KR101569083B1

KR101569083B1 - Vegfr-2와 dll4를 표적으로 하는 이중표적항체 및 이를 포함하는 약학적 조성물

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Publication number: KR101569083B1
Application number: KR1020130141451A
Authority: KR
Inventors: 김중규; 유진산; 이상훈; 이원섭; 김성우; 심상렬; 유진상; 이영애; 박미주; 변상순; 이혁준; 김도윤; 김연주; 최진희; 남경희; 남주령; 정종근; 정보영; 이은진; 이선영
Original assignee: 주식회사 파멥신
Priority date: 2012-11-21
Filing date: 2013-11-20
Publication date: 2015-11-16
Anticipated expiration: 2033-11-20
Also published as: KR20140065352A; EP2924052B1; JP2016505244A; DK2924052T3; AU2013348570B2; US9963512B2; CN104870476B; US10155817B2; CN104870476A; AU2013348570A1; WO2014081202A1; EP2924052A4; CA2892193C; US20150315277A1; ES2744267T3; CA2892193A1; US20180208660A1; JP6144771B2; EP2924052A1

Abstract

본 발명은 VEGFR-2를 표적으로 하는 항체, 특히 타니비루맵 경쇄의 N-말단에 인간 Notch1 의 11~12번째 calcium-binding EGF-유사 도메인이 결합된 신규한 형태의 이중표적항체, 이를 코딩하는 유전자, 이 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 이 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포 및 이 숙주세포를 배양하여 이중표적항체를 제조하는 방법, 상기 이중표적항체를 포함하는 약제학적 조성물 및 인간 DLL4(hDLL4)를 발현하는 세포주와 인간탯줄내피세포(HUVEC)의 공배양을 통해 Notch 1 활성을 측정하는 것을 특징으로 하는 상기 이중표적항체의 DLL4 길항 효능 측정방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 이중표적항체는 VEGF/VEGFR-2 및 DLL4/Notch1의 두 가지 경로에 따른 신호전달을 보다 효율적으로 동시에 저해함으로써 종양 등 다양한 혈관신생 관련 질환을 치료할 수 있으며, 특히 신생혈관치료제를 단독으로 사용함에 따라 발생되는 내성을 극복할 수 있으며, 암줄기세포를 직접 타겟팅함으로써 암의 재발을 근본적으로 방지할 수 있다는 장점이 있다.

Description

VEGFR-2와 DLL4를 표적으로 하는 이중표적항체 및 이를 포함하는 약학적 조성물{Bispecific Antibody Targeting VEGFR-2 and DLL4, and Pharmaceutical Composition Comprising Thereof}

본 발명은 VEGFR-2를 표적으로 하는 항체의 말단에 DLL4에 대한 길항제(antagonist)가 연결되어 인간 DLL4를 추가로 표적하는 신규한 형태의 이중표적항체, 상기 항체를 코딩하는 DNA 및 이를 포함하는 재조합 발현 벡터, 그리고 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포 및 이를 이용한 상기 이중표적항체의 제조 방법, 상기 이중표적항체를 포함하는 약제학적 조성물 및 상기 이중표적항체의 DLL4 길항 효능을 측정하는 방법에 관한 것이다.

혈관신생(angiogenesis)은 내피세포의 성장, 분열, 이동 등에 의하여 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관이 생성되는 기작으로, 상처의 치유나 여성의 생리주기를 포함하는 정상적인 성장과정에서 중요한 역할을 담당하고 있으며(Risau, Nature, 386:671, 1997), 뿐만 아니라 비정상적으로 과도한 혈관신생은 종양의 성장과 전이 (metastasis), 연령관련 황반변성(age-related macular degeneration, ARMD), 당뇨병성 망막병증(diabetic retinopathy), 건선(psoriasis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 만성염증(chronic inflammation)과 같은 질환에 결정적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (Carmeliet and Jain, Nature, 407:249, 2000).

1971년 Dr. J. Folkman에 의해, 종양의 성장과 전이는 혈관신생 의존적이고, 따라서 항 혈관신생에 초점을 맞춘 치료법은 고형암에 대한 새로운 치료제가 될 수 있을 것이라는 가설이 제기된 이후, 과도한 혈관신생 기작의 억제와 관련된 연구는 다수 연구진들의 관심을 끌어왔다 (Ferrara and Kerbel, Nature, 435:967, 2005). 혈관신생 과정의 진행양상은 혈관신생 유발 인자들과 혈관신생 저해 인자들의 종합적인 밸런스에 의해서 결정되며, 여러 단계의 복잡하고 순차적인 과정에 의해서 진행된다. 그 과정을 살펴보면, 우선 종양이나 상처 난 조직에서 분비되는 혈관내피성장인자(Vasicular Endothelial Growth Factor, VEGF)를 비롯한 다양한 혈관신생 유발 인자들이 주변에 있는 기존 혈관내피세포의 해당 수용체에 결합함으로써, 혈관내피세포들을 활성화시켜 혈관내피세포들의 투과성을 증가시키게 되고, 기저막 단백분해효소(matrix metalloproteinase, MMP)와 같은 단백질 분해효소를 분비함으로써, 혈관내피세포 주변의 기저막과 세포외기질을 분해시켜, 혈관내피세포들이 기존의 모세혈관으로부터 벗어나 혈관신생 유발 인자를 분비하는 조직을 향해 이동·증식하게 된다. 이동·증식한 혈관내피세포들은 혈관 내 튜브 구조를 이루고, 마지막으로 혈관내피세포의 구조적 지지대인 혈관주위세포(pericyte)가 유입되면서 안정하고 성숙한 혈관형성이 이루어지게 된다.

상기 기재된 바와 같이 VEGF 및 이와 결합하는 VEGF 수용체(VEGFR)의 신호전달을 저해하여 궁극적으로 혈관신생을 억제함으로써 종양의 성장과 전이를 비롯한 연령관련 황반변성, 당뇨병성 망막병증, 건선, 류마티스성 관절염 및 만성염증을 포함한 다양한 질환에 대한 치료효과를 거둘 수 있다는 점이 규명됨에 따라, VEGF의 활성을 억제할 수 있는 다양한 약물의 개발이 진행되고 있다.

구체적으로 살펴보면, VEGF는 1989년 제넨텍(Genentech)사의 Dr. N. Ferrara 그룹에 의해서 단백질의 분리·정제 및 cDNA 클로닝이 이루어졌다 (Leung et al ., Science , 246:1306, 1989). VEGF-A라고도 불리는 VEGF는 현재까지 4개의 이소형 (VEGF121, VEGF165, VEGF189, VEGF206)이 존재하는 것으로 알려져 있으며, 그 가운데 VEGF165는 태반을 제외한 모든 인간조직에서 가장 풍부한 것으로 보고된 바 있다 (Tisher et al ., J. Biol . Chem ., 266:11947, 1991). VEGF는 그것의 수용체인 VEGFR-1과 VEGFR-2/KDR에 매우 높은 친화도를 가지고 결합하지만, 주로 VEGFR-2를 통해서 그것의 신호를 전달함으로써, 혈관내피세포의 증식과 이동 등의 혈관신생과 관련된 기작을 유도하는 것으로 알려져 있다. 이러한 이유에서, VEGF 및 VEGFR-2는 VEGF에 의해 유도되는 혈관신생 기작을 억제하기 위한 주요 표적이 되어왔으며, 이와 관련해서 다수의 논문이 이들을 다루고 있다 (Ellis and Hicklin, Nature Rev . Cancer, 8:579, 2008; Youssoufian et al ., Clin . Cancer Res ., 13:5544s, 2007).

예를 들어 제넨텍사의 아바스틴(Avastin, bevacizumab)은 VEGF-A를 표적으로 하는 인간화항체(Ferrara et al ., Biochem . Biophy . Res . Comm ., 333:328, 2005)로서, 2004년에 전이성 대장암(metastatic colorectal cancer), 2006년에 비소세포성 폐암(non-small cell lung cancer), 그리고 2008년에 Her-2 negative 전이성 유방암(metastatic breast cancer)에 대하여 각각 미국 FDA 승인을 받았으며, 글리오블라스토마 멀티폼(Glioblastoma mutiforme, GBM) 및 신장암(renal cancer)에 대한 승인이 이루어졌고, 현재에도 적응증을 확대하기 위해 다양한 고형암종에 대해서 임상시험을 진행 중에 있다. 뿐만 아니라 같은 회사에서 출시된 루센티스(Lucentis)는 노인성 황반변성의 주 양상인 황반주위의 과도한 혈관신생을 억제하기 위해서, 망막에 주사하였을 때, 그것의 투과성을 좋도록 만들기 위해서 아바스틴으로부터 Fab 절편만을 잘라내어 제조된 항체로서(Eter et al ., Biodrgus , 20:167, 2006), 습성 연령관련 황반변성(wet-ARMD)에 대한 치료약으로서, 2006년에 미국 FDA 승인을 획득한 바 있다.

VEGF를 표적으로 하는 또 다른 치료용 항체로는 리제네론(Regeneron)사의 VEGF-trap이 있다 (Holash et al ., PNAS, 99:11393, 2002). 이것은 VEGFR-1의 두 번째 면역글로불린 도메인과 VEGFR-2의 세 번째 면역글로불린 도메인을 인간의 Fc에 융합한 형태의 수용성 '미끼 수용체(decoy receptor)'로, 아직 미국 FDA 승인을 얻지 못했지만, 전이성 유방암과 전이성 폐암, 전이성 대장암 그리고 호르몬 비의존성 전립선암(hormone refractory prostate cancer) 등에 대해서 현재 Phase Ⅲ 단계를 진행 중에 있다.

한편, VEGF 수용체인 VEGFR-2를 표적으로 하는 혈관신생 억제 항체에는 임클론(Imclone)사의 IMC-1121B(EP 1916001A2)와 UCB사의 CDP-791 (PCT/GB02/04619), 그리고 본 발명자들이 개발하여 임상시험을 진행 중에 있는 타니비루맵(Tanibirumab, TTAC-0001) (PCT/KR07/003077) 등이 있다.

IMC-1121B는 완전인간 Fab 라이브러리로부터 선별된 단일클론항체로서, 현재 전이성 유방암에 대해서 Phase Ⅲ 단계를 진행 중에 있으며, 2010년에 위암에 대한 Phase Ⅲ 단계에 진입하였으며, UCB사의 CDP-791은 인간화항체로서, PEGylated Di-Fab 형태로 비소세포성 폐암에 대해서 현재 Phase Ⅱ 단계를 진행하고 있다. 이 항체는 Fc를 가지고 있지 않기 때문에 항체의존적세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)이나 보체의존적독성(complement-dependent cytotoxicity)을 기대할 수 없다.

마지막으로 본 발명자들이 개발한 타니비루맵(Tanibirumab, TTAC-0001)은 완전인간 ScFv 라이브러리로부터 선별된 단일클론항체로서, VEGFR-2를 표적으로 하면서 동시에 마우스나 렛트 유래의 flk-1(VEGFR-2 상동체)에 대해서도 반응성을 가지는 유일한 항체로서, 이것은 임클론사의 IMC-1121B와 구별이 되는 중요한 특징 가운데 하나이다 (PCT/KR07/003077). 특히, 타니비루맵이 보여주는 이종간 교차반응성(cross-species cross reactivity)은 동물질환모델에 대한 연구를 가능케 함으로써, 향후 특정 암종에 대한 항암제 개발을 단계적으로 진행시켜 관련 연구를 더욱 수월하게 마치도록 도움을 줄 수 있다.

이처럼 VEGF 및 VEGFR-2를 표적으로 하는 연구는 최근 5년간 비약적으로 발전하여, 다수의 치료제가 시장 및 임상연구를 통해서 개발되고 있다.

한편, VEGF/VEGFR-2 신호전달에 의해 Tip cell로 분화된 세포는 DLL4를 강하게 발현시켜 주변 세포들에 존재하는 Notch1 수용체와 결합하고, 이렇게 Notch1 신호전달체계가 활성화된 세포는 stalk cell로 분화하여 정상적 혈관 tube 구조를 형성하게 되는데, 이는 DLL4/Notch1 신호전달체계가 VEGF/VEGFR-2 경로와 더불어 혈관신생에 가장 중요한 기전 중 하나라는 점을 입증하는 것이다 (Dufraine et al ., Oncogene, 27:5132~5137, 2008).

상기 DLL4는 Notch 수용체에 대한 리간드 중 하나로, 포유동물에는 현재까지 4 종류의 Notch 수용체(Notch1~4)와 5 종류의 Notch 리간드(Jagged-1, Jagged-2, DLL1, DLL3, DLL4)가 존재하는 것으로 알려져 있으며, Notch 신호전달체계의 경우 한 세포의 Notch 리간드가 다른 세포의 Notch 수용체에 결합함으로 시작되는데, 반드시 서로 다른 세포간의 직접적인 상호작용을 통해서만 활성화된다 (Bray SJ, Nat Rev Mol Cell Biol ., 7(9):678, 2006).

Notch 리간드가 Notch 수용체에 결합하면 우선 ADAM metalloprotease가 활성화되어 Notch 수용체의 세포막 바깥쪽 근접부위가 끊어지고, 이어 gamma-secretase 복합체가 활성화되어 Notch 수용체의 세포막 안쪽 근접부위를 끊어 NICD(Notch Intracellular Domain)가 유리되고, 이 NICD는 핵으로 이동, RBPJ/CSL transcription factor와 결합하여 Hes, Hey 같은 basic helix-loop-helix 단백질 등의 Notch 타겟 유전자의 발현을 유도한다. 이처럼 Notch 신호전달체계는 해당 세포가 처한 상황에 따라 증식/분화/자멸(apoptosis) 등의 운명을 결정하며, 정상 줄기세포 및 암 줄기세포의 유지에도 중요한 역할을 한다.

기본적으로 모든 Notch 수용체가 모든 Notch 리간드와 결합할 수 있지만, 이러한 다양한 결합의 조합은 해당 세포들이 처한 미세환경에서 선택적으로 조절된다. 예를 들어 DLL4는 태아발달 과정에서 혈관신생 시 내피세포에 강하게 발현되며, 주변 내피세포에 발현되는 Notch1과 Notch4와 결합하지만, 이 중 DLL4-Notch1 결합이 배타적으로 가장 중요하며(Yan M, Vasc Cell, 2011), 이 결합을 통해 혈관신생이 진행된다. 이러한 사실은 유전자결핍실험 등을 통해 잘 밝혀져 있다 (Duarte et al ., Genes Dev , 2004; Gale et al ., PNAS, 2004; Krebs et al ., Genes Dev, 2004).

따라서, DLL4-Notch1 결합을 저해한다면 혈관신생을 억제할 수 있으며, 이에 따라 종양 등의 다양한 질환을 치료할 수 있다. 이미 암치료에 있어 Avastin(bevacizumab) 등을 이용해 VEGF를 억제하면 혈관형성이 억제되어 종양의 perfusion 이 감소함에 따라 종양 크기가 줄어드는 한편, DLL4를 표적으로 하여 주변 세포에서 발현되는 Notch1 과의 결합을 억제하면 혈관들이 비정상적으로 많이 생성(hypersprouting)되지만 온전한 기능을 수행하지 못해(non-functional) 종양의 perfusion 이 감소하고, 결과적으로 종양 크기가 줄어든다(Thurston et al ,, Nat Rev Cancer , 7(5):327, 2007)는 점이 입증되어 있다.

흥미로운 사실은 Genentech 사의 연구팀에서 수행한 몇몇 암세포주를 이용한 이종이식 동물실험에서 VEGF와 DLL4를 억제하는 항체를 함께 투여 시 각각을 따로 억제한 경우에 비해 암의 성장이 훨씬 강하게 저해되었다는 것이다 (Ridgway et al ., Nature, 444(7122):1083, 2006). 이는 DLL4/Notch1 경로에 의한 신호전달이 단순히 VEGF/VEGFR-2 경로에 의해 활성화되는 것만은 아니며, 두 가지 경로에 따른 신호전달을 동시에 저해함으로써 보다 효율적인 종양 등 다양한 혈관신생 관련 질환의 치료가 가능하다는 것을 시사한다.

또한 DLL4 억제는 VEGF/VEGFR-2 경로 저해제에 민감한 종양 및 내성이 있는 종양 모두에 효과가 있음이 밝혀졌는데(Ridgway et al ., Nature ., 444(7122):1083, 2006; Noguera-Troise et al ., Nature ., 444(7122):1032. 2006), 이는 현재 VEGF를 차단하는 Avastin과 같은 약물 투여 시 빈번히 발생하는 내성(처음부터 Avastin 이 듣지 않는 intrinsic resistance, 시간이 지나면서 Avastin 의 약효가 점점 떨어지는 acquired resistance 두 경우 모두)극복에 매우 중요한 단서를 제공하고 있다.

또한, DLL4 억제가 직접적으로 종양 내 암 줄기세포의 빈도를 줄이고 종양 성장을 억제한다는 사실이 Oncomed사의 연구팀에 의해 밝혀졌으며(Hoey et al ., Cell Stem Cell ., 2009) 이는 DLL4 억제가 암의 재발을 근본적으로 차단할 가능성이 있음을 시사한다. 마지막으로 현재 암치료에 사용되고 있는 항암화학요법(chemotherapy) 및 Herceptin 등의 항체치료제에 대한 내성이 Notch 신호전달체계와 많은 관련이 있으며, DLL4/Notch1 경로의 억제는 이러한 항암화학요법 또는 Herceptin 과 같은 항체치료제의 내성도 극복할 가능성이 있다 (Wang et al., Biochim Biophys Acta ., 1806(2):258, 2010).

상기 살핀 바와 같이 VEGF/VEGFR-2 및 DLL4/Notch1의 두 가지 경로에 따른 신호전달을 동시에 저해함으로써 보다 효율적인 종양 등 다양한 혈관신생 관련 질환의 치료가 가능할 수 있으나, 아직까지 이를 위한 효율적인 약품의 개발은 이루어지지 않고 있는 실정으로, 이에 대한 개발이 절실하게 요구되고 있는 상황이다.

본 발명자들은 상기와 같은 문제를 해결하기 위하여, VEGF/VEGFR-2 및 DLL4/Notch1의 두 가지 경로에 따른 신호전달을 보다 효율적으로 동시에 저해함으로써 종양 등 다양한 혈관신생 관련 질환을 치료할 수 있는 치료제를 개발하기 위하여 연구를 수행한 결과, VEGFR-2와 DLL4를 동시에 표적 하는 이중표적항체가 효율적으로 그러한 효과를 나타냄을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

이에 따라 본 발명은 VEGFR-2에 대한 항체 및 DLL4에 대한 길항제가 결합되어, VEGFR과 DLL4를 동시에 표적 하는 이중표적항체를 제공하는 것을 하나의 목적으로 한다.

본 발명의 다른 목적은 상기 이중표적항체를 코딩하는 DNA 및 이를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포 및 이를 이용하여 본 발명에 따른 이중표적항체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 이중표적항체를 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 VEGFR-2에 특이적으로 결합하는 항체의 말단에 DLL4의 길항제(antagonist)가 결합된 이중표적항체를 제공한다.

본 발명에 따른 이중표적항체는 혈관신생을 보다 효율적으로 억제함으로써 혈관신생에 의해 발생되는 질환을 억제하는 효능을 가지며, 본 발명에 따른 이중표적항체는 VEGFR-2와 DLL4 각각의 표적에 대한 결합능이 있음이 확인되었으며, HUVEC 증식억제실험을 통해 VEGFR-2만을 단독 표적 하는 항체, 예를 들어 타니비루맵(Tanibirumab)에 비해 우수한 HUVEC 증식억제능이 있음이 확인되었다.

본 발명에서의 용어, "이중표적항체"는 하나 이상의 타겟에 결합능 또는 길항능을 가지는 항체를 의미하며, 2개의 서로 다른 타겟에 대한 결합능 또는 길항능을 가지는 항체가 결합된 형태 또는 한 타겟에 대한 결합능을 가지는 항체와 다른 타겟에 대한 길항능을 가지는 물질이 결합되어 있는 항체를 의미한다.

또한, 본 발명에서 용어, "항체"는 다클론 항체 및 단클론 항체를 모두 포함하며, 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 단편도 사용될 수 있다. 항체 분자의 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 단일 사슬(single-chain) Fv(scFv), Fab, F(ab'), F(ab')₂, 단일 도메인(single domain) 등을 포함한다.

바람직하게는 본 발명에 따른 이중표적항체는 혈관신생 인자 또는 그러한 혈관신생 인자에 대한 수용체에 특이적인 항체와, 혈관신생 길항제, 즉 혈관신생 인자 또는 그러한 혈관신생 인자 수용체에 대한 길항제가 결합된 형태이다.

본 발명에 따른 이중표적항체에서, VEGFR-2에 특이적으로 결합하는 항체는, VEGFR-2에 결합하여 VEGF/VEGFR-2 신호전달을 저해하는 특성을 지니는 항체라면 제한 없이 사용가능하며, 타니비루맵(Tanibirumab) 또는 베바시주맵(bevacizumab), 또는 이들의 변이체들이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, DLL4의 길항제는 DLL4/Notch1 신호전달을 저해하는 특성을 가지는 물질이라면 제한 없이 사용가능하며, 특히 Notch1의 세포내 도메인이 결실된 수용성 수용체(soluble receptor)가 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니며, 보다 바람직하게는 DLL4의 길항제(antagonist), 특히 DLL4에 대한 Notch1 수용체의 11 내지 12 번째의 EGF-유사 도메인(이하 "notch1 minimal decoy"라 한다)이 사용될 수 있다.

DLL4의 길항제는 VEGFR-2에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 또는 경쇄의 N-말단 또는 C-말단 등에 제한 없이 결합될 수 있지만, 바람직하게는 중쇄 또는 경쇄의 N-말단, 더욱 바람직하게는 경쇄의 N-말단에 결합될 수 있다.

본 발명에서 제공되는 PMC-201이라 명명된 가장 바람직한 이중표적항체는 VEGFR-2에 특이적으로 결합하는 항체의 말단, 특히 경쇄 N-말단에 DLL4의 길항제(antagonist), 특히 DLL4에 대한 Notch1 minimal decoy가 연결된 형태로, VEGFR-2 특이적 항체는 타니비루맵 및 그 변이체임을 특징으로 한다.

본 발명에서의 "혈관신생"은 혈관 내피세포가 증식하고 재구성되어 기존에 존재하는 혈관 네트워크로부터 새로운 혈관을 형성하는 세포 현상을 의미한다. 이러한 혈관신생에는 혈관 신생, 내피세포 성장, 혈관 안정성 및 혈관 형성을 촉진하는 혈관신생 인자가 관여한다. 상기 혈관신생 인자는 예를 들어 VEGF 및 VEGF 패밀리, PIGF(placental growth factor), PDGF(platelet-derived growth factor) 패밀리의 멤버, DLL4, 섬유아세포 성장 인자 패밀리(FGF), TIE 리간드(앤지오포이에틴), 에프린, Del-1, 섬유아세포 성장 인자(산성 (aFGF) 및 염기성(bFGF)), 폴리스타틴, 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF), 간세포 성장 인자(HGF)/산란 인자(SF), 인터루킨-8(IL-8), 렙틴, 미드카인, 태반 성장 인자, 혈소판 유래 내피세포 성장 인자(PD-ECGF), 혈소판 유래 성장 인자, 특히 PDGF-BB 또는 PDGFR-베타, 플레이오트로핀(PTN), 프로그라뉼린, 프로리페린, 형질전환 성장 인자-알파(TGF-알파), 형질전환 성장 인자-베타(TGF-베타), 종양 괴사 인자-알파(TNF-알파), 혈관 내피 성장 인자(VEGF)/혈관 투과 인자(VPF) 등이 포함되며, 특별히 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서의 용어, "혈관신생 길항제"는 혈관신생, 혈관형성, 또는 바람직하지 않은 혈관 투과성을 직접 또는 간접적으로 억제하는 저분자량 물질, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 단리된 단백질, 재조합 단백질, 항체, 또는 이들의 컨쥬게이트 또는 이중표적항체를 의미한다. 또한 상기 혈관신생 억제제는 혈관신생 인자 또는 그의 수용체에 결합하여 혈관신생 활성을 차단하는 물질을 포함한다. 예를 들어, 혈관신생 억제제는 혈관형성제에 대한 항체 또는 다른 길항제, 예를 들어 VEGF-A 또는 VEGF-A의 수용성 수용체(예를 들어, 수용성 KDR 수용체 또는 Flt-1 수용성 수용체), VEGF-트랩, 앤지오포에이틴(Angiopoietin) 2, Notch1 수용성 수용체 및 디코이(decoy), 또는 상기 물질들의 리간드에 대한 결합능을 유지하는 절편 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 설명한 바와 같이 본 발명은 특히 바람직한 형태로 VEGFR-2에 특이적으로 결합하는 항체의 말단에 DLL4의 길항제(antagonist), 특히 DLL4에 대한 Notch1 minimal decoy가 연결된 형태의 이중표적항체를 제공하는데, 본 발명에서의 VEGFR-2에 특이적인 항체는 타니비루맵 또는 이의 변이체인 것이 바람직하며, 본 발명에 따른 VEGFR-2에 특이적인 항체는 서열번호 1 내지 서열번호 3에서 선택된 어느 하나의 서열을 가지는 중쇄 가변영역과, 서열번호 4 내지 서열번호 6에서 선택된 어느 하나의 경쇄 가변영역으로 이루어지는 것이 바람직하다.

특히 바람직하게는 서열번호 1의 중쇄 가변영역과 서열번호 4의 경쇄 가변영역, 서열번호 2의 중쇄 가변영역과 서열번호 5의 경쇄 가변영역 또는 서열번호 3의 중쇄 가변영역과 서열번호 6의 경쇄 가변영역으로 이루어지는 것이 바람직하며, 상기 VEGFR-2에 특이적인 항체는 가변영역에 추가적으로 불변영역을 포함할 수 있으며, VEGFR-2에 대한 결합능력을 보유하는 한, 이의 단편 또는 아미노산 변이가 일어난 것을 이용하는 경우도 본 발명의 권리범위에 포함됨은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다.

본 발명에 따른 VEGFR-2 특이적 항체의 경쇄 및 중쇄 가변영역 서열

SEQ ID NO.	구분	서열
1	중쇄 가변영역	AQPAMAQMQL VQSGAEVKKP GASVKLSCKA SGYTFSSYWM HWVRQAPGQR LEWMGEINPG NGHTNYNEKF KSRVTITVDK SASTAYMELS SLRSEDTAVY YCAKIWGPSL TSPFDYWGQG TL
2	중쇄 가변영역	QMQLVQSGAE VKKPGASVKL SCKASGYTFS SYWMHWVRQA PGQRLEWMGE INPGNGHTNY NEKFKSRVTI TVDKSASTAY MELSSLRSED TAVYYCAKIW GPSLTSPFDY WGQGTL
3	중쇄 가변영역	QMQLVQSGAE VKKPGASVKL SCKASGYTFS SYWMHWVRQA PGQRLEWMGE INPGNGHTNY NEKFKSRVTI TVDKSASTAY MELSSLRSED TAVYYCAKIW GPSLTSPFDY WGQGTL
4	경쇄 가변영역	SGVGSNFMLT QPPSVSVSPG KTARITCRGD NLGDVNVHWY QQRPGQAPVL VMYYDADRPS GIPERFSGSN SGNTATLTIS GVEAGDEADY YCQVWDRTSE YVFGTGTKVT VLG
5	경쇄 가변영역	NFMLTQPPSV SVSPGKTARI TCRGDNLGDV NVHWYQQRPG QAPVLVMYYD ADRPSGIPER FSGSNSGNTA TLTISGVEAG DEADYYCQVW DRTSEYVFGT GTKVTVLG
6	경쇄 가변영역	NFMLTQPPSV SVSPGKTARI TCRGDNLGDV NVHWYQQRPG QAPVLVMYYD ADRPSGIPER FSGSNSGNTA TLTISGVEAG DEADYYCQVW DRTSEYVFGT GTKVEIKRT

또한, 본 발명에서의 DLL4에 대한 Notch1 minimal decoy는 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열로 이루어져 있는 것이 바람직하지만, DLL4에 대한 길항능을 유지하는 한, 아미노산의 변이, 결실 및 삽입이 일어난 변이체도 본 발명의 권리범위에 포함됨 역시 통상의 기술자에게는 자명한 것이다.

본 발명에 따른 이중표적항체에서, VEGFR-2에 특이적으로 결합하는 항체와 DLL4의 길항제는 링커에 의한 결합, 화학적 직접 결합 또는 유전공학 융합(genetic fusion) 등의 다양한 방법에 의해 연결될 수 있으며, 바람직하게는 링커에 의한 결합, 더욱 바람직하게는 아미노산 링커에 의해 결합될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 아미노산 링커는 서열번호 8에 기재된 서열을 가진다.

본 발명에 따른 Notch1 minimal decoy 및 아미노산 링커의 아미노산 서열

SEQ ID NO.	구분	서열
7	Notch1 수용체의 11 내지 12 번째의 EGF-유사 도메인	DVDECSLGAN PCEHAGKCIN TLGSFECQCL QGYTGPRCEI DVNECVSNPC QNDATCLDQI GEFQCICMPG YEGVHCE
8	아미노산 링커	SGGGGSGGGGSGS

이에 따라 본 발명에 따른 이중표적항체의 경쇄 N-말단에 아미노산 링커를 통해 DLL4에 대한 Notch1 minimal decoy가 연결된 이중표적항체의 경쇄-아미노산 링커-Notch1 minimal decoy 단백질은 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 가진다.

본 발명에 따른 이중표적항체의 경쇄-Notch1 minimal decoy가 연결된 형태의 아미노산 서열

SEQ ID NO.	서열
9	DVDECSLGAN PCEHAGKCIN TLGSFECQCL QGYTGPRCEI DVNECVSNPC QNDATCLDQI GEFQCICMPG YEGVHCE SGG GGSGGGGSGS NFMLTQPPSV SVSPGKTARI TCRGDNLGDV NVHWYQQRPG QAPVLVMYYD ADRPSGIPER FSGSNSGNTA TLTISGVEAG DEADYYCQVW DRTSEYVFGT GTKVTVLG
10	DVDECSLGAN PCEHAGKCIN TLGSFECQCL QGYTGPRCEI DVNECVSNPC QNDATCLDQI GEFQCICMPG YEGVHCE SGG GGSGGGGSGS NFMLTQPPSV SVSPGKTARI TCRGDNLGDV NVHWYQQRPG QAPVLVMYYD ADRPSGIPER FSGSNSGNTA TLTISGVEAG DEADYYCQVW DRTSEYVFGT GTKVEIKRT

(서열에서 밑줄로 표시된 부분이 아미노산 링커)

또한 본 발명에서는 상기 이중표적항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 및 이를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

상기 이중표적항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 상기 서열번호 1 내지 10에 기재된 아미노산 서열로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 용이하게 도출 가능하다. 또한 리더 서열(leader sequence)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 이중표적항체의 N-말단에 위치하도록 하여 본 발명에 따른 이중표적항체의 생산에 이용될 수 있다.

본 발명에서 용어, 본 발명에서, "재조합 벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

본 발명에서 "작동가능하게 연결된(operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용하여 용이하게 할 수 있다.

본 발명의 적합한 발현 벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 개시코돈 및 종결코돈은 일반적으로 면역원성 표적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 일반 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 원핵 세포에는 lac, tac, T3 및 T7 프로모터가 있으나 이로 제한되지는 않는다. 진핵세포에는 원숭이 바이러스 40(SV40), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 사람 면역 결핍 바이러스(HIV), 예를 들면 HIV의 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스, 시토메갈로바이러스(CMV), 엡스타인 바 바이러스(EBV), 로우스 사코마 바이러스(RSV) 프로모터뿐만 아니라, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈, 사람 근육 크레아틴, 사람 메탈로티오네인 유래의 프로모터가 있으나 이것으로 제한되지는 않는다.

상기 발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함할 수 있다. 선택마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제 (selective agent)가 처리된 환경에서 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하므로 형질전환된 세포가 선별 가능하다. 또한, 벡터는 복제가능한 발현벡터인 경우, 복제가 개시되는 특정 핵산 서열인 복제원점(replication origin)을 포함할 수 있다.

외래 유전자를 삽입하기 위한 재조합 발현 벡터로는 플라스미드, 바이러스, 코즈미드 등 다양한 형태의 벡터를 사용할 수 있다. 재조합 벡터의 종류는 원핵세포 및 진핵세포의 각종 숙주세포에서 원하는 유전자를 발현하고 원하는 단백질을 생산하는 기능을 하는 한 특별히 한정되지 않지만, 강력한 활성을 나타내는 프로모터와 강한 발현력을 보유하면서 자연 상태와 유사한 형태의 외래 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 벡터가 바람직하다.

본 발명에 따른 이중표적항체를 발현시키기 위해 다양한 발현 숙주/벡터 조합이 이용될 수 있다. 진핵숙주에 적합한 발현 벡터로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 SV40, 소 유두종바이러스, 아데노바이러스, 아데노부속 바이러스(adeno-associated virus), 시토메갈로바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 발현 조절 서열이 포함된다. 세균 숙주에 사용할 수 있는 발현 벡터에는 pET, pRSET, pBluescript, pGEX2T, pUC 벡터, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체와 같이 대장균(Escherichia coli)에서 얻어지는 세균성 플라스미드, RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드, gt10과 gt11, NM989와 같은 매우 다양한 파지 람다(phage lambda) 유도체로 예시될 수 있는 파지 DNA, 및 M13과 필라멘트성 단일가닥의 DNA 파지와 같은 기타 다른 DNA 파지가 포함된다. 효모 세포에 유용한 발현 벡터는 2 플라스미드 및 그의 유도체이다. 곤충 세포에 유용한 벡터는 pVL941이다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 숙주세포에 삽입되어 형질전환체를 형성한다. 상기 벡터의 적합한 숙주세포는 대장균, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스 속(Staphylococcus sp.)과 같은 원핵 세포일 수 있다. 또한, 아스페르길러스 속(Aspergillus sp.)과 같은 진균, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스 속(Schizosaccharomyces sp.) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)와 같은 효모, 그 밖의 하등진핵 세포, 및 곤충으로부터의 세포와 같은 고등 진핵생물의 세포와 같은 진핵 세포일 수 있다. 또한 식물, 포유동물로부터 유래할 수 있다. 바람직하게는, 원숭이 신장 세포7(COS7:monkey kidney cells)세포, NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소(CHO:chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK:baby hamster kidney)세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK293 세포 등이 이용가능하지만 이에 한정되지 않는다. 특히 바람직하게는 CHO 세포이다.

본 발명에서 "숙주세포로의 형질 전환"은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO₄) 침전, 염화 칼슘(CaCl₂) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG(polyethyleneglycol), PEI(polyethyleneimine), 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기한 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 배양하여 본 발명에 따른 이중표적항체를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 이중표적항체는 유전자 재조합 방법으로 발현 및 정제하여 수득하는 것이 바람직한데, 구체적으로는 항체의 중쇄 가변영역 또는 중쇄 전체 영역을 코딩하는 유전자 서열 및 경쇄 가변영역 또는 경쇄 전체 영역을 코딩하는 유전자 서열을 하나의 벡터 또는 2개의 벡터에서 따로 발현시킬 수도 있으며, 이때 중쇄 또는 경쇄의 N-말단에 해당하는 부위에 아미노산 링커 및/또는 DLL4의 길항제를 코딩하는 유전자 서열을 연결시켜 세포 발현 시스템에서 발현시켜 본 발명에 따른 이중 표적항체를 제조할 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.

구체적으로, 상기 이중표적항체의 제조방법은 본 발명의 이중표적항체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계; 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환시켜 배양하는 단계; 상기 배양된 형질전환체로부터 이중표적항체를 분리, 정제하는 단계를 포함할 수 있다.

구체적으로, 재조합 벡터가 발현되는 형질전환체를 영양배지에서 배양함으로써 이중표적항체를 대량으로 생산할 수 있으며, 배지와 배양조건은 숙주 세포에 따라 관용되는 것을 적당히 선택 이용할 수 있다. 배양시 세포의 생육과 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양시간 등의 조건들을 적절하게 조절할 수 있다.

상기와 같이 재조합적으로 생산된 펩타이드 또는 단백질은 배지 또는 세포 분해물로부터 회수될 수 있다. 막 결합형인 경우, 적합한 계면활성제 용액(예, 트리톤-X 100)을 사용하거나 또는 효소적 절단에 의해 막으로부터 유리될 수 있다. 이중표적항체 발현에 사용된 세포는 동결-해동 순화, 음파처리, 기계적 파괴 또는 세포 분해제와 같은 다양한 물질적 또는 화학적 수단에 의해 파괴될 수 있으며, 통상적인 생화학 분리 기술에 의해서 분리, 정제가 가능하다 (Sambrook et al ., Molecular Cloning: A laborarory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deuscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, Vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)). 전기영동, 원심분리, 겔여과, 침전, 투석, 크로마토그래피(이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 면역흡착 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등), 등전점 포커싱 및 이의 다양한 변화 및 복합 방법 등이 이용가능하지만 이에 한정되지 않는다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 이중표적항체를 포함하는 혈관신생억제용 또는 암 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명에서 용어, "항암"이란 "예방" 및 "치료"를 포함하며, 여기서 "예방"이란 본 발명의 항체를 포함하는 조성물 투여에 의해 암이 억제되거나 지연되는 모든 행위을 의미하고, "치료"란 본 발명의 항체 투여에 의해 암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 조성물로 치료할 수 있는 암 또는 암종은 특별히 제한되지 않으며, 고형암 및 혈액암을 포함한다. 바람직하게 대장암, 결장암, 위암, 유방암, 폐암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 이자암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 식도암, 담도암, 고환암, 직장암, 두경부암, 경추암, 요관암, 골육종, 신경세포아종, 흑색종, 섬유육종, 횡문근육종, 성상세포종, 신경모세포종 또는 신경교종 등을 포함한다.

본 발명의 항암 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릴시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 또한, 상기 항암 조성물은 전형적으로 막을 통과한 이동을 용이하게 하는 계면활성제를 포함할 수 있다. 이러한 계면활성제는 스테로이드에서 유도된 것이거나 N-[1-(2,3-디올레오일)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTMA) 등의 양이온성 지질, 또는 콜레스테롤 헤미숙시네이트, 포스파티딜 글리세롤 등의 각종 화합물 등이 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 이중표적항체, 또는 이중표적항체를 포함한 조성물을 개체에 투여하여 암을 치료하고 암의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 이중표적항체를 포함하는 조성물은 암세포 또는 그들의 전이를 치료하기 위하여, 또는 암의 성장을 억제하기 위하여 약학적으로 효과적인 양으로 투여될 수 있다. 암 종류, 환자의 연령, 체중, 증상의 특성 및 정도, 현재 치료법의 종류, 치료 회수, 투여 형태 및 경로 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 해당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 상기한 약리학적 또는 생리학적 성분을 함께 투여하거나 순차적으로 투여할 수 있으며, 또한 추가의 종래의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 이러한 투여는 단일 또는 다중 투여일 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명에서, "개체"는 본 발명의 이중표적항체를 투여하여 경감, 억제 또는 치료될 수 있는 상태 또는 질환을 앓고 있거나 그러한 위험이 있는 포유동물을 의미하며, 바람직하게 사람을 의미한다.

본 발명에서, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 개체에 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하면 본 발명의 이중표적항체를 포함하는 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여시, 단백질은 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 하는 것이 바람직하다. 또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

또한 본 발명에서는 인간 DLL4(hDLL4)를 발현하는 세포주 또는 재조합 세포주와 인간탯줄내피세포(HUVEC)의 공배양을 통해 Notch 1 활성을 측정하는 것을 특징으로 하는 상기 이중표적항체의 DLL4 길항 효능 측정방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 Notch 1 활성은 NICD의 발현양을 측정하는 것을 특징으로 하며, Notch 리간드가 Notch 수용체에 결합하면 우선 ADAM metalloprotease가 활성화되어 Notch 수용체의 세포막 바깥쪽 근접부위가 끊어지고, 이어 gamma-secretase 복합체가 활성화되어 Notch 수용체의 세포막 안쪽 근접부위를 끊어 NICD(Notch Intracellular Domain)가 유리되고, 이 NICD는 핵으로 이동, RBPJ/CSL transcription factor와 결합하여 Hes, Hey 같은 basic helix-loop-helix 단백질 등의 Notch 타겟 유전자의 발현을 유도한다.

NICD의 발현양 측정은 직접적으로는 SDS-PAGE, 웨스턴블랏(western blotting), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역염색법(immuno-staining), 면역형광염색법(immunofluorescence), 효소면역측정법(ELISA assay) 및 간접적으로는 루시퍼레이즈 어세이(luciferase assay)로 구성된 군에서 선택되는 방법을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하나, 이에 한정된 것은 아니며 당업계에 공지된 단백질 발현 측정법을 제한 없이 사용할 수 있다. 본 발명에서는 바람직하게 웨스턴블랏방법을 사용하여 NICD의 발현양을 측정하였다.

상기 인간 DLL4(hDLL4)를 발현하는 세포주 또는 재조합 세포주와 인간탯줄내피세포(HUVEC)의 공배양은 구체적으로, (a) 인간탯줄내피세포를 배양하는 단계; 및 (b) hDLL4를 발현하는 293 세포주(293-hDLL4)와 이중표적항체를 반응시킨 다음, 상기 (a) 단계에서 배양된 인간탯줄내피세포에 처리하여 공배양하는 단계;를 포함하는 방법을 이용하여 배양할 수 있으며, 본 발명의 실시예에서 상기 공배양 방법을 이용하여 이중표적항체 PMC-201에 의해 Notch-1 활성화에 의해 나타나는 NICD 발현 양이 감소하는 것을 확인하였다.

또한, Notch 1 활성은 NICD의 발현양을 측정하는 것을 특징으로 하는 이중표적항체의 hDLL4 길항 효능 측정방법은 본 발명의 다른 실시예에서 확인한 것처럼, NICD 양을 루시퍼레이즈 어세이 방법을 이용하여 NICD 프로모터 활성정도를 측정할 수 있으며, hDLL4이 코팅된 플레이트에 인간탯줄내피세포와 이중표적항체 PMC-201를 처리하여 배양한 후, HUVEC 세포 내의 NICD의 양을 측정하여 이중표적항체의 hDLL4 길항 효능을 측정할 수 있다.

본 발명에 따른 이중표적항체는 VEGF/VEGFR-2 및 DLL4/Notch1의 두 가지 경로에 따른 신호전달을 보다 효율적으로 동시에 저해함으로써 종양 등 다양한 혈관신생 관련 질환을 치료할 수 있으며, 특히 신생혈관치료제를 단독으로 사용함에 따라 발생되는 내성을 극복할 수 있으며, 암줄기세포를 직접 타겟팅함으로써 암의 재발을 근본적으로 방지할 수 있다는 장점이 있다.

도 1은 DLL4에 결합하는 Notch1의 11번째, 12번째 EGF-유사 도메인의 아미노산 서열을 나타낸 도면.
도 2는 본 발명에 따른 벡터 PMC-201 v213을 도식화하여 나타낸 도면.
도 3은 본 발명에 따른 벡터를 293-T 세포를 이용하여 임의발현 시킨 후 정제한 이중표적항체의 생산을 SDS-PAGE를 통해서 확인한 결과를 나타낸 도면.
도 4는 본 발명에 따른 이중표적항체의 VEGFR-2 및 인간 DLL4에 대한 결합능을 ELISA로 분석한 결과를 나타낸 도면.
도 5는 본 발명에 따른 이중표적항체의 인간 DLL4에 대한 결합능을 Biacore 로 분석한 결과를 나타낸 도면.
도 6은 본 발명에 따른 이중표적항체의 인간 DLL4에 대한 결합능을 Flow cytometer 로 분석한 결과를 나타낸 도면.
도 7은 본 발명에 따른 이중표적항체의 HUVEC에 대한 세포증식 분석(proliferation assay) 결과를 나타낸 도면.
도 8은 본 발명에 따른 이중표적항체가 인간의 DLL4에 결합하는 Notch-Fc의 결합을 경쟁적으로 저해하는 현상을 FACS를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 도면.
도 9는 본 발명에 따른 이중표적항체가 Notch-1 의한 프로모터 활성화를 저해하는 것을 luciferase 발광 값으로 분석한 결과를 나타낸 도면.
도 10은 본 발명에 따른 이중표적항체와 HUVEC를 hDLL4가 코팅된 배양접시에서 배양하였을 때, Notch-1의 활성화에 의해서 세포내 도메인(NICD)이 증가하는 것을 저해하는 현상을 웨스턴블랏으로 분석한 결과를 나타낸 도면.
도 11은 본 발명에 따른 이중표적항체와 HUVEC를 hDLL4를 발현하는 293 세포주와 공배양하였을 때, Notch-1의 활성화에 의해서 세포내 도메인(NICD)이 증가하는 것을 저해하는 현상을 웨스턴블랏으로 분석한 결과를 나타낸 도면.

이하 본 발명을 실시예와 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명한다. 그러나 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

이중표적항체 PMC -201 임시생산용 발현벡터의 제조

hDLL4에 결합하는 Notch1 minimal decoy(Notch1의 11~12번째 calcium-binding EGF-유사 도메인)을 코딩하는 DNA는 해당 도메인의 아미노산 염기서열(도 1 및 서열번호 7) 파악 후 유전자합성(gene optimization 포함, GeneArt, 독일)을 통해 확보하였다.

상기 77개의 아미노산 염기서열을 13개 아미노산으로 이루어진 G4S 링커(S GGGG SGGGGS GS)를 이용하여 타니비루맵(국제특허출원 제PCT/KR07/003077호에 개시된 TTAC0001 참조) 발현벡터의 경쇄 N-말단부분에 클로닝하여 293-T 세포주(ATCC, CRL-11268™)에서 발현이 최적화된 이중표적항체 PMC-201 발현벡터를 제조하였다 (도 2). 확인된 재조합 벡터는 'PMC-201-v213'으로 명명하였다.

이중표적항체 PMC -201의 생산 및 동정

완성된 발현 벡터 PMC-201-v213을 293T 세포에 형질도입을 통한 임의발현을 유도한 후, SDS-PAGE 및 웨스턴블로팅을 통해서 그 발현 여부를 확인하였다. 형질도입은 lipofectamine^TM 2000(Invitrogen #11668-019, 미국)을 이용하였으며, 그 방법은 제조사의 설명을 따랐다. 약술하면, αMEM 배지(Welgene, 대한민국)가 들어있는 6-웰 플레이트(well plate)에 웰당 5 x 10⁵개의 293T 세포를 접종한 후, 가습이 유지되는 CO₂(5%) 배양기를 사용하여 37℃에서 24시간 방치함으로써, 세포밀도가 80-90% 정도 되도록 조밀하게 배양하였다. 재조합벡터 2 ㎍(PMC-201-v213)과 6 ㎕의 lipofectamin^TM 2000을 각기 250 ㎕의 무혈청 αMEM 배지에 희석하여 상온에서 5분간 방치하였다.

DNA 희석액과 lipofectamin^TM 2000 희석액을 섞어 상온에서 20분간 반응시켜 DNA-lipofectamin^TM 2000 복합체가 형성되도록 하였다. 배양된 세포에서 기존의 배지를 제거한 후, DNA-lipofectamin^TM 2000 복합체 500 ㎕와 무혈청 αMEM 배지 500 ㎕를 각 웰에 첨가하여, 37℃ 조건의 CO₂ 배양기에서 6시간 동안 배양하였다. 투석우태혈청이 20% 포함된 αMEM 배지 1 ㎖를 추가하여 48-72시간 동안 배양한 후, 그 상등액만을 분리하여 항체의 발현 여부를 SDS-PAGE를 통해 확인하였다. SDS-PAGE는 당업계에서 일반적으로 사용되는 방법을 준용하였으며, 사용된 시료는 다음과 같다: 12% SDS-polyacrylamide Gel, PVDF 멤브레인(Millipore #IPVH00010, 미국), HRP-conjugated goat anti-human IgG(kappa) 항체, 그리고 HRP-conjugated goat anti-human IgG(Fc) 항체(Pierce, 미국).

그 결과, SDS-PAGE 및 웨스턴블로팅을 통해서 이중표적항체 PMC-201이 발현되었음을 확인할 수 있었으며, Protein A 친화성 컬럼, SP-sepharose 컬럼, 크기배제 컬럼을 이용한 FPLC를 통해서 순도 95% 이상의 정제된 항체를 수득할 수 있었다 (도 3).

이중표적항체 PMC -201의 결합능 시험

3-1 : VEGFR-2 및 hDLL4에 대한 결합능 시험

이중표적항체 PMC-201이 VEGFR-2 및 hDLL4에 대하여 결합하는지를 알아보는 결합능어세이를 ELISA를 이용하여 실시하였다. 이를 위하여 96-웰 플레이트에 VEGFR-2의 Extracellular domain 1~3(이하 VEGFR-2 ECD)과 DLL4를 각각 1 ㎍/㎖농도로 웰에 분주하여 실온에서 2시간 코팅한 후, 2% 탈지우유/PBS를 이용하여 실온에서 2시간 동안 blocking 반응을 수행하였다.

Blocking이 끝난 플레이트를 PBS로 세척한 후, 실온에서 미리 준비한 다양한 농도(0.18 ~ 3000 ng/㎖)의 Tanibirumab과 PMC-201을 VEGFR-2 ECD 혹은 hDLL4가 코팅된 웰에 넣고, 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, PBS를 이용하여 세척하였으며, 이후 2차 항체로써 HRP-conjugated goat anti-human IgG antibody(Pierce, 미국)를 1:2000으로 희석해서 첨가하고, 상온에서 30분 동안 반응시킨 다음, TMB substrate reagent(BD Biosciences #555214, 미국)를 이용해 발색반응을 유도하였으며, 2N 황산 (H₂SO₄) 용액 50 ㎕씩을 첨가하여 발색반응을 중지시켰다. 발색반응의 측정은 마이크로플레이트 리더(Tecan, 스위스)를 이용해서 흡광도 450 nm와 650 nm에서 이루어졌다.

그 결과, VEGFR-2에는 Tanibirumab과 PMC-201이 비슷한 결합능을 보이는 것을 확인한 반면, hDLL4에는 PMC-201만이 결합능을 가지고 있는 것을 확인하였다 (도 4).

3-2 : PMC - 201와 human DLL4 의 친화도 분석

PMC-201의 human DLL4 에 대한 해리상수(Kd, dissociation constant)를 알아보기 위해 BIACORE® 3000(GE Healthcare)을 사용하였으며 CM5 chip을 사용하였다. 해리상수는 Km 값의 유사값으로 효소-기질복합체에서 효소의 기질에 대한 친화성의 지표로 사용되며, 값이 낮을수록 효소와 기질의 친화도가 높은 것을 의미한다.

시료의 고정화는 Amine Coupling Kit(GE Healthcare)인 400mM EDC(N-ethyl-N'-(dimethylaminopropyl) Carbodiimide), 100mM NHS(N-Hydroxysuccinimide), 1M 에탄올 아민 염화수소(Ethanolamine hydrocholoride, pH 8.5)를 사용하며, 재생 버퍼로는 20mM 수산화나트륨, 고정화 버퍼로는 1XPBS에 희석한 후 pH 5.0의 10mM 아세테이트(GE Healthcare)에 분석시료를 1/40으로 희석하였다. 고정화 범위로는 4000RU(Response Unit)에서 고정화시켰다. 분석시료의 흡착성 측정 버퍼는 HBS-EP 버퍼(GE Healthcare)를 사용하였다. 항원으로는 DLL4를 측정 농도 4.9, 9.7, 19.5, 39.1, 78.1, 156.3, 312.5nM로 HBS-EP 버퍼를 사용하여 최종 부피가 200㎕가 되도록 단계별 희석하였다. 7개의 농도 중 5개의 농도를 선택하여 fitting하였다. 재생버퍼는 실제 분석하기 전에 예비로 156.3nM 시료를 결합단계, 해리단계를 거친 후 수산화나트륨을 이용 베이스라인(base line)의 + 10% 정도 재생되는지를 확인 후 사용 농도를 선택하였다. 분석 유속은 30㎕/min이며, 결합 구간은 60초, 해리 구간은 300초로 하여 분석시료의 친화도를 측정하였다.

각 배치별 친화도를 분석한 결과, PMC-201, Notch-1 Fc에서 각각의 친화도를 확인하였으며, 본 발명의 이중표적항체 PMC-201이 Notch-1 Fc에 비해 친화도가 높은 것을 확인하였다 (도 5).

3-3 : 세포 표면에 발현되는 hDLL4와 PMC-201의 결합능 측정

ELISA와 Biacore는 solid-phase 로 고정된 hDLL4 에 대한 PMC-201의 결합능을 알아본 것이고, PMC-201이 세포 표면에 발현되는 hDLL4에 결합하는지 여부를 알기 위해 FACS 분석을 실행하였다 (도 6).

먼저, hDLL4(서열번호 12 아미노산 서열)를 발현하는 293 pool과 세포주를 제작하기 위하여, GeneArt의 Geneoptimizer를 통하여, gene optimization을 수행한 hDLL4의 코딩서열(서열번호 11 염기서열)을 pcDNA3.1(+)의 제한효소 BamHI과 EcoRI 자리에 클로닝하여, pcDNA-hDLL4를 구축하였다. 그 다음 상기 pcDNA-hDLL4 벡터를 293 세포에 형질도입하였다. 형질도입은 lipofectamine^TM 2000 (Invitrogen #11668-019, 미국)을 이용하였으며, 그 방법은 제조사의 설명을 따랐다. 약술하면, αMEM 배지(Welgene, 대한민국)가 들어있는 100 mm 플레이트에 1 x 10⁶개의 293 세포를 접종한 후, 가습이 유지되는 CO₂(5%) 배양기를 사용하여 37℃에서 24시간 배양함으로써, 세포밀도가 20% 정도 되도록 하였다. 벡터 16 ㎍(DLL4 pcDNA3.1)과 40 ㎕의 lipofectamin^TM 2000을 각기 1 ㎖의 무혈청 αMEM 배지에 희석하여 상온에서 5분간 incubation 후, DNA 희석액과 lipofectamin^TM 2000 희석액을 섞어 상온에서 20분간 반응시켜 DNA-lipofectamin^TM 2000 복합체가 형성되도록 하였다. 배양된 세포에서 기존의 배지를 제거한 후, DNA-lipofectamin^TM 2000 복합체 1 ㎖과 무혈청 αMEM 배지 9 ㎖을 각 웰에 첨가하고, 가습이 유지되는 37℃ CO₂ 배양기에서 6시간 동안 배양한 후 투석우태혈청이 10% 포함된 DMEM 배지로 바꾸어주었다. 이후 37℃에서 72시간 동안 배양하고 Trypsin-EDTA를 사용하여 세포를 분리한 후, 투석우태혈청이 10% 포함된 DMEM 배지와 neomycin(G418, 500 ㎍/㎖)을 첨가하여 배양했다. 72시간 후 같은 조건에서 G418 농도를 1 ㎎/㎖로 증가시킨 배지로 바꿔주어 콜로니가 형성될 때까지 1주일 전후로 배양했다. 콜로니가 형성된 플레이트에서 각각의 콜로니를 Trypsine-EDTA 처리하여, 24 웰 플레이트로 옮겨서 투석우태혈청이 10% 포함된 DMEM 배지와 neomycin(G418, 500 ㎍/㎖)을 첨가하여 배양하는 한편, 생장하는 모든 콜로니들을 모아, pool 상태로 배양하였다.

1주일 후 pool 상태에서 anti-hDLL4 항체(Biolegend, 미국)로 FACS 분석을 수행하여 hDLL4 발현을 확인 후 사용하였고, 선별된 단일 콜로니 23종은 이들을 각각 6-well 플레이트와 100 mm 플레이트로 계대하면서, 투석우태혈청 10% 와 neomycin (G418, 500 ㎍/㎖)이 포함된 DMEM 배지로 배양했다. 단일 콜로니 가운데 hDLL4를 잘 발현하는 세포 1종을 선택하여, 293-hDLL4라고 명명하였고, 이후 PMC-201의 DLL4의 길항효능 관련 분석에 이용하였다.

PMC-201이 293-DLL4 pool에 잘 결합하는지를 알아보기 위해 FACS 분석을 실시하였다. 우선 충분한 수(FACS 샘플당 1 x 10⁶ 이상)의 293-DLL4 pool을 배양한 후 이들을 Trypsin-EDTA로 single-cell화 시켰고, 1x FACS buffer(0.2% BSA in PBS) 2 ㎖을 첨가하여 잘 섞어주고 1200 rpm으로 3분 동안 원심분리시킨 다음 상등액을 버리고 가라앉은 세포에 10 nM 농도의 PMC-201, Notch-1 Fc, Tanibirumab 으로 ice에서 20분간 1차 염색한 후, 1X FACS buffer로 세척하고 PE-anti-human Fc 항체로 2차 염색(ice에서 20분) 한 뒤 세척하였다. 이후 유세포분석기(flow cytometry; FACSCalibur)로 측정하였다.

세포 표면에 발현되는 hDLL4에 대한 결합여부를 측정한 결과, PMC-201는 Notch-1 Fc와 비슷한 결합능을 보이는 것을 확인하였다 (도 6).

이중표적항체 PMC -201 처리 후 HUVEC 의 증식능 분석

본 발명에 따른 이중표적항체 PMC-201 처리 후, 혈관내피세포(Human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)(Lonza, 스위스)의 증식능 변화를 확인하기 위해서, 세포 증식능 분석을 실시하였다. HUVEC의 배양은 20% 우태혈청(Hyclone, 미국), 페니실린 100 units/㎖(Hyclone, 미국), 스트렙토마이신 100 ㎍/㎖(Hyclone, 미국), 섬유아세포성장인자(Upstate Biotechnology, 미국) 3 ng/㎖, 헤파린 5 units/㎖ (Sigma-Aldrich, 미국)을 첨가한 phenol red-free M199 배지(Invitrogen, 미국)를 사용하였으며, 세포배양은 가습된 5% CO₂ 혼합공기 조건의 37℃ 배양기에서 배양하였다. 혈관내피세포의 생존률 분석을 위해서 이들 세포를 24-웰 플레이트에 2 x 10⁴세포/웰의 밀도로 24시간 배양하였다. 이후, M199 배지로 2회 씻어낸 후, 1% 우태혈청(Hyclone, 미국)이 포함된 M199 배지의 낮은 혈청농도 조건에서 6시간 동안 배양하였다. 다양한 농도의 항체를 세포에 30분간 선 처리한 후, 20 ng/㎖ VEGF (R&D systems, 미국)을 처리하였다. 48시간 배양 후 WST-8(Dojindo, 일본)을 2시간 처리하여 450 nm 파장에서의 흡광도를 측정함으로써, 각 조건에서의 세포 증식능을 비교하였다.

그 결과, 초대 배양한 HUVEC 세포에 대한 세포 증식능 어세이를 통해서, 이중표적항체 PMC-201이 VEGF에 의해 야기되는 HUVEC 세포의 증식능을 모항체인 타니비루맵(Tanibirumab)에 비해 더욱 강력히 저해할 수 있음을 확인하였다 (도 7).

FACS 를 이용한 경쟁적 human DLL4 결합능 분석

293-hDLL4 세포주에 결합하는 hNotch1-Fc를 PMC-201이 경합적으로 결합하는 지를 알아보기 위해 FACS 분석을 실시하였다. 우선 충분한 수(FACS 샘플당 세포 수 1 x 10⁶이상)의 293-hDLL4을 배양한 후 이들을 Trypsin-EDTA로 처리하여 단일세포로 잘 분리시킨 다음, 1 X FACS buffer(0.2% BSA in PBS) 2 ㎖을 첨가하였다. 그 다음 단일세포로 분리시킨 세포를 회수하여 1,200 rpm으로 3분 동안 원심분리한 다음 상등액을 버리고 가라앉은 세포에 16 ㎍/㎖ 농도의 타니비루맵 또는 PMC-201과 Alexa-488(Zenon, #Z-25402)을 라벨링한 rhNotch1-Fc를 1 ㎍/㎖로 함께 넣어, 얼음에서 30분간 1차 염색한 후, 1X FACS buffer로 세척하고 이후 유세포분석기(flow cytometry; FACSCalibur)로 측정하였다.

그 결과, HUVEC에 결합하는 rhNotch1-Fc의 결합이, PMC-201에 의해 기하학적 평균량(Geometric mean)으로 봤을 때, 4 배 이상 감소한 것을 확인하였다. 반면에 타니비루맵의 경우 항체 비처리군과 비슷하게 rhNotch1-Fc의 결합을 저해하지 못하였다 (도 8).

Notch -1 의한 프로모터 활성 분석

1x10⁵개의 LS174T 세포(colon cancer cell line; ATCC, CL-188™)를 10%의 우태혈청이 포함된 RPMI 배지에 24시간 배양하고, Cignal Reporter Assay Kit (#336841 CCS-014L, QIAGEN)에 포함된 Notch Cignal reporter DNA 0.8 ㎍과 lipofectamine(#11668-500; Invitrogen) 2 ㎕를 opti-MEM media 100 ㎕ 와 섞어 20분간 정치시킨 후 잘 섞어 트랜스펙션 할 때, 400 ㎕ opti-MEM을 첨가하여 6시간 배양하였다. 6시간 후 10%의 우태혈청이 포함됨 MEM 배지로 배지를 교환해 준 다음 하룻밤 동안 배양하였다. 다음날 1x10⁵개의 293-hDLL4 세포에 타니비루맵과 PMC-201(각각 20 mg/ml)을 섞어 1 시간 전처리(pretreatment)한 후에, Notch Cignal reporter DNA가 트랜스펙션 된 LS174T 세포와 24시간 공배양(coculture)하였다. DAPT(5 mM)는 전처리하지 않고, 트랜스펙션 된 LS174T 세포에 293-hDLL4 세포와 함께 섞어 24시간 공배양(coculture)하였다.

DAPT(N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester)는 일반적으로 Notch 1 활성을 억제하는 것으로 알려졌으며, γ-secretase의 활성을 억제하여 NICD의 생산 증가를 감소시키는 역할을 한다 (Andrea Geling et al., EMBO Rep ., :3(7):688, 2002; Ie-Ming Shih and Tian-Li Wang, Cancer Research, 67:1879, 2007).

24시간 동안 공배양 한 다음, Dual-Luciferase Reporter Assay System(Cat.# E1910;Promega)에 포함된 용해버퍼(lysis buffer)로 용해한 후에, 기질과 ATP를 섞어 주고, Luminometer 사용하여 발광 정도를 측정하였다.

그 결과, LS174T 세포의 Notch-1 활성화에 의해 나타나는 NICD의 프로모터 활성화가 항체를 처리하지 않은 비교군에 비해 이중표적항체 PMC-201를 처리한 경우 DAPT 처리군 만큼 NICD의 프로모터 활성화가 감소한 것을 확인하였다 (도 9).

Notch -1의 활성화에 의한 세포내 도메인( NICD ) 증가 분석

6-웰 플레이트에 재조합 hDLL4를 1 ㎍/㎖ 농도로 하룻밤 동안(16시간) 코팅하였다. 1XPBS로 세척한 후 각 웰(well)에 인간 IgG(hIgG), 타니비루맵, PMC-201(20 ㎍/㎖)농도로 한 시간 동안 처리한 다음, 처리한 항체용액을 제거하고, 5x10⁵ 개의 HUVEC과 IgG, 타니비루맵, PMC-201(20 ㎍/㎖)를 섞어서 6-웰 플레이트에 각각 처리하였다. 24시간 배양 후 용해버퍼(최종 1% SDS, 1mM Na3VO4, 1x protease inhibitor cocktail)를 사용하여 세포를 용해시킨 후, 세포 용해액을 모아서 에펜도르프튜브로 옮기고, 95℃에서 10분 동안 가열한 후 얼음에서 식힌 다음, BCA 정량법을 이용하여 전체 단백질을 정량한 후에, 실시예 2의 웨스턴블랏법과 동일한 방법으로 NICD를 측정하였다.

이때, 1차 항체로 Cleaved Notch1(Val1744)(D3B8) 항체(Rabbit)를 1:1000으로, β-actin 항체(Rabbit)는 1:2000으로 5% 0.05% TBST가 든 skim milk에 희석하였고, 2차 항체로는 anti-Rabbit IgG(R&D HAF008)를 1:1000로 희석하여 사용하였다.

그 결과, HUVEC 세포에서 hNotch-1 활성화에 의해 나타나는 NICD의 양이, 모항체인 타니비루맵에 비해 DLL4를 타겟팅하는 이중표적항체 PMC-201에 의해 상당히 줄어들어 있음을 확인하였다 (도 10).

한편, hDLL4를 코팅하지 않고, 세포 배양과 공배양(co-culture)만으로 NICD를 검출하는 분석방법을 위하여, 다음을 수행하였다.

먼저, 6-웰 플레이트에 HUVEC을 5x10⁵세포/웰로 24시간 배양하였다. 이후, 293-hDLL4(인간 DLL4 과발현 293 세포주) 2.5x10⁵세포/웰과 hIgG, PMC-201(10 ㎍/㎖) DAPT(5 uM)를 1시간 처리한 다음, 항체(hIgG, PMC-201)와 DAPT가 처리된 293-hDLL4 세포를 항체 용액을 제거하지 않은 상태로, 상기 6-웰 플레이트에 초기 배양된 HUVEC에 첨가하여 24시간 동안 공배양하였다. 비교군으로는 293-T 세포주를 처리하여 HUVEC와 공배양하였다.

이렇게, 24시간 공배양된 세포를 용해버퍼(final 1% SDS, 1 mM Na3VO4, 1x protease inhibitor cocktail)를 사용하여 세포를 용해시킨 후, 세포 용해액을 모아서 에펜도르프튜브로 옮기고, 95℃에서 10분 가열한 후 얼음에서 식힌 다음, BCA 정량법을 이용하여 전체 단백질을 정량한 후에, 실시예 2의 웨스턴블랏법과 동일한 방법으로 NICD를 측정하였다.

그 결과, HUVEC 세포에서 Notch-1 활성화에 의해 나타나는 NICD의 양이, hIgG 에 비해 DLL4를 타겟팅하는 이중표적항체 PMC-201에 의해 50% 미만으로 감소하였음을 확인하였다 (도 11).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명에 따른 이중표적항체 및 이를 포함하는 약학적 조성물은 혈관신생과 관련된 질환, 특히 암을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

<110> pharmabcine <120> Bispecific Antibody Targeting VEGFR-2 and DLL4, and Pharmaceutical Composition Comprising Thereof <130> P13-B296 <150> KR 2012-0132431 <151> 2012-11-21 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-VEGFR-2 variable heavy chain <400> 1 Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu 1 5 10 15 Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly 20 25 30 Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 35 40 45 Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr 50 55 60 Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Ser Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys 65 70 75 80 Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp 85 90 95 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Ile Trp Gly Pro Ser Leu Thr Ser 100 105 110 Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 115 120 <210> 2 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-VEGFR-2 variable heavy chain <400> 2 Gln Met Gln 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Lys Arg Thr 100 105 <210> 7 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Notch1 minimal decoy <400> 7 Asp Val Asp Glu Cys Ser Leu Gly Ala Asn Pro Cys Glu His Ala Gly 1 5 10 15 Lys Cys Ile Asn Thr Leu Gly Ser Phe Glu Cys Gln Cys Leu Gln Gly 20 25 30 Tyr Thr Gly Pro Arg Cys Glu Ile Asp Val Asn Glu Cys Val Ser Asn 35 40 45 Pro Cys Gln Asn Asp Ala Thr Cys Leu Asp Gln Ile Gly Glu Phe Gln 50 55 60 Cys Ile Cys Met Pro Gly Tyr Glu Gly Val His Cys Glu 65 70 75 <210> 8 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid linker <400> 8 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser 1 5 10 <210> 9 <211> 198 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> bispecific antibody (light chain-Notch1 minimal decoy) <400> 9 Asp Val Asp Glu Cys Ser Leu Gly Ala Asn Pro Cys Glu His Ala Gly 1 5 10 15 Lys Cys Ile Asn Thr Leu Gly Ser Phe Glu Cys Gln Cys Leu Gln Gly 20 25 30 Tyr Thr Gly Pro Arg Cys Glu Ile Asp Val Asn Glu Cys Val Ser Asn 35 40 45 Pro Cys Gln Asn Asp Ala Thr Cys Leu Asp Gln Ile Gly Glu Phe Gln 50 55 60 Cys Ile Cys Met Pro Gly Tyr Glu Gly Val His Cys Glu Ser Gly Gly 65 70 75 80 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Asn Phe Met Leu Thr Gln 85 90 95 Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Lys Thr Ala Arg Ile Thr Cys 100 105 110 Arg Gly Asp Asn Leu Gly Asp Val Asn Val His Trp Tyr Gln Gln Arg 115 120 125 Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Met Tyr Tyr Asp Ala Asp Arg Pro 130 135 140 Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala 145 150 155 160 Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr 165 170 175 Cys Gln Val Trp Asp Arg Thr Ser Glu Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr 180 185 190 Lys Val Thr Val Leu Gly 195 <210> 10 <211> 199 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> bispecific antibody (light chain-Notch1 minimal decoy) <400> 10 Asp Val Asp Glu Cys Ser Leu Gly Ala Asn Pro Cys Glu His Ala Gly 1 5 10 15 Lys Cys Ile Asn Thr Leu Gly Ser Phe Glu Cys Gln Cys Leu Gln Gly 20 25 30 Tyr Thr Gly Pro Arg Cys Glu Ile Asp Val Asn Glu Cys Val Ser Asn 35 40 45 Pro Cys Gln Asn Asp Ala Thr Cys Leu Asp Gln Ile Gly Glu Phe Gln 50 55 60 Cys Ile Cys Met Pro Gly Tyr Glu Gly Val His Cys Glu Ser Gly Gly 65 70 75 80 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Asn Phe Met Leu Thr Gln 85 90 95 Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Lys Thr Ala Arg Ile Thr Cys 100 105 110 Arg Gly Asp Asn Leu Gly Asp Val Asn Val His Trp Tyr Gln Gln Arg 115 120 125 Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Met Tyr Tyr Asp Ala Asp Arg Pro 130 135 140 Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala 145 150 155 160 Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr 165 170 175 Cys Gln Val Trp Asp Arg Thr Ser Glu Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr 180 185 190 Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 195 <210> 11 <211> 2058 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human DLL4 DNA sequence <400> 11 atggccgctg ccagcagatc tgcctctggc tgggctctgc tgctgctggt ggctctgtgg 60 cagcagagag ccgccggaag cggcgtgttc cagctgcagc tccaggagtt catcaacgag 120 cggggcgtgc tggccagcgg cagaccttgt gaacccggct gccggacctt cttcagagtg 180 tgcctgaagc acttccaggc cgtggtgtcc cccggaccct gcacctttgg caccgtgtcc 240 acacccgtgc tgggcaccaa cagcttcgcc gtgcgggacg atagcagcgg cggaggcaga 300 aaccccctgc agctgccctt caacttcacc tggcccggca ccttcagcct gatcatcgag 360 gcctggcacg cccctggcga cgacctgagg cctgaagccc tgcctcccga cgccctgatc 420 agcaagatcg ccatccaggg cagcctggcc gtgggccaga actggctgct ggacgagcag 480 accagcaccc tgacccggct gcggtacagc tacagagtga tctgcagcga caactactac 540 ggcgacaact gcagccggct gtgcaagaag cggaacgacc acttcggcca ctacgtgtgc 600 cagcccgacg gcaacctgag ctgcctgcct ggatggaccg gcgagtactg ccagcagccc 660 atctgcctga gcggctgcca cgagcagaac ggctactgca gcaagcccgc cgagtgcctg 720 tgcagacctg gctggcaggg cagactgtgc aacgagtgca tcccccacaa cggctgccgg 780 cacggcacct gtagcacccc ctggcagtgc acctgtgacg agggctgggg cggactgttc 840 tgtgatcagg acctgaacta ctgcacccac cacagcccct gcaagaacgg cgccacatgc 900 agcaacagcg gccagcggag ctacacctgt acctgcagac ccggctacac cggcgtggac 960 tgcgagctgg aactgagcga gtgcgacagc aacccctgcc ggaatggcgg cagctgcaag 1020 gaccaggaag atggctacca ctgcctgtgc ccccctggct actacggcct gcactgcgag 1080 cacagcaccc tgtcctgcgc cgactccccc tgctttaacg gcggctcctg cagagagcgg 1140 aaccagggcg ccaactacgc ctgcgagtgc ccccccaatt tcaccggcag caactgcgag 1200 aagaaagtgg accggtgcac ctccaacccc tgcgccaatg gcggacagtg cctgaacaga 1260 ggccccagcc ggatgtgcag atgcaggcct ggcttcaccg gcacctattg cgagctgcac 1320 gtgtccgact gcgcccggaa tccttgtgcc cacggcggca cctgtcacga cctggaaaac 1380 ggcctgatgt gcacctgtcc tgccggcttc agcgggcgga gatgcgaagt gcggaccagc 1440 atcgatgcct gcgcctccag cccctgcttc aaccgggcca cctgttacac cgacctgagc 1500 accgacacct tcgtgtgcaa ctgcccctac ggcttcgtgg gcagcagatg cgagttcccc 1560 gtgggcctgc cccccagctt tccttgggtg gccgtgtctc tgggcgtggg cctggctgtg 1620 ctgctggtcc tgctgggaat ggtggccgtg gctgtgcggc agctgagact gagaaggccc 1680 gacgacggca gccgcgaggc catgaacaac ctgagcgact tccagaagga caacctgatc 1740 cctgccgccc agctgaagaa caccaaccag aaaaaagagc tggaagtcga ctgcggcctg 1800 gacaagagca actgcggcaa gcagcagaac cacaccctgg actacaacct ggcccctggc 1860 cctctgggca gaggcaccat gcctggcaag ttcccccaca gcgacaagag cctgggcgag 1920 aaggcccccc tgagactgca cagcgagaag cccgagtgcc ggatcagcgc catctgcagc 1980 cccagagaca gcatgtacca gagcgtgtgc ctgatctccg aggaacggaa cgagtgcgtg 2040 atcgccaccg aagtgtga 2058 <210> 12 <211> 686 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human DLL4 amino acid sequence <400> 12 Met Ala Ala Ala Ser Arg Ser Ala Ser Gly Trp Ala Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Val Ala Leu Trp Gln Gln Arg Ala Ala Gly Ser Gly Val Phe Gln Leu 20 25 30 Gln Leu Gln Glu Phe Ile Asn Glu Arg Gly Val Leu Ala Ser Gly Arg 35 40 45 Pro Cys Glu Pro Gly Cys Arg Thr Phe Phe Arg Val Cys Leu Lys His 50 55 60 Phe Gln Ala Val Val Ser Pro Gly Pro Cys Thr Phe Gly Thr Val Ser 65 70 75 80 Thr Pro Val Leu Gly Thr Asn Ser Phe Ala Val Arg Asp Asp Ser Ser 85 90 95 Gly Gly Gly Arg Asn Pro Leu Gln Leu Pro Phe Asn Phe Thr Trp Pro 100 105 110 Gly Thr Phe Ser Leu Ile Ile Glu Ala Trp His Ala Pro Gly Asp Asp 115 120 125 Leu Arg Pro Glu Ala Leu Pro Pro Asp Ala Leu Ile Ser Lys Ile Ala 130 135 140 Ile Gln Gly Ser Leu Ala Val Gly Gln Asn Trp Leu Leu Asp Glu Gln 145 150 155 160 Thr Ser Thr Leu Thr Arg Leu Arg Tyr Ser Tyr Arg Val Ile Cys Ser 165 170 175 Asp Asn Tyr Tyr Gly Asp Asn Cys Ser Arg Leu Cys Lys Lys Arg Asn 180 185 190 Asp His Phe Gly His Tyr Val Cys Gln Pro Asp Gly Asn Leu Ser Cys 195 200 205 Leu Pro Gly Trp Thr Gly Glu Tyr Cys Gln Gln Pro Ile Cys Leu Ser 210 215 220 Gly Cys His Glu Gln Asn Gly Tyr Cys Ser Lys Pro Ala Glu Cys Leu 225 230 235 240 Cys Arg Pro Gly Trp Gln Gly Arg Leu Cys Asn Glu Cys Ile Pro His 245 250 255 Asn Gly Cys Arg His Gly Thr Cys Ser Thr Pro Trp Gln Cys Thr Cys 260 265 270 Asp Glu Gly Trp Gly Gly Leu Phe Cys Asp Gln Asp Leu Asn Tyr Cys 275 280 285 Thr His His Ser Pro Cys Lys Asn Gly Ala Thr Cys Ser Asn Ser Gly 290 295 300 Gln Arg Ser Tyr Thr Cys Thr Cys Arg Pro Gly Tyr Thr Gly Val Asp 305 310 315 320 Cys Glu Leu Glu Leu Ser Glu Cys Asp Ser Asn Pro Cys Arg Asn Gly 325 330 335 Gly Ser Cys Lys Asp Gln Glu Asp Gly Tyr His Cys Leu Cys Pro Pro 340 345 350 Gly Tyr Tyr Gly Leu His Cys Glu His Ser Thr Leu Ser Cys Ala Asp 355 360 365 Ser Pro Cys Phe Asn Gly Gly Ser Cys Arg Glu Arg Asn Gln Gly Ala 370 375 380 Asn Tyr Ala Cys Glu Cys Pro Pro Asn Phe Thr Gly Ser Asn Cys Glu 385 390 395 400 Lys Lys Val Asp Arg Cys Thr Ser Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Gln 405 410 415 Cys Leu Asn Arg Gly Pro Ser Arg Met Cys Arg Cys Arg Pro Gly Phe 420 425 430 Thr Gly Thr Tyr Cys Glu Leu His Val Ser Asp Cys Ala Arg Asn Pro 435 440 445 Cys Ala His Gly Gly Thr Cys His Asp Leu Glu Asn Gly Leu Met Cys 450 455 460 Thr Cys Pro Ala Gly Phe Ser Gly Arg Arg Cys Glu Val Arg Thr Ser 465 470 475 480 Ile Asp Ala Cys Ala Ser Ser Pro Cys Phe Asn Arg Ala Thr Cys Tyr 485 490 495 Thr Asp Leu Ser Thr Asp Thr Phe Val Cys Asn Cys Pro Tyr Gly Phe 500 505 510 Val Gly Ser Arg Cys Glu Phe Pro Val Gly Leu Pro Pro Ser Phe Pro 515 520 525 Trp Val Ala Val Ser Leu Gly Val Gly Leu Ala Val Leu Leu Val Leu 530 535 540 Leu Gly Met Val Ala Val Ala Val Arg Gln Leu Arg Leu Arg Arg Pro 545 550 555 560 Asp Asp Gly Ser Arg Glu Ala Met Asn Asn Leu Ser Asp Phe Gln Lys 565 570 575 Asp Asn Leu Ile Pro Ala Ala Gln Leu Lys Asn Thr Asn Gln Lys Lys 580 585 590 Glu Leu Glu Val Asp Cys Gly Leu Asp Lys Ser Asn Cys Gly Lys Gln 595 600 605 Gln Asn His Thr Leu Asp Tyr Asn Leu Ala Pro Gly Pro Leu Gly Arg 610 615 620 Gly Thr Met Pro Gly Lys Phe Pro His Ser Asp Lys Ser Leu Gly Glu 625 630 635 640 Lys Ala Pro Leu Arg Leu His Ser Glu Lys Pro Glu Cys Arg Ile Ser 645 650 655 Ala Ile Cys Ser Pro Arg Asp Ser Met Tyr Gln Ser Val Cys Leu Ile 660 665 670 Ser Glu Glu Arg Asn Glu Cys Val Ile Ala Thr Glu Val *** 675 680 685

Claims

삭제
VEGFR-2에 특이적으로 결합하는 항체의 말단에 DLL4의 길항제(antagonist)가 결합된, VEGFR-2와 DLL4를 표적으로 하는 이중표적항체로,
상기 VEGFR-2에 특이적으로 결합하는 항체는 서열번호 1 내지 서열번호 3에서 선택된 어느 하나의 서열을 가지는 중쇄 가변영역과, 서열번호 4 내지 서열번호 6에서 선택된 어느 하나의 서열을 가지는 경쇄 가변영역을 포함하고,
상기 DLL4의 길항제는 서열번호 7의 서열을 가지는 인간 Notch1의 11~12번째 칼슘 결합(calcium-binding) EGF-유사 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중표적항체.
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제2항에 있어서, VEGFR-2를 표적으로 하는 항체의 경쇄 N-말단에 DLL4의 길항제가 결합된 것을 특징으로 하는 이중표적항체.
제5항에 있어서, VEGFR-2를 표적으로 하는 항체와 DLL4의 길항제는 아미노산 링커를 통해 결합된 것을 특징으로 하는 이중표적항체.
삭제
제2항에 있어서, VEGFR-2에 특이적인 항체는 서열번호 1의 중쇄 가변영역과 서열번호 4의 경쇄 가변영역, 서열번호 2의 중쇄 가변영역과 서열번호 5의 경쇄 가변영역 또는 서열번호 3의 중쇄 가변영역과 서열번호 6의 경쇄 가변영역으로 이루어진 것을 특징으로 하는 이중표적항체.
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제2항, 제5항, 제6항 및 제8항 중 어느 한 항에 따른 이중표적항체를 코딩하는 DNA.
제10항에 따른 DNA를 포함하는 재조합 발현 벡터.
제11항에 따른 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포.
제12항에 따른 숙주세포를 배양하고, 이의 배양물로부터 이중표적항체를 분리하는 것을 특징으로 하는 이중표적항체의 제조 방법.
제13항에 있어서, 이중표적항체는 Protein A 친화성 컬럼, SP-sepharose 컬럼 및 크기배제크로마토그래피를 가지고 FPLC를 이용해서 추가로 정제하는 것을 특징으로 하는 이중표적항체의 제조 방법.
제2항, 제5항, 제6항 및 제8항 중 어느 한 항에 따른 이중표적항체를 포함하는 혈관신생 억제용 약제학적 조성물.
제15항에 있어서, 상기 혈관신생에 의해 유발되는 종양(암), 종양의 전이 (metastasis), 연령관련 황반변성 (age-related macular degeneration, ARMD), 당뇨병성 망막병증 (diabetic retinopathy), 건선 (psoriasis), 류마티스성 관절염 (rheumatoid arthritis) 및 만성염증 (chronic inflammation)에서 선택된 1 종 이상의 치료용 조성물임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제16항에 있어서, 상기 암은 대장암, 결장암, 위암, 유방암, 폐암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 이자암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 식도암, 담도암, 고환암, 직장암, 두경부암, 경추암, 요관암, 골육종, 신경세포아종, 흑색종, 섬유육종, 횡문근육종, 성상세포종, 신경모세포종 또는 신경교종 중에서 선택된 1 종 이상임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
인간 DLL4(hDLL4)를 발현하는 세포주 또는 재조합 세포주와 인간탯줄내피세포(HUVEC)의 공배양을 통해 Notch 1 활성을 측정하는 것을 특징으로 하는 제2항, 제5항, 제6항 및 제8항 중 어느 한 항에 따른 이중표적항체의 DLL4 길항 효능 측정방법.
제18항에 있어서, Notch 1 활성은 NICD의 발현양을 측정하는 것을 특징으로 하는 이중표적항체의 DLL4 길항 효능 측정방법.
제19항에 있어서, NICD의 발현양은 SDS-PAGE, 웨스턴 블랏(western blotting), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역염색법(immuno-staining), 면역형광염색법(immunofluorescence) 및 루시퍼레이즈 어세이(luciferase assay)로 구성된 군에서 선택되는 방법으로 측정하는 것을 특징으로 하는 이중표적항체의 DLL4 길항 효능 측정방법.
제18항에 있어서, hDLL4를 발현하는 재조합 세포주는 hDLL4 과발현 293 세포주(293-hDLL4)인 것을 특징으로 하는 이중표적항체의 DLL4 길항 효능 측정방법.
제18항에 있어서, 상기 공배양은 (a) 인간탯줄내피세포를 배양하는 단계; 및 (b) hDLL4를 발현하는 세포주 또는 재조합 세포주와 이중표적항체를 반응시킨 다음, 상기 (a) 단계에서 배양된 인간탯줄내피세포에 처리하여 공배양하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중표적항체의 DLL4 길항 효능 측정방법.