡핑 효소를 사용하여 전사 후 RNA에 부착될 수 있다.

일부 구체예에서, RNA에 대한 빌딩 블록 캡은 m₂ ^7,3'-OGppp(m₁ ^2'-O)ApG (때때로 m27,3'OG(5')ppp(5')m2'-OApG라고도 함)이며, 이는 다음과 같은 구조를 갖는다:

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아래는 RNA 및 m₂ ^7,3`OG(5')ppp(5')m^2'-OApG를 포함하는 예시적인 Cap1 RNA이다:

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아래는 또 다른 예시적인 Cap1 RNA(캡 아날로그 없음)이다:

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일부 구체예에서, RNA는 한 구체예에서 다음 구조를 갖는 캡 유사체 역전 방지 캡(m₂ ^7,3`OG(5')ppp(5')G))을 사용하여 "Cap0" 구조로 변형된다:

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아래는 RNA m₂ ^7,3`OG(5')ppp(5')G를 포함하는 예시적인 Cap0 RNA이다:

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일부 구체예에서, "Cap0" 구조는 하기 구조를 갖는 캡 유사체 베타-S-ARCA(m₂ ^7,2`OG(5')ppSp(5')G)를 사용하여 생성된다:

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아래는 베타-S-ARCA (m₂ ^7,2`OG(5')ppSp(5')G) 및 RNA를 포함하는 예시적인 Cap0 RNA이다:

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베타-S-ARCA의 "D1" 부분입체이성질체 또는 "베타-S-ARCA(D1)"는 베타-S-ARCA의 D2 부분입체이성질체와 비교하여 HPLC 컬럼에서 먼저 용출되는 베타-S-ARCA의 부분입체이성질체(베타-S-ARCA(D2))이며 따라서 더 짧은 체류 시간을 나타낸다(참조, WO 2011/015347, 본원에 참조로 포함됨).

특히 바람직한 캡은 베타-S-ARCA(D1) (m₂ ^7,2'-OGppSpG) 또는 m₂ ^7,3'-OGppp(m₁ ^2'-O)ApG이다.

일부 구체예에서, 본 개시내용에 따른 RNA는 5'-UTR 및/또는 3'-UTR을 포함한다. 용어 "비번역 영역" 또는 "UTR"은 전사되지만 아미노산 서열로 번역되지 않는 DNA 분자 내의 영역, 또는 mRNA 분자와 같은 RNA 분자 내의 상응하는 영역에 관한 것이다. 비번역 영역 (UTR)은 오픈 리딩 프레임의 5' (업스트림)(5'-UTR) 및/또는 오픈 리딩 프레임의 3' (다운스트림)(3'-UTR)에 존재할 수 있다. 존재하는 경우 5'-UTR은 단백질-인코딩 영역의 개시 코돈의 업스트림인 5' 말단에 위치한다. (존재한다면) 5'-UTR은 5'-캡의 다운스트림이며, 예를 들어 5'-캡에 직접 인접한다. 3'-UTR이 존재하는 경우 단백질 코딩 영역의 종결 코돈 하류인 3' 말단에 위치하지만, 용어 "3'-UTR"은 폴리(A) 서열을 포함하지 않는 것이 바람직하다. 따라서, 3'-UTR은 폴리(A) 서열(존재한다면)의 업스트림이며, 즉 폴리(A) 서열에 직접 인접한다.

일부 구체예에서, RNA는 SEQ ID NO: 199의 뉴클레오타이드 서열, 또는 SEQ ID NO: 199의 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 또는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5'-UTR을 포함한다.

일부 구체예에서, RNA는 SEQ ID NO: 200 또는 201의 뉴클레오타이드 서열, 또는 SEQ ID NO: 200 또는 201의 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 또는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3'-UTR을 포함한다.

특히 바람직한 5'-UTR은 SEQ ID NO: 199의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특히 바람직한 3'-UTR은 SEQ ID NO: 200 또는 201의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

일부 구체예에서, 본 발명에 따른 RNA는 3'-폴리(A) 서열을 포함한다.

본원에 사용되는 바 용어 "폴리(A) 서열" 또는 "폴리-A 꼬리"는 RNA 분자의 3'-말단에 전형적으로 위치하는 아데닐레이트 잔기의 단절되지 않거나 단절된 서열을 지칭한다. 폴리(A) 서열은 당업자에게 공지되어 있고 본원에 기재되는 RNA에서 3'-UTR에 이어질 수 있다. 단절되지 않은 폴리(A) 서열은 연속적인 아데닐레이트 잔기를 특징으로 한다. 자연에서, 단절되지 않는 폴리(A) 서열이 일반적이다. 본 명세서에 개시되는 RNA는, 전사 후 주형-비의존성 RNA 폴리머라제에 의해 RNA의 자유 3'-말단에 부착된 폴리(A) 서열 또는 DNA에 의해 인코딩되고 주형-의존성 RNA 폴리머라제에 의해 전사된 폴리(A) 서열을 가질 수 있다.

약 120A 뉴클레오타이드로 이루어지는 폴리(A) 서열은 형질감염된 진핵 세포의 RNA 수준뿐만 아니라, 그 폴리(A) 서열의 업스트림(5')에 존재하는 오픈 리딩 프레임으로부터 번역되는 단백질 수준에 유익한 영향을 미친다는 것이 입증되었다. (Holtkamp et al., 2006, Blood, vol. 108, pp. 4009-4017).

폴리(A) 시퀀스는 임의의 길이일 수 있다. 일부 구체예에서, 폴리(A) 서열은 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 80개 이상, 또는 100개 이상 및 500개 이하, 400개 이하, 300개 이하, 200개 이하, 또는 150개 이하의 A 뉴클레오타이드, 특히 약 120개의 A 뉴클레오타이드를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진된다. 이러한 맥락에서, "본질적으로 ~로 이루어진다"는 폴리(A) 서열에서 대부분의 뉴클레오타이드, 전형적으로 폴리(A) 서열 내 뉴클레오타이드 수로 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%가 A 뉴클레오타이드이지만 나머지 뉴클레오타이드가 A 뉴클레오타이드 이외의 뉴클레오타이드, 예컨대 U 뉴클레오타이드 (우리딜레이트), G 뉴클레오타이드 (구아닐레이트), 또는 C 뉴클레오타이드 (시티딜레이트)임을 허용함을 의미한다. 이러한 맥락에서, "이루어진다"는 폴리(A) 서열 내 모든 뉴클레오타이드, 즉 폴리(A) 서열 내 뉴클레오타이드 수로 100%가 A 뉴클레오타이드임을 의미한다. 용어 "A 뉴클레오타이드" 또는 "A"는 아데닐레이트를 의미한다.

일부 구체예에서, 폴리(A) 서열은, 코딩 가닥에 상보적인 가닥 내 반복된 dT 뉴클레오타이드 (데옥시티미딜레이트)를 포함하는 DNA 주형에 기초하여, RNA 전사 동안, 예를 들어 시험관내 전사된 RNA의 제조 동안 부착된다. 폴리(A) 서열을 인코딩하는 DNA 서열 (코딩 가닥) 폴리(A) 카세트로 지칭된다.

일부 구체예에서, DNA의 코딩 가닥에 존재하는 폴리(A) 카세트는 본질적으로 dA 뉴클레오타이드로 이루어지지만, 4가지 뉴클레오타이드 (dA, dC, dG 및 dT)의 무작위 서열에 의해 단절된다. 이러한 무작위 서열은 길이가 5 내지 50개, 10 내지 30개, 또는 10 내지 20개 뉴클레오타이드일 수 있다. 이러한 카세트는 WO 2016/005324 A1에 개시되어 있으며, 이는 본원에 참조로서 포함된다. WO 2016/005324 A1에 개시된 임의의 폴리(A) 카세트가 본 발명에서 사용될 수 있다. 본질적으로 dA 뉴클레오타이드로 이루어지지만 4가지 뉴클레오타이드 (dA, dC, dG, dT)의 동일한 분포를 갖고 예를 들어 5 내지 50개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는 무작위 서열에 의해 단절된 폴리(A) 카세트는, DNA 수준에서, E. coli 내 플라스미드 DNA의 일정한 전파를 보여주며, RNA 수준에서, RNA 안정성 및 번역 효율을 지지함과 관련된 유익한 특성과 여전히 연관되어 있다. 결과적으로, 일부 구체예에서, 본원에 기재되는 RNA 분자에 함유된 폴리(A) 서열은 본질적으로 A 뉴클레오타이드로 이루어지지만, 4가지 뉴클레오타이드 (A, C, G, U)의 무작위 서열에 의해 단절된다. 이러한 무작위 서열은 길이가 5 내지 50개, 10 내지 30개, 또는 10 내지 20개 뉴클레오타이드일 수 있다.

일부 구체예에서, A 뉴클레오타이드 이외의 어떤 뉴클레오타이드도 그의 3'-말단에서 폴리(A) 서열의 측면으로 위치하지 않으며, 즉, 폴리(A) 서열은 그의 3'-말단에서 A 이외의 뉴클레오타이드에 의해 가려지거나 이어지지 않는다.

일부 구체예에서, 폴리(A) 서열은 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 80개 이상, 또는 100개 이상 및 500개 이하, 400개 이하, 300개 이하, 200개 이하, 또는 150개 이하의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 폴리(A) 서열은 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 80개 이상, 또는 100개 이상 및 500개 이하, 400개 이하, 300개 이하, 200개 이하, 또는 150개 이하의 뉴클레오타이드로 본질적으로 이루어질 수 있다. 일부 구체예에서, 폴리(A) 서열은 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 80개 이상, 또는 100개 이상 및 500개 이하, 400개 이하, 300개 이하, 200개 이하, 또는 150개 이하의 뉴클레오타이드로 이루어질 수 있다. 일부 구체예에서, 폴리(A) 서열은 100개 이상의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리(A) 서열은 약 150개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리(A) 서열은 약 120개의 뉴클레오타이드를 포함한다.

일부 구체예에서, RNA는 SEQ ID NO: 202의 뉴클레오타이드 서열, 또는 SEQ ID NO: 202의 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

특히 바람직한 폴리(A) 서열은 SEQ ID NO: 14의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

본 개시내용에 따르면, 결합제는 좋기로는 RNA가 투여되는 대상체의 세포에 들어갈 때 각각의 단백질로 번역되는 단일 가닥, 5' 캡핑된 mRNA로서 투여된다. 좋기로는, RNA는 안정성 및 번역 효율과 관련하여 RNA의 최대 효능을 위해 최적화된 구조적 요소를 함유한다(5' 캡, 5' UTR, 3' UTR, 폴리(A) 서열).

일 구체예에서, 베타-S-ARCA(D1)는 RNA의 5'-말단에서 특정 캡핑 구조로서 이용된다. 일 구체예에서, m₂ ^7,3'-OGppp(m₁ ^2'-O)ApG는 RNA의 5'-말단에서 특정 캡핑 구조로서 이용된다. 일 구체예에서, 5'-UTR 서열은 인간 알파-글로빈 mRNA로부터 유도되고 선택적으로 번역 효율을 증가시키기 위해 최적화된 'Kozak 서열'을 갖는다. 일 구체예에서, "스플릿의 아미노 말단 인핸서"(AES) mRNA(F로 불림) 및 미토콘드리아 인코딩된 12S 리보솜 RNA(I로 불림)로부터 유도된 2개의 서열 요소(FI 요소)의 조합은 코딩 서열과 폴리(A) 서열 사이에 배치되어 더 높은 최대 단백질 수준과 mRNA의 장기간 지속성을 보장한다. 이들은 RNA 안정성을 부여하고 총 단백질 발현을 증가시키는 서열에 대한 생체외 선택 과정에 의해 확인되었다(본원에 참조로 포함된 WO 2017/060314 참조). 일 구체예에서, 인간 베타-글로빈 mRNA로부터 유래된 2개의 반복된 3'-UTR은 코딩 서열과 폴리(A) 서열 사이에 배치되어 더 높은 최대 단백질 수준 및 mRNA의 장기간 지속성을 보장한다. 일 구체예에서, 30개 아데노신 잔기의 스트레치에 이어서 10개 뉴클레오타이드 링커 서열 및 또 다른 70개 아데노신 잔기로 이루어진 110개 뉴클레오타이드 길이의, 폴리(A) 서열이 사용된다. 이 폴리(A) 서열은 RNA 안정성과 번역 효율을 향상시키도록 설계되었다.

본 발명의 모든 측면의 일 구체예에서, 결합제를 인코딩하는 RNA는 결합제를 제공하도록 처리된 대상체의 세포에서 발현된다. 본 발명의 모든 측면의 일 구체예에서, RNA는 대상체의 세포에서 일시적으로 발현된다. 본 발명의 모든 측면의 일 구체예에서, RNA는 시험관내에서 전사된 RNA이다. 본 발명의 모든 측면의 일 구체예에서, 결합제의 발현은 세포외 공간으로, 즉 결합제가 분비된다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "전사"는 DNA 서열의 유전자 코드가 RNA로 전사되는 과정에 관한 것이다. 그 후, RNA는 펩타이드 또는 단백질로 번역될 수 있다.

본 발명에 따르면, 용어 "전사"는 "시험관내 전사"를 포함하고, 여기서 용어 "시험관내 전사"는, RNA, 특히 mRNA가 무세포 (cell-free) 시스템 내에서, 좋기로는 적절한 세포 추출물을 사용하여 시험관내 합성되는, 과정에 관한 것이다. 좋기로는, 클로닝 벡터는 전사체 생성에 적용된다. 이러한 클로닝 벡터는 일반적으로 전사 벡터로 칭해되며 본 발명에 따라 용어 "벡터"에 포함된다. 본 발명에 따르면, 본 발명에서 사용되는 RNA는 좋기로는 시험관내 전사된 RNA (IVT-RNA)이고 적절한 DNA 주형의 시험관내 전사에 의해 수득될 수 있다. 전사를 제어하기 위한 프로모터는 임의의 RNA 폴리머라제에 대한 임의의 프로모터일 수 있다. RNA 폴리머라제의 특정 예는 T7, T3 및 SP6 RNA 폴리머라제이다. 좋기로는, 본 발명에 따른 시험관내 전사는 T7 또는 SP6 프로모터에 의해 조절된다. 시험관내 전사를 위한 DNA 주형은 핵산, 특히 cDNA를 클로닝하고 그것을 시험관내 전사를 위한 적절한 벡터에 도입함으로써 얻을 수 있다. cDNA는 RNA의 역전사에 의해 얻어질 수 있다.

RNA와 관련하여, 용어 "발현" 또는 "번역"은 그에 의하여 mRNA 가닥이 펩타이드 또는 단백질을 만들기 위한 아미노산 서열의 조립을 지시하는 세포의 리보솜에서의 과정에 관한 것이다.

일 구체예에서, 예를 들어 RNA 지질 입자로서 제형화된, 본원에 기재된 RNA의 투여 후, RNA의 적어도 일부는 표적 세포에 전달된다. 일 구체예에서, RNA의 적어도 일부는 표적 세포의 세포질로 전달된다. 일 구체예에서, RNA는 표적 세포에 의해 번역되어 그것이 인코딩하는 펩타이드 또는 단백질을 생성한다. 따라서, 본 발명은 또한, 본원에 기재된 RNA 입자를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 대상체의 표적 세포에 RNA를 전달하는 방법에 관한 것이다. 일 구체예에서, RNA는 표적 세포의 세포질로 전달된다. 일부 구체예에서, RNA는 표적 세포에 의해 번역되어 그 RNA에 의해 인코딩되는 펩타이드 또는 단백질을 생성한다.

"인코딩"은, 생물학적 과정에서, 정의된 뉴클레오타이드 서열 (즉, rRNA, tRNA 및 mRNA)이나 정의된 아미노산 서열, 그리고 그로부터 생성되는 생물학적 특성을 갖는 다른 폴리머 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서의 역할을 하는 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 유전자, cDNA 또는 mRNA 내 특정한 뉴클레오타이드 서열의 고유한 특성을 말한다. 따라서, 유전자는, 그 유전자에 대응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생성하는 경우, 그 단백질을 인코딩하는 것이다. 그의 뉴클레오타이드 서열이 mRNA 서열과 동일하고 일반적으로 서열 목록으로 제공되는 코딩 가닥과, 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로 사용되는 비-코딩 가닥 양자 모두가 그 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 기타 산물로 일컬어질 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명에 따라 투여될 결합제를 인코딩하는 RNA는 비-면역원성이다.

본원에 사용된 용어 "비면역원성 RNA"는 예를 들어 포유동물에 투여시 면역계에 의한 반응을 유도하지 않거나, 상기 비면역원성 RNA를 비면역원성으로 만드는 변형 및 처리를 받지 않았다는 점에서만 다른 동일한 RNA에 의해 유도되었을 것보다, 즉 표준 RNA (stdRNA)에 의해 유도되었을 것보다 약한 반응을 유도하는 RNA를 지칭한다. 하나의 바람직한 구체예에서, 본원에서 변형된 RNA (modRNA)라고도 하는 비-면역원성 RNA는 선천성 면역 수용체의 RNA-매개 활성화를 억제하는 변형된 뉴클레오사이드를 상기 RNA에 혼입하고 이중 가닥 RNA (dsRNA)를 제거함으로써 비면역원성이 된다.

변형된 뉴클레오사이드의 혼입에 의해 비면역원성 RNA를 비면역원성으로 만들기 위해, 그것이 RNA의 면역원성을 낮추거나 억제하는 한 어떠한 변형된 뉴클레오사이드라도 사용될 수 있다. 선천성 면역 수용체의 RNA-매개 활성화를 억제하는 변형된 뉴클레오사이드가 특히 바람직하다. 일 구체예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 하나 이상의 우리딘을 변형된 핵염기를 포함하는 뉴클레오사이드로 대체하는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 변형된 핵염기는 변형된 우라실이다. 일 구체예에서, 상기 변형된 핵염기를 포함하는 뉴클레오사이드는 3-메틸-우리딘 (m³U), 5-메톡시-우리딘 (mo⁵U), 5-아자-우리딘, 6-아자-우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오-우리딘 (s²U), 4-티오-우리딘 (s⁴U), 4-티오-슈도우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 5-하이드록시-우리딘 (ho⁵U), 5-아미노알릴-우리딘, 5-할로-우리딘 (예컨대, 5-요오도-우리딘 또는 5-브로모-우리딘), 우리딘 5-옥시아세트산 (cmo⁵U), 우리딘 5-옥시아세트산 메틸 에스터 (mcmo⁵U), 5-카르복시메틸-우리딘 (cm⁵U), 1-카르복시메틸-슈도우리딘, 5-카르복시하이드록시메틸-우리딘 (chm⁵U), 5-카르복시하이드록시메틸-우리딘 메틸 에스터 (mchm⁵U), 5-메톡시카르보닐메틸-우리딘 (mcm⁵U), 5-메톡시카르보닐메틸-2-티오-우리딘 (mcm⁵s²U), 5-아미노메틸-2-티오-우리딘 (nm⁵s²U), 5-메틸아미노메틸-우리딘 (mnm⁵U), 1-에틸-슈도우리딘, 5-메틸아미노메틸-2-티오-우리딘 (mnm⁵s²U), 5-메틸아미노메틸-2-셀레노-우리딘 (mnm⁵se²U), 5-카르바모일메틸-우리딘 (ncm⁵U), 5-카르복시메틸아미노메틸-우리딘 (cmnm⁵U), 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오-우리딘 (cmnm⁵s²U), 5-프로피닐-우리딘, 1-프로피닐-슈도우리딘, 5-토리노메틸-우리딘 (τm⁵U), 1-토리노메틸-슈도우리딘, 5-토리노메틸-2-티오-우리딘(τm5s2U), 1-토리노메틸-4-티오-슈도우리딘), 5-메틸-2-티오-우리딘 (m⁵s²U),1-메틸-4-티오-슈도우리딘 (m¹s⁴Ψ), 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 3-메틸-슈도우리딘 (m³Ψ), 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 디하이드로우리딘 (D), 디하이드로슈도우리딘, 5,6-디하이드로우리딘, 5-메틸-디하이드로우리딘 (m⁵D), 2-티오-디하이드로우리딘, 2-티오-디하이드로슈도우리딘, 2-메톡시-우리딘, 2-메톡시-4-티오-우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, N1-메틸-슈도우리딘, 3-(3-아미노-3-카르복시프로필)우리딘 (acp³U), 1-메틸-3-(3-아미노-3-카르복시프로필)슈도우리딘 (acp³Ψ), 5-(이소펜테닐아미노메틸)우리딘 (inm⁵U),5-(이소펜테닐아미노메틸)-2-티오-우리딘 (inm⁵s²U),α-티오-우리딘, 2'-O-메틸-우리딘 (Um), 5,2'-O-디메틸-우리딘 (m⁵Um),2'-O-메틸-슈도우리딘 (Ψm), 2-티오-2'-O-메틸-우리딘 (s²Um),5-메톡시카르보닐메틸-2'-O-메틸-우리딘 (mcm⁵Um), 5-카르바모일메틸-2'-O-메틸-우리딘 (ncm⁵Um), 5-카르복시메틸아미노메틸-2'-O-메틸-우리딘 (cmnm⁵Um), 3,2'-O-디메틸-우리딘 (m³Um), 5-(이소펜테닐아미노메틸)-2'-O-메틸-우리딘 (inm⁵Um), 1-티오-우리딘, 데옥시티미딘, 2'-F-아라-우리딘, 2'-F-우리딘, 2'-OH-아라-우리딘, 5-(2-카보메톡시비닐) 우리딘, 및 5-[3-(1-E-프로페닐아미노)우리딘으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 한 가지 특정한 구체예에서, 상기 변형된 핵염기를 포함하는 뉴클레오사이드는 슈도우리딘 (Ψ), N1-메틸-슈도우리딘 (m1Ψ) 또는 5-메틸-우리딘 (m5U), 특히 N1-메틸-슈도우리딘이다.

일 구체예에서, 하나 이상의 우리딘을 변형된 핵염기를 포함하는 뉴클레오사이드로 교체하는 것은 상기 우리딘의 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 교체를 포함한다. T7 RNA 폴리머라제를 사용하는 시험관내 전사 (IVT)에 의한 mRNA 합성 동안, 효소의 비통상적 활성으로 인해 이중 가닥 RNA (dsRNA)를 포함한 상당한 양의 비정상적인 산물이 생성된다. dsRNA는 염증성 사이토카인을 유도하고 효과자 효소를 활성화하여 단백질 합성 억제를 유도한다. dsRNA는 예를 들어, 비-다공성 또는 다공성 C-18 폴리스티렌-디비닐벤젠 (PS-DVB) 매트릭스를 사용하는 이온-쌍 역상 HPLC에 의해, IVT RNA와 같은 RNA로부터 제거될 수 있다. 혹은, dsRNA를 특이적으로 가수분해하지만 ssRNA는 가수분해하지 않는 E. coli RNaseIII를 사용하는 효소 기반 방법을 사용하여, IVT RNA 제조물에서 dsRNA 오염물질을 제거할 수 있다. 또한, dsRNA는 셀룰로오스 물질을 사용하여 ssRNA로부터 분리될 수 있다. 일 구체예에서, RNA 제조물은 셀룰로오스 물질과 접촉되고 ssRNA는 셀룰로오스 물질에 대한 dsRNA의 결합을 허용하고 셀룰로오스 물질에 대한 ssRNA의 결합은 허용하지 않는 조건 하에 셀룰로오스 물질로부터 분리된다.

본원에 사용된 용어 "제거하다" 또는 "제거"는 dsRNA와 같은 제2 물질 집단의 근접성으로부터 분리되는, 비-면역원성 RNA와 같은 제1 물질 집단의 특성을 지칭하는데, 여기서 제1 물질 집단에 반드시 제2 물질이 없는 것은 아니며, 제2 물질의 집단에 반드시 제1 물질이 없는 것은 아니다. 그러나, 제2 물질 집단의 제거를 특징으로 하는 제1 물질 집단은, 제1 및 제2 물질의 분리되지 않은 혼합물과 비교하여 측정상 더 낮은 제2 물질 함량을 갖는다.

일 구체예에서, 비-면역원성 RNA로부터 dsRNA의 제거는, 상기 비면역원성 RNA 조성물 중 RNA의 10% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만, 0.3% 미만, 또는 0.1% 미만이 dsRNA도록, dsRNA의 제거를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 비-면역원성 RNA에는 dsRNA가 없거나 본질적으로 없다. 일 구체예에서, 비-면역원성 RNA 조성물은 단일 가닥 뉴클레오사이드 변형 RNA의 정제된 제조물을 포함한다. 예를 들어, 일 구체예에서, 단일 가닥 뉴클레오사이드 변형 RNA의 정제된 제조물에는 이중 가닥 RNA (dsRNA)가 실질적으로 없다. 일 구체예에서, 정제된 제조물은, 다른 모든 핵산 분자 (DNA, dsRNA 등)에 비해 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 단일 가닥 뉴클레오사이드 변형된 RNA이다.

일 구체예에서, 비-면역원성 RNA는 동일한 서열을 갖는 표준 RNA보다 세포에서 더 효율적으로 번역된다. 일 구체예에서, 번역은 변형되지 않은 카운터파트에 비해 2배로 향상된다. 일 구체예에서, 번역은 3배로 향상된다. 일 구체예에서, 번역은 4배로 향상된다. 일 구체예에서, 번역은 5배로 향상된다. 일 구체예에서, 번역은 6배로 향상된다. 일 구체예에서, 번역은 7배로 향상된다. 일 구체예에서, 번역은 8배로 향상된다. 일 구체예에서, 번역은 9배로 향상된다. 일 구체예에서, 번역은 10배로 향상된다. 일 구체예에서, 번역은 15배로 향상된다. 일 구체예에서, 번역은 20배로 향상된다. 일 구체예에서, 번역은 50배로 향상된다. 일 구체예에서, 번역은 100배로 향상된다. 일 구체예에서, 번역은 200배로 향상된다. 일 구체예에서, 번역은 500배로 향상된다. 일 구체예에서, 번역은 1000배로 향상된다. 일 구체예에서, 번역은 2000배로 향상된다. 일 구체예에서, 인자는 10-1000배이다. 일 구체예에서, 인자는 10-100배이다. 일 구체예에서, 인자는 10-200배이다. 일 구체예에서, 인자는 10-300배이다. 일 구체예에서, 인자는 10-500배이다. 일 구체예에서, 인자는 20-1000배이다. 일 구체예에서, 인자는 30-1000배이다. 일 구체예에서, 인자는 50-1000배이다. 일 구체예에서, 인자는 100-1000배이다. 일 구체예에서, 인자는 200-1000배이다. 일 구체예에서, 번역은 임의의 다른 상당한 양 또는 범위량으로 향상된다.

일 구체예에서, 비-면역원성 RNA는 동일한 서열을 갖는 표준 RNA보다 상당히 덜 선천성 면역원성을 나타낸다. 일 구체예에서, 비-면역원성 RNA는 그의 비변형 카운터파트보다 2배 더 적은 선천성 면역 반응을 나타낸다. 일 구체예에서, 선천성 면역원성은 3배로 감소된다. 일 구체예에서, 선천성 면역원성은 4배로 감소된다. 일 구체예에서, 선천성 면역원성은 5배로 감소된다. 일 구체예에서, 선천성 면역원성은 6배로 감소된다. 일 구체예에서, 선천성 면역원성은 7배로 감소된다. 일 구체예에서, 선천성 면역원성은 8배로 감소된다. 일 구체예에서, 선천성 면역원성은 9배로 감소된다. 일 구체예에서, 선천성 면역원성은 10배로 감소된다. 일 구체예에서, 선천성 면역원성은 15배로 감소된다. 일 구체예에서, 선천성 면역원성은 20배로 감소된다. 일 구체예에서, 선천적 면역원성은 50배로 감소된다. 일 구체예에서, 선천성 면역원성은 100배로 감소된다. 일 구체예에서, 선천성 면역원성은 200배로 감소된다. 일 구체예에서, 선천성 면역원성은 500배로 감소된다. 일 구체예에서, 선천성 면역원성은 1000배로 감소된다. 일 구체예에서, 선천성 면역원성은 2000배로 감소된다.

"상당히 덜 선천적 면역원성을 나타낸다"는 용어는 선천성 면역원성의 검출가능한 감소를 지칭한다. 일 구체예에서, 상기 용어는 검출가능한 선천성 면역 반응을 촉발하지 않고 유효량의 비-면역원성 RNA가 투여될 수 있도록 하는 감소를 지칭한다. 일 구체예에서, 상기 용어는 비-면역원성 RNA에 의해 인코딩되는 단백질의 생산을 검출가능하게 감소시키기에 충분한 선천적 면역 반응을 유도하지 않으면서 비-면역원성 RNA가 반복적으로 투여될 수 있도록 하는 감소를 지칭한다. 일 구체예에서, 상기 감소는 비-면역원성 RNA가 상기 비-면역원성 RNA에 의해 인코딩되는 단백질의 검출가능한 생산을 제거하기에 충분한 선천적 면역 반응을 유도하지 않고 반복적으로 투여될 수 있도록 한다. "면역원성"은 RNA와 같은 이물질이 인간이나 다른 동물의 신체에서 면역 반응을 유발하는 능력이다. 선천적 면역계는 상대적으로 비특이적이고 즉각적인 면역 체계의 구성 요소이다. 이는, 적응 면역계와 함께 척추동물 면역 체계의 두 가지 주요 구성 요소 중 하나이다.

본원에 사용되는 바 "내인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로부터 또는 그 내부에서 생성되는 임의의 물질을 지칭한다.

본원에 사용되는 바 용어 "외인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로부터 도입되거나 그 외부에서 생성되는 임의의 물질을 지칭한다.

본원에 사용되는 바 용어 "발현"은 특정 뉴클레오타이드 서열의 전사 및/또는 번역으로 정의된다.

본원에 사용되는 바 용어 "연결된", "융합된" 또는 "융합"은 상호교환적으로 사용된다. 이들 용어는 둘 이상의 요소 또는 구성 요소 또는 도메인을 함께 결합하는 것을 나타낸다.

코돈-최적화 / G/C 함량 증가

일부 구체예에서, 본원에 기재된 결합제의 아미노산 서열은 코돈-최적화된 코딩 서열 및/또는 그의 G/C 함량이 야생형 코딩 서열에 비해 증가된 코딩 서열에 의해 코딩된다. 이것은 또한 코딩 서열의 하나 이상의 서열 영역이 야생형 코딩 서열의 상응하는 서열 영역과 비교하여 G/C 함량에서 코돈-최적화된 및/또는 증가된 구체예를 포함한다. 일 구체예에서, 코돈-최적화된 및/또는 G/C 함량의 증가는 좋기로는 인코딩된 아미노산 서열의 서열을 변화시키지 않는다.

"코돈-최적화된"이라는 용어는, 좋기로는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 변경하지 않으면서, 숙주 유기체의 전형적인 코돈 사용을 반영하도록 상기 핵산 분자의 코딩 영역에서의 코돈의 변경을 지칭하는 것으로 당업자에 의해 이해된다. 본 발명의 맥락 내에서, 코딩 영역은 좋기로는 본원에 개시되는 RNA 분자를 사용하여 치료될 대상체에서 최적의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 코돈-최적화는 번역 효율이 또한 세포의 tRNA의 상이한 발생 빈도에 따라 결정된다는 발견을 기반으로 한다. 따라서, RNA의 서열은 "희귀 코돈" 대신에 빈번하게 존재하는 tRNA가 이용가능한 코돈이 삽입되도록 변형될 수 있다.

본 발명의 일부 구체예에서, 본원에 설명된 RNA의 코딩 영역의 구아노신/시토신 (G/C) 함량은 야생형 RNA의 상응하는 코딩 서열의 G/C 함량과 비교하여 증가되고, 여기서 상기 RNA에 의해 인코딩되는 아미노산 서열은 좋기로는 상기 야생형 RNA에 의해 인코딩되는 아미노산 서열과 비교하여 변형되지 않는다. RNA 서열의 이러한 변형은 번역될 임의의 RNA 영역의 서열이 그 mRNA의 효율적인 번역에 중요하다는 사실에 기초한다. 증가된 G(구아노신)/C(시토신) 함량을 갖는 서열은 증가된 A(아데노신)/U(우라실) 함량을 갖는 서열보다 더 안정하다. 여러 코돈이 하나의 그리고 동일한 아미노산을 코딩한다는 사실 (소위 유전자 코드의 축퇴)과 관련하여, 안정성에 가장 유리한 코돈을 결정할 수 있다 (소위 대체 코돈 사용). RNA에 의해 인코딩되는 아미노산에 따라, RNA 서열의 변형 가능성은 그 야생형 서열에 비해 다양하다. 특히, A 및/또는 U 뉴클레오타이드를 포함하는 코돈은, 동일한 아미노산을 코딩하지만 A 및/또는 U를 포함하지 않거나 더 낮은 함량의 A 및/또는 U 뉴클레오타이드를 포함하는 다른 코돈으로 이러한 코돈을 대체함으로써 변형될 수 있다.

다양한 구체예에서, 본원에 기재된 RNA의 코딩 영역의 G/C 함량은 야생형 RNA의 코딩 영역의 G/C 함량과 비교하여 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 또는 그 이상으로 증가된다.

핵산 함유 입자

결합제를 인코딩하는 RNA와 같은 본원에 기재되는 핵산은 입자로서 제형화되어 투여될 수 있다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "입자"는 분자 또는 분자 복합체에 의해 형성되는 구조화된 실체에 관한 것이다. 일 구체예에서, 용어 "입자"는 매질에 분산된 마이크로- 또는 나노- 크기의 콤팩트 구조와 같은 마이크로- 또는 나노- 크기의 구조에 관한 것이다. 일 구체예에서, 입자는 DNA, RNA 또는 이들의 혼합물을 포함하는 입자와 같은 핵산 함유 입자이다.

폴리머 및 지질과 같은 양전하를 띤 분자와, 음전하를 띤 핵산 사이의 정전기적 상호작용이 입자 형성에 관여한다. 이것이 핵산 입자의 복합화 및 자발적 형성을 초래한다. 일부 구체예에서, 핵산 입자는 나노입자이다.

본 발명에서 사용되는 바 "나노입자"는 비경구 투여에 적합한 평균 직경을 갖는 입자를 의미한다.

"핵산 입자"는 관심 표적 부위 (예를 들어, 세포, 조직, 기관 등)에 핵산을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 핵산 입자는, 하나 이상의 양이온성 또는 양이온성으로 이온화 가능한 지질 또는 지질-유사 물질, 프로타민과 같은 하나 이상의 양이온성 폴리머, 또는 이들의 혼합물과, 핵산으로부터 형성될 수 있다. 핵산 입자에는 지질 나노 입자 (LNP)-기반 및 리포플렉스 (LPX)-기반 제형이 포함된다.

어떠한 이론에도 구속되지 않고, 양이온성 또는 양이온성으로 이온화 가능한 지질 또는 지질-유사 물질 및/또는 양이온성 폴리머는 핵산과 함께 결합하여 응집체를 형성하고, 이러한 응집체는 콜로이드적으로 안정한 입자를 결과하는 것으로 여겨진다.

일 구체예에서, 본원에 기재되는 입자는, 양이온성 또는 양이온성으로 이온화 가능한 지질 또는 지질-유사 물질 이외의 하나 이상의 지질 또는 지질-유사 물질, 양이온성 폴리머가 아닌 하나 이상의 폴리머, 또는 이들의 혼합물을 추가로 포함한다.

일 구체예에서, 핵산 입자는 하나 이상의 유형의 핵산 분자를 포함하며, 여기서 핵산 분자의 분자 파라미터는 서로 유사하거나 상이할 수 있는데, 몰 질량 또는 분자 구조와 같은 기본 구조 요소, 캡핑, 코딩 영역 또는 기타 특징과 관련하여와 같이 그러할 수 있다. 본원에 기재되는 핵산 입자는, 일부 구체예에서 약 30 nm 내지 약 1000 nm, 약 50 nm 내지 약 800 nm, 약 70 nm 내지 약 600 nm, 약 90 nm 내지 약 400 nm 범위 또는 약 100 nm 내지 약 300 nm의 범위인 평균 직경을 가질 수 있다.

본원에 기재되는 핵산 입자는 약 0.5 미만, 약 0.4 미만, 약 0.3 미만, 또는 약 0.2 미만의 다분산 지수를 나타낼 수 있다. 예로서, 핵산 입자는 약 0.1 내지 약 0.3 또는 약 0.2 내지 약 0.3 범위의 다분산 지수를 나타낼 수 있다.

RNA 지질 입자와 관련하여, N/P 비는 RNA 내 포스페이트 기의 수에 대한 지질 내 질소 기의 비율을 제시한다. 질소 원자 (pH에 따라 다름)는 일반적으로 양전하를 띠고 포스페이트 기는 음전하를 띠기 때문에, 이는 전하 비와 상관 관계가 있다. 전하 평형이 존재하는, N/P 비율은 pH에 따라 달라진다. 양으로 하전된 나노입자가 형질감염에 유리한 것으로 간주되기 때문에, 지질 제형은 흔히 4 초과 12 이하의 N/P 비로 형성된다. 이 경우 RNA는 나노 입자에 완전히 결합된 것으로 간주된다.

본원에 기재되는 핵산 입자는, 하나 이상의 양이온성 또는 양이온성으로 이온화 가능한 지질 또는 지질-유사 물질 및/또는 하나 이상의 양이온성 폴리머로부터 콜로이드를 수득하는 단계 및 콜로이드를 핵산과 혼합하여 핵산 입자를 수득하는 단계를 포함할 수 있는 광범위한 방법을 사용하여 제조될 수 있다.

본원에 사용되는 바 용어 "콜로이드"는 분산된 입자가 가라앉지 않는 균질한 혼합물의 유형에 관한 것이다. 혼합물 내 불용성 입자는 1에서 1000 나노미터 사이의 입자 크기를 갖는 미시성이다. 혼합물은 콜로이드 또는 콜로이드 현탁액이라고 칭할 수 있다. 때때로 "콜로이드"라는 용어는 전체 현탁액이 아니라 혼합물의 입자만을 나타낸다.

하나 이상의 양이온성 또는 양이온성으로 이온화 가능한 지질 또는 지질-유사 물질 및/또는 하나 이상의 양이온성 폴리머를 포함하는 콜로이드의 제조를 위해, 리포솜 소포를 제조하기 위해 통상적으로 사용되며 적절하게 적용되는 방법이 본원에서 적용 가능하다. 리포솜 소포를 제조하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 방법은 다음과 같은 기본 단계를 공유한다: (i) 유기 용매에서 지질 용해, (ii) 생성된 용액의 건조, 및 (iii) 건조된 지질의 수화 (다양한 수성 매질 사용).

막 수화법에서, 지질은 먼저 적절한 유기 용매에 용해되고 건조되어 플라스크 바닥에 박막을 생성한다. 얻어진 지질 필름은 적절한 수성 매질을 사용하여 수화되어 리포솜 분산액을 생성한다. 또한, 추가적인 다운사이징 단계가 포함될 수 있다.

역상 증발은, 수성상과 지질을 포함하는 유기상 사이에 유-중-수 에멀젼의 형성을 포함하는, 리포솜 소포를 제조하기 위한, 막 수화의 대안적 방법이다. 이러한 혼합물의 간단한 초음파 처리는 시스템 균질화에 필요하다. 감압 하에서 유기상을 제거하면 유백색 겔이 생성되며, 이는 후속적으로 리포솜 현탁액으로 변한다.

"에탄올 주입 기술"이라는 용어는 지질을 포함하는 에탄올 용액을 바늘을 통해 수용액에 빠르게 주입하는 공정을 의미한다. 이러한 작용은 용액 전체에 지질을 분산시키고 지질 구조 형성, 예를 들어 리포솜 형성과 같은 지질 소포 형성을 촉진한다. 일반적으로, 본원에 기재되는 RNA 리포플렉스 입자는 RNA를 콜로이드성 리포솜 분산액에 첨가함으로써 얻을 수 있다. 에탄올 주입 기술을 사용하여, 이러한 콜로이드성 리포솜 분산액은 일 구체예에서 다음과 같이 형성된다: 양이온성 지질 및 추가적인 지질과 같은 지질을 포함하는 에탄올 용액을 교반하에 수용액에 주입. 일 구체예에서, 본원에 기재되는 RNA 리포플렉스 입자는 압출 단계 없이 수득가능하다.

"압출하다" 또는 "압출"이라는 용어는 고정된, 단면 프로파일을 갖는 입자의 생성을 의미한다. 특히, 이것은 그에 의하여 입자가 한정된 구멍을 갖는 필터를 통해 강제되는, 입자의 다운사이징을 의미한다.

유기 용매가 없는 특성을 갖는 다른 방법 또한 콜로이드를 제조하기 위해 본 발명에 따라 사용될 수 있다.

LNP는 일반적으로 4가지 구성 요소를 포함한다: 이온화 가능한 양이온성 지질, 인지질과 같은 중성 지질, 콜레스테롤과 같은 스테로이드, 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-지질과 같은 폴리머 접합된 지질. 각 구성 요소는 페이로드 보호를 담당하며 효과적인 세포 내 전달을 가능하게 한다. LNP는 에탄올에 용해된 지질을 수성 완충액에서 핵산과 빠르게 혼합함으로써 제조될 수 있다.

"평균 직경"이라는 용어는 소위 누적 알고리즘을 사용한 데이터 분석과 함께 동적 레이저 광 산란 (DLS)에 의해 측정된 입자의 평균 유체역학적 직경을 말하며, 이는 결과로서 길이 차원을 갖는 소위 재버리지 (Zaverage) 및 무차원인 다분산 지수 (PI)를 제공한다 (Koppel, D., J. Chem. Phys. 57, 1972, pp 4814-4820, ISO 13321). 본원에서, "평균 직경", "직경" 또는 입자에 대한 "크기"는 이 재버리지 값과 동의어로 사용된다.

"다분산 지수"는 좋기로는, 상기 "평균 직경"의 정의에 언급된 바와 같은 소위 누적 분석에 의한 동적 광산란 측정에 기초하여 계산된다. 특정 전제 조건 하에서 이것을 나노 입자 총체 (ensemble)의 크기 분포의 척도로 취할 수 있다.

입자를 포함하는 여러 유형의 핵산이 미립자 형태로 핵산 전달에 적합한 것으로 이전에 설명되었다 (예컨대, Kaczmarek, J. C. et al, 2017, Genome Medicine 9, 60). 비바이러스 핵산 전달 비히클의 경우, 핵산의 나노입자 캡슐화는 핵산이 분해되지 않도록 물리적으로 보호하고, 특정 화학에 따라, 세포 흡수 및 엔도솜 탈출을 도울 수 있다.

본 발명은 핵산, 하나 이상의 양이온성 또는 양이온성으로 이온화 가능한 지질 또는 지질-유사 물질, 및/또는 핵산과 결합하여 핵산 입자를 형성하는 하나 이상의 양이온성 폴리머를 포함하는 입자, 및 이러한 입자를 포함하는 조성물을 개시한다. 핵산 입자는, 입자와의 비-공유적 상호작용에 의해 여러 형태로 복합체화되는 핵산을 포함할 수 있다. 본원에 기재되는 입자는 바이러스 입자, 특히 감염성 바이러스 입자가 아니며, 즉 이들은 바이러스성으로 세포를 감염시킬 수 없다. 적합한 양이온성 또는 양이온성으로 이온화 가능한 지질 또는 지질-유사 물질 및 양이온성 폴리머는, 핵산 입자를 형성하고, 용어 "입자 형성 성분" 또는 "입자 형성 제제"에 포함되는 것들이다. 용어 "입자 형성 성분" 또는 "입자 형성 제제"는 핵산과 결합하여 핵산 입자를 형성하는 임의의 성분에 관한 것이다. 이러한 성분은 핵산 입자의 일부일 수 있는 임의의 성분을 포함한다.

양이온성 폴리머

높은 수준의 화학적 유연성으로 인해 폴리머는 나노 입자-기반 전달에 흔히 사용되는 재료이다. 일반적으로 양이온성 폴리머는 음전하를 띤 핵산을 나노입자로 정전기적으로 응축시키는 데 사용된다. 이러한 양전하를 띤 그룹은 종종 5.5에서 7.5 사이의 pH 범위에서 그들의 양성자화 상태가 변하는 아민으로 구성되며, 이는 엔도솜 파열을 초래하는 이온 불균형을 초래하는 것으로 여겨진다. 폴리-L-리신, 폴리아미도아민, 프로타민 및 폴리에틸렌이민과 같은 폴리머, 뿐만 아니라 키토산과 같은 자연 발생적 폴리머는 모두 핵산 전달에 적용되었으며 본원의 일부 구체예에서 유용한 양이온성 물질로서 적합하다. 또한, 일부 연구자들은 핵산 전달을 위해 특별히 폴리머 물질을 합성하였다. 폴리(β-아미노 에스터)는, 특히, 그의 합성 및 생분해성의 용이성에 기하여 핵산 전달에 널리 사용되었다. 이러한 합성 폴리머는 본원의 양이온성 폴리머로서 사용하기에 적합할 수 있다.

본원에서 사용되는 바 "폴리머"는 그의 통상적인 의미, 즉 공유 결합에 의해 연결된 하나 이상의 반복 단위 (단량체)를 포함하는 분자 구조로 주어진다. 반복 단위는 모두 동일할 수 있고; 혹은, 어떤 경우에는 폴리머 내에 하나 이상의 유형의 반복 단위가 존재할 수 있다. 일부 경우에, 폴리머는 생물학적 유래성이며, 예를 들어 단백질과 같은 생체고분자이다. 일부 경우에, 추가적인 모이어티 역시 폴리머 분자에 존재할 수 있는데, 예를 들어 본원에 기재된 것과 같은 표적화 모이어티이다.

하나 이상의 유형의 반복 단위가 폴리머 내에 존재하는 경우, 그 폴리머를 "코폴리머"라고 한다. 본 발명에 따라 사용되는 폴리머는 코폴리머일 수 있다. 코폴리머를 형성하는 반복 단위는 임의의 방식으로 배열될 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서 반복 단위는 무작위 순서로 배열될 수 있으며; 교대 순서로, 또는 "블록" 코폴리머로서 배열될 수 있는데, 즉 각각 제1 반복 단위 (예를 들어, 제1 블록)를 포함하는 하나 이상의 영역, 및 각각 제2 반복 단위 (예를 들어, 제2 블록)를 포함하는 하나 이상의 영역 등을 포함한다. 블록 코폴리머는 2개 (이중 블록 코폴리머), 3개 (삼중 블록 코폴리머) 또는 그 이상의 개별 블록을 가질 수 있다.

특정 구체예에서, 폴리머는 생체적합성이다. 생체적합성 폴리머는 일반적으로 중간 농도에서 심각한 세포 사멸을 일으키지 않는 폴리머이다. 특정 구체예에서, 생체적합성 폴리머는 생분해성이며, 즉 폴리머는 체내와 같은 생리학적 환경 내에서 화학적 및/또는 생물학적으로 분해될 수 있다.

특정 구체예에서, 폴리머는 프로타민 또는 폴리알킬렌이민, 특히 프로타민일 수 있다.

용어, "프로타민"은 아르기닌이 풍부하고 (물고기와 같은) 여러 동물의 정자 세포에서 체세포 히스톤 대신 특히 DNA와 관련된 것으로 발견되는 비교적 저분자량의 다양한 강염기성 단백질을 지칭한다. 특히, "프로타민"이라는 용어는 강염기성이고, 물에 용해성이며, 열에 의해 응고되지 않고, 가수분해시 주로 아르기닌을 생성하는, 어류 정자에서 발견되는 단백질을 지칭한다. 정제된 형태로, 이들은 인슐린의 지속형 제형에 사용되며 헤파린의 항응고 효과를 중화하는 데 사용된다.

본원에 따라, 본원에 사용되는 용어 "프로타민"은 천연 또는 생물학적 원으로부터 얻어지거나 유래되는 프로타민 아미노산 서열, 예컨대 그의 단편 및 상기 아미노산 서열의 다량체 형태 또는 그의 단편, 및 인공적이며 특정 목적을 위해 특이적으로 설계되고 천연 또는 생물학적 공급원으로부터 단리될 수 없는 (합성) 폴리펩타이드를 모두 지칭한다.

일 구체예에서, 폴리알킬렌이민은 폴리에틸렌이민 및/또는 폴리프로필렌이민, 좋기로는 폴리에틸렌이민을 포함한다. 바람직한 폴리알킬렌이민은 폴리에틸렌이민 (PEI)이다. PEI의 평균 분자량은 좋기로는 0.75·102 내지 107 Da, 좋기로는 1000 내지 105 Da, 보다 좋기로는 10000 내지 40000 Da, 더욱 좋기로는 15000 내지 30000 Da, 더욱 더 좋기로는 20000 내지 25000 Da이다.

본 발명에서 바람직한 것은 선형 폴리에틸렌이민 (PEI)과 같은 선형 폴리알킬렌이민이다.

본원에서 사용하기 위해 고려되는 양이온성 폴리머 (예를 들어, 다가양이온성 폴리머를 포함)는 핵산에 정전기적으로 결합할 수 있는 모든 양이온성 폴리머를 포함한다. 일부 구체예에서, 본원에서 사용하기 위해 고려되는 양이온성 폴리머는 예를 들어 핵산과 함께 복합체를 형성하거나 핵산이 그 안에 둘러싸이거나 캡슐화되는 소포를 형성함으로써, 핵산이 그와 결합될 수 있는 임의의 양이온성 폴리머 를 포함한다.

본원에 기재되는 입자는 양이온성 폴리머 이외의 폴리머, 즉 비-양이온성 폴리머 및/또는 음이온성 폴리머를 포함할 수 있다. 총체적으로, 음이온성 및 중성 폴리머는 본원에서 비-양이온성 폴리머로 지칭된다.

지질 및 지질-유사 물질

용어 "지질" 및 "지질-유사 물질"은, 하나 이상의 소수성 모이어티 또는 그룹 및 선택적으로 또한 하나 이상의 친수성 모이어티 또는 그룹을 포함하는 분자를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 소수성 모이어티 및 친수성 모이어티를 포함하는 분자는 또한 종종 양친매성 물질로 표시된다. 지질은 일반적으로 물에 잘 녹지 않는다. 수성 환경에서 양친매성 성질은 분자로 하여금 조직화된 구조 및 다른 상 (phase) 내로 자가-조립되도록 한다. 이들 상 중 하나는, 그들이 수성 환경에서 소포, 다층/단층 리포솜 또는 막에 존재할 때, 지질 이중층으로 구성된다. 소수성은 장쇄 포화 및 불포화 지방족 탄화수소 그룹 및 하나 이상의 방향족, 지환족 또는 헤테로시클릭 그룹(들)로 치환된 그러한 그룹을 포함하지만 이에 제한되지 않는 비극성 그룹을 포함한다. 친수성 그룹은 극성 및/또는 하전된 그룹을 포함할 수 있고 탄수화물, 포스페이트, 카르복실, 설페이트, 아미노, 설프하이드릴, 니트로, 하이드록실, 및 기타 유사한 그룹을 포함할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바, 용어 "양친매성"은 극성 부분 및 비-극성 부분 모두를 갖는 분자를 지칭한다. 종종 양친매성 화합물은 긴 소수성 꼬리에 부착되는 극성 헤드를 갖는다. 일부 구체예에서, 극성 부분은 물에 용해되는 반면, 비-극성 부분은 물에 불용성이다. 또한 극성 부분은 형식적 양전하 또는 형식적 음전하를 가질 수 있다. 혹은, 극성 부분은 형식적 양전하 및 음전하를 모두 가질 수 있고, 양쪽성 이온 (zwitter ion) 또는 내부 염일 수 있다. 본 명세서의 목적상, 양친매성 화합물은 하나 또는 복수의 천연 또는 비-천연 지질 및 지질-유사 화합물일 수 있지만 이에 제한되지 않는다.

"지질-유사 물질", "지질-유사 화합물" 또는 "지질-유사 분자"라는 용어는 구조적으로 및/또는 기능적으로 지질에 관한 것이지만 엄격한 의미에서 지질로 간주되지 않을 수 있는 물질에 관한 것이다. 예를 들어, 이 용어는 그들이 수성 환경에서 소포, 다층/단층 리포솜 또는 막에 존재할 때 양친매성 층을 형성할 수 있는 화합물을 포함하고, 계면활성제 또는 친수성 및 소수성 모이어티를 모두 갖는 합성 화합물을 포함한다. 일반적으로 말해서, 이 용어는, 지질의 그것과 유사하거나 유사하지 않을 수 있는 상이한 구조적 조직을 갖는 친수성 및 소수성 모이어티들을 포함하는 분자를 지칭한다. 본원에 사용되는 바, 용어 "지질"은 본원에 자가 나타내지 않거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 지질 및 지질-유사 물질 모두를 포괄하는 것으로 해석되어야 한다.

양친매성 층에 포함될 수 있는 양친매성 화합물의 특정한 예는 인지질, 아미노리피드 및 스핑고리피드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

특정 구체예에서, 양친매성 화합물은 지질이다. "지질"이라는 용어는 물에 녹지 않지만 많은 유기 용매에 용해되는 것을 특징으로 하는 유기 화합물 그룹을 지칭한다. 일반적으로 지질은 8개 범주로 나뉠 수 있다: 지방산, 글리세로리피드, 글리세로인지질, 스핑고리피드, 새커로리피드, 폴리케타이드 (케토아실 서브유닛의 축합에서 유래), 스테롤 지질 및 프레놀 지질 (이소프렌 서브유닛의 축합에서 유래). "지질"이라는 용어는 때때로 지방 (fat)의 동의어로 사용되지만 지방은 트리글리세리드라고 불리는 지질의 하위 그룹이다. 지질은 또한 지방산 및 그 유도체와 같은 분자 (트리-, 디-, 모노글리세리드 및 인지질 포함) 및 콜레스테롤과 같은 스테롤-함유 대사 산물을 포함한다.

지방산 또는 지방산 잔기는 카르복실산 기로 끝나는 탄화수소 사슬로 구성된 다양한 분자 그룹으로; 이러한 배열은 분자에 극성의 친수성 말단과 물에 불용성인 비극성의 소수성 말단을 부여한다. 일반적으로 길이가 4개에서 24개 사이인 탄소 사슬은 포화되거나 불포화될 수 있으며 산소, 할로겐, 질소 및 황을 포함하는 작용기에 부착될 수 있다. 지방산에 이중 결합이 포함되어 있으면 시스 또는 트랜스 기하 이성질체의 가능성이 있으며, 이는 분자 형태에 상당한 영향을 미친다. 시스-이중 결합은 지방산 사슬을 구부러지게 하며, 이는 사슬 내 더 많은 이중 결합으로 구성되는 효과이다. 지방산 범주의 다른 주요 지질 부류는 지방 에스터와 지방 아미드이다.

글리세로리피드는 모노-, 디- 및 트리-치환된 글리세롤로 구성되며, 가장 잘 알려진 것은 트리글리세리드라고 하는 글리세롤의 지방산 트리에스터이다. "트리아실글리세롤"이라는 용어는 때로 "트리글리세리드"와 동의로 사용된다. 이들 화합물에서, 글리세롤의 3개의 하이드록실 그룹은 일반적으로 여러 지방산에 의해 각각 에스터화된다. 글리세로리피드의 추가적인 하위 부류는 글리코시드 결합을 통해 글리세롤에 부착되는 하나 이상의 당 잔기의 존재를 특징으로 하는 글리코실글리세롤로 대표된다.

글리세로인지질은, 에스터 결합에 의해 2개의 지방산-유래 "꼬리"에 연결되고, 인산 에스터 결합에 의해 하나의 "헤드" 그룹에 연결되는, 글리세롤 코어를 포함하는 양친매성 분자 (소수성 및 친수성 영역 모두 포함)이다. 일반적으로 인지질 (스핑고미엘린도 인지질로 분류되지만)이라고 하는 글리세로인지질의 예는, 포스파티딜콜린 (PC, GPCho 또는 레시틴으로도 알려짐), 포스파티딜에탄올아민 (PE 또는 GPEtn) 및 포스파티딜세린 (PS 또는 GPSer)이다.

스핑고리피드는 공통 구조적 특징인 스핑고이드 염기 백본을 공유하는 복합 화합물 패밀리이다. 포유동물의 주요 스핑고이드 염기는 일반적으로 스핑고신이라고 불린다. 세라마이드 (N-아실-스핑고이드 염기)는 아미드-결합 지방산을 가지는 스핑고이드 염기 유도체의 주요 하위 부류이다. 지방산은 전형적으로 16 내지 26개의 탄소 원자 사슬 길이를 갖고 포화되거나 단일-불포화된다. 포유동물의 주요 포스포스핑고지질은 스핑고미엘린 (세라마이드 포스포콜린)인 반면, 곤충은 주로 세라마이드 포스포에탄올아민을 함유하고 곰팡이는 피토세라마이드 포스포이노시톨과 만노스-함유 헤드그룹을 갖는다. 글리코스핑고리피드는 글리코시드 결합을 통해 스핑고이드 염기에 연결된 하나 이상의 당 잔기로 구성된 다양한 분자 패밀리이다. 이들의 예는 세레브로사이드 및 갱글리오사이드와 같은 단순 및 복합 글리코스핑고리피드이다.

콜레스테롤 및 그 유도체, 또는 토코페롤 및 그 유도체와 같은 스테롤 지질은 글리세로인지질 및 스핑고미엘린과 함께 막 지질의 중요한 구성 요소이다.

새커로리피드는, 지방산이 당 백본에 직접 연결되어 막 이중층과 호환되는 구조를 형성하는 화합물을 설명한다. 새커로리피드에서 단당류는 글리세로리피드 및 글리세로인지질에 존재하는 글리세롤 백본을 대체한다. 가장 친숙한 새커로리피드는 그람-음성 세균의 지질다당류의 지질 A 성분의 아실화된 글루코사민 전구체이다. 전형적인 지질 A 분자는 글루코사민의 이당류이며, 이는 무려 7개의 지방산-아실 사슬로 유도체화된다. 대장균에서 성장에 필요한 최소 지질다당류는 Kdo2-지질 A로, 2개의 3-데옥시-D-만노옥툴로손산 (Kdo) 잔기로 글리코실화된 글루코사민의 헥사-아실화된 이당류이다.

폴리케타이드는, 고전적인 효소 뿐만 아니라 상기 지방산 합성효소와 기계적 특징을 공유하는 반복적이고 다중 모듈성 효소에 의한 아세틸 및 프로피오닐 서브유닛의 중합에 의해 합성된다. 이들은 동물, 식물, 박테리아, 곰팡이 및 해양 원으로부터의 많은 2차 대사 산물과 천연 산물을 포함하며 구조적 다양성이 뛰어나다. 많은 폴리케타이드는, 그의 백본이 종종 글리코실화, 메틸화, 하이드록실화, 산화 또는 기타 과정에 의해 추가로 변형되는 고리형 분자이다.

본 발명에 따르면, 지질 및 지질-유사 물질은 양이온성, 음이온성 또는 중성일 수 있다. 중성 지질 또는 지질-유사 물질은 선택된 pH에서 전하를 띠지 않거나 중성 쯔비터이온 형태로 존재한다.

양이온성 또는 양이온성으로 이온화 가능한 지질 또는 지질-유사 물질

본원에 설명된 핵산 입자는 입자 형성 제제로서 하나 이상의 양이온성 또는 양이온성으로 이온화 가능한 지질 또는 지질-유사 물질을 포함할 수 있다. 본원에서 사용하기 위해 고려되는 양이온성 또는 양이온성으로 이온화 가능한 지질 또는 지질-유사 물질은 핵산에 정전기적으로 결합할 수 있는 임의의 양이온성 또는 양이온성으로 이온화 가능한 지질 또는 지질-유사 물질을 포함한다. 일 구체예에서, 본원에서 사용하기 위해 고려되는 양이온성 또는 양이온성으로 이온화 가능한 지질 또는 지질-유사 물질은, 예를 들어 핵산과 복합체를 형성하거나 그 안에서 핵산이 둘러싸이거나 캡슐화되는 소포를 형성함으로써 핵산과 결합될 수 있다.

본원에 사용되는 바, "양이온성 지질" 또는 "양이온성 지질-유사 물질"은 순 양전하를 갖는 지질 또는 지질-유사 물질을 지칭한다. 양이온성 지질 또는 지질-유사 물질은 정전기적 상호작용에 의해 음전하를 띤 핵산에 결합한다. 일반적으로, 양이온성 지질은 스테롤, 아실 사슬, 디아실 또는 더 큰 아실 사슬과 같은 친유성 모이어티를 가지며, 지질의 헤드 그룹은 일반적으로 양전하를 띤다.

특정 구체예에서, 양이온성 지질 또는 지질-유사 물질은 특정 pH, 특히 산성 pH에서만 순 양전하를 갖는 반면, 다른, 좋기로는 생리학적 pH와 같은 더 높은 pH에서는 좋기로는 어떠한 순 양전하를 갖지 않고, 좋기로는 전하를 갖지 않으며, 즉 중성이다. 이러한 이온화 가능 거동은 생리학적 pH에서 양이온성을 유지하는 입자와 비교하여 엔도솜 탈출을 돕고 독성을 감소시켜 효능을 향상시키는 것으로 여겨진다.

본 발명의 목적상, 이러한 "양이온성으로 이온화 가능한" 지질 또는 지질-유사 물질은, 상황과 모순되지 않는 한 용어 "양이온성 지질 또는 지질-유사 물질"에 포함된다.

일 구체예에서, 양이온성 또는 양이온성으로 이온화 가능한 지질 또는 지질-유사 물질은 양전하를 띠거나 양성자화될 수 있는 적어도 하나의 질소 원자 (N)를 포함하는 헤드 그룹을 포함한다.

양이온성 지질의 예는: 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTAP); N,N-디메틸-2,3-디올레일옥시프로필아민 (DODMA), 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTMA), 3-(N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카르바모일)콜레스테롤 (DC-Chol), 디메틸디옥타데실암모늄 (DDAB); 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄-프로판 (DODAP); 1,2-디아실옥시-3-디메틸암모늄 프로판; 1,2-디알킬옥시-3-디메틸암모늄 프로판; 디옥타데실디메틸 암모늄 클로라이드 (DODAC), 1,2-디스테아릴옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판 (DSDMA), 2,3-디(테트라데콕시)프로필-(2-하이드록시에틸)-디메틸아자늄 (DMRIE), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (DMEPC), l,2-디미리스토일-3-트리메틸암모늄 프로판 (DMTAP), 1,2-디올레일옥시프로필-3-디메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드 (DORIE), 및 2,3-디올레오일옥시- N-[2(스퍼민 카르복사마이드)에틸]-N,N-디메틸-l-프로파나뮴 트리플루오로아세테이트 (DOSPA), 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DLinDMA), 1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DLenDMA), 디옥타데실아미도글리실 스퍼민 (DOGS), 3-디메틸아미노-2-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시부탄-4-옥시)-1-(시스,시스-9,12-옥타데카디엔옥시)프로판 (CLinDMA), 2-[5'-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시)-3'-옥사펜톡시)-3-디메틸-1-(시스,시스-9',12'-옥타데카디엔옥시)프로판 (CpLinDMA), N,N-디메틸-3,4-디올레일옥시벤질아민 (DMOBA), 1,2-N,N'-디올레일카르바밀-3-디메틸아미노프로판 (DOcarbDAP), 2,3-디리놀레오일옥시-N,N-디메틸프로필아민 (DLinDAP), 1,2-N,N'-디리놀레일카르바밀-3-디메틸아미노프로판 (DLincarbDAP), 1,2-디리놀레오일카르바밀-3-디메틸아미노프로판 (DLinCDAP), 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란 (DLin-K-DMA), 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란 (DLin-K-XTC2-DMA), 2,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란 (DLin-KC2-DMA), 헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일-4-(디메틸아미노)부타노에이트 (DLin-MC3-DMA), N-(2-하이드록시에틸)-N,N-디메틸-2,3-비스(테트라데실옥시)-1-프로판아미늄브로마이드 (DMRIE), (±)-N-(3-아미노프로필)-N,N-디메틸-2,3-비스(시스-9-테트라데세닐옥시)-1-프로판아미늄브로마이드 (GAP-DMORIE), (±)-N-(3-아미노프로필)-N,N-디메틸-2,3-비스(도데실옥시)-1-프로판아미늄브로마이드 (GAP-DLRIE), (±)-N-(3-아미노프로필)-N,N-디메틸-2,3-비스(테트라데실옥시)-1-프로판아미늄브로마이드 (GAP-DMRIE), N-(2-아미노에틸)-N,N-디메틸-2,3-비스(테트라데실옥시)-1-프로판아미늄브로마이드 (βAE-DMRIE), N-(4-카르복시벤질)-N,N-디메틸-2,3-비스(올레오일옥시)프로판-1-아미늄 (DOBAQ), 2-({8-[(3β)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]옥틸}옥시)-N,N-디메틸-3-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시]프로판-1-아민 (옥틸-CLinDMA), 1,2-디미리스토일-3-디메틸암모늄-프로판 (DMDAP), 1,2-디팔미토일-3-디메틸암모늄-프로판 (DPDAP), N1-[2-((1S)-1-[(3-아미노프로필)아미노]-4-[디(3-아미노-프로필)아미노]부틸카르복사미도)에틸]-3,4-디[올레일옥시]-벤즈아미드 (MVL5), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (DOEPC), 2,3-비스(도데실옥시)-N-(2-하이드록시에틸)-N,N-디메틸프로판-1-암모늄 브로마이드 (DLRIE), N-(2-아미노에틸)-N,N-디메틸-2,3-비스(테트라데실옥시)프로판-1-아미늄 브로마이드 (DMORIE), 디((Z)-논-2-엔-1-일) 8,8'-((((2(디메틸아미노)에틸)티오)카르보닐)아잔디일)디옥타노에이트 (ATX), N,N-디메틸-2,3-비스(도데실옥시)프로판-1-아민 (DLDMA), N,N-디메틸-2,3-비스(테트라데실옥시)프로판-1-아민 (DMDMA), 디((Z)-논-2-엔-1-일)-9-((4-(디메틸아미노부타노일)옥시)헵타데칸디오에이트 (L319), N-도데실-3-((2-도데실카르바모일-에틸)-{2-[(2-도데실카르바모일-에틸)-2-{(2-도데실카르바모일-에틸)-[2-(2-도데실카르바모일-에틸아미노)-에틸]-아미노}-에틸아미노)프로피온아미드 (리피도이드 98N12-5), 1-[2-[비스(2-하이드록시도데실)아미노]에틸-[2-[4-[2-[비스(2 하이드록시도데실)아미노]에틸]피페라진-1-일]에틸]아미노]도데칸-2-올 (리피도이드 C12-200)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

일부 구체예에서, 양이온성 지질은 입자에 존재하는 총 지질의 약 10 몰% 내지 약 100 몰%, 약 20 몰% 내지 약 100 몰%, 약 30 몰% 내지 약 100 몰%, 약 40 몰% 내지 약 100 몰%, 또는 약 50 몰% 내지 약 100 몰%를 포함할 수 있다.

추가적인 지질 또는 지질-유사 물질

본원에 기재된 입자는 양이온성 또는 양이온성으로 이온화 가능한 지질 또는 지질-유사 물질 외에도지질 또는 지질-유사 물질, 즉 비-양이온성 지질 또는 지질-유사 물질을 포함한다 (비-양이온성으로 이온화 가능한 지질 또는 지질-유사 물질 포함). 총체적으로, 음이온성 및 중성 지질 또는 지질-유사 물질은 본원에서 비-양이온성 지질 또는 지질 유사 물질로 지칭된다. 이온화가능/양이온성 지질 또는 지질-유사 물질에 더하여, 콜레스테롤 및 지질과 같은 다른 소수성 모이어티의 추가에 의해 핵산 입자의 제형을 최적화하면 입자 안정성 및 핵산 전달 효율이 향상될 수 있다.

핵산 입자의 전체 전하에 영향을 미치거나 영향을 미치지 않을 수 있는 추가적인 지질 또는 지질-유사 물질이 혼입될 수 있다. 특정 구체예에서, 추가적인 지질 또는 지질-유사 물질은 비-양이온성 지질 또는 지질-유사 물질이다. 비-양이온성 지질은 예를 들어, 하나 이상의 음이온성 지질 및/또는 중성 지질을 포함할 수 있다. 본원에 사용되는 "음이온성 지질"은 선택된 pH에서 음으로 하전된 임의의 지질을 지칭한다. 본원에 사용되는 "중성 지질"은 선택된 pH에서 전하를 띠지 않거나 중성 쯔비터이온 형태 중 하나로 존재하는 다수의 지질 종 중 임의의 것을 지칭한다. 바람직한 구체예에서, 추가적인 지질은 하기 중성 지질 성분 중 하나를 포함한다: (1) 인지질, (2) 콜레스테롤 또는 그의 유도체; 또는 (3) 인지질과 콜레스테롤 또는 이의 유도체의 혼합물. 콜레스테롤 유도체의 예는 콜레스탄올, 콜레스타논, 콜레스테논, 코프로스탄올, 콜레스테릴-2'-하이드록시에틸 에테르, 콜레스테릴-4'-하이드록시부틸 에테르, 토코페롤 및 그의 유도체, 및 그의 혼합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

사용될 수 있는 특정 인지질은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 포스파타이드산, 포스파티딜세린 또는 스핑고미엘린을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 인지질은 특히 디아실포스파티딜콜린, 예컨대 디스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린 (DOPC), 디미리스토일포스파티딜콜린 (DMPC), 디펜타데카노일포스파티딜콜린, 디라우로일포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC), 디아라키도일포스파티딜콜린 (DAPC), 디베헤노일포스파티딜콜린 (DBPC), 디트리코사노일포스파티딜콜린 (DTPC), 디리그노세로일파티딜콜린 (DLPC), 팔미토일올레오일-포스파티딜콜린 (POPC), 1,2-디-O-옥타데세닐-sn-글리세로-3-포스포콜린 (18:0 디에테르 PC), 1-올레오일-2-콜레스테릴헤미숙시노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (OChemsPC), 1-헥사데실-sn-글리세로-3-포스포콜린 (C16 Lyso PC) 및 포스파티딜에탄올아민, 특히 디아실포스파티딜에탄올아민, 예컨대 디올레오일포스파티딜에탄올아민 (DOPE), 디스테아로일-포스파티딜에탄올아민 (DSPE), 디팔미토일-포스파티딜에탄올아민 (DPPE), 디미리스토일-포스파티딜에탄올아민 (DMPE), 디라우로일-포스파티딜에탄올아민 (DLPE), 디피타노일-포스파티딜에탄올아민 (DPyPE), 및 여러 가지 소수성 사슬을 가지는 추가적인 포스파티딜에탄올아민을 포함한다.

바람직한 특정 구체예에서, 추가적인 지질은 DSPC 또는 DSPC 및 콜레스테롤이다. 특정 구체예에서, 핵산 입자는 양이온성 지질 및 추가적인 지질 양자 모두를 포함한다.

일 구체예에서, 본원에 기재되는 입자는 페길화 지질과 같은 폴리머 접합된 지질을 포함한다. 용어 "페길화 지질"은 지질 부분 및 폴리에틸렌 글리콜 부분 양자 모두를 포함하는 분자를 지칭한다. 페길화된 지질은 당업계에 공지되어 있다.

이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 하나 이상의 추가적인 지질의 양과 비교할 때, 하나 이상의 양이온성 지질의 양은 핵산의 전하, 입자 크기, 안정성, 조직 선택성 및 생체활성과 같은 중요한 핵산 입자 특성에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 하나 이상의 추가적인 지질에 대한 하나 이상의 양이온성 지질의 몰비는 약 10:0 내지 약 1:9, 약 4:1 내지 약 1:2, 또는 약 3:1 내지 약 1:1이다.

일부 구체예에서, 비-양이온성 지질, 특히 중성 지질 (예를 들어, 하나 이상의 인지질 및/또는 콜레스테롤)은 입자에 존재하는 총 지질의 약 0 몰% 내지 약 90 몰%, 약 0 몰% 내지 약 80 몰%, 약 0 몰% 내지 약 70 몰%, 약 0 몰% 내지 약 60 몰%, 또는 약 0 몰% 내지 약 50 몰%를 포함할 수 있다.

리포플렉스 입자

본 발명의 특정 구체예에서, 본원에 기재된 RNA는 RNA 리포플렉스 입자에 존재할 수 있다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "RNA 리포플렉스 입자"는 지질, 특히 양이온성 지질, 및 RNA를 함유하는 입자에 관한 것이다. 양전하를 띤 리포솜과 음전하를 띤 RNA 사이의 정전기적 상호작용은 RNA 리포플렉스 입자의 복합화 및 자발적인 형성을 초래한다. 양으로 하전된 리포솜은 일반적으로 DOTMA와 같은 양이온성 지질 및 DOPE와 같은 추가 지질을 사용하여 합성될 수 있다. 일 구체예에서, RNA 리포플렉스 입자는 나노입자이다.

특정 구체예에서, RNA 리포플렉스 입자는 양이온성 지질 및 추가 지질 양자 모두를 포함한다. 예시적인 구체예에서, 양이온성 지질은 DOTMA이고 추가 지질은 DOPE이다.

일부 구체예에서, 하나 이상의 양이온성 지질 대 하나 이상의 추가 지질의 몰비는 약 10:0 내지 약 1:9, 약 4:1 내지 약 1:2, 또는 약 3:1 내지 약 1:1이다. 특정 구체예에서, 몰비는 약 3:1, 약 2.75:1, 약 2.5:1, 약 2.25:1, 약 2:1, 약 1.75:1, 약 1.5:1, 약 1.25:1, 또는 약 1:1이다. 예시적인 구체예에서, 하나 이상의 추가 지질에 대한 하나 이상의 양이온성 지질의 몰 비는 약 2:1이다.

본원에 기재되는 RNA 리포플렉스 입자는 일 구체예에서 약 200 nm 내지 약 1000 nm, 약 200 nm 내지 약 800 nm, 약 250 내지 약 700 nm, 약 400 내지 약 600 nm, 약 300 nm 내지 약 500 nm, 또는 약 350 nm 내지 약 400 nm 범위인 평균 직경을 갖는다. 특정 구체예에서, RNA 리포플렉스 입자는 약 200 nm, 약 225 nm, 약 250 nm, 약 275 nm, 약 300 nm, 약 325 nm, 약 350 nm, 약 375 nm, 약 400 nm, 약 425 nm, 약 450 nm, 약 475 nm, 약 500 nm, 약 525 nm, 약 550 nm, 약 575 nm, 약 600 nm, 약 625 nm, 약 650 nm, 약 700 nm, 약 725 nm, 약 750 nm 약 775 nm, 약 800 nm, 약 825 nm, 약 850 nm, 약 875 nm, 약 900 nm, 약 925 nm, 약 950 nm, 약 975 nm, 또는 약 1000 nm의 평균 직경을 갖는다. 한 가지 구체예에서, RNA 리포플렉스 입자는 약 250 nm 내지 약 700 nm 범위의 평균 직경을 갖는다. 또 다른 구체예에서, RNA 리포플렉스 입자는 약 300 nm 내지 약 500 nm 범위의 평균 직경을 갖는다. 예시적인 구체예에서, RNA 리포플렉스 입자는 약 400 nm의 평균 직경을 갖는다.

RNA 리포플렉스 입자 및 본원에 기재되는 RNA 리포플렉스 입자를 포함하는 조성물은 비경구 투여 후, 특히 정맥내 투여 후 표적 조직으로 RNA의 전달에 유용하다. RNA 리포플렉스 입자는 에탄올 중의 지질 용액을 물 또는 적합한 수상에 주사함으로써 수득될 수 있는 리포솜을 사용하여 제조될 수 있다. 일 구체예에서, 수성 상은 산성 pH를 갖는다. 일 구체예에서, 수성 상은 예를 들어 약 5 mM의 양으로 아세트산을 포함한다. 리포솜은 RNA와 리포솜을 혼합하여 RNA 리포플렉스 입자를 제조하는 데 사용할 수 있다. 일 구체예에서, 리포솜 및 RNA 리포플렉스 입자는 하나 이상의 양이온성 지질 및 하나 이상의 추가 지질을 포함한다. 일 구체예에서, 하나 이상의 양이온성 지질은 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTMA) 및/또는 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판 (DOTAP)을 포함한다. 일 구체예에서, 하나 이상의 추가 지질은 1,2-디-(9Z-옥타데세노일)-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 콜레스테롤 (Chol) 및/또는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC)을 포함한다. 부 구체예에서, 하나 이상의 양이온성 지질은 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTMA)을 포함하고, 하나 이상의 추가 지질은 1,2-디-(9Z-옥타데세노일)-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE)를 포함한다. 일 구체예에서, 리포솜 및 RNA 리포플렉스 입자는 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTMA) 및 1,2-디-(9Z-옥타데세노일)-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE)을 포함한다.

지질 나노 입자(LNP)

일 구체예에서, 본원에 기재되는 RNA와 같은 핵산은 지질 나노입자 (LNP)의 형태로 투여된다. LNP는, 그에 하나 이상의 핵산 분자가 부착되거나 그 안에 하나 이상의 핵산 분자가 캡슐화되는, 입자를 형성할 수 있는 임의의 지질을 포함할 수 있다.

일 구체예에서, LNP는 하나 이상의 양이온성 지질, 및 하나 이상의 안정화 지질을 포함한다. 안정화 지질에는 중성 지질 및 페길화 지질이 포함된다.

일 구체예에서, LNP는 양이온성 지질, 중성 지질, 스테로이드, 폴리머 접합된 지질; 및 지질 나노입자 내에 캡슐화되거나 그와 결합된 RNA를 포함한다.

일 구체예에서, LNP는 40 내지 55 몰%, 40 내지 50 몰%, 41 내지 49 몰%, 41 내지 48 몰%, 42 내지 48 몰%, 43 내지 48 몰%, 44 내지 48 몰%, 45 내지 48 몰%, 46 내지 48 몰%, 47 내지 48 몰%, 또는 47.2 내지 47.8 몰%의 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구체예에서, LNP는 약 47.0, 47.1, 47.2, 47.3, 47.4, 47.5, 47.6, 47.7, 47.8, 47.9 또는 48.0 몰%의 양이온성 지질을 포함한다.

일 구체예에서, 중성 지질은 5 내지 15 몰%, 7 내지 13 몰%, 또는 9 내지 11 몰% 범위의 농도로 존재한다. 일 구체예에서, 중성 지질은 약 9.5, 10 또는 10.5 몰%의 농도로 존재한다.

일 구체예에서, 스테로이드는 30 내지 50 몰%, 35 내지 45 몰% 또는 38 내지 43 몰% 범위의 농도로 존재한다. 일부 구체예에서, 스테로이드는 약 40, 41, 42, 43, 44, 45 또는 46 몰%의 농도로 존재한다.

일 구체예에서, LNP는 1 내지 10 몰%, 1 내지 5 몰%, 또는 1 내지 2.5 몰%의 폴리머 접합된 지질을 포함한다.

일 구체예에서, LNP는, 40 내지 50 몰%의 양이온성 지질; 5 내지 15 몰%의 중성 지질; 35 내지 45 몰%의 스테로이드; 1 내지 10 몰%의 폴리머 접합된 지질; 및 지질 나노입자 내에 캡슐화되거나 그와 결합된 RNA를 포함한다.

일부 구체예에서, 몰%는 지질 나노입자에 존재하는 지질의 총 몰에 기초하여 결정된다.

일 구체예에서, 중성 지질은 DSPC, DPPC, DMPC, DOPC, POPC, DOPE, DOPG, DPPG, POPE, DPPE, DMPE, DSPE, 및 SM으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일 구체예에서, 중성 지질은 DSPC, DPPC, DMPC, DOPC, POPC, DOPE 및 SM으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일 구체예에서, 중성 지질은 DSPC이다.

일 구체예에서, 스테로이드는 콜레스테롤이다.

일 구체예에서, 폴리머 접합된 지질은 페길화된 지질이다. 일 구체예에서, 페길화된 지질은 하기 구조를 갖거나, 그의 약학적으로 허용되는 염, 호변 이성질체 또는 입체 이성질체로:

여기서,

R¹² 및 R¹³은 각각 독립적으로 10 내지 30개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지쇄, 포화 또는 불포화 알킬쇄이며, 여기서 알킬쇄는 임의로 하나 이상의 에스터 결합에 의해 단절되고; w는 30 내지 60 범위의 평균값을 갖는다. 일 구체예에서, R¹² 및 R¹³은 각각 독립적으로 12 내지 16개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄, 포화 알킬쇄이다. 일 구체예에서, w는 40 내지 55 범위의 평균 값을 갖는다. 일 구체예에서, 평균 w는 약 45이다. 일 구체예에서, R¹² 및 R¹³은 각각 독립적으로 약 14개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄, 포화 알킬 사슬이고, w는 약 45의 평균값을 갖는다.

일부 구체예에서, LNP의 양이온성 지질 성분은 화학식 (III)의 구조를 갖거나, 그의 약학적으로 허용되는 염, 호변 이성질체, 전구약물 또는 입체 이성질체로:

여기서,

L¹ 또는 L² 중 하나는 -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O)x-, -S-S-, -C(=O)S-, SC(=O)-, -NRaC(=O)-, -C(=O)NRa-, NRaC(=O)NRa-, -OC(=O)NRa- 또는 -NRaC(=O)O- 이고, L¹ 또는 L² 중 다른 것은 -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O)x-, -SS-, -C(=O)S-, SC(=O)-, -NRaC(=O)-, -C(=O)NRa-, NRaC(=O)NRa-, -OC(=O)NRa- 또는 -NRaC(=O)O- 또는 직접 결합이고;

G¹ 및 G²는 각각 독립적으로 비치환된 C1-C12 알킬렌 또는 C1-C12 알케닐렌이고;

G³는 C1-C24 알킬렌, C1-C24 알케닐렌, C3-C8 사이클로알킬렌, C3-C8 사이클로알케닐렌이고;

Ra는 H 또는 Cl-Cl2알킬이고;

R¹ 및 R²는 각각 독립적으로 C6-C24 알킬 또는 C6-C24 알케닐이고;

R³는 H, OR⁵, CN, -C(=0)0R⁴, -0C(=0)R⁴ 또는 -NR⁵C(=0)R⁴이고;

R⁴는 C1-C12알킬이고;

R⁵는 H 또는 C1-C6알킬이고; 및

x는 0, 1 또는 2이다.

화학식 (III)의 상기 구체예 중 일부에서, 지질은 하기 구조 (IIIA) 또는 (IIIB) 중 하나를 갖고:

또는

여기서,

A는 3 내지 8-원 사이클로알킬 또는 사이클로알킬렌 고리이고;

R⁶는 각 경우에 독립적으로 H, OH 또는 C1-C24알킬이고;

n은 1에서 15 범위의 정수이다.

화학식 (III)의 전술한 구체예 중 일부에서, 지질은 구조 (IIIA)를 갖고, 다른 구체예에서 지질은 구조 (IIIB)를 갖는다.

화학식 (III)의 다른 구체예에서, 지질은 하기 구조 (IIIC) 또는 (IIID) 중 하나를 갖고:

또는

여기서,

y 및 z는 각각 독립적으로 1 내지 12 범위의 정수이다.

화학식 (III)의 상기 구체예 중 임의의 것에서, L¹ 또는 L² 중 하나는 -O(C=O)-이다. 예를 들어, 일부 구체예에서 L¹ 및 L²각각은 -0(C=0)-이다. 전술한 것들 중 어느 하나의 일부 상이한 구체예에서, L¹ 및 L²는 각각 독립적으로 -(C=0)0- 또는 -0(C=0)-이다. 예를 들어, 일부 구체예에서 각각의 L¹ 및 L²는 -(C=0)0-이다.

화학식 (III)의 일부 상이한 구체예에서, 지질은 하기 구조 (IIIE) 또는 (IIIF) 중 하나를 갖는다:

또는

.

화학식 (III)의 상기 구체예 중 일부에서, 지질은 하기 구조 (IIIG), (IIIH), (IIII), 또는 (IIIJ) 중 하나를 갖는다:

.

화학식 (III)의 상기 구체예 중 일부에서, n은 2 내지 12, 예를 들어 2 내지 8 또는 2 내지 4 범위의 정수이다. 예를 들어, 일부 구체예에서, n은 3, 4, 5 또는 6이다. 일부 실시상태에서, n은 3이다. 일부 실시상태에서, n은 4이다. 일부 실시상태에서, n은 5이다. 일부 실시상태에서, n은 6이다.

화학식 (III)의 상기 구체예 중 일부 다른 것에 있어서, y 및 z는 각각 독립적으로 2 내지 10 범위의 정수이다. 예를 들어, 일부 구체예에서, y 및 z는 각각 독립적으로 4 내지 9 또는 4 내지 6 범위의 정수이다.

화학식 (III)의 전술한 구체예 중 일부에서, R⁶는 H이다. 전술한 구체예 중 다른 것에서, R⁶는 C1-C24알킬이다. 다른 구체예에서, R⁶는 OH이다.

화학식 (III)의 일부 구체예에서, G³는 비치환된다. 다른 구체예에서, G³는 치환된다. 다양한 여러 구체예에서, G³는 선형 C1-C24알킬렌 또는 선형 C1-C24알케닐렌이다.

화학식 (III)의 일부 다른 상기 구체예에서, R¹ 또는 R², 또는 양자 모두는 C6-C24 알케닐이다.

예를 들어, 일부 구체예에서, R¹ 및 R²는 각각 독립적으로 하기 구조를 갖고:

,

여기서:

R^7a 및 R^7b는 각각의 경우에 독립적으로 H 또는 C1-C12 알킬이고; 및

a는 2 내지 12의 정수이고,

여기서 R^7a, R^7b 및 a는 R¹ 및 R²가 각각 독립적으로 6 내지 20개의 탄소 원자를 포함하도록 각각 선택된다. 예를 들어, 일부 구체예에서 a는 5 내지 9 또는 8 내지 12 범위의 정수이다.

화학식 (III)의 상기 구체예 중 일부에서, 적어도 하나의 R^7a은 H이다. 예를 들어, 일부 구체예에서, R^7a는 각각의 경우에 H이다. 전술한 것의 다른 상이한 구체예에서, 적어도 하나의 R^7b는 C1-C8 알킬이다. 예를 들어, 일부 구체예에서, C1-C8 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, 이소-부틸, tert-부틸, n-헥실 또는 n-옥틸이다.

화학식 (III)의 상이한 구체예에서, R¹ 또는 R², 또는 양자 모두는 하기 구조 중 하나를 갖는다:

화학식 (III)의 상기 구체예 중 일부에서, R³는 OH, CN, -C(=0)0R⁴, -0C(=0)R⁴ 또는 -NHC(=0)R⁴이다. 일부 구체예에서, R⁴는 메틸 또는 에틸이다.

다양한 상이한 구체예에서, 화학식 (III)의 양이온성 지질은 하기 표에 제시된 구조 중 하나를 갖는다.

화학식 (III)의 대표적인 화합물.

일부 구체예에서, LNP는 화학식 (III)의 지질, RNA, 중성 지질, 스테로이드 및 페길화된 지질을 포함한다. 일부 구체예에서, 화학식 (III)의 지질은 화합물 III-3이다. 일부 구체예에서, 중성 지질은 DSPC이다. 일부 구체예에서, 스테로이드는 콜레스테롤이다. 일부 구체예에서, 페길화된 지질은 ALC-0159이다.

ALC-0159

일부 구체예에서, 양이온성 지질은 약 40 내지 약 50 몰%의 양으로 LNP에 존재한다. 일 구체예에서, 중성 지질은 약 5 내지 약 15 몰%의 양으로 LNP에 존재한다. 일 구체예에서, 스테로이드는 약 35 내지 약 45 몰%의 양으로 LNP에 존재한다. 일 구체예에서, 페길화된 지질은 약 1 내지 약 10 몰%의 양으로 LNP에 존재한다.

일부 구체예에서, LNP는, 화합물 III-3을 약 40 내지 약 50 몰%의 양으로, DSPC를 약 5 내지 약 15 몰%의 양으로, 콜레스테롤을 약 35 내지 약 45 몰%의 양으로, 및 ALC-0159를 약 1 내지 약 10 몰%의 양으로 포함한다. 일부 구체예에서, LNP는, 화합물 III-3을 약 47.5 몰%의 양으로, DSPC를 약 10 몰%의 양으로, 콜레스테롤을 약 40.7 몰%의 양으로, ALC-0159를 약 1.8 몰%의 양으로 포함한다.

N/P 값은 좋기로는 적어도 약 4이다. 일부 구체예에서, N/P 값은 4 내지 20, 4 내지 12, 4 내지 10, 4 내지 8, 또는 5 내지 7의 범위이다. 일 구체예에서, N /P 값은 약 6이다.

의약 조성물

본원에 기술된 제제는 약학적 조성물 또는 약제로 투여될 수 있고 임의의 적합한 의약 조성물의 형태로 투여될 수 있다.

일 구체예에서, 본원에 기재된 의약 조성물은 대상체에서 코로나바이러스에 대한 조성물이다.

본 발명의 모든 측면의 일 구체예에서, 결합제를 인코딩하는 RNA와 같은 본원에 기재된 성분은 제약상 허용되는 담체를 포함할 수 있고 임의로 하나 이상의 아쥬반트, 안정화제 등을 포함할 수 있는 제약 조성물로 투여될 수 있다. 일 구체예에서, 의약 조성물은 예컨대 코로나바이러스 감염을 치료하거나 예방하는데 사용하기 위한 치료 또는 예방 치료를 위한 것이다.

용어 "의약 조성물"은 좋기로는 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제와 함께 치료 유효 제제를 포함하는 제제에 관한 것이다. 상기 의약 조성물은 대상체에게 상기 약학적 조성물을 투여함으로써 질병 또는 장애의 중증도를 치료, 예방 또는 감소시키는데 유용하다. 의약 조성물은 또한 의약 제형으로서 당업계에 공지되어 있다.

본 발명에 따른 의약 조성물은 일반적으로 "약학적 유효량"으로 및 "약학적으로 허용되는 제조물"로 적용된다.

"약학적으로 허용되는"이라는 용어는 의약 조성물의 활성 성분의 작용과 상호작용하지 않는 물질의 무-독성을 의미한다.

용어 "약학적 유효량" 또는 "치료학적 유효량"은 단독으로 또는 추가 용량과 함께 원하는 반응 또는 원하는 효과를 달성하는 양을 지칭한다. 특정 질병의 치료의 경우, 원하는 반응은 좋기로는 질병 경과의 억제와 관련된다. 이것은 질병의 진행을 늦추는 것, 특히 질병의 진행을 방해하거나 역전시키는 것을 포함한다. 질병의 치료에서 원하는 반응은 또한 상기 질병 또는 상기 병태의 발병의 지연 또는 예방일 수 있다. 본원에 기재되는 조성물의 유효량은, 치료할 병태, 질병의 중증도, 환자의 개인적 파라미터, 예컨대 연령, 생리학적 상태, 체적 및 체중, 치료 기간, 동반 요법의 유형 (존재하는 경우), 특정한 투여 경로 및 유사 요인에 의존할 것이다. 따라서, 본원에 기재되는 조성물의 투여되는 용량은 다양한 이러한 파라미터에 의존할 수 있다. 환자의 반응이 초기 용량으로 충분하지 않은 경우, 더 높은 용량 (또는, 상이한, 보다 국소화된 투여 경로에 의해 달성되는 유효하게 더 높은 용량)이 사용될 수 있다.

본원에 개시되는 의약 조성물은 염, 완충제, 보존제, 및 임의로 다른 치료 제제를 함유할 수 있다. 일 구체예에서, 본원에 개시되는 의약 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함한다.

본 발명의 의약 조성물에 사용하기에 적합한 보존제는, 제한없이, 염화벤잘코늄, 클로로부탄올, 파라벤 및 티메로살을 포함한다.

본원에 사용되는 바 용어 "부형제"는 본 발명의 의약 조성물에 존재할 수 있지만 활성 성분이 아닌 물질을 의미한다. 부형제의 예는, 제한없이, 담체, 결합제, 희석제, 윤활제, 증점제, 표면 활성 제제, 보존제, 안정화제, 유화제, 완충제, 향미 제제 또는 착색제를 포함한다.

"희석제"라는 용어는 희석 제제 및/또는 솎음 (thinning) 제제에 관한 것이다. 또한, "희석제"라는 용어는 임의의 하나 이상의 유체, 액체 또는 고체 현탁액 및/또는 혼합 매질을 포함한다. 적합한 희석제의 예에는 에탄올, 글리세롤 및 물이 포함된다.

"담체"라는 용어는 의약 조성물의 투여를 촉진, 향상 또는 가능하게 하기 위해 활성 성분이 그 안에서 조합되는 천연, 합성, 유기, 무기일 수 있는 성분을 지칭한다. 본원에 사용되는 바 담체는 대상체에 투여하기에 적합한 하나 이상의 상용성 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질일 수 있다. 적합한 담체는, 제한 없이, 멸균수, 링거, 링거 락테이트, 멸균 염화나트륨 용액, 등장성 염수, 폴리알킬렌 글리콜, 수소화된 나프탈렌, 특히 생체적합성 락타이드 폴리머, 락타이드/글리콜라이드 코폴리머 또는 폴리옥시에틸렌/폴리옥시-프로필렌 코폴리머를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 의약 조성물은 등장성 염수를 포함한다.

치료 용도를 위한 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제는 약학 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R Gennaro edit. 1985)]에 기재되어 있다.

약학적 담체, 부형제 또는 희석제는 의도된 투여 경로 및 표준 약학적 관행과 관련하여 선택될 수 있다.

일부 구체예에서, 본원에 기재되는 의약 조성물은 정맥내, 동맥내, 피하, 피내 또는 근육내 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, 의약 조성물은 국소 투여 또는 전신 투여를 위해 제형화된다. 전신 투여는 위장관을 통한 흡수를 수반하는 장관 투여 또는 비경구 투여를 포함할 수 있다. 본원에 사용되는 바 "비경구 투여"는 정맥내 주사에 의하는 바와 같이 위장관을 통하는 것 외의 임의의 방식으로 투여하는 것을 의미한다. 바람직한 구체예에서, 의약 조성물은 근육내 투여를 위해 제형화된다. 또 다른 구체예에서, 의약 조성물은 전신 투여, 예를 들어, 정맥 투여를 위해 제형화된다.

다른 구체예에서, 약학적 조성물은 전신 투여, 예를 들어 정맥내 투여용으로 제형화된다.

본원에서 사용되는 용어 "공동-투여(co-administering)"는 상이한 화합물 또는 조성물이 동일한 환자에게 투여되는 과정을 의미한다. 상이한 화합물 또는 조성물은 동시에, 본질적으로 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.

치료(Treatments)

본 발명은 ACE2에 결합하는 코로나바이러스 S 단백질을 차단하기 위한, 특히 대상체에서 ACE2에 결합하는 코로나바이러스 S 단백질을 중화하기 위한 방법 및 제제를 제공한다. 본원에 기재된 방법은 본원에 기재된 결합제를 코딩하는 RNA를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있다.

일 구체예에서, 본원에 기술된 방법 및 제제는 대상체에서 코로나바이러스, 코로나바이러스 감염, 또는 코로나바이러스와 관련된 질병 또는 장애에 대해 중화 효과를 제공한다. 따라서 본 발명은 코로나바이러스와 관련된 감염, 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하기 위한 방법 및 제제를 제공한다.

본 발명에서 용어 "중화(neutralization)"는 수용체 결합 단백질과 같은 바이러스의 생물학적 활성 부위에 결합제가 결합하여 세포의 바이러스 감염을 억제하는 현상을 의미한다. 용어 "중화"는 특히 관심 대상 바이러스의 병독성(virulence: 예컨대 세포 감염 능력)을 제거하거나 상당히 감소시킬 수 있는 결합제를 의미한다.

일 구체예에서, 본원에 기술된 방법 및 제제는 코로나바이러스와 관련된 감염, 질환 또는 장애가 있는 대상체에게 투여된다. 일 구체예에서, 본원에 기재된 방법 및 제제는 코로나바이러스와 관련된 감염, 질환 또는 장애가 발병할 위험이 있는 대상체에게 투여된다. 예를 들어, 본원에 기술된 방법 및 제제는 코로나바이러스와 접촉할 위험이 있는 대상체에게 투여될 수 있다. 일 구체예에서, 본원에 기술된 방법 및 제제는 코로나바이러스가 유행하는 지리적 영역에 거주하거나, 여행하거나, 여행할 것으로 예상되는 대상체에게 투여된다. 일 구체예에서, 본원에 기술된 방법 및 제제는 코로나바이러스가 유행하는 지리적 지역에 거주하거나, 여행하거나, 여행할 것으로 예상되는 다른 사람과 접촉했거나 접촉할 것으로 예상되는 대상체에게 투여된다. 일 구체예에서, 본원에 기술된 방법 및 제제는 직업 또는 기타 접촉을 통해 코로나바이러스에 고의로 노출된 대상체에게 투여된다. 일 구체예에서, 코로나바이러스는 SARS-CoV-1 또는 SARS-CoV-2이다. 일 구체예에서, 코로나바이러스는 SARS-CoV-2이다.

본 발명의 치료 화합물 또는 조성물은 예방적으로(즉, 질병 또는 장애를 예방하기 위해) 또는 치료적으로(즉, 질병 또는 장애를 치료하기 위해) 질병 또는 장애를 앓고 있거나 발병할 위험이 있는(또는 발병하기 쉬운) 대상체에게 투여될 수 있다. 이러한 대상체는 표준 임상 방법을 사용하여 식별할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 예방적 투여는 질병 또는 장애가 예방되거나 대안적으로 그의 진행이 지연되도록 질병의 명백한 임상 증상이 나타나기 전에 발생한다. 의학 분야의 맥락에서 "예방"이라는 용어는 질병으로 인한 사망 또는 이환율의 부담을 줄이는 모든 활동을 포함한다. 예방은 1차, 2차 및 3차 예방 수준에서 발생할 수 있다. 1차 예방이 질병의 발병을 예방하는 반면, 2차 및 3차 예방 수준은 질병의 진행과 증상의 출현을 예방하고 기능을 회복하고 질병 관련 합병증을 줄임으로써 이미 확립된 질병의 부정적인 영향을 줄이는 것을 목표로 하는 활동을 포함한다.

일부 구체예에서, 본 발명의 제제 또는 조성물의 투여는 단일 투여에 의해 수행되거나 다중 투여에 의해 부스팅될 수 있다.

"질병"이라는 용어는 개체의 신체에 영향을 미치는 비정상적인 상태를 의미한다. 질병은 종종 특정 증상 및 징후와 관련된 의학적 상태로 해석된다. 질병은 전염병과 같은 원래 외부 요인에 의해 발생하거나 자가 면역 질환과 같은 내부 기능 장애로 인해 발생할 수 있다. 인간에서 "질병"은 고통받는 개체에게 고통, 기능 장애, 고통, 사회적 문제 또는 사망을 유발하는 상태 또는 개체과 접촉하는 사람들에게 유사한 문제를 유발하는 상태를 지칭하기 위해 더 광범위하게 사용되는 경우가 많다. 이 넓은 의미에서 부상, 장애, 장애, 증후군, 감염, 고립된 증상, 비정상적인 행동, 구조와 기능의 비정형 변이를 포함하는 반면, 다른 맥락에서 다른 목적을 위해 이들은 구별 가능한 범주로 간주될 수 있다. 질병은 일반적으로 신체적으로 뿐만 아니라 정서적으로도 개체에게 영향을 미친다. 많은 질병에 걸리고 생활하면 삶에 대한 관점과 성격이 바뀔 수 있기 때문이다. 본 문맥에서, "치료", "치료하는" 또는 "치료적 개입 또는 개재"라는 용어는 질병 또는 장애와 같은 상태를 퇴치할 목적으로 대상체를 관리 및 보호하는 것과 관련된다. 이 용어는 증상 또는 합병증을 완화하기 위해, 질병, 장애 또는 상태의 진행을 지연시키기 위해, 증상 및 합병증을 완화 또는 경감시키기 위해, 및/또는 질병, 장애 또는 상태를 치유 또는 제거하고 상태를 예방하기 위한 치료적으로 효과적인 화합물을 투여하는 것과 같은, 주어진 병태에 걸린 대상체를 치료하기 위한 모든 범위의 치료를 포함하는 것으로 의도되며, 여기서 예방은 질병, 상태 또는 장애 퇴치를 목적으로 개체를 관리하고 돌보는 것으로 이해되어야 하며, 증상 또는 합병증의 발병을 예방하기 위한 활성 화합물의 투여를 포함한다.

"치료적 치료"라는 용어는 건강 상태를 개선하고/하거나 개체의 수명을 연장(증가)시키는 모든 치료에 관한 것이다. 상기 치료는 개체에서 질병을 제거하고, 개체에서 질병의 발달을 정지시키거나 늦추고, 개체에서 질병의 발달을 억제하거나 늦추고, 개체에서 증상의 빈도 또는 중증도를 감소시키고/시키거나, 현재 질병을 앓고 있거나 또는 이전에 질병을 앓은 적이 있는 개체에서 재발을 감소시킬 수 있다.

"예방적(prophylactic 또는 preventive) 치료"라는 용어는 개체에게 질병이 발생하는 것을 예방하기 위한 모든 치료와 관련된다. 용어 "예방적 치료" 또는 "예방적 치료"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.

"개체" 및 "대상체"라는 용어는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 이그들은 질병이나 장애에 걸릴 수 있거나 걸리기 쉬운 인간 또는 다른 포유동물(예컨대 마우스, 쥐, 토끼, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말 또는 영장류)을 말하지만, 질병이나 장애가 있을 수도 있고 없을 수도 있다. 많은 구체예에서, 개체는 인간이다. 별도의 언급이 없는 한, "개체" 및 "대상자"라는 용어는 특정 연령을 나타내지 않으며, 따라서 성인, 노인, 어린이 및 신생아를 포함한다. 일부 구체예에서, 용어 "대상체"는 50세 이상, 55세 이상, 60세 이상, 65세 이상, 70세 이상 또는 그 이상의 연령의 인간을 포함한다. 본 개시내용의 구체예에서, "개체" 또는 "대상자"는 "환자"이다.

용어 "환자"는 치료를 위한 개인 또는 대상체, 특히 질병에 걸린 개인 또는 대상체를 의미한다.

본 개시내용의 일 구체예에서, 목적은 코로나바이러스 감염을 예방 또는 치료하는 것이다.

"전염성 질병"이라는 용어는 개인에서 개인으로 또는 유기체에서 유기체로 전염될 수 있는 모든 질병을 말하며 미생물 물질에 의해 발생한다(예컨대 감기). 감염성 질환은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 바이러스, 세균 및 기생충에 의해 발생하는 질병인 바이러스성 질환, 세균성 질환 또는 기생충성 질환을 포함한다. 이와 관련하여, 감염성 질병은 예를 들어 간염, 성병(예컨대 클라미디아 또는 임질), 결핵, HIV/후천성 면역결핍 증후군(AIDS), 디프테리아, B형 간염, C형 간염, 콜레라, 중증 급성 호흡기증후군(SARS), 조류 독감, 인플루엔자일 수 있다.

본원에 참조된 문서 및 연구의 인용이 곧 이들이 적절한 선행 기술임을 인정하는 것으로 의도되는 것은 아니다. 이들 문서의 내용에 대한 모든 진술은 출원인이에게 입수가능한 정보를 기반으로 하며 이들 문서 내용이 정확하다고 인정하는 것이 아니다.

다음 설명은 당업자가 다양한 구체예를 만들고 사용할 수 있도록 제공된다. 특정 장치, 기술 및 응용 프로그램에 대한 설명은 예제로만 제공된다. 본 명세서에 기재된 실시예에 대한 다양한 수정은 당업자에게 용이하게 명백할 것이며, 본 명세서에 정의된 일반적인 원리는 다양한 실시예의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다른 구체예 및 응용에 적용될 수 있다. 따라서, 다양한 구체예는 본 명세서에 기술되고 도시된 실시예에 국한되도록 의도되는 것이 아니며 청구범위와 일치하는 범위를 인정받아야 한다.

실시예

실시예 1: SARS-CoV-2 및 SARS-CoV S1 단백질 표적 분자의 생성

강력한 결합 및 SARS-CoV 및 SARS-CoV-2 바이러스 중화 활성을 가진 분자를 생성하기 위해 이전에 기술된 항-SARS-CoV S1 단백질 특이적 항체(항-S1 항체; ter Meulen et al, 2006)의 경쇄를 ACE2 세포외 도메인(aa 18-615)의 N- 또는 C-말단에 융합시켰다. 효소 활성 및 기질 결합을 피하기 위해 돌연변이 R273Q, H345L, H374N, H378N를 ACE2 세포외 도메인에 도입하였다(Guy et al, 2005). 일부 작제물의 항-S1-항체 중쇄에 생체내 반감기를 연장시키는 것으로 설명된 LS (M428L/N434S) 돌연변이를 도입하였다(Zalevsky et al 2009). 이러한 단백질 작제물을 인코딩하는 플라스미드 DNA를 HEK-293 FreeStyle™ 세포에 형질감염시키고 단백질-A 친화도 및 후속 크기 배제 크로마토그래피에 의해 배양 상등액으로부터 단백질을 정제하였다. 도 1은 생성된 구조에 대한 개요를 제공한다

실시예 2: 재조합 SARS-CoV2 S1-RBD 단백질에 대한 항-S1-항체-ACE2 융합 단백질의 결합

SARS-CoV2 S1-RBD 단백질에 대한 항-S1-항체-ACE2 융합 단백질의 결합 효능은 ELISA로 구하였다.

마우스-Fc-태그된 SARS-CoV2 S1-RBD(Sino Biologicals) 재조합 단백질을 실온에서 60분 동안 PBS에서 2.5 μg/ml의 농도로 384-웰 Nunc MaxiSorp™ 평평한 바닥 플레이트에 코팅하였다. PBS 0.1% Tween(세척 완충액)으로 3회 세척한 후 실온에서 60분 동안 PBS, 2% BSA, 0.05% Tween으로 차단하고 또 다른 3회 세척 후 항-S1-항체-ACE2 융합 단백질을 PBS, 0.5% BSA, 0.05% Tween(ELISA 완충액)에 20,000 내지 0.013 ng/ml 범위의 농도로 첨가하고 플레이트를 실온에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 대조군으로서, 인간-Fc 태그를 갖는 재조합 ACE-2 세포외 도메인을 사용하였다. 세척 완충액으로 3회 세척한 후, 호스래디쉬 퍼옥시다제 커플링된 검출 항-인간 IgG, Fcγ 단편 특이적 F(ab')₂단편(Jackson Immuno Research)을 ELISA 완충액에 1:2,500의 희석률로 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 60분 동안 인큐베이션하고, TMB 용액(Thermo Fisher Scientific)을 첨가하기 전에 세척 완충액으로 6회 세척하였다. 6분 후 HCl을 첨가하고 Tecan Infinite M1000 판독기를 사용하여 450 및 620nm 파장에서의 흡광도를 기록하였다. 곡선 맞춤 및 EC50 계산은 Excel(Microsoft) 및 XLfit(IDBS)을 사용하여 얻었다. 도 2는 항-S1-항체-ACE2 융합 단백질이 7~10.2 ng/ml 범위의 EC50 값으로 SARS-CoV2 S1-RBD 단백질에 결합한다는 것을 보여준다.

실시예 3: ACE2에 대한 SARS-CoV2-S1-RBD의 항-S1-항체-ACE2 융합 단백질에 의한 중화

경쟁 ELISA에서 ACE-2 세포외 도메인에 결합하는 SARS-CoV2 S1-RBD를 중화시키는 항-S1-항체-ACE2 융합 단백질의 효능을 조사하였다. His-태그된 인간 ACE-2 세포외 도메인(Sino Biologicals) 재조합 단백질을 실온에서 60분 동안 PBS에서 2.5 ㎍/ml의 농도로 384-웰 Nunc MaxiSorp™ 평평한 바닥 플레이트에 코팅하였다. PBS 0.1% Tween(세척 완충액)으로 3회 세척한 후 MaxiSorp™ 플레이트를 실온에서 60분 동안 PBS, 2% BSA, 0.05% Tween으로 차단하였다. 별도의 폴리프로필렌 384-웰 플레이트(Corning)에서 PBS, 0.5% BSA, 0.05% Tween(ELISA 완충액)에 30,000~0.01 ng/ml 범위의 농도로 희석된 항-S1-항체-ACE2 단백질을 30 ng/ml 마우스-Fc-태그된 SARS-CoV2 S1-RBD(Sino Biologicals) 재조합 단백질과 함께 실온에서 60분간 사전 배양하였다. 대조군으로서, 인간-Fc 태그를 갖는 재조합 ACE-2 세포외 도메인을 사용하였다. 세척 완충액으로 3회 세척한 후 Corning 플레이트의 예비 배양 혼합물을 MaxiSorp™ 플레이트로 옮기고 실온에서 60분 동안 배양하였다. 세척 완충액으로 3회 세척한 후, 호스래디쉬 퍼옥시다제 결합 검출 항-마우스 IgG F(ab')₂단편(Cytiva)을 ELISA 완충액에 1:1,000의 희석률로 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 60분 동안 인큐베이션하고, TMB 용액(Thermo Fisher Scientific)을 첨가하기 전에 세척 완충액으로 6회 세척하였다. 15분 후 HCl을 첨가하고 Tecan Infinite M1000 판독기를 사용하여 450 및 620nm 파장에서의 흡광도를 기록하였다. 곡선 맞춤과 IC50 계산은 Excel(Microsoft) 및 XLfit(IDBS)을 사용하여 얻었다. 도 3의 데이터는 항-S1-항체(408, 413)가 테스트된 농도에서 S1-RBD와 ACE2 세포외 도메인의 상호작용을 유의하게 차단하지 않는 반면, hFc-태그된 ACE2 세포외 도메인(402, 403)은 IC50 값 > 4 μg/ml로 상호작용을 차단한다. 대조적으로, 항-S1-항체-ACE2 융합 단백질은 32.4 내지 97.8 ng/ml 범위의 IC50 값으로 이러한 상호작용을 억제하고, 따라서 이 검정에서 ACE2-hFc에 비해 약 > 40배 증가된 효능을 갖는다.

실시예 4: 항-S1-항체-ACE2 융합 단백질에 의한 슈도바이러스 중화 활성

항-S1-항체-ACE2 단백질의 바이러스 중화 활성을 구하기 위해 슈도바이러스 중화 시험(pVNT)을 수행하였다. 복제 결핍 수포성 구내염 바이러스(VSV) 외피 당단백질 VSV-G에 대한 유전 정보가 부족하지만 녹색 형광 단백질(GFP)에 대한 개방 판독 프레임(ORF)을 포함하는 VSV를 이용하여 SARS-CoV2-S 슈도바이러스를 생성하였다. 공개된 프로토콜(PMID: 32142651)에 따라 VSV 슈도타입이 생성되었다.

pVNT 검정을 위해, Vero-76 세포를 해동하여 분석 매질(DMEM/10% FBS)에서 2.67　Х　10⁵ 세포/mL로 희석하고 96-웰 편평 바닥 플레이트에 웰당 4 x 10⁴ 세포로 접종하였다. 세포를 37℃ 및 7.5% CO₂에서 4 내지 6시간 동안 인큐베이션하였다. VSV/SARS CoV2 슈도바이러스를 해동하고 희석하여 4.8 × 10³감염 단위[IU]/mL를 얻었다. 30 μL의 희석된 슈도바이러스를 30 μL 항-S1-항체-ACE2 융합 단백질, 항-S1-항체 또는 ACE-2-hFc가 포함된 웰에 200~0.092 μg/ml 범위의 최종 농도 범위로 첨가하였다. 슈도바이러스/테스트 단백질 혼합물을 실온에서 10분 동안 마이크로플레이트 진탕기에서 400rpm으로 인큐베이션하였다. 그런 다음 슈도바이러스/테스트 단백질 희석 혼합물을 접종된 Vero-76 세포(MOI:0.003)에 첨가한 다음 37℃ 및 5% CO₂ 에서 16~24시간 동안 배양 하였다. 혈청 샘플의 각 희석액을 이중 웰에서 테스트하였다. 인큐베이션 후 세포 배양 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내 IncuCyte Live Cell Analysis 시스템에 넣고 분석 전에 30분 동안 인큐베이션하였다. 명시야 및 GFP 형광에 대한 전체 웰 스캐닝은 4X 대물렌즈를 사용하여 수행되었다. GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 곡선 맞춤 및 IC50 계산을 수행하였다. 도 4는 항-S1-항체(413) 및 ACE2-hFC(402)가 테스트된 농도에서는 슈도바이러스에 의한 Vero-76 세포의 감염에 유의한 영향을 미치지 않는 반면 항-S1-항체-ACE2 융합 단백질은 5.847 ~ 36.29 μg/ml 범위의 IC50 값으로 용량 의존적 방식으로 감염을 억제함을 입증한다.

실시예 5: 항-S1-항체-ACE2 융합 단백질의 결합 친화도

SARS-CoV-2에 대한 ACE-2-hFc(402), 항-S1-항체(413) 및 항-S1-mAB-ACE2 융합 단백질(406, 409, 410, 411, 412)의 생화학적 친화성 S1 단백질은 표면 플라즈몬 공명 측정에 의해 결정되었다. SARS-CoV-2 S1 단백질(HIS 태그, 활성 트라이머; Acro Biosystems #SPN-C52H8)은 두 가지 다른 밀도(Rmax ~100 RU 및 Rmax ~620 RU)로 항-HIS-태그 항체를 통해 CM5 센서 칩 표면에 고정되었다. 또 다른 실험 시리즈에서 마우스 Fc-태그(Sino Biologicals #40592-V05H)에 커플링된 SARS-CoV-2 S1-RBD 단백질을 두 가지 다른 밀도(Rmax ~20RU 및 Rmax ~250RU)로 항-마우스-Fc 항체를 통해 CM5 센서 칩 표면에 고정시켰다. 고정된 SARS-CoV-2 S1 단백질(활성 트라이머) 또는 SARS-CoV-2 S1-RBD 단백질과 가용성 항-S1-항체-ACE2 융합 단백질과의 상호작용 동역학을 Biacore T200 SPR 기기에서 분석하였다. 동역학 데이터는 La ngmuir 1:1 결합 모델을 사용하여 결정되었다. 도 5A 및 B는 융합 단백질 406, 411 및 412가, 항-S1 항체(413)에 비해 SARS-CoV-2 S1 단백질(활성 트라이머) 또는 SARS-CoV-2 S1-RPD 단백질 두 가지 모두에 대한 결합시 더 느린 온-레이트(on-rate)와 더 느린 오프-레이트(off-rate)를 가짐을 보여준다. ACE-2-Fc(402)와 비교시, 융합 단백질의 오프율도 상당히 느리다. 따라서 융합 단백질 406, 411, 412가 일단 S1 단백질에 결합하면, 이들은 항-S1 항체 또는 ACE-2-Fc 단독에 비해 더 오랜 시간 동안 S1 단백질에 결합된 상태를 유지하며 바이러스-발현된 S1 단백질과 세포-발현된 ACE-2 수용체 간의 상호작용을 가용성 ACE-2-Fc 단백질보다 더 지속적으로 차단할 수 있다.

실시예 6: SARS-CoV-2 S1-RBD 결합 중화 항체의 생성

새로운 항-S1 항체를 얻기 위해 뉴질랜드 화이트 토끼를 재조합 SARS-CoV-2 S1-RBD-mFc 단백질 또는 S1-RBD 인코딩 mRNA로 면역화하였다. 단일 B 세포를 FACS로 분리하고 배양하여 배지 상등액에서 모노클로날 항체를 얻었다. 배양 7일 후, B 세포 상등액을 B 세포로부터 분리하여 결합 및 기능 분석을 수행하였다. 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 RNA 추출, RT-PCR 및 Sanger 시퀀싱을 위해 B-세포를 RNA 추출 RLT 완충액에서 용해시켰다.

실시예 7: SARS-CoV2-S1 단백질에 대한 B 세포 상등액 내 항체의 결합

B 세포 상등액에서 모노클로날 항체의 농도를 결정하기 위해 정량적 샌드위치 ELISA를 수행하였다. 간략하게, B 세포 상등액을 1:10, 1:30, 1:100, 1:300, 1:100 및 1:3,000으로 희석하고 염소 항-토끼-IgG 항체(Sigma-Aldrich)로 코팅된 플레이트에서 배양하였다. 포획된 토끼 IgG는 당나귀care)의 호스래디쉬 퍼옥시다제-연결된 종 특이적 항-토끼-IgG F(ab)₂단편을 사용하여 검출되었다(GE Health. Tecan Infinite M1000 장비를 사용하여 450/620 nm에서의 OD를 기록하였는데 이는 정제된 토끼 IgG(Sigma Aldrich)로 얻은 표준 곡선과 상관 관계가 있었다. B 세포 상등액에서 모노클로날 항체의 계산된 rIgG 농도를 도 6A에 요약하였다.

B 세포 상등액에서 SARS-CoV2 S1 단백질에 대한 본 발명의 항-S1-항체의 결합 효능을 ELISA로 테스트하였다. 인간-Fc-태그된 SARS-CoV2 S1 재조합 단백질(Sino Biologicals)을 실온에서 60분 동안 PBS에서 0.875 또는 3 μg/ml의 농도로 384웰 Nunc MaxiSorp™ 평평한 바닥 플레이트에 코팅하였다. PBS 0.1% Tween(세척 완충액)으로 3회 세척하고 실온에서 60분 동안 PBS, 2% BSA, 0.05% Tween으로 차단하고 또 다른 3회 세척 후, 항-S1-항체를 함유하는 B-세포 상등액을 1,000 ~ 0.04 ng/ml 농도 범위로, PBS, 0.5% BSA, 0.05% Tween(ELISA 완충액)에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 대조군으로서, 마우스-Fc 태그(Sino Biologicals)가 있는 재조합 ACE-2 세포외 도메인을 5,000 내지 2 ng/ml의 농도로 사용하였다. 세척 완충액으로 3회 세척한 후, 호스래디쉬 퍼옥시다제 커플링된 검출 항-토끼 IgG F(ab')₂단편(Cytiva) 또는 대조군의 경우 호스래디쉬 퍼옥시다제 결합 검출 항-마우스 IgGF(ab')₂단편(Cytiva)을 각각 1:4,000 또는 1:1,000의 희석으로 ELISA 완충액에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 60분 동안 인큐베이션하고, TMB 용액(Thermo Fisher Scientific)을 첨가하기 전에 세척 완충액으로 6회 세척하였다. 6분 후 HCl을 첨가하고 Tecan Infinite M1000 판독기를 사용하여 450 및 620nm 파장에서의 흡광도를 기록하였다. 곡선 맞춤 및 EC50 계산은 Excel(Microsoft) 및 XLfit(IDBS)을 사용하여 얻었다. 도 6B 및 C의 데이터는 모노클로날 B 세포 상등액에서 분비된 모든 항체가 용량 의존 방식으로 SARS-CoV2 S1 재조합 단백질에 결합하고 mFc-태그된 ACE-2 세포외 도메인과 비교하여 더 낮은 EC50 값으로 결합함을 보여준다.

실시예 8: B 세포 상등액 중 항체에 의한 SARS-CoV2-S1 - ACE-2 상호작용의 중화

B 세포 상등액 중 본 발명의 항-S1-항체의, ACE-2 세포외 도메인에 대한 SARS-CoV2 S1의 결합을 중화시키는 효능을 경쟁 ELISA로 조사하였다. 마우스-Fc-태그된 인간 ACE-2 세포외 도메인(Sino Biologicals) 재조합 단백질을 실온에서 60분 동안 PBS에서 2.5 ㎍/ml의 농도로 384-웰 Nunc MaxiSorp™ 평평한 바닥 플레이트에 코팅하였다. PBS 0.1% Tween(세척 완충액)으로 3회 세척한 후 MaxiSorp™ 플레이트를 실온에서 60분 동안 PBS, 2% BSA, 0.05% Tween으로 차단하였다. 별도의 폴리프로필렌 384-웰 플레이트(Corning)에서 2,000~0.08 ng/ml 농도의 항 S1 항체를 함유하는 B 세포 상등액을, 실온에서 60분 동안 PBS, 0.5% BSA, 0.05% Tween(ELISA 완충액)에 희석된 60 ng/ml 인간-Fc-태그된 SARS-CoV2 S1(Sino Biologicals) 재조합 단백질과 함께 예비인큐베이션하였다. 대조군으로 마우스-Fc 태그(Sino Biologicals)가 있는 재조합 ACE-2 세포외 도메인을 사용하였다. 세척 완충액으로 3회 세척한 후 Corning 플레이트의 사전 배양 항-S1 항체/S1 단백질 혼합물을 MaxiSorp™ 플레이트로 옮기고 실온에서 60분 동안 배양하였다.

세척 완충액으로 3회 세척한 후, 호스래디쉬 퍼옥시다제 결합 검출 항-인간 IgG, Fcγ 단편 특이적 F(ab')₂단편(Jackson Immuno Research)을 ELISA 완충액에 1:5,000의 희석률로 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 60분 동안 인큐베이션하고, TMB 용액(Thermo Fisher Scientific)을 첨가하기 전에 세척 완충액으로 6회 세척하였다. 15분 후 HCl을 첨가하고 Tecan Infinite M1000 판독기를 사용하여 450 및 620nm 파장에서의 흡광도를 기록하였다. 곡선 맞춤과 IC50 계산은 Excel(Microsoft) 및 XLfit(IDBS)을 사용하여 얻었다. 도 7A 및 B의 데이터는 모노클로날 B 세포 상등액에서 분비된 모든 항체가 SARS-CoV2 S1과 ACE-2 재조합 단백질 간의 상호작용을, mFc-태그된 ACE-2 세포외 도메인에 비해 현저히 낮은 EC50 값으로 용량 의존 방식으로 차단함을 보여준다.

실시예 9: SARS-CoV2-S/S1-RBD 및 SARS-CoV-S1-RBD 재조합 단백질에 대한 정제된 hIgG1-LALA-LS 키메라 항체의 결합

본 발명의 항체의 가변 영역 서열을 hIgG1 불변 경쇄 및 중쇄 서열과 함께 인프레임으로 클로닝하여 키메라 항체 작제물을 얻었다. hIgG1 중쇄 서열에 Fcγ 수용체 결합(Hezareh et al. 2001) 및 LS(M428L/N434S) 돌연변이를 감소시키는 것으로 기술된 돌연변이 L234A 및 L235A가 도입되었다. 키메라 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 플라스미드 DNA를 HEK-293 FreeStyle™ 세포에 공동형질감염시키고 단백질-A 친화도 및 후속 크기 배제 크로마토그래피에 의해 배양 상등액으로부터 정제된 항체를 정제하였다.

SARS-CoV S1-RBD, SARS-CoV2 S(활성 트라이머) 및 SARS-CoV2 S1-RBD 단백질에 결합하는 본 발명의 키메라 항-S1-항체의 효능을 ELISA로 결정하였다. His-태그된 SARS-CoV S1-RBD(Sino Biologicals), His-태그된 SARS-CoV2 S 활성 트라이머(AcroBiosystems) 및 마우스-Fc-태그된 SARS-CoV2 S1-RBD(Sino Biologicals) 재조합 단백질을, 실온에서 PBS 중 1 μg/ml, 1 μg/ml 및 2.5 μg/ml 농도로 384-웰 Nunc MaxiSorp™ 평평한 바닥 플레이트에 코팅하였다. PBS 0.1% Tween(세척 완충액)으로 3회 세척한 후, 실온에서 60분 동안 PBS, 2% BSA, 0.05% Tween으로 차단하고 또 다른 3회 세척 후 키메라 항-S1-항체를 20,000 내지 0.006 ng/ml 범위의 농도로 PBS, 0.5% BSA, 0.05% Tween(ELISA 완충액)에 첨가하고 플레이트를 실온에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 대조군으로서, 인간-Fc 태그(402/403), 항-S1-ACE2 융합 작제물 406 및 항-S1 항체 408을 갖는 재조합 ACE-2 세포외 도메인을 사용하였다. 세척 완충액으로 3회 세척한 후, 호스래디쉬 퍼옥시다제 결합 검출 항-인간 IgG, Fcγ 단편 특이적 F(ab')₂단편(Jackson Immuno Research)을 ELISA 완충액에 1:2,500의 희석률로 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 60분 동안 인큐베이션하고, TMB 용액(Thermo Fisher Scientific)을 첨가하기 전에 세척 완충액으로 6회 세척하였다. 6분 후 HCl을 첨가하고 Tecan Infinite M1000 판독기를 사용하여 450 및 620nm 파장에서의 흡광도를 기록하였다. 곡선 맞춤 및 EC50 계산은 Excel(Microsoft) 및 XLfit(IDBS)을 사용하여 얻었다. 도 8 A 및 B의 데이터는 본 발명의 시험된 키메라 항체가 모두 SARS-CoV2 S(활성 트라이머) 및 SARS-CoV2 S1-RBD에 3.4 내지 11.2 ng/ml의 EC50 값을 특징으로 하는 유사한 효능으로 결합함을 입증한다. 이러한 EC50은 ACE2-hFc 및 항-S1-ACE2 융합 작제물 406에 대해 측정된 것보다 낮다. 키메라 항체 P043.A.00047.H08 및 P043.A.00117.C08 역시도 SARS-CoV S1-RBD에 결합할 수 있으며 계산된 EC50은 각각 8.1 및 88.5 ng/ml였다.

실시예 10: 본 발명의 키메라 항체에 의한 ACE2에 대한 SARS-CoV2-S1-RBD 결합의 중화

ACE-2 세포외 도메인에 대한 SARS-CoV2 S1-RBD 결합을 중화시키는 본 발명의 정제된 키메라 항체의 효능을 실시예 3에 기재된 바와 같이 경쟁 ELISA에서 조사하였다. 모든 키메라 항체는 ACE-2와 ACE-2의 상호작용을 차단한다. 용량 의존적 방식의 SARS-CoV2 S1-RBD. EC50 값 범위는 19.2~115 ng/ml이다. 본 발명의 항체의 키메라에 의해 관찰된 억제는 ACE2-hFc(402/403)에서 관찰된 억제보다 상당히 더 강력하다(도 9A 및 B).

실시예 11: 본 발명의 정제된 항체에 의한 슈도바이러스 중화 활성

세포의 S1 단백질-지향 바이러스 감염을 억제하는 본 발명의 키메라 항체의 효능을 결정하기 위해, 슈도바이러스 중화 시험(pVNT)을 실시예 4에 기술된 바와 같이, 그러나 다음과 같이 변형하여 수행하였다.

pVNT 분석을 위해 Vero-76 세포를 해동하고 분석 배지(DMEM/10% FBS)에서 0.5 x 10⁶세포/mL로 희석하고 384-웰 평평한 바닥 조직 배양 플레이트(Corning)에 웰당 1 x 10⁴개의 세포를 접종하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO₂에서 4 내지 6시간 동안 인큐베이션하였다. VSV/SARS CoV2 슈도바이러스를 해동하고 희석하여 12 × 10³감염 단위[IU]/mL를 얻었다. 희석된 슈도바이러스 10㎕를 본 발명의 키메라 항체 10㎕ 또는 분자 403, 413 및 411을 함유하는 384-웰 V-바닥 플레이트(Corning)의 웰에 100 내지 0.05 ㎍/ml 범위의 최종 농도로 첨가하였다. 일부 실험에서, 본 발명의 선택된 항체는 30 내지 0.01 ㎍/ml 범위의 농도로 테스트되었다(도 10B). 슈도바이러스/테스트 항체 믹스를 1,200 rpm의 마이크로플레이트 진탕기에서 실온에서 10분 동안 배양하였다. 그런 다음 슈도바이러스/시험 단백질 희석 혼합물을 접종된 Vero-76 세포에 첨가한 다음 37℃ 및 5% CO₂에서 16 내지 24시간 동안 배양하였다. 혈청 샘플의 각 희석액을 3중 웰에서 테스트하였다. 인큐베이션 후, 세포 배양 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내 분석 배지에 희석된 5 μg/ml Hoechst 33342(Thermo Fisher Scientific)로 염색하고 CellInsight CX5 이미징 시스템에 넣고 분석 전에 10분 동안 인큐베이션하였다. Hoechst 및 GFP 형광에 대한 전체 웰 스캐닝은 4X 대물렌즈를 사용하여 수행되었다. 곡선 맞춤은 Excel(Microsoft) 및 XLfit(IDBS)을 사용하여 수행되었다. 도 10은 항-S1-항체(413) 및 ACE2-hFC(403)가 슈도바이러스에 의한 Vero-76 세포의 감염에 유의한 영향을 미치지 않는 반면 항-S1-항체-ACE2 융합 단백질(411) 및 많은 본 발명의 키메라 항체는 용량 의존적 방식으로 감염을 억제함을 보여준다. 대부분의 키메라 항체는 더 낮은 농도에서 이미 완전 중화를 달성하여 단백질 411보다 더 강한 중화 활성을 나타낸다. 도 10B에는 본 발명의 선택된 항체에 대한 IC50 및 IC90 값이 요약되어 있다.

실시예 12: 본 발명의 항체들 간의 SARS-CoV2-S1-RBD 에피토프 경쟁

SARS-CoV2 S1-RBD에 대한 결합에서 각 키메라 항체와 본 발명의 임의의 다른 키메라 항체의 간섭을 경쟁 ELISA로 테스트하였다.

하나의 항체를 실온에서 60분 동안 PBS에서 2.5 ㎍/ml의 농도로 384-웰 Nunc MaxiSorp™ 평평한 바닥 플레이트에 코팅하였다. PBS 0.1% Tween(세척 완충액)으로 3회 세척한 후 MaxiSorp™ 플레이트를 실온에서 60분 동안 PBS, 2% BSA, 0.05% Tween으로 차단하였다. 별도의 폴리프로필렌 384-웰 플레이트(Corning)에서 20,000~0.01 ng/ml 농도의 다른 항체를 PBS, 0.5% BSA, 0.05% Tween(ELISA 완충액)에서 60분 동안 실온에서 150 ng/ml 마우스-Fc 태그된 SARS-CoV2 S1-RBD(Sino Biologicals) 재조합 단백질과 예비 인큐베이션하였다. 세척 완충액으로 3회 세척한 후 Corning 플레이트로부터의 예비 인큐베이션 혼합물을 MaxiSorp™ 플레이트로 옮기고 실온에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 세척 완충액으로 3회 세척한 후, 호스래디쉬 퍼옥시다제 결합 검출 항-마우스 IgG F(ab')₂단편(Cytiva)을 ELISA 완충액에 1:1,000의 희석률로 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 60분 동안 인큐베이션하고, TMB 용액(Thermo Fisher Scientific)을 첨가하기 전에 세척 완충액으로 6회 세척하였다. 6분 후 HCl을 첨가하고 Tecan Infinite M1000 판독기를 사용하여 450 및 620nm 파장에서의 흡광도를 기록하였다. 도 11은 경쟁 ELISA 데이터의 결과를 요약한 도면으로, (+)는 2개의 시험된 항체 사이의 S1-결합에서의 경쟁을 나타내고 (-)는 2개의 시험된 항체의 부수적인 결합을 나타낸다. P043.A.00047.H 08은 본 발명의 시험된 키메라 항체 세트 중 검정에서 그 자신과만 경쟁하고 항-S1-mAB를 비롯한 다른 항체와는 경쟁하지 않는 유일한 항체이다. 이와 대조적으로, 본 발명의 다른 모든 키메라 항체는 서로 경쟁하는데 이는 이들이 S1-RBD 단백질에 중복되는 에피토프를 가짐을 나타낸다. 본 발명의 어떠한 키메라 항체도 항-S1 mAB와 경쟁하지 않는다.

실시예 13: IVT-mRNA 기반 항-S1-항체-ACE2 융합 리보Mab의 생성.

a. 항체 IVT-mRNA 주형 벡터의 클로닝 및 IVT-mRNA 합성

시험관내에서 전사된 메신저 RNA(IVT-mRNA)를 통한 항-S1-항체-ACE2 융합 리보Mab의 생성을 위해, 본 발명자들은 완전 인간 항-S1-항체-ACE2 융합 항체 ID 406 및 ID 411(실시예 1에 기재됨)의 DNA 서열을 표준 기술을 사용하여 IVT-mRNA 주형 벡터 pST1-hAg-MCS-FI-A30LA70(BioNTech RNA Pharmaceuticals, Mainz, Germany) 내로 서브클로닝하였다. 인간 알파 글로빈(hAg) 5'UTR 리더 서열은 다른 곳에서 설명된 바 있으며 FI 서열은 특허출원 "3'UTR Sequences for Stabilization of RNA"(PCT/EP2016/073814)에 설명되어 있다. 폴리(A) 꼬리-인코딩 영역(A30LA70)은 30개의 아데닌 코돈, 링커(L) 및 추가로 70개의 아데닌 코돈으로 구성된다(PCT/EP2015/065357). 모든 항체 도메인은 인간 IgG1에서 유래한다. 항-S1-항체-ACE2 융합 리보Mab의 형성을 위해 다음 작제물을 클로닝하였다:

리보Mab_406:

pST1-5'hAg-Sec-V_H ^항-S1-C_H1-C_H2-C_H3^{(Met434Leu, Asn428Ser)}-FI-A30LA70 (HC)

pST1-5'hAg-Sec-V_L ^항-S1-C_L-(G₄S)₄-ACE2-ECD-FI-A30LA70 (LC-ACE2)

리보Mab_411:

pST1-5'hAg-Sec-V_H ^항-S1-C_H1-C_H2-C_H3-FI-A30LA70 (HC)

pST1-5'hAg-Sec-V_L ^항-S1-C_L-(G₄S)₄-ACE2-ECD-FI-A30LA70 (LC-ACE2)

인간 알파-글로빈으로부터의 5'hAg, 5'UTR; A, 아데닌; Asn, 아스파라긴; CL, 불변 경쇄 영역; CH, 불변 중쇄 영역; ECD, ACE2의 세포외 도메인; FI, 3'UTR 서열; (G₄S)_4, 글리신-세린 링커 인코딩 서열; HC, 중쇄; Leu, 류신; LC, 경쇄; Met, 메티오닌; pST1, DNA 주형 벡터; Sec, 분비 신호; Ser, 세린; VH, 가변 중쇄 도메인; VL, 가변 경쇄 도메인.

b. IVT-mRNA 합성

시험관내 전사를 위한 주형을 생성하기 위해 클래스 IIs 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 폴리(A) 꼬리-인코딩 영역의 하류에 플라스미드 DNA를 선형화하여 폴리(A) 꼬리를 지나 추가 뉴클레오타이드 없이 RNA를 전사하는 주형을 생성하였다(Holtkamp, S. et al.(2006) Blood 108(13), 4009-4017). 선형화된 주형 DNA를 정제하고, 분광광도계로 정량화한 다음 본질적으로 이전에 설명한 대로 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 시험관내 전사에 적용하였다(Grudzien-Nogalska, E. et al. (2013): Synthetic mRNAs with superior translation and stability properties. In: Methods in molecular biology (Clifton, NJ) 969, 55-72). 면역원성을 최소화하기 위해, N1-메틸슈도우리딘-5'-트리포스페이트(TriLink Biotechnologies, San Diego, CA, USA), 짧은 m1ΨTP를 UTP 대신 통합하고(Kariko, K. et al. (2008) Mol. Ther. 16 (11)), 1833-1840) 이중 가닥 RNA는 셀룰로오스 정제에 의해 제거하였다(Baiersdorfer, M. et al. (2019) Nucleic acids 15, 26-35). RNA는 Cap1 구조인 CleanCap413으로 캡핑되었다. 이를 위해 각각 7.5 nM의 ATP, CTP, m1ΨTP, GTP 및 1.5 mM CleanCap413의 존재하에서 시험관내 전사를 수행하였다. RNA는 자기 입자를 사용하여 정제되었다(Berensmeier, S. (2006): Magnetic particle for the separation and Purification of nucleic acids. In: Applied microbiology and biotechnology 73 (3), 495-504). RNA 농도 및 품질은 2100 Bioanalyzer(Agilent, Santa Clara, CA, USA)에서 분광광도법 및 분석으로 평가하였다. 완전한 항체 분자의 형성에 필요한 2개의 IVT-mRNA의 스케치가 도 13에 묘사되어 있다.

실시예 14: 시험관내 항-S1-항체-ACE2 융합 리보Mab의 발현 및 단백질 무결성.

a. 생산자 세포의 전기천공

IVT-mRNA로부터 항-S1-항체-ACE2 융합 리보Mab의 생산을 위해, 대수상으로 성장하는 mL당 1 x 10⁷HEK 293T/17 세포(ATCC CRL^®-11268^TM, LGC Standards GmbH, Wesel, Germany)를전기천공법에 사용하였다. X-Vivo 15 배지 (LONZA Technologies, Basel, Switzerland)의 세포를 4 mM 갭 큐벳(VWR, Darmstadt, Germany)에서 10 mM Hepes/0.1 mM EDTA 완충액(Mock) 또는 100 μg/mL의 항체 인코딩 IVT-mRNA 혼합물과 결합시켰다. RNA 혼합물은 HC 및 LC-ACE2를 각각 0:1, 0.6:1, 0.8:1, 1:1 또는 1:0의 질량비로 인코딩하는 mRNA를 함유하였다. 세포는 다음 설정으로 BTX ECM830(BTX Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA)으로 즉시 전기천공하였다: 250 V, 2 펄스, 5 ms. 이어서 생존 세포를 Expi293^TM배지(Gibco Thermo Fischer Scientific, Darmstadt, Germany)에12-웰 조직 배양 플레이트(Cellstar®, Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany)에 2 x 10 6 /mL의 밀도로접종 하였다. 48시간 배양 후, 상등액을 원심분리(10분, 300xg)로 수확하고 분석할 때까지 4℃에서 보관하였다.

b. 면역분석을 통한 생산자 세포 배양 상등액 내 항-S1-항체-ACE2 융합 리보Mab의 정량화

전기천공 HEK 293T/17 세포로부터의 SN의 항-S1-항체-ACE2 융합 리보Mab을 Gyros xPand™ XPA1025 장치(Gyros Protein Technologies AB, Uppsala, Sweden)를 사용하여 정량화하였다. 달리 명시되지 않은 한, 모든 재료는 Gyros Protein Technologies AB에서 구입하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 Gyrolab^® huIgG Kit - Low Titer를사용하여 샌드위치 면역분석을 실행하였다. 20-9,000 ng/ml의 동적 단백질 농도 범위에 대해 시약 키트 구성 요소를 Gyrolab^®Bioaffy 1000 HC CD와 함께 사용하였다.

모든 샘플과 시약을 12,000 x g 에서 4분 동안 원심분리하여 응집체를 침전시켰다. 각각의 리보Mab 분자를 포함하는 SN을 시약 E 완충액에서 1:2로 희석하였다. 준비된 표준, 품질 관리, 시약 및 희석된 샘플을 Gyrolab 로딩 목록에 따라 96-웰 플레이트에 로딩하였다. 데이터는 Gyrolab^®huIgG Low Titer 키트 방법 v2로 생성되었으며 결과는 Gyrolab^®Evaluator 소프트웨어를 사용하여 평가되었다.

HC-대-LC-ACE2 mRNA 질량비를 0.6:1로 하자, 약 5 μg/mL의 최고 항-S1-항체-ACE2 융합 리보Mab 농도가 얻어졌다. 0.8:1의 비율은 약 2.5 μg/mL, 1:1의 비율은 약 2 μg/mL를 결과시켰다. 요약하면, 리보Mab_411 및 리보Mab_406은 동일하게 발현되었다(도 14A).

c. 생산자 세포 배양 상등액에서 항-S1-항체-ACE2 융합의 웨스턴 블롯 분석

HEK 293T/17 세포의 SN(실시예 13a)을 항-S1-항체-ACE2 융합 리보Mab의 번역 및 분비 분석에 사용하였다. SN 및 참조 단백질(Mock SN에 스파이크됨)은 물과 4x Laemmli 완충액(Bio-Rad Laboratories, Dreieich, Germany)을 사용하여 최종 부피 21.5 μL로 달성되었고, 1M 디티오트레이톨(DTT, 최종 농도 0.1M, Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany) 부재(비환원, 도 14B) 또는 존재(환원, 도 14C) 하에 95℃로 5분간 가열되었다. 준비된 SN과 상응하는 정제된 참조 단백질 ID 411을, 4-15% Criterion™ TGX Stain-Free™ Gel(Bio-Rad)을 사용하여 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리하였다. 분자량 표품으로서 분자량 범위가 각각 10-250 kD 및 31-460 kD인, Precision Plus Protein™ All Blue Pre-stained Protein Standard(Bio-Rad) 및 Novex™ HiMark™ Pre-Stained Protein Standard(Hi-Mark, Invitrogen/Thermo Fisher Scientific)가 적용되었다. 웨스턴 블롯 분석(도 14B, C)은 당업자에게 공지된 표준 절차에 따라 수행하였다. 니트로셀룰로오스 막(Bio-Rad)을 5% 우유 용액(Carl Roth GmbH & Co. KG)으로 1시간 동안 차단하였다. 단백질은 3% BSA Fraction V 용액(Eurobio Scientific, Les Ulis, France)에 희석된, 폴리클로날 항체인 Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ 단편 특이적(희석 1:2,000; Jackson ImmunoResearch, Cambridge, UK) 및 Goat anti-Human Kappa Light Chain Cross-Adsorbed Secondary Antibody, HRP(희석 1:200; Invitrogen/Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany)의 혼합물로 검출되었다. 이어서 멤브레인을 Clarity Western Peroxide Reagent와 Clarity Western Luminol/Enhancer Reagent(Bio-Rad)의 1:1 혼합물과 함께 배양하고 VILBER Fusion X 이미징 장치(Vilber Lourmat, Eberhardzell, Germany)로 기록하였다. Image Lab 소프트웨어(Bio-Rad)로 데이터를 분석하였다. 리보Mab_411 및 리보Mab_406의 신호는 내부 분자량 표준과 비교하여, 비환원 조건 하에서 하에서 각각 약 200-460kD(완전 항체) 및 100kD(LC-ACE2), 그리고, 환원 조건 하에서 각각 100kD(LC-ACE2) 및 50kD(HC)로 검출되었다. .

요약하면, 두 가지 항-S1-항체-ACE2 융합 리보Mab 모두는 IVT-mRNA로부터 효율적으로 번역되었고 SN으로 분비되었다.

실시예 15: 마우스에서 항-S1-항체-ACE2 융합 리보Mab의 약동학적 거동 추정

마우스에서 항-S1-항체-ACE2 융합 리보Mab의 대략적인 반감기 및 소거율을 결정하기 위해 본 발명자들은 11주령의 암컷 Balb/cJRj(Janvier Labs, Le Genest-Saint-Isle, France) 마우스를 사용하였다. 주입을 위해 HC-대-LC-ACE2(0.925:1 비율)의 RNA 혼합물을 간-표적화 양이온성 지질 나노입자(LNP)에 캡슐화하였다(Jayaraman, M. et al. (2012), Angewandte Chemie (International ed. 영문) 51 (34), 8529-8533). 리보Mab_406 또는 리보Mab_411을 인코딩하는 30 ㎍의 RNA-LNP를 마우스당 정맥 주사하였다. 그룹 크기는 하나의 채혈 시점에 해당하는 4마리의 마우스와 함께 RNA-LNP당 12마리의 마우스로 구성되었다. 주사 14일 전에 채혈한 마우스의 혈청이 기준선으로 사용되었다. 채혈을 위한 추가 시점은 6, 24, 48, 96, 240시간으로 설정되었다. 혈액을 Microvette 500Z 겔 튜브(Sarstedt, N

rmbrecht, Germany)에 직접 수집하고 혈청을 당업자에게 공지된 바와 같이 원심분리를 통해 분리하였다. 혈청을 수확하고 액체 질소에서 즉시 급속 냉동하고 사용할 때까지 -65 ~ -85℃에서 보관하였다.

Gyros xPand™ XPA1025 면역분석 장치(Gyros Protein Technologies AB)를 사용하여 마우스 혈청 내 항-S1-항체-ACE2 융합 리보Mab 농도를 정량화하였다. 달리 명시되지 않은 경우 모든 재료는 Gyros Protein Technologies AB에서 구입하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 Gyrolab^®Generic PK Kit 또는 Gyrolab^®Generic TK Kit를사용하여 샌드위치 면역분석을 실행하였다. 포획 항체(시약 A, Gyrolab^®Generic TK Kit에 포함됨) 및 검출 항체 항-Kappa 경쇄 Alexa Fluor^®647(Abcam, Cambridge, UK)을, 동적 범위 0.5-1,000 ng/ml의 단백질 농도의 경우 Gyrolab^®Bioaffy 1000 HC CD와, 동적 범위 40-80.000 ng/ml의 경우 Gyrolab^®Bioaffy 20 HC CD와 각각 사용하였다.

샘플은 시약 F(Gyrolab Generic TK Kit에 포함됨)에서 최소 1:10 부피로 희석되었다. 데이터는 Gyrolab^®Generic PK 키트 방법 v1 또는 Gyrolab^®Generic TK 키트 방법 v1로 생성되었다.

도 15에서 입증된 바와 같이, 30-40 ㎍/mL(각각 리보Mab_406 및 리보Mab_411)의 최대 항-S1-항체-ACE2 융합 리보Mab 혈청 농도는 정맥 주사 후 6시간 이내에 도달되었다. 5-7 μg/mL(각각 리보Mab_411 및 리보Mab_406)가 주입 후 96시간에 검출되었다. 그 후 측정된 리보Mab 농도는 1 ng/ml 미만이었다.

요약하면, 두 리보Mab 모두 생체내에서 유사하게 발현되고 유사한 약동학적 거동을 보인다. 실시예 14b에 기재된 바와 같이 0.6:1의 최적 HC-대-LC-ACE2 비율의 경우, 더 높은 리보Mab 농도에 도달될 것으로 예상된다. 참고로, 리보Mab_406의 Fc 부분에서 LS-돌연변이에 의한 반감기 연장은 Balb/cJRj 마우스에서 분석할 수 없다. LS 돌연변이에 의해 유발된 반감기 연장을 조사하기 위해서는, 인간 신생아 Fc 수용체(FcRn)-형질전환 마우스 계통을 사용해야 한다.

실시예 16. 생체내 항-S1-항체-ACE2 융합 리보Mab의 발현 및 단백질 무결성.

Balb/cJRj 마우스 혈청(실시예 15)에서 분비된 항-S1-항체-ACE2 융합체 리보Mab_406 및 _411의 무결성을 원칙적으로 실시예 14c에 기재된 바와 같이 웨스턴 블롯 분석을 통해 조사하였으며, 차이점은 샘플 준비에 앞서 혈청을 멜론 겔^TM (Thermo Fisher Scientific)을 통해 정제하였다는 점이다. 10 ng의 정제된 참조 단백질 ID 411을 처리되지 않은 마우스의 혈청이 있거나 없는 상태에서 로딩하였다. 음성 대조군으로서, 루시페라제-인코딩 RNA-LNP를 주사한 Balb/cJRj 마우스로부터의 혈청을 사용하였다.

리보Mab의 신호는 내부 분자량 표준과 비교하여, 비환원(도 16A) 조건 하에서는 대략 200-460kD(완전 항체) 및 100kD(LC-ACE2)에서 검출되었고 환원 조건(도 16B) 하에서는 대략 각각 100kD(LC-ACE2) 및 50kD(HC)에서 검출되었다. 한 마우스(리보Mab_406, 마우스# 4)에서, 본 발명자들은 아마도 비환원 조건 하 ACE2가 없는 인간 항-S1-항체의 무게(~170 kD)에서 그리고 환원 조건 하 부가적인 자유 LC(25 kD)에서 전체 항-S1-항체-ACE2 융합 리보Mab과 동일한 강도의 밴드를 검출하는데, 이는 IgG-단독 분자의 가설을 뒷받침한다.

결론적으로, 두 리보Mab 모두는 시험관내 및 생체내에서 필적할 정도로 발현되고, 안정한 생산을 나타내며 유사한 방식으로 뮤린 전신 순환으로부터 제거된다.

실시예 17: 리보Mab_411 및 406에 의한 슈도바이러스 중화 활성.

리보Mab_406 및 411의 바이러스 중화 활성을 결정하기 위해 pVNT를 수행하였다. 리보Mab_406 또는 411 인코딩 RNA로 전기천공된 HEK 293 T/17 세포의 상등액은 시험 항목으로 사용되었고 각각의 HC로만 전기천공된 HEK 293 T/17 세포의 상등액은 Mock 대조군으로 사용되었다(실시예 14a에 설명된 전기천공). 모든 SN은 Amicon Ultra-0.5 30 KDa(Merck Millipore, Darmstadt, Germany)로 60배 농축되었다.

분석은 실시예 4에 기술된 바와 같이 수행하였다. 희석된 슈도바이러스 30 μL를 SN에 30 μL 항-S1-항체-ACE2 융합 리보Mab_411 또는 406을 함유하는 웰에 60 내지 ~ 0.46 μg/mL (최종 농도 = 30 ~ 0.23 μg/mL) 범위의 2배, 8점 계대 희석으로 그리고 Mock SN에 첨가하였다. 슈도바이러스/테스트 희석 혼합물을 시딩된 Vero-76 세포(MOI: 0.003)에 첨가한 후, 37℃ 및 5% CO₂ 에서 24시간 동안 인큐베이션하였다.

도 17은 Mock SN이 슈도바이러스에 의한 Vero-76 세포의 감염에 현저한 영향을 미치지 않는 반면, 항-S1-항체-ACE2 융합 리보Mab_411 및 406은 1.34 내지 4.54 ㎍/mL 범위의 IC50 값으로 용량 의존적 방식으로 감염을 억제함을 입증한다..

실시예 18: 재조합 SARS-CoV2 S1-RBD 단백질에 대한 이중특이적 항-S1-항체-scFv 융합 단백질의 결합

SARS-CoV2 S1-RBD 단백질에 대한 이중특이적 항-S1-항체-scFv 융합 단백질의 결합을 시험하기 위해 ELISA를 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행하였다. 대조군으로서 항-S1 항체 및 본 발명의 항체를 사용하였다. 도 18A 및 B는 항-S1-항체-scFv 융합 단백질이 용량-의존 방식으로 SARS-CoV2 S1-RBD 단백질에 결합하고 항-S1-항체(408) 및 본 발명의 항체(444, 446, 449, 450 및 451)에 대략적으로 유사한 EC50 값을 나타냄을 보여준다.

실시예 19: 항-S1-항체-scFv 융합 단백질에 의한 ACE2에 대한 SARS-CoV2-S1-RBD 결합의 중화

ACE-2 세포외 도메인에 대한 SARS-CoV2 S1-RBD 결합을 중화시키는 항-S1-항체-scFv 융합 단백질의 효능을 실시예 3에 기재된 바와 같이 경쟁 ELISA로 조사하였다. 대조군으로서 항-S1 항체 및 본 발명의 항체를 사용하였다. 도 19A 및 B는 증가하는 농도의 항-S1-항체-scFv 융합 단백질이 ACE-2 ECD와 SARS-CoV2 S1-RBD 단백질의 상호작용을 억제함을 입증한다. 이와 대조적으로 항-S1 항체 대조군을 사용한 경우에는 약간의 억제만 관찰되었다. 본 발명의 항체(444, 446, 449, 450 및 451)와 비교하여, 항-S1-항체-scFv 융합 단백질은 상당히 낮은 IC90 값을 나타내므로 ACE-2 S1-RBD 상호작용을 더 강력히 차단함을 나타낸다.

실시예 20: 본 발명의 S1 표적화 항체의 결합 친화도

본 발명의 S1 표적화 항체의 생화학적 친화도를 표면 플라즈몬 공명 측정으로 결정하였다. 마우스 Fc-태그(Sino Biologicals #40592-V05H)에 결합된 SARS-CoV-2 S1-RBD 단백질을 Rmax ~10 RU의 밀도로 항-마우스-Fc 항체를 통해 CM5 센서 칩 표면에 고정시켰다. SARS-CoV-2 S1-RBD 단백질과 본 발명의 S1 표적화 항체의 상호작용의 동역학을 Biacore T200 SPR 기기에서 분석하였다. 동역학 데이터는 La ngmuir 1:1 결합 모델을 사용하여 결정되었다. 도 20은 본 발명의 항체에 대한 K_D값이 115 내지 1360pM 범위임을 보여준다. 단백질 샘플 ID가 447인 항체는 다른 테스트된 항체와 비교할 때 0.672 x 10^-4s^-1의 특히 낮은 해리율을 나타낸다.

실시예 21: 항-S1-항체-scFv 융합 단백질에 의한 슈도바이러스 중화 활성

세포의 S1 단백질-지향된 바이러스 감염을 억제하는 이중특이적 항-S1-항체-scFv 융합 항체의 효능을 결정하기 위해, 슈도바이러스 중화 시험(pVNT)을 실시예 11에 기재된 바와 같이 수행하였다. 이중특이적 항체를 30 내지 0.01 μg/ml의 농도 범위에서 시험하였다. 도 21은 이중특이적 항체 465 및 467이 S1-매개 슈도바이러스 감염을 효율적으로 차단한다는 것을 보여준다. IC50 및 IC90 값은 도 21B에 요약되어 있다. 도 22는 0.57 내지 0.28 ㎍/ml 범위의 IC90 값을 갖는 작제물 478, 480, 481, 482 및 483에 경우 강력한 중화가 달성되었음을 보여준다.

실시예 22: 항-S1-항체-scFv 융합 단백질 498, 500, 501 및 502에 의한 슈도바이러스 중화 활성

세포의 S1 단백질-지향된 바이러스 감염을 억제하는 이중특이적 항-S1-항체-scFv 융합 항체 498, 500, 501 및 502의 효능을 결정하기 위해, 슈도바이러스 중화 시험(pVNT)을 실시예 11에 기재된 바와 같이 수행하였다. 이중특이적 항체를 6000 ~ 0.03 ng/ml 범위의 농도에서 시험하였다. 도 23은 이중특이적 항체 498 및 502가 각각 29.4 및 51.4 ng/ml의 IC90 값으로 가장 강력한 중화를 제공함을 보여준다.

실시예 23: 본 발명의 S1 표적화 항체 470의 결합 친화도

본 발명의 S1 표적화 항체 470의 생화학적 친화도를 표면 플라즈몬 공명 측정에 의해 구하였다. 마우스 Fc-태그(Sino Biologicals #40592-V05H)에 커플링된 SARS-CoV-2 S1-RBD 단백질을 Rmax ~10 RU의 밀도로 항-마우스-Fc 항체를 통해 CM5 센서 칩 표면에 고정시켰다. SARS-CoV-2 S1-RBD 단백질과 본 발명의 S1 표적화 항체 470의 상호작용의 정성적 및 정량적 친화성을, 2개의 상이한 유동 세포에서 3회 복제를 측정하는 다중 사이클 동역학을 사용하여 Biacore T200 SPR 기기에서 분석하였다. 동역학 데이터는 La ngmuir 1:1 결합 모델을 사용하여 결정되었다. 도 24는 본 발명의 항체 470에 대한 다중 사이클 동역학으로부터 계산된 평균 K_D값이 10.4 pM임을 보여준다.

실시예 24: 항-SARS-Cov-2를 인코딩하는 DNA 주형 및 IVT-mRNA의 생성 IgG 리보Mab.

a. 항체 IVT-mRNA 주형 벡터의 클로닝

시험관내 전사된 메신저 RNA(IVT-mRNA)를 통한 키메라 항-SARS-Cov-2 IgG 리보Mab의 생성을 위해, 토끼 항-SARS-Cov-2 항체 ID 443, 445, 447, 451, 470 및 472의 VH 및 VL DNA 서열(표 1에 열거됨)을 표준 기술을 사용하여 IVT-mRNA 주형 벡터 pST1-hAg-MCS-FI-A30LA70(BioNTech SE, 독일 마인츠)에 서브클로닝하였다. 추가 세부사항은 실시예 13a에 기재되어 있다. 토끼 VH 및 VL 도메인을 제외하고 다른 모든 항체 도메인은 인간 IgG1에서 유래하였다. 항-SARS-Cov-2 IgG 리보Mab의 형성을 위해 다음 작제물을 클로닝하였다.

본 발명의 리보Mab_443 / 445 / 447 / 451 / 470 / 472 및 항-SARS-Cov-2 IgG 참조:

pST1-5'hAg-Sec-VH-CH1-CH2^{(Leu234Ala,Leu235Ala)}-CH3^{(Met434Leu,Asn428Ser)}-FI-A30LA70(HC)

pST1-5'hAg-Sec-VL-CL-FI-A30LA70 (LC)

인간 알파-글로빈으로부터의 5'hAg, 5'UTR; A, 아데닌; 알라, 알라닌; Asn, 아스파라긴; CL, 불변 경쇄 영역; CH, 불변 중쇄 영역; FI, 3'UTR 서열; HC, 중쇄; L, 링커; Leu, 류신; LC, 경쇄; Met, 메티오닌; pST1, DNA 주형 벡터; Sec, 분비 신호; Ser, 세린; VH, 가변 중쇄 도메인; VL, 가변 경쇄 도메인.

b. IVT-mRNA 합성

IVT-mRNA의 생성은 실시예 13b에 기술되어 있다. 도 25는 완전한 항체 분자 및 IgG 리보Mab 자체의 형성에 필요한 2개의 IVT-mRNA(도 25A)의 스케치를 보여준다(도 25B).

실시예 25: 시험관내 항-SARS-Cov-2 IgG 리보Mab의 발현 및 단백질 무결성.

a. 생산자 세포의 전기천공

IVT-mRNA로부터 항-SARS-CoV-2 IgG 리보Mab의 생산은 실시예 14a에 기술된 바와 같이 수행되었다. RNA 혼합물은 각각 1.5:1의 질량비로 HC 및 LC를 인코딩하는 mRNA를 포함하였다.

b. 생산자 세포 배양 상등액 내 항-SARS-CoV-2 IgG 리보Mab의 면역분석 기반 정량

전기천공ehls HEK 293T/17 세포로부터의 SN 내 항-SARS-CoV-2 IgG 리보Mab를 원칙적으로 실시예 14b에 기술된 바와 같이 정량화하였다. 4-3,000 ng/ml의 동적 범위에서 단백질 농도 측정은 Gyrolab® Bioaffy 1000 HC CD 및 Gyrolab huIgG 키트 - 저역가 구성 요소 시약 A(포획 시약) 및 시약 B(검출 시약)를 사용하여 수행되었다. 데이터는 Gyrolab® huIgG Low Titer Kit 방법 v1로 생성되었다.

항-SARS-CoV-2 IgG 리보Mab 농도는 약 2~8 μg/mL 범위였으며, 발현 수율은 리보Mab_443이 가장 높았고 리보Mab_472가 가장 낮았다(도 26).

실시예 26: 시험관내에서 발현된 항-SARS-CoV-2 IgG 리보Mab에 의한 슈도바이러스 중화 활성.

HEK 293/T17 (#CL-11268 ^TM, American Type culture collection [ATCC])에 의해 시험관내 발현된 항-SARS-CoV-2 IgG 리보Mab_443/445/447/451/470 및 472의 바이러스 중화 활성을 전기천공(실시예 25)을 통해 결정하기 위해, pVNT 검정을 수행하였다. VSV 엔벨로프 당단백질 VSV-G에 대한 유전 정보가 부족하지만 루시페라제 단백질에 대한 ORF를 포함하는 복제 결핍 VSV를, SARS-CoV-2-S(S = 스파이크 단백질) 슈도바이러스 생성에 사용하였다. 여기서는 SARS-CoV-2의 야생형 스파이크 단백질(중국 우한에서 확인된 첫 번째 변종)을 운반하는 슈도바이러스만 사용하였다. 공개된 프로토콜(PMID: 32142651)에 따라 VSV 슈도형이 생성되었다.

HEK 293/T17 세포 배양 SN 샘플에서 200 내지 300 ㎍/mL의 거의 유사한 리보Mab 농도를 산출하기 위해 모든 SN 샘플을 30KDa의 컷오프를 갖는 Amicon Ultra-0.5 원심 필터 유닛(Merck Millipore, Darmstadt, Germany)으로 농축하였다.

pVNT 분석을 위해, VERO 76 세포(#CL-1587TM,American Type culture collection)를 해동하고 분석 배지(DMEM [Gibco/ThermoFisher Scientific, Darmstadt, Germany]/10% FBS [Merck/Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany])에 5 x 10⁵세포/mL로 희석한 다음 흰색 384-웰 평평한 바닥 플레이트(Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany) 에 20 μL 분석 배지 중 웰당 1 x 10⁴세포의 밀도로 접종하였다. 세포를 37℃ 및 7.5% CO₂에서 4시간 동안 배양하였다. VSV/SARS-CoV-2 슈도바이러스를 해동하고 희석하여 웰당 약 50IU를 얻었다. 항-SARS-CoV-2 IgG 리보Mab 함유 SN을 96-웰 V-바닥 플레이트(Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany)의 분석 배지에서 12 단계, 2배 계대 희석으로 희석당 총 40 μL 희석하였다. 15 내지 7 x10^-3 ㎍/ml 범위(리보Mab_443) 또는 30 ~ 1 x 10^-2μg/mL(다른 모든 리보Mab)의 최종 IgG 리보Mab 농도를 위해, 384-딥 웰 바닥 플레이트(Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany)에서 웰당 10 ㎕의 희석된 슈도바이러스 및 10 ㎕의 리보Mab 희석물을 조합하였다. 슈도바이러스/리보Mab 혼합물을 마이크로 플레이트 진탕기에서 1,200rpm으로 10분 동안 그리고 추가 5분 동안 진탕 없이 3회 배양 하였다. 이러한 슈도바이러스/리보Mab 희석 혼합물 중, 10 μL를 접종된 VERO 76 세포에 첨가한 후, 37℃ 및 5% CO₂ 에서 18시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포 배양 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내어 실온으로 평형화시켰다. 웰 당 30 μL의 BioGlo^TM루시페린 용액(Promega, Germany)을 첨가하고 상온에서 5분간 빛을 차단하여 배양하였다. 상대적 발광 광 단위(RLU)는 Tecan Infinite M200 Pro 마이크로플레이트 판독기(Tecan, M

nnedorf, Switzerland)에서 측정되었다. 여기에서 발광은 바이러스 감염의 억제를 역으로 나타낸다. 곡선 맞춤은 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. IC50 및 IC90 계산은 Excel(Microsoft)용 XLfit 추가 기능(IDBS)을 사용하여 수행되었다.

도 27A는 본 발명의 시험관내 발현된 항-SARS-Cov-2 IgG 리보Mab가 132.4 내지 406.1 ng/ml 범위의 IC50 값으로 용량 의존 방식으로 감염을 억제함을 입증한다(도 27B). IgG 리보Mab 참조(ID 408에 해당)는 테스트된 농도에서 슈도바이러스에 의한 VERO 76 세포의 감염에 유의한 영향을 미치지 않았다. IC90 값은 449.1~7,243.2 ng/ml 범위였으며 리보Mab_470이 가장 낮은 IC90을 보였다.

실시예 27: 마우스에서 항-SARS-CoV-2 IgG 리보Mab의 약동학적 거동 추정

a. 마우스에 RNA-LNP 투여 및 혈청 준비

마우스에서 IgG 리보Mab의 약동학적 거동을 조사하기 위해, 9주령의 암컷 Balb/cJRj(Janvier Labs, Le Genest-Saint-Isle, France) 마우스를 사용하였다.

주입을 위해 HC-대-LC 1.5:1 비율의 RNA 혼합물을 간-표적화 양이온성 지질 나노입자(LNP)에 캡슐화하였다(Jayaraman, M. et al. (2012), Angewandte Chemie (International ed. 영문) 51 (34), 8529-8533). RNA-LNP(1 mg/mL)의 원액을 실온에서 해동하고 주사를 위해 1xDPBS(Gibco/ThermoFisher Scientific, Germany)로 희석하였다. 본 발명의 리보Mab_445, 리보Mab_447, 리보Mab_470 또는 리보Mab_472를 인코딩하는 30 ㎍의 RNA-LNP를 마우스당 150㎕의 부피로 정맥 주사하였다. 루시페라제를 인코딩하는 30 μg RNA-LNP를 음성 대조군으로 사용하고, 100 μg의 단백질 ID 408은 IgG 단백질 참조로 사용되었다. 그룹 크기는 RNA-LNP당 4마리의 마우스로 구성되었다. 채혈 시점은 24, 96, 168, 216, 336, 504시간(1, 4, 7, 9, 14, 21일)으로 설정하였다. 혈액은 Microvette 500Z 겔 튜브(Sarstedt, N

rmbrecht, Germany)에 직접 수집하고 공지방법에 따라, 훈련된 실험실 직원이 원심분리를 통해 혈청을 분리하였다. 혈청을 수확하고 액체 질소에서 즉시 급속 냉동하고 사용할 때까지 -65 ~ -85℃에서 보관하였다

b. 마우스 혈청 내 항-SARS-CoV-2 IgG 리보Mab의 면역분석 기반 정량화

Gyros xPand™ XPA1025 면역분석 장치(Gyros Protein Technologies AB, Uppsala, Sweden)를 사용하여 마우스 혈청 내 항-SARS-CoV-2 IgG 리보Mab 농도를 정량화하였다. 달리 명시되지 않은 경우 모든 재료는 Gyros Protein Technologies AB에서 구입하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 Gyrolab® Generic PK 또는 TK 키트를 사용하여 샌드위치 면역분석을 실행하였다. 포획 시약(Gyrolab® PK 또는 TK 키트에 포함된 시약 A) 및 검출 항체(Gyrolab® PK 또는 TK 키트에 포함된 시약 B)를 각각, 단백질 농도 1.4-333 ng/ml의 동적 범위에 대해 Gyrolab® Bioaffy 1000 HC CD와, 또는 111-243,000 ng/ml의 동적 범위에 대해 Gyrolab® Bioaffy 20 HC CD와 함께 사용하였다.

샘플은 시약 F(Gyrolab® PK 키트에 포함됨)에서 최소 1:10 부피로 희석되었다. 데이터는 Gyrolab® Generic PK 또는 TK Kit 방법 v1을 사용하여 생성되었다.

도 28에서 입증된 바와 같이, 1.6 mg/mL(리보Mab_445), 686 μg/mL(리보Mab_447), 741 μg/mL(리보Mab_470) 및 627 μg/mL(리보Mab_472)의 최대 항-SARS-CoV-2 IgG 리보Mab 혈청 농도가 정맥 주사 후 24시간(리보Mab_472) 또는 96시간(본 발명의 다른 모든 리보Mab) 내에 도달하였다. 리보Mab_445, 447 및 470은 최대 504시간 동안, 리보Mab_472는 최대 336시간 동안 검출할 수 있었다. IgG 리보Mab 참조(CH2의 LALA 돌연변이를 포함하는 단백질 ID 408에 기초함)는 최대 168시간의 검출 가능성과 함께 610 μg/mL(주사 후 24시간)의 Cmax를 나타내었다. IgG 단백질 참조(단백질 ID 408)은 168시간 동안 검출 가능한 빠른 소거율을 나타냈다. 루시페라제를 인코딩하는 RNA-LNP 대조군에서는 단백질이 검출되지 않았다.

요약하면, 새로운 항체 서열에 의해 생성된 RNA에 의해 인코딩된 본 발명의 시험된 4가지 모든 항-SARS-CoV-2 IgG 리보Mab는 생체내에서 높은 역가로 발현된다. 리보Mab_447과는 별개로, 본 발명의 모든 IgG 리보Mab은 적어도 21일 동안 높은 역가를 나타냈다.

실시예 28: 생체내 발현된 항-SARS-CoV-2 IgG 리보Mab에 의한 슈도바이러스 중화 활성.

생체내에서 발현된 항-SARS-CoV-2 IgG 리보Mab_445/447/470 및 472 (실시예 27a)의 바이러스 중화 활성을 결정하기 위해, 다음 차이점을 제외하고 실시예 26에 기술된 바와 같이 pVNT 검정을 수행하였다: (i) RNA-LNP 주입 24시간 후에 수확된, 그룹당 2마리의 마우스로부터의 리보Mab-함유 마우스 혈청(원심분리 농축 단계 없음)을 시험 항목으로 사용하였다. 12단계, 3배(리보Mab_445/470/472) 또는 2배(리보Mab_447) 계대 희석을 적용하였다. 시작 농도는 최소 30.6 μg/mL(리보Mab_470)에서 최대 59.8 μg/mL(리보Mab_445 및 472)로 각 마우스마다 달리하였다. 따라서 계대 희석 범위는 약 31 내지 2 x 10^-4μg/mL(리보Mab_470), 60 내지 3 x 10^-4μg/mL(리보Mab_445 및 472) 및 35 내지 2 x 10^-2μg/mL(리보Mab_447) 범위였다.

도 29A는 본 발명의 생체내 발현된 항-SARS-Cov-2 IgG 리보Mab이 약 47 내지 582 ng/ml 범위의 IC50 값으로 용량 의존적 방식으로 감염을 억제함을 입증한다(2개의 생물학적 복제물의 평균, 도 29B). IgG 리보Mab 참조(ID 408에 해당하는 서열)는 상당히 더 높은 IC50을 도출하고 계산 가능한 IC90을 도출하지 않는다. IgG 참조 단백질 ID 408은 테스트된 농도에서 SARS-CoV-2 야생형 슈도바이러스에 의한 VERO 76 세포의 감염에 유의한 영향을 미치지 않았다. IC90 값 범위는 297 내지 5,458 ng/ml(2개의 생물학적 복제 수단)였고 리보Mab_470이 가장 낮은 IC90을 나타냈다.

실시예 29: 항-SARS-CoV-2 IgG-scFv 이중특이적 리보Mab를 인코딩하는 DNA 주형 벡터 및 IVT-mRNA의 생성.

a. 항체 IVT-mRNA 주형 벡터의 클로닝

키메라 항-SARS-CoV-2-항체 IgG-scFv 이중특이적 리보Mab의 생성을 위해, 리보Mab_443/445 및 470(실시예 25-28)의 VH 및 VL 서열을 선택하고 조합하였다(하기 및 도 30에서 VH^#1, VL^#1 및 VH^#2, VL^#2로 표시됨). IgG-scFv 분자의 아이디어는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 두 에피토프에 동시에 결합하여 중화를 가속화하는 것이다. 연결된 단일 사슬 가변 단편(IgG-scFv)으로 HC 및 경쇄를 인코딩하는 IVT-mRNA를 생성하기 위해, 토끼 항-SARS-CoV-2 항체 ID 443, 445 및 470의 VH 및 VL DNA 서열(표 2에 나열됨)을 표준 기술을 사용하여 IVT-mRNA 주형 벡터 pST1-hAg-MCS-FI-A30LA70(BioNTech RNA Pharmaceuticals, Mainz, Germany)에 서브클로닝하였다. 클로닝에 관한 추가 세부사항은 실시예 13a에 기재되어 있다. scFv 도메인을 LC에 연결하고 scFv에서 VH 및 VL을 연결하기 위해 글리신-세린 링커를 사용하였다. 토끼 VH 및 VL 도메인을 제외하고 다른 모든 항체 도메인은 인간 IgG1에서 유래하였다. 본 발명의 항-SARS-CoV-2 IgG-scFv 이중특이적 리보Mab의 형성을 위해 하기 작제물을 클로닝하였다:

리보Mab_498, 500 및 502:

#1, 첫 번째 항-SARS-CoV-2 항체의 항원 결합 서열; #2, 두 번째 항-SARS-CoV-2 항체의 항원 결합 서열; 인간 알파-글로빈으로부터의 5'hAg, 5'UTR; A, 아데닌; 알라, 알라닌; Asn, 아스파라긴; CL, 불변 경쇄 영역; CH, 불변 중쇄 영역; FI, 3'UTR 서열; GS, 글리신-세린 링커 인코딩 서열; HC, 중쇄; L, 링커; Leu, 류신; LC, 경쇄; Met, 메티오닌; pST1, DNA 주형 벡터; scFv, 단일 사슬 가변 단편; Sec, 분비 신호; Ser, 세린; VH, 가변 중쇄 도메인; VL, 가변 경쇄 도메인.

생성된 리보Mab은 ID 470(IgG) 및 ID 443(scFv)로부터의 VH, VL 도메인(리보Mab_498로 명명됨), ID 470(IgG) 및 ID 443(scFv)로부터의 VH, VL 도메인(리보Mab_500으로 명명됨), 및 ID 445(IgG) 및 ID 470(scFv)로부터의 VH, VL 도메인(리보Mab_502로 명명됨)로 구성된다.

b. IVT-mRNA 합성

IVT-mRNA의 생성은 실시예 13b에 기술되어 있다. 완전한 항체 분자의 형성에 필요한 2개의 IVT-mRNA의 스케치(도 30B)가 도 30A에 도시되어 있다.

실시예 30: 마우스에서 항-SARS-CoV-2 IgG-scFv 이중특이적 리보Mab의 약동학적 거동 추정

a. 마우스에 RNA-LNP 투여 및 혈청 준비

마우스에서 IgG-scFv 이중특이적 리보Mab의 약동학적 거동을 조사하기 위해, 7주령의 암컷 Balb/cJRj(Janvier Labs, Le Genest-Saint-Isle, France) 마우스를 사용하였다.

주입을 위해 HC-대-LC-scFv 0.8:1 비율의 RNA 혼합물을 간-표적화 양이온성 지질 나노입자(LNP)에 캡슐화하였다(Jayaraman, M. et al. (2012), Angewandte Chemie (International ed. 영문) 51 (34), 8529-8533). RNA-LNP(1 mg/mL)의 원액을 실온에서 해동하고 주사를 위해 1xDPBS(Gibco/ThermoFisher Scientific, Germany)로 희석하였다. 본 발명의 리보Mab_498, 리보Mab_500 및 리보Mab_502를 인코딩하는 30 ㎍의 RNA-LNP를 마우스당 100㎕의 부피로 정맥 주사하였다. 루시페라제를 인코딩하는 30 μg RNA-LNP를 음성 대조군으로 사용하고, 250 μg의 단백질 ID 408은 IgG 단백질 참조로 사용되었다. 그룹 크기는 RNA-LNP당 4마리의 마우스로 구성되었다. 채혈 시점은 6, 24, 48, 96, 168, 336 및 504 시간 (0.25, 1, 2, 4, 7, 14 및 21일) 으로 설정하였다. 혈액은 Microvette 500Z 겔 튜브(Sarstedt, N

rmbrecht, Germany)에 직접 수집하고 공지방법에 따라, 훈련된 실험실 직원이 원심분리를 통해 혈청을 분리하였다. 혈청을 수확하고 액체 질소에서 즉시 급속 냉동하고 사용할 때까지 -65 ~ -85℃에서 보관하였다.

b. 마우스 혈청 내 항-SARS-CoV-2 IgG-scFv 이중특이적 리보Mab의 면역분석 기반 정량화

실시예 27b에 기재된 바와 같이 Gyros xPand™ XPA1025 면역분석 장치(Gyros Protein Technologies AB, Uppsala, Sweden)를 사용하여 마우스 혈청 내 항-SARS-CoV-2 IgG-scFv 이중특이적 리보Mab 농도를 정량화하였다.

도 31에서 입증된 바와 같이, 최대 항-SARS-CoV-2 IgG-scFv 리보Mab 혈청 농도 460 μg/mL(리보Mab_498), 521 μg/mL(리보Mab_500) 및 608 μg/mL(리보Mab_502)는 정맥 주사 후 96시간 이내에 도달하였다. 리보Mab_500 및 502는 최대 504시간(21일) 동안, 리보Mab_498은 최대 336시간(14일) 동안 검출할 수 있었다. IgG 단백질 참조(단백질 ID 408)는 336시간 동안 검출 가능성을 보여주었다. 루시페라제를 인코딩하는 RNA-LNP 대조군에서는 단백질이 검출되지 않았다.

요약하면, 새로운 항-SARS-CoV-2 스파이크 단백질 항체 서열(실시예 6)로 생성된 RNA에 의해 인코딩된 본 발명의 모든 3개의 시험된 항-SARS-CoV-2 IgG-scFv 이중특이적 리보Mab는 마우스 생체내에서 대략적인 반감기 10~11일의 높은 역가로 발현된다.

실시예 31: 생체내 발현된 항-SARS-CoV-2 IgG-scFv 이중특이적 리보Mab에 의한 슈도바이러스 중화 활성.

생체내에서 발현된 본 발명의 항-SARS-CoV-2 IgG-scFv 이중특이적 리보Mab_498/500 및 502의 바이러스 중화 활성을 구하기 위해, 테스트 항목당 2마리의 마우스만을 사용한 것을 제외하고, 실시예 30a에 기술된 것과 동일한 조건 하에 Balb/cJRj 마우스에서 리보Mab을 생성하였다. 다음의 차이점을 제외하고 실시예 26에 기술된 바와 같이 수행된 pVNT 검정을 위한 최대 혈청 부피를 생성하기 위해 정맥 주사 24시간 후에 마우스를 희생시켰다: (i) 리보Mab-함유 마우스 혈청(농축 단계 없음)을 농도 범위 5 내지 1 x 10^-6μg/mL로, 12단계, 4배 계대 희석으로 하여 테스트 항목으로서 사용하였다. (ii) SARS-CoV-2의 야생형 스파이크 단백질을 운반하는 슈도바이러스 외에도 B.1.1.7(알파 변종), B.1.315(베타 변종) 및 B.1.617 스파이크 단백질을 가진 슈도바이러스도 테스트하였다. (iii) BMG 마이크로플레이트 판독기(BMG LABTECH GmbH, Ortenberg, Germany)를 RLU 판독에 사용하였다.

도 32A는 상이한 SARS-CoV-2 변이체에 대한 본 발명의 이중특이적 IgG-scFv 리보Mab의 IC50 값을 비교한다. 리보Mab_500은 일반적으로 모든 테스트된 바이러스 스파이크 단백질 변이체에 대해 IC50 값 12.9 내지 66.4 ng/ml의 가장 높은 중화 효능을 나타낸다(도 32B). 리보Mabs_498 및 502는 야생형 및 B.1.1.7 변이체에 대해서는 낮은 IC50 값(5.4 내지 10.4 ng/ml)으로 높은 중화 효능을 나타내지만 B.1.351(161.7 내지 349.4 ng/ml) 및 B.1.617(62.9~141.4 ng/ml)에 대해서는 상당히 더 높은 IC50 값을 나타낸다. 모든 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 변이체에 대한 IC90 값 범위는 리보Mab_498의 경우 17.4 내지 4,885 ng/ml, 리보Mab_500의 경우 63.6 내지 591.4 ng/ml, 그리고 리보Mab_502의 경우 55.8 내지 2,072 ng/ml였다.　 .

요약하면, 본 발명의 리보Mab_500은 전반적으로 가장 높은 바이러스 중화 효능을 입증한다.

실시예 32: 생체내 발현된 항-SARS-CoV-2 IgG-scFv 이중특이적 리보Mab의 무결성.

마우스 혈청에서 항-SARS-Cov-2 IgG-scFv 이중특이적 리보Mab의 웨스턴 블롯 분석

RNA-LNP 주사 후 24시간에 생성된 마우스 혈청 샘플(실시예 30)을 본 발명의 항-SARS-CoV-2 IgG-scFv 리보Mab의 분석에 사용하였다. 혈청 샘플을 Melon Gel Purification Buffer(Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany)에 1:100으로 희석하였다. DPBS(Thermo Fisher Scientific) 중 정제된 ID 500 단백질을 참조 단백질로 사용하였다. 모든 샘플을 DPBS 및 4x Laemmli 완충액(Bio-Rad Laboratories, Dreieich, Germany)으로 최종 부피 15 μL가 되도록 채우고 비환원 조건에서 5분 동안 95℃로 가열하였다. 열처리된 샘플과 상응하는 정제 참조 단백질 ID 500을, 4-15% Criterion™ TGX Stain-Free™ Gel(Bio-Rad)을 사용하여 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리하였다. 분자량 표품으로서 분자량 범위가 10-250 kD인 Precision Plus Protein™ Dual Xtra Prestained Protein Standards(Bio-Rad)를 사용하였다. 웨스턴 블롯 분석(도 33A)은 훈련된 실험실 직원에 의해 표준 절차에 따라 수행되었다. 니트로셀룰로오스 막(Bio-Rad)을 5% 우유 용액(Carl Roth GmbH & Co. KG)으로 1시간 동안 차단하였다. 3% BSA 분획 V 용액(Eurobio Scientific, Les Ulis, France)에 희석된 퍼옥시다제-접합된 염소 항-인간 IgG (H+L)(희석 1:500; Jackson ImmunoResearch, Cambridge, UK)의 혼합물을 사용하여 블로팅된 멤브레인 상의 단백질 밴드를 검출하였다. 이어서 멤브레인을 Clarity Western Peroxide Reagent와 Clarity Western Luminol/Enhancer Reagent(Bio-Rad)의 1:1 혼합물과 함께 배양하고 VILBER Fusion X 이미징 장치(Vilber Lourmat, Eberhardzell, Germany)에서 영상화하였다. Image Lab 소프트웨어(Bio-Rad)로 데이터를 분석하였다. 리보Mab 신호는 내부 분자량 표준과 비교하여 대략 250kD(전체 항체)에서 검출되었다.

모노머 단백질, 고분자량 및 저분자량(HMW, LMW) 종의 분획을 ImageLab 소프트웨어(Bio-Rad, Dreieich, Germany)를 사용하여 정량화하였다. 상대적인 단백질 정량화를 위해 단일 단백질 밴드의 영역을 정의하고 포함하는 픽셀 신호를 통합하였다. 도 33B에 요약된 바와 같이, 리보Mab_498, 500 및 502에 대해 모노머 종은 각각 87.5%, 94.4% 및 86.7%로, HMW 종은 4.7%, 2.6% 및 6.6%로, LMW는 7.8, 3.0 및 6.7%로 검출되었다. 특히, LMW 종 밴드는 정제된 재조합 IgG-scFv 단백질 ID 500의 패턴에 해당하며 이에 대해 정상적인 항체 패턴에 속한다.

요약하면, 본 발명의 IgG-scFv 이중특이적 리보Mab는 HMW 종의 형성을 최소화하면서 주로 모노머 단백질로 정확하게 조립 및 폴딩되었다.

SEQUENCE LISTING <110> BioNTech SE <120> BINDING AGENTS FOR CORONAVIRUS S PROTEIN <130> 674-342 PCT2 <150> PCT/EP2020/072199 <151> 2020-08-06 <160> 212 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC VR <400> 1 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Lys Tyr Ala 20 25 30 Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Ile Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile 65 70 75 80 Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Ala 85 90 95 Gly Tyr Pro Gly Tyr Ser Pro His Tyr Phe Asn Ile Trp Gly Pro Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Leu 115 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 <400> 2 Lys Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H2 <400> 3 Ile Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H3 <400> 4 Ala Gly Tyr Pro Gly Tyr Ser Pro His Tyr Phe Asn Ile 1 5 10 <210> 5 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC VR <400> 5 Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asp Ile Gly Tyr Glu 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Ile Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Asn Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Glu Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Gly Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L1 <400> 6 Lys Ala Ser Glu Asp Ile Gly Tyr Glu Leu Asn 1 5 10 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L2 <400> 7 Gly Ala Asn 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Gly 1 5 10 15 <210> 20 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H3 <400> 20 Asp Ala Ser Ser Arg Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Pro 1 5 10 15 <210> 21 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC VR <400> 21 Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asp Ile Gly Tyr Gly 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Ile Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Asn Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Glu Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Gly Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L1 <400> 22 Lys Ala Ser Glu Asp Ile Gly Tyr Gly Leu Asn 1 5 10 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L2 <400> 23 Gly Ala Asn Thr Leu Glu Ser 1 5 <210> 24 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Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu 420 425 430 Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 212 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Binding agent (LC) <400> 212 Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asp Ile Ala Tyr Gly 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Ile Thr Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Asn Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Glu Thr His Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Gly Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Asn Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Val Pro Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 210 215 220 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Glu Gln Leu Glu 225 230 235 240 Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Glu Gly Ser Leu Thr Leu Thr 245 250 255 Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Asn Tyr Trp Ile Cys Trp 260 265 270 Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Cys Ile Tyr 275 280 285 Ile Gly Ser Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe 290 295 300 Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu Gln Met Thr Ser 305 310 315 320 Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Tyr Thr 325 330 335 Pro Gly Ser Tyr Tyr Asn Met Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val 340 345 350 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 355 360 365 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro 370 375 380 Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln 385 390 395 400 Ala Ser Gln Gln Ile Ser Asn Glu Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Ser 405 410 415 Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser 420 425 430 Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr 435 440 445 Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Ser Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 450 455 460 Gln Ser Thr Gly Gly Ala Ser Ser Asp Gly Asn Ala Phe Gly Gly Gly 465 470 475 480 Thr Glu Val Val Val Lys 485

Claims

코로나바이러스 스파이크 단백질(S 단백질)에 결합하는 적어도 하나의 제1 결합 도메인 및 코로나바이러스 S 단백질에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 결합제로서, 여기서 제1 및 제2 결합 도메인은 코로나바이러스 S의 상이한 에피토프에 결합하는, 결합제 단백질.
제1항에 있어서, 결합제가 이중특이적 결합제와 같은 다중특이적인 것인, 결합제.
제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 결합 도메인이 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는, 결합제.
제3항에 있어서, VH는 SEQ ID NO: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 92, 100, 108, 116, 및 124로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는, 결합제.
제3항 또는 제4항에 있어서, VH는 SEQ ID NO: 3, 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 91, 99, 107, 115, 및 123으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 HCDR2를 포함하는, 결합제.
제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, VH는 SEQ ID NO: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 98, 106, 114, 및 122로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 HCDR1을 포함하는, 결합제.
제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, VH는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 결합제:
(i) SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;
(ii) SEQ ID NO: 10의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 11의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 12의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;
(iii) SEQ ID NO: 18의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 19의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 20의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;
(iv) SEQ ID NO: 26의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 27의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 28의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;
(v) SEQ ID NO: 34의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 35의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;
(vi) SEQ ID NO: 42의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 43의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 44의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;
(vii) SEQ ID NO: 50의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 51의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 52의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;
(viii) SEQ ID NO: 58의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 59의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 60의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;
(ix) SEQ ID NO: 66의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 67의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 68의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;
(x) SEQ ID NO: 74의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 75의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 76의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;
(xi) SEQ ID NO: 82의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 83의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 84의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;
(xii) SEQ ID NO: 90의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 91의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 92의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;
(xiii) SEQ ID NO: 98의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 99의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 100의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;
(xiv) SEQ ID NO: 106의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 107의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 108의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;
(xv) SEQ ID NO: 114의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 115의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 116의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH; 및
(xvi) SEQ ID NO: 122의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 123의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 124의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 결합 도메인은 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 결합제.
제8항에 있어서, VL은 SEQ ID NO: 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88, 96, 104, 112, 120, 및 128로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는, 결합제.
제8항 또는 제9항에 있어서, VL은 SEQ ID NO: 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 87, 95, 103, 111, 119, 및 127로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 LCDR2를 포함하는, 결합제.
제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, VL은 6, 14, 22, 30, 38, 46, 54, 62, 70, 78, 86, 94, 102, 110, 118 및 126으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 LCDR1을 포함하는, 결합제.
제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, VL은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 결합제:
(i) SEQ ID NO: 6의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 7의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 8의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(ii) SEQ ID NO: 14의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 15의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 16의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(iii) SEQ ID NO: 22의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 23의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 24의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(iv) SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 31의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 32의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(v) SEQ ID NO: 38의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 39의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 40의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(vi) SEQ ID NO: 46의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 47의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 48의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(vii) SEQ ID NO: 54의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 55의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 56의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(viii) SEQ ID NO: 62의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 63의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 64의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(ix) SEQ ID NO: 70의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 71의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 72의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(x) SEQ ID NO: 78의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 79의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 80의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(xi) SEQ ID NO: 86의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 87의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 88의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(xii) SEQ ID NO: 94의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 95의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 96의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(xiii) SEQ ID NO: 102의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 103의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 104의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(xiv) SEQ ID NO: 110의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 111의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 112의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(xv) SEQ ID NO: 118의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 119의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 120의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL; 및
(xvi) SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 127의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 128의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 결합 도메인은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 및 VL을 포함하는, 결합제:
(i) SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 6의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 7의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 8의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(ii) SEQ ID NO: 10의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 11의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 12의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 14의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 15의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 16의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(iii) SEQ ID NO: 18의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 19의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 20의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 VH SEQ ID NO: 22의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 23의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 24의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(iv) SEQ ID NO: 26의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 27의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 28의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 31의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 32의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(v) SEQ ID NO: 34의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 35의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 38의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 39의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 40의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(vi) SEQ ID NO: 42의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 43의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 44의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 46의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 47의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 48의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(vii) SEQ ID NO: 50의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 51의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 52의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 54의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 55의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 56의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(viii) SEQ ID NO: 58의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 59의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 60의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 62의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 63의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 64의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(ix) SEQ ID NO: 66의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 67의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 68의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 70의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 71의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 72의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(x) SEQ ID NO: 74의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 75의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 76의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 78의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 79의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 80의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(xi) SEQ ID NO: 82의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 83의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 84의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 86의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 87의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 88의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(xii) SEQ ID NO: 90의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 91의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 92의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 94의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 95의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 96의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(xiii) SEQ ID NO: 98의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 99의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 100의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 102의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 103의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 104의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(xiv) SEQ ID NO: 106의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 107의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 108의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 110의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 111의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 1124의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(xv) SEQ ID NO: 114의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 115의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 116의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 118의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 119의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 120의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(xvi) SEQ ID NO: 122의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 123의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 124의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 127의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 128의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 97, 105, 113, 및 121로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH를 포함하는 결합제.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 5, 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85, 93, 101, 109, 117, 및 125로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하는 결합제.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 결합 도메인은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 및 VL을 포함하는, 결합제:
(i) SEQ ID NO: 1의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 5의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;
(ii) SEQ ID NO: 9의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 13의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;
(iii) SEQ ID NO: 17의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 21의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;
(iv) SEQ ID NO: 25의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 29의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;
(v) SEQ ID NO: 33의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 37의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;
(vi) SEQ ID NO: 41의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 45의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;
(vii) SEQ ID NO: 49의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 53의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;
(viii) SEQ ID NO: 57의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 61의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;
(ix) SEQ ID NO: 65의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 69의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;
(x) SEQ ID NO: 73의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 77의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;
(xi) SEQ ID NO: 81의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 85의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;
(xii) SEQ ID NO: 89의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 93의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;
(xiii) SEQ ID NO: 97의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 101의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;
(xiv) SEQ ID NO: 105의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 109의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;
(xv) SEQ ID NO: 113의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 117의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL; 및
(xvi) SEQ ID NO: 121의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 125의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 결합 도메인은 ACE2 단백질의 세포외 도메인(ECD) 또는 이의 변이체, 또는 ACE2 단백질의 세포외 도메인(ECD) 또는 이의 변이체의 단편을 포함하는, 결합제.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, ACE2 단백질의 ECD의 변이체 또는 ACE2 단백질의 ECD의 단편 또는 이의 변이체는 코로나바이러스 S 단백질에 결합하는, 결합제.
제17항 또는 제18항에 있어서, 제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 129의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 결합제.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 결합 도메인은 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는, 결합제.
제20항에 있어서, 제2 결합 도메인의 VH는 SEQ ID NO: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 92, 100, 108, 116, 및 124로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는, 결합제.
제20항 또는 제21항에 있어서, 제2 결합 도메인의 VH는 SEQ ID NO: 3, 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 91, 99, 107, 115, 및 123으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는 HCDR2를 포함하는, 결합제.
제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 결합 도메인의 VH는 SEQ ID NO: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 98, 106, 114, 및 122로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는 HCDR1을 포함하는, 결합제.
제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 결합 도메인의 VH는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 결합제:
(i) SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;
(ii) SEQ ID NO: 10의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 11의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 12의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;
(iii) SEQ ID NO: 18의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 19의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 20의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;
(iv) SEQ ID NO: 26의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 27의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 28의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;
(v) SEQ ID NO: 34의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 35의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;
(vi) SEQ ID NO: 42의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 43의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 44의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;
(vii) SEQ ID NO: 50의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 51의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 52의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;
(viii) SEQ ID NO: 58의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 59의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 60의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;
(ix) SEQ ID NO: 66의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 67의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 68의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;
(x) SEQ ID NO: 74의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 75의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 76의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;
(xi) SEQ ID NO: 82의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 83의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 84의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;
(xii) SEQ ID NO: 90의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 91의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 92의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;
(xiii) SEQ ID NO: 98의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 99의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 100의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;
(xiv) SEQ ID NO: 106의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 107의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 108의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;
(xv) SEQ ID NO: 114의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 115의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 116의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH; 및
(xvi) SEQ ID NO: 122의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 123의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 124의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH.
제1항 내지 제16항 또는 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 결합 도메인은 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 결합제.
제25항에 있어서, 제2 결합 도메인의 VL은 SEQ ID NO: 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88, 96, 104, 112, 120, 및 128로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는, 결합제.
제25항 또는 제26항에 있어서, 제2 결합 도메인의 VL은 SEQ ID NO: 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 87, 95, 103, 111, 119, 및 127로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 LCDR2를 포함하는, 결합제.
제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 결합 도메인의 VL은 SEQ ID NO: 6, 14, 22, 30, 38, 46, 54, 62, 70, 78, 86, 94, 102, 110, 118, 및 126 SEQ ID NO: 6, 14, 22, 30, 38, 46으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 LCDR1을 포함하는, 결합제.
29. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 결합 도메인의 VL은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 결합제:
(i) SEQ ID NO: 6의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 7의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 8의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(ii) SEQ ID NO: 14의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 15의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 16의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(iii) SEQ ID NO: 22의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 23의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 24의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(iv) SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 31의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 32의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(v) SEQ ID NO: 38의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 39의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 40의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(vi) SEQ ID NO: 46의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 47의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 48의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(vii) SEQ ID NO: 54의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 55의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 56의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(viii) SEQ ID NO: 62의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 63의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 64의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(ix) SEQ ID NO: 70의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 71의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 72의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(x) SEQ ID NO: 78의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 79의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 80의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(xi) SEQ ID NO: 86의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 87의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 88의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(xii) SEQ ID NO: 94의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 95의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 96의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(xiii) SEQ ID NO: 102의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 103의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 104의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(xiv) SEQ ID NO: 110의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 111의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 112의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(xv) SEQ ID NO: 118의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 119의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 120의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL; 및
(xvi) SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 127의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 128의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL.
30. 제1항 내지 제16항 또는 제20항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 결합 도메인은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 및 VL을 포함하는 결합제:
(i) SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 6의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 7의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 8의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(ii) SEQ ID NO: 10의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 11의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 12의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 14의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 15의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 16의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(iii) SEQ ID NO: 18의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 19의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 20의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 VH SEQ ID NO: 22의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 23의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 24의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(iv) SEQ ID NO: 26의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 27의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 28의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 31의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 32의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(v) SEQ ID NO: 34의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 35의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 38의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 39의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 40의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(vi) SEQ ID NO: 42의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 43의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 44의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 46의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 47의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 48의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(vii) SEQ ID NO: 50의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 51의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 52의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 54의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 55의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 56의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(viii) SEQ ID NO: 58의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 59의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 60의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 62의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 63의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 64의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(ix) SEQ ID NO: 66의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 67의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 68의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 70의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 71의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 72의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(x) SEQ ID NO: 74의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 75의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 76의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 78의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 79의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 80의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(xi) SEQ ID NO: 82의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 83의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 84의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 86의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 87의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 88의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(xii) SEQ ID NO: 90의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 91의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 92의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 94의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 95의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 96의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(xiii) SEQ ID NO: 98의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 99의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 100의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 102의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 103의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 104의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(xiv) SEQ ID NO: 106의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 107의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 108의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 110의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 111의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 112의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(xv) SEQ ID NO: 114의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 115의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 116의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 118의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 119의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 120의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(xvi) SEQ ID NO: 122의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 123의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 124의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 127의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 128의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL.
제1항 내지 제16항 또는 제20항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 97, 105, 113, 및 121로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH를 포함하는, 결합제.
제1항 내지 제16항 또는 제20항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 5, 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85, 93, 101, 109, 117, 및 125로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 결합제.
제1항 내지 제16항 또는 제20항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 결합 도메인은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 및 VL을 포함하는 결합제:
(i) SEQ ID NO: 1의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 5의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;
(ii) SEQ ID NO: 9의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 13의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;
(iii) SEQ ID NO: 17의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 21의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;
(iv) SEQ ID NO: 25의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 29의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;
(v) SEQ ID NO: 33의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 37의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;
(vi) SEQ ID NO: 41의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 45의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;
(vii) SEQ ID NO: 49의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 53의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;
(viii) SEQ ID NO: 57의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 61의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;
(ix) SEQ ID NO: 65의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 69의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;
(x) SEQ ID NO: 73의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 77의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;
(xi) SEQ ID NO: 81의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 85의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;
(xii) SEQ ID NO: 89의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 93의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;
(xiii) SEQ ID NO: 97의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 101의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;
(xiv) SEQ ID NO: 105의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 109의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;
(xv) SEQ ID NO: 113의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 117의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL; 및
(xvi) SEQ ID NO: 121의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 125의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL.
제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서:
(i) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 122의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 123의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 124의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 127의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 128의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 34의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 35의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 38의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 39의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 40의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(ii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 122의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 123의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 124의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 127의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 128의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 6의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 7의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 8의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(iii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 122의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 123의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 124의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 127의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 128의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 10의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 11의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 12의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 14의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 15의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 16의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(iv) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 122의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 123의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 124의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 127의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 128의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 26의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 27의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 31의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 32의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(v) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 122의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 123의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 124의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 127의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 128의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 42의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 43의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 44의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 46의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 47의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 48의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(vi) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 34의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 35의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 38의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 39의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 40의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 122의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 123의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 124의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 127의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 128의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(vii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 26의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 27의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 28의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 31의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 32의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 122의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 123의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 124의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 127의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 128의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(viii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 42의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 43의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 44의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 46의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 47의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 48의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 122의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 123의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 124의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 127의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 128의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(ix) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 6의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 7의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 8의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 122의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 123의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 124의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 127의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 128의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(x) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 10의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 11의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 12의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 14의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 15의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 16의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 122의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 123의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 124의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 127의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 128의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(xi) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 122의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 123의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 124의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 127의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 128의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 18의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 19의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 20의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 22의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 23의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 24의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(xii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 122의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 123의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 124의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 127의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 128의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 50의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 51의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 52의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 54의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 55의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 56의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(xiii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 122의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 123의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 124의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 127의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 128의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 106의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 107의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 108의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 110의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 111의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 112의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(xiv) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 18의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 19의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 20의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 22의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 23의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 24의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 122의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 123의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 124의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 127의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 128의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(xv) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 50의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 51의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 52의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 54의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 55의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 56의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 122의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 123의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 124의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 127의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 128의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(xvi) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 106의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 107의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 108의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 110의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 111의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 112의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 122의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 123의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 124의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 127의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 128의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(xvii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 106의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 107의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 108의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 110의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 111의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 112의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 18의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 19의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 20의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 22의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 23의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 24의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(xviii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 106의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 107의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 108의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 110의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 111의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 112의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 50의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 51의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 52의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 54의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 55의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 56의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(xix) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 106의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 107의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 108의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 110의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 111의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 112의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 42의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 43의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 44의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 46의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 47의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 48의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(xx) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 18의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 19의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 20의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 22의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 23의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 24의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 106의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 107의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 108의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 110의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 111의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 112의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(xxi) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 50의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 51의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 52의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 54의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 55의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 56의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 106의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 107의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 108의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 110의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 111의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 112의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(xxii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 42의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 43의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 44의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 46의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 47의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 48의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 106의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 107의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 108의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 110의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 111의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 112의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(xxiii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 122의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 123의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 124의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 126의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 127의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 128의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 129의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 또는
(xxiv) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 18의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 19의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 20의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 22의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 23의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 24의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 82의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 83의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 84의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 86의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 87의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 88의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(xxv) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 82의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 83의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 84의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 86의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 87의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 88의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 18의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 19의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 20의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 22의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 23의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 24의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(xxvi) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 82의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 83의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 84의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 86의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 87의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 88의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 50의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 51의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 52의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 54의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 55의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 56의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(xxvii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 50의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 51의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 52의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 54의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 55의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 56의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 82의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 83의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 84의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 86의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 87의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 88의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하는 것인, 결합제.
제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서:
(i) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 121의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 125의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 33의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 37의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(ii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 121의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 125의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 1의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 5의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(iii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 121의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 125의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 9의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 13의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(iv) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 121의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 125의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 25의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 29의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(v) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 121의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 125의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 41의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 45의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(vi) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 33의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 37의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 121의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 125의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(vii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 25의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 29의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 121의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 125의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(viii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 41의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 45의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 121의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 125의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(ix) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 1의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 5의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 121의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 125의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(x) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 9의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 13의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 121의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 125의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(xi) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 121의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 125의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 17의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 21의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(xii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 121의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 125의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 49의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 53의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(xiii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 121의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 125의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 105의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 109의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(xiv) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 17의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 21의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 121의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 125의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(xv) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 49의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 53의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 121의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 125의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(xvi) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 105의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 109의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 121의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 125의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(xvii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 105의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 109의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 17의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 21의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(xviii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 105의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 109의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 49의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 53의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(xix) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 105의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 109의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 41의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 45의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(xx) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 17의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 21의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 105의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 109의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(xxi) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 49의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 53의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 105의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 109의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(xxii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 41의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 45의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 105의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 109의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(xxiii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 121의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 125의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 129의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 또는
(xxiv) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 17의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 21의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 81의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 85의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(xxv) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 81의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 85의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 17의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 21의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(xxvi) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 81의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 85의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 49의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 53의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하며; 또는
(xxvii) 제1 결합 도메인은 SEQ ID NO: 49의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 53의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하고,
제2 결합 도메인은 SEQ ID NO: 81의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 85의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하는 것인, 결합제.
제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 결합 도메인을 형성하는 중쇄 및 경쇄를 포함하는, 결합제.
제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하고, 각각의 중쇄는 경쇄 중 하나와 함께 제1 결합 도메인을 형성하는, 결합제.
제36항 또는 제37항에 있어서, 중쇄는 VH를 포함하는, 결합제.
제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄는 VL을 포함하는, 결합제.
제36항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄는 단편 결정화가능(Fc) 영역을 포함하는, 결합제.
제36항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄는 경쇄와 회합되는, 결합제.
제37항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄는 공유적으로 및/또는 비공유적으로 회합된, 결합제.
제37항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 중쇄는 동일하고 2개의 경쇄는 동일한, 결합제.
제36항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 전장 항체 또는 제1 결합 도메인을 포함하는 전장 항체 유사 분자를 포함하는, 결합제.
제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 제1 결합 도메인을 포함하는, 결합제.
제45항에 있어서, 2개의 제1 결합 도메인은 동일한 에피토프에 결합하는, 결합제.
제1항 내지 제16항 또는 제20항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 결합 도메인은 단일 사슬 가변 단편(scFv)를 포함하는, 결합제.
제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 결합 도메인은 직접적으로 공유 연결되거나 또는 링커를 통해 공유 연결된, 결합제.
제48항에 있어서, 링커는 글리신-세린(GS) 링커인, 결합제.
제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 전장 항체 또는 2개의 제1 결합 도메인을 포함하는 전장 항체 유사 분자를 형성하는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하고, 여기서 각각의 경쇄는 제2 결합 도메인에 연결된 것인, 결합제.
제50항에 있어서, 각각의 경쇄의 C-말단은 제2 결합 도메인의 N-말단에 연결된, 결합제.
제50항에 있어서, 각각의 경쇄의 N-말단은 제2 결합 도메인의 C-말단에 연결된, 결합제.
중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 항체로서, 여기서 VH는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것인, 항체:
(i) SEQ ID NO: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 92, 100, 108, 및 116으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 HCDR3;
(ii) SEQ ID NO: 3, 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 91, 99, 107, 및 115로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 HCDR2;
(iii) SEQ ID NO: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 98, 106, 및 114로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 HCDR1.
제53항에 있어서, VH는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체:
(i) SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;
(ii) SEQ ID NO: 10의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 11의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 12의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;
(iii) SEQ ID NO: 18의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 19의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 20의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;
(iv) SEQ ID NO: 26의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 27의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 28의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;
(v) SEQ ID NO: 34의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 35의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;
(vi) SEQ ID NO: 42의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 43의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 44의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;
(vii) SEQ ID NO: 50의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 51의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 52의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;
(viii) SEQ ID NO: 58의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 59의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 60의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;
(ix) SEQ ID NO: 66의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 67의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 68의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;
(x) SEQ ID NO: 74의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 75의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 76의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;
(xi) SEQ ID NO: 82의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 83의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 84의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;
(xii) SEQ ID NO: 90의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 91의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 92의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;
(xiii) SEQ ID NO: 98의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 99의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 100의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH;
(xiv) SEQ ID NO: 106의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 107의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 108의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH; 및
(xv) SEQ ID NO: 114의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 115의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 116의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH.
경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항체로서, 여기서 VL은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것인, 항체:
(i) SEQ ID NO: 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88, 96, 104, 112 및 120으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 LCDR3;
(ii) SEQ ID NO: 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 87, 95, 103, 111 및 119로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 LCDR2; 및
(iii) SEQ ID NO: 6, 14, 22, 30, 38, 46, 54, 62, 70, 78, 86, 94, 102, 110 및 118로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 LCDR1.
제55항에 있어서, VL은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된, 항체:
(i) SEQ ID NO: 6의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 7의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 8의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(ii) SEQ ID NO: 14의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 15의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 16의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(iii) SEQ ID NO: 22의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 23의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 24의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(iv) SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 31의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 32의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(v) SEQ ID NO: 38의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 39의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 40의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(vi) SEQ ID NO: 46의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 47의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 48의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(vii) SEQ ID NO: 54의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 55의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 56의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(viii) SEQ ID NO: 62의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 63의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 64의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(ix) SEQ ID NO: 70의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 71의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 72의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(x) SEQ ID NO: 78의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 79의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 80의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(xi) SEQ ID NO: 86의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 87의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 88의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(xii) SEQ ID NO: 94의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 95의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 96의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(xiii) SEQ ID NO: 102의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 103의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 104의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(xiv) SEQ ID NO: 110의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 111의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 112의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL; 및
(xv) SEQ ID NO: 118의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID NO: 119의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 120의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL.
제53항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 및 VL을 포함하는 것인 항체:
(i) SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 6의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID No: 7의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 8의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(ii) SEQ ID NO: 10의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 11의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 12의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 14의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID No: 15의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 16의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(iii) SEQ ID NO: 18의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 19의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 20의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 22의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID No: 23의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 24의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(iv) SEQ ID NO: 26의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 27의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 28의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID No: 31의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 32의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(v) SEQ ID NO: 34의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 35의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 36의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 38의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID No: 39의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 40의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(vi) SEQ ID NO: 42의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 43의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 44의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 46의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID No: 47의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 48의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(vii) SEQ ID NO: 50의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 51의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 52의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 54의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID No: 55의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 56의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(viii) SEQ ID NO: 58의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 59의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 60의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 62의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID No: 63의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 64의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(ix) SEQ ID NO: 66의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 67의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 68의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 70의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID No: 71의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 72의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(x) SEQ ID NO: 74의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 75의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 76의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 78의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID No: 79의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 80의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(xi) SEQ ID NO: 82의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 83의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 84의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 86의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID No: 87의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 88의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(xii) SEQ ID NO: 90의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 91의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 92의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 94의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID No: 95의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 96의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(xiii) SEQ ID NO: 98의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 99의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 100의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 102의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID No: 103의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 104의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL;
(xiv) SEQ ID NO: 106의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 107의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 108의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 110의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID No: 111의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 112의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL; 및
(xv) SEQ ID NO: 114의 서열을 포함하는 HCDR1, SEQ ID NO: 115의 서열을 포함하는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 116의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 118의 서열을 포함하는 LCDR1, SEQ ID No: 119의 서열을 포함하는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 120의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL.
제53항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 SEQ ID NO. 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 97, 105, 및 113으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH를 포함하는, 항체.
제53항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 SEQ ID NO: 5, 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85, 93, 101, 109, 및 117로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 항체.
제53항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 및 VL을 포함하는, 항체:
(i) SEQ ID NO: 1의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 5의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;
(ii) SEQ ID NO: 9의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 13의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;
(iii) SEQ ID NO: 17의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 21의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;
(iv) SEQ ID NO: 25의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 29의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;
(v) SEQ ID NO: 33의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 37의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;
(vi) SEQ ID NO: 41의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 45의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;
(vii) SEQ ID NO: 49의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 53의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;
(viii) SEQ ID NO: 57의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 61의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;
(ix) SEQ ID NO: 65의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 69의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;
(x) SEQ ID NO: 73의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 77의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;
(xi) SEQ ID NO: 81의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 85의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;
(xii) SEQ ID NO: 89의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 93의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;
(xiii) SEQ ID NO: 97의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 101의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;
(xiv) SEQ ID NO: 105의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 109의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL; 및
(xv) SEQ ID NO: 113의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 117의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL.
제1항 내지 제52항 중 어느 한 항의 결합제 또는 제53항 내지 제60항 중 어느 한 항의 항체를 인코딩하는, 재조합 핵산.
제61항에 있어서, RNA인 재조합 핵산.
제61항 또는 제62항의 재조합 핵산으로 형질감염된, 세포.
제63항에 있어서, 결합제 또는 항체를 발현하는, 세포.
제1항 내지 제52항 중 어느 한 항의 결합제, 제53항 내지 제60항 중 어느 한 항의 항체, 또는 제61항 또는 제62항의 재조합 핵산을 포함하는, 의약 조성물.
치료 용도를 위한, 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항의 결합제, 제53항 내지 제60항 중 어느 한 항의 항체, 또는 제61항 또는 제62항의 재조합 핵산.
제66항에 있어서, 치료적 용도가 개체에서 코로나바이러스 감염의 치료적 또는 예방적 치료를 포함하는, 결합제, 항체 또는 재조합 핵산.
제66항 또는 제67항에 있어서, 치료 용도가 대상체에서 코로나바이러스를 중화시키는 것을 포함하는, 결합제, 항체 또는 재조합 핵산.
제67항 또는 제68항에 있어서, 대상체가 인간인, 결합제, 항체 또는 재조합 핵산.
코로나바이러스가 베타코로나바이러스인, 제1항 내지 제52항 및 제66항 내지 제69항 중 어느 한 항의 결합제, 제53항 내지 제60항 및 제66항 내지 제69항 중 어느 한 항의 항체, 제61항, 제62항 및 제66항 내지 제69항 중 어느 한 항의 재조합 핵산, 제63항 또는 제64항의 세포, 또는 제65항의 의약 조성물.
코로나바이러스가 사르베코바이러스인, 제1항 내지 제52항 및 제66항 내지 제70항 중 어느 한 항의 결합제, 제53항 내지 제60항 및 제66항 내지 제70항 중 어느 한 항의 항체, 제61항, 제62항 및 제66항 내지 제70항 중 어느 한 항의 재조합 핵산, 제63항 또는 제64항 및 제70항 중 어느 한 항의 세포, 또는 제65항 또는 제70항의 의약 조성물.
코로나바이러스가 SARS-CoV-1 및/또는 SARS-CoV-2인, 제1항 내지 제52항 및 제66항 내지 제71항 중 어느 한 항의 결합제, 제53항 내지 제60항 및 제66항 내지 제71항 중 어느 한 항의 항체, 제61항, 제62항 및 제66항 내지 제71항 중 어느 한 항의 재조합 핵산, 제63항, 제64항, 제70항 및 제71항 중 어느 한 항의 세포, 또는 제65항, 제70항 및 제72항 중 어느 한 항의 의약 조성물.
제1항 내지 제52항 중 어느 한 항의 결합제, 제53항 내지 제60항 중 어느 한 항의 항체, 제61항 또는 제62항의 재조합 핵산, 또는 제65항의 의약 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 코로나바이러스 감염의 치료 또는 예방 방법.