PT1342093E

PT1342093E - Biossensores electroquímicos

Info

Publication number: PT1342093E
Application number: PT02720651T
Authority: PT
Inventors: Gang Cui; Ju-Yong Kim; Moon-Hwan Kim; Jung-Hee Uhm; Hakhyun Nam; Geun-Sig Cha
Original assignee: I Sens Inc
Priority date: 2001-12-24
Filing date: 2002-04-17
Publication date: 2010-02-01
Also published as: EP1342093B1; DK1342093T3; WO2003056345A1; AU2002251574A1; CN1223850C; US20040045821A1; DE60234807D1; US7258769B2; KR20030054204A; KR100475634B1; JP2005513508A; EP1342093A4; ATE452985T1; JP3948627B2; CN1514937A; EP1342093A1; ES2334893T3

Description

DESCRIÇÃO "BIOSSENSORES ELECTROQUÍMICOS"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a biossensores electroquímicos. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a biossensores electroquímicos com uma parte de introdução de amostra melhorada; compreendendo a parte de introdução de amostra uma passagem de introdução de amostra, uma passagem de descarga de ar e um espaço vazio, em que a passagem de introdução de amostra comunica com a passagem de descarga de ar e em que o espaço vazio é formado no ponto de comunicação. A presente invenção também proporciona um método de determinação da fluidez de amostras sanguíneas utilizando a referida parte de introdução de amostra.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A monitorização periódica de níveis de glucose no sangue é necessária para o diagnóstico e profilaxia da diabetes mellitus. Os analisadores convencionais para detectar o nível de glucose no sangue são analisadores do tipo com tiras baseados num método colorimétrico ou num método electroquímico. 0 método colorimétrico depende de uma reacção colorimétrica da glucose-oxidase: 1 glucose+02->ácido glucónico+H202 (catalisador: glucose-oxidase) H202+corante-^produto (catalisador: peroxidase)

Como mostrado na reacção, a glucose reage com oxigénio e é oxidada transformando-se em ácido glucónico e peróxido de hidrogénio na presença de glucose-oxidase. Com a ajuda de peroxidase, o peróxido de hidrogénio é, depois, reduzido a água, ao mesmo tempo que oxida o receptor de oxigénio cromofórico. Esta reacção dá origem a uma alteração de cor proporcional ao nível de glucose no sangue.

Este método colorimétrico, no entanto, exige um cuidado preciso, dado que a alteração da cor (ou intensidade) depende do grau de transporte de amostra e pré-tratamento de amostra, quantidade de amostra, tempo de reacção e tempo de coloração. Além disso, a coagulação de sangue ou a presença de materiais interferentes (por exemplo, ácido úrico, ácido ascórbico e bilirrubina) podem perturbar a análise colorimétrica. 0 método electroquímico pode evitar os problemas acima, proporcionando uma elevada selectividade e sensibilidade. Por exemplo, um biossensor electroquímico permite a introdução de amostras sem pré-tratamento, mesmo que as amostras se apresentem turvas e possibilita a análise precisa do nível de glucose num curto período de tempo.

Tanto o método colorimétrico como o electroquimico, que utilizam oxigénio como mediador de transferência de electrões, são denominados como o biossensor de primeira geração. 0 electroquímico de segunda geração adopta compostos organometálicos (e. g., Fe, Os, Ru contendo derivados), quinonas, 2 derivados de quinonas, sais orgânicos condutores ou viologénio como mediador de transferência de electrões. Os sensores electroquimicos de segunda geração baseiam-se na reacção: glucose+GOx-FADácido glucónico+G0x_FADH2 G0x_FADH2 +Mqx ^ GOx_FÃD+Mrad (em que GOx representa a glucose-oxidase; GOx_Fad e G0x_Fadh2 representam, respectivamente, um estado oxidado e um estado reduzido de glucose-oxidase; e Mox e Mred indicam, respectivamente, o mediador de transferência de electrões oxidado e reduzido).

Como mostrado na reacção, a glucose é oxidada, transformando-se em ácido glucónico ao reduzir GOx_FAd para G0x-FAdh2· A glucose-oxidase reduzida transfere um electrão(ões) para o mediador Mox de transferência de electrões e, depois, regressa ao estado inicial. Durante esta reacção, a corrente redox assim gerada é medida na superfície do eléctrodo. A tira biossensora electroquímica compreende; a) pelo menos, um substrato no qual um sistema de eléctrodos (um eléctrodo de teste, um eléctrodo auxiliar e/ou eléctrodo de referência) é impresso, b) uma oxidase e um mediador de transferência de electrões imobilizados no sistema de eléctrodos e c) uma parte de introdução de amostra. A tira biossensora electroquímica pode ser classificada em quatro tipos: (1) um biossensor de tipo plano, no qual um eléctrodo de teste e um eléctrodo auxiliar (ou um eléctrodo de referência) são impressos no mesmo substrato base; (2) um biossensor de tipo invertido, no qual um eléctrodo de teste e um eléctrodo auxiliar estão em frente um do outro e; (3) 3 um biossensor diferencial de tipo plano; e (4) um biossensor diferencial de tipo invertido. A maioria dos biossensores comercialmente disponíveis tem uma parte de introdução de amostra que poderia ser classificada como de tipo i ou tipo linha horizontal. A parte de introdução de amostra de tipo i compreende um substrato base, um separador de película fina (tipicamente, 100 - 500 pm) com uma parte recortada em forma de U e a placa de cobertura com um orifício de ventilação para descarregar o ar. O orifício de ventilação também pode ser formado na placa base. Este tipo de biossensor proporciona uma rápida introdução de amostra líquida através do tubo capilar de tipo i, mas tem a desvantagem de a quantidade da amostra introduzida não ser controlada com exactidão porque o canal em forma de U é, frequentemente, demasiado cheio ou não suficientemente cheio em torno do orifício de ventilação; o enchimento do canal de amostra depende, significativamente, da fluidez do sangue que varia, em grande medida, com o nível de hematócrito. Outra desvantagem do tipo i é que o manuseamento incorrecto da tira facilmente contamina o utilizador com o sangue projectado através do orifício de ventilação. A parte de introdução de amostra de tipo linha horizontal é formada pelo separador configurado para formar um canal de escoamento estreito transversal à tira entre os substratos base e de cobertura; a amostra é introduzida através da entrada formada numa face lateral, enquanto o ar no interior do espaço é descarregado através da saída formada na outra face lateral. Este tipo de biossensor também tem a desvantagem de uma amostra ter que ser introduzida lateralmente, forçando, frequentemente, o 4 utilizador a colocar a tira numa posição estranha por cima da área de amostragem. 0 documento US 6299757 de Feldman et al., divulga um sensor incluindo um separador com um canal de amostra. Embora se divulguem algumas formas de realização nas quais se forma uma região expandida no separador, a função da região é limitada para obter câmaras de amostra de maiores dimensões.

Por conseguinte, de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção, proporciona-se um biossensor electroquímico equipado com uma parte de introdução de amostra que permite uma rápida introdução de uma amostra sanguínea na ponta da tira, com uma quantidade exacta, para detecção electroquímica. 0 sangue humano contém partículas sólidas (hematócritos), tais como eritrócitos, glóbulos brancos e outras proteínas, que podem ser separadas do plasma. Estas partículas alteram a fluidez e a condutividade eléctrica do sangue. Deve salientar-se que a amostra é introduzida com uma velocidade diferente no canal capilar de uma tira de biossensor e o tempo de enchimento de amostra é uma função do nível de hematócrito.

Por conseguinte, de acordo com o segundo aspecto da presente invenção, proporciona-se um biossensor electroquímico equipado com um eléctrodo de determinação de fluidez que mede o tempo de enchimento total de amostra no tubo capilar e um método para corrigir os valores em relação aos de um nível de hematócrito conhecido. 5

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Um objectivo da presente invenção é proporcionar um biossensor electroquimico com uma parte de introdução de amostra que permita uma introdução rápida e exacta de amostra fisiológica, sem qualquer pré-tratamento de uma amostra sanguínea.

Outro objectivo da presente invenção é proporcionar um biossensor electroquimico equipado com um eléctrodo de determinação de fluidez de amostra, em que as influências de componentes modificadores de fluidez são corrigidas de modo efectivo. 0 eléctrodo de determinação de fluidez também discrimina amostras anormais, tais como as amostras sanguíneas com uma viscosidade invulgar (demasiado elevada ou demasiado baixa, comparativamente com a do sangue humano normal), ou as amostras contendo bolhas de ar (documento US5284658).

Estes e outros objectivos podem ser conseguidos ao proporcionar uma parte de introdução de amostra compreendendo uma passagem de introdução de amostra, uma passagem de descarga de ar e um espaço vazio, em que a passagem de introdução de amostra comunica com a passagem de descarga de ar, e em que o espaço vazio é formado no ponto de comunicação como reivindicado na reivindicação 1, e em que o espaço vazio pode ser ainda utilizado para colocar um eléctrodo de determinação de fluidez.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A aplicação das formas de realização preferidas da presente invenção é melhor compreendida fazendo referência aos desenhos em 6 anexo, nos quais algarismos de referência semelhantes são utilizados para partes semelhantes e correspondentes, em que: A Fig. 1 é uma vista em perspectiva explodida que ilustra um biossensor electroquimico com uma parte de introdução de amostra de acordo com a presente invenção; A Fig. 2 é uma vista em perspectiva explodida que mostra um biossensor de tipo plano de acordo com uma primeira forma de realização da presente invenção; A Fig. 3 é uma vista em perspectiva explodida que mostra um biossensor de tipo invertido de acordo com uma segunda forma de realização da presente invenção; A Fig. 4 é uma vista em perspectiva explodida que mostra um biossensor diferencial de tipo plano de acordo com uma terceira forma de realização da presente invenção; A Fig. 5 é uma vista em perspectiva explodida que mostra um biossensor diferencial de tipo invertido de acordo com uma quarta forma de realização da presente invenção; A Fig. 6 é uma vista em perspectiva explodida que ilustra um biossensor electroquimico com uma parte de introdução de amostra e um eléctrodo de detecção de fluidez de acordo com a presente invenção; A Fig. 7 é o gráfico que mostra a influência de vários materiais interferentes num sensor de glucose de tipo invertido; 7 a

Glucose b: Glucose + Acetoaminofeno ( 660 pm) c: Glucose + Ácido ascórbico (570 pm) d: Glucose + Ácido úrico (916 pm) A Fig. 8 é um gráfico que mostra uma curva de calibração de um sensor de glucose de tipo invertido para uma solução de glucose convencional; e A Fig. 9 é um gráfico que mostra curvas dinâmicas obtidas por um método cronoamperométrico, de um sensor de glucose de tipo invertido, para soluções de glucose convencionais. A Fig. 10 é um gráfico que ilustra a relação entre a fluidez de amostra (em função do tempo) e o nível de hematócrito.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

No que se refere à Fig. 1, um biossensor electroquímico compreende um separador 200 e um substrato 400 inferior (base) e um substrato 300 superior (cobertura) para formar os sensores electroquímicos e canal de introdução de amostra. Numa extremidade do separador 200 está formada uma passagem 101 de introdução de amostra, uma passagem 102 de descarga de ar e um espaço vazio 103. Deve observar-se que a passagem 101 de introdução de amostra comunica com a passagem 102 de descarga de ar de um modo mais ou menos perpendicular e o espaço vazio 103 é formado no ponto de comunicação, o que significa que a passagem (101) de introdução de amostra e a passagem (102) de descarga de ar ficam ligadas com um ângulo de 45-135°, de um modo preferido, com um ângulo de 75-105°, na extremidade da passagem de introdução de amostra e o espaço vazio (103) é um espaço adicional que é formado na extremidade da passagem de introdução de amostra na direcção oposta à entrada de amostra. Considerados em conjunto, a passagem 101 de introdução de amostra, passagem 102 de descarga de ar e espaço vazio 103 constituem uma passagem 101 de introdução de amostra. A passagem 101 de introdução de amostra é uma passagem apta a introduzir a amostra no biossensor e a passagem 102 de descarga de ar é uma passagem para ar. Devido à acção capilar, uma amostra a testar é introduzida na parte 100 de introdução de amostra e ar é descarregado através da passagem 102 de descarga de ar. 0 espaço vazio 103 proporciona uma posição livre e reduz o fenómeno da criação de bolsas de ar que ocorre, frequentemente, no ponto de comunicação entre a passagem 101 de introdução de amostra e a passagem 102 de descarga de ar. A ocorrência do fenómeno de criação de bolsas de ar dá origem a medições inexactas, pelo que o espaço vazio 103 assegura uma amostragem exacta e reprodutível. A razão entre a largura da passagem 102 de descarga de ar e a da passagem 101 de introdução de amostra é, de um modo preferido, não superior a 1:2. O intervalo mais preferido é de 1:5 a 1:2. Uma razão inferior a 1:2 assegura a contenção de uma quantidade exacta de amostra no canal 101 com uma sobrecarga mínima através da passagem 102 de descarga de ar.

Na Fig. 1, o ângulo de comunicação (Φ) entre a passagem 101 de introdução de amostra e a passagem 102 de descarga de ar é de 90°. Mas, de acordo com outra forma de realização da presente invenção, este ângulo pode variar num intervalo de entre cerca de 9 45° a cerca de 135°, de um modo preferido, de cerca de 75° a cerca de 105°.

Como também mostrado na Fig. 1, o espaço vazio 103 ultrapassa o ponto de comunicação relativamente à passagem 101 de introdução de amostra. Para assegurar um nivel de amostragem exacto sem formação de bolhas, é desejado um tratamento hidrófilo da passagem 101 de introdução de amostra incluindo o espaço vazio 103. A parte 100 de introdução de amostra da presente invenção tem a capacidade de introduzir 0,1-3,0 pL de uma amostra. De um modo mais preferido, esta capacidade é de 0,1-1,0 pL; de um modo muito preferido, a capacidade é de 0,3-0,7 pL. As amostras inferiores a 0,1 pL são demasiado pequenas para proporcionar uma medição exacta no actual intervalo de erro do biossensor. Ao mesmo tempo, as amostras superiores a 3,0 pL são demasiado grandes. Em formas de realização preferidas, obtiveram-se medições exactas com amostras de apenas 0,5 pL. A compressão de uma película de polímero orgânico constituído por poliéster, poli (cloreto de vinilo) ou policarbonato poderia levar à introdução do separador 200 entre o substrato base e superior. Poderia ser fabricado pela compressão de uma película adesiva de face dupla feita de polímero orgânico ou pela aplicação por serigrafia de uma camada de adesivo com o padrão mostrado na Fig. 1. O princípio de funcionamento da parte 100 de introdução de amostra é descrito, em seguida, em pormenor. 10

Em primeiro lugar, a amostra é introduzida na passagem 101 de introdução de amostra, por acção capilar, logo que a amostra entra em contacto com a boca da passagem 101 de introdução de amostra, e a passagem 101 é preenchida com a amostra até ao espaço vazio 103. Faz-se avançar, em seguida, uma amostra suplementar até à passagem 102 de descarga de ar. Aqui, a sobrecarga de amostra pode ser minimizada ao controlar-se a razão entre a largura da passagem 102 de descarga de ar e a da passagem 101 de introdução de amostra de modo a ser inferior a 1:2 e o espaço vazio 103 hidrófilo elimina o fenómeno de formação de bolsas de ar que ocorre no ponto de comunicação entre a passagem 101 de introdução de amostra e a passagem 102 de descarga de ar.

De acordo com a forma de realização preferida da presente invenção, se a capacidade de amostra for de 0,5 pL, a parte 100 de introdução de amostra é preenchida com sangue em cerca de 200 - 2000 ms dependendo do nivel de hematócrito, condições de armazenamento de amostra e tipo de anticoagulante utilizado. Novas amostras de sangue enchem, normalmente, o canal de amostragem de 0,5 pL em cerca de 200 - 800 ms em função do nivel de hematócrito. A parte 100 de introdução de amostra da presente invenção pode ser aplicada a vários tipos de biossensores, incluindo um biossensor de tipo plano, biossensor de tipo invertido, biossensor diferencial de tipo plano, biossensor diferencial de tipo invertido ou um biossensor invertido com eléctrodo de determinação de fluidez.

No que se refere à Fig. 2, um biossensor de tipo plano com a parte 100 de introdução de amostra da presente invenção compreende um substrato 400 no qual um sistema de eléctrodos (um 11 eléctrodo 104 de teste e um eléctrodo 105 de referência) é impresso, com uma oxidase e um mediador de transferência de electrões imobilizados no sistema de eléctrodos; um separador 200 de introdução de amostra tendo a parte 100 de introdução de amostra; e um substrato 300 superior para envolver as partes de introdução de amostra e para proteger o biossensor contra contaminantes externos. A parte 100 de introdução de amostra pode ser formada como mostrado, mas a presente invenção é satisfeita desde que a passagem 101 de introdução de amostra comunique com a passagem 102 de descarga de ar e o espaço vazio 103 seja formado no ponto de comunicação; a estrutura do espaço vazio 103 também pode ser modificada como pormenorizado acima.

No biossensor de tipo plano acima, um material de carbono ou de metal condutor pode ser impresso ou depositado sobre o substrato 400 base por meio de, por exemplo, serigrafia, deposição por plasma ou gravação quimica para formar o eléctrodo 104 de teste e o eléctrodo 105 de referência. Os dois eléctrodos são formados simetricamente e estendem-se longitudinalmente sobre o substrato 400 base. Depois de a parte dos eléctrodos ser construída desse modo, uma oxidase e um mediador de transferência de electrões são espalhados sobre os eléctrodos.

Excepto a parte de ligação dos eléctrodos, o substrato 400 base é colado ao separador 200 de introdução de amostra utilizando um adesivo. O separador 200 de introdução de amostra é, de um modo preferido, constituído por um polímero isolante, sem estar limitado a este. O substrato 400 base e o substrato 300 superior são fixos utilizando adesivos ou uma fita adesiva de face dupla. A utilização de meios adesivos semelhantes permite que o fabrico do biossensor possa ser terminado por compressão do 12 substrato 300 superior, que serve de cobertura, sobre o separador 200 de introdução de amostra. A Fig. 3 ilustra um biossensor de tipo invertido com uma parte 100 de introdução de amostra, caracterizado por possuir um substrato 400' base, no qual um eléctrodo 104' de teste e um conector 106 de eléctrodo estão impressos, e uma oxidase e um mediador de transferência de electrões estarem imobilizados no eléctrodo 104' de teste; um separador 200' de introdução de amostra tendo a parte 100 de introdução de amostra; e um substrato 300' superior no lado inferior do qual um eléctrodo 105 de referência e um conector 106 de eléctrodo estão impressos. A parte 100 de introdução de amostra pode ser formada como mostrado, mas a presente invenção é satisfeita desde que a passagem 101 de introdução de amostra comunique com a passagem 102 de descarga de ar e o espaço vazio 103 seja formado no ponto de comunicação; a estrutura do espaço vazio 103 também pode ser modificada como pormenorizado acima. O fabrico do biossensor de tipo invertido com a parte 100 de introdução de amostra pode ser conseguido do mesmo modo que o biossensor de tipo plano com a parte 100 de introdução de amostra.

Como mostrado na Fig. 4, um biossensor diferencial de tipo plano compreende um substrato 400a de base em cujas superfícies um eléctrodo 104 de teste e um eléctrodo 105 de referência estão impressos e se proporcionam uma oxidase e um mediador de transferência de electrões; um par de separadores 200a e 200b de introdução de amostra, tendo, cada, uma parte 100 de introdução de amostra, respectivamente fixos a superfícies superior e inferior do substrato 400a base; e um par de placas 300a e 300b 13 de cobertura respectivamente fixas a superfícies externas dos separadores 200a e 200b de introdução de amostra. A parte 100 de introdução de amostra pode ser formada como mostrado, mas a presente invenção é satisfeita desde que a passagem 101 de introdução de amostra comunique com a passagem 102 de descarga de ar e o espaço vazio 103 seja formado no ponto de comunicação; a estrutura do espaço vazio 103 também pode ser modificada como pormenorizado acima.

Como mostrado na Fig. 5, um biossensor diferencial de tipo invertido compreende um substrato 400b de base em cujas superfícies um eléctrodo 104 de teste e um conector 106 de eléctrodo estão impressos e se proporcionam uma oxidase e um mediador de transferência de electrões; um par de separadores 200a' e 200b' de introdução de amostra, tendo, cada, um substrato 100 de introdução de amostra, respectivamente fixos a superfícies superior e inferior do substrato 400b base; e um par de placas 300a' e 300b' de cobertura respectivamente fixas a superfícies externas dos separadores 200a' e 200b' de introdução de amostra, em lados internos dos quais um eléctrodo 105' de referência e um conector 106 de eléctrodo estão impressos. A parte 100 de introdução de amostra pode ser formada como mostrado, mas a presente invenção é satisfeita desde que a passagem 101 de introdução de amostra comunique com a passagem 102 de descarga de ar e o espaço vazio 103 seja formado no ponto de comunicação; a estrutura do espaço vazio 103 também pode ser modificada como pormenorizado acima.

Como mostrado na Fig. 6, ilustra-se um biossensor de tipo invertido com capacidade de determinação de fluidez, caracterizado por possuir um substrato 400' de base no qual um eléctrodo 104' de teste, um conector 106 de eléctrodo e um 14 eléctrodo 107 de determinação de fluidez estão impressos e uma oxidase e um mediador de transferência de electrões estarem imobilizados no eléctrodo 104' de teste; um separador 200' de introdução de amostra, tendo a parte 100 de introdução de amostra; e um substrato 300' superior em cujo lado de fundo um eléctrodo 105' de referência e um conector 106 de eléctrodo estão impressos. A parte 100 de introdução de amostra pode ser formada como mostrado, mas a presente invenção é satisfeita desde que a passagem 101 de introdução de amostra comunique com a passagem 102 de descarga de ar e o espaço vazio 103 seja formado no ponto de comunicação; a estrutura do espaço vazio 103 também pode ser modificada como pormenorizado acima. A fluidez de uma amostra é determinada em função da velocidade de enchimento de amostra entre o primeiro ponto de contacto do eléctrodo 105' próximo da boca de introdução de amostra e o eléctrodo 107 de determinação de fluidez que está posicionado no espaço vazio 103 ou na passagem 102 de descarga de ar.

Os substratos de qualquer das placas base ou placas de cobertura a utilizar nos biossensores descritos acima podem ser fabricados em cerâmica, vidro ou materiais poliméricos, de um modo preferido, um polimero orgânico de poliéster, poli(cloreto de vinilo) ou policarbonato. O fabrico dos eléctrodos, tais como os eléctrodos de referência, eléctrodos de teste e eléctrodos de referência, pode ser conseguido através da utilização de um material condutor, e. g., prata-epóxi, prata/cloreto de prata, carbono, pares redox ou uma pasta de carbono condutora modificada contendo um ligante de resina. Estes materiais podem ser formados em eléctrodos de referência, auxiliares e de teste por um método de serigrafia, um 15 método de deposição a vapor seguido de gravação química ou uma aderência de uma fita condutora.

Os biossensores descritos acima com a parte 100 de introdução de amostra têm várias vantagens. (1) O fenómeno de criação de bolsas de ar, que ocorre no ponto de comunicação entre a passagem de introdução de amostra e a passagem de descarga de ar é eliminado à medida que a amostra é rapidamente introduzida no biossensor. (2) Dado que a parte 100 de introdução de amostra está bem envolvida pela boca estreita e passagem de descarga de ar, os biossensores da presente invenção mantêm uma concentração de amostra consistente com evaporação mínima, melhorando, assim, a reprodutibilidade analítica. Além disso, a amostra fica melhor contida com a presente invenção do que com outros tipos de esquemas de introdução de amostra quando as tiras são adaptadas a e retiradas de instrumentos, reduzindo, desse modo e consideravelmente, a possibilidade de contaminação. (3) Os biossensores equipados com a parte 100 de introdução de amostra, na qual a passagem de introdução de amostra e passagem de descarga de ar comunicam de um modo aproximadamente perpendicular, estão aptos a introduzir rapidamente uma quantidade predeterminada de sangue amostrado e a aumentar a exactidão e reprodutibilidade. Ao contrário do biossensor de tipo i convencional. (4) A presente invenção permite uma amostragem de sangue mais fácil através da ponta do biossensor quando este é aplicado a partes corporais. 16 0 mediador de transferência de electrões para o eléctrodo de teste pode empregar ferroceno ou seus derivados, quinona ou seus derivados, sais orgânicos condutores ou viologénio. 0 mediador de transferência de electrões é, de um modo preferido, um composto de valência mista capaz de formar pares redox, incluindo cloreto de ruténio hexamina (III), ferricianeto de potássio, ferrocianeto de potássio, dimetilferroceno, ferricinio, ácido ferrocenomonocarboxilico, 7,7,8,8-tetracianoquinodimetano, tetratiafulvaleno, niqueloceno, N-metilacidinio, tetratiatetraceno, N-metilfenazínio, hidroquinona, ácido 3- dimetilaminobenzóico, 3-metil-2-benzotiazolinona-hidrazona, 2-metoxi-4-alilfenol, 4-aminoantipirina, dimetilanilina, 4- aminoantipireno, 4-metoxinaftol, 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina; 2,2-azino-di-[3-etilbenzotiazolina-sulfonato] , o-dianisidina, o-toluidina, 2,4-diclorofenol, 4-aminofenazona, benzidina e azul Prússiamo. Destes, o mediador preferido para o sistema de biossensores proposto é o cloreto de ruténio hexamina (III), dado que satisfaz várias condições: (1) tanto no seu estado oxidado como reduzido em solução aquosa são estáveis e reversíveis; (2) o mediador de transferência de electrões reduzido não é reactivo com oxigénio; (3) o seu potencial formal é suficientemente baixo para minimizar a influência de materiais interferentes, tais como ácido ascórbico, ácido úrico e acetaminofeno; (4) a oxidação do mediador de transferência de electrões reduzido não é sensível ao pH; e (5) não reage com materiais electroquimicamente interferentes, tais como ácido ascórbico, acetaminofeno e ácido úrico.

Deve compreender-se aqui, que a presente invenção, embora descrita para biossensores para análise de níveis de glucose no sangue, pode introduzir enzimas e mediadores de transferência de electrões apropriados no sistema de eléctrodos para se poder 17 analisar quantitativamente uma variedade de amostras, incluindo biomateriais, tais como metabolitos, e. g., colesterol, lactato, creatinina, proteínas, peróxido de hidrogénio, álcoois, aminoácidos e enzimas, e. g., GPT (glutamato-piruvato-transaminase) e GOT (glutamato-oxaloacetato-transaminase), materiais ambientais, materiais agrícolas e industriais e materiais alimentícios. Por exemplo, colesterol, lactato, glutamato peróxido de hidrogénio e álcool podem ser analisados quantitativamente utilizando, respectivamente, glucose-oxidase, lactato-oxidase, colesterol-oxidase, glutamato-oxidase, peroxidase de rábano ou álcool-oxidase.

Pode-se obter uma melhor compreensão da presente invenção à luz dos exemplos que se seguem que são enunciados para ilustrar, mas não devem ser interpretados como limitativos da presente invenção.

Exemplo 1: Fabrico de um Biossensor tipo Plano

Uma pasta de carbono condutora foi impressa por serigrafia para formar um padrão simétrico numa placa 400 base de poliéster para criar um eléctrodo 104 de teste e um eléctrodo 105 de referência (ou eléctrodo de referência). 0 intervalo entre os dois eléctrodos é de 125 pm. Uma cura dos eléctrodos impressos a 140 °C durante cinco minutos deu origem a um único corpo de eléctrodo para um biossensor de tipo plano.

Subsequentemente, a parte 100 de introdução de amostra, compreendendo a passagem 101 de introdução de amostra, passagem 102 de descarga de ar e espaço vazio 103 nela formado, foi fixa por compressão da fita de face dupla em poliéster. A passagem 101 18 de introdução de amostra comunica perpendicularmente com a passagem 102 de descarga de ar e a razão entre a largura da passagem 102 de descarga de ar e a da passagem 101 de introdução de amostra foi controlada de modo a ser 1:2. O espaço vazio 103 foi formado de modo a estender-se para além da passagem 101 de introdução de amostra. A quantidade total de sangue amostrado no interior da parte 100 de introdução de amostra foi de 0,5 pL. A armação para o biossensor foi preparada pela inserção em cada placa 400 base de poliéster, e por compressão da fita de face dupla em poliéster, de um separador 200 de introdução de amostra tendo a parte 100 de introdução de amostra. Uma solução contendo 0,015 mg de cloreto de ruténio hexamina (III), 0,015 mg de um agente dispersante (carboximetilcelulose), 0,01 mg de um agente tensioactivo (Triton X-100) e 40 mg de glucose-oxidase foi aplicada aos eléctrodos para formar o biossensor e o depósito resultante ficou a secar durante trinta minutos a 45 °C. A compressão de uma placa 300 de cobertura sobre o separador 200 de introdução de amostra finaliza o biossensor de tipo plano da Fig. 2.

Exemplo 2: Fabrico de um Biossensor de tipo invertido

Como mostrado na Fig. 3, um eléctrodo 104' de teste e um conector 106 de eléctrodo foram impressos por serigrafia com pasta de carbono condutora e efectuou-se uma cura a 140 °C durante cinco minutos. Em seguida, um conector de circuito foi impresso por serigrafia com a pasta de prata a uma extremidade do conector 106 de eléctrodo. A placa de cobertura com o eléctrodo impresso, enquanto eléctrodo 105' de referência (auxiliar), foi 19 impressa por serigrafia com pasta de carbono e foi curada. Por fim, o biossensor foi fabricado de modo a que a extremidade do eléctrodo 105' de referência fosse impressa por serigrafia com pasta de prata para se transformar no conector de circuito. O separador 200' de introdução de amostra compreendendo a passagem 101 de introdução de amostra, passagem 102 de descarga de ar e espaço vazio 103 foi colocado no substrato base por compressão da fita de face dupla em poliéster. A razão entre a largura da passagem 102 de descarga de ar e a da passagem 101 de introdução de amostra foi de 1:4 e a quantidade total de sangue amostrado no interior da parte 100 de introdução de amostra foi regulada para ser de 0,5 pL.

Uma solução de 1 mL contendo 0,015 mg de cloreto de ruténio hexamina (III), 0,015 mg de um agente dispersante (carboximetilcelulose), 0,01 mg de um agente tensioactivo (Triton X-100) e 40 mg de glucose-oxidase foi aplicada aos eléctrodos que formam o biossensor e a camada de reacção ficou a secar durante trinta minutos a 45 °C. A compressão da placa 300' de cobertura sobre o separador 200' de introdução de amostra de modo a efectuar a ligação com o conector de circuito do substrato 400' base finalizou o biossensor mostrado na Fig. 3.

Exemplo 3: Fabrico de um Sensor de Glucose Diferencial de tipo Plano O sensor de glucose diferencial de tipo plano foi preparado da mesma forma que no Exemplo 1. Como mostrado na Fig. 4, o 20 biossensor diferencial de tipo plano foi fabricado ao proporcionar-se uma pequena quantidade de albumina de soro bovino (BSA) no eléctrodo 104 de teste diferencial do substrato 400a base, em vez do cloreto de ruténio hexamina (III) e glucose-oxidase utilizados no Exemplo 1, comprimindo as placas 300a e 300b de cobertura.

Exemplo 4: Fabrico de um Biossensor Diferencial de Tipo Invertido 0 sensor de glucose diferencial de tipo invertido foi preparado da mesma forma que no Exemplo 2. Como mostrado na Fig. 5, o biossensor diferencial de tipo invertido foi fabricado ao proporcionar-se uma pequena quantidade de albumina de soro bovino (BSA) no eléctrodo 104' de teste diferencial do substrato 400b base, em vez do cloreto de ruténio hexamina (III) e glucose-oxidase utilizados no Exemplo 1, e comprimindo as placas 300a' e 300b' de cobertura.

Exemplo 5: Fabrico de um Biossensor com Eléctrodo de Determinação de Fluidez O biossensor com eléctrodo de determinação de fluidez era o biossensor de tipo invertido preparado da mesma forma que no Exemplo 2, salvo a utilização do eléctrodo 107 de determinação de fluidez; como ilustrado na Fig. 6, foi impresso por serigrafia com a mesma pasta de carbono. A ponta do eléctrodo de determinação de fluidez foi colocada no espaço vazio 103 da parte de introdução de amostra. 21

Exemplo 1 Experimental: Influência de Materiais

Interferentes num Sensor de Glucose de Tipo Invertido A Figura 7 mostra as correntes de resposta total a soluções convencionais tamponadas por fosfatos (pH 7,4) contendo 177 mg/dL de glucose e materiais interferentes cujas concentrações são cinco vezes superiores aos níveis clínicos máximos (e. g., 570 μΜ de ácido ascórbico, 660 μΜ de acetaminofeno e 916 μΜ de ácido úrico) . As correntes de resposta total foram medidas ao ler a resposta cronoamperométrica 5 segundos depois de uma aplicação de um potencial de +0,2 v ao eléctrodo 104' de teste (vs. eléctrodo 105' de referência). Introduziram-se amostras na parte 100 de introdução de amostra do biossensor fabricado como indicado no Exemplo 2 e o seu volume médio foi de 0,5 pL. Os histogramas da Fig. 7 mostram que os sensores não são praticamente afectados pela presença de materiais interferentes com um potencial aplicado de +0,2 V.

Exemplo 2 Experimental: Curva de Calibração de um Sensor de Glucose de tipo Invertido para Soluções de Glucose Convencionais O sensor de glucose de tipo invertido preparado no Exemplo 2 foi analisado quanto à sensibilidade com soluções de glucose convencionais. A curva de calibração assim obtida é indicada na Fig. 8. Neste caso, valores de corrente foram medidos dez vezes em cada concentração sob a acção do campo eléctrico com um potencial aplicado de 0,2 V relativamente ao eléctrodo de referência. A quantidade de amostras aplicada na parte de introdução de amostra foi de 0,5 pL e o tempo de enchimento não foi superior a 200 ms. As medições foram efectuadas 2 s após a introdução da amostra por aplicação de 0,2 V durante três 22 segundos e os valores de corrente foram lidos em cinco segundos. As curvas dinâmicas assim obtidas estão indicadas na Fig. 9, em que as curvas respectivas mostram concentrações de glucose de 0 mg/dL (curva a), 50 mg/dL (curva b), 150 mg/dL (curva c), 300 mg/dL (curva d), 450 mg/dL (curva e) e 600 mg/dL (curva f).

Demonstrando que o sensor de glucose de tipo invertido da presente invenção é fiável, a curva foi avaliada e mostrou-se que tinha um declive (μΑ por mg/dL) de 0, 093 e uma linearidade tão alta quanto 0,997.

Exemplo 3 Experimental: Medição da Fluidez de Sangue 0 biossensor equipado com o eléctrodo de determinação de fluidez foi preparado como descrito no Exemplo 5. Aplicou-se um potencial de 200 mV ao eléctrodo 104' de teste e ao eléctrodo 107 de determinação de fluidez (vs. o eléctrodo 105' de referência). Quando se introduzem amostras de sangue através da passagem 101 de introdução de amostra, detecta-se uma alteração súbita de corrente e inicia-se a medição temporal. Assim que a amostra alcança o espaço vazio 103, a segunda oscilação de corrente é detectada e o intervalo de tempo entre a primeira e segunda oscilação de corrente é registada. A relação entre o instante de introdução de amostra e o nivel de hematócrito é mostrada na Fig. 10. A experiência foi realizada com o sangue total tratado com NaF contendo 180 mg/dL de glucose e um nivel de hematócrito variado. A equação de adaptação obtida foi Y = -72,23 + 0,58691X - 0, 00084073 X2 - 1,1211χ10"6 X3 + 5, 7521xl0"9 X4 - 9,1172xl0"12 X5, em que Y é o nível de hematócrito estimado a partir do tempo X de enchimento de amostra medido com o eléctrodo de determinação de 23 fluidez. 0 Quadro 1 mostra o nível de hematócrito estimado a partir da velocidade de tempo de enchimento de amostra.

Quadro 1. Nível de hematócrito estimado a partir do tempo de enchimento de amostra do biossensor preparado no Exemplo 5.

Velocidade Hematócrito Hematócrito (%) Amostra preparada (ms) Estimado (%) 30% 326 30,3 % 35% 352 32,8 % 40% 530 41,8 % 45% 634 44,0 % 50% 1129 50,1 % 55% 1791 54,7 %

Numa experiência separada, as curvas de calibração foram obtidas com o sangue total com vários níveis de hematócrito e a relação entre o nível de hematócrito e os declives de resposta foi formulada (Quadro 2). 24

Hematócrito Equação (y = corrente |1A; = glucose) 30% Y = 0,035934 x - 1,7228 35% Y = 0,030559 x - 1,31815 40% Y = 0,025831 x - 1,0137 45% Y = 0,021752 x - 0,80945 50% Y = 0,018322 x - 0,7054 55% Y = 0,015539 x - 0,70155

Os factores de correcção obtidos deste modo foram utilizados para recalibrar o nivel de glucose medido em relação ao sangue total tendo um nivel de hematócrito de 40%, o que deu origem a biossensores que proporcionam concentrações de glucose independentes do hematócrito. O medidor lê, em primeiro lugar, a velocidade de introdução de amostra e determina o nível de hematócrito na amostra de sangue, consulta o quadro que proporciona as curvas de calibração correspondentes e determina o nível de glucose a partir das correntes medidas. O Quadro 3 mostra os resultados da experiência realizada como delineado. Vê-se que a correcção do nível de hematócrito proporciona os níveis de glucose próximos dos obtidos com o YSI 2300. 25

Quadro 3. Concentração de glucose no sangue total; a velocidade de introdução de amostra medida com o eléctrodo de determinação de fluidez e a curva de calibração no Quadro 2 foram utilizadas para estimar o nível de glucose no sangue total.

Glucose Hematócrito Hematócrito % corrigido YSI2300 (mg/dL) (mg/dL) 111 117 202 186 30% 381 392 138 141 200 207 35% 276 277 107 112 196 195 40% 266 264 103 105 190 189 45% 367 363 102 107 142 143 50% 253 256 125 144 241 240 55% 332 331 26 0 eléctrodo de determinação de fluidez também discrimina as amostras de sangue com uma fluidez invulgar, i. e., amostras com níveis de hematócrito demasiado elevados ou demasiado baixos e a introdução falhada de amostras de sangue devido à formação de bolhas de ar. Nesses casos, um dispositivo de medição pode ser programado para emitir uma mensagem de aviso ou código de erro para a medição.

Lisboa, 22 de Janeiro de 2010 27

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Biossensor electroquímico para determinar uma concentração de um analito numa amostra, compreendendo: um substrato (400) base e um substrato (300) de cobertura; um separador (200) de introdução de amostra tendo uma parte (100) de introdução de amostra, em que o separador de introdução de amostra está posicionado entre o substrato base e o substrato de cobertura; e pelo menos, um eléctrodo (104) de teste impresso no substrato (400) base e, pelo menos, um eléctrodo (105) de referência impresso em, pelo menos, um de entre um substrato base e uma superfície interna do substrato de cobertura e uma oxidase e um mediador de transferência de electrões proporcionados no substrato base, caracterizado por a parte (100) de introdução de amostra ser formada numa extremidade do separador (200) de introdução de amostra, compreendendo a parte de introdução de amostra: uma passagem (101) de introdução de amostra, uma passagem (102) de descarga de ar e um espaço vazio (103), em que a passagem (101) de introdução de amostra e a passagem (102) de descarga de ar estão ligadas segundo um ângulo de 45-135°, de um modo preferido, um ângulo de 75-105°, na extremidade da passagem de introdução de amostra e o espaço vazio (103) é um espaço adicional que é formado na extremidade da passagem de introdução de amostra na direcção oposta da entrada de amostra e a razão entre a largura da 1 passagem (102) de descarga de ar e a da passagem (101) de introdução de amostra não é superior a 1:2.
2. Biossensor electroquímico de acordo com a reivindicação 1, em que compreende um eléctrodo (104) de teste e um eléctrodo (105) de referência impresso na superfície superior do substrato (400) base.
3. Biossensor electroquímico de acordo com a reivindicação 1, compreendendo ainda um conector (106) de eléctrodo impresso na superfície superior do substrato (400') base e na superfície interna do substrato (300') de cobertura, em que compreende um eléctrodo (104') de teste impresso na superfície superior do substrato (400' ) base e um eléctrodo (105') de referência impresso na superfície interna do substrato (300') de cobertura.
4. Biossensor electroquímico de acordo com a reivindicação 2, compreendendo ainda: um segundo separador (200b) de introdução de amostra com a parte (100) de introdução de amostra como descrita na reivindicação 1 e acoplado à superfície inferior do substrato (400a) base; um segundo substrato (300b) de cobertura, comprimido sobre a superfície externa do segundo separador (200b) de introdução de amostra; um segundo eléctrodo (104) de teste e um segundo eléctrodo (105) de referência impressos na superfície inferior do substrato (400a) base; e 2 uma BSA e um segundo mediador de transferência de electrões proporcionados na superfície inferior do substrato (400a) base.
5. Biossensor electroquímico de acordo com a reivindicação 3, compreendendo ainda: um segundo separador (200b') de introdução de amostra com a parte (100) de introdução de amostra como descrita na reivindicação 1 e acoplado à superfície inferior do substrato (400b) base; um segundo substrato (300b') de cobertura, comprimido sobre a superfície externa do segundo separador (200b') de introdução de amostra; um segundo eléctrodo (104') de teste impresso na superfície inferior do substrato (400b) base; uma BSA e um segundo mediador de transferência de electrões proporcionados na superfície inferior do substrato (400b) base; um segundo eléctrodo (105') de referência impresso na superfície interna do segundo substrato (300b') de cobertura; e um segundo conector (106) de eléctrodo impresso na superfície inferior do substrato (400b) base e na superfície interna do segundo substrato (300b') de cobertura. 3
6. Biossensor electroquímico de acordo com a reivindicação 3, compreendendo ainda um eléctrodo (107) de determinação de fluidez impresso na superfície superior do substrato (400') base.
7. Biossensor electroquímico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que a razão entre a largura da passagem de descarga de ar e a da passagem de introdução de amostra está compreendida entre 1:5 e 1:2.
8. Biossensor electroquímico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a parte de introdução de amostra tem uma capacidade de introdução de 0,1-3,0 pL de uma amostra.
9. Biossensor electroquímico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a parte (100) de introdução de amostra tem uma capacidade de introdução de 0,1-1,0 pL de uma amostra.
10. Biossensor electroquímico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a parte de introdução de amostra tem uma capacidade de introdução de 0,3-0,7 pL de uma amostra.
11. Biossensor electroquímico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que a passagem de introdução de amostra está ligada à passagem de descarga de ar de um modo aproximadamente perpendicular, de um modo preferido, formando um ângulo de 90°. 4
12. Biossensor electroquímico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que a oxidase é seleccionada do grupo consistindo em glucose-oxidase, lactato-oxidase, colesterol-oxidase, glutamato-oxidase, peroxidase de rábano e álcool-oxidase.
13. Biossensor electroquimico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que o mediador de transferência de electrões é seleccionado do grupo consistindo em cloreto de ruténio hexamina (III), ferricianeto de potássio, ferrocianeto de potássio, dimetilferroceno, ferricinio, ácido ferrocenomonocarboxilico, 7,7,8,8-tetracianoquinodimetano, tetratiafulvaleno, niqueloceno, N-metilacidinio, tetratiatetraceno, N-metilfenazinio, hidroquinona, ácido 3-dimetilaminobenzóico, 3-metil-2-benzotiazolinona- hidrazona, 2-metoxi-4-alilfenol, 4-aminoantipirina, dimetilanilina, 4-aminoantipireno, 4-metoxinaftol, 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina; 2,2-azino-di-[3- etilbenzotiazolina-sulfonato], o-dianisidina, o-toluidina, 2,4-diclorofenol, 4-aminofenazona, benzidina e azul Prússiam.
14. Biossensor electroquimico de acordo com a reivindicação 13, em que o mediador de transferência de electrões é cloreto de ruténio hexamina (III). Lisboa, 22 de Janeiro de 2010 5