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CN114560940B - 一种抗SIRPα兔重组单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种抗SIRPα兔重组单克隆抗体及其制备方法和应用 Download PDF

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CN114560940B CN202011358784.7A CN202011358784A CN114560940B CN 114560940 B CN114560940 B CN 114560940B CN 202011358784 A CN202011358784 A CN 202011358784A CN 114560940 B CN114560940 B CN 114560940B
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Abstract

本发明涉及一种抗SIRPα兔重组单克隆抗体及其制备方法和应用，该抗SIRPα兔重组单克隆抗体的重链互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，且轻链互补决定区LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。该抗SIRPα兔重组单克隆抗体具有良好的特异性，可用于ELISA和普通的流式检测方法中，最重要的是该抗体可以阻断CD47蛋白与SIRPα蛋白的相互作用，具有潜在的肿瘤免疫治疗的价值。

Description

一种抗SIRPα兔重组单克隆抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别是涉及具有阻断活性的抗SIRPα兔重组单克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术
信号调控蛋白α(即Signal reg μ latory protein alpha，SIRPα)是一种跨膜蛋白，表达在巨噬细胞和骨髓细胞表面，能够与其配体CD47蛋白结合，产生一种“别吃我”的信号，从而阻止巨噬细胞对健康细胞的吞噬。然而，肿瘤细胞非常狡猾，它们可以利用这个机制从而逃避巨噬细胞的吞噬。因此，通过CD47抗体阻断CD47与SIRPα的结合可以激活巨噬细胞对肿瘤的吞噬作用。但是，CD47在红细胞膜表面也有较高的表达，CD47治疗药物杀伤肿瘤细胞的同时，会误伤红细胞，导致出现贫血。另外，由于CD47的广泛表达，临床上抗体需要大剂量才会有效果，这是目前CD47临床开发上的两大瓶颈。SIRPα则主要只存在于巨噬细胞和树突状性细胞表面，抑制SIRPα基本上不会引起红细胞贫血，同时，也不需要大量的抗体就能达到效果。因此，具有阻断CD47和SIRPα作用的抗SIRPα的抗体，也会是未来肿瘤免疫疗法的一个方向。
发明内容
本发明目的在于提供一种抗SIRPα兔重组单克隆抗体，以阻断CD47和SIRPα作用，并提供该抗SIRPα兔重组单克隆抗体的制备方法及其应用。
本发明提供的抗SIRPα兔重组单克隆抗体，其重链互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，且轻链互补决定区LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6所示的氨基酸序列。
在上述技术方案的基础上，该抗SIRPα兔重组单克隆抗体的重链可变区序列为SEQID NO:7所示的氨基酸序列，且轻链可变区序列为SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
在上述技术方案的基础上，该抗SIRPα兔重组单克隆抗体的SCFV序列为SEQ IDNO:9所示的氨基酸序列。
在上述技术方案的基础上，该抗SIRPα兔重组单克隆抗体的轻链恒定区为κ链，且重链恒定区为IgG型。
本发明还提供一种核酸分子，其包含能够编码抗SIRPα兔重组单克隆抗体的重链互补决定区或轻链互补决定区的核酸序列。
本发明还提供一种载体，其含有上述核酸分子。
本发明还提供一种宿主细胞，该宿主细胞含有上述抗SIRPα兔重组单克隆抗体、上述核酸分子或上述载体。
本发明还提供一种偶联物，含有上述抗SIRPα兔重组单克隆抗体。
本发明还提供一种药物组合物，含有主成分和辅成分，其中：主成分上述抗SIRPα兔重组单克隆抗体、上述核酸分子、上述载体、上述宿主细胞、上述偶联物中的一种或多种，辅成分选自药学上可接受的载体或赋形剂，以及任选的其它生物活性物质。
本发明还提供上述抗SIRPα兔重组单克隆抗体、上述酸分子上述载体、上述宿主细胞、上述偶联物在制备治疗疾病的药物或检测试剂中的应用。
本发明还提供一种试剂盒，该试剂盒包含上述抗SIRPα兔重组单克隆抗体。
本发明还提供一种制备上述抗SIRPα兔重组单克隆抗体的方法，包括以下步骤：
(1)用人SIRPα胞外区FC融合蛋白免疫新西兰大白兔，采集外周血；用淋巴细胞分离液将所采集外周血中的PBMC细胞分离出来；
(2)将SIRPα蛋白偶联的磁珠与所分离出的PBMC细胞共同室温孵育，分离磁珠和上清，得到B淋巴细胞；
(3)利用含人IL2的培养基培养B淋巴细胞，收集培养基上清，进行抗体的鉴定；
(4)提取鉴定为SIRPα特异性的B细胞的RNA，反转录为cDNA，利用引物对SIRPα特异性抗体的重轻链基因进行PCR扩增，回收PCR产物，将SIRPα特异性抗体的重轻链基因克隆至表达载体后进行转化，利用菌落PCR验证单菌落，将阳性菌落进行基因测序，得到SIRPα特异性抗体的基因序列；
(5)将SIRPα特异性抗体的重轻链基因的表达质粒共转染入293细胞，培养后收集细胞上清，利用proteinA树脂进行纯化，即获得权利要求1所述的抗SIRPα兔重组单克隆抗体。
与传统的杂交瘤融合技术相比，本发明利用B细胞克隆技术提供了一种具有阻断活性的抗SIRPα的兔重组单克隆抗体，该抗体既能进行ELISA应用，也可以进行普通的流式反应，最重要的是该抗体可以阻断CD47蛋白与SIRPα蛋白的相互作用，具有潜在的肿瘤免疫治疗的价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1显示了SIRPα胞外区蛋白的SDS电泳图。
图2显示了抗SIRPα兔重组单克隆抗体的FACs检测结果。
图3显示了竞争ELISA检测抗SIRPα兔重组单克隆抗体阻断SIRPα蛋白与CD47蛋白的相互作用。
图4显示了竞争FACs检测SIRPα抗兔重组单克隆抗体阻断SIRPα蛋白与CD47蛋白的相互作用。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下对本发明做进一步描述：在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
这里提到的术语“抗体”包括完整抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。“抗体”是指包含通过二硫键互相连接在一起的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区和重链恒定区组成。本发明中涉及的蛋白或其片段可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从真核宿主(例如哺乳动物细胞)中产生。本发明所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明的技术方案。
实施例：
(1)SIRPα胞外区蛋白的制备：本发明构建了人SIRPα胞外区(Glu31-Arg370)FC融合蛋白真核表达质粒，转染293F细胞5天后，收集细胞培养基上清，利用proteinA树脂进行纯化，并对蛋白的浓度进行鉴定。
(2)免疫动物外周血单个核细胞(即PBMC细胞)的获取：选择新西兰大白兔作为免疫动物。第一次免疫时将250μgSIRPα胞外区蛋白与等体积的完全弗氏佐剂进行乳化，对新西兰大白兔皮下背部多点进行注射，21天后进行第二次免疫，将120μg的蛋白与等体积的不完全弗氏佐剂进行乳化，对新西兰大白兔背部皮下注射，21天后进行第三次免疫。第三次免疫后间隔一周，无菌采集外周血。
(3)SIRPα特异性B淋巴细胞的获取：用淋巴细胞分离液将所采集的外周血中的PBMC细胞分离出来；按照免疫磁珠操作说明，将SIRPα蛋白偶联到磁珠上；将SIRPα蛋白偶联的磁珠与分离出的PBMC细胞共同室温孵育50min后的混合物放入磁力架中，5min后磁珠全部沉入底部，弃掉上清，加入无菌的PBS洗涤细胞，重复洗细胞3次，最后分离得到的细胞即为SIRPα特异性的B淋巴细胞。
(4)B淋巴细胞的鉴定：将分离获得的B淋巴细胞进行一定倍数的稀释后置入96孔细胞培养板，加入含10％胎牛血清(FBS)和2μg/ml的人IL2的1640培养基，37℃5％CO2条件下培养6天。收集培养基上清进行抗体的鉴定。
a)间接ELISA鉴定：
包被浓度为1μg/ml的SIRPα蛋白，100μl/孔，4℃孵育16h；次日弃掉包被液后用含1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS进行封闭，150μl/孔，37℃孵育1h。弃掉封闭液，加入B细胞上清，50μl/孔，37℃孵育1h。弃掉B细胞上清，用含0.5wt.％的Tween-20的PBS洗板5次，2min/次，最后加入稀释5000倍的羊抗兔IgG-HRP二抗，37℃孵育1h。弃掉二抗，用磷酸盐吐温缓冲液(PBST)洗板5次，2min/次。弃掉洗涤液，拍干，加入底物进行显色。
b)流式方法鉴定：
用人髓系白血病单核细胞THP-1进行测试。即收集细胞于离心管中，采用无菌的PBS洗细胞两次，采用Fc受体封闭液进行细胞表面Fc受体的封闭，4℃孵育30min。离心收集细胞，用含0.5wt.％BSA的PBS洗细胞两次，加入B细胞培养上清，4℃孵育30min。再用含0.5wt.％BSA的PBS洗细胞两次，最后加入羊抗兔IgG-488荧光二抗于4℃孵育30min。用含0.5wt.％BSA的PBS洗细胞两次后，加入200μl含0.5wt.％BSA的PBS重悬细胞，流式机器上机测试。
(5)抗体基因的克隆：对经鉴定为阳性的B细胞进行收集，利用常规的RNA提取方法提取RNA后，反转录为cDNA，利用抗体重链的基因引物即：上游引物5’-CAGTCGCTGGAGGAGTCCGG-3’和下游引物5’-CCATTGGTGAGGGTGCCCGAG-3’，抗体轻链基因的引物即：上游引物5’-GACATTGTGATGACCCAGAC-3’和下游引物5’-CCACCTCGGTCCCTTCGCCG-3’，对抗体重轻链基因进行扩增，其扩增条件为：94℃3min进行变性，(95℃1min，56℃30s，72℃1min)进行30个循环反应，最后72℃延伸10min。利用DNA胶纯化回收试剂盒将PCR产物进行回收。将兔重组单克隆抗体的重轻链基因克隆至表达载体后进行转化，利用菌落PCR验证单菌落，将阳性菌落进行基因测序，即可获得抗SIRPα兔重组单克隆抗体的基因序列，其重链互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列，且轻链互补决定区LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列分别为SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，重链可变区序列为SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，且轻链可变区序列为SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，SCFV序列为SEQ IDNO:9所示的氨基酸序列，该抗SIRPα兔重组单克隆抗体的轻链恒定区为κ链，且重链恒定区为IgG型。
(6)SIRPα兔重组单克隆抗体的生产和鉴定：将抗体的重轻链基因的表达质粒共转染入293细胞，37℃5％CO2培养条件下培养72h，收集细胞上清，利用proteinA树脂进行抗体的纯化。
纯化后的抗体进行功能鉴定，具体如下：
a)ELISA反应:
包被浓度为1μg/ml的SIRPα蛋白，100μl/孔，4℃孵育16h；次日弃掉包被液后用含1wt.％BSA的PBS进行封闭，150μl/孔，37℃孵育1h。弃掉封闭液，加入不同倍比稀释的抗体，50μl/孔，37℃孵育1h。弃掉抗体，用含0.5wt.％的Tween-20的PBS洗板5次，2min/次，最后加入稀释5000倍的羊抗兔IgG-HRP二抗，37℃孵育1h。弃掉二抗，用PBST洗板5次，2min/次。弃掉洗涤液，拍干，加入底物进行显色。
表1 SIRPα兔重组单克隆抗体的ELISA测定结果
抗体稀释浓度(ng/ml) OD450值
150 溢出
30 溢出
6 3.5169
1.2 1.5652
0.24 0.4844
0.048 0.2045
0.0096 0.1386
空白 0.1237
b)流式反应:
用人髓系白血病单核细胞THP-1进行测试。即收集细胞于离心管中，无菌的PBS洗细胞两次，采用Fc受体封闭液进行细胞表面Fc受体的封闭，4℃孵育30min。离心收集细胞，用含0.5wt.％BSA的PBS洗细胞两次，加入不同倍比稀释的纯化抗体，4℃孵育30min。再用含0.5wt.％BSA的PBS洗细胞两次，最后加入羊抗兔IgG-488荧光二抗，50μl/样，4℃孵育30min。用含0.5wt.％BSA的PBS洗细胞两次后，用200μl含0.5wt.％BSA的PBS重悬细胞，流式机器上机测试。
c)阻断活性功能测试:
用人髓系白血病单核细胞THP-1进行测试。即收集细胞于离心管中，无菌的PBS洗细胞两次，采用Fc受体封闭液进行细胞表面Fc受体的封闭，4℃孵育30min。离心收集细胞，用含0.5wt.％BSA的PBS洗细胞两次，加入不同倍比稀释的抗体，4℃孵育30min。再用含0.5wt.％BSA的PBS洗细胞两次，加入CD47带mFc标签的蛋白，1μg/ml，4℃孵育30min。最后加入羊抗鼠IgG-488荧光二抗，4℃孵育30min。用含0.5wt.％BSA的PBS洗细胞两次后，用200μl含0.5wt.％BSA的PBS重悬细胞，流式机器上机测试。
序列表
<110> 缔码生物科技(武汉)有限公司
<120> 一种抗SIRPα兔重组单克隆抗体及其制备方法和应用
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Ser Ala Ser
1
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Ser Tyr Tyr Gly Ser Asn Ala Ile Tyr Asn Gly
1 5 10
<210> 7
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ala Tyr Ala
20 25 30
Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Asp Ile Trp Ser Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Thr
65 70 75 80
Gly Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asn Val
85 90 95
Tyr Ser Ser Tyr Gly Tyr Ile Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Ile Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Glu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Ser Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Tyr Gly Ser Asn Ala
85 90 95
Ile Tyr Asn Gly Phe Gly Glu Gly Thr Glu Val
100 105
<210> 9
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ala Tyr Ala
20 25 30
Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Asp Ile Trp Ser Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Thr
65 70 75 80
Gly Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asn Val
85 90 95
Tyr Ser Ser Tyr Gly Tyr Ile Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu
115 120 125
Ala Ala Val Gly Gly Thr Ile Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser
130 135 140
Ile Ser Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Glu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
145 150 155 160
Ser Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser
165 170 175
Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser
180 185 190
Asp Leu Glu Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Tyr
195 200 205
Gly Ser Asn Ala Ile Tyr Asn Gly Phe Gly Glu Gly Thr Glu Val
210 215 220
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cagtcgctgg aggagtccgg 20
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccattggtga gggtgcccga g 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gacattgtga tgacccagac 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ccacctcggt cccttcgccg 20

Claims (11)

1.一种抗SIRPα兔重组单克隆抗体，其特征在于：其重链互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，且轻链互补决定区LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗SIRPα兔重组单克隆抗体，其特征在于：其重链可变区序列为SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，且轻链可变区序列为SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的抗SIRPα兔重组单克隆抗体，其特征在于：其SCFV序列为SEQID NO:9所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的抗SIRPα兔重组单克隆抗体，其特征在于：其轻链恒定区为κ链，且重链恒定区为IgG型。
5.一种核酸分子，其特征在于：其包含能够编码权利要求1-4任一项所述的抗SIRPα兔重组单克隆抗体的重链互补决定区或轻链互补决定区的核酸序列。
6.一种载体，其特征在于：其含有权利要求5所述的核酸分子。
7.一种宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞含有权利要求1至4任一项所述的抗SIRPα兔重组单克隆抗体、权利要求5所述的核酸分子或含有权利要求6所述的载体。
8.一种偶联物，其特征在于：其含有权利要求1至4任一项所述的抗SIRPα兔重组单克隆抗体。
9.一种药物组合物，其特征在于：含有主成分和辅成分，所述主成分含有权利要求1至4任一项所述的抗SIRPα兔重组单克隆抗体、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6所述的载体、权利要求7所述的宿主细胞、权利要求8所述的偶联物中的一种或多种，所述辅成分选自药学上可接受的载体或赋形剂，以及任选的其它生物活性物质。
10.权利要求1至4任一项所述的抗SIRPα兔重组单克隆抗体、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6所述的载体、权利要求7所述的宿主细胞或者权利要求8所述的偶联物在制备治疗疾病的药物或检测试剂中的应用。
11.一种制备权利要求1所述的抗SIRPα兔重组单克隆抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用人SIRPα胞外区FC融合蛋白免疫新西兰大白兔，采集外周血；用淋巴细胞分离液将所采集外周血中的PBMC细胞分离出来；
(2)将SIRPα蛋白偶联的磁珠与所分离出的PBMC细胞共同室温孵育，分离磁珠和上清，得到B淋巴细胞；
(3)利用含人IL2的培养基培养B淋巴细胞，收集培养基上清，进行抗体的鉴定；
(4)提取鉴定为SIRPα特异性的B细胞的RNA，反转录为cDNA，利用引物对SIRPα特异性抗体的重轻链基因进行PCR扩增，回收PCR产物，将SIRPα特异性抗体的重轻链基因克隆至表达载体后进行转化，利用菌落PCR验证单菌落，将阳性菌落进行基因测序，得到SIRPα特异性抗体的基因序列；
(5)将SIRPα特异性抗体的重轻链基因的表达质粒共转染入293细胞，培养后收集细胞上清，利用proteinA树脂进行纯化，即获得权利要求1所述的抗SIRPα兔重组单克隆抗体。
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