KR20240017129A

KR20240017129A - Cd40 및 cd137에 대한 다중특이적 항체

Info

Publication number: KR20240017129A
Application number: KR1020247003328A
Authority: KR
Inventors: 아이실 알틴타스; 다비드 사테인; 리크 라데마케르; 파울 파렌; 프리데리케 지에제케; 우구르 사인
Original assignee: 젠맵 에이/에스; 비온테크 에스이
Priority date: 2016-07-14
Filing date: 2017-07-14
Publication date: 2024-02-06
Also published as: SG11201811431VA; US20220064317A1; AU2017296095A1; KR102632202B1; WO2018011421A1; NZ749274A; US20230089969A1; EA201990293A1; US11084882B2; US20210317225A1; JP2022184871A; US11939388B2; AU2024205418A1; CN109641959B; IL264142B1; IL264142A; JP7138630B2; AU2017296095B2; BR112019000512A2; MA45672A

Abstract

인간 CD40 및 인간 CD137에 결합하는 다중특이적 항체, 이러한 다중특이적 항체를 제조하는 방법, 및 치료 또는 다른 목적을 위해 이러한 다중특이적 항체를 사용하는 방법.

Description

CD40 및 CD137에 대한 다중특이적 항체{MULTISPECIFIC ANTIBODIES AGAINST CD40 AND CD137}

본 발명은 CD40 및 CD137에 결합하는 다중특이적 항체, 및 이러한 다중특이적 항체의 용도, 특히 암의 치료를 위한 용도에 관한 것이다.

CD40은 종양 괴사 인자 (TNF) 수용체 (TNFR) 패밀리의 구성원이고, 다양한 세포 유형에서 발견되는 공동-자극 단백질로서 공지되어 있다. CD40은 수지상 세포 (DC), B 세포 및 대식세포를 포함한 항원-제시 세포 (APC)에 의해 구성적으로 발현된다. 이는 또한 내피 세포, 혈소판, 평활근 세포, 섬유모세포 및 상피 세포에 의해 발현될 수 있다. 정상 세포 상에서의 그의 만연한 발현과 일관되게, CD40은 또한 광범위한 종양 세포 상에서도 발현된다.

항원-특이적 CD4⁺ T 세포에 대한 MHC 부류 II 분자와 관련된 펩티드 항원의 제시는, 공동-자극 신호 (CD80 및/또는 CD86으로부터의 것)와 함께, CD4⁺ T 세포의 활성화 및 DC 허가 인자 CD40 리간드 (CD40L) 및 림프독소-α1β2 (LTα1β2)의 상향조절을 발생시킨다. 활성화된 항원-특이적 CD4⁺ T 세포 상에서의 CD40L 및 LTα1β2의 발현은 CD40 및 LTβ 수용체 (LTβR)를 통한 신호전달을 유도하고, 이는 DC가 CD8⁺ T-세포 반응을 유도하는 것을 허가한다. CD40 신호전달은 인터류킨-12 (IL-12)의 생산 및 CD70, CD86, 4-1BB 리간드 (4-1BBL), OX40 리간드 (OX40L) 및 GITR 리간드 (GITRL)의 상향조절을 발생시키는 반면에, LTβR 신호전달은 제I형 인터페론 (IFN)의 생산으로 이어진다. 핵 인자 카파B (NF-κB)의 활성을 제어하는 신호전달 시스템은 실질적으로 모든 TNFR 슈퍼패밀리 구성원에 대해 반응성이다. 병원체-연관 분자 패턴 (PAMP) 및 손상-연관 분자 패턴 (DAMP)이 또한 이들 사건에 기여한다. MHC 부류 I-제한 펩티드에 의한 CD8⁺ T 세포의 프라이밍은 CD27, 4-1BB, OX40 및 글루코코르티코이드-유도된 TNFR-관련 단백질 (GITR)의 상향조절을 발생시킨다. IL-12 및 유형 I IFN과 조합된, 그의 동족 TNF 슈퍼패밀리 리간드에 의한 CD8⁺ T 세포 상의 이들 수용체의 자극은 강건한 CD8⁺ T 세포 활성화, 증식 및 이펙터 기능, 뿐만 아니라 CD8⁺ T 세포 기억의 형성 및 유지를 발생시킨다. CD40 항체는 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC), 보체-의존성 세포독성 (CDC) 또는 항체-의존성 세포-매개 식세포작용 (ADCP)의 유도, 직접 아폽토시스 또는 성장 정지를 유도하기 위한 세포 신호전달의 유도에 의해, 뿐만 아니라 종양 세포 상의 CD40 발현과 독립적으로, APC가 항암 면역 반응을 자극하도록 허가하는 것을 통해 상이한 작용, CD40-발현 종양 세포 사멸을 발휘할 수 있다. CD40에 결합하는 항체는 APC 상의 CD40이 이펙터 세포독성 T 림프구 (CTL)를 프라이밍하고 이들 세포에 의한 IL-2의 방출을 유도하는 것을 촉발할 수 있고, 간접적으로 NK 세포를 활성화할 수 있다. CD40을 자극하는 항체는 선행 기술에 개시되어 있고, 인간 IgG2 항체인 CP-870,893 (WO 2003/040170); 인간화 IgG1 항체인 다세투주맙 (WO 2000/075348) 및 키메라 IgG1 항체인 Chi Lob 7/4 (US 2009/0074711)를 포함한다. 또한, 길항작용 CD40 항체인 인간 IgG1 항체 루카투무맙이 개시되어 있다 (WO 2002/028481).

CD137 (4-1BB)도 또한 TNFR 패밀리의 구성원이다. CD137은 CD8⁺ 및 CD4⁺ T 세포, 조절 T 세포 (Treg), 자연 킬러 T 세포 (NK(T) 세포), B 세포 및 호중구 상의 공동-자극 분자이다. T 세포 상에서, CD137은 구성적으로 발현되지 않지만, T-세포 수용체 (TCR) 활성화 시에 (예를 들어, 종양 침윤 림프구 (TIL) 상에서 (Gros et al., J. Clin Invest 2014;124(5):2246-59)) 유도된다. 그의 천연 리간드 4-1BBL 또는 효능제 항체를 통한 자극은 어댑터로서 TRAF-2 및 TRAF-1을 사용한 신호전달로 이어진다. CD137에 의한 조기 신호전달은 K-63 폴리-유비퀴틴화 반응을 수반하고, 이는 궁극적으로 핵 인자(NF)-κB 및 미토겐-활성화 단백질(MAP)-키나제 경로의 활성화를 발생시킨다. 신호전달은 증가된 T 세포 공동-자극, 증식, 시토카인 생산, 성숙 및 장기간 CD8⁺ T-세포 생존으로 이어진다. CD137에 대한 효능작용 항체는 다양한 전임상 모델에서 T 세포에 의한 항종양 제어를 촉진하는 것으로 제시되었다 (Murillo et al., Clin Cancer Res 2008;14(21):6895-906). CD137을 자극하는 항체는 T 세포의 생존 및 증식을 유도하여, 그로 인해 항종양 면역 반응을 증진시킬 수 있다. CD137을 자극하는 항체는 선행 기술에 개시되어 있고, 인간 IgG4 항체인 우렐루맙 (AU2004279877) 및 인간 IgG2 항체인 우토밀루맙 (Fisher et al. 2012 Cancer Immunol. Immunother. 61: 1721-1733)을 포함한다.

문헌 [Westwood JA, et al., Leukemia Research 38 (2014), 948-954]은 "뮤린 myc-구동 혈액암에서의 조합 항-CD137 및 항-CD40 항체 요법"을 개시한다.

US20090074711은 "키메라 효능작용 항-인간 CD40 항체를 사용한 인간 요법"을 개시한다.

그러나, 관련 기술분야에서의 이들 및 다른 진전에도 불구하고, CD40 및 CD137에 둘 다 결합하여, CD40-발현 APC 및 CD137-발현 T 세포에 동시에 결합함으로써, 이들 세포 유형을 근접 접촉시킬 수 있는 다중특이적 항체에 대한 필요가 존재한다. 이는 차례로, 둘 다의 세포 유형의 활성화 및 항종양 면역의 효율적 유도로 이어질 수 있다.

본 발명자들은 CD40 및 CD137 둘 다에 결합하고 T 세포 및 APC 활성화를 도출할 수 있는 다중특이적 항체를 확인하였다.

따라서, 한 측면에서, 본 발명은

(i) 인간 CD40에 결합하는 제1 항원-결합 영역, 및 (ii) 인간 CD137에 결합하는 제2 항원-결합 영역

을 포함하는 다중특이적 항체에 관한 것이다.

일부 실시양태에서, 본 발명은, 제1 항원-결합 영역이 임의로 돌연변이를 갖는 특정 아미노산 서열을 포함하는 또는 이러한 특정 아미노산 서열을 포함하는 항체와 경쟁하거나 그의 특이성을 갖는 항체의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 것인, 이러한 다중특이적 항체에 관한 것이다. 구체적 실시양태에서, 제1 항원-결합 영역은 항-CD40 항체 001의, 또는 이러한 항체와 경쟁하거나 그의 특이성을 갖는 항체의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은, 제2 항원-결합 영역이 중쇄 및 경쇄 가변 서열을 포함하고, 여기서 CDR1, CDR2 및 CDR3은 임의로 돌연변이를 갖는 특정 아미노산 서열을 포함하거나 특정 아미노산 서열을 제공하거나, 또는 이러한 특정 아미노산 서열을 포함하는 항체와 경쟁하거나 그의 특이성을 갖는 항체의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 이러한 다중특이적 항체에 관한 것이다. 구체적 실시양태에서, 제2 항원-결합 영역은 항-CD137 항체 001, 002, 003, 004, 005, 006, 007, 008, 009, 010, 011 또는 012의, 또는 임의의 이러한 항체와 경쟁하거나 그의 특이성을 갖는 항체의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 서열을 포함한다.

이러한 다중특이적 항체의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산; 이러한 핵산을 포함하는 발현 벡터; 이러한 핵산 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포; 이러한 다중특이적 항체를 포함하는 조성물; 암 또는 다른 질환을 치료하는데 사용하기 위한 이러한 조성물; 이러한 다중특이적 항체를 생산하는 방법; 및 이러한 다중특이적 항체에 기초한 진단 방법 및 키트를 포함하는 이들 및 다른 측면 및 실시양태가 하기 추가의 세부사항에 기재된다.

도 1: 인간, 아프리카 코끼리 및 멧돼지 CD137의 서열 정렬. 인간 서열의 것과 상이한 아프리카 코끼리 또는 멧돼지 CD137의 아미노산을 흑색으로 강조표시한다.
도 2: 아프리카 코끼리 (셔플 5) 또는 멧돼지 (셔플 1-4, 6) CD137 도메인을 함유하는 CD137 셔플 구축물.
도 3: HEK293-T17 세포 상에서의 CD137 셔플 구축물의 발현. HEK293-T17 세포를 CD137 셔플 구축물로 형질감염시켰다. 구축물의 세포 표면 발현은 인간, 멧돼지 및 아프리카 코끼리 CD137을 인식하는 폴리클로날 항-CD137 항체를 사용하여, 유동 세포측정법에 의해 측정하였다.
도 4: HEK293-T17 세포 상에 발현된 CD137 셔플 구축물에 대한 CD137 항체 클론의 결합. HEK293-T17 세포를 제시된 바와 같이 CD137 셔플 구축물 및 인간 CD137 (hCD137 wt), 아프리카 코끼리 또는 멧돼지 CD137로 형질감염시켰다. HEK293-T17 세포 상에 발현된 이들 구축물에 대한 상이한 CD137 항체 클론의 결합을 유동 세포측정법에 의해 측정하였다. 폴리클로날 항-CD137 항체에 의한 염색은 대조군으로서 제시한다.
도 5: 자동화된 이중특이적 항체 발견에 사용된 행렬-유사 혼합 그리드. 모 항체를 표시된 바와 같이 플레이팅할 수 있다. 이어서 단순한 행렬-유사 혼합 그리드를 사용하여 모 항체를 조합하여 이중특이적 항체를 수득할 수 있다. 이어서 제어된 Fab-아암 교환을 수행하여 이중특이적 항체를 수득할 수 있다.
도 6: 안정하게 형질도입된 HEK293-NFK-gfp-luc 및 K562 세포의 세포 표면 상에서의 CD40 및 CD137의 발현. NF-κB/293/GFP-Luc (a) 및 K562 (b) 세포를 CD40 또는 CD137에 의해 안정하게 형질도입하였다. CD40 (좌측 패널) 및 CD137 (우측 패널)의 표면 발현을 유동 세포측정법에 의해 결정하였다 (백색 곡선: 항체가 부재하는 대조군; 회색 곡선: 항체 염색).
도 7: CD40 및 CD137 (CD40xCD137)을 동시에 표적화하는 이중특이적 항체의 분석. CD40 및 CD137을 표적화하는 이중특이적 항체 (CD40-FEALxCD137-FEAR)를 리포터 검정에서 이중으로 시험하였다 (a-l: CD40-001xCD137-001, CD40-001xCD137-012까지). CD137의 활성화는 CD137에 의해 형질도입된 NF-κB/293/GFP-Luc (HEK293_NFK_CD137_gfp_luc)의, 표시된 이중특이적 항체 및 트랜스-활성화를 위한 CD40에 의해 형질도입된 K562 세포 (K562_CD40) 또는 대조군으로서 야생형 K562 세포 (K562_wt)와의 인큐베이션 시의 루시페라제 활성 (상대적 발광 단위, RLU)에 의해 측정하였다. CD40의 활성화는 CD40에 의해 형질감염된 NF-κB/293/GFP-Luc (HEK293_NFK_CD40_gfp_luc)의, 표시된 이중특이적 항체 및 트랜스-활성화를 위한 CD137에 의해 형질도입된 K562 (K562_CD137) 또는 대조군으로서 야생형 K562 세포 (K562_wt)와의 인큐베이션 시의 루시페라제 활성 (RLU)에 의해 측정하였다. 1개의 비관련 아암을 갖는 2종의 단일특이적, 1가 항체 (b12-FEALxCD137-FEAR, b12-FEALxCD40-FEAR)를 이중특이적 CD40xCD137 항체에 대한 대조군으로서 사용하였다.
도 8: 비-항원-특이적 T 세포 검정에서의 CD40xCD137 이중특이적 항체에 의한 CD8⁺ T-세포 증식의 유도. CFSE-표지된 PBMC를 CD40xCD137 이중특이적 항체 또는 단일특이적, 1가 대조군 항체와 함께 4일 동안 인큐베이션하였다. CD8⁺ 세포의 증식을 유동 세포측정법에 의해 측정하였다. 제시된 데이터는 플로우조(FlowJo) 소프트웨어를 사용하여 계산된 바와 같은, 0.02 μg/mL의 표시된 이중특이적 및 대조군 항체에 의해 유도된 CD8⁺ T-세포 증식 (a), CD40-001-FEALxCD137-005-FEAR (b), CD40-001-FEALxCD137-009-FEAR (c), CD40-001-FEALxCD137-003-FEAR (d) 및 CD40-001-FEALxCD137-011-FEAR (e)에 대한 분열된 세포의 백분율 및 증식 지수를 보여주는 CFSE 플롯이다.
도 9: 항원-특이적 T-세포 검정에서의 CD40xCD137 이중특이적 항체에 의한 CD8⁺ T-세포 증식의 증진. 클라우딘-6-특이적 TCR로 형질감염되고 CFSE로 표지된 T 세포를 클라우딘-6 IVT-RNA-전기천공된 미성숙 DC와 함께 CD40xCD137 이중특이적 항체 또는 대조군 항체의 존재 또는 부재 하에 5일 동안 인큐베이션하였다. CD8⁺ T-세포 증식을 유동 세포측정법에 의해 측정하였다. 제시된 데이터는 플로우조 소프트웨어를 사용하여 계산된 바와 같은, 0.02 μg/mL의 표시된 이중특이적 항체 및 대조군에 의해 유도된 CD8⁺ T-세포 증식 (a), 표시된 이중특이적 항체 (b) 및 CD40-001-FEALxCD137-005-FEAR 및 대조군 항체 (c) 및 CD40-001-FEALxCD137-009-FEAR 및 대조군 항체 (d)에 대한 표시된 농도에서의 백분율 분열된 세포 및 증식 지수를 보여주는 CFSE 플롯이다. 6.4 x 10^-5 내지 5 μg/mL 범위로 연속 희석된 표시된 이중특이적 항체에 대한 증식 지수 곡선을 또한 (e)에 제시한다. 곡선을 그래프패드 프리즘 5(GraphPad Prism 5) 소프트웨어 (그래프패드 소프트웨어(GraphPad Software), 미국 캘리포니아주 샌디에고)를 사용하여 비-선형 회귀 (가변 기울기를 갖는 S자형 용량-반응)에 의해 분석하였다. CD40-001-FEALxCD137-005-FEAR 및 CD40-001-FEALxCD137-009-FEAR의 경우 T-세포 증식의 유도에 대한 EC50 값은 각각 0.005 및 0.030 μg/mL였다.
도 10: 비-항원-특이적 T 세포 검정에서의 인간화 CD40xCD137 이중특이적 항체에 의한 CD8⁺ T-세포 증식의 유도. CFSE-표지된 PBMC를 인간화 CD40xCD137 이중특이적 항체, 모 이중특이적 항체 또는 IgG1 대조군 항체와 함께 4일 동안 인큐베이션하였다. CD8⁺ T 세포의 증식을 유동 세포측정법에 의해 측정하였다. 제시된 데이터는 플로우조 소프트웨어에 의해 계산된 바와 같은, 분열된 세포의 백분율 및 증식 지수이다. (n.d. = 결정되지 않음)
도 11: 항원-특이적 T-세포 검정에서의 인간화 CD40xCD137 이중특이적 항체에 의한 CD8⁺ T-세포 증식의 증진. 클라우딘-6-특이적 TCR로 형질감염되고 CFSE로 표지된 T 세포를 클라우딘-6 IVT-RNA-전기천공된 미성숙 DC와 함께 인간화 CD40xCD137 이중특이적 항체 (BisG1-CD40-001-H6LC1-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR), 모 이중특이적 항체 또는 IgG1 대조군 항체의 존재 또는 부재 하에 4일 동안 인큐베이션하였다. CD8⁺ T-세포 증식을 유동 세포측정법에 의해 측정하였다. 제시된 데이터는 플로우조 소프트웨어를 사용하여 계산된 바와 같은, 표시된 항체에 대한 백분율 분열된 세포 및 증식 지수이다. (n.d. = 결정되지 않음)
도 12: CD40xCD137 이중특이적 항체에 의한 인간 흑색종 조직 절제물로부터의 TIL의 생체외 확장. 절제된 조직으로부터의 종양 조각을 100 U/mL IL-2 및 표시된 농도의 CD40xCD137 이중특이적 항체 (BisG1-CD40-001-FEALxCD137-009-FEAR)와 배양하였다. 배양 14일 후에, 세포를 수거하고 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 샘플당 상대 생존 TIL 카운트 (1,000개의 측정된 카운팅 비드로 정규화됨)를 제시한다. 각각의 데이터 포인트는 1개의 FACS 튜브에서 분석된 2개의 종양 조각 중 TIL의 확장을 나타내는 단일 웰을 가리킨다. 선은 5개의 측정된 샘플의 평균을 나타낸다.
도 13: CD40xCD137 이중특이적 항체에 의한 인간 비소세포 폐암 (NSCLC) 조직 절제물로부터의 TIL의 생체외 확장. 절제된 NSCLC 조직으로부터의 종양 조각을 10 U/mL IL-2 및 표시된 농도의 CD40xCD137 이중특이적 항체 (BisG1-CD40-001-FEALxCD137-009-FEAR)와 배양하였다. 배양 10일 후에, 세포를 수거하고 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 샘플당 상대 생존 TIL 카운트 (1,000개의 측정된 카운팅 비드로 정규화됨)를 제시한다. 각각의 데이터 포인트는 1개의 FACS 튜브에서 분석된 2개의 종양 조각 중 TIL의 확장을 나타내는 단일 웰을 가리킨다. 선은 5개의 측정된 샘플의 평균을 나타낸다.
표 1 - 서열

*EU 넘버링에 따른 아미노산 위치 118-447

정의

본원에 사용된 용어 "CD40"은 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 5 (TNFRSF5)로도 지칭되는 CD40을 지칭하며, 이는 리간드 TNFSF5/CD40L에 대한 수용체이다. CD40은 TRAF6- 및 MAP3K8-매개 신호를 전달하여 대식세포 및 B 세포에서 ERK를 활성화하는 것으로 공지되어 있고, 이는 B 세포에 의한 이뮤노글로불린 분비의 유도로 이어진다. CD40에 대해 사용되는 다른 동의어는 B-세포 표면 항원 CD40, Bp50, CD40L 수용체 및 CDw40을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, CD40은 유니프롯 수탁 번호 P25942를 갖는 인간 CD40이다. 인간 CD40의 서열은 또한 서열식별번호(SEQ ID NO): 115에 제시된다. 서열식별번호: 115의 아미노산 1-20은 인간 CD40의 신호 펩티드에 상응하고; 서열식별번호: 115의 아미노산 21-193은 인간 CD40의 세포외 도메인에 상응하고; 나머지 단백질; 즉 서열식별번호: 115의 아미노산 194-215 및 216-277은 각각 막횡단 및 세포질 도메인이다.

본원에 사용된 용어 "CD137"은 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 9 (TNFRSF9)로도 지칭되는 CD137 (4-1BB)을 지칭하며, 이는 리간드 TNFSF9/4-1BBL에 대한 수용체이다. CD137 (4-1BB)은 T-세포 활성화에 수반되는 것으로 여겨진다. CD137에 대한 다른 동의어는 4-1BB 리간드 수용체, CDw137, T-세포 항원 4-1BB 상동체 및 T-세포 항원 ILA를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, CD137 (4-1BB)은 유니프롯 수탁 번호 Q07011을 갖는 인간 CD137 (4-1BB)이다. 인간 CD137의 서열은 또한 서열식별번호: 92에 제시된다. 서열식별번호: 92의 아미노산 1-23은 인간 CD137의 신호 펩티드에 상응하고; 서열식별번호: 92의 아미노산 24-186은 인간 CD137의 세포외 도메인에 상응하고; 나머지 단백질, 즉, 서열식별번호: 92의 아미노산 187-213 및 214-255는 각각 막횡단 및 세포질 도메인이다.

본원에 사용된 용어 "키메라 항체"는 가변 영역이 비-인간 종으로부터 유래되고 (예를 들어 설치류로부터 유래되고) 불변 영역이 상이한 종, 예컨대 인간으로부터 유래된 것인 항체를 지칭한다. 키메라 항체는 항체 조작에 의해 생성될 수 있다. "항체 조작"은 상이한 종류의 항체 변형에 대해 일반적으로 사용되는 용어이고, 항체 조작 과정은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 특히, 키메라 항체는 문헌 [Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Ch. 15]에 기재된 바와 같은 표준 DNA 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 따라서, 키메라 항체는 유전적으로 또는 효소적으로 조작된 재조합 항체일 수 있다. 키메라 항체를 생성하는 것은 통상의 기술자의 지식 범위 내에 포함되고, 따라서, 키메라 항체의 생성은 본원에 기재된 바와 다른 방법에 의해 수행될 수 있다. 인간의 치료 용도를 위한 키메라 모노클로날 항체는 비-인간 항체, 예를 들어 설치류 항체의 예상되는 항체 면역원성를 감소시키기 위해 개발되고 있다. 이는 전형적으로 관심 항원에 특이적인 비-인간 (예를 들어 뮤린 또는 토끼) 가변 영역, 및 인간 불변 항체 중쇄 및 경쇄 도메인을 함유할 수 있다. 키메라 항체와 관련하여 사용된 용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 하기 기재된 바와 같은, 이뮤노글로불린의 중쇄 및 경쇄 둘 다의 CDR 및 프레임워크 영역을 포함하는 영역을 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "인간화 항체"는 인간 항체 불변 도메인, 및 인간 가변 도메인에 대한 높은 수준의 서열 상동성을 함유하도록 변형된 비-인간 가변 도메인을 함유하는 유전자 조작된 비-인간 항체를 지칭한다. 이는, 함께 항원-결합 부위를 형성하는 6개의 비-인간 항체 CDR을 상동 인간 수용체 프레임워크 영역 (FR) 상으로 이식함으로써 달성될 수 있다 (WO92/22653 및 EP0629240 참조). 모 항체의 결합 친화도 및 특이성을 완전히 재구성하기 위해, 모 항체 (즉, 비-인간 항체)로부터의 프레임워크 잔기의 인간 프레임워크 영역 내로의 치환 (복귀-돌연변이)이 필요할 수 있다. 구조적 상동성 모델링은 항체의 결합 특성에 중요한 프레임워크 영역 내의 아미노산 잔기를 확인하는 것을 도울 수 있다. 따라서, 인간화 항체는 비-인간 CDR 서열, 비-인간 아미노산 서열에 1개 이상의 아미노산 복귀-돌연변이를 임의로 포함하는 주로 인간 프레임워크 영역, 및 완전 인간 불변 영역을 포함할 수 있다. 임의로, 바람직한 특징, 예컨대 친화도 및 생화학적 특성을 갖는 인간화 항체를 수득하기 위해, 반드시 복귀-돌연변이일 필요는 없는 추가의 아미노산 변형이 적용될 수 있고/거나 추가의 아미노산 돌연변이가 불변 영역 내에 도입될 수 있다.

본원에 사용된, 또 다른 단백질, 예를 들어, 모 단백질"로부터 유래된" 단백질은 단백질의 1개 이상의 아미노산 서열이 다른 또는 모 단백질의 1개 이상의 아미노산 서열과 동일하거나 유사한 것을 의미한다. 예를 들어, 또 다른 또는 모 항체, 결합 아암, 항원-결합 영역, 또는 불변 영역으로부터 유래된 항체, 결합 아암, 항원-결합 영역, 불변 영역 등에서, 1개 이상의 아미노산 서열은 다른 또는 모 항체, 결합 아암, 항원-결합 영역, 또는 불변 영역의 것과 동일하거나 유사하다. 이러한 1개 이상의 아미노산 서열의 예는 VH 및 VL CDR 및/또는 1개 이상 또는 모든 프레임워크 영역, VH, VL, CL, 힌지, 또는 CH 영역의 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 인간화 항체는 비-인간 모 항체"로부터 유래된" 것으로서 본원에 기재될 수 있고, 이는 적어도 VL 및 VH CDR 서열이 상기 비-인간 모 항체의 VH 및 VL CDR 서열과 동일하거나 유사하다는 것을 의미한다. 키메라 항체는 비-인간 모 항체"로부터 유래된" 것으로서 본원에 기재될 수 있고, 이는 전형적으로 VH 및 VL 서열이 비-인간 모 항체의 것과 동일하거나 유사할 수 있다는 것을 의미한다. 또 다른 예는 특정한 모 항체"로부터 유래된" 것으로서 본원에 기재될 수 있는 결합 아암 또는 항원-결합 영역이고, 이는 상기 결합 아암 또는 항원-결합 영역이 전형적으로 상기 모 항체 결합 아암 또는 항원-결합 영역과 동일하거나 상이한 VH 및/또는 VL CDR, 또는 VH 및/또는 VL 서열을 포함한다는 것을 의미한다. 그러나, 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 목적하는 특징을 도입하기 위해 항체, 결합 아암, 항원-결합 영역 등의 CDR, 불변 영역 또는 다른 곳에 아미노산 변형 예컨대 돌연변이가 만들어질 수 있다. 제1 또는 모 단백질로부터 유래된 1개 이상의 서열과 관련하여 사용된 경우에, "유사한" 아미노산 서열은 바람직하게는 적어도 약 50%, 예컨대 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다.

비-인간 항체는 수많은 상이한 종, 예컨대 마우스, 토끼, 닭, 기니 피그, 라마 및 염소에서 생성될 수 있다.

모노클로날 항체는 통상적인 모노클로날 항체 방법론, 예를 들어 문헌 [Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)]의 표준 체세포 혼성화 기술을 포함한 다양한 기술에 의해 생산될 수 있다. 모노클로날 항체를 생산하기 위한 다른 기술, 예를 들어 항체 유전자의 라이브러리를 사용한 B-림프구의 바이러스성 또는 종양원성 형질전환 또는 파지 디스플레이 기술이 사용될 수 있고, 이러한 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.

이러한 비-인간 종에서의 하이브리도마 생산은 매우 널리 확립된 절차이다. 면역화 프로토콜 및 융합을 위한 면역화 동물/비-인간 종의 비장세포의 단리를 위한 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 융합 파트너 (예를 들어, 뮤린 골수종 세포) 및 융합 절차가 또한 공지되어 있다.

본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 인간 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않은 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 그라프팅된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.

인간 모노클로날 항체는 마우스 시스템이 아닌 인간 면역계의 일부를 보유하는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소말 마우스를 사용하여 생성될 수 있다.

용어 "이뮤노글로불린"은 저분자량 경쇄 (L) 1쌍 및 중쇄 (H) 1쌍의 2쌍의 폴리펩티드 쇄로 이루어지고, 4개 모두 디술피드 결합에 의해 상호연결된, 구조적으로 관련된 당단백질의 부류를 지칭한다. 이뮤노글로불린의 구조는 널리 특징화되어 있다. 예를 들어 문헌 [Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))]을 참조한다. 간략하게, 각각의 중쇄 ("HC"로 약칭됨)는 전형적으로, 중쇄 가변 영역 (본원에서 V_H 또는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역 (본원에서 C_H 또는 CH로 약칭됨)으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 전형적으로 3개의 도메인, C_H1, C_H2, 및 C_H3으로 구성된다. 중쇄는 전형적으로 힌지 영역을 추가로 포함할 수 있다. 각각의 경쇄 ("LC"로 약칭됨)는 전형적으로, 경쇄 가변 영역 (본원에서 V_L 또는 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역 (본원에서 C_L 또는 CL로 약칭됨)으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 전형적으로 1개의 도메인, C_L로 구성된다. V_H 및 V_L 영역은, 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는, 상보성 결정 영역 (CDR)으로도 불리는 초가변성 영역 (또는 서열이 초가변성일 수 있고/거나 구조적으로 규정된 루프를 형성할 수 있는 초가변 영역)으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 V_H 및 V_L은 전형적으로, 아미노-말단으로부터 카르복시-말단으로 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (또한 문헌 [Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196, 901-917 (1987)] 참조). 달리 언급되지 않거나 문맥에 의해 모순되지 않는 한, 본원의 CDR 서열은 도메인갭얼라인(DomainGapAlign) (프로그램 버전: 4.9.1; 2013-12-19)을 사용하여 IMGT 규칙에 따라 확인된다 (Lefranc MP., Nucleic Acids Research 1999;27:209-212, 및 Ehrenmann F., Kaas Q. and Lefranc M.-P. Nucleic Acids Research 2010;38, D301-307; 또한 인터넷 http 주소 www.imgt.org/ 참조).

달리 언급되지 않거나 문맥에 의해 모순되지 않는 한, 본 발명에서 불변 영역의 아미노산 위치에 대한 언급은 EU-넘버링에 따른다 (Edelman et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1969 May;63(1):78-85; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. 1991 NIH Publication No. 91-3242).

본 발명의 문맥의 용어 "항체" (Ab)는 적어도 1개의 항체 가변 도메인 예컨대 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 또는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 분자, 또는 그의 단편, 또는 그 중 어느 하나의 유도체를 지칭하며, 이는 예컨대 전형적 생리학적 조건 하에 유의한 기간, 예컨대 적어도 약 30분, 적어도 약 45분, 적어도 약 1시간, 적어도 약 2시간, 적어도 약 4시간, 적어도 약 8시간, 적어도 약 12시간, 약 24시간 또는 그 초과, 약 48시간 또는 그 초과, 약 3, 4, 5, 6, 7일 또는 그 초과 등의 반감기, 또는 임의의 다른 관련 기능적-정의 기간 (예컨대 항원에 대한 항체 결합과 연관된 생리학적 반응을 유도, 촉진, 증진, 및/또는 조정하는데 충분한 시간 및/또는 항체가 이펙터 활성을 동원하는데 충분한 시간)으로 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는다. 특히 항체는 이뮤노글로불린 분자, 이뮤노글로불린 분자의 단편 또는 그의 유도체일 수 있다. 이뮤노글로불린 분자의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 이뮤노글로불린이 숙주 조직 또는 인자, 예컨대 면역계의 다양한 세포 (예컨대 이펙터 세포) 및 보체 시스템의 성분, 예컨대 보체 활성화의 전형적 경로에서의 제1 성분인 C1q에 결합하는 것을 매개할 수 있다. 상기 표시된 바와 같이, 본원의 용어 항체는 달리 언급되지 않거나 문맥에 의해 명백하게 모순되지 않는 한, 항원-결합 단편인, 즉 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 단편을 포함한다. 항체의 항원-결합 기능이 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다는 것이 제시되었다. 용어 "항체" 내에 포괄되는 항원-결합 단편의 예는 (i) V_L, V_H, C_L 및 C_H1 도메인으로 이루어진 1가 단편 또는 WO2007059782 (젠맙(Genmab))에 기재된 바와 같은 1가 항체인 Fab' 또는 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')₂ 단편; (iii) V_H 및 C_H1 도메인으로 본질적으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 V_L 및 V_H 도메인으로 본질적으로 이루어진 Fv 단편, (v) V_H 도메인으로 본질적으로 이루어지고 또한 도메인 항체 (Holt et al.; Trends Biotechnol. 2003 Nov;21(11):484-90)로도 불리는 dAb 단편 (Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)); (vi) 낙타류 또는 나노바디 (Revets et al.; Expert Opin Biol Ther. 2005 Jan;5(1):111-24) 및 (vii) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인, V_L 및 V_H가 개별 유전자에 의해 코딩되지만, 이는 V_L 및 V_H 영역이 쌍형성하여 1가 분자 (단일 쇄 항체 또는 단일 쇄 Fv (scFv)로 공지됨, 예를 들어 문헌 [Bird et al., Science 242, 423-426 (1988) 및 Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988)] 참조)를 형성하는 단일 단백질 쇄로서 형성되도록 할 수 있는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 연결될 수 있다. 이러한 단일 쇄 항체는 달리 언급되지 않거나 문맥에 의해 명백하게 나타내지 않는 한 용어 항체 내에 포괄된다. 이러한 단편은 일반적으로 항체의 의미 내에 포함되지만, 이들은 집합적으로 및 각각 독립적으로 상이한 생물학적 특성 및 유용성을 나타내는 본 발명의 고유한 특색이다. 본 발명과 관련하여 이들 및 다른 유용한 항체 단편, 뿐만 아니라 이러한 단편의 이중특이적 포맷이 본원에 추가로 논의된다. 또한, 달리 명시되지 않는 한, 용어 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 (mAb), 항체-유사 폴리펩티드, 예컨대 키메라 항체 및 인간화 항체, 및 임의의 공지된 기술, 예컨대 효소적 절단, 펩티드 합성, 및 재조합 기술에 의해 제공되는, 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체 단편 (항원-결합 단편)을 또한 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 생성된 바와 같은 항체는 임의의 이소형 및/또는 하위부류를 가질 수 있다.

정규 항체; 예를 들어 임의의 종에서 발생한 항체는 통상적으로 단일특이적, 2가 항체이고, 이는 이들이 동일한 에피토프에 결합하는 2개의 항원-결합 영역을 포함한다는 것을 의미한다.

본 발명과 관련하여 용어 "다중특이적 항체"는 상이한 항체 서열에 의해 정의되는 상이한 항원-결합 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 따라서 다중특이적 항체는 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과의 상이한 항원-결합 영역을 가질 수 있다. 다중특이적 항체의 예는 2개의 상이한 항원-결합 영역을 갖는 항체; 즉, 이중특이적 항체를 포함한다.

3개 이상의 상이한 항원-결합 영역을 포함하는 다중특이적 항체의 예는 (i) 그의 Fc 부분에서 추가의 단일 쇄 가변 단편 (scFv)과 커플링된 이중특이적 항체 (Weidle et al., Cancer Genomics Proteomics. 2013 Jan-Feb;10(1):1-18), (ii) 3개 이상의 scFv로 이루어진 융합 단백질 (트리아바디, 테트라바디; Chames et al., FEMS Microbiol Lett. 2000 Aug 1;189(1):1-8) 및 (iii) scFv에 연결된 융합 단백질 (Kermer et al. Mol Cancer Ther. 2014 Jan;13(1):112-21)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

본 발명과 관련하여 용어 "이중특이적 항체"는 상이한 항체 서열에 의해 규정된 2개의 상이한 항원-결합 영역을 갖는 항체를 지칭한다.

문맥에 의해 모순되지 않는 한, 본원에 사용된 용어 "Fab-아암" 또는 "아암"은 1개의 중쇄-경쇄 쌍을 지칭하고, 본원에서 "절반 분자"와 상호 교환가능하게 사용된다.

용어 "항원-결합 영역을 포함하는 결합 아암"은 항원-결합 영역을 포함하는 항체 분자 또는 단편을 의미한다. 따라서, 결합 아암은, 예를 들어, 6개의 VH 및 VL CDR 서열, VH 및 VL 서열, Fab 또는 Fab' 단편, 또는 Fab-아암을 포함할 수 있다.

문맥에 의해 모순되지 않는 한, 본원에 사용된 용어 "Fc 영역"은 적어도 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 항체 영역을 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "이소형"은 HC (예를 들어 IgG, IgD, IgA, IgE 및 IgM) 또는 LC (카파, κ 또는 람다, λ) 유전자에 의해 코딩된 특정 유형의 이뮤노글로불린을 지칭한다. 각각의 이소형 내에는, 여러 하위부류, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 등이 존재할 수 있다.

용어 "1가 항체"는, 본 발명과 관련하여, 항체 분자가 항원의 단일 분자와 결합할 수 있고, 따라서 항원 가교를 할 수 없다는 것을 의미한다.

"CD40 항체" 또는 "항-CD40 항체"는 항원 CD40에 특이적으로 결합하는 상기 기재된 바와 같은 항체이다.

"CD137 항체" 또는 "항-CD137 항체"는 항원 CD137에 특이적으로 결합하는 상기 기재된 바와 같은 항체이다.

"CD40xCD137 항체" 또는 "항-CD40xCD137 항체"는, 1개는 항원 CD40에 특이적으로 결합하고 1개는 CD137에 특이적으로 결합하는, 2개의 상이한 항원-결합 영역을 포함하는 이중특이적 항체이다.

용어 "특이적으로 결합하다", "특이적으로 결합하는", "특이적 결합" 또는 다른 유사한 어구는 다른 항원과 비교하여 특정한 항원에 또는 동일한 항원의 다른 부분과 비교하여 항원의 특정한 부분 (에피토프)에 우선적으로 결합하는 항체의 능력을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은, 미리 결정된 항원 또는 에피토프에 대한 항체의 결합과 관련하여 용어 "결합"은 전형적으로, 예를 들어 항체를 리간드로, 항원을 분석물로 사용하여 (또는 그 반대의 경우로) 비아코어 3000(BIAcore 3000) 기기에서 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 기술에 의해 결정하는 경우 약 10^-7 M 이하, 예컨대 약 10^-8M 이하, 예컨대 약 10^-9 M 이하, 약 10^-10 M 이하, 또는 약 10^-11 M 또는 심지어 그 미만의 K_D에 상응하는 친화도로의 결합이고, 미리 결정된 항원 또는 밀접하게 관련된 항원 이외의 비-특이적 항원 (예를 들어, BSA, 카세인)에의 결합에 대한 K_D보다 적어도 10-배 낮은, 예컨대 적어도 100-배 낮은, 예를 들어 적어도 1,000-배 낮은, 예컨대 적어도 10,000-배 낮은, 예를 들어 적어도 100,000-배 낮은 K_D에 상응하는 친화도로 미리 결정된 항원에 결합한다. 보다 높은 친화도의 양은 항체의 K_D 의존성이며, 따라서 항체의 K_D가 매우 낮은 경우 (즉, 항체가 고도로 특이적인 경우), 비-특이적 항원에 대한 친화도보다 높은 항원에 대한 친화도의 양은 적어도 10,000배일 수 있다.

본원에 사용된 용어 "k_d" (sec^-1)는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리율 상수를 지칭한다. 상기 값은 또한 k_off 값으로 지칭된다.

본원에 사용된 용어 "K_D" (M)는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 지칭한다.

2개의 항체는 그들이 동일한 항원 및 동일한 에피토프에 결합하면 "동일한 특이성"을 갖는다. 시험될 항체가 특정 항원-결합 항체와 동일한 에피토프를 인식하는지 여부는, 즉 항체들이 동일한 에피토프에 결합하는지 여부는, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 상이한 방법에 의해 시험될 수 있다.

항체 사이의 경쟁은 교차-차단 검정에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 경쟁적 ELISA 검정이 교차-차단 검정으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 표적 항원을 마이크로타이터 플레이트의 웰에 코팅할 수 있고, 항원-결합 항체 및 시험 항체와 경쟁하는 후보를 첨가할 수 있다. 웰 내 항원에 결합된 항원-결합 항체의 양은 동일한 에피토프에의 결합에 대해 서로 경쟁하는 시험 항체와 경쟁하는 후보의 결합 능력과 간접적으로 상관된다. 특히, 동일한 에피토프에 대해 시험 항체와 경쟁하는 후보의 친화도가 클수록, 항원-코팅 웰에 보다 적은 양의 항원-결합 항체가 결합한다. 웰에 결합된 항원-결합 항체의 양은 검출 가능한 또는 측정가능한 표지 물질로 항체를 표지함으로써 측정될 수 있다.

또 다른 항체와 항원에의 결합에 대해 경쟁하는 항체, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체, 또는 또 다른 항체의 항원에 대해 특이성을 갖는 항체, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체는, 본원에 기재된 바와 같은 상기 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 변이체, 예를 들어 CDR에서의 변형 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 특정 정도의 동일성을 포함하는 항체일 수 있다.

본원에 사용된 "단리된 다중특이적 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 다중특이적 항체를 지칭하는 것으로 의도된다 (예를 들어, CD40 및 CD137에 특이적으로 결합하는 단리된 이중특이적 항체는 CD40 또는 CD137에 특이적으로 결합하는 단일특이적 항체가 실질적으로 없다).

용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정기를 의미한다. 에피토프는 통상적으로, 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 표면 집단으로 이루어지고, 통상적으로 특이적 3차원 구조적 특징뿐만 아니라 특이적 전하 특징을 갖는다. 입체형태적 및 비-입체형태적 에피토프는 전자에 대한 결합이 변성 용매의 존재 하에 상실되지만, 후자는 그렇지 않다는 점에서 구별된다. 에피토프는 결합에 직접적으로 수반되는 아미노산 잔기 및 결합에 직접적으로 수반되지 않는 다른 아미노산 잔기, 예컨대 특이적 항원-결합 펩티드에 의해 효과적으로 차단되거나 커버되는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다 (다시 말해서, 아미노산 잔기는 특이적 항원-결합 펩티드의 영향범위 내에 있음).

본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 단일 분자 조성의 항체 분자 제제를 지칭한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정한 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.

본원에 사용된 경우에 용어 "제1 및 제2 CH3 영역 사이의 이종이량체 상호작용"은 제1-CH3/제2-CH3 이종이량체 항체에서 제1 CH3 영역과 제2 CH3 영역 사이의 상호작용을 지칭한다.

본원에 사용된 경우에 용어 "제1 및 제2 CH3 영역 사이의 동종이량체 상호작용"은 제1-CH3/제1-CH3 동종이량체 항체에서 제1 CH3 영역과 또 다른 제1 CH3 영역 사이의 상호작용 및 제2-CH3/제2-CH3 동종이량체 항체에서 제2 CH3 영역과 또 다른 제2 CH3 영역 사이의 상호작용을 지칭한다.

본원에 사용된 경우에 용어 "동종이량체 항체"는 2개의 제1 Fab-아암 또는 절반-분자를 포함하고, 여기서 상기 Fab-아암 또는 절반-분자의 아미노산 서열이 동일한 항체를 지칭한다.

본원에 사용된 경우에 용어 "이종이량체 항체"는 제1 및 제2 Fab-아암 또는 절반-분자를 포함하고, 여기서 상기 제1 및 제2 Fab-아암 또는 절반-분자의 아미노산 서열이 상이한 항체를 지칭한다. 특히, 상기 제1 및 제2 Fab-아암/절반-분자의 CH3 영역, 또는 항원-결합 영역, 또는 CH3 영역 및 항원-결합 영역은 상이하다.

용어 "환원 조건" 또는 "환원 환경"은 기질, 예컨대 항체의 힌지 영역 내의 시스테인 잔기가 산화되는 것보다 환원될 가능성이 더 큰 조건 또는 환경을 지칭한다.

본 발명은 또한, 실시예의 이중특이적 항체의 V_L 영역, V_H 영역, 또는 1개 이상의 CDR의 기능적 변이체를 포함하는 다중특이적 항체, 예컨대 이중특이적 항체를 제공한다. 이중특이적 항체와 관련하여 사용된 V_L, V_H, 또는 CDR의 기능적 변이체는 여전히, 이중특이적 항체의 각각의 항원-결합 영역이 모 이중특이적 항체의 친화도 및/또는 특이성/선택성의 적어도 실질적인 비율 (적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 초과)을 보유하게 하며, 일부 경우에 이러한 이중특이적 항체는 모 이중특이적 항체보다 더 큰 친화도, 선택성 및/또는 특이성과 연관될 수 있다.

이러한 기능적 변이체는 전형적으로 모 이중특이적 항체와 유의한 서열 동일성을 보유한다. 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려하여, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, % 상동성 = 동일한 위치의 #/위치의 총 # x 100). 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은, 예를 들어 PAM120 가중치 잔기 표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 사용하여 ALIGN 프로그램 (버젼 2.0) 내로 혼입된 문헌 [E. Meyers and W. Miller, Comput. Appl. Biosci 4, 11-17 (1988)]의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 또한, 2개의 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 문헌 [Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 444-453 (1970)] 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.

본 발명과 관련하여 하기 표기법은, 달리 나타내지 않는 한, 돌연변이를 기재하는데 사용된다; 돌연변이된 아미노산의 명칭, 이어서 돌연변이된 위치 번호, 이어서 포함된 돌연변이. 따라서, 돌연변이가 치환인 경우에, 이전 아미노산을 대체한 아미노산의 명칭이 포함되고, 아미노산이 결실된 경우에, 이는 *로 표시되고, 돌연변이가 부가인 경우에, 부가된 아미노산이 원래의 아미노산 다음에 포함된다. 아미노산 명칭은 1글자 또는 3글자 코드일 수 있다. 따라서 예를 들어; 위치 409의 리신이 아르기닌으로 치환된 것은 K409R로 지칭되고, 위치 409의 리신이 임의의 아미노산으로 치환된 것은 K409X로 지칭되고, 위치 409의 리신이 결실된 것은 K409*로 지칭되고, 위치 K409의 리신 다음에 P가 부가된 것은 K409KP로 지칭된다.

예시적인 변이체는 주로 보존적 치환에 의해 모 서열의 VH 및/또는 VL 및/또는 CDR 영역과 상이한 것을 포함하며; 예를 들어, 변이체에서 치환 중 12개, 예컨대 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개는 보존적 아미노산 잔기 대체이다.

본 발명과 관련하여, 보존적 치환은 하기에 반영된 아미노산의 부류 내에서의 치환으로 정의될 수 있다:

보존적 치환을 위한 아미노산 잔기 부류:

산성 잔기: Asp (D) 및 Glu (E)

염기성 잔기: Lys (K), Arg (R), 및 His (H)

친수성 비하전된 잔기: Ser (S), Thr (T), Asn (N), 및 Gln (Q)

지방족 비하전된 잔기: Gly (G), Ala (A), Val (V), Leu (L), 및 Ile (I)

비-극성 비하전된 잔기: Cys (C), Met (M), 및 Pro (P)

방향족 잔기: Phe (F), Tyr (Y), 및 Trp (W)

본 발명의 제1 및/또는 제2 항원-결합 영역은 또한, 각각 본원에 개시된 제1 및/또는 제2 항원-결합 영역의 변이체일 수 있다.

예를 들어 항체의 그의 표적 항원에 대한 친화도를 증가시키기 위해, 인간에서 사용될 비-인간 항체의 잠재적 면역원성을 감소시키기 위해 및/또는 숙주 세포에 의해 발현되는 항체의 수율을 증가시키기 위해 예를 들어 아미노산 치환에 의해; 변형을 도입하는 방법 및 CDR 서열의 어떠한 특정 아미노산이 변형될 수 있는 지는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 이러한 변형은 항체가 결합하는 표적 항원의 에피토프에 영향을 미치지 않고 도입될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "재조합 숙주 세포" (또는 간단히 "숙주 세포" 또는 "세포")는 핵산, 예컨대 발현 벡터, 예를 들어 본 발명의 다중특이적 항체를 코딩하는 핵산, 예컨대 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭하는 것으로 의도된다. 재조합 숙주 세포는 예를 들어 트랜스펙토마, 예컨대 CHO, CHO-S, HEK, HEK293, HEK-293F, Expi293F, PER.C6 또는 NS0 세포 및 림프구성 세포를 포함한다.

용어 "치료"는 증상 또는 질환 상태를 경감, 완화, 정지 또는 근절 (치유)시킬 목적으로 본 발명의 치료 활성 다중특이적 항체의 유효량을 투여하는 것을 지칭한다.

용어 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 목적하는 치료 결과를 달성하는데 필요한 투여량 및 기간 동안 유효한 양을 지칭한다. 다중특이적 항체의 치료 유효량은 개체의 질환 상태, 연령, 성별, 및 체중, 및 개체에서 다중특이적 항체가 목적하는 반응을 도출하는 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 치료 유효량은 또한 다중특이적 항체 또는 그의 단편의 임의의 독성 또는 유해한 효과보다 치료상 유익한 효과가 더 큰 것이다.

용어 "항-이디오타입 항체"는 일반적으로 항체의 항원-결합 부위와 연관된 고유 결정기를 인식하는 항체를 지칭한다.

본 발명과 관련하여, 다중특이적 항체를 포함한 항체와 관련하여 사용된 용어 "더 낮은 정도로 Fc-매개된 이펙터 기능을 유도한다"는, 항체가 (i) 특히 상기 항체와 동일한 제1 및 제2 항원-결합 영역을 포함하는 동일한 CDR 서열 및 (ii) 인간 IgG1 힌지, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 2개의 중쇄를 포함하는 인간 IgG1 항체와 비교하여, 더 낮은 정도로 Fc-매개된 이펙터 기능, 특히 IgG Fc 수용체 (Fc감마R, FcγR) 결합, C1q 결합, ADCC 또는 CDC의 목록으로부터 선택된 기능을 유도한다는 것을 의미한다.

Fc-매개된 이펙터 기능은 FcγR에 대한 결합, C1q에 대한 결합, 또는 FcγR을 통한 Fc-매개된 가교의 유도에 의해 측정될 수 있다.

본 발명의 추가 측면 및 실시양태

본 발명은, 1개는 인간 CD40에 대한 특이성을 갖고 1개는 인간 CD137에 대한 특이성을 갖는, 2개의 상이한 항원-결합 영역을 포함하는 분자에 관한 것이다.

특정한 실시양태에서, 상기 분자는 다중특이적 항체일 수 있다.

따라서 본 발명은 (i) 인간 CD40에 결합하는 제1 항원-결합 영역; 및 (ii) 인간 CD137에 결합하는 제2 항원-결합 영역을 포함하는 다중특이적 항체에 관한 것이다.

본 발명의 본 발명자들에 의해 제시된 바와 같이, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 하나의 세포 상에서 발현된 CD40에 결합하고 또 다른 세포 상에서 발현된 CD137에 결합한 경우에 세포내 신호전달을 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 다중특이적 항체는 2종의 상이한 세포를 트랜스-활성화할 수 있다. 인간에서, CD40은 항원-제시 세포 (APC), 예컨대 수지상 세포를 포함한 수많은 세포 상에서 발현되는 반면에, CD137은 T 세포 및 다른 세포 상에서 발현된다. 따라서, CD40 및 CD137에 결합하는 본 발명에 따른 다중특이적 항체, 예컨대 이중특이적 항체는 이들 수용체를 발현하는 APC 및 T 세포에 동시에 결합할 수 있다. 이론에 얽매이지는 않지만, 본 발명에 따른 다중특이적 항체, 예컨대 이중특이적 항체는 따라서 (i) 수용체 결합에 의해 APC와 T 세포 사이의 세포-대-세포 상호작용을 매개할 수 있고, (ii) CD40 및 CD137 둘 다를 한 번에 활성화할 수 있으며, 이는 주로 가교 및 세포-대-세포 상호작용 시의 수용체 클러스터링에 의해 유도되고, 반드시 모 단일특이적 2가 항체의 효능작용 활성에 의존하는 것은 아니다. 따라서, 이들 트랜스-활성화 다중특이적 항체, 예컨대 이중특이적 항체는 APC:T 세포 상호작용과 관련하여 공동-자극 활성을 발휘하고, 종양 세포에 대해 T 세포 반응을 도출할 수 있다. 이에 따라 이러한 작용 메카니즘은 활성화된 APC에 의한 항원-제시를 통한 천연 T-세포 활성화를 반영할 수 있고, 이는 T 세포에 대한 APC에 의한 다양한 종양-특이적 항원의 제시를 가능하게 한다. 이론에 제한되지는 않지만, 공동자극 활성은 (i) 임의의 T 세포와 대조적으로 오직 특이적 T 세포 (즉, APC와 접촉해 있는 것)만의 활성화 및 (ii) 활성화된 APC 및 CD137 촉발을 통한 강력한 공동-자극에 의한, 소진된 T 세포의 재-활성화 및 (iii) 활성화된 APC에 의해 항원 제시를 유도하고 동시에 CD137을 촉발시키는 것에 의한 T 세포의 프라이밍 중 1종 이상을 제공할 수 있다.

따라서, 본 발명의 다중특이적, 예컨대 이중특이적 항체는 T 세포의 활성화로부터의 이익을 얻을 질환, 예컨대 암의 치료에 사용될 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명에 따른 다중특이적 항체는

(I) 인간 CD40에 결합하며,

a) 서열식별번호: 3에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 3에서 최대 4개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR3, 및 서열식별번호: 5에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 5에서 최대 4개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR3; 및

b) (i) a)에 따른 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 항체와 인간 CD40 결합에 대해 경쟁하고/거나 (ii) a)에 따른 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 항체의 CD40에 대해 특이성을 갖는 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR3

으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 제1 항원-결합 영역,

및

(II) 인간 CD137에 결합하는 제2 항원-결합 영역

을 포함한다.

추가 실시양태에서, 제1 항원-결합 영역은 서열식별번호: 1에 제시된 바와 같은 서열 또는 서열식별번호: 1에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, 및/또는 서열식별번호: 2에 제시된 바와 같은 서열 또는 서열식별번호: 2에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR2; 및/또는 서열식별번호: 4에 제시된 바와 같은 서열 또는 서열식별번호: 4에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, 및/또는 서열 YTS 또는 YTS에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR2를 추가로 포함할 수 있다.

따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은

(I) 인간 CD40에 결합하며,

a) 각각 서열식별번호: 1, 2 및 3에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 4, YTS 및 5에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3;

b) 총 1 내지 12개의 돌연변이를 갖는 a)에 따른 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3; 및

c) (i) a) 또는 b)에 따른 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체와 인간 CD40 결합에 대해 경쟁하고/거나 (ii) a) 또는 b)에 따른 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체의 CD40에 대한 특이성을 갖는 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3

으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 제1 항원-결합 영역, 및

(II) 인간 CD137에 결합하는 제2 항원-결합 영역

을 포함하는 다중특이적 항체에 관한 것이다.

추가 실시양태에서, 상기 제1 항원-결합 영역은 제1 중쇄 가변 (VH) 서열 및 제1 경쇄 가변 (VL) 서열을 포함하고, 상기 제2 항원-결합 영역은 제2 중쇄 가변 (VH) 서열 및 제2 경쇄 가변 (VL) 서열을 포함하며, 여기서 상기 가변 서열 각각은, 각각 3개의 CDR 서열, CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 4개의 프레임워크 서열, FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함한다.

추가 실시양태에서, 상기 다중특이적 항체는 (I) 상기 제1 항원-결합 영역을 포함하는 제1 결합 아암, 및 (II) 상기 제2 항원-결합 영역을 포함하는 제2 결합 아암을 포함한다.

한 실시양태에서, 제1 결합 아암은 상기 제1 항원-결합 영역 및 제1 중쇄 불변 서열을 포함하고, 제2 결합 아암은 상기 제2-항원-결합 영역 및 제2 중쇄 불변 서열을 포함한다.

추가 실시양태에서, (i) 상기 제1 결합 아암은 상기 제1 항원-결합 영역을 포함하며, 여기서 제1 결합 아암은 제1 중쇄 가변 (VH) 서열 및 제1 중쇄 불변 (CH) 서열을 포함하는 제1 중쇄, 및 제1 경쇄 가변 (VL) 서열을 포함하는 제1 경쇄를 포함하고, (ii) 상기 제2 결합 아암은 상기 제2 항원-결합 영역을 포함하며, 여기서 제2 결합 아암은 제2 중쇄 가변 (VH) 서열 및 제2 중쇄 불변 (CH) 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 제2 경쇄 가변 (VL) 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함한다.

추가 실시양태에서, 상기 제1 경쇄는 제1 경쇄 불변 (CL) 서열을 추가로 포함하고, 상기 제2 경쇄는 제2 경쇄 불변 (CL) 서열을 추가로 포함한다.

한 실시양태에서, 제1 결합 아암은 상기 제1 항원-결합 영역을 포함하는 제1 Fab-아암을 포함하고, 제2 결합 아암은 상기 제2 항원-결합 영역을 포함하는 제2 Fab-아암을 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명에 따른 다중특이적 항체의 상기 제1 및 제2 항원-결합 영역은 인간화 항체로부터 유래된다. 한 실시양태에서, 제1 및 제2 결합 아암은 인간화 항체로부터 유래될 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명에 따른 다중특이적 항체의 제1 및 제2 결합 아암은 전장 항체로부터 유래된다.

한 실시양태에서, 본 발명에 따른 다중특이적 항체의 제1 및 제2 결합 아암은 전장 IgG1,λ (람다) 또는 IgG1,κ (카파) 항체로부터 유래된다.

한 실시양태에서, 제1 및 제2 결합 아암은 모노클로날 항체로부터 유래된다.

한 실시양태에서, 본 발명에 따른 다중특이적 항체의 제1 및 상기 제2 중쇄는 IgG 이소형의 것이다. 제1 및 제2 중쇄의 하위부류는 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 개별적으로 선택될 수 있다. 한 실시양태에서, 제1 및 제2 중쇄는 동일한 IgG 하위부류, 예컨대 IgG1의 것이다.

한 실시양태에서, 본 발명에 따른 다중특이적 항체는 단리된 항체이다.

추가 실시양태에서, 각각의 상기 제1 및 제2 중쇄는 적어도 힌지 영역, CH2 및 CH3 영역을 포함한다. 추가 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄의 CH3 영역은 비대칭 돌연변이를 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명에 따른 다중특이적 항체는 이중특이적 항체이다.

한 실시양태에서, 본 발명에 따른 다중특이적 항체는 인간 CD40을 발현하는 하나의 세포, 예를 들어 제1 세포, 및 인간 CD137을 발현하는 또 다른 세포, 예를 들어 제2 세포를 가교할 수 있다.

한 실시양태에서, 상기 가교는 인간 CD40을 발현하는 제1 세포주 및 인간 CD137을 발현하는 제2 세포주를 사용한 검정에 의해 결정되고, 제1 또는 제2 세포주는 NF-κB 활성화 시 측정가능한 리포터의 생산을 발생시키는 리포터 구조를 포함한다.

한 실시양태에서 상기 제1 세포는 항원-제시 세포일 수 있고, 상기 제2 세포는 T-세포, 예컨대 CD4⁺ 또는 CD8⁺ T-세포일 수 있다.

CD40을 발현하는 제1 세포 및 CD137을 발현하는 제2 세포의 가교를 결정하기 위해 상이한 방법이 사용될 수 있고, 본 발명은 어떠한 특별한 방법으로 제한되지 않는다.

한 실시양태에서, 상기 가교는 예를 들어 실시예 4에 기재된 바와 같은 리포터 검정에 의해 결정될 수 있다. 간략하게, 상기 검정은 제1 표적 항원을 발현하고 NF-κB 반응 요소에 의해 구동되는 리포터 유전자 (예를 들어 루시페라제)로 형질도입된 리포터 세포주를 제2 표적 항원을 발현하는 제2 세포주와 함께 공동-배양하는 단계, 본 발명에 따른 다중특이적 항체를 세포 공동-배양물에 100 ng/mL 내지 10,000 ng/mL의 농도로 첨가하는 단계, 및 리포터 유전자 발현, 예를 들어 루시페라제 생성을 측정하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 제1 표적 항원은 인간 CD40이고, 상기 제2 표적 항원은 인간 CD137이거나 또는 그 반대이다.

상이한 세포 상에서 발현된 CD40 및 CD137의 가교를 유도할 수 있는 다중특이적 항체는 이러한 검정에서, NF-κB 경로 활성화 시 리포터 유전자 발현에 기초하여 제1 표적 항원의 측정가능한 활성화를 발생시킬 것이다.

한 실시양태에서, 본 발명에 따른 다중특이적 항체는 NF-κB 리포터 유전자 없이 제2 표적 항원을 발현하는 제2 세포주의 첨가 시에만 NF-κB 활성화 시 생산되는 리포터 유전자 발현을 유도할 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명에 따른 다중특이적 항체는, 제2 표적 항원을 발현하지 않는 제2 세포주의 첨가와 비교하여, NF-κB 리포터 유전자 없이 제2 표적 항원을 발현하는 제2 세포주가 첨가될 경우 NF-κB 활성화 시 생산되는 보다 높은 리포터 유전자 발현을 유도할 수 있다.

한 실시양태에서, 다중특이적 항체는 이중특이적 항체이고, 상기 이중특이적 항체는, 한 실시양태에서:

(i) CD137을 발현하는 리포터 세포주 및 CD40을 발현하는 제2 세포주의 공동-배양물에 첨가될 경우 리포터 유전자 발현을 유도할 수 있거나, 또는

(ii) 인간 CD137에 결합하는 동일한 제2 항원-결합 영역을 포함하지만 여기서 참조 이중특이적 항체의 제1 항원-결합 영역이 비관련 표적 항원에 결합하는 것인, 예를 들어 제1 항원-결합 영역이 각각 서열식별번호: 99, 100 및 101에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 102, GVS 및 103에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 것인 참조 이중특이적 항체와 비교하여, CD137을 발현하는 리포터 세포주 및 CD40을 발현하는 제2 세포주의 공동-배양물에 첨가될 경우 보다 높은 양의 리포터 유전자 발현을 유도할 수 있다.

(i) CD40을 발현하는 리포터 세포주 및 CD137을 발현하는 제2 세포주의 공동-배양물에 첨가될 경우 리포터 유전자 발현을 유도할 수 있거나, 또는

(ii) 인간 CD40에 결합하는 동일한 제1 항원-결합 영역을 포함하지만 여기서 참조 이중특이적 항체의 제2 항원-결합 영역이 각각 서열식별번호: 99, 100 및 101에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 102, GVS 및 103에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 것인 참조 이중특이적 항체와 비교하여, CD40을 발현하는 리포터 세포주 및 CD137을 발현하는 제2 세포주의 공동-배양물에 첨가될 경우 보다 높은 양의 리포터 유전자 발현을 유도할 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명에 따른 다중특이적 항체는 T 세포의 증식을 유도하고/거나 개선시키고, 예를 들어 여기서 상기 T 세포는 CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포이다.

T 세포의 증식을 결정하거나 측정하기 위한 상이한 방법이 사용될 수 있고, 본 발명은 어떠한 특정한 방법으로 제한되지 않는다.

한 실시양태에서, T 세포의 증식의 상기 유도 또는 증진은 예를 들어 실시예 5에 기재된 바와 같은 비-항원-특이적 T-세포 증식 검정에 의해 결정된다. 따라서 T 세포의 증식의 유도 및/또는 증진은 PBMC 풀 (말초 혈액 단핵 림프구)에서의 T 세포의 준-최적 활성화에 의해 결정될 수 있다. 준-최적 활성화는 PBMC 풀에 첨가된 항-CD3 항체의 농도를 적정하고, T 세포 증식을 측정하고, 낮은 T 세포 증식을 발생시키지만 T 세포 증식의 추가의 증진을 가능하게 하는 항-CD3 항체 농도를 선택함으로써 결정될 수 있다. 이러한 농도는 PBMC-공여자-의존성이고, 검정이 수행되기 전에 각각의 공여자에 대해 결정된다.

한 실시양태에서, T 세포의 증식의 상기 유도 또는 증진은 상기 준-최적 농도의 항-CD3 항체에 의해 PBMC의 T 세포를 활성화하고, PBMC를 다중특이적 항체와 접촉시키고, T 세포의 증식을 결정하는 것에 의해 결정된다. 추가 실시양태에서, PBMC는 CFSE로 표지될 수 있고, PBMC를 다중특이적 항체와 접촉시키는 것은 4일 동안의 인큐베이션에 의해 수행될 수 있고, T 세포의 증식은 유동 세포측정법에 의해 측정될 수 있다.

특정 반응 또는 효과를 유도하는 것 예컨대 "T 세포의 증식을 유도하는 것"은 유도 전에는 어떠한 이러한 반응 또는 효과 예컨대 T 세포의 증식이 존재하지 않았음을 의미할 수 있지만, 이는 또한 유도 전에 특정 수준의 반응 또는 효과 예컨대 T 세포의 증식이 존재하였고 유도 후 상기 반응 또는 효과 예컨대 T 세포의 증식이 증진된 것을 의미할 수 있다. 따라서, "유도하는 것"은 또한 "증진시키는 것"을 포함한다.

또한 T 세포의 증식은 관심 시험 항원을 사용한, 예를 들어 실시예 6에 기재된 바와 같은 항원-특이적 T 세포 증식 검정에 의해 측정될 수 있다. 따라서, T 세포 증식의 유도 및/또는 증진은 주요 조직적합성 복합체 (MHC)로 제시되는 시험 항원의 펩티드에 특이적인 TCR을 발현하는 T 세포, 및 이어서 TCR에 의해 인식되는 MHC의 상응하는 펩티드를 제시하는 DC를 공동-배양하는 것에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 CD8+ T 세포일 수 있고, MHC는 MHC 부류 I일 수 있거나, 또는 T 세포는 CD4+ T 세포일 수 있고, MHC는 MHC 부류 II일 수 있다. 특이적 TCR을 발현하는 T 세포는 TCR을 코딩하는 mRNA에 의한 형질도입에 의해 생성될 수 있다. 상응하는 펩티드를 제시하는 DC는 항원을 코딩하는 mRNA에 의한 DC의 형질도입에 의해 생성될 수 있다. TCR-양성 T 세포와 항원-제시 세포의 공동-배양은 T-세포 증식을 유도하고; 증식의 정도는 DC에 의해 제시된 항원 밀도 및/또는 공동자극 신호의 강도에 좌우될 수 있다. 한 실시양태에서, T 세포의 증식은 CFSE 표지된 T-세포를 사용한 이러한 항원-특이적 T-세포 검정에 의해, 시험될 항체를 첨가하고 4일 후 유동 세포측정법에 의해 T 세포 증식을 측정하는 것에 의해 측정될 수 있다.

한 실시양태에서, T 세포의 증식의 상기 유도 또는 증진은 예를 들어 실시예 11에 기재된 바와 같은 생체외 확장 검정에서 종양-침윤 림프구 (TIL)를 사용하여 결정된다. TIL의 증식의 유도 또는 증진에 대한 본 발명의 다중특이적 항체의 효과는 인간 종양 샘플을 인터류킨-2 (IL-2) 및 상기 항체와 인큐베이션하고, 약 10 내지 약 14일의 기간 동안의 인큐베이션 후에 생존 TIL을 회수하고, 카운팅함으로써 평가될 수 있다. 이어서 TIL의 증식의 유도 또는 증진은 적합한 대조군, 예를 들어 임의의 다중특이적 항체 없이 또는 참조 (대조군) 다중특이적 항체와 함께 인큐베이션된 인간 종양 샘플과 비교하는 것에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 인간 종양 조직의 샘플을 예를 들어 생검을 통해 또는 외과적 시편으로부터 단리하고, 무혈청 배지 중에서 세척하고, 약 1-2 mm 직경의 종양 조각을 배양 접시 또는 웰에 놓고, 예를 들어, 1 또는 2개의 종양 조각을 1 mL 적합한 배지 중에 놓고, 37℃에서 인큐베이션할 수 있다. 적합한 배지는, 예를 들어 10% 인간 혈청 알부민, 1% Pen/Strep, 1% 푼기존 및 IL-2로 보충된 10 내지 100 U/mL 농도 범위, 예를 들어, 10 U/mL 또는 100 U/mL의 무혈청 배지 (예를 들어 엑스-비보15(X-VIVO 15))일 수 있다. 이어서 다중특이적 항체가 TIL 배지에 적합한 농도로 첨가될 수 있다. 10-14일의 총 배양 기간 후, 이러한 기간 동안 필요한 경우에 임의로 세포 배양물을 분할한 후, TIL을 수거하고, 생존 CD4+ 및 CD8+ T 세포 뿐만 아니라 NK 세포의 검출을 가능하게 하는, 예를 들어 항-CD3, 항-CD4, 항-CD8, 항-CD56 및 7-AAD 항체를 사용하여, 예를 들어 유동 세포측정법에 의해 이를 카운팅할 수 있다.

한 실시양태에서, 다중특이적 항체는, 본원에 기재된 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 제2 항원-결합 영역을 포함하지만 여기서 제1 항원-결합 영역은 각각 서열식별번호: 99, 100 및 101에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 102, GVS 및 103에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 것인 참조 이중특이적 항체와 비교하여, T 세포의 보다 많은 증식을 유도하고/거나 증진시키는 이중특이적 항체이다.

한 실시양태에서, 다중특이적 항체는, 본원에 기재된 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 제1 항원-결합 영역을 포함하지만 여기서 제2 항원-결합 영역은 각각 서열식별번호: 99, 100 및 101에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 102, GVS 및 103에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 것인 참조 이중특이적 항체와 비교하여, T 세포의 보다 많은 증식을 유도하고/거나 증진시키는 이중특이적 항체이다.

CD40에 대한 결합

상기 기재된 바와 같이, 본 발명에 따른 다중특이적 항체는 인간 CD40에 결합하는 제1 항원-결합 영역을 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명에 따른 다중특이적 항체는 인간 CD40에 결합하는 제1 항원-결합 영역을 포함하며, 여기서 상기 제1 항원-결합 영역은

a) 서열식별번호: 3에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 3에서 최대 4개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR3, 및 서열식별번호: 5에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 5에서 최대 4개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR3,

b) (i) a)에 따른 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 항체와 인간 CD40 결합에 대해 경쟁하고/거나 (ii) a)에 따른 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 항체의 CD40에 대한 특이성을 갖는 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR3

으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.

a) 각각 서열식별번호: 1, 2 및 3에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 4, YTS 및 5에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3,

으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다.

한 실시양태에서 상기 제1 항원-결합 영역은 제1 중쇄 가변 (VH) 서열, 및 제1 경쇄 가변 (VL) 서열을 포함하며, 여기서 상기 가변 서열 각각은, 각각 3개의 CDR 서열, CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다.

한 실시양태에서, 상기 제1 항원-결합 영역은 제1 중쇄 가변 (VH) 서열, 및 제1 경쇄 가변 (VL) 서열을 포함하며, 여기서 상기 가변 서열 각각은, 각각 3개의 CDR 서열, CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 4개의 프레임워크 서열, FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함한다.

한 실시양태에서, 상기 제1 항원-결합 영역은 각각 서열식별번호: 1, 2 및 3에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 4, YTS 및 5에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 따라서 제1 항원-결합 영역은 표 1에 제시된 바와 같은 CD40 항체의 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함할 수 있다.

이러한 제1 항원-결합 영역을 포함하는 항체의 예는 본원에 개시된 키메라 항체 Chi Lob 7/4 및 CD40-001이다.

또 다른 실시양태에서, 상기 제1 항원-결합 영역은 총 1 내지 12개의 돌연변이, 예컨대 1 내지 11개의 돌연변이, 1 내지 10개의 돌연변이, 1 내지 8개의 돌연변이, 1 내지 7개의 돌연변이, 1 내지 6개의 돌연변이, 1 내지 5개의 돌연변이, 1 내지 4개의 돌연변이, 1 내지 3개의 돌연변이, 또는 1 내지 2개의 돌연변이를 갖는, 각각 서열식별번호: 1, 2 및 3에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 4, YTS 및 5에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다.

한 실시양태에서, 상기 돌연변이는 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환일 수 있다.

한 실시양태에서, 상기 돌연변이는 각각의 VH 및 VL CDR3이 최대 3개의 돌연변이를 포함하고 각각의 VH 및 VL CDR2 및 CDR1이 최대 2개의 아미노산 돌연변이를 포함하도록 VH CDR1, 2 및 3 및 VL CDR 1, 2 및 3에 걸쳐 분포될 수 있다.

추가 실시양태에서, 제1 항원-결합 영역은 총 1 내지 12개의 돌연변이를 갖는, 각각 서열식별번호: 1, 2, 3, 4, YTS 및 5에 제시된 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하며, 여기서 VH 및 VL CDR3은 각각 최대 3개의 아미노산 돌연변이를 포함하고, VH 및 VL CDR1 및 CDR2는 각각 최대 2개의 아미노산 돌연변이를 포함한다.

추가 실시양태에서, 제1 항원-결합 영역은 총 1 내지 10개 예컨대 1 내지 8개의 돌연변이를 갖는, 각각 서열식별번호: 1, 2, 3, 4, YTS 및 5에 제시된 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하며, 여기서 VH 및 VL CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 최대 2개의 아미노산 돌연변이를 포함한다.

추가 실시양태에서, 제1 항원-결합 영역은 총 1 내지 6개의 돌연변이를 갖는, 각각 서열식별번호: 1, 2, 3, 4, YTS 및 5에 제시된 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하며, 여기서 VH 및 VL CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 최대 1개의 아미노산 돌연변이를 포함한다.

예를 들어 항체의 그의 표적 항원에 대한 친화도를 증가시키기 위해, 인간에서 사용될 비-인간 항체의 잠재적 면역원성을 감소시키기 위해 및/또는 숙주 세포에 의해 발현되는 항체의 수율을 증가시키기 위해 예를 들어 아미노산 치환에 의해 돌연변이를 도입하는 방법 및 CDR 서열의 어떠한 특정 아미노산이 돌연변이될 수 있는지는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 이러한 돌연변이는 항체가 결합하는 표적의 에피토프에 영향을 미치지 않고 도입될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 상기 제1 항원-결합 영역은 (i) a) 또는 b)에 따른 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체와 인간 CD40 결합에 대해 경쟁하고/거나 (ii) a) 또는 b)에 따른 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체의 CD40에 대한 특이성을 갖는 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다.

추가 실시양태에서, 상기 제1 항원-결합 영역은 (i) a) 또는 b)에 따른 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체와 인간 CD40 결합에 대해 경쟁하고/거나 (ii) a) 또는 b)에 따른 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체의 CD40에 대한 특이성을 갖는 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.

용어 "경쟁하다"는 표적 항원에의 결합에 대한 2개의 항체 사이의 경쟁과 관련하여 언급된다. 2개의 항체가 표적 항원에의 결합에 대해 서로를 차단하지 않는 경우에, 이러한 항체는 비-경쟁적이고, 이는 상기 항체가 동일한 부분, 즉 표적 항원의 에피토프에 결합하지 않는다는 지표이다. 항체가 표적 항원에의 결합에 대해 경쟁하는지 시험하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 이러한 방법의 예는, 예를 들어 ELISA로서 또는 유동 세포측정법에 의해 수행될 수 있는, 소위 교차-경쟁 검정이다.

예를 들어, ELISA-기반 검정은 ELISA 플레이트 웰을 각각의 항체로 코팅하고; 경쟁 항체 및 표적 항원의 His-태그부착된 세포외 도메인을 첨가하고 인큐베이션하는 것에 의해 수행될 수 있고; 첨가된 항체가 His-태그부착된 단백질이 코팅된 항체에 결합하는 것을 억제하는지 여부를 검출하는 것은 비오티닐화된 항-His 항체에 이어 스트렙타비딘-폴리-HRP를 첨가하고, ABTS와의 반응을 추가로 발색시키고, 405 nm에서 흡광도를 측정하는 것에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어 유동 세포측정 검정은 표적 항원을 발현하는 세포를 과량의 비표지된 항체와 인큐베이션하고, 세포를 준-최적 농도의 비오틴-표지된 항체와 인큐베이션한 다음, 형광 표지된 스트렙타비딘과 인큐베이션하고, 유동 세포측정법에 의해 분석함으로써 수행될 수 있다.

한 실시양태에서, 제1 항원-결합 영역의 상기 VH 서열은 서열식별번호: 117 및 서열식별번호: 6 중 적어도 1개, 예컨대 서열식별번호: 117에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

한 실시양태에서, 제1 항원-결합 영역의 상기 VL 서열은 서열식별번호: 121 및 서열식별번호: 7 중 적어도 1개, 예컨대 서열식별번호: 121에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

한 실시양태에서, 제1 항원-결합 영역의 상기 VH 및 VL 서열은 각각 서열식별번호: 6 및 서열식별번호: 7에 대해 각각 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.

한 실시양태에서, 제1 항원-결합 영역의 상기 VH 및 VL 서열은 각각 서열식별번호: 117 및 서열식별번호: 121에 대해 각각 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.

한 실시양태에서, VH 및 VL 서열은 각각 서열식별번호: 6 및 7에 제시된 바와 같이 단지 비-CDR 서열에서만 벗어난다.

한 실시양태에서, VH 및 VL 서열은 각각 서열식별번호: 117 및 121에 제시된 바와 같이 단지 비-CDR 서열에서만 벗어난다.

한 실시양태에서, VH 및 VL 서열은 단지 프레임워크 서열에서만 벗어난다.

한 실시양태에서, 제1 항원-결합 영역의 VH 및 VL 서열의 각각의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 프레임워크 서열은 상기 VH 및 VL 서열의 각각의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 프레임워크 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는다.

한 실시양태에서, 제1 항원-결합 영역의 VH 및 VL 서열의 각각의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 프레임워크 서열은 서열식별번호: 6에 제시된 바와 같은 VH 서열, 및 서열식별번호: 7에 제시된 바와 같은 VL 서열의 각각의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 프레임워크 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는다.

한 실시양태에서, 제1 항원-결합 영역의 VH 및 VL 서열의 각각의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 프레임워크 서열은 서열식별번호: 6에 제시된 바와 같은 VH 서열, 및 서열식별번호: 7에 제시된 바와 같은 VL 서열의 각각의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 프레임워크 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖고, 제1 항원-결합 영역의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 1, 2, 3, 4, YTS 및 5에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3과 비교하여 총 1 내지 12개의 돌연변이를 갖는다. 추가 실시양태에서, 상기 돌연변이는 상기 기재된 바와 같을 수 있다.

추가 실시양태에서, 제1 항원-결합 영역의 VH 및 VL 서열의 각각의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 프레임워크 서열은 서열식별번호: 6에 제시된 바와 같은 VH 서열, 및 서열식별번호: 7에 제시된 바와 같은 VL 서열의 각각의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 프레임워크 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖고, 제1 항원-결합 영역은 각각 서열식별번호: 1, 2, 3, 4, YTS 및 5에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다.

한 실시양태에서, 제1 항원-결합 영역의 VH 및 VL 서열의 각각의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 프레임워크 서열은 서열식별번호: 117에 제시된 바와 같은 VH 서열, 및 서열식별번호: 121에 제시된 바와 같은 VL 서열의 각각의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 프레임워크 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖고, 제1 항원-결합 영역의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 1, 2, 3, 4, YTS 및 5에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3과 비교하여 총 1 내지 12개의 돌연변이를 갖는다. 추가 실시양태에서, 상기 돌연변이는 상기 기재된 바와 같을 수 있다.

추가 실시양태에서, 제1 항원-결합 영역의 VH 및 VL 서열의 각각의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 프레임워크 서열은 서열식별번호: 117에 제시된 바와 같은 VH 서열, 및 서열식별번호: 121에 제시된 바와 같은 VL 서열의 각각의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 프레임워크 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖고, 제1 항원-결합 영역은 각각 서열식별번호: 1, 2, 3, 4, YTS 및 5에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다.

한 실시양태에서, 제1 항원-결합 영역의 상기 VH 서열은 서열식별번호: 117의 아미노산 서열을 포함한다.

한 실시양태에서, 제1 항원-결합 영역의 상기 VL 서열은 서열식별번호: 121의 아미노산 서열을 포함한다.

추가 실시양태에서, 제1 항원-결합 영역의 상기 VH 및 VL 서열은 각각 서열식별번호: 117 및 서열식별번호: 121의 아미노산 서열을 포함한다.

한 실시양태에서, 제1 항원-결합 영역의 상기 VH 서열은 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함한다.

한 실시양태에서, 제1 항원-결합 영역의 상기 VL 서열은 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함한다.

추가 실시양태에서, 제1 항원-결합 영역의 상기 VH 및 VL 서열은 각각 서열식별번호: 6 및 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명에 따른 다중특이적 항체는 본원의 임의의 측면 또는 실시양태의 상기 제1 항원-결합 영역을 포함하는 제1 결합 아암을 포함할 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명에 따른 다중특이적 항체는 상기 제1 항원-결합 영역 및 제1 중쇄 불변 서열을 포함하는 제1 결합 아암을 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명에 따른 다중특이적 항체는 상기 제1 항원-결합 영역을 포함하는 제1 결합 아암을 포함하며, 여기서 제1 결합 아암은 제1 중쇄 가변 (VH) 서열 및 제1 중쇄 불변 (CH) 서열을 포함하는 제1 중쇄, 및 제1 경쇄 가변 (VL) 서열을 포함하는 제1 경쇄를 포함한다.

한 실시양태에서, 상기 제1 경쇄는 제1 경쇄 불변 (CL) 서열을 추가로 포함한다.

추가 실시양태에서, 상기 제1 중쇄는 적어도 힌지 영역, CH2 및 CH3 영역을 포함한다.

구체적 실시양태에서, 본 발명에 따른 다중특이적 항체는 상기 제1 항원-결합 영역을 포함하는 제1 Fab-아암을 포함한다.

한 실시양태에서, 제1 항원-결합 영역은 마우스 항체로부터 유래될 수 있다.

한 실시양태에서, 제1 항원-결합 영역은 키메라 항체, 예컨대 Chi Lob 7/4로부터 유래될 수 있다.

한 실시양태에서, 제1 항원-결합 영역은 인간화 항체로부터 유래될 수 있다.

한 실시양태에서, 제1 결합 아암은 전장 항체로부터 유래될 수 있다.

한 실시양태에서, 제1 결합 아암은 전장 IgG1,λ (람다) 또는 IgG1,κ (카파) 항체로부터 유래될 수 있다.

한 실시양태에서, 제1 결합 아암은 모노클로날 항체로부터 유래될 수 있다.

한 실시양태에서, 상기 제1 중쇄는 임의로 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된 IgG 이소형의 것일 수 있다.

한 실시양태에서, 제1 결합 아암은, 임의로 HC의 불변 영역에서 1개 이상의 돌연변이, 예컨대 1 내지 10, 예컨대 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 돌연변이를 갖는, 서열식별번호: 118을 포함하는 HC 및 서열식별번호: 122를 포함하는 LC를 포함하는 항체로부터 유래될 수 있다.

한 실시양태에서, 제1 결합 아암은 서열식별번호: 118, 119 또는 120을 포함하는 HC 및 서열식별번호: 122를 포함하는 LC를 포함한다.

CD137에 대한 결합

본 발명에 따른 다중특이적 항체는 인간 CD137에 결합하는 제2 항원-결합 영역을 포함한다.

추가 실시양태에서, 제2 항원-결합 영역은 또한 시노몰구스 CD137에 결합한다.

한 실시양태에서, 상기 제2 항원-결합 영역은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다:

a) 서열식별번호: 10에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 10에서 최대 4개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR3, 및 서열식별번호: 12에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 12에서 최대 4개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR3 (CD137 클론 001),

b) 서열식별번호: 17에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 17에서 최대 4개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR3, 및 서열식별번호: 19에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 19에서 최대 4개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR3 (CD137 클론 002),

c) 서열식별번호: 24에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 24에서 최대 4개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR3, 및 서열식별번호: 26에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 26에서 최대 4개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR3 (CD137 클론 003),

d) 서열식별번호: 31에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 31에서 최대 4개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR3, 및 서열식별번호: 33에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 33에서 최대 4개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR3 (CD137 클론 004),

e) 서열식별번호: 38에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 38에서 최대 4개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR3, 및 서열식별번호: 40에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 40에서 최대 4개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR3 (CD137 클론 005),

f) 서열식별번호: 45에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 45에서 최대 4개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR3, 및 서열식별번호: 47에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 47에서 최대 4개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR3 (CD137 클론 006),

g) 서열식별번호: 52에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 52에서 최대 4개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR3, 및 서열식별번호: 54에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 54에서 최대 4개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR3 (CD137 클론 007),

h) 서열식별번호: 59에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 59에서 최대 4개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR3, 및 서열식별번호: 61에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 61에서 최대 4개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR3 (CD137 클론 008),

i) 서열식별번호: 66에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 66에서 최대 4개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR3, 및 서열식별번호: 68에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 68에서 최대 4개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR3 (CD137 클론 009),

j) 서열식별번호: 73에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 73에서 최대 4개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR3, 및 서열식별번호: 75에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 75에서 최대 4개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR3 (CD137 클론 010),

k) 서열식별번호: 80에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 80에서 최대 4개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR3, 및 서열식별번호: 82에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 82에서 최대 4개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR3 (CD137 클론 011),

l) 서열식별번호: 87에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 87에서 최대 4개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR3, 및 서열식별번호: 89에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 89에서 최대 4개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR3 (CD137 클론 012), 및

m) (i) a) 내지 l) 중 임의의 것에 따른 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 항체와 인간 CD137 결합에 대해 경쟁하고/거나 (ii) a) 내지 l) 중 임의의 것에 따른 중쇄 및 경쇄 가변 CDR3을 포함하는 항체의 CD137에 대한 특이성을 갖는 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR3.

추가 실시양태에서, 상기 제2 항원-결합 영역은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 및/또는 경쇄 영역 CDR1 및 CDR2를 추가로 포함한다:

a) 서열식별번호: 8에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 8에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, 및/또는 서열식별번호: 9에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 9에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR2, 및/또는 서열식별번호: 11에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 11에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, 및/또는 서열 KAS 또는 KAS에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR2 (CD137 클론 001),

b) 서열식별번호: 15에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 15에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, 및/또는 서열식별번호: 16에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 16에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR2, 및/또는 서열식별번호: 18에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 18에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, 및/또는 서열 KAS 또는 KAS에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR2 (CD137 클론 002),

c) 서열식별번호: 22에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 22에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, 및/또는 서열식별번호: 23에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 23에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR2, 및/또는 서열식별번호: 25에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 25에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, 및/또는 서열 RTS 또는 RTS에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR2 (CD137 클론 003),

d) 서열식별번호: 29에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 29에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, 및/또는 서열식별번호: 30에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 30에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR2, 및/또는 서열식별번호: 32에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 32에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, 및/또는 서열 GAS 또는 GAS에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR2 (CD137 클론 004),

e) 서열식별번호: 36에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 36에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, 및/또는 서열식별번호: 37에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 37에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR2, 및/또는 서열식별번호: 39에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 39에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, 및/또는 서열 SAS 또는 SAS에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR2 (CD137 클론 005),

f) 서열식별번호: 43에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 43에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, 및/또는 서열식별번호: 44에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 44에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR2, 및/또는 서열식별번호: 46에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 46에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, 및/또는 서열 AAS 또는 AAS에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR2 (CD137 클론 006),

g) 서열식별번호: 50에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 50에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, 및/또는 서열식별번호: 51에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 51에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR2, 및/또는 서열식별번호: 53에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 53에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, 및/또는 서열 KAS 또는 KAS에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR2 (CD137 클론 007),

h) 서열식별번호: 57에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 57에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, 및/또는 서열식별번호: 58에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 58에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR2, 및/또는 서열식별번호: 60에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 60에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, 및/또는 서열 RAS 또는 RAS에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR2 (CD137 클론 008),

i) 서열식별번호: 64에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 64에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, 및/또는 서열식별번호: 65에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 65에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR2, 및/또는 서열식별번호: 67에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 67에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, 및/또는 서열 GAS 또는 GAS에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR2 (CD137 클론 009),

j) 서열식별번호: 71에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 71에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, 및/또는 서열식별번호: 72에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 72에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR2, 및/또는 서열식별번호: 74에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 74에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, 및/또는 서열 KAS 또는 KAS에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR2 (CD137 클론 010),

k) 서열식별번호: 78에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 78에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, 및/또는 서열식별번호: 79에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 79에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR2, 및/또는 서열식별번호: 81에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 81에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, 및/또는 서열 DTS 또는 DTS에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR2 (CD137 클론 011), 및

l) 서열식별번호: 85에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 85에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, 및/또는 서열식별번호: 86에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 86에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR2, 및/또는 서열식별번호: 88에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 88에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, 및/또는 서열 SAS 또는 SAS에서 최대 2개의 아미노산이 변형된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR2 (CD137 클론 012).

한 실시양태에서 상기 제2 항원-결합 영역은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다:

a) 각각 서열식별번호: 8, 9 및 10에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 11, KAS 및 12에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 (CD137 클론 001),

b) 각각 서열식별번호: 15, 16 및 17에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 18, KAS 및 19에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 (CD137 클론 002),

c) 각각 서열식별번호: 22, 23, 및 24에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 25, RTS 및 26에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 (CD137 클론 003),

d) 각각 서열식별번호: 29, 30 및 31에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 32, GAS 및 33에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 (CD137 클론 004),

e) 각각 서열식별번호: 36, 37 및 38에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 39, SAS 및 40에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 (CD137 클론 005),

f) 각각 서열식별번호: 43, 44 및 45에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 46, AAS, 및 47에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 (CD137 클론 006),

g) 각각 서열식별번호: 50, 51 및 52에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 53, KAS 및 54에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 (CD137 클론 007),

h) 각각 서열식별번호: 57, 58 및 59에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 60, RAS 및 61에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 (CD137 클론 008),

i) 각각 서열식별번호: 64, 65 및 66에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 67, GAS 및 68에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 (CD137 클론 009),

j) 각각 서열식별번호: 71, 72 및 73에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 74, KAS 및 75에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 (CD137 클론 010),

k) 각각 서열식별번호: 78, 79 및 80에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 81, DTS 및 82에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 (CD137 클론 011),

l) 각각 서열식별번호: 85, 86 및 87에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 88, SAS 및 89에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 (CD137 클론 012),

m) 총 1 내지 12개의 돌연변이를 갖는 a) 내지 l) 중 임의의 것에 따른 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및

n) (i) a) 내지 m) 중 임의의 것에 따른 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체와 인간 CD137 결합에 대해 경쟁하고/거나 (ii) a) 내지 m) 중 임의의 것에 따른 중쇄 및 경쇄 가변 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체의 CD137에 대한 특이성을 갖는 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3.

따라서, 제2 항원-결합 영역은 표 1에 제시된 바와 같은 CD137 항체; 즉 CD137 클론 001, CD137 클론 002, CD137 클론 003, CD137 클론 004, CD137 클론 005, CD137 클론 006, CD137 클론 007, CD137 클론 008, CD137 클론 009, CD137 클론 010, CD137 클론 011 또는 CD137 클론 012의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함할 수 있다. 특히, 제2 항원-결합 영역은 동일한 CD137 항체 클론으로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함할 수 있고, 임의로 여기서 프레임워크 영역은, 비-인간 아미노산 서열로의 1개 이상의 아미노산 복귀돌연변이를 임의로 포함하는, 주로 인간 프레임워크 영역이다.

추가 실시양태에서, 제2 항원-결합 영역은 (i) a) 내지 m) 중 임의의 것에 따른 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체와 인간 CD137 결합에 대해 경쟁하고/거나 (ii) a) 내지 m) 중 임의의 것에 따른 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체의 CD137에 대한 특이성을 갖는 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.

한 실시양태에서, 상기 제2 항원-결합 영역은 돌연변이체 인간 CD137 (서열식별번호: 93)에 결합하는 것보다 더 높은 정도로 인간 CD137 (서열식별번호: 92)에 결합한다. 서열식별번호: 93의 돌연변이체 인간 CD137은 또한 본원에서 셔플 6으로 지칭된다.

또 다른 실시양태에서, 상기 제2 항원-결합 영역은 돌연변이체 인간 CD137 (서열식별번호: 94)에 결합하는 것보다 더 높은 정도로 인간 CD137 (서열식별번호: 92)에 결합한다. 서열식별번호: 94의 돌연변이체 인간 CD137은 또한 본원에서 셔플 5로 지칭된다.

추가 실시양태에서, 상기 제2 항원-결합 영역은 돌연변이체 인간 CD137 (서열식별번호: 95)에 결합하는 것과 동일한 정도로 인간 CD137 (서열식별번호: 92)에 결합한다. 서열식별번호: 95의 돌연변이체 인간 CD137은 또한 본원에서 셔플 4로 지칭된다.

본 발명과 관련하여 "더 높은 정도로"는 제2 항원-결합 영역의 친화도가 돌연변이체 인간 CD137 (서열식별번호: 93 및 94, 각각 셔플 6 및 5)에 대한 것보다 인간 CD137 (서열식별번호: 92)에 대해 더 높다는 것을 의미한다. 돌연변이체 CD137에 대해 어떠한 결합도 존재하지 않으면, 인간 CD137에 대한 친화도는 상기 돌연변이체 CD137에 대한 것보다 무한하게 더 높을 것이다. 그러나, 상기 돌연변이체 CD137에 결합하는 경우에 친화도는 각각의 돌연변이체 CD137에 대한 것보다 인간 CD137에 대해 2-배, 예컨대 3-배, 또는 4-배, 또는 5-배, 또는 6-배 더 높을 수 있다.

본 발명과 관련하여 "동일한 정도로"는 제2 항원-결합 영역의 친화도가 인간 CD137 (서열식별번호: 92) 및 돌연변이체 인간 CD137 (서열식별번호: 95, 셔플 4)에 대해 유사하다는 것을 의미한다. 특히, 이와 관련하여 "유사한"은 인간 CD137에 대한 친화도 및 상기 돌연변이체 CD137에 대한 친화도가 최대 2.5-배, 예컨대 2.2-배, 또는 2.0-배, 또는 1.8-배, 또는 1.75-배 또는 1.5-배만큼 상이하다는 것을 의미할 수 있다.

서열식별번호: 93의 돌연변이체 인간 CD137은 아미노산 24-47 (셔플 6)이 멧돼지 CD137로부터의 상응하는 아미노산에 의해 대체된 인간 CD137의 아미노산 서열에 상응한다.

따라서, 한 실시양태에서, 제2 항원-결합 영역은 서열식별번호: 92의 위치 24-47의 아미노산 L, Q, D, P, C, S, N, C, P, A, G, T, F, C, D, N, N, R, N, Q, I, C, S 및 P (서열식별번호: 129에 상응함) 중 1개 이상을 포함하거나 이를 필요로 하는 인간 CD137의 에피토프에 결합한다.

서열식별번호: 94의 돌연변이체 인간 CD137은 아미노산 48-88 (셔플 5)이 아프리카 코끼리 CD137로부터의 상응하는 아미노산에 의해 대체된 인간 CD137의 아미노산 서열에 상응한다.

따라서, 한 실시양태에서, 제2 항원-결합 영역은 서열식별번호: 92의 위치 48-88의 아미노산 C, P, P, N, S, F, S, S, A, G, G, Q, R, T, C, D, I, C, R, Q, C, K, G, V, F, R, T, R, K, E, C, S, S, T, S, N, A, E, C, D 및 C (서열식별번호: 130에 상응함) 중 1개 이상을 포함하거나 이를 필요로 하는 인간 CD137의 에피토프에 결합한다.

서열식별번호: 95의 돌연변이체 인간 CD137은 아미노산 59-114 (셔플 4)이 아프리카 코끼리 CD137로부터의 상응하는 아미노산에 의해 대체된 인간 CD137의 아미노산 서열에 상응한다.

따라서, 한 실시양태에서, 제2 항원-결합 영역은 서열식별번호: 92의 위치 89-114의 아미노산 T, P, G, F, H, C, L, G, A, G, C, S, M, C, E, Q, D, C, K, Q, G, Q, E, L, T 및 K (서열식별번호: 131에 상응함) 중 1개 이상을 포함하거나 이를 필요로 하는 인간 CD137의 에피토프에 결합하지 않는다.

한 실시양태에서, 돌연변이체 및 인간 CD137에 대한 결합은 실시예 2에 기재된 셔플 검정으로서 수행될 수 있다. 따라서, 인간 CD137 (서열식별번호: 92) 및 돌연변이체 인간 CD137 (서열식별번호: 93, 94 및 95)에 대한 결합은, 참조 구축물로서 인간 CD137 및 상이한 종의 CD137을 사용하여 상이한 종으로부터의 CD137의 상응하는 도메인에 의해 인간 CD137의 단백질 도메인이 대체된 인간 CD137로부터 유래된 셔플 구축물을 제조하고; 각각 참조 구축물 또는 셔플 구축물을 코딩하는 플라스미드로 세포를 형질도입하고, 유동 세포측정법, 예컨대 FACS에 의해 각각의 이들 CD137 구축물에 대한 항체의 결합을 측정함으로써 결정될 수 있다.

특정 셔플 구축물에 대한 결합의 상실은 상응하는 영역이 항체 에피토프에 수반될 가능성이 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 항-인간 CD137 항체의 에피토프에 기여하는 인간 CD137의 단백질 도메인은 셔플 검정에 의해 결정될 수 있다. 셔플 구축물을 제조하는데 사용되는 상이한 종의 CD137은 모노클로날 항-인간 CD137 항체가 이들 상이한 종으로부터의 전체 CD137 단백질 (참조 구축물)에 결합하지 않도록 선택되어야 한다.

인간 CD137 및 그의 돌연변이체에 대한 결합의 결정은 특히 본 발명에 따른 2개의 제2 항원-결합 영역을 포함하는 모노클로날 항체에 의해 수행될 수 있다.

한 실시양태에서, 상기 제2 항원-결합 영역은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다:

c) 각각 서열식별번호: 36, 37 및 38에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 39, SAS 및 40에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 (CD137 클론 005),

d) 각각 서열식별번호: 43, 44 및 45에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 46, AAS 및 47에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 (CD137 클론 006),

e) 각각 서열식별번호: 64, 65 및 66에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 67, GAS 및 68에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 (CD137 클론 009),

f) 각각 서열식별번호: 71, 72 및 73에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 74, KAS 및 75에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 (CD137 클론 010),

g) 각각 서열식별번호: 85, 86 및 87에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 88, SAS 및 89에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 (CD137 클론 012),

h) 총 1 내지 12개의 돌연변이를 갖는 a) 내지 g) 중 임의의 것에 따른 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및

i) (i) a) 내지 h) 중 임의의 것에 따른 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체와 인간 CD137 결합에 대해 경쟁하고/거나 (ii) a) 내지 h) 중 임의의 것에 따른 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체의 CD137에 대한 특이성을 갖는 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3.

따라서, 한 실시양태에서, 상기 제2 항원-결합 영역은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다:

a) 각각 서열식별번호: 64, 65 및 66에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 67, GAS 및 68에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 (CD137 클론 009),

b) 총 1 내지 12개의 돌연변이를 갖는 a)에 따른 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3;

c) (i) a) 또는 b)에 따른 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체와 인간 CD137 결합에 대해 경쟁하고/거나 (ii) a) 또는 b)에 따른 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체의 CD137에 대한 특이성을 갖는 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3.

또 다른 실시양태에서, 상기 제2 항원-결합 영역은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다:

a) 각각 서열식별번호: 36, 37 및 38에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 39, SAS 및 40에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 (CD137 클론 005),

b) 총 1 내지 12개의 돌연변이를 갖는 a)에 따른 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및

특정한 실시양태에서, 상기 제2 항원-결합 영역은 각각 서열식별번호: 64, 65 및 66에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 67, GAS 및 68에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 이러한 항체의 예는 본원에서 CD137 클론 009로 지칭되는 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

또 다른 실시양태에서, 상기 제2 항원-결합 영역은 각각 서열식별번호: 36, 37 및 38에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 39, SAS 및 40에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 이러한 항체의 예는 본원에서 CD137 클론 005로 지칭되는 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

또 다른 실시양태에서, 상기 제2 항원-결합 영역은 총 1 내지 12개의 돌연변이, 예컨대 1 내지 10개의 돌연변이, 또는 1 내지 8개의 돌연변이, 또는 1 내지 6개의 돌연변이, 또는 1 내지 4개의 돌연변이, 또는 1 내지 2개의 돌연변이를 갖는, 각각 서열식별번호: 64, 65 및 66에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 67, GAS 및 68에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 (CD137 클론 009)을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 상기 제2 항원-결합 영역은 총 1 내지 12개의 돌연변이, 예컨대 1 내지 10개의 돌연변이, 또는 1 내지 8개의 돌연변이, 또는 1 내지 6개의 돌연변이, 또는 1 내지 4개의 돌연변이, 또는 1 내지 2개의 돌연변이를 갖는, 각각 서열식별번호: 36, 37 및 38에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 39, SAS 및 40에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 (CD137 클론 005)을 포함한다.

한 실시양태에서, 상기 돌연변이는 각각의 VH 및 VL CDR3이 최대 3개의 돌연변이를 포함하고 각각의 VH 및 VL CDR2 및 CDR1이 최대 2개의 아미노산 변형을 포함하도록 VH CDR1, 2 및 3 및 VL CDR 1, 2 및 3에 걸쳐 분포될 수 있다.

따라서, 추가 실시양태에서, 제2 항원-결합 영역은 총 1 내지 12개의 돌연변이를 갖는, 각각 서열식별번호: 64, 65, 66, 67, GAS 및 68에 제시된 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하며 (CD137 클론 009), 여기서 VH 및 VL CDR3은 각각 최대 3개의 아미노산 변형을 포함하고, VH 및 VL CDR1 및 CDR2는 각각 최대 2개의 아미노산 변형을 포함한다.

추가 실시양태에서, 제2 항원-결합 영역은 총 1 내지 10개 예컨대 1 내지 8개의 돌연변이를 갖는, 각각 서열식별번호: 64, 65, 66, 67, GAS 및 68에 제시된 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하며 (CD137 클론 009), 여기서 VH 및 VL CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 최대 2개의 아미노산 변형을 포함한다.

추가 실시양태에서, 제2 항원-결합 영역은 총 1 내지 6개의 돌연변이를 갖는, 각각 서열식별번호: 64, 65, 66, 67, GAS 및 68에 제시된 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하며 (CD137 클론 009), 여기서 VH 및 VL CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 최대 1개의 아미노산 변형을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 제2 항원-결합 영역은 총 1 내지 12개의 돌연변이를 갖는, 각각 서열식별번호: 36, 37, 38, 39, SAS 및 40에 제시된 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하며 (CD137 클론 005), 여기서 VH 및 VL CDR3은 각각 최대 3개의 아미노산 변형을 포함하고, VH 및 VL CDR1 및 CDR2는 각각 최대 2개의 아미노산 변형을 포함한다.

추가 실시양태에서, 제2 항원-결합 영역은 총 1 내지 10개 예컨대 1 내지 8개의 돌연변이를 갖는, 각각 서열식별번호: 36, 37, 38, 39, SAS 및 40에 제시된 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하며 (CD137 클론 005), 여기서 VH 및 VL CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 최대 2개의 아미노산 변형을 포함한다.

추가 실시양태에서, 제2 항원-결합 영역은 총 1 내지 6개의 돌연변이를 갖는, 각각 서열식별번호: 36, 37, 38, 39, SAS 및 40에 제시된 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하며 (CD137 클론 005), 여기서 VH 및 VL CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 최대 1개의 아미노산 변형을 포함한다.

추가 실시양태에서, 총 1 내지 12개의 돌연변이; 예컨대 1 내지 10개의 돌연변이, 또는 1 내지 8개의 돌연변이, 또는 1 내지 6개의 돌연변이, 또는 1 내지 4개의 돌연변이, 또는 1 내지 2개의 돌연변이가 존재할 수 있고; 각각의 CDR 서열은 최대 2개의 아미노산 치환을 포함한다.

예를 들어 항체의 그의 표적 항원에 대한 친화도를 증가시키기 위해, 또는 인간의 치료에 사용될 비-인간 항체의 면역원성을 감소시키기 위해, 예를 들어 아미노산 치환에 의해; 돌연변이를 도입하는 방법 및 CDR 서열의 어떠한 특정 아미노산이 돌연변이될 수 있는 지는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 이러한 돌연변이는 항체가 결합하는 표적 항원의 에피토프에 영향을 미치지 않고 도입될 수 있다.

한 실시양태에서 상기 제2 항원-결합 영역은 제2 중쇄 가변 (VH) 서열 및 제2 경쇄 가변 (VL) 서열을 포함하고, 여기서 상기 가변 서열 각각은, 각각 3개의 CDR 서열, CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다.

한 실시양태에서, 상기 제2 항원-결합 영역은 제2 중쇄 가변 (VH) 서열 및 제2 경쇄 가변 (VL) 서열을 포함하고, 여기서 상기 가변 서열 각각은, 각각 3개의 CDR 서열, CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 4개의 프레임워크 서열, FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함한다.

한 실시양태에서, 제2 항원-결합 영역의 상기 VH 서열은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다:

a) 서열식별번호: 123에 제시된 VH 서열 (인간화 CD137 클론 009)

b) 서열식별번호: 13에 제시된 VH 서열 (CD137 클론 001)

c) 서열식별번호: 20에 제시된 VH 서열 (CD137 클론 002)

d) 서열식별번호: 27에 제시된 VH 서열 (CD137 클론 003)

e) 서열식별번호: 34에 제시된 VH 서열 (CD137 클론 004)

f) 서열식별번호: 41에 제시된 VH 서열 (CD137 클론 005)

g) 서열식별번호: 48에 제시된 VH 서열 (CD137 클론 006)

h) 서열식별번호: 55에 제시된 VH 서열 (CD137 클론 007)

i) 서열식별번호: 62에 제시된 VH 서열 (CD137 클론 008)

j) 서열식별번호: 69에 제시된 VH 서열 (CD137 클론 009)

k) 서열식별번호: 76에 제시된 VH 서열 (CD137 클론 010)

l) 서열식별번호: 83에 제시된 VH 서열 (CD137 클론 011)

m) 서열식별번호: 90에 제시된 VH 서열 (CD137 클론 012)

한 실시양태에서, 제2 항원-결합 영역의 상기 VL 서열은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다:

a) 서열식별번호: 127에 제시된 VL 서열 (인간화 CD137 클론 009)

b) 서열식별번호: 14에 제시된 VL 서열 (CD137 클론 001)

c) 서열식별번호: 21에 제시된 VL 서열 (CD137 클론 002)

d) 서열식별번호: 28에 제시된 VL 서열 (CD137 클론 003)

e) 서열식별번호: 35에 제시된 VL 서열 (CD137 클론 004)

f) 서열식별번호: 42에 제시된 VL 서열 (CD137 클론 005)

g) 서열식별번호: 49에 제시된 VL 서열 (CD137 클론 006)

h) 서열식별번호: 56에 제시된 VL 서열 (CD137 클론 007)

i) 서열식별번호: 63에 제시된 VL 서열 (CD137 클론 008)

j) 서열식별번호: 70에 제시된 VL 서열 (CD137 클론 009)

k) 서열식별번호: 77에 제시된 VL 서열 (CD137 클론 010)

l) 서열식별번호: 84에 제시된 VL 서열 (CD137 클론 011)

m) 서열식별번호: 91에 제시된 VL 서열 (CD137 클론 012)

한 실시양태에서, 제2 항원-결합 영역의 상기 VH 및 VL 서열은 각각 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다:

a) 서열식별번호: 123에 제시된 VH 서열 및 서열식별번호: 127에 제시된 VL 서열 (인간화 CD137 클론 009)

b) 서열식별번호: 13에 제시된 VH 서열 및 서열식별번호: 14에 제시된 VL 서열 (CD137 클론 001)

c) 서열식별번호: 20에 제시된 VH 서열 및 서열식별번호: 21에 제시된 VL 서열 (CD137 클론 002)

d) 서열식별번호: 27에 제시된 VH 서열 및 서열식별번호: 28에 제시된 VL 서열 (CD137 클론 003)

e) 서열식별번호: 34에 제시된 VH 서열 및 서열식별번호: 35에 제시된 VL 서열 (CD137 클론 004)

f) 서열식별번호: 41에 제시된 VH 서열 및 서열식별번호: 42에 제시된 VL 서열 (CD137 클론 005)

g) 서열식별번호: 48에 제시된 VH 서열 및 서열식별번호: 49에 제시된 VL 서열 (CD137 클론 006)

h) 서열식별번호: 55에 제시된 VH 서열 및 서열식별번호: 56에 제시된 VL 서열 (CD137 클론 007)

i) 서열식별번호: 62에 제시된 VH 서열 및 서열식별번호: 63에 제시된 VL 서열 (CD137 클론 008)

j) 서열식별번호: 69에 제시된 VH 서열 및 서열식별번호: 70에 제시된 VL 서열 (CD137 클론 009)

k) 서열식별번호: 76에 제시된 VH 서열 및 서열식별번호: 77에 제시된 VL 서열 (CD137 클론 010)

l) 서열식별번호: 83에 제시된 VH 서열 및 서열식별번호: 84에 제시된 VL 서열 (CD137 클론 011)

m) 서열식별번호: 90에 제시된 VH 서열 및 서열식별번호: 91에 제시된 VL 서열 (CD137 클론 012).

한 실시양태에서, 제2 항원-결합 영역의 상기 VH 서열은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다:

a) 서열식별번호: 123에 제시된 VH 서열 (인간화 CD137 클론 009)

b) 서열식별번호: 41에 제시된 VH 서열 (CD137 클론 005)

c) 서열식별번호: 69에 제시된 VH 서열 (CD137 클론 009)

a) 서열식별번호: 127에 제시된 VL 서열 (인간화 CD137 클론 009)

b) 서열식별번호: 42에 제시된 VL 서열 (CD137 클론 005)

c) 서열식별번호: 70에 제시된 VL 서열 (CD137 클론 009)

b) 서열식별번호: 41에 제시된 VH 서열 및 서열식별번호: 42에 제시된 VL 서열 (CD137 클론 005)

c) 서열식별번호: 69에 제시된 VH 서열 및 서열식별번호: 70에 제시된 VL 서열 (CD137 클론 009)

한 실시양태에서, 제2 항원-결합 영역의 상기 VH 서열은 서열식별번호: 41에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열 (CD137 클론 005)을 포함한다.

한 실시양태에서, 제2 항원-결합 영역의 상기 VH 서열은 서열식별번호: 69에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열 (CD137 클론 009)을 포함한다.

한 실시양태에서, 제2 항원-결합 영역의 상기 VH 서열은 서열식별번호: 123에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열 (인간화 CD137 클론 009)을 포함한다.

한 실시양태에서, 제2 항원-결합 영역의 상기 VL 서열은 서열식별번호: 42에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열 (CD137 클론 005)을 포함한다.

한 실시양태에서, 제2 항원-결합 영역의 상기 VL 서열은 서열식별번호: 70에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열 (CD137 클론 009)을 포함한다.

한 실시양태에서 제2 항원-결합 영역의 상기 VL 서열은 서열식별번호: 127에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열 (인간화 CD137 클론 009)을 포함한다.

한 실시양태에서, 제2 항원-결합 영역의 상기 VH 및 상기 VL 서열은 각각 서열식별번호: 41 및 서열식별번호: 42에 대해 각각 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열 (CD137 클론 005)을 포함한다.

한 실시양태에서, 제2 항원-결합 영역의 상기 VH 및 VL 서열은 각각 서열식별번호: 69 및 서열식별번호: 70에 대해 각각 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열 (CD137 클론 009)을 포함한다.

한 실시양태에서, 제2 항원-결합 영역의 상기 VH 및 VL 서열은 각각 서열식별번호: 123 및 서열식별번호: 127에 대해 각각 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열 (인간화 CD137 클론 009)을 포함한다.

한 실시양태에서, 상기 VH 및 VL 서열은 단지 프레임워크 서열에서만 벗어난다.

한 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 항원-결합 영역의 VH 및 VL 서열의 각각의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 프레임워크 서열은 상기 VH 및 VL 서열의 각각의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 프레임워크 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는다.

한 실시양태에서, VH 및 VL 서열은, 각각 서열식별번호: 41 및 42에 제시된 바와 같이, 단지 비-CDR 서열에서만 벗어난다 (CD137 클론 005).

한 실시양태에서 VH 및 VL 서열은, 각각 서열식별번호: 69 및 70에 제시된 바와 같이, 단지 비-CDR 서열에서만 벗어난다 (CD137 클론 009).

한 실시양태에서 VH 및 VL 서열은, 각각 서열식별번호: 123 및 127에 제시된 바와 같이, 단지 비-CDR 서열에서만 벗어난다 (인간화 CD137 클론 009).

한 실시양태에서, VH 및 VL 서열은, 단지 프레임워크 서열에서만 벗어난다.

한 실시양태에서, 제2 항원-결합 영역의 VH 및 VL 서열의 각각의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 프레임워크 서열은 서열식별번호: 41에 제시된 바와 같은 VH 서열, 및 서열식별번호: 42에 제시된 바와 같은 VL 서열의 각각의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 프레임워크 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는다.

한 실시양태에서, 제2 항원-결합 영역의 VH 및 VL 서열의 각각의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 프레임워크 서열은 서열식별번호: 41에 제시된 바와 같은 VH 서열, 및 서열식별번호: 42에 제시된 바와 같은 VL 서열의 각각의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 프레임워크 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖고, 제2 항원-결합 영역의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 36, 37, 38, 39, SAS 및 40에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3과 비교하여 총 1 내지 12개의 돌연변이를 갖는다. 추가 실시양태에서 상기 돌연변이는 상기 기재된 바와 같을 수 있다.

추가 실시양태에서, 제2 항원-결합 영역의 VH 및 VL 서열의 각각의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 프레임워크 서열은 서열식별번호: 41에 제시된 바와 같은 VH 서열, 및 서열식별번호: 42에 제시된 바와 같은 VL 서열의 각각의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 프레임워크 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖고, 제2 항원-결합 영역은 각각 서열식별번호: 36, 37, 38, 39, SAS 및 40에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다.

한 실시양태에서 제2 항원-결합 영역의 VH 및 VL 서열의 각각의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 프레임워크 서열은 서열식별번호: 69에 제시된 바와 같은 VH 서열, 및 서열식별번호: 70에 제시된 바와 같은 VL 서열의 각각의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 프레임워크 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는다.

한 실시양태에서 제2 항원-결합 영역의 VH 및 VL 서열의 각각의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 프레임워크 서열은 서열식별번호: 69에 제시된 바와 같은 VH 서열, 및 서열식별번호: 70에 제시된 바와 같은 VL 서열의 각각의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 프레임워크 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖고, 제2 항원-결합 영역의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 64, 65, 66, 67, GAS 및 68에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3과 비교하여 총 1 내지 12개의 돌연변이를 갖는다. 추가 실시양태에서 상기 돌연변이는 상기 기재된 바와 같을 수 있다.

추가 실시양태에서 제2 항원-결합 영역의 VH 및 VL 서열의 각각의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 프레임워크 서열은 서열식별번호: 69에 제시된 바와 같은 VH 서열, 및 서열식별번호: 70에 제시된 바와 같은 VL 서열의 각각의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 프레임워크 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖고, 제2 항원-결합 영역은 각각 서열식별번호: 64, 65, 66, 67, GAS 및 68에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다.

한 실시양태에서, 제2 항원-결합 영역의 VH 및 VL 서열의 각각의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 프레임워크 서열은 서열식별번호: 123에 제시된 바와 같은 VH 서열, 및 서열식별번호: 127에 제시된 바와 같은 VL 서열의 각각의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 프레임워크 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는다.

한 실시양태에서 제2 항원-결합 영역의 VH 및 VL 서열의 각각의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 프레임워크 서열은 서열식별번호: 123에 제시된 바와 같은 VH 서열, 및 서열식별번호: 127에 제시된 바와 같은 VL 서열의 각각의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 프레임워크 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖고, 제2 항원-결합 영역의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 64, 65, 66, 67, GAS 및 68에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3과 비교하여 총 1 내지 12개의 돌연변이를 갖는다. 추가 실시양태에서 상기 돌연변이는 상기 기재된 바와 같을 수 있다.

추가 실시양태에서 제2 항원-결합 영역의 VH 및 VL 서열의 각각의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 프레임워크 서열은 서열식별번호: 123에 제시된 바와 같은 VH 서열, 및 서열식별번호: 127에 제시된 바와 같은 VL 서열의 각각의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 프레임워크 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖고, 제2 항원-결합 영역은 각각 서열식별번호: 64, 65, 66, 67, GAS 및 68에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다.

한 실시양태에서, 제2 항원-결합 영역의 상기 VH 서열은 서열식별번호: 123을 포함한다 (인간화 CD137 클론 009).

한 실시양태에서, 제2 항원-결합 영역의 상기 VL 서열은 서열식별번호: 127을 포함한다 (인간화 CD137 클론 009).

한 실시양태에서, 제2 항원-결합 영역의 상기 VH 및 VL 서열은 각각 서열식별번호: 123 및 서열식별번호: 127을 포함한다.

한 실시양태에서, 제2 항원-결합 영역의 상기 VH 서열은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 서열을 포함한다:

a) 서열식별번호: 41 (CD137 클론 005)

b) 서열식별번호: 69 (CD137 클론 009)

한 실시양태에서, 제2 항원-결합 영역의 상기 VL 서열은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 VL 서열을 포함한다:

a) 서열식별번호: 42 (CD137 클론 005)

b) 서열식별번호: 70 (CD137 클론 009)

한 실시양태에서, 제2 항원-결합의 상기 VH 및 VL 서열은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:

a) 서열식별번호: 41에 제시된 VH 서열 및 서열식별번호: 42에 제시된 VL 서열 (CD137 클론 005),

b) 서열식별번호: 69에 제시된 VH 서열 및 서열식별번호: 70에 제시된 VL 서열 (CD137 클론 009).

한 실시양태에서, 본 발명에 따른 다중특이적 항체는 상기 제2 항원-결합 영역을 포함하는 제2 결합 아암을 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명에 따른 다중특이적 항체는 상기 제2-항원-결합 영역 및 제2 중쇄 불변 서열을 포함하는 제2 결합 아암을 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명에 따른 다중특이적 항체는 상기 제2 항원-결합 영역을 포함하는 제2 결합 아암을 포함하며, 여기서 제2 결합 아암은 제2 중쇄 가변 (VH) 서열 및 제2 중쇄 불변 (CH) 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 제2 경쇄 가변 (VL) 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함한다.

한 실시양태에서 상기 제2 경쇄는 추가로 제2 경쇄 불변 서열을 포함한다.

추가 실시양태에서, 상기 제2 중쇄는 적어도 힌지 영역, CH2 및 CH3 영역을 포함한다.

구체적 실시양태에서, 본 발명에 따른 다중특이적 항체는 상기 제2 항원-결합 영역을 포함하는 제2 Fab-아암을 포함한다.

한 실시양태에서, 제2 항원-결합 영역은 토끼 항체, 예컨대 본원에 개시된 항-CD137 클론 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12 중 임의의 것, 특히 클론 5 및 9 중 임의의 것으로부터 유래된다.

한 실시양태에서, 제2 항원-결합 영역은 키메라 항체, 예컨대 본원에 개시된 항-CD137 클론 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12 중 임의의 것, 특히 클론 5 및 9 중 임의의 것으로부터의 가변 영역을 포함하는 항체로부터 유래된다.

한 실시양태에서, 제2 항원-결합 영역은 인간화 항체로부터 유래된다.

한 실시양태에서, 제2 결합 아암은 전장 항체로부터 유래된다.

한 실시양태에서 제2 결합 아암은 전장 IgG1,λ (람다) 또는 IgG1,κ (카파) 항체로부터 유래된다.

한 실시양태에서, 제2 결합 아암은 모노클로날 항체로부터 유래된다.

한 실시양태에서, 상기 제2 중쇄는, 임의로 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된 하위부류를 갖는, IgG 이소형의 것이다.

한 실시양태에서, 제1 결합 아암은 서열식별번호: 124를 포함하는 HC 및 서열식별번호: 128을 포함하는 LC를 포함하는 항체로부터 유래될 수 있고, 임의로 HC의 불변 영역에 1개 이상의 돌연변이, 예컨대 1 내지 10, 예컨대 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 돌연변이가 존재한다.

한 실시양태에서, 제1 결합 아암은 서열식별번호: 124, 125 또는 126을 포함하는 HC 및 서열식별번호: 128을 포함하는 LC를 포함한다.

CD40 및 CD137에 대한 결합

일부 실시양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 다중특이적 항체에 관한 것이다:

(I) 인간 CD40에 결합하며,

으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 제1 항원-결합 영역, 및

(II) 인간 CD137에 결합하며,

x) 각각 서열식별번호: 64, 65 및 66에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 67, GAS 및 68에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 (CD137 클론 009),

y) 총 1 내지 12개의 돌연변이를 갖는 x)에 따른 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3; 및

z) (i) x) 또는 y)에 따른 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체와 인간 CD137 결합에 대해 경쟁하고/거나 (ii) x) 또는 y)에 따른 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체의 CD137에 대한 특이성을 갖는 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3

으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 제2 항원-결합 영역.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 다중특이적 항체에 관한 것이다:

(I) 인간 CD40에 결합하며,

(II) 인간 CD137에 결합하며,

x) 각각 서열식별번호: 36, 37 및 38에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 39, SAS 및 40에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 (CD137 클론 005),

따라서, 한 실시양태에서, 상기 제1 항원-결합 영역은 각각 서열식별번호: 1, 2 및 3에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 4, YTS 및 5에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고; 상기 제2 항원-결합 영역은

a) 각각 서열식별번호: 64, 65 및 66에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 67, GAS 및 68에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 (CD136 클론 009), 또는

b) 각각 서열식별번호: 36, 37 및 38에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 39, SAS 및 40에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 (CD137 클론 005)

을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 상기 제1 항원-결합 영역은 각각 서열식별번호: 1, 2 및 3에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 4, YTS 및 5에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고; 상기 제2 항원-결합 영역은 각각 서열식별번호: 64, 65 및 66에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 67, GAS 및 68에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다 (CD137 클론 009).

또 다른 실시양태에서 상기 제1 항원-결합 영역은 각각 서열식별번호: 1, 2 및 3에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 4, YTS 및 5에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고; 상기 제2 항원-결합 영역은 각각 서열식별번호: 36, 37 및 38에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 39, SAS 및 40에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다 (CD137 클론 005).

추가 실시양태에서, 본 발명에 따른 다중특이적 항체의 상기 제1 항원-결합 영역은 제1 중쇄 가변 (VH) 서열 및 제1 경쇄 가변 (VL) 서열을 포함하고, 본 발명에 따른 다중특이적 항체의 상기 제2 항원-결합 영역은 제2 중쇄 가변 (VH) 서열 및 제2 경쇄 가변 (VL) 서열을 포함하고, 여기서 상기 가변 서열 각각은 각각 3개의 CDR 서열, CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 4개의 프레임워크 서열, FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함한다.

추가 실시양태에서 제1 항원-결합 영역의 상기 VH 및 VL 서열 각각은 각각 서열식별번호: 6에 제시된 바와 같은 VH 서열, 및 서열식별번호: 7에 제시된 바와 같은 VL 서열의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 제2 항원-결합 영역의 상기 VH 및 상기 VL 서열 각각은 각각 서열식별번호: 41에 제시된 바와 같은 VH 서열 및 서열식별번호: 42에 제시된 바와 같은 VL 서열의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다 (CD137 클론 005).

또 다른 추가 실시양태에서, 제1 항원-결합 영역의 상기 VH 및 VL 서열 각각은 각각 서열식별번호: 6에 제시된 바와 같은 VH 서열 및 서열식별번호: 7에 제시된 바와 같은 VL 서열의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 제2 항원-결합 영역의 상기 VH 및 상기 VL 서열 각각은 각각 서열식별번호: 69에 제시된 바와 같은 VH 서열 및 서열식별번호: 70에 제시된 바와 같은 VL 서열의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다 (CD137 클론 009).

또 다른 추가 실시양태에서, 제1 항원-결합 영역의 상기 VH 및 VL 서열 각각은 각각 서열식별번호: 117에 제시된 바와 같은 VH 서열 및 서열식별번호: 121에 제시된 바와 같은 VL 서열의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 제2 항원-결합 영역의 상기 VH 및 상기 VL 서열 각각은 각각 서열식별번호: 123에 제시된 바와 같은 VH 서열 및 서열식별번호: 127에 제시된 바와 같은 VL 서열의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함한다 (인간화 CD137 클론 009).

특정한 실시양태에서, 본 발명은

(I) 제1 중쇄 가변 (VH) 서열 및 제1 중쇄 불변 (CH) 서열을 포함하는 제1 중쇄, 및 제1 경쇄 가변 (VL) 서열 및 제1 경쇄 불변 (CL) 서열을 포함하는 제1 경쇄를 포함하며, 여기서 상기 제1 중쇄 가변 서열은 각각 서열식별번호: 1, 2 및 3에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, 상기 제1 경쇄 서열은 각각 서열식별번호: 4, YTS 및 5에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 것인 제1 결합 아암, 및

(II) 제2 중쇄 가변 (VH) 서열 및 제2 중쇄 불변 (CH) 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 제2 경쇄 불변 (CL) 서열 및 제2 경쇄 가변 (VL) 서열을 추가로 포함하는 제2 경쇄를 포함하며, 여기서 상기 제2 중쇄 가변 서열은 각각 서열식별번호: 64, 65 및 66에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, 상기 제2 경쇄 서열은 각각 서열식별번호: 67, GAS 및 68에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 것인 제2 결합 아암 (CD137 클론 009)

을 포함하는 이중특이적 항체에 관한 것이며;

여기서 제1 및 제2 중쇄는 인간 IgG1 이소형의 것이고, 제1 및 제2 경쇄는 IgG1,κ의 것이고, 제1 및 제2 불변 중쇄 둘 다의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234, L235, 및 D265에 상응하는 위치는 각각 F, E, 및 A이고, 여기서 (a) 제1 불변 중쇄의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 F405에 상응하는 위치는 L이고, 제2 불변 중쇄의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 K409에 상응하는 위치는 R이거나; 또는 (b) 제1 불변 중쇄의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 K409에 상응하는 위치는 R이고, 제2 불변 중쇄의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 F405에 상응하는 위치는 L이다.

추가의 특정한 실시양태에서, 본 발명은

(II) 제2 중쇄 가변 (VH) 서열 및 제2 중쇄 불변 (CH) 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 제2 경쇄 불변 (CL) 서열 및 제2 경쇄 가변 (VL) 서열을 추가로 포함하는 제2 경쇄를 포함하며, 여기서 상기 제2 중쇄 가변 서열은 각각 서열식별번호: 36, 37 및 38에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, 상기 제2 경쇄 서열은 각각 서열식별번호: 39, SAS 및 40에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 것인 제2 결합 아암 (CD137 클론 005)

을 포함하는 이중특이적 항체에 관한 것이며;

구체적 실시양태에서, 본 발명은

(I) 제1 중쇄 가변 (VH) 서열 및 제1 중쇄 불변 (CH) 서열을 포함하는 제1 중쇄, 및 제1 경쇄 가변 (VL) 서열 및 제1 경쇄 불변 (CL) 서열을 포함하는 제1 경쇄를 포함하며, 여기서 상기 제1 VH 및 VL 서열 각각은 각각 서열식별번호: 117에 제시된 바와 같은 VH 서열 및 서열식별번호: 121에 제시된 바와 같은 VL 서열의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 제1 결합 아암, 및

(II) 제2 중쇄 가변 (VH) 서열 및 제2 중쇄 불변 (CH) 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 제2 경쇄 불변 (CL) 서열 및 제2 경쇄 가변 (VL) 서열을 추가로 포함하는 제2 경쇄를 포함하며, 여기서 상기 제2 VH 및 VL 서열은 각각 서열식별번호: 123에 제시된 바와 같은 VH 서열 및 서열식별번호: 127에 제시된 바와 같은 VL 서열의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 제2 결합 아암 (인간화 CD137 클론 009)

을 포함하는 이중특이적 항체에 관한 것이다.

추가의 구체적 실시양태에서, 본 발명은

(I) 제1 중쇄 가변 (VH) 서열 및 제1 중쇄 불변 (CH) 서열을 포함하는 제1 중쇄, 및 제1 경쇄 가변 (VL) 서열 및 제1 경쇄 불변 (CL) 서열을 포함하는 제1 경쇄를 포함하며, 여기서 상기 제1 VH 서열은 서열식별번호: 117을 포함하고 상기 제1 VL 서열은 서열식별번호: 121을 포함하는 것인 제1 결합 아암, 및

(II) 제2 중쇄 가변 (VH) 서열 및 제2 중쇄 불변 (CH) 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 제2 경쇄 불변 (CL) 서열 및 제2 경쇄 가변 (VL) 서열을 추가로 포함하는 제2 경쇄를 포함하며, 여기서 상기 제2 VH 서열은 서열식별번호: 123을 포함하고 상기 제2 VL 서열은 서열식별번호: 127을 포함하는 것인 제2 결합 아암 (인간화 CD137 클론 009)

을 포함하는 이중특이적 항체에 관한 것이다.

구체적 실시양태에서, 본 발명은

(I) 제1 중쇄 가변 (VH) 서열 및 제1 중쇄 불변 (CH) 서열을 포함하는 제1 중쇄, 및 제1 경쇄 가변 (VL) 서열 및 제1 경쇄 불변 (CL) 서열을 포함하는 제1 경쇄를 포함하며, 여기서 상기 제1 VH 및 VL 서열은 각각 서열식별번호: 117에 제시된 바와 같은 VH 서열 및 서열식별번호: 121에 제시된 바와 같은 VL 서열의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 제1 결합 아암, 및

을 포함하는 이중특이적 항체에 관한 것이며,

추가의 구체적 실시양태에서, 본 발명은

을 포함하는 이중특이적 항체에 관한 것이며,

또 다른 측면에서, 본 발명은 인간 CD40에 결합하는 제1 결합 아암 및 인간 CD137에 결합하는 제2 결합 아암을 포함하는 이중특이적 항체에 관한 것이며, 여기서

(i) 상기 제1 결합 아암은 서열식별번호: 118을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 (HC) 아미노산 서열 및 서열식별번호: 122를 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 (LC) 아미노산 서열을 포함하고

(ii) 상기 제2 결합 아암은 서열식별번호: 124를 포함하거나 이로 이루어진 HC 아미노산 서열 및 서열식별번호: 128을 포함하거나 이로 이루어진 LC 아미노산 서열을 포함하고,

임의로 여기서 서열식별번호: 118, 서열식별번호: 124 또는 둘 다는 HC의 불변 영역에서 1개 이상의 돌연변이, 예컨대 1 내지 10, 예컨대 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 돌연변이를 포함한다.

(i) 상기 제1 결합 아암은 서열식별번호: 119를 포함하거나 이로 이루어진 HC 아미노산 서열 및 서열식별번호: 122를 포함하거나 이로 이루어진 LC 아미노산 서열을 포함하고

(ii) 상기 제2 결합 아암은 서열식별번호: 125를 포함하거나 이로 이루어진 HC 아미노산 서열 및 서열식별번호: 128을 포함하거나 이로 이루어진 LC 아미노산 서열을 포함한다.

(i) 상기 제1 결합 아암은 서열식별번호: 120을 포함하거나 이로 이루어진 HC 아미노산 서열 및 서열식별번호: 122를 포함하거나 이로 이루어진 LC 아미노산 서열을 포함하고

(ii) 상기 제2 결합 아암은 서열식별번호: 126을 포함하거나 이로 이루어진 HC 아미노산 서열 및 서열식별번호: 128을 포함하거나 이로 이루어진 LC 아미노산 서열을 포함한다.

이중특이적 포맷

특정한 실시양태에서 본 발명에 따른 다중특이적 항체는 이중특이적 항체이다.

본 발명은 CD40을 발현하는 세포 및 CD137을 발현하는 세포; 예컨대 각각 항원-제시 세포 및 T 세포를 가교할 수 있는 이중특이적 CD40xCD137 항체를 제공한다. 특정한 사용을 위한 목적하는 기능적 특성에 따라, 본 발명에 의해 제공된 항체 또는 항원-결합 영역의 세트로부터 특정한 항원-결합 영역을 선택할 수 있다. 이중특이적 항체의 많은 상이한 포맷 및 용도가 관련 기술분야에 공지되어 있고, 문헌 [Kontermann; Drug Discov Today, 2015 Jul;20(7):838-47 및; MAbs, 2012 Mar-Apr;4(2):182-97]에서 검토되었다.

본 발명에 따른 이중특이적 항체는 임의의 특정한 이중특이적 포맷 또는 그의 생산 방법으로 제한되지 않는다.

본 발명에 사용될 수 있는 이중특이적 항체 분자의 예는 (i) 상이한 항원-결합 영역을 포함하는 2개의 결합 아암을 갖는 단일 항체; (ii) 예를 들어, 여분 펩티드 링커에 의해 탠덤으로 연결된 2개의 scFv를 통해 2개의 상이한 에피토프에 대한 특이성을 갖는 단일 쇄 항체; (iii) 각각의 경쇄 및 중쇄가 짧은 펩티드 연결을 통해 탠덤으로 2개의 가변 도메인을 함유하는 이중-가변-도메인 항체 (DVD-Ig) (Wu et al., Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig™) Molecule, In: Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010)); (iv) 화학적으로 연결된 이중특이적 (Fab')2 단편; (v) 각각의 표적 항원에 대해 2개의 결합 부위를 갖는 4가 이중특이적 항체를 생성하는 2개의 단일 쇄 디아바디의 융합체인 탠드Ab; (vi) 다가 분자를 생성하는 scFv와 디아바디의 조합인 플렉시바디; (vii) Fab에의 적용 시 상이한 Fab 단편에 연결된 2개의 동일한 Fab 단편으로 이루어진 3가 이중특이적 결합 단백질을 생성할 수 있는, 단백질 키나제 A의 "이량체화 및 도킹 도메인"에 기초한 소위 "독 앤 록" 분자; (viii) 예를 들어 인간 Fab-아암의 둘 다의 말단에 융합된 2개의 scFv를 포함하는 소위 스콜피온 분자; 및 (ix) 디아바디를 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 디아바디, 크로스-바디, 또는 제어된 Fab-아암 교환 (예컨대 WO2011131746 (젠맙)에 기재된 바와 같음)을 통해 수득되는 이중특이적 항체이다.

상이한 부류의 이중특이적 항체의 예는 (i) 이종이량체화를 강제하는 상보성 CH3 도메인을 갖는 IgG-유사 분자; (ii) 분자의 2개의 측면이 각각 적어도 2개의 상이한 항체의 Fab 단편 또는 Fab 단편의 일부를 함유하는 재조합 IgG-유사 이중 표적화 분자; (iii) 전장 IgG 항체가 여분 Fab 단편 또는 Fab 단편의 일부에 융합된 IgG 융합 분자; (iv) 단일 쇄 Fv 분자 또는 안정화된 디아바디가 중쇄 불변-도메인, Fc-영역 또는 그의 일부에 융합된 Fc 융합 분자; (v) 상이한 Fab-단편이 함께 융합된, 중쇄 불변-도메인, Fc-영역 또는 그의 일부에 융합된 Fab 융합 분자; 및 (vi) 상이한 단일 쇄 Fv 분자 또는 상이한 디아바디 또는 상이한 중쇄 항체 (예를 들어 도메인 항체, 나노바디)가 서로에 또는 중쇄 불변-도메인, Fc-영역 또는 그의 일부에 융합된 또 다른 단백질 또는 운반체 분자에 융합된 ScFv- 및 디아바디-기반 및 중쇄 항체 (예를 들어, 도메인 항체, 나노바디)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

상보성 CH3 도메인을 갖는 IgG-유사 분자의 예는 트리오맙(Triomab)/쿼드로마(Quadroma) 분자 (트리온 파마(Trion Pharma)/프레제니우스 바이오테크(Fresenius Biotech); 로슈(Roche), WO2011069104), 소위 노브-인투-홀 분자 (제넨테크(Genentech), WO9850431), 크로스맙(CrossMAb) (로슈, WO2011117329) 및 정전기적으로-매칭되는 분자 (암젠(Amgen), EP1870459 및 WO2009089004; 츄가이(Chugai), US201000155133; 온코메드(Oncomed), WO2010129304), LUZ-Y 분자 (제넨테크(Genentech), 문헌 [Wranik et al. J. Biol. Chem. 2012, 287(52): 43331-9, doi: 10.1074/jbc.M112.397869. Epub 2012 Nov 1]), DIG-바디 및 PIG-바디 분자 (파맙신(Pharmabcine), WO2010134666, WO2014081202), 가닥 교환 조작 도메인 바디 (시드바디) 분자 (이엠디 세로노(EMD Serono), WO2007110205), 비클로닉스(Biclonics) 분자 (메루스(Merus), WO2013157953), FcΔAdp 분자 (레게네론(Regeneron), WO201015792), 이중특이적 IgG1 및 IgG2 분자 (화이자(Pfizer)/리나트(Rinat), WO11143545), 아지메트릭(Azymetric) 스캐폴드 분자 (자이메워크스(Zymeworks)/머크(Merck), WO2012058768), mAb-Fv 분자 (젠코르(Xencor), WO2011028952), 2가 이중특이적 항체 (WO2009080254) 및 듀오바디(DuoBody)® 분자 (젠맙 A/S, WO2011131746)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

재조합 IgG-유사 이중 표적화 분자의 예는 이중 표적화 (DT)-Ig 분자 (WO2009058383), 투-인-원 항체 (제넨테크; 문헌 [Bostrom, et al. 2009. Science 323, 1610-1614]), 가교 mAb (카르마노스 암 센터), mAb2 (에프-스타(F-Star), WO2008003116), 지바디 분자 (진게니아(Zyngenia); 문헌 [LaFleur et al. MAbs. 2013 Mar-Apr;5(2):208-18]), 통상적인 경쇄에 의한 접근 (크루셀(Crucell)/메루스, US7,262,028), κλ바디스 (노브이뮨(NovImmune), WO2012023053) 및 코브엑스-바디(CovX-body) (코브엑스/화이자; 문헌 [Doppalapudi, V.R., et al. 2007. Bioorg. Med. Chem. Lett. 17,501-506])를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

IgG 융합 분자의 예는 이중 가변 도메인 (DVD)-Ig 분자 (애보트(Abbott), US7,612,181), 이중 도메인 이중 헤드 항체 (유니레버(Unilever); 사노피 아벤티스(Sanofi Aventis), WO20100226923), IgG-유사 이중특이적 분자 (임클론(ImClone)/일라이 릴리(Eli Lilly), 문헌 [Lewis et al. Nat Biotechnol. 2014 Feb;32(2):191-8]), Ts2Ab (메드이뮨(MedImmune)/AZ; 문헌 [Dimasi et al. J Mol Biol. 2009 Oct 30;393(3):672-92]) 및 BsAb 분자 (지모제네틱스(Zymogenetics), WO2010111625), 허큘레스(HERCULES) 분자 (비오젠 아이덱(Biogen Idec), US007951918), scFv 융합 분자 (노파르티스(Novartis)), scFv 융합 분자 (창저우 아담 바이오테크 인크.(Changzhou Adam Biotech Inc.), CN 102250246) 및 TvAb 분자 (로슈, WO2012025525, WO2012025530)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

Fc 융합체 분자의 예는 ScFv/Fc 융합체 (Pearce et al., Biochem Mol Biol Int. 1997 Sep;42(6):1179-88), 스콜피온 분자 (에멀전트 바이오솔루션즈(Emergent BioSolutions)/트루비온(Trubion), 문헌 [Blankenship JW, et al. AACR 100th Annual meeting 2009 (Abstract # 5465)]; 지모제네틱스/BMS, WO2010111625), 이중 친화도 재표적화 기술 (Fc-DART) 분자 (마크로게닉스(MacroGenics), WO2008157379, WO2010080538) 및 이중(ScFv)2-Fab 분자 (항체 의약 국립 연구 센터 - 중국)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

Fab 융합 이중특이적 항체의 예는 F(ab)2 분자 (메다렉스/암젠; 문헌 [Deo et al. J Immunol. 1998 Feb 15;160(4):1677-86]), 이중-작용 또는 비스-Fab 분자 (제넨테크, 문헌 [Bostrom, et al. 2009. Science 323, 1610-1614]), 독-앤-록 (DNL) 분자 (이뮤노메딕스(ImmunoMedics), WO2003074569, WO2005004809), 2가 이중특이적 분자 (바이오테크놀(Biotecnol), 문헌 [Schoonjans, J Immunol. 2000 Dec 15;165(12):7050-7]) 및 Fab-Fv 분자 (유씨비-셀테크(UCB-Celltech), WO 2009040562 A1)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

ScFv-, 디아바디-기반 및 도메인 항체의 예는 이중특이적 T 세포 연관체 (BiTE) 분자 (마이크로메트(Micromet), WO2005061547), 탠덤 디아바디 분자 (TandAb) (아피메드(Affimed)) Le Gall et al., Protein Eng Des Sel. 2004 Apr;17(4):357-66.), 이중 친화도 재표적화 기술 (DART) 분자 (마크로게닉스, WO2008157379, WO2010080538), 단일-쇄 디아바디 분자 (로렌스(Lawrence), 문헌 [FEBS Lett. 1998 Apr 3;425(3):479-84]), TCR-유사 항체 (AIT, 리셉터로직스(ReceptorLogics)), 인간 혈청 알부민 ScFv 융합체 (메리마크(Merrimack), WO2010059315) 및 콤바디(COMBODY) 분자 (에피겐 바이오테크(Epigen Biotech), 문헌 [Zhu et al. Immunol Cell Biol. 2010 Aug;88(6):667-75]), 이중 표적화 나노바디 (아블링스(Ablynx), 문헌 [Hmila et al., FASEB J. 2010]) 및 이중 표적화 중쇄 단독 도메인 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

한 실시양태에서, 각각의 상기 제1 및 제2 중쇄는 적어도 힌지 영역, CH2 및 CH3 영역을 포함한다.

추가 실시양태에서, 제1 및 제2 중쇄의 CH3 영역은 비대칭 돌연변이, 예컨대 안정한 이종이량체 항체를 생성하는 비대칭 돌연변이 (또한 본원에서 변형으로도 지칭됨)를 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 제1 CH3 영역을 포함하는 제1 중쇄, 및 제2 CH3 영역을 포함하는 제2 중쇄를 포함하며, 여기서 제1 및 제2 CH3 영역의 서열은 상이하고, 상기 제1 및 제2 CH3 영역 사이의 이종이량체 상호작용은 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 각각의 동종이량체 상호작용보다 더 강하다. 이들 상호작용 및 이를 달성할 수 있는 방법에 관한 보다 세부사항은 예를 들어 본원에 참조로 포함되는 WO 2011/131746 및 WO 2013/060867 (젠맙)에서 제공된다.

본원에 추가로 기재된 바와 같이, 안정한 이중특이적 CD40xCD137 항체는 CH3 영역 내에 단지 소수의 꽤 보존적인 비대칭 돌연변이만을 함유하는 하나의 동종이량체 모 CD40 항체 및 하나의 동종이량체 모 CD137 항체에 기초한 특정한 방법을 사용하여 고수율로 수득할 수 있다. 비대칭 돌연변이는 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 서열이 동일하지 않은 위치에서 아미노산 치환을 함유한다는 것을 의미한다.

따라서, 본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체의 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 CH3 영역의 서열은 비대칭 돌연변이, 예를 들어 CH3 영역 중 하나의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 405에 상응하는 위치에서의 돌연변이, 및 다른 CH3 영역의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 409에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 함유한다.

한 측면에서, 본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체는 제1 및 제2 중쇄를 포함하고, 여기서 상기 제1 중쇄에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 T366, L368, K370, D399, F405, Y407, 및 K409로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 상응하는 위치의 아미노산 중 적어도 1개가 치환되고, 상기 제2 중쇄에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 T366, L368, K370, D399, F405, Y407, 및 K409로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 상응하는 위치의 아미노산 중 적어도 1개가 치환되고, 여기서 상기 제1 및 상기 제2 중쇄는 동일한 위치에서 치환되지 않는다.

본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체의 한 실시양태에서, 제1 중쇄는 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 366, 368, 370, 399, 405, 407 및 409로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서 아미노산 치환을 갖고, 제2 중쇄는 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 366, 368, 370, 399, 405, 407 및 409로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서 아미노산 치환을 갖고, 여기서 제1 및 제2 중쇄는 동일한 위치에서 치환되지 않는다.

본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체의 한 실시양태에서, 제1 중쇄는 위치 366에서 아미노산 치환을 갖고, 상기 제2 중쇄는 368, 370, 399, 405, 407 및 409로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서 아미노산 치환을 갖는다. 한 실시양태에서 위치 366의 아미노산은 Ala, Asp, Glu, His, Asn, Val, 또는 Gln으로부터 선택된다.

본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체의 한 실시양태에서, 제1 중쇄는 위치 368에서 아미노산 치환을 갖고, 상기 제2 중쇄는 366, 370, 399, 405, 407 및 409로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서 아미노산 치환을 갖는다.

본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체의 한 실시양태에서, 제1 중쇄는 위치 370에서 아미노산 치환을 갖고, 상기 제2 중쇄는 366, 368, 399, 405, 407 및 409로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서 아미노산 치환을 갖는다.

본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체의 한 실시양태에서, 제1 중쇄는 위치 399에서 아미노산 치환을 갖고, 상기 제2 중쇄는 366, 368, 370, 405, 407 및 409로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서 아미노산 치환을 갖는다.

본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체의 한 실시양태에서, 제1 중쇄는 위치 405에서 아미노산 치환을 갖고, 상기 제2 중쇄는 366, 368, 370, 399, 407 및 409로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서 아미노산 치환을 갖는다.

본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체의 한 실시양태에서, 제1 중쇄는 위치 407에서 아미노산 치환을 갖고, 상기 제2 중쇄는 366, 368, 370, 399, 405, 및 409로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서 아미노산 치환을 갖는다.

본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체의 한 실시양태에서, 제1 중쇄는 위치 409에서 아미노산 치환을 갖고, 상기 제2 중쇄는 366, 368, 370, 399, 405, 및 407로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서 아미노산 치환을 갖는다.

따라서, 본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체의 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 서열은 비대칭 돌연변이, 즉 2개의 CH3 영역의 상이한 위치에서의 돌연변이, 예를 들어 하나의 CH3 영역의 405에서의 돌연변이 및 다른 CH3 영역의 409에서의 돌연변이를 함유한다.

본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체의 한 실시양태에서, 제1 중쇄는 위치 409에서 Lys, Leu 또는 Met 이외의 아미노산, 예를 들어 Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, 또는 Cys를 갖고, 상기 제2 중쇄는 366, 368, 370, 399, 405 및 407로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서 아미노산 치환을 갖는다. 하나의 이러한 실시양태에서, 상기 제1 중쇄는 위치 409에서 Lys, Leu 또는 Met 이외의 아미노산, 예를 들어 Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, 또는 Cys를 갖고, 상기 제2 중쇄는 위치 405에서 Phe 이외의 아미노산, 예를 들어 Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, Cys, Lys, 또는 Leu를 갖는다. 그의 추가 실시양태에서, 상기 제1 중쇄는 위치 409에서 Lys, Leu 또는 Met 이외의 아미노산, 예를 들어 Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, 또는 Cys를 갖고, 상기 제2 중쇄는 위치 405에서 Phe, Arg 또는 Gly 이외의 아미노산, 예를 들어 Leu, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Met, Lys, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, 또는 Cys를 갖는다.

본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체의 또 다른 실시양태에서, 상기 제1 중쇄는 위치 405에서 Phe 및 위치 409에서 Lys, Leu 또는 Met 이외의 아미노산, 예를 들어 Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, 또는 Cys를 포함하고, 상기 제2 중쇄는 위치 405에서 Phe 이외의 아미노산, 예를 들어 Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, Leu, Met, 또는 Cys 및 위치 409에서 Lys를 포함한다. 그의 추가 실시양태에서, 상기 제1 중쇄는 위치 405에서 Phe 및 위치 409에서 Lys, Leu 또는 Met 이외의 아미노산, 예를 들어 Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, 또는 Cys를 포함하고, 상기 제2 중쇄는 위치 405에서 Phe, Arg 또는 Gly 이외의 아미노산, 예를 들어 Leu, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Met, Lys, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, 또는 Cys 및 위치 409에서 Lys를 포함한다.

본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체의 또 다른 실시양태에서, 상기 제1 중쇄는 위치 405에서 Phe 및 위치 409에서 Lys, Leu 또는 Met 이외의 아미노산, 예를 들어 Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, 또는 Cys를 포함하고, 상기 제2 중쇄는 위치 405에서 Leu 및 위치 409에서 Lys를 포함한다. 그의 추가 실시양태에서, 상기 제1 중쇄는 위치 405에서 Phe 및 위치 409에서 Arg를 포함하고, 상기 제2 중쇄는 위치 405에서 Phe, Arg 또는 Gly 이외의 아미노산, 예를 들어 Leu, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Lys, Met, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, 또는 Cys 및 위치 409에서 Lys를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 제1 중쇄는 위치 405에서 Phe 및 위치 409에서 Arg를 포함하고, 상기 제2 중쇄는 위치 405에서 Leu 및 위치 409에서 Lys를 포함한다.

본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체의 추가 실시양태에서, 상기 제1 중쇄는 위치 409에서 Lys, Leu 또는 Met 이외의 아미노산, 예를 들어 Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, 또는 Cys를 포함하고, 상기 제2 중쇄는 위치 409에서 Lys, 위치 370에서 Thr 및 위치 405에서 Leu를 포함한다. 추가 실시양태에서, 상기 제1 중쇄는 위치 409에서 Arg를 포함하고, 상기 제2 중쇄는 위치 409에서 Lys, 위치 370에서 Thr 및 위치 405에서 Leu를 포함한다.

본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체의 추가 실시양태에서, 상기 제1 중쇄는 위치 370에서 Lys, 위치 405에서 Phe 및 위치 409에서 Arg를 포함하고, 상기 제2 중쇄는 위치 409에서 Lys, 위치 370에서 Thr 및 위치 405에서 Leu를 포함한다.

본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체의 또 다른 실시양태에서, 상기 제1 중쇄는 위치 409에서 Lys, Leu 또는 Met 이외의 아미노산, 예를 들어 Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, 또는 Cys를 포함하고, 상기 제2 중쇄는 위치 409에서 Lys 및: a) 위치 350에서 Ile 및 위치 405에서 Leu, 또는 b) 위치 370에서 Thr 및 위치 405에서 Leu를 포함한다.

본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체의 또 다른 실시양태에서, 상기 제1 중쇄는 위치 409에서 Arg를 포함하고, 상기 제2 중쇄는 위치 409에서 Lys 및: a) 위치 350에서 Ile 및 위치 405에서 Leu, 또는 b) 위치 370에서 Thr 및 위치 405에서 Leu를 포함한다.

본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체의 또 다른 실시양태에서, 상기 제1 중쇄는 위치 350에서 Thr, 위치 370에서 Lys, 위치 405에서 Phe 및 위치 409에서 Arg를 포함하고, 상기 제2 중쇄는 위치 409에서 Lys 및: a) 위치 350에서 Ile 및 위치 405에서 Leu, 또는 b) 위치 370에서 Thr 및 위치 405에서 Leu를 포함한다.

본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체의 또 다른 실시양태에서, 상기 제1 중쇄는 위치 350에서 Thr, 위치 370에서 Lys, 위치 405에서 Phe 및 위치 409에서 Arg를 포함하고, 상기 제2 중쇄는 위치 350에서 Ile, 위치 370에서 Thr, 위치 405에서 Leu 및 위치 409에서 Lys를 포함한다.

본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체의 한 실시양태에서, 상기 제1 중쇄는 위치 409에서 Lys, Leu 또는 Met 이외의 아미노산을 갖고, 상기 제2 중쇄는 위치 405에서 Phe 이외의 아미노산, 예컨대 위치 405에서 Phe, Arg 또는 Gly 이외의 아미노산을 갖거나; 또는 상기 제1 CH3 영역은 위치 409에서 Lys, Leu 또는 Met 이외의 아미노산을 갖고, 상기 제2 CH3 영역은 위치 407에서 Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser 또는 Thr 이외의 아미노산을 갖는다.

한 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체는 위치 409에서 Lys, Leu 또는 Met 이외의 아미노산을 갖는 제1 중쇄 및 위치 407에서 Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser 또는 Thr 이외의 아미노산을 갖는 제2 중쇄를 포함한다.

한 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체는 위치 407에서 Tyr 및 위치 409에서 Lys, Leu 또는 Met 이외의 아미노산을 갖는 제1 중쇄 및 위치 407에서 Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser 또는 Thr 이외의 아미노산 및 위치 409에서 Lys를 갖는 제2 중쇄를 포함한다.

한 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체는 위치 407에서 Tyr 및 위치 409에서 Arg를 갖는 제1 중쇄 및 위치 407에서 Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser 또는 Thr 이외의 아미노산 및 위치 409에서 Lys를 갖는 제2 중쇄를 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 상기 제1 중쇄는 위치 409에서 Lys, Leu 또는 Met 이외의 아미노산, 예를 들어 Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, 또는 Cys를 갖고, 상기 제2 중쇄는 위치 407에서 Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser 또는 Thr 이외의 아미노산, 예를 들어 Leu, Met, Gly, Ala, Val, Ile, His, Asn, Pro, Trp, 또는 Cys를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 상기 제1 중쇄는 위치 409에서 Lys, Leu 또는 Met 이외의 아미노산, 예를 들어 Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, 또는 Cys를 갖고, 상기 제2 중쇄는 위치 407에서 Ala, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Val 또는 Trp를 갖는다.

본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체의 또 다른 실시양태에서, 상기 제1 중쇄는 위치 409에서 Lys, Leu 또는 Met 이외의 아미노산, 예를 들어 Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, 또는 Cys를 갖고, 상기 제2 중쇄는 위치 407에서 Gly, Leu, Met, Asn 또는 Trp를 갖는다.

본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체의 또 다른 실시양태에서, 상기 제1 중쇄는 위치 407에서 Tyr 및 위치 409에서 Lys, Leu 또는 Met 이외의 아미노산, 예를 들어 Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, 또는 Cys를 갖고, 상기 제2 중쇄는 위치 407에서 Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser 또는 Thr 이외의 아미노산, 예를 들어 Leu, Met, Gly, Ala, Val, Ile, His, Asn, Pro, Trp, 또는 Cys를 갖고 위치 409에서 Lys를 갖는다.

본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체의 또 다른 실시양태에서, 상기 제1 중쇄는 위치 407에서 Tyr 및 위치 409에서 Lys, Leu 또는 Met 이외의 아미노산, 예를 들어 Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, 또는 Cys를 갖고, 상기 제2 중쇄는 위치 407에서 Ala, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Val 또는 Trp 및 위치 409에서 Lys를 갖는다.

본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체의 또 다른 실시양태에서, 상기 제1 중쇄는 위치 407에서 Tyr 및 위치 409에서 Lys, Leu 또는 Met 이외의 아미노산, 예를 들어 Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, 또는 Cys를 갖고, 상기 제2 중쇄는 위치 407에서 Gly, Leu, Met, Asn 또는 Trp 및 위치 409에서 Lys를 갖는다.

본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체의 또 다른 실시양태에서, 상기 제1 중쇄는 위치 407에서 Tyr 및 위치 409에서 Arg를 갖고, 상기 제2 중쇄는 위치 407에서 Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser 또는 Thr 이외의 아미노산, 예를 들어 Leu, Met, Gly, Ala, Val, Ile, His, Asn, Pro, Trp, 또는 Cys 및 위치 409에서 Lys를 갖는다.

본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체의 또 다른 실시양태에서, 상기 제1 중쇄는 위치 407에서 Tyr 및 위치 409에서 Arg를 갖고, 상기 제2 중쇄는 위치 407에서 Ala, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Val 또는 Trp 및 위치 409에서 Lys를 갖는다.

본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체의 또 다른 실시양태에서, 상기 제1 중쇄는 위치 407에서 Tyr 및 위치 409에서 Arg를 갖고, 상기 제2 중쇄는 위치 407에서 Gly, Leu, Met, Asn 또는 Trp 및 위치 409에서 Lys를 갖는다.

본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체의 또 다른 실시양태에서, 제1 중쇄는 위치 409에서 Lys, Leu 또는 Met 이외의 아미노산, 예를 들어 Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, 또는 Cys를 갖고, 제2 중쇄는

(i) 위치 368에서 Phe, Leu 및 Met 이외의 아미노산, 예를 들어 Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, 또는 Cys, 또는

(ii) 위치 370에서 Trp, 또는

(iii) 위치 399에서 Asp, Cys, Pro, Glu 또는 Gln 이외의 아미노산, 예를 들어 Phe, Leu, Met, Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, His, Asn, Trp, Tyr, 또는 Cys 또는

(iv) 위치 366에서 Lys, Arg, Ser, Thr, 또는 Trp 이외의 아미노산, 예를 들어 Phe, Leu, Met, Ala, Val, Gly, Ile, Asn, His, Asp, Glu, Gln, Pro, Tyr, 또는 Cys

를 갖는다.

한 실시양태에서, 제1 중쇄는 위치 409에서 Arg, Ala, His 또는 Gly를 갖고, 제2 중쇄는

(i) 위치 368에서 Lys, Gln, Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Asn, Arg, Ser, Thr, Val, 또는 Trp, 또는

(ii) 위치 370에서 Trp, 또는

(iii) 위치 399에서 Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr, Trp, Phe, His, Lys, Arg 또는 Tyr, 또는

(iv) 위치 366에서 Ala, Asp, Glu, His, Asn, Val, Gln, Phe, Gly, Ile, Leu, Met, 또는 Tyr

를 갖는다.

한 실시양태에서, 제1 중쇄는 위치 409에서 Arg를 갖고, 제2 중쇄는

(i) 위치 368에서 Asp, Glu, Gly, Asn, Arg, Ser, Thr, Val, 또는 Trp, 또는

(ii) 위치 370에서 Trp, 또는

(iii) 위치 399에서 Phe, His, Lys, Arg 또는 Tyr, 또는

(iv) 위치 366 Ala, Asp, Glu, His, Asn, Val, Gln

을 갖는다.

한 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체는 제1 및 제2 중쇄를 포함하며, 여기서 (i) EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 F405에 상응하는 위치의 아미노산은 상기 제1 중쇄에서 L이고, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 K409에 상응하는 위치의 아미노산은 상기 제2 중쇄에서 R이거나, 또는 (ii) EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 K409에 상응하는 위치의 아미노산은 상기 제1 중쇄에서 R이고, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 F405에 상응하는 위치의 아미노산은 상기 제2 중쇄에서 L이다.

추가 실시양태에서 상기 제1 및 제2 중쇄는 인간 IgG1 이소형의 것이다.

또 다른 추가 실시양태에서 상기 제1 및 제2 중쇄는 인간 IgG2 이소형의 것이다.

또 다른 추가 실시양태에서 상기 제1 및 제2 중쇄는 인간 IgG3 이소형의 것이다.

또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체는 인간 IgG4 이소형의 제1 및 제2 중쇄를 포함하며, 여기서 (i) EU 넘버링에 따른 인간 IgG4 중쇄의 S228에 상응하는 위치의 아미노산은 상기 제1 중쇄에서 P이고, EU 넘버링에 따른 인간 IgG4 중쇄의 S228, F405 및 R409에 상응하는 위치의 아미노산은 상기 제2 중쇄에서 각각 P, L 및 K이거나, 또는 (ii) EU 넘버링에 따른 인간 IgG4 중쇄의 S228, F405 및 R409에 상응하는 위치의 아미노산은 상기 제1 중쇄에서 각각 P, L 및 K이고, EU 넘버링에 따른 인간 IgG4 중쇄의 S228에 상응하는 위치의 아미노산은 상기 제2 중쇄에서 P이다.

제1 중쇄의 특정 위치에서의 아미노산 및/또는 제2 중쇄의 특정 위치에서의 아미노산이 본원에서 참조되는 경우에, 이러한 참조는 제1 중쇄의 특정 위치에서의 아미노산이 제1 중쇄보다는 제2 중쇄의 상응하는 위치에 존재하고/거나 제2 중쇄의 특정 위치에서의 아미노산이 제2 중쇄보다는 제1 중쇄의 상응하는 위치에 존재하는 실시양태를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

상기 명시된 아미노산 치환에 더하여, 상기 제1 및 제2 중쇄는 야생형 중쇄 서열에 비해 추가의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 함유할 수 있다.

추가 실시양태에서, 제1 및 제2 중쇄를 포함하는 상기 제1 및 제2 Fab-아암 (또는 중쇄 불변 도메인)은 명시된 돌연변이를 제외하고는, 다음으로부터 독립적으로 선택된 CH3 서열을 포함한다:

(IgG1m(a)) (서열식별번호: 106), (IgG1m(f)) (서열식별번호: 107), 및 (IgG1m(ax) (서열식별번호: 108).

한 실시양태에서, 상기 제1 또는 상기 제2 중쇄 중 어느 것도 (코어) 힌지 영역에서 Cys-Pro-Ser-Cys 서열을 포함하지 않는다.

추가 실시양태에서, 상기 제1 및 상기 제2 중쇄 둘 다는 (코어) 힌지 영역에서 Cys-Pro-Pro-Cys 서열을 포함한다.

별개의 및 구체적 실시양태에서, 하나 또는 둘 다의 Fab-아암은 서열식별번호: 109, 110, 111, 112, 113 및 116으로부터 독립적으로 선택된 중쇄 불변 영역 서열을 포함한다 (표 1 참조).

이중특이적 항체를 제조하는 방법

전통적인 방법, 예컨대 하이브리드 하이브리도마 및 화학적 접합 방법 (Marvin and Zhu (2005) Acta Pharmacol Sin 26:649)을 본 발명의 이중특이적 항체의 제조에 사용할 수 있다. 상이한 중쇄 및 경쇄로 이루어진 2개의 항체를 숙주 세포에서 공동 발현시키면, 목적하는 이중특이적 항체에 더하여, 가능한 항체 생성물의 혼합물이 생성되며, 이어서 이를, 예를 들어 친화성 크로마토그래피 또는 유사한 방법에 의해 단리할 수 있다.

상이한 항체 구축물의 공동 발현시 기능적 이중특이적 생성물의 형성을 촉진시키는 전략은, 예를 들어 문헌 [Lindhofer et al. (1995 J Immunol 155:219)]에 기재된 방법에 의해 또한 사용될 수 있다. 상이한 항체를 생산하는 래트 및 마우스 하이브리도마의 융합은 우선적 종-제한 중쇄/경쇄 쌍형성으로 인해 제한된 수의 이종이량체 단백질을 생성한다. 동종이량체에 비해 이종이량체의 형성을 촉진하는 또 다른 전략은 제1 중쇄 폴리펩티드 상에는 돌기를 도입하고 제2 중쇄 폴리펩티드 내에는 상응하는 공동을 도입하여, 이종이량체 형성을 촉진하고 동종이량체 형성을 방해하도록 이들 2개의 중쇄의 계면에서 돌기가 공동 내에 위치할 수 있도록 한 "노브-인투-홀" 전략이다. "돌기"는 제1 폴리펩티드의 계면으로부터의 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄로 대체함으로써 구축된다. 돌기와 동일하거나 유사한 크기의 보상 "공동"은 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 것으로 대체함으로써 제2 폴리펩티드의 계면에 생성된다 (미국 특허 5,731,168). EP1870459 (츄가이) 및 WO 2009/089004 (암젠)는 숙주 세포에서의 상이한 항체 도메인의 공동 발현 시 이종이량체 형성을 촉진시키는 다른 전략을 기재한다. 이들 방법에서, 둘 다의 CH3 도메인에서 CH3-CH3 계면을 구성하는 하나 이상의 잔기는, 동종이량체 형성이 정전기적으로 불리하고 이종이량체화가 정전기적으로 유리하도록 하전된 아미노산으로 대체된다. WO2007110205 (머크)는 IgA 및 IgG CH3 도메인 사이의 차이를 활용하여 이종이량체화를 촉진하는 또 다른 전략을 기재한다.

본 발명의 이중특이적 CD40xCD137 항체를 제조하는 바람직한 방법은

a) 제1 CH3 영역을 포함하는 Fc 영역을 포함하는 제1 항체를 제공하는 단계;

b) 제2 CH3 영역을 포함하는 제2 Fc 영역을 포함하는 제2 항체를 제공하는 단계이며,

여기서 제1 항체는 본원에 기재된 바와 같은 2개의 제1 항원-결합 영역을 포함하는 CD40 항체이고, 제2 항체는 본원에 기재된 바와 같은 2개의 제2 항원-결합 영역을 포함하는 CD137 항체이거나, 또는 그 반대이고; 여기서 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 서열은 상이하고, 상기 제1 및 제2 CH3 영역 사이의 이종이량체 상호작용은 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 각각의 동종이량체 상호작용보다 더 강한 것인 단계;

c) 상기 제1 항체를 상기 제2 항체와 함께 환원 조건 하에 인큐베이션하는 단계; 및

d) 상기 이중특이적 CD40xCD137 항체를 수득하는 단계

를 포함하는, WO 2011/131746 및 WO 2013/060867 (젠맙)에 기재된 방법을 포함한다.

한 실시양태에서, 상기 제1 항체는 상기 제2 항체와 함께, 힌지 영역 내의 시스테인이 디술피드 결합 이성질화를 거치게 하는데 충분한 환원 조건 하에 인큐베이션되고, 여기서 생성되는 이종이량체 항체의 상기 제1 및 제2 항체 사이의 이종이량체 상호작용은 0.5 mM GSH에서 37℃에서 24시간 후 어떠한 Fab-아암 교환도 일어나지 않도록 이루어진다.

이론에 제한되는 것은 아니지만, 단계 c)에서, 모 항체 (단계 a) 및 b)에서 제1 및 제2 항체)의 힌지 영역 내의 중쇄 디술피드 결합은 환원되고, 생성되는 시스테인은 이어서 또 다른 모 항체 분자 (원래 상이한 특이성을 가짐)의 시스테인 잔기와 중쇄간 디술피드 결합을 형성할 수 있다. 이러한 방법의 한 실시양태에서, 단계 c)에서 환원 조건은 환원제, 예를 들어 2-메르캅토에틸아민 (2-MEA), 디티오트레이톨 (DTT), 디티오에리트리톨 (DTE), 글루타티온, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP), L-시스테인 및 베타-메르캅토-에탄올로 이루어진 군으로부터 선택된 환원제, 바람직하게는 2-메르캅토에틸아민, 디티오트레이톨 및 트리스(2-카르복시에틸)포스핀으로 이루어진 군으로부터 선택된 환원제를 첨가하는 것을 포함한다. 추가 실시양태에서, 단계 c)는 예를 들어 환원제의 제거에 의해, 예를 들어 탈염에 의해, 상기 조건을 비-환원성 또는 덜 환원성이 되도록 복원하는 것을 포함한다. 하나의 특정한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 하기와 같이 생성된다: 2종의 모 상보적 항체를, 둘 다 동일한 양으로 완충제 (예를 들어, PBS 또는 트리스-EDTA) 중 75 mM 2-메르캅토에틸아민-HCl (2-MEA)와 함께 31℃에서 5시간 동안 인큐베이션하고; 스핀 칼럼 (예를 들어, 마이크로콘 원심분리 필터, 30k, 밀리포어(Millipore))을 사용하여 환원제 2-MEA를 제거함으로써 환원 반응을 정지시킨다 (Labrijn et al. Nature Protocols, Vol 9 No 10, p2450-2463; 2014). 또 다른 특정한 실시양태에서, 방법은 실시예 3의 방법이다.

이러한 방법을 위해, 본원에 개시된 CD40 및 CD137 항체 중 임의의 것이는 사용될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 이중특이적 항체를 수득하기 위해 각각 인간 CD40 및 CD137에 결합하는 제1 및 제2 항체가 선택될 수 있다.

상기 방법의 한 실시양태에서, 상기 제1 및/또는 제2 항체는 전장 항체이다.

제1 및 제2 항체의 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된 하위부류를 갖는 IgG 이소형을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 이소형의 것일 수 있다. 상기 방법의 한 실시양태에서, 상기 제1 및 상기 제2 항체 둘 다의 Fc 영역은 IgG1 이소형의 것이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체의 Fc 영역 중 하나는 IgG1 이소형의 것이고, 다른 것은 IgG4 이소형의 것이다. 후자의 실시양태에서, 생성된 이중특이적 항체는 IgG1의 Fc 영역 및 IgG4의 Fc 영역을 포함한다.

추가 실시양태에서, 모 항체 중 하나를 단백질 A에 결합하지 않도록 조작하여, 생성물을 단백질 A 칼럼 상으로 통과시킴으로써 이종이량체 항체를 상기 모 동종이량체 항체로부터 분리하는 것이 가능하다.

상기 기재된 바와 같이, 동종이량체 모 항체의 제1 및 제2 CH3 영역의 서열은 상이하고; 상기 제1 및 제2 CH3 영역 사이의 이종이량체 상호작용은 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 각각의 동종이량체 상호작용보다 더 강하다. 이들 상호작용 및 이를 달성할 수 있는 방법에 관한 보다 세부내용은 WO 2011/131746 및 WO 2013/060867 (젠맙)에 제공되며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

특히, 안정한 이중특이적 CD40xCD137 항체는 CD40 및 CD137에 각각 결합하고 CH3 영역 내에 소수의 꽤 보존적인 비대칭 돌연변이만을 함유하는 2개의 동종이량체 항체에 기초한 본 발명의 상기 방법을 사용하여 고수율로 수득할 수 있다. 비대칭 돌연변이는 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 서열이 동일하지 않은 위치에서 아미노산 치환을 함유한다는 것을 의미한다.

본 발명의 이중특이적 항체는 또한, 제1 및 제2 폴리펩티드를 코딩하는 구축물을 단일 세포에서 공동-발현시킴으로써 수득할 수 있다. 따라서, 추가 측면에서, 본 발명은

a) 본원의 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 제1 CH3 영역을 포함하는 제1 Fc 영역 및 인간 CD40에 결합하는 제1 항원-결합 영역을 포함하는 제1 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 구축물을 제공하는 단계,

b) 본원의 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 제2 CH3 영역을 포함하는 제2 Fc 영역 및 인간 CD137에 결합하는 제2 항원-결합 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드를 코딩하는 제2 핵산 구축물을 제공하는 단계이며,

여기서 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 서열은 상이하고, 상기 제1 및 제2 CH3 영역 사이의 이종이량체 상호작용은 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 각각의 동종이량체 상호작용보다 더 강하고, 상기 제1 CH3 영역에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 T366, L368, K370, D399, F405, Y407, 및 K409로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 상응하는 위치의 아미노산 중 적어도 1개가 치환되고, 상기 제2 CH3 영역에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 T366, L368, K370, D399, F405, Y407, 및 K409로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 상응하는 위치의 아미노산 중 적어도 1개가 치환되고, 상기 제1 및 상기 제2 중쇄는 동일한 위치에서 치환되지 않고,

임의로 여기서 상기 제1 및 제2 핵산 구축물은 상기 제1 및 제2 항체의 경쇄 서열을 코딩하는 것인 단계,

c) 숙주 세포에서 상기 제1 및 제2 핵산 구축물을 공동-발현시키는 단계, 및

d) 세포 배양물로부터 상기 이종이량체 단백질을 수득하는 단계

를 포함하는, 이중특이적 항체의 생산 방법에 관한 것이다.

따라서, 본 발명은 또한, 본 발명의 이중특이적 항체를 생산하는 재조합 진핵 또는 원핵 숙주 세포에 관한 것이다.

본 발명의 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 본 발명에 따른 임의의 방법에 의해 수득된다.

프로모터, 인핸서 등을 포함한 적합한 발현 벡터, 및 항체를 생산하는데 적합한 숙주 세포는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 숙주 세포의 예는 효모, 박테리아 및 포유동물 세포, 예컨대 CHO 또는 HEK 세포를 포함한다.

한 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체는 명시된 돌연변이를 제외하고는, 서열식별번호: 107의 서열(IgG1m(f))을 포함하는 제1 및 제2 CH3 영역을 포함한다.

한 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체는 제1 Fc-영역 및 제2 Fc-영역을 포함하며, 여기서 상기 제1 또는 상기 제2 Fc-영역 중 어느 것도 힌지 영역에서 Cys-Pro-Ser-Cys 서열을 포함하지 않는다.

한 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체는 제1 Fc-영역 및 제2 Fc-영역을 포함하며, 여기서 상기 제1 및 상기 제2 Fc-영역 둘 다는 힌지 영역에서 Cys-Pro-Pro-Cys 서열을 포함한다.

한 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체는 제1 Fc-영역 및 제2 Fc-영역을 포함하며, 여기서 제1 및 제2 Fc-영역은 인간 항체 Fc-영역이다.

한 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체는 제1 Fc-영역 및 제2 Fc-영역을 포함하며, 여기서 상기 제1 및 제2 Fc 영역은 명시된 돌연변이를 제외하고는, 서열식별번호: 109, 110, 111, 112, 113 및 116으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 서열을 포함한다.

한 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체는 제1 Fc-영역 및 제2 Fc-영역을 포함하며, 여기서 제1 및 제2 항원-결합 영역은 중쇄 항체로부터의 것이다.

한 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 이중특이적 항체는 제1 Fc-영역 및 제2 Fc-영역을 포함하며, 여기서 제1 및 제2 항원-결합 영역은 제1 및 제2 경쇄를 포함한다.

추가 실시양태에서, 본 발명에 따른 공동-발현 방법은 상기 시험관내 방법 하에 기재된 추가의 특색 중 임의의 것을 포함한다.

불활성 포맷

항체의 Fc 영역에 의해 매개되는 이펙터 기능은 외래 물질의 파괴, 예컨대 병원체의 사멸 및 항원의 클리어런스 및 분해를 가능하게 한다. 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및 항체-의존성 세포-매개 식세포작용 (ADCP)은 Fc 수용체 (FcR)-보유 세포에 대한 Fc 영역의 결합에 의해 개시되는 반면에, 보체-의존성 세포독성 (CDC) 및 보체-의존성 세포-매개 세포독성 (CDCC)은 보체 활성화의 고전적 경로를 개시하는 C1q에 대한 Fc 영역의 결합에 의해 개시된다.

Fc-매개된 이펙터 기능, 예컨대 ADCC 및 보체 활성화는 암의 치료를 위해 사용되는 모노클로날 항체의 치료 효능에 기여하는 것으로 시사되었다 (Weiner et al. Cell 2012, 148:1081-1084).

본 발명에 따른 다중특이적 항체, 예컨대 이중특이적 항체는 T-세포, 예를 들어 CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T-세포 상에 발현된 CD137에 결합한다. 예를 들어 항원-제시 세포 (APC) 상에 발현된 CD40에의 항체의 병행 결합은 CD40을 발현하는 APC 및 CD137을 발현하는 T-세포 둘 다에 대한 자극을 제공하여, 그에 의해 예를 들어 T-세포 증식이 증가될 수 있다.

일반적으로, 세포에 의해 발현된 표적 항원에 대한 항체의 결합은 이펙터 분자 예컨대 Fc 수용체 또는 보체 단백질과의 상호작용으로 이어질 수 있고, 이는 Fc-매개 이펙터 기능, 예컨대 ADCC 또는 보체 활성화를 유도할 수 있고, 이는 상기 표적 항원을 발현하는 세포의 사멸을 발생시킬 수 있다.

본 발명에 따른 다중특이적 항체, 예컨대 이중특이적 항체의 용도는 APC 및 T 세포에 대해 공동-자극을 제공하는 그의 능력에 기초한다.

특정한 실시양태에서, 다중특이적 항체는 FcR, 예를 들어 FcγR에 결합하지 않는 것이 바람직하고, 따라서 FcR-매개 가교를 유도하지 않는 것이 바람직하다.

추가 실시양태에서, CD40 및/또는 CD137 발현 세포의 사멸을 피하기 위해 다중특이적 항체는 이펙터 기능에 관여하지 않는 것이 바람직하다.

본 발명의 한 측면에서, 본 발명에 따른 다중특이적 CD40xCD137 항체는 본원에 기재된 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 (i) 제1 중쇄 및 제1 항원-결합 영역을 포함하는 제1 결합 아암 및 (ii) 제2 중쇄 및 제2 항원-결합 영역을 포함하는 제2 결합 아암을 포함한다.

한 실시양태에서 본 발명에 따른 다중특이적 항체는 제1 및 제2 중쇄를 포함하며, 여기서 상기 항체는 상기 항체와 동일한 제1 및 제2 항원-결합 영역을 포함하고 인간 IgG1 힌지, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 2개의 중쇄를 포함하는 다중특이적 항체와 비교하여 보다 낮은 정도로 Fc-매개된 이펙터 기능을 유도하고/거나 증진시킨다.

한 실시양태에서, 본 발명에 따른 다중특이적 항체는 제1 및 제2 항원-결합 영역 및 제1 및 제2 중쇄를 포함하며, 각각의 제1 및 제2 중쇄는 인간 IgG1 힌지, CH2 및 CH3 영역을 포함하고, 여기서 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나는 상기 항체와 동일한 제1 및 제2 항원-결합 영역을 포함하고 변형이 없는 인간 IgG1 힌지, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 2개의 중쇄를 포함하는 참조 다중특이적 항체와 비교하여 보다 낮은 정도로 Fc-매개된 이펙터 기능을 유도하고/거나 증진시키기 위해 변형을 포함한다.

한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄는 다중특이적 항체가 비-변형된 제1 및 제2 중쇄를 포함하는 것을 제외하고는 동일한 다중특이적 항체와 비교하여 보다 낮은 정도로 Fc-매개된 이펙터 기능을 유도하고/거나 증진시키도록 변형된다.

한 실시양태에서, 상기 Fc-매개된 이펙터 기능은 Fcγ-수용체에 대한 결합, C1q에 대한 결합, 또는 FcR의 Fc-매개된 가교의 유도에 의해 측정될 수 있다.

한 실시양태에서, 상기 Fc-매개된 이펙터 기능은 C1q에 대한 결합에 의해 측정된다.

한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 및 경쇄 불변 서열은 상기 다중특이적 항체에 대한 C1q의 결합이 야생형 다중특이적 항체와 비교하여 적어도 70% 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 100%만큼 감소되도록 변형되었고, 여기서 C1q 결합은 ELISA에 의해 결정된다.

인간 IgG1은 Fc-매개된 이펙터 기능을 유도하는 그의 능력에 대해 공지되어 있고, 한편 다른 인간 이소형, 예컨대 IgG4는 Fc-매개된 이펙터 기능을 덜 유도할 수 있다.

제1 및 제2 중쇄는 각각 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된 IgG1 이소형을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 이소형의 것일 수 있고, 임의로 1개 이상의 돌연변이 또는 변형을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 각각의 제1 및 제2 중쇄는 IgG4 이소형의 것이거나 또는 그로부터 유래되고, 임의로 1개 이상의 돌연변이 또는 변형을 갖는다. 한 실시양태에서, 각각의 제1 및 제2 중쇄는 IgG1 이소형의 것이거나 또는 그로부터 유래되고, 임의로 1개 이상의 돌연변이 또는 변형을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 중쇄 중 하나는 IgG1 이소형의 것이고 다른 것은 IgG4 이소형의 것이거나, 또는 이러한 각각의 이소형으로부터 유래되고, 임의로 1개 이상의 돌연변이 또는 변형을 갖는다.

한 실시양태에서, 제1 및 중쇄 중 하나 또는 둘 다는 2개의 제1 또는 2개의 제2 중쇄를 포함하는 항체가 이펙터-기능-결핍이도록 설정된다. 예를 들어, 제1 및 제2 중쇄는 이펙터 기능, 예컨대 ADCC를 매개하는 능력이 비-돌연변이된 중쇄와 비교하여 감소되거나 또는 심지어 제거되도록 돌연변이된 IgG4 이소형, 또는 비-IgG4 유형, 예를 들어 IgG1, IgG2 또는 IgG3의 것일 수 있다. 이러한 돌연변이는 예를 들어 문헌 [Dall'Acqua WF et al., J Immunol. 177(2):1129-1138 (2006) 및 Hezareh M, J Virol.; 75(24):12161-12168 (2001)]에 기재되어 있다. 본 발명에 따른 다중특이적 항체는 야생형 인간 IgG1 서열과 비교하여 제1 및 제2 중쇄에서 변형을 포함할 수 있다. 항체의 Fc 영역에서 이러한 변형을 포함하는 다중특이적 항체는 불활성, 또는 비-활성화, 다중특이적 항체가 될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "불활성", "불활성인" 또는 "비-활성화"는 적어도 임의의 Fcγ(감마) 수용체에 결합할 수 없거나, C1q에 결합할 수 없거나, 또는 FcR의 Fc-매개된 가교를 유도할 수 없는 Fc 영역을 지칭한다. 본 발명의 다중특이적 항체의 Fc 영역, 또는 제1 및/또는 제2 중쇄의 불활성은 상기 Fc 영역, 또는 2개의 제1 중쇄 또는 2개의 제2 중쇄를 포함하는 2가, 단일특이적 항체를 사용하여 시험될 수 있다. 이는 또한 제1 및 제2 중쇄를 포함하는 다중특이적 항체를 사용하여 시험될 수 있다.

치료 항체 개발을 위해 Fcγ 수용체 및 C1q와의 상호작용에 불활성인 항체의 Fc 영역을 제조하기 위해 여러 변이체가 구축될 수 있다. 본 발명은 Fc-매개된 이펙터 기능을 감소시키는데 관련된 임의의 특정 돌연변이로 제한되지 않는다. 이러한 변이체의 예가 본원에 기재된다.

따라서, C1q 및 Fcγ 수용체와의 상호작용에서 우세한 역할을 하는 Fc 영역 내의 아미노산이 변형될 수 있다. 변형될 수 있는 아미노산 위치의 예는 위치 L234, L235 및 P331을 포함한다.

따라서, 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 L234, L235 및 P331에 상응하는 적어도 하나의 위치의 아미노산은 각각 A, A 및 S일 수 있다. (Xu et al., 2000, Cell Immunol. 200(1):16-26; Oganesyan et al., 2008, Acta Cryst. (D64):700-4). 또한, L234F 및 L235E 아미노산 치환은 Fcγ 수용체 및 C1q과의 상호작용이 무효화된 Fc 영역을 생성할 수 있다 (Canfield et al., 1991, J. Exp.Med. (173):1483-91; Duncan et al., 1988, Nature (332):738-40). 따라서, 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 F 및 E일 수 있다. D265A 아미노산 치환은 모든 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 감소시키고 ADCC를 막을 수 있다 (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. (276):6591-604). 따라서, 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 A일 수 있다. C1q에 대한 결합은 위치 D270, K322, P329, 및 P331을 돌연변이시키는 것에 의해 무효화될 수 있다. 이들 위치를 D270A 또는 K322A 또는 P329A 또는 P331A로 돌연변이시키는 것은 CDC 활성이 결핍된 항체를 제조할 수 있다 (Idusogie EE, et al., 2000, J Immunol. 164: 4178-84). 따라서, 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 D270, K322, P329 및 P331에 상응하는 적어도 하나의 위치의 아미노산은 각각 A, A, A, 및 A일 수 있다.

Fc 영역과 Fcγ 수용체 및 C1q의 상호작용을 최소화하는 대안적 접근법은 항체의 글리코실화 부위를 제거하는 것이다. 위치 N297을 예를 들어 Q, A, 또는 E로 돌연변이시키는 것은 IgG-Fcγ 수용체 상호작용에 중요한 글리코실화 부위를 제거한다. 따라서, 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 N297에 상응하는 위치의 아미노산은 G, Q, A 또는 E일 수 있다 (Leabman et al., 2013, MAbs; 5(6):896-903). Fc 영역과 Fcγ 수용체의 상호작용을 최소화하는 또 다른 대안적 접근법은 하기 돌연변이; P238A, A327Q, P329A 또는 E233P/L234V/L235A/G236del에 의해 수득될 수 있다 (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. (276):6591-604).

대안적으로, 인간 IgG2 및 IgG4 하위부류는, Fcγ 수용체와의 상호작용이 보고되어 있지만, C1q 및 Fc 감마 수용체와 그의 상호작용이 자연 손상된 것으로 생각된다 (Parren et al., 1992, J. Clin Invest. 90: 1537-1546; Bruhns et al., 2009, Blood 113: 3716-3725). 이들 잔기 상호작용을 무효화하는 돌연변이는 둘 다의 이소형에서 이루어질 수 있고, 이는 FcR 결합과 연관된 원치않는 부작용의 감소를 발생시킨다. IgG2의 경우에, 이는 V234A 및 G237A를 포함하고, IgG4의 경우에, L235E를 포함한다. 따라서, 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서, 예컨대 상기 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서, EU 넘버링에 따른 인간 IgG2 중쇄의 V234 및 G237에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 A 및 A일 수 있다. 한 실시양태에서, EU 넘버링에 따른 인간 IgG4 중쇄의 L235에 상응하는 위치의 아미노산은 E일 수 있다.

IgG2 항체에서 Fcγ 수용체 및 C1q와의 상호작용을 추가로 최소화하기 위한 다른 접근법은 WO2011066501 및 문헌 [Lightle, S., et al., 2010, Protein Science (19):753-62]에 기재된 것을 포함한다.

항체의 힌지 영역은 또한, Fcγ 수용체 및 보체와의 상호작용과 관련하여 중요할 수 있다 (Brekke et al., 2006, J Immunol 177:1129-1138; Dall'Acqua WF, et al., 2006, J Immunol 177:1129-1138). 따라서, 힌지 영역 내의 돌연변이 또는 결실은 항체의 이펙터 기능에 영향을 미칠 수 있다.

한 실시양태에서, 다중특이적 항체는 상기 제1 및 제2 이뮤노글로불린 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234, L235, D265, N297, 및 P331에 상응하는 위치의 1개 이상의 아미노산이 각각 L, L, D, N, 및 P가 아닌 제1 및 제2 중쇄를 포함한다.

한 실시양태에서, 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234, L235, D265, N297, 및 P331에 상응하는 위치의 1개 이상의 아미노산은 각각 L, L, D, N, 및 P가 아니다.

또 다른 실시양태에서, 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234, L235 및 D265에 상응하는 위치의 1개 이상의 아미노산은 각각 L, L 및 D가 아니고, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 N297 및 P331에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 N 및 P이다.

한 실시양태에서, 중쇄 중 하나 또는 둘 다는 Asn-연결된 글리코실화를 위한 수용체 부위를 제거하는 돌연변이를 포함하거나, 또는 글리코실화 특성을 변화시키도록 달리 조작된다. 예를 들어, IgG1 Fc-영역에서, N297Q 돌연변이를 사용하여 Asn-연결된 글리코실화 부위를 제거할 수 있다. 따라서, 구체적 실시양태, 하나 또는 둘 다의 중쇄는 N297Q 돌연변이를 갖는 IgG1 야생형 서열을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "위치에 상응하는 아미노산"은 인간 IgG1 중쇄에서의 아미노산 위치 번호를 지칭한다. 다른 이뮤노글로불린 내의 상응하는 아미노산 위치는 인간 IgG1과의 정렬에 의해 찾을 수 있다. 달리 언급되지 않거나 문맥에 의해 모순되지 않는 한, 불변 영역 서열의 아미노산은 본원에서 EU-인덱스의 넘버링에 따라 넘버링된다 (문헌 [Kabat, E.A. et al., 1991, Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition - US Department of Health and Human Services, NIH publication No. 91-3242, pp 662, 680, 689]에 기재됨). 따라서, 또 다른 서열의 아미노산 또는 절편"에 상응하는" 하나의 서열의 아미노산 또는 절편은 표준 서열 정렬 프로그램, 예컨대 ALIGN, 클러스탈W 또는 유사한 것을 사용하여, 전형적으로 디폴트 설정에서 다른 아미노산 또는 절편과 정렬되는 것이고, 이는 인간 IgG1 중쇄와 적어도 50%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일성을 갖는다. 서열 또는 서열 내의 절편을 정렬하여 본 발명에 따른 아미노산 위치에 상응하는 서열 내의 위치를 결정하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 것으로 생각된다.

본 발명과 관련하여, 아미노산 위치는 상기 기재된 바와 같이 정의될 수 있다.

중쇄의 아미노산을 언급할 때 용어 "아미노산은 …가 아니다" 또는 유사한 표현은 아미노산이, 언급된 특정 아미노산 이외의 임의의 다른 아미노산임을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 인간 IgG1 중쇄의 L234에 상응하는 위치의 아미노산은 L이 아니다는, 아미노산이 L 이외의 다른 자연 또는 비-자연 발생 아미노산 중 임의의 것일 수 있다는 것을 의미한다.

한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 D가 아니다.

한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 D가 아니고, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 N297 및 P331에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 N 및 P이다.

한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 소수성 또는 극성 아미노산이다.

아미노산 잔기와 관련하여 본원에 사용된 용어 "소수성"은 A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W, 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기를 지칭한다.

따라서, 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W 및 Y로 이루어진 아미노산의 군으로부터 선택된다.

아미노산 잔기와 관련하여 본원에 사용된 용어 "극성"은 C, D, E, H, K, N, Q, R, S, 및 T로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 아미노산 잔기를 지칭한다. 따라서, 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 C, E, H, K, N, Q, R, S, 및 T로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또 다른 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 지방족 비하전, 방향족 또는 산성 아미노산이다.

아미노산 잔기와 관련하여 본원에 사용된 용어 "지방족 비하전"은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 아미노산 잔기를 지칭한다.

따라서, 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된다.

아미노산 잔기와 관련하여 본원에 사용된 용어 "방향족"은 F, T, 및 W로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 아미노산 잔기를 지칭한다.

따라서, 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 F, T, 및 W로 이루어진 군으로부터 선택된다.

아미노산 잔기와 관련하여 본원에 사용된 용어 "산성"은 D 및 E로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 아미노산 잔기를 지칭한다.

따라서, 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 D 및 E로 이루어진 군으로부터 선택된다.

따라서, 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 D 및 E로 이루어진 군으로부터 선택된다.

특정한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 A, E, F, G, I, L, T, V, 및 W로 이루어진 군으로부터 선택된다.

특정한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 A, E, F, G, I, L, T, V, 및 W로 이루어진 군으로부터 선택된다.

한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 D가 아니다.

한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 D가 아니다.

한 실시양태에서, 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 D가 아니고, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 N297 및 P331에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 N 및 P이다.

한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 D가 아니고, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 N297 및 P331에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 N 및 P이다.

한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 소수성 또는 극성 아미노산이다.

한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 소수성 또는 극성 아미노산이다.

따라서, 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W 및 Y로 이루어진 아미노산의 군으로부터 선택된다.

따라서, 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 중쇄의 위치 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 C, E, H, K, N, Q, R, S, 및 T로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W 및 Y로 이루어진 아미노산의 군으로부터 선택된다.

한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서 EU 넘버링에 따른 인간 중쇄의 위치 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 C, E, H, K, N, Q, R, S, 및 T로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또 다른 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 지방족 비하전, 방향족 또는 산성 아미노산이다.

따라서, 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된다.

따라서, 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 F, T, 및 W로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또 다른 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 지방족 비하전, 방향족 또는 산성 아미노산이다.

따라서, 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된다.

따라서, 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 F, T, 및 W로 이루어진 군으로부터 선택된다.

추가 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 N297에 상응하는 위치의 아미노산은 N이 아니다.

한 실시양태에서, 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 N297에 상응하는 위치의 아미노산은 N이 아니고, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 P331에 상응하는 위치의 아미노산은 P이다.

한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 N297에 상응하는 위치의 아미노산은 N이 아니다.

한 실시양태에서, 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 N297에 상응하는 위치의 아미노산은 N이 아니고, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 P331에 상응하는 위치의 아미노산은 P이다.

추가 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 L 및 L이 아니다.

한 실시양태에서, 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 L 및 L이 아니고, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 N297 및 P331에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 N 및 P이다.

한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234 및 L235에 상응하는 아미노산은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, Y, V로 이루어진 군으로부터 선택된다.

한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산은 소수성 또는 극성 아미노산이다.

따라서, 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 A, C, F, G, H, I, M, R, T, V, W, 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된다.

따라서, 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 C, D, E, H, K, N, Q, R, S, 및 T로 이루어진 아미노산의 군으로부터 선택된다.

특정한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된다.

한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 L 및 L이 아니다.

한 실시양태에서, 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 L 및 L이 아니고, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 N297 및 P331에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 N 및 P이다.

한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산은 소수성 또는 극성 아미노산이다.

한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 A, C, F, G, H, I, M, R, T, V, W, 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된다.

한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 C, D, E, H, K, N, Q, R, S, 및 T로 이루어진 아미노산의 군으로부터 선택된다.

특정한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또 다른 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산은 지방족 비하전, 방향족 또는 산성 아미노산이다.

따라서, 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 A, G, I, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된다.

따라서, 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 F, T, 및 W로 이루어진 군으로부터 선택된다.

따라서, 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 D 및 E로 이루어진 군으로부터 선택된다.

특정한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 A, D, E, F, G, I, T, V, 및 W로 이루어진 군으로부터 선택된다.

한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 F 및 E; 또는 A 및 A이다.

한 실시양태에서, 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 F 및 E; 또는 A 및 A이고, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 N297 및 P331에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 N 및 P이다.

한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 F 및 E; 또는 A 및 A이다.

한 실시양태에서, 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 F 및 E; 또는 A 및 A이고, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 N297 및 P331에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 N 및 P이다.

특정한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 F 및 E이다.

한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 F 및 E이다.

한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 적어도 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 A 및 A이다.

한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서 적어도 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 A 및 A이다.

한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234, L235, 및 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 L, L, 및 D가 아니다.

한 실시양태에서, 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 L234, L235, 및 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 L, L 및 D가 아니고, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 N297 및 P331에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 N 및 P이다.

한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234 및 L235에 상응하는 아미노산은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, Y, V, 및 W로 이루어진 군으로부터 선택되고, 위치 D265에 상응하는 아미노산은 A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, Y, V, 및 W로 이루어진 군으로부터 선택된다.

한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234, L235 및 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 소수성 또는 극성 아미노산이다.

따라서, 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W 및 Y로 이루어진 아미노산의 군으로부터 선택되고, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 A, C, F, G, H, I, M, R, T, V, W, 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된다.

따라서, 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 C, D, E, H, K, N, Q, R, S, 및 T로 이루어진 아미노산의 군으로부터 선택되고, EU 넘버링에 따른 인간 중쇄의 위치 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 C, E, H, K, N, Q, R, S, 및 T로 이루어진 군으로부터 선택된다.

특정한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된다.

한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 L234, L235, 및 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 소수성 또는 극성 아미노산이다.

한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W 및 Y로 이루어진 아미노산의 군으로부터 선택되고, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 A, C, F, G, H, I, M, R, T, V, W, 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된다.

한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 C, D, E, H, K, N, Q, R, S, 및 T로 이루어진 아미노산의 군으로부터 선택되고, EU 넘버링에 따른 인간 중쇄의 위치 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 C, E, H, K, N, Q, R, S, 및 T로 이루어진 군으로부터 선택된다.

특정한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또 다른 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234, L235 및 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 지방족 비하전, 방향족 또는 산성 아미노산이다.

따라서, 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 A, G, I, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된다.

따라서, 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234, L235 및 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 F, T, 및 W로 이루어진 군으로부터 선택된다.

따라서, 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234, L235, 및 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 D 및 E로 이루어진 군으로부터 선택된다.

특정한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 A, E, F, G, I, L, T, V, 및 W로 이루어진 군으로부터 선택되고, L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 A, D, E, F, G, I, T, V, 및 W로 이루어진 군으로부터 선택된다.

한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234, L235 및 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 L, L, 및 D가 아니다.

한 실시양태에서, 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 L234, L235, 및 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 L, L, 및 D가 아니고, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 N297 및 P331에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 N 및 P이다.

한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 L234, L235, 및 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 지방족 비하전, 방향족 또는 산성 아미노산이다.

한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 A, G, I, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된다.

한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234, L235, 및 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 D 및 E로 이루어진 군으로부터 선택된다.

특정한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 A, E, F, G, I, L, T, V, 및 W로 이루어진 군으로부터 선택되고, L234 및 L235에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 A, D, E, F, G, I, T, V, 및 W로 이루어진 군으로부터 선택된다.

한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234, L235, 및 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 F, E, 및 A; 또는 A, A, 및 A이다.

한 실시양태에서, 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 L234, L235, 및 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 F, E, 및 A; 또는 A, A, 및 A이고, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 N297 및 P331에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 N 및 P이다.

한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234, L235, 및 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 F, E, 및 A; 또는 A, A, 및 A이다.

한 실시양태에서, 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 L234, L235, 및 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 F, E, 및 A; 또는 A, A, 및 A이고, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 N297 및 P331에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 N 및 P이다.

특정한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234, L235, 및 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 F, E, 및 A이다.

특히 바람직한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234, L235, 및 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 F, E, 및 A이다.

한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234, L235, 및 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 A, A, 및 A이다.

한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234, L235, 및 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 A, A, 및 A이다.

또 다른 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234, L235, D265, N297, 및 P331에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 F, E, A, Q, 및 S이다.

한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234, L235, D265, N297, 및 P331에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 F, E, A, Q, 및 S이다.

특정한 실시양태에서 상기 제1 항원-결합 영역은 각각 서열식별번호: 1, 2 및 3에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 4, YTS 및 5에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고; 상기 제2 항원-결합 영역은 각각 서열식별번호: 64, 65 및 66에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 67, GAS 및 68에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고 (CD137 클론 009), 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서, 예컨대 상기 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서, 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234, L235, 및 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 F, E, 및 A이다.

또 다른 실시양태에서 상기 제1 항원-결합 영역은 각각 서열식별번호: 1, 2 및 3에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 4, YTS 및 5에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고; 상기 제2 항원-결합 영역은 각각 서열식별번호: 36, 37 및 38에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 39, SAS 및 40에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고 (CD137 클론 005), 및 제1 및 제2 중쇄 중 적어도 하나에서, 예컨대 상기 제1 및 제2 중쇄 둘 다에서, 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234, L235, 및 D265에 상응하는 위치의 아미노산은 각각 F, E, 및 A이다.

비-활성화 Fc 영역은 항체가 혈액 세포, 예컨대 단핵구 상에 존재하는 Fc-수용체와 상호작용하는 것을 막거나, 또는 C1q와 상호작용하여 고전적 보체 경로를 활성화하는 것을 막는다. Fc 활성의 감소는 Fc 영역 내에서 아미노산 치환의 상이한 조합을 함유하는 항체 변이체에서 시험하였다. 돌연변이 L234F, L235E, 및 D265A를 포함하는 3개의 아미노산 치환을 본 발명의 모 항체에 도입하였다. 이들 3개의 아미노산 위치에서의 치환을 K409R 및/또는 F405L IgG1 백본에 도입하였다. 생성된 비-활성화 항체 변이체를 각각 접미어 "FEAR" 또는 "FEAL"을 붙여 칭한다. 상기 모 항체를 사용하여 실시예에 기재된 바와 같이 본 발명의 이중특이적 항체를 생성하였다.

한 측면에서, 본 발명에 따른 다중특이적 항체는 발현 수준 및/또는 생산 수율을 증가시키기 위해 경쇄 및/또는 중쇄에서 변형될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 경쇄에서 변형될 수 있다. 이러한 변형은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Zheng, L., Goddard, J.-P., Baumann, U., & Reymond, J.-L. (2004). Expression improvement and mechanistic study of the retro-Diels-Alderase catalytic antibody 10F11 by site-directed mutagenesis. Journal of Molecular Biology, 341(3), 807-14]에 기재된 방법에 따라 수행될 수 있다.

본 발명의 추가 실시양태에서, 본 발명의 다중특이적 항체의 일부를 형성하는 항체 중 하나 또는 둘 다를, 다중특이적 항체의 혈청 반감기를 조작하기 위해 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 대한 결합을 감소 또는 증가시키도록 조작하였다. 혈청 반감기를 증가 또는 감소시키기 위한 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Dall'Acqua et al. 2006, J. Biol. Chem., 281:23514-24; Hinton et al. 2006,J. Immunol., 176:346-56; 및 Zalevsky et al. 2010 Nat. Biotechnol., 28:157-9]을 참조한다.

한 측면에서, 본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 다중특이적 항체는 제1 불변 중쇄 (HC) 및 제1 불변 경쇄 (LC)를 포함하며, 여기서 제1 중쇄 및 제2 중쇄 둘 다의 서열식별번호: 109의 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234, L235, 및 D265에 상응하는 위치는 각각 F, E, 및 A이다.

한 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 다중특이적 항체는 제1 및 제2 불변 중쇄 (HC) 및 제1 및 제2 불변 경쇄 (LC)를 포함하며, 여기서 제1 중쇄 및 제2 중쇄 둘 다의 서열식별번호: 109의 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치는 각각 F 및 E이다.

한 실시양태에서, 다중특이적 항체는 제1 및 제2 중쇄를 포함하며, 여기서 제1 중쇄 및 제2 중쇄 둘 다의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치는 각각 F 및 E이고, (i) 제1 중쇄의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 F405에 상응하는 위치는 L이고, 제2 중쇄의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 K409에 상응하는 위치는 R이거나, 또는 (ii) 제1 중쇄의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 K409에 상응하는 위치는 R이고, 제2 중쇄의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 F405에 상응하는 위치는 L이다.

한 실시양태에서, 다중특이적 항체는 제1 및 제2 중쇄를 포함하며, 여기서 제1 및 제2 중쇄 둘 다의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234, L235, 및 D265에 상응하는 위치는 각각 F, E, 및 A이고, 제1 중쇄의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 F405에 상응하는 위치는 L이고, 제2 중쇄의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 K409에 상응하는 위치는 R이다. 따라서 추가 실시양태에서, 상기 제1 중쇄는 서열식별번호: 113에 제시된 바와 같은 불변 중쇄 서열을 포함하고; 제2 중쇄는 서열식별번호: 112에 제시된 바와 같은 불변 중쇄 서열을 포함한다.

한 실시양태에서, 다중특이적 항체는 제1 및 제2 중쇄를 포함하며, 여기서 제1 및 제2 중쇄 둘 다의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 위치 L234, L235, 및 D265에 상응하는 위치는 각각 F, E, 및 A이고, 제1 중쇄의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 K409에 상응하는 위치는 R이고, 제2 중쇄의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄의 F405에 상응하는 위치는 L이다. 따라서 추가 실시양태에서, 상기 제1 중쇄는 서열식별번호: 112에 제시된 바와 같은 불변 중쇄 서열을 포함하고; 제2 중쇄는 서열식별번호: 113에 제시된 바와 같은 불변 중쇄 서열을 포함한다.

핵산

본 발명은 또한 본원에 개시된 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 하나 이상의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본원에 개시된 임의의 측면 또는 실시양태에 정의된 바와 같은 다중특이적 항체를 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명의 핵산을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 상기 숙주 세포는 재조합 진핵, 재조합 원핵, 또는 재조합 미생물 숙주 세포이다.

추가 실시양태에서, 발현 벡터는 항체, 예를 들어 인간 항체의 경쇄, 중쇄, 또는 경쇄 및 중쇄 둘 다의 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.

본 발명과 관련하여 발현 벡터는 염색체, 비-염색체 및 합성 핵산 벡터 (발현 제어 요소의 적합한 세트를 포함하는 핵산 서열)를 포함한 임의의 적합한 벡터일 수 있다. 이러한 벡터의 예는 SV40의 유도체, 박테리아 플라스미드, 파지 DNA, 바큘로바이러스, 효모 플라스미드, 플라스미드 및 파지 DNA의 조합으로부터 수득된 벡터, 및 바이러스 핵산 (RNA 또는 DNA) 벡터를 포함한다. 한 실시양태에서, 핵산은 예를 들어 선형 발현 요소 (예를 들어, 문헌 [Sykes and Johnston, Nat Biotech 17, 355 59 (1997)]에 기재된 바와 같음), 압축된 핵산 벡터 (예를 들어, US 6,077,835 및/또는 WO 00/70087에 기재된 바와 같음), 플라스미드 벡터, 예컨대 pBR322, pUC 19/18, 또는 pUC 118/119, "난쟁이" 최소-크기 핵산 벡터 (예를 들어, 문헌 [Schakowski et al., Mol Ther 3, 793 800 (2001)]에 기재된 바와 같음)를 포함한 네이키드 DNA 또는 RNA 벡터 내에, 또는 침전된 핵산 벡터 구축물, 예컨대 CaP04-침전된 구축물로서 (예를 들어, WO200046147, 문헌 [Benvenisty and Reshef, PNAS USA 83, 9551 55 (1986), Wigler et al., Cell 14, 725 (1978), 및 Coraro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 603 (1981)]에 기재된 바와 같음) 포함된다. 이러한 핵산 벡터 및 그의 용법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, US 5,589,466 및 US 5,973,972 참조).

한 실시양태에서, 벡터는 박테리아 세포에서 CD40 항체 및/또는 CD137 항체의 발현에 적합하다. 이러한 벡터의 예는 발현 벡터, 예컨대 블루스크립트(BlueScript) (스트라타진(Stratagene)), pIN 벡터 (문헌 [Van Heeke & Schuster, J Biol Chem 264, 5503 5509 (1989)]), pET 벡터 (노바젠(Novagen), 위스콘신주 매디슨) 등을 포함한다.

발현 벡터는 또한 또는 대안적으로 효모 시스템에서의 발현에 적합한 벡터일 수 있다. 효모 시스템에서의 발현에 적합한 임의의 벡터가 사용될 수 있다. 적합한 벡터는 예를 들어 구성적 또는 유도성 프로모터 예컨대 알파 인자, 알콜 옥시다제 및 PGH를 포함하는 벡터를 포함한다 (문헌 [F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York (1987), 및 Grant et al., Methods in Enzymol 153, 516 544 (1987)]에서 재검토됨).

발현 벡터는 또한 또는 대안적으로 포유동물 세포에서의 발현에 적합한 벡터, 예를 들어 선택 마커로서 글루타민 신테타제를 포함하는 벡터, 예컨대 문헌 [Bebbington (1992) Biotechnology (NY) 10:169-175]에 기재된 벡터일 수 있다.

핵산 및/또는 벡터는 또한 폴리펩티드, 예컨대 신생 폴리펩티드 쇄를 주변세포질 공간으로 또는 세포 배양 배지 내로 표적화할 수 있는, 분비/국재화 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 분비 리더 또는 신호 펩티드를 포함한다.

발현 벡터는 임의의 적합한 프로모터, 인핸서, 및 다른 발현-촉진 요소를 포함할 수 있거나 또는 이와 회합될 수 있다. 이러한 요소의 예는 강한 발현 프로모터 (예를 들어, 인간 CMV IE 프로모터/인핸서 뿐만 아니라 RSV, SV40, SL3 3, MMTV, 및 HIV LTR 프로모터), 유효 폴리 (A) 종결 서열, 이. 콜라이(E. coli)에서의 플라스미드 생성물을 위한 복제 기점, 선택 마커로서 항생제 저항성 유전자, 및/또는 편리한 클로닝 부위 (예를 들어, 폴리링커)를 포함한다. 핵산은 또한, 구성적 프로모터, 예컨대 CMV IE와 대조적으로 유도성 프로모터를 포함할 수 있다.

한 실시양태에서, CD40 및/또는 CD137 항체-코딩 발현 벡터는 바이러스 벡터를 통해 숙주 세포 또는 숙주 동물 내에 위치할 수 있고/거나 전달될 수 있다.

추가 측면에서, 본 발명은 상기 본원에 명시된 제1 및 제2 핵산 구축물을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.

따라서 본 발명은 또한, 본 발명의 다중특이적 항체를 생산하는 재조합 진핵 또는 원핵 숙주 세포, 예컨대 트랜스펙토마에 관한 것이다.

제1, CD40-특이적, 항체는 본원에 정의된 바와 같은 항체를 생산하는 재조합 진핵 또는 원핵 숙주 세포, 예컨대 트랜스펙토마에서 발현될 수 있다. 제2, CD137-특이적 항체도 마찬가지로 항체를 생산하는 재조합 진핵 또는 원핵 숙주 세포, 예컨대 트랜스펙토마에서 발현될 수 있다. 이러한 항체는 본 발명에 따른 다중특이적 항체를 제조하는데 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 다중특이적 항체는 또한 재조합 진핵 또는 원핵 숙주 세포, 예컨대 트랜스펙토마에서 발현될 수 있다.

숙주 세포의 예는 효모, 박테리아, 식물 및 포유동물 세포, 예컨대 CHO, CHO-S, HEK, HEK293, HEK-293F, Expi293F, PER.C6 또는 NS0 세포 또는 림프구성 세포를 포함한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 숙주 세포는 세포 게놈 내로 안정하게 통합된 제1 및 제2 핵산 구축물을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 명시된 바와 같은 제1 및 제2 핵산 구축물을 포함하는, 비-통합된 핵산, 예컨대 플라스미드, 코스미드, 파지미드, 또는 선형 발현 요소를 포함하는 세포를 제공한다.

추가 측면에서, 본 발명은 1개 또는 2개 세트의 인간 중쇄 및 인간 경쇄를 코딩하는 핵산을 포함하는 트랜스제닉 비-인간 동물 또는 식물에 관한 것이며, 여기서 동물 또는 식물은 본 발명의 다중특이적 항체를 생산한다.

제1, CD40-특이적 항체 및/또는 제2, CD137-특이적 항체는 또한 1개 또는 2개 세트의 인간 중쇄 및 인간 경쇄를 코딩하는 핵산을 포함하는 하이브리도마, 트랜스제닉 비-인간 동물 또는 식물에 의해 생산될 수 있으며, 여기서 동물 또는 식물은 다중특이적 항체에 사용하기 위한 항체 또는 본 발명의 다중특이적 항체를 생산한다.

한 측면에서, 본 발명은 표 1에 설정된 1개 이상의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

한 측면에서, 본 발명은

(i) 본원에 개시된 실시양태 중 어느 하나에 따른 제1 결합 아암의 중쇄 서열을 코딩하는 핵산 서열;

(ii) 본원에 개시된 실시양태 중 어느 하나에 따른 제1 결합 아암의 경쇄 서열을 코딩하는 핵산 서열;

(iii) 본원에 개시된 실시양태 중 어느 하나에 따른 제2 결합 아암의 중쇄 서열을 코딩하는 핵산 서열;

(iv) 본원에 개시된 실시양태 중 어느 하나에 따른 제2 결합 아암의 경쇄 서열을 코딩하는 핵산 서열;

(v) (i)에 제시된 핵산 및 (ii)에 제시된 핵산;

(vi) (iii)에 제시된 핵산 및 (iv)에 제시된 핵산;

(vii) (i), (ii), (iii) 및 (iv)에 제시된 핵산

을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.

특정한 실시양태에서, 핵산은 표 1에 열거된 CD40 항체의 VH CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 코딩할 수 있고, 서열식별번호: 110, 111, 112, 113 및 116으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 인간 IgG1 중쇄를 코딩할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 핵산은 표 1에 열거된 CD137 항체 중 하나, 즉, 클론 001-012 중 어느 하나의 VH CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 코딩할 수 있고, 서열식별번호: 110, 111, 112, 113 및 116으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 인간 IgG1 중쇄를 코딩할 수 있다.

별개의 및 구체적 실시양태에서, 본 발명에 따른 핵산, 핵산 구축물, 제1 및 제2 핵산 구축물의 조합, 발현 벡터, 또는 제1 및 제2 발현 벡터의 조합은 하기를 코딩할 수 있다.

(a) (i) 표 1의 CD40 항체의 VH CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 임의로 비-인간 아미노산 서열로의 1개 이상의 아미노산 복귀돌연변이를 포함하는 주로 인간 프레임워크 영역을 포함하는 VH, 및 (ii) 서열식별번호: 110, 111, 112, 113 및 116으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 인간 IgG1 중쇄를 포함하는 HC;

(b) (i) 표 1에 열거된 CD137 항체 중 하나, 즉, 클론 001-012 중 어느 하나의 VH CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 임의로 비-인간 아미노산 서열로의 1개 이상의 아미노산 복귀돌연변이를 포함하는 주로 인간 프레임워크 영역을 포함하는 VH, 및 (ii) 서열식별번호: 110, 111, 112, 113 및 116으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 인간 IgG1 중쇄를 포함하는 HC;

(c) (i) 표 1의 CD40 항체의 VL CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 임의로 비-인간 아미노산 서열로의 1개 이상의 아미노산 복귀돌연변이를 포함하는 주로 인간 프레임워크 영역을 포함하는 VL, 및 (ii) 서열식별번호: 114의 서열을 갖는 경쇄 불변 영역을 포함하는 LC;

(d) (i) 표 1에 열거된 CD137 항체 중 하나, 즉, 클론 001-012 중 어느 하나의 VL CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 임의로 비-인간 아미노산 서열로의 1개 이상의 아미노산 복귀돌연변이를 포함하는 주로 인간 프레임워크 영역을 포함하는 VL, 및 (ii) 서열식별번호: 114의 서열을 갖는 경쇄 불변 영역을 포함하는 LC;

(e) (a) 및 (b) 둘 다;

(f) (a) 및 (c) 둘 다;

(g) (b) 및 (d) 둘 다;

(h) (c) 및 (d) 둘 다; 또는

(i) (a), (b), (c) 및 (d) 모두.

다른 별개의 및 구체적 실시양태에서, 본 발명에 따른 핵산, 핵산 구축물, 제1 및 제2 핵산 구축물의 조합, 발현 벡터, 또는 제1 및 제2 발현 벡터의 조합은 하기를 코딩할 수 있다.

(a) (i) 서열식별번호: 1, 2 및 3의 VH CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 임의로 비-인간 아미노산 서열로의 1개 이상의 아미노산 복귀돌연변이를 포함하는 주로 인간 프레임워크 영역을 포함하는 VH, 및 (ii) 서열식별번호: 110, 111, 112, 113 및 116으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 인간 IgG1 중쇄를 포함하는 HC;

(b) (i) 서열식별번호: 64, 65 및 66의 VH CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 임의로 비-인간 아미노산 서열로의 1개 이상의 아미노산 복귀돌연변이를 포함하는 주로 인간 프레임워크 영역을 포함하는 VH, 및 (ii) 서열식별번호: 110, 111, 112, 113 및 116으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 인간 IgG1 중쇄를 포함하는 HC;

(c) (i) 서열식별번호: 4, YTS 및 서열식별번호: 5의 VL CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 임의로 비-인간 아미노산 서열로의 1개 이상의 아미노산 복귀돌연변이를 포함하는 주로 인간 프레임워크 영역을 포함하는 VL, 및 (ii) 서열식별번호: 114의 서열을 갖는 경쇄 불변 영역을 포함하는 LC;

(d) (i) 서열식별번호: 67, GAS 및 서열식별번호: 68의 VL CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 임의로 비-인간 아미노산 서열로의 1개 이상의 아미노산 복귀돌연변이를 포함하는 주로 인간 프레임워크 영역을 포함하는 VL, 및 (ii) 서열식별번호: 114의 서열을 갖는 경쇄 불변 영역을 포함하는 LC;

(e) (a) 및 (b) 둘 다;

(f) (a) 및 (c) 둘 다;

(g) (b) 및 (d) 둘 다;

(h) (c) 및 (d) 둘 다; 또는

(i) (a), (b), (c) 및 (d) 모두.

(a) 서열식별번호: 117을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 110, 111, 112, 113 및 116으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 인간 IgG1 중쇄를 포함하는 HC;

(b) 서열식별번호: 123을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 110, 111, 112, 113 및 116으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 인간 IgG1 중쇄를 포함하는 HC;

(c) 서열식별번호: 121을 포함하는 VL 및 서열식별번호: 114의 서열을 갖는 경쇄 불변 영역을 포함하는 LC;

(d) 서열식별번호: 127을 포함하는 VL 및 서열식별번호: 114의 서열을 갖는 경쇄 불변 영역을 포함하는 LC;

(e) (a) 및 (b) 둘 다;

(f) (a) 및 (c) 둘 다;

(g) (b) 및 (d) 둘 다;

(h) (c) 및 (d) 둘 다; 또는

(i) (a), (b), (c) 및 (d) 모두.

(a) 서열식별번호: 118 (CD40-001-HC6, IgG1)을 포함하는 HC;

(b) 서열식별번호: 119 (CD40-001-HC6-FEAL)를 포함하는 HC;

(c) 서열식별번호: 120 (CD40-001-HC6-FEAR)을 포함하는 HC;

(d) 서열식별번호: 124 (CD137-009-HC7)를 포함하는 HC;

(e) 서열식별번호: 125 (CD137-009-HC7-FEAR)를 포함하는 HC;

(f) 서열식별번호: 126 (CD137-009-HC7-FEAL)을 포함하는 HC;

(g) 서열식별번호: 122 (CD40-001-LC1)를 포함하는 LC;

(h) 서열식별번호: 128 (CD137-009-LC2)을 포함하는 LC;

(i) (a) 및 (g) 둘 다;

(j) (b) 및 (g) 둘 다;

(k) (c) 및 (g) 둘 다;

(l) (d) 및 (h) 둘 다;

(m) (e) 및 (h) 둘 다;

(n) (f) 및 (h) 둘 다;

(o) (b) 및 (e) 둘 다;

(p) (c) 및 (f) 둘 다;

(q) (g) 및 (h) 둘 다;

(r) (b), (e), (g) 및 (h) 모두;

(s) (c), (f), (g) 및 (h) 모두.

한 측면에서, 본 발명은

a) 본원에 개시된 바와 같은 제1 항체를 발현하는 본원에 개시된 바와 같은 발현 벡터를 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 숙주 세포를 배양하고, 상기 항체를 배양 배지로부터 정제하는 단계;

b) 본원에 개시된 바와 같은 제2 항체를 발현하는 본원에 개시된 바와 같은 발현 벡터를 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 숙주 세포를 배양하고, 상기 항체를 배양 배지로부터 정제하는 단계;

c) 상기 제1 항체를 상기 제2 항체와 함께, 힌지 영역 내의 시스테인이 디술피드 결합 이성질화를 거치게 하는데 충분한 환원 조건 하에 인큐베이션하는 단계; 및

d) 상기 이중특이적 항체를 수득하는 단계

를 포함하는, 본원에 개시된 바와 같은 실시양태 중 어느 하나에 따른 이중특이적 항체를 생산하는 방법에 관한 것이다.

한 측면에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 재조합 진핵, 재조합 원핵, 또는 재조합 미생물 숙주 세포이다.

조성물

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 다중특이적 항체, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 발현 벡터 또는 본 발명에 따른 숙주 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

추가 실시양태에서 본 발명에 따른 조성물은 제약 조성물이다.

추가 실시양태에서, 본 발명에 따른 제약 조성물은 추가로 제약상 허용되는 담체를 포함한다.

추가 측면에서, 본 발명은

- 본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 다중특이적 CD40xCD137 항체, 및

- 제약상 허용되는 담체

를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 제약 조성물은 본 발명의 하나의 다중특이적 항체 또는 본 발명의 상이한 다중특이적 항체의 조합을 함유할 수 있다.

제약 조성물은 통상적인 기술 예컨대 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995]에 개시된 바에 따라 제제화될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 예를 들어 희석제, 충전제, 염, 완충제, 세제 (예를 들어, 비이온성 세제, 예컨대 트윈(Tween)-20 또는 트윈-80), 안정화제 (예를 들어, 당 또는 단백질-무함유 아미노산), 보존제, 조직 고정제, 가용화제, 및/또는 제약 조성물에 포함되기에 적합한 다른 물질을 포함할 수 있다.

제약상 허용되는 담체는 본 발명의 다중특이적 항체와 생리학상 상용성인 임의의 및 모든 적합한 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제, 항산화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 본 발명의 제약 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 염수, 포스페이트 완충 염수, 에탄올, 덱스트로스, 폴리올 (예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 등), 및 그의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 카르복시메틸 셀룰로스 콜로이드성 용액, 트라가칸트 검 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트, 및/또는 다양한 완충제를 포함한다. 제약상 허용되는 담체는 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 적절한 유동성은, 예를 들어 코팅 물질, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에는 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.

또한, 본 발명의 제약 조성물은 제약상 허용되는 항산화제, 예를 들어 (1) 수용성 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 히드로클로라이드, 중황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨 등; (2) 유용성 항산화제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔, 부틸화 히드록시톨루엔, 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트화제, 예를 들어 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등을 또한 포함할 수 있다.

본 발명의 제약 조성물은 또한 등장화제, 예컨대 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 글리세롤 또는 염화나트륨을 조성물에 포함할 수 있다.

본 발명의 제약 조성물은 또한 제약 조성물의 보관 수명 또는 유효성을 증진시킬 수 있는, 선택된 투여 경로에 적절한 1종 이상의 아주반트, 예컨대 보존제, 습윤제, 유화제, 분산제, 보존제 또는 완충제를 함유할 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 다중특이적 항체를 급속 방출로부터 보호할 담체와 함께, 예컨대 임플란트, 경피 패치, 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함한 제어 방출 제제로 제조될 수 있다. 이러한 담체는 젤라틴, 글리세릴 모노스테아레이트, 글리세릴 디스테아레이트, 생분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산을 단독으로, 또는 왁스 또는 관련 기술분야에 널리 공지된 다른 물질과 함께 포함할 수 있다. 이러한 제제의 제조 방법은 일반적으로 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.

멸균 주사가능한 용액은 활성 화합물을 적절한 용매 중에 필요한 양으로, 예를 들어 상기 열거된 바와 같은 성분 중 하나 또는 조합과 함께 혼입시킨 후, 필요에 따라 멸균 마이크로여과함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 예를 들어 상기 열거된 것으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 제조 방법의 예는 이전에 멸균-여과된 그의 용액으로부터 활성 성분 플러스 임의의 추가의 목적하는 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 냉동-건조 (동결건조)이다.

제약 조성물 중의 활성 성분의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성이지 않으면서, 특정한 환자, 조성물, 및 투여 방식에 대한 목적하는 치료 반응을 달성하는데 효과적인 활성 성분의 양을 수득하기 위해 달라질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용되는 본 발명의 특정한 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정한 화합물의 배출 속도, 치료 지속기간, 사용되는 특정한 조성물과 조합되어 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 전반적 건강 및 과거 병력, 및 의학 기술분야에 널리 공지되어 있는 기타 인자를 포함한 다양한 약동학적 인자에 좌우될 것이다.

제약 조성물은 임의의 적합한 경로 및 방식에 의해 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 비경구로 투여된다. 본원에 사용된 바와 같은 "비경구로 투여되는"은 경장 및 국소 투여 이외의 투여 방식, 통상적으로 주사에 의한 투여 방식을 의미하고, 표피, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 건내, 경기관, 피하, 각피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 두개내, 흉곽내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.

한 실시양태에서, 제약 조성물은 정맥내 또는 피하 주사 또는 주입에 의해 투여된다.

용도

본 발명은 또한 의약으로 사용하기 위한 본 발명에 따른 다중특이적 항체, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 발현 벡터, 본 발명에 따른 숙주 세포, 본 발명에 따른 조성물, 또는 본 발명에 따른 제약 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 질환, 예컨대 암 또는 감염성 질환의 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 다중특이적 항체, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 발현 벡터, 본 발명에 따른 숙주 세포, 본 발명에 따른 조성물, 또는 본 발명에 따른 제약 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 용어 "질환"은 임의의 병리학적 상태, 특히 암, 감염성 질환, 염증성 질환, 대사 질환, 자가면역 장애, 변성 질환, 아폽토시스-연관 질환 및 이식 거부를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "암"은 비정상적으로 조절되는 세포 성장, 증식, 분화, 유착 및/또는 이동을 특징으로 하는 질환을 포함한다. "암 세포"는 신속한, 비제어 세포 증식에 의해 성장하고, 새로운 성장 중지를 개시하는 자극 후에도 계속 성장하는 비정상 세포를 의미한다.

본 발명에 따른 용어 "암"은 백혈병, 정상피종, 흑색종, 기형종, 림프종, 신경모세포종, 신경교종, 직장암, 자궁내막암, 신장암, 부신암, 갑상선암, 혈액암, 피부암, 뇌암, 자궁경부암, 장암, 간암, 결장암, 위암, 장암, 두경부암, 위장암, 림프절암, 식도암, 결장직장암, 췌장암, 귀, 코 및 인후 (ENT) 암, 유방암, 전립선암, 자궁암, 난소암 및 폐암 및 그의 전이를 포함한다. 그의 예는 폐 암종, 유방 암종, 전립선 암종, 결장 암종, 신세포 암종, 자궁경부 암종, 또는 상기 기재된 암 유형 또는 종양의 전이이다.

본 발명에 따른 용어 "암"은 또한 암 전이를 포함한다. "전이"는 암 세포가 그의 원래의 부위에서 신체의 또 다른 부분으로 확산된 것을 의미한다. 전이의 형성은 매우 복잡한 과정이고, 악성 세포의 원발성 종양으로부터의 탈착, 세포외 매트릭스의 침습, 내피 기저막의 침투에 의한 체강 및 혈관으로의 진입, 및 이어서 혈액에 의한 수송 후 표적 기관의 침윤에 좌우된다. 최종적으로, 표적 부위에서의 새로운 종양, 즉 속발성 종양 또는 전이성 종양의 성장은 혈관신생에 좌우된다. 종양 전이는 종종 원발성 종양의 제거 후에도 발생하고, 이는 종양 세포 또는 성분이 잔류하여 전이 잠재력을 전개할 수 있기 때문이다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 용어 "전이"는 원발성 종양 및 부위 림프절 시스템으로부터 떨어진 전이와 관련된 "원격 전이"와 관련된다.

용어 "감염성 질환"은 개체에서 개체로 또는 유기체에서 유기체로 전염될 수 있고, 미생물제에 의해 유발되는 (예를 들어 감기) 임의의 질환을 지칭한다.

감염성 질환의 예는 바이러스 감염성 질환, 예컨대 AIDS (HIV), A형, B형 또는 C형 간염, 포진, 대상 포진 (수두), 독일 홍역 (풍진 바이러스), 황열, 뎅기 등 플라비바이러스, 인플루엔자 바이러스, 출혈성 감염성 질환 (마르부르크(Marburg) 또는 에볼라(Ebola) 바이러스), 및 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS), 박테리아 감염성 질환, 예컨대 레지오넬라병 (레지오넬라(Legionella)), 성 매개 질환 (예를 들어 클라미디아 또는 임질), 위 궤양 (헬리코박터(Helicobacter)), 콜레라 (비브리오(Vibrio)), 결핵, 디프테리아, 이. 콜라이, 스타필로코쿠스(Staphylococci), 살모넬라(Salmonella) 또는 스트렙토코쿠스(Streptococci)에 의한 감염 (파상풍); 원충 병원체 예컨대 말라리아에 의한 감염, 수면병, 리슈마니아증; 톡소플라스마증, 즉, 플라스모디움(Plasmodium), 트리파노소마(Trypanosoma), 리슈마니아(Leishmania) 및 톡소플라스마(Toxoplasma)에 의한 감염; 또는 예를 들어, 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 히스토플라스마 캅술라툼(Histoplasma capsulatum), 콕시디오이데스 임미티스(Coccidioides immitis), 블라스토미세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis) 또는 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 의해 유발된 진균 감염을 포함한다.

용어 "염증성 질환"은 조직, 특히 결합 조직에서의 높은 수준의 염증, 또는 이들 조직의 변성을 특징으로 하거나 또는 이와 연관된 임의의 질환을 지칭한다. 만성 염증성 질환은 지속적인 염증을 특징으로 하는 의학적 상태이다. (만성) 염증성 질환의 예는 복강 질환, 혈관염, 루푸스, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 과민성 장 질환, 아테롬성동맥경화증, 관절염, 강직성 척추염, 크론병, 결장염, 만성 활성 간염, 피부염 및 건선을 포함한다.

용어 "대사 질환"은 정상 대사를 방해하는 임의의 질환 또는 장애를 지칭한다. 예는 시스틴축적증, 당뇨병, 이상지혈증, 갑상선기능항진증, 갑상선기능저하증, 고지혈증, 저지혈증, 갈락토스혈증, 고셔병, 비만 및 페닐케톤뇨를 포함한다.

용어 "자가면역 장애"는 신체가 그 자체의 조직의 일부 구성성분에 대해 면역원성 (즉, 면역계) 반응을 생성하는 임의의 질환/장애를 지칭한다. 다시 말해서, 면역계는 신체 내의 일부 조직 또는 시스템을 자기로서 인식하는 능력을 상실하고, 그것을 그것이 외래인 것처럼 표적화하고 공격한다. 자가면역 질환은 우세하게 하나의 기관이 영향을 받는 것 (예를 들어 용혈성 빈혈 및 항-면역 갑상선염) 및 자가면역 질환 과정이 많은 조직을 통해 확산된 것 (예를 들어 전신 홍반성 루푸스)으로 분류될 수 있다. 예를 들어, 다발성 경화증은 뇌 및 척수의 신경 섬유를 둘러싸는 외피를 공격하는 T 세포에 의해 유발되는 것으로 생각된다. 이는 조정력 상실, 쇠약 및 흐린 시각을 야기한다. 자가면역 질환은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 하시모토 갑상선염, 그레이브스병, 루푸스, 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 용혈성 빈혈, 항-면역 갑상선염, 전신 홍반성 루푸스, 복강 질환, 크론병, 결장염, 당뇨병, 경피증, 건선 등을 포함한다.

용어 "변성 질환"은 이환 조직 또는 기관의 기능 또는 구조가 시간의 경과에 따라 점점 악화될 임의의 질환을 지칭한다. 예는 알츠하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 헌팅턴병, 황반 변성, 다발성 경화증, 근육 이영양증, 니만 픽병, 골다공증 및 류마티스 관절염을 포함한다.

용어 "아폽토시스-연관 질환"은 아폽토시스의 변경이 수반되는 임의의 질환을 지칭한다. 예는 암, 신경계 장애, 예컨대 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 및 졸중, 심장 질환, 예컨대 허혈 재관류 및 만성 심부전, 감염성 질환 및 자가면역 질환을 포함한다.

용어 "이식 거부"는 수용자의 면역계에 의한 이식된 조직 또는 기관의 거부를 지칭하고, 이는 궁극적으로 이식된 조직 또는 기관을 파괴할 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명에 따른 용도를 위한 다중특이적 항체, 핵산, 발현 벡터, 숙주 세포 또는 조성물의 용도는 암을 치료하기 위한 것일 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명에 따른 용도를 위한 다중특이적 항체, 핵산, 발현 벡터, 숙주 세포 또는 조성물의 용도는 감염성 질환을 치료하기 위한 것일 수 있다.

본 발명은 또한 질환, 예컨대 암 또는 감염성 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 본 발명에 따른 다중특이적 항체, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 발현 벡터, 본 발명에 따른 숙주 세포, 본 발명에 따른 조성물, 또는 본 발명에 따른 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 질환, 예컨대 암 또는 감염성 질환의 치료 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 의약의 제조를 위한 본 발명에 따른 다중특이적 항체, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 발현 벡터, 본 발명에 따른 숙주 세포, 본 발명에 따른 조성물, 또는 본 발명에 따른 제약 조성물의 용도에 관한 것이다.

한 실시양태에서 본 발명에 따른 방법 또는 용도는 1종 이상의 추가의 치료제, 예컨대 화학요법제와 조합하여 사용하기 위한 것이다.

한 측면에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 본원에 개시된 실시양태 중 어느 하나에 따른 다중특이적 항체, 예컨대 이중특이적 항체, 본원에 개시된 바와 같은 조성물, 또는 본원에 개시된 바와 같은 제약 조성물에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 질환, 예컨대 암 또는 감염성 질환의 치료를 위한 의약의 제조에서의 본 발명에 따른 다중특이적 항체의 용도에 관한 것이다.

한 측면에서, 본 발명은 질환, 예컨대 암 또는 감염성 질환의 치료에 사용하기 위한 본원에 개시된 실시양태 중 어느 하나에 따른 다중특이적 항체, 본원에 개시된 봐와 같은 조성물, 또는 본원에 개시된 바와 같은 제약 조성물에 관한 것이다.

한 측면에서, 본 발명은 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 본원에 개시된 실시양태 중 어느 하나에 따른 다중특이적 항체, 본원에 개시된 봐와 같은 조성물, 또는 본원에 개시된 바와 같은 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 질환의 치료 방법에 관한 것이다.

본 발명의 다중특이적 항체는 수많은 목적으로 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 다중특이적 항체는 전이성 암 및 불응성 암을 포함한 다양한 형태의 암을 치료하는데 사용될 수 있다.

한 실시양태에서 본 발명에 따른 사용은 1종 이상의 추가의 치료제, 예컨대 화학요법제와 조합된다.

특히, 본 발명에 따른 다중특이적 항체는 T 세포의 증가하는 증식과 관련된 치료적 환경에서 유용할 수 있다. 이러한 치료적 환경의 예는 암 또는 종양, 예컨대 혈액 및 고형 종양, 예를 들어, 흑색종, 폐암, 유방암, 비소세포 폐암 (NSCLC), 결장암, 신암, 자궁경부암 및 전립선암, 예컨대 흑색종 또는 NSCLC를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 그의 예는 폐 암종, 유방 암종, 전립선 암종, 결장 암종, 신세포 암종, 자궁경부 암종, 또는 이러한 암 유형 또는 종양의 전이이다.

본 발명은 또한

a) 암을 앓고 있는 대상체를 선택하는 단계, 및

b) 본 발명의 다중특이적 항체 또는 본 발명의 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 단계

를 포함하는, 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 암, 예컨대 본원에 언급된 구체적 암 적응증 중 하나의 치료를 위한 의약의 제조를 위한, 인간 CD40 및 인간 CD137에 결합하는 다중특이적 항체의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 추가로, 암, 예컨대 상기 언급된 암 적응증 중 하나의 치료에 사용하기 위한 다중특이적 항체에 관한 것이다.

상기 언급된 용도를 위해, 본 발명의 임의의 다중특이적 항체, 예컨대 이중특이적 항체가 사용될 수 있다.

한 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 실시양태 중 어느 하나에 따른 다중특이적 항체를 포함하는 진단 조성물에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 진단 조성물은 다중특이적 항체에 의한 치료로부터 이익을 얻을 환자를 스크리닝하고 선택하는데 사용되는 동반 진단제이다.

본 발명의 치료 방법의 추가 실시양태에서, 치료의 효능은 요법 동안, 예를 들어 소정의 시점에, 종양 부담을 결정함으로써 모니터링된다.

상기 치료 방법 및 용도에서 투여 요법은 최적의 목적하는 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하기 위해 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스를 투여할 수 있거나, 여러 분할 용량을 시간의 경과에 따라 투여할 수 있거나 또는 용량은 치료 상황의 위급성에 의해 제시되는 바와 비례하여 감소 또는 증가될 수 있다. 비경구 조성물은 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 제제화될 수 있다.

다중특이적 항체에 대한 효율적인 투여량 및 투여 요법은 치료될 질환 또는 상태에 좌우되고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 다중특이적 항체의 치료 유효량에 대한 예시적인 비제한적 범위는 약 0.001-30 mg/kg이다.

관련 기술분야의 통상의 기술을 갖는 의사 또는 수의사는 필요한 제약 조성물의 유효량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는 제약 조성물에 사용되는 다중특이적 항체의 용량을 목적하는 치료 효과를 달성하기 위해 요구되는 수준보다 낮은 수준으로 시작할 수 있고 목적하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점차적으로 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 다중특이적 항체의 적합한 1일 용량은 치료 효과를 생성하는데 효과적인 최저 용량인 화합물의 양일 것이다. 투여는, 예를 들어 비경구, 예컨대 정맥내, 근육내 또는 피하 투여일 수 있다. 한 실시양태에서, 다중특이적 항체는 mg/m²으로 계산된 매주 투여량으로 주입에 의해 투여될 수 있다. 이러한 투여량은 예를 들어 상기 제공된 mg/kg 투여량에 기초하여 하기에 따를 수 있다: 용량 (mg/kg) x 70: 1.8. 이러한 투여는 예를 들어, 1 내지 8회, 예컨대 3 내지 5회 반복될 수 있다. 투여는 2 내지 24시간, 예컨대 2 내지 12시간의 기간에 걸친 연속 주입에 의해 수행될 수 있다. 한 실시양태에서, 다중특이적 항체는 독성 부작용을 감소시키기 위해, 장기간, 예컨대 24시간을 초과하여 천천히 연속적으로 주입함으로써 투여될 수 있다.

한 실시양태에서 다중특이적 항체는 1주 1회 주어지는 경우에 8회 이하, 예컨대 4 내지 6회 동안 고정된 용량으로서 계산된 매주 투여량으로 투여될 수 있다. 이러한 요법은 필요에 따라, 예를 들어 6개월 또는 12개월 후에, 1회 이상 반복될 수 있다. 이러한 고정 투여량은 예를 들어 체중 추정치를 70 kg으로 하여, 상기 제공된 mg/kg 투여량에 기초할 수 있다. 투여량은, 예를 들어 생물학적 샘플을 취하고 본 발명의 다중특이적 항체의 CD137 항원 항원-결합 영역을 표적화하는 항-이디오타입 항체를 사용하여, 투여시 혈액 중의 본 발명의 다중특이적 항체의 양을 측정함으로써 결정되거나 조정될 수 있다.

한 실시양태에서, 다중특이적 항체는 유지 요법으로서, 예컨대, 예를 들어, 6개월 이상의 기간 동안 1주 1회 투여될 수 있다.

다중특이적 항체는 또한, 암 발생의 위험을 감소시키고/거나, 암 진행에서의 사건의 발생 개시를 지연시키고/거나, 암이 완화 상태일 때 재발의 위험을 감소시키기 위해 예방적으로 투여될 수 있다.

본 발명의 다중특이적 항체는 또한 조합 요법으로 투여될 수 있고, 즉, 치료될 질환 또는 상태와 관련된 다른 치료제와 조합될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 다중특이적 항체-함유 의약은 1종 이상의 추가의 치료제, 예컨대 세포독성제, 화학요법제 또는 항혈관신생제와 조합하기 위한 것이다.

이러한 조합 투여는 동시, 개별 또는 순차적일 수 있다. 동시 투여의 경우, 작용제는 하나의 조성물로서 또는 별개의 조성물로서 적절하게 투여될 수 있다. 따라서 본 발명은 또한 하기 기재된 바와 같은 1종 이상의 추가의 치료제와 조합된 본 발명의 다중특이적 항체의 투여를 포함하는, 장애를 치료하는 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본 발명의 다중특이적 항체, 및 임의로 적어도 1종의 추가의 치료제를 투여하는 것을 포함하는, 장애를 치료하는 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 암의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본 발명의 다중특이적 항체 및 적어도 1종의 추가의 치료제를 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

본 발명의 제약 조성물은 또한 조합 요법으로 투여될 수 있고, 즉, 다른 작용제와 조합될 수 있거나, 또는 다른 치료 요법과 조합될 수 있다. 예를 들어 다중특이적 항체는 방사선요법 및/또는 수술 및/또는 자가 또는 동종 말초 줄기 세포 또는 골수 이식과 조합될 수 있다.

바이오마커

따라서, 한 측면에서, 본 발명은 또한 바이오마커로서 다중특이적 항체의 용도에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은

i) 본원에 개시된 바와 같은 실시양태 중 어느 하나에 따른 다중특이적 항체; 및

ii) 키트의 사용에 대한 지침서

를 포함하는, 환자로부터 수득된 샘플, 예컨대 혈액 샘플, 림프절 샘플 또는 골수 샘플에서 CD40- 및 CD137-발현 세포 사이의 가교를 검출하기 위한 키트에 관한 것이다.

추가 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 실시양태 중 어느 하나에 따른 이중특이적 항체의 투여 시 환자로부터 수득된 샘플, 예컨대 혈액 샘플, 림프절 샘플 또는 골수 샘플에서 CD40- 및 CD137-발현 세포 사이에 가교가 발생하는지 여부를 검출하는 방법에 관한 것이며, 이는

(i) 본원에 개시된 바와 같은 실시양태 중 어느 하나에 따른 다중특이적 항체와 CD40- 및 CD137-발현 세포 사이의 복합체의 형성을 가능하게 하는 조건 하에 샘플을 상기 다중특이적 항체와 접촉시키는 단계; 및

(ii) 복합체의 형성 여부를 분석하는 단계

를 포함한다.

복합체의 검출은 관련 기술분야에 공지된 방법, 예컨대 실시예 4, 5, 6, 10, 11 또는 12에서 수행된 방법에 의해 이루어질 수 있다.

항-이디오타입 항체

또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 실시양태 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 제1 및/또는 제2 항원-결합 영역에 결합하는 항-이디오타입 항체에 관한 것이다.

특정한 실시양태에서, 항-이디오타입 항체는 다중특이적 항체의 제1 및/또는 제2 항원-결합 영역에 결합하며, 여기서

- 제1 항원-결합 영역은 서열식별번호: 117에 제시된 바와 같은 VH 서열 및 서열식별번호: 121에 제시된 바와 같은 VL 서열을 포함하고,

- 제2 항원-결합 영역은 서열식별번호: 123을 포함하는 VH 서열 및 서열식별번호: 127을 포함하는 VL 서열을 포함한다.

한 실시양태에서, 항-이디오타입 항체는 본원에 개시된 실시양태 중 어느 하나에 정의된 제1 항원-결합 영역에 결합한다. 구체적 실시양태에서, 제1 항원-결합 영역은 서열식별번호: 117을 포함하는 VH 서열 및 서열식별번호: 121을 포함하는 VL 서열을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 항-이디오타입 항체는 본원에 개시된 실시양태 중 어느 하나에 정의된 제2 항원-결합 영역에 결합한다. 구체적 실시양태에서, 제2 항원-결합 영역은 서열식별번호: 123을 포함하는 VH 서열 및 서열식별번호: 127을 포함하는 VL 서열을 포함한다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.

실시예

실시예 1: 항체의 생성

상기 표 1에 언급된 CD40 및 각각의 CD137 항체 (즉 클론 1-12)를 표 1에 기재된 VH 및 VL 서열 및 인간 κ 경쇄, 및 인간 IgG1 중쇄를 사용하여 생산하였다. CD40 항체는 2개의 상이한 인간 IgG1 중쇄; 1) 하기 아미노산 돌연변이: L234F, L235E, D265A 및 F405L (FEAL)를 함유하며 여기서 아미노산 위치 번호는 EU 넘버링에 따른 것인 인간 IgG1 중쇄 (서열식별번호: 113에 상응함); 및 2) 하기 아미노산 돌연변이: L234F, L235E, D265A 및 K409R (FEAR)을 함유하며 여기서 아미노산 위치 번호는 EU 넘버링에 따른 것인 인간 IgG1 중쇄 (서열식별번호: 112에 상응함)를 사용하여 생산하였다.

CD137 항체는 모두 하기 아미노산 돌연변이: L234F, L235E, D265A 및 K409R (FEAR)을 함유하며 여기서 아미노산 위치 번호는 EU 넘버링에 따른 것인 인간 IgG1 중쇄 (서열식별번호: 112에 상응함)를 사용하여 생산하였다.

유사하게, 표 1에 언급된 VH 및 VL 서열을 포함하는 b12 항체를 인간 IgG1 경쇄 및 하기 아미노산 돌연변이: L234F, L235E, D265A 및 F405L (FEAL)을 함유하며 여기서 아미노산 위치 번호는 EU 넘버링에 따른 것인 인간 IgG 중쇄 (서열식별번호: 113에 상응함)를 사용하여 생산하였다.

항체는 무혈청 조건 하에 에피펙타민(ExpiFectamine)™ 293 (써모피셔 카탈로그 번호 A14525)을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 Expi293F™ 세포 (써모피셔(ThermoFisher) 카탈로그 번호 A14527)를 관련 중쇄 및 경쇄 발현 벡터로 공동-형질감염시켜 생산하였다. 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 항체를 정제하고, 12.6 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, pH 7.4 완충제 (비.브라운(B.Braun) 또는 써모 피셔)로 완충제 교환하였다. 완충제 교환 후, 샘플을 0.2 μm 전량 필터 상에서 멸균 여과하였다. 정제된 단백질을 CE-SDS 및 HP-SEC에 의해 분석하였다. 280 nm에서의 흡광도에 의해 농도를 측정하였다. 정제된 항체를 2-8℃에서 저장하였다.

실시예 2: 항 CD137 항체의 결합에 중요한 도메인을 결정하기 위한 멧돼지 또는 코끼리 및 인간 CD137 사이의 DNA 셔플링

인간 CD137에 대한 항 CD137 항체의 결합에 중요한 도메인을 결정하기 위해, 인간 및 멧돼지 CD137 (수스 수크로파(sus scrofa); XP_005665023) 사이에 또는 인간 및 아프리카 코끼리 CD137 (로소돈타 아프리카나(loxodonta africana); XP_003413533) 사이에 DNA 셔플링을 수행하였다. 인간 CD137을 코딩하는 DNA로부터, 인간 도메인을 멧돼지 (셔플 구축물 1-4, 6) 또는 코끼리 (셔플 구축물 5) 도메인으로 대체하여 셔플 구축물을 제조하였다. 인간 CD137의 도메인이 항 CD137 항체의 결합에 중요하다면, 그러한 도메인이 멧돼지 또는 아프리카 코끼리 도메인으로 대체될 경우 결합이 상실될 것이다. 항체는 전체 CD137 코끼리 또는 멧돼지 서열에 결합하지 않을 것이 요구된다. 인간 및 멧돼지 사이 및 인간 및 아프리카 코끼리 CD137 사이의 상동성은 각각 70.2 및 74.5%이다. 도 1은 인간, 멧돼지 및 아프리카 코끼리 CD137의 서열 정렬을 보여준다. 도 2는 표시된 바와 같은 멧돼지 CD137 또는 아프리카 코끼리 도메인을 함유하는 인간 CD137에 대한 구축물을 보여준다.

3 x 10⁶개 HEK293T-17 세포를 T75 배양 플라스크 (그라이너 바이오-원(Greiner Bio-One), cat. no. 658175)의 10% FCS를 함유하는 20 mL RPMI 1640 글루타맥스 배지 (바이오크롬(Biochrom), cat. no. S 0115) 중에 시딩하였다. O/N 인큐베이션 후, 트랜스IT(TransIT)®-LT1 형질감염 시약, 미루스 바이오(Mirus Bio) (VWR 인터내셔널(VWR International), cat. no. 731-0029)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 구성적으로 활성인 인간 신장 인자-1 알파 (EF-1 알파) 프로모터 하류의 셔플 구축물 또는 멧돼지, 아프리카 코끼리 또는 인간 CD137을 코딩하는 발현 벡터로 세포를 일시적으로 형질도입하였다. 다음날, 1.5 mL 아큐타제 (시그마 알드리치(Sigma Aldrich), cat. no. A6964)를 사용하여 세포를 수거하고 (37℃에서 5분 동안 인큐베이션), 본질적으로 실시예 4에 기재된 바와 같이 유동 세포측정법을 수행하여 셔플 구축물 및 인간, 아프리카 코끼리 및 멧돼지 CD137의 표면 발현을 측정하고 상이한 셔플 구축물에 대한 항체 클론의 결합을 측정하였다. 구축물의 세포 표면 발현을 측정하기 위해, 형질도입된 세포를 FACS 완충제 (5 mM EDTA [시그마 알드리치, cat. no. 03690] 및 5% (v/v) 태아 소 혈청 [FBS, 바이오크롬, cat. no. S 0115]이 보충된 D-PBS) 중 1 μg/mL 염소 폴리클로날 항-인간 CD137 (알앤디 시스템즈(R&D Systems), cat. no. AF838)과 인큐베이션하고 (4℃, 20분), 이어서 APC-표지된 항-염소 IgG (H+L) (알앤디 시스템즈, cat. no. F0108)와 인큐베이션하였다 (4℃, 20분). 셔플 구축물을 발현하는 세포에 대한 상이한 CD137 항체 클론의 결합을, 형질도입된 세포와 1 μg/mL의 항체 클론, 이어서 APC-표지된 아피니퓨어(AffiniPure) F(ab')2 단편 (1:50 최종 희석; 잭슨(Jackson), cat. no. 109-136-127)의 인큐베이션에 의해 측정하였다.

모든 CD137 셔플 구축물, 뿐만 아니라 인간, 아프리카 코끼리 및 멧돼지 CD137은 세포 표면에서 유사한 발현 수준으로 발현되었다 (도 3).

표 2 및 도 4는 클론 1을 제외한 모든 클론이 적어도 아프리카 코끼리 또는 멧돼지 CD137에 대한 결합의 상실을 보여주었음을 보여준다. 클론 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11은 셔플 구축물 중 적어도 1종에 대한 결합의 상실을 보여주었다. 클론 1은 인간 CD137에 대한 결합과 비교하여 아프리카 코끼리 및 셔플 구축물 5에 대한 감소된 결합을 보여주었다. 클론 12는 셔플 구축물 중 임의의 것에 대한 결합의 상실을 보여주지 않았지만, 셔플 구축물 5에 대한 감소된 결합을 보여주었다. 어떠한 클론도 셔플 구축물 1 및 2에 대한 결합의 상실 또는 감소된 결합을 보여주지 않았다.

표 2: 셔플 구축물에 대한 CD137 항체의 결합의 요약

실시예 3: 2-MEA-유도된 Fab-아암 교환에 의한 이중특이적 항체의 생성

안정한 IgG1-기반 이중특이적 항체를 생산하는 방법은 WO2011131746 (젠맙)에 기재되어 있다. 하기 기재된 이러한 방법에 의해 생성된 이중특이적 항체 생성물은 더 이상 Fab-아암 교환에 참여하지 않을 것이다. 이러한 방법의 기초는 특이적 검정 조건 하에 이종이량체의 형성을 촉진하는 상보적 CH3 도메인을 사용하는 것이었다. 이러한 방법에 의해 이중특이적 항체의 생산을 가능하게 하기 위해, CH3 도메인에 특정 돌연변이를 보유하는 IgG1 분자를 생성하였다: 하나의 모 IgG1 항체에서 T350I, K370T 및 F405L 돌연변이 (또는 최소한 F405L), 다른 모 IgG1 항체에서 K409R 돌연변이.

최소한 F405L 또는 K409R 점 돌연변이를 함유하는 모 IgG1 항체의 농도를 280 nm에서의 그의 흡광도를 사용하여 측정하였다. 아미노산 서열에 기초한 특이적 흡광 계수를 사용하여 단백질 농도를 추론하였다.

큐브 시스템은 젠맙의 유연한 로봇 작업 셀이다. 영국 판버러 소재의 피크 애널리시스 앤드 오토메이션(Peak Analysis and Automation) (PAA)과 협력하여 시스템을 설계하고 구축하였다.

이중특이적 항체를 실시예 1로부터 하기 항체를 조합하여 생성하였다:

- 각각의 CD137-FEAR 항체와 조합된 CD40-FEAL 항체,

- b12-FEAL 항체와 조합된 CD40-FEAR 항체, 및

- b12-FEAL 항체와 조합된 각각의 CD137-FEAR 항체

도 5에 제시되고 하기 기재된 바와 같이, 이중특이적 항체 검색 프로세스는 큐브 시스템에서 자동화된 방식으로 수행되었다.

이중특이적 항체를 생성하기 위해, 하기 (자동화된) 단계를 수행하였다:

- 필요한 부피에 따라, 딥 웰 공급원 플레이트 (96 웰 투명 V-바닥 2 mL 폴리프로필렌 딥 웰 플레이트, 코닝(Corning), cat. no. 3960; 48 웰 리플레이트(Riplate)® SW 5mL, 리터(Ritter), cat. no. 43001-1062 ; 24 웰 리플레이트 SW 10 mL, 리터, cat. no. 43001-1066)를 모 항체 (상이한 플레이트 내의 F405L- 및 K409R-함유 항체)로 1.0 mg/mL의 농도 (1x PBS 중, 비.브라운)로 채웠다 (도 5, 좌측 플레이트).

- 이들 공급원 플레이트로부터, 큐브에 의해, 도 5, 중간 플레이트에 따라 프리-그리드 플레이트 (96 웰 V-바닥, 코닝)를 제조하였다. 교환 그리드에서의 모 항체와의 각각의 조합을 위해, 67.5 μL 모 항체를 적절한 프리-그리드 플레이트에 첨가하였다.

- 프리-그리드 후, 교환을 수행하였다. 여기서는, 각각 상이한 프리-그리드 플레이트로부터의 2종의 모 항체 (각각 67.5 μL, 1.0 mg/mL)를 교환 플레이트에 (96 웰 둥근-바닥 폴리프로필렌 플레이트, 그라이너, cat. no. 650293), 각각의 항체를 0.5 mg/mL의 최종 농도로 (등몰 농도) 첨가하였다 (도 5, 우측 플레이트).

- 15 μL 75 mM 2-메르캅토에틸아민-HCl (2-MEA) (1x PBS 중, 비.브라운)을 교환 플레이트에 첨가하여 교환 반응을 시작하였다. 교환 플레이트 내의 총 부피는 이제 150 μL이다 (최종 농도 2-MEA 7.5 mM)

- 교환 플레이트를 시토마트 6000(Cytomat 6000) 자동화 인큐베이터 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific)) 내에서 31℃에서 5시간 동안 인큐베이션하였다.

- 탈염 칼럼 (피팁(PhyTip) 탈염 칼럼, 600 μL 수지, 피넥수스(PhyNexus), cat. no. PDR 91-60-06)을 사용하고 유동은 중력에 기초하여 환원제 2-MEA를 제거하였다.

o 96 칼럼을 갖는 어댑터를 폐기물 위치에 두고, 450 μL 1x PBS (비.브라운)를 2회 첨가하고, 용액이 칼럼을 통해 폐기물로 흐르게 함으로써 칼럼을 조건화하였다.

o 조건화 후, 교환 플레이트로부터의 100 μL 샘플을 첨가하여, 그에 의해 잔류 PBS를 칼럼 밖으로 밀어내었다.

o 용액이 칼럼을 통해 폐기물로 흐르게 한 후, 칼럼을 갖는 어댑터를 탈염 (또는 목표) 플레이트 (96 웰 둥근-바닥, 그라이너)에 두었다.

o 교환 플레이트로부터의 잔류 샘플을 칼럼에 첨가하였다.

o 샘플이 칼럼을 통해 탈염 플레이트로 흐르게 한 후, 225 μL 1x PBS (비.브라운)를 칼럼에 첨가하고, 샘플을 탈염 플레이트 내로 용리시켰다.

o 2-MEA는 칼럼 내부에 잔류하였다. 적절한 경우에, 1x PBS (비.브라운)로 세척하여 칼럼을 재생시킬 수 있다.

- 탈염 플레이트를 시토마트 6001 자동화 인큐베이터 (써모 사이언티픽) 내에서 8℃에서 저장하였다. 이들 플레이트는 이제 이중특이적 항체를 함유한다.

최종 이중특이적 항체 샘플을 0.2 μm 전량 필터 상에서 여과하고, 이중특이적 생성물의 280 nm에서의 흡광도 (A280)를 측정하여 최종 농도를 결정하였다. 샘플을 추가 사용 전 적어도 24시간 동안 2-8℃에서 저장하였다.

이중특이적 항체 교환 효율을 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC) - 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)를 사용하여, 부틸-NPR, 2.5 μm, 4.6 x 35 mm HIC-HPLC 칼럼 (도소 바이오사이언스(Tosoh Bioscience))을 1 mL/분의 유량으로 사용하여 정량화하였다. 모 항체 및 분석 샘플을 농도면에서 정규화하고, HIC 용리액 A (15.4 mM K₂HPO₄, 9.6 mM KH2PO4, 1.5 M (NH4)2SO4; pH 7.0)로 2-배 희석하였다. 샘플 50 μL를 주입하고, HIC 용리액 A에서 HIC 용리액 B (15.4 mM K₂HPO₄, 9.6 mM KH₂PO₄; pH 7.0)의 12-분 구배로 용리를 수행하고 280 nm에서 검출하였다. 대안적으로, HPLC - 분석 양이온 교환 크로마토그래피 (CIEX)를 사용하여 이중특이적 항체 교환 효율을 정량화하였다. 이동상 A (10 mM NaPO₄, pH 7.0) 중 1 mg/mL의 모 항체 및 분석 샘플을 HPLC 상에 주입하였다. 상이하게 하전된 IgG 분자를 프로팩(ProPac) WCX-10, 4 mm x 250 mm, 분석 칼럼을 사용하여 1 mL/분의 유량으로 분리하였다. 샘플 50 μL를 주입하고, 이동상 A (10 mM NaPO₄, pH 7.0; 밀리-큐(Milli-Q) 리터당 10.3 g Na₂HPO₄·2H₂O 및 5.07 g NaH₂PO₄를 첨가함으로써 수득되는, 인산나트륨 완충제 0.1 M 원액으로부터 제조됨)에서 이동상 B (10 mM NaPO₄, pH 7.0, 0.25 M NaCl)의 구배로 용리를 수행하고 280 nm에서 검출하였다. 엠파워 3(Empower 3) 소프트웨어 (워터스(Waters))를 사용하여 피크를 모 항체 또는 이중특이적 반응 생성물로서 배정하고, 피크 면적을 통합하여 이중특이적 항체 교환 반응의 정도를 정량화하였다. 이중특이적 항체 반응 생성물을 TSK HP-SEC 칼럼 (G3000SWxl; 도소 바이오사이언스, 네덜란드 브레다 소재의 옴니라보(Omnilabo)를 통함)을 사용한 분석용 크기 배제 크로마토그래피 및 HT 단백질 발현 랩칩(LabChip) (캘리퍼 라이프 사이언시스, 매사추세츠주) 상의 랩칩 GXII (캘리퍼 라이프 사이언시스, 매사추세츠주)를 사용한 모세관 전기영동 - 소듐 도데실 술페이트 (CE-SDS)를 사용하여, 환원 및 비-환원 조건 하에, 제조업체의 지침에 따라 추가로 분석하였다.

실시예 4: CD40 및 CD137에 결합하는 이중특이적 항체에 의해 트랜스-활성화를 측정하는 리포터 검정

CD40은 항원-제시 세포 (APC), 예컨대 수지상 세포 상에서 우세하게 발현되는 반면에, CD137은 활성화된 T 세포 상에서 우세하게 발현된다. 따라서, CD40 및 CD137에 결합하는 이중특이적 항체는 이들 수용체를 발현하는 APC 및 T 세포에 동시에 결합할 수 있다. 그에 의해, 이들 이중특이적 항체는 수용체 결합에 의해 APC 및 T 세포 사이의 세포-세포 접촉을 매개하고, 둘 다의 수용체를 활성화할 수 있다. 이러한 수용체 활성화는 세포-세포 상호작용 시의 가교 및 수용체 클러스터링에 의해 유도될 수 있고, 모 단일특이적 2가 항체의 효능작용 활성에 반드시 의존하는 것은 아니다. 따라서, 이들 트랜스-활성화 이중특이적 항체는 APC 및 T 세포 사이의 상호작용과 관련하여 공동-자극 활성을 발휘할 수 있다.

리포터 검정 시스템은 이중특이적 항체에 의한 각각의 수용체의 활성화를 측정하기 위해 확립되었다. NF-κB/293/GFP-Luc™ 전사 리포터 세포주 (시스템 바이오사이언시스(System Biosciences); cat. no. TR860A-1)는 시험관내 NF-κB 신호 전달 경로를 모니터링하기 위해 설계된 리포터 세포주이다. NF-κB 경로의 활성화는 정량적 전사 활성화 리포터 검정의 경우 녹색 형광 단백질 (GFP) 형광 뿐만 아니라 루시페라제 활성을 검출하는 것에 의해 모니터링될 수 있다. NF-κB/293/GFP-Luc 세포를 트랜스IT®-LT1 형질감염 시약, 미루스 바이오(Mirus Bio) (VWR 인터내셔널, cat. no. 731-0029)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여, 구성적으로 활성인 인간 신장 인자-1 알파 (EF-1 알파) 프로모터의 하류에 전장 인간 CD40 또는 CD137을 코딩하는 발현 벡터로 안정하게 형질도입하였다. 10 mg/mL 블라스티시딘 (인비보젠(Invivogen), cat. no. ant-bl-1)을 사용하여 안정한 클론을 선택하였다. 또한, K562를 상기 문헌에 기재된 바와 같이 인간 CD40 및 CD137로 안정하게 형질도입하여, 이중특이적 항체의 다른 아암에 상응하는 표적 항원을 제공할 수 있는 세포주를 생성하였다. 수용체의 세포 표면 발현을 유동 세포측정법에 의해 측정하였다. 0.3 x 10⁶개의 세포를 스핀 다운시키고 (460 x g, 5분), FACS 완충제 (5 mM EDTA [시그마 알드리치, cat. no. 03690] 및 5% (v/v) 태아 소 혈청 [FBS, 바이오크롬(Biochrom), cat. no. S 0115]으로 보충된 D-PBS) 중에서 세척하였다 (460 x g, 5분). 1:50 희석된 알로피코시아닌 (APC)-표지된 항-인간 CD40 (비디 바이오사이언시스(BD Biosciences), 클론 5C3, cat. no. 555591) 또는 피코에리트린 (PE)-표지된 항-인간 CD137 (비디 바이오사이언시스, 클론 4B4-1, cat. no. 555956) 50 μL를 세포 펠릿에 첨가하고, 4℃에서 암실에서 20분 동안 인큐베이션하였다. FACS 완충제로 3회 세척한 후, 세포를 100 μL FACS 완충제 중에 재현탁시키고, 항체의 결합을 FACS칸토 II (비디 바이오사이언시스) 상에서 유동 세포측정법에 의해 검출하였다. 형질도입된 NF-κB/293/GFP-Luc 세포 (도 6a) 및 K562 세포 (도 6b) 상에서의 CD40 및 CD137의 세포 표면 발현이 잘 나타났다.

트랜스-활성화를 측정하는 리포터 검정을 다음과 같이 설정하였다: 2종의 표시된 TNF 수용체 중 1종을 발현하는 NF-κB/293/GFP-Luc 세포를 백색 불투명 384-웰 세포 배양 플레이트 (퍼킨엘머(PerkinElmer), cat. no. 6007680)에서 글루타맥스(GlutaMAX) 보충제 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies), cat. no. 61870)를 함유하는 30 μL RPMI 1640 배지 중 10,000개 세포/웰로 시딩하였다. CD40에 하나의 아암으로 결합하고 CD137에 다른 아암으로 결합하는 이중특이적 항체 및 상응하는 단일특이적, 1가 (1개의 비관련 대조군 아암을 함유함 [b12]) 대조군 항체를, 완충제 대조군을 포함하여, 0.078 μg/mL 내지 10 μg/mL 최종 농도 범위의 연속 희석물로 (배지 중) 리포터 세포에 10 μL/웰로 첨가하였다. 17,000개의 제2 TNF 수용체를 발현하는 K562 세포 또는 야생형 K562 (K562_wt) 세포를 각각의 웰에 10 μL 배지로 첨가하고, 37℃ 및 5% CO₂에서 18시간 동안 인큐베이션하였다. 따라서, 이중특이적 항체는 NF-κB/293/GFP-Luc 세포주 상의 제1 TNF 수용체에 및, 동시에, K562 세포주 상의 제2 TNF 수용체에 결합할 수 있다. NF-κB/293/GFP-Luc 세포 상의 제1 TNF 수용체의 유일한 수용체 활성화는 NF-κB 신호전달 시 유도된 루시페라제 활성에 의해 측정되었다. 따라서, CD40 및 CD137을 표적화하는 이중특이적 항체를 2종의 리포터 검정: 리포터 세포주 상의 CD137 및 K562 세포 상의 CD40의 동시 결합에 의해 유도되는 CD137 활성화를 측정하는 제1 검정 (HEK293_NFK_CD137_gfp_luc + K562_CD40) 및 리포터 세포주 상의 CD40 및 K562 세포 상의 CD137의 동시 결합에 의해 유도되는 CD40 활성화를 측정하는 제2 검정 (HEK293_NFK_CD40_gfp_luc + K562_CD137)에 의해 분석하였다. 루시페라제 활성을, 글로 용해 완충제 (프로메가(Promega); cat. no. E266A) 중에 재구성된 50 μL/웰 스테디-글로(Steady-Glo)® 시약 (프로메가; cat. no. E2520)의 첨가 및 실온에서 30분 인큐베이션 후, 엔비전 플레이트 판독기 (퍼킨엘머) 상에서 상대적 발광 단위로서 측정하였다.

오직 이중특이적 CD40xCD137 항체만이 (도 7 a-l, 하부 패널, 첫번째 및 세번째 그래프) CD137 또는 CD40으로 형질도입된 NF-κB/293/GFP-Luc 세포에서, 트랜스-활성화 조건 (각각 K562-CD40 또는 K562-CD137과 인큐베이션) 하에 루시페라제 활성을 유도하였다 (약 100 ng/mL 이상의 농도에서). 어떠한 단일특이적, 1가 (1개의 비관련 대조군 아암을 함유함 [b12]) 대조군 항체도 형질도입된 NF-κB/293/GFP-Luc 세포에서 루시페라제 활성을 유도하지 않았다 (상부 패널). 또한, 트랜스-활성화 조건의 부재 하에서도 (야생형 K562 세포를 사용함) 이중특이적 CD40xCD137 항체에 의해 어떠한 루시페라제 활성도 유도되지 않았다 (하부 패널, 두번째 및 네번째 패널).

실시예 5: CD40 및 CD137에 결합하는 이중특이적 항체에 의한 트랜스-활성화를 측정하기 위한 비-항원-특이적 T-세포 증식 검정

비-항원-특이적 증식을 측정하기 위해, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 집단 내 T 세포를 CD40xCD137 이중특이적 또는 대조군 항체와 조합된 준-최적 농도의 항-CD3 항체 (클론 UCHT1)와 인큐베이션하였다. 이러한 PBMC 집단 내에서, CD40을 발현하는 항원-제시 세포는 이중특이적 항체의 CD40-특이적 아암에 의해 결합될 수 있는 반면에, 집단 내의 T 세포는 CD137-특이적 아암에 의해 결합될 수 있다. 이중특이적 항체를 통한 항원-제시 세포에의 가교에 의해 유도된 T 세포의 트랜스-활성화는 T-세포 증식으로서 측정된다.

PBMC를 건강한 공여자 (트란스푸지온첸트랄레 대학 병원, 독일 마인츠)의 백혈구 연층으로부터 피콜 구배 (VWR, cat. no. 17-5446-02)를 사용하여 수득하였다. PBMC를 제조업체의 지침에 따라, PBS 중 1.6 μM 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE) (써모 피셔, cat. no. C34564)를 사용하여 표지하였다. 75,000개의 CFSE-표지된 PBMC를 96-웰 둥근 바닥 플레이트 (시그마 알드리치, CLS3799-50EA)에서 웰당 시딩하고, 5% 인간 AB 혈청이 보충된 150 μL IMDM 글루타맥스 중, 각각의 공여자에 대해 준-최적 농도의 미리-결정된 항-CD3 항체 (알앤디 시스템즈, 클론 UCHT1, cat. no. MAB100; 0,01-0,1 μg/mL 최종 농도), 및 이중특이적 또는 대조군 항체와 37℃, 5% CO₂에서 4일 동안 인큐베이션하였다. CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포의 증식을, 본질적으로 상기 문헌에 기재된 바와 같이, 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. FACS 완충제 중 PE-표지된 CD4 항체 (비디 바이오사이언시스, cat. no. 555347; 1:80 최종 희석), PE-Cy7-표지된 CD8α 항체 (클론 RPA-T8, 이바이오사이언스(eBioscience), cat. no. 25-0088-41; 1:80 최종 희석) APC-표지된 CD56 항체 (이바이오사이언시스, cat. no. 17-0567; 1:80 최종 희석) 및 7-AAD (베크만 쿨터(Beckman Coulter), cat. no. A07704; 1:80 최종 희석)를 함유하는 30 μL를 사용하여 세포를 염색하고, 자연 킬러 (NK) 세포 (CD56) 및 사멸 세포 (7-AAD)는 분석에서 제외하였다. 샘플을 FACS칸토 II (비디 바이오사이언시스) 상에서 측정하였다. 플로우조 7.6.5 소프트웨어에 의해 세포 분열을 나타내는 CFSE-피크에 기초하여 T-세포 증식의 상세한 분석을 행하였다. 분열을 거친 T 세포의 평균 백분율 (% 분열된 세포) 및 분열을 거친 세포의 평균 분열 횟수 (증식 지수)를 계산하였다.

도 8a는 오직 CD40xCD137 이중특이적 항체만이 CD8⁺ T 세포의 증식을 효율적으로 증진시켰음을 보여준다. 대조군 단일특이적, 1가 항체 (b12xCD40; b12xCD137) 및 단일특이적, 1가 CD40과 단일특이적, 1가 CD137 항체의 조합물 (b12xCD40 + b12xCD137)은 대조군에서 관찰되는 것보다 더 많은 증식을 유도하지 못했다 (단지 약하게 활성화된 PBMC, ctrl, w/o). 상기 문헌에 기재된 바와 같이, 상이한 항체에 대한 상이한 농도에서의 유동 세포측정 히스토그램을 정량화하여 분열된 세포의 백분율 (도 8b) 및 증식 지수 (도 8c)를 나타내었다. 이들 도면은 오직 이중특이적 항체만이 CD8⁺ 세포의 증식을 유도할 수 있고, 최적은 0.04 내지 0.2 μg/mL임을 보여준다.

실시예 6: CD40 및 CD137에 결합하는 이중특이적 항체에 의해 트랜스-활성화를 측정하기 위한 항원-특이적 CD8⁺ T 세포 증식 검정

항원-특이적 검정에서 이중특이적 항체에 의한 증식의 유도를 측정하기 위해, 수지상 세포 (DC)를 클라우딘 6 시험관내-전사된 RNA (IVT-RNA)로 형질감염시켜 클라우딘 6 항원을 발현하게 하였다. T 세포를 클라우딘-6-특이적, HLA-A2-제한 T 세포 수용체 (TCR)로 형질감염시켰다. 이러한 TCR은 DC 상의 HLA-A2에 제시된 클라우딘-6-유래 에피토프를 인식할 수 있다. CD40xCD137 이중특이적 항체는 수지상 세포 상의 CD40 및 T 세포 상의 CD137과 가교할 수 있고, 이는 DC의 활성화 및 T 세포에 대한 공동-자극 신호로 이어져, T-세포 증식을 발생시킬 수 있다.

HLA-A2⁺ PBMC를 건강한 공여자 (트란스푸지온첸트랄레 대학 병원, 독일 마인츠)로부터 수득하였다. 항-CD14 마이크로비즈(MicroBeads) (밀테니(Miltenyi); cat. no. 130-050-201)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 자기-활성화 세포 분류 (MACS) 기술에 의해 PBMC로부터 단핵구를 단리하였다. 말초 혈액 림프구 (PBL, CD14-음성 분획)는 추후 T-세포 단리를 위해 동결시켰다. 미성숙 DC (iDC)로의 분화를 위해, 1x10⁶개 단핵구/mL를 5% 인간 AB 혈청 (시그마-알드리치 케미 게엠베하(Sigma-Aldrich Chemie GmbH), cat. no. H4522-100ML), 피루브산나트륨 (라이프 테크놀로지스 게엠베하, cat. no. 11360-039), 비필수 아미노산 (라이프 테크놀로지스 게엠베하, cat. no. 11140-035), 100 IU/mL 페니실린-스트렙토마이신 (라이프 테크놀로지스 게엠베하, cat. no.15140-122), 1000 IU/mL 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF; 밀테니, cat. no. 130-093-868) 및 1000 IU/mL 인터류킨 4 (IL-4; 밀테니, cat. no. 130-093-924)를 함유하는 RPMI 글루타맥스 (라이프 테크놀로지스 GmbH, cat. no. 61870-044) 중에서 5일 동안 배양하였다. 이들 5일 배양 동안 1회, 배지의 절반을 신선한 배지로 대체하였다. 비-부착 세포를 수집하여 iDC를 수거하고; 2mM EDTA를 함유하는 PBS와 37℃에서 10분 동안 인큐베이션하여 부착 세포를 탈착시켰다. 세척 후, iDC를 추후 항원-특이적 T 세포 검정을 위해 10% v/v DMSO (어플라이켐 게엠베하(AppliChem GmbH), cat. no A3672,0050) 및 50% v/v 인간 AB 혈청을 함유하는 RPMI 글루타맥스 중에 동결시켰다.

T-세포 검정을 시작하기 1일 전에, 동일한 공여자로부터의 동결된 PBL 및 iDC를 해동하였다. PBL은, 항-CD8 마이크로비드 (밀테니, cat. no. 130-045-201)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 MACS 기술에 의해 CD8⁺ T 세포를 단리하는데 사용하였다. 약 10-15 x 10⁶개의 CD8⁺ T 세포를, BTX ECM® 830 전기천공 시스템 디바이스 (BTX; 500 V, 1 x 3 ms 펄스)를 사용하여 4-mm 전기천공 큐벳 (VWR 인터내셔널 게엠베하, cat. no. 732-0023)에서 250 μL 엑스-비보15 (바이오짐 사이언티픽 게엠베하(Biozym Scientific GmbH), cat. no.881026) 중 클라우딘-6-특이적 뮤린 TCR의 알파-쇄를 코딩하는 10 μg IVT-RNA 플러스 베타-쇄를 코딩하는 10 μg IVT-RNA (HLA-A2-제한됨; WO 2015150327 A1에 기재됨)로 전기천공하였다. 전기천공 직후에, 세포를 5% 인간 AB 혈청이 보충된 신선한 IMDM 배지 (라이프 테크놀로지스 GmbH, cat. no. 12440-061)로 옮기고, 37℃, 5% CO₂에서 적어도 1시간 동안 휴지시켰다. T 세포를 PBS 중 1.6 μM 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE; 인비트로젠(Invitrogen), cat. no. C34564)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 표지하고, 5% 인간 AB 혈청이 보충된 IMDM 배지에서, O/N 인큐베이션하였다.

최대 5 x 10⁶개의 해동된 iDC를 상기 기재된 바와 같이 전기천공 시스템을 사용하여 (300 V, 1x12 ms 펄스) 250 μL 엑스-비보15 배지 중에서 전장 클라우딘-6 (유니프롯 P56747)을 코딩하는 0,4-5 μg IVT-RNA로 전기천공하고, 5% 인간 AB 혈청이 보충된 IMDM 배지에서, O/N 인큐베이션하였다.

다음날, 세포를 수거하였다. DC 상에서의 클라우딘-6 및 T 세포 상에서의 TCR의 세포 표면 발현을 유동 세포측정법에 의해 체크하였다. 따라서, DC를 알렉사647-접합된 CLDN6-특이적 항체 (상업적으로 입수가능하지 않음; 사내 생산)로 염색하고, T 세포를 항-마우스 TCR β 쇄 항체 (벡톤 디킨슨 게엠베하(Becton Dickinson GmbH), cat. no. 553174)로 염색하였다. 5,000개의 전기천공된 DC를 50,000개의 전기천공된, CFSE-표지된 T 세포와 96-웰 둥근 바닥 플레이트에서 5% 인간 AB 혈청이 보충된 IMDM 글루타맥스 (라이프 테크놀로지스, cat. no. 12440-061) 중에서 이중특이적 또는 대조군 항체의 존재 하에 인큐베이션하였다. 유동 세포측정법에 의하면 5일 후에 T-세포 증식이 측정되었다. 플로우조 7.6.5 소프트웨어에 의해 세포 분열을 나타내는 CFSE-피크에 기초하여 T-세포 증식의 상세한 분석을 행하였다. 분열을 거친 T 세포의 평균 백분율 (% 분열된 세포) 및 분열을 거친 세포의 평균 분열 횟수 (증식 지수)를 계산하였다.

도 9a는 오직 CD40xCD137 이중특이적 항체만이 CD8⁺ T 세포의 증식을 효율적으로 증진시켰음을 보여준다. 대조군 단일특이적, 1가 항체 (b12xCD40; b12xCD137) 및 단일특이적, 1가 CD40과 단일특이적, 1가 CD137 항체의 조합물 (b12xCD40 + b12xCD137)은 대조군에서 관찰되는 것보다 더 많은 증식을 유도하지 못했다 (단지 약하게 활성화된 PBMC, ctrl, w/o). 동일한 사항이 분열된 세포의 백분율에 또한 반영되었고 (도 9b), 이는 증식 지수로부터 매우 명백하였다 (도 9c). 도 9d는 CD40xCD137 이중특이적 항체에 의한 항원-특이적 증식의 유도가 농도 의존적이며, 최적은 본 검정에서 약 0.1 μg/mL임을 보여준다.

실시예 7: 뮤린 및 토끼 항체의 인간화

안티토프(Antitope) (영국 캠브리지)에서 항체 마우스 항-CD40-001 및 토끼 항-CD137-009로부터 인간화 항체 서열을 생성하였다. 인간화 항체 서열은 배선 인간화 (CDR-그라프팅) 기술을 사용하여 생성하였다. 뮤린 및 토끼 항체의 VH 및 Vκ 아미노산 서열과 가장 가까운 상동성을 갖는 인간 배선 서열에 기초하여 인간화 V 영역 유전자를 설계하였다. 각각의 비-인간 모 항체에 대해 일련의 4 내지 6개의 VH 및 4 또는 5개의 Vκ (VL) 배선 인간화 V-영역 유전자를 설계하였다. 스위스 PDB를 사용하여 비-인간 모 항체 V 영역의 구조적 모델을 생성하고 분석하여 항체의 결합 특성에 중요할 수 있는 V 영역 프레임워크 내의 아미노산을 확인하였다. 이들 아미노산은 1개 이상의 변이체 CDR-그라프트된 항체 내로 혼입된 것으로 나타났다. 인간화 설계를 위한 기초로서 사용된 가장 가까운 매칭 배선 서열을 표 3에 제시한다.

표 3: 가장 가까운 매칭 인간 배선 V 절편 및 J 절편 서열

이어서 안티토프 독점의 인 실리코 기술, 아이토프(iTope)™ 및 TCED™ (T 세포 에피토프 데이터베이스)를 사용하여 잠재적 T 세포 에피토프의 발생률이 가장 낮은 변이체 서열을 선택하였다 (Perry, L.C.A, Jones, T.D. and Baker, M.P. New Approaches to Prediction of Immune Responses to Therapeutic Proteins during Preclinical Development (2008). Drugs in R&D 9 (6): 385-396; 20; Bryson, C.J., Jones, T.D. and Baker, M.P. Prediction of Immunogenicity of Therapeutic Proteins (2010). Biodrugs 24 (1):1-8). 마지막으로, 설계된 변이체의 뉴클레오티드 서열을 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화하였다.

인간화 CD40 및 CD137 항체의 가변 영역 서열을 서열 목록 및 상기 표 1에 제시한다.

실시예 8: 항체를 위한 발현 구축물, 일시적 발현 및 정제

항체 발현을 위해 VH 및 VL 서열을, VH의 경우에는 관련 불변 중쇄 (HC)를 함유하고, 특정 경우에 F405L 또는 K409R 돌연변이, 및/또는 L234F, L235E 및 D265A를 함유하며, VL의 경우에는 경쇄 (LC) 영역을 함유하는 발현 벡터 (pcDNA3.3) 내로 클로닝하였다. 항체는 IgG1,κ로서 발현되었다. 항체의 중쇄 및 경쇄 둘 다를 코딩하는 플라스미드 DNA 혼합물로, 본질적으로 문헌 [Vink et al. (Vink et al., Methods, 65 (1), 5-10 2014)]에 기재된 바와 같이, 293펙틴 (라이프 테크놀로지스)을 사용하여 Expi293F 세포 (라이프 테크놀로지스, 미국) 내로 일시적으로 형질감염시켰다. 다음으로, 고정된 단백질 G 크로마토그래피에 의해 항체를 정제하였다.

실시예 9: CD40 및 CD137에 결합하는 인간화 이중특이적 항체의 기능성을 시험하기 위한 비-특이적 T-세포 증식 검정

CD40 및 CD137에 결합하는 인간화 이중특이적 항체의 기능성을 측정하기 위해, 비-항원-특이적 T-세포 증식 검정을 상기 문헌에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간단히, 하나의 공여자의 PBMC를 CFSE-표지하고, 준-최적 농도의 항-CD3 항체 (클론 UCHT1; 이러한 공여자에 대해 결정된 바와 같은 0.01 μg/mL) 및 0.008, 0.04, 0.2 또는 1 μg/mL 인간화 CD40xCD137 이중특이적 항체, 모 이중특이적 항체 또는 IgG1 대조군 항체와 함께 인큐베이션하였다.

CD8⁺ T 세포의 증식을, 본질적으로 상기 문헌에 기재된 바와 같이, 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 플로우조 7.6.5 소프트웨어에 의해 세포 분열을 나타내는 CFSE-피크에 기초하여 T-세포 증식의 상세한 분석을 행하였다. 분열을 거친 T 세포의 평균 백분율 (% 분열된 세포) 및 분열을 거친 세포의 평균 분열 횟수 (증식 지수)를 계산하였다.

도 10은 인간화 CD40xCD137 이중특이적 항체 (BisG1-CD40-001-HC6LC1-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR)가 CD8⁺ T 세포의 증식을 효율적으로 증진시켰음을 보여준다. 인간화 이중특이적 항체는 분열된 세포의 백분율 및 CD8⁺ 세포의 평균 분열 횟수 둘 다를 증진시켰다. 인간화 이중특이적 항체의 효능은 모 이중특이적 항체 (CD40-001xCD137-009)의 효능과 대등하였다.

실시예 10: CD40 및 CD137에 결합하는 인간화 이중특이적 항체의 기능성을 시험하기 위한 항원-특이적 CD⁸+ T-세포 증식 검정

CD40 및 CD137에 결합하는 인간화 이중특이적 항체의 기능성을 측정하기 위해, 항원-특이적 CD8⁺ T-세포 증식 검정을 상기 문헌에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간단히, CFSE-표지된, CLDN6-TCR 형질감염된 CD8⁺ T-세포를 CLDN6 RNA-전기천공된 DC와 인간화 CD40xCD137 이중특이적 항체, 모 항체 또는 IgG1 대조군 항체의 존재 하에 인큐베이션하였다. 4일 후에 T-세포 증식을 유동 세포측정법에 의해 측정하였다. 플로우조 7.6.5 소프트웨어에 의해 세포 분열을 나타내는 CFSE-피크에 기초하여 T-세포 증식의 상세한 분석을 행하였다. 분열을 거친 T 세포의 평균 백분율 (% 분열된 세포) 및 분열을 거친 세포의 평균 분열 횟수 (증식 지수)를 계산하였다.

도 11은 인간화 CD40xCD137 이중특이적 항체 (BisG1-CD40-001-H6LC1-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR)가 CD8⁺ T 세포의 증식을 효율적으로 증진시켰음을 보여준다. 인간화 이중특이적 항체의 효능은 모 이중특이적 항체 (CD40-001xCD137-009)의 효능과 대등하였다. 인간화 및 모 이중특이적 항체 둘 다는 본 검정에서, 분열된 세포의 백분율 뿐만 아니라 CD8+ 세포의 증식 지수를 증진시켰다.

실시예 11: 종양 침윤 림프구에 대한 CD40xCD137 이중특이적 항체의 효과를 평가하기 위한 생체외 TIL 확장 검정

종양 침윤 림프구 (TIL)에 대한 CD40xCD137 이중특이적 항체 (BisG1-CD40-001-FEAL/CD137-009-FEAR)의 효과를 평가하기 위해, 인간 종양 조직의 생체외 배양을 하기와 같이 수행하였다. 단리된 종양 덩어리를 6개-웰 플레이트 (피셔 사이언티픽(Fisher Scientific) cat. no. 10110151) 중 하나의 세척 배지-함유 웰로부터 다음 웰로 스패튤라 또는 혈청학 피펫을 사용하여 옮김으로써, 신선한 인간 종양 조직 절제물을 3회 세척하였다. 세척 배지는 1% Pen/Strep (써모 피셔, cat. no. 15140-122) 및 1% 푼기존(Fungizone) (써모 피셔, cat. no. 15290-026)이 보충된 엑스-비보 15 (바이오짐, cat. no. 881024)로 구성되었다. 다음으로, 외과용 나이프 (브라운(Braun)/로트(Roth), cat. no. 5518091 BA223)를 사용하여 종양을 절단하고, 약 1-2 mm 직경의 종양 조각으로 컷팅하였다. 2개의 조각을 각각 1 mL TIL 배지 (엑스-비보 15, 10% 인간 혈청 알부민 (HSA, CSL 베링(CSL Behring), cat. no. PZN-6446518), 1% Pen/Strep, 1% 푼기존 및 표시된 농도의 IL-2 (프로류킨(Proleukin)®S, 노파르티스 파마(Novartis Pharma), cat. no. 02238131))를 함유하는 24-웰 플레이트 (VWR 인터내셔널, cat. no. 701605) 중 1개의 웰 내에 넣었다. CD40 및 CD137에 결합하는 이중특이적 항체를 표시된 최종 농도로 첨가하였다. 배양 플레이트를 37℃ 및 5% CO₂에서 72시간 동안 인큐베이션하고, 표시된 IL-2 농도 및 표시된 농도의 이중특이적 항체를 함유하는 1 mL 신선한 TIL 배지를 각각의 웰에 첨가하였다. 5.0 메가픽셀 카메라가 장착된 레이카(Leica) DMi1 현미경을 사용하여 격일로, TIL 클러스터의 발생에 대해 웰을 모니터링하였다. 25개 초과의 TIL 마이크로클러스터가 검출되면 웰을 개별 분할하였다. TIL 배양물을 분할하기 위해, 세포를 재현탁시키고, 6-웰 플레이트의 웰로 옮기고, 또 다른 2 mL의 TIL 배지를 보충하였다.

10-14일의 총 배양 기간 후, TIL을 수거하고 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 상이한 치료 군의 정량적 비교가 가능하도록, BD™ 콤프비즈(CompBeads) (비디 바이오사이언시스, cat. no. 51-90-9001291)로 보충된 FACS-완충제에 의한 최종 세척 단계 후 세포 펠릿을 재현탁시켰다. BD FACS칸토™ II 유동 세포측정기 (벡톤 디킨슨) 상에서 유동 세포측정 분석을 수행하고, 수득된 데이터를 플로우조 7.6.5 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 1,000개 비드당 상대 생존 TIL 카운트 (7-AAD-음성 세포)를 각각의 웰에 대해 계산하였다.

도 12는 인간 흑색종 조직으로부터의 TIL 확장의 분석을 보여준다. 여기서, 100 U/mL IL-2는 TIL 배지의 보충제로서 사용되었다. 또한, CD40 및 CD137에 결합하는 이중특이적 항체 (BisG1-CD40-001-FEAL/CD137-009-FEAR)를 하기 농도로 첨가하였고: 0.016, 0.08, 0.4, 2.0 및 10.0 μg/mL; 항체를 첨가하지 않은 웰은 음성 대조군으로서 제공되었다. 배양 14일 후, TIL을 수거하여 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 24-웰 플레이트의 상이한 웰로부터 유래된, 각각의 항체 농도에 대해 5개의 샘플을 측정하였다. CD40 및 CD137에 결합하는 이중특이적 항체와 함께 배양된 모든 샘플에서 TIL의 생존 카운트는 항체가 없는 대조군 샘플과 비교하여 실질적으로 증가되었다. 전체적으로, 평균 상대 생존 TIL 카운트의 약 100-배 증가가 관찰되었다 (도 12).

도 13은 비소세포 폐암 (NSCLC) 조직으로부터의 TIL 확장의 분석을 보여준다. 여기서, 10 U/mL IL-2는 TIL 배지의 보충제로서 사용되었다. 또한, CD40 및 CD137에 결합하는 이중특이적 항체 (BisG1-CD40-001-FEAL/CD137-009-FEAR)를 하기 최종 농도로 투여하였고: 0.01, 0.1, 및 1.0 μg/mL; 항체를 첨가하지 않은 웰은 음성 대조군으로서 제공되었다. 배양 10일 후, TIL을 수거하여 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 24-웰 플레이트의 상이한 웰로부터 유래된, 각각의 항체 농도에 대해 5개의 샘플을 측정하였다. CD40 및 CD137에 결합하는 이중특이적 항체와 함께 배양된 모든 샘플에서 TIL의 생존 카운트는 항체가 없는 대조군 샘플과 비교하여 실질적으로 증가되었다. 전체적으로, 0.1 또는 1 μg/mL에서 평균 상대 생존 TIL 카운트의 최대 10-배 증가가 관찰되었다 (도 13).

SEQUENCE LISTING <110> Genmab A/S <120> MULTISPECIFIC ANTIBODIES AGAINST CD40 AND CD137 <130> P/0101-WO <160> 136 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 1 Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Ile 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 2 Ile Ile Pro Asn Asn Gly Gly Thr 1 5 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 3 Thr Arg Arg Glu Val Tyr Gly Arg Asn Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 4 Gln Gly Ile Asn Asn Tyr 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 5 Gln Gln Tyr Ser Asn Leu Pro Tyr Thr 1 5 <210> 6 <211> 122 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 6 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Ile Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Gly Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Arg Glu Val Tyr Gly Arg Asn Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 7 <211> 107 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 7 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 8 Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala 1 5 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 9 Ile Trp Asn Asn Gly Ala Thr 1 5 <210> 10 <211> 14 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 10 Ala Arg Ser Ala Asn Asp Ala Trp Ser Thr Tyr Ser Asp Leu 1 5 10 <210> 11 <211> 6 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 11 Gln Thr Ile Thr Asn Tyr 1 5 <210> 12 <211> 14 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 12 Gln Asn Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Ser Gly Tyr Gly Phe Val 1 5 10 <210> 13 <211> 117 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 13 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala 20 25 30 Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Val Ile Trp Asn Asn Gly Ala Thr His Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Ala Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Val Thr 65 70 75 80 Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Ala 85 90 95 Asn Asp Ala Trp Ser Thr Tyr Ser Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 14 <211> 112 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 14 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Thr Ile Thr Asn Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Thr Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Ser 65 70 75 80 Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser 85 90 95 Ser Gly Tyr Gly Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 15 Gly Phe Ser Leu Thr Tyr Tyr Ala 1 5 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 16 Ile Tyr Asp Asn Gly Ala Thr 1 5 <210> 17 <211> 14 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 17 Ala Arg Ser Ala Asn Asn Ala Trp Ser Thr Tyr Ser Asn Leu 1 5 10 <210> 18 <211> 6 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 18 Glu Asp Ile Ser Ser Tyr 1 5 <210> 19 <211> 14 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 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cuniculus <400> 67 Glu Asp Ile Ser Ser Tyr 1 5 <210> 68 <211> 12 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 68 His Tyr Tyr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Gly Val Ala 1 5 10 <210> 69 <211> 114 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 69 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn Asp Tyr Trp 20 25 30 Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Tyr Ile Asp Val Gly Gly Ser Leu Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Thr 65 70 75 80 Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly 85 90 95 Leu Thr Tyr Gly Phe Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 70 <211> 110 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 70 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys 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Glu Glu Gly Asp Cys Glu Leu 245 250 255

Claims

CD40 및 CD137에 결합하는 다중특이적 항체의 용도.