TWI580958B

TWI580958B - 分析物濃度的檢測方法

Info

Publication number: TWI580958B
Application number: TW104128306A
Authority: TW
Inventors: 陳筑瑄; 顏鈺芳; 袁亦雲; 沈蕙如; 林芬菲; 董易庭; 謝文彬
Original assignee: 財團法人工業技術研究院
Priority date: 2015-04-28
Filing date: 2015-08-28
Publication date: 2017-05-01
Also published as: EP3088880A1; US20160320327A1; US9903832B2; TW201638581A; EP3088880B1

Description

分析物濃度的檢測方法

本發明係有關於一種分析物濃度的檢測方法，特別係有關於一種具有校正血球容積比(hematocrit；Hct)偏差的分析物濃度檢測方法。

血球容積比(hematocrit；Hct)是指在一定量的血液中所含有的紅血球數量比例。更確切的說，血球容積比主要指抗凝全血經離心後測得沉澱的血細胞(主要是紅血球)在全血中佔有的比例。離心後的紅血球越多，血球容積比越高，表示血漿所佔比例越少；離心後的紅血球越少，血球容積比越低，表示血漿所佔比例越高。一般男性的血球容積比範圍大約為40%~50%，而女性的血球容積比範圍大約為35%~45%，此數值範圍會因性別、年齡、生理、與飲食狀況而受影響，若是病患則會有更廣泛的血球容積比分佈，低於20%以及高於60%也是常見的情況。

傳統上在臨床實驗室檢測機台中所進行的血液樣本檢測，都是使用血漿做為檢測的樣品，也就是在檢測之前血液都先經過離心處理，得到的血漿再用以進行檢測。如此一來，血球容積比的差異對檢測結果就不至於造成干擾。但是，相對於大型的臨床實驗機台，醫護點檢測(POCT)或是病患可自行操作(OTC)的檢測機台通常需要取得病患的全血檢體作為測試樣品。若須進行血漿血球分離以取得血漿進行測試，勢必要取得更多體積的全血檢體以進行分離純化血漿，導致病患自行操作的困難度和機台成本的增加，也增加了檢驗所需的時間。所以一般醫護點檢測(POCT)或是病患可自行操作(OTC)的檢測機台多是使用病患的全血檢體進行直接的量測。但是，如此也使得具有個體差異性的血容積比造成檢測干擾。

以血糖試片為例，不同的血球容積比會造成不同的影響，舉例而言，當血球容積比過低，易造成量測之血糖值過高，而當血球容積比過高，則會造成量測之血糖值過低。所以如何提供一校正之系統與方法，使得樣品中因血球容積比所導致之檢測偏差，得以被正確的校正，對檢測系統而言是非常重要的。

隨著血糖儀產品日漸普及，2014年1月美國食品藥物管理局(FDA)公佈指引草案(draft guidance)，內容首次提列血球容積比(hematocrit；Hct)為干擾物質，使得血球容積比被正式列入血糖機上市送審報告中須研究之干擾物對象，指引草案中也指出往後廠商上市送審之產品允收測試，必須包含以血球容積比10%~65%範圍的臨床樣本進行。

因此，目前亟需一種改良的分析物濃度檢測方法，除了能夠針對因血球容積比所導致的偏差正確地進行校正之外，還能夠符合對於往後欲上市之血糖儀中樣品所需測試之血球容積比範圍的要求。

根據一實施例，本發明提供一種分析物濃度的檢測方法，包括：提供一檢測試片，包括：一第一組電極，包括一第一反應區；一第二組電極，包括一第二反應區；以及一反應試劑層，設置於第二反應區上；提供一血液，使血液與第一組電極和第二組電極接觸；透過伏安法對第一組電極施加一第一電壓，以取得一第一回饋值；依據第一回饋值計算出一血球容積比；對第二組電極施加一第二電壓，以取得一第二回饋值；以及利用血球容積比和第二回饋值計算出一分析物濃度的一實際值。

根據另一實施例，本發明提供一種分析物濃度的檢測方法，包括：提供一檢測試片，包括：一第一組電極，包括一第一反應區；一第二組電極，包括一第二反應區；以及一反應試劑層，設置於第二反應區上；提供一血液，使血液與第一組電極和第二組電極接觸；利用該第一組電極取得一血球容積比；利用血球容積比對與一分析物濃度相關的一線性關係式進行校正，以取得一經校正的線性關係式；對第二組電極施加一電壓，以取得一回饋值；依據回饋值和經校正的線性關係式計算出分析物濃度的一實際值。

為讓本發明之上述和其他目的、特徵與優點能更明顯易懂，下文特舉出較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：

100‧‧‧檢測試片

102‧‧‧第一組電極

103‧‧‧第一反應區

104‧‧‧第二組電極

105‧‧‧第二反應區

106‧‧‧反應試劑層

108‧‧‧樣品注入處

102’、104’‧‧‧工作電極

102”、104”‧‧‧參考電極

200、400‧‧‧方法

202-212、402-412‧‧‧步驟

第1圖為根據本發明一實施例顯示一檢測試片之示意圖；第2圖為根據本發明第一樣態之實施例顯示分析物濃度的檢測方法流程圖；第3圖根據本發明一實施例顯示透過方波伏安法(SWV)所施加之電壓型態；第4圖為根據本發明第二樣態之實施例顯示分析物濃度的檢測方法流程圖；第5圖顯示將具有相同血球容積比但不同血糖濃度的樣品之電流值平均作圖的結果；第6圖為根據本發明一些實施例顯示樣品之回饋電流值與血球容積比之間的關係；第7圖為根據本發明一些實施例顯示樣品所測得與血糖濃度相關之電流值與不同血球容積比之間的關係；第8A圖顯示根據本發明一些實施例推算出之Ka值的趨勢代表公式；第8B圖顯示根據本發明一些實施例推算出之Kb值的分布範圍；第9A、9B圖為根據本發明一些實施例分別顯示校正前後之血糖濃度量測值比較。

本發明提供一種分析物濃度的檢測方法，此方法可使得檢測樣品中因血球容積比(hematocrit；Hct)所導致的檢測偏差得以被正確的校正。

第1圖為根據本發明一實施例顯示一檢測試片100 的示意圖。根據一實施例，本發明提供一檢測試片100，包括第一組電極102、第二組電極104、以及反應試劑層106。第一組電極102可具有第一反應區103，而第二組電極104可具有第二反應區105，其中第一反應區103與第二反應區105設置於一相同通道內。然而，如本技術領域中具有通常知識者可了解的，上述配置可包括其他的變化，例如第一反應區與第二反應區可分別設置於不同通道內。

於一實施例中，第一組電極102可由一工作電極102’和一參考電極102”組成，而第二組電極104可由一工作電極104’和一參考電極104”組成。如第1圖所示，於此實施例中，第一組電極102可配置於距離注入樣品處108之相對近端，而第二組電極104可配置於距離注入樣品處108之相對遠端，然而，如本技術領域中具有通常知識者可了解的，上述配置可包括其他的變化，例如近遠端顛倒設置、左右設置或不同平面設置等，只要第一組電極或第二組電極能接觸到血液進行檢測，皆可運用於本揭露中。於另一實施例中，第一組電極102的參考電極102”和第二組電極104的參考電極104”可為電性連接。或者，又於另一實施例中，第一組電極102和第二組電極104可共用一參考電極。

應注意的是，根據本發明一實施例，參考電極104”係配置於距離檢測試片注入樣品處之相對遠端，當兩組電極102、104分別包括工作電極102’、104’和參考電極102”、104”，如第1圖所示，或當參考電極102”和參考電極104”為電性連接時，參考電極104”更可另外用來偵測樣品的進入，藉此，可於樣品足夠時再啟動檢測的功能，可達到更為準確測量的目的。根據本發明另一實施例，當第一組電極102和第二組電極104係共用一參考電極時，此共用之參考電極同樣可用來偵測樣品的進入，當偵測到樣品足夠時再啟動檢測的功能。

於一實施例中，第一組電極102的工作電極102’和參考電極102”的間距範圍可介於0.01mm~5mm，例如：0.01mm~1mm或0.05mm~5mm，而第一組電極102的工作電極102’和參考電極102”的面積比可介於1~1.5，例如：1~1.2。藉由上述的參數設定，當以方波伏安法對第一組電極102施加一電壓時，可以得到一穩定的回饋訊號。

於一實施例中，反應試劑層106可設置於第二組電極104的第二反應區105上。然而，應注意的是，雖然第1圖僅顯示反應試劑層106設置於第二組電極104的第二反應區105上的實施例樣態，但根據所提供的檢測試片的電極材料、圖案、配置等的不同，於其他實施例中，反應試劑層106也可視情況進一步延伸設置於第一組電極102的第一反應區103上。其中，反應試劑層106可包括例如一反應酵素和一電子媒介物。於一實施例中，反應試劑層106僅具有一種反應酵素。

應理解的是，上述檢測試片的配置方式及示意圖僅為本發明眾多實施例之一，本發明並不限於此，本技術領域具有通常知識者可依據本發明之教示並參酌現有技術加以修改或潤飾。

根據第一樣態之實施例，本發明提供一種分析物濃度的檢測方法200，如第2圖所示。第2圖為根據本發明一實施例顯示一分析物濃度的檢測方法200的流程圖。方法200首先進行至步驟202，提供一檢測試片。此述之檢測試片大致上與第1圖所示檢測試片100相同，包括：第一組電極102，具有第一反應區；第二組電極104，具有一第二反應區；以及反應試劑層106，設置於第二反應區104上。類似地，此述之檢測試片的結構也可包括不同的樣態，如上述對第1圖之檢測試片100之描述相同，為達簡潔之目的，故不在此贅述。

接著，方法200進行至步驟204，提供一血液，使血液與檢測試片的第一組電極和第二組電極接觸。配合第1圖之檢測試片100的示意圖所示，第一組電極102可配置於距離注入樣品處108之相對近端，而第二組電極104可配置於距離注入樣品處108之相對遠端，當樣品由樣品注入處進入檢測試片後，先經過第一反應區103並接觸第一組電極102，再經過第二反應區105並接觸第二組電極104。第二組電極104之可視情況另外用來偵測樣品的進入，藉此，可於樣品足夠時再啟動檢測的功能，可達到更為準確測量的目的。

方法200進行至步驟206，透過伏安法對第一組電極施加一第一電壓，以取得一第一回饋值。於一實施例中，採用之伏安法為方波伏安法(square wave voltammetry；SWV)，透過方波伏安法(square wave voltammetry；SWV)對第一組電極所施加的第一電壓為一連串的方波型的電壓，如第3圖所示。此方波型的電壓為一正電壓，其初始電壓值(E_init)隨時間的進行以一增幅電壓(E_incr)逐漸往最終目標電壓(E_final)遞增。更確切的說，此方波型的電壓以初始電壓值(E_init)為中心，經由固定頻率施加一固定電壓振幅之正負電壓震盪，接著增加一固定增幅電壓(E_incr)，以新的電壓值(E_init+E_incr)為中心作固定電壓振幅之振盪，直到電壓值中心到達最終目標電壓(E_final)。在給予適當的振幅(A)、頻率(F)及增幅電壓(E_incr)等參數調控的情況下，可以穩定量測到各種不同血球容積比的血液樣品所產生的回饋值。於一實施例中，第一電壓可具有固定的振幅、頻率及增幅電壓。舉例而言，第一電壓之頻率可大於等於100Hz，例如可介於100Hz~4000Hz，且第一電壓之振幅可大於等於0.01V，例如可介於0.01V~0.4V。於一實施例中，第一電壓之增幅電壓可介於0.01V~0.4V，例如可介於0.05V~0.2V。其中第一電壓之一電壓掃描範圍可介於0V~0.8V，例如可介於0V~0.5V，且第一電壓之施加時間可介於0.01秒~4秒，例如可介於0.01秒~2秒。

然而，值得一提的是，施加於第一組電極之第一電壓可隨著電極材料、圖案、配置等條件的改變而做出適應性的調整。舉例而言，根據本發明一實施例，當電極的材料為碳墨，例如：SPCE網版印刷電極時，第一電壓之頻率可例如介於100Hz~500Hz，且第一電壓之振幅可例如介於0.01V~0.4V。並且，在此情況下，第一電壓之一電壓掃描範圍可例如介於0V~0.5V，且第一電壓之施加時間可例如介於0.01秒~2秒。又例如，根據本發明另一實施例，當電極的材料為金(Au)時，第一電壓之頻率可例如介於500Hz~4000Hz，且第一電壓之振幅可例如介於0.1V~0.4V。並且，在此情況下，第一電壓之一電壓掃描範圍可例如介於0V~0.5V，且第一電壓之施加時間可例如介於0.01秒~2秒。

應注意的是，特別透過方波伏安法(SWV)對第一組電極施加第一電壓，是因為此方法所得到的回饋值穩定，且只與血球容積比(Hct)相關，而與血糖濃度無關。於一實施例中，回饋值可例如為一電流值，然而，如本技術領域中具有通常知識者可了解的，偵測回饋值之方式可包括其他的變化，例如當使用不同電路機制設計時，可將電流轉換為電壓、電容或其他電性形式進行偵測，本案並不限於此。

方法200進行至步驟208，依據第一回饋值計算出一血球容積比，可以該第一回饋值與該血球容積比之關係式或查表換算方式取得對應之該血球容積比。

方法200進行至步驟210，對第二組電極施加一第二電壓，以取得一第二回饋值。於步驟210中，可利用任何合適的方法對第二組電極施加第二電壓，例如：安培法(amperometry)、庫侖法(coulometry)、電位法(potentiometry)、伏安法(voltammetry)、電阻抗法(impedance)、或前述方法之組合，但本發明並不以此為限。

應注意的是，本發明實施例中對第一組電極和第二組電極施加第一電壓和第二電壓的順序並沒有特別的限制。於本發明第一樣態中，只要可獲得第一回饋值和第二回饋值，且施加第一電壓的方法是透過伏安法，皆可應用於本發明中以取得最終經過校正之血糖濃度的實際值。舉例而言，於一實施例中，可先對第一組電極施加第一電壓後，再對第二組電極施加第二電壓。於另一實施例中，可先對第二組電極施加第二電壓後，再對第一組電極施加第一電壓。或者，又於另一實施例中，可同時對第一組電極和第二組電極分別施加第一電壓和第二電壓。

方法200進行至步驟212，利用血球容積比和第二回饋值計算出一分析物濃度的一實際值。其中，分析物濃度可例如為一血糖濃度。於一實施例中，利用血球容積比和第二回饋值計算出一分析物濃度的一實際值之方法可以透過補償法或查表法，但不限於此。於另一實施例中，補償法係先依據第二回饋值計算出一分析物濃度的一測量值，可透過此第二回饋值與分析物濃度之關係式或查表換算方式取得對應之測量值，再依據血球容積比與標準血球容積比之差異進行一定比例的補償，以取得分析物濃度的實際值。於再一實施例中，查表法係先依據血球容積比取得對應與分析物濃度相關的線性關係式，再將第二回饋值帶入對應的線性關係式計算取得分析物濃度的實際值。

根據本發明第二樣態之實施例，本發明提供一種分析物濃度的檢測方法400。第4圖為根據本發明一實施例顯示一分析物濃度的檢測方法400的流程圖。方法400首先進行至步驟402，提供一檢測試片。此述之檢測試片大致上與第1圖所示檢測試片100相同，包括：第一組電極102，具有第一反應區；第二組電極104，具有一第二反應區；以及反應試劑層106，設置於第二反應區104上。類似地，此述之檢測試片的結構也可包括不同的樣態，如上述對第1圖之檢測試片100之描述相同，為達簡潔之目的，故不在此贅述。

接著，方法400進行至步驟404，提供一血液，使血液與第一組電極和第二組電極接觸。配合第1圖之檢測試片100的示意圖所示，第一組電極102可配置於距離注入樣品處108之相對近端，而第二組電極104可配置於距離注入樣品處108之相對遠端，當樣品由樣品注入處進入檢測試片後，先經過第一反應區103並接觸第一組電極102，再經過第二反應區105並接觸第二組電極104。第二組電極104之可視情況另外用來偵測樣品的進入，藉此，可於樣品足夠時再啟動檢測的功能，可達到更為準確測量的目的。

方法400進行至步驟406，利用第一組電極102取得一血球容積比。於此步驟中，血球容積比的量測不限於伏安法，可例如包括：安培法(amperometry)、庫侖法(coulometry)、電位法(potentiometry)、伏安法(voltammetry)、電阻抗法(impedance)、或前述方法之組合，但本發明並不以此為限。

方法400進行至步驟408，利用血球容積比對與一分析物濃度相關的一線性關係式進行校正，以取得一經校正的線性關係式。其中，此述與分析物濃度相關的線性關係式為y=ax+b，其係當血液的血球容積比為0%時，透過步驟406的方法所得之回饋值(例如回饋電流值)與分析物濃度之一轉換公式，其中y為回饋值(例如回饋電流值)，a為一斜率參數，x為分析物濃度，b為一截距參數，由於測定血球容積比易受到檢測方法或儀器不同而產生誤差，若以0%血球容積比的血液(即為血漿)做基準而得到與分析物濃度相關的線性關係式時，可以消除檢測誤差之影響。於另一實施例中，也可透過正常標準Hct 值(例如，血球容積比為40~45%)之血液作為基準而得到與分析物濃度相關的線性關係式。值得注意的是，本發明只需要提供一組預設之線性關係式，例如上述以0%或40~45%血球容積比的血液做基準而得到與分析物濃度相關的線性關係式，再利用取得的血球容積比對該線性關係式進行校正，則可直接獲得對應該取得之血球容積比的經校正的線性關係式。

於一實施例中，利用血球容積比對與分析物濃度相關的線性關係式進行校正的方法包括：依據一對照表或一關係式取得對應血球容積比的一斜率係數和一截距係數，以及利用斜率係數和截距係數對與分析物濃度相關的線性關係式進行校正，以取得經校正的線性關係式。於另一實施例中，對照表包括複數個血球容積比所對應之斜率係數和截距係數，這些血球容積比的範圍介於10%~70%，例如，血球容積比可包括：20%、30%、35%、43%、55%、60%、65%、或70%，應注意的是，可利用內插法推算出不同的血球容積比之斜率係數和截距係數，並不限於上述的特定值。於再一實施例中，關係式可包括常數、多項式或線性關係式，將血球容積比代入此關係式後，即可獲得一相應的斜率係數或截距係數。

方法400進行至步驟410，對第二組電極施加一電壓，以取得一回饋值。於步驟412中，可利用任何合適的方法對第二組電極施加一電壓，例如：安培法(amperometry)、庫侖法(coulometry)、電位法(potentiometry)、伏安法(voltammetry)、電阻抗法(impedance)、或前述方法之組合，但本發明並不以此為限。

方法400進行至步驟412，依據第二回饋值和經校正的線性關係式計算出分析物濃度的一實際值。其中，分析物濃度可例如為一血糖濃度。其中，此述經校正的線性關係式為：y=a’x+b’，其中y為第二回饋值，a’為一經斜率係數校正的斜率參數，x為分析物濃度的實際值，b’為一經截距係數校正的截距參數。

此外，本發明更可包括一第三樣態，其分析物濃度的檢測方法流程與本發明之第二樣態之大致相同，惟將步驟406中取代為：透過伏安法對第一組電極施加一第一電壓，以取得一第一回饋值，並依據此第一回饋值計算出一血球容積比。為達簡潔之目的，以下將僅針對第三樣態與第二樣態不同的部份進行描述，其他相同的步驟可參照本發明第二樣態的步驟402~404及步驟408~412，此處便不再贅述。

詳細而言，於本發明一第三樣態中，係將第二樣態之步驟406取代為透過伏安法對第一組電極施加一第一電壓，以取得一第一回饋值。於一實施例中，採用之伏安法為方波伏安法(square wave voltammetry；SWV)，透過方波伏安法(square wave voltammetry；SWV)對第一組電極所施加的第一電壓為一連串的方波型的電壓，如第3圖所示。此方波型的電壓為一正電壓，其初始電壓值(E_init)隨時間的進行以一增幅電壓(E_incr)逐漸往最終目標電壓(E_final)遞增。更確切的說，此方波型的電壓以初始電壓值(E_init)為中心，經由固定頻率施加一固定電壓振幅之正負電壓震盪，接著增加一固定增幅電壓(E_incr)，以新的電壓值(E_init+E_incr)為中心作固定電壓振幅之振盪，直到電壓值中心到達最終目標電壓(E_final)。在給予適當的振幅(A)、頻率(F)及增幅電壓(E_incr)等參數調控的情況下，可以穩定量測到各種不同血球容積比的血液樣品所產生的回饋值。於一實施例中，第一電壓可具有固定的振幅、頻率及增幅電壓。舉例而言，第一電壓之頻率可大於等於100Hz，例如可介於100Hz~4000Hz，且第一電壓之振幅可大於等於0.01V，例如可介於0.01V~0.4V。於一實施例中，第一電壓之增幅電壓可介於0.01V~0.4V，例如可介於0.05V~0.2V。其中第一電壓之一電壓掃描範圍可介於0V~0.8V，例如可介於0V~0.5V，且第一電壓之施加時間可介於0.01秒~4秒，例如可介於0.01秒~2秒。

接著，依據第一回饋值計算出一血球容積比。本發明人經實驗發現，第一回饋值(電流)與血球容積比之間的關係呈現一反比關係，且可表示為一關係式，其中該關係式可包括多項式或線性關係式，隨後，將偵測到的第一回饋值代入此關係式後，即可獲得一相應的血球容積比。於一實施例中，第一回饋值與血球容積比之間的關係可表示於一對照表，該對照表中血球容積比的範圍可介於10%~70%，例如，血球容積比可包括：20%、30%、35%、43%、55%、60%、65%、或70%。應注意的是，根據第一回饋值與血球容積比之間的反比關係，可利用內插法推算出不同的血球容積比，並不限於上述的特定值。

簡而言之，本發明第一樣態所提供的分析物濃度的檢測方法，利用伏安法測得不受到分析物濃度影響的血球容積比，再根據血球容積比獲得分析物濃度的實際。此外，本發明第二樣態所提供的分析物濃度的檢測方法，血球容積比的量測不限於伏安法，利用測得的血球容積比取得斜率係數及截距係數，以校正預設的線性關係式，再將與分析物濃度相關的回饋值代入經校正的線性關係式，即可直接獲得分析物濃度的實際值。於本發明第二樣態之一實施例中，利用第一組電極取得一血球容積比方法包括：安培法(amperometry)、庫侖法(coulometry)、電位法(potentiometry)、伏安法(voltammetry)、電阻抗法(impedance)或前述方法之組合。於第二樣態之另一實施例中，取得一血球容積比方法包括利用電極對間之流經時間換算或AC電阻抗法。

另外，於本發明第二樣態所提供的分析物濃度的檢測方法中，若同樣使用伏安法測得不受到分析物濃度影響的血球容積比時，則形成本發明之第三樣態。也就是說，本發明第三樣態所提供的分析物濃度的檢測方法，利用伏安法測得不受到分析物濃度影響的血球容積比後，進一步利用血球容積比獲得一經校正的線性關係式，將與分析物濃度相關的回饋值代入經校正的線性關係式，即可直接獲得分析物濃度的實際值。

一般用來校正分析物濃度因受到血球容積比(hematocrit；Hct)影響而產生偏差的方法包括直接量測血球容積比並校正補償其量測值，然而，這些方法都無法獲得只與血球容積比相關，而不與其他因素如血糖濃度、三酸甘油酯濃度等相關的量測值。此外，目前市面上的血糖儀通常只有在一般正常血液所具有的血球容積比範圍內(如30%~55%)所測得的量測值才能直接準確的反應真實的血糖濃度，有一些血糖儀甚至只在特定的血球容積比(如42%)下才能準確的測量。當需要檢驗的樣品之血球容積比不在血糖儀所能準確偵測的範圍內時，還需要事先將樣品的血球容積比進行調整，否則會造成檢測誤差。

本發明提供一種分析物濃度的檢測方法，其可正確地校正分析物濃度因受到血球容積比(hematocrit；Hct)所導致的偏差值。此外，本發明所提供之分析物濃度檢測方法，依據本發明人深入研究所得的校正關係或演算方法，使得不同的血球容積比之間具有關聯，更進一步在血球容積比(Hct)範圍10%~70%之間都能正確地量測出血糖濃度，符合美國食品藥物管理局(FDA)對血糖儀上市所訂定的審查標準。

此外，本發明所使用的方波伏安法(SWV)在機台上的建構較為平易，成本較低。再加上方波伏安法(SWV)對於血糖濃度的敏感度遠低於一般市面上所使用測量血球容積比(Hct)的方法，故可較正確地推算出實際的血糖濃度。

以下提供實施例說明本發明所提供之分析物濃度之檢測方法：

實施例1： 提供檢測試片及血液樣品

首先，提供一檢測試片，包括以網版印刷碳墨為材料的兩組電極，兩組電極分別具有工作電極和參考電極。接著，以葡萄糖氧化酵素、鐵氰化鉀(potassium ferricyanide)、PBS緩衝液、牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin)當作反應試劑層覆蓋在第二組電極上，而第一組電極上沒有覆蓋反應試劑層。以第二組電極的參考電極用來偵測樣品的進入以及判斷樣品是否足夠。取5種血糖濃度不同的樣品(57mg/dl、75.6mg/dl、140mg/dl、203mg/dl、327mg/dl)，各自再配成9種不同的血球容積比(0%、20%、30%、35%、43%、55%、60%、65%、70%)作為血液樣品，分別由樣品注入處注入。樣品先經過第一組電極，再到達第二組電極，當第二組電極的參考電極偵測到樣品的進入時，啟動量測的功能。

實施例2： 透過方波伏安法(SWV)施加電壓所量測之樣品回饋電流值

啟動量測功能後，透過方波伏安法(SWV)施加一連串方波型電壓至第一組電極，調控其振幅為0.01V、頻率為100Hz、增幅電壓為0.01V，且電壓掃描範圍介於0V~0.5V。接著，量測各個樣品所產生之回饋電流，結果如第5圖所示。其中，以0.24V的電壓去計算不同血糖濃度之回饋電流的偏差值，得到0% Hct之CV值為2.68%、20% Hct之CV值為2.24%、30% Hct之CV值為2.03%、35% Hct之CV值為4.23%、43% Hct之CV值為2.17%、55% Hct之CV值為4.5%、60% Hct之CV值為4.01%、65% Hct之CV值為3.61%、以及70% Hct之CV值為2.68%。由第5圖可以觀察到，血球容積比較低的樣品所產生的電流較高，血球容積比較高的樣品產生的電流較低。同時可發現，雖然各個樣品的血糖濃度不相同，但是透過方波伏安法施加電壓所量測到的回饋電流受血糖濃度的影響較低(CV值小於 5%)，甚至幾乎不受血糖濃度的影響。

實施例3： 回饋電流值與血球容積比之關係

使用不同人體所得之靜脈血並調製不同血球容積比之樣品重覆進行實驗，記錄各個樣品的血球容積比和所產生之回饋電流值。根據實驗結果推算回饋電流值與血球容積比之關係，如第6圖所示，可發現回饋電流值與血球容積比的確是呈現一反比之關係。所以當樣品注入檢測試片並啟動量測功能時，可以透過方波伏安法(SWV)施加電壓得到一回饋電流以估算其相應之血球容積比的數值。

實施例4： 不同血球容積比與血糖濃度相關電流值之關係

不同全血樣品引入樣品流道後，對第二組電極施加0.3V之電壓，並偵測試片上之回饋電流，若使用不同血糖濃度之全血樣品可得出一血糖值與回饋電流之線性關係。此時若使用不同血球容積比的全血樣品進行檢測，可得出不同血球容積比全血樣品之血糖與回饋電流之線性關係，如第7圖所示，當樣品中血球容積比過高，易造成檢測試片中試劑溶解較慢，且試劑反應受氧濃度偏高影響，使得反應酵素產生的與血糖相關的回饋電流值偏低，相反地，當樣品中血球容積比過低，則會造成反應酵素產生的與血糖相關的回饋電流值偏高。觀察不同血球容積比的樣品之血糖與回饋電流線性關係，可進一步發現各個不同血球容積比的血糖與回饋電流線性關係之間具有一固定關係存在。

實施例5： 推導Hct X%公式

若將不同的Hct X%的直線y=a1x+b1與Hct 0%的直線y=ax+b相比，可發現a/a1的Ka值在不同的血液樣品之下都為一接近的數值。若以Hct 0%的斜率做為基準對其他Hct X%的斜率進行計算，則可獲得如表1所示之Ka值的數據。

將各個具有不同血球容積比的樣品之斜率項比值(表示為Ka)對於血球容積比數值進行比較後，Ka值可以歸納出一個趨勢，如第8A圖所示。而將各個具有不同血球容積比的樣品之常數項差值b-b₁(表示為Kb)對於血球容積比數值進行比較後，Kb值也可歸納出一個分布範圍，如第8B圖所示。由上述a/a₁=Ka以及b-b₁=Kb之關係可知，Hct X%的直線y=a₁x+b₁亦可表示為直線y=(a/Ka)x+(b-Kb)。

接著，導入大量的數據推算出Ka值的趨勢代表公式，如第8A圖所示，當Hct值>20時，Ka值的趨勢代表公式為y=0.0006x²-0.0124x+1.2396，而當Hct值<20時，Ka值的趨勢代表公式為y=0.0116x+1。另外，由第8B圖可看到，由於Kb值為亂數，且彼此之間的差值不大，因此，在後續的關係式中，取其平均值714來代表常數項之Kb值。

利用實施例3的方法估算出血球容積比的數值後，將此數值代入上述Ka值的趨勢代表公式y=0.0006x²-0.0124x+1.2396或y=0.0116x+1中，即可推算出Ka值。如表2所示，可以觀察到相同的血球容積比具有固定範圍的Ka值，並不會受到不同血糖濃度的影響。接下來，將所得到的Ka值和Kb值代入Hct X%的直線y=(a/Ka)x+(b-Kb)中就能推導出符合相應斜率及截距關係之Hct X%公式。在Hct為0%的情況下，所推導出Hct 0%的公式為y=160.43x+5789，其中x代表所測得之血糖相關電流值，y代表對應之血糖濃度。因此，根據估算出的血球容積比推導出符合各個血球容積比之相應斜率及截距關係之Hct X%公式後，只要提供所測得之血糖相關電流值，就能正確估算出對應之血糖濃度。由於本發明之Ka值和Kb值只與血球容積比相關，不會隨著不同之血糖濃度或不同的樣品而有所差異，因此，本發明只需提供一組預設之線性關係式，再利用不同血球容積比所推得之Ka值和Kb值對預設之線性關係式進行校正，就可以直接獲得對應於不同血球容積比之經校正的線性關係式。

實施例6： 校正前後之血糖量測值比較

對實施例1所述5種血糖濃度不同的樣品(57mg/dl、75.6mg/dl、140mg/dl、203mg/dl、327mg/dl)，各自再配成8種不同的血球容積比(0%、20%、30%、35%、43%、55%、60%、65%)進行量測，原始未經校正過之血糖量測值，如第9A圖所示。由第9A圖可看到，因各種血球容積比的干擾，在同一血糖濃度下呈現各種量測數值的偏差。相較之下，經過實施例1~5的方法，其經校正後之血糖量測值，已消除原有的血球容積比干擾，同一血糖值的樣品數據變得較為集中，如第9B圖所示。

上述結果證實，本發明成功利用方波伏安法(SWV)檢測並估算血球容積比，並利用此血球容積比自Hct 0%的公式去推導出符合相應斜率及截距關係之Hct X%公式，在血球容積比範圍20%~65%下，直接透過測得與分析物濃度相關的電流值即可準確地估算出分析物濃度的實際值。量測所得的血糖值與標準值的偏差，由原本未經校正時的偏差值(Bias)介於0%~80%，在校正後被縮減至偏差值(Bias)±15%。

雖然本發明已以數個較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作任意之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

200‧‧‧方法

202-212‧‧‧步驟

Claims

一種分析物濃度的檢測方法，包括：提供一檢測試片，包括：一第一組電極，包括一第一反應區；一第二組電極，包括一第二反應區；以及一反應試劑層，設置於該第二反應區上；其中該第一組電極和該第二組電極分別包括一工作電極和一參考電極；提供一血液，使該血液與該第一組電極和該第二組電極接觸；透過伏安法對該第一組電極施加一第一電壓，以取得一第一回饋值；依據該第一回饋值計算出一血球容積比；對該第二組電極施加一第二電壓，以取得一第二回饋值；以及利用該血球容積比和該第二回饋值計算出一分析物濃度的一實際值。
如申請專利範圍第1項所述之分析物濃度的檢測方法，其中該反應試劑層包括一反應酵素和一電子媒介物。
如申請專利範圍第1項所述之分析物濃度的檢測方法，其中該伏安法為方波伏安法(square wave voltammetry；SWV)。
如申請專利範圍第3項所述之分析物濃度的檢測方法，其中該第一組電極包括一工作電極和一參考電極，該第一組電極的該工作電極和該參考電極的間距範圍介於0.01~5mm及/或該第一組電極的該工作電極和該參考電極的面積比介於1~1.5。
如申請專利範圍第3項所述之分析物濃度的檢測方法，其中該第一電壓之頻率大於等於100Hz、該第一電壓之振幅大於等於0.01V、及/或該第一電壓之增幅電壓介於0.01~0.4V。
如申請專利範圍第3項所述之分析物濃度的檢測方法，其中該第一電壓之一電壓掃描範圍介於0~0.8V及/或該第一電壓之施加時間介於0.01~4秒。
如申請專利範圍第1項所述之分析物濃度的檢測方法，更包括：利用該血球容積比對與一分析物濃度相關的一線性關係式進行校正，以取得一經校正的線性關係式；以及依據該第二回饋值和該經校正的線性關係式計算出該分析物濃度的一實際值，其中與該分析物濃度相關的該線性關係式為y=ax+b，其中y為該第二回饋值，a為一斜率參數，x為該分析物濃度，b為一截距參數，其中該經校正的線性關係式為y=a’x+b’，其中y為該第二回饋值，a’為一經校正的斜率參數，x為該分析物濃度的該實際值，b’為一經校正的截距參數。
如申請專利範圍第7項所述之分析物濃度的檢測方法，其中利用該血球容積比對與該分析物濃度相關的該線性關係式進行校正的方法包括：依據一對照表或一關係式取得對應該血球容積比的一斜率係數和一截距係數；以及利用該斜率係數和該截距係數對與該分析物濃度相關的該線性關係式的該斜率參數和該截距參數進行校正，以取得該經校正的線性關係式。
如申請專利範圍第8項所述之分析物濃度的檢測方法，其中該對照表包括複數個血球容積比所對應之該斜率係數和該截距係數，該些血球容積比的範圍介於10%~70%。
如申請專利範圍第7項所述之分析物濃度的檢測方法，其中該線性關係式y=ax+b係當該血液的該血球容積比為0%時，該第二回饋值與該分析物濃度之一轉換公式。
如申請專利範圍第7項所述之分析物濃度的檢測方法，其中該線性關係式y=ax+b係當該血液的該血球容積比為40~45%時，該第二回饋值與該分析物濃度之一轉換公式。
一種分析物濃度的檢測方法，包括：提供一檢測試片，包括：一第一組電極，包括一第一反應區；一第二組電極，包括一第二反應區；以及一反應試劑層，設置於該第二反應區上；其中該第一組電極和該第二組電極分別包括一工作電極和一參考電極；提供一血液，使該血液與該第一組電極和該第二組電極接觸；利用該第一組電極取得一血球容積比；利用該血球容積比對與一分析物濃度相關的一線性關係式進行校正，以取得一經校正的線性關係式；對該第二組電極施加一電壓，以取得一回饋值；依據該回饋值和該經校正的線性關係式計算出該分析物濃度的一實際值，其中與該分析物濃度相關的該線性關係式為y=ax+b，其中y為該回饋值，a為一斜率參數，x為該分析物濃度，b為一截距參數，其中該經校正的線性關係式為：y=a’x+b’，其中y為該回饋值，a’為一經校正的斜率參數，x為該分析物濃度的該實際值，b’為一經校正的截距參數。
如申請專利範圍第12項所述之分析物濃度的檢測方法，其中利用該血球容積比對與該分析物濃度相關的該線性關係式進行校正的方法包括：依據一對照表或一關係式取得對應該血球容積比的一斜率係數和一截距係數；以及利用該斜率係數和該截距係數對與該分析物濃度相關的該線性關係式的該斜率參數和該截距參數進行校正，以取得該經校正的線性關係式。
如申請專利範圍第13項所述之分析物濃度的檢測方法，其中該對照表包括複數個血球容積比所對應之該斜率係數和該截距係數，該些血球容積比的範圍介於 10%~70%。
如申請專利範圍第12項所述之分析物濃度的檢測方法，其中該線性關係式y=ax+b係當該血液的該血球容積比為0%時，該回饋值與該分析物濃度之一轉換公式。
如申請專利範圍第12項所述之分析物濃度的檢測方法，其中該線性關係式y=ax+b係當該血液的該血球容積比為40~45%時，該回饋值與該分析物濃度之一轉換公式。
如申請專利範圍第12項所述之分析物濃度的檢測方法，其中利用該第一組電極取得一血球容積比方法包括：安培法(amperometry)、庫侖法(coulometry)、電位法(potentiometry)、伏安法(voltammetry)、電阻抗法(impedance)或前述方法之組合。