PL206105B1

PL206105B1 - Zmodyfikowany ludzki czynnik VIII oraz sposób modyfikacji ludzkiego czynnika VIII ze zmniejszeniem reaktywności na przeciwciało hamujące i zachowaniem aktywności prokoagulacyjnej

Info

Publication number: PL206105B1
Application number: PL366199A
Authority: PL
Inventors: John S. Lollar
Original assignee: Emory Universityemory University
Priority date: 2000-09-19
Filing date: 2001-09-19
Publication date: 2010-07-30
Also published as: CA2422902A1; US20020182670A1; RU2003107100A; WO2002024723A1; MXPA03002256A; EP1319016A1; EP1319016A4; KR20030033074A; WO2002024723A9; CN1474830A; AU2001292861A1; HUP0301179A2; CN1205221C; PL366199A1; HUP0301179A3; US6770744B2; JP2004525608A; KR100638184B1

Description

Opis wynalazku

Odnośnik do pokrewnych zgłoszeń

To zgłoszenie zastrzega pierwszeństwo zgodnie z § 119(e) 35 U.S.C. do U.S. 60/236,460 z dnia 29 września 2000 roku i 60/234,047 zgłoszonego 19 września 2000 roku, w których oba są tu załączone jako odnośnik w zakresie zgodnym z niniejszym ujawnieniem.

Podziękowania za federalne środki na badania

Wynalazku tego dokonano, co najmniej częściowo, dzięki funduszom z National Institutes of Health, numer kontraktu F01-HL46215. Zgodnie z tym rząd USA może mieć pewne prawa do tego wynalazku.

Dziedzina wynalazku

Ogólnie przedmiotem wynalazku jest zmodyfikowany czynnik VIII ssaków posiadający podstawienia aminokwasowe, które zmniejszają jego immunogenność i/lub antygenowość w porównaniu z białkami, z których zostały otrzymane lub innymi preparatami czynnika VIII takimi, jak ludzki czynnik VIII.

Stan techniki

Krzepnięcie krwi rozpoczyna się, gdy płytki krwi przylegają do przeciętej ściany zranionego naczynia krwionośnego w miejscu uszkodzenia. Następnie w kaskadzie regulowanych enzymatycznie reakcji, rozpuszczalne cząsteczki fibrynogenu są przekształcane przez enzym trombinę w nierozpuszczalne nici fibryny, które utrzymują płytki krwi razem w skrzepie. W każdym etapie kaskady prekursor białkowy jest przekształcany w proteazę, która rozszczepia następny w serii prekursor białkowy. W wię kszoś ci etapów wymagana jest obecność kofaktorów.

Czynnik VIII krąży we krwi jako nieaktywny prekursor, związany ściśle i niekowalencyjnie z czynnikiem von Willebranda. Czynnik VIII jest aktywowany proteolitycznie przez trombinę lub czynnik Xa, który oddysocjowuje go od czynnika von Willebranda i aktywuje jego pro-koagulacyjną funkcję w kaskadzie. W swojej aktywnej formie białkowy czynnik VIIIa jest kofaktorem, który zwiększa o kilka rzędów wielkości wydajność katalityczną czynnika IXa wobec aktywacji czynnika X.

Osoby z niedoborem czynnika VIII lub posiadające przeciwciała przeciwko czynnikowi VIII, które nie są leczone czynnikiem VIII doświadczają niekontrolowanych krwawień wewnętrznych, które mogą spowodować szereg poważnych objawów, od reakcji zapalnych w stawach do przedwczesnej śmierci. Ludzie chorzy na ciężką hemofilię, których w Stanach Zjednoczonych jest około 10 000, mogą być leczeni infuzjami ludzkiego czynnika VIII, który gdy jest stosowany z wystarczającą częstotliwością i w odpowiednim stężeniu, przywraca normalną zdolność krwi do krzepnięcia. Według klasycznej definicji czynnik VIII jest substancją obecną w normalnym osoczu krwi, która koryguje zaburzenia krzepnięcia w osoczu pobranym od chorych na hemofilię A.

Powstawanie przeciwciał („inhibitorów” lub „przeciwciał hamujących”), które hamują aktywność czynnika VIII jest poważną komplikacją w leczeniu pacjentów chorych na hemofilię. Autoprzeciwciała powstają u około 20% pacjentów chorych na hemofilię A w odpowiedzi na terapeutyczne infuzje czynnika VIII. U wcześniej nie leczonych pacjentów chorych na hemofilię A, u których powstają inhibitory, inhibitory te zazwyczaj powstają w ciągu pierwszego roku leczenia. Dodatkowo, autoprzeciwciała inaktywujące czynnik VIII czasami powstają u osób, które miały poprzednio normalny poziom czynnika VIII. Hamujące przeciwciała (inhibitory) wobec czynnika VIII (fVIII) powstają jako alloprzeciwciała u pacjentów chorych na hemofilię A po infuzjach fVIII lub jako autoprzeciwciała u osób nie chorujących na hemofilię (Hoyer, L.W. i D. Scandella, 1994, „Factor VIII inhibitors: structure and function in autoantibody and hemophilia A patients”, Semin. Hematol. 31:1-5). Przeciwciała przeciwko epitopom w domenach A2, ap-A3 i C2 w obrębie cząsteczki A1-A2-B-ap-C1-C2 f VIII są odpowiedzialne za całkowite działanie antykoagulacyjne w większości osoczy hamujących (Prescott, R i wsp., 1997, “The inhibitory antibody response is more complex in hemophilia A patients than in most nonhemophiliacs with fVIII autoantibodies”, Blood 89:3663-3671; Barrow, R.T. i wsp., 2000, “Reuction of the antigenicity of factor VIII toward complex inhibitory plasmas using multiply-substituted hybrid human/porcine factor VIII molecules”, Blood 95:557-561). 18 kDa domena C2 zdefiniowana jako reszty Ser2173-Tyr2332 w ludzkim fVIII o pojedynczym łańcuchu zawiera miejsce wiązania z błoną fosfolipidową, które jest potrzebne do sprawowania normalnej funkcji koagulacyjnej przez fVIII Ludzkie specyficzne wobec C2 przeciwciała przeciwko fVIII hamują tę interakcję (Arai, M. i wsp., 1989, „Molecular basis of factor-VIII inhibition by human antibodies - antibodies that bind to the factor fVIII light chain prevent the interaction of factor fVIII with phospholipid”, J.Clin. Invest. 83: 1978-1984). Zgodnie z tym fosfolipid chroni fVIII przed inaktywacją przez inhibitory fVIII (Arai i wsp., supra; Barrowcliffe, T.W. i wsp., 1983, „Binding to phospholipid protects factor VIII from inactivation by human antibodies”, J.Lab. Clin.Med. 101: 34-43).

PL 206 105 B1

Domena C2 również zawiera część miejsca wiązania czynnika von Willebranda (vWF) (Saenko, E.L. i wsp., 1994, „A role for the C2 domain of factor binding to von Willebrand factor” J.Biol. Chem. 269: 11601-11605; Saenko, E.L., i Scandella, D., 1997, „The acidic region of the factor VIII light chain and the C2 domain together form the high affinity binding site for von Willebrand factor”, J.Biol. Chem. 272: 18007-18014). Niektóre inhibitory mogą wpływać na to odziaływanie (Shima, M. i wsp., 1995, „Common inhibitory effects of human anti-C2 domain inhibitor antibodies on factor VIII binding to von Willebrand factor”, Br. J. Haematol. 91: 714-721; Saenko, E.L. i wsp., 1996, „Slowed release of thrombincleaved factor VIII from von Willebrand factor by a monoclonal and human antibody is a novel mechanism for factor VIII inhibition”, J.Biol. Chem. 271: 27424-27431; Gilles, J.G. i wsp., 1999, „Some factor VIII (FVIII) inhibitors recognize a FVIII epitope(s) that is present only on FVIII-vWf complexes”, Thromb. Haemost. 82: 40-45).

Pacjenci mogą być leczeni przez zwiększanie dawki czynnika VIII pod warunkiem, że miano inhibitora jest wystarczająco niskie. Jednakże często miano inhibitora jest tak wysokie, że nie może być zrównoważone czynnikiem VIII. Alternatywną strategią jest ominięcie zapotrzebowania na czynnik VIII podczas normalnej hemostazy przy użyciu preparatów kompleksu czynnika IX (na przykład KONYNE®, Proplex®) lub rekombinacyjnego ludzkiego czynnika VIIIa. Dodatkowo, ponieważ faktor VIII pochodzący od świni zazwyczaj wykazuje znacznie mniejszą reaktywność z inhibitorami niż ludzki czynnik VIII, stosowany jest częściowo oczyszczony preparat czynnika VIII pochodzącego od świni (HYATE:C®). Wielu pacjentów, u których powstają przeciwciała hamujące przeciwko ludzkiemu czynnikowi VIII, jest z sukcesem leczonych czynnikiem VIII pochodzącym od świni i toleruje takie leczenie przez długi czas. Jednak zastosowanie czynnika VIII pochodzącego od świni nie jest idealnym rozwiązaniem, ponieważ mogą powstać inhibitory wobec czynnika VIII pochodzącego od świni po jednej lub więcej infuzji.

Na rynku dostępnych jest kilka preparatów ludzkiego pochodzącego z osocza czynnika VIII o różnym stopniu czystości do leczenia hemofilii A. Należy do nich częściowo oczyszczony czynnik VIII pochodzący z zebranej krwi od wielu dawców, który jest traktowany ciepłem i detergentami przeciwko wirusom, lecz zawiera znaczną ilość antygenowych białek; oczyszczony z przeciwciał monoklonalnych czynnik VIII, który ma niższy poziom antygenowych zanieczyszczeń i zanieczyszczenia wirusami oraz rekombinacyjny ludzki czynnik VIII, który znajduje się w badaniach klinicznych. Niestety ludzki czynnik VIII jest niestabilny w fizjologicznym stężeniu i pH, występuje we krwi w ekstremalnie niskim stężeniu (0,2 μg/ml osocza) i wykazuje niską specyficzną aktywność krzepnięcia.

Osoby chore na hemofilię wymagają codziennej wymiany czynnika VIII, aby zapobiec krwawieniu i wynikającej z niego deformującej artropatii krwawiączkowej. Jednakże podawanie preparatów jest niewystarczające i występują problemy w ich stosowaniu terapeutycznym w związku z trudnościami w wyizolowaniu i oczyszczaniu, immugenicznością i koniecznością zapobiegania ryzyku infekcji AIDS i zapalenia wątroby. Zastosowanie rekombinacyjnego ludzkiego czynnika VIII lub częściowo oczyszczonego czynnika VIII pochodzącego od świni nie rozwiązuje wszystkich tych problemów.

Problemy związane z powszechnie stosowanym, dostępnym na rynku, pochodzącym z osocza czynnikiem VIII wywołały znaczne zainteresowanie opracowaniem lepszego produktu zawierającego czynnik VIII. Istnieje zapotrzebowanie na cząsteczkę czynnika VIII o silniejszym działaniu, aby na cząsteczkę przypadało więcej jednostek aktywności krzepnięcia; cząsteczkę czynnika VIII, która jest stabilna w wybranym pH i stężeniu fizjologicznym; cząsteczkę czynnika VIII, która w mniejszym stopniu powoduje wytwarzanie przeciwciał hamujących i cząsteczkę czynnika VIII, która może uniknąć detekcji immunologicznej u pacjenta, który już posiada przeciwciała przeciwko ludzkiemu czynnikowi VIII.

W patencie U.S. 6,180,371 Lollara opisano substytucje aminokwasowe w domenie A2 ludzkiego czynnika VIII, które zmieniają antygenowość otrzymanych cząsteczek czynnika VIII. Patent '371 nie ujawnia i nie sugeruje specyficznych substytucji aminokwasowych w domenie C2, które zmniejszają antygenowość lub immunogenność w porównaniu z czynnikiem VIII typu dzikiego lub odpowiednim rekombinacyjnym czynnikiem VIII.

W patencie U.S. 5,859,204 Lollara ujawniono miejscowo specyficzne zastąpienie aminokwasów w regionie 484-509 ludzkiego czynnika VIII. Bardziej specyficznie, patent '204 opisuje zmodyfikowany czynnik VIII z substytucjami aminokwasowymi w pozycjach 485, 487, 488, 489, 492, 495, 501 lub 508 względem białka ludzkiego. W patencie '204 nie ujawnia i nie sugeruje specyficznych substytucji aminokwasowych w domenie C2, które zmniejszają antygenowość lub immunogenność w porównaniu z czynnikiem VIII typu dzikiego lub odpowiednim rekombinacyjnym czynnikiem VIII.

PL 206 105 B1

W patencie U.S. 5,888,974 Lollara i wsp. ujawniono hybrydowy prokoagulacyjny czynnik VIII wytwarzany na drodze izolacji i rekombinacji ludzkich i nie pochodzących od człowieka podjednostek lub domen czynnika VIII.

W patencie U.S. 5,744,446 Lollara i wsp. opisano hybrydowy czynnik VIII posiadają cy substytucje aminokwasowe w domenie A2.

W patencie U.S. 5,663,060 Lollara i wsp. opisano hybrydowy czynnik VIII skł adają cy się z kombinacji nie pochodzących od człowieka i ludzkich podjednostek łańcucha ciężkiego i lekkiego. W patencie U.S. 5,583,209 opisano kwasy nukleinowe kodujące cząsteczki hybrydowego czynnika VIII w patencie '060.

W patencie U.S. 5,364,771 opisano oczyszczony hybrydowy czynnik VIII składający się z ludzkich i pochodzących od świni kombinacji podjednostek ciężkich i lekkich. Ujawniony jest również ludzki czynnik VIII domeną A2 pochodzenia świńskiego zamienioną na ludzką domenę A2.

W patentach U.S. 6,180,371; 5,888,974; 5,859,204; 5,744,446; 5,663,060; 5,583,209 i 5,364,771 (z których wszystkie są tu dołączone jako odnośniki) nie ujawniono substytucji i nie zasugerowano specyficznych substytucji aminokwasowych w domenie C2 czynnika VIII, które zmniejszają antygenowość lub immunogenność w porównaniu z czynnikiem VIII typu dzikiego lub odpowiednim rekombinacyjnym czynnikiem VIII. Mimo lat intensywnych badań w laboratoriach na całym świecie wydaje się, że wynalazek dotyczący domeny C2 czynnika VIII opisany tu w szczegółach nie był opisany lub sugerowany w innych źródłach.

Pratt i wsp. (1999, „Structure of the C2 domain of human factor VIIIa at 1.5 A resolution”, Nature 402: 439-422) opisał strukturę krystaliczną domeny C2 ludzkiego czynnika VIII przy rozdzielczości 1,5 A. Pratt i wsp. opisał, że struktura częściowo wyjaśnia, dlaczego mutacje w regionie C2 czynnika VIII prowadzą do zaburzeń krzepnięcia. W rzeczywistości opisano, że 21 reszt w regionie C2 było miejscami szkodliwych mutacji punktowych u pacjentów chorych na hemofilię A. Na przykład wiadomo, że V2223 jest pozycją gdzie występują mutacje punktowe i jest związana z zaburzeniami krzepnięcia. I tak, osoba biegła w dziedzinie wynalazku nie uzna, że V2223 mogłoby być właściwym kandydatem do substytucji w celu uzyskania zmodyfikowanego czynnika VIII o aktywności terapeutycznej. Rzeczywiście, Shima i wsp. ogłosili, że inhibitory przeciwciała wiążącego C2 oddziałują z czynnikiem VIII w odniesieniu do wiązania fosfolipidu i czynnika Von Willebranda. Zatem Pratt i wsp. twierdzą, że inhibitory C2, np. inhibitory związane z niektórymi zaburzeniami krzepnięcia u osób chorych na hemofilię A, oddziałują z wiązaniem domeny C2 z fosfolipidem i czynnikiem Von Willebranda. Ten wniosek, w połączeniu z ich stwierdzeniem, że M2199, F2200, L2251, L2252, V2223 i R2220 występują między fazami białko-fosfolipid, sugeruje, że mutacja tych reszt może doprowadzić do zmian w wiązaniu fosfolipidu i/lub czynnika Von Willebranda razem ze związanym z tym nasileniem zaburzeń krzepnięcia. Z badań tych nie wynika jasno, które reszty aminokwasowe i odpowiednie substytucje mogą doprowadzić do uzyskania ulepszonych cząsteczek czynnika VIII.

Nieoczekiwanie autor niniejszego wynalazku stwierdził, że mutacje w 3 hydrofobowych stopach zidentyfikowane w dostępnej ostatnio strukturze rentgenowskiej domeny C2 czynnika VIII wykazują słabsze wiązanie z przeciwciałami hamującymi, korzystniejsze właściwości i/lub zmniejszoną imunogeniczność.

Dlatego celem wynalazku jest opracowanie czynnika VIII, który koryguje hemofilię u pacjentów z niedoborem czynnika VIII lub posiadającego inhibitory czynnika VIII.

Dalszym celem wynalazku jest opracowanie sposobów leczenia hemofilii.

Kolejnym celem wynalazku jest opracowanie czynnika VIII, który jest stabilny w wybranym pH i stężeniu fizjologicznym.

Innym celem wynalazku jest opracowanie czynnika VIII, który wykazuje większą aktywność koagulacyjną niż ludzki czynnik VIII.

Istota wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zmodyfikowany ludzki czynnik VIII, w którym metioninę w pozycji 2199 sekwencji nr 2 zastąpiono izoleucyną, zaś fenyloalaninę w pozycji 2200 sekwencji nr 2 zastąpiono leucyną, przy czym zmodyfikowany ludzki czynnik VIII ma obniżoną antygenowość i/lub immunogeniczność w porównaniu z odpowiadającym niezmodyfikowanym białkiem ludzkim. W jednym z korzystnych wariantów realizacji zmodyfikowany ludzki czynnik VIII według wynalazku ma specyficzną aktywność większą od 2000 jednostek na miligram, korzystniej - większą od 3000 jednostek na miligram, jeszcze korzystniej - większą od 5000 jednostek na miligram, a najkorzystniej - większą od 10000 jednostek na miligram.

PL 206 105 B1

Przedmiotem wynalazku jest także zmodyfikowany ludzki czynnik VIII, w którym walinę w pozycji 2223 sekwencji nr 2 zastąpiono alaniną, zaś lizynę w pozycji 2227 sekwencji nr 2 zastąpiono glutaminanem, przy czym zmodyfikowany ludzki czynnik VIII ma obniżoną antygenowość i/lub immunogeniczność w porównaniu z odpowiadającym niezmodyfikowanym białkiem ludzkim. W jednym z korzystnych wariantów realizacji zmodyfikowany ludzki czynnik VIII według wynalazku ma specyficzną aktywność większą od 2000 jednostek na miligram, korzystniej - większą od 3000 jednostek na miligram, jeszcze korzystniej - większą od 5000 jednostek na miligram, a najkorzystniej - większą od 10000 jednostek na miligram.

Przedmiotem wynalazku jest także zmodyfikowany ludzki czynnik VIII, w którym metioninę w pozycji 2199 sekwencji nr 2 zastą piono izoleucyną , fenyloalaninę w pozycji 2200 sekwencji nr 2 zastąpiono leucyną, walinę w pozycji 2223 sekwencji nr 2 zastąpiono alaniną, zastąpienie lizynę w pozycji 2227 sekwencji nr 2 zastą piono glutaminanem, przy czym zmodyfikowany ludzki czynnik VIII ma obniżoną antygenowość i/lub immunogeniczność w porównaniu z odpowiadającym niezmodyfikowanym białkiem ludzkim. W jednym z korzystnych wariantów realizacji zmodyfikowany ludzki czynnik VIII według wynalazku ma specyficzną aktywność większą od 2000 jednostek na miligram, korzystniej - większą od 3000 jednostek na miligram, jeszcze korzystniej - większą od 5000 jednostek na miligram, a najkorzystniej - większą od 10000 jednostek na miligram.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób modyfikacji ludzkiego czynnika VIII ze zmniejszeniem reaktywności na przeciwciało hamujące i zachowaniem aktywności prokoagulacyjnej, charakteryzujący się tym, że w niezmodyfikowanym czynniku ludzkim VIII metioninę w pozycji 2199 sekwencji nr 2 zastępuje się izoleucyną, zaś fenyloalaninę w pozycji 2200 sekwencji nr 2 zastępuje się leucyną.

Ponadto, przedmiotem wynalazku jest sposób modyfikacji ludzkiego czynnika VIII ze zmniejszeniem reaktywności na przeciwciało hamujące i zachowaniem aktywności prokoagulacyjnej, charakteryzujący się tym, że w niezmodyfikowanym czynniku ludzkim VIII walinę w pozycji 2223 sekwencji nr 2 zastępuje się alaniną, zaś lizynę w pozycji 2227 sekwencji nr 2 zastępuje się glutaminanem.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób modyfikacji ludzkiego czynnika VIII ze zmniejszeniem reaktywności na przeciwciało hamujące i zachowaniem aktywności prokoagulacyjnej, charakteryzujący się tym, że w niezmodyfikowanym czynniku ludzkim VIII metioninę w pozycji 2199 sekwencji nr 2 zastępuje się izoleucyną, fenyloalaninę w pozycji 2200 sekwencji nr 2 zastępuje się leucyną, walinę w pozycji 2223 sekwencji nr 2 zastępuje się alaniną, zastąpienie lizynę w pozycji 2227 sekwencji nr 2 zastępuje się glutaminanem.

Przedmiot wynalazku w przykładach wykonania zilustrowano na rysunku, na którym:

Fig. 1. przedstawia przypuszczalne reszty fVIII zaangażowane w wiązanie fosfolipidów; ukazano odnośne sekwencje domen C2 człowieka (Vehar, G.A. i wsp. supra, 1984; Toole, JJ. i wsp., 1984, „Molecular cloning of a cDNA encoding human antihaemophilic factor” Nature 312: 342-347), pochodzące od świni (Healey, J.F. i wsp., 1996, „The cDNA and derived amino acid sequence of porcine factor VIII”, Blood 88: 4209-4214), mysi (Elder, B. i wsp., 1993, „Sequence of the murine factor VIII cDNA”, Genomics 16: 374-379) i pochodzące od psa (Cameron, C. i wsp., 1998, „The canine factor VIII cDNA and 5' flanking sequence”, Thromb. Haemostas. 79:317-322) fVIII. Proposed phospholipidbinding residues in human fVIII (Pratt, K.P. i wsp., 1999, „Structure of the C2 domain of human factor VIII at 1.5 A resolution”, Nature 402: 439-442), homologiczne reszty są podkreślone i wytłuszczone;

Fig. 2. przedstawia zmutowane miejsca w ludzkiej domenie C2 fVIII. Diagram A. Ribbona ukazujący reszty hydrofobowe, co do których zaproponowano, że są zaangażowane w wiązanie z błoną fosfolipidową i Lys2227, jedna z czterech dodatnio naładowanych prawdopodobnych wiążących reszt (Pratt, K.P. i wsp., 1999, „Structure of the C2 domain of human factor VIII at 1.5 A resolution”, Nature 402: 439-442). Met2199, Phe2200, Val2223, Lys2227 i Leu2252 zostały zmutowane w tym badaniu. Leu2251, która jest konserwowana w ludzkim, świńskim, mysim i psim fVIII, nie została zmutowana. Obrócony model wypełniania przestrzennego B. Space'a, widok od góry membrany;

Fig. 3. przedstawia miana Bethesda przeciwciał poliklonalnych przeciwko MII pacjenta; rekombinacyjny fVIII został rozcieńczony w osoczu chorego na hemofilię A i określono miana Bethesda przeciwciał AA, AJ, HR, LK i RvR, jak opisano w „Materiał i metody”; ukazano średnie i odchylenia standardowe obliczone metodą nielinearnej analizy regresji najmniejszych kwadratów; C2 D1 jest podwójnym mutantem Met2199Ile/Phe2200Leu; C2 D2 jest podwójnym mutantem Val2223Ala/Lys2227Glu; C2 Q jest poczwórnym mutantem Met2199Ile/Phe2200Leu/Val2223Ala/Lys2227Glu. HP20 jest pozbawioną domeny B hybrydową cząsteczką ludzkiego/świńskiego fVIII zawierającą ludzkie domeny

PL 206 105 B1

A1, A2, ap-A3 i C1 oraz świńską domenę C2; Poziomy ufności dla różnic pomiędzy mutantami i HBsą określone jako „**” przy poziomie 99,9% i „*” przy poziomie 99%. NS, nie znaczące.

Fig. 4. przedstawia miana Bethesda przeciwciała monoklonalnego B02C11 pacjenta; skróty i adnotacje jak w opisie do fig. 3.

Fig. 5. przedstawia miana Bethesda przeciwciała monoklonalnego myszy NMCVIII-5; skróty i adnotacje jak w opisie do fig. 3.

Szczegółowy opis wynalazku

Jak wskazano powyżej wynalazek dotyczy kompozycji zawierających rekombinacyjny czynnik VIII ssaków. Kompozycja według wynalazku zawiera izolowaną, oczyszczoną rekombinacyjną cząsteczkę czynnika VIII o działaniu koagulacyjnym. Nieoczekiwanie stwierdzono, że mutacje w domenie C2 czynnika VIII, w trzech hydrofobowych miejscach zidentyfikowanych w dostępnej od niedawna strukturze rentgenowskiej, zmniejszają wiązanie przeciwciał hamujących mutantów w porównaniu z biał kami, z których są otrzymywane i/lub z innymi preparatami czynnika VIII. Zatem nowe kompozycje według wynalazku zawierają rekombinacyjny czynnik VIII z substytucjami aminokwasowymi w domenie C2, które zmniejszają antygenowo ść w porównaniu z biał kami, z których są otrzymywane. Co więcej, wynalazek dotyczy również rekombinacyjnego czynnika VIII z substytucjami aminokwasowymi w domenie C2, które zmniejszają antygenowość w porównaniu z innymi dostępnymi preparatami czynnika VIII. Odpowiednie zastosowania wynalazku dotyczą sposobów leczenia pacjentów potrzebujących leczenia czynnikiem VIII, sposobów wytwarzania nowych kompozycji rekombinacyjnego czynnika VIII według wynalazku, sekwencji DNA zawierających sekwencje kodujące białka nowego rekombinacyjnego czynnika VIII i kompozycji farmaceutycznych zawierających białka nowego czynnika VIII.

Rozwiązanie według wynalazku dotyczy ponadto aktywnych cząsteczek hybrydowego rekombinacyjnego czynnika VIII lub jego fragmentów, sekwencji kwasów nukleinowych kodujących te hybrydy, sposobów ich przygotowywania i izolowania i sposobów ich charakteryzowania. Te hybrydy zawierają ludzkie/zwierzęce, zwierzęce/zwierzęce lub inne takie cząsteczki hybrydowego czynnika VIII i dalej zawierają co najmniej jedną specyficzną sekwencję aminokwasów w domenie C2 włącznie z jednym lub większą liczbą spośród wyjątkowych aminokwasów czynnika VIII jednego gatunku zastąpionym odpowiednią sekwencją aminokwasów (lub aminokwasem) czynnika VIII innego gatunku lub zawierają co najmniej jedną sekwencję w domenie C2 włącznie z jednym lub większą liczbą aminokwasów o nieznanym stopniu identycznoś ci z czynnikiem VIII podstawionym specyficzną sekwencją aminokwasów w ludzkim lub zwierzęcym hybrydowym czynniku VIII. Powstający rekombinacyjny hybrydowy czynnik VIII posiada zmniejszoną immunoreaktywność lub nie posiada immunoreaktywności z przeciwciałami hamującymi czynnik VIII w porównaniu z ludzkim lub świńskim czynnikiem VIII.

„Odpowiedni” kwas nukleinowy lub aminokwas lub ich sekwencja, jak podaje się tutaj, jest obecny w miejscu cząsteczki czynnika VIII lub jego fragmentu i posiada taką samą strukturę i/lub funkcję, jak miejsce cząsteczki czynnika VIII innego gatunku mimo, że numer kwasu nukleinowego lub aminokwasu może nie być identyczny. Sekwencja DNA „odpowiadająca” innej sekwencji czynnika VIII zasadniczo takiej sekwencji i hybrydyzuje do sekwencji oznaczonego numeru identyfikacyjnego sekwencji w rygorystycznych warunkach. Sekwencja DNA „odpowiadająca” innej sekwencji czynnika VIII również zawiera sekwencję powodującą ekspresję czynnika VIII lub jego fragmentu i będzie hybrydyzować do oznaczonego numeru identyfikacyjnego sekwencji, lecz z redukcją kodu genetycznego „Wyjątkowa” reszta aminokwasowa lub sekwencja, w używanym tu znaczeniu, odnosi się do sekwencji aminokwasowej lub reszty w cząsteczce czynnika VIII jednego gatunku, która różni się od homologicznej reszty lub sekwencji w cząsteczce czynnika VIII innego gatunku. „Specyficzna aktywność”, w używanym tu znaczeniu, odnosi się do aktywności, która skoryguje defekt koagulacji w osoczu ludzkim z niedoborem czynnika VIII. Specyficzna aktywność jest mierzona w jednostkach aktywności krzepnięcia na miligram całkowitego białka czynnika VIII w teście standardowym, w którym czas krzepnięcia ludzkiego osocza z niedoborem czynnika VIII jest porównywany z czasem krzepnięcia normalnego ludzkiego osocza. Jedna jednostka aktywności czynnika VIII jest to aktywność obecna w jednym mililitrze normalnego ludzkiego osocza. W tym teś cie im krótszy jest czas formowania skrzepu, tym większa jest aktywność badanego czynnika VIII. Czynnik VIII pochodzący od świni wykazuje aktywność koagulacyjną w teście ludzkiego czynnika VIII.

„Ekspresja” odnosi się do szeregu procesów, które występują w sytuacjach, kiedy informacja genetyczna jest używana do wytworzenia produktu. DNA kodujące sekwencję aminokwasów czynnika VIII pochodzącego od świni może podlegać „ekspresji” w komórce ssaka, co prowadzi do wytworzenia zmodyfikowanego białka czynnika VIII. Materiały, struktury genetyczne, komórki gospodarza i warunki

PL 206 105 B1 umożliwiające wystąpienie ekspresji danej sekwencji DNA są dobrze znane w literaturze i mogą podlegać manipulacjom w celu wpłynięcia na czas i zakres ekspresji, jak również na wewnątrz- lub zewnątrzkomórkowe umiejscowienie białka podlegającego ekspresji. Na przykład włączenie DNA kodującego peptyd sygnałowy na końcu 5' DNA kodującego czynnik VIII pochodzący od świni (ten koniec 5' jest zazwyczaj końcem kodującym końcową grupę NH2 białka) powoduje, że białko podlegające ekspresji jest przenoszone z wnętrza komórki gospodarza do pożywki hodowlanej. Kombinacja DNA kodującego białko sygnałowe i DNA kodującego czynnik VIII pochodzący od świni jest korzystne, ponieważ czynnik VIII podlegający ekspresji jest przenoszony do pożywki hodowlanej, co ułatwia proces oczyszczania. Korzystnym białkiem sygnałowym jest peptyd sygnałowy czynnika VIII ssaków.

Nukleotyd cDNA ludzkiego czynnika VIII i przewidywana sekwencja aminokwasów ukazane są, odpowiednio, w sekwencjach o numerach 1 i 2. Czynnik VIII jest syntetyzowany jako białko o pojedynczym łańcuchu o masie około 300 kDa z homologią wewnętrznej sekwencji, które definiuje sekwencję „domeny” NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOH. W cząsteczce czynnika VIII „domena”, w używanym tu znaczeniu, jest ciągłą sekwencją aminokwasów, która jest definiowana przez tożsamość wewnętrznej sekwencji aminokwasów i miejsca proteolitycznego rozszczepienia przez trombinę. Jeżeli nie określono inaczej, domeny czynnika VIII zawierają następujące reszty aminokwasowe, gdy sekwencje są zestawione z ludzką sekwencją aminokwasową (numer identyfikacyjny sekwencji: 2): A1, reszty Ala1Arg372; A2, reszty Ser373-Arg740; B, reszty Ser741-Arg1648; A3, reszty Ser1690-Ile2032; C1, reszty Arg2033-Asn2172; C2, reszty Ser2173-Tyr2332. Sekwencja A3-C1-C2 zawiera reszty Ser1690-Tyr2332. Pozostały segment, reszty Glu1649-Arg1689 jest zazwyczaj określany jako peptyd aktywacyjny czynnika VIII o lekkim łańcuchu. Czynnik VIII jest aktywowany proteolitycznie przez trombinę lub czynnik Xa, który dysocjuje go z czynnika von Willebranda tworząc czynnik VIIIa, który ma funkcję prokoagulacyjną. Biologiczną rolą czynnika VIIIa jest zwiększanie wydajności katalitycznej czynnika IXa przez aktywację czynnika X o kilka rzędów wielkości. Aktywowany trombiną czynnik VIIIa heterotrimerem A1/A2/A3-C1-C2 o masie 160 kDa, który tworzy kompleks z czynnikiem IXa i X na powierzchni płytek krwi lub monocytów. „Częściowa domena”, w używanym tu znaczeniu, jest ciągłą sekwencją aminokwasów tworzących część domeny.

„Podjednostki” ludzkiego lub zwierzęcego czynnika VIII, w używanym tu znaczeniu, są ciężkimi i lekkimi ł a ń cuchami biał ka. Ciężki ł a ń cuch czynnika VIII zawiera trzy domeny: A1, A2 i B. Lekki ł a ń cuch czynnika VIII również zawiera trzy domeny: A3, C1 i C2.

Terminy „epitop”, „miejsce antygenowe” i „determinant antygenowy”, w używanym tu znaczeniu, są stosowane jako synonimy i są zdefiniowane jako część ludzkiego lub zwierzęcego czynnika VIII lub jego fragmentu, który jest specyficznie rozpoznawany przez przeciwciało. Może on się składać z dowolnej liczby reszt aminokwasowych i może zależeć od pierwszo-, drugo- lub trzeciorzędowej struktury białka.

Termin „miejsce immunogenne”, w używanym tu znaczeniu, jest zdefiniowany jako region ludzkiego lub zwierzęcego czynnika VIII lub jego fragmentu, które specyficznie wywołuje wytwarzanie przeciwciał przeciwko czynnikowi VIII lub fragmentowi u człowieka lub zwierzęcia, co jest mierzone rutynowymi testami, jak immunoassay np. ELISA lub test Bethesda opisany tutaj. Może się składać z dowolnej liczby reszt aminokwasowych i moż e zależ e ć od pierwszo-, drugo- lub trzeciorzę dowej struktury białka. W pewnych zastosowaniach hybryd lub ekwiwalent hybrydu czynnika VIII lub jego fragment nie jest immunogenny lub jest mniej immunogenny u zwierzęcia lub człowieka niż ludzki lub pochodzący od świni czynnik VIII.

„Niedobór czynnika VIII”, w używanym tu znaczeniu, oznacza niedobór aktywności koagulacyjnej spowodowany przez wytwarzanie nieprawidłowego czynnika VIII, przez niewystarczające lub brak wytwarzania czynnika VIII lub przez częściowe lub całkowite zahamowanie czynnika VIII przez inhibitory. Hemofilia A jest rodzajem niedoboru czynnika VIII wywołanym defektem genu związanego z X i brakiem lub niedoborem białka czynnika VIII, które koduje.

W uż ywanym tu znaczeniu „testy diagnostyczne” oznacza testy, które w pewien sposób wykorzystują interakcje antygen/przeciwciało w celu wykrycia i/lub określenia ilościowego ilości szczególnego przeciwciała obecnego w badanej próbce w celu pomocy w wybraniu terapii medycznych. Istnieje wiele takich testów znanych osobom biegłym w dziedzinie wynalazku. W używanym tu znaczeniu ludzkie, pochodzące od świni lub zmodyfikowane pochodzące od świni DNA czynnika VIII lub jego fragment i białko podlegające ekspresji, w całości lub częściowo, może być zastąpione odpowiednimi reagentami w znanych testach, podczas gdy zmodyfikowane testy mogą być zastosowane do wykrycia i/lub określenia ilościowego przeciwciał przeciwko czynnikowi VIII. To właśnie użycie tych reagentów,

PL 206 105 B1

DNA czynnika VIII lub jego fragmentu lub białka podlegającego ekspresji umożliwia modyfikację znanych testów wykrywania przeciwciał przeciwko ludzkiemu lub zwierzęcemu czynnikowi VIII. Takie testy obejmują (lecz nie są ograniczone do) ELISA, testy immunodyfuzji i testy immunoblot. Odpowiednie sposoby wykonywania tych testów są znane osobom biegłym w sztuce. W używanym tu znaczeniu czynnik VIII lub jego fragment, który zawiera co najmniej jeden epitop białka może być używany jako reagent diagnostyczny. Przykłady innych testów, w których może być używany ludzki, pochodzący od świni lub zmodyfikowany pochodzący od świni czynnik VIII lub jego fragment obejmują test Bethesda i testy antykoagulacji.

Termin „DNA kodujące białko takie, jak czynnik VIII pochodzący od świni” oznacza kwas polidezoksynukleinowy, którego sekwencja nukleotydów zawiera informację kodującą dla komórki gospodarza na temat sekwencji aminokwasów białka, np. czynnika VIII pochodzący od świni, zgodnie ze znanymi danymi o kodzie genetycznym. „Produkt ekspresji” DNA kodującego ludzki lub zwierzęcy czynnik VIII lub zmodyfikowany czynnik VIII jest produktem otrzymanym na drodze ekspresji referencyjnego DNA w odpowiedniej komórce gospodarza, włącznie z takimi cechami, jak przed- i potranslacyjna modyfikacja białka kodowanego przez referencyjne DNA, włącznie z (lecz bez ograniczenia do) glikozylacją, rozszczepieniem proteolitycznym i tym podobne. Wiadomo z literatury, że takie modyfikacje mogą zachodzić i mogą się nieco różnić w zależności od typu komórki gospodarza i innych czynników i mogą prowadzić do powstania molekularnych izoform produktu z zachowaniem aktywności prokoagulacyjnej. Patrz np. Lind P. i wsp., Eur. J.Biochem. 232: 1927 (1995) załączony tu jako odnośnik.

„Wektor ekspresji” jest elementem DNA, często o okrągłej strukturze, posiadającym zdolność do autonomicznej replikacji w pożądanej komórce gospodarza lub do integracji z genomem komórki gospodarza i posiadającym także pewne znane cechy, które umożliwiają ekspresję kodującego DNA włączonego do sekwencji wektora w odpowiednim miejscu i orientacji. Do takich cech należą (lecz nie są do nich ograniczone) jedna lub więcej sekwencji promotora służące do zapoczątkowywania transkrypcji kodującego DNA lub innych elementów DNA takich, jak wzmacniacze, miejsca poliadenylacji i tym podobne, wszystkie jednakowo znane w literaturze. Termin „wektor ekspresji” używany jest do oznaczenia wektora posiadającego sekwencję kodującą DNA podlegającą ekspresji w obrębie sekwencji i wektora posiadającego wymagane elementy kontrolujące ekspresję tak zaaranżowane w odniesieniu do miejsca przyłączenia, że mogą służyć do ekspresji jakiegokolwiek kodującego DNA włączonego do miejsca, jak dobrze wiadomo z literatury. I tak, na przykład wektor bez promotora może stać się wektorem ekspresji poprzez włączenie promotora w kombinacji z kodującym DNA.

Odkrycie mutacji czynnika VIII, które mogą zmniejszyć wiązanie przeciwciał hamujących.

Ostatnio opisano 1,5 A strukturę rentgenowską ludzkiej domeny C2 MII (Pratt, K.P. i wsp., 1999, „Structure of the C2 domain of human factor VIII at 1.5 A resolution”, Nature 402: 439-422). Badanie tej struktury ujawniło obecność trzech traktowanych rozpuszczalnikiem „miejsc” hydrofobowych składających się z Met2199/Phe2200, Val2223 i Leu2251/Leu2252. Pierścień dodatnio naładowanych reszt, włącznie z Arg2213, Arg2220Lys2227 i Lys2249, otacza te reszty. Ten motyw sugeruje, że wiązanie membranowe składa się z włączenia miejsc hydrofobowych do dwu-warstwy membranowej i jest stabilizowane przez interakcje elektrostatyczne z ujemnie naładowanym fosfolipidem.

Większość inhibitorów fVIII słabo reaguje krzyżowo z fVIII pochodzącym od świni. Ta obserwacja doprowadziła do wykonania mapy głównego determinantu epitopu C2 dla reszt Glu2181-Val2243 przy użyciu szeregu konstruktów, które zawierały pochodzące od świni substytucje w ludzkiej domenie C2 fVIII (Healey, J.F. i wsp., 1998, „Residues Glu 2181-Val2243 contain a major determinat of the inhibitory epitope in the C2 domain of human Factor VIII”, Blood 92: 3701-3709). Według wynalazku, reszty w pochodzącym od świni, myszy lub psa fVIII, które są homologiczne do reszt

Met2199, Phe2200, Val2223, Lys2227 i/lub Leu2252 w ludzkim fVIII były użyte jako podstawa do wytworzenia szeregu cząsteczek rekombinacyjnego fVIII. Znaczące obniżenie antygenowości było obserwowane w związku z mutacjami przy Met2199, Phe2200 i Leu2252 wskazując, że te reszty biorą udział w wiązaniu fVIII do błon fosfolipidowych i często do przeciwciał hamujących.

Na Fig. 1 pokazano uszeregowanie ludzkich, pochodzących od świni, myszy i psa domen C2 fVIII. Przy czterech z pięciu proponowanych hydrofobowych reszt wiążących fosfolipidy u jednego gatunku występuje różnica z ludzkim fVIII: Met2199 > Ile (Świnia), Phe2200 > Leu (pies), Val2223 > Ala (pies) i Leu2252 > Phe (mysz). Istnieje różnica gatunkowa w tylko jednym z czterech proponowanych podstawowych reszt, Lys2227 > Glu (Świnia). Zgodnie z tym, wytworzono pojedyncze mutanty Met2199Ile, Phe2200Leu, Val2223Ala, Leu2252Phe i Lys2227Glu w ludzkim fVIII bez domeny B. Dodatkowo, wytworzono dwa podwójne mutanty, Met2199IlePhe2200Leu (oznaczone C2 D1) i Val2223Ala/Leu2252Phe (C2 D2)

PL 206 105 B1 i poczwórny mutant Met2199Ile/Phe2200Leu/Val2223Ala/Leu2252Phe (C2 Q). Lokacje zmutowanych reszt w strukturze rentgenowskiej fVIII są ukazane na fig. 2. Met2199/Phe2200 i Leu2251/Leu2252 rzutują z dwóch pętli β w kształcie spinki do włosów. Val2223 rzutuje z przylegającej pętli i jest w pobliżu Lys2227.

Mutanty ulegały stabilnej ekspresji w pożywce wolnej od osocza w linii komórkowej uzyskanej od noworodka chomika i następnie były częściowo oczyszczane. Specyficzna aktywność koagulacyjna hybrydów mierzona testem ELISA była równa lub większa niż aktywność HB- jak opisano w „Materiałach i metodach” wskazując, że były one odpowiednie do badań antygenowości. Interakcja mutantów z inhibitorami fVIII specyficznymi dla C2 była mierzona przy użyciu testu Bethesda, jak opisano w „Materiałach i metodach”. Wyniki były porównane do cząsteczek ludzkiego fVIII (HB-) bez domeny B i hybrydowego ludzkiego/świńskiego fVIII, HP20, który pochodzi od człowieka z wyjątkiem substytucji całej świńskiej domeny C2 (Healey, J.F. i wsp., 1998, „Residues Glu2181-Val2243 contain a major determinant of the inhibitory epitope in the C2 domain of human factor VIII”, Blood 92: 3701-3709).

Większość inhibitorów fVIII jest poliklonalnymi populacjami IgG skierowanymi przeciwko epitopom zarówno w obrębie, jak i poza domeną C2 (Prescott, R. i wsp., supra, 1997; Fulcher. CA. i wsp. 1985, „Localization of human factor FVIII inhibitor epitopes to two polypeptide fragments”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7728-7732). Jednakże niektóre inhibitory są specyficzne dla C2 i są użyteczne w ocenie efektów substytucji sekwencji nie pochodzą cej od czł owieka w domenie C2 (Healey, J.F. i wsp. 1998, „Residues Glu2181-Val2243 contain a major determinant of the inhibitory epitope in the C2 domain of human factor VIII”, Blood 92: 3701-3709). W badaniach tych były używane specyficzne dla C2 poliklonalne inhibitory od pięciu pacjentów, AA, AJ, HR, LK, RvR (rys. 3). Zmniejszenie antygenowości związane z mutacjami w Met2199, Phe2200 i/lub Leu2252 było zawsze obserwowane, mimo że poszczególne inhibitory różniły się resztami, które rozpoznawały. Nieoczekiwanie często występowało znaczne zwiększenie miana Bethesda, szczególnie w przypadku mutanta Val2223. Podwójny mutant Met2199Ile/Phe2200Leu wykazywał niską antygenowość wobec wszystkich pięciu przeciwciał, zgodnie z faktem, że antygenowość Met2199Ile i/lub Phe2200Leu zawsze była zmniejszona. Paradoksalnie, podwójny mutant Val2223Ala/Lys2227Glu wykazywał zmniejszenie antygenowości wobec wszystkich pięciu typów przeciwciał mimo, że w trzech przypadkach (AA, AJ i HR) odpowiednie indywidualne mutanty wykazywały niezmienioną lub zwiększoną antygenowość. Antygenowość poczwórnego mutanta Met2199Ile/Phe2200-Leu/ Val2223Ala/Lys2227Glu była równa lub niższa niż pojedynczych lub podwójnych mutantów. Antygenowość HP20 była najniższa wśród wszystkich mutantów. Jest to zgodne z obecnością antygenowych reszt w dodatku do Met2199, Phe2200 i Leu2252, które nie były mutowane w tym badaniu.

Miana Bethesda przeciwciał B02C11 (Jacquemin, M.G. i wsp., 1998, „Mechanism and kinetics of factor VIII inactivation: study woth an IgG4 monoclonal antibody derived from a hemophilia A patient with inihibitor”, Blood 92: 496-506) i NMC VIII-5 (Shima, M.D. i wsp. 1993, „A factor VIII neutralizing monoclonal antibody and human inhibitor alloantibody recognizing epitopes in the C2 domain inhibit factor VIII binding to von Willebrand factor and to phosphatidylserine”, Thromb,. Haemost. 69: 240-246) przeciwko HB- I zmutowanym cząsteczkom są ukazane odpowiednio na fig. 4 i 5. B02C11 jest specyficznym dla C2 ludzkim przeciwciałem monoklonalnym IgG4_K otrzymanym z transformowanych komórek B pacjenta z inhibitorem hemofilii A. Jest to jedyne ludzkie specyficzne dla C2 przeciwciało, które zostało do tej pory sklonowane. Zarówno B02C11, jak i NMC VIII-5 rozpoznają domenę C2 fVIII i hamują wiązanie fVIII do vWf i fosfolipidu.

NMC VIII-5 może konkurować w wiązaniu ludzkich poliklonalnych inhibitorów do fVIII. Wyniki uzyskane w przypadku B02C11 i NMC VIII-5 były podobne do wyników uzyskanych przy użyciu poliklonalnego przeciwciała HR (rys. 3). We wszystkich trzech przeciwciałach Phe2200 jest antygenowe, podczas gdy Val2223 i Lys2227 wydają się mieć zmniejszoną antygenowość.

Mutacje w Met2199, Phe2200 i/lub Leu2252 były związane z zmniejszeniem antygenowości w przypadku większości z siedmiu badanych przeciwciał (tabela 1), co było często wyrażane (fig. 3-5). Jest to zgodne z hipotezą, że pętle Met2199/Phe2200 i Leu2251/Leu2252 uczestniczą w wiązaniu do membran. Mimo, że wszystkie siedem inhibitorów rozpoznawało pętlę M2199/Phe2200, efekty mutacji w Met2199 i Phe2200 często różniły się. Na przykład Met2199Ile wykazywało zmniejszoną antygenowość i Phe2200 wykazywało zwiększoną antygenowość wobec przeciwciała AJ, podczas gdy odwrotna sytuacja miała miejsce w przypadku B02C11. I tak, specyficzność aminokwasowa AJ i B02C11 różni się, chociaż jedno i drugie rozpoznaje pętlę Met2199/Phe2200.

PL 206 105 B1

Poprzednio używano szeregu rekombinowanych hybrydowych ludzkich/pochodzących od świni cząsteczek fVIII do mapowania głównego determinantu epitopu (epitopów) C2 na segmencie związanym przez reszty Glu2181-Val2243 (Healey, J.F. i wsp., 1998, „Residues Glu2181-Val2243 contain a major determinant of the inhibitory epitope in the C2 domain of human factor VIII, Blood 92: 3701-3709). Pętla Met2199/Phe2200 jest zawarta w tym regionie. Pętla Leu2251/Leu2252 nie była ani uwzględniona, ani wykluczona przez tę analizę, ponieważ fVIII pochodzący od świni zawiera również leucynę przy resztach 2251 i 2252. Substytucja całej domeny C2 pochodzącej od świni do ludzkiego fVIII, która prowadzi do powstania cząsteczki oznaczonej HP20 jest związana z mniejszą antygenowością niż bardziej ograniczone substytucje wykonane w niniejszym badaniu (rys. 3-5). To wskazuje na to, że istnieją reszty poza pętlami Met2199/Phe2200 i Leu2251/Leu2252, które przyczyniają się do wiązania przez inhibitory C2.

Ostatnio opisano strukturę rentgenowską dwóch konformacji domeny C2 czynnika V przy braku obecności fosfolipidu (Macedo-Ribeiro, S. i wsp., 1999, „Crystal structures of the membrane-binding C2 domain of human coagulation factor V”, Nature 402: 434-439). Autorzy zaproponowali model wiązania z błoną fosfolipidową z zaangażowaniem pętli zawierającej tryptofan w pozycjach 26 i 27 (numerowanie domeny C2 ludzkiego czynnika V), które są homologiczne do Met2199 i Phe2200 w fVIII. Istnieje znaczna ilość danych potwierdzających zaangażowanie tej pętli w wiązanie z błoną fosfolipidową. Hamujące przeciwciało monokonalne HV-1, które blokuje wiązanie czynnika V z PS łączy się z tą pętlą (Kim, S.W. i wsp., 2000, „Identification of functionally important amino acid residues within the C2-domain of human factor V using alanine-scanning mutagenesis” Biochemistry 39: 1951-1958; Ortel, T.L. i wsp., 1994 „Localization of functionally important epitopes within the second C-type domain of coagulation factor V using recombinant chimeras”, J.Biol.Chem. 269: 15898-15905; Ortel, T.L. i wsp., 1998, “Inhibitory anti-factor V antibodies bond to the factor V C2 domain and are associated with hemorrhagic manifestations”, Blood 91: 4188-4196). Zastąpienie reszt ekwiwalentnych do Trp26 i Trp27 alaniną w czynniku Va jest związane ze zmniejszonym wiązaniem z PS i utratą aktywności koagulacyjnej (Kim, S.W. i wsp., supra, 2000, „Identification of functionally important amino acid residues within the C2-domain of human factor V using alanine-scanning mutagenesis”, Biochemistry 39:1951-1958).

Dodatkowo zaproponowano również, że pętla zawierająca Leu79, które jest homologiczne do Leu2251 w fVIII i pętla zwierająca reszty Asn41 - Asn51 biorą udział w wiązaniu z błoną fosfolipidową na podstawie bliskości do pętli Trp26/Trp27 (Macedo-Ribeiro, S. i wsp., 1999, „Crystal structures of the membrane-binding C2 domain of human coagulation factor V”, Nature 402: 434-439). Segment fVIII, który jest homologiczny do pętli Asn41-Asn51, His2076-Asn2082, nie został zaproponowany jako miejsce wiązania z błoną fosfolipidową (Pratt, K.P., 1999, „Structure of the C2 domain of human factor

VIII at 1.5 A resolution”, Nature 402: 439-442). Odwrotnie, nie zaproponowano, że pętla w czynniku V, która jest homologiczna do pętli Val2223 w fVIII bierze udział w wiązaniu z błoną fosfolipidową. W niniejszym badaniu mutacje Val2223 i Lys2227Glu zazwyczaj były związane ze zwiększeniem antygenowości (tabela 1). Zatem te wyniki nie popierają hipotezy, że te reszty uczestniczą w wiązaniu z błoną fosfolipdową. Jednakże jest możliwe, że nie wiążą się one z fosfolipidem, lecz są często celem działania przeciwciał hamujących.

Dwie struktury C2 czynnika V mają różne konformacje oznaczone jako „otwarte” i „zamknięte”, które są związane z głównymi ruchami TRp26 i Trp27 w miejscu wiązania z błoną fosfolipidową. Zaproponowano, ze te stany przełączają stan błony fosfolipidowej do pozycji „on” i „off” (Macedo-Ribeiro, S. supra, 1999). Zmniejszenie antygenowości związanej z Val2223i Lys2227 może wystąpić, ponieważ te reszty stabilizują podobny „zamknięty” stan konformacyjny w fVIII, który jest związany z niskim powinowactwem wiązania z błoną i przeciwciałami. Relaksacja tego stanu przez mutacje Val2223Ala i Lys2227Glu może wówczas prowadzić do wysokiego powinowactwa wiązania przeciwciał. Alternatywnie, Val2223 i Lys2227 mogą po prostu oddziaływać z interakcją antygen-przeciwciało typu kluczdo-zamka, które angażuje kontakty o wysokim powinowactwie z innymi resztami fVIII (np. Met2199, Phe2200, etc).

Specyficzne dla C2 ludzkie monoklonalne przeciwciało B02C11 jest ważne dla porównania inhibitorów poliklonalnych z uwagi na heterogeniczność, która może być mylna w analizie tych ostatnich. Właściwości funkcjonalne B02C11 są podobne do mysiego przeciwciała monoklonalnego NMC VIII-5. Oba przeciwciała hamują wiązanie fVIII do PS i do vWf i sprzyjają dysocjacji kompleksu fVIII-vWf (Jacquemin, M.G. i wsp., 1998, „Mechanism and kinetics of factor VIII inactivation: study with an IgG4 monoklonal antibody derived from a hemophilia A patient with inhibitor”, Blood 92: 496-506; Shima, M. i wsp. 1993, „A factor VIII neutralizing monoklonal antibody and a human inhibitor alloantibody recognizing epitopes

PL 206 105 B1 in the C2 domain inhibit factor VIII binding to von Willebrand factor and to phosphatidylserine”, Thromb. Haemost., 69: 240-246). Te wyniki wskazują, że Phe2200, lecz nie Met2199 jest ważną częścią epitopu rozpoznawaną przez oba przeciwciała (rys. 4 i 5). Jednakże NMC VIII-5 rozpoznaje Leu2252, a B02C11 nie rozpoznaje. Val2223 i Lys2227 zmniejszają antygenowość w odniesieniu do obu przeciwciał. I tak, B02C11 i NMC VIII-5 wydają się rozpoznawać zachodzące na siebie, lecz nie identyczne epitopy.

Przeciwciało RvR zostało uzyskane od pacjenta chorego na hemofilię A, który był częściowo ofiarą „epidemii” inhibitorów wynikającej z ekspozycji na pasteryzowany cieplnie produkt CPS-A (Sawamoto, Y. i wsp., 1998, „C2 domain restricted epitope specificity of inhibitor antibodies elicited by a heat pasteurized product, factor VIII CPS-P, in previously treated hemophilia A patients without inhibitors”, Thromb. Haemostas. 70: 62-68). W latach 1990 i 1991 u kilku uprzednio leczonych pacjentów bez inhibitorów szybko wystąpiły przeciwciała specyficzne dla C2 po ekspozycji na ten produkt w Holandii i Belgii. Przeciwciała RvR blokują wiązanie fVIII zarówno z PS, jak i z vWf (Sawamoto, Y i wsp., supra, 1998). Epitop RvR łączy się z N - końcowym regionem Glu2181-Val2243 domeny C2 fVIII rozpoznawanej przez większość inhibitorów C2 (Healey, J.F. i wsp., 1998, „Residues Glu2181-Val2243 contain a major determinant of the inhibitory epitope in the C2 domain of human factor VII”, Blood 92: 3701-3709). Mapowanie przy wysokiej rozdzielczości w niniejszym badaniu wskazuje na to, że RvR jest typowym inhibitorem C2, który rozpoznaje pierwotnie pętle Met2199/Phe2200 i Leu2251/Leu2252. I tak, immunogenność związana z CPS-A wydaje się być raczej spowodowana zwiększonym rozpoznawaniem immunologicznym normalnego immunodominującego epitopu niż rozwojem neoepitopu.

Ogólny opis metod

W patencie U.S. 5,364,771 opisano odkrycie hybrydowych cząsteczek ludzkiego/pochodzącego od świni czynnika VIII o aktywności koagulacyjnej, w której odpowiednie elementy cząsteczki czynnika VIII innego gatunku zastąpiono elementami cząsteczki czynnika VIII człowieka lub świni. W patencie US 5,663,060 opisuje prokoagulacyjne hybrydowe ludzkie/zwierzęce i ekwiwalentne hybrydowe cząsteczki czynnika VIII, w których odpowiednie elementy cząsteczki czynnika VIII jednego gatunku zastąpiono odpowiednimi elementami cząsteczki czynnika VIII innego gatunku.

Ponieważ aktualna wiedza wskazuje, że domena B nie ma hamującego epitopu i nie wywiera wiadomego wpływu na funkcję czynnika VIII, w pewnych wypadkach domena B jest całkowicie lub częściowo kasowana w aktywnym hybrydzie lub cząsteczkach czynnika VIII ekwiwalentnych dla hybrydu lub ich fragmentach („B(-) czynnik VIII”) przygotowanych w jakikolwiek sposób tu opisany.

Gen ludzkiego czynnika VIII został wyizolowany i poddany ekspresji w komórkach ssaków, jak opisał Toole, JJ. i wsp. (1984) Nature 312: 342-347 (Genetics Institute); Gitschier, J. i wsp. (1984) Nature 312: 326-330 (Genentech); Wood, W.I. i wsp. (1984) Nature 312:337-342 (Genentech); WO 87/04187; WO 88/08035; WWO 88/03558; U.S. Patent No. 4,757,006, a sekwencja aminokwasów została ustalona na podstawie cDNA. W patencie U.S. 4,965,199 Capona i wsp. ujawniono sposób wytwarzania czynnika VIII w komórkach ssaków na zasadzie rekombinacji DNA i oczyszczania ludzkiego czynnika VIII. Opisano ekspresję ludzkiego czynnika VIII w komórkach CHO (jajnik chomika chińskiego) i BHKC (komórki nerki noworodka chomika). Ludzki czynnik VIII został zmodyfikowany w celu skasowania części lub całej domeny B (patent U.S. 4,868,112) i próbowano zastąpić ludzką domenę B czynnika VIII domeną B ludzkiego czynnika V (patent U.S. 5,004,803). Sekwencja cDNA kodująca ludzki czynnik VIII i przewidywana sekwencja aminokwasów ukazane są odpowiednio w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych 1 i 2. W sekwencji o numerze identyfikacyjnym 1 region kodujący zaczyna się w pozycji nukleotydu 208, triplet GCC jest kodonem dla aminokwasu numer 1 (Ala) dojrzałego białka, jak ukazano w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2.

Czynnik VIII pochodzący od świni został wyizolowany z osocza (Fass, D.N., i wsp., 1982, Blood 59: 594). Częściowa sekwencja aminokwasów czynnika VIII pochodzącego od świni odpowiadająca fragmentom N-końcowej sekwencji o lekkim łańcuchu homologicznej do ceruloplazminy i czynnika koagulacji V została opisana przez Church i wsp. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6934. Toole, JJ. i wsp. (1984) Nature 312: 342-347 opisali częściowe sekwencjonowanie N-końcowego zakończenia czterech fragmentów aminokwasów czynnika VIII pochodzącego od świni, lecz nie scharakteryzowali fragmentów pod względem ich pozycji w cząsteczce Czynnika VIII. Sekwencja aminokwasów domeny B i części domeny A2 czynnika VIII pochodzącego od świni została opisana przez Toole, JJ. i wsp. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5939-5942. Sekwencja cDNA kodująca kompletną domenę A2 czynnika VIII pochodzącego od świni i przewidywana sekwencja aminokwasów i hybrydowy ludzki/pochodzący od świni czynnik VIII posiadający substytucje we wszystkich domenach, wszystkich podjednostkach i specyficzne sekwencje aminokwasów zostały ujawnione w patencie U.S. 5,364,771

PL 206 105 B1 pod tytułem „Hybrid Human/Porcine factor VIII” opublikowanym 15 listopada 1994 roku i WO 93/20093 opublikowanym 14 października 1993 roku. Sekwencja cDNA kodująca domenę A2 czynnika VIII pochodzącego od świni odpowiadająca resztom 373-740 dojrzałego ludzkiego czynnika VIII, jak ukazano w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 1 i przewidywana sekwencja aminokwasów są ukazane odpowiednio w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych 3 i 4. Niedawno, nukleotyd i odpowiednie sekwencje aminokwasów części domeny A2 pozbawionej pierwszego aminokwasu 198 i domeny A2 czynnika VIII pochodzącego od świni zostały opisane w WO94/11503 opublikowanym 26 maja 1994. Cała sekwencja nukleotydów kodująca czynnik VIII pochodzący od świni, włącznie z kompletną domeną A1, peptydem aktywacyjnym, domenami A3, C1 i C2, jak również kodowana sekwencja aminokwasów, została ostatecznie ustalona przez Lollara, jak ujawniono w patencie U.S. 5,859,204 opublikowanym 12 stycznia 1999 roku i w WO 97/49725 opublikowanym 31 grudnia 1997 roku, z których oba są tu załączone jako odnośniki.

Zarówno pochodzący od świni, jak i ludzki czynnik VIII zostały wyizolowane z osocza jako białko o dwóch podjednostkach. Podjednostki, znane jako łańcuch ciężki i łańcuch lekki, są utrzymywane razem przez niekowalencyjne wiązanie, które wymaga wapnia lub innych dwuwartościowych jonów metali. Łańcuch ciężki czynnika VIII zawiera trzy domeny, A1, A2 i B, które są połączone kowalencyjnie. Lekki łańcuch czynnika VIII również zawiera trzy domeny oznaczone jako A3, C1 i C2. Funkcja biologiczna domeny B jest nieznana i może ona być usunięta lub częściowo usunięta z cząsteczki proteolitycznie lub sposobami technologii rekombinacji DNA bez znaczącej zmiany w jakimkolwiek mierzalnym parametrze czynnika VIII. Ludzki rekombinacyjny czynnik VIII posiada podobną strukturę i funkcję, jak czynnika VIII otrzymywany z osocza, mimo że nie jest glikozylowany, o ile nie podlega ekspresji w komórkach ssaków.

Zarówno ludzki, jak i pochodzący od świni aktywowany czynnik VIII („czynnik VIIIa”) posiadają trzy podjednostki z powodu rozszczepienia łańcucha ciężkiego pomiędzy domenami A1 i A2. Ta struktura jest oznaczona A1/A2/A3-C1-C2. Ludzki czynnik VIIIa nie jest stabilny w warunkach, które stabilizują czynnik VIIIa pochodzący od świni, prawdopodobnie z powodu słabszej asocjacji podjednostki A2 ludzkiego czynnika VIIIa. Dysocjacja podjednostki A2 ludzkiego i pochodzącego od świni czynnika VIIIa jest związana z utratą aktywności cząsteczki czynnika VIIIa. Yakhyaev, A. i wsp. (1997) Blood 90:Suppl. 1, Abstarct # 126, opisali wiązanie domeny A2 przez białko związane z receptorem lipoproteiny o niskiej gęstości sugerując, że wychwyt komórkowy A2, w którym pośredniczy takie wiązanie obniża aktywność czynnika VIII.

Ekspresja „czynnika VIII bez domeny B” jest nasilana przez włączenie części domeny B. Opisano, że włączenie tych części domeny B oznaczonych „SQ” (Lind, P. i wsp., 1995, supra) powoduje korzystną ekspresję. Konstrukty „SQ” nie mają ludzkiej domeny B z wyjątkiem 5 aminokwasów w końcu N domeny B i 9 aminokwasów w końcu C domeny B.

Oczyszczony zmodyfikowany czynnik VIII lub jego fragment może być testowany na immunoreaktywność i aktywność koagulacyjną standardowymi testami włącznie np. z testem wolnego od osocza czynnika VIII, jednoetapowym testem koagulacji i testem związanego z enzymem immunosorbentu przy użyciu oczyszczonego rekombinacyjnego ludzkiego czynnika VIII jako standardu.

Inne wektory, włącznie z zarówno plazmidowymi, jak i eukariotycznymi wektorami wirusowymi, mogą być używane do ekspresji rekombinacyjnego konstruktu genowego w komórkach eukariotycznych zależnie od preferencji i oceny osoby biegłej w sztuce (patrz np. Sambrook i wsp., Chapter 16). Inne systemy wektorów i ekspresji, włącznie z systemami komórkowymi pochodzącymi od bakterii, drożdży i owadów, mogą być używane, lecz nie są preferowane z powodu różnic w glikozylacji lub jej braku.

Białko rekombinacyjne czynnika VIII może podlegać ekspresji w różnorodnych komórkach zwykle używanych do hodowli i ekspresji rekombinacyjnego białka ssaków. W szczególności stwierdzono, że wiele linii komórkowych gryzoni jest szczególnie użytecznymi gospodarzami do ekspresji dużych białek. Do korzystnych linii komórkowych, które można uzyskać z American Type Culture Collection, Rockville, MD, należą komórki nerek noworodka chomika i komórki jajnika chomika chińskiego (CHO), które są hodowane przy użyciu rutynowych procedur i pożywek.

Podstawą większej aktywności koagulacyjnej czynnika VIII pochodzącego od świni wydaje się być szybsza spontaniczna dysocjacja ludzkiej podjednostki A2 z ludzkiego czynnika VIIIa niż podjednostki A2 czynnika VIIIa pochodzącego od świni. Dysocjacja podjednostki A2 prowadzi do utraty aktywności, (Lollar, P. i wsp. (1990) J. Biol. Chem. 265: 1688-1692; Lollar, P. i wsp. (1992) J. Biol. Chem. 267: 13246-13250).

PL 206 105 B1

Cząsteczki czynnika VIII o zmniejszonej immunoreaktywności

Epitopy, które są wchodzą w reakcje immunologiczne z przeciwciałami, które hamują aktywność koagulacyjną czynnika VIII („inhibitory” lub „przeciwciała hamujące”) zostały scharakteryzowane na podstawie znanych relacji struktura-funkcja w czynniku VIII. Prawdopodobnie inhibitory mogą działać przez zakłócanie którejkolwiek z makromolekularnych interakcji związanych ze strukturą domeny czynnika VIII lub jego asocjacji z czynnikiem von Willebranda, trombiną, czynnikiem XA, czynnikiem IXa lub czynnikiem X. Jednakże większość hamujących przeciwciał przeciwko ludzkiemu czynnikowi VIII działa przez wiązanie do epitopów zlokalizowanych w domenie A2 40 kDa lub domenie C2 20 kDa czynnika VIII zakłócając specyficzne funkcje związane z tymi domenami, jak opisał Fulcher i wsp. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7728-7732; i Scandella i wsp. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6152-6156. W dodatku do epitopów A2 i C2, może istnieć trzeci epitop w domenie A3 lub C1 lekkiego łańcucha czynnika VIII, według Scandella i wsp. (1993) Blood 82: 1767-1775. Znaczenie tego próbnego trzeciego epitopu jest nieznane, lecz wydaje się, że ma on znaczenie dla niewielkiej frakcji reaktywności epitopu w czynniku VIII. Przeciwciała anty-A2 blokują aktywację czynnika X, jak wykazał Lollar i wsp. (1994) J. Clin. Invest. 93: 2497-2504. Poprzednie badania mapowania przez mutagenezę delecyjną opisane przez Ware i wsp. (1992) Blood Coagul. Fibrynolysis 3: 703-716, zlokalizowały epitop A2 w obrębie regionu 20 kDa NH2-końcowego zakończenia domeny A2 40 kDA. Kompetycyjne testy immunoradiometryczne wskazywały, że inhibitory A2 rozpoznają albo zwykły epitop, albo ściśle grupowane epitopy, jak opisał Scandella i wsp. (1992) Throm. Haemostas. 67: 665-671 i jak wykazano w U.S. Patent 5,859,204.

Zmodyfikowane cząsteczki czynnika VIII mogą być testowane na ludziach pod względem ich zmniejszonej antygenowości i/lub immunogenności w badaniach klinicznych. W jednym typie badań mających na celu ustalenie, czy czynnik VIII jest immunoreaktywny z przeciwciałami hamującymi, podawany jest czynnik VIII, korzystnie droga infuzji dożylnej, około 25 pacjentom z niedoborem czynnika VIII, którzy mają przeciwciała, które hamują aktywność terapeutyczną terapeutycznego ludzkiego czynnika VIII. Dawka zwierzęcego lub zmodyfikowanego zwierzęcego czynnika VIII mieści się w granicach pomiędzy 5 i 50 jednostek/kg masy ciała, korzystnie 10-50 jednostek/kg, najkorzystniej 40 jednostek/kg masy ciała. Około 1 godziny po każdym podaniu, mierzony jest odzysk czynnika VIII z próbek krwi w jednoetapowym teście koagulacji. Próbki są pobierane ponownie około 5 godzin po infuzji, a odzysk jest mierzony. Całkowity odzysk i tempo znikania czynnika VIII z próbek może służyć do przewidzenia miana przeciwciał i aktywności hamującej. Jeżeli miano przeciwciał jest wysokie, odzysk czynnika VIII zazwyczaj nie może być zmierzony. Wyniki dotyczące odzysku są porównywane do wyników dotyczących odzysku u pacjentów leczonych ludzkim czynnikiem VIII pochodzącym z osocza, rekombinacyjnym ludzkim czynnikiem VIII, czynnikiem VIII pochodzącym od świni pobranym z osocza i innymi powszechnie używanymi terapeutycznymi formami czynnika VIII lub substytutami czynnika VIII.

Po identyfikacji klinicznie znaczących epitopów, ekspresji mogą podlegać cząsteczki rekombinacyjnego czynnika VIII, które mają mniejsza lub niż równą reaktywność krzyżową w porównaniu do otrzymanym z osocza czynnikiem VIII pochodzącym od świni, gdy są badane in vitro wobec szeregu osocz hamujących. Dodatkowa mutageneza w regionach epitopowych może być wykonana w celu zmniejszenia reaktywności krzyżowej. Zmniejszona reaktywność krzyżowa, pomimo że jest pożądana, nie jest konieczna do wytworzenia produktu, który może mieć przewagę nad istniejącym koncentratem pochodzącego od świni czynnika VIII otrzymanego z osocza, który może wywoływać działania uboczne z powodu obecności zanieczyszczających białek pochodzących od świni lub zanieczyszczających czynników zakaźnych takich, jak wirusy lub priony. Rekombinowana cząsteczka pochodzącego od świni lub zmodyfikowanego pochodzącego od świni czynnika VIII nie będzie zawierać obcych białek pochodzących od świni.

Testy diagnostyczne cDNA czynnika VIII i/lub białko, które podlega ekspresji, w całości lub w części, może być używane w testach jako reagent diagnostyczny do wykrywania przeciwciał hamujących przeciwko ludzkiemu lub zwierzęcemu czynnikowi VIII lub zmodyfikowanemu zwierzęcemu VIII w substratach, włącznie np. z próbkami osocza i płynów organicznych od pacjentów z niedoborem czynnika VIII. Do tych testów przeciwciał należą takie testy, jak testy ELISA, testy Immunoblot, testy radioimmunologiczne, testy immunodyfuzji i testy biologicznej aktywności czynnika VIII (np. przez test koagulacji). Techniki przygotowywania tych reagentów i sposoby ich używania są znane osobom biegłym w sztuce. Na przykład, test immunologiczny do wykrywania przeciwciał hamujących w próbce osocza pacjenta może obejmować reakcję próbki testowej w wystarczającą ilością czynnika VIII w celu

PL 206 105 B1 stwierdzenia, że wykrywalny kompleks przeciwciał hamujących w próbce testowanego czynnika VIII jest rzeczywiście antygenowy.

Próbki kwasu nukleinowego i aminokwasów mogą być przygotowane na podstawie sekwencji cDNA zmodyfikowanego czynnika VIII lub cząsteczki białka lub jego fragmentów. W pewnych wypadkach mogą one być oznakowane przy użyciu barwników lub znaczników enzymatycznych, fluorescencyjnych, chemiluminescencyjnych lub radioaktywnych, które są dostępne na rynku. Próbki aminokwasów mogą być użyte na przykład do badania osocza lub innych płynów organicznych, w których oczekuje się obecności ludzkich, zwierzęcych lub hybrydowych ludzkich/zwierzęcych inhibitorów czynnika VIII. Poziomy inhibitorów mogą być mierzone u pacjentów i porównywane z poziomami u zdrowych osób kontrolnych i mogą być używane, na przykład, do stwierdzenia, czy pacjent z niedoborem czynnika VIII może być leczony zwierzęcym, czy zmodyfikowanym zwierzęcym czynnikiem VIII. Próbki cDNA mogą być używane, na przykład, do celów naukowych w badaniu przesiewowym bibliotek DNA.

Przygotowanie rekombinacyjnego czynnika VIII

Rekombinacyjny czynnik VIII może być wytworzony przez użycie systemów ekspresji białka eukariotycznego. Ogólnie, eukariotyczna linia komórkowa, w której występuje niedobór wymaganego genu, jest transformowana wektorem zawierającym gen, którego niedobór występuje i rekombinacyjne DNA, którego ekspresja jest pożądana. Transformacja może być osiągnięta przez zastosowanie takich technik, jak elektroporacja lub dostarczanie wirusowe. Wybrana linia komórkowa wytwarzająca białko jest tak wyselekcjonowana, aby była kompatybilna z interesującym białkiem, zdolna do ciągłej ekspresji interesującego białka, zdolna do wzrostu na pożywce, która ułatwia oczyszczanie interesującego białka, wraz z innymi czynnikami znanymi osobie biegłej w sztuce. Przykłady takich technik są ujawnione w europejskim zgłoszeniu patentowym EP 0 302 968 A2 i patencie US 5,149,637, z których obydwa są załączone tu w całości jako odnośniki.

Testowanie cząsteczek rekombinacyjnego czynnika VIII

Cząsteczki rekombinacyjnego czynnika VIII mogą być testowane u ludzi pod względem ich zmniejszonej antygenowości i/lub immunogenności w co najmniej dwóch typach badań klinicznych. W jednym typie badania ukierunkowanym na określenie, czy rekombinacyjny hybrydowy czynnik VIII jest immunoreaktywny z przeciwciałami hamującymi, rekombinacyjny lub rekombinacyjny hybrydowy czynnik VIII jest podawany, korzystnie drogą infuzji dożylnej, około 25 pacjentom z niedoborem czynnika VIII, którzy posiadają przeciwciała przeciwko czynnikowi VIII, które hamują aktywność terapeutyczną ludzkiego lub pochodzącego od świni czynnika VIII. Dawka rekombinacyjnego lub rekombinacyjnego hybrydowego czynnika VIII jest zawarta w granicach pomiędzy 5 i 50 jednostek/kg masy ciała, korzystnie 10-50 jednostek/kg, najkorzystniej 40 jednostek/kg masy ciała. Około 1 godzinę po każdej infuzji, mierzony jest odzysk czynnika VIII z próbek krwi w jednoetapowym teście koagulacji. Próbki są pobierane ponownie około 5 godzin po infuzji i badany jest odzysk. Całkowity odzysk i tempo znikania czynnika VIII z próbek może służyć przewidywaniu miana przeciwciał i aktywności hamującej. Jeżeli miano przeciwciał jest wysokie, odzysk czynnika VIII zazwyczaj nie może być zmierzony. Wyniki dotyczące odzysku są porównywane z wynikami dotyczącymi odzysku u pacjentów leczonych ludzkim czynnikiem VIII otrzymanym z osocza, rekombinacyjnym ludzkim czynnikiem VIII, czynnikiem VIII pochodzącym od świni i innymi zwykle stosowanymi terapeutycznymi formami czynnika VIII lub substytutami czynnika VIII.

W drugim typie badania, mają cym na celu ustalenie, czy rekombinacyjny lub rekombinacyjny hybrydowy czynnik VIII jest immunogenny tzn. czy u pacjentów powstaną przeciwciała hamujące, rekombinacyjny lub rekombinacyjny hybrydowy czynnik VIII jest podawany, jak opisano powyżej, około 100 uprzednio nie leczonym pacjentom chorym na hemofilię, u których nie powstały przeciwciała przeciwko czynnikowi VIII. Terapia jest powtarzana co około 2 tygodnie przez okres od 6 miesięcy do 1 roku. W tym czasie w odstępach od 1 do 3 miesięcy pobierane są próbki krwi i przeprowadzane są testy Bethesda lub inne testy przeciwciał w celu wykrycia obecności przeciwciał hamujących. Mogą być również przeprowadzone testy odzysku, jak opisano powyżej, po każdej infuzji. Wyniki są porównywane do wyników pacjentów chorych na hemofilię, którzy otrzymują ludzki otrzymywany z osocza czynnik VIII, rekombinacyjny czynnik VIII, czynnik VIII pochodzący od świni lub inne zazwyczaj używane formy czynnika VIII lub substytuty czynnika VIII.

Kompozycje farmaceutyczne

Kompozycje farmaceutyczne zawierające rekombinacyjny lub rekombinacyjny hybrydowy czynnik VIII, sam lub w kombinacji z odpowiednimi farmaceutycznymi związkami stabilizującymi, podłożami

PL 206 105 B1 i/lub nośnikami, są przygotowywane zgodnie ze znanymi sposobami, jak opisano w Remington's Pharmaceutical Sciences E.W. Martina.

W jednym z korzystnych zastosowań, korzystne nośniki lub podłoża do podawania dożylnego sól fizjologiczna lub zbuforowana fosforanem sól fizjologiczna.

W innym korzystnym zastosowaniu, odpowiednie związki stabilizujące, podłoża i nośniki obejmują (lecz nie są ograniczone do) innych ludzkich lub zwierzęcych białek takich, jak albumina.

Pęcherzyki fosfolipidowe lub zawiesiny liposomowe są także korzystne jako farmaceutycznie akceptowane nośniki lub podłoża. Mogą one być przygotowane zgodnie ze sposobami znanymi osobom biegłym w sztuce i mogą zawierać, na przykład, fosfatydyloserynę/fosfatydylocholinę lub inne kompozycje fosfolipidów lub detergentów, które razem nadają ujemny ładunek powierzchni, ponieważ czynnik VIII wiąże się z ujemnie naładowanymi błonami fosfolipidowymi. Liposomy mogą być przygotowywane przez rozpuszczenie odpowiedniego lipidu (lipidów) (jak stearoilofosfatydyloetanoloamina, stearoilofosfatydylocholina, arachadoilofosfatydylocholina i cholesterol) w nieorganicznym rozpuszczalniku, który jest następnie odparowywany, pozostawiając cienka błonę wysuszonego lipidu na powierzchni pojemnika. Wodny roztwór hybrydowego czynnika VIII jest następnie wprowadzany do pojemnika. Następnie pojemnik jest wirowany ręcznie w celu uwolnienia materiału lipidowego od ścian pojemnika i zdyspergowania agregatów lipidowych, przez co tworzy się zawiesina lipidowa.

Rekombinacyjny lub rekombinacyjny hybrydowy czynnik VIII może być łączony z innymi odpowiednimi związkami stabilizującymi, podłożami i/lub nośnikami, włącznie z zależnym od witaminy K czynnikami krzepnięcia, czynnikiem tkankowym i czynnikiem von Willebranda (vWf) lub fragmentem vWf, który zawiera miejsce wiążące czynnik VIII i polisacharydami takimi, jak sacharoza.

Rekombinacyjny lub rekombinacyjny hybrydowy czynnik VIII może również być dostarczany na drodze terapii genowej w taki sam sposób, w jaki może być dostarczany ludzki czynnik VIII, przy użyciu takich środków dostarczania, jak wektory retrowirusowe. Ten sposób polega na inkorporacji cDNA czynnika VIII do komórek ludzkich, które są podawane bezpośrednio pacjentowi z niedoborem czynnika VIII lub umieszczane we wszczepialnych urządzeniach przepuszczalnych dla cząsteczek czynnika VIII, lecz nieprzepuszczalne dla komórek, które są następnie wszczepiane. Korzystnym sposobem jest transfer genu przy pośrednictwie retrowirusowym. W tym sposobie egzogenny gen (np. cDNA czynnika VIII) jest klonowany do genomu zmodyfikowanego retrowirusa. Gen jest umieszczany w genomie komórki gospodarza za pośrednictwem wirusa, gdzie będzie podlegał ekspresji w komórce. Wektor retrowirusowy jest modyfikowany tak, że nie wytwarza wirusa, zapobiegając infekcji wirusowej u gospodarza. Ogólne zasady tego typu terapii są znane osobom biegłym w sztuce i zostały omówione w literaturze (np. Kohn, D.B. i wsp. (1989) Transfusion 29: 812-820).

Rekombinacyjny lub rekombinacyjny hybrydowy czynnik VII może być przechowywany w połączeniu z vWf w celu przedłużenia okresu półtrwania i okresu trwałości cząsteczki hybrydowej. Dodatkowo, liofilizacja czynnika VIII może poprawić wydajność aktywnych cząsteczek w obecności vWf. Obecne sposoby przechowywania ludzkich i zwierzęcych czynników VIII stosowane przez dostawców handlowych mogą być zastosowane do przechowywania hybrydowego czynnika VIII. Do tych sposobów należą: (1) liofilizacja czynnika VIII w stanie częściowo oczyszczonym (ponieważ czynnik VIII „ulega koncentracji”, jest podawany bez dalszego oczyszczania); (2) oczyszczanie czynnika VIII metodą immunopowinowactwa Zimmermana i liofilizacja w obecności albuminy, która stabilizuje czynnik VIII; (3) liofilizacja rekombinacyjnego czynnika VIII w obecności albuminy.

Dodatkowo, hybrydowy czynnik VIII może być na czas nieokreślony stabilny w 4°C w 0,6 M NaCI, 20 mM MES i 5 mM CaCI2 przy pH 6,0 i również może być przechowywany w stanie zamrożonym w tych buforach i odmrażany przy minimalnej utracie aktywności.

Sposoby leczenia

Rekombinacyjny lub rekombinacyjny hybrydowy czynnik VIII jest stosowany do leczenia nie kontrolowanego krwawienia spowodowanego niedoborem czynnika VIII (np. wewnątrzstawowego, wewnątrzczaszkowego lub krwotoku z przewodu pokarmowego) u osób chorych na hemofilię z przeciwciałami hamującymi lub bez nich i u pacjentów z nabytym niedoborem czynnika VIII spowodowanym wystąpieniem hamujących przeciwciał. Aktywne czynniki są korzystnie podawane dożylnie.

Dodatkowo, rekombinacyjny lub rekombinacyjny hybrydowy czynnik VIII może być podawany drogą wszczepienia komórek, które są uzyskiwane na drodze inżynierii genetycznej lub przez implantację urządzenia zawierającego takie komórki, jak opisano powyżej.

W korzystnym zastosowaniu, kompozycje farmaceutyczne zawierające rekombinacyjny lub rekombinacyjny hybrydowy czynnik VIII sam lub w kombinacji ze stabilizatorami, podłożami i/lub nośnikami

PL 206 105 B1 są podawane pacjentom w infuzji dożylnej według takich samych procedur, jakie są stosowane przy infuzji ludzkiego lub zwierzęcego czynnika VIII.

Dawki lecznicze kompozycji rekombinacyjnego lub rekombinacyjnego hybrydowego czynnika VIII, które musza być podane pacjentowi potrzebującemu takiego leczenia są zróżnicowane w zależności od stopnia ciężkości niedoboru czynnika VIII. Ogólnie poziom dawkowania jest dostosowywany pod względem częstotliwości, długości stosowania i ilości jednostek w zależności od stopnia ciężkości i czasu trwania epizodu krwawienia każ dego pacjenta. Zgodnie z tym, hybrydowy czynnik VIII jest zawarty w farmaceutycznie akceptowanym nośniku, podłożu lub stabilizatorze w ilości wystarczającej do dostarczenia pacjentowi terapeutycznie skutecznej ilości hybrydu w celu zatrzymania krwawienia, co jest mierzone standardowymi testami krzepnięcia.

Czynnik VIII jest klasycznie definiowany jako substancja obecna w normalnym osoczu krwi, która koryguje defekt krzepnięcia w osoczu pobranym od osób chorych na hemofilię A. Aktywność koagulacyjna in vitro oczyszczonych lub częściowo oczyszczonych form czynnika VIII jest używana do obliczania dawki czynnika VIII do infuzji pacjentom (ludziom) i jest wiarygodnym wskaźnikiem aktywności odzyskanej z osocza pacjenta i korekcji defektu krzepnięcia in vivo. Nie opisano rozbieżności pomiędzy standardowym testem nowych cząsteczek czynnika VIII in vitro i ich zachowaniem w modelu infuzji u psa lub u ludzi według: Lusher, J.M. i wsp. 328 New Engl. J.Med. 328: 453-459; Pittman, D.D. i wsp. (1992) Blood 79: 389-397 i Brinkhous i wsp. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 8752:8755.

Zazwyczaj pożądany poziom czynnika VIII w osoczu, który ma być osiągnięty u pacjenta poprzez podanie rekombinacyjnego lub rekombinacyjnego hybrydowego czynnika VIII jest w granicach 30-100% normy. W korzystnym sposobie podania rekombinacyjnego lub rekombinacyjnego hybrydowego czynnika VIII, kompozycja jest podawana dożylnie w korzystnej dawce w zakresie od około 5 do 50 jednostek/kg masy ciała, korzystniej w zakresie 10-50 jednostek/kg masy ciała i najkorzystniej w dawce 20-40 jednostek/kg masy ciała; częstotliwość podawania wynosi od około 8 do 24 godzin (u osób ciężko chorych na hemofilię; a długość okresu leczenia w dniach znajduje się w zakresie od 1 do 10 dni lub do czasu zakończenia epizodu krwawienia. Patrz np. Roberts, H.R. i M.RJones, „Hemophilia and Related Conditions - Congenital Deficiencies of Prothrombin (Factor II, Factor V, and Factors VII to

XII”). Ch. 153, 1453-1474, 1460, w Hematology Williams, WJ. i wsp. wyd. (1990). Pacjenci z inhibitorami mogą wymagać większej ilości rekombinacyjnego lub rekombinacyjnego hybrydowego czynnika VIII lub też pacjenci mogą wymagać mniejszej ilości rekombinacyjnego lub rekombinacyjnego hybrydowego czynnika VIII z uwagi na jego większą specyficzną aktywność od ludzkiego czynnika VIII lub zmniejszoną reaktywność lub immunogenność przeciwciał. Podobnie, jak w przypadku leczenia ludzkim lub pochodzącym od świni czynnikiem VIII, ilość podanego w infuzji rekombinacyjnego lub rekombinacyjnego hybrydowego czynnika VIII jest definiowana w jednoetapowym teście koagulacji czynnika VIII i, w wybranych przypadkach, odzysk in vivo jest określany przez mierzenie czynnika VII w osoczu pacjenta po infuzji. Należy rozumieć, że dla każdej szczególnej osoby, specyficzne schematy dawkowania powinny być dostosowywane w przeciągu czasu zgodnie z indywidualną potrzebą i profesjonalną oceną osoby podającej lub nadzorującej podawanie kompozycji, i że zakresy stężeń określone tutaj są jedynie przykładowe i nie ograniczają zakresu lub praktycznego stosowania zastrzeżonej kompozycji.

Leczenie może mieć formę pojedynczego podania dożylnego kompozycji lub okresowego lub ciągłego podawania w dłuższym okresie, zależnie od potrzeb. Alternatywnie, rekombinacyjny lub rekombinacyjny hybrydowy czynnik VIII może być podawany podskórnie lub doustnie z liposomami w jednej lub kilku dawkach w zróżnicowanych odstępach czasowych.

Czynnik VIII może także być używany do leczenia niekontrolowanego krwawienia z powodu niedoboru czynnika VIII u chorych na hemofilię, u których powstały przeciwciała przeciwko ludzkiemu czynnikowi VIII. W takim przypadku aktywność koagulacyjna większa od aktywności koagulacyjnej samego ludzkiego lub zwierzęcego czynnika VIII nie jest konieczna. Aktywność koagulacyjna mniejsza od aktywności koagulacyjnej ludzkiego czynnika VIII (tzn. mniejsza niż 3000 jednostek/kg) będzie użyteczna, jeżeli ta aktywność nie będzie neutralizowana przez przeciwciała w osoczu pacjenta.

Cząsteczka rekombinacyjnego lub rekombinacyjnego hybrydowego czynnika VIII i sposoby izolacji, charakteryzacji, wytwarzania i stosowania ogólnie opisane powyżej będą lepiej zrozumiane w odniesieniu do następujących, nie ograniczających przykładów.

P r z y k ł a d y

Materiały - osocze chorego na hemofilię A z cytrynianem i normalne pobrane osocze ludzkie (FACT) zostały nabyte w George King Biomedical, Inc. (Overland Park, KS). Heparyna-Sefaroza została nabyta w Sigma Chemical Co. (St. Luis, MO). Osocze płodu bydlęcego, genetycyna, penicylina,

PL 206 105 B1 streptomycyna, pożywka DMEM/F12 i pożywka AIM-V zostały nabyte w Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD). Polimeraza Pfu DNA i fagemid pBlueScript II KS^- zostały nabyte w Stratagene (La Jolla, CA). Monoklonalne przeciwciała mysie przeciwko ludzkiemu fVIII ESH4 i ESH8 zostały nabyte w American Diagnostica (Greenwich, CT). Hamujące monoklonalne przeciwciało mysie specyficzne dla C2 fVIII - NMC VIII-5 zostało uzyskane od dr Midori Shima, Nara Medical College, Japonia. Ludzkie monoklonalne przeciwciało specyficzne dla C2 fVIII IgG4_K - B02C11, które zostało sklonowane z transformowanej linii komórek B od pacjenta z hemofilią, zostało przygotowane jak opisano poprzednio (Jaquemin, M.G. i wsp., 1998, „Mechanism and kinetics of factor VIII inactivation: study with an IgG4 monoklonal antibody derived from a hemophilia A patient with inhibitor”, Bloood 92: 496-506). Osocza ludzkie z cytrynianem od pięciu pacjentów z inhibitorami - AA, AJ, HR, LK i RvR zostały nabyte od dr Dorothea Scandella. Były one używane albo bez dalszego oczyszczania (HR, RvR i AJ) lub jako preparaty IgG (LK i AA). Inhibitor IgG został przygotowany jak opisano poprzednio (Scandella, D.L. i wsp., 1992, „A soluble recombinant factor VIII fragment containing the A2 domain binds to some human antifactor VIII antibodies that are not detected by immunoblotting”, Thromb. Haemostas. 67: 665-671). Inhibitory u HR, LK, AA i przeciwciała RvR były specyficzne dla domeny C2, jak oceniono w teście neutralizacji przeciwciał (Prescott, R i wsp., 1997, „The inhibitory antibody response is more complex in hemophilia A patients than in most nonhemophiliacs with fVIII autoantibodies”, Blood 89: 3663-3671). AJ został zidentyfikowany jako specyficzny dla C2 przy użyciu panelu rekombinacyjnych hybrydowych ludzkich/pochodzących od świni cząsteczek fVIII (Barrow, R.T i wsp., 2000, „Reduction of the antigenicity of factor VIII toward complex inhibitory plasmas using multiply-substituted hybrid human/porcine factor VIII molecules”, Blood 95: 557-561). Wolny od albuminy rekombinacyjny fVIII pełnej długości został uzyskany od Hyland-Immuno Division of Baxter Healthcare (Deerfield, IL). Syntetyczne oligonukleotydy zostały nabyte od Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD). Enzymy restrykcyjne zostały nabyte od New England Biolabs (Beverly, MA) lub Promega (Madison, WI). Linia komórkowa uzyskana z komórek nerki noworodka chomika została otrzymana od dr R.T.A Macgillivray (Funk, W.D. i wsp., 1990, „Expression of the amino-terminal half-molecule from human serum transferrin in cultured cells and characterization of the recombinant protein”, Biochemistry 29: 1654-1660). Wektor ekspresyjny fVIII bez domeny B, oznaczony HB-/ReNeo, zawierający dwie zasady 3' miejsca Notl w celu zatrzymania kodonu i geny oporności na ampicylinę i genetycynę zostały przygotowane jak opisano poprzednio (Healey, J.F. i wsp., 1998, „Residues Glu2181-Val2243 contain a major determinant of the inhibitory epitope in the C2 domain of human falctor VIII” Blood 92: 3701-3709). HSQ/ReNeo, ludzka cząsteczka fVIII bez domeny B zawierająca segment 14 aminokwasów, SerPheSerGlnAsnProProValLeuLys-ArgHisGlnArg, w miejsce domeny B w ludzkim fVIII (lind, P. i wsp., 1995, „Novel forms of B-domain-dleted recombinant factor VIII molecules. Construction and biochemical characterization”, Eur. J.Biochem. 232: 19-27) została skonstruowana przez rozszerzenie mutagenezy typu łączenie-przez-zachodzenie na siebie (SOE) (Horton, R.M. i wsp., 1993, „Gene splicing by overlap extension”, Methods Enzymol. 217: 270-279) przy użyciu Hb-/ReNeo jako szablonu, zasadniczo jak opisano poprzednio dla odpowiadającej cząsteczki pochodzącej od świni (Healey, J.F. i wsp., 1998, „residues Glu2181-Val2243 contain a major determinant of the inhibitory epitope in the C2 domain of human factor VIII”, Blood 92: 3701-3709). HP20, hybrydowa cząsteczka ludzkiego/pochodzącego od świni fVIII bez domeny B zawierająca ludzkie domeny A1, A2, ap-A3 i C1 i domenę C2 pochodzącą od świni została przygotowana jak opisano poprzednio (Healey, J.F., supra, 1998).

Plazmid DNA został oczyszczony przy użyciu zestawu Qiagen Plasmidl Maxi Kit (Qiagen, Inc., Valencia, CA). Reakcje PCR zostały przeprowadzone przy użyciu termocyklera Hubrid OmniGene przy użyciu polimerazy Pfu DNA. Produkty PCr zostały oczyszczone na żelu, poddane precypitacji z etanolem i włączone do DNA plazmidu przy użyciu ligazy T4 DNA (Rapid DNA Ligation Kit, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Plazmidy zawierające insert zostały użyte do transformacji komórek E. coli Epicurean XL1-Blue. Wszystkie nowe sekwencje DNA fVIII wygenerowane przez PCR zostały potwierdzone przez sekwencjonowanie dideoksy przy użyciu automatycznego sekwencera DNA 373a i zestawu terminatora barwnika PRISM firmy Applied Biosystems (Foster City, CA).

P r z y k ł a d 1: konstrukcja zmutowanego cDNA fVIII

Mutacje zostały wykonane w kodonach HSQ przez mutagenezę SOE w celu wytworzenia następujących białek: Met2199Ile (ludzkie do świńskiego), ATG do ATC, Phe2200Leu (ludzkie do psiego), TTT do TTG, Val2223Ala (ludzkie do psiego), GTG do GCC, Lys2227Glu (ludzkie do świńskiego), AAA do GAG, Leu2252Phe (ludzkie do mysiego), CTT do TTC, Met2199Ile/Phe2200Leu, ATG do ATC i TTT do TTG,

PL 206 105 B1

Val2223Ala/Lys2227Glu, GTG do GCC i AAA do GAG, Met2199Ile/Phe2200Leu/Val2223Ala/Lys-2227Glu, ATG do ATC, TTT do TTT, GTG do GCC i AAA do GAG.

HSQ/ReNeo był użyty jako szablon do reakcji PCR. Pierwsza reakcja PCR wykorzystywała ludzki primer C1, numer identyfikacyjny sekwencji 3,5'-GTG GAT TCA TCT GGG ATA CAC-3',oznaczony H3763+, odpowiadający nukleotydom 3763-3786 w sekwencji HSQ, jako primer sensowny. Następujące primery zostały użyte jako primery antysensowne: Met2199Ile, numer identyfikacyjny sekwencji 4,5'-AGG AGA CCA GGT GGC AAA GAT ATT GGT AAA GTA GGA TGA-3', Phe2200Leu, numer identyfikacyjny sekwencji 5,5'-TGA AGG AGA CCA GGT CAA CAT ATT GGT AAA GA GGA-3', Val2223Ala, numer identyfikacyjny sekwencji 6,5'-CCA CTC TTT TGG ATT ATT GGC CTG AGG TCT CCA GGC ATT-3', Lys2227Glu, numer identyfikacyjny sekwencji 7,5'-GTC CAC TTG CAG CCA CTC CTC TGG ATT ATT CAC CTG AGG-3', Leu2252Phe, numer identyfikacyjny sekwencji 8,5'-CTT CAC ATACAT GCT GGT GAA CAG AGA TTT TAC TCC CTG-3', Met 2199Ile/Phe2200Leu, numer identyfikacyjny sekwencji 9,5'-AGG AGA CCA GGT GGC CAA GAT ATTGGT AAAGTA GGA TGA-3' i Val2223Ala/Lys2227Glu, numer identyfikacyjny sekwencji 10,5'-CAC TTG CAG CCA CTC CTCTGG ATT ATT GGC CTG AGG TCT CCA GGC-3'.

Druga reakcja PCR wykorzystywała primer ReNeo, numer identyfikacyjny sekwencji 11,5'-AGT TTT TCT ACA ACA GAG GAA GTG-3', oznaczonej RE1110-, która jest 3' do domeny C2, jako primer antysensowny. Następujące primery była użyte jako primery sensowne: Met2199Ile, numer identyfikacyjny sekwencji 12,5'-TCA TCC TAC TTT ACC AAT ATC TTT GCC ACC TGG TCT CCT-3', Phe2200Leu, numer identyfikacyjny sekwencji 13,5'-TCC TAC TTT ACC AAT ATG TTG GCC ACC TGG TCT CCT TCA-3', Val 2223Ala, numer identyfikacyjny sekwencji 14,5'-AAT GCC TGG AGA CCT CAG GCC AAT AAT CCA AAAGAG TGG-3', Lys2227Glu, numer identyfikacyjny sekwencji 15,5'-CCT CAG GTG AAT AAT CCA GAG GAG TGG CTG CAA GTG GAC-3', Leu2252Phe, numer identyfikacyjny sekwencji 16,5'-CAG GGA GTA AAA TCT CTG TTC ACC AGC ATG TAT GTG AAG-3', Met2199Ile/Phe2200Leu, numer identyfikacyjny sekwencji 17,5'-TCA TCC TAC TTT ACC AAT ATC TTG GCC ACC TGG TCT CCT-3' i Val2223Ala/Lys2227Glu, numer identyfikacyjny sekwencji 18,5'-GCC TGG AGA CCT CAG GCC AAT AAT CCA GAG GAG TGG CTG CAA GTG-3'.

Reakcja SOE wykorzystywała fragmenty z reakcji PCR jako szablony i H3763+ i RE1110 jako primery. Produkt SOE i fragmenty połączenia HSQ/ReNeo zostały wygenerowane przy użyciu Swa I i Not I.

cDNA Met2199Ile/Phe2200Leu/Val2223Ala/Lys2227Glu zostało skonstruowane jak następuje. cDNA Met2199Ile/Phe2200Leu zostało przesunięte do pBluescript II KS- i wytrawione za pomocą Bsu36 I. cDNA Val2223Ala/Lys2227Glu również zostało wytrawione przy pomocy Bsu36 i odpowiednie fragmenty zostały połączone. Powstałe cDNA Met2199/Phe2200Leu/Val2223Ala/Lys2227Glu zostało przesunięte do ReNeo przez wytrawianie przy pomocy Swa i Not I.

P r z y k ł a d 2: ekspresja rekombinacyjnych cząsteczek fVIII

Transfekowane linie komórkowe były utrzymywane w pożywce F12 Dulbecco zmodyfikowanym przez Eagle'a zawierającej 10% osocza 1 płodu bydlęcego, 50 j/ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny. Surowica płodu bydlęcego była inaktywowana cieplnie przez jedną godzinę w 56°C przed użyciem. Zmutowane cDNA w ReNeo były stabilnie transfekowane do komórek BHK, wyselekcjonowane pod względem oporności na genetycynę, przeniesione do wolnej od surowicy pożywki AIM-V dla ekspresji i częściowo oczyszczone za pomocą chromatografii heparyna-Sefaroza, jak opisano poprzednio (Healey, J.F. i wsp., supra, 1998).

P r z y k ł a d 3: testy hamowania FVIII i fVIII

Aktywność rekombinacyjnych białek fVIII była mierzona w jednoetapowym teście krzepnięcia (Bowie, E.j.W. i CA. Owen, 1984, „The clinical and laboratory diagnosis of hemorrhagic disorders” w Disorders of Hemostasis, wydawcy O.D. Ratnoff i CD. Forbes. Grune & Stratton, Inc., Orlando, FL 43-72). Jedna jednostka fVIII jest zdefiniowana jako aktywność w ml normalnego ludzkiego osocza z cytrynianem. Miano inhibitora fVIII było mierzone przez modyfikację testu Bethesda (kasper, CK. i wsp., 1975, „A more uniform measurement of factor VIII inhibitors”, Thromb. Diath. Haemorrh. 34: 869-872) jak następuje. Rekombinacyjne fVIII zostało dodane do osocza chorego na hemofilię A do końcowego stężenia 0,8-1,2 jednostki na ml i było inkubowane z różnymi stężeniami inhibitora przez 2 godziny w 37°C Aby określić 50% punkt hamowania, który definiuje jednostkę Bethesda, wykonano rozcieńczenia inhibitora, które wytwarzały aktywność resztkową, która obejmowała co najmniej zakres 35% do 65%. W pewnych przypadkach wykonano kopie rozcieńczeń, w których stosowano średnie rozcieńczenia. Wykonano średnią z 10 rozcieńczeń do oceny miana Bethesda. Wykresy semi-logarytmiczne procentu aktywności resztkowej względem logarytmu odwrotności rozcieńczenia inhibitora były we

PL 206 105 B1 wszystkich przypadkach liniowe. Dane zostały przedstawione w formie nie-liniowej regresji przy użyciu algorytmu Marquardta (SigmaPlot 5.0, SPSS, Inc.) według równania % aktywności resztkowej = m (log x - log x50) + 50 gdzie parametr x50 jest odwrotnością rozcieńczenia, które powoduje 50% zahamowanie, parametr m jest nachyleniem linii semi-logarytmicznej i niezależna zmienna x jest odwrotnością rozcieńczenia próbki inhibitora. Błąd standardowy oceny (średnie odchylenie punktów danych od linii regresji) dla 62 testów Bethesda wynosiło 10,0 ± 4,0 (średnia ± SD), wskazując na względnie małą dokładność, która jest właściwa dla testu.

Miano Bethesda równa się x50^-1. Ocena błędu standardowego (SD) miana Behtesda została obliczona przez pomnożenie miana Bethesda przez współczynnik zmienności x50. Miana Bethesda mutantów fVIII i HB- zostały porównane w teście t studenta.

Masowe stężenie fVIII w częściowo oczyszczonych preparatach było ustalone przez sadwiczowy test ELISA przy użyciu ESH4 jako przeciwciała chwytającego i biotynylowanego ESH8 jak opisano poprzednio (Lubin, I.M. i wsp., 1994, „Elimination of a major inhibitor epitope in factor VII”, J. Biol. Chem. 269: 8639-8641). Pełnej długości rekombinacyjny fVIII był użyty jako standard i wartości zostały skorygowane dla różnicy w masie pomiędzy pełnej długości formami fVIII i formami bez domeny B. Próbki były badane w czterech kopiach. Średni współczynnik zmienności wynosił 9,0%. Specyficzna aktywność cząsteczek fVIII była obliczona przez podzielenie aktywności koagulacyjnej przez stężenie, jak określono w ELISA. Uzyskano następujące wartości (jednostki na mg): HB-, 7800, Met2199Ile, 12800, Phe2200Leu, 10200, Val2223Ala, 19600, Lys2227Glu, 36200, Leu2252Phe, 10100, Met2199Ile/Phe2200Leu, 10000, Val2223Ala/Lys2227-Glu, 33200, Met2199Ile/Phe2200Leu/Val2223Ala/Lys2227Glu, 14200. Widoczna specyficzna aktywność pewnych mutantów jest wyższa niż HB-. Może to być wynikiem względnie małej obniżonej zdolności mutantów do wiązania albo wychwytującego albo wykrywającego przeciwciała w porównaniu z HB-, co prowadzi do zbyt niskiego oszacowania masy MII lub zbyt wysokiego oszacowania specyficznej aktywności.

T a b e l a 1.

Antygenowość mutantów FVIII C2 wobec specyficznych dla C2 przeciwciał hamujących w porównaniu z ludzkim FVIII

		Antygenowość^a
Mutant	Mniejsza	Równa	Większa
Met2199Ile	4/7	0/7	3/7
Phe2200Leu	4/7	2/7	1/7
Val2223Ala	0/7	2/7	5/7
Lys2227Glu	2/7	1/7	4/7
Leu2252Phe	4/7	3/7	0/7
Met2199Ile/Phe2200Leu	6/7	1/7	0/7
Val2223Ala/Lys2227Glu	4/7	1/7	2/7
Met2199Ile/Phe2200Leu/ Val223Ala/Lys2227Glu	7/7	0/7	0/7
HP20	7/7	0/7	0/7

^a Znacząca róż nica przy poziomie ufności 99%

PL 206 105 B1

Lista sekwencji <110> Emory Uniyersity <12 0> MODIFIED FACTOR VIII <130> 75-00 WO <140> PCT/US01/29431 <141> 2001-09-19 <150> US 60/234,047 <151> 2000-09-19 <150> US 60/236,460 <151> 2000-09-29 <160> 18 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 9009 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (208).. (7203) <400> 1

cagtgggtaa	gttccttaaa	tgctctgcaa	agaaattggg	acttttcatt	aaatcagaaa	60
ttttactttt	ttcccctcct	gggagctaaa	gatattttag	agaagaatta	accttttgct	120
tctccagttg	aacatttgta	gcaataagtc	atgcaaatag	agctctccac	ctgcttcttt	180
ctgtgccttt	tgcgattctg	ctttagt gcc Ala	acc aga aga tac tac Thr Arg Arg Tyr Tyr	ctg ggt gca Leu Gly Ala	234

5

gtg Val 10

gaa Glu

ctg Leu

tca Ser

tgg Trp

gac Asp 15

tat Tyr

atg Met

caa Gln

agt Ser

gat Asp 20

ctc Leu

ggt Gly

gag Glu

ctg Leu

cct Pro 25

282

gtg

gac

gca

aga

ttt

cct

aga

gtg

cca

aaa

tct

ttt

cca

ttc

aac

330

Val

Asp

Ala

Arg

Phe 30

Pro

Arg

Val

Pro 35

Lys

Ser

Phe

Pro

Phe 40

Asn

acc

tca

gtc

gtg

tac

aaa

aag

act

ctg

ttt

gta

gaa

ttc

acg

gtt

cac

378

Thr

Ser

Val

Val 45

Tyr

Lys

Thr

Leu 50

Phe

Val

Glu

Phe

Thr 55

Val

His

ctt

ttc

aac

atc

gct

aag

cca

agg

cca

ccc

tgg

atg

ggt

ctg

eta

ggt

426

Leu

Phe

Asn 60

Ile

Ala

Lys

Pro

Arg 65

Pro

Trp

Met

Gly 70

Leu

Gly

cct

acc

atc

cag

gct

gag

gtt

tat

gat

aca

gtg

gtc

att

aca

ctt

aag

474

Pro

Thr 75

Ile

Gln

Ala

Glu

Val 80

Tyr

Asp

Thr

Val

Val 85

Ile

Thr

Leu

Lys

PL 206 105 B1 aac atg gct tcc cat cct gtc agt ctt cat gct gtt ggt gta tcc tac 522

Asn Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr

95 100 105 tgg aaa gct tct gag gga gct gaa tat gat gat cag acc agt caa agg 570

Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gin Thr Ser Gin Arg

110 115 120 gag aaa gaa gat gat aaa gtc ttc cct ggt gga agc cat aca tat gtc 618

Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val

125 130 135 tgg cag gtc ctg aaa gag aat ggt cca atg gcc tct gac cca ctg tgc 666

Trp Gin Val Leu Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys

140 145 150 ctt acc tac tca tat ctt tct cat gtg gac ctg gta aaa gac ttg aat 714

Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn

155 160 165 tca ggc ctc att gga gcc eta eta gta tgt aga gaa ggg agt ctg gcc 762

Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala

170 175 180 185 aag gaa aag aca cag acc ttg cac aaa ttt ata eta ctt ttt gct gta 810

Lys Glu Lys Thr Gin Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val

190 195 200 ttt gat gaa ggg aaa agt tgg cac tca gaa aca aag aac tcc ttg atg 858

Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met

205 210 215 cag gat agg gat gct gca tct gct cgg gcc tgg cct aaa atg cac aca 906

Gin Asp Arg Asp Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr

220 225 230 gtc aat ggt tat gta aac agg tct ctg cca ggt ctg att gga tgc cac 954

Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His

235 240 245 agg aaa tca gtc tat tgg cat gtg att gga atg ggc acc act cct gaa 1002

Arg Lys Ser Val Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu

250 ~ 255 260 265 gtg cac tca ata ttc ctc gaa ggt cac aca ttt ctt gtg agg aac cat 1050

Val His Ser Ile Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His

270 275 280 cgc cag gcg tcc ttg gaa atc tcg cca ata act ttc ctt act gct caa 1098

Arg Gin Ala Ser Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gin

285 290 295 aca ctc ttg atg gac ctt gga cag ttt eta ctg ttt tgt cat atc tct 1146

Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly Gin Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser

300 305 310 tcc cac caa cat gat ggc atg gaa gct tat gtc aaa gta gac agc tgt 1194

Ser His Gin His Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys

315 320 325 cca gag gaa ccc caa eta ega atg aaa aat aat gaa gaa gcg gaa gac 1242

PL 206 105 B1

Pro 330

Glu

Pro

Gln

Leu 335

Arg

Met

Lys

Asn Asn 340

Glu

Ala

Glu

Asp 345

tat

gat

ctt

act

gat

tet

gaa

atg

gat

gtg

gtc

agg

ttt

gat

1290

Tyr

Asp

Leu 350

Thr

Asp

Ser

Glu

Met 355

Asp

Val

Arg

Phe 360

Asp

gat

gac

aac

tet

cct

tcc

ttt

atc

caa

att

cgc

tea

gtt

gcc

aag

1338

Asp

Asn

Ser 365

Pro

Ser

Phe

Ile

Gln 370

Ile

Arg

Ser

Val

Ala 375

Lys

cat

cct

aaa

act

tgg

gta

cat

tac

att

gct

gaa

gag

gac

tgg

1386

His

Pro

Lys 380

Thr

Trp

Val

His

Tyr 385

Ile

Ala

Glu

Glu 390

Glu

Asp

Trp

gac

tat

gct

ccc

tta

gtc

ctc

gcc

ccc

gat

gac

aga

agt

tat

aaa

agt

1434

Asp

Tyr 395

Ala

Pro

Leu

Val

Leu 400

Ala

Pro

Asp

Arg 405

Ser

Tyr

Lys

Ser

caa

tat

ttg

aac

aat

ggc

cct

cag

cgg

att

ggt

agg

aag

tac

aaa

1482

Gln 410

Tyr

Leu

Asn

Gly 415

Pro

Gln

Arg

Ile

Gly 420

Arg

Lys

Tyr

Lys

Lys 425

gtc

ega

ttt

atg

gca

tac

aca

gat

gaa

acc

ttt

aag

act

cgt

gaa

gct

1530

Val

Arg

Phe

Met

Ala 430

Tyr

Thr

Asp

Glu

Thr 435

Phe

Lys

Thr

Arg

Glu 440

Ala

att

cag

cat

gaa

tea

gga

atc

ttg

gga

cct

tta

ctt

tat

ggg

gaa

gtt

1578

Ile

Gln

His

Glu 445

Ser

Gly

Ile

Leu

Gly 450

Pro

Leu

Tyr

Gly 455

Glu

Val

gga

gac

aca

ctg

ttg

att

ata

ttt

aag

aat

caa

gca

age

aga

cca

tat

1626

Gly

Asp

Thr 460

Leu

Ile

Phe 465

Lys

Asn

Gln

Ala

Ser 470

Arg

Pro

Tyr

aac

atc

tac

cct

cac

gga

atc

act

gat

gtc

cgt

cct

ttg

tat

tea

agg

1674

Asn

Ile 475

Tyr

Pro

His

Gly

Ile 480

Thr

Asp

Val

Arg

Pro 485

Leu

Tyr

Ser

Arg

aga

tta

cca

aaa

ggt

gta

aaa

cat

ttg

aag

gat

ttt

cca

att

ctg

cca

1722

Arg 490

Leu

Pro

Lys

Gly

Val 495

Lys

His

Leu

Lys

Asp 500

Phe

Pro

Ile

Leu

Pro 505

gga

gaa

ata

ttc

aaa

tat

aaa

tgg

aca

gtg

act

gta

gaa

gat

ggg

cca

1770

Gly

Glu

Ile

Phe

Lys 510

Tyr

Lys

Trp

Thr

Val 515

Thr

Val

Glu

Asp

Gly 520

Pro

act

aaa

tea

gat

cct

cgg

tgc

ctg

acc

cgc

tat

tac

tet

agt

ttc

gtt

1818

Thr

Lys

Ser

Asp 525

Pro

Arg

Cys

Leu

Thr 530

Arg

Tyr

Ser

Ser 535

Phe

Val

aat

atg

gag

aga

gat

eta

gct

tea

gga

ctc

att

ggc

cct

ctc

atc

1866

Asn

Met

Glu 540

Arg

Asp

Leu

Ala

Ser 545

Gly

Leu

Ile

Gly

Pro 550

Leu

Ile

tgc

tac

aaa

gaa

tet

gta

gat

caa

aga

gga

aac

cag

ata

atg

tea

gac

1914

Cys

Tyr 555

Lys

Glu

Ser

Val

Asp 560

Gln

Arg

Gly

Asn

Gln 565

Ile

Met

Ser

Asp

aag

agg

aat

gtc

atc

ctg

ttt

tet

gta

ttt

gat

gag

aac

ega

age

tgg

1962

Lys

Arg

Asn

Val

Ile

Leu

Phe

Ser

Val

Phe

Asp

Glu

Asn

Arg

Ser

Trp

PL 206 105 B1

2010

570

575

580

585

tac

ctc

aca

gag

aat

ata

caa

cgc

ttt

ctc

ccc

aat

cca

get

gga

gtg

Tyr

Leu

Thr

Glu

Asn 590

Ile

Gln

Arg

Phe

Leu 595

Pro

Asn

Pro

Ala

Gly 600

Val

cag

c 11

gag

gat

Y^ Y- d

gag

ttc

caa

gcc

tcc

aac

atc

atg

cac

age

atc

Gln

Leu

Glu

Asp 605

Pro

Glu

Phe

Gln

Ala 610

Ser

Asn

Ile

Met

His 615

Ser

Ile

aat

ggc

tat

gtt

ttt

gat

agt

ttg

cag

ttg

tea

gtt

tgt

ttg

cat

gag

Asn

Gly

Tyr 620

Val

Phe

Asp

Ser

Leu 625

Gln

Leu

Ser

Val

Cys 630

Leu

His

Glu

gtg

gca

tac

tgg

tac

att

eta

age

att

gga

gca

cag

act

gac

ttc

ctt

Val

Ala 635

Tyr

Trp

Tyr

Ile

Leu 640

Ser

Ile

Gly

Ala

Gln 645

Thr

Asp

Phe

Leu

tct

gtc

ttc

tct

gga

tat

acc

ttc

aaa

cac

aaa

atg

gtc

tat

gaa

Ser 650

Val

Phe

Ser

Gly 655

Tyr

Thr

Phe

Lys

His 660

Lys

Met

Val

Tyr

Glu 665

gac

aca

ctc

acc

eta

ttc

cca

ttc

tea

gga

gaa

act

gtc

ttc

atg

teg

Asp

Thr

Leu

Thr

Leu 670

Phe

Pro

Phe

Ser

Gly 675

Glu

Thr

Val

Phe

Met 680

Ser

atg

gaa

aac

cca

ggt

eta

tgg

att

ctg

ggg

tgc

cac

aac

tea

gac

ttt

Met

Glu

Asn

Pro 685

Gly

Leu

Trp

Ile

Leu 690

Gly

Cys

His

Asn

Ser 695

Asp

Phe

cgg

ciel O

aga

ggc

atg

acc

gcc

tta

ctg

aag

gtt

tct

agt

tgt

gac

aag

Arg

Asn

Arg 700

Gly

Met

Thr

Ala

Leu 705

Leu

Lys

Val

Ser

Ser 710

Cys

Asp

Lys

aac

act

ggt

gat

tat

tac

gag

gac

agt

tat

gaa

gat

att

tea

gca

tac

Asn

Thr 715

Gly

Asp

Tyr

Glu 720

Asp

Ser

Tyr

Glu

Asp 725

Ile

Ser

Ala

Tyr

ttg

ctg

agt

aaa

aac

aat

gcc

att

gaa

cca

aga

age

ttc

tcc

cag

aat

Leu 730

Leu

Ser

Lys

Asn

Asn 735

Ala

Ile

Glu

Pro

Arg 740

Ser

Phe

Ser

Gln

Asn 745

tea

aga

cac

cct

age

act

agg

caa

aag

caa

ttt

aat

gcc

acc

aca

att

Ser

Arg

His

Pro

Ser 750

Thr

Arg

Gln

Lys

Gln 755

Phe

Asn

Ala

Thr

Thr 760

Ile

cca

gaa

aat

gac

ata

gag

aag

act

gac

cct

tgg

ttt

gca

cac

aga

aca

Pro

Glu

Asn

Asp 765

Ile

Glu

Lys

Thr

Asp 770

Pro

Trp

Phe

Ala

His 775

Arg

Thr

cct

atg

cct

aaa

ata

caa

aat

gtc

tcc

tct

agt

gat

ttg

atg

ctc

Pro

Met

Pro 780

Lys

Ile

Gln

Asn

Val 785

Ser

Asp

Leu 790

Leu

Met

Leu

ttg

ega

cag

agt

cct

act

cca

cat

ggg

eta

tcc

tta

tct

gat

ctc

caa

Leu

Arg 795

Gln

Ser

Pro

Thr

Pro 800

His

Gly

Leu

Ser

Leu 805

Ser

Asp

Leu

Gln

gaa

gcc

aaa

tat

gag

act

ttt

tct

gat

cca

tea

cct

gga

gca

ata

Glu 810

Ala

Lys

Tyr

Glu

Thr 815

Phe

Ser

Asp

Pro 820

Ser

Pro

Gly

Ala

Ile 825

2058

2106

2154

2202

2250

2298

2346

2394

2442

2490

2538

2586

2634

2682

PL 206 105 B1

gac Asp

agt Ser

aat Asn

aac Asn

agc Ser 830

ctg Leu

tct Ser

gaa Glu

atg Met

aca Thr 835

cac His

ttc Phe

agg Arg

cca Pro

cag Gin 840

ctc Leu

2730

cat

cac

agt

ggg

gac

atg

gta

ttt

acc

cct

gag

tca

ggc

ctc

caa

tta

2778

His

Ser

Gly 845

Asp

Met

Val

Phe

Thr 850

Pro

Glu

Ser

Gly

Leu 855

Gin

Leu

aga

tta

aat

gag

aaa

ctg

ggg

aca

act

gca

aca

gag

ttg

aag

aaa

2826

Arg

Leu

Asn 860

Glu

Lys

Leu

Gly

Thr 865

Thr

Ala

Thr

Glu 870

Leu

Lys

ctt

gat

ttc

aaa

gtt

tct

agt

aca

tca

aat

ctg

att

tca

aca

att

2874

Leu

Asp 875

Phe

Lys

Val

Ser

Ser 880

Thr

Ser

Asn

Leu 885

Ile

Ser

Thr

Ile

cca

tca

gac

aat

ttg

gca

ggt

act

gat

aat

aca

agt

tcc

tta

gga

2922

Pro 890

Ser

Asp

Asn

Leu

Ala 895

Ala

Gly

Thr

Asp

Asn 900

Thr

Ser

Leu

Gly 905

ccc

cca

agt

atg

cca

gtt

cat

tat

gat

agt

caa

tta

gat

acc

act

eta

2970

Pro

Ser

Met

Pro 910

Val

His

Tyr

Asp

Ser 915

Gin

Leu

Asp

Thr

Thr 920

Leu

ttt

ggc

aaa

aag

tca

tct

ccc

ctt

act

gag

tct

ggt

gga

cct

ctg

agc

3018

Phe

Gly

Lys

Lys 925

Ser

Pro

Leu

Thr 930

Glu

Ser

Gly

Pro 935

Leu

Ser

ttg

agt

gaa

aat

gat

tca

aag

ttg

tta

gaa

tca

ggt

tta

atg

3066

Leu

Ser

Glu 940

Glu

Asn

Asp

Ser 945

Lys

Leu

Glu

Ser 950

Gly

Leu

Met

aat

agc

caa

gaa

agt

tca

tgg

gga

aaa

aat

gta

tcg

tca

aca

gag

agt

3114

Asn

Ser 955

Gin

Glu

Ser

Trp 960

Gly

Lys

Asn

Val

Ser 965

Ser

Thr

Glu

Ser

ggt

agg

tta

ttt

aaa

ggg

aaa

aga

gct

cat

gga

cct

gct

ttg

act

3162

Gly 970

Arg

Leu

Phe

Lys

Gly 975

Lys

Arg

Ala

His

Gly 980

Pro

Ala

Leu

Thr 985

aaa

gat

aat

gcc

tta

ttc

aaa

gtt

agc

atc

tct

ttg

tta

aag

aca

aac

3210

Lys

Asp

Asn

Ala

Leu 990

Phe

Lys

Val

Ser

Ile 995

Ser

Leu

Lys Thr 1000

Asn

aaa

act

tcc

aat

tca

gca

act

aat

aga

aag

act

cac

att

gat

ggc

3258

Lys

Thr

Ser Asn 1005

Asn

Ser

Ala

Thr Asn 1010

Arg

Lys

Thr

His Ile 1015

Asp

Gly

cca

tca

tta

att

gag

aat

agt

cca

tca

gtc

tgg

caa

aat

ata

tta

3306

Pro

Ser Leu 1020

Leu

Ile

Glu

Asn Ser 1025

Pro

Ser

Val

Trp Gin 1030

Asn

Ile

Leu

gaa

agt

gac

act

gag

ttt

aaa

gtg

aca

cct

ttg

att

cat

gac

aga

3354

Glu Ser 1035

Asp

Thr

Glu

Phe Lys 1040

Lys

Val

Thr

Pro Leu 1045

Ile

His

Asp

Arg

atg

ctt

atg

gac

aaa

aat

gct

aca

gct

ttg

agg

eta

aat

cat

atg

tca

3402

Met 1050

Leu

Met

Asp

Lys Asn 1055

Ala

Thr

Ala

Leu Arg 1060

Leu

Asn

His

Met Ser 1065

PL 206 105 B1

aat Asn

aaa Lys

act Thr

tca Ser 1070

tca Ser

aaa Lys

aac Asn

atg Met

gaa Glu 1075

atg Met

gtc Val

caa Gin

cag Gin

aaa Lys 1080

aaa Lys

3450

gag

ggc

ccc

att

cca

gat

gca

caa

aat

cca

gat

atg

tcg

ttc

ttt

3498

Glu

Gly

Pro

Ile

Pro

Asp

Ala

Gin

Asn

Pro

Asp

Met

Ser

Phe

1085

1090

1095

aag

atg

eta

ttc

ttg

cca

gaa

tca

gca

agg

tgg

ata

caa

agg

act

cat

3546

Lys

Met

Leu

Phe

Leu

Pro

Glu

Ser

Ala

Arg

Trp

Ile

Gin

Arg

Thr

His

1100

1105

1110

gga

aag

aac

tet

ctg

aac

tet

ggg

caa

ggc

ccc

agt

cca

aag

caa

tta

3594

Gly

Lys

Asn

Ser

Leu

Asn

Ser

Gly

Gin

Gly

Pro

Ser

Pro

Lys

Gin

Leu

1115

1120

1125

gta

tcc

tta

gga

cca

gaa

aaa

tet

gtg

gaa

ggt

cag

aat

ttc

ttg

tet

3642

Val

Ser

Leu

Gly

Pro

Glu

Lys

Ser

Val

Glu

Gly

Gin

Asn

Phe

Leu

Ser

1130

1135

1140

1145

gag

aaa

aac

aaa

gtg

gta

gga

aag

ggt

gaa

ttt

aca

aag

gac

gta

3690

Glu

Lys

Asn

Lys

Val

Gly

Lys

Gly

Glu

Phe

Thr

Lys

Asp

Val

1150

1155

1160

gga

ctc

aaa

gag

atg

gtt

ttt

cca

age

aga

aac

eta

ttt

ctt

act

3738

Gly

Leu

Lys

Glu

Met

Val

Phe

Pro

Ser

Arg

Asn

Leu

Phe

Leu

Thr

1165

1170

1175

aac

ttg

gat

aat

tta

cat

gaa

aat

aca

cac

aat

caa

gaa

aaa

3786

Asn

Leu

Asp

Asn

Leu

His

Glu

Asn

Thr

His

Asn

Gin

Glu

Lys

1180

1185

1190

att

cag

gaa

ata

gaa

aag

gaa

aca

tta

atc

caa

gag

aat

gta

3834

Ile

Gin

Glu

Ile

Glu

Lys

Glu

Thr

Leu

Ile

Gin

Glu

Asn

Val

1195

1200

1205

gtt

ttg

cct

cag

ata

cat

aca

gtg

act

ggc

act

aag

aat

ttc

atg

aag

3882

Val

Leu

Pro

Gin

Ile

His

Thr

Val

Thr

Gly

Thr

Lys

Asn

Phe

Met

Lys

1210

1215

1220

1225

aac

ctt

ttc

tta

ctg

age

act

agg

caa

aat

gta

gaa

ggt

tca

tat

gag

3930

Asn

Leu

Phe

Leu

Ser

Thr

Arg

Gin

Asn

Val

Glu

Gly

Ser

Tyr

Glu

1230

1235

1240

ggg

gca

tat

gct

cca

gta

ctt

caa

gat

ttt

agg

tca

tta

aat

gat

tca

3978

Gly

Ala

Tyr

Ala

Pro

Val

Leu

Gin

Asp

Phe

Arg

Ser

Leu

Asn

Asp

Ser

1245

1250

1255

aca

aat

aga

aca

aag

aaa

cac

aca

gct

cat

ttc

tca

aaa

ggg

gag

4026

Thr

Asn

Arg

Thr

Lys

His

Thr

Ala

His

Phe

Ser

Lys

Gly

Glu

1260

1265

1270

gaa

aac

ttg

gaa

ggc

ttg

gga

aat

caa

acc

aag

caa

att

gta

gag

4074

Glu

Asn

Leu

Glu

Gly

Leu

Gly

Asn

Gin

Thr

Lys

Gin

Ile

Val

Glu

1275

1280

1285

aaa

tat

gca

tgc

acc

aca

agg

ata

tet

cct

aat

aca

age

cag

aat

4122

Lys

Tyr

Ala

Cys

Thr

Arg

Ile

Ser

Pro

Asn

Thr

Ser

Gin

Asn

1290

1295

1300

1305

ttt

gtc

acg

caa

cgt

agt

aag

aga

gct

ttg

aaa

caa

ttc

aga

ctc

cca

4170

PL 206 105 B1

Phe

Val

Thr

Gln

Arg 1310

Ser

Lys

Arg

Ala

Leu 1315

Lys

Gln

Phe

Arg

Leu 1320

Pro

eta

gaa

aca

gaa

ctt

gaa

aaa

agg

ata

att

gtg

gat

gac

acc

tca

4218

Leu

Glu

Thr

Glu

Leu

Glu

Lys

Arg

Ile

Val

Asp

Thr

Ser

1325

1330

1335

acc

cag

tgg

tcc

aaa

aac

atg

aaa

cat

ttg

acc

ccg

agc

acc

ctc

aca

4266

Thr

Gln

Trp

Ser

Lys

Asn

Met

Lys

His

Leu

Thr

Pro

Ser

Thr

Leu

Thr

1340

1345

1350

cag

ata

gac

tac

aat

gag

aag

gag

aaa

ggg

gcc

att

act

cag

tet

ccc

4314

Gln

Ile

Asp

Tyr

Asn

Glu

Lys

Glu

Lys

Gly

Ala

Ile

Thr

Gln

Ser

Pro

1355

1360

1365

tta

tca

gat

tgc

ctt

acg

agg

agt

cat

agc

atc

cct

caa

gca

aat

aga

4362

Leu

Ser

Asp

Cys

Leu

Thr

Arg

Ser

His

Ser

Ile

Pro

Gln

Ala

Asn

Arg

1370

1375

1380

1385

tet

cca

tta

ccc

att

gca

aag

gta

tca

ttt

cca

tet

att

aga

cct

4410

Ser

Pro

Leu

Pro

Ile

Ala

Lys

Val

Ser

Phe

Pro

Ser

Ile

Arg

Pro

1390

1395

1400

ata

tat

ctg

acc

agg

gtc

eta

ttc

caa

gac

aac

tet

cat

ctt

cca

4458

Ile

Tyr

Leu

Thr

Arg

Val

Leu

Phe

Gln

Asp

Asn

Ser

His

Leu

Pro

1405

1410

1415

gca

tet

tat

aga

aag

aaa

gat

tet

ggg

gtc

caa

gaa

agc

agt

cat

4506

Ala

Ser

Tyr

Arg

Lys

Asp

Ser

Gly

Val

Gln

Glu

Ser

His

1420

1425

1430

ttc

tta

caa

gga

gcc

aaa

aat

aac

ctt

tet

tta

gcc

att

eta

acc

4554

Phe

Leu

Gln

Gly

Ala

Lys

Asn

Leu

Ser

Leu

Ala

Ile

Leu

Thr

1435

1440

1445

ttg

gag

atg

act

ggt

gat

caa

aga

gag

gtt

ggc

tcc

ctg

ggg

aca

agt

4602

Leu

Glu

Met

Thr

Gly

Asp

Gln

Arg

Glu

Val

Gly

Ser

Leu

Gly

Thr

Ser

1450

1455

1460

1465

gcc

aca

aat

tca

gtc

aca

tac

aag

aaa

gtt

gag

aac

act

gtt

ctc

ccg

4650

Ala

Thr

Asn

Ser

Val

Thr

Tyr

Lys

Val

Glu

Asn

Thr

Val

Leu

Pro

1470

1475

1480

aaa

cca

gac

ttg

ccc

aaa

aca

tet

ggc

aaa

gtt

gaa

ttg

ctt

cca

aaa

4698

Lys

Pro

Asp

Leu

Pro

Lys

Thr

Ser

Gly

Lys

Val

Glu

Leu

Pro

Lys

1485

1490

1495

gtt

cac

att

tat

cag

aag

gac

eta

ttc

cct

acg

gaa

act

agc

aat

ggg

4746

Val

His

Ile

Tyr

Gln

Lys

Asp

Leu

Phe

Pro

Thr

Glu

Thr

Ser

Asn

Gly

1500

1505

1510

tet

cct

ggc

cat

ctg

gat

ctc

gtg

gaa

ggg

agc

ctt

cag

gga

aca

4794

Ser

Pro

Gly

His

Leu

Asp

Leu

Val

Glu

Gly

Ser

Leu

Gln

Gly

Thr

1515

1520

1525

gag

gga

gcg

att

aag

tgg

aat

gaa

gca

aac

aga

cct

gga

aaa

gtt

ccc

4842

Glu

Gly

Ala

Ile

Lys

Trp

Asn

Glu

Ala

Asn

Arg

Pro

Gly

Lys

Val

Pro

1530

1535

1540

1545

ttt

ctg

aga

gta

gca

aca

gaa

agc

tet

gca

aag

act

ccc

tcc

aag

eta

4890

Phe

Leu

Arg

Val

Ala

Thr

Glu

Ser

Ala

Lys

Thr

Pro

Ser

Lys

Leu

PL 206 105 B1

	1550	1555	1560
ttg	gat cct ctt gct tgg gat	aac cac tat ggt act cag	ata cca aaa 4938
Leu	Asp Pro Leu Ala Trp Asp	Asn His Tyr Gly Thr Gin	Ile Pro Lys
	1565	1570 :	1575
gaa	gag tgg aaa tcc caa gag	aag tca cca gaa aaa aca	gct ttt aag 4986
Glu	Glu Trp Lys Ser Gin Glu	Lys Ser Pro Glu Lys Thr	Ala Phe Lys
	1580 :	1585 1590
aaa	aag gat acc att ttg tcc	ctg aac gct tgt gaa agc	aat cat gca 5034
Lys	Lys Asp Thr Ile Leu Ser	Leu Asn Ala Cys Glu Ser	Asn His Ala
1595 1600	1605
ata	gca gca ata aat gag gga	caa aat aag ccc gaa ata	gaa gtc acc 5082
Ile	Ala Ala Ile Asn Glu Gly	Gin Asn Lys Pro Glu Ile	Glu Val Thr
1610 1615	1620	1625
tgg	gca aag caa ggt agg act	gaa agg ctg tgc tct caa	aac cca cca 5130
Trp	Ala Lys Gin Gly Arg Thr	Glu Arg Leu Cys Ser Gin	Asn Pro Pro
	1630	1635	1640
gtc	ttg aaa cgc cat caa cgg	gaa ata act cgt act act	ctt cag tca 5178
Val	Leu Lys Arg His Gin Arg	Glu Ile Thr Arg Thr Thr	Leu Gin Ser
	1645	1650 1655
gat	caa gag gaa att gac tat	gat gat acc ata tca gtt	gaa atg aag 5226
Asp	Gin Glu Glu Ile Asp Tyr	Asp Asp Thr Ile Ser Val	Glu Met Lys
	1660 1665 1670
aag	gaa gat ttt gac att tat	gat gag gat gaa aat cag	agc ccc cgc 5274
Lys	Glu Asp Phe Asp Ile Tyr	Asp Glu Asp Glu Asn Gin	Ser Pro Arg
1675 1680	1685
agc	ttt caa aag aaa aca ega	cac tat ttt att gct gca	gtg gag agg 5322
Ser	Phe Gin Lys Lys Thr Arg	His Tyr Phe Ile Ala Ala	Val Glu Arg
169C	1 1695	1700	1705
ctc	tgg gat tat ggg atg agt	agc tcc cca cat gtt eta	aga aac agg 5370
Leu	Trp Asp Tyr Gly Met Ser	Ser Ser Pro His Val Leu	Arg Asn Arg
	1710	1715	1720
gct	cag agt ggc agt gtc cct	cag ttc aag aaa gtt gtt	ttc cag gaa 5418
Ala	Gin Ser Gly Ser Val Pro	Gin Phe Lys Lys Val Val	Phe Gin Glu

1725 1730 1735 ttt act gat ggc tcc ttt act cag ccc tta tac cgt gga gaa eta aat 5466

Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gin Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn

1740 1745 1750 gaa cat ttg gga ctc ctg ggg cca tat ata aga gca gaa gtt gaa gat 5514

Glu His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp

1755 1760 1765 aat atc atg gta act ttc aga aat cag gcc tct cgt ccc tat tcc ttc 5562

Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gin Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe

1770 1775 1780 1785 tat tct agc ctt att tct tat gag gaa gat cag agg caa gga gca gaa 5610

Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gin Arg Gin Gly Ala Glu

1790 1795 1800

PL 206 105 B1

cct Pro

aga Arg

aaa Lys

aac Asn 1805

ttt Phe

gtc Val

aag Lys

cct Pro

aat Asn 1810

gaa Glu

acc Thr

aaa Lys

act Thr

tac Tyr 1815

ttt Phe

tgg Trp

5658

aaa

gtg

caa

cat

atg

gca

ccc

act

aaa

gat

gag

ttt

gac

tgc

aaa

5706

Lys

Val

Gin

His

Met

Ala

Pro

Thr

Lys

Asp

Glu

Phe

Asp

Cys

Lys

1820

1825

1830

gcc

tgg

gct

tat

ttc

tct

gat

gtt

gac

ctg

gaa

aaa

gat

gtg

cac

tca

5754

Ala

Trp

Ala

Tyr

Phe

Ser

Asp

Val

Asp

Leu

Glu

Lys

Asp

Val

His

Ser

1835

1840

1845

ggc

ctg

att

gga

ccc

ctt

ctg

gtc

tgc

cac

act

aac

aca

ctg

aac

cct

5802

Gly

Leu

Ile

Gly

Pro

Leu

Val

Cys

His

Thr

Asn

Thr

Leu

Asn

Pro

1850

1855

1860

1865

gct

cat

ggg

aga

caa

gtg

aca

gta

cag

gaa

ttt

gct

ctg

ttt

ttc

acc

5850

Ala

His

Gly

Arg

Gin

Val

Thr

Val

Gin

Glu

Phe

Ala

Leu

Phe

Thr

1870

1875

1880

atc

ttt

gat

gag

acc

aaa

agc

tgg

tac

ttc

act

gaa

aat

atg

gaa

aga

5898

Ile

Phe

Asp

Glu

Thr

Lys

Ser

Trp

Tyr

Phe

Thr

Glu

Asn

Met

Glu

Arg

1885

1890

1895

aac

tgc

agg

gct

ccc

tgc

aat

atc

cag

atg

gaa

gat

ccc

act

ttt

aaa

5946

Asn

Cys

Arg

Ala

Pro

Cys

Asn

Ile

Gin

Met

Glu

Asp

Pro

Thr

Phe

Lys

1900

1905

1910

gag

aat

tat

cgc

ttc

cat

gca

atc

aat

ggc

tac

ata

atg

gat

aca

eta

5994

Glu

Asn

Tyr

Arg

Phe

His

Ala

Ile

Asn

Gly

Tyr

Ile

Met

Asp

Thr

Leu

1915

1920

1925

cct

ggc

tta

gta

atg

gct

cag

gat

caa

agg

att

ega

tgg

tat

ctg

ctc

6042

Pro

Gly

Leu

Val

Met

Ala

Gin

Asp

Gin

Arg

Ile

Arg

Trp

Tyr

Leu

1930

1935

1940

1945

agc

atg

ggc

agc

aat

gaa

aac

atc

cat

tct

att

cat

ttc

agt

gga

cat

6090

Ser

Met

Gly

Ser

Asn

Glu

Asn

Ile

His

Ser

Ile

His

Phe

Ser

Gly

His

1950

1955

1960

gtg

ttc

act

gta

ega

aaa

gag

tat

aaa

atg

gca

ctg

tac

aat

6138

Val

Phe

Thr

Val

Arg

Lys

Glu

Tyr

Lys

Met

Ala

Leu

Tyr

Asn

1965

1970

1975

ctc

tat

cca

ggt

gtt

ttt

gag

aca

gtg

gaa

atg

tta

cca

tcc

aaa

gct

6186

Leu

Tyr

Pro

Gly

Val

Phe

Glu

Thr

Val

Glu

Met

Leu

Pro

Ser

Lys

Ala

1980

1985

1990

gga

att

tgg

cgg

gtg

gaa

tgc

ctt

att

ggc

gag

cat

eta

cat

gct

ggg

6234

Gly

Ile

Trp

Arg

Val

Glu

Cys

Leu

Ile

Gly

Glu

His

Leu

His

Ala

Gly

1995

2000

2005

atg

agc

aca

ctt

ttt

ctg

gtg

tac

agc

aat

aag

tgt

cag

act

ccc

ctg

6282

Met

Ser

Thr

Leu

Phe

Leu

Val

Tyr

Ser

Asn

Lys

Cys

Gin

Thr

Pro

Leu

2010

2015

2020

2025

gga

atg

gct

tct

gga

cac

att

aga

gat

ttt

cag

att

aca

gct

tca

gga

6330

Gly Met

Ala

Ser

Gly

His

Ile

Arg

Asp

Phe

Gin

Ile

Thr

Ala

Ser

Gly

2030

2035

2040

PL 206 105 B1

caa Gin

tat Tyir

gga cag Gly Gin 2045

tgg Trp

gcc Ala

cca Pro

aag ctg Lys Leu 2050

gcc Ala

aga Arg

ctt Leu

cat His

tat Tyr 2055

tcc Ser

gga Gly

6378

tca

atc

aat gcc

tgg

agc

acc

aag gag

ccc

ttt

tct

tgg

atc

aag

gtg

6426

Ser

Ile

Asn Ala

Trp

Ser

Thr

Lys Glu

Pro

Phe

Ser

Trp

Ile

Lys

Val

2060

2065

2070

gat

ctg

ttg gca

cca

atg

att

att cac

ggc

atc

aag

acc

cag

ggt

gcc

6474

Asp

Leu

Leu Ala

Pro

Met

Ile

Ile His

Gly

Ile

Lys

Thr

Gin

Gly

Ala

2075

2080

2085

cgt

cag

aag ttc

tcc

agc

ctc

tac atc

tct

cag

ttt

atc

atg

tat

6522

Arg

Gin

Lys Phe

Ser

Leu

Tyr Ile

Ser

Gin

Phe

Ile

Met

Ty

2090

2095

2100

2105

agt

ctt

gat ggg

aag

tgg

cag act

tat

ega

gga

aat

tcc

act

gga

6570

Ser

Leu

Asp Gly

Lys

Trp

Gin Thr

Tyr

Arg

Gly

Asn

Ser

Thr

Gly

2110

2115

2120

acc

tta

atg gtc

ttc

ttt

ggc

aat gtg

gat

tca

tct

ggg

ata

aaa

cac

6618

Thr

Leu

Met Val

Phe

Gly

Asn Val

Asp

Ser

Gly

Ile

Lys

His

2125

2130

2135

aat

att

ttt aac

cct

cca

att

att gct

ega

tac

atc

cgt

ttg

cac

cca

6666

Asn

Ile

Phe Asn

Pro

Ile

Ile Ala

Arg

Tyr

Ile

Arg

Leu

His

Pro

2140

2145

2150

act

cat

tat agc

att

cgc

agc

act ctt

cgc

atg

gag

ttg

atg

ggc

tgt

6714

Thr

His

Tyr Ser

Ile

Arg

Ser

Thr Leu

Arg

Met

Glu

Leu

Met

Gly

Cys

2155

2160

2165

gat

tta

aat agt

tgc

agc

atg

cca ttg

gga

atg

gag

agt

aaa

gca

ata

6762

Asp

Leu

Asn Ser

Cys

Ser

Met

Pro Leu

Gly

Met

Glu

Ser

Lys

Ala

Ile

2170

2175

2180

2185

tca

gat

gca cag

att

act

gct

tca tcc

tac

ttt

acc

aat

atg

ttt

gcc

6810

Ser

Asp

Ala Gin

Ile

Thr

Ala

Ser Ser

Tyr

Phe

Thr

Asn

Met

Phe

Ala

2190

2195

2200

acc

tgg

tct cct

tca

aaa

gct

ega ctt

cac

ctc

caa

ggg

agg

agt

aat

6858

Thr

Trp

Ser Pro

Ser

Lys

Ala

Arg Leu

His

Leu

Gin

Gly

Arg

Ser

Asn

2205 2210 2215 gcc tgg aga cct cag gtg aat aat cca aaa gag tgg ctg caa gtg gac 6906

Ala Trp Arg Pro Gin Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gin Val Asp

2220 2225 2230 ttc cag aag aca atg aaa gtc aca gga gta act act cag gga gta aaa 6954

Phe Gin Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gin Gly Val Lys

2235 2240 2245 tct ctg ctt acc agc atg tat gtg aag gag ttc ctc atc tcc agc agt 7002

Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser

2250 2255 2260 2265 caa gat ggc cat cag tgg act ctc ttt ttt cag aat ggc aaa gta aag 7050

Gin Asp Gly His Gin Trp Thr Leu Phe Phe Gin Asn Gly Lys Val Lys

2270 2275 2280 gtt ttt cag gga aat caa gac tcc ttc aca cct gtg gtg aac tct eta 7098

PL 206 105 B1

Val

Phe

Gln Gly 2285

Asn

Gln

Asp

Ser

Phe 2290

Thr

Pro

Val

Asn 2295

Ser

Leu

gac

cca

ccg

tta

ctg

act

cgc

tac

ctt

ega

att

cac

ccc

cag

agt

tgg

7146

Asp

Pro

Leu

Thr

Arg

Tyr

Leu

Arg

Ile

His

Pro

Gln

Ser

Trp

2300

2305

2310

gtg

cac

cag

att

gcc

ctg

agg

atg

gag

gtt

ctg

ggc

tgc

gag

gca

cag

7194

Val

His

Gln

Ile

Ala

Leu

Arg

Met

Glu

Val

Leu

Gly

Cys

Glu

Ala

Gln

2315

2320

2325

gac ctc tac tgagggtggc cactgcagca cctgccactg ccgtcacctc 7243

Asp Leu Tyr

2330

tccctcctca	gctccagggc	agtgtccctc	cctggcttgc	cttctacctt	tgtgctaaat	7303
cctagcagac	actgccttga	agcctcctga	attaactatc	atcagtcctg	catttctttg	7363
gtggggggcc	aggagggtgc	atccaattta	acttaactct	tacctatttt	ctgcagctgc	7423
tcccagatta	ctccttcctt	ccaatataac	taggcaaaaa	gaagtgagga	gaaacctgca	7483
tgaaagcatt	cttccctgaa	aagttaggcc	tctcagagtc	accacttcct	ctgttgtaga	7543
aaaactatgt	gatgaaactt	tgaaaaagat	atttatgatg	ttaacatttc	aggttaagcc	7603
tcatacgttt	aaaataaaac	teteagttgt	ttattatcct	gatcaagcat	ggaacaaagc	7663
atgtttcagg	ateagateaa	tacaatcttg	gagtcaaaag	gcaaatcatt	tggacaatct	7723
gcaaaatgga	gagaatacaa	taactactac	agtaaagtct	gtttctgctt	ccttacacat	7783
agatataatt	atgttattta	gtcattatga	ggggcacatt	cttatctcca	aaactagcat	7843
tcttaaactg	agaattatag	atggggttca	agaatcccta	agtcccctga	aattatataa	7903
ggcattctgt	ataaatgcaa	atgtgcattt	ttctgacgag	tgtccataga	tataaagcca	7963
ttggtcttaa	ttctgaccaa	taaaaaaata	agtcaggagg	atgcaattgt	tgaaagcttt	8023
gaaataaaat	aacatgtctt	cttgaaattt	gtgatggcca	agaaagaaaa	tgatgatgac	8083
attaggette	taaaggacat	acatttaata	tttctgtgga	aatatgagga	aaatccatgg	8143
ttatctgaga	taggagatac	aaactttgta	attctaataa	tgcactcagt	ttactctctc	8203
cctctactaa	tttcctgctg	aaaataacac	aacaaaaatg	taacagggga	aattatatac	8263
cgtgactgaa	aactagagtc	ctacttacat	agttgaaata	tcaaggaggt	cagaagaaaa	8323
ttggactggt	gaaaacagaa	aaaacactcc	agtctgccat	atcaccacac	aataggatcc	8383
cccttcttgc	cctccacccc	cataagattg	tgaagggttt	actgctcctt	ccatctgcct	8443
gcaccccttc	actatgacta	cacagaactc	tcctgatagt	aaagggggct	ggaggcaagg	8503
ataagttata	gageagttgg	aggaagcatc	caaagactgc	aacccagggc	aaatggaaaa	8563
caggagatcc	taatatgaaa	gaaaaatgga	tcccaatctg	agaaaaggca	aaagaatggc	8623

PL 206 105 B1

tacttttttc	tatgctggag	tattttctaa	taatcctgct	tgacccttat	ctgacctctt	8683
tggaaactat	aacatagctg	tcacagtata	gtcacaatcc	acaaatgatg	caggtgcaaa	8743
tggtttatag	ccctgtgaag	ttcttaaagt	ttagaggcta	acttacagaa	atgaataagt	8803
tgttttgttt	tatagcccgg	tagaggagtt	aaccccaaag	gtgatatggt	tttatttcct	8863
gttatgttta	acttgataat	cttattttgg	cattcttttc	ccattgacta	tatacatctc	8923
tatttctcaa	atgttcatgg	aactagctct	tttattttcc	tgctggtttc	ttcagtaatg	8983
agttaaataa	aacattgaca	cataca				9009

<210> 2 <211> 2332 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Ala 1

Thr

Arg

Tyr 5

Tyr

Leu

Gly

Ala

Val 10

Glu

Leu

Ser

Trp

Asp 15

Tyr

Met

Gin

Ser

Asp 20

Leu

Gly

Glu

Leu

Pro 25

Val

Asp

Ala

Arg

Phe 30

Pro

Arg

Val

Pro 35

Lys

Ser

Phe

Pro

Phe 40

Asn

Thr

Ser

Val

Val 45

Tyr

Lys

Thr

Leu 50

Phe

Val

Glu

Phe

Thr 55

Val

His

Leu

Phe

Asn 60

Ile

Ala

Lys

Pro

Arg 65

Pro

Trp

Met

Gly 70

Leu

Gly

Pro

Thr 75

Ile

Gin

Ala

Glu

Val 80

Tyr

Asp

Thr

Val

Val 85

Ile

Thr

Leu

Lys

Asn 90

Met

Ala

Ser

His

Pro 95

Val

Ser

Leu

His

Ala 100

Val

Gly

Val

Ser

Tyr 105

Trp

Lys

Ala

Ser

Glu 110

Gly

Ala

Glu

Tyr

Asp 115

Asp

Gin

Thr

Ser

Gin 120

Arg

Glu

Lys

Glu

Asp 125

Asp

Lys

Val

Phe

Pro 130

Gly

Ser

His

Thr 135

Tyr

Val

Trp

Gin

Val 140

Leu

Lys

Glu

Asn

Gly 145

Pro

Met

Ala

Ser

Asp 150

Pro

Leu

Cys

Leu

Thr 155

Tyr

Ser

Tyr

Leu

Ser 160

His

Val

Asp

Leu

Val 165

Lys

Asp

Leu

Asn

Ser 170

Gly

Leu

Ile

Gly

Ala 175

Leu

Val

Cys

Arg 180

Glu

Gly

Ser

Leu

Ala 185

Lys

Glu

Lys

Thr

Gin 190

Thr

Leu

His

Lys

Phe 195

Ile

Leu

Phe

Ala 200

Val

Phe

Asp

Glu

Gly 205

Lys t

Ser

Trp

His

Ser

Glu

Thr

Lys

Asn

Ser

Leu

Met

Gin

Asp

Arg

Asp

Ala

Ser

PL 206 105 B1

Ala

225

Ser

Val

Gly

Ser

Gln

305

Glu

Met

Ser

Ile

Tyr

385

Ala

Gln

Asp

Leu

Phe

465

Thr

His

Trp

Leu

210

Arg Ala Trp Pro Lys 230

Leu Pro Gly Leu Ile 245

Ile Gly Met Gly Thr 260

His Thr Phe Leu Val 275

Pro Ile Thr Phe Leu 290

Phe Leu Leu Phe Cys 310

Ala Tyr Val Lys Val 325

Lys Asn Asn Glu Glu 340

Glu Met Asp Val Val 355

Gln Ile Arg Ser Val 370

Ile Ala Ala Glu Glu 390

Pro'Asp Asp Arg Ser 405

Arg Ile Gly Arg Lys 420

Glu Thr Phe Lys Thr 435

Gly Pro Leu Leu Tyr 450

Lys Asn Gln Ala Ser 470

Asp Val Arg Pro Leu 485

Leu Lys Asp Phe Pro 500

Thr Val Thr Val Glu 515

Thr Arg Tyr Tyr Ser 530

215

Met His Thr Val Asn 235

Gly Cys His Arg Lys 250

Thr Pro Glu Val His 265

Arg Asn His Arg Gln 280

Thr Ala Gln Thr Leu 295

His Ile Ser Ser His 315

Asp Ser Cys Pro Glu 330

Ala Glu Asp Tyr Asp 345

Arg Phe Asp Asp Asp 360

Ala Lys Lys His Pro 375

Glu Asp Trp Asp Tyr 395

Tyr Lys Ser Gln Tyr 410

Tyr Lys Lys Val Arg 425 .

Arg Glu Ala Ile Gln 440

Gly Glu Val Gly Asp 455

Arg Pro Tyr Asn Ile 475

Tyr Ser Arg Arg Leu 490

Ile Leu Pro Gly Glu 505

Asp Gly Pro Thr Lys 520

Ser Phe Val Asn Met 535

220

Gly Tyr Val Asn Arg 240

Ser Val Tyr Trp His 255

Ser Ile Phe Leu Glu 270

Ala Ser Leu Glu Ile 285

Leu Met Asp Leu Gly 300

Gln His Asp Gly Met 320

Glu Pro Gln Leu Arg 335

Asp Asp Leu Thr Asp 350

Asn Ser Pro Ser Phe 365

Lys Thr Trp Val His 380

Ala Pro Leu Val Leu 400

Leu Asn Asn Gly Pro 415

Phe Met Ala Tyr Thr 430

His Glu Ser Gly Ile 445

Thr Leu Leu Ile Ile 460

Tyr Pro His Gly Ile 480

Pro Lys Gly Val Lys 495

Ile Phe Lys Tyr Lys 510

Ser Asp Pro Arg Cys 525

Glu Arg Asp Leu Ala 540

PL 206 105 B1

Ser 545

Gly

Leu

Ile

Gly

Pro 550

Leu

Ile

Cys

Tyr 555

Lys

Glu

Ser

Val

Asp 560

Gln

Arg

Gly

Asn

Gln

Ile

Met

Ser

Asp

Lys

Arg

Asn

Val

Ile

Leu

Phe

565

570

575

Ser

Val

Phe

Asp

Glu

Asn

Arg

Ser

Trp

Tyr

Leu

Thr

Glu

Asn

Ile

Gln

Arg Phe

Gln Ala 610

Leu Gln 625

Ser Ile

Thr Phe

Phe Ser

Ile Leu 690

Leu Leu 705

Asp Ser

Ile Glu

Gln Lys

Thr Asp 770

Val Ser 785

His Gly

Ser Asp

Glu Met

Phe Thr 850

580

Leu Pro 595

Ser Asn

Leu Ser

Gly Ala

Lys His 660

Gly Glu 675

Gly Cys

Lys Val

Tyr Glu

Pro Arg 740

Gln Phe 755

Pro Trp

Ser Ser

Leu Ser

Asp Pro 820

Thr His 835

Pro Glu

Asn Pro

Ile Met

Val Cys 630

Gln Thr 645

Lys Met

Thr Val

His Asn

Ser Ser 710

Asp Ile 725

Ser Phe

Asn Ala

Phe Ala

Asp Leu 790

Leu Ser 805

Ser Pro

Phe Arg

Ser Gly

585 590

Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe 600 605

His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser 615 620

Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu 635 640

Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr 650 655

Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro 665 670

Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp 680 685

Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala 695 700

Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu 715 720

Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala 730 735

Ser Gln Asn Ser Arg His Pro Ser Thr Arg 745 750

Thr Thr Ile Pro Glu Asn Asp Ile Glu Lys 760 765

His Arg Thr Pro Met Pro Lys Ile Gln Asn 775 780

Leu Met Leu Leu Arg Gln Ser Pro Thr Pro 795 800

Asp Leu Gln Glu Ala Lys Tyr Glu Thr Phe 810 815

Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asn Ser Leu Ser 825 830

Pro Gln Leu His His Ser Gly Asp Met Val 840 845

Leu Gln Leu Arg Leu Asn Glu Lys Leu Gly 855 860

PL 206 105 B1

Thr 865

Thr

Ala

Thr

Glu 870

Leu

Lys

Leu

Asp 875

Phe

Lys

Val

Ser

Ser 880

Thr

Ser

Asn

Leu

Ile

Ser

Thr

Ile

Pro

Ser

Asp

Asn

Leu

Ala

885

890

895

Gly

Thr

Asp

Asn

Thr

Ser

Leu

Gly

Pro

Ser

Met

Pro

Val

His

900

905

910

Tyr

Asp

Ser

Gin

Leu

Asp

Thr

Leu

Phe

Gly

Lys

Ser

Pro

915

920

925

Leu

Thr

Glu

Ser

Gly

Pro

Leu

Ser

Leu

Ser

Glu

Asn

Asp

930

935

940

Ser

Lys

Leu

Glu

Ser

Gly

Leu

Met

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Trp

945

950

955

960

Gly

Lys

Asn

Val

Ser

Thr

Glu

Ser

Gly

Arg

Leu

Phe

Lys

Gly

Lys

965

970

975

Arg

Ala

His

Gly

Pro

Ala

Leu

Thr

Lys

Asp

Asn

Ala

Leu

Phe

Lys

980

985

990

Val

Ser

Ile

Ser

Leu

Lys

Thr

Asn

Lys

Thr

Ser

Asn

Ser

Ala

995

1000

1005

Thr

Asn

Arg

Lys

Thr

His

Ile

Asp

Gly

Pro

Ser

Leu

Ile

Glu

Asn

1010

1015

1020

Ser

Pro

Ser

Val

Trp

Gin

Asn

Ile

Leu

Glu

Ser

Asp

Thr

Glu

Phe

Lys

1025

1030

1035

1040

Lys

Val

Thr

Pro

Leu

Ile

His

Asp

Arg

Met

Leu

Met

Asp

Lys

Asn

Ala

1045

1050

1055

Thr

Ala

Leu

Arg

Leu

Asn

His

Met

Ser

Asn

Lys

Thr

Ser

Lys

1060

1065

1070

Asn

Met

Glu

Met

Val

Gin

Lys

Glu

Gly

Pro

Ile

Pro

Asp

1075

1080

1085

Ala

Gin

Asn

Pro

Asp

Met

Ser

Phe

Lys

Met

Leu

Phe

Leu

Pro

Glu

1090

1095

1100

Ser

Ala

Arg

Trp

Ile

Gin

Arg

Thr

His

Gly

Lys

Asn

Ser

Leu

Asn

Ser

1105

1110

1115

1120

Gly

Gin

Gly

Pro

Ser

Pro

Lys

Gin

Leu

Val

Ser

Leu

Gly

Pro

Glu

Lys

1125

1130

1135

Ser

Val

Glu

Gly

Gin

Asn

Phe

Leu

Ser

Glu

Lys

Asn

Lys

Val

1140

1145

1150

Gly

Lys

Gly

Glu

Phe

Thr

Lys

Asp

Val

Gly

Leu

Lys

Glu

Met

Val

Phe

1155

1160

1165

Pro

Ser

Arg

Asn

Leu

Phe

Leu

Thr

Asn

Leu

Asp

Asn

Leu

His

Glu

1170

1175

1180

Asn

Thr

His

Asn

Gin

Glu

Lys

Ile

Gin

Glu

Ile

Glu

Lys

PL 206 105 B1

1185	1190	1195	1200
Lys Glu	Thr Leu Ile Gln Glu Asn 1205	Val Val Leu Pro Gln Ile 1210	His Thr 1215
Val Thr	Gly Thr Lys Asn Phe Met 1220	Lys Asn Leu Phe Leu Leu 1225 1230	Ser Thr
Arg Gln	Asn Val Glu Gly Ser Tyr 1235 1240	Glu Gly Ala Tyr Ala Pro 1245	Val Leu
Gln Asp 1250	Phe Arg Ser Leu Asn Asp 1255	Ser Thr Asn Arg Thr Lys 1260	Lys His
Thr Ala 1265	His Phe Ser Lys Lys Gly 1270	Glu Glu Glu Asn Leu Glu 1275	Gly Leu 1280
Gly Asn	Gln Thr Lys Gln Ile Val 1285	Glu Lys Tyr Ala Cys Thr 1290 :	Thr Arg 1295
Ile Ser	Pro Asn Thr Ser Gln Gln 1300 :	Asn Phe Val Thr Gln Arg 1305 1310	Ser Lys
Arg Ala Leu Lys Gln Phe Arg Leu 1315 1320	Pro Leu Glu Glu Thr Glu 1325	Leu Glu
Lys Arg 1330	Ile Ile Val Asp Asp Thr 1335	Ser Thr Gln Trp Ser Lys 1340	Asn Met
Lys His 1345	Leu Thr Pro Ser Thr Leu 1350	Thr Gln Ile Asp Tyr Asn 1355	Glu Lys 1360
Glu Lys	Gly Ala Ile Thr Gln Ser 1365	Pro Leu Ser Asp Cys Leu Thr Arg 1370 1375
Ser Hię	Ser Ile Pro Gln Ala Asn Arg Ser Pro Leu Pro Ile 1380 1385 1390	Ala Lys
Val Ser Ser Phe Pro Ser Ile Arg 1395 1400	Pro Ile Tyr Leu Thr Arg 1405	Val Leu
Phe Gln 1410	Asp Asn Ser Ser His Leu 1415	Pro Ala Ala Ser Tyr Arg 1420	Lys Lys
Asp Ser 1425	Gly Val Gln Glu Ser Ser 1430	His Phe Leu Gln Gly Ala 1435	Lys Lys 1440
Asn Asn	Leu Ser Leu Ala Ile Leu 1445	Thr Leu Glu Met Thr Gly Asp Gln 1450 1455
Arg Glu	Val Gly Ser Leu Gly Thr Ser Ala Thr Asn Ser Val 1460 1465 1470	Thr Tyr
Lys Lys Val Glu Asn Thr Val Leu 1475 1480	Pro Lys Pro Asp Leu Pro 1485	Lys Thr
Ser Gly 1490	Lys Val Glu Leu Leu Pro 1495	Lys Val His Ile Tyr Gln 1500	Lys Asp
Leu Phe 1505	Pro Thr Glu Thr Ser Asn 1510	Gly Ser Pro Gly His Leu 1515	Asp Leu 1520

PL 206 105 B1

Val

Glu Gly

Ser

Leu 1525

Leu

Gin

Gly

Thr

Glu Gly Ala 1530

Ile

Lys

Trp 1535

Asn

Glu

Ala Asn

Arg

Pro

Gly

Lys

Val

Pro

Phe Leu Arg

Val

Ala

Thr

Glu

1540

1545

1550

Ser

Ser Ala

Lys

Thr

Pro

Ser

Lys

Leu

Leu Asp Pro

Leu

Ala

Trp

Asp

1555

1560

1565

Asn

His Tyr

Gly

Thr

Gin

Ile

Pro

Lys

Glu Glu Trp

Lys

Ser

Gin

Glu

1570

1575

1580

Lys

Ser Pro

Glu

Lys

Thr

Ala

Phe

Lys

Lys Lys Asp

Thr

Ile

Leu

Ser

1585

1590

1595

1600

Leu

Asn Ala

Cys

Glu

Ser

Asn

His

Ala

Ile Ala Ala

Ile

Asn

Glu

Gly

1605

1610

1615

Gin

Asn Lys

Pro

Glu

Ile

Glu

Val

Thr

Trp Ala Lys

Gin

Gly

Arg

Thr

1620

1625

1630

Glu

Arg Leu

Cys

Ser

Gin

Asn

Pro

Val Leu Lys

Arg

His

Gin

Arg

1635

1640

1645

Glu

Ile Thr

Arg

Thr

Leu

Gin

Ser

Asp Gin Glu

Glu

Ile

Asp

Tyr

1650

- 1655

1660

Asp

Asp Thr

Ile

Ser

Val

Glu

Met

Lys

Lys Glu Asp

Phe

Asp

Ile

Tyr

1665

1670

1675

1680

Asp

Glu Asp

Glu

Asn

Gin

Ser

Pro

Arg

Ser Phe Gin

Lys

Thr

Arg

1685

1690

1695

His

Tyr Phe

Ile

Ala

Val

Glu

Arg

Leu Trp Asp

Tyr

Gly

Met

Ser

1700

1705

1710

Ser

Ser Pro

His

Val

Leu

Arg

Asn

Arg

Ala Gin Ser

Gly

Ser

Val

Pro

1715

1720

1725

Gin

Phe Lys

Lys

Val

Phe

Gin

Glu

Phe Thr Asp

Gly

Ser

Phe

Thr

1730

1735

1740

Gin

Pro Leu

Tyr

Arg

Gly

Glu

Leu

Asn

Glu His Leu

Gly

Leu

Gly

1745

1750

1755

1760

Pro

Tyr Ile

Arg

Ala

Glu

Val

Glu

Asp

Asn Ile Met

Val

Thr

Phe

Arg

1765

1770

1775

Asn

Gin Ala

Ser

Arg

Pro

Tyr

Ser

Phe

Tyr Ser Ser

Leu

Ile

Ser

Tyr

1780

1785

1790

Glu

Glu Asp

Gin

Arg

Gin

Gly

Ala

Glu

Pro Arg Lys

Asn

Phe

Val

Lys

1795

1800

1805

Pro

Asn Glu

Thr

Lys

Thr

Tyr

Phe

Trp

Lys Val Gin

His

Met

Ala

1810

1815

1820

Pro

Thr Lys

Asp

Glu

Phe

Asp

Cys

Lys

Ala Trp Ala

Tyr

Phe

Ser

Asp

1825

1830

1835

1840

PL 206 105 B1

Val

Asp

Leu

Glu

Lys 1845

Asp Val

His

Ser

Gly 185

Leu 0

Ile

Gly

Pro

Leu 1855

Leu

Val

Cys

His

Thr

Asn

Thr Leu

Asn

Pro

Ala

His

Gly

Arg

Gln

Val

Thr

1860

1865

1870

Val

Gln

Glu

Phe

Ala

Leu Phe

Phe

Thr

Ile

Phe

Asp

Glu

Thr

Lys

Ser

1875

1880

1885

Trp

Tyr

Phe

Thr

Glu

Asn Met

Glu

Arg

Asn

Cys

Arg

Ala

Pro

Cys

Asn

1890

1895

1900

Ile

Gln

Met

Glu

Asp

Pro Thr

Phe

Lys

Glu

Asn

Tyr

Arg

Phe

His

Ala

1905

1910

1915

1920

Ile

Asn

Gly

Tyr

Ile

Met Asp

Thr

Leu

Pro

Gly

Leu

Val

Met

Ala

Gln

1925

1930

1935

Asp

Gln

Arg

Ile

Arg

Trp Tyr

Leu

Ser

Met

Gly

Ser

Asn

Glu

Asn

1940

1945

1950

Ile

His

Ser

Ile

His

Phe Ser

Gly

His

Val

Phe

Thr

Val

Arg

Lys

1955

1960

1965

Glu

Tyr

Lys

Met

Ala Leu

Tyr

Asn

Leu

Tyr

Pro

Gly

Val

Phe

Glu

1970

1975

1980

Thr

Val

Glu

Met

Leu

Pro Ser

Lys

Ala

Gly

Ile

Trp

Arg

Val

Glu

Cys

1985

1990

1995

2000

Leu

Ile

Gly

Glu

His

Leu His

Ala

Gly

Met

Ser

Thr

Leu

Phe

Leu

Val

2005

2010

2015

Tyr

Ser

Asn

Lys

Cys

Gln Thr

Pro

Leu

Gly

Met

Ala

Ser

Gly

His

Ile

2020

2025

2030

Arg

Asp

Phe

Gln

Ile

Thr Ala

Ser

Gly

Gln

Tyr

Gly

Gln

Trp

Ala

Pro

2035

2040

2045

Lys

Leu

Ala

Arg

Leu

His Tyr

Ser

Gly

Ser

Ile

Asn

Ala

Trp

Ser

Thr

2050

2055

2060

Lys

Glu

Pro

Phe

Ser

Trp Ile

Lys

Val

Asp

Leu

Ala

Pro

Met

Ile

2065

2070

2075

2080

Ile

His

Gly

Ile

Lys

Thr Gln

Gly

Ala

Arg

Gln

Lys

Phe

Ser

Leu

2085

2090

2095

Tyr

Ile

Ser

Gln

Phe

Ile Ile

Met

Tyr

Ser

Leu

Asp

Gly

Lys

Trp

2100

2105

2110

Gln

Thr

Tyr

Arg

Gly

Asn Ser

Thr

Gly

Thr

Leu

Met

Val

Phe

Gly

2115

2120

2125

Asn

Val

Asp

Ser

Gly Ile

Lys

His

Asn

Ile

Phe

Asn

Pro

Ile

2130

2135

2140

Ile

Ala

Arg

Tyr

Ile

Arg Leu

His

Pro

Thr

His

Tyr

Ser

Ile

Arg

Ser

2145

2150

2155

2160

Thr

Leu

Arg

Met

Glu

Leu Met

Gly

Cys

Asp

Leu

Asn

Ser

Cys

Ser

Met

Ζ ΧΙΟ

Z1ZU

2120

Asn Val 2130

Asp

Ser

Gly Ile 2135

Lys

His

Asn

Ile Phe 2140

Asn

Pro

Ile

38

Ile Ala 2145

Arg

Tyr

Ile

Arg Leu 2150

His

Pro

Thr

His Tyr 2155

Ser

Ile

Arg

Ser 2160

Thr Leu

Arg

Met

Glu

Leu Met

Gly

Cys

Asp

Leu Asn

Ser

Cys

Ser

Met

	2165	2170	2175
Pro Leu	Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile	Ser Asp Ala	Gln Ile Thr Ala
	2180 2185		2190
Ser Ser	Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala	Thr Trp Ser	Pro Ser Lys Ala
2195 2200	2205
Arg Leu	His Leu Gln Gly Arg Ser Asn	Ala Trp Arg	Pro Gln Val Asn
2210	2215	2220
Asn Pro	Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp	Phe Gln Lys	Thr Met Lys Val
2225	2230	2235	2240
Thr Gly	Val Thr Thr Gln Gly Val Lys	Ser Leu Leu	Thr Ser Met Tyr
	2245	2250	2255
Val Lys	Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser	Gln Asp Gly	His Gln Trp Thr
	2260 2265		2270
Leu Phe	Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys	Val Phe Gln	Gly Asn Gln Asp
2275 2280	2285
Ser Phe	Thr Pro Val Val Asn Ser Leu	Asp Pro Pro	Leu Leu Thr Arg
2290	2295	2300
Tyr Leu	Arg Ile His Pro Gln Ser Trp	Val His Gln	Ile Ala Leu Arg
2305	2310	2315	2320
Met Glu	Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln	Asp Leu Tyr

2325 2330 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Sekwencja sztucznie wytworzona <220>

<223> Opis sekwencji sztucznie wytworzonej:

Starter oligonukleotydowy <400> 3 gtggattcat ctgggataaa acac 24 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Sekwencja sztucznie wytworzona <220>

<223> Opis sekwencji sztucznie wytworzonej:

Starter oligonukleotydowy <400> 4 aggagaccag gtggcaaaga tattggtaaa gtaggatga 39 <210> 5 <211> 39

PL 206 105 B1 <212> DNA <213> Sekwencja sztucznie wytworzona <220>

<223> Opis sekwencji sztucznie wytworzonej:

Starter oligonukleotydowy <400> 5 tgaaggagac caggtggcca acatattggt aaagtagga 39 <210> 6 <211> 39 <212> DNA <213> Sekwencja sztucznie wytworzona <220>

<223> Opis sekwencji sztucznie wytworzonej:

Starter oligonukleotydowy <400> 6 ccactctttt ggattattgg cctgaggtct ccaggcatt 39 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213> Sekwencja sztucznie wytworzona <220>

<223> Opis sekwencji sztucznie wytworzonej:

Starter oligonukleotydowy <400> 7 gtccacttgc agccactcct ctggattatt cacctgagg 39 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Sekwencja sztucznie wytworzona <220>

<223> Opis sekwencji sztucznie wytworzonej:

Starter oligonukleotydowy <400> 8 cttcacatac atgctggtga acagagattt tactccctg 39 <210> 9 <211> 39 <212> DNA <213> Sekwencja sztucznie wytworzona <220>

<223> Opis sekwencji sztucznie wytworzonej:

Starter oligonukleotydowy <400> 9 aggagaccag gtggccaaga tattggtaaa gtaggatga 39

PL 206 105 B1 <210> 10 <211> 45 <212> DNA <213> Sekwencja sztucznie wytworzona <220>

<223> Opis sekwencji sztucznie wytworzonej:

Starter oligonukleotydowy <400> 10 cacttgcagc cactcctctg gattattggc ctgaggtctc caggc 45 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztucznie wytworzona <220>

<223> Opis sekwencji sztucznie wytworzonej:

Starter oligonukleotydowy <400> 11 agtttttcta caacagagga a 21 <210> 12 <211> 39 <212> DNA <213> Sekwencja sztucznie wytworzona <220>

<223> Opis sekwencji sztucznie wytworzonej:

Starter oligonukleotydowy <400> 12 tcatcctact ttaccaatat ctttgccacc tggtctcct 39 <210> 13 <211> 39 <212> DNA <213> Sekwencja sztucznie wytworzona <220>

<223> Opis sekwencji sztucznie wytworzonej:

Starter oligonukleotydowy <400> 13 tcctacttta ccaatatgtt ggccacctgg tctccttca 39 <210> 14 <211> 39 <212> DNA <213> Sekwencja sztucznie wytworzona <220>

<223> Opis sekwencji sztucznie wytworzonej

PL 206 105 B1

Starter oligonukleotydowy <400> 14 aatgcctgga gacctcaggc caataatcca aaagagtgg 39 <210> 15 <211> 39 <212> DNA <213> Sekwencja sztucznie wytworzona <220>

<223> Opis sekwencji sztucznie wytworzonej:

Starter oligonukleotydowy <400> 15 cctcaggtga ataatccaga ggagtggctg caagtggac 39 <210> 16 <211> 39 <212> DNA <213> Sekwencja sztucznie wytworzona <220>

<223> Opis sekwencji sztucznie wytworzonej:

Starter oligonukleotydowy <400> 16 cagggagtaa aatctctgtt caccagcatg tatgtgaag 39 <210> 17 <211> 39 <212> DNA <213> Sekwencja sztucznie wytworzona <220>

<223> Opis sekwencji sztucznie wytworzonej: starter oligonukleotydowy <400> 17 tcatcctact ttaccaatat cttggccacc tggtctcct 39 <210> 18 <211> 45 <212> DNA <213> Sekwencja sztucznie wytworzona <220>

<223> Opis sekwencji sztucznie wytworzonej:

Starter oligonukleotydowy <400> 18 gcctggagac ctcaggccaa taatccagag gagtggctgc aagtg 45

Claims

1. Zmodyfikowany ludzki czynnik VIII, w którym metioninę w pozycji 2199 sekwencji nr 2 zastąpiono izoleucyną, zaś fenyloalaninę w pozycji 2200 sekwencji nr 2 zastąpiono leucyną, przy czym zmodyfikowany ludzki czynnik VIII ma obniżoną antygenowość i/lub immunogeniczność w porównaniu z odpowiadającym niezmodyfikowanym białkiem ludzkim.

2. Zmodyfikowany ludzki czynnik VIII według zastrz. 1, znamienny tym, że ma specyficzną aktywność większą od 2000 jednostek na miligram.

3. Zmodyfikowany ludzki czynnik VIII według zastrz. 1, znamienny tym, że ma specyficzną aktywność większą od 3000 jednostek na miligram.

4. Zmodyfikowany ludzki czynnik VIII według zastrz. 1, znamienny tym, że ma specyficzną aktywność większą od 5000 jednostek na miligram.

5. Zmodyfikowany ludzki czynnik VIII według zastrz. 1, znamienny tym, że ma specyficzną aktywność większą od 10000 jednostek na miligram.

6. Zmodyfikowany ludzki czynnik VIII, w którym walinę w pozycji 2223 sekwencji nr 2 zastąpiono alaniną, zaś lizynę w pozycji 2227 sekwencji nr 2 zastąpiono glutaminianem, przy czym zmodyfikowany ludzki czynnik VIII ma obniżoną antygenowość i/lub immunogeniczność w porównaniu z odpowiadającym niezmodyfikowanym białkiem ludzkim.

7. Zmodyfikowany ludzki czynnik VIII według zastrz. 6, znamienny tym, że ma specyficzną aktywność większą od 2000 jednostek na miligram.

8. Zmodyfikowany ludzki czynnik VIII według zastrz. 6, znamienny tym, że ma specyficzną aktywność większą od 3000 jednostek na miligram.

9. Zmodyfikowany ludzki czynnik VIII według zastrz. 6, znamienny tym, że ma specyficzną aktywność większą od 5000 jednostek na miligram.

10. Zmodyfikowany ludzki czynnik VIII według zastrz. 6, znamienny tym, że ma specyficzną aktywność większą od 10000 jednostek na miligram.

11. Zmodyfikowany ludzki czynnik VIII, w którym metioninę w pozycji 2199 sekwencji nr 2 zastąpiono izoleucyną, fenyloalaninę w pozycji 2200 sekwencji nr 2 zastąpiono leucyną, walinę w pozycji 2223 sekwencji nr 2 zastąpiono alaniną, zastąpienie lizynę w pozycji 2227 sekwencji nr 2 zastąpiono glutaminianem, przy czym zmodyfikowany ludzki czynnik VIII ma obniżoną antygenowość i/lub immunogeniczność w porównaniu z odpowiadającym niezmodyfikowanym białkiem ludzkim.

12. Zmodyfikowany ludzki czynnik VIII według zastrz. 11, znamienny tym, że ma specyficzną aktywność większą od 2000 jednostek na miligram.

13. Zmodyfikowany ludzki czynnik VIII według zastrz. 11, znamienny tym, że ma specyficzną aktywność większą od 3000 jednostek na miligram.

14. Zmodyfikowany ludzki czynnik VIII według zastrz. 11, znamienny tym, że ma specyficzną aktywność większą od 5000 jednostek na miligram.

15. Zmodyfikowany ludzki czynnik VIII według zastrz. 11, znamienny tym, że ma specyficzną aktywność większą od 10000 jednostek na miligram.

16. Sposób modyfikacji ludzkiego czynnika VIII ze zmniejszeniem reaktywności na przeciwciało hamujące i zachowaniem aktywności prokoagulacyjnej, znamienny tym, że w niezmodyfikowanym czynniku ludzkim VIII metioninę w pozycji 2199 sekwencji nr 2 zastępuje się izoleucyną, zaś fenyloalaninę w pozycji 2200 sekwencji nr 2 zastępuje się leucyną.

17. Sposób modyfikacji ludzkiego czynnika VIII ze zmniejszeniem reaktywności na przeciwciało hamujące i zachowaniem aktywności prokoagulacyjnej, znamienny tym, że w niezmodyfikowanym czynniku ludzkim VIII walinę w pozycji 2223 sekwencji nr 2 zastępuje się alaniną, zaś lizynę w pozycji 2227 sekwencji nr 2 zastępuje się glutaminianem.

18. Sposób modyfikacji ludzkiego czynnika VIII ze zmniejszeniem reaktywności na przeciwciało hamujące i zachowaniem aktywności prokoagulacyjnej, znamienny tym, że w niezmodyfikowanym czynniku ludzkim VIII metioninę w pozycji 2199 sekwencji nr 2 zastępuje się izoleucyną, fenyloalaninę w pozycji 2200 sekwencji nr 2 zastępuje się leucyną, walinę w pozycji 2223 sekwencji nr 2 zastępuje się alaniną, zastąpienie lizynę w pozycji 2227 sekwencji nr 2 zastępuje się glutaminianem.