JPH09101280A

JPH09101280A - バイオセンサ

Info

Publication number: JPH09101280A
Application number: JP7282363A
Authority: JP
Inventors: Tadahisa Toyama; 忠久当山; Masao Karube; 征夫輕部
Original assignee: Casio Computer Co Ltd
Current assignee: Casio Computer Co Ltd
Priority date: 1995-10-05
Filing date: 1995-10-05
Publication date: 1997-04-15

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】試料液中に妨害物質が存在する場合での基質
濃度の測定を確実に行えるバイオセンサを提供する。【解決手段】上下連続多孔性膜１１、１２を介して、
カソード電極１５と、アノード電極１７、補正用アノー
ド電極１８と、を対向配置し、アノード電極１７に接触
する上連続多孔性膜１１に酵素固定化層１１Ａを形成す
ることにより、アノード電極１７と補正用アノード電極
１８との電流応答の差を取ることにより、還元性物質の
電解酸化電流を除去できるため、高濃度の妨害物質を含
んだ試料液の基質濃度の測定が可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は、バイオセンサに
関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、この種のバイオセンサとしては、
図５（Ａ）、（Ｂ）に示すような構造のものが提案され
ている。このバイオセンサは、図に示すように、絶縁基
板１の上に、例えばスクリーン印刷法により導電性カー
ボンペーストを印刷してなる作用極（アノード電極）２
Ａと、同じく導電性カーボンでなる対極（カソード電
極）２Ｂと、が所定間隔を介して形成されている。作用
極２Ａは、矩形状であり、対極２Ｂはこの作用極２Ａの
三方を囲むような略コ字形状となっている。そして、作
用極２Ａの表面には、酸化還元酵素または、酸化還元酵
素およびメディエータの両者、からなる酵素反応層３が
形成されている。このバイオセンサを用いて試料液の基
質濃度を測定するには、このバイオセンサを試料液に浸
漬して、作用極２Ａと対極２Ｂとの間に試料液が存在す
る状態で行う。このとき、酸化還元酵素の触媒作用によ
り、基質が例えば酸化され、メディエータが還元され
る。そして、還元されたメディエータを電気化学的に酸
化し、そのとき得られるメディエータの酸化電流を検出
することにより、試料液中の基質濃度を求めるようにな
っている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、このよ
うなバイオセンサを例えばグルコースセンサに適用した
場合、４０ｍｇ／ｄｌ以下のグルコース濃度に対する電
流応答が小さく、低濃度領域のグルコース測定が困難で
あった。また、還元性物質による妨害電流が生じ、還元
性物質（例えば、アスコルビン酸など）を多く含む試料
液の測定値が高くでるという問題点があった。なお、こ
のような問題は、グルコースセンサに限られるものでは
なく、他の基質濃度を測定する各種のバイオセンサにお
いても同様であった。

【０００４】この発明の課題は、所謂妨害物質を含んだ
試料液中の基質濃度の測定を可能にするバイオセンサを
得るにはどのような手段を講じればよいかという点にあ
る。

【０００５】

【課題を解決するための手段】

【０００６】請求項１記載の発明は、バイオセンサにお
いて、スペーサにより互いに離間された一対の絶縁膜に
それぞれカソード電極及び白金からなるアノード電極が
対向して形成され、前記アノード電極表面に測定する試
料と化学反応を生じる酵素または酵素及びメディエータ
を含む酵素層が形成され、前記酵素層の少なくとも一側
面には、前記スペーサにより外部と連通されている試料
導入空間が形成されていることを特徴とする。

【０００７】したがって、酵素層が形成されているアノ
ード電極を白金とすることにより、試料に含まれる被測
定対象である基質の酵素反応に伴う酸化還元電流を鋭敏
に検知すると共に試料に含まれる妨害物質に起因する電
流の検知を低減することができるので、より精度の高い
試料中の基質の測定を行なうことができる。また、試料
導入空間が酵素層の少なくとも一側面に形成されている
ので迅速に試料を酵素層に到達することができる。

【０００８】請求項２記載の発明は、前記力ソード電極
に対向して、前記酵素層と重ならない補正用アノード電
極を備えることを特徴とする。

【０００９】したがって、補正用アノード電極を用いて
酵素反応と異なる反応により生じる電流を測定し、アノ
ード電極とカソード電極との間に発生する電流から差し
引くことにより、より精度の高いセンスを行なうことが
できる。

【００１０】請求項３記載の発明は、前記酵素層は、柔
軟性を有する多孔性膜であり、前記酵素または酵素及び
メディエータは前記多孔性膜内に形成されている。

【００１１】したがって、多孔質の酵素層であるので反
応を起こす表面積が大きいので高感度に測定することが
できる。また、試料導入空間を狭小にすることができる
ので微量な試料でセンスすることができる。

【００１２】請求項４記載の発明は、一部が外部に露出
している前記多孔性膜上にカソード電極表面が形成され
ていることを特徴とする。

【００１３】したがって、カソード電極側にも試料が導
入することができ、迅速に測定することができる。

【００１４】請求項５記載の発明では、前記試料はグル
コースを含み、前記酵素層はグルコースオキシターゼを
含むことを特徴とする。

【００１５】

【発明の実施の形態】以下、この発明に係るバイオセン
サの詳細を図面に示す実施形態に基づいて説明する。

【００１３】（実施形態１）図１（Ａ）および（Ｂ）
は、この発明の実施形態１を示している。図１（Ａ）
は、この実施形態のバイオセンサの平面説明図であり、
図１（Ｂ）は同図（Ａ）のＢ−Ｂ断面図である。

【００１４】このバイオセンサの構成は、図１（Ｂ）に
示すように、上連続多孔性膜３１と下連続多孔性膜３２
とが、絶縁性材料でなる板状のスペーサ３３を介して接
合されている。これら上下連続多孔性膜３１、３２は、
ポリテトラフルオロエチレンでなり、その膜厚は例えば
２０〜〜２００μｍで、連続孔の孔径は０．２μｍに設
定されている。そして、下連続多孔性膜３２には、上連
続多孔性膜３１の一側縁部より外側に突出する延在部３
２Ａが形成されている。なお、スペーサ３３には、図１
（Ａ）に破線で示すような平面略Ｔ字形状の、試料液導
入空間としての中空部３４が形成されている。この中空
部３４は、下連続多孔性膜３２の延在部３２Ａの幅方向
の中央の位置から内側に向けてスペーサ３３を切り欠い
た試料液導入部３４Ａと、この試料液導入部３４Ａに連
通する、上下連続多孔性膜３１、３２の幅方向に沿って
スペーサ３３を切り欠いた検査空間３４Ｂと、から構成
されている。

【００１５】そして、下連続多孔性膜３２の下面には、
白金（Ｐｔ）でなるカソード電極３５が全面に亙って形
成されている。また、このカソード電極３５の下面に
は、全面に亙って下絶縁膜３６が形成されている。一
方、上連続多孔性膜３１の上面には、図１（Ａ）に示す
ように、白金でなるアノード電極３７が形成されてい
る。このアノード電極３７の一端部には、例えば径寸法
が２．５ｍｍの円形状の検査部３７Ａが形成されてい
る。なお、アノード電極３７における検査部３７Ａ以外
の部分は、幅寸法が１ｍｍの線状パターン３７Ｂに形成
されている。また、検査部３７Ａは、スペーサ３３と上
下連続多孔性膜３１、３２とで形成される検査空間３４
Ｂに、上連続多孔性膜３１を介して臨むように配置され
ている。ところで、アノード電極３７およびカソード電
極３５を形成するには、マグネットスパッタリング法で
白金膜を成膜する。この白金膜からアノード電極３７を
パターン形成するには、例えばメタルマスクまたはフォ
トリソグラフィー技術およびエッチング技術を用いれば
よい。そして、図１（Ａ）に示すように、検査空間３４
Ｂに対応する部分の上連続多孔性膜３１には、グルコー
スオキシダーゼ（ＧＯＤ）と牛血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）とが固定化されて、酵素固定化層３１Ａが形成され
ている。この酵素固定化層３１Ａは、上連続多孔性膜３
１の連続孔を酵素で塞いでしまうものではなく、基性で
あるグルコースがアノード電極１７に到達し得るように
連続孔が連通した状態を保つように固定化されている。
このような酵素の固定化方法としては、架橋法や包括法
などが知られている。本実施形態では、上下連続多孔性
膜３１、３２をスペーサ３３を介して張り合わせる前
に、グルコース酸化酵素であるグルコースオキシダーゼ
（ＧＯＤ）と牛血清アルブミン（ＢＳＡ）との混合溶液
を、上連続多孔性膜３１の検査空間３４Ａに臨む部分
に、適量滴下し、乾燥後、グルタルアルデヒド蒸気中で
架橋反応を行って酵素を固定化した。アノード電極３７
を覆うように上連続多孔性膜３１の上面に上絶縁膜３９
が全面に亙って設けられている。

【００１６】そして、図１（Ｂ）に示すように、カソー
ド電極３５は、リード線４０を介して電圧印加回路４１
および電流測定回路４２に接続されている。また、アノ
ード電極３７は、リード線４３を介して電圧印加回路４
１および電流測定回路４２に接続されている。

【００１７】このような構成のグルコースセンサを用い
て、試料液に対する電流応答を測定した。試料液として
は、低濃度のグルコース標準溶液を１０μｌ滴下して用
いた。なお、試料液の滴下位置は、下連続多孔性膜３２
の延在部３２Ａ中央の試料液導入部３４Ａの入口位置で
ある。このような位置に滴下すると、標準溶液は毛細管
現象により、試料液導入部３４Ａに沿って検査空間３４
Ｂに取り込まれ、アノード電極３７側に標準溶液が拡散
して行く。そして、酵素固定化層３１Ａで酵素反応が起
こり、グルコースが酸化されるとともに、過酸化水素が
生成される。標準溶液が、対向するアノード電極３７
（検査部３７Ａ）とカソード電極３５との間に十分染み
込むのを待って、所定時間経過後、電極間に０．７Ｖの
電圧を電圧印加回路４１によって印加した。電圧印加に
より、電極間に過酸化水素の電解電流が流れる。電圧印
加してから５秒後の電解電流を電流測定回路４２により
検出した。図２は、グルコース濃度０のときのバイアス
電流キャンセル後の、グルコース濃度に対する電解電流
値をプロットしたグラフである。このグラフから、グル
コース濃度０〜６０ｍｇ／ｄｌの低濃度領域で、非常に
良い直線性が得られた。また、１００ｍｇ／ｄｌのアス
コルビン酸溶液に対する応答は、約０．２μＡとなり、
従来のカーボンペースト電極の応答の約２．２μＡより
１０分の１以下となり、アスコルビン酸の影響を著しく
削減できた。

【００１８】本実施形態では、電極材料に白金を用いた
ことにより、例えばアスコルビン酸などの妨害物質の影
響を受けずに、低濃度の基質の濃度測定が可能となる。

【００１９】（実施形態２）図３（Ａ）はこの実施形態
の平面図、図３（Ｂ）は同図（Ａ）のＡ−Ａ断面図であ
る。本実施形態では、図に示すように、上連続多孔性膜
１１と下連続多孔性膜１２とが、絶縁性材料でなる板状
のスペーサ１３を介して接合されている。なお、下連続
多孔性膜１２は、上連続多孔性膜１１の一側縁部より外
側に突出する延在部１２Ａが形成されている。なお、ス
ペーサ１３には、図３（Ａ）に破線で示すような平面略
Ｔ字形状の、試料液導入空間としての中空部１４が形成
されている。この中空部１４は、下連続多孔性膜１２の
延在部１２Ａの幅方向の中央の位置から内側に向けてス
ペーサ１３を切り欠いた試料液導入部１４Ａと、この試
料液導入部１４Ａに連通する、上下連続多孔性膜１１、
１２の幅方向に沿ってスペーサ１３を切り欠いた検査空
間１４Ｂと、から構成されている。

【００２０】そして、下連続多孔性膜１２の下面には、
例えば対向電極として導電性カーボンでなるカソード電
極１５が全面に亙って形成されている。また、このカソ
ード電極１５の下面には、全面にわたって下絶縁膜１６
が形成されている。一方、上連続多孔性膜１１の上面に
は、図３（Ａ）に示すように、所定距離を介して、長手
方向に沿って形成された、作用電極として白金でなるア
ノード電極１７と、同じく白金でなる補正用アノード電
極１８とが形成されている。これらアノード電極１７と
補正用アノード電極１８のそれぞれの一端部には、円形
状の検査部１７Ａ、１８Ａが形成されている。この検査
部１７Ａ、１８Ａは、スペーサ１３と上下連続多孔性膜
１１、１２とで形成される検査空間１４Ｂに、上連続多
孔性膜１１を介して臨むように配置されている。そし
て、図３（Ａ）に示すように、検査空間１４Ｂのアノー
ド電極１７側の半分に対応する部分の上連続多孔性膜１
１には、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）と牛血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）とが固定化されて、酵素固定化層１
１Ａが形成されている。また、検査空間１４Ｂの補正用
アノード電極１８側の半分に対応する部分の上連続多孔
性膜１１には、牛血清アルブミン（蛋白質）のみが固定
化されてなる非酵素固定化層１１Ｂが形成されている。
なお、これら酵素固定化層１１Ａ、非酵素固定化層１１
Ｂは、上連続多孔性膜１１の連続孔を酵素等で塞いでし
まうものではなく、基質であるグルコースがアノード電
極１７、補正用アノード電極１８に到達し得るように連
続孔が連通した状態を保つように固定化されている。そ
して、図３（Ｂ）に示すように、アノード電極１７およ
び補正用アノード電極１８を覆うように上連続多孔性膜
１１の上面に上絶縁膜１９が全面に亙って設けられてい
る。

【００２１】なお、上記した酵素固定化層１１Ａ、非酵
素固定化層１１Ｂを形成する方法としては、それぞれの
領域の上連続多孔性膜１１に、グルコースオキシダーゼ
と牛血清アルブミンとの混合溶液、または牛血清アルブ
ミン溶液を滴下し、乾燥を行った後、グルタルアルデヒ
ド蒸気中で架橋反応を行って固定化する。

【００２２】そして、図３（Ｂ）に示すように、カソー
ド電極１５は、リード線２２を介して電圧印加回路２３
および電流測定回路２４に接続されている。また、アノ
ード電極１７は、リード線２０を介して電圧印加回路２
３および電流測定回路２４に接続されている。さらに、
補正用アノード電極１８は、リード線２１を介して電圧
印加回路２３および電流測定回路２４に接続されてい
る。またさらに、電流測定回路２４は、演算手段２５お
よび表示手段２６に接続されている。

【００２３】本実施形態では、アノード電極１７に接触
する部分の上連続多孔性膜１１のみに酵素を固定化した
ため、電圧印加により例えば尿酸の酸化電流が生じて
も、アノード電極１７と補正用アノード電極１８との両
方に流れ、酵素反応後に生じる過酸化水素の酸化電流は
アノード電極１７のみに流れるため、２つの電流の差を
取れば、尿酸やその他の還元性物質による影響を除去す
ることができる。具体的には、尿酸１００ｍｇ／ｄｌ、
グルコース１０ｍｇ／ｄｌの混合溶液に対する電流応答
とグルコース１０ｍｇ／ｄｌ溶液に対する電流応答の差
は０．１μＡとなり、グルコースの１０倍濃度の尿酸を
含むに拘わらず、その影響は著しく削減された。

【００２４】また、作用電極であるアノードで１７が白
金でなるため、アスコルビン酸１００ｍｇ／ｄｌ溶液に
対する応答は、約０．２μＡとなり、従来のカーボンペ
ースト電極の応答の約２．２より１０分の１以下とな
り、アスコルビン酸に起因する電流の影響を著しく低減
することができた。

【００２５】以上、実施形態２について説明したが、本
実施形態においては、酵素を固定化したアノード電極１
７と、固定化しない補正用アノード電極１８との電流応
答の差を取ることにより、還元性物質の電解酸化電流を
除去できるため、高濃度の妨害物質を含んだ試料液、例
えば唾液中のグルコース濃度の正確な測定が可能とな
る。また、酵素を固定化したアノード電極１７と固定化
しない補正用アノード電極１８との電流応答の差を取る
ことにより、基質濃度０のときに生じるバイアス電流を
自動的に除去できるため、基質濃度０での応答を別に測
定して、バイアス電流をキャンセルする必要がないとい
う利点がある。

【００２６】なお、上記実施形態では、アノード電極１
７の電流応答のそれぞれを検出し、その差を算出した
が、それぞれの電流検出回路の後段に引き算回路を設
け、直接差電流を検出するようにしても勿論よい。ま
た、酵素の種類を変えることで、グルコース以外の基質
のセンサとすることも可能である。さらに、酵素固定化
層１１Ａは、酵素としてグルコースオキシダーゼのみを
固定したが、これに加えてメディエータを共存させる構
成としも勿論よい。この場合、酵素およびメディエータ
の酸化還元反応に伴う還元型メディエータの酸化電流を
検出するバイオセンサを構築することができる。このバ
イオセンサでは、図４に示すように、グルコースを酸化
させて還元型に変化した酵素ＧＯＤ_red２７が元の酸化
型酵素ＧＯＤ_ox２８に戻る際、メディエータが酵素から
電子を奪い還元型メディエータＭ_red２９となる。そし
て、この還元型メディエータが電極反応によって酸化さ
れ、元の酸化型メディエータＭ_ox３０となる。すなわ
ち、酵素とメディエータとが固定化されたアノード電極
近傍に基質が存在すれば、酵素とメディエータとを仲介
して電子がアノード電極へ移動し、グルコース濃度に応
じた電流が流れる。従って、この電流を検出すればグル
コース濃度を測定することができる。このようなバイオ
センサの場合は、酵素とメディエータとをアノード電極
近傍に共存させて固定化されているため、試料液中に溶
存酸素が全くないか、あるいはその量が少ないときで
も、グルコース濃度に応じた電流が流れるため、溶存酸
素濃度に依存しないバイオセンサとすることができる。
また、メディエータを介して電極と電子の授受を行うの
で、メディエータが無い場合に比べて印加電圧を低く抑
えることができる。

【００２７】また、上下連続多孔性膜１１、１２および
上下絶縁膜１９、１６を柔軟性および可撓性を有する材
料で形成することにより、例えば瞼の下に挿入したり、
歯に被せるなど、狭小な場所や凹凸のある場所での使用
を可能にすることができる。さらに、連続多孔性膜の連
続孔の径寸法を適宜設定することにより、例えばヘモグ
ロビンや蛋白質のなどの高分子がアノード電極に到達す
ることを防止することができる。このようにすれば、酵
素固定化層内で発生した過酸化水素を効率よく検出する
ことができる。

【００２８】以上、実施形態１および実施形態２につい
て説明したが、この発明はこれらに限定されるものでは
なく、構成の要旨に付随する各種の設計変更が可能であ
る。例えば、上記実施形態１においてアノード電極、補
正用アノード電極およびカソード電極を白金で形成した
が、アノード電極のみを白金で形成する構成としても勿
論よい。また、上記実施形態１において、アノード電極
全体を白金で形成したが、少なくとも酵素固定化層に接
する電極表面だけに白金薄膜を形成する構成としてもよ
い。なお、上記実施形態１において、酵素固定化層は酵
素としてグルコースオキシターゼのみを固定したが、こ
れに加えてメディエータを共存させてもよい。

【００２９】

【発明の効果】以上の説明から明らかなように、この発
明によれば、高濃度の妨害物質を含んだ試料液中の基質
濃度の測定が可能となる。また、この発明によれば、試
料液が微量での基質濃度の測定を可能にするという効果
を奏する。

【図面の簡単な説明】

【図１】（Ａ）はこの発明の実施形態１の平面説明図、
（Ｂ）は（Ａ）のＡ−Ａ断面図。

【図２】実施形態１の測定結果を示すグラフ。

【図３】（Ａ）はこの発明の実施形態２の平面説明図、
（Ｂ）は（Ａ）のＢ−Ｂ断面図。

【図４】メディエータを用いた酵素反応を示す説明図。

【図５】（Ａ）は従来例の平面説明図、（Ｂ）は従来例
の断面図。

【符号の説明】

１１上連続多孔性膜１２下連続多孔性膜１３スペーサ１４中空部１５カソード電極１７アノード電極１８補正用アノード電極

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】スペーサにより互いに離間された一対の
絶縁膜にそれぞれカソード電極及び白金からなるアノー
ド電極が対向して形成され、前記アノード電極に測定す
る試料と化学反応を生じる酵素または酵素及びメディエ
ータを含む酵素層が形成され、前記酵素層の少なくとも
一側面には、前記スペーサにより外部と連通されている
試料導入空間が形成されていることを特徴とするバイオ
センサ。
【請求項２】前記カソード電極に対向して、前記酵素
層と重ならない補正用アノード電極を備えることを特徴
とする請求項１記載のバイオセンサ。
【請求項３】前記酵素層は、柔軟性を有する多孔性膜
であり、前記酵素または酵素及びメディエータは前記多
孔性膜内に形成されていることを特徴とする請求項１ま
たは請求項２記載のバイオセンサ。
【請求項４】一部が外部に露出している前記多孔性膜
上にカソード電極が形成されていることを特徴とする請
求項１〜請求項３のいずれかに記載のバイオセンサ。
【請求項５】前記試料はグルコースを含み、前記酵素
層はグルコースオキシターゼを含むことを特徴とする請
求項１〜請求項４のいずれかに記載のバイオセンサ。