PL202936B1 - Zmodyfikowany czynnik VIII - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Wzajemne odniesienie do pokrewnych zgłoszeń patentowych.

Niniejsze zgłoszenie zastrzega pierwszeństwo wynikające z Zgłoszenia Patentowego US nr 09/037,601 złożonego 10 marca 1998; będącego częściową kontynuacją Zgłoszenia Patentowego nr 08/670,707 złożonego 26 czerwca 1996 wydanego jako Patent USA nr 5/859,204 i Międzynarodowe Zgłoszenie Patentowe nr PCT/US97/1155 złożonego 26 czerwca 1997.

Tło wynalazku.

Krzepnięcie zachodzi gdy płytki krwi przywierają do ściany uszkodzonego naczynia krwionośnego w miejscu urazu. Następnie, w wyniku kaskady enzymatycznie regulowanych reakcji rozpuszczalne cząsteczki fibrynogenu są przekształcane przez enzym trombinę do nierozpuszczalnych nici trombiny utrzymujących płytki krwi razem jako skrzeplinę. Na każdym etapie w kaskadzie białko prekursora jest przekształcane do proteazy tnącej kolejne w serii białko prekursora. Na większości etapów wymagane są kofaktory.

Czynnik VIII krąży w krwi jako nieaktywny prekursor wiążąc się silnie i nie kowalencyjnie z czynnikiem von Willebrand. Czynnik VIII jest proteolitycznie aktywowany przez trombinę lub czynnik Xa oddysocjowujący go od czynnika von Willebranda i aktywujący, w kaskadzie, jego funkcję pobudzającą koagulację krwi. W swojej aktywnej postaci białko czynnika VIIIa jest czynnikiem zwiększającym wielokrotnie katalityczną skuteczność czynnika IXa wobec aktywacji czynnika X.

Ludzie z niedoborami czynnika VIII lub z przeciwciałami przeciw czynnik czynnikowi VIII, którzy nie są leczeni czynnikiem VIII są dotknięci niekontrolowanym wewnętrznym krwawieniem, które może spowodować szereg poważnych objawów, od reakcji zapalnych w ścięgnach do wczesnej śmierci. Osoby dotknięte hemofilią, których liczbę w Stanach Zjednoczonych ocenia się na około 10 tysięcy mogą być leczone wlewkami ludzkiego czynnika VIII, które odtwarzają normalną zdolność krwi do krzepnięcia, gdy jest podawany dostatecznie często w wystarczającym stężeniu. W rzeczywistości klasyczna definicja czynnika VIII to substancja obecna w normalnej surowicy krwi poprawiająca wadę krzepnięcia surowicy pochodzącej od osób z hemofilią typu A.

Wytwarzanie przeciwciał („inhibitory” lub „przeciwciała inhibitorowe”) hamujących aktywność czynnika VIII jest poważnym powikłaniem w leczeniu pacjentów z hemofilią. Autoprzeciwciała wykształcane są u około 20% pacjentów z hemofilią typu A w odpowiedzi na terapeutyczne wlewki czynnika VIII. Wcześniej u nie leczonych pacjentów z hemofilią typu A, którzy wykształcili inhibitory, inhibitory zazwyczaj pojawiają się po roku leczenia. Ponadto, przeciwciała inaktywujące czynnik VIII czasami rozwijają się u pacjentów z uprzednio normalnymi poziomami czynnika VIII. Jeśli miano czynnika jest dostatecznie niskie pacjenci mogą być leczeni przez zwiększenie dawki czynnika VIII. Jednakowoż, często miano inhibitora jest tak wysokie, że nie można przebić go czynnikiem VIII. Alternatywną strategią jest obejście wymagania czynnika VIII, w normalnej homeostazie, przy pomocy złożonych preparatów czynnika IX (przykładowo KONYNE^®, Proplex^®) lub zrekombinowanego ludzkiego czynnika VIIa. Ponadto, ponieważ świński czynnik VIII zazwyczaj posiada mniejszą reaktywność wobec inhibitorów niż ludzki czynnik VIII użyty może być częściowo oczyszczony preparat czynnika VIII (HYATE:C^®). Wielu pacjentów, którzy wykształcili inhibitorowe przeciwciała przeciw ludzkiemu czynnikowi VIII było z powodzeniem leczonych świńskim czynnikiem VIII i tolerowało takie leczenie przez długi okres czasu. Jednakowoż, podawanie świńskiego czynnika VIII nie jest rozważanym rozwiązaniem, ponieważ u tego samego pacjenta po jednej lub kilku wlewkach mogą zostać wykształcone inhibitory przeciw świńskiemu czynnikowi VIII.

Szereg preparatów ludzkiego, pochodzącego z surowicy czynnika VIII, o różnym stopniu częstości jest dostępnych komercyjnie dla leczenia hemofilii typu A. Obejmują one częściowo oczyszczony czynnik VIII pochodzący z połączonej krwi wielu dawców poddanej działaniu temperatury i detergentów przeciw wirusom, lecz zawierających dostateczny poziom antygenowych białek; czynnik VIII oczyszczony przy pomocy monoklonalnego przeciwciała o niższych poziomach zanieczyszczenia wirusem i antygenami, i zrekombinowany ludzki czynnik VIII, którego badania kliniczne są w toku. Niefortunnie, ludzki czynnik VIII jest niestabilny w stężeniu i pH fizjologicznym, występuje we krwi w granicznie niskim stężeniu (0,2 μ g/ml) i ma niską specyficzną aktywność powodowania krzepnię cia. Publiczna służba zdrowia rozważa, w związku z ryzykiem wirusów lub innych zanieczyszczeń pochodzących z krwi, ograniczenie stosowania świńskiego, oczyszczonego z krwi świni, czynnika VIII.

Chorzy na hemofilię wymagają codziennego uzupełniania czynnika VIII dla zapobiegania krwawieniu i powstającej, związanej z hemofilią, deformującej artropatii. Jednakże, dostawy są niewystarPL 202 936 B1 czające i występują problemy w leczeniu związane z izolacją i oczyszczaniem, immunogennością i koniecznością usunięcia niebezpieczeństwa związanego z zarażeniem AIDS i żółtaczką. Uż ycie zrekombinowanego ludzkiego czynnika VIII lub częściowo oczyszczonego świńskiego czynnika VIII nie rozwiąże tych wszystkich problemów.

Problemy związane z powszechnie używanym, komercyjnie dostępnym, pochodzącym z surowicy czynnikiem VIII nieustannie wywołują zainteresowanie opracowaniem lepszego czynnika VIII. Istnieje potrzeba silniej działającej cząsteczki czynnika VIII tak, że więcej jednostek powodującej krzepnięcie aktywności może być dostarczone z jedną jego cząsteczką; cząsteczki czynnika VIII stabilnej w wybranym pH i stężeniu fizjologicznym; cząsteczki czynnika VIII, która jest w mniejszym stopniu zdolna do powodowania wytwarzania inhibitorowych przeciwciał i cząsteczki czynnika VIII nie wykrywanej przez układ odpornościowy u pacjentów, wytwarzających przeciwciała przeciw ludzkiemu czynnikowi VIII.

Co za tym idzie, podmiotem niniejszego wynalazku jest dostarczenie czynnika VIII korygującego hemofilię u pacjentów z niedoborem czynnika VIII lub posiadających inhibitory ludzkiego czynnika VIII. Ponadto, podmiotem niniejszego wynalazku jest dostarczenie sposobów leczenia hemofilii.

Kolejnym podmiotem niniejszego wynalazku jest dostarczenie czynnika VIII stabilnego w wybranym pH i stężeniu fizjologicznym.

Kolejnym podmiotem niniejszego wynalazku jest dostarczenie czynnika VIII o większej aktywności powodującej krzepnięcie krwi, niż ludzki czynnik VIII.

Kolejnym podmiotem niniejszego wynalazku jest dostarczenie czynnika VIII, przeciw któremu jest wytwarzane mniej przeciwciał.

Kolejnym podmiotem wynalazku jest dostarczenie sposobu przygotowania zrekombinowanego świńskiego czynnika VIII i specyficznie zmodyfikowanego świńskiego czynnika VIII.

Podsumowanie wynalazku.

Określenie pełnej sekwencji DNA kodującej świński czynnik VIII, którą tu podano, po raz pierwszy stworzyło możliwość syntezy pełnej długości świńskiego czynnika VIII przez ekspresję DNA kodującego świński czynnik VIII w dogodnej komórce gospodarza. Co za tym idzie, zrekombinowany, oczyszczony świński czynnik VIII jest aspektem niniejszego wynalazku. DNA kodujący każdą domenę świńskiego czynnika VIII jak również jakikolwiek, wyszczególniony jego fragment może być wyrażony w podobny sposób. Ponadto, świński fVIII posiadający usunięte wszystkie części domeny B (świński fVIII bez domeny B) jest udostępniony jako część niniejszego wynalazku przez ekspresję DNA kodującego białko fVlII z delecją jednego lub większej liczby kodonów domeny B.

Dostarczone są również kompozycje farmaceutyczne i sposoby leczenia pacjentów z niedoborem czynnika VIII obejmujący podanie zrekombinowanego świńskiego czynnika VIII lub zmodyfikowanego zrekombinowanego świńskiego czynnika VIII, w szczególności pozbawionego domeny B świńskiego czynnika B.

Krótki opis rysunków.

Fig. 1A-1H łącznie dostarczają przyrównania sekwencji obejmującego sekwencje ludzkiego, świńskiego i mysiego czynnika VIII.

Szczegółowy opis wynalazku.

Jeśli nie jest inaczej wyszczególnione lub podane, to w użytym tu znaczeniu „czynnik VIII” określa jakąkolwiek, funkcjonalną cząsteczkę białka czynnika VIII, pochodzącą z jakiegokolwiek ssaka.

W uż ytym tu znaczeniu „ssaczy czynnik VIII” obejmuje czynnik VIII o sekwencji aminokwasowej pochodzącej od ssaka nie będącego człowiekiem chyba, że jest podane inaczej. „Zwierzę” w użytym tu znaczeniu określa świnię lub inne ssaki nie będące człowiekiem.

„Fuzja białkowa” lub „fuzja czynnika VIII lub jej fragment” w użytym tu znaczeniu jest produktem hybrydowego genu, w którym sekwencja kodująca jednego białka jest zmieniona, przykładowo przez przyłączenie jej części do sekwencji kodującej drugiego białka, pochodzącej z innego genu, połączonej w odpowiedniej ramce odczytu tak, że zajść może nie zaburzona transkrypcja i translacja połączonych fragmentów, wytwarzająca hybrydowy gen kodujący fuzję białkową.

„Odpowiadający” kwas nukleinowy lub aminokwas, lub sekwencja obu w użytym tu znaczeniu jest występującą w określonym miejscu cząsteczki czynnika VIII lub jej fragmentu, posiadającego tą samą strukturę i/lub funkcję co miejsce w cząsteczce czynnika VIII innych gatunków, choć kwas nukleinowy lub liczba aminokwasów może nie być identyczna. Sekwencja DNA „odpowiadająca” sekwencji innego czynnika VIII zasadniczo odpowiada takiej sekwencji i hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją oznaczoną SEQ ID NO. Sekwencja DNA „odpowiadająca” sekwencji innego czynnika VIII

PL 202 936 B1 obejmuje również sekwencję będącą wynikiem ekspresji czynnika VIII lub jego fragmentu i hybrydyzującej z zaprojektowaną SEQ ID NO. za wyjątkiem degeneracji kodu genetycznego.

„Unikalny” aminokwas lub sekwencja, w użytym tu znaczeniu oznacza sekwencję aminokwasową lub aminokwas w cząsteczce czynnika VIII jednego gatunku, innego niż homologiczny aminokwas lub sekwencja w cząsteczce czynnika VIII innych gatunków.

„Aktywność specyficzna” w użytym tu znaczeniu, określa aktywność, która koryguje defekt krzepnięcia surowicy człowieka z niedoborem czynnika VIII. Aktywność specyficzna jest mierzona w jednostkach aktywności krzepnięcia na miligram całkowitego białka czynnika VIII w typowym oznaczeniu, w którym czas krzepnięcia ludzkiej surowicy z niedoborem czynnika VIII jest porównany z normalną ludzką surowicą . Jedna jednostka aktywnoś ci czynnika VIII, to aktywność wystę pują ca w jednym mililitrze normalnej ludzkiej surowicy. W oznaczeniu, im krótszy czas krzepnięcia, tym wię ksza oznaczona aktywność czynnika VIII. Świński czynnik VIII wykazuje aktywność krzepnięcia w oznaczeniu dla ludzkiego czynnika VIII.

„Ekspresja” określa zestaw procesów zachodzących gdy informacja genetyczna jest wykorzystywana dla uzyskania produktu. DNA kodujący sekwencję aminokwasową z świńskiego czynnika VIII może być „wyrażony” w komórkach gospodarza będącego ssakiem dając świńskie białko czynnika VIII. Materiały, struktury genetyczne, komórki gospodarza i warunki pozwalające na ekspresję danej sekwencji DNA są dobrze znane nauce i mogą być manipulowane celem wpłynięcia na czas i poziom ekspresji, jak również na wewnątrz lub zewnątrzkomórkową lokalizację wyrażanego białka. Przykładowo, uwzględniając DNA kodujący peptyd sygnałowy na 5' końcu DNA kodującego świński czynnik VIII (5' koniec zgodnie z konwencją to ten, który koduje NH2 końce białka) powoduje, że kodowane białko jest eksportowane z wnętrza komórki gospodarza do pożywki. Dostarczenie DNA kodującego peptyd sygnałowy w połączeniu z DNA kodującym świński czynnik VIII jest korzystny z uwagi na ekspresję czynnika VIII, który jest eksportowany do pożywki hodowlanej co upraszcza proces oczyszczania. Korzystnie, peptyd sygnałowy jest peptydem sygnałowym ludzkiego czynnika VIII.

Sekwencja nukleotydowa cDNA dla ludzkiego czynnika VIII i wydedukowane sekwencje aminokwasowe przedstawiono odpowiednio jako SEQ ID NO: 1 i 2. Czynnik VIII jest syntetyzowany jako pojedynczy łańcuch białka o masie cząsteczkowej około 300 kDa z wewnętrzną homologią sekwencji określającą sekwencję „domeny” NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-C00H. W cząsteczce czynnika VIII „domena” w użytym tu znaczeniu jest ciągłą sekwencją aminokwasową określoną przez identyczność wewnętrznej sekwencji aminokwasowej i miejsca proteolitycznego cięcia przez trombinę. Jeśli nie jest inaczej określone, to domeny czynnika VIII obejmują poniższe aminokwasy, gdzie sekwencje są przyrównane do ludzkiej sekwencji aminokwasowej (SEQ ID NO: 2): A1, aminokwasy Ala1-Arg372; A2, aminokwasy Ser373-Arg740; B, aminokwasy Ser741-Arg1648; A3, aminokwasy Ser1690-Ile2032; C1, aminokwasy Arg2033-Asn2172; C2, aminokwasy Ser2173-Tyr2332. Sekwencja A3-C1-C2 obejmuje aminokwasy Ser1690-Tyr2332. Pozostały fragment, aminokwasy Glu1649-Arg1689 są zazwyczaj określane jako lekki łańcuch peptydu aktywującego czynnik VIII. Czynnik VIII jest proteolitycznie aktywowany przez trombinę lub czynnik Xa, który oddysocjowuje go od czynnika von Willebrand, tworząc czynnik VIIIa o działaniu prokoagulującym. Biologiczną funkcją czynnika VIIIa jest zwiększanie wydajności katalitycznej czynnika IXa dla aktywacji czynnika X kilkukrotnie zwiększając jego aktywność. Czynnik VIIIa aktywowany trombiną o masie 160 kDa jest heterodimerem A1/A2/A3-C1-C2 tworzącym kompleks z czynnikiem IXa i czynnikiem X na powierzchni płytek lub monocytów. „Częściowa domena” w użytym tu znaczeniu jest ciągłą sekwencją aminokwasową tworzącą część domeny.

„Podjednostki” ludzkiego lub zwierzęcego czynnika VIII w użytym tu znaczeniu są białkiem łańcuchów lekkiego lub ciężkiego. Ciężki łańcuch czynnika VIII zawiera trzy domeny A1, A2 i B. Łańcuch lekki czynnika VIII również zawiera trzy domeny A3, C1 i C2.

Terminy „epitop”, „miejsca antygenowe” i „determinanta antygenowa” są użyte tu wymiennie i określają część ludzkiego lub zwierzęcego czynnika VIII lub jego fragment, który jest rozpoznawany specyficznie przez przeciwciało. Może się składać z jakiejkolwiek liczby aminokwasów i może zależeć od pierwszorzędowej, drugorzędowej lub trzeciorzędowej struktury białka. Termin „miejsce immunogeniczne” w użytym tu znaczeniu jest zdefiniowany jako obszar ludzkiego lub zwierzęcego czynnika VIII lub jego fragment, który specyficznie wywołuje wytwarzanie przeciwciała przeciw czynnikowi VIII lub jego fragmentowi, u człowieka lub zwierzęcia, co zmierzono rutynowymi sposobami, takimi jak oznaczenia immunologiczne, np. ELISA lub oznaczenie Bethesda, które tu opisano. Może on zawierać każdą liczbę aminokwasów i może zależeć od pierwszorzędowej, drugorzędowej lub trzeciorzędowej struktury białka. W pewnych postaciach, hybryda lub hybrydowy odpowiednik czynnika VIII lub

PL 202 936 B1 jego fragmentu jest nie immunogeniczny lub mniej immunogeniczny u zwierzęcia lub człowieka niż ludzki lub świński czynnik VIII.

„Niedobór czynnika VIII” w użytym tu znaczeniu obejmuje niedobór w aktywności wywołującej krzepnięcie spowodowany wytwarzaniem defektywnego czynnika VIII, przez niedostateczne lub brak wytwarzania czynnika VIII, lub częściowe, lub całkowite zahamowanie czynnika VIII przez inhibitory. Hemofilia A jest typem zależnym od niedoboru czynnika VIII wynikającego z defektu genu sprzężonego z chromosomem X i brakiem lub niedoborem kodowanego przez ten gen białka czynnika VIII.

W uż ytym tu znaczeniu „oznaczenia diagnostyczne” obejmują doświadczenia, które w jakichś sposób wykorzystują oddziaływanie antygen-przeciwciało dla wykrycia i/lub oceny ilości szczególnego przeciwciała występującego w badanej próbce wykorzystanego dla wybrania sposobu leczenia. Istnieje wiele takich oznaczeń znanych biegłemu naukowcowi. W użytym tu znaczeniu ludzki, świński lub zmodyfikowany świński DNA dla czynnika VIII lub jego fragment ulegający ekspresji w całości lub częściowo może być podstawiony znanymi odczynnikami w innych, znanych oznaczeniach, co za tym idzie zmodyfikowane oznaczenia mogą być użyte dla wykrycia i/lub oznaczenia przeciwciał przeciw czynnikowi VIII. Tak więc, zastosowanie tych odczynników, DNA dla czynnika VIII lub jego fragmentu, lub eksprymowanego na jego matrycy białka, umożliwia modyfikację znanych oznaczeń dla wykrywania przeciwciał przeciw ludzkiemu lub zwierzęcemu czynnikowi VIII. Oznaczenia takie obejmują, lecz nie są ograniczone do ELISA, oznaczeń immunodyfuzji i blotów immunologicznych. Użyteczne sposoby dla praktykowania któregokolwiek z tych oznaczeń są znane naukowcom. W użytym tu znaczeniu czynnik VIII lub jego fragment obejmujący przynajmniej jeden epitop białka może być użyty jako odczynnik diagnostyczny. Przykłady innych oznaczeń, w których ludzki, świński lub zmodyfikowany świński czynnik VIII lub jego fragment mogą być użyte, obejmują oznaczenie Bethesda i oznaczenia antykoagulacji.

Termin „DNA kodujący białko takie jak świński czynnik VIII” oznacza kwas polideoksynukleotydowy, którego sekwencja nukleotydowa zawiera informację kodowaną zgodną z komórką gospodarza dla sekwencji aminokwasowej białka, np. z świńskiego czynnika VIII, zgodnie ze znanymi zależnościami kodu genetycznego.

„Produkt ekspresji” DNA kodującego ludzki lub zwierzęcy czynnik VIII lub zmodyfikowany czynnik VIII jest produkt otrzymany przez ekspresję omówionego DNA w dogodnej komórce gospodarza, obejmując takie cechy pre, lub posttranslacyjnej modyfikacji białka kodowanego przez omówiony DNA, które obejmują lecz nie są ograniczone do glikozylacji, proteolitycznego cięcia i tym podobne. Jest znane przez naukę, że modyfikacje takie mogą występować i mogą w jakiś sposób różnić się zależnie od typu komórki gospodarza i innych czynników i mogą prowadzić do cząsteczkowych izoform produktu z zachowaniem aktywności prokoagulacyjnej. Patrz np. Lindt, P. i wsp., Eur. J. Biochem. 232: 1927 (1995) włączone tu przez cytowanie. „Wektor ekspresyjny” jest cząsteczką DNA, często o kolistej strukturze, posiadającej zdolność do autonomicznej replikacji w pożądanej komórce gospodarza lub do integracji do genomu komórki gospodarza i również posiadająca określone, dobrze znane właściwości pozwalające na ekspresję kodującego DNA wbudowanego do sekwencji wektora w odpowiednie miejsce i w odpowiedniej orientacji. Takie wł a ś ciwoś ci mogą obejmować , ale nie są ograniczone do jednej lub większej liczby sekwencji promotorowych kierujących inicjacją transkrypcji kodującego DNA i innych elementów DNA, takich jak enhansery, miejsca poliadenylacji i im podobne, dobrze znane nauce. Termin „wektor ekspresyjny” jest użyty dla określenia zarówno wektora posiadającego sekwencję kodującą DNA, która będzie ulegała ekspresji wbudowana do jego sekwencji i wektor posiadający dodatkowe elementy kontrolujące ekspresję tak zorganizowane względem miejsca wbudowania, że mogą służyć dla ekspresji jakiegokolwiek, kodującego DNA wbudowanego w miejsce tak jak jest to dobrze znane nauce. Tak więc, przykładowo, wektor pozbawiony promotora może stać się wektorem ekspresyjnym przez wbudowanie promotora w połączeniu z kodującym DNA.

Ogólny opis sposobów.

Patent USA 5,364,771 opisał odkrycie hybryd ludzko-świńskich cząsteczek czynnika VIII posiadających aktywność powodującą krzepnięcie, których elementy cząsteczki czynnika VIII ludzkiego lub świńskiego są podstawione przez odpowiednie elementy cząsteczki czynnika VIII z innych gatunków. Patent US 5,663,060 opisał ludzko-zwierzęce hybrydy o aktywności prokoagulacyjnej i równoważnik hybrydy cząsteczek czynnika VIII, w których elementy cząsteczki czynnika VIII z jednych gatunków są podstawione odpowiednimi elementami cząsteczki czynnika VIII z innych gatunków.

Ponieważ obecne informacje wykazują, że domena B nie posiada inhibitorowego epitopu i nie ma znanego wpływu na funkcje czynnika VIII, w pewnych postaciach domena B jest cała lub częścio6

PL 202 936 B1 wo usunięta w aktywnej hybrydzie lub hybrydowym równoważniku cząsteczek czynnika VIII lub jego fragmentów („B(-) czynnik VIII”) przygotowany jakimkolwiek opisanym tu sposobem.

Ludzki gen dla czynnika VIII został wyizolowany i wyrażony o czym donosili Toole, J.J. i wsp., (1984) Nature 312:342-347 (Genetics Institute); Gitschier, J. i wsp., (1984) Nature 312:326-330 (Genetech); Wood, W.I. i wsp., (1984) Nature 312:330-337 (Genetech); Vehar, G.A. i wsp., (1984) Nature 312:337-342 (Genetech); WO 87/04187; WO 88/08035; WO 88/03558; Patent U.S. Nr 4,757,006, i sekwencja aminokwasowa został a wydedukowana z cDNA. Patent USA Nr 4,965,199 dla Capon i wsp., ujawniaj ący sposób rekombinowania DNA dla wytworzenia czynnika VIII w komórkach gospodarza i oczyszczenia ludzkiego czynnika VIII. Donoszono o ludzkim czynniku VIII wyrażonym w komórkach CHO (komórki jajnikowe chomika chińskiego) i komórkach BHKC (komórki nerki oseska chomika). Ludzki czynnik VIII został zmodyfikowany dla usunięcia części lub całej domeny B (Patent US Nr 4,868,112) i zastąpienie domeny B ludzkiego czynnika VIII domeną B ludzkiego czynnika V (Patent US 5,004,803). Sekwencja cDNA kodująca ludzki czynnik VIII i wydedukowana sekwencja aminokwasową są przedstawione odpowiednio jako SEQ ID NO: 1 i 2. Na SEQ ID NO: 1 obszar kodujący rozpoczyna się od nukleotydu w pozycji 208, trójka GCC jest kodonem dla aminokwasu nr 1 (Ala) dojrzałego białka jakie podano na SEQ ID NO: 2.

Białko czynnika VIII wyizolowano z surowicy [Fass, D.N. i wsp., (1982) Blood 59: 594]. Częściowa sekwencja aminokwasowa świńskiego czynnika VIII odpowiada części N-końcowej sekwencji lekkiego łańcucha o homologii do ceruloplazminy i czynnika V krzepnięcia krwi opisanych przez Church i wsp., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6934. Toole, J.J. i wsp., (1984) Naturę 312:342347 opisujący częściową sekwencję N-końcowych cztero aminokwasowych fragmentów świńskiego czynnika VIII, lecz nie charakteryzujących fragmentów w odpowiednich pozycjach w cząsteczce czynnika VIII. Sekwencja aminokwasowa B i części domen A2 świńskiego czynnika VIII podano przez Toole, J.J. i wsp., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5939-5942. Sekwencja cDNA kodująca pełną domenę A świńskiego czynnika A i wydedukowaną sekwencję aminokwasową i hybrydę ludzko/świńsko czynnika VIII posiadającą substytucję we wszystkich domenach, wszystkie substytucje i specyficzne sekwencje aminokwasowe ujawniono w Patencie U.S. 5,364,771 zatytuł owanym „Hybrid Human/Porcine Factor VIII” nadanym 15 listopada 1994 roku i w WO 93/20093 opublikowanym 14 października 1994. Sekwencja cDNA kodująca domenę A świńskiego czynnika VIII odpowiada aminokwasom 373-740 dojrzałego ludzkiego czynnika VIII jak przedstawiono na SEQ ID NO: 1 i wydedukowanej sekwencji aminokwasowej przedstawionych odpowiednio na SEQ ID NO: 3 i 4. Bardziej współcześnie sekwencje nukleotydowa i odpowiadająca jej sekwencja aminokwasową części domeny A1, która utraciła pierwsze 198 aminokwasów i domeny A2 ze świńskiego czynnika VIII podano w opublikowanym 26 maja 1994 roku WO 94/11503. Cała sekwencja nukleotydowa świński czynnik VIII zawiera pełną domenę A1, aktywujący peptyd, A3, domeny C1 i C2, jak również kodowana sekwencja aminokwasowa była ostatecznie otrzymana przez Lollar jak ujawniono w Patencie US 5,859,204 nadanym 12 stycznia 1999 i w WO 97/49725 opublikowanym 31 grudnia 1997, oba włączone tu przez odniesienie literaturowe.

Zarówno świński jak i ludzki czynnik VIII są wyizolowane z surowicy jako dwu podjednostkowe białko. Podjednostki, znane jako łańcuch ciężki i łańcuch lekki utrzymują się ze sobą przy pomocy nie kowalencyjnego wiązania i wymagają wapnia i innych dwuwartościowych jonów metalu. Łańcuch ciężki czynnika VIII zawiera trzy domeny Al, A2 i B, które są ze sobą związane kowalencyjnie. Łańcuch lekki czynnika VIII zawiera również trzy domeny oznaczone A3, C1 i C2. Domena B nie posiada znanej funkcji biologicznej i może być usunięta, lub częściowo usunięta z cząsteczki proteolitycznie lub sposobami rekombinowania DNA bez znaczącej zmiany jakiegokolwiek mierzalnego parametru czynnika VIII. Ludzki, zrekombinowany czynnik VIII ma podobną strukturę i funkcję do pochodzącego z surowicy czynnika VIII, choć nie jest glikozylowany, chyba że jest wyrażony w komórkach ssaczych.

Zarówno ludzki jak i świński, aktywowany czynnik VIII („czynnik VIIIa”) posiada trzy podjednostki zależnie od cięcia ciężkiego łańcucha pomiędzy domenami A1 i A2. Struktura ta jest oznaczona A1/A2/A3-C1-C2. Ludzki czynnik VIIIa nie jest stabilny w warunkach stabilizujących świński czynnik VlIIa, przypuszczalnie ze względu na słabsze związanie podjednostki A2 z ludzkiego czynnika VIIIa. Dysocjacja podjednostki A2 ludzkiego i świńskiego czynnika VIIIa jest związana z utratą aktywności przez cząsteczkę czynnika Vllla. Yakhyάev, A. I wsp., (1997) Blood 90: Suppl. 1, Streszczenie #126 donosi o wiązaniu domeny A2 przez białko pokrewne receptorowi lipoproteiny o niskiej gęstości sugerując, że komórkowe pobieranie A2 uczestniczące w takim wiązaniu działa jak czynnik wyciszający aktywność czynnika VIII.

PL 202 936 B1

Ekspresja „czynnika VIII bez domeny B” jest zwiększona przez uwzględnienie części domeny B. Włączenie części domeny B oznaczonych „SQ” [Lind, P. i wsp., (1995) powyżej] było podane jako prowadzące do korzystnej ekspresji. Konstrukty „SQ” utraciły całą ludzką domenę B z wyjątkiem pięciu aminokwasów N-końca domeny B i dziewięciu aminokwasów C-końców domeny B.

Oczyszczony, hybrydowy czynnik VIII lub jego fragment może być oznaczony z uwagi na reaktywność immunologiczną i aktywność koagulującą przy pomocy typowych oznaczeń obejmujących, przykładowo, oznaczenie wolnego od surowicy czynnika VIII, jedno etapowe oznaczenie krzepnięcia i oznaczenie immunosorbcji ze zwią zanym enzymem wykorzystują ce jako standard częściowo oczyszczony ludzki czynnik VIII.

Dla ekspresji zrekombinowanego konstruktu genów w komórce eukariotycznej mogą być użyte inne wektory, obejmujące zarówno plazmid, jak i eukariotyczne wektory wirusowe, zależnie od preferencji i osądu biegłego praktyka (patrz przykładowo Sambrook i wsp., Rozdział 16). Inne wektory i systemy ekspresji obejmują systemy bakteryjne, droż dż owe i owadzie i mogą być użyte, lecz nie są konieczne z uwagi na różnice w lub utratę glikozylacji.

Zrekombinowane białko czynnika VIII może być wyrażone w różnych komórkach powszechnie użytych dla hodowania i ekspresji zrekombinowanego ssaczego białka. W szczególności szereg linii komórkowych gryzonia określono jako szczególnie użyteczni gospodarze dla ekspresji dużych białek. Korzystnie, linie komórkowe dostępne z American Type Culture Collection, Rockville, MD obejmują komórki nerki oseska chomika i komórki jajnikowe chomika chińskiego (CHO), które są hodowane przy pomocy rutynowych procedur i podłoża.

Podstawą dla większej aktywności koagulacyjnej świńskiego czynnika VIII wydaje się być gwałtowniejsza spontaniczna dysocjacja ludzkiej podjednostki A2 z ludzkiego czynnika VIIIa niż świńskiej podjednostki A2 ze świńskiego czynnika VIIIa. Dysocjacja podjednostki A2 prowadzi do utraty aktywności [Lollar, P. i wsp., (1990) J. Biol. Chem. 265:1688-1692; Lollar, P. i wsp., (1992) J. Biol. Chem. 267:23652; 23657; Fay, P.J. i wsp., (1992) J. Biol. Chem. 267:13246-13250].

Cząsteczki czynnika VIII o ograniczonej aktywności immunologicznej; epitopy, które są immunoreaktywne z przeciwciałami, które hamują aktywność koagulacyjną czynnika VIII („inhibitory” lub „inhibitorowe przeciwciała”) zostały scharakteryzowane na podstawie znanych strukturalno-funkcjonalnych zależności w czynniku VIII. Przypuszczalnie, inhibitory mogą działać przez zniszczenie jakichkolwiek cząsteczkowych oddziaływań związanych ze strukturą domeny czynnika VIII lub jej asocjacji z czynnikiem von Willebranda, trombiną, czynnikiem Xa, czynnikiem IXa lub czynnikiem X. Jednakowoż, większość inhibitorowych przeciwciał dla ludzkiego czynnika VIII działa przez wiązanie z epitopami umiejscowionymi w 40 kDa domenie A2 lub 20 kDa domenie C2 czynnika VIII, specyficzne funkcje rozbijające związane z tymi domenami są opisane przez Fulcher i wsp. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7728-7732 i Scandella i wsp., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6152-6156. Poza epitopami A2 i C2 może być trzeci epitop w domenie A3 lub C1 z lekkiego łańcucha czynnika VIII, zgodnie z Scandella i wsp. (1993) Blood 82:1767-1775. Znaczenie tych potencjalnych trzech epitopów jest nieznane, lecz wydaje się mieć znaczenie dla mniejszej części reaktywności epitopu w czynniku VIII.

Przeciwciała anty-A2 blokują aktywację czynnika X co wskazali Lollar i wsp., (1994) J. Clin. Invest. 93:2497-2504. Wcześniejsze badania polegające na mapowaniu przez mutagenezę delecyjną, które opisali Ware i wsp., (1992) Blood Coalgul. Fibrinolysis 3:703-716 umiejscowiły epitop A2 w obrębie NH2-obszaru o wielkości 20 kDa domeny A2 o masie cząsteczkowej 40 kDa. Immunoradiometryczne oznaczenia współzawodnictwa wykazały, że inhibitory A2 rozpoznają zarówno wspólny epitop lub blisko siebie położone epitopy jak to opisali Scandella i wsp., (1992) Throm. Haemostas 67:665-671 jak pokazano w Patencie US 5,859,204.

Zwierzęca lub zmodyfikowane zwierzęce cząsteczki czynnika VIII mogą być badane u ludzi z uwagi na ich ograniczoną antygenowość i/lub immunogeniczność w testach klinicznych. W jednym typie postępowania, zaprojektowanym dla określenia czy czynnik VIII jest immunoreaktywny przeciwciałami inhibitorowymi, czynnik VIII jest podany, korzystnie przez wlekę do naczyniową około 25 pacjentom z niedoborem czynnika VIII, którzy posiadali przeciwciała hamujące aktywność koagulacyjną terapeutycznego ludzkiego czynnika VIII. Dawki zwierzęcego lub zmodyfikowanego ludzkiego czynnika VIII mieszczą się w zakresie pomiędzy 5 i 50 jednostek/kg wagi ciała, korzystnie 10-50 jednostek/kg i najkorzystniej 40 jednostek/kg wagi ciała. Około 1 godz. Po każdym podaniu odzysk czynnika VIII z próbek krwi jest mierzony jedno etapowym oznaczeniem koagulacji. Próbki są pobierane ponownie około 5 godzin po wlewce o dokonany jest pomiar odtwarzania. Całkowite odtworzenie i szybkość zanikania czynnika VIII w próbkach jest wskazówką miana przeciwciała i aktywności inhibitoro8

PL 202 936 B1 wej. Wyniki odzyskiwania są porównane z wynikami odzyskiwania otrzymanymi dla pacjentów leczonych ludzkim czynnikiem VIII pochodzącym z surowicy, zrekombinowanym czynnikiem VIII, pochodzącym z surowicy świńskim czynnikiem VIII i innymi powszechnie używanymi postaciami terapeutycznymi czynnika VIII, lub odpowiednikami czynnika VIII.

Po identyfikacji klinicznie istotnych epitopów zrekombinowane cząsteczki czynnika VIII mogą być wyrażone tak, że ujawniają mniejszą lub równą reaktywność krzyżową w porównaniu z pochodzącym z surowicy świńskim czynnikiem VIII, gdy są badane in vitro względem szerokiego spektrum inhibitorów surowiczych. Ponadto, dla ograniczenia reaktywności krzyżowej może być przeprowadzona mutageneza w obszarach epitopu. Ograniczona reaktywność krzyżowa, choć pożądana, nie jest niezbędna dla wytworzenia produktu, który może być korzystniejszy niż istniejący koncentrat pochodzącego z surowicy świńskiego czynnika VIII, który może wywoływać efekty uboczne zależnie od zanieczyszczenia świńskimi białkami, lub zanieczyszczenia czynnikami infekcyjnymi takimi, jak wirusy lub priony. Zrekombinowana świńska lub zmodyfikowana świńska cząsteczka czynnika VIII nie będzie zawierała obcych świńskich białek.

Oznaczenia diagnostyczne.

cDNA dla czynnika VIII i/lub kodowane przez nie białka, całe lub ich części, mogą być użyte w oznaczeniach jako odczynniki diagnostyczne dla wykrycia inhibitorowych przeciwciał dla substratu będącego ludzkim lub zwierzęcym czynnikiem VIII lub zmodyfikowanym zwierzęcym czynnikiem VIII, przykładowo, próbki surowicy i płyny ciała od będących ludźmi pacjentów z niedoborem czynnika VIII. Te oznaczenia przeciwciała obejmują oznaczenia takie jak ELISA, bloty immunologiczne, oznaczenia radioimmunologiczne, oznaczenia immunodyfuzji i oznaczenia aktywności biologicznej czynnika VIII (np. przez oznaczenie krzepnięcia). Sposoby przygotowania tych odczynników i sposoby ich użycia są znane biegłym naukowcom. Przykładowo, immunologiczne oznaczenie dla wykrycia inhibitorowych przeciwciał w próbce surowicy pacjenta może obejmować reakcję badanej próbki z dostateczną ilością badanego czynnika VIII, bowiem możliwy do wykrycia kompleks może zostać utworzony z występującymi w próbce inhibitorowymi przeciwciałami i czynnikiem VIII, które rzeczywiście jest antygenem.

Sondy będące kwasem nukleinowym i aminokwasem mogą być przygotowane na podstawie sekwencji cDNA dla hybrydowego czynnika VIII, lub cząsteczki białka lub jej fragmentu. W pewnych postaciach mogą być one wyznakowane przy pomocy barwników lub komercyjnie dostępnymi znacznikami enzymatycznymi, fluorescencyjnymi, chemiluminescencyjnymi lub radioaktywnymi. Użyte mogą być sondy aminokwasowe, przykładowo dla badania surowicy lub innych płynów ciała, które są podejrzane, że zawierają inhibitory ludzkiego, zwierzęcego lub hybrydowego ludzko/zwierzęcego czynnika VIII. Poziomy inhibitorów mogą być ocenione u pacjentów i porównane ze zdrowymi kontrolami i mogą być użyte przykładowo dla określenia czy pacjent z niedoborem czynnika VIII może być leczony zwierzęcym lub zmodyfikowanym zwierzęcym czynnikiem VIII. Użyte mogą być również sondy cDNA, przykładowo dla celów badawczych w przeszukiwaniu bibliotek DNA.

Kompozycje farmaceutyczne.

Kompozycje farmaceutyczne zawierające zrekombinowany świński lub zmodyfikowany świński czynnik VIII, same lub w kombinacji z odpowiednimi farmaceutycznymi związkami stabilizującymi, nośnikami dostarczającymi i/lub nośnikami transportującymi są przygotowane zgodnie ze znanymi sposobami jakie opisano w Remington's Pharmaceutical Sciences Przez W.E. Martin.

W pewnej, korzystnej postaci, korzystne noś niki lub noś niki dostarczają ce dla wlewki do naczyniowej są solą fizjologiczną lub buforem fosforanowo-solankowym.

W kolejnej, korzystnej postaci, dogodne zwią zki stabilizują ce dostarczają ce noś niki i transportujące nośniki obejmują, lecz nie są ograniczone do innych, ludzkich lub zwierzęcych białek, takich jak albumina.

Fosfolipidowe nośniki lub zawiesiny liposomów są również korzystne jako farmaceutycznie akceptowalne nośniki lub nośniki dostarczające. Mogą być one przygotowane zgodnie ze sposobami znanymi biegłym naukowcom i mogą przykładowo zawierać fosfatydyloserynę/fosfatydylocholinę lub inne kompozycje fosfolipidów lub detergentów, które razem tworzą na powierzchni ujemny ładunek, bowiem czynnik VIII wiąże się z ujemnie naładowanymi fosfolipidami błon. Liposomy mogą być przygotowane przez rozpuszczenie odpowiedniego lipidu(ów) (takiego jak stearoilofosfatydylo etanoloamina, stearoilofosfatydylo cholina, arachadoilofosfatydylo cholina i cholesterol) w nieorganicznym rozpuszczalniku, który jest następnie odparowany pozostawiając cienki film wysuszonego lipidu na powierzchni zbiornika. Następnie do zbiornika jest wprowadzony wodny roztwór hybrydowego czynnika

PL 202 936 B1

VIII. Następnie, zawartość pojemnika jest mieszana ręcznie, aby z jego ścianek uwolnić lipidowy materiał i dla rozproszenia lipidowych agregatów, co za tym idzie, tworząc zawiesinę liposomów.

Zrekombinowany świński lub zmodyfikowany świński czynnik VIII może być połączony z innymi dogodnymi, stabilizującymi związkami, dostarczającymi nośnikami i/lub transportującymi nośnikami obejmującymi zależne od witaminy K czynniki krzepnięcia, czynniki tkankowe i czynnik von Willebrand (vWf) lub fragment vWf zawierający miejsce wiązania czynnika VIII i polisacharydy takie jak sacharoza.

Zrekombinowany świński lub zmodyfikowany świński czynnik VIII może również być dostarczony przez terapię genową w taki sam sposób jak dostarczony może być ludzki czynnik VIII, przy pomocy sposobu dostarczenia takiego jak wektory retrowirusowe. Sposób ten obejmuje wbudowanie pożądanego konstruktu cDNA dla czynnika VIII do komórek człowieka, które są przeszczepione bezpośrednio do pacjenta z niedoborem czynnika VIII lub, które są umieszczone we wszczepialnym urządzeniu przepuszczalnym dla cząsteczek czynnika VIII, lecz nie przepuszczalnego dla komórek, do których jest wszczepiony. Korzystnym sposobem będzie przeniesienie genu za pośrednictwem retrowirusa. W sposobie tym, egzogenny gen (np. cDNA dla czynnika VIII) jest klonowany do genomu zmodyfikowanego retrowirusa. Gen jest wbudowany do genomu komórki gospodarza dzięki mechanizmom wirusowym, i tam ulega ekspresji przez komórkę. Wektor retrowirusowy jest zmodyfikowany tak, że nie będzie wytwarzał wirusów, co zapobiega zarażeniu wirusem gospodarza. Ogólne zasady tego typu leczenia są dobrze znane biegłym naukowcom i ich przeglądu dokonano w literaturze [np. Kohn, D.B. i wsp., (1989) Transfusion 29:812-820].

Świński lub zmodyfikowany świński czynnik VIII może być przechowywany związany z vWf dla zwiększenia półokresu trwania i stabilności powierzchniowej hybrydowej cząsteczki. Ponadto, liofilizacja czynnika VIII może zwiększać wydajność otrzymywania aktywnych cząsteczek w obecności vWf Współczesne metody dla przechowywania ludzkiego i zwierzęcego czynnika VIII użyte przez komercyjnych dostawców mogą być zastosowane dla przechowywania zrekombinowanego czynnika VIII. Sposoby te obejmują: (1) liofilizację czynnika VIII w częściowo oczyszczonej postaci (jako „koncentrat” czynnika VIII, który jest podawany w postaci wlewki bez dalszego oczyszczania); (2) oczyszczanie przez powinowactwo immunologiczne czynnika VIII sposobem Zimmerman i liofilizacja w obecności albuminy, która stabilizuje czynnik VIII; (3) liofilizacja zrekombinowanego czynnika VIII w obecności albuminy.

Ponadto stwierdzono, że świński lub modyfikowany świński czynnik VIII jest nieograniczenie stabilny w 4°C w 0,6 M NaCl, 20 mM MES i 5 mM CaCl2 w pH 6,0 i może być również przechowywane w takich buforach i rozmrażany z minimalną utratą aktywności.

Sposoby leczenia.

Zrekombinowane białko lub zmodyfikowany czynnik VIII jest użyty dla leczenia nie kontrolowanego krwawienia zależnego od niedoboru czynnika VIII (np. wewnątrz chrząstkowego, wewnątrz czaszkowego lub krwawienia jelitowo-żołądkowego) u chorych na hemofilię z lub bez inhibitorowych przeciwciał i u pacjentów z nabytym niedoborem czynnika VIII zależnym od wykształcenia inhibitorowych przeciwciał. Aktywne czynniki są korzystnie podawane donaczyniowo.

Ponadto, zrekombinowany świński lub zmodyfikowany świński czynnik VIII może być podany przez przeszczep komórek przekształconych genetycznie dla wytwarzania białka, przez wszczepienie urządzenia zawierającego takie komórki, jak to opisano powyżej.

W korzystnej postaci kompozycje farmaceutyczne zrekombinowanego ś wiń skiego lub samego zmodyfikowanego świńskiego czynnika VIII lub w kombinacji z czynnikami stabilizującymi, nośnikami dostarczającymi i/lub nośnikami są wprowadzone przez wlewkę donaczyniowo do pacjenta, zgodnie z tą samą procedurą , która jest uż yta dla wlewki ludzkiego lub zwierzę cego czynnika VIII.

Lecznicze dawki zrekombinowanego świńskiego lub zmodyfikowanego świńskiego czynnika VIII w kompozycji, która musi być podana potrzebują cemu tego pacjentowi, b ę d ą róż nił y się zależ nie od ostrości niedoboru czynnika VIII. Ogólnie, poziom dawki jest dostosowany w częstości, czasie podawania i liczbie jednostek zgodnie z ostrością i długością czasu krwawienia u każdego pacjenta. Zgodnie z tym czynnik VIII jest uwzględniony w farmaceutycznie akceptowalnym nośniku, nośniku dla dostarczenia lub substancji stabilizującej w ilości wystarczającej dla dostarczenia pacjentowi leczniczo skutecznej ilości białka dla zatrzymania krwawienia, co jest zmierzone typowymi oznaczeniami krzepnięcia.

Czynnik VIII jest klasycznie określony jako substancja występująca w normalnej surowicy krwi, która poprawia defekt krzepnięcia surowicy pochodzącej od osobników z hemofilią typu A. Powodująca krzepnięcie aktywność in vitro oczyszczonych i częściowo oczyszczonych postaci czynnika VIII jest

PL 202 936 B1 użyta dla obliczenia dawki czynnika VIII dla wlewki pacjentom będącym ludźmi i jako wiarygodny wskaźnik aktywności odtworzonej w surowicy pacjenta i naprawy defektu powodującego krwawienie in vivo. Nie donoszono o rozbieżności pomiędzy typowym oznaczeniem nowych cząsteczek czynnika VIII in vitro i ich zachowaniu w modelu wlewki u psa lub pacjenta będącego człowiekiem zgodnie z Lusher, J.M. i wsp., 328 New Engl. J. Med. 328:453-459; Pittman D.D. i wsp., (1992) Blood 79:389-397 i Bringhouse i wsp., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:8752-8755.

Zazwyczaj, pożądany poziom aktywności czynnika VIII z surowicy, który powinien być osiągnięty u pacjenta przez podanie zrekombinowanego świńskiego lub zmodyfikowanego i świńskiego czynnika VIII mieści się w zakresie 30-100% normalnego. W korzystnej postaci podania leczniczego czynnika VIII kompozycja jest podana donaczyniowo w korzystnej dawce w zakresie od około 5 do 50 jednostek/kg wagi ciała, korzystniej w zakresie 10-50 jednostek/kg wagi ciała i najkorzystniej w zakresie dawki 20-40 jednostek wagi ciała; z częstością co około 8 do 24 godzin (u pacjentów z ostrą hemofilią) przy leczeniu trwającym w dniach w zakresie od 1 do 10 dni lub do zaniku przypadku krwawienia. Patrz np. Roberts, H.R. i M.R. Jones, „Haemophilia and Related Conditions - Congenitial Deficiencies of Prothrombin (Factor II, Factor V and Factors VII to XII)” Ch. 153, 1453-1474, 1460 w Haematology, Williams, W.J. i wsp., wyd. (1990). Pacjenci z inhibitorami mogą wymagać innych ilości zrekombinowanego świńskiego lub zmodyfikowanego świńskiego czynnika VIII niż ich wcześniejsze postaci czynnika VIII. Przykładowo, pacjenci mogą wymagać mniej zrekombinowanego świńskiego lub zmodyfikowanego świńskiego czynnika VIII z uwagi na ich wyższą aktywność specyficzną niż ludzkiego czynnika VIII i zmniejszonej reaktywności z przeciwciałem. Tak jak w leczeniu ludzkim lub pochodzącym ze świńskiej surowicy czynnikiem VIII ilość wprowadzonego przy pomocy wlewki czynnika VIII jest określona przez jedno etapowe oznaczenie krzepnięcia zależnego od czynnika VIII i w wybranej postaci in vivo odtwarzanie jest określone przez pomiar czynnika VIII w surowicy pacjentów po wlewce. Powinno być zrozumiałe, że dla każdej szczególnej jednostki ustalony powinien być specyficzny reżim dawkowania w czasie zgodny z indywidualnymi potrzebami, profesjonalną oceną osoby podającej i nadzorującej podawanie kompozycji i że zakres stężeń, które tu podano jest jedynie przykładowy i nie jest pomyślany dla ograniczania zakresu lub klinicznej praktyki wykorzystującej kompozycję.

Leczenie może przyjąć postać jednorazowego podania donaczyniowego kompozycji lub okresowego, lub ciągłego podawania przez dłuższy okres czasu gdy jest to wymagane. Alternatywnie, terapeutyczny czynnik VIII może być podany podskórnie lub doustnie z liposomami jako jedna lub kilka dawek, w różnych odstępach czasu. Zrekombinowane białko lub zmodyfikowany świński czynnik VIII może również być użyty dla leczenia niekontrolowanego krwawienia zależnego od niedoboru czynnika VIII u chorych na hemofilię, którzy wykształcili przeciwciała przeciw ludzkiemu czynnikowi VIII. W tym przypadku jest niezbędna aktywność powodująca krzepnię cie, która jest większa niż ludzkiego lub zwierzęcego czynnika VIII. Aktywność powodująca krzepnięcie, która jest mniejsza niż ludzkiego czynnika VIII (np. mniej niż 3000 jednostek/mg) będzie użyteczna jeśli aktywność ta nie jest zobojętniana przez przeciwciała w surowicy pacjenta.

Pokazano tu, że zrekombinowany świński i zmodyfikowany świński czynnik VIII może różnić się aktywnością specyficzną od ludzkiego czynnika VIII. Białka czynnika VIII o większej aktywności powodującej krzepnięcie niż ludzkiego czynnika VIII są użyteczne w leczeniu hemofilii bowiem mniejsze dawki będą wymagane dla naprawy niedoboru czynnika VIII u pacjenta. Czynnik VIII o niższej aktywności powodującej krzepnięcie niż ludzki czynnik VIII jest również użyteczny dla zastosowania leczniczego pod warunkiem, że posiada przynajmniej 1% specyficznej aktywności w porównaniu z normalnym ludzkim czynnikiem VIII. Czynnik VIII z niniejszego wynalazku posiadający aktywność powodującą krzepnięcie jest, co za tym idzie, określony jako posiadający przynajmniej 1% aktywności specyficznej ludzkiego czynnika VIII.

Zrekombinowana świńska lub zmodyfikowana świńska cząsteczka czynnika VIII i sposoby dla izolowania, charakteryzowania, sporządzania i używania, które ogólnie opisano powyżej będą lepiej zrozumiane w odniesieniu do poniższych, nie ograniczających przykładów.

P r z y k ł a d 1: Oznaczenie ś wiń skiego czynnika VIII i hybrydowego ludzko/ś wińskiego czynnika VIII.

Świński czynnik VIII posiada większą aktywność powodującą krzepnięcie krwi niż ludzki czynnik VIII, co opiera się na specyficznej aktywności cząsteczki. Wniosek ten wynika z zastosowania odpowiednich krzywych standardowych umożliwiających prawidłowe porównanie ludzkiego i świńskiego czynnika VIII. Oznaczenia krzepnięcia krwi opierają się na zdolności czynnika VIII do skracania czasu krzepPL 202 936 B1 nięcia surowicy pochodzącej od pacjenta z hemofilią A. Zastosowano dwa typy oznaczeń: jedno etapowe i dwu etapowe oznaczenie.

W jedno etapowym oznaczeniu 0,1 ml surowicy od osoby z hemofilią typu A (George King Biomedical, Inc.) inkubowano z 0,1 ml częściowo aktywowanego odczynnika tromboplastyny (APTT) (Organon Teknika) i 0,01 ml próbki lub standardu zawierającego rozcieńczoną, poddaną działaniu cytrynianu normalną ludzką surowicę przez 5 min. w 37°C w łaźni wodnej. Po inkubacji dodano 0,1 ml 20 mM CaCl2 i czas wykształcenia skrzepu określono przez obserwacje wzrokową.

Jednostka czynnika VIII jest określona jako ilość występująca w 1 ml normalnej ludzkiej surowicy poddanej działaniu cytrynianu. Stosując ludzką surowicę jako standard porównano bezpośrednio aktywność świńskiego i ludzkiego czynnika VIII. Rozcieńczenia standardowej surowicy lub oczyszczonych białek wykonano w 0,15 M NaCl, 0,02 M HEPES pH 7,4. Krzywą standardową sporządzono na podstawie trzech lub czterech rozcieńczeń surowicy, najwyższe rozcieńczenie począwszy od 1/50 i log10 czasu krzepnię cia odł o ż onym wzglę dem log10 stężenia surowicy, co daje liniowy wykres. Jednostki czynnika VIII w nieznanej próbce określono przez interpolowanie z krzywej standardowej.

Jedno etapowe oznaczenie ujawnia endogenna aktywację czynnika VIII przez aktywatory utworzone w surowicy osoby z hemofilią A, podczas gdy dwu etapowe oznaczenie mierzy aktywność powodującą krzepnięcie czynnika VIII przed aktywacją. W dwu etapowym oznaczeniu, próbki zawierające czynnik VIII, które reagowały z trombiną były dodane do częściowo aktywowanej tromboplastyny i ludzkiej surowicy od osoby z hemofilią typu B wcześ niej inkubowanej przez 5 minut w 37°C. Otrzymany czas krzepnięcia był następnie przekształcony w jednostki/ml na podstawie opisanej powyżej krzywej standardowej dla człowieka. Aktywność względna w oznaczeniu dwu etapowym była wyższa niż w oznaczeniu jedno etapowym ponieważ czynnik VIII był preaktywowany.

P r z y k ł a d 2: Charakteryzowanie róż nic funkcjonalnych pomiędzy ludzkim a ś wińskim czynnikiem VIII.

Izolowanie świńskiego i ludzkiego czynnika VIII pochodzącego z surowicy i ludzkiego zrekombinowanego czynnika VIII opisano w literaturze przez Fulcher, CA. i wsp., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 1648-1652; Toole i wsp., (1984) Nature 312:342-347 (Genetics Institute); Gitschier i wsp., (1984) Nature 312:326-330 (Genentech); Fass i wsp., (1982) Blood 59:594; Toole i wsp., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5939-5942. Może być to osiągnięte różnymi sposobami. Wszystkie te preparaty są podobne pod względem kompozycji podjednostki, choć istnieje funkcjonalna różnica w stabilności pomiędzy ludzkim i świńskim czynnikiem VIII.

Dla porównania ludzkiego zrekombinowanego i świńskiego czynnika VIII, preparaty wysoko oczyszczonego ludzkiego zrekombinowanego czynnika VIII (Cutter Laboratories, Berkeley, CA) i ś wińskiego czynnika VIII [oczyszczonego immunologicznie jak opisali Fass i wsp., (1982) Blood 59:594] poddano wysoko ciśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC) przez Mono Q™ (Pharmacia LKB, Piscataway, NJ) kolumnę jonowymienną (Pharmacia Inc.). Celem etapu HPLC na kolumnie Mono Q™ było wyeliminowanie mniejszych zanieczyszczeń i zamiana buforu, w którym znajdował się ludzki i świński czynnik VIII na ten sam bufor, dla porównania białek. Naczyńka zawierały 1000-2000 jednostek czynnika VIII, które zawieszano w 5 ml H2O. Następnie dodano HEPES (2 M o pH 7,4) do końcowego stężenia 0,02 M. Czynnik VIII naniesiono na kolumnę HR 5/5 z Mono Q™ zrównoważoną 0,15 M NaCl, 0,02 M HEPES, 5 mM CaCl2 o pH 7,4 (bufor A z 0,15 M NaCl); wypłukano 10 ml buforu A plus 0,15 M NaCl i wymyto 20 ml liniowego gradientu 0,15 M do 0,90 M NaCl w buforze A przy szybkości przepływu 1 ml/min..

Dla porównania ludzkiego, pochodzącego z surowicy czynnika VIII (oczyszczony przez HPLC na Mono Q™) i świńskiego czynnika VIII oczyszczonego przez powinowactwo immunologiczne, świński czynnik VIII pochodzący z surowicy był rozcieńczony 1:4 razy 0,04 M HEPES, 5 mM CaCl2, 0,01% Tween-80 o pH 7,4 i poddany HPLC na Mono Q™ w tych samych warunkach jakie opisano w poprzednim paragrafie dla ludzkiego czynnika VIII. Procedury te dla izolowania ludzkiego i świńskiego czynnika VIII są typowe dla biegłych naukowców.

Frakcje z kolumny oznaczono z uwagi na aktywność czynnika VIII w jedno etapowym oznaczeniu krzepnięcia krwi. Średnie wyniki oznaczeń wyrażone w jednostkach aktywności na A280 materiału podano w Tabeli II wykazuje, że świński czynnik VIII posiada przynajmniej sześciokrotnie większą aktywność niż ludzki czynnik VIII gdy użyto oznaczenia jedno etapowego.

PL 202 936 B1

T a b e l a II

Porównanie aktywności koagulacyjnej ludzkiego i świńskiego czynnika VIII.

Aktywność (jednostka/A280)

Świński

Ludzki z surowicy

Ludzki zrekombinowany

21,300

3600

2400

P r z y k ł a d 3: Porównanie stabilności ludzkiego i świńskiego czynnika VIII.

Wyniki jedno etapowego oznaczenia czynnika VIII oddają aktywowanie czynnika VIII przez czynnik VIIIa w próbce i możliwą utratę podstawowej aktywności czynnika VIIIa. Przeprowadzono bezpośrednie porównanie stabilności ludzkiego i świńskiego czynnika VIII. Próbki z Mono Q™ HPLC (Pharmacia, Inc., Piscataway, N.J.) rozcieńczono do tego samego stężenia i kompozycji buforu i przeprowadzono reakcję z trombiną. Po różnym czasie próbki pobrano dla dwu etapowego oznaczenia koagulacji. Zazwyczaj, maksimum aktywności (w 2 min.) było dziesięć razy większe w przypadku świńskiego niż ludzkiego czynnika VIIIa i aktywacja obydwu, świńskiego i ludzkiego czynnika VIIIa ulegała następnie zmniejszeniu, gdzie aktywność ludzkiego czynnika VIIIa zmniejszała się bardziej gwałtownie.

Ogólnie, próby wyizolowania stabilnego ludzkiego czynnika VIIIa nie zakończyły się powodzeniem nawet gdy zastosowano warunki, w których wytwarzano stabilny świński czynnik VIIIa. Dla pokazania, że oczyszczony przez Mono Q™ HPLC ludzki czynnik VIII był aktywowany trombiną i poddany kationowej wymianie przez HPLC na kolumnie Mono S™ (Pharmacia, Inc.) w warunkach, w których otrzymano stabilny świński czynnik VIIIa jak to opisali Lollar i wsp. (1989) Biochemistry 28:666.

Ludzki czynnik VIII, 43 pg/ml (0,2 μΜ) w 0,2 M NaCl, 0,01 M Hepes, 2,5 mM CaCl₂ o pH 7,4 w 10 ml końcowej objętości reagował z trombiną (0,036 pM) przez 10 min., w którym to czasie dodano ketonu FPR-CH₂CI D-fenylo-proilo-arginilo-chlorometylowego do stężenia 0,2 pM dla nieodwracalnej inaktywacji trombiny. Następnie mieszaninę rozcieńczono 1:1 40 mM 2-(N-morfolino)etano kwasem sulfonowym (MES), 5 mM CaCl2 o pH 6,0 i naniesiono na kolumnę Mono-S™ HR 5/5 HPLC (Pharmacia, Inc.) przy przepływie 2 ml/min. zrównoważonej 5 mM MES, 5 mM CaCl2 o pH 6,0 (bufor B) plus 0,1 M NaCl. Czynnik VIIIa był wymywany bez płukania kolumny 20 ml gradientu od 0,1 M NaCl do 0,9 M NaCl w buforze B przy przepływie 1 ml/min.

Frakcje o aktywności powodującej krzepnięcie w dwu etapowym oznaczeniu były wymywane w tych warunkach jako jedna frakcja. Specyficzna aktywność tej frakcji wynosiła około 7,500 U/A280. Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym z solą sodową siarczanu dodecylu (SDS-PAGE) frakcji z kolumny Mono S™ zawierającego czynnik VIIIa, a następnie barwienie białek srebrem, ujawniło dwa pasma odpowiadające heterodimerowej (A3-C1-C2/A1) pochodnej czynnika VIII. Choć fragment A2 nie był zidentyfikowany w tych warunkach przez barwienie srebrem, z uwagi na jego niskie stężenie, został zidentyfikowany jako śladowy składnik przez znakowanie ¹²⁵I.

W przeciwieństwie do wyników z ludzkim czynnikiem VIII, świński czynnik VIIIa wyizolowany przy pomocy Mono S™ HPLC, w tych samych warunkach posiadał specyficzną aktywność 1,6 x 10⁶ U/A280. Analiza świńskiego czynnika VIIIa przez SDS-PAGE ujawniła trzy fragmenty odpowiadające podjednostkom A1, A2 A3-C1-C2 dowodząc, że świński czynnik VIIIa posiada trzy podjednostki.

Wyniki HPLC na Mono S^TM ludzkiego aktywowanego trombiną czynnika VIII w pH 6,0 wykazują, że ludzki czynnik VIIIa jest niestabilny w warunkach, w których stabilny jest świński czynnik VIIIa. Jednakowoż, choć śladowe ilości fragmentu A2 zidentyfikowano w głównej frakcji, określenie czy aktywność powodująca krzepnięcie krwi wynika z małych ilości heterodimerowego czynnika VIIIa lub z heterodimerowego czynnika VIIIa, który ma niską aktywność specyficzną, było niemożliwym do rozstrzygnięcia jedynie tym sposobem.

Pożądanym dla uzyskania odpowiedzi na to pytanie jest sposób izolacji ludzkiego czynnika VIIIa zanim utraci on podjednostkę A2. Ostatecznie, izolacja została osiągnięta dzięki procedurze wymagającej obniżenia pH buforu dla Mono S™ do pH 5,0. Oczyszczony przez Mono Q™ ludzki czynnik VIII (0,5 mg) był rozcieńczony H2O dając ostateczną kompozycję zawierającą 0,25 mg/ml (1 pM) czynnik VIII w 0,25 M NaCl, 0,01 M Hepes, 2,5 mM CaCl2, 0,005% Tween-80 o pH 7,4 (całkowita objętość 7,0 ml). Trombinę dodano do końcowego stężenia 0,072 pM pozwalając zachodzić reakcji przez 3 min.. Następnie trombinę inaktywowano FPR-CH2CI (0,2 pM). Następnie mieszanina była rozcieńczona 1:1 40 mM octanem sodu, 5 mM CaCl2, 0,01% Tween-80 o pH 5,0 i naniesiona przy przepływie 2 ml/min. na kolumnę Mono S™ HR 5/5 do HPLC zrównoważonej 0,01 M octanem sodu, 5 mM CaCl2,

PL 202 936 B1

0,01 Tween-80 o pH 5,0 plus 0,1 M NaCl. Czynnik VIIIa był wymyty bez płukania kolumny 20 ml gradientu od 0,1 M NaCl do 1,0 M NaCl w tym samym buforze przy przepływie 1 ml/min. Wynikiem tego było odzyskanie powodującej krzepnięcie aktywności w głównej frakcji, która zawierała wykrywalne ilości fragmentu A2 co pokazano przez SDS-PAGE i barwienie srebrem. Aktywność specyficzna głównej frakcji była dziesięciokrotnie wyższa niż ta odzyskiwana przy pH 6,0 (75,000 U/A280 versus 7,500 U/A280). Jednakowoż, w przeciwieństwie do świńskiego czynnika VIIIa wyizolowanego przy pH 6,0, który jest nieograniczenie stabilny w 4°C, aktywność ludzkiego czynnika VIIIa zmniejsza się w sposób stały przez kilka godzin po wymyciu z Mono S^TM. Ponadto, specyficzna aktywność czynnika VIIIa, oczyszczonego przy pH 5,0 i oznaczonego niezwłocznie, stanowi jedynie 5% aktywności świńskiego czynnika VIIIa, co wykazuje że istotna dysocjacja zachodzi przed oznaczeniem.

Wyniki te dowodzą, że zarówno ludzki jak i świński czynnik Vllla są zbudowane z trzech podjednostek (A1, A2 A3-C1-C2). Dysocjacja podjednostki A2 jest odpowiedzialna za utratę aktywności, w określonych warunkach, takich jak fizjologiczna siła jonowa, pH i stężenie ludzkiego i świńskiego czynnika Vllla. Świński czynnik Vllla jest względnie stabilny w określonych warunkach z uwagi na jego silniejsze związania z podjednostką A2.

P r z y k ł a d 4: Izolacja i oznaczenie sekwencji DNA kodującej domenę A2 świńskiego czynnika Vlll.

Jedynie sekwencja nukleotydowa kodująca domenę B i część domeny A świńskiego czynnika Vlll została wcześnie zsekwencjonowana [Toole i wsp., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:59395942]. cDNA i wydedukowane sekwencje aminokwasowe (odpowiednio SEQ ID NO: 3 i 4) i cała domena A2 świńskiego czynnika Vlll zostały tu ujawnione. Świńska domena A2 czynnika Vlll została sklonowana przez odwrotną transkrypcję całkowitego RNA ze śledziony świni i amplifikację PCR; użyto zdegenerowanych starterów opartych na znanej sekwencji cDNA ludzkiego czynnika Vlll i dokładny starter dla świńskiego DNA częściowo oparty na sekwencji świńskiego czynnika Vlll. Produkt PCR o wielkości 1 tys. par zasad został wyizolowany i namnożony przez wbudowanie do fagemidowego wektora Bluescript™ (Stratagene). Ustalono pełną sekwencję nukleotydową kodującą świńską domenę A2 przy pomocy analizy sekwencji metodą dideoksy. cDNA i wydedukowane sekwencje aminokwasowe są opisane odpowiednio jako SEQ ID NO: 3 i 4.

P r z y k ł a d 5: Pełna sekwencja DNA kodująca świński czynnik VIII.

Fragment Klenow'a polimerazy I, ufosforylowane łączniki Clal, łączniki Notl, T4 ligaza i Taq DNA polimeraza pochodziły z Promega (Madison, Wisconsin). Kinazę polinukleotydową otrzymano z Life Technologies Inc., Gaithersburg, Maryland. y³²P-ATP (Redivue, >5000 Ci/mmol) został dostarczony z Amersham. pBluescript II KS- i komórki E. coli Epicurean XL1-Blue otrzymano z Stratagene (La Jolla, Kalifornia). Syntetyczne oligonukleotydy otrzymano z Life Technologies, Inc. lub Cruahem, Inc. 5' ufosforylowane startery użyto gdy produktu PCR wytwarzano dla klonowania. Numeracja nukleotydów (nt) z oligonukleotydów użytych jako startery dla amplifikacji przez polimerazową reakcję łańcuchową (PCR) cDNA dla świńskiego f8 lub genomowego DNA wykorzystują jako odniesienie ludzki f8 cDNA (Wood i wsp. (1984) powyżej).

Świński, całkowity RNA ze śledziony został wyizolowany przez ekstrakcję rodankiem guanidyny-fenolem-chloroformem [Chomczynski i wsp. (1987) Anal. Biochem. 162:156-159]. Świński cDNA przygotowano na matrycy całkowitego RNA ze śledziony przy pomocy odwrotnej transkryptazy (RT) z wirusa Maloney'a mysiej białaczki i losowych heksamerów dla zapoczątkowania reakcji (First-Strand cDNA Synthesis Kit, Pharmacia Biotech) chyba, że podane jest inaczej. Reakcje RT zawierają 45 mM Tris-Cl, pH 8,3, 68 mM KCl, 15 mM DTT, 9 mM MgCl2, 0,08 mg/ml albuminy z surowicy bydlęcej i 1,8 mM trójfosforanów deoksynukleotydu (dNTP). Świński genomowy DNA wyizolowano ze śledziony przy pomocy typowej procedury (Strauss, W.M. (1995) w Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel i wsp., wyd. John Willey & Sons, str. 2.2.1-2.2.3). Izolację DNA z żeli agarozowych przeprowadzono przy pomocy Geneclean II (Bio 101) lub Quiex II Gel Extraction Kit (Qiagen).

Reakcje PCR przeprowadzono przy pomocy termocyklera Hybaid OmniGene. Reakcje PCR wykorzystywały Taq DNA polimerazę, reakcje zawierały 0,6 mM MgCl₂, 0,2 mM dNTPs, 0,5 μM starterów oligonukleotydowych, 50 U/ml polimerazy i 0,1 objętości mieszaniny reakcyjnej z syntezy pierwszej nici cDNA. Z wyjątkiem sytuacji kiedy podano to inaczej, produkty PCR oczyszczano w żelu, tępiono fragmentem Klenow'a i wytrącano etanolem, a następnie łączono przy pomocy ligazy z miejscem EcoRV zdefosforylowanego wektora pBluescript II KS- lub wbudowano przy pomocy ligazy z ufosforylowanymi łącznikami Clal, stosując ligazę T4, strawione Clal, oczyszczone przez chromatografie na Sephacryl S400 i wbudowane przy pomocy ligazy T4 do przeciętego Clal, zdefosforylowane14

PL 202 936 B1 go wektora pBluescript II KS-. Reakcję ligazy przeprowadzono stosując T4 DNA ligazę (Rapid DNA ligation kit, Boehringer Mannheim) chyba, że podano inaczej. Zawierające wstawki plazmidy pBluescript II KS- użyto dla transformacji komórek E. coli Epicurean XL1-Blue.

Ustalenie sekwencji nukleotydowej plazmidowego DNA wykonano stosując zautomatyzowany DNA sekwenser Applied Biosystems 373a i zestaw barwników terminacyjnych PRISM lub manualnie stosując zestaw dla sekwencjonowania Sequenase v.2.0 (Amersham Corporation). Bezpośrednie oznaczanie sekwencji nukleotydowej produktów PCR obejmujące znakowanie końców ³²P oligonukleotydów przeprowadzono stosując protokół dla sekwencjonowania cyklicznego (dsDNA Cycle Sequencing System, Life Technologies).

Izolacja klonów cDNA dla świńskiego fVIII zawierających sekwencje 5' UTR, peptyd sygnałowy i kodony domeny A1.

Świński cDNA fVIII 5' względem domeny A2 namnożono przez zagnieżdżony RT-PCR na matrycy całkowitego RNA ze śledziony maciory, stosując szybką amplifikację 5' końców cDNA (5'-RACE) (Marathon cDNA Amplification, Clontech, wersja PR55453). Obejmuje to syntezę pierwszej nici cDNA przy pomocy kotwiczonego startera oligo(dT) [Borson, N.D. i wsp. (1992) PCR Methods Appl. 2:144148], syntezę drugiej nici cDNA przy pomocy polimerazy I DNA z E. coli, łączenie przy pomocy ligazy z 5' wydłuż onym dwu niciowym adaptorem, SEQ ID NO: 5

5'-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CTC GAG CGG CCG CCC GGGCAGGT-3 3'-H2N-CCCGTCCA-PO4-5' którego krótsza nić została zablokowana na 3' końcu grupą aminową dla ograniczenia zapoczątkowania niespecyficznego PCR, a który jest komplementarny do ośmiu nukleotydów na 3' końcu (Siebert, P.D. i wsp., (1995) Nucleic Acids Res. 23:1087-1088). Pierwsza runda PCR została przeprowadzona przy pomocy specyficznego dla adaptora oligonukleotydu, SEQ ID NO: 6 5'-CCA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC-3' (oznaczonego jako AP1) jako starter do nici sensownej i oligonukleotydu specyficznego dla domeny A2 świńskiego fVlII SEQ ID NO: 7 5'-CCA TTG AC A TGA AGA CCG TTT CTC-3' (nukleotydy 2081-2104) jako starter do nici antysensownej. Drugą rundę PCR przeprowadzono przy pomocy oligonukleotydu specyficznego dla adaptora, SEQ ID NO: 8 5'-ACT CAC TAT AGG GCT CGA GCG GC-3' (oznaczonego jako AP2) jako starter do nici sensownej i zagnieżdżonego oligonukleotydu specyficznego dla świńskiej domeny A2 SEQ ID NO: 9 5'-GGG TGC AAA GCG CTG ACA TCA GTG-3' (nukleotydy 1497-1520) jako startera do nici antysensownej. PCR przeprowadzono przy pomocy komercyjnie dostępnego zestawu (Advantage cDNA PCR core kit), który wykorzystuje sposób inicjacji reakcji na gorąco zależny od przeciwciała [Kellogg, D.E. i wsp. (1994) BioTechniques 16:1134-1137]. Warunki PCR obejmują denaturację w 94°C przez 60 sek., a następnie przez 30 cykli (pierwszy PCR) lub 25 cykli (drugi PCR) denaturacja przez 30 sek. w 94°C, przyłączanie startera przez 30 sek. w 60°C i wydłużanie przez 4 min. w 68°C z wykorzystaniem sondy termicznej. Procedura ta daje główny produkt o wielkości około 1,6 tys. par zasad, co jest zgodne z amplifikacją fragmentu wydłużonego o około 150 par zasad na obszarze 5' UTR. Produkt PCR klonowano w pBluescript przy pomocy łączników Clal. Oznaczono sekwencję nukleotydowa wstawek czterech klonów dla obu nici.

Sekwencja tych klonów obejmuje 137 par zasad 5' UTR, sekwencję kodującą peptyd sygnałowy, domenę A1 i część domeny A2. Zgodność osiągnięto przynajmniej w trzech z czterech miejsc. Jednak, klony zawierały średnio cztery wygenerowane przez PCR mutacje, głównie ze względu na wiele rund PCR wymaganych dla wytworzenia możliwego dla sklonowania produktu. Tak więc, użyliśmy sekwencję otrzymaną z pojedynczego obszaru peptydu sygnałowego dla zaprojektowania ufosforylowanego startera dla PCR odpowiadającego nici sensownej; SEQ ID NO: 10 5'-CCT CTC GAG CCA CCA TGT CGA GCC ACC ATG CAG CTA GAG CTC TCC ACC TG-3', oznaczonego RENEOPIGSP dla syntezy kolejnego produktu PCR dla potwierdzenia sekwencji i dla klonowania do wektora ekspresyjnego. Sekwencja pogrubiona przedstawia kodon start. Sekwencja 5' z tej sekwencji przedstawia sekwencje identyczną z 5' miejscem wrekombinowania występującym w ssaczym wektorze ekspresyjnym ReNeo użytym dla ekspresji fVIII (Lubin i wsp. (1994) powyżej). Miejsce to zawiera miejsce cięcia dla XhoI (podkreślone). RENEOPIGSP i oligonukleotyd 1497-1520 były użyte jako startery dla reakcji PCR prowadzonej przez Taq DNA polimerazę wykorzystującą jako matrycę cDNA dla śledziony maciory. Użycie polimeraz DNA pochodzących od szeregu innych producentów nie daje wykrywalnego produktu. Warunki PCR obejmują denaturację w 94°C przez 4 min., a następnie 35 cykli denaturacji przez 1 min. w 94°C, przyłączania przez 2 min. w 55°C i wydłużania przez 2 min. w 72°C, a następnie końcowy etap wydłużania przez 5 min. w 72°C. Produkt PCR sklonowano

PL 202 936 B1 w pBluescript stosują c startery Clal. Wstawki z dwóch z tych klonów sekwencjonowano w obu kierunkach i dopasowano do sekwencji najwyższej zgodności.

Izolacja klonów cDNA świńskiego fVIII A3, C1 i 5' połowy kodonów domeny C2.

Początkowo sklonowano dwa produkty RT-PCR dla świńskiej śledziony odpowiadające fragmentowi domeny B-A3 (nukleotydy 4519-5571) i fragmenty domeny C1-C2 (nukleotydy 6405-6990). 3' koniec domeny C2, które otrzymano ciągną się do obszaru egzonu 26, który jest końcowym egzonem w fVIII. Produkt B-A3 został otrzymany przy pomocy startera specyficznego dla świńskiej domeny

B, SEQ ID NO: 11 5' CGC GCG GCC GCG CAT CTG GCA AAG CTG AGT T 3' gdzie podkreślony obszar odpowiada rejonowi w świńskim fVIII zgodnym z nukleotydami 4519-4530 w ludzkim fVIII. Obszar 5' oligonukleotydu obejmuje miejsce Notl, które zostało oryginalnie pomyślane dla celów klonowania. Starter do nici antysensownej użyty dla wytworzenia produktu B-A3, SEQ ID NO: 12 5'-GAA ATA AGC CCA GGC TTT GCA GTC RAA-3', odpowiadał odwrotnej i komplementarnej sekwencji do sekwencji cDNA dla ludzkiego fVlII nukleotydy 5545-5571. Reakcja PCR zawierała 50 mM KCl, 10 mM Tris-Cl, pH 9,0, 0,1% Triton X-100, 1,5 mM MgCl₂, 2,5 mM dNTP, 20 μM starterów, 25 jednostek/ml Taq DNA polimerazy i 1/20 objętości mieszaniny reakcyjnej dla RT. Warunki denaturacji były następujące 94°C przez 3 min., następnie 30 cykli, denaturacja przez 1 min. w 94°C, przyłączanie startera przez 2 min. w 50°C i wydłużanie przez 2 min. w 72°C. Produkty PCR były ufosforylowane przy pomocy T4 kinazy i dodano linkery Notl. Po przecięciu Notl fragmenty PCR klonowano w miejsce Notl BlueScript 11 KS- i wprowadzono przez transformację do komórek XL1-blue.

Produkt C1-C2 został otrzymany przy pomocy znanej ludzkiej sekwencji cDNA dla syntezy starterów dla nici sensownej i antysensownej odpowiednio SEQ ID NO: 13 5'-AGG AAA TTC CAC TGG AAC CTT N-3' (nt 6405-6426) i SEQ ID NO: 14 5'-CTG GGG GTG AAT TCG AAG GTA GCG N-3' (odwrotny komplementarny nt 6966-6990). Warunki PCR były identyczne do tych, które użyto dla wytworzenia produktu B-A2. Otrzymany fragment wbudowano przy pomocy ligazy do wektora dla klonowania pNOT przy pomocy Prime PCR Cloner Cloning System (5 Prime-3 Prime, Inc., Boulder, Kolorado) i hodowano w komórkach JM 109.

Plazmidy B-A3 i C1-C2 były częściowo sekwencjonowane dla przygotowania specyficznych dla świni nukleotydów dla nici sensownej i antysensownej, odpowiednio SEQ ID NO: 15 5'-GAG TTC ATC GGG AAG ACC TGT TG-3' (nt 4551-4573) i SEQ ID NO: 16 5'-ACA GCC CAT CAA CTC CAT GCG AAG-3' (nt 6541-6564). Oligonukleotydy te użyto jako startery dla wytworzenia produktu RT-PCR o wielkości 2013 par zasad przy pomocy zestawu Clontech Advantage cDNA PCR Kit. Produkt ten, który odpowiada ludzkim nukleotydom 4551-6564 obejmuje obszar odpowiadający lekkiemu łańcuchowi peptydu aktywującego (nukleotydy 5002-5124), domena A3 (nukleotydy 5125-6114) i większość domeny C1 (nukleotydy 6115-6573). Sekwencja klonu C1-C2 określiła, że ludzki i świński cDNA od nukleotydu 6565 do 3' końca sekwencji kodującej domenę C1 były identyczne. Produkt PCR sklonowany w miejscu EcoRV pBluescript 11 KS-. Ustalono pełną sekwencję nukleotydową dla obu nici czterech klonów. Zgodność uzyskano w przynajmniej w trzech na cztery miejsca.

Izolacja klonów cDNA dla świńskiego fVIII zawierającego kodony 3' połowy domeny C2.

Domena C2 ludzkiego fVIII (nukleotydy 6574-7053) jest zawarta w egzonach 24-26 [Gitshier J. i wsp. (1984) Nature 312:326-330]. Ludzki egzon 26 zawiera 1958 par zasad odpowiadających nukleotydom 6901-8858. Obejmuje on 1478 par zasad 3' nie ulegającej translacji sekwencji. Dla sklonowania cDNA egzonu 26 odpowiadającego 3' końcowej sekwencji dla domeny C2 i 3' UTR przez 3' RACE [Siebert i wsp. (1995) powyżej] odwrotny PCR [Ochman, H. i wsp. (1990) Biotechnology (N.Y.) 8:759760], miejsce restrykcyjne PCR [Sarkar, G. i wsp. (1993) PCR Meth. Appl. 2:318-322], „nie przewidywalnie inicjowany PCR” [Dominguez, O. i wsp. (1994) Nucleic Acids Res. 22:3247-3248] i przez przeszukiwanie bibliotek cDNA dla świńskiej wątroby zakończyły się niepowodzeniem. Podjęto próbę 3' RACE przy pomocy tej samej biblioteki dwu niciowego cDNA z przyłączonym adaptorem, która była z powodzeniem użyta dla sklonowania 5' końca świńskiego cDNA dla fVIII. Co za tym idzie niepowodzenie tego sposobu nie było spowodowane brakiem cDNA odpowiadającego egzonowi 26.

Procedura kroczenia przez PCR do docelowego genu [Parker J.D. i wsp. (1991) Nucleic Acid Res. 19:3055-3060] została użyta dla sklonowania sekwencji odpowiadającej 3' połowie domeny C2. Specyficzny dla świni starter dla nici sensownej SEQ ID NO: 17 5'-TCAGGGCAATCAGGACTCC-3' (nt 6904-6924) została zsekwencjonowana na podstawie wyjściowej sekwencji domeny C2 i została użyta w reakcji PCR z niespecyficznymi starterami dla „spaceru” wybranych spośród oligonukleotydów dostępnych w laboratorium. Następnie produkty PCR były porządkowane przez analizę wydłużania startera [Parker i wsp. (1991) BioTechniques 10:94-101] przy pomocy wyznakowanego ³²P na końcu spe16

PL 202 936 B1 cyficznego dla świni wewnętrznego startera, SEQ ID NO: 18 5'-CCGTGGTGAACGCTCTGGACC-3' (nt 6932-6952). Co interesujące, z czterdziestu niespecyficznych, badanych starterów jedynie dwa dały pozytywne produkty w analizie wydłużenia startera i one odpowiadają dokładnej i zdegenerowanej ludzkiej sekwencji na 3' końcu domeny C2: SEQ ID NO: 19 5'-GTAGAGGTCCTGTGCCTCGCAGCC-3' (nt 7030-7053) i SEQ ID NO: 20 5'-GTAGAGSTSCTGKGCCTCRCAKCCYAG-3' (nt 7027-7053). Startery te wyjściowo zostały zaprojektowane aby dać produkt przez tradycyjny RT-PCR, lecz nie dały dostatecznie dużo produktu, który mógłby być uwidoczniony przez wiązanie bromku etydyny. Jednakowoż, produkt PCR mógł być zidentyfikowany przez bardziej czuły sposób wydłużania startera. Produkt ten został oczyszczony w żelu i bezpośrednio określono jego sekwencję nukleotydowa. Rozszerza to sekwencję świńskiego 3' końca fVIII do nukleotydu 7026.

Dodatkowa sekwencja została uzyskana przez analizę wydłużania startera zagnieżdżonego produktu PCR wytworzonego przy pomocy biblioteki dwuniciowego cDNA z dołączonym adaptorem użytej w opisanym wcześniej protokole 5'-RACE. W pierwszej rundzie reakcji użyto dokładnego startera dla świni SEQ ID NO: 21 5'-CTTCGCATGGAGTTGATGGGCTGT-3' (nt 6541-6564) i startera AP1. W drugiej rundzie reakcji uż yto startera SEQ ID NO: 22 5'-AATCAGGACTCCTCCACCCCCG-3' (nt 6913-6934) i startera AP2. Bezpośrednie sekwencjonowanie produktu PCR wydłuża 3' sekwencję do końca domeny C2 (nt 7053). Sekwencja dla domeny C2 była unikalna z wyjątkiem nukleotydu 7045 w pobliż u 3' koń ca sekwencji dla domeny C2. Analiza powtórzonych reakcji daje zarówno A, G lub podwójny odczyt w miejscu A/G.

Analizę sekwencji rozszerzono na obszar 3' UTR przy pomocy dwóch dodatkowych starterów SEQ ID NO: 23 5'-GGA TCC ACC CCA CGA GCT GG-3' (nt 6977-6996) i SEQ ID NO: 24 5'-CGC CCT GAG GCT GCA GGT TCT AGG-3' (nt 7008-7031). Otrzymano około 15 par zasad z sekwencji 3' UTR, choć sekwencja była niejasna w kilku miejscach. Następnie zsyntetyzowano kilka starterów dla nici antysensownej opierając się na najlepszym określeniu 3' sekwencji nie ulegającej translacji. Startery te obejmują odwrotny komplementarny do kodonu stop TGA znajdującego się na jej 3' końcu. Produkty PCR uzyskano zarówno ze świńskiego genomowego DNA śledziony jak i świńskiego cDNA ze śledziony, który uwidoczniono przez elektroforezę w żelu agarozowym i barwienie bromkiem etydyny przy pomocy specyficznego startera dla nici sensownej SEQ ID NO: 25 5'-AAT CAG GAC TCC TCC ACC CCC G-3' (nt 6913-6934) i startera dla antysensownej nici 3' UTR, SEQ ID NO: 26 5'-CCTTGCAGGAATTCGATTCA-3'. Dla uzyskania materiału o jakości wystarczającej dla klonowania przeprowadzono drugą rundę PCR wykorzystując zagnieżdżony starter dla nici sensownej SEQ ID NO: 27 5'-CCGTGGTGAACGCTCTGGACC-3' (nt 6932-6952) i tego samego startera dla nici antysensownej. Produkt PCR o długości 141 par zasad sklonowano w miejscu EcoRV pBluescript II KS-. Sekwencje trzech klonów pochodzące z genomowego DNA i trzech klonów z cDNA otrzymano dla obu nici. Niedwuznaczne, z wyjątkiem nt 7045 gdzie w genomowym DNA zawsze występował A, a w cDNA zawsze G.

Przyrównanie wielu sekwencji DNA z człowieka, świni i myszy dla fVIII (Fig. 1A-1H).

Przyrównania pojedynczego peptydu obszarów A1, A2, A3, C1 i C2 przeprowadzono używając programu CLUSTAL [Thompson, J.D. i wsp. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680]. Kary za otwarcie luki i wydłużenie luki wynosiły odpowiednio 10 i 0,05. Przyrównania ludzkiej, mysiej i świńskich domen B opisano wcześniej [Elder i wsp. (1993) powyżej]. Ludzka sekwencja A2 odpowiada aminokwasom 373-740 w SEQ ID NO: 2. Świńska sekwencja aminokwasowa A2 jest podana jako SEQ ID NO: 4 i mysia sekwencja aminokwasowa domeny A2 jest podana jako SEQ ID NO: 28, aminokwasy 392-759.

P r z y k ł a d 6: Ekspresja aktywnego, zrekombinowanego, pozbawionego domeny B świńskiego czynnika VIII (PB^-).

Materiały.

Poddane działaniu cytrynianu ludzkie zbiorcze surowice normalna i pochodząca od chorego na hemofilię były otrzymane z George King Biomedical, Inc.. Bydlęca surowica płodowa, genetycyna, penicylina, streptomycyna, pożywka DMEM/F12 i pożywka AIM-V były otrzymane z Life Technologies Inc., Taq DNA polimeraza była otrzymana z Promega. Polimeraza DNA Vent była otrzymana z New England Biolabs. Polimeraza DNA Pfu i fagemid pBlueScript II KS^- była otrzymana ze Stratagene. Syntetyczne oligonukleotydy otrzymano z Life Technologies lub Cruachem, Inc.. Enzymy restrykcyjne otrzymano z New England Biolabs lub Promega. 5'-ufosforylowane startery użyto gdy produkty PCR były wytworzone dla klonowania. Numeracja nukleotydów (nt) w oligonukleotydach użytych jako startery dla polimerazowej reakcji łańcuchowej (PCR) dla świńskiego cDNA dla fVIII lub genomowego

PL 202 936 B1

DNA wykorzystuje ludzki cDNA fVIII jako odniesienie [Wood i wsp. (1984) Nature 312:330-337]. Wektor ekspresyjny dla fVIII, oznaczony HB^-/ReNeo uzyskano z Biogen, Inc. HB^-/ReNeo zawierał geny odporności na ampicylinę i genetycynę i ludzki cDNA dla fVIII, który utracił całą domenę B, zdefiniowaną jako Ser 741-Arg 1648 fragment wytwarzany przez cięcie trombiną. Prosta mutageneza cDNA dla domeny C2 fVIII, która znajduje się na 3' końcu wstawki fVIII w ReNeo w miejscu Notl wprowadziła dwie zasady na 3' końcu względem kodonu stop w HB^-/ReNeo przez mutagenezę ze składaniem na zakładkę (SOE) [Horton, R.M. i wsp. (1993) Methods Enzymol. 217:270-279]. Konstrukt ten oznaczono HB^-/ReNeo/Notl.

Całkowity RNA wyizolowano przy pomocy ekstrakcji rodankiem guanidyny-fenolemchloroformem [Chomczynski, P. i wsp. (1987) Anal. Blochem. 162:156-159]. cDNA zsyntetyzowano na matrycy mRNA stosując odwrotną transkryptazę (RT) z mysiego wirusa Maloney'a białaczki i losowe heksamery, zgodnie z instrukcją załączoną przez producenta (First-Strand cDNA Synthesis Kit, Pharmacia Biotech). Plazmidowy DNA oczyszczono przy pomocy Qiagen Plazmid Maxi Kit (Qiagen, Inc.). Reakcje PCR przeprowadzono przy pomocy termocyklera Hybaid OmniGene stosując polimerazy Taq, Vent lub Pfu. Produkty PCR oczyszczono w żelu, wtrącono etanolem i wbudowano przy pomocy ligazy DNA T4 do plazmidu (Rapid DNA ligation kit, Boehringer Mannheim). Plazmidy zawierające wstawki użyto dla transformacji komórek E. coli Epicurean XL1-Blue. Wszystkie nowe sekwencje DNA dla fVIII wytworzone przez PCR potwierdzono przez oznaczenie sekwencji nukleotydowej metodą dideoksy stosując automatyczny sekwenser DNA Applied Biosystems 373a i zestaw barwników terminacyjnych PRISM.

Konstrukcja hybrydowego wektora ekspresyjnego fVIII, HP20, zawierającego świńską domenę C2.

Świński cDNA dla fVlll odpowiadający 3' końcowi sekwencji kodującej domenę C1 i całej domenie C2 sklonowano również w pBluescript przez RT-PCR na matrycy całkowitego RNA ze śledziony stosując startery oparte na znanej sekwencji cDNA świńskiego fVlIl [Healey, J.F. i wsp. (1996) Blood 88:4209-4214]. Konstrukt i HB^-/ReNeo użyto jako matryc dla konstrukcji produktu fuzyjnego ludzki C1-świński C2 w pBluescript przez mutagenezę SOE. Fragment C1-C2 w plazmidzie został usunięty przy pomocy Apal i Notl i włączony przy pomocy ligazy do ciętego Apal/Notl HB^-/ReNeo/Notl co daje HP20/ReNeo/NotI.

Konstrukcja hybrydy ludzko/świńskiej fVlll z usuniętą domeną B zawierającej świński łańcuch lekki (HP18).

Ludzki łańcuch lekki fVlll zawiera reszty aminokwasowe Asp1649-Tyr2332. Odpowiadające mu nukleotydy w świńskim cDNA dla fVlIl zostały podstawione w tym obszarze HB^- dla wytworzenia hybrydy ludzko/świńskiej cząsteczki fVIII oznaczonej HP18. Dokonano tego przez podstawienie produktu PCR odpowiadającego świńskiemu obszarowi A2, domenie A3, domenie C1 i części domeny C2 odpowiadającym im obszarem HP20. Dla umożliwienia konstrukcji wprowadzono synonimowe miejsce Avrll do nukleotydu 2273 w miejscu połączenia domen A2 i A3 HP20 stosując mutagenezę SOE.

Konstrukcja hybryd ludzko/świńskich fVlll pozbawionych domeny B, zawierających świński peptyd sygnałowy, domenę A1 i domenę A2 (HP22)-.

Ludzki peptyd sygnałowy fVlll, domena A1 i domena A2 zawiera aminokwasy Met(-19)-Arg740. Odpowiednie nukleotydy w cDNA dla świńskiego fVlIl zostały podstawione w tym obszarze HB^- dla wytworzenia cząsteczki oznaczonej HP22. Ponadto, synonimowe miejsce AvrII zostało wprowadzone do nukleotydu 2273 w miejscu połączenia domen A2 i A3 z HP22 przez mutagenezę SOE. HP22 został skonstruowany przez fuzję świńskiego peptydu sygnałowego -A1- część fragmentu A2 w pBluescript [Healey i wsp. (1996) powyżej] z hybrydą pozbawioną domeny B ludzko/świńskiego fVIII zawierającego świńską domenę A2 oznaczoną HP1 [Lubin i wsp. (1994) powyżej].

Konstrukcja świńskiego pozbawionego domeny B fVlII-(PB^-).

Fragment Spl/Notl z HP18/BS (+AvrII) strawiono AvrII/NotI i wbudowano przy pomocy ligazy do strawionego AvrIl/NotI HP22/BS (+AvrII) dla wytworzenia konstruktu PB^-/BS (+AvrlI), który zawiera świński fVlll pozbawiony całej domeny B. PB- sklonowano w ReNeo przez łączenie przy pomocy ligazy fragmentu Xba/NotI z PB^-/BS (-1-Avrll) do HP22/ReNeo/NotI (+AvrII).

Ekspresja zrekombinowanych cząsteczek fVlll.

PB^-/ReNeo/Notl (+AvrII) i HP22/ReNeo/NotI (+AvrII) stransformowano przejściowo do komórek COS i wyrażono jak to wcześniej opisano [Lubin, l.M. i wsp. (1994) J. Biol. Chem. 269:8639-8641]. Próbki z HB^-/ReNeo/NotI i bez DNA (ślepa) wprowadzono przez transformację jako kontrolę.

Aktywność fVlll PB^-, HP22 i HB^- mierzono przy pomocy oznaczenia barwnego podanego poniżej. Próbki fVIll w nadsączu z hodowli komórek COS aktywowano 40 mM trombiny w 0,15 M NaCl,

PL 202 936 B1 mM HEPES, 5 mM CaCl2, 0,01% Tween 80 pH 7,4 w obecności 10 mM czynnika lXa, 425 mM czynnika X i 50 μΜ jednowarstwowej fosfatydyloseryno-fosfatydylocholiny (25/75 wag/wag) jako nośnika. Po 5 min. reakcję zatrzymywano stosując 0,05 M EDTA i 100 mM zrekombinowanej desulfohirudyny i otrzymany czynnik Xa mierzono oznaczeniem z substratem chromogenicznym. W oznaczeniu z substratem chromogenicznym dodano 0,4 mM Spectrozyme Xa i mierzono szybkość uwalniania para-nitroanilidu przez pomiar absorbancji roztworu przy 450 nm.

Wyniki niezależnie stransfekowanych nadsączy z dwóch hodowli komórkowych (absorbancja przy 405 nm na minutę).

HB^-:13,9

PB^-: 139

HP22: 100

Ślepa: <0,2

Wyniki te wskazują, że świński pozbawiony domeny B fVIII i pozbawiony domeny fVIII zawierający świńskie podjednostki A1 i A2 są aktywne i sugerują, że posiadają one większą aktywność niż ludzki, pozbawiony domeny B fVIII.

PB^- zostały częściowo oczyszczone i zatężone z pożywki hodowlanej przez chromatografię na heparyna-Sepharose. Heparyna-Sepharose (10 ml) była zrównoważona 0,075 M NaCl, 10 mM HEPES, 2,5 mM CaCl2, 0,005% Tween-80, 0,02% azydek sodu pH 7,40. Pożywka (100-200 ml) z komórek wytwarzających czynnik została naniesiona na kolumnę z heparyną-Sepharose, którą następnie wypłukano 30 ml buforu dla równoważenia bez azydku sodu. PB^- był wymywany 0,65 M NaCl, 20 mM HEPES, 5 mM CaCl2, 0,01% Tween-80 pH 7,40 i był przechowywany w -80°C. Odzysk aktywności powodującej krzepnięcie czynnika fVlll wynosił typowo 50-75%.

Stabilna ekspresja świńskiego, pozbawionego domeny B fVIII (PB^-).

Stransfekowane linie komórkowe utrzymywano w zmodyfikowanej przez Dulbecco pożywce Eagle-F12 zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej, 50 U/ml penicyliny, 50 μg/ml Streptomycyny. Płodowa surowica bydlęca była unieczynniona w 50°C przez 1 godzinę przed użyciem. HB^-/ReNeo i PB^-/ReNeo/Notl (+Avrll) były stabilnie wprowadzone przez transfekcję do komórek BHK i poddane selekcji z uwagi na odporność na genetycynę przy pomocy ogólnego sposobu postępowania, który wcześniej opisano [Lubin i wsp. (1994) Biol. Chem. 269:8639-8641] za wyjątkiem, że komórki w których zachodziła ekspresja były utrzymane w pożywce hodowlanej zawierającej 600 μg/ml genetycyny. Komórki hodowane do nasycenia w kolbach Corning T-75 przenoszono do potrójnych kolb Nunc w pożywce zawierającej 600 μg/ml genetycyny i hodowano do nasycenia. Pożywka została usunięta i zastąpiona nie zawierającą surowicy pożywką AIM-V (Life Technologies, Inc.) bez genetycyny. Ekspresja czynnika VIII była śledzona przez jedno etapowe oznaczenie aktywności koagulacyjnej czynnika VIII (patrz wyżej) i 100-150 ml pożywki zbierano raz dziennie przez cztery do pięciu dni. Maksymalne poziomy ekspresji w pożywce dla HB^- i PB^- wynosiły odpowiednio 102 jednostki/ml i 10-12 jednostek/ml aktywności koagulacyjnej czynnika VIII.

Oczyszczanie PB^-.

PB^- był wytrącany z nadsączu hodowli przy pomocy 60% nasyconego siarczanu amonu i następnie oczyszczony przez W3-3 chromatografie powinowactwa immunologicznego i mono Q wysoko ciśnieniową chromatografię cieczową jak to opisano wcześniej dla oczyszczania pochodzącego z surowicy świni czynnika VIII [Lollar i wsp. (1993) Factor VIII/factor VIIIa. Methods Enzymol. 222:128143]. Specyficzna aktywność koagulacyjna PB^- była mierzona przez jedno etapowe oznaczenie koagulacji [Lollar i wsp. (1993) powyżej] i była podobna do pochodzącego z surowicy świńskiego czynnika VIII.

Zbadany przez elektroforezę w żelu SDS-poliakryloamidowym preparat PB^- zawiera trzy pasma odpowiadające cząsteczkom o masie cząsteczkowej 160 kDa, 82 kDa i 76 kDa. Pasma 82 kDa i 76 kDa były wcześniej opisane jako heterodimery zawierające domeny A1-A2 i ap-A3-C1-C2 (gdzie ap określa peptyd aktywujący) [Toole i wsp. (1984) Nature 312:342-347]. Pasmo 160 kDa przeniesiono na błonę z fluorku poliwinylidenowego i poddano sekwencjonowaniu od końca NH2 co dało Arg-Ile-Xx-Xx-Tyr (gdzie Xx oznacza nieokreślony), która jest sekwencją NH2 końcową pojedynczego łańcucha czynnika VIII [Toole i wsp. (1984) powyżej]. Tak więc, PB^- ulega częściowej obróbce przez cięcie pomiędzy domenami A2 i A3, tak że powstają dwie postaci jedno łańcuchowe białko A1-A2-ap-A3-C1-C2 i heterodimer A1-A2/ap-A3-C1-C2. Opisano podobną obróbkę zrekombinowanego HB^- [Lind i wsp. (1995) Eur. J. Blochem. 232:19-27].

PL 202 936 B1

Charakteryzowanie świńskiego czynnika VIII.

Określono, że sekwencja cDNA świńskiego fVIII odpowiada 137 parom zasad 5' UTR, obszaru kodującego peptyd sygnałowy (57 par zasad) i A1 (1119 par zasad), A3 (990 par zasad). C1 (456 par zasad) i domeny C2 (483 pary zasad). Wraz z wcześniej opublikowaną sekwencją domeny B i obszarów aktywujących lekkiego łańcucha peptydu [Toole i wsp. (1986), powyżej] i domeny A2 [Lubin i wsp. (1994), powyżej] podana sekwencja w pełni określa cDNA dla świńskiego fVIII odpowiadającego produktowi translacji. Fragment zawierający obszar 5' UTR, sekwencje dla peptydu sygnałowego i cDNA domeny A1 sklonowano posługując się protokołem 5'-RACE RT-PCR. Starter oparty na sekwencji ludzkiego C2 sprawdził się w wytwarzaniu produktu RT-PCR co doprowadziło do sklonowania domen A3, C1 15' połowy domeny C2. cDNA odpowiadający 3' połowie domeny C2 i cDNA dla 3' UTR okazały się być trudne dla klonowania. Pozostałość domeny C2 ostatecznie sklonowano przez ukierunkowany na gen spacer produktami PCR [Parker i wsp. (1991), powyżej]. Podane tu sekwencje SEQ ID NO: 29 były jednoznaczne z wyjątkiem pozycji nt 7045 w pobliżu 3' końca domeny C2, która jak to opisano powyżej jest zarówno A lub G. Odpowiednie kodony to GAC (Asp) lub AAC (Asn). Ludzkie i mysie kodony są odpowiednio GAC i CAG (Gln). Nie wiadomo czy jest to polimorfizm lub powtarzalny artefakt PCR. Zrekombinowane hybrydy ludzko/świńskiego cDNA pozbawionego domeny B fVllI zawierające podstawienia świńskiej domeny C2 odpowiadające zarówno kodonom GAC jak i AAC ulegają stabilnej ekspresji nie wykazując wykrywalnej różnicy w aktywności powodującej krzepnięcie. Wykazuje to, że nie ma istotnej różnicy funkcjonalnej pomiędzy tymi dwoma wariantami domeny C.

Przyrównanie wydedukowanej sekwencji aminokwasowej pełnej długości świńskiego fVllI SEQ ID NO: 30 z opublikowaną ludzką [Wood i wsp. (1984), powyżej] i mysią [Elder i wsp. (1993), powyżej] przedstawiono na Fig. 1A-1H wraz z miejscami posttranslacyjnej modyfikacji, proteolitycznego cięcie i rozpoznawania przez inne makrocząsteczki. Stopień identyczności przyrównanych sekwencji przedstawiono w Tabeli 8. Jak podano wcześniej domeny B z tych gatunków są bardziej zmienne niż domeny A lub C. Jest to zgodne z obserwacją, że domena B nie ma znanej funkcji poza jej dużym rozmiarem [Elder i wsp. (1993), powyżej; Toole i wsp. (1986), powyżej]. Wyniki z niniejszego wynalazku potwierdzają, że domena B świńskiego fVlII nie jest niezbędna dla aktywności. Opierając się na dotyczących sekwencji danych, które tu przedstawiono, świńska fVlll, posiadająca usunięte wszystkie części domeny B, może być zsyntetyzowana przez ekspresję DNA kodującego świński fVIII posiadającego usunięte wszystkie lub część kodonów świńskiej domeny B. Występuje również większe zróżnicowanie sekwencji odpowiadającej domenie A1 APC/peptyd cięty przez czynnik lXa (aminokwasy 337372) i lekkiego łańcucha aktywującego peptyd (Tabela 7). Miejsce cięcia przez trombinę w pozycji 336 wytwarzające polipeptyd 337-372 jest częściowo utracone u myszy, bowiem występuje w tym miejscu glutamina zamiast argininy [Elder i wsp. (1993), powyżej]. Względnie szybkie różnicowanie się peptydów ciętych przez trombinę (lub u myszy fVlll przypuszczalny polipeptyd aktywujący 337-372) zostało wcześniej odnotowane w przypadku fibrynopeptydów [Creighton, T.E. (1993) In Proteins: Structures and Molecular Properties, W.H. Freeman, Nowy Jork str. 105-138]. Utrata funkcji biologicznej przez te peptydy w momencie ich przecięcia była podawana jako przykład możliwego powodu szybkiego różnicowania. Arg 562 w ludzkim fVIII był proponowany jako istotniejsze miejsce cięcia w aktywowanym białku C podczas inaktywacji fVIII i fVIIIa [Fay, P.J. i wsp. (1991) J. Biol. Chem. 266:20139-20145]. Miejsce to jest zakonserwowane w ludzkim, świńskim i mysim fVIII.

Potencjalne miejsca N-glikozylacji (NXS/T, gdzie X nie jest proliną) można zobaczyć na Fig. 1A-1H. Występuje tam osiem zakonserwowanych N-glikozylowanych miejsc: jedno w domenie A1, jedno w domenie A2, cztery w domenie B, jedno w domenie A3 i jedno w domenie C1. 19 cystein domen A i C jest zakonserwowanych, podczas gdy dywergencja dotyczy cystein domeny B. Sześć z siedmiu wiązań dwusiarczkowych w fVIII jest homologicznych do miejsc w czynniku V i ceruloplazminy i oba wiązania dwusiarczkowe domeny C znaleziono w czynniku V [McMullen, B.A. i wsp. (1995) Protein Sci. 4:740-746]. Ludzki fVIII zawiera sulfonowane tyrozyny w pozycjach 346, 718, 719, 723, 1664 i 1680 [Pittman D.D. i wsp. (1992) Biochemistry 31:3315-3325; Michnick, D.A. i wsp. (1994) J. Biol. Chem. 269:20095-20102]. Aminokwasy te są konserwowane w mysim fVIII i świńskim fVIII (Fig. 1), choć program CLUSTAL W nie był w stanie przyrównać mysiej tyrozyny odpowiadającej Tyr 346 w ludzki fVIII.

Mysia i świńska surowica może naprawiać defekt krzepnięcia w surowicy od ludzi z hemofilią typu A, co jest zgodne z poziomem konserwowania, u tych gatunków, domen A i C. Prokoagulacyjna aktywność świńskiego fVIII ma przewagę nad ludzkim fVIII [Lollar, P. i wsp. (1992) J. Biol. Chem. 267: 23652-23657]. Zrekombinowany świński czynnik VIII (usunięta domena B), wyrażony i oczyszczony jak tu opisano również ujawnia większą specyficzną aktywność koagulacyjną niż ludzki fVIII, będąc

PL 202 936 B1 porównywalnym z pochodzącym z surowicy świni fVIII. Może być to spowodowane zmniejszeniem stopnia spontanicznej dysocjacji podjednostki A2 z aktywnego heterodimeru A1/A2/A3-C1-C2 fVIIIa. Nie jest znane czy różnica ta w aktywności powodującej krzepnięcie odbija zmianę ewolucyjną w funkcji jaką przykładowo jest adaptacja gatunków [Perutz, M.F. (1996) Adv. Protein Chem. 36: 213244]. Obecnie, kiedy dostępna jest pełna sekwencja cDNA dla świńskiego fVIII, odpowiadająca produktowi translacji, przeprowadzona może być mutageneza sprawdzająca znaczenie homologii [Cunningham, B.C. i wsp. (1989) Science 243:1330-1336] dla identyfikacji różnic strukturalnych pomiędzy ludzkim i świńskim fVIII, które są odpowiedzialne za większą aktywność tej ostatniej.

Świński fVIII jest typowo mniej reaktywny z inhibitorowymi przeciwciałami, które są wykształcane u osób chorych na hemofilię, którym przez transfuzje podawano fVIII, lub które są wytwarzane w całej populacji jako autoprzeciwciała. Stanowi to podstawę dla zastosowania stężonego świńskiego fVIII w postępowaniu z pacjentami z przeciwciałami inhibitorowymi [Hay i Lozier (1995), powyżej]. Większość inhibitorów jest skierowanych przeciw epitopom umiejscowionych w domenie A2 lub domenie C2 [Fulcher, CA. i wsp. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7728-7732; Scandella, D. i wsp. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6152-6156; Scandella, D. i wsp. (1989) Blood 74:1618-1626]. Ponadto, zidentyfikowano epitop o nieznanej roli występujący zarówno w domenie A3 lub C1 [Scandella, D. i wsp. (1989), powyżej; Scandella, D. i wsp. (1993) Blood 82:1767-1775; Nakai, H. I wsp. (1994) Blood 84:224a]. Epitop A2 został zmapowany w obrębie aminokwasów 484-508 przez mutagenezę sprawdzającą homologię [Healey i wsp. (1995), powyżej]. Na tym, 25 aminokwasowym obszarze obserwowana jest względnie niska proporcja identycznej sekwencji (16/25 lub 64%). Jest interesującym, że obszar ten, który wydaje się być funkcjonalnie ważny na podstawie faktu, że skierowane przeciw niemu przeciwciała są inhibitorowymi, w sposób zaskakujący wydaje się podlegać względnie szybszemu dryfowi genetycznemu. Przyrównanie świńskich domen A2 i A3 wykazuje, że epitop A2 nie dzieli wykrywalnej homologii z odpowiadającym mu obszarem w domenie A3.

Inhibitorowy epitop C2 z ludzkiego fVlll został zaproponowany jako umiejscowiony, przez mapowanie delecyjne, między aminokwasami 2248-2312 [Scandella, D. i wsp. (1995) Blood 86: 18111819]. Ludzki i świński fVIII są w 83% identyczne z tym 65-aminokwasowym segmentem. Jednakowoż, mutageneza sprawdzająca homologię dla tego obszaru, dla scharakteryzowania epitopu C2 ujawniła, że główna determinanta epitopu C2 była nieoczekiwanie zlokalizowana w rejonie odpowiadającym ludzkim aminokwasom 2181-2243 (SEQ ID NO: 2) i Fig. 1H. Przygotowano ludzko-świńskie białka czynnika VIII, w których różne części domeny C2 ludzkiego czynnika VIII zastąpiono odpowiadającymi im częściami świńskiego czynnika VIII, stosując opisaną tu strategię (Przykład 5). Synteza różnych C2-hybryd czynnika VIII została osiągnięta przez konstrukcje hybrydowego, kodującego DNA przy pomocy sekwencji nukleotydowej kodującej świński obszar C2 podanej na SEQ ID NO: 30. Każdy hybrydowy DNA był wyrażony w stransfekowanych komórkach tak, że hybrydowy czynnik VIII mógł być częściowo oczyszczony z pożywki hodowlanej. Aktywność, przy braku jakiegokolwiek inhibitora, była zmierzona przez jedno etapowe oznaczenie krzepnięcia.

Zestaw pięciu ludzkich inhibitorów był użyty dla sprawdzania każdego, hybrydowego czynnika VIII. Inhibitorowe surowice zawierające przeciwciało przeciw czynnikowi VIII zostały wcześniej określone jako skierowane przeciw ludzkiej domenie C2, co opierało się na zdolności zrekombinowanej ludzkiej domeny C2 do neutralizowania hamowania. We wszystkich badanych surowicach miano inhibitora było neutralizowane w ponad 79% przez domenę C2 lub łańcuch lekki, lecz w mniej niż 10% przez zrekombinowaną ludzką domenę A2. Ponadto, C2-hybrydowy czynnik VIII był sprawdzany względem mysiego przeciwciała monoklonalnego wiążącego domenę C2 i podobnych ludzkich przeciwciał inhibitorowych C2. Hamowały one wiązanie czynnika VIII do fosfolipidu i czynnika von Wil-lebrand.

Przez porównanie mian przeciwciała inhibitorowego przeciw C2-hybrydowemu czynnikowi VIII, większość determinant ludzkiego C2 inhibitorowego epitopu zlokalizowano w obszarze aminokwasów 2181-2443 9SEQ ID NO: 2, patrz również Fig. 1H). Przeciwciała przeciw C2 skierowane do obszaru COOH-końcowego do aminokwasu 2253 nie zostały wykryte w surowicach czterech z pięciu pacjentów. W porównaniu hybryd posiadających świńską sekwencję odpowiadającą ludzkim aminokwasom 2181-2199 i 2207-2243 okazało się, że oba obszary uczestniczą w wiązaniu przeciwciała. Świńska sekwencja aminokwasowa odpowiadająca ludzkim aminokwasom 2181-2243 jest ponumerowana 1982-2044 na SEQ ID NO: 30. Sekwencja świńskiego DNA kodującego świńskie aminokwasy o numerach 1982-2044 jest nukleotydami o numerach 5944-6132 na SEQ ID NO: 29.

Na podstawie Fig. 1H można zobaczyć, że na obszarze 2181-2243 występuje 16 aminokwasowych różnic pomiędzy ludzką i świńskimi sekwencjami. Różnice dotyczą aminokwasów 2181, 2182,

PL 202 936 B1

2188, 2195-2197, 2199, 2207, 2216, 2222, 2224-2227, 2234, 2238 i 2243. Aminokwasy zastąpione w jednym lub większej liczbie tych miejsc mogą być usunięte dla sporządzenia zmodyfikowanego, ludzkiego czynnika VIII nie reaktywnego względem przeciwciał inhibitorowych, anty ludzki-C2. Mutageneza sprawdzająca alaninę dostarcza dogodnego sposobu dla zastąpienia alaniną naturalnie występujących aminokwasów jak to wcześniej opisano. Aminokwasy inne niż alanina mogą być również podstawione, jak to opisano. Podstawienia alaniną poszczególnych aminokwasów, szczególnie tych, które nie są identyczne u człowieka i świni, lub człowieka/myszy, lub które najprawdopodobniej uczestniczą w wiązaniu antygenu mogą dawać zmodyfikowany czynnik VIII o ograniczonej reaktywności z przeciwciałami inhibitorowymi.

Fig. 1A-1H łącznie dostarczają przyrównania sekwencji aminokwasowej ludzkiego, małpiego i mysiego czynnika VIII. Fig. 1A jest porównaniem obszarów peptydu sygnałowego (ludzki SEQ ID NO: 31, świński SEQ ID NO: 30, aminokwasy 119; mysi SEQ ID NO: 28 aminokwasy 1-19). Należy zauważyć, że aminokwasy z Fig. 1A-1H są ponumerowane począwszy od pierwszej alaniny dojrzałego białka, którą oznaczono numerem 1, gdzie aminokwasy peptydu sygnałowego są oznaczone numerami ujemnymi. Sekwencja ludzkiego fVIll na SEQ ID NO: 2 również rozpoczyna się od pierwszej alaniny dojrzałego białka oznaczonej jako aminokwas numer 1. Na sekwencjach aminokwasowych mysiego fVlll (SEQ ID NO: 28) i świńskiej fVIII (SEQ ID NO: 30) pierwszy aminokwas (alanina) w dojrzałej sekwencji jest aminokwasem numer 20. Fig. 1A-1H przedstawia przyrównanie odpowiadających sobie sekwencji ludzkiego, mysiego i świńskiego fVIII takie, że obszary o najwyższej identyczności aminokwasów są podpisane pod sobą. Numery aminokwasów na Fig. 1A-1H dotyczą jedynie ludzkiego fVIII. Fig. 1B podaje sekwencje aminokwasowe ludzkiej domeny A1 (SEQ ID NO: 2, aminokwasy 1-372), świńskiej (SEQ ID NO: 30, aminokwasy 20-391) i mysiej (SEQ ID NO: 28, aminokwasy 20391). Fig. 1C dostarcza sekwencję aminokwasową dla domen A2 czynnika VIII człowieka (SEQ ID NO: 2, aminokwasy 373-740), świni (SEQ ID NO: 30, aminokwasy 392-759) i myszy (SEQ ID NO: 28, aminokwasy 392-759). Fig. 1D dostarcza sekwencje aminokwasowe domen B czynnika VIII człowieka (SEQ ID NO: 2, aminokwasy 741-1648), świni (SEQ ID NO: 30, aminokwasy 760-1449) i myszy (SEQ ID NO: 28, aminokwasy 760-1640). Fig. 1E porównuje sekwencje aminokwasowe lekkiego łańcucha peptydów aktywujących czynnika VIII z człowieka, świni i myszy ((SEQ ID NO: 2, aminokwasy 16491689; SEQ ID NO: 30, aminokwasy 1450-1490; i SEQ ID NO: 28, aminokwasy 1641-1678). Fig. 1F dostarcza porównania sekwencji ludzkiej, świńskiej i mysiej dla domen A3 czynnika VIII (odpowiednio SEQ ID NO: 2, aminokwasy 1690-2019; SEQ ID NO: 30, aminokwasy 1491-1820 i SEQ ID NO: 28, aminokwasy 1679-2006). Fig. 1G dostarcza sekwencji aminokwasowych domen C1 czynnika VIII człowieka, świni i myszy (odpowiednio SEQ ID NO: 2, aminokwasy 2020-170; SEQ ID NO: 30, aminokwasy 1821-1973 i SEQ ID NO: 28, aminokwasy 2007-2159). Fig. 1H dostarcza danych o sekwencji domen C2 czynnika VIII ludzkiego, świni i myszy (odpowiednio SEQ ID NO: 2, aminokwasy 21732332; SEQ ID NO: 30, aminokwasy 1974-2133 i SEQ ID NO: 28, aminokwasy 2160-2319).

Kara oznaczają miejsca sulfatydylacji tyrozyny, proponowane miejsca wiązania dla czynnika IXa, fosfolipidu i białka C są podwójnie podkreślone i obszary uczestniczące w wiązaniu przeciwciał inhibitorowych anty-A2 i anty-C2 są oznaczone kursywą. Gwiazdki oznaczają konserwowane sekwencje aminokwasowe. Patrz również SEQ ID NO: 29 (cDNA dla świńskiego czynnika VIII) i SEQ ID NO: 30 (wydedukowana sekwencja aminokwasowa świńskiego czynnika VIII). System numeracji ludzkiej sekwencji jest użyty zgodnie z danymi literaturowymi [Wood i wsp. (1984), powyżej]. Domeny A1, A2 i B są określone przez miejsca cięcia trombiną w pozycjach 372 i 740 i miejscem cięcia dla nieznanej proteazy w pozycji 1648, co daje fragmenty odpowiednio 1-372, 373-740 i 741-1648 [Eaton, D.L. i wsp. (1986) Biochemistry 25:8343-8347]. Domeny A3, C1 i C2 są określone odpowiednio przez aminokwasy 1690-2019, 2020-2172 i 2173-2332 [Vehar i wsp. (1984), powyżej]. Miejsca cięcia dla trombiny (czynnik lla), czynnika IXa, czynnika Xa i APC [Fay i wsp. (1991), powyżej; Eaton D. i wsp. (1986) Biochemistry 25:505-512; Lamphear, B.J. i wsp. (1992) Blood 80:3120-3128] przedstawiono umieszczając nazwę enzymu ponad reaktywną argininą. Kwaśny peptyd jest odcięty od łańcucha lekkiego fVIII przez trombinę lub czynnik Xa w pozycji 1689. Proponowane miejsca wiązania dla czynnika IXa [Fay, P.J. i wsp. (1994) J. Biol. Chem. 269:20522-20527; Lenting, P.J. i wsp. (1994) J. Biol. Chem. 269:7150-7155, fosfolipidu (Foster, P.A. i wsp. (1990) Blood 75:1999-2004) i białka C (Walker, F.J. i wsp. (1990) J. Biol. Chem. 265:1484-1489] są podwójnie podkreślone. Obszary uczestniczące w wiązaniu przeciwciała anty-A2 [Lubin i wsp. (1994), powyżej; Healey i wsp. (1995), powyżej] i wcześniej proponowane dla przeciwciał inhibitorowych anty-C2 podano kursywą. Epitop inhibitorowy C2 zidentyfikowany jak tu opisano (ludzka sekwencja aminokwasowa 2181-2243) jest przedstawiony na

PL 202 936 B1

Fig. 1H jako podkreślony jedną linią. Miejsca sulfatydylacji tyrozyny [Pittman i wsp. (1992), powyżej; Michnick i wsp. (1994), powyżej] są oznaczone przez ♦.

P r z y k ł a d 7: Konstrukcja POL1212 i ekspresja w komórkach nerki z noworodków chomika.

POL1212 jest częściowo pozbawionym domeny B świńskim czynnikiem Vlll o usuniętej domenie B z wyjątkiem dwunastu aminokwasów na -NH2 końcu domeny B i 12 aminokwasach zachowanych na końcu -COOH.

cDNA kodujący sekwencje dla świńskich domen fVlll A1, A2, ap-A3-C1 i C2 otrzymano jak to opisano w przykładzie 5. Sekwencja nukleotydowa DNA i pochodząca od niej sekwencja aminokwasową świńskiego czynnika Vlll są przedstawione odpowiednio jako SEQ ID NO: 29 i SEQ ID NO: 30. Namnożone fragmenty były niezależnie sklonowane w plazmidzie pBluescript II KS^- (pBS).

POL1212 określa cDNA kodujący świński fVIII pozbawiony większej części domeny B, lecz zawierający sekwencję DNA kodującą 24-aminokwasowy łącznik pomiędzy domenami A2 i ap. POL1212 został skonstruowany w ssaczym wektorze ekspresyjnym ReNeo, który otrzymano z Biogen. ReNeo może replikować się w bakterii, replikować się jako episom w komórkach COS dla przejściowej ekspresji czynnika VIII lub ulegać stabilnej integracji w różnych komórkach ssaka. Zawiera 1) sekwencje pochodzące z plazmidu pBR322 zawierające miejsce inicjacji replikacji i gen odporności na ampicylinę, 2) gen odporności na neomycynę, którego ekspresja znajduje się pod kontrolą promotora/enhansera SV40, mały intron t SY40 i elementy regulatorowe sygnału poliadenylacji SV40, 3) miejsce dla wbudowania fVIII i jego peptydu sygnałowego, którego ekspresja znajduje się pod kontrolą enhansera SV40, główny późny promotor adenowirusa typu 2 i trój częściową sekwencję liderową adenowirusa typu 2. Wektor posiadający podobne składniki funkcjonalne może być użyty zamiast wektora ReNeo.

POL1212/ReNeo został przygotowany w kilku etapach. Po pierwsze cDNA kodujący świński łańcuch ciężki fVIII (A1-A2) i cDNA kodujący świński łańcuch lekki fVIII (ap-A3-C1-C2) były niezależnie złożone w pBS. Z konstruktów tych DNA kodujący świński, pozbawiony domeny B fVIII został złożony w pBS (PB-/pBS). Taka postać świńskiego fVIII pozbawiona całej domeny B, określona jako aminokwasy odpowiadające resztom 741-1648 w ludzkim fVIII (u człowieka nukleotydy 2278-5001). Następnie, DNA kodujący świński a2 został podstawiony ludzką domeną A2 w ludzkim, pozbawionym domeny B wektorze ekspresyjnym ReNeo (HB-/ReNeo) dla fVIII. DNA kodujący pozostałość świńskiego łańcucha ciężkiego i DNA kodujący świński łańcuch lekki były podstawione domenami ludzkimi w dwóch kolejnych etapach wykorzystujących świński łańcuch ciężki/pBS i PB-/pBS, które wcześniej przygotowano. Fragment ludzkiej domeny B kodujący 5 C-końcowych i 9 N-końcowych aminokwasów wbudowano pomiędzy domeny A2 i A3 tworząc konstrukt nazwany PSQ/ReNeo [Healey i wsp. (1998) 92:3701-3709]. Reszty Glu 2181-Wal 2243 zawierają główną determinantę inhibitorowego epitopu w domenie C2 ludzkiego czynnika Vlll. Konstrukt ten użyto jako matrycę dla przygotowania fragmentu świńskiej domeny B kodującego 12 C-końcowych i 12 N-końcowych aminokwasów. Fragment ten wbudowano pomiędzy domeny A2 i A3 otrzymując ostateczny konstrukt POL1212/ReNeo.

24-aminokwasowy łącznik POL1212 zawiera pierwsze 12 i ostatnie 12 aminokwasów świńskiej domeny B fVlIl. Łącznik POL1212 posiada następującą sekwencję: SFAQNSRPPSASAPKPPVLRRHQR (SEQ ID NO: 32).

Sekwencja nukleotydowa odpowiadająca łącznikowi 1212 i otaczające aminokwasy to:

GTT ATT GAA CCT AGG AGC TTT GCC CAG AAT TCA AGA CCC CCT AGT GCG (SEQ ID NO: 33)

V I E P R S F A Q N S R P P S A

AGC GCT CCA AAG CCT CCG GTC CTG CGA CGG CAT CAG AGG GAC ATA AGC

S A P K P P V L R R H Q R D I S

CTT CCT ACT

L P T

Łącznik POL1212 został zsyntetyzowany przez mutagenezę z wydłużeniem na zakładkę (SOE) jak następuje:

Reakcje PCR użyte dla sporządzenia produktów SOE były następujące:

Reakcja #1

Zewnętrzny starter: Rev4, który jest świńskim starterem dla A2 odpowiadającym nukleotydom 1742-1761. (SEQ ID NO:29) o sekwencji: 5'-GAGGAAAACCAGATGATGTCA-3' (SEQ ID NO: 34).

PL 202 936 B1

Wewnętrzny starter: OL12, który jest odwrotnym starterem dla świni pokrywającym pierwsze (5') 15 aminokwasów OL1212 i ostatnie (3') 5 aminokwasów świńskiej A2. Sekwencja: 5'-CTTTGGAGCGCTCGCACTAGGGGGTCTTGAATTCTGGGCAAAGCTCCTAGGTTCAATGAC-3' (SEQ ID NO: 35).

Matryca: PSQ/ReNeo.

Produkt: świński DNA od nukleotydu 1742 w domenie A2 do 2322 w OL1212, 580 par zasad.

Reakcja #2

Zewnętrzny starter: P2949 jest odwróconym starterem dla świńskiej A3 odpowiadającym nukleotydom 2998-3021 z SEQ ID NO: 29. Sekwencja: 5'-GGTCACTTGTCTACCGTGAGCAGC-3' (patrz SEQ ID NO: 29).

Wewnętrzny starter: OL12+, starter obejmujący sekwencję dla końcowych (3') 16 aminokwasów OL1212 i pierwszych (5') 6 aminokwasów świńskiego peptydu aktywującego, nukleotyd 2302-2367 z SEQ ID NO: 29. Sekwencja jest: 5'-CCTAGTGCGAGCGCTCCAAAGCCTCCGGTCCTGCGACGGCATCAGAGGGACATAAGCCTTCCTACT-3' (SEQ ID NO: 36). Matryca: PSQ/ReNeo-.

Produkt: świńska sekwencja od nukleotydu 2302 w OL1212 do 3021 w domenie A3, 719 par zasad.

Reakcja SOE

Startery: Rev4, P2949Matryce: fragment od rxn#1 (BP) i fragment o niskiej temperaturze topnienia z rxn#2 (BP).

Produkt: świński DNA od nukleotydu 1742 w domenie A2 do nukleotydu 3021 w domenie A3 (SEQ ID NO: 29) obejmujący OL1212, 1279 par zasad. Produkt reakcji wytrącono etanolem.

Łącznik 1212 wbudowano do PSQ/ReNeo przez cięcie produktu SOE (wstawka) i PSQ/ReNeo (wektor) przy pomocy BsaB I. Wektor i wstawkę łączono przy pomocy ligazy T4 i produkt użyto dla transformacji komórek E.coli XL1-Blue. DNA plazmidu wyizolowano z szeregu kolonii i sekwencje łącznika 1212 i inne wytworzone przez OCR sekwencje potwierdzono przez oznaczenie sekwencji DNA.

Hodowla komórek CRL-1632 z nerki noworodka chomika (BHK).

Linię komórek BHK otrzymano z ATCC, gdzie jest pod numerem dostępu CRL-1632 i była przechowywana zamrożona w -20°C do chwili przyszłego użycia. Komórki rozmrożono w 37°C i umieszczono w 10 ml pełnej pożywki określonej jako DMEM/F12, 50 U/ml penicyliny, 50 μg/ml Streptomycyny plus 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). FBS otrzymano z Hyclone, Logan Utah. Komórki wirowano przez 2 min. przy 300 obr./min. Pożywkę usuwano i komórki ponownie zawieszano w 2 ml pełnej pożywki w kolbie T-75 zawierającej 20 ml pożywki pełnej.

POL1212 była wyrażana zarówno w komórkach noworodkowej wątroby chomika (BHK) jak i w komórkach jajnikowych chomika chińskiego (CHO). Użyto dwóch linii BHK, linii CRL-1632 z ATCC i kolejnej linii BHK otrzymanej od R. McGillivray, Uniwersytet Kolumbii Brytyjskiej [Funk, i wsp. (1990) Biochemistry 29:1654-1660]. Te ostatnie, subklonowano bez selekcji w laboratorium wynalazców i oznaczono BHK1632 (Emory). Linią komórek CHO były CHO-K1, ATCC numer dostępu CCL-61. Ekspresja przeciętnego klonu z linii komórek Emory i z komórek CHO-K1 była w pewnym stopniu wyższa niż w komórkach CRL-1632, co oceniono przez chromogeniczne oznaczenie aktywności.

Komórki rosły w kolbach T-75 tworząc jednorodną pojedynczą warstwę. Przygotowano 60 ml łiodowlę komórek E.coli XL1-Blue w LB/ampicylina (50 mg/ml) niosących plazmid POL1212/ReNeo.

Transfekcja komórek BHK CRL-1632 przez POL1212/ReNeo.

DNA z całonocnej hodowli komórek POL1212/ReNeo XL1-Blue sporządzono przy pomocy zestawu Spin Miniprep firmy Qiagen, Valencja, CA. Komórkami CRL-1632 pochodzącymi z jednej kolby zaszczepiono dwie kolby dodając do 2 ml końcowej objętości 0,2 ml w przypadku kolby wyjściowej i 0,3 ml w przypadku kolby dla transfekcji. Kolejna kolba zawierała świeżą pożywkę. Pożywką była DMEM/F12 plus 10% Hyclone FBS + 50 U/ml penicyliny, 50 μg/ml Streptomycyny. Komórki CRL-1632 wyszczepiono na 6-studzienkowe płytki do 50-90% konfluencji dla transformacji (0,3 ml komórek z kolby T-75 w 2 ml 1:5000 Versene [Life Technologies, Gaithersburg, MD] w każdej studzience) przy pomocy świeżej DMEM/F12 + 10% Hyclone FBS + 50 U/ml penicyliny, 50 μg/ml Streptomycyny.

Poniższe roztwory były przygotowane w jałowych 1-2 ml probówkach testowych;

A) 48 μl (10 μg) minipreparatu DNA POL1212/ReNeo plus 10 μl pożywki bez surowicy (DMEM/F12) plus 10 μ! Lipofectin™ (Life Technologies, Gaithersburg, MD).

B) 10 μl Lipofectin plus 190 μl pożywki (ślepa transformacja) dokładnie zmieszano i pozwolono DNA i Lipofectin na reakcję przez 15 minut w temperaturze pokojowej. W tym czasie, komórki płukano dwukrotnie 2 ml DMEM/F12. Następnie dodano do komórek 1,8 ml DMEM/F12. Do komórek dodano kroplami kompleks DNA/Lipofectin i dokładnie obracano dla zmieszania. Komórki pozostawiono na noc w termostacie. Usunięto DNA/Lipofectin i do komórek dodano 3 ml pożywki. Komórki inkubowano

PL 202 936 B1

30-48 godzin. Genetycynę otrzymano z Life Technologies, Gaithersburg, MD. Hodowle komórek podzielono 1:20, 1:50 i 1:100, 1:250, 1:500 na 10 cm szalkach w 10 ml pożywki z surowicą zawierającej

535 μg/ml genetycyny. Po kilku kolejnych dniach, komórki które nie pobrały plazmid POL1212/ReNeo zostały zabite z powodu obecności genetycyny. Następnie pozostałe komórki przeszczepione w pożywce z genetycyną utworzyły na szalkach widoczne jednowarstwowe hodowle.

Ekspresja i oznaczanie POL1212 z komórek BHK CRL-1632.

Wokół kolonii umieszczono małe plastikowe cylindryczne pierścienie. Kolonie niezależnie pobrano przy pomocy kompletnej pożywki i przeniesiono do probówek testowych. Kolonie te są określone jako kolonie sklonowane pierścieniem. Sklonowane pierścieniem kolonie umieszczono niezależnie na 24-studzienkowych płytkach i hodowano w pożywce pełnej.

Oznaczenie, przy pomocy chromogenicznego substratu, ekspresji czynnika VIII przez stransfekowane komórki CRL-1632.

Próbki POL1212 z nadsączy hodowli komórkowej zmieszano z 50 nM oczyszczonego świńskiego czynnika IXa i 0,05 mM nośników fosfatydylocholina/fosfatydyloseryna (PCPS) w 0,15 M NaCl, 20 mM HEPES, 5 mM CaCl2, 0,01% Tween 80, pH 7,4. Jako kontrolę użyto pożywkę z hodowli komórkowej z komórek stransformowanych ślepą próbą. Równocześnie dodano trombinę i czynnik X do końcowych stężeń odpowiednio 40 i 425 nM. Trombiną aktywowała czynnik VIII, który następnie wraz z PCPS służy jako kofaktor dla czynnika IXa podczas aktywowania czynnika X.

Po 5 min. aktywowanie czynnika X przez czynnik IXa/czynnik VIIIa/PCPS hamowano przez dodanie EDTA do końcowego stężenia 50 mM. W tym samym czasie aktywowanie czynnika VIII przez trombinę było zahamowane przez dodanie inhibitora trombiny, zrekombinowanej desulfatohirudyny do końcowego stężenia 100 mM. 25 μl próbkę mieszaniny reakcyjnej przeniesiono do studzienki płytki dla mikromiareczkowania, do której dodano 74 μl Spectrozyme Xa (America Diagnostica, Greenwich, CT), który jest chromogenicznym substratem dla czynnika Xa. Końcowe stężenie Spectrozyme Xa wynosiło 0,6 mM. Absorbancja przy 405 mM zależną od cięcia Spectrozyme Xa przez czynnik Xa śledzono w sposób ciągły przez 5 minut przy pomocy Vmax Kinetic Plate Reader (Molecular Devices, Inc., Menlo Park, CA). Wyniki są wyrażone w kategoriach A405/min..

Oznaczenie chromogeniczne czynnika VIII dla dziesięciu kolonii sklonowanych pierścieniem:

Numer kolonii	A405/min. (x103)
Bufor	0,2
1	2,1
2	8,4
3	6,4
4	10,7
5	12,5
6	7,6
7	51,3
8	139,5
9	3,8
10	8,4

Wyniki te pokazują, że wszystkie dziesięć wyselekcjonowanych kolonii wyraża aktywność czynnika VIII, która jest przynajmniej dziesięciokrotnie większa od tła.

Aktywność dla pożywki z kolonii 8, która jest kolonią o najwyższej ekspresji była następnie sprawdzana przy pomocy jedno etapowego oznaczenia krzepnięcia dla czynnika VIII. W oznaczeniu tym 50 ml surowicy z niedoborem czynnika VIII (George King Biomedical Overland Park, KA), 5 ml próbki lub standardu i 50 ml aktywowanych cząsteczek tromboplastyny czasowego czynnika (Organon Technika, Durham, NC) inkubowano 3 min. w 37°C. Próbki zawierają pożywkę z kolonii 8 rozcieńczoną w 0,15 M NaCl, mM hepes, pH 7,4 (HBS) lub jako kontrolą pożywką pełną. Krzepnięcie zapoczątkowano przez dodanie 50 ml 20 mM CaCl2. Czas krzepnięcia zmierzono przy pomocy ST4 BIO Coagulation Instrument (Diagnostica Stago, Parsippany, NJ). Krzywą standardową otrzymano przez sporządzenie

PL 202 936 B1 rozcieńczeń połączonych, poddanych działaniu normalnych surowic ludzkich, dostawa 0641 (George King Biomedical, Overland Park, KA). Stężenie czynnika Vlll w standardzie było 0,9 jednostki/ml.

Krzywa standardowa:

Rozcieńczenie	Jednostki/ml	Czas krzepnięcia
1) Nie rozcieńczona	0,96	45,2
2) 1/3 (HBS)	0,32	53,7
3) 1/11 (HBS)	0,087	62,5
4) 1/21 (HBS)	0,046	68,9

Liniowa zależność czasu krzepnięcia od logarytmu stężenia standardu daje współczynnik zależności 0,997.

Badane substancje dają poniższe czasy krzepnięcia, które są przekształcane w jednostki/ml przy pomocy krzywej standardowej:

Próbka	Czas krzepnięcia (sek.)	Jednostki/ml
1) Kolonia 8 (24 godz., 1/10 w HBS	40,6	1,74x10=17,4
2) Kolonia 8 (24 godz., 1/10 w HBS	41,1	1,63x10=16,3
3) Kolonia 8 (24 godz., 1/20 w HBS	47,7	0,69x20=13,8
4) Kolonia 8 (24 godz., 1/20 w HBS	47,2	0,73x20=14,6
5) Pożywka pełna	82,9	0,007
6) Pożywka pełna	83,3	0,006

Wyniki te pokazują, że aktywność powodująca krzepnięcie koloni 8 jest około 2000 razy wyższa niż próbki kontrolne.

Sekwencja DNA kodująca POL1212 jest podana jako SEQ ID NO: 37. Kodowana sekwencja aminokwasowa POL1212 jest podana jako SEQ ID NO: 38. Dalsze oczyszczanie POL1212 może być przeprowadzone różnymi znanymi sposobami, takimi jak chromatografia powinowactwa i chromatografia HPLC - patrz Przykłady 2 i 3.

Wnioski ogólne.

Powinno być zrozumiałe, że niewielkie zmiany sekwencji aminokwasowej lub DNA kodującego taką sekwencje, która jest pokrewna POL1212 mogą być wprowadzone bez zaburzania istotnych właściwości funkcji. Przykładowo, długość sekwencji domeny B zachowanej jako łącznik/pomiędzy domeną A2 i peptydem aktywującym może być zwiększona lub zmniejszona bez ograniczeń znanych nauce. Warianty sekwencji mogą być wprowadzone do obszaru łącznika z zachowaniem równoważnych cech funkcjonalnych POL1212 jakie tu podano i świńskiego, pozbawionego domeny B czynnika VIII, który tu podano i jakie są znane nauce. Opierając się na porównaniach znanych sekwencji aminokwasowych czynnika VIII posiadających aktywność powodującą krzepnięcie krwi człowieka, warianty sekwencji, takie jak pojedyncze podstawienia aminokwasowe lub podstawienie sekwencji peptydu znanymi wariantami funkcjonalnymi może być dokonane na podstawie sekwencji aminokwasowej POL1212 z zachowaniem ich równoważnych właściwości funkcjonalnych. Wspomniane typy zmienności nie są pomyślane jako wyczerpujące, lecz są skromnym przykładem modyfikacji sekwencji, które mogą być dokonane przez naukowców o przeciętnych umiejętnościach bez istotnego modyfikowania funkcjonalnych właściwości białka. Wszystkie takie warianty i modyfikacje są pomyślane zakresem wynalazku jako zastrzeżone lub im równoważne.

Lista ID sekwencji:

SEQ ID NO do 27 28 do 36

Identyfikacja cDNA ludzkiego czynnika VIII. Kodująca aminokwas numer 1 z dojrzałego białka kodowanego począwszy od nukleotydu numer 208. Sekwencja aminokwasowa ludzkiego czynnika cDNA dla domeny A2 świńskiego czynnika VIII

Sekwencja aminokwasowa domeny A2 świńskiego czynnika VIII. Sekwencja startera oligonukleotydowego (Przykład 5)

Sekwencja aminokwasowa mysiego czynnika VIII cDNA świńskiego czynnika VIII

Sekwencja aminokwasowa świńskiego czynnika VIII

Sekwencja aminokwasowa peptydu sygnałowego ludzkiego czynnika VIII Starter oligonukleotydowy (Przykład 7)

DNA kodujący POL1212

Sekwencja aminokwasowa POL1212

PL 202 936 B1

LISTA SEKWENCJI <iio> Uniwersytet Ernory ' <12O> ZMODYFIKOWANY CZYNNIK VIII <130> 75-951 WO <i40> NIE NADANO NUMERU <141> 2001-02-16 ' <150> US 09/523,655 <151> 2000-03-10 <150? US 09/037,601 <151> 1998-03-10 <150> US 03/670,707 <151> 1996-06-26 <160> 38 <170> Patentln Ver. 2,0 <210> 1 <211> 9009 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<22l> CDS <222> (208)..(7203) <400> 1 cagtgggtaa gttccttaaa tgctctgcaa agaaattggg acttttcatt aaatcagaaa 60 ttttactttt ttcccctcct gggagctaaa gatattttag agaagaatta accttttgct 120 tctccagttg aacatttgta gcaataagtc atgcaaatag agetctccac ctgcttcttt 180 ctgtgccttt tgcgattctg ctttagt gcc acc aga aga tac tac ctg ggt gca 234 Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala

5

gtg gaa

ctg tca

tgg gac

tat atg

caa agt gat ctc ggt gag ctg cct

282

Val 10

Glu

Leu

Ser

Trp

Asp 15

Tyr

Met

Gin

Ser

Asp 20

Leu Gly

Glu Leu

Pro 25

gtg

gac

gca

aga

ttt

cct

ect

aga

gtg

cca

aaa

tct

ttt

cca

ttc

aac

330

Val

Asp

Ala

Arg

Phe

Pro

Pro

Arg

Val

Pro

Lys

Ser

Phe

Pro

Phe

Asn

30

*

35

40

acc

tca

gtc

gtg

tac

aaa

aag

act

ctg

ttt

gta

gaa

ttc

acg

gtt

cac

378

Thr

Ser

Val

Val

Tyr

Lys

Lys

Thr

Leu

Phe

Val

Glu

Phe

Thr

Val

His

45

50

55

PL 202 936 B1

ctt

ttc

aac

atc

gct

aag

cca

agg

cca

ccc

tgg

atg

ggt

ctg

eta

ggt

426

Leu

Phe

Asn 60

Ile

Ala

Lys

Pro

Arg 65

Pro

Pro

Trp

Met

Gly 70

Leu

Leu

Gly

cct

acc

atc

cag

gct

gag

gtt

tat

gat

aca

gtg

gtc

att

aca

ctt

aag

474

Pro

Thr 75

Ile

Gin

Ala

Glu

Val 60

Tyr

Asp

Thr

Val

Val 85

Ile

Thr

Leu

Lys

aac

atg

gct

tcc

cat

cct

gtc

agt

ctt

cat

gct

gtt

ggt

gta

tcc

tac

522

Asn 90

Met

Ala

Ser

His

Pro 95

Val

Ser

Leu

His

Ala 100

Val

Gly

Val

Ser

Tyr 105

tgg

aaa

gct

tct

gag

gga

gct

gaa

tat

gat

gat

cag

acc

agt

caa

agg

570

Trp

Lys

Ala

Ser

Glu 110

Gly

Ala

Glu

Tyr

Asp 115

Asp

Gin

Thr

Ser

Gin 120

Arg

gag

aaa

gaa

gat

gat

aaa

gtc

ttc

cct

ggt

gga

agc

cat

aca

tat

gtc

618

Glu

Lys

Glu

Asp 125

Asp

Lys

Val

Phe

Pro 130

Gly

Gly

Ser

His

Thr 135

Tyr

Val

tgg

cag

gtc

ctg

aaa

gag

aat

ggt

cca

atg

gcc

tct

gac

cca

ctg

tgc

666

Trp

Gin

Val 140

Leu

Lys

Glu

Asn

Gly 145

Pro

Met

Ala

Ser

Asp 150

Pro

Leu

Cys

ctt

acc

tac

tca

tat

ctt

tct

cat

gtg

gac

ctg

gta

aaa

gac

ttg

aat

714

Leu

Thr 155

Tyr

Ser

Tyr

Leu

Ser 160

His

Val

Asp

Leu

Val 165

Lys

Asp

Leu

Asn

tca

gg«

ctc

att

gga

gcc

eta

eta

gta

tgt

aga

gaa

ggg

agt

ctg

gcc

762

Ser 170

Gly

Leu

Ile

Gly

Ala 175

Leu

Leu

Val

Cys

Arg 180

Glu

Gly

Ser

Leu

Ala 185

aag

gaa

aag

aca

cag

acc

ttg

cac

aaa

ttt

ata

eta

ctt

ttt

gct

gta

810

Lys

Glu

Lys

Thr

Gin 190

Thr

Leu

His

Lys

Phe 195

Ile

Leu

Leu

Phe

Ala 200

Val

ttt

gat

gaa

ggg

aaa

agt

tgg

cac

tca

gaa

aca

aag

aac

tcc

ttg

atg

858

Phe

Asp

Glu

Gly 205

Lys

Ser

Trp

His

Ser 210

Glu

Thr

Lys

Asn

Ser 215

Leu

Met

cag

gat

agg

gat

gct

gca

tct

gct

cgg

gcc

tgg

cct

aaa

atg

cac

aca

906

Gin

Asp

Arg 220

Asp

Ala

Ala

Ser

Ala 225

Arg

Ala

Trp

Pro

Lys 230

Met

His

Thr

gtc

aat

ggt

tat

gta

aac

agg

tct

ctg

cca

ggt

ctg

att

gga

tgc

cac

954

Val

Asn 235

Gly

Tyr

Val

Asn

Arg 240

Ser

Leu

Pro

Gly

Leu 245

Ile

Gly

Cys

His

agg

aaa

tca

gtc

tat

tgg

cat

gtg

att

gga

atg

ggc

acc

act

cct

gaa

1002

Arg 250

Lys

Ser

Val

Tyr

Trp 255

His

Val

Ile

Gly

Met 260

Gly

Thr

Thr

Pro

Glu 265

gtg

cac

tca

ata

ttc

ctc

gaa

ggt

cac

aca

ttt

ctt

gtg

agg

aac

cat

1050

Val

His

Ser

Ile

Phe 270

Leu

Glu

Gly

His

Thr 275

Phe

Leu

Val

Arg

Asn 280

His

PL 202 936 B1

cgc cag gcg tcc ttg gaa atc tcg cca ata act ttc ctt act

get Ala

caa Gin

1098

Arg Gin Ala Ser 285

Leu

Glu

Ile Ser

Pro 290

Ile Thr

Phe

Leu

Thr 295

aca

ctc

ttg

atg

gac

ctt

gga

cag

ttt

eta

ctg

ttt

tgt

cat

atc

tet

1146

Thr

Leu

Leu

Met

Asp

Leu

Gly

Gin

Phe

Leu

Leu

Phe

Cys

His

Ile

Ser

300

305

310

tcc

cac

caa

cat

gat

ggc

atg

gaa

get

tat

gtc

aaa

gta

gac

age

tgt

1194

Ser

His

Gin

His

Asp

Gly

Met

Glu

Ala

Tyr

Val

Lys

Val

Asp

Ser

Cys

315

320

325

cca

gag

gaa

ccc

caa

eta

ega

atg

aaa

aat

aat

gaa

gaa

gcg

gaa

gac

1242

Pro

Glu

Glu

Pro

Gin

Leu

Arg

Met

Lys

Asn

Asn

Glu

Glu

Ala

Glu

Asp

330

335

340

345

Łat

gat

gat

gat

ctt

act

gat

tet

gaa

atg

gat

gtg

gtc

agg

ttt

gat

1290

Tyr

Asp

Asp

Asp

Leu

Thr

Asp

Ser

Glu

Met

Asp

Val

Val

Arg

Phe

Asp

350

355

360

gat

gac

aac

tet

cct

tcc

ttt

atc

caa

att

cgc

tea

gtt

gee

aag

aag

1338

Asp

Asp

Asn

Ser

Pro

Ser

Phe

Ile

Gin

Ile

Arg

Ser

Val

Ala

Lys

Lys

365

370

375

cat

cct

aaa

act

tgg

gta

cat

tac

att

get

get

gaa

gag

gag

gac

tgg

1386

His

Pro

Lys

Thr

Trp

Val

His

Tyr

Ile

Ala

Ala

Glu

Glu

Glu

Asp

Trp

380

385

390

gac

tat

get

ccc

tta

gtc

ctc

gee

ccc

gat

gac

aga

agt

tat

aaa

agt

1434

Asp

Tyr

Ala

Pro

Leu

Val

Leu

Ala

Pro

Asp

Asp

Arg

Ser

Tyr

Lys

Ser

395

400

405

caa

tat

ttg

aac

aat

ggc

cct

cag

cgg

att

ggt

agg

aag

tac

aaa

aaa

1482

Gin

Tyr

Leu

Asn

Asn

Gly

Pro

Gin

Arg

Ile

Gly

Arg

Lys

Tyr

Lys

Lys

410

415

420

425

gtc

ega

ttt

atg

gca

tac

aca

gat

gaa

acc

ttt

aag

act

cgt

gaa

get

1530

Val

Arg

Phe

Met

Ala

Tyr

Thr

Asp

Glu

Thr

Phe

Lys

Thr

Arg

Glu

Ala

430

435

440

att

cag

cat

gaa

tea

gga

atc

ttg

gga

cct

tta

ctt

tat

ggg

gaa

gtt

1578

Ile

Gin

His

Glu

Ser

Gly

Ile

Leu

Gly

Pro

Leu

Leu

Tyr

Gly

Glu

Val

445

450

455

gga

gac

aca

ctg

ttg

att

ata

ttt

aag

aat

caa

gca

age

aga

cca

tat

1626

Gly Asp

Thr

Leu

Leu

Ile

Ile

Phe

Lys

Asn

Gin

Ala

Ser

Arg

Pro

Tyr

460

465

470

aac

atc

tac

cct

cac

gga

atc

act

gat

gtc

cgt

cct

ttg

tat

tea

agg

1674

Asn

Ile

Tyr

Pro

His

Gly

Ile

Thr

Asp

Val

Arg

Pro

Leu

Tyr

Ser

Arg

475

480

485

aga

tta

cca

aaa

ggt

gta

aaa

cat

ttg

aag

gat

ttt

cca

att

ctg

cca

1722

Arg

Leu

Pro

Lys

Gly

Val

Lys

His

Leu

Lys

Asp

Phe

Pro

Ile

Leu

Pro

490

495

500

505

PL 202 936 B1

gga

gaa

ata

ttc

aaa

tat

aaa

tgg

aca

gtg

act

gta

gaa

gat

ggg

cca

1770

Gly

Glu

Ile

Ehe

Lys 510

Tyr

Lys

Trp

Thr

Val 515

Thr

Val

Glu

Asp

Gly 520

Pro

act

aaa

tca

gat

cct

cgg

tgc

ctg

acc

cgc

tat

tac

tct

agt

ttc

gtt

1818

Thr

Lys

Ser

Asp 525

Pro

Arg

Cys

Leu

Thr 530

Arg

Tyr

Tyr

Ser

Ser 535

Phe

Val

aat

atg

gag

aga

gat

eta

gct

tca

gga

ctc

att

ggc

cct

ctc

ctc

atc

1866

Asn

Met

Glu 540

Arg

Asp

Leu

Ala

Ser 545

Gly

Leu

Ile

Gly

Pro 550

Leu

Leu

Ile

tgc

tac

aaa

gaa

tct

gta

gat

caa

aga

gga

aac

cag

ata

atg

tca

gac

1914

Cys

Tyr 555

Lys

Glu

Ser

Val

Asp 560

Gin

Arg

Gly

Asn

Gin 565

Ile

Met

Ser

Asp

aag

agg

aat

gtc

atc

ctg

ttt

tct

gta

ttt

gat

gag

aac

ega

agc

tgg

1962

Lys 570

Arg

Asn

Val

Ile

Leu 575

Phe

Ser

Val

Phe

Asp 580

Glu

Asn

Arg

Ser

Trp 585

tac

ctc

aca

gag

aat

ata

caa

cgc

ttt

ctc

ccc

aat

cca

gct

gga

gtg

2010

Tyr

Leu

Thr

Glu

Asn 590

Ile

Gin

Arg

Phe

Leu 595

Pro

Asn

Pro

Ala

Gly 600

Val

cag

ctt

gag

gat

cca

gag

ttc

caa

gee

tcc

aac

atc

atg

cac

agc

atc

2058

Gin

Leu

Glu

Asp 605

Pro

Glu

Phe

Gin

Ala 610

Ser

Asn

Ile

Met

His 615

Ser

Ile

aat

ggc

tat

gtt

ttt

gat

agt

ttg

cag

ttg

tca

gtt

tgt

ttg

cat

gag

2106

Asn

Gly

Tyr 620

Val

Phe

Asp

Ser

Leu 625

Gin

Leu

Ser

Val

Cys 630

Leu

His

Glu

gtg

gca

tac

tgg

tac

att

eta

agc

att

gga

gca

cag

act

gac

ttc

ctt

2154

Val

Ala 635

Tyr

Trp

Tyr

Ile

Leu 640

Ser

Ile

Gly

Ala

Gin 645

Thr

Asp

Phe

Leu

tct

gtc

ttc

ttc

tct

gga

tat

acc

ttc

aaa

cac

aaa

atg

gtc

tat

gaa

2202

Ser 650

val

Phe

Phe

Ser

Gly 655

Tyr

Thr

Phe

Lys

His 660

Lys

Met

Val

Tyr

Glu 665

gac

aca

ctc

acc

eta

ttc

cca

ttc

tca

gga

gaa

act

gtc

ttc

atg

teg

2250

Asp

Thr

Leu

Thr

Leu 670

Phe

Pro

Phe

Ser

Gly 675

Glu

Thr

Val

Phe

Met 680

Ser

atg

gaa

aac

cca

ggt

eta

tgg

att

ctg

ggg

tgc

cac

aac

tca

gac

ttt

2298

Met

Glu

Asn

Pro 685

Gly

Leu

Trp

Ile

Leu 690

Gly

Cys

His

Asn

Ser 695

Asp

Phe

cgg

aac

aga

ggc

atg

acc

gee

tta

ctg

aag

gtt

tct

agt

tgt

gac

aag

2346

Arg

Asn

Arg 700

Gly

Met

Thr

Ala

Leu 705

Leu

Lys

Val

Ser

ser 710

Cys

Asp

Lys

aac

act

ggt

gat

tat

tac

gag

gac

agt

tat

gaa

gat

att

tca

gca

tac

2394

Asn

Thr 715

Gly

Asp

Tyr

Tyr

Glu 720

Asp

Ser

Tyr

Glu

Asp 725

Ile

Ser

Ala

Tyr

PL 202 936 B1

ttg

ctg

agt

aaa

aac

aat

gcc

att

gaa

cca

aga

agc

ttc

tcc

cag

aat

2442

Leu 730

Leu

Ser

Lys

Asn

Asn 735

Ala

Ile

Glu

Pro

Arg 740

Ser

Phe

Ser

Gln

Asn 745

tca

aga

cac

cct

agc

act

agg

caa

aag

caa

ttt

aat

gcc

acc

aca

att

24S0

Ser

Arg

His

Pro

Ser 750

Thr

Arg

Gln

Lys

Gln 755

Phe

Asn

Ala

Thr

Thr 760

Ile

cca

gaa

aat

gac

ata

gag

aag

act

gac

cct

tgg

ttt

gca

cac

aga

aca

2538

Pro

Glu

Asn

Asp 765

Ile

Glu

Lys

Thr

Asp 770

Pro

Trp

Phe

Ala

His 775

Arg

Thr

cct

atg

cct

aaa

ata

caa

aat

gtc

tcc

tct

agt

gat

ttg

ttg

atg

ctc

2586

Pro

Met

Pro 780

Lys

Ile

Gln

Asn

Val 785

Ser

Ser

Ser

Asp

Leu 790

Leu

Met

Leu

ttg

ega

cag

agt

cct

act

cca

cat

ggg

eta

tcc

tta

tct

gat

ctc

caa

2634

Leu

Arg 795

Gln

Ser

Pro

Ttir

Pro 800

His

Gly

Leu

Ser

Leu 805

Ser

Asp

Leu

Gln

gaa

gcc

aaa

tat

gag

act

ttt

tct

gat

gat

cca

tca

cct

gga

gca

ata

2682

Glu 810

Ala

Lys

Tyr

Glu

Thr 815

Phe

Ser

Asp

Asp

Pro 820

Ser

Pro

Gly

Ala

Ile 825

gac

agt

aat

aac

agc

ctg

tct

gaa

atg

aca

cac

ttc

agg

cca

cag

ctc

2730

Asp

Ser

Asn

Asn

Ser 830

Leu

Ser

Glu

Met

Thr 835

His

Phe

Arg

Pro

Gln 840

Leu

cat

cac

agt

ggg

gac

atg

gta

ttt

acc

cct

gag

tca

ggc

ctc

caa

tta

2778

His

His

Ser

Gly 845

Asp

Met

Val

Phe

Thr 850

Pro

Glu

Ser

Gly

Leu 855

Gln

Leu

aga

tta

aat

gag

aaa

ctg

ggg

aca

act

gca

gca

aca

gag

ttg

aag

aaa

2826

Arg

Leu

Asn 860

Glu

Lys

Leu

Gly

Thr 855

Thr

Ala

Ala

Thr

Glu 870

Leu

Lys

Lys

ctt

gat

ttc

aaa

gtt

tct

agt

aca

tca

aat

aat

ctg

att

tca

aca

att

2874

Leu

Asp 875

Ehe

Lys

Val

Ser

Ser 880

Thr

Ser

Asn

Asn

Leu 885

Ile

Ser

Thr

Ile

cca

tca

gac

aat

ttg

gca

gca

ggt

act

gat

aat

aca

agt

tcc

tta

gga

2922

Pro 890

Ser

Asp

Asn

Leu

Ala B95

Ala

Gly

Thr

Asp

Asn 900

Thr

Ser

Ser

Leu

Gly 905 \

CCC

cca

agt

atg

cca

gtt

cat

tat

gat

agt

caa

tta

gat

acc

act

eta

2970

Pro

Pro

Ser

Met

Pro 910

Val

His

Tyr

Asp

Ser 915

Gln

Leu

Asp

Thr

Thr 920

Leu

ttt

ggc

aaa

aag

tca

tct

ccc

ctt

act

gag

tct

ggt

gga

cct

ctg

agc

3018

Phe

Gly

Lys

Lys 925

Ser

Ser

Pro

Leu

Thr 930

Glu

Ser

Gly

Gly

Pro 935

Leu

Ser

ttg

agt

gaa

gaa

aat

aat

gat

tca

aag

ttg

tta

gaa

tca

ggt

tta

atg

3066

Leu

Ser

Glu

Glu

Asn

Asn

Asp

Ser

Lys

Leu

Leu

Glu

Ser

Gly

Leu

Met

Ο 945 950

PL 202 936 B1

aat Asn	agc Ser 955	caa gaa Gin Glu	agt tca tgg gga aaa aat gta teg tca aca gag agt	3114
Ser	Ser Trp Gly 960	Lys Asn	Val	Ser 965	Ser	Thr Glu	Ser
ggt	agg	tta ttt	aaa	ggg aaa aga	gct cat	gga	cct	gct	ttg ttg	act	3162
Gly 970	Arg	Leu Phe	Lys	Gly Lys Arg 975	Ala His	Gly 980	Pro	Ala	Leu Leu	Thr 9Θ5
aaa	gat	aat gcc	tta	ttc aaa gtt	agc atc	tct	ttg	tta	aag aca	aac	3210
Lys	Asp	Asn Ala	Leu 990	Phe Lys Val	Ser Ile 995	Ser	Leu	Leu	Lys Thr 1000	Asn
aaa	act	tcc aat	aat	tca gca act	aat aga	aag	act	cac	att gat	ggc	3258
Lys	Thr	Ser Asn 1005	Asn	Ser Ala Thr Asn Arg 1010	Lys	Thr	His	Ile Asp 1015	Gly
cca	tca	tta tta	att	gag aat agt	cca tca	gtc	tgg	caa	aat ata	tta	3306
Pro	Ser Leu Leu 1020	Ile	Glu Asn Ser 1025	Pro Ser	Vai	Trp Gin 1030	Asn Ile	Leu
gaa	agt	gac act	gag	ttt aaa aaa	gtg aca	cct	ttg	att	cat gac	aga	3354
Glu Ser 1035	Asp Thr	Glu	Phe Lys Lys v 1040	Val Thr	Pro Leu 1045	Ile	His Asp	Arg
atg	ctt	atg gac	aaa	aat gct aca	gct ttg	agg	eta	aat	cat atg	tca	3402
Met Leu 1050	Met Asp	Lys Asn Ala Thr 1055	Ala Leu Arg 1060	Leu	Asn	His Met Ser 1065
aat	aaa	act act	tca	tca aaa aac	atg gaa	atg	gtc	caa	cag aaa	aaa	3450
Asn	Lys	Thr Thr Ser 1070	Ser Lys Asn	Met Glu 1075	Met	Val	Gin	Gin Lys 1080	Lys
gag	ggc	ccc att	cca	cca gat gca	caa aat	cca	gat	atg	teg ttc	ttt	3498
Glu	Gly	Pro Ile 1085	Pro	Pro Asp Ala Gin Asn 1090	Pro	ASp	Met Ser Phe 1095	Phe
aag	atg	eta ttc	ttg	cca gaa tca	gca agg	tgg	ata	caa	agg act	cat	3546
Lys	Met Leu Phe 1100	Leu	Pro Glu Ser 1105	Ala Arg	Trp	Ile Gin 1110	Arg Thr	His
gga	aag	aac tct	ctg	aac tct ggg	caa ggc	ccc	agt	cca	aag caa	tta	3594
Gly Lys 1115	Asn Ser	Leu	Asn Ser Gly 1120	Gin Gly	Pro Ser 1125	Pro	Lys Gin	Leu
gta	tcc	tta gga	cca	gaa aaa tct	gtg gaa	ggt	cag	aat	ttc ttg	tct	3642
Val 113 0	Ser 1	Leu Gly	Pro Glu Lys Ser 1135	Val Glu Gly 1140	Gin	Asn	Phe Leu Ser 1145
gag	aaa	aac aaa	gtg	gta gta gga	aag ggt	gaa	ttt	aca	aag gac	gta	3690
Glu	Lys	Asn Lys Val 1150	Val Val Gly	Lys Gly 1155	Glu	Phe	Thr	Lys Asp 1160	Val
gga	ctc	aaa gag	atg	gtt ttt cca	agc agc	aga	aac	eta	ttt ctt	act	3738
Gly	Leu	Lys Glu	Met	Val Phe Pro	Ser Ser	Arg	Asn	Leu	Phe Leu	Thr

1155 1170 1175

PL 202 936 B1

aac Asn	ttg gat Leu Asp 1180	aat Asn	tta Leu	cat gaa aat aat aca cac aat caa gaa aaa	aaa Lys	3786
His	Glu Asn 1185	Asn Thr	His Asn Gin 1190	Glu	Lys
att	cag gaa	gaa	ata	gaa	aag aag	gaa aca	tta atc caa	Hag	aat	gta	3834
Ile	Gin Glu	Glu	Ile	Glu	Lys Lys	Glu Thr	Leu Ile Gin	Glu	Asn	Val
1195			1200		1205
gtt	ttg cct	cag	ata	cat	aca gtg	act ggc	act aag aat	ttc	atg	aag	3882
Val	Leu Pro	Gin	Ile	His	Thr Val	Thr Gly	Thr Lys Asn	Phe	Met	Lys
1210		1215		1220		1225
aac	ctt ttc	tta	ctg	agc	act agg	caa aat	gta gaa ggt	tca	tat	gag	3930
Asn	Leu Phe	Leu	Leu	Ser	Thr Arg	Gin Asn	Val Glu Gly	Ser	Tyr	Glu
		1230			1235		1240
ggg	gca tat	get	cca	gta	ctt caa	gat ttt	agg tca tta	aat	gat	tca	3978
Gly	Ala Tyr	Ala	Pro	Val	Leu Gin	Asp Phe	Arg Ser Leu	Asn	Asp	Ser
	1245			1250	1255
aca	aat aga	aca	aag	aaa	cac aca	get cat	ttc tca aaa	aaa	ggg	gag	4026
Thr	Asn Arg	Thr	Lys	Lys	His Thr	Ala His	Phe Ser Lys	Lys	Gly	Glu
	1260				1265		1270
gaa	gaa aac	ttg	gaa	ggc	ttg gga	aat caa	acc aag caa	att	gta	gag	4074
Glu	Glu Asn	Leu	Glu	Gly	Leu Gly	Asn Gin	Thr Lys Gin	Ile	Val	Glu
1275			1280		1285
aaa	tat gca	tgc	acc	aca	agg ata	tct cct	aat aca agc	cag	cag	aat	4122
Lys	Tyr Ala	Cys	Thr	Thr	Arg Ile	Ser Pro	Asn Thr Ser	Gin	Gin	Asn
1290		ląss		1300		1305
ttt	gtc acg	caa	cgt	agt	aag aga	get ttg	aaa caa ttc	aga	ctc	cca	4170
Phe	Val Thr	Gin	Arg	Ser	Lys Arg	Ala Leu	Lys Gin Phe	Arg	Leu	Pro
		1310			1315		1320
eta	gaa gaa	aca	gaa	ctt	gaa aaa	agg ata	att gtg gat	gac	acc	tca	4218
Leu	Glu Glu	Thr	Glu	Leu	Glu Lys	Arg Ile	Ile Val Asp	Asp	Thr	Ser
	1325			1330	1335
acc	cag tgg	tcc	aaa	aac	atg aaa	cat ttg	acc ccg agc	acc	ctc	aca	4266
Thr	Gin Trp	Ser	Lys	Asn	Met Lys	His Leu	Thr Pro Ser	Thr	Leu	Thr

1340 1345 1350 cag ata gac tac aat gag aag gag aaa ggg gcc att act cag tct ccc 4314

Gin, Ile Asp Tyr Asn Glu Lys Glu Lys Gly Ala Ile Thr Gin Ser Pro

1355 1360 1365 tta tca gat tgc ctt acg agg agt cat agc atc cct caa gca aat aga 4362

Leu Ser Asp Cys Leu Thr Arg Ser His Ser Ile Pro Gin Ala Asn Arg

1370 1375 1380 1385

tct

cca

tta

ccc

att

gca

aag

gta

tca

tca

ttt

cca

tct

att

aga

cct

4410

Ser

Pro

Leu

Pro

Ile

Ala

Lys

Val

Ser

Ser

Phe

Pro

Ser

Ile

Arg

Pro

1390 1395 1400

PL 202 936 B1

ata Ile

tat Tyr

ctg acc Leu Thr 1405

agg Arg

gtc Val

eta Leu

ttc caa Phe Gin 1410

gac Asp

aac Asn

tct Ser

tct cat Ser His 1415

ctt Leu

cca Pro

4458

gca

gca

tct tat

aga

aag

aaa

gat tct

srsrsr

gtc

caa

gaa age

agt

cat

4506

Ala

Ala

Ser Tyr

Arg

Lys

Lys

Asp Ser

Gly

Val

Gin

Glu Ser

Ser

His

1420

1425

1430

ttc

tta

caa gga

gcc

aaa

aaa

aat aac

ctt

tct

tta

gcc att

eta

acc

4554

Phe

Leu

Gin Gly

Ala

Lys

Lys

Asn Asn

Leu

Ser

Leu

Ala Ile

Leu

Thr

1435

1440

1445 ttg gag atg act ggt gat caa aga gag gtt ggc tcc ctg ggg aca agt Leu Glu Met Thr Gly Asp Gin Arg Glu Val Gly Ser Leu Gly Thr Ser 1450 1455 1460 1465 gcc aca aat tca gtc aca tac aag aaa gtt gag aac act gtt ctc ccg Ala Thr Asn Ser Val Thr Tyr Lys Lys Val Glu Asn Thr Val Leu Pro

1470 1475 1480 aaa cca gac ttg ccc aaa aca tct ggc aaa gtt gaa ttg ctt cca aaa Lys Pro Asp Leu Pro Lys Thr Ser Gly Lys Val Glu Leu Leu Pro Lys

1485 1490 1495 gtt cac att tat cag aag gac eta ttc cct acg gaa act age aat ggg Val His Ile Tyr Gin Lys Asp Leu Phe Pro Thr Glu Thr Ser Asn Gly

1500 1505 1510 tct cct ggc cat ctg gat ctc gtg gaa ggg age ctt ctt cag gga aca Ser Pro Gly His Leu Asp Leu Val Glu Gly Ser Leu Leu Gin Gly Thr

1515 1520 1525 gag gga gcg att aag tgg aat gaa gca aac aga cct gga aaa gtt ccc Glu Gly Ala Ile Lys Trp Asn Glu Ala Asn Arg Pro Gly Lys Val Pro 1530 1535 1540 1545 ttt ctg aga gta gca aca gaa age tct gca aag act ccc tcc aag eta Phe Leu Arg Val Ala Thr Glu Ser Ser Ala Lys Thr Pro Ser Lys Leu

1550 1555 1560 ttg gat cct ctt get tgg gat aac cac tat ggt act cag ata cca aaa Leu Asp Pro Leu Ala Trp Asp Asn His Tyr Gly Thr Gin Ile Pro Lys

1565 1570 1575 gaa gag tgg aaa tcc caa gag aag tca cca gaa aaa aca get ttt aag Glu Glu Trp Lys Ser Gin Glu Lys Ser Pro Glu Lys Thr Ala Phe Lys

1580 1585 1590 aaa aag gat acc att ttg tcc ctg aac get tgt gaa age aat cat gca Lys Lys Asp Thr Ile Leu Ser Leu Asn Ala Cys Glu Ser Asn His Ala

1595 1600 1605 ata gca gca ata aat gag gga caa aat aag ccc gaa ata gaa gtc acc Ile Ala Ala Ile Asn Glu Gly Gin Asn Lys Pro Glu Ile Glu Val Thr 1610 1615 1620 1625

4602

4650

4698

4746

4794

4842

4690

4938

4986

5034

5082

PL 202 936 B1

tgg gca Trp Ala	aag caa ggt agg act gaa agg ctg tgc tct caa aac cca cca	5130
Lys Gin Gly 1630	Arg	Thr	Glu	Arg Leu 1635	Cys	Ser	Gin	Asn Pro 1640	Pro ,
gtc ttg	aaa cgc cat	caa	cgg	gaa	ata act	cgt	act	act	ctt cag	tca	5178
Val Leu	Lys Arg His 1645	Gin	Arg	Glu	Ile Thr 1650	Arg	Thr	Thr	Leu Gin 1655	Ser
gat caa	gag gaa att	gac	tat	gat	gat acc	ata	tca	gtt	gaa atg	aag	5226
Asp Gin Glu Glu Ile 1660	Asp	Tyr Asp 1665	Asp Thr	Ile	Ser Val 1670	Glu Met	Lys
aag gaa	gat ttt gac	att	tat	gat	gag gat	gaa	aat	cag	agc ccc	cgc	5274
Lys Glu 1675	Asp Phe Asp	Ile Tyr 1680	Asp	Glu Asp	Glu Asn 1685	Gin	Ser Pro	Arg
agc ttt	caa aag aaa	aca	ega	cac	tat ttt	att	gct	gca	gtg gag	agg	5322
Ser Phe 1690	Gin Lys Lys Thr 1695	Arg	Gis	Tyr Phe Ile 1700	Ala	Ala	Val Glu Arg 1705
ctc tgg	gat tat ggg	atg	agt	agc	tcc cca	cat	gtt	eta	aga aac	agg	5370
Leu Trp	Asp Tyr Gly 1710	Met	Ser	Ser	Ser Pro 1715	His	Val	Leu	Arg Asn 1720	Arg
gct cag	agt ggc agt	gtc	cct	cag	ttc aag	aaa	gtt	gtt	ttc cag	gaa	5418
Ala Gin	Ser Gly Ser 1725	Val	Pro	Gin Phe Lys 1730	Lys	Val	Val Phe Gin .1735	Glu
ttt act	gat ggc tcc	ttt	act	cag	ccc tta	tac	cgt	gga	gaa eta	aat	5466
Phe Thr Asp Gly Ser 1740	Phe	Thr Gin 1745	Pro Leu	Tyr	Arg Gly 1750	Glu Leu	Asn
gaa cat	ttg gga ctc	ctg	ggg	cca	tat ata	aga	gca	gaa	gtt gaa	gat	5514
Glu His 1755	Leu Gly Leu	Leu Gly 1760	Pro	Tyr Ile	Arg Ala 1765	Glu	Val Glu	Asp
aat atc	atg gta act	ttc	aga	aat	cag gcc	tct	cgt	ccc	tat tcc	ttc	5562
Asn Ile 1770	Met Val Thr Phe 1775	Arg	Asn	Gin Ala Ser 1780	Arg	Pro	Tyr Ser Phe 1785
tat tct	agc ctt att	tct	tat	gag	gaa gat	cag	agg	caa	gga gca	gaa	5610
Tyr Ser	Ser Leu Ile 1790	Ser	Tyr	Glu	Glu Asp 1795	Gin	Arg	Gin	Gly Ala 1800	Glu
cct aga	aaa aac ttt	gtc	aag	cct	aat gaa	acc	aaa	act	tac ttt	tgg	5658
Pro Arg	Lys Asn Phe 1805	Val	Lys	Pro Asn Glu 1810	Thr	Lys	Thr Tyr Phe 1815	Trp
aaa gtg	caa cat cat	atg	gca	ccc	act aaa	gat	gag	ttt	gac tgc	aaa	5706
Lys Val Gin His His 1820	Met	Ala Pro 1825	Thr Lys	Asp	Glu Phe 1830	Asp Cys	Lys
gcc tgg gct tat ttc	tct	gat	gtt	gac ctg	gaa	aaa	gat	gtg cac	tca	5754
Ala Trp Ala Tyr Phe	Ser	Asp Val	Asp Leu	Glu	Lys Asp	Val His	Ser

1835 1840 1845

PL 202 936 B1 ggc ctg att gga ccc ctt ctg gtc tgc cac act aac aca ctg aac cct 5802

Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro 18S0 1B55 1860 1865 get cat ggg aga caa gtg aca gta cag gaa ttt get ctg ttt ttc acc 5850

Ala His Gly Arg Gin Val Thr Val Gin Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr

1870 1875 1880

atc ttt gat gag	acc aaa age tgg tac ttc act	gaa aat atg gaa	aga Arg	5898
Ile Phe	Asp Glu 1885	Thr Lys	Ser	Trp Tyr 1890	Phe Thr	Glu	Asn Met Glu 1895
aac tgc	agg get	ccc tgc	aat	atc cag	atg gaa	gat	ccc act ttt	aaa	5946
Asn Cys	Arg Ala	Pro Cys	Asn	Ile Gin	Met Glu	Asp	Pro Thr Phe	Lys
1900		1905		1910
gag aat	tat cgc	ttc cat	gca	atc aat	ggc tac	ata	atg gat aca	eta	5994

Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu 1915 1920 1925 cct ggc tta gta atg get cag gat caa agg att ega tgg tat ctg ctc 6042

Pro Gly Leu Val Met Ala Gin Asp Gin Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu 1930 1935 1940 1945

age Ser

atg Met

ggc Gly

age aat Ser Asn 1950

gaa Glu

aac Asn

atc Ile

cat tct His Ser 1955

att Ile

cat His

ttc Phe

agt gga Ser Gly 1960

cat His

6090

gtg

ttc

act

gta ega

aaa

aaa

gag

gag tat

aaa

atg

gca

ctg tac

aat

6138

Val

Phe

Thr Val Arg 1965

Lys

Lys

Glu Glu Tyr 1970

Lys

Met

Ala Leu Tyr 1975

Asn

ctc

tat

cca

ggt gtt

ttt

gag

aca

gtg gaa

atg

tta

cca

tcc aaa

get

6186

Leu

Tyr Pro 1980

Gly Val

Phe

Glu Thr 1985

Val Glu

Met

Leu Pro 1990

Ser Lys

Ala

gga

att

tgg

cgg gtg

gaa

tgc

ctt

att ggc

gag

cat

eta

cat get

ggg

6234

Gly Ile 1995

Trp

Arg Val

Glu Cys 2000

Leu

Ile Gly

Glu His 2005

Leu

His Ala

Gly

atg

age

aca

ctt ttt

ctg

gtg

tac

age aat

aag

tgt

cag

act ccc

ctg

6282

Met Ser 2010

Thr

Leu Phe Leu 2015

Val

Tyr

Ser Asn Lys 2020

Cys

Gin

Thr Pro Leu 2025

gga

atg

get

tct gga

cac

att

aga

gat ttt

cag

att

aca

get tca

gga

6330

Gly

Met

Ala

Ser Gly 2030

His

Ile

Arg

Asp Phe 2035

Gin

Ile

Thr

Ala Ser 2040

Gly

caa

tat

gga

cag tgg

gcc

cca

aag

ctg gcc

aga

ctt

cat

tat tcc

gga

6378

Gin

Tyr

Gly Gin Trp 2045

Ala

Pro

Lys Leu Ala 2050

Arg

Leu

His Tyr Ser 2055

Gly

tca

atc

aat

gcc tgg

age

acc

aag

gag ccc

ttt

tct

tgg atc aag

gtg

6426

Ser

Ile

Asn

Ala Trp

Ser

Thr

Lys Glu Pro

Phe

Ser

Trp

Ile Lys

Val

2060 2065 2070

PL 202 936 B1

gat ctg ttg gca

cca Pro

atg att att cac ggc atc aag acc

ca9 Gin

ggt Gly

gcc Ala

64 74

Asp Leu 2075

Leu

Ala

Met Ile 2080

Ile His

Gly

Ile Lys 2085

Thr

cgt cag

aag

ttc

tcc

agc ctc

tac atc

tct

cag ttt

atc

atc

atg

tat

6522

Arg Gin 2090

Lys

Phe

Ser Ser Leu 2095

Tyr Ile

Ser Gin Phe 2100

Ile

Ile

Met Tyr 2105

agt ctt

gat

399

aag

aag tgg

cag act

tat

ega gga

aat

tcc

act

gga

6570

Ser Leu

Asp

Gly Lys 2110

Lys Trp

Gin Thr Tyr Arg Gly 2115

Asn

Ser Thr 2120

Gly

acc tta

atg

gtc

ttc

ttt ggc

aat gtg

gat

tca tct

999

ata

aaa

cac

6518

Thr Leu

Met Val 2125

Phe

Phe Gly

Asn Val 213 0

Asp

Ser Ser

Gly Ile 2135

Lys

His

aat att

ttt

aac

cct

cca att

att gct

ega

tac atc

cgt

ttg

cac

cca

, 6666

Asn Ile Phe 2140

Asn

Pro

Pro Ile Ile Ala 2145

Arg

Tyr Ile Arg 2150

Leu

His

Pro

act cat

tat

agc

att

cgc agc

act ctt

cgc

atg gag

ttg

atg

ggc

tgt

6714

Thr His 2155

Tyr

Ser

Ile

Arg Ser 2160

Thr Leu

Arg

Met Glu 2165

Leu

Met

Gly

Cys

gat tta

aat

agt

tgc

agc atg

cca ttg

gga

atg gag

agt

aaa

gca

ata

6762

Asp Leu 2170

Asn

Ser

Cys Ser Met 2175

Pro Leu

Gly Met Glu 2180

Ser

Lys

Ala Ile 2185

tca gat

gca

cag

att

act gct

tca tcc

tac

ttt acc

aat

atg

ttt

gcc

6810

Ser Asp

Ala

Gin Ile 2190

Thr Ala

Ser Ser Tyr 2195

Phe Thr

Asn

Met Phe 2200

Ala

acc tgg

tct

cct

tca

aaa gct

ega ctt

cac

ctc caa

999

agg

agt

aat

6858

Thr Trp

Ser Pro 2205

Ser

Lys Ala

Arg Leu 2210

His

Leu Gin

Gly Arg 2215

Ser

Asn

gcc tgg

aga

cct

cag

gtg aat

aat cca

aaa

gag tgg

ctg

caa

gtg

gac

6906

Ala Trp Arg 2220

Pro

Gin

Val Asn Asn Pro 2225

Lys

Glu Trp Leu 2230

Gin

Val

Asp

ttc cag

aag

aca

atg

aaa gtc

aca gga

gta

act act

cag

gga

gta

aaa

6954

Phe Gin 2235

Lys

Thr

Met

Lys Val 2240

Thr Gly

Val

Thr Thr 2245

Gin

Gly

Val

Lys

tct ctg

ctt

acc

agc

atg tat

gtg aag

gag

ttc ctc

atc

tcc

agc

agt

7002

Ser Leu 2250

Leu

Thr

Ser Met Tyr 2255

Val Lys

Glu Phe Leu 2260

Ile

Ser

Ser Ser 2265

caa gat

ggc

cat

cag

tgg act

ctc ttt

ttt

cag aat

ggc

aaa

gta

aag

7050

Gin Asp

Gly

His Gin 2270

Trp Thr

Leu Phe Phe 2275

Gin Asn

Gly

Lys Val 2280

Lys

gtt ttt

cag

gga

aat

caa gac

tcc ttc

aca

cct gtg

gtg

aac

tct

eta

7098

Val Phe

Gin

Gly Asn

Gin Asp

Ser Phe

Thr

Pro Val

Val

Asn

Ser

Leu

2285 2280 2285

PL 202 936 B1

gac cca ccg tta ctg act cgc tac

ctt ega att cac ccc cag agt tgg

7146

Asp Pro Pro Leu Leu

Thr w

Arg Tyr 2305

Leu

Arg

Ile His Pro 2310

Gin Ser Trp

2300

gtg

cac

cag

att

gcc

ctg

agg atg

gag

gtt

ctg

ggc tgc

gag

gca

cag

7194

Val

His

Gin

Ile

Ala

Leu

Arg Met

Glu

Val

Leu

Gly Cys

Glu

Ala

Gin

2315 2320 2325 gac ctc tac tgagggtggc cactgcagca cctgccactg ccgtcacctc 7243

Asp Leu Tyr

2330

tccctcctca	gctccagggc	agtgtccctc	cctggcttgc	cttctacctt	tgtgctaaat	7303
cctagcagac	actgccttga	agcctcctga	attaactatc	atcagtcctg	catttctttg	7363
gtggggggcc	aggagggtgc	atccaattta	acttaactct	tacctatttt	ctgcagctgc	7423
tcccagatta	ctccttcctt	ccaatataac	taggcaaaaa	gaagtgagga	gaaacctgca	74S3
tgaaagcatt	cttccctgaa	aagttaggcc	tctcagagtc	accacttcct	ctgttgtaga	7543
aaaactatgt	gatgaaactt	tgaaaaagat	atttatgatg	ttaacatttc	aggttaagcc	7603
tcatacgttt	aaaataaaac	teteagttgt	ttattatcct	gatcaagcat	ggaacaaagc	7663
atgtttcagg	ateagateaa	tacaatcttg	gagtcaaaag	gcaaatcatt	tggacaatct	7723
gcaaaatgga	gagaatacaa	taactactac	agtaaagtct	gtttctgctt	ccttacacat	7783
agatataatt	atgttattta	gtcattatga	ggggcacatt	cttatctcca	aaactagcat	7843
tcttaaactg	agaattatag	atggggttca	agaatcccta	agtcccctga	aattatataa	7903
ggcattctgt	ataaatgcaa	atgtgcattt	ttctgacgag	tgtccataga	tataaagcca	7963
ttggtcttaa	ttctgaccaa	taaaaaaata	agtcaggagg	atgcaattgt	tgaaagcttt	8023
gaaataaaat	aacatgtctt	cttgaaattt	gtgatggcca	agaaagaaaa	tgatgatgac	8083
attaggette	taaaggacat	acatttaata	tttctgtgga	aatatgagga	aaatccatgg	8143
ttatctgaga	taggagatac	aaactttgta	attctaataa	tgcactcagt	ttactctctc	8203
cctctactaa	tttcctgctg	aaaataacac	aacaaaaatg	taacagggga	aattatatac	8263
cgtgactgaa	aactagagtc	ctacttacat	agttgaaata	tcaaggaggt	cagaagaaaa	8323
ttggactggt	gaaaacagaa	aaaacactcc	agtctgccat	atcaccacac	aataggatcc	8383
cccttcttgc	cctccacccc	cataagattg	tgaagggttt	actgctcctt	ccatctgcct	8443
gcaccccttc	actatgacta	cacagaactc	tcctgatagt	aaagggggct	ggaggcaagg	8503
ataagttata	gageagttgg	aggaagcatc	caaagactgc	aacccagggc	aaatggaaaa	8563

PL 202 936 B1

caggagatcc	taatatgaaa	gaaaaatgga	tcccaatctg	agaaaaggca	aaagaatggc	8623
tacttttttc	tatgctggag	tattttctaa	taatcctgct	tgacccttat	ctgacctctt	S6S3
tggaaactat	aacatagctg	tcacagtata	gtcacaatcc	acaaatgatg	caggtgcaaa	8743
tggtttatag	ccctgtgaag	ttcttaaagt	ttagaggcta	acttacagaa	atgaataagt	8803
tgttttgttt	tatagcccgjj	tagaggagtt	aaccccaaag	gtgatatggt	tttatttcct	8863
gttatgttta	acttgataat	cttattttgg	cattcttttc	ccattgacta	tatacatctc	8923
tatttctcaa	atgttcatgg	aactagctct	tttattttcc	tgctggtttc	ttcagtaatg	8983
agttaaataa	aacattgaca	cataca				9009

<210> 2 <211> 2332 <2l2> PRT <213> Homo sapiens

<400> 2 Ala Thr 1

Arg

Arg

Tyr 5

Tyr

Leu

Gly

Ala

val 10

Glu

Leu

Ser

Trp Asp 15

Tyr

Met

Gin

Ser

Asp 20

Leu

Gly

Glu

Leu

Pro 25

Val

Asp

Ala

Arg

Phe 30

Pro

Pro

Arg

Val

Pro 35

Lys

Ser

Phe

Pro

Phe 40

Asn

Thr

Ser

Val

Val 45

Tyr

Lys

Lys

Thr

Leu 50

Phe

Val

Glu

Phe

Thr 55

Val

His

Leu

Phe

Asn 60

Ile

Ala

Lys

Pro

Arg 65

Pro

Pro

Trp

Met

Gly 70

Leu

Leu

Gly

Pro

Thr 75

Ile

Gin

Ala

Glu

Val 80

Tyr

Asp

Thr

Val

Val 85

Ile

Thr

Leu

Lys

Asn 90

Met

Ala

Ser

His

Pro 95

Val

Ser

Leu

His

Ala ICO

Val

Gly

Val

Ser

Tyr 105

Trp

Lys

Ala

Ser

Glu 110

Gly

Ala

Glu

Tyr

Asp 115

Asp

Gin

Thr

Ser

Gin 120

Arg

Glu

Lys

Glu

Asp 125

Asp

Lys

Val

Phe

Pro 130

Gly

Gly

Ser

His

Thr 135

Tyr

Val

Trp

Gin

Val 140

Leu

Lys

Glu

Asn

Gly 145

Pro

Met

Ala

Ser

Asp 150

Pro

Leu

Cys

Leu

Thr 155

Tyr

Ser

Tyr

Leu

Ser 160

His

Val

Asp

Leu

Val 165

Lys

Asp

Leu

Asn

Ser 170

Gly

Leu

Ile

Gly

Ala 175

Leu

PL 202 936 B1

Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu 180 18S 190

His Lys Phe Tle Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp 195 200 205

His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser 210 215 220

Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg

225 230 235 240

Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His

245 250 255

Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu 260 265 270

Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile 275 280 285

Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly 290 295 300

Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met

305 310 315 320

Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg

325 330 335

Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp 340 345 350

Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe 355 360 365

Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His 370 375 380

Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu 385 390 395 '400 '

Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro 405 410 415

Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr 420 425 430

Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile 435 440 445

Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile ile 450 455 460

PL 202 936 B1

Phe 465

Lys

Asn

Gln

Ala

Ser 470

Arg

Pro

Tyr

Asn

Ile 475

Tyr

Pro

His

Gly

Ile 480

Thr

Asp

Val

Arg

Pro 485

Leu

Tyr

Ser

Arg

Arg 490

Leu

Pro

Lys

Gly

Val 495

Lys

His

Leu

Lys

Asp 500

Phe

Pro

Ile

Leu

Pro 505

Gly

Glu

Ile

Phe

Lys 510

Tyr

Lys

Trp

Thr

Val 515

Thr

Val

Glu

Asp

Gly 520

Pro

Thr

Lys

Ser

Asp 525

Pro

Arg

Cys

Leu

Thr 530

Arg

Tyr

Tyr

Ser

Ser 535

Phe

Val

Asn

Met

Glu 540

Arg

Asp

Leu

Ala

Ser 545

Gly

Leu

Ile

Gly

Pro 550

Leu

Leu

Ile

Cys

Tyr 555

Lys

Glu

Ser

Val

Asp 560

Gln

Arg

Gly

Asn

Gln 565

Ile

Met

Ser

Asp

Lys 570

Arg

Asn

Val

Ile

Leu 575

Phe

Ser

Val

Phe

Asp 5Θ0

Glu

Asn

Arg

Ser

Trp 585

Tyr

Leu

Thr

Glu

Asn 590

Ile

Gln

Arg

Phe

Leu 595

Pro

Asn

Pro

Ala

Gly 600

Val

Gln

Leu

Glu

Asp 605

Pro

Glu

Phe

Gln

Ala 610

Ser

Asn

Ile

Met

His 615

Ser

Ile

Asn

Gly

Tyr 620

Val

Phe

Asp

Ser

Leu 625

Gln

Leu

Ser

Val

Cys 630

Leu

His

Glu

Val

Ala 635

Tyr

Trp

Tyr

Ile

Leu 640

Ser

Ile

Gly

Ala

Gln 645

Thr

Asp

Phe

Leu

Ser 650

Val

Phe

Phe

Ser

Gly 655

Tyr

Thr

Phe

Lys

His 660

Lys

Met

Val

Tyr

Glu 665

Asp

Thr

Leu

Thr

Leu 670

Phe

Pro

Phe

Ser

Gly 675

Glu

Thr

Val

Phe

Met 680

Ser

Met

Glu

Asn

Pro 685

Gly

Leu

Trp

Ile

Leu 690

Gly

Cys

His

Asn

Ser 695

Asp

Phe

Arg

Asn

Arg 700

Gly

Met

Thr

Ala

Leu 705

Leu

Lys

Val

Ser

Ser 710

Cys

Asp

Lys

Asn

Thr 715

Gly

Asp

Tyr

Tyr

Glu 720

Asp

Ser

Tyr

Glu

Asp 725

Ile

Ser

Ala

Tyr

Leu 730

Leu

Ser

Lys

Asn

Asn 735

Ala

Ile

Glu

Pro

Arg

Ser

Phe

Ser

Gln

Asn

Ser

Arg

His

Pro

Ser

Thr

Arg

740 745 750

PL 202 936 B1

Gin Lys Gin Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Asp Ile Glu Lys
	755	760	765
Thr	Asp Pro Trp Phe Ala 770	His Arg 775	Thr Pro Met Pro Lys Ile Gin Asn 780
Val 785	Ser Ser Ser Asp Leu 790	Leu Met	Leu Leu Arg Gin Ser Pro Thr Pro 795 800
His	Gly Leu Ser Leu Ser 305	Asp Leu	Gin Glu Ala Lys Tyr Glu Thr Phe 810 815
Ser	Asp Asp Pro Ser Pro 820	Gly Ala	Ile Asp Ser Asn Asn Ser Leu Ser 825 830
Glu	Met Thr His Phe Arg 835	Pro Gin 840	Leu His His Ser Gly Asp Met Val 845
Phe	Thr Pro Glu Ser Gly 850	Leu Gin 855	Leu Arg Leu Asn Glu Lys Leu Gly 860
Thr 865	Thr Ala Ala Thr Glu 870	Leu Lys	Lys Leu Asp Phe Lys Val Ser Ser 875 880
Thr	Ser Asn Asn Leu Ile 835	Ser Thr	Ile Pro Ser Asp Asn Leu Ala Ala 890 895
Gly	Thr Asp Asn Thr Ser 900	Ser Leu	Gly Pro Pro Ser Met Pro Val His 905 910
Tyr	Asp Ser Gin Leu Asp 915	Thr Thr 920	Leu Phe Gly Lys Lys Ser Ser Pro 925
Leu	Thr Glu Ser Gly Gly 930	Pro Leu 935	Ser Leu Ser Glu Glu Asn Asn Asp 940 -
Ser 945	Lys Leu Leu Glu Ser 950	Gly Leu	Met Asn Ser Gin Glu Ser Ser Trp 955 960
Gly	Lys Asn Val Ser Ser 965	Thr Glu	Ser Gly Arg Leu phe Lys Gly Lys 970 975
Arg	Ala His Gly Pro Ala 980	Leu Leu	Thr Lys Asp Asn Ala Leu Phe Lys 985 990
Val	Ser Ile Ser Leu Leu 995	Lys Thr 1000	Asn Lys Thr Ser Asn Asn Ser Ala 1005
Thr Asn Arg Lys Thr His Ile Asp 1010 1015	Gly Pro Ser Leu Leu Ile Glu Asn 1020
Ser 025	Pro Ser Val Trp Gin Asn Ile 1030	Leu Glu Ser Asp Thr Glu Phe Lys 1035 1040

PL 202 936 B1

Lys Val Thr Pro Leu Ile His Asp Arg Met Leu Met Asp Lys Asn Ala 1045 1050 1055 Thr Ala Leu Arg Leu Asn His Met Ser Asn Lys Thr Thr Ser Ser Lys 1060 1065 1070

Asn Met Glu Met Val Gin Gin Lys Lys Glu Gly Pro Ile Pro Pro Asp 1075 1080 1085

Ala Gin Asn Pro Asp Met Ser Phe Phe Lys Met Leu Phe Leu Pro Glu 1090 1095 1100

Ser Ala 105	Arg	Trp Ile Gin Arg Thr His Gly Lys Asn Ser Leu Asn Ser
1110	1115	1120
Gly Gin	Gly	Pro Ser Pro 1125	Lys Gin Leu Val Ser Leu . 1130	Gly Pro Glu Lys 1135
Ser Val	Glu Gly Gin Asn 1140	Phe Leu Ser Glu Lys Asn 1145	Lys Val Val Val 1150
Gly Lys Gly 1155	Glu Phe Thr	Lys Asp Val Gly Leu Lys Glu Met Val Phe 1160 1165
Pro Ser 1170	Ser	Arg Asn Leu Phe Leu Thr Asn Leu Asp 1175 . 1180	Asn Leu His Glu
Asn Asn 185	Thr	His Asn Gin 1190	Glu Lys Lys Ile Gin Glu 1195	Glu Ile Glu Lys 1200
Lys Glu	Thr	Leu Ile Gin 1205	Glu Asn Val Val Leu Pro 1210	Gin Ile His Thr 1215
Val Thr	Gly Thr Lys Asn 1220	Phe Met Lys Asn Leu Phe 1225	Leu Leu Ser Thr 1230
Arg Gin Asn 1235	Val Glu Gly w	Ser Tyr Glu Gly Ala Tyr Ala Pro Val Leu 1240 1245
Gin Asp 1250	Phe	Arg Ser Leu Asn Asp Ser Thr Asn Arg 1255 1260	Thr Lys Lys His
Thr Ala 265	His	Phe Ser Lys 1270	Lys Gly Glu Glu Glu Asn 1275	Leu Glu Gly Leu 1280
Gly Asn	Gin	Thr Lys Gin 1285	Ile Val Glu Lys Tyr Ala 1290	Cys Thr Thr Arg 1295
Ile Ser	Pro	Asn Thr Ser	Gin Gin Asn Phe Val Thr	Gin Arg Ser Lys

1300 1305 1310

Arg Ala Leu Lys Gin Phe Arg Leu Pro Leu Glu Glu Thr Glu Leu Glu 1315 1320 1325

PL 202 936 B1

Lys Arg Ile Ile Val Asp Asp Thr Ser Thr Gin Trp Ser Lys Asn Met 1330 1335 1340

Lys His Leu Thr Pro Ser Thr Leu Thr Gin Ile Asp Tyr Asn Glu Lys 345 1350 1355 1360

Glu Lys Gly Ala Ile Thr Gin Ser Pro Leu Ser Asp Cys Leu Thr Arg 1365 1370 1375

Ser His Ser Ile Pro Gin Ala Asn Arg Ser Pro Leu Pro Ile Ala Lys 1380 1385 1390

Val Ser Ser Phe Pro Ser Ile Arg Pro Ile Tyr Leu Thr Arg Val Leu 1395 1400 1405

Phe Gin Asp Asn Ser Ser His Leu Pro Ala Ala Ser Tyr Arg Lys Lys
1410	1415	1420
Asp Ser Gly 425	Val Gin Glu Ser 1430	Ser His Phe Leu Gin Gly Ala Lys Lys 1435 1440
Asn Asn Leu	Ser Leu Ala Ile 1445	Leu Thr Leu Glu Met Thr Gly Asp Gin 1450 1455
Arg Glu Val Gly Ser Leu Gly 1460	Thr Ser Ala Thr Asn Ser Val Thr Tyr 1465 1470
Lys Lys Val 1475	Glu Asn Thr Val Leu Pro Lys Pro Asp Leu Pro Lys Thr 1480 1485
Ser Gly Lys 1490	Val Glu Leu Leu 1495	Pro Lys Val His Ile Tyr Gin Lys Asp 1500
Leu Phe Pro S05	Thr Glu Thr Ser 1510	Asn Gly Ser Pro Gly His Leu Asp Leu 1515 1520
val Glu Gly	Ser Leu Leu Gin 1525	Gly Thr Glu Gly Ala Ile Lys Trp Asn 1530 1535
Glu Ala Asn Arg Pro Gly Lys 1540	Val Pro Phe Leu Arg Val Ala Thr Glu 1545 1550
Ser Ser Ala 1555	Lys Thr Pro Ser Lys Leu Leu Asp Pro Leu Ala Trp Asp 1560 1565
Asn His Tyr 1570	V Gly Thr Gin Ile 1575	Pro Lys Glu Glu Trp Lys Ser Gin Glu 1580
Lys Ser Pro	Glu Lys Thr Ala	Phe Lys Lys Lys Asp Thr Ile Leu Ser

585 1590 1595 1600

Leu Asn Ala Cys Glu Ser Asn His Ala Ile Ala Ala Ile Asn Glu Gly 1605 1610 1615

PL 202 936 B1

Gin Asn Lys Pro Glu Ile Glu Val Thr Trp Ala Lys Gin Gly Arg Thr 1620 1625 1630

Glu Arg Leu Cys Ser Gin Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gin Arg 1635 1640 1645

Glu Ile 1650	Thr Arg Thr Thr Leu Gin Ser Asp Gin Glu Glu Ile Asp	Tyr
1655	1660
Asp Asp 665	Thr Ile Ser Val Glu 1670	Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr 1675 1680
Asp Glu	Asp Glu Asn Gin Ser 1685	Pro Arg Ser Phe Gin Lys Lys Thr 1690 1695	Arg
His Tyr	Phe Ile Ala Ala Val 1700	Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met 1705 1710	Ser
Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gin Ser Gly Ser Val 1715 1720 1725	Pro
Gin Phe 1730	Lys Lys Val Val Phe 1735	Gin Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe 1740	Thr
Gin Pro 745	Leu Tyr Arg Gly Glu 1750	Leu Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly 1755 1760
Pro Tyr	Ile Arg Ala Glu Val 1765	Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe 1770 1775	Arg
Asn Gin	Ala Ser Arg Pro Tyr 1780	Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser 1785 1790	Tyr
Glu Glu Asp Gin Arg Gin Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val 1795 1800 1805	Lys
Pro Asn	Glu Thr Lys Thr Tyr	Phe Trp Lys Val Gin His His Met	Ala

1810 1815 1820

Pro 825	Thr	Lys	Asp Glu Phe 1830	Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp
1835	1840
Val	Asp	Leu	Glu Lys Asp 1845	Val His Ser Gly Leu Ile Gly 1850	Pro Leu Leu 1855
Val	Cys	His Thr Asn Thr 1860	Leu Asa Pro Ala His Gly Arg Gin Val Thr 1865 1870
Val	Gin Glu 1875	Phe Ala Leu	Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu 1880 1885	Thr Lys Ser
Trp	Tyr	Phe	Thr Glu Asn	Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala	Pro Cys Asn

1890

1895

1900

PL 202 936 B1

Ile Gin Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala 905 1910 1915 1920

Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gin 1925 . 1930 1935

Asp Gin Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn 1940 1945 1950

Ile His Ser Ile His	Phe	Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys
	1955	1960	1965
Glu Glu Tyr Lys Met 1970	Ala Leu Tyr 1975	Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu 1980
Thr 985	Val Glu Met Leu Pro 1990	Ser Lys	Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys 1995 2000
Leu	Ile Gly Glu His 2005	Leu	His Ala	Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val 2010 2015
Tyr	Ser Asn Lys Cys 2020	Gin	Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile 2025 2030
Arg	Asp Phe Gin Ile 2035	Thr	Ala Ser 2040	Gly Gin Tyr Gly Gin Trp Ala Pro 2045
Lys Leu Ala Arg Leu 2050	His Tyr Ser 2055	Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr 2060
Lys 065	Glu Pro Phe Ser Trp 2070	Ile Lys	Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile 2075 2080
Ile	His Gly Ile Lys 2085	Thr	Gin Gly	Ala Arg Gin Lys Phe Ser Ser Leu 2090 2095
Tyr	Ile Ser Gin Phe 2100	Ile	Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp 2105 2110
Gin	Thr Tyr Arg Gly 2115	Asn	Ser Thr 2120	Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly 2125
Asn	Val Asp Ser Ser	Gly	Ile Lys	His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile

2130 2135 2140

Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser

145 2150 2155 2160

Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met

2165 2170 2175

Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gin Ile Thr Ala 2180 2185 2190

PL 202 936 B1

Ser Ser Tyr 2195	Phe Thr Asn	Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys	Ala
2200	2205
Arg Leu His	Leu Gin Gly Arg Ser Asn	Ala Trp Arg Pro Gin Vai	Asn
2210	2215	2220
Asn. Pro Lys	Glu Trp Leu	Gin Val Asp	Phe Gin Lys Thr Met Lys	Val
225	2230		2235 2240
Thr Gly Val	Thr Thr Gin	Gly Val Lys	Ser Leu Leu Thr Ser Met	Tyr
	2245		2250 2255
val Lys Glu	Phe Leu He	Ser Ser Ser	Gin Asp Gly His Gin Trp	Thr
2260	2265	2270
Leu Phe Phe	Gin Asn Gly Lys Val Lys	Val Phe Gin Gly Asn Gin	Asp
2275		2280	2285
Ser Phe Thr	Pro Val Val	Asn ser Leu	Asp Pro Pro Leu Leu Thr	Arg
2290	2295	2300
Tyr Leu Arg	Ile His Pro	Gin ser Trp	Val His Gin Ile Ala Leu	Arg
305	2310		2315 2320
Met Glu Val	Leu Gly Cys	Glu Ala Gin	Asp Leu Tyr ·'·'
	2325		2330

<210> 3 <211> 1130 <212> DNA <213 > Świński <400> 3

taagoaccct	aagacgtggg	tgcactacat	ctctgcagag	gaggaggact gggactacgc	60
ccccgcggtc	cccagcccca	gtgacagaag	ttataaaagt	ctctacttga acagtggtcc	120
tcagcgaatt	ggtaggaaat	acaaaaaagc	tcgattcgtc	gcttacacgg atgtaacatt	180
taagactcgt	aaagctattc	cgtatgaatc	aggaatcctg	ggacctttac	tttatggaga	240
agttggagac	acacttttga	ttatatttaa	gaataaagcg	agccgaccat	ataacatcta	300
ccctcatgga	atcactgatg	tcagcgcttt	gcacccaggg	agacttctaa	aaggttggaa	360
acatttgaaa	gacatgccaa	ttctgccagg	agagactt-tc	aagtataaat	ggacagtgac	420
tgtggaagat	gggccaacca	agtccgatcc	tcggtgcctg	acccgctact	actcgagctc	480
cattaatcta	gagaaagatc	tggcttcggg	actcattggc	cctctcctca	tctgctacaa	540
agaatctgta	gaccaaagag	gaaaccagat	gatgtcagac	aagagaaacg	tcatcctgtt	600
ttctgtattc	gatgagaatc	aaagctggta	cctcgcagag	aatattcagc	gcttcctccc	660

PL 202 936 B1

caatccggat	ggattacagc	cccaggatcc	agagttccaa	gcttctaaca	tcatgcacag	720
catcaatggc	tatgtttttg	atagcttgca	gctgtcggtt	tgtttgcacg	aggtggcata	780
ctggtacatt	ctaagtgttg	gagcacagac	ggacttcctc	tccgtcttct	tctctggcta	840
caccttcaaa	cacaaaatgg	tctatgaaga	cacactcacc	ctgttcccct	tctcaggaga	900
aacggtcttc	atgtcaatgg	aaaacccagg	tctctgggtc	ctagggtgcc	acaactcaga	960
cttgcggaac	agagggatga	cagccttact	gaaggtgtat	agttgtgaca	gggacattgg	1020
tgattattat	gacaacactt	atgaagatat	tccaggcttc	ttgctgagtg	gaaagaatgt	1080
cattgaaccc	agaagctttg	cccagaattc	aagaccccct	agtgcgagca		1130

<210> 4 <211> 368 <212> PRT <2ΐ_3> świński <400> 4

Ser 1

Val

Ala

Lys

Lys 5

His

Pro

Lys

Thr

Trp 10

Val

His

Tyr

Ile

Ser 15

Ala

Glu

Glu

Glu

Asp 20

Trp

Asp

Tyr

Ala

Pro 25

Ala

Val

Pro

Ser

Pro 30

Ser

Asp

Arg

Ser

Tyr 35

Lys

Ser

Leu

Tyr

Leu 40

Asn

Ser

Gly

Pro

Gin 45

Arg

Ile

Gly

Arg

Lys 50

Tyr

Lys

Lys

Ala

Arg 55

Phe

Val

Ala

Tyr

Thr 60

ASp

Val

Thr

Phe

Lys 65

Thr

Arg

Lys

Ala

Ile 70

Pro

Tyr

Glu

Ser

Gly 75

Ile

Leu

Gly

Pro

Leu 80

Leu

Tyr

Gly

Glu

Val 85

Gly •w

Asp

Thr

Leu

Leu 90

Ile

Ile

Phe

Lys

Asn 95

Lys

Ala

Ser

Arg

Pro 100

Tyr

Asn

Ile

Tyr

Pro 105

His

Gly

Ile

Thr

Asp 110

Val

Ser

Ala

Leu

His 115

Pro

Gly Arg

Leu

Leu 120

Lys

Gly

Trp

Lys

His 125

Leu

Lys

Asp

Met

Pro 130

Ile

Leu

Pro

Gly

Glu 135

Thr

Phe

Lys

Tyr

Lys 140

Trp

Thr

Val

Thr

Val 145

Glu

Asp

Gly

Pro

Thr 150

Lys

Ser

Asp

Pro

Arg 155

Cys

Leu

Thr

Arg

Tyr 160

Tyr

Ser

Ser

Ser

Ile

Asn

Leu

Glu

Lys

Asp

Leu

Ala

Ser

Gly

Leu

Ile

165 170 175

PL 202 936 B1

Gly

Pro

Leu

Leu 180

Ile

Cys

Tyr Lys

Glu 185

Ser

vai

Asp

Gin

Arg 190

Gly

Asn

Gin

Met

Met 195

Ser

Asp

Lys

Arg

Asn 200

Val

Ile

Leu

Phe

Ser 205

Val

Phe

Asp

Glu

Asn 210

Gin

Ser

Trp

Tyr

Leu 215

Ala

Glu

Asn

Ile

Gin 220

Arg

Phe

Leu

Pro

Asn 225

Pro

ASp

Gly

Leu

Gin 230

Pro

Gin

Asp

Pro

Glu 235

Phe

Olu

Ala

Ser

Asn 240

Ile

Met

His

Ser

Ile 245

Ksn

Gly

Tyr

Val

Phe 250

Asp

Ser

Leu

Gin

Leu 255

Ser

Val

Cys

Leu

His 260

Glu

Val

Ala

Tyr

Trp 265

Tyr

Ile

Leu

Ser

Val 270

Gly

Ala

Gin

Thr

Asp 275

Phe

Leu

Ser

Val

Phe 290

Phe

Ser

Gly

Tyr

Thr 285

Phe

Lys

His

Lys

Met 290

Val

Tyr

Glu

Asp

Thr 2PS

Leu

Thr

Leu

Phe

Pro 300

Phe

Ser

Gly

Glu

Thr 305

V«1

Phe

Met

Ser

Met 310

Glu

Asn

Pro

Gly

Leu 315

Trp

Val

Leu

Gly

Cys 320

His

Asn

Ser

Asp

Leu 325

Arg

Asn

Arg

Gly

Met 330

Thr

Ala

Leu

Leu

Lys 33S

Val

Tyr

Ser

Cys

Asp 340

Arg

Asp

Ile

Gly

Asp 345

Tyr

Tyr

Asp

Asn

Thr 350

Tyr

Glu

Asp

He

Pro 355

Gly

Phe

Leu

Leu

Ser 360

Gly

Lys

Asn

val

ile 365

Glu

Pro

Arg

<210> 5 <211> 44 <212> DNA. .

<213 > Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: starter oligonukleotydowy <400> 5 ctaatacgac tcactatagg gctcgagcgg ccgcccgggo aggt 44 <210> 6 <211> 27 <212> DNA .

<2i3> Sztuczna sekwencja

PL 202 936 B1 <220> .. _____ <223> Opi_s sztucznej sekwencji: starter oligonukleotydowy <400> 6 ccatcctaat acgactcact atagggc <210> 7 <211> 24 <212> DNA <²¹³ > S ztuczna sekwencj a <22 0 > _ __ <223> Opis sztucznej sekwencji: starter oligonukleotydowy <400> 7 ccattgacat gaagaccgtt tctc <210> 8 . <211> 23 <212 > DNA ... — <2i3> Sztuczna sekwencja <22 0> ___ <223> Opis sztucznej sekwencji: starter oligonukleotydowy <400> 8 ' actcactata gggctcgagc ggc <210> 9 <211> 24 <212> DNA <2i3> Sztuczna sekwencja .

<220> <223> Opis sztucznej sekwencji: starter oligonukleotydowy <400> 9 gggtgcaaag cgctgacatc agtg <210> 10 <211> 50 <212> DNA .

<213 > Sztuczna sekwępcja <220> . ...

<223> opis sztucznej sekwencji: starter oligonukleotydowy

PL 202 936 B1 <400> 10 ' cctctcgagc caccatgtcg agccaccatg cagctagagc tctccacctg 50 <210> 11 <211> 31 <212> DNA ___ <2i3> Sztuczna sekwencja <220> - . - <223> Opis sztucznej sekwencji: starter oligonukleotydowy <400> 11. ' cgcgcggccg cgcatctggc aaagctgagt t . 31 <21O> 12 <211> 27 <212> DNA <2i3> Sztuczna sekwencja <220> . _____ .

<223> Opis sztucznej sekwencji: starter oligonukleotydowy <400> 12 v gaaataagcc caggctttgc agtcraa 27 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213 > Sztuczna sekwencja <220» — . .. , <223> Opis sztucznej sekwencji: starter oligonukleotydowy <400> 13 \ aggaaattcc actggaacct tn 22 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <2i3> Sztuczna sekwencja <220> ____ ’ — <223> Qpj_{s sz}tucznej sekwencji: starter oligonukleotydowy f

<400> 14 ctgggggtga attcgaaggt agcgn 25

PL 202 936 B1 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <2ΐ3> Sztuczna sekwencja <220> . ...... —...........

<223> Opis sztucznej sekwencji: starter oligonukleotydowy <400> 15 .

gagttcatcg ggaagacctg ttg ' 23 <210> 16 <211> 24 <212> DNA . _Λ ........ - ......

<213 > Sztuczna sekwencja <220>__ . ... - - <223> opi_s sztucznej sekwencji: starter oligonukleotydowy <40D> 16 acagcccatc aactccatgc gaag 24 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <2i3> Sztuczna sekwencja ‘ <220> . .. .

<223> Opis sztucznej sekwencji: starter oligonukleotydowy <400> 17 '‘ tcagggcaat caggactcc 19 <210> 18 \ <211> 21 ' <212> DNA <2i3> Sztuczna sekwencja <220> - — ......

<223> opi_s sztucznej sekwencji: starter oligonukleotydowy <400> 18 ccgtggtgaa cgctctggac c ’ 21 <210> 19 <211> 24 <212> DNA

PL 202 936 B1 <2i3> Sztuczna sekwencja <220 <223> Opis sztucznej sekwencji: starter oligonukleotydowy <400> 19 gtagaggtcc tgtgcctcgc agcc 24 <210> 20 <211> 27 <212> DNA <2i3> Sztuczna sekwencja <220 <223> Opis sztucznej sekwencji: starter oligonukleotydowy <400> 20 gtagagstsc tgkgcctcrc akccyag 27 <210 21 <211> 24 <212> DNA — <213 > Sztuczna sekwencja .

<223 > opis sztucznej sekwencji: starter oligonukleotydowy <400> 21 cttcgcatgg agttgatggg ctgt 24 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213 > Sztuczna sekwencja \ <220>

<223> Ορ|₃ sztucznej sekwencji: starter oligonukleotydowy <400> 22 .

aatcaggact cctccacccc g 21 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213 > Sztuczna sekwencja <220>

PL 202 936 B1 <223> Opis sztucznej sekwencji: starter oligonukieotydowy <400> 23 _; ggatccaccc cacgagctgg 20 <210> 24 <211^ 24 <212> DNA _ <2i3> Sztuczna sekwencja <220> . __ _ <223> Opis sztucznej sekwencji: starter oligonukieotydowy <400> 24 cgccctgagg ctcgaggttc tagg 24 <210> 25 <211> 22 <212> DNA .

<2i3> Sztuczna sekwencja <220> ___ <223> Q_pj_s sztucznej sekwencji: starter oligonukieotydowy <400> 25 aatcaggact cctccacccc cg 22 <210> 26 <211> 20 <212 > DNA ...

<2!3> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Qpj_s sztucznej sekwencji: starter oligonukieotydowy <400> 26 ccttgcagga attcgattca 20 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <2i3> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: starter oligonukieotydowy

PL 202 936 B1 <400> 27 ccgtggtgaa cgctctggac c <210> 28 <211> 2319 <212 > PRT <213> Mus musculus <400> 28

Met Gin Ile Ala Leu Phe Ala Cys Phe Phe Leu Ser Leu Phe Asn, Phe 15 10 15

Cys Ser Ser Ala Ile Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser 20 25 30

Trp Asn Tyr Ile Gin Ser Asp Leu Leu Ser Val Leu His Thr Asp Ser 35 40 45 »·

Arg Phe Leu Pro Arg Met Ser Thr Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Ile 50 55 60

Met Tyr Lys Lys Thr Val Phe Val Glu Tyr Lys Asp Gin Leu Phe Asn ⁶⁵ 70 75 80

Ile Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile

30 95

Trp Thr Glu Val His Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala 100 105 no

Ser

His

Pro Val 115

Ser

Leu

His

Ala 120

Val

Gly

Val

Ser

Tyr 125

Trp

Lys

Ala

Ser

Glu

Gly Asp

Glu

Tyr

Glu

Asp

Gin

Thr

Ser

Gin

Met

Glu

Lys

Glu

130 135 140

Asp 145

Asp

Lys

Val

Phe

Pro 150

Gly

Glu

Ser

His

Thr 155

Tyr

Val

Trp

Gin

Val 160

Leu

Lys

Glu

Asn

Gly 165

Pro

Met

Ala

Ser

Asp 170

Pro

Pro

Cys

Leu

Thr 175

Tyr

Ser

Tyr

Met

Ser 180

His

Val

Asp

Leu

Val 185

Lys

Asp

Leu

Asn

Ser 190

Gly

Leu

Ile

Gly

Ala 195 -

Leu

Leu

Val

Cys

Lys 200

Glu

Gly

Ser

Leu

Ser 205

Lys

Glu

Arg

Thr

Gin 210

Met

Leu

Tyr

Gin

Phe 215

Val

Leu

Leu

Phe

Ala 220

Val

Phe

Asp

Glu

Gly 225

Lys

Ser

Trp

His

V Ser 230

Glu

Thr

Asn

Asp

Ser 235

Tyr

Thr

Gin

Ser

Met 240

PL 202 936 B1

Asp

Ser

Ala

Ser

Ala 245

Arg

Asp

Trp

Pro

Lys 250

Met

His

Thr

Val

Asn 255

Gly

Tyr

Val

Asn

Arg 260

Ser

Leu

Pro

Gly

Leu 265

Ile

Gly

Cys

His

Arg 270

Lys

Ser

val

Tyr

Trp 275

His

Val

Ile

θίγ

Met 280

Giy

Thr

Thr

Pro

Glu 235

Ile

His

Ser

Ile

Phe 290

Leu

Glu

Gly

His

Thr 295

Phe

Phe

Val

Arg

Asn 300

His

Arg

Gin

Ala

Ser 305

Leu

Glu

Ile

Ser

Pro 310

Ile

Thr

Phe

Leu

Thr 315

Ala

Gin

Thr

Leu

Leu 320

Ile

Asp

Leu

Gly

Gin 325

Phe

Leu

Leu

Phe

Cys 330

His

Ile

Ser

Ser

His 335

Lys

His

Asp

Gly

Met 340

Glu

Ala

Tyr

Val

Lys 345

Val

Asp

Ser

Cys

Pro 350

Glu

Glu

Ser

Gin

Trp 355

Gin

Lys

Lys

Asn

Asn 350

Asn

Glu

Glu

Met

Glu 365

Asp

Tyr

Asp

Asp

Asp 370

Leu

Tyr

Ser

Glu

Met 375

Asp

Met

Phe

Thr

Leu 380

Asp

Tyr

Asp

Ser

Ser 385

Pro

Phe

Ile

Gin

Ile 390

Arg

Ser

Val

Ala

Lys 395

Lys

Tyr

Pro

Lys

Thr 400

Trp

Ile

His

Tyr

Ile 405

Ser

Ala

Glu

Glu

Glu 410

Asp

Trp

Asp

Tyr

Ala 415

Pro

Ser

Val

Pro

Thr 420

Ser

Asp

Asn

Gly

Ser 425

Tyr

Lys

Ser

Gin

Tyr 430

Leu

Ser

Asn Gly Pro His Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Ile 435 440 445

Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Thr Ile Gin His Glu 450 455 460

Ser Gly Leu Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu 465 470 475 480

Leu

Ile

Ile

Phe

Lys 485

Asn

Gin

Ala

Ser

Arg 490

Pro

Tyr

Asn

Ile

Tyr 495

Pro

His

Gly

Ile

Thr 500

Asp

Val

Ser

Pro

Leu 505

His

Ala

Arg

Arg

Leu 510

Pro

Arg

Gly

Ile

Lys

His

Val

Lys

Asp

Leu

Pro

Ile

His

Pro

Gly

Glu

Ile

Phe

515 520 525

PL 202 936 B1

Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp 530 535 540

Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Ile Asn Pro Glu Arg

545 550 555 560

Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu

565 570 575

Ser Val Asp Gin Arg Gly Asn Gin Met Met Ser Asp Lys Arg Asn Val 580 585 590

Ile Leu Phe Ser Ile Phe Asp Glu Asn Gin Ser Trp Tyr Ile Thr Glu 595 600 605 .

Asn Met Gin Arg Phe Leu pro Asn Ala Ala Lys Thr Gin Pro Gin Asp 610 615 620

Pro Gly Phe Gin Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val

625 630 635 640

Phe Asp Ser Leu Glu Leu Thr Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp

645 650 655

His Ile Leu Ser Val Gly Ala Gin Thr Asp Phe Leu Ser Ile Phe Phe 660 665 670

Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr 675 680 685

Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro 690 695 700

Gly Leu Trp Val Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Lys Arg Gly

705 710 715 720

Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Ser Thr Ser Asp

725 730 735

Tyr Tyr Glu Glu Ile Tyr Glu Asp Ile Pro Thr Gin Leu Val Asn Glu 740 745 750

Asn Asn Val Ile Asp Pro Arg Ser Phe Phe Gin Asn Thr Asn His Pro 755 760 765

Asn Thr Arg Lys Lys Lys Phe Lys Asp Ser Thr Ile Pro Lys Asn Asp 770 775 780

Met Glu Lys Ile Glu Pro Gin Phe Glu Glu Ile Ala Glu Met Leu Lys

785 790 795 800

Val Gin Ser Val Ser Val Ser Asp Met Leu Met Leu Leu Gly Gin Ser

805 810 815

PL 202 936 B1

His Pro Thr Pro	His	Gly	Leu Phe Leu Ser Asp Gly Gln Glu Ala Ile
	820	825	830
Tyr Glu Ala 835	Ile	His	Asp	Asp His Ser 840	Pro Asn Ala Ile Asp Ser Asn 845
Glu Gly Pro 850	Ser	Lys	Val V	Thr Gln Leu 855	Arg Pro Glu Ser His His Ser 860
Glu Lys Ile 865	Val	Phe	Thr 870	Pro Gln Pro	Gly Leu Gln Leu Arg Ser Asn 875 880
Lys Ser Leu	Glu	Thr 885	Thr	Ile Glu Val	Lys Trp Lys Lys Leu Gly Leu 890 895
Gln Val Ser	Ser 900	Leu	Pro	Ser Asn Leu 905	Met Thr Thr Thr Ile Leu Ser 910
Asp Asn Leu 915	Lys	Ala	Thr	Phe Glu Lys 920	Thr Asp Ser Ser Gly Phe Pro 925
Asp Met Pro 930	Val	His	Ser	Ser Ser Lys 935	Leu Ser Thr Thr Ala Phe Gly 940
Lys Lys Ala 945	Tyr	Ser	Leu 950	Val Gly Ser	His Val Pro Leu Asn Ala Ser 955 960
Glu Glu Asn	Ser	Asp 965	Ser	Asn Ile Leu	Asp Ser Thr Leu Met Tyr Ser 970 975
Gln Glu Ser	Leu 980	Pro	Arg Asp Asn Ile 985	Leu Ser Ile Glu Asn Asp Arg 990 .
Leu Leu Arg 995	Glu	Lys	Arg Phe His Gly 1000	Ile Ala Leu Leu Thr Lys Asp - 1005
Asn Thr Leu 1010	Phe	Lys	Asp Asn Val Ser 1015	Leu Met Lys Thr Asn Lys Thr 1020
Tyr Asn His 1025	Ser	Thr Thr 1030	Asn Glu Lys	Leu His Thr Glu Ser Pro Thr 1035 1040
Ser Ile Glu	Asn Ser 1045	Thr	Thr Asp Leu Gln Asp Ala Ile Leu Lys Val 1050 1055
Asn Ser Glu Ile 1060	Gln	Glu	Val Thr Ala 1065	Leu Ile His Asp Gly Thr Leu 1070
Leu Gly Lys 1075	Asn	Ser	Thr	Tyr Leu Arg 1080	Leu Asn His Met Leu Asn Arg 1085
Thr Thr Ser 1090	Thr	Lys	Asn Lys Asp Ile 1095	Phe His Arg Lys Asp Glu Asp 1100

PL 202 936 B1

Pro Ile Pro Gin Asp Glu Glu Asn Thr Ile Met Pro Phe Ser Lys Met 1105 1110 1115 1120

Leu	Phe Leu Ser Glu Ser Ser Asn 1125	Trp Phe Lys 1130	Lys	Thr	Asn Gly Asn 1135
Asn	Ser Leu Asn Ser Glu Gin Glu	His Ser Pro	Lys	Gin	Leu Val Tyr
	1140 :	1145		1150
Leu	Met Phe Lys Lys Tyr Val Lys	Asn Gin Ser	Phe	Leu	Ser Glu Lys
	1155 1160		1165
Asn	Lys Val Thr Val Glu Gin Asp	Gly Phe Thr	Lys	Asn	Ile Gly Leu
1170 . 1175 W	1180
Lys	Asp Met Ala Phe Pro His Asn	Met Ser Ile	Phe	Leu	Thr Thr Leu
1185 1190	1195			1200
Ser	Asn Val His Glu Asn Gly Arg	His Asn Gin	Glu	Lys	Asn Ile Gin
	1205	1210			1215
Glu	Glu Ile Glu Lys Glu Ala Leu	Ile Glu Glu	Lys	Val	Val Leu Pro
	1220 1225		1230
Gin	Val His Glu Ala Thr Gly Ser	Lys Asn Phe	Leu	Lys	Asp Ile Leu
	1235 1240		1245
Ile	Leu Gly Thr Arg Gin Asn Ile	Ser Leu Tyr	Glu	Val	His Val Pro
1250 1255	1260
Val	Leu Gin Asn Ile Thr Ser Ile	Asn Asn Ser	Thr	Asn	Thr Val Gin
1265	i 1270	1275			1280
Ile	His Met Glu His Phe Phe Lys	Arg Arg Lys	Asp	Lys	Glu Thr Asn

1285 1290 1295

Ser Glu Gly Leu Val Asn Lys Thr Arg Glu Met Val Lys Asn Tyr Pro 1300 1305 1310

Ser Gin Lys Asn Ile Thr Thr Gin Arg Ser Lys Arg Ala Leu Gly Gin 1315 1320 1325

Phe Arg 1330	Leu Ser	Thr Gin Trp Leu Lys Thr Ile Asn Cys Ser Thr	Gin
1335	1340
Cys Ile 1345	Ile Lys	Gin Ile Asp His Ser Lys Glu Met Lys Lys Phe Ile 1350 1355 1360
Thr Lys	Ser Ser Leu Ser Asp Ser Ser Val 1365 1370	Ile Lys Ser Thr Thr 1375	Gin
Thr Asn	Ser Ser Asp Ser His Ile Val Lys 1380 1385	Thr Ser Ala Phe Pro 1390	Pro

PL 202 936 B1

Ile Asp Leu Lys Arg Ser Pro Phe Gin Asn Lys Phe Ser His Val Gin 1395 1400 1405

Ala Ser Ser Tyr Ile Tyr Asp Phe Lys Thr Lys Ser Ser Arg Ile Gin 1410 1415 1420

Glu Ser Asn Asn Phe Leu Lys Glu Thr Lys Ile Asn Asn Pro Ser Leu 1425 1430 1435 1440

Ala Ile Leu Pro Trp	Asn	Met Phe Ile Asp Gin Gly Lys Phe Thr	Ser
	1445	1450	1455
Pro Gly Lys	Ser Asn	Thr	Asn Ser Val Thr	Tyr Lys Lys Arg Glu	Asn
1460		1465	1470
Ile Ile Phe	Leu Lys	Pro	Thr Leu Pro Glu	Glu Ser Gly Lys Ile	Glu
1475			1480	1485
Leu Leu Pro	Gin Val	Ser	Ile Gin Glu Glu	Glu Ile Leu Pro Thr	Glu
1490		v 1495	1500
Thr Ser His	Gly Ser	Pro Gly His Leu Asn	Leu Met Lys Glu Val	Phe
1505	1510	1515 1520
Leu Gin Lys	Ile Gin	Gly Pro Thr Lys Trp	Asn Lys Ala Lys Arg	His
	1525		1530	1535
Gly Glu Ser	Ile Lys	Gly Lys Thr Glu Ser	Ser Lys Asn Thr Arg	Ser
1540		1545	1550
Lys Leu Leu	Asn His	His	Ala Trp Asp Tyr	His Tyr Ala Ala Gin	Ile
1555			1560	1565
Pro Lys Asp	Met Trp	Lys	Ser . Lys Glu Lys	Ser Pro Glu Ile Ile	Ser
1570		1575	1580
Ile Lys Gin	Glu Asp	Thr	Ile Leu Ser Leu	Arg Pro His Gly Asn	Ser
1585	1590	1595 1600
His Ser Ile	Gly Ala	Asn	Glu Lys Gin Asn	Trp Pro Gin Arg Glu	Thr
	1605		1610	1615
Thr Trp Val	Lys Gin	Gly	Gin Thr Gin Arg	Thr Cys Ser Gin Ile	Pro

1620 1625 1630

Pro Val Leu Lys Arg His Gin Arg Glu Leu Ser Ala Phe Gin Ser Glu 1635 1640 1645

Gin Glu Ala Thr Asp Tyr Asp Asp Ala Ile Thr Ile Glu Thr Ile Glu 1650 1655 1660

Asp Phe Asp Ile Tyr Ser Glu Asp Ile Lys Gin Gly Pro Arg Ser Phe 1665 1670 1675 1660

PL 202 936 B1

Gin Gin Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp
	1685	1690	1695
Asp Tyr	Gly Met Ser Thr Ser His Val Leu Arg Asn 1700 1705	Arg Tyr Gin Ser 1710
Asp Asn Val Pro Gin Phe Lys Lys 1715 1720	Val Val Phe Gin Glu Phe Thr Asp 1725
Gly ser 1730	Phe Ser Gin Pro Leu Tyr 1735	Arg Gly Glu Leu 1740	Asn Glu His Leu
Gly Leu 1745	Leu Gly Pro Tyr Ile Arg 1750	Ala Glu Val Glu 1755	Asp Asn Ile Met 1760
Val Thr	Phe Lys Asn Gin Ala Ser 1765	Arg Pro Tyr Ser 1770	Phe Tyr Ser Ser 1775
Leu Ile	Ser Tyr Lys Glu Asp Gin Arg Gly Glu Glu 1780 1785	Pro Arg Arg Asn 1790
Phe TOl Lys Pro Asn Glu Thr Lys 1795 1800	Ile Tyr Phe Trp Lys Val Gin His 1805
His Met 1810	Ala Pro Thr Glu Asp Glu 1815	Phe Asp Cys Lys 1820	Ala Trp Ala Tyr
Phe Ser 1825	Asp Val Asp Leu Glu Arg 1830	Asp Met His Ser 1835	Gly Leu Ile Gly 1840
Pro Leu	Leu Ile Cys His Ala Asn 1845	Thr Leu Asn Pro 1850	Ala His Gly Arg 1855
Gin Val	Ser Val Gin Glu Phe Ala	Leu Leu Phe Thr	Ile Phe Asp Glu

1860 1865 1870

Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Val Lys Arg Asa Cys Lys Thr 1875 1880 1885

Pro Cys Asn 1890	Phe	Gin Met Glu Asp Pro Thr Leu Lys Glu Asn Tyr Arg
1895	1900
Phe His Ala 1905	Ile	Asn Gly Tyr Val Met 1910	Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val 1915 1920
Met Ala Gin	Asp Gin Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Asn 1925 1930 1935
Asn Glu Asn Ile 1940	Gin Ser Ile His Phe 1945	Ser Gly His Val Phe Thr Val 1950
Arg Lys Lys	Glu	Glu Tyr Lys Met Ala	Val Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly

1955 1960 1965

PL 202 936 B1

Val Phe Glu 1970	Thr	Leu	Glu Met Ile Pro Ser Arg Ala Gly Ile Trp Arg
1975	1980
Val Glu Cys 1985	Leu	Ile Gly Glu 1990	His Leu Gin Ala Gly Met Ser Thr Leu 1995 2000
Phe Leu Val	Tyr Ser 2005	Lys Gin	Cys Gin Ile Pro Leu Gly Met Ala Ser 2010 2015
Gly Ser Ile	Arg	Asp	Phe Gin	Ile Thr Ala Ser Gly His Tyr Gly Gin

2020 2025 2030

Trp Ala Pro Asn Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser ile Asn Ala 2035 2040 2045

Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala 2050 2055 2060

Pro Met Ile Val His Gly Ile Lys Thr Gin Gly Ala Arg Gin Lys phe 2065 2070 2075 2080

Ser	Ser Leu	Tyr Ile 2085	Ser Gin	Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp	Gly
2090	2095
Lys	Lys Trp	Leu Ser	Tyr Gin	Gly Asn Ser Thr Gly Thr	Leu Met	val
	2100		2105 2110
Phe	Phe Gly	Asn Val	Asp Ser	Ser Gly Ile Lys His Asn	Ser Phe	Asn
	2115		2120 2125
Pro	Pro Ile	Ile Ala	Arg Tyr	Ile Arg Leu His Pro Thr	His Ser	Ser
2130		. 2135	2140	*
Ile Arg Ser	Thr Leu	Arg Met	Glu Leu Met Gly Cys Asp	Leu Asn	Ser
2145	2150	2155	2160
Cys	Ser Ile	Pro Leu	Gly Met	Glu Ser Lys Val Ile Ser	Asp Thr	Gin
		2165		2170	2175
Ile	Thr Ala	Ser Ser	Tyr Phe	Thr Asn Met Phe Ala Thr	Trp Ser	Pro
	2180		2185 2190
Ser	Gin Ala	Arg Leu	His Leu	Gin Gly Arg Thr Asn Ala	Trp Arg	Pro
	2195		2200 2205
Gin	Val Asn	Asp Pro	Lys Gin	Trp Leu Gin Val Asp Leu	Gin Lys	Thr
2210		2215	2220
Met	Lys Val	Thr Gly	Ile Ile	Thr Gin Gly Val Lys Ser	Leu Phe	Thr
2225	2230	2235	2240
Ser	Met Phe	Val Lys	Glu Phe	Leu Ile Ser Ser Ser Gin	Asp Gly His
		2245		2250	2255

PL 202 936 B1

<210> 29 <211> 6402 <212> DNA <213 > Świńska <220>

<221> CDS ' <222> (1)..¢6399) <400> 29

atg Met 1

cag eta

gag ctc Glu Leu 5

tcc Ser «s

acc tgt gtc ttt ctg tgt ctc ttg cca ctc

48

Gln

Leu

Thr

Cys

Val

Phe Leu 10

Cys Leu

Leu Pro 15

Leu

ggc

ttt

agt

gcc

atc

agg

aga

tac

tac

ctg

ggc

gca

gtg

gaa

ctg

tcc

96

Gly

Phe

Ser

Ala

Ile

Arg

Arg

Tyr

Tyr

Leu

Gly

Ala

Val

Glu

Leu

Ser

20

25

30

tgg

gac

tac

cgg

caa

agt

gaa

ctc

ctc

cgt

gag

ctg

cac

gtg

gac

acc

144

Trp

Asp

Tyr

Arg

Gln

Ser

Glu

Leu

Leu

Arg

Glu

Leu

His

Val

Asp

Thr

35

40

•

45

aga

ttt

cct

gct

aca

gcg

cca

gga

gct

ctt

ceg

ttg

ggc

ccg

tca

gtc

192

Arg

Phe

Pro

Ala

Thr

Ala

Pro

Gly

Ala

Leu

Pro

Leu

Gly

Pro

Ser

Val

50

*

55

60

ctg

tac

aaa

aag

act

gtg

ttc

gta

gag

ttc

acg

gat

caa

ctt

ttc

agc

240

Leu

Tyr

Lys

Lys

Thr

Val

Phe

Val

Glu

Phe

Thr

Asp

Gln

Leu

Phe

Ser

65

70

75

80

gtt

gcc

agg

ccc

agg

cca

cca

tgg

atg

ggt

ctg

ctg

ggt

cct

acc

atc

288

Val

Ala

Arg

Pro

Arg

Pro

Pro

Trp

Met

Gly

Leu

Leu

Gly

Pro

Thr

Ile

85

90

95

cag

gct

gag

gtt

tac

gac

acg

gtg

gtc

gtt

acc

ctg

aag

aac

atg

gct

336

Gln

Ala

Glu

Val

Tyr

Asp

Thr

Val

Val

Val

Thr

Leu

Lys

Asn

Met

Ala

100

105

110

tct

cat

ccc

gtt

agt

ctt

cac

gct

gtc

ggc

gtc

tcc

ttc

tgg

aaa

tct

384

Ser

His

Pro

Val

Ser

Leu

His

Ala

Val

Gly

Val

Ser

Phe

Trp

Lys

Ser

115

120

125

PL 202 936 B1

tcc gaa Ser Glu 130

ggc Gly

gct gaa Ala Glu

tat Tyr

gag gat cac acc agc caa agg gag aag gaa

432

Glu Asp 135

His Thr

Ser Gin 140

Arg

Glu Lys

Glu

gac

gat

aaa

gtc

ctt

ccc

ggt

aaa

agc

caa

acc

tac

gtc

tgg

cag

gtc

480

Asp

Asp

Lys

Val

Leu

Pro

Gly

Lys

Ser

Gin

Thr

Tyr

Val

Trp

Gin

val

145

150

155

160

ctg

aaa

gaa

aat

ggt

cca

aca

gcc

tct

gac

cca

cca

tgt

ctc

acc

tac

528

Leu

Lys

Glu

Asn

Gly

Pro

Thr

Ala

Ser

Asp

Pro

Pro

Cys

Leu

Thr

Tyr

165

170

175

tca

tac

ctg

tct

cac

gtg

gac

ctg

gtg

aaa

gac

ctg

aat

tcg

ggc

ctc

576

Ser

Tyr

Leu

Ser

His

Val

Asp

Leu

Val

Lys.

Asp

Leu

Asn

Ser

Gly

Leu

180

185

190

att

gga

gcc

ctg

ctg

gtt

tgt

aga

gaa

ggg

agt

ctg

acc

aga

gaa

agg

624

Ile

Gly

Ala

Leu

Leu

Val

Cys

Arg

Glu

Gly

Ser

Leu

Thr

Arg

Glu

Arg

195

200

205

acc

cag

aac

ctg

cac

gaa

ttt

gta

eta

ctt

ttt

gct

gtc

ttt

gat

gaa

672

Thr

Gin

Asn

Leu

His

Glu

Phe

Val

Leu

Leu

Phe

Ala

Val

Phe

Asp

Glu

210

215

220

999

aaa

agt

tgg

cac

tca

gca

aga

aat

gac

tcc

tgg

aca

cgg

gcc

atg

720

Gly

Lys

Ser

Trp

His

Ser

Ala

Arg

Asn

Asp

Ser

Trp

Thr

Arg

Ala

Met

225

230

235

240

gat

ccc

gca

cct

gcc

agg

gcc

cag

cct

gca

atg

cac

aca

gtc

aat

ggc

768

Asp

Pro

Ala

Pro

Ala

Arg

Ala

Gin

Pro

Ala

Met

His

Thr

Val

Asn

Gly

245

250

255

tat

gtc

aac

agg

tct

ctg

cca

ggt

ctg

atc

gga

tgt

cat

aag

aaa

tca

816

Tyr

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

Pro

Gly

Leu

Ile

Gly

Cys

His

Lys

Lys

Ser

260

265

270

gtc

tac

tgg

cac

gtg

att

gga

atg

ggc

acc

agc

ccg

gaa

gtg

cac

tcc

864

Val

Tyr

Trp

His

Val

Ile

Gly

Met

Giy

Thr

Ser

Pro

Glu

Val

His

Ser

275

280

285

att

ttt

Ctt

gaa

ggc

cac

acg

ttt

ctc

gtg

agg

cac

cat

cgc

cag

gct

912

Ile

Phe

Leu

Glu

Gly

His

Thr

Phe

Leu

Val

Arg

His

His

Arg

Gin

Ala

290

295

300

tcc

ttg

gag

atc

tcg

cca

eta

act

ttc

ctc

act

gct

cag

aca

ttc

ctg

960

Ser

Leu

Glu

Ile

Ser

Pro

Leu

Thr

Phe

Leu

Thr

Ala

Gin

Thr

Phe

Leu

305

310

315

320

atg

gac

ctt

ggc

cag

ttc

eta

ctg

ttt

tgt

cat

atc

tct

tcc

cac

cac

1008

Met

Asp

Leu

Gly

Gin

Phe

Leu

Leu

Phe

Cys

His

Ile

Ser

Ser

His

His

325

330

335

cat

ggt

ggc

atg

gag

gct

cac

gtc

aga

gta

gaa

agc

tgc

gcc

gag

gag

1056

His

Gly

Gly

Met

Glu

Ala

His

Val

Arg

Val

Glu

Ser

Cys

Ala

Glu

Glu

340

345

350

PL 202 936 B1

ccc cag ctg cgg agg aaa get gat gaa gag gaa gat tat gat gac aat

1104

Pro

Gin

Leu 355

Arg Arg Lys

Ala Asp Glu 360

Glu Glu

Asp

Tyr Asp Asp Asn 365

ttg

tac

gac

teg

gac

atg

gac

gtg

gtc

cgg

ctc

gat

ggt

gac

gac

gtg

1152

Leu

Tyr

Asp

Ser

Asp

Met

Asp

Val

Val

Arg

Leu

Asp

Gly

Asp

Asp

Val

370

375

380

tct

ccc

ttt

atc

caa

atc

ege

teg

gtt

gcc

aag

aag

cat

ccc

aaa

acc

1200

Ser

Pro

Phe

Ile

Gin

Ile

Arg

Ser

Val

Ala

Lys

Lys

His

Pro

Lys

Thr

385

390

395

400 ''

tgg

gtg

cac

tac

atc

tct

gca

gag

gag

gag

gac

tgg

gac

tac

gcc

ccc

1248

Trp

Val

His

Tyr

Ile

Ser

Ala

Glu

Glu

Glu

Asp

Trp

Asp

Tyr

Ala

Pro

405

410

415

gcg

gtc

ccc

agc

ccc

agt

gac

aga

agt

tat

aaa

agt

ctc

tac

ttg

aac

1296

Ala

Val

Pro

Ser

Pro

Ser

Asp

Arg

Ser

Tyr

Lys

Ser

Leu

Tyr

Leu

Asn

420

425

430

agt

ggt

cct

cag

ega

att

ggt

agg

aaa

tac

aaa

aaa

get

ega

ttc

gtc

1344

Ser

Gly

Pro

Gin

Arg

Ile

Gly Arg

Lys

Tyr

Lys

Lys

Ala

Arg

Phe

Val

435

440

445

get

tac

acg

gat

gta

aca

ttt

aag

act

cgt

aaa

get

att

ccg

tat

gaa

1392

Ala

Tyr

Thr

Asp

Val

Thr

Phe

Lys

Thr

Arg

Lys

Ala

Ile

Pro

Tyr

Glu

450

455

460*

tca

gga

atc

ctg

gga

cct

tta

ctt

tat

gga

gaa

gtt

gga

gac

aca

ctt

1440

Ser

Gly

Ile

Leu

Gly

Pro

Leu

Leu

Tyr

Gly

Glu

Val

Gly

Asp

Thr

Leu

465

470

475

480

ttg

att

ata

ttt

aag

aat

aaa

gcg

agc

ega

cca

tat

aac

atc

tac

cct

1488

Leu

Ile

Ile

Phe

Lys

Asn

Lys

Ala

Ser

Arg

Pro

Tyr

Asn

Ile

Tyr

Pro

485

490

495

cat

gga

atc

act

gat

gtc

agc

get

ttg

cac

cca

ggg

aga

ctt

eta

aaa

1536

His

Gly

Ile

Thr

Asp

Val

Ser

Ala

Leu

His

Pro

Gly Arg

Leu

Leu

Lys

500

505

510

ggt

tgg

aaa

cat

ttg

aaa

gac

atg

cca

att

ctg

cca

gga

gag

act

ttc

1584

Gly

Trp

Lys

His

Leu

Lys

Asp

Met

Pro

Ile

Leu

Pro

Gly

Glu

Thr

Phe

515

520

525

aag

tat

aaa

tgg

aca

gtg

act

gtg

gaa

gat

ggg

cca

acc

aag

tcc

gat

1632

Lys

Tyr

Lys

Trp

Thr

Val

Thr

Val

Glu

Asp

Gly

Pro

Thr

Lys

Ser

Asp

530

535

540

cct

cgg

tgc

ctg

acc

ege

tac

tac

teg

agc

tcc

att

aat

eta

gag

aaa

1680

Pro

Arg

Cys

Leu

Thr

Arg

Tyr

Tyr

Ser

Ser

Ser

Ile

Asn

Leu

Glu

Lys

£45

550

555

560

gat

ctg

get

teg

gga

ctc

att

ggc

cct

ctc

ctc

atc

tgc

tac

aaa

gaa

1728

Asp

Leu

Ala

Ser

Gly

Leu

Ile

Gly

Pro

Leu

Leu

Ile

Cys

Tyr

Lys

Glu

565 570 575

PL 202 936 B1

tct gta Ser Val

gac caa

aga Arg

gga aac cag atg atg tca gac aag

aga aac Arg Asn 590

gtc Val

1776

Asp

Gin 580

Gly Asn

Gin

Met Met 585

Ser

Asp

Lys

atc

ctg

ttt

tct

gta

ttc

gat

gag

aat

caa

age

tgg

tac

ctc

gca

gag

1824

Ile

Leu

Phe

Ser

Val

Phe

Asp

Glu

Asn

Gin

Ser

Trp

Tyr

Leu

Ala

Glu

595

600

605

aat

att

cag

cgc

ttc

ctc

ccc

aat

ccg

gat

gga

tta

cag

ccc

cag

gat

1872

Asn

Ile

Gin

Arg

Phe

Leu

Pro

Asn

Pro

Asp

Gly

Leu

Gin

Pro

Gin

Asp

6X0

615

620

cca

gag

ttc

caa

get

tct

aac

atc

atg

cac

age

atc

aat

ggc

tat

gtt

1920

Pro

Glu

Phe

Gin

Ala

Ser

Asn

Ile

Met

His

Ser

Ile

Asn

Gly

Tyr

Val

625

630

635

640

ttt

gat

age

ttg

cag

ctg

teg

gtt

tgt

ttg

cac

gag

gtg

gca

tac

tgg

' 1968

Phe

Asp

Ser

Leu

Gin

Leu

Ser

val

Cys

Leu

His

Glu

val

Ala

Tyr

Trp

645

650

655

tac

att

eta

agt

gtt

gga

gca

cag

acg

gac

ttc

ctc

tcc

gtc

ttc

ttc

2016

Tyr

Ile

Leu

Ser

Val

Gly

Ala

Gin

Thr

Asp

Phe

Leu

Ser

Val

Phe

Phe

660

665

670

tct

ggc

tac

acc

ttc

aaa

cac

aaa

atg

gtc

tat

gaa

gac

aca

ctc

acc

2064

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Lys

His

Lys

Met

Val

Tyr

Glu

Asp

Thr

Leu

Thr

675

680

685

ctg

ttc

ccc

ttc

tca

gga

gaa

acg

gtc

ttc

atg

tca

atg

gaa

aac

cca

2112

Leu

Phe

Pro

Phe

Ser

Gly

Glu

Thr

Val

Phe

Met

Ser

Met

Glu

Asn

Pro

690

695

700

ggt

ctc

tgg

gtc

eta

ggg

tgc

cac

aac

tca

gac

ttg

cgg

aac

aga

ggg

2160

Gly

Leu

Trp

Val

Leu

Gly

Cys

His

Asn

Ser

Asp

Leu

Arg

Asn

Arg

Gly

705

710

715

720

atg

aca

gcc

tta

ctg

aag

gtg

tat

agt

tgt

gac

agg

gac

att

ggt

gat

2208

Met

Thr

Ala

Leu

Leu

Lys

Val

Tyr

Ser

Cys

Asp

Arg

Asp

Ile

Gly

Asp

725

730

735

tat

tat

gac

aac

act

tat

gaa

gat

att

cca

ggc

ttc

ttg

ctg

agt

gga

2256

Tyr

Tyr

Asp

Asn

Thr

Tyr

Glu

Asp

Ile

Pro

Gly

Phe

Leu

Leu

Ser

Gly

740

745

750

aag

aat

gtc

att

gaa

ccc

aga

age

ttt

gcc

cag

aat

tca

aga

ccc

cct

23 04

Lys

Asn

Val

Ile

Glu

Pro

Arg

Ser

Phe

Ala

Gin

Asn

Ser

Arg

Pro

Pro

755

760

765

agt

gcg

age

caa

aag

caa

ttc

caa

acc

atc

aca

agt

cca

gaa

gat

gac

2352

Ser

Ala

Ser

Gin

Lys

Gin

Phe

Gin

Thr

Ile

Thr

Ser

Pro

Glu

Asp

Asp

770

775

780

gtg

gag

ctt

gac

ccg

cag

tct

gga

gag

aga

acc

caa

gca

ctg

gaa

gaa

2400

val

Glu

Leu

Asp

Pro

Gin

ser

Gly

Glu

Arg

Thr

Gin

Ala

Leu

Glu

Glu

785

790

795

800

PL 202 936 B1

eta agt gtc Leu Ser Val	ccc tet ggt gat ggg tcg atg ctc ttg gga cag aat cct	2448
Pro	Ser 805	Gly Asp Gly	Ser	Met Leu Leu Gly Gin Asn Pro
810	815
get cca cat		tea	tcc tea tet	gat	ctt	caa gaa gee agg aat gag	2496
Ala Pro His	Gly 820	Ser	Ser Ser Ser	Asp 825	Leu	Gin Glu Ala Arg Asn Glu 830
get gat gat	tat	tta	cct gga gca	aga	gaa	aga ggc acg gee cca tcc	2544
Ala Asp Asp 835	Tyr	Leu	Pro Gly Ala 840	Arg	Glu	Arg Gly Thr Ala Pro Ser 845
gca gcg gca	cgt	ctc	aga cca gag	ctg	cat	cac agt gee gaa aga gta	2592
Ala Ala Ala 850	Arg	Leu	Arg Pro Glu 855	Leu	His	His Ser Ala Glu Arg Val 860
ctt act cct	9ag	cca	gag aaa gag	ttg	aag	aaa ctt gat tea aaa atg	2640
Leu Thr Pro 865	Glu	Pro	Glu*Lys Glu 870	Leu	Lys	Lys Leu Asp Ser Lys Met 875 880
tet agt tea	tea	gac	ctt eta aag	act	tcg	cca aca att cca tea gac	2638
Ser Ser .Ser	Ser	Asp 885	Leu Leu Lys	Thr	Ser 890	Pro Thr Ile Pro Ser Asp 895 ;
acg ttg tea	9cg	gag	act gaa agg	aca	cat	tcc tta ggc ccc cca cac	2736
Thr Leu Ser	Ala 900	Glu	Thr Glu Arg	Thr 905	His	Ser Leu Gly Pro Pro His . 910
ccg cag gtt	aat	ttc	agg agt caa	tta	ggt	gee att gta ctt ggc aaa	2784
Pro Gin Val 915	Asn	Phe	Arg Ser Gin 920	Leu	Gly	Ala Ile Val Leu Gly Lys 925
aat tea tet	cac	ttt	att ggg get	ggt	gtc	cct ttg ggc tcg act gag	2832
Asn Ser Ser 930	His	Phe	Ile Gly Ala 935	Gly	Val	Pro Leu Gly Ser Thr Glu 940
gag gat cat	gaa	age	tcc ctg gga	gaa	aat	gta tea cca gtg gag agt	2880
Glu Asp His 945	Glu	Ser	Ser Leu Gly 950	Glu	Asn	Val Ser Pro Val Glu Ser 955 960
gac ggg ata	ttt	gaa	aag gaa aga	get	cat	gga cct get tea ctg acc	2928
Asp Gly Ile	Phe	Glu 965	Lys Glu Arg	Ala	His 970	Gly Pro Ala Ser Leu Thr 975
aaa gac gat	gtt	tta	ttt aaa gtt	aat	atc	tet ttg gta aag aca aac	2976
Lys Asp Asp	Val 980	Leu	Phe Lys Val	Asn 985	Ile	Ser Leu Val Lys Thr Asn 990
aag gca ega	gtt	tac	tta aaa act	aat	aga	aag att cac att gat gac	3024
Lys Ala Arg 995	Val	Tyr	Leu Lys Thr 1000	Asn	Arg	Lys Ile His Ile Asp Asp 1005
gca get tta	tta	act	gag aat agg	gca	tet	gca acg ttt atg gac aaa	3072
Ala Ala Leu	Leu	Thr	Glu Asn Arg	Ala	Ser	Ala Thr Phe Met Asp Lys

1010 1015 1020

PL 202 936 B1 aat act aca gct teg gga tta aat cat gtg tca aat tgg ata aaa ggg 3120

Asn Thr Thr Ala Ser Gly Leu Asn His Val Ser Asn Trp Ile Lys Gly

1025 1030 1035 1040 ccc ctt ggc aag aac ccc eta agc teg gag ega ggc ccc agt cca gag 3168

Pro Leu Gly Lys Asn Pro Leu Ser Ser Glu Arg Gly Pro Ser Pro Glu

1045 1050 1055

ctt ctg aca tct Leu Leu Thr Ser	tca gga tca gga aaa tct	gtg aaa Val Lys	ggt cag agt tct	3216
Ser	Gly	Ser	Gly Lys 1065	Ser	Gly Gin 1070	Ser	Ser
	1060
ggg cag	ggg aga	ata	cgg	gtg	gca gtg	gaa	gag gaa	gaa ctg	agc	aaa	3264
Gly Gin Gly Arg 1075	Ile	Arg	Val Ala Val 1080	Glu	Glu Glu Glu Leu 1085	Ser	Lys
ggc aaa	gag atg	atg	ctt	ccc	aac agc	gag	ctc acc	ttt ctc	act	aac	3312
Gly Lys 1090	Glu Met	Met	Leu Pro 1095	Asn Ser	Glu	Leu Thr , 1100	Phe Leu	Thr	Asn
teg gct	gat gtc	caa	gga	aac	gat aca	cac	agt caa	gga aaa	aag	tct	3360
Ser Ala 1105	Asp Val	Gin Gly 1110	Asn	Asp Thr	His Ser Gin 1115	Gly Lys	Lys Ser 1120
cgg gaa	gag atg	gaa	agg	aga	gaa aaa	tta	gtc caa	gaa aaa	gtc	gac	3408
Arg Glu	Glu Met Glu 1125	Arg	Arg	Glu Lys Leu 1130	Val Gin	Glu Lys Val 1135	Asp
ttg cct	cag gtg	tat	aca	gcg	act gga	act	aag aat	ttc ctg	aga	aac >	3456
Leu Pro	Gin Val 1140	Tyr	Thr	Ala	Thr Gly 1145	Thr	Lys Asn	Phe Leu 1150	Arg	Asn
att ttt	cac caa	agc	act	gag	ccc agt	gta	gaa ggg	ttt gat	ggg	ggg	3504
Ile Phe His Gin 1155	Ser	Thr	Glu Pro Ser 1160	Val	Glu Gly Phe Asp 1165	Gly	Gly
tca cat	gcg ccg	gtg	cct	caa	gac agc	agg	tca tta	aat gat	teg	gca	3552
Ser His 1170	Ala Pro	Val	Pro Gin 1175	Asp Ser	Arg	Ser Leu 1180	Asn Asp	Ser	Ala
gag aga	gca gag	act	cac	ata	gcc cat	ttc	tca gca	att agg	gaa	gag	3600
Glu Arg 1185	Ala Glu	Thr His 1190	Ile	Ala His	Phe Ser Ala 1195	Ile Arg	Glu Glu 1200
gca ccc	ttg gaa	gcc	ccg	gga	aat ega	aca	ggt cca	ggt ccg	agg	agt	3648
Ala Pro	Leu Glu Ala 1205	Pro	Gly	Asn Arg Thr 1210	Gly Pro	Gly Pro Arg 1215	Ser
gcg gtt	ccc cgc	cgc	gtt	aag	cag agc	ttg	aaa cag	atc aga	ctc	ccg	3696
Ala Val	Pro Arg 1220	Arg	Val	Lys	Gin Ser 1225	Leu	Lys Gin	Ile Arg 1230	Leu	Pro
eta gaa	gaa ata	aag	cct	gaa	agg ggg	gtg	gtt ctg	aat gcc	acc	tca	3744
Leu Glu	Glu Ile	Lys	Pro	Glu	Arg Gly	Val	Val Leu	Asn Ala	Thr	Ser

1235 1240 1245

PL 202 936 B1

acc cgg tgg tct gaa agc agt cct atc tta caa gga	gcc Ala	aaa aga Lys Arg	aat Asn	3792
Thr Arg Trp Ser Glu Ser Ser Pro	Ile	Leu	Glu Gly 1260
1250	1255
aac ctt tct tta	cct ttc ctg acc	ttg	gaa	atg gcc	gga	ggt caa	gga	3840
Asn Leu Ser Leu	Pro Phe Leu Thr	Leu	Glu	Met Ala	Gly	Gly Gin	Gly
1265	1270		1275		1280
aag atc agc gcc	ctg ggg aaa agt	gcc	gca	ggc ccg	ctg	gcg tcc	ggg	3888
Lys Ile Ser Ala	Leu Gly Lys Ser	Ala	Ala	Gly Pro	Leu	Ala Ser	Gly
1285 u	1290			1295
aag ctg gag aag	gct gtt ctc tct	tca	gca	ggc ttg	tct	gaa gca	tct	3936
Lys Leu Glu Lys	Ala Val Leu Ser	Ser	Ala	Gly Leu	Ser	Glu Ala	Ser
1300	1305			1310
ggc aaa gct gag	ttt ctt cct aaa	gtt	ega	gtt cat	cgg	gaa gac	ctg	3934
Gly Lys Ala Glu	Phe Leu Pro Lys	Val	Arg	Val His	Arg	Glu Asp	Leu

1315 1320 1325 ttg cct caa aaa acc agc aat gtt tct tgc gca cac ggg gat ctc ggc 4032

Leu Pro Gin Lys Thr Ser Asn Val Ser Cys Ala His Gly Asp Leu Gly

1330 1335 1340 cag gag atc ttc ctg cag aaa aca cgg gga cct gtt aac ctg aac aaa 4080

Gin Glu Ile Phe Leu Gin Lys Thr Arg Gly Pro Val Asn Leu Asn Lys 1345 1350 1355 1360

gta aat Val Asn	aga cct gga agg act ccc tcc aag ctt ctg ggt ccc ccg atg	4128
Arg Pro Gly 1365	Arg	Thr Pro	Ser Lys Leu Leu Gly Pro Pro Met
1370	1375
ccc aaa	gag tgg gaa	tcc	eta gag	aag tca cca aaa agc	aca gct ctc	4176
Pro Lys	Glu Trp Glu	Ser	Leu Glu	Lys Ser Pro Lys Ser	Thr Ala Leu
	1380		1385 1390
agg acg	aaa gac atc	atc	agt tta	ccc ctg gac cgt cac	gaa agc aat	4224
Arg Thr	Lys Asp Ile	Ile	Ser Leu	Pro Leu Asp Arg His	Glu Ser Asn
1395		1400	. 1405
cat tca	ata gca gca	aaa	aat gaa	gga caa gcc gag acc	caa aga gaa	4272
His Ser	Ile Ala Ala	Lys	Asn Glu	Gly Gin Ala Glu Thr	Gin Arg Glu
1410		1415	1420
gcc gcc	tgg acg aag	cag	gga ggg	cct gga agg ctg tgc	gct cca aag	4320
Ala Ala	Trp Thr Lys	Gin	Gly Gly	Pro Gly Arg Leu Cys	Ala Pro Lys
1425	1430		1435	1440
cct ccg	gtc ctg ega	cgg	cat cag	agg gac ata agc ctt	cct act ttt	4368
Pro Pro	Val Leu Arg	Arg	His Gin	Arg Asp Ile Ser Leu	Pro Thr Phe
	1445			1450	1455
cag ccg	gag gaa gac	aaa	atg gac	tat gat gat atc ttc	tca act gaa	4416
Gin Pro	Glu Glu Asp	Lys	Met Asp	Tyr Asp Asp Ile Phe	Ser Thr Glu
	1460		1465 1470

PL 202 936 B1

acg aag gga gaa	gat ttt gac att	tac ggt gag gat gaa	aat Asn	cag gac Gin Asp	4464
Thr Lys Gly 1475	Glu	Asp	Phe	Asp Ile 1480	Tyr	Gly	Glu	Asp Glu 1485
cct cgc agc	ttt	cag	aag	aga acc	ega	cac	tat	ttc att	gct	gcg gtg	4512
Pro Arg Ser	Phe	Gin	Lys	Arg Thr	Arg	His	Tyr	Phe Ile	Ala	Ala Val
1490			1495			1500
gag cag ctc	tgg	gat	tac	ggg atg	agc	gaa	tcc	ccc cgg	gcg	eta aga	4560
Glu Gin Leu	Trp	Asp	Tyr	Gly Met	Ser	Glu	Ser	Pro Arg	Ala	Leu Arg
1505		1510			1515			1520
aac agg gct	cag	aac	gga	gag gtg	cct	cgg	ttc	aag aag	gtg	gtc ttc	4608
Asn Arg Ala	Gin	Asn	Gly	Glu Val	Pro	Arg	Phe	Lys Lys	Val	Val Phe
	1525			1530			1535
cgg gaa ttt	gct	gac	ggc	tcc ttc	acg	cag	ccg	tcg tac	cgc	ggg gaa	4656
Arg Glu Phe	Ala	Asp	<Uy	Ser Phe	Thr	Gin	Pro	Ser Tyr	Arg	Gly Glu
1540			1545			1550
ctc aac aaa	cac	ttg	ggg	ctc ttg	gga	ccc	tac	atc aga	gcg	gaa gtt	4704
Leu Asn Lys	His	Leu	Gly	Leu Leu	Gly	Pro	Tyr	Ile Arg	Ala	Glu Val
1555				1560				1565
gaa gac aac	atc	atg	gta	act ttc	aaa	aac	cag	gcg tct	cgt	ccc tat	4752
Glu Asp Asn	Ile	Met	Val	Thr Phe	Lys	Asn	Gin	Ala Ser	Arg	Pro Tyr
1570			1575			1580
tcc ttc tac	tcg	agc	Ctt	att tct	tat	ccg	gat	gat cag	gag	caa ggg	4800
Ser Phe Tyr	Ser	Ser	Leu	Ile Ser	Tyr	Pro	Asp	Asp Gin	Glu	Gin Gly
1585		1590			1595			1600
gca gaa cct	ega	cac	aac	ttc gtc	cag	cca	aat	gaa acc	aga	act tac	4848
Ala Glu Pro	Arg	His	Asn	Phe Val	Gin	Pro	Asn	Glu Thr	Arg	Thr Tyr
	1605			1610			1615
ttt tgg aaa	gtg	cag	cat	cac atg	gca	ccc	aca	gaa gac	gag	ttt gac	4896
Phe Trp Lys	Val	Glri	His	His Met	Ala	Pro	Thr	Glu Asp	Glu	Phe Asp
162 0			1625			1630
tgc aaa gcc	tgg	gcc	tac	ttt tct	gat	gtt	gac	ctg gaa	aaa	gat gtg	4944
Cys Lys Ala	Trp	Ala	Tyr	Phe Ser	Asp	Val	Asp	Leu Glu	Lys	Asp Val

1635 1640 1645 cac tca ggc ttg atc ggc ccc ctt ctg atc tgc cgc gcc aac acc ctg 4992

His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Arg Ala Asn Thr Leu

1650 1655 1660 aac gct gct cac ggt aga caa gtg acc gtg caa gaa ttt gct ctg ttt 5040

Asn Ala Ala His Gly Arg Gin Val Thr Val Gin Glu Phe Ala Leu Phe

1665 1670 1675 1680 ttc act att ttt gat gag aca aag agc tgg tac ttc act gaa aat gtg 5088

Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Val

1685 1690 1695

PL 202 936 B1

gaa agg aac tgc	cgg Arg	gcc ccc tgc cac ctg cag atg gag gac	ccc Pro	act Thr	5136
Glu	Arg Asn Cys 1700	Ala	Pro	Cys His 1705	Leu	Gln	Met Glu Asp 1710
ctg	aaa gaa aac	tat	cgc	ttc	cat gca	atc	aat	ggc tat gtg	atg	gat	5184
Leu	Lys Glu Asn	Tyr	Arg	Phe	His Ala	Ile	Asn	Gly Tyr Val	Met	Asp
	1715			1720			1725
aca	ctc cct ggc	tta	gta	atg	gct cag	aat	caa	agg atc ega	tgg	tat	5232
Thr	Leu Pro Gly	Leu	Val	Met	Ala Gln	Asn	Gln	Arg Ile Arg	Trp	Tyr

1730 1735 1740 ctg ctc agc atg ggc agc aat gaa aat atc cat tcg att cat ttt agc 5280

Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser

1745 1750 1755 1760 gga cac gtg ttc agt gta cgg aaa aag gag gag tat aaa atg gcc gtg 5328

Gly His Val Phe Ser Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Val

1765 1770 1775

tac aat ctc tat Tyr Asn Leu Tyr	ccg ggt gtc ttt gag aca gtg gaa atg eta ccg tcc	5376
Pro	Gly	Val	Phe Glu 1785	Thr	val	Glu	Met Leu Pro 1790	Ser
	1780
aaa	gtt gga att	tgg	ega	ata	gaa tgc	ctg	att	ggc	gag cac ctg	caa	5424
Lys	Val Gly Ile 1795	Trp	Arg	Ile Glu Cys 1800	Leu	Ile	Gly Glu His Leu 1805	Gln
gct	ggg atg agc	acg	act	ttc	ctg gtg	tac	agc	aag	gag tgt cag	gct	5472
Ala Gly Met Ser 1810	Thr	Thr Phe 1815	Leu Val	Tyr	Ser Lys 1820	Glu Cys Gln	Ala
cca	ctg gga atg	gct	tct	gga	cgc att	aga	gat	ttt	cag atc aca	gct	5520
Pro Leu Gly Met 1825	Ala Ser 1830	Gly	Arg Ile	Arg Asp 1835	Phe	Gln Ile Thr Ala 1840
tca	gga cag tat	gga	cag	tgg	gcc cca	aag	ctg	gcc	aga ctt cat	tat	5568
Ser	Gly Gln Tyr Gly 1845	Gln	Trp	Ala Pro Lys 1850	Leu	Ala	Arg Leu His 1855	Tyr
tcc	gga tca atc	aat	gcc	tgg	agc acc	aag	gat	ccc	cac tcc tgg	atc	5616
Ser	Gly Ser Ile 1860	Asn	Ala	Trp	Ser Thr 1865	Lys	Asp	Pro	His Ser Trp 1870	Ile
aag	gtg gat ctg	ttg	gca	cca	atg atc	att	cac	ggc	atc atg acc	cag	5664
Lys	Val Asp Leu 1875	Leu	Ala	Pro Met Ile 1880	Ile	His	Gly Ile Met Thr 1885	Gln
ggt	gcc cgt cag	aag	ttt	tcc	agc ctc	tac	atc	tcc	cag ttt atc	atc 1	5712
Gly Ala Arg Gln 1890	Lys	Phe Ser 1895	Ser Leu	Tyr	Ile Ser 1900	Gln Phe Ile	Ile
atg	tac agt ctt	gac	ggg	agg	aac tgg	cag	agt	tac	ega ggg aat	tcc	5760
Met Tyr Ser Leu 1905	Asp Gly Arg 1910	Asn Trp	Gln Ser 1915	Tyr	Arg Gly Asn Ser 1920

PL 202 936 B1

acg ggc	acc tta atg Thr Leu Met 1925	gtc Val	ttc ttt ggc aat gtg gac gca tet ggg att	5808
Thr	Gly	Phe Phe	Gly Asn Val 1930	Asp	Ala	Ser Gly 1935	Ile
aaa	cac	aat att ttt	aac	cct ccg	att gtg get	cgg	tac	atc cgt	ttg	5856
Lys	His	Asn Ile Phe	Asn	Pro Pro	Ile Val Ala	Arg	Tyr	Ile Arg	Leu
		1940		1945		1950
cac	cca	aca cat tac	age	atc cgc	age act ctt	cgc	atg	gag ttg	atg	5904
His	Pro	Thr His Tyr	Ser	Ile Arg	Ser Thr Leu	Arg	Met	Glu Leu	Met
	1955		1960		1965
ggc	tgt	gat tta aac	agt	tgc age	atg ccc ctg	gga	atg	cag aat	aaa	5952
Gly	Cys	Asp Leu Asn	Ser	Cys'Ser	Met Pro Leu	Gly	Met	Gin Asn	Lys
1970		1975	1980
gcg	ata	tea gac tea	cag	atc acg	gee tcc tcc	cac	eta	age aat	ata	6000
Ala	Ile	Ser Asp Ser	Gin	Ile Thr	Ala Ser Ser	His	Leu	Ser Asn	Ile
1985	1990		1995			2000
ttt	gee	acc tgg tet	cct	tea caa	gee ega ctt	cac	ctc	cag ggg	cgg	6048
Phe	Ala	Thr Trp Ser	Pro	Ser Gin	Ala Arg Leu	His	Leu	Gin Gly	Arg
		2005			2010			2015
acg	aat	gee tgg ega	ccc	cgg gtg	age age gca	gag	gag	tgg ctg	cag	6096
Thr	Asn	Ala Trp Arg	Pro	Arg Val	Ser Ser Ala	Glu	Glu	Trp Leu	Gin
		2020		2025		2030
gtg	gac	ctg cag aag	acg	gtg aag	gtc aca ggc	atc	acc	acc cag	ggc	6144
Val	Asp	Leu Gin Lys	Thr	Val Lys	Val Thr Gly	Ile	Thr	Thr Gin	Gly
	2035		2040		2045
gtg	aag	tcc ctg ctc	age	age atg	tat gtg aag	gag	ttc	ctc gtg	tcc	6192
Val	Lys	Ser Leu Leu	Ser	Ser Met	Tyr Val Lys	Glu	Phe	Leu Val	Ser
2050		2055	2060
agt	agt	cag gac ggc	cgc	cgc tgg	acc ctg ttt	ctt	cag	gac ggc	cac	6240
Ser	Ser	Gin Asp Gly Arg	Arg Trp	Thr Leu Phe	Leu	Gin	Asp Gly	His
2065	2070		2075			2080
acg	aag	gtt ttt cag	ggc	aat cag	gac tcc tcc	acc	ccc	gtg gtg	aac	6288
Thr	Lys	Val Phe Gin	Gly	Asn Gin	Asp Ser Ser	Thr	Pro	Val Val	Asn

2085 2090 . 2095 get ctg gac ccc ccg ctg ttc acg cgc tac ctg agg atc cac ccc acg 6336

Ala Leu Asp Pro Pro Leu Phe Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Thr

2100 2105 2110 age tgg gcg cag cac atc gee ctg agg ctc gag gtt eta gga tgt gag 6384

Ser Trp Ala Gin His Ile Ala Leu Arg Leu Glu Val Leu Gly Cys Glu

2115 2120 2125 gca cag gat ctc tac tga 6402

Ala Gin Asp Leu Tyr . .

2130 ‘

PL 202 936 B1 <210> 30 <211> 2133 <212> PRT <2ΐ3> Świński

<400> 30

Met 1

Gin

Leu

Glu

Leu 5

Ser

Thr

Cys

Val

Phe 10

Leu

Cys

Leu

Leu

Pro 15

Leu

Gly

Phe

Ser

Ala 20

Ile

Arg

Arg

Tyr

Tyr 25

Leu

Gly

Ala

Val

Glu 30

Leu

Ser

Trp

Asp

Tyr 35

Arg

Gin

Ser

Glu

Leu 40

Leu

Arg

Glu

Leu

His 45

Val

Asp

Thr

Arg

Phe 50

Pro

Ala

Thr

Ala

Pro 55

Gly

Ala

Leu

Pro

Leu 60

Gly

Pro

Ser

Val

Leu 65

Tyr

Lys

Lys

Thr

Val 70

Phe

Val

Glu

Phe

Thr 75

Asp

Gin

Leu

Phe

Ser 80

Val

Ala

Arg

Pro

Arg 85

Pro

Pro

Trp

Met

Gly 90

Leu

Leu

Gly

Pro

Thr 95

Ile

Gin

Ala

Glu

Val 100

Tyr

Asp

Thr

Val

Val 105

Val

Thr

Leu

Lys

Asn 110

Met

Ala

Ser

His

Pro 115

Val

Ser

Leu

His

Ala 120

Val

Gly

Val

Ser

Phe 125

Trp

Lys

Ser

Ser

Glu 130

Gly

Ala

Glu

Tyr

Glu 135

Asp

His

Thr

Ser

Gin 140

Arg

Glu

Lys

Glu

Asp 145

Asp

Lys

Val

Leu

·*> Pro 150

Gly

Lys

Ser

Gin

Thr 155

Tyr

Val

Trp

Gin

Val 160

Leu

Lys

Glu

Asn

Gly 165

V Pro

Thr

Ala

Ser

Asp 170

Pro

Pro

Cys

Leu

Thr 175

Tyr

Ser

Tyr

Leu

Ser 180

His

Val

Asp

Leu

Val 185

Lys

Asp

Leu

Asn

Ser 190

Gly

Leu

Ile

Gly

Ala 195

Leu

Leu

Val

Cys

Arg 200

Glu

Gly

Ser

Leu

Thr 205

Arg

Glu

Arg

Thr

Gin 210

Asn

Leu

His

Glu

Phe 215

Val

Leu

Leu

Phe

Ala 220

Val

Phe

Asp

Glu

Gly 225

Lys

Ser

Trp

His

Ser 230

Ala

Arg

Asn

Asp

Ser 235

Trp

Thr

Arg

Ala

Met 240

Asp

Pro

Ala

Pro

Ala 245

Arg

Ala

Gin

Pro

Ala 250

Met

His

Thr

Val

Asn 255

Gly

PL 202 936 B1

Tyr

Val

Asn

Arg 260

Ser

Leu

Pro Gly

Leu 265

Ile

Gly

Cys

His

Lys 270

Lys

Ser

Val

Tyr

Trp 275

His

Val

Ile

Gly Met 280

Gly

Thr

Ser

Pro

Glu 295

Val

His

Ser

Ile

Phe 290

Leu

Glu

Gly

His

Thr phe 295

Leu

Val

Arg

His 300

His

Arg

Gin

Ala

Ser 305

Leu

Glu

Ile

Ser

Pro 310

Leu Thr

Phe

Leu

Thr 315

Ala

Gin

Thr

Phe

Leu 320

Met

Asp

Leu

Gly

Gin 325

Phe

Leu Leu

Phe

Cys 330

His

Ile

Ser

Ser

His 335

His

His

Gly

Gly

Met 340

Glu

Ala

His Val

Arg 345

Val

Glu

Ser

Cys

Ala 350

Glu

Glu

Pro

Gin

Leu 355

Arg

Arg

Lys

Ala Asp 360

Glu

Glu

Glu

Asp

Tyr 365

ASp

Asp

Asn

Leu

Tyr 370

Asp

Ser

Asp

Met

Asp Val 375

Val

Arg

Leu

Asp 380

Gly

Asp

Asp

Val

Ser 305

Pro

Phe

Ile

Gin

Ile 390

Arg ser

Val

Ala

Lys 395

Lys

His

Pro

Lys

Thr 400

Trp

Val

His

Tyr

Ile 405

Ser

Ala Glu

Glu

Glu 410

Asp Trp Asp

Tyr

Ala 415

Pro

Ala

Val

Pro

Ser 420

Pro

Ser

Asp Arg

Ser 425

Tyr

Lys

Ser

Leu

Tyr 430

Leu

Asn

Ser

Gly

Pro 435

Gin

Arg

Ile

Gly Arg 440

Lys

Tyr

Lys

Lys

Ala 445

Arg

Phe

Val

Ala

Tyr 450

Thr

Asp

Val

Thr

Phe Lys 4ΞΞ

Thr

Arg

Lys

Ala 460

Ile

Pro

Tyr

Glu

Ser 465

Gly

Ile

Leu

Gly

Pro 470

Leu Leu

Tyr

Gly

Glu Val 475

Gly

Asp

Thr

Leu 480

Leu

Ile

Ile

Phe

Lys 485

Asn F

Lys Ala

ser

Arg 490

Pro

Tyr

Asn

Ile

Tyr 495

Pro

His

Gly

Ile

Thr 500

Asp

Val

Ser Ala

Leu 505

His

Pro

Gly Arg

Leu 510

Leu

Lys

Gly

Trp

Lys 515

His

Leu

Lys

Asp Met 520

Pro

Ile

Leu

Pro

Gly 525

Glu

Thr

Phe

Lys

Tyr

Lys

Trp

Thr

Val

Thr Val

Glu

Asp

Gly

Pro

Thr

Lys

Ser

Asp

530 535 540

PL 202 936 B1

Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Ile Asn Leu Glu Lys

545 550 555 550

Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu

565 570 575

Ser Val Asp Gin Arg Gly Asn Gin Met Met Ser Asp Lys Arg Asn Val 580 585 590

Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Gin Ser Trp Tyr Leu Ala Glu 59Ξ 600 605

Asn Ile Gin Arg Phe Leu Pro Asn Pro Asp Gly Leu Gin Pro Gin Asp 610 615 620

Pro Glu Phe Gin Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val

625 630 635 640

Phe Asp Ser Leu Gin Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp

645 650 655

Tyr Ile Leu Ser Val Gly Ala Gin Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe 660 665 670

Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr 675 680 685

Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro 690 695 700

Gly Leu Trp Val Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Leu Arg Asn Arg Gly

705 710 715 720

Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Tyr Ser Cys Asp Arg Asp Ile Gly Asp

725 730 735

Tyr Tyr Asp Asn Thr Tyr Glu Asp Ile Pro Gly Phe Leu Leu Ser Gly 740 745 750

Lys Asn Val Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ala Gin Asn Ser Arg Pro Pro 755 760 765

Ser Ala Ser Gin Lys Gin Phe Gin Thr Ile Thr Ser Pro Glu Asp Asp 770 775 780

Val Glu Leu Asp Pro Gin Ser Gly Glu Arg Thr Gin Ala Leu Glu Glu

785 790 795 800

Leu Ser Val Pro Ser Gly Asp Gly Ser Met Leu Leu Gly Gin Asn Pro

805 810 815

H.’

Ala Pro His Gly Ser Ser Ser Ser Asp Leu Gin Glu Ala Arg Asn Glu 820 825 830

PL 202 936 B1

Ala Asp Asp Tyr	Leu	Pro Gly Ala Arg 640	Glu Arg	Gly	Thr Ala 845	Pro	Ser
	635
Ala	Ala Ala Arg 850	Leu	Arg Pro Glu Leu 855	His His	Ser 860	Ala Glu	Arg	Val
Leu 865	Thr Pro Glu	Pro	Glu Lys Glu Leu 870	Lys Lys 875	Leu	Asp Ser	Lys	Met 880
Ser	Ser Ser Ser	Asp 885	Leu Leu Lys Thr	Ser Pro 890	Thr	Ile Pro	Ser 895	Asp
Thr	Leu Ser Ala 900	Glu	Thr Glu Arg Thr 905	His Ser	Leu	Gly Pro 910	Pro	His
Pro	Gin Val Asn 915	Phe	Arg Ser Gin Leu 920	Gly Ala	Ile	Val Leu 925	Gly	Lys
Asn	Ser Ser His 930	Phe	Ile Gly Ala Gly 935	Val Pro	Leu 940	Gly Ser	Thr	Glu
Glu 945	Asp His Glu	Ser	Ser Leu Gly Glu 950	Asn Val 955	Ser	Pro Val	Glu	Ser 960
Asp	Gly Ile Phe	Glu 965	Lys Glu Arg Ala	His Gly 970	Pro	Ala Ser	Leu 975	Thr
Lys	Asp Asp Val 980	Leu	Phe Lys Val Asn 985	Ile Ser	Leu	Val Lys 990	Thr	Asn
Lys	Ala Arg Val 995	Tyr	Leu Lys Thr Asn 1000	Arg Lys	Ile His Ile 1005	Asp	Asp
Ala Ala Leu Leu 1010	Thr	Glu Asn Arg Ala 1015	Ser Ala Thr 1020	Phe Met	Asp	Lys
Asn Thr Thr Ala 1025	Ser Gly Leu Asn His 1030	Val Ser 1035	Asn	Trp Ile	Lys Gly 1040
Pro	Leu Gly Lys Asn 1045	Pro Leu Ser Ser Glu Arg 1050	Gly	Pro Ser Pro 1055	Glu
Leu	Leu Thr Ser 1060	Ser	Gly Ser Gly Lys 1065	Ser Val	Lys	Gly Gin 1070	Ser	Ser
θίγ	Gin Gly Arg 1075	Ile	Arg Val Ala Val 1080	Glu Glu	Glu Glu Leu 1085	Ser	Lys
Gly Lys Glu Met 1090	Met	Leu Pro Asn Ser 1095	Glu Leu Thr 1100	Phe Leu	Thr	Asn
Ser 1105	Ala Asp Val	Gin Gly Asn Asp Thr 1110	His Ser 1115	Gin Gly Lys	Lys Ser 1120

PL 202 936 B1

Arg Glu Glu Met Glu Arg Arg Glu Lys Leu Val Gin Glu Lys Val Asp 1125 1130 1135

Leu Pro Gin Val Tyr Thr Ala Thr Gly Thr Lys Asn Phe Leu Arg Asn 1140 1145 1150

Ile Phe His Gin Ser Thr Glu Pro Ser Val Glu Gly Phe Asp Gly Gly 1155 1160 1165

Ser His Ala Pro Val Pro Gin Asp Ser Arg Ser Leu Asn Asp Ser Ala 1170 1175 1180

Glu Arg Ala Glu Thr His Ile Ala His Phe Ser Ala Ile Arg Glu Glu 1185 1190 1195 1200

Ala Pro Leu	Glu Ala Pro Gly Asn Arg Thr Gly Pro Gly Pro Arg Ser
1205	1210	1215
Ala Val Pro Arg Arg Val Lys λ 1220	Gin Ser Leu 1225	Lys Gin Ile Arg Leu Pro 1230
Leu Glu Glu 1235	Ile Lys Pro Glu Arg Gly Val 1240	Val Leu Asn Ala Thr Ser 1245 „
Thr Arg Trp 1250	Ser Glu Ser Ser 1255	Pro Ile Leu	Gin Gly Ala Lys Arg Asn 1260
Asn Leu Ser 1265	Leu Pro Phe Leu 1270	Thr Leu Glu Met Ala Gly Gly Gin Gly 1275 1280
Lys Ile Ser	Ala Leu Gly Lys 1285	Ser Ala Ala 1290	Gly Pro Leu Ala Ser Gly 1295
Lys Leu Glu Lys Ala Val Leu 1300	Ser Ser Ala 1305	Gly Leu Ser Glu Ala Ser 1310
Gly Lys Ala 1315	Glu Phe Leu Pro Lys Val Arg 1320	Val His Arg Glu Asp Leu 1325
Leu Pro Gin 1330	Lys Thr Ser Asn 1335	Val Ser Cys	Ala His Gly Asp Leu Gly 1340
Gin Glu Ile	Phe Leu Gin Lys	Thr Arg Gly	Pro Val Asn Leu Asn Lys

1345 1350 1355 1360

Val Asn Arg Pro Gly Arg Thr Pro Ser Lys Leu Leu Gly Pro Pro Met 1365 1370 ' 1375

Pro Lys Glu Trp Glu Ser Leu Glu Lys Ser Pro Lys Ser Thr Ala Leu 1380 1385 1390

Arg Thr Lys Asp Ile Ile Ser Leu Pro Leu Asp Arg His Glu Ser Asn 1395 1400 1405

PL 202 936 B1

His Ser Ile Ala Ala Lys Asn Glu Gly Gin Ala Glu Thr Gin Arg Glu
1410	1415	1420
Ala Ala Trp Thr 1425	Lys Gj.n Gly Gly Pro 1430	Gly Arg Leu Cys Ala Pro Lys 1435 1440
Pro Pro Val Leu Arg Arg His Gin Arg Asp Ile Ser Leu Pro Thr Phe 1445 1450 1455
Gin Pro Glu Glu 1460	Asp Lys Met Asp Tyr 1465	Asp Asp Ile Phe Ser Thr Glu 1470
Thr Lys Gly Glu 1475	Asp Phe Asp Ile Tyr 1480 '	Gly Glu Asp Glu Asn Gin Asp 1485
Pro Arg Ser Phe 1490	Gin Lys Arg Thr Arg 1495	His Tyr Phe Ile Ala Ala Val 1500
Glu Gin Leu Trp 1505	Asp Tyr Gly Met Ser 1510	Glu Ser Pro Arg Ala Leu Arg 1515 1520
Asn Arg Ala Gin Asn Gly Glu Val Pro Arg Phe Lys. Lys Val Val Phe 1525 1530 1535
Arg Glu Phe Ala 1540	Asp Gly Ser Phe Thr 1Ξ4Ξ	Gin Pro Ser Tyr Arg Gly Glu 1550
Leu Asn Lys His 1555	Leu Gly Leu Leu Gly 1560'	Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val 1565 J
Glu Asp Asn Ile 1570	Met Val Thr Phe Lys 1575	Asn Gin Ala Ser Arg Pro Tyr 1580
Ser Phe Tyr Ser 1585	Ser Leu Ile Ser Tyr 1590	Pro Asp Asp Gin Glu Gin Gly 1595 1600
Ala Glu Pro Arg	His Asn Phe Val Gin Pro Asn Glu Thr Arg Thr Tyr 1605 1610 1615
Phe Trp Lys Val 1620	Gin His His Met Ala 1625	Pro Thr Glu Asp Glu Phe Asp 1630
Cys Lys Ala Trp 1635	Ala Tyr Phe Ser Asp 1640	Val Asp Leu Glu Lys Asp Val 1645
His Ser Gly Leu 1650	Ile Gly Pro Leu Leu 1655	Ile Cys Arg Ala Asn Thr Leu 1660
Asn Ala Ala His 1665	Gly Arg Gin Val Thr 1670	Val Gin Glu Phe Ala Leu Phe 1675 1680
Phe Thr Ile Phe	Asp Glu Thr Lys Ser 1685	Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Val 1690 1695

PL 202 936 B1

Glu Arg	Asn Cys Arg Ala Pro Cys His Leu Gin Met Glu Asp Pro Thr
1700	1705	1710
Leu Lys Glu Asn Tyr Arg 1715	Phe His Ala Ile 1720	Asn Gly Tyr Val Met Asp 1725
Thr Leu 1730	Pro Gly Leu Val Met Ala Gin Asn .1735	Gin Arg Ile Arg Trp Tyr 1740
Leu Leu 1745	Ser Met Gly Ser 1750	Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser 1755 1760
Gly His	Val Phe Ser Val 1765	Arg Lys Lys Glu 1770	Glu Tyr Lys Met Ala Val 1775
Tyr Asn	Leu Tyr Pro Gly 1780 .	Val Phe Glu Thr 1785	Val Glu Met Leu Pro Ser 1790
Lys Val Gly Ile Trp Arg 1795	Ile Glu Cys Leu 1800	Ile Gly Glu His Leu Gin 1805
Ala Gly 1810	Met Ser Thr Thr Phe Leu Val Tyr 1815	Ser Lys Glu Cys Gin Ala 1820
Pro Leu 1825	Gly Met Ala Ser 1830	Gly Arg Ile Arg Asp Phe Gin Ile Thr Ala 1835 1840
Ser Gly	Gin Tyr Gly Gin 1845	Trp Ala Pro Lys 1850	Leu Ala Arg Leu His Tyr 1855
Ser Gly	Ser Ile Asn Ala	Trp Ser Thr Lys	Asp Pro His Ser Trp Ile

1860 1865 1870

Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Met Thr Gin 1875 1880 1885 ^;

Gly Ala 1890	Arg	Gin Lys	Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gin Phe Ile Ile
1895	1900
Met Tyr 1905	Ser	Leu Asp Gly Arg 1910	Asn Trp Gin Ser Tyr Arg Gly Asn Ser 1915 1920
Thr Gly	Thr	Leu Met 1925	Val Phe	Phe Gly Asa Val Asp Ala Ser Gly Ile 1930 1935
Lys His	Asn Ile Phe 1940	Asn Pro	Pro Ile Val Ala Arg Tyr Ile Arg Leu 1945 1950
His Pro	Thr	His Tyr	Ser Ile	Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met

1955 1960 1965

Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Gin Asn Lys 1970 1975 1980

PL 202 936 B1

Ala Ile Ser Asp Ser Gin Ile Thr Ala Ser Ser eis Leu Ser Aac Ile
1985	1990	1995	2000
Phe Ala	Thr Trp Ser Pro Ser 2005	Gin Ala Arg Leu His Leu Gin Gly Arg 2010 2015
τητ Asn	Ala Trp Arg Pro Arg 2020	Val Ser ser Ala Glu Glu Trp 2025 2030	Le-u Gin
Val Asp Leu Gin Lys Thr Val Lys Val Thr Gly ile Thr Thr 2035 2040 2045	Gin Gly
Val Lys 2050	Ser Leu Leu Ser Ser 2055	Met Tyr val Lys Glu Ehe Leu ’ 2060	Val ser
Ser Ser 2065	Gin Asp Gly Arg Arg 2070	Trp Thr Leu Phe Leu Gin Asp 2075	Gly His 2080
Thr Lys	Val Phe Gin Gly Asn 2085	Gin Asp Ser Ser Thr Ero Val Val Asn 2Q3Q 2095
Ala Leu	Asp Pro Pro Leu Phe 2100	Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His 2105 2H0	Pro Thr
Ser Trp Ala Gin His He Ala beu Arg Leu Glu Val Leu Gly 2115 2120 212$ Ala Gin Asp Leu Tyr	Cys Glu

2130 <210i 31 <211> 19 <212 > PRT .

<213> Homo sapiens <4005 31

Met Gin Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe ² £ 10 15

Cys Phe Ser / <210> 32 <211> 24 <2l2> PET <2i3> Sztuczna sekwencja » <220>

<223 > Qpi_s sztucznej sekwencji; łącznik <400> 32

Ser Phe Ala Gin Asn ser Arg Pro Pro Ser Ala ser Ala Pro Lye Pro 1 s 10 15

PL 202 936 B1

Pro val Leu Arg Arg His Gln Arg 20 <210> 33 <211> 105 <212> DNA <2i3> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: łącznik <400> 33 gtcattgaaa ctaggagctt tgcccagaat tcaagacccc ctagtgcgag cgctccaaag 60 cctccggtcc tgcgacggca tcagagggac ataagccttc ctact 105 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <2i3> . Sztuczna sekwencja ·*» <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: starter ohgonukleotydowy <400> 34 gaggaaaacc agatgatgtc a 21 <210> 35 <211> 60 ' <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220> '__ _____ _v<223> Opis sztucznej sekwencji: starter oligonukleotydowy <400> 35 ctttggagcg ctcgcactag ggggtcttga attctgggca aagctcctag gttcaatgac 60 <210> 36 _w <211> 66 <212> DNA <2i3> Sztuczna sekwencja ¹ ' <220> _______ ____________ ______ <223> opis sztucznej sekwencji: starter oligonukleotydowy <400> 36 cctagtgcga gcgctccaaa gcctccggtc ctgcgacggc atcagaggga cataagcctt 60

PL 202 936 B1 cctact 66 <210> 37 <211> 4404 <212> DNA <2i3> świński <220>

<221i CDS .

<222> (1)..(4401) <400> 37

atg cag eta gag

ctc Leu 5

ccc acc

tgt gtc ttt

ctg tgt ctc ttg cca ctc

48

Met 1

Gin

Leu

Glu

Ser

Thr

Cys

Val

Phe 10

Leu

Cys

Leu

Leu

Pro 15

Leu

ggc

ttt

agt

gcc

atc

agg

aga

tac

tac

ctg

ggc

gca

gtg

gaa

Ctg

tcc

96

Gly

Phe

Ser

Ala 20

Ile

Arg

Arg

Tyr

Tyr 25

Leu

Gly

Ala

Val

Olu 30

Leu

Ser

tgg

gac

tac

cgg

caa

agt

gaa

ctc

ctc

cgt

gag

ctg

cac

gtg

gac

acc

144

Trp

Asp

Tyr 35

Arg

Gin

Ser

Glu

Leu 40

Leu

Arg

Glu

Leu

His 45

Val

Asp

Thr

aga

ttt

cct

gct

aca

gcg

cca

gga

gct

ctt

ccg

ttg

ggc

ccg

tca

gtc

192

Arg

Phe 50

Pro

Ala

Thr

Ala

Pro 55

Gly

Ala

Leu

Pro

Leu 60

Gly

Pro

Ser

Val

ctg

tac

aaa

aag

act

gtg

ttc

gta

gag

ttc

acg

gat

caa

ctt

ttc

agc

240

Leu 65

Tyr

Lys

Lys

Thr

Val 70

Phe

Val

Glu

Phe

Thr 75

Asp

Gin

Leu

Phe

Ser 80

gtt

gcc

agg

ccc

agg

cca

cca

tgg

atg

ggt

ctg

ctg

ggt

cct

acc

atc

288

Val

Ala

Arg

Pro

Arg 85

Pro

Pro

Trp

Met

Gly 90

Leu

Leu

Gly

Pro

Thr 95

Ile

cag

gct

gag

gtt

tac

gac

acg

gtg

gtc

gtt

acc

ctg

aag

aac

atg

gct

336

Gin

Ala

Glu

Val 100

Tyr

Asp

Thr

Val

Val 105

Val

Thr

Leu

Lys

Asn 110

Met

Ala

tct

cat

ccc

gtt

agt

ctt

cac

gct

gtc

ggc

gtc

tcc

ttc

tgg

aaa

tct

384

Ser

His

Pro 115

Val

Ser

Leu

His

Ala 120

Val

Gly

Val

Ser

Phe 125

Trp

Lys

Ser

tcc

gaa

ggc

gct

gaa

tat

gag

gat

cac

acc

agc

caa

agg

gag

aag

gaa

432

Ser

Glu 130

Gly

Ala

Glu

Tyr

Glu 135

Asp

His

Thr

Ser

Gin 140

Arg

Glu

Lys

Glu

gac

gat

aaa

gtc

ctt

ccc

ggt

aaa

agc

caa

acc

tac

gtc

tgg

cag

gtc

480

Asp 145

Asp

Lys

val

Leu

Pro 150

Gly

Lys

Ser

Gin

Thr 155

Tyr

Val

Trp

Gin

Val 160

ctg

aaa

gaa

aat

ggt,, cca

aca

gcc

tct

gac

cca

cca

tgt

ctt

acc

tac

528

Leu

Lys

Glu

Asn

Gly Pro

Thr

Ala

Ser

Asp

Pro

Pro

Cys

Leu

Thr Tyr.

165 170 175

PL 202 936 B1

tea

tac

ctg

tet

cac

gtg

gac

ctg

gtg

aaa

gac

ctg

aat

tcg

ggc

ctc

576

Ser

Tyr

Leu

Ser 180

His

Val

Asp

Leu

Val 185

Lys

Asp

Leu

Asn

Ser 190

Gly

Leu

att

gga

gee

ctg

ctg

gtt

tgt

aga

gaa

ggg

agt

ctg

acc

aga

gaa

agg

624

Ile

Gly

Ala 195

Leu

Leu

Val

Cys

Arg 200

Glu

Gly

Ser

Leu

Thr 205

Arg

Glu

Arg

acc

cag

aac

ctg

cac

gaa

ttt

gta

eta

ctt

ttt

get

gtc

ttt

gat

gaa

672

Thr

Gin 210

Asn

Leu

His

Glu

Phe 215

Val

Leu

Leu

Phe

Ala 220

Val

Phe

Asp

Glu

ggg

aaa

agt

tgg

cac

tea

gca

aga

aat

gac

tcc

tgg

aca

cgg

gee

atg

720

Gly 225

Lys

Ser

Trp

His

Ser 230

Ala

Arg

Asn

Asp

Ser 235

Trp

Thr

Arg

Ala

Met 240

gat

ccc

gca

cct

gee

agg

gee

cag

cct

gca

atg

cac

aca

gtc

aat

ggc

768

Asp

Pro

Ala

Pro

Ala 245

Arg

Ala

Gin

Pro

Ala 250

Met

His

Thr

Val

Asn 255

Gly

tat

gtc

aac

agg

tet

ctg

cca

ggt

ctg

atc

gga

tgt

cat

aag

aaa

tea

816

Tyr

Val

Asn

Arg 260

Ser

Leu

Pro

Gly

Leu 265

Ile

Gly

Cys

His

Lys 270

Lys

Ser

gtc

tac

tgg

cac

gtg

att

gga

atg

ggc

acc

age

ccg

gaa

gtg

cac

tcc

864

Val

Tyr

Trp 275

His

Val

Ile

Gly

Met 280

Gly

Thr

Ser

Pro

Glu 285

Val

His

Ser

att

ttt

ctt

gaa

ggc

cac

acg

ttt

ctc

gtg

agg

cac

cat

cgc

cag

get

912

Ile

Phe 290

Leu

Glu

Giy

His

Thr 295

Phe

Leu

Val

Arg

His 300

His

Arg

Gin

Ala

tcc

ttg

gag

atc

tcg

cca

eta

act

ttc

ctc

act

get

cag

aca

ttc

ctg

960

Ser 305

Leu

Glu

Ile

Ser

Pro 310 *

Leu

Thr

Phe

Leu

Thr 315

Ala

Gin

Thr

Phe

Leu 320

atg

gac

ctt

ggc

cag

ttc

eta

ctg

ttt

tgt

cat

atc

tet

tcc

cac

cac

1008

Met

Asp

Leu

Gly

Gin 325

Phe

Leu

Leu

Phe

Cys 330

His

Ile

Ser

Ser

His 335

His

cat

ggt

ggc

atg

gag

get

cac

gtc

aga

gta

gaa

age

tgc

gee

gag

gag

1056

His

Gly

Gly

Met 340

Glu

Ala

His

Val

Arg 345

Val

Glu

Ser

Cys

Ala 350

Glu

Glu

ccc

cag

ctg

cgg

agg

aaa

get

gat

gaa

gag

gaa

gat

tat

gat

gac

aat

1104

Pro

Gin

Leu 355

Arg

Arg

Lys

Ala

Asp 360

Glu

Glu

Glu

Asp

Tyr 365

Asp

Asp

Asn

ttg

tac

gac

tcg

gac

atg

gac

gtg

gtc

cgg

ctc

gat

ggt

gac

gac

gtg

1152

Leu

Tyr 370

Asp

Ser

Asp

Met

Asp 375

Val

Val

Arg

Leu

Asp 380

Gly Asp Asp

Val

tet

ccc

ttt

atc

caa

atc

cgc

tcg

gtt

gee

aag

aag

cat

ccc

aaa

acc

1200

Ser 385

Pro

Phe

Ile

Gin

Ile 390

Arg

Ser

Val

Ala

Lys 395

Lys

His

Pro

Lys

Thr 400

PL 202 936 B1

tgg Trp

gtg cac

tac atc tct gca gag gag gag gac tgg gac tac gcc

.Ccc . Pro

1248

Val

His

Tyr

Ile 405

Ser

Ala

Glu Glu

Glu Asp 410

Trp Asp

Tyr

Ala 415

gcg

gtc

ccc

agc

ccc

agt

gac

aga agt

tat aaa

agt ctc

tac

ttg

aac

1296

Ala

Val

Pro

Ser

Pro

Ser

Asp

Arg Ser

Tyr Lys

Ser Leu

Tyr

Leu

Asn

420

425

430

agt

ggt

cct

cag

ega

att

ggt

agg aaa

tac aaa

aaa get

ega

ttc

gtc

1344

Ser

Gly

Pro

Gin

Arg

Ile

Gly

Arg Lys

Tyr Lys

Lys Ala

Arg

Phe

Val

435

440

445

get

tac

acg

gat

gta

aca

ttt

aag act

cgt aaa

get att

ccg

tat

gaa

1392

Ala

Tyr

Thr

Asp

Val

Thr

Phe

Lys Thr

Arg Lys

Ala Ile.

Pro

Tyr

Glu

450

455

460

tca

gga

atc

ctg

gga

cct

tta

ctt tat

gga gaa

gtt gga

gac

aca

ctt

1440

ser

Gly

Ile

Leu

Gly

Pro

Leu

Leu Tyr

Gly Glu

Val Gly

Asp

Thr

Leu

465

470

475

480

ttg

att

ata

ttt

aag

aat

aaa

gcg agc

ega cca

tat aac

atc

tac

cct

1488

Leu

Ile

Ile

Phe

Lys

Asn

Lys

Ala Ser

Arg Pro

Tyr Asn

Ile

Tyr

Pro

485

490

495

cat

gga

atc

act

gat

gtc

agc

get ttg

cac cca

ggg aga

ctt

eta

aaa

1536

His

Gly

Ile

Thr

Asp

Val

Ser

Ala Leu

His Pro

Gly Arg

Leu

Leu

Lys

500

505

510

ggt

tgg

aaa

cat

ttg

aaa

gac

atg cca

att ctg

cca gga

gag

act

ttc

1584

Gly

Trp

Lys

His

Leu

Lys

Asp

Met Pro

Ile Leu

Pro Gly

Glu

Thr

Phe

515

520

525

aag

tat

aaa

tgg

aca

gtg

act

gtg gaa

gat ggg

cca acc

aag

tcc

gat

1632

Lys

Tyr

Lys

Trp

Thr

Val

Thr

Val Glu

Asp Gly

Pro Thr

Lys

Ser

Asp

530

535

540

cct

cgg

tgc

ctg

acc

ege

tac

tac teg

agc tcc

att aat

eta

gag

aaa

1680

Pro

Arg

Cys

Leu

Thr

Arg

Tyr

Tyr Ser

Ser Ser

Ile Asn

Leu

Glu

Lys

545

550

555

560

gat

ctg

get

teg

gga

ctc

att

ggc cct

ctc ctc

atc tgc

tac

aaa

gaa

1728

Asp

Leu

Ala

Ser

Gly

Leu

Ile

Gly Pro

Leu Leu

Ile Cys

Tyr

Lys

Glu

565

570

575

tct

gta

gac

caa

aga

gga

aac

cag atg

atg tca

gac aag

aga

aac

gtc

1776

Ser

Val

Asp

Gin

Arg

Gly

Asn

Gin Met

Met Ser

Asp Lys

Arg

Asn

Val

580

585

590

atc

ctg

ttt

tct

gta

ttc

gat

gag aat

caa agc

tgg tac

ctc

gca

gag

1824

Ile

Leu

Phe

Ser

Val

Phe

Asp

Glu Asn

Gin Ser

Trp Tyr

Leu

Ala

Glu

595

600

605

aat

att

cag

ege

ttc

ctc

ccc

aat ccg

gat gga

tta cag

ccc

cag

gat

1872

Asn

Ile

Gin

Arg

Phe

Leu

Pro

Asn Pro

Asp Gly

Leu Gin

Pro

Gin

Asp

€10 €15 620

PL 202 936 B1

cca

gag

ttc

caa

gct

tct

aac

atc

atg

cac

agc

atc

aat

ggc

tat

gtt

1920

Pro 625

Glu

Phe

Gin

Ala

Ser 630

Asn

Ile

Met

His

Ser 635

Ile

Asn

Gly

Tyr

Val 640

ttt

gat

agc

ttg

cag

ctg

teg

gtt

tgt

ttg

cac

gag

gtg

gca

tac

tgg

1968

Phe

Asp

Ser

Leu

Gin 645

Leu

Ser

Val

Cys

Leu 650

His

Glu

Val

Ala

Tyr 655

Trp

tac

att

eta

agt

gtt

gga

gca

cag

acg

gac

ttc

ctc

tcc

gtc

ttc

ttc

2016

Tyr

Ile

Leu

Ser 660

Val

Gly

Ala

Gin

Thr 665

Asp

Phe

Leu

Ser

Val 670

Phe

Phe

tct

ggc

tac

acc

ttc

aaa

cac

aaa

atg

gtc

tat

gaa

gac

aca

ctc

acc

2064

Ser

Gly

Tyr 675

Thr

Phe

Lys

His

Lys 6B0

Met

Val

Tyr

Glu

Asp 685

Thr

Leu

Thr

ctg

ttc

ccc

ttc

tca

gga

gaa

acg

gtc

ttc

atg

tca

atg

gaa

aac

cca

2112

Leu

Phe 690

pro

Phe

Ser

Gly

Glu 695

Thr

Val

Phe

Met

Ser 700

Met

Glu

Asn

Pro

ggt

ctc

tgg

gtc

ctt

ggg

tgc

cac

aac

tca

gac

ttg

cgg

aac

aga

ggg

2160

Gly 705

Leu

Trp

Val

Leu

Gly 710

Cys

His

Asn

Ser

Asp 715

Leu

Arg

Asn

Arg

Gly 720

atg

aca

gcc

tta

ctg

aag

gtg

tat

agt

tgt

gac

agg

gac

att

ggt

gat

2208

Met

Thr

Ala

Leu

Leu 725

Lys

Val

Tyr

Ser

Cys 730

Asp

Arg

Asp

Ile

Gly 735

Asp

tat

tat

gac

aac

act

tat

gaa

gat

att

cca

ggc

ttc

ttg

ctg

agt

gga

2256

Tyr

Tyr

Asp

Asn 740

Thr

Tyr

Glu

Asp

Ile 745

Pro

Gly

Phe

Leu

Leu 750

Ser

Gly

aag

aat

gtc

att

gaa

cct

agg

agc

ttt

gcc

cag

aat

tca

aga

ccc

cct

2304

Lys

Asn

Val 755

Ile

Glu

Pro

Arg

Ser 760

Phe

Ala

Gin

Asn

Ser 765

Arg

Pro

Pro

agt

gcg

agc

gct

cca

aag

cct

ccg

gtc

ctg

ega

cgg

cat

cag

agg

gac

2352

Ser

Ala 770

Ser

Ala

Pro

Lys

Pro 775

Pro

Val

Leu

Arg

Arg 780

His

Gin

Arg

Asp

ata

agc

ctt

cct

act

ttt

cag

ccg

gag

gaa

gac

aaa

atg

gac

tat

gat

2400

Ile 785

Ser

Leu

Pro

Thr

Phe 790

Gin

Pro

Glu

Glu

Asp 795

Lys

Met

Asp

Tyr

Asp 800

gat

atc

ttc

tca

act

gaa

acg

aag

gga

gaa

gat

ttt

gac

att

tac

ggt

2448

Asp

Ile

Phe

Ser

Thr 805

Glu

Thr

Lys

Gly

Glu 810

Asp

Phe

ASp

Ile

Tyr B15

Gly

gag

gat

gaa

aat

cag ,gac

cct

cgc

agc

ttt

cag

aag

aga

acc

ega

cac

2496

Glu

Asp

Glu

Asn 820

Gin

Asp

Pro

Arg

Ser 825

Phe

Gin

Lys

Arg

Thr 830

Arg

His

tat

ttc

att

gct

gcg

gtg

gag

cag

ctc

tgg

gat

tac

ggg

atg

agc

gaa

2544

Tyr

Phe

Ile 835

Ala

Ala

Val

Glu

Gin 840

Leu

Trp

Asp

Tyr

Gly 845

Met

Ser

Glu

PL 202 936 B1

tcc ccc cgg

gcg Ala

eta aga

aac agg gct cag aac gga

gag gtg Glu Val

cct cgg Pro Arg

2592

Ser Pro 850

Arg

Leu

Arg

Asn 855

Arg

Ala

Gin

Asn

Gly 860

ttc aag

aag

gtg

gtc

ttc

cgg

gaa

ttt

gct

gac

ggc

tcc ttc

acg cag

2640

Phe Lys B65

Lys

Val

Val

Phe 870

Arg

Glu

Phe

Ala

Asp 875

Gly

Ser Phe

Thr Gin 880

ccg tcg

tac

cgc

ggg

gaa

ctc

aac

aaa

cac

ttg

ggg

ctc ttg

gga ccc

2688

Pro Ser

Tyr

Arg

Gly 885

Glu

Leu

Asn

Lys

His 890

Leu

Gly

Leu Leu

Gly Pro 895

tac atc

aga

srcg

gaa

gtt

gaa

gac

aac

atc

atg

gta

act ttc

aaa aac

2736

Tyr Ile

Arg

Ala 900

Glu

Val

Glu

Asp

Aśn 905

Ile

Met

Val

Thr Phe 91Q

Lys Asn

cag gcg

tct

cgt

ccc

tat

tcc

ttc

tac

tcg

agc

ctt

att tct

tat ccg

2784

Gin Ala

Ser 915

Arg

Pro

Tyr

Ser

Phe 920

Tyr

Ser

Ser

Leu

Ile Ser 925

Tyr Pro

gat gat

cag

gag

caa

ggg

gca

gaa

cct

ega

cac

aac

ttc gtc

cag cca

2832

Asp Asp 930

Gin

Glu

Gin

Gly

Ala 935

Glu

Pro

Arg

His

Asn 940

Phe Val

Gin Pro

aat gaa

acc

aga

act

tac

ttt

tgg

aaa

gtg

cag

cat

cac atg

gca ccc

2880

Asn Glu 945

Thr

Arg

Thr

Tyr 950

Phe

Trp

Lys

Val

Gin 955

His

His Met

Ala Pro 960

aca gaa

gac

gag

ttt

gac

tgc

aaa

gcc

tgg

gcc

tac

ttt tct

gat gtt

2928

Thr Glu

Asp

Glu

Phe 965

Asp

Cys

Lys

Ala

Trp 970

Ala

Tyr

Phe Ser

Asp Val 975

gac ctg

gaa

aaa

gat

gtg

cac

tca

ggc

ttg

atc

ggc

ccc ctt

ctg atc

2976

Asp Leu

Glu

Lys 9B0

Asp

Val

His

Ser

Gly 985

Leu

Ile

Gly

Pro Leu 990

Leu Ile

tgc cgc

gcc

aac

acc

ctg

aac

gct

gct

cac

ggt

aga

caa gtg

acc gtg

3024

Cys Arg

Ala 995

Asn

Thr

Leu

Asn Ala 1000

Ala

His

Gly Arg Gin Val 1005

Thr Val

caa gaa

ttt

gct

ctg

ttt

ttc

act

att

ttt

gat

gag

aca aag

agc tgg

3072

Gin Glu 1010

Phe

Ala

Leu

Phe Phe 1015

Thr

Ile

Phe

Asp Glu 1020

Thr Lys

Ser Trp

tac ttc

act

gaa

aat

gtg

gaa

agg

aac

tgc

cgg

gcc

ccc tgc

cat ctg

3120

Tyr Phe 1025

Thr

Glu

Asn Val 1030

Glu

Arg

Asn

Cys Arg 1035

Ala

Pro Cys

His Leu 1040

cag atg

gag

gac

ccc

act

ctg

aaa

gaa

aac

tat

cgc

ttc cat

gca atc

3168

Gin Met

Glu

Asp Pro 1045

Thr

Leu

Lys

Glu Asn 1050

Tyr

Arg

Phe His Ala Ile 1055

aat ggc

tat

gtg

atg

gat

aca

ctc

cct

ggc

tta

gta

atg gct

cag aat

3216

Asn Gly

Tyr

Val

Met

Asp

Thr

Leu

Pro Gly

Leu

Val

Met Ala

Gin Asn

1060 1065 1070

PL 202 936 B1

caa agg atc	ega tgg tat ctg ctc age atg ggc age aat gaa aat atc	3264
Gin	Arg Ile 1075	Arg Trp Tyr	Leu Leu Ser 1080	Met	Gly	Ser Asn 1085	Glu	Asn	Ile
cat	teg att	cat ttt age	gga cac gtg	ttc	agt	gta cgg	aaa	aag	gag	3312
His	Ser Ile	His Phe Ser	Gly His Val	Phe	Ser	Val Arg	Lys	Lys	Glu
1090	1095		1100
gag	tat aaa	atg gcc gtg	tac aat ctc	tat	ccg	ggt gtc	ttt	gag	aca	3360
Glu Tyr Lys	Met Ala Val	Tyr Asn Leu	Tyr	Pro	Gly val	Phe	Glu	Thr
1105	1110		1115			1120
gtg	gaa atg	eta ccg tcc	aaa gtt gga	att	tgg	ega ata	gaa	tgc	ctg	3408
Val	Glu Met	Leu Pro Ser	Lys Val Gly	Ile	Trp Arg Ile	Glu	Cys	Leu
		1125	1130			1135
att	ggc gag	cac ctg caa	get ggg atg	age	acg	act ttc	ctg	gtg	tac	3456
Ile	Gly Glu	His Leu Glu	Ala Gly Met	Ser	Thr	Thr Phe	Leu	Val	Tyr
	1140	1145			1150
age	aag gag	tgt cag get	cca ctg gga	atg	get	tct gga	cgc	att	aga	3504
Ser	Lys Glu	Cys Gin Ala	Pro Leu Gly	Met	Ala	Ser Gly	Arg	Ile	Arg
	1155		neo			1165
gat	ttt cag	atc aca get	tca gga cag	tat	gga	cag tgg	gcc	cca	aag	3552
Asp	Phe Gin	Ile Thr Ala	Ser Gly Gin	Tyr	Gly	Gin Trp	Ala	Pro	Lys
1170	1175		1180
ctg gcc aga	ctt cat tat	tcc gga tca	atc	aat	gcc tgg	age	acc	aag	3600
Leu	Ala Arg	Leu His Tyr	Ser Gly Ser	Ile	Asn	Ala Trp	Ser	Thr	Lys '
1185	1190		1195			1200
gat	ccc cac	tcc tgg atc	aag gtg gat	ctg	ttg	gca cca	atg	atc	att	3648
Asp	Pro His	Ser Trp Ile	Lys Val Asp	Leu	Leu	Ala Pro	Met	Ile	Ile
		1205	1210			1215
cac	ggc atc	atg acc cag	ggt gcc cgt	cag	aag	ttt tcc	age	ctc	tac	3696
His	Gly Ile	Met Thr Gin	Gly Ala Arg	Gin	Lys	Phe Ser	Ser	Leu	Tyr

1220 1225 1230 atc tcc cag ttt atc atc atg tac agt ctt gac ggg agg aac tgg cag 3744

Ile Ser Gin Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Arg Asn Trp Gin

1235 1240 1245 agt tac ega ggg aat tcc acg ggc acc tta atg gtc ttc ttt ggc aat 3792

Ser Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn

1250 1255 1260 gtg gac gca tct ggg att aaa cac aat att ttt aac cct ccg att gtg 3840

Val Asp Ala Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro pro Ile Val

1265 1270 1275 1280 get cgg tac atc cgt ttg cac cca aca cat tac age atc cgc age act 3888

Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr

1285 1250 1295

PL 202 936 B1

ctt cgę atg gag ttg atg ggc tgt gat tta aac agt tgc agc atg ęcc Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys ser Met Pro	3536
	1300	1305	1310
ctg	gga atg cag aat aaa gcg	ata tca gac	tca cag atc acg gcc tcc	3984
Leu	Gly Met Gln Asn Lys Ala	Ile Ser Asp	Ser Gln Ile Thr Ala ser
	1313	1320	1325
tcc	cac eta agc aat ata ttt	gcc acc tgg	tct cct tca caa gcc ega	4032
Ser	His Leu Ser Asn Ile Phe	Ala Thr Trp	Ser Pro Ser Gln Ala Arg
1330 1335		1340
ctt	cac ctc cag ggg cgg acg	aat gcc tgg	ega ccc cgg gtg agc agc	4080
Leu	His Leu Gln Gly Arg Thr	Asn Ala Trp Arg Pro Arg Val Ser ser
1345 1350	1355 1360
gca	gag gag tgg ctg cag gtg	gac ctg cag	aag acg gtg aag gtc aca	4128
Ala	Glu Glu Trp Leu Gln Val	Asp Leu Gln	Lys Thr Val Lys Val Thr
	1365	1370	1375
ggc	atc acc acc cag ggc gtg	aag tcc ctg	ctc agc agc atg tat gtg	4176
Gly	Ile Thr Thr Gln Gly val	Lys Ser Leu	Leu Ser Ser Met Tyr val
	1280	1385	1390
aag	gag ttc ctc gtg tcc agt	ajt cag gac	ggc cgc ego tgg acc ętg	4224
Lys	Glu Phe Leu Val Ser Ser	Ser Gln Asp Gly Arg Arg Trp Thr Leu
	1395 1400	1405
ttt	ctt cag gac ggc cac acg	aag gtt ttt	cag ggc aat cag gac tcc	4272
Phe	Leu Gln Asp Gly His Thr	Lys Val Phe	Gln Gly Asa Gln Asp ser
1410 1415		1420
tcc	acc ccc gtg gtg aac gct	etg gac ecn	ceg ctg tt« aeg cgc tae	4320
Ser	Thr Pro Vai Val Asn Ala	Leu Asp Pro	Pro Leu Phe Thr Arg Tyr
1425	1430	1435 1440
ctg	agg atc cac ccc acg agc	t^g gcg cag	cac atc gcc ctg agg ctc	4368
Leu	Arg He His Pro Thr Ser	Trp Ala Gln	His tle Ala Leu Arg Leu

1445 1450 1455 gag gtt eta gga tgt gag gca Cag gat qtc tac tga 4404

Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp leu Tyr

1460 1455 <210» 38 <211» 1467 <212» PET.

<213 > Świński <400> 30

Met Gln Leu Glu Leu Ser Thr Oys Val Phe Leu Cys Leu Leu Pro Leu ¹ 5 io 15

Gly Phe Ser Ala Ile Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Clu Leu ser 20 25 30

PL 202 936 B1

Trp

Asp

Tyr 35

Arg

Gin

Ser

Glu

Leu 40

Leu

Arg

Glu

Leu

His 45

Val

Asp

Thr

Arg

Phe 50

Pro

Ala

Thr

Ala

Pro 55

Gly

Ala

Leu

Pro

Leu 60

Gly

Pro

Ser

Val

Leu 65

Tyr

Lys

Lys

Thr

tfal 70

Phe

Val

Glu

Phe

Thr 75

Asp

Gin

Leu

Phe

Ser so

Val

Ala

Arg

Pro

Arg B5

Pro

Pro

Trp

Met

Gly 90

Leu

Leu

Gly

Pro

Thr 95

ile

Gin

Ala

Glu

Val 100

Tyr

Asp

Thr

Val

Val 105

Val

Thr

Leu

Lys

Asn 110

Met

Ala

Ser

His

Pro 115

Val

Ser

Leu

His

Ala 120

Val

Gly

Val

Ser

Phe 125

Trp

Lys

Ser

Ser

Glu 130

Gly

Ala

Glu

Tyr

Glu 135

Asp

His

Thr

Ser

Gin 140

Arg

Glu

Lys

Glu

Asp 145

Asp

Lys

Val

Leu

Pro 150

Gly Lys

Ser

Gin

Thr 155

Tyr

Val

Trp

Gin

Val 160

Leu

Lys

Glu

Asn

Gly 165

Pro

Thr

Ala

Ser

Asp 170

Pro

Pro

Cys

Leu

Thr 175

Tyr

Ser

Tyr

Leu

Ser ISO

His

Val

Asp

Leu

Val 1B5

Lys

Asp

Leu

Asn

Ser 190

Gly

Leu

Ile

Gly

Ala 195

Leu

Leu

Val

Cys

Arg 200

Glu

Gly

Ser

Leu

Thr 205

Arg

Glu . Arg

Thr

Gin 210

Asn

Leu

His

Glu

Phe 215

Val

Leu

Leu

Phe

Ala 220

Val

Phe

Asp

Glu

Gly 225

Lys

Ser

Trp

His

Ser 230

Ala

Arg

Asn

Asp

Ser 235

Trp

Thr

Arg

Ala

Met 240

Asp

Pro

Ala

Pro

Ala 245

Arg

Ala

Gin

Pro

Ala 250

Met

His

Thr

Val

Asn 255

Gly

Tyr

Val

Asn

Arg 260

Ser

Leu

Pro

Gly

Leu 265

Ile

Gly

Cys

His

Lys 270

Lys

Ser

Val

Tyr

Trp 275

His

Val

Ile

Gly

Met 2S0

Gly

Thr

Ser

Pro

Glu 285

Val

His

Ser

Ile

Phe 290

Leu

Glu

Gly

His

Thr 295

Phe

Leu

Val

Arg

His 300

His

Arg

Gin

Ala

Ser

Leu

Glu

Ile

Ser

Pro

Leu

Thr

Phe

Leu

Thr

Ala

Gin

Thr

Phe

Leu

305 310 315 320

PL 202 936 B1

Met

Asp

Leu

Gly

Gln 325

Phe

Leu

Leu

Phe

Cys 330

His

Ile

Ser

Ser

His 335

His

His

Gly

Gly

Met 340

Glu

Ala

His

Val

Arg 345

Val

Glu

Ser

Cys

Ala 350

Glu

Glu

Pro

Gln

Leu 355

Arg

Arg

Lys

Ala

Asp 360

Glu

Glu

Glu

Asp

Tyr 365

Asp

Asp

Asn

Leu

Tyr 370

Asp

Ser

Asp

Met

Asp 375

Val

Val

Arg

Leu

Asp 380

Gly Asp

Asp

Val

Ser 385

Pro

Phe

Ile

Gln

He 3*90

Arg

Ser

Val

Ala

Lys 395

Lys

His

Pro

Lys

Thr 400

Trp

Val

His

Tyr

Ile 405

Ser

Ala

Glu

Glu

Glu 410

Asp

Trp

Asp

Tyr

Ala 415

Pro

Ala

Val

Pro

Ser 420

Pro

Ser

Asp

Arg

Ser 425

Tyr

Lys

Ser

Leu

Tyr 430

Leu

Asn

Ser

Gly

Pro 435

Gln

Arg

Ile

Gly

Arg 440

Lys

Tyr

Lys

Lys

Ala 445

Arg

Phe

Val

Ala

Tyr 450

Thr

Asp

Val

Thr

Phe 455

Lys

Thr

Arg

Lys

Ala 460

Ile

Pro

Tyr

Glu

Ser 465

Gly

Ile

Leu

Gly

Pro 470

Leu

Leu

Tyr

Gly

Glu 475

Val

Gly Asp

Thr

Leu 4B0

Leu

Ile

Ile

Phe

Lys 485

Asn

Lys

Ala

Ser

Arg 490

Pro

Tyr

Asn

Ile

Tyr 495

Pro

His

Gly

Ile

Thr 500

Asp

Val

Ser

Ala

Leu 505

His

Pro

Gly

Arg

Leu 510

Leu

Lys

Gly

Trp

Lys 515

His

Leu

Lys

Asp

Met 520

Pro

Ile

Leu

Pro

Gly 525

Glu

Thr

Phe

Lys

Tyr 530

Lys

Trp

Thr

Val

Thr 535

Val

Glu

Asp

Gly

Pro 540

Thr

Lys

Ser

Asp

Pro 545

Arg

Cys

Leu

Thr

Arg 550

Tyr

Tyr

Ser

Ser

Ser 555

Ile

Asn

Leu

Glu

Lys 560

Asp

Leu

Ala

Ser

Gly 565

Leu

Ile

Gly

Pro

Leu 570

Leu

Ile

Cys

Tyr

Lys 575

Glu

Ser t

Val

Asp

Gln 580

Arg

Gly

Asn

Gln

Met 585

Met

Ser

Asp

Lys

Arg 590

Asn

Val

Ile

Leu

Phe

Ser

Val

Phe

Asp

Glu

Asn

Gln

Ser

Trp

Tyr

Leu

Ala

Glu

595 600 605

PL 202 936 B1

Asn

Ile 610

Gin

Arg

Phe

Leu

Pro 615

Asn

Pro

Asp

Gly

Leu 620

Gin

Pro

Gin

Asp

Pro 625

Glu

Phe

Gin

Ala

Ser 630

Asn

Ile

Met

His

Ser 635

Ile

Asn

Gly

Tyr

Val 640

Phe

Asp

Ser

Leu

Gin 645

Leu

Ser

Val

Cys

Leu 650

His

Glu

Val

Ala

Tyr 655

Trp

Tyr

Ile

Leu

Ser 660

Val

Gly

Ala

Gin

Thr 665

Asp

Phe

Leu

Ser

Val 670

Phe

Phe

Ser

Gly

Tyr 675

Thr

Phe

Lys

His

Lys 680

Met

Val

Tyr

Glu

Asp 685

Thr

Leu

Thr

Leu

Phe 690

Pro

Phe

Ser

Gly

Glu 695

Thr

Val

Phe

Met

Ser 700

Met

Glu

Asn

Pro

Gly 705

Leu

Trp

Val

Leu

Gly 710

Cys

His

Asn

Ser

Asp 715

Leu

Arg

Asn

Arg

Gly 720

Met

Thr

Ala

Leu

Leu 725

Lys

Val

Tyr

Ser

Cys 730

Asp

Arg

Asp

Ile

Gly 735

Asp

Tyr

Tyr

Asp

Asn 740

Thr

Tyr

Glu

Asp

Ile 745

Pro

Gly

Phe

Leu

Leu 750

Ser

Gly

Lys

Asn

Val 755

Ile

Glu

Pro

Arg

Ser 760

Phe

Ala

Gin

Asn

Ser 765

Arg

Pro

Pro

Ser

Ala 770

Ser

Ala

Pro

Lys

Pro 775

Pro

Val

Leu

Arg

Arg 780

His

Gin

Arg

Asp

Ile 785

Ser

Leu

Pro

Thr

Phe 790

Gin

Pro

Glu

Glu

Asp 795

Lys

Met

Asp

Tyr

Asp 800

Asp

Ile

Phe

Ser

Thr 805

Glu

Thr

Lys

Gly

Glu 810

Asp

Phe

Asp

Ile

Tyr 815

Gly

Glu

Asp

Glu

Asn 820

Gin

Asp

Pro

Arg

Ser 825

Phe

Gin

Lys

Arg

Thr 830

Arg

His

Tyr

Phe

Ile 835

Ala

Ala

Val

Glu

Gin 840

Leu

Trp

Asp

Tyr

Gly 845

Met

Ser

Glu

Ser

Pro 850

Arg

Ala

Leu

Arg

Asn 855

Arg

Ala

Gin

Asn

Gly 860

Glu

Val

Pro

Arg'

Phe 865

Lys

Lys

Val

Val

Phe 870

Arg

Glu

Phe

Ala

Asp 875

Gly

Ser

Phe

Thr

Gin 880

Pro

Ser

Tyr

Arg

Gly 885

Glu

Leu

Asn

Lys

His 890

Leu

Gly

Leu

Leu

Gly 895

Pro

PL 202 936 B1

Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Lys	Asn
	900	905	910
Gin	Ala Ser Arg Pro	Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser	Leu Ile Ser Tyr	Pro
	915	920	925
Asp	Asp Gin Glu Gin	Gly Ala Glu Pro Arg His	Asn Phe Val Gin	Pro
	930	935	940
Asn	Glu Thr Arg Thr	Tyr Phe Trp Lys Val Gin	His His Met Ala	Pro
945		950 955		960
Thr	Glu Asp Glu Phe	Asp Cys Lys Ala Trp Ala	Tyr Phe Ser Asp	Val
	965	970	975
Asp	Leu Glu Lys Asp	Val His Ser Gly Leu Ile	Gly Pro Leu Leu	Ile
	980	985	990
Cys	Arg Ala Asn Thr	Leu Asn Ala Ala His Gly Arg Gin Val Thr	Val
	995	1000	1005
Gin	Glu Phe Ala Leu	Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser	Trp
1010	1015 1020
Tyr	Phe Thr Glu Asn	Val Glu Arg Asn Cys Arg	Ala Pro Cys His	Leu
1025 1030 1035	1040
Gin	Met Glu Asp Pro	TKr Leu Lys Glu Asn Tyr	Arg Phe His Ala	Ile
	1045	1050	1055
Asn	Gly Tyr Val Met	Asp Thr Leu Pro Gly Leu	Val Met Ala Gin	Asn
	1060	1065	1070
Gin	Arg Ile Arg Trp	Tyr Leu Leu Ser Met Gly	Ser Asn Glu Asn	Ile
	1075	1080	1085
His	Ser Ile His Phe	Ser Gly His Val Phe Ser	Val Arg Lys Lys	Glu
1090	1095 1100
Glu	Tyr Lys Met Ala	Val Tyr Asn Leu Tyr Pro	Gly Val Phe Glu	Thr
1105	i 1110 . 1115	1120
Val	Glu Met Leu Pro	Ser Lys Val Gly Ile Trp	Arg Ile Glu Cys	Leu

1125 1130 1135

Ile Gly Glu His Leu Gin Ala Gly Met Ser Thr Thr Phe Leu Val Tyr 1140 1145 1150

Ser Lys Glu Cys Gin Ala Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly Arg Ile Arg 1155 1160 1165

Asp Phe Gin Ile Thr Ala Ser Gly Gin Tyr Gly Gin Trp Ala Pro Lys 1170 1175 1180

PL 202 936 B1

Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys
1185	1190	1195	1200
Asp Pro His Ser Trp Ile 1205	Lys Val Asp Leu Leu 1210	Ala Pro Met Ile Ile 1215
His Gly Ile Met 1220	Thr Gin	Gly Ala Arg Gin Lys 1225	Phe Ser Ser Leu Tyr 1230
Ile Ser Gin Phe	Ile Ile	Met Tyr Ser Leu Asp	Gly Arg Asn Trp Gin

1235 1240 1245

Ser Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn 1250 1255 1260

Val Asp Ala Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Val 1265 1270 1275 1280

Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr
1235	1290	1295
Leu Arg Met Glu Leu Met 1300	Gly Cys Asp Leu Asn Ser 1305	Cys Ser Met Pro 1310
Leu Gly Met Gin Asn Lys 1315	Ala Ile Ser Asp Ser Gin Ile Thr Ala Ser 1320 1325
Ser His Leu Ser Asn ile Phe Ala Thr Trp Ser Pro 1330 1335 1340	Ser Gin Ala Arg
Leu His Leu Gin Gly Arg 1345 1350	Thr Asn Ala Trp Arg Pro 1355	Arg Val Ser Ser 1360
Ala Glu Glu Trp Leu Gin 1365 w	Val Asp Leu Gin Lys Thr 1370	Val Lys Val Thr 1375
Gly Ile Thr Thr Gin Gly 1380	Val Lys Ser Leu Leu Ser 1385	Ser Met Tyr Val 1390
Lys Glu Phe Leu Val Ser 1395	Ser Ser Gin Asp Gly Arg Arg Trp Thr Leu 1400 1405
Phe Leu Gin Asp Gly His Thr Lys Val Phe Gin Gly 1410 1415 1420	Asn Gin Asp Ser
Ser Thr Pro Val Val Asn 1425 1430	Ala Leu Asp Pro Pro Leu 1435	Phe Thr Arg Tyr 1440
Leu Arg Ile His Pro Thr	Ser Trp Ala Gin His Ile	Ala Leu Arg Leu

1445 1450 1455

Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gin Asp Leu Tyr 1460 1465

Claims (12)

1. DNA kodują cy sekwencję aminokwasową POL1212 jaką podano w SEQ ID NO: 38.

2. Wektor ekspresyjny zawierający DNA według zastrz. 1.

3. DNA według zastrz. 1 o sekwencji nukleotydowej SEQ ID NO: 37.

4. Wektor ekspresyjny zawierający DNA według zastrz. 3.

5. Zmodyfikowany ś wiń ski czynnik VIII o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: 38.

6. Kompozycja terapeutyczna zawierająca zmodyfikowany świński czynnik VIII, według zastrz. 5 i fizjologicznie akceptowany nośnik.

7. Sposób wytwarzania zmodyfikowanego biał ka ś wiń skiego czynnika VIII o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: 38, obejmujący ekspresję DNA kodującego sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 38 w ssaczej komórce gospodarza.

8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że DNA kodujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 38 koduje również peptyd sygnałowy, a co za tym idzie zmodyfikowane białko świńskiego czynnika VIII jest eksportowane z ssaczej komórki gospodarza.

9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że peptyd sygnałowy ma sekwencję aminokwasową odpowiadającą aminokwasom 1-19 z SEQ ID NO: 30.

10. Komórka ssaka zawierająca replikujący się wektor ekspresyjny zawierający DNA kodujący sekwencję aminokwasową POL 1212 według SEQ ID NO: 38.

11. Komórka ssaka według zastrz. 10, znamienna tym, że wektor zawierający DNA posiada sekwencję nukleotydową SEQ ID NO: 37.

12. Komórka według zastrz. 11, znamienna tym, że komórką gospodarza jest BHK CRL-1632.