CZ20023346A3

CZ20023346A3 - Modifikovaný faktor VIII a DNA, která ho kóduje

Info

Publication number: CZ20023346A3
Application number: CZ20023346A
Authority: CZ
Inventors: John S. Lollar
Original assignee: Emory University
Priority date: 2000-03-10
Filing date: 2001-02-16
Publication date: 2003-01-15
Also published as: PL202936B1; CA2400295C; YU68002A; US6458563B1; SK14392002A3; ES2304379T3; CY2016011I1; RU2002124123A; SK286205B6; NO20024296L; EP1280540A1; FR16C0016I1; NO2016007I2; WO2001068109A1; UA75064C2; NL300808I1; MEP8209A; EE200200510A; HUS1600020I1; IL151371A0

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká oblasti krevní koagulace, zejména faktoru VIII. Konkrétně se vynález týká modifikované formy prasečího faktoru VIII postrádající doménu B, DNA kódující tuto formu a jejich použití v lékařství.

Dosavadní stav techniky

Koagulace (srážení) krve začíná tím, že destičky adherují k ploše řezu v poraněné krevné cévě v místě léze. Následně se v kaskádě enzymaticky regulovaných reakcí rozpustné molekuly fibrinogenu za účasti enzymu trombinu přeměňují na nerozpustná vlákna fibrinu, která drží destičky pohromadě v trombu. V každém kroku této kaskády je proteinový prekurzor přeměňován na proteázu, která , že štěpí následující proteinový prekurzor v řadě. Ve většině kroků jsou nutné kofaktory.

Faktor VIII cirkuluje jako inaktivní prekurzor v krvi, těsně a nekovalentně vázaný na von Willebrandův faktor. Faktor VIII je proteolyticky aktivován trombinem nebo faktorem Xa, který ho disociuje od von Willebrandova faktoru a aktivuje jeho prokoagulační funkci v kaskádě. Ve své aktivní formě je proteinový faktor Vlila kofaktorem, který zvyšuje katalytickou účinnost faktoru IXa pro aktivaci faktoru X až o několik řádů.

Lidé s deficienci faktoru VIII nebo protilátkami proti faktoru VIII, kteří nejsou léčení faktorem VIII, trpí nekontrolovaným vnitřním krvácením, které může způsobovat řadu vážných symptomů, od zánětlivých reakcí v kloubech až po předčasné úmrtí. Těžcí hemofilici, kterých je jen V USA přibližně 10000, mohou být léčeni unfúzemi humánního faktoru VIII, které obnoví normální koagulační schopnost krve, pokud je léčení prováděno v dostatečné frekvenci a koncentraci. Klasická definice faktoru VIII je ve skutečnosti taková, že ho definuje jako látku přítomnou v normální krevní plazmě, která koriguje defekty koagulace v plazmě pocházející z jedinců s hemofilií A.

Vytváření protilátek (inhibitorů nebo inhibičních protilátek), které inhibují aktivitu faktoru VIII, je vážnou komplikací při léčení pacientů s hemofilií. Autoprotilátky se vyvíjejí přibližně u 20 % pacientů s hemofilií A v reakci na terapeutickou infúzi faktoru VIII. U dříve neléčených pacientů s hemofilií A, kteří tvoří inhibiční, se obvykle inhibitor vyvine v průběhu jednoho roku léčení. Navíc autoprotilátky, které inaktivují faktor VIII, se příležitostně vyvíjejí i u jedinců s dříve normální hladinou faktoru VIII. Když je titr inhibitorů dostatečně nízký, pacient může být

Avšak často je být překonán ani je obejít potřebu • · · · « · · * • · · · i · · · • « · ·

- 3 léčen zvyšujícími se dávkami faktoru VIII. titr inhibitoru tak vysoký, že nemůže faktorem VIII. Alternativní strategií proto faktoru VIII v průběhu normální hemostázy užitím komplexních přípravků faktoru IX (například KONYNE®, Proplex®) nebo rekombinantního humánního faktoru Vila. Navíc jelikož prasečí faktor VIII má obvykle podstatně nižší reaktivitu s inhibiční než humánní faktor VIII, byl užit i přípravek částečně purifikovaného prasečího faktoru VIII (HYATE:C®). Mnoho pacientů, u kterých se vyvinuly inhibiční protilátky k humánnímu faktoru VIII bylo úspěšně léčeno prasečím faktorem VIII a tolerovalo toto léčení po dlouhou dobu. Avšak podávání prasečího faktoru VIII není úplným řešením, neboť se u některých pacientů po jedné nebo více infúzích vyvinou protilátky proti prasečímu faktoru VIII.

Několik přípravků humánního, z plazmy pocházejícího faktoru VIII s různým stupněm čistoty je dostupných komerčně pro léčení hemofilie A. Patří k nim také částečně purifikovaný faktor VIII pocházející ze sloučené krve mnoha dárců, která byla protivirově ošetřena působením tepla a detergentů, avšak obsahuje významnou hladinu antigenních proteinů, faktor VIII purifikovaný pomocí monoklonálních protilátek, který má nižší hladinu antigenních nečistot a virové kontaminace, a rekombinantní humánní faktor VIII, který je zatím ve stádiu klinických zkoušek. Naneštěstí humánní faktor VIII je nestabilní za fyziologických koncentrací a pH, je přítomen v krvi v mimořádně nízké koncentraci (0,2 pg/ml plazmy) a má velmi nízkou specifickou koagulační aktivitu. Obavy ve zdravotnictví týkající se rizika virové infekce nebo jiné krví přenášené kontaminace omezují užitečnost prasečího faktoru VIII purifikovaného z prasečí krve.

• · • · » · ♦·· ·

Hemofilici vyžadují denní doplňování faktoru VIII pro prevenci krvácení a v důsledku toho vznikající deformující hemofilní artropatie. Avšak dodávka je nedostatečná a terapeutické užití je problematické z důvodu obtížné izolace, imunogenicity, a také nutnosti odstranit riziko infekcí AIDS a hepatitidy. Ani použití rekombinantního humánního faktoru VIII nebo částečně purifikovaného prasečího faktoru VIII neřeší všechny výše uvedené problémy.

Problémy spojené s obecně užívaným, komerčně dostupným faktorem VIII pocházejícím z plazmy, stimulovaly významně zájem na vývoji lepšího přípravku faktoru VIII. Existuje potřeba účinnějšího faktoru VIII, aby jednou molekulou mohlo být podáno více jednotek jednotek koagulační aktivity, stabilnějšího faktoru VIII, jehož molekula je stabilní ve vybraném pH a fyziologické koncentraci, faktoru VIII, jehož molekula je méně náchylná k tomu, aby vyvolávala tvorbu inhibičních protilátek, a nakonec faktor VIII, jehož molekula unikne imunitní detekci (rozpoznání) v organizmu pacienta, který již získal protilátky proti humánnímu faktoru VIII..

Proto bylo cílem vynálezu poskytnout faktor VIII, který léčí hemofilii u pacientů s deficitem faktoru VIII nebo s inhibiční humánního faktoru VIII.

Dalším cílem vynálezu bylo poskytnout způsoby léčení hemofiliků.

Ještě dalším cílem vynálezu bylo poskytnout faktor VIII, který je stabilní při vybraném pH a fyziologických koncentracích.

Ještě dalším cílem vynálezu bylo poskytnout faktor VIII, který má větší koagulační aktivitu než humánní faktor VIII.

A ještě dalším cílem vynálezu bylo poskytnout faktor VIII,

- 5 proti kterému se bude tvořit méně protilátek.

A ještě dalším cílem vynálezu bylo poskytnout způsob výroby rekombinantního prasečího faktoru VIII a zejména specificky modifikovaného prasečího faktoru VIII.

Podstata vynálezu

Určení celé DNA sekvence kódující prasečí faktor VIII, která je zde uvedena v seznamu sekvencí, umožnilo poprvé syntézu úplného prasečího faktoru VIII užitím exprese DNA kódující prasečí faktor VIII ve vhodných hostitelských buňkách. Purifíkovaný rekombinantní prasečí faktor VIII je proto jedním aspektem předkládaného vynálezu. DNA kódující každou z domén prasečího faktoru VIII stejně tak jako specifický fragment mohou být obdobně dále prasečí faktor VIII (fVIII) mající jakýkoliv jeho exprimovány. A deletovanou (odstraněnou) část nebo celou doménu B (prasečí fVIII bez domény B) je dále poskytnut podle předkládaného vynálezu, a sice tím, že se exprimuje DNA kódující prasečí fVIII mající deleci jednoho nebo více kodonů v B doméně.

Předkládaný vynález dále poskytuje farmaceutické přípravky k léčení pacientů trpících deficiencí faktoru VIII a týká se léčení těchto pacientů tím, že se podává rekombinantní prasečí faktor VIII nebo modifikovaný rekombinantní prasečí faktor VIII, zejména prasečí faktor VIII postrádající doménu B.

Popis obrázků

Obrázky 1A-1H dohromady poskytují srovnání přiřazených sekvencí nukleové kyseliny humánního, prasečího a myšího faktoru faktoru VIII.

Podrobný popis vynálezu

Pokud není uvedeno jinak, zde užívaný termín faktor VIII označuje jakoukoliv funkční molekulu proteinu faktoru VIII z jakéhokoliv savce.

Termín savčí faktor VIII, jak je zde užíván, zahrnuje faktor VIII, jehož aminokyselinová sekvence je odvozena z jakéhokoliv savce kromě člověka, pokud není konkrétně uvedeno jinak. Termín zvíře nebo živočich zde označuje např. prase a další savce s výjimkou člověka.

Termín fúzní protein nebo fúzní faktor VIII nebo jeho fragment v předkládaném popisu označuje produkt hybridního genu, kde kódující sekvence jednoho proteinu je změněna, například spojením s částí kódující sekvence druhého proteinu z jiného genu ve správném čtecí rámci, takže dochází k nepřerušené transkripci a translaci spojených segmentů, takže vzniká hybrid gen kódující fúzní protein.

Termín odpovídající nukleová kyselina nebo aminokyselina, nebo jejich sekvence, označují nukleovou kyselinu nebo aminokyselinu přítomnou v místě molekuly faktoru VIII nebo jejího fragmentu, které má stejnou strukturu a/ nebo funkci jako místo molekuly faktoru VIII jiného biologického druhu, i když počet baží nukleových kyselin nebo aminokyselin nemusí být identický. DNA sekvence odpovídající jiné sekvenci faktoru VIII v podstatě odpovídá takové sekvenci a hybridizuje s takto označenou sekvencí za stringentních podmínek. DNA sekvence odpovídající VIII také zahrnuje sekvenci, která faktoru VIII nebo jeho fragmentu jiné sekvenci faktoru je výsledkem exprese a hybridizovala by z označenou sekvencí nebýt redundance genetického kódu.

Termín jedinečný aminokyselinový zbytek nebo sekvence označují jakýkoliv aminokyselinový zbytek nebo jakoukoliv sekvenci v molekule faktoru VIII jednoho biologického druhu, která je odlišná od homologického zbytku nebo sekvence molekuly faktoru VIII jiného biologického druhu.

Termín specifická aktivita jak se zde užívá, se týká aktivity, která napraví defekt koagulace v humánní plazmě deficientní na faktor VIII. Specifická aktivita je měřena v jednotkách srážlivé aktivity na jeden miligram celkového proteinu faktoru VIII ve standardním testu, kdy je koagulační čas humánní plazmy deficientní na faktor VIII srovnáván s normální humánní plazmou. Jedna jednotka aktivity faktoru VIII je aktivita přítomná v jednom mililitru normální humánní plazmy. V tomto testu čím kratší čas je potřebný pro vytvoření trombu, tím větší je aktivita testovaného faktoru VIII. Prasečí faktor VIII projevuje koagulační aktivitu v testu na humánní faktor VIII.

Termín exprese se týká souboru procesů, ke kterým dochází, když se užívá genetické informace k tomu, aby DNA kódující aminokyselinovou sekvenci poskytla prasečího produkt.

faktoru

VIII může být exprimována v savčí hostitelské buňce, aby poskytla protein - prasečí faktor VIII. Materiály, genetické struktury, hostitelské buňky a podmínky, které umožňují expresi dané DNA sekvence jsou odborníkům dobře známy, a mohou být upraveny tak, aby se ovlivnila doba a množství exprese, stejně jako intra- nebo extracelulární lokalizace exprimovaného proteinu. Například po vložení DNA « · » ♦ • · · · r · · · * · * · kódující signální peptid na 5' konec DNA kódující prasečí faktor VIII (5' konec je konvencí konec DNA kódující NH₂ konec proteinu) je exprimovaný protein exportován z vnitřku hostitelské buňky do kultivačního média. Vytvoření kombinace DNA kódující signální peptid s DNA kódující prasečí faktor VIII je výhodné, protože exprimovaný faktor VIII je exportován do kultivačního média, což zjednodušuje proces purifikace.

Výhodný signální VIII.	peptid je	signální peptid	savčího	faktoru
Nukleotidová	sekvence	cDNA humánního	faktoru	VIII a
predikovaná aminokyselinová	sekvence jsou	zde v	' seznamu
sekvencí uvedeny	jako SEKVENCE ID. Č. 1	a 2, v	uvedeném

pořadí. Faktor VIII je syntetizován jako přibližně 300 kDa jednořetězcový protein s vnitřní sekvenční homologií, která definuje doménovou sekvenci NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOH. V molekule faktoru VIII termín doména označuje souvislou sekvenci aminokyselin, která je definovaná interní aminokyselinovou sekvenční identitou a místy proteolytického štěpení trombinem. Pokud není uvedeno jinak, domény faktoru VIII zahrnují následující aminokyselinové zbytky, když jsou přiřazeny (aligned) s humánní aminokyselinovou sekvencí (SEKVENCE ID. Č. 2): AI, zbytky Alal - Arg372; A2, zbytky Ser373 - Arg740; B, zbytky Ser741-Argl648; A3, zbytky Serl690 - Ile2032; Cl, zbytky Arg2033 - Asn2172; C2, zbytky Ser2173 - Tyr2332. Sekvence A3-C1-C2 zahrnuje zbytky Serl690 - Tyr2332. Zbývající segment, zahrnující zbytky Glul649 - Argl689, je obvykle označován aktivační peptid lehkého řetězce faktoru VIII. Faktor VIII je proteolyticky aktivován trombinem nebo faktorem Xa, který ho disociuje od von Willebrandova faktoru, vytváří se tak faktor Vlila, který má prokoagulační funkci. Biologická funkce faktoru Vlila je zvyšovat katalytickou účinnost faktoru IXa vůči aktivaci

faktoru X až o několik řádů. Trombinem aktivovaný faktor Vlila je 160 kDa velký heterotrimer A1/A2/A3-C1-C2, který vytváří komplex s faktorem IXa a faktorem X na povrchu destiček nebo monocytů. Částečná doména zde v textu označuje souvislou sekvence aminokyselin tvořící část domény.

Podjednotky humánního nebo zvířecího faktoru VIII označují těžké a lehké proteinové řetězce. Těžký řetězec faktoru VIII obsahuje tři domény, Al, A2 a B. Lehký řetězec faktoru VIII také obsahuje tři domény, a sice A3, Cl a C2.

Termíny epitop, antigenní místo a antigenní determinanta jsou zde textu užívány jako synonyma a jsou definovány jako část humánního nebo zvířecího faktoru VIII, nebo fragment, které jsou specificky rozpoznávány protilátkou. Může sestávat z libovolného počtu aminokyselinových zbytků a může záviset na primární, sekundární nebo terciární struktuře proteinu.

Termín imunogenní místo je zde v textu definován jako úsek humánního nebo zvířecího faktoru VIII, nebo jeho fragmentu, který specificky vyvolává tvorbu protilátek proti faktoru VIII, nebo fragment, u člověka nebo zvířete, který je detekován (měřen) rutinním postupem, jako je např. imunotest, např. ELISA nebo tzv. Bethesda test, popsaný zde. Může sestávat z libovolného počtu aminokyselinových zbytků a může záviset na primární, sekundární nebo terciární struktuře proteinu. V některých provedeních vynálezu není hybridní nebo hybridní ekvivalentní faktor VIII nebo jeho fragment imunogenní nebo je méně imunogenní ve zvířeti nebo v člověku než humánní nebo prasečí faktor VIII.

Deficit (deficience) faktoru VIII a případně nedostatek faktoru VIII označují nedostatek koagulační aktivity způsobeny tvorbou defektního faktoru VIII, • » » · ·· » · * * *

I · · · «·

- 10 nedostatečnou nebo nulovou tvorbou faktoru VIII, nebo částečnou nebo úplnou inhibicí faktoru VIII vlivem inhibitorů. Hemofilie A je typ deficitu faktoru VIII, který je důsledkem defektu na X-vázaném genu a absence nebo nedostatku proteinu, který gen kóduje, tj. faktoru VIII.

Termin diagnostický test se týká všech testů, které nějakým způsobem využívají interakce antigenu s protilátkou pro detekci a/ nebo kvantifikaci množství sledované protilátky, která je přítomna v testovaném vzorku, jako pomoc při stanovení vhodné terapie. Odborníkům je známa celá řada takových testů. Je zřejmé, že humánní, prasečí nebo modifikovaný prasečí faktor VIII DNA nebo její fragment a nebo z nich exprimovaný protein, celý nebo jeho část, může být využit k nahrazení odpovídající reagencie ve známých testech, takže pak takto modifikovaný test může být použit k detekci a/nebo kvantifikaci protilátek proti faktoru VIII. Je to právě použití těchto reagencií, DNA faktoru VIII nebo jejího fragmentu nebo z nich exprimovaného proteinu, co dovoluje modifikovat známé testy, aby byly vhodné pro detekci protilátek proti humánnímu nebo zvířecímu faktoru VIII. K takovým testům patří, aniž by výčet byl omezující, ELISA testy, imunodifúzní testy a imunopřenosové testy (imunobloty). Vhodné postupy pro realizaci těchto testů jsou odborníkům dobře známy. Faktor VIII nebo jeho fragment. Který obsahuje al jeden epitop proteinu, může být použit jako diagnostická reagencie. K příkladům dalších testů, kde se může využít humánní, prasečí nebo modifikovaný prasečí faktor VIII nebo jeho fragment, je Bethesda test a antikoagulační test.

Termín DNA kódující protein, jako prasečí faktor VIII znamená polydeoxynukleovou kyselinu, jejíž nukleotidová sekvence představuje kódující informaci pro hostitelskou buňku « · « *

- 11 pro expresi aminokyselinové sekvence proteinu, tedy např. prasečího faktoru VIII, v souladu se známými vztahy genetického kódu.

Termín expresní produkt DNA kódující humánní nebo zvířecí faktor VIII nebo modifikovaný faktor VIII je produkt získaný expresí příslušné DNA ve vhodné hostitelské buňce, přičemž exprese zahrnuje takové i takové pre- nebo posttranslační modifikace proteinu kódovaného příslušnou DNA, jako je, aniž by však výčet byl omezující, glykosylace, proteolytické štěpení apod. Odborníkům je známo, že k takovým modifikacím dochází a mohou se mírně lišit v závislosti na typu hostitelské buňky a dalších faktorech, a v jejich důsledku dochází ke vzniku molekulárních isoforem produktu, který si však uchovává prokoagulační aktivitu. Viz např. publikace Lind, P. et al., Eur. J. Biochem. 232:1927 (1995), zahrnuta formou odkazu.

Termín expresní vektor označuje DNA element, často s kruhovou strukturou, který má schopnost autonomně se replikovat v požadované hostitelské buňce nebo integrovat se do genomu hostitelské buňky, a také má určité, odborníkům dobře známé, rysy, které umožňují expresi kódující DNA, která byla vložena do sekvence vektoru ve vhodném místě a ve vhodné orientaci. K těmto rysům patří, avšak bez omezení, přítomnost promotorové sekvence pro řízení iniciace transkripce kódující DNA a také další DNA elementy jako jsou např. enhancery, polyadenylační místa apod., což vše je odborníkům dobře známo. Termín expresní vektor se užívá k označení jak vektorů, které mají DNA kódující sekvenci, která má být exprimována, vloženou do své sekvence, tak i vektorů, které mají potřebné elementy pro kontrolu exprese vzhledem k místu inzerce uspořádány tak, že mohou sloužit pro expresi jakékoliv

- 12 sekvence DNA vložené do tohoto místa inzerce, což vše je v oboru dobře známo. Tak například vektor postrádající promotor se může stát expresním vektorem tak, že se do něho vloží promotor kombinovaný s kódující DNA.

Obecný popis metod

Patent USA č. 5,364,771 popsal objev molekuly hybridního humánního/prasečího faktoru VIII, která měla koagulační aktivitu, ve které byly elementy molekuly faktoru VIII jiných biologických druhů nahrazeny odpovídajícími elementy humánního nebo prasečího faktoru VIII. Patent USA č. 5,663,060 popsal prokoagulační hybridní humánní/zvířecí a hybridní ekvivalentní molekuly faktoru VIII, kde elementy v molekule faktoru VIII jednoho biologického druhu byly nahrazeny elementy molekuly faktoru VII jiného biologického druhu.

Jelikož současné informace naznačují, že B doména nemá žádný inhibiční epitop a nemá žádný známý účinek na funkci faktoru VIII, v některých provedeních vynálezu je B doména, celá nebo alespoň její část, deletována v aktivní hybridní molekule nebo hybridní ekvivalentní molekule faktoru VIII nebo jejich fragmentech (B(—) faktor VIII”), připravených kteroukoliv z metod zde popsaných.

Gen pro humánní faktor VIII byl izolován a exprimován savčích buňkách, jak publikovali Toole, J.J. et al. (1984) Nátuře 312:342-347 (Genetics Institute); Gitschier, J. et al. (1984) Nátuře 312:326-330 (Genentech); Wood, W.I. et al. (1984) Nátuře 312:330-337 (Genentech); Vehar, G.A. et al. (1984) Nátuře 312:337-342 (Genentech); WO 87/04187; WO 88/08035; WO 88/03558; Patent USA č. 4,757,006, a aminokyselinová sekvence byla dedukována z cDNA. Patent USA č. 4,965,199 (Capon et al.) popsal metodu rekombinantní DNA

- 13 pro přípravu faktoru VIII v savčích hostitelských buňkách a purifikaci humánního faktoru VIII. Byla také popsána exprese humánního faktoru VIII v buňkách CHO (ovária čínského křečka, Chinese hamster ovary) a buňkách BHKC (ledvinné buňky novorozených křečků, baby hamster kidney cells). Humánní faktor VIII byl modifikován tím, že byla odstraněna B doména, buďto celá nebo její část (Patent USA č. 4,868,112), a bylo vyzkoušeno nahrazení B domény humánního faktoru VIII B doménou humánního faktoru V (Patent USA č. 5,004,803). cDNA sekvence kódující humánní faktor VIII a predikovaná aminokyselinová sekvence jsou zde uvedeny v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID. Č. 1 a SEKVENCE ID. Č. 2, v uvedeném pořadí. V SEKVENCI ID. Č. 1 začíná kódující úsek nukleotidem v poloze 208, přičemž triplet GCC je kodonem pro aminokyselinu číslo 1 (Ala) zralého proteinu, který je uveden jako SEKVENCE ID. Č. 2.

Prasečí faktor VIII byl izolován z plazmy [Fass, D.N. et al. (1982) Blood 59:594]. Částečná aminokyselinová sekvence prasečího faktoru VIII odpovídající úsekům N-konce lehkého řetězce mající homologii s ceruloplasminem a koagulačním faktorem V byla popsána v publikaci Church et al. (1984) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81:6934. Toole, J.J. et al. (1984) Nátuře. 312:342-347 popsal částečné sekvencování N-koncové části čtyř aminokyselinových fragmentů prasečího faktoru VIII, avšak necharakterizoval fragmenty vzhledem k jejich pozici v molekule faktoru VIII. Aminokyselinová sekvence B domény a části A2 domény prasečího faktoru VIII byly popsány v publikaci Toole, J.J. et al. (1986) Proč. Nati. Acad. Sci, USA 81:5939-5942. cDNA sekvence kódující úplnou A2 doménu prasečího faktoru VIII a predikovaná aminokyselinová sekvence, a také hybridní humánní/prasečí faktor VIII mající substituce všech domén, všech podjednotek, a specifických aminokyselinových sekvencí, byly popsány patentu USA ·· ♦« • · ·· • · · · *

Μ ♦·

«· t

č. 5,364,771 nazvaném Hybridní humánní/prasečí faktor VIII, který byl udělen 15 listopadu 1994, a také v mezinárodní přihlášce 93/20093 zveřejněné 14. Října 1993. cDNA sekvence kódující A2 doménu prasečího faktoru VIII odpovídající aminokyselinovým zbytkům 373-740 zralého humánního faktoru VIII, jak je uveden v SEKVENCI ID. Č. 1, a predikovaná aminokyselinová sekvence jsou uvedeny jako SEKVENCE ID. Č. 3 a 4. Nedávno byla nukleotidová sekvence a odpovídající aminokyselinová sekvence části AI domény postrádající prvních 198 aminokyselin, a A2 domény prasečího faktoru VIII byly popsány v mezinárodní přihlášce WO 94/11503, zveřejněné 26. Května 1994. Celá nukleotidová sekvence kódující prasečí faktor VIII, včetně úplné AI domény, aktivačního peptidu, domén A3, Cl a C2, a také kódovaná aminokyselinová sekvence, byly nakonec získány a popsány Lollarem v patentu USA č. 5,859,204, uděleném 12. ledna 1999, a také v mezinárodní přihlášce WO 97/49725, zveřejněné 31. prosince 1997, přičemž obě publikace jsou zde zahrnuty formou odkazu.

Jak prasečí tak i humánní faktor VIII byl izolován z plazmy jako protein složený ze dvou podjednotek. Podjednotky, známé jako těžký řetězec a lehký řetězec, jsou drženy pohromadě nekovalentní vazbou, která vyžaduje kalcium nebo jiný divalentní kovový iont. Těžký řetězec faktoru VIII obsahuje tři domény, AI, A2, a B, které jsou spojeny kovalentně. Lehký řetězec faktoru VIII také obsahuje tři domény, označené A3, Cl a C2. B doména nemá žádnou známou biologickou funkci a může být tedy odstraněna, celá nebo její část, z molekuly proteolyticky nebo metodami rekombinantní DNA, aniž by se významně změnil jakýkoliv měřitelný parametr faktoru VIII. Humánní rekombinantní faktor VIII má podobnou strukturu a funkci jako faktor VIII pocházející z plazmy, i když není glykosylován, pokud není exprimován savčích

- 15 Μ 9«

9 9 ♦ · 9«

9 « 9 9 · 9 ·

99 «

· 9 99 9 buňkách.

Jak humánní tak i prasečí aktivovaný faktor VIII (faktor Vlila) má tři podjednotky, a to díky štěpení těžkého řetězce AI a A2. Tato struktura je označena jako mezi doménami A1/A2/A3-C1-C2 v podmínkách,

Vlila není stabilní prasečí faktor Vlila,

Humánní faktor které stabilizují pravděpodobně proto, že je slabší asociace A2 podjednotky humánního faktoru Vlila. Disociace A2 podjednotky humánního a prasečího faktoru Vlila je spojena se ztrátou aktivity molekuly faktoru Vlila. Yakhyaev, A. et al. ((1997) Blood 90:Suppl. 1, Abstract #126) popsali vazbu A2 domény proteinem lipoproteinu s nízkou hustotou (low receptor-related protein), což vede k domněnce, že A2 vazbou zprostředkovaný buněčný příjem působí k utlumení (down regulaci) aktivity faktoru VIII.

příbuzným receptoru density lipoprotein

Exprese faktoru VIII postrádajícího B doménu je zesilována vložením části B domény. Vložení části B domény označené SQ vedlo, jak bylo publikováno [Lind, P. et al. (1995) supra], k příznivé expresi. SQ konstrukt postrádá celou humánní B doménu s výjimkou 5 aminokyselin N_konce B domény a 9 aminokyselin C-konce B domény.

Purifikovaný hybridní faktor VIII nebo jeho fragment proto mohou být testovány na imunoreaktivitu a koagulační aktivitu ve standardních testech, ke kterým patří například test s plazmou bez faktoru VIII, jednofázový koagulační test a ELISA test s využitím purifikovaného rekombinantního humánního faktoru VIII jako standardu.

Další vektory, které zahrnují jak plazmidy tak i eukaryotické virové vektory, mohou být využity pro expresi rekombinantního genového konstruktu v eukaryotických buňkách v závislosti na požadavcích a posouzení odborníka (viz např.

*· ·<

• · · · • · ·· « · · · ♦ « · · · «· ·· ·* ···♦

- 16 Sambrook et al., kapitola 16). K dalším vektorům a expresním systémům, které mohou být užity, patří také bakteriální a kvasinkové systémy a systém hmyzích buněk, avšak nejsou výhodné, neboť poskytují odlišnou glykosylaci nebo ji zcela postrádají.

Protein rekombinantního faktoru VIII může být exprimován v celé řadě různých buněk obecně užívaných pro kultivace a expresi rekombinantních savčích proteinů. Zejména byla nelezena řada vhodných buněčných linií hlodavců, které jsou zvláště užitečnými hostitelskými systémy pro expresi velkých proteinů.

Výhodné buněčné linie, které lze získat z Americké sbírky mikroorganismů (American Type Culture Collection, Rockville, MD) jsou především ledvinné buňky novorozených křečků (BHK) a buňky ovarií čínského křečka (CHO), které se kultivují rutinním způsobem ve známých kultivačních médiích.

Základní příčinou vyšší koagulační aktivity prasečího faktoru VIII se zdá být rychlejší spontánní disociace humánní A2 podjednotky od humánního faktoru Vlila než prasečí A2 podjednotky od prasečího faktoru Vlila. Disociace A2 podjednotky vede ke ztrátě aktivity (Lollar, P. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:1688-1692; Lollar, P. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:23652 23657; Fay, P.J. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:13246-13250).

Molekuly faktoru VIII se sníženou imunoreaktivitou

Epitopy, které jsou imunoreaktivní s protilátkami, které inhibují koagulační aktivitu faktoru VIII (inhibitory nebo inhibiční protilátky), byly charakterizovány na základě známých vztahů struktura-funkce faktoru VIII. Inhibitory v · · » · · · ·« ·<

• ·

»· ·· • » · • · ♦ • * · • * * «· ····

- 17 nejspíše působí tím, že poruší některou z makromolekulárních interakcí spojených s doménovou strukturou faktoru VIII nebo s jeho navázáním na von Willebrandův faktor, trombin, faktor Xa, faktor IXa, nebo faktor X. Avšak většina inhibičních protilátek k humánnímu faktoru VIII působí tím, že se naváže na epitopy lokalizované na 40 kDa A2 doméně nebo 20 kDa C2 doméně faktoru VIII, a tím naruší specifické funkce spojené s těmito domény, jak to předpokládali Fulcher et al. (1985 Proč. Nati. Acad. Sci USA 82:7728-7732; a Scandella et al. (1988) Proč. Nati. Acad. Sci. USA . 85:6152-6156. Navíc k A2 a C2 epitopům, může zde být ještě třetí epitop v A3 nebo Cl doméně lehkého řetězce faktoru VIII, podle publikace Scandella et al. (1993) Blood 82:1767-1775. Význam domnělého třetího epitopu je neznámý, ale mohl by být zodpovědný za malou frakci epitopové reaktivity faktoru VIII.

Anti-A2 protilátky blokují aktivaci faktoru X, jak ukázali Lollar et al. (1994) J. Clin. Invest. 93:2497-2504. Předchozí mapovací studie deleční mutagenezí, popsané v Ware et al. (1992) Blood Coagul. Fibrinolysis 3:703-716, lokalizovaly A2 epitop do 20 kDa úseku NH2 koncového úseku 40 kDa A2 domény. Kompetiční imunoradiometrické testy ukázaly, že A2 inhibitory rozpoznávají buďto společný epitop nebo úzce nahloučené epitopy, jako popsali Scandella et al. (1992) Throm. Haemostas 67:665-671, a jak je také ukázáno v patentu USA č. 5,859,204.

Zvířecí nebo modifikované zvířecí molekuly faktoru VIII mohou být testovány u lidí na sníženou antigenicitu a/nebo imunogenicitu v příslušných klinických zkouškách. V jednom typu klinických zkoušek, navržených ke zjištění toho, zda je faktor VIII imunoreaktivní s inhibičními protilátkami, se faktor VIII podává, výhodně intravenózní infúzí, přibližně 25 »· ·· • * · · ♦ · ·· * * · · ♦ · · · ·» ·· « »· ♦» ·· ♦♦ · · · 1 · » ♦ · · · ' »···»* · • · · * · · .

Přibližně (zotavení) pacientům, kteří trpí deficitem faktoru VIII a mají protilátky, které inhibují koagulační aktivitu terapeutického humánního faktoru VIII. Dávky zvířecího nebo modifikovaného zvířecího faktoru VIII jsou v rozmezí 5 až 50 jednotek/kg tělesné hmotnosti, výhodně 10 až 50 jednotek/kg tělesné hmotnosti, a nejvýhodněji 40 jednotek/kg tělesné hmotnosti.

hodinu po každém podání je nové ustavení hladiny faktoru VIII ve vzorcích krve měřeno jednofázovým koagulačním testem. Vzorky se odebírají přibližně 5 hodin po infúzi, a měří se faktor VIII. Celkové hladina a rychlost vymizení faktoru VIII ve vzorcích jsou slouží pro předpověď titru protilátky a inhibiční aktivity. Jestliže je titr protilátky vysoký, zotavení hladiny faktoru VIII nelze změřit. Výsledky měření se srovnávají s výsledky získanými s pacienty, kteří byli léčeni humánním faktorem VIII pocházejícím z plazmy, prasečím faktorem VIII a nebo jinou obecně užívanou terapeutickou formou faktoru VIII nebo substituentu faktoru VIII.

Po identifikaci klinicky významných epitopů mohou být exprimovány takové rekombinantní molekuly faktoru VIII, které vykazují menší nebo stejnou zkříženou reaktivitu ve srovnání s prasečím faktorem VIII pocházejícím z plazmy, když jsou testovány v vitro proti celému spektru plazmy s inhibitory. Dodatečná mutageneze v úsecích epitopů může být provedena s cílem redukovat zkříženou reaktivitu. Snížená zkřížená reaktivita, přestože je žádoucí, není nezbytná k přípravě výsledného produktu, který i tak může mít výhody ve srovnání s existujícími koncentráty prasečího faktoru VIII získaného z plazmy, které mají řadu nežádoucích vedlejších příznaků v důsledku kontaminace prasečími proteiny nebo kontaminace infekčními agens jako jsou viry nebo priony. Rekombinantní prasečí nebo modifikovaný prasečí faktor VIII neobsahuje « · ·♦ • « · · »· ·· • ♦ · • ♦ ♦ • · ♦ • · · ·· ··*· cizorodé prasečí proteiny.

Diagnostické testy cDNA faktoru VIII a/nebo protein z ní exprimovaný, buďto celé nebo jejich části, mohou být použity v testech jakožto diagnostické reagencie pro detekci inhibičních protilátek proti humánnímu nebo zvířecímu faktoru VIII nebo modifikovanému zvířecímu faktoru VIII v substrátech, ke kterým patří zejména sérum a tělní tekutiny pacientů trpících deficitem faktoru VIII. K takovým protilátkovým testům patří zejména ELISA testy, imunobloty, radioimunotesty, imunodifúzní testy, a testy biologické aktivity faktoru VIII (např. koagulační test). Techniky pro přípravu těchto reagencií a metody jejich použití jsou odborníkům dobře známy Tak například imunotest pro detekci inhibičních protilátek ve vzorku séra pacienta může zahrnovat kroky, kdy se nechá reagovat testovaný vzorek s dostatečným množstvím testovaného faktoru VIII, a když se vytvoří s inhibičními protilátkami detekovatelný komplex, testovaný faktor VIII je skutečně antigenní.

Sondy nukleových kyselin a aminokyselin mohou být připraveny na základě sekvencí cDNA hybridního faktoru VIII nebo proteinu nebo jejich fragmentů. V některých provedeních vynálezu mohou být tyto sondy označeny, buďto užitím barviva nebo enzymaticky, fluorescenčními, chemiluminescenčními nebo radioaktivními značkami, které jsou komerčně dostupné. Aminokyselinové sondy mohou být užity pro screening například séra nebo jiných tělních tekutin podezřelých z přítomnosti inhibitorů humánního, zvířecího nebo hybridního humánního/zvířecího faktoru VIII. Hladiny inhibitorů mohou být kvantifikovány u pacientů a srovnány se zdravými kontrolami, a «· ·· • · ♦ ♦ • * · · · • · « · ·♦ »♦ * * · « « ♦ • * · » · · «· »···

- 20 mohou být užity například ke stanovení, zda pacient s deficitem faktoru VIII může být léčen zvířecím nebo modifikovaným zvířecím faktorem VIII. cDNA sondy mohou být použity například ve výzkumu pro screening DNA knihoven.

Farmaceutické přípravky

Farmaceutické přípravky obsahující rekombinantní prasečí nebo modifikovaný prasečí faktor VIII, samotný nebo v kombinaci s vhodnými farmaceutickými stabilizujícími látkami, nosiči nebo prostředky pro podávání (vehikuly), mohou být připraveny odborníkům známými metodami, např. jak byly popsány v příručce Remington's Pharmaceutical Science (E. W. Martin).

V jednom výhodném provedení jsou vhodnými nosiči nebo prostředky pro podávání intravenózní infúzí fyziologický roztok soli nebo roztok soli pufrovaný fosfátem.

V jiném výhodném provedení je vhodným stabilizátorem, nosičem nebo prostředkem pro podávání, aniž by byl omezující, humánní nebo zvířecí protein jako je např. albumin.

například kompozice vytvářejí a obsahují nebo jiné které společně

Fosfolipidové vezikuly nebo lipozomové suspenze jsou také výhodnými farmaceuticky přijatelnými nosiči nebo prostředky pro podávání. Lze je připravit standardními postupy, které jsou odborníkům známy, fosfatidylserin/fosfatidylcholin fosfolipidů nebo detergnetů, negativní náboj na povrchu, jelikož faktor VIII se váže na negativně nabité fosfolipidové membrány. Lipozómy mohou být připraveny rozpuštěním vhodných lipidů (jako je např. stearoylfosfatidylethanolamin, stearoylfosfatidylcholin, arachadoylfosfatidylcholin a cholesterol) v anorganickém

• t • · • * « · » » rozpouštědle, které se nechá odpařit, a zůstane tenký film vyschlého lipidu na povrchu použité nádoby. Do nádoby se pak vnese vodný roztok hybridního faktoru VIII. Nádobou se pak krouží, aby se uvolnil lipidový materiál ze stěn nádoby a lipidové agregáty dispergovaly, čímž se vytvoří lipozomová suspenze.

Rekombinantní prasečí nebo modifikovaný prasečí faktor VIII mohou být kombinovány s dalšími vhodnými stabilizujícími sloučeninami, prostředky pro podávání a/nebo nosiči, včetně na vitamínu K závislých koagulačních faktorů, tkáňových faktorů, a von Willebrandova faktoru (vWf) nebo fragmentu vWf, který obsahuje vazebné místo pro faktor VIII, a polysacharidů, jak je např. such jako sacharóza.

Rekombinantní prasečí nebo modifikovaný prasečí faktor VIII může být také podáván metodami genové terapie stejným způsobem jako je podáván humánní faktor VIII, a sice užitím retrovirových vektorů. Tato metoda spočívá v tom, že se konstrukt s požadovanou cDNA faktoru VIII vnese do humánních buněk, které jsou pak přímo transplantovány pacientovi s deficitem faktoru VIII nebo jsou vloženy do implantovatelného zařízení, které je propustné pro molekuly faktoru VIII avšak nepropustné pro buňky, a toto zařízení je pak transplantováno. Výhodným způsobem je přenos genu zprostředkovaný retrovirovým vektorem. Při tomto způsobu je exogenní gen (např. faktor VIII cDNA) klonován do genomu modifikovaného retroviru. Gen je pak vložen do genomu hostitelské buňky prostřednictvím virového mechanismu, kde je pak buňkou exprimován. Retrovirový vektor je modifikován tak, že neprodukuje virus, což zabraňuje virové infekci hostitele. Obecné principy genové terapie jsou odborníkům známy a byly publikovány v odborné literatuře (např. Kohn, D.B. et al. (1989) Transfusion 29:812-820].

<* ·♦ • · ·« • · · « · • # · · «·> *· .1 »» ·· ft » · · · « · · · · • · » · · · • < · · * • 1· »· ····

- 22 Prasečí nebo modifikovaný prasečí faktor VIII může být uchováván navázaný na vWf, což zvyšuje poločas a také dobu uskladnění hybridní molekuly. Navíc lyofilizací faktoru VIII může být zlepšen výtěžek aktivních molekul v přítomnosti vWf. Současné metody uchovávání (uskladnění) humánního a zvířecího faktoru VIII užívané komerčními dodavateli, mohou být využity také pro uchování rekombinantního faktoru VIII. Tyto metody zahrnují: (1) lyofilizací faktoru VIII v částečně purifikovaném stavu(jako koncentrát faktoru VIII, který může být užit pro infúzi bez další purifikace) (2) imunoafinitní purifikaci faktoru VIII Zimmermanovou metodou a lyofilizací v přítomnosti albuminu, který stabilizuje faktor VIII; (3) lyofilizací rekombinantního faktoru VIII v přítomnosti albuminu.

Navíc bylo zjištěno, že prasečí nebo modifikovaný prasečí faktor VIII je prakticky nekonečně dlouhou stabilní při 4 °C v 0,6 M NaCl, 20 mM MES, a 5 mM CaCl2 a při pH 6,0 a může být také uchován zamražený v takových pufrech, přičemž po roztátí projevuje minimální ztrátu aktivity.

Léčení

Rekombinantní prasečí nebo modifikovaný prasečí faktor VIII se užívají k léčení spontánního krvácení způsobeného deficitem faktoru VIII (např. intraartikulární, intrakraniální nebo gastrointestinální hemoragie) u hemofiliků s nebo bez inhibičních protilátek a také u pacientů se získaným deficitem faktoru VIII způsobenou rozvojem inhibičních protilátek. Účinné látky se podávají výhodně intravenózně.

Navíc může být rekombinantní prasečí nebo modifikovaný prasečí faktor VIII podáván transplantací buněk, které byly • · · · · » · · · · · geneticky modifikovány tak, aby produkovaly tento protein, a nebo implantací zařízení, které obsahuje takové modifikované buňky, jak bylo již popsáno výše.

Ve výhodném provedení farmaceutické přípravky obsahující rekombinantní prasečí nebo modifikovaný prasečí faktor VIII, samotný nebo v kombi se stabilizátory, prostředky pro přenos a/nebo nosiči, jsou podávány pacientům intravenózně infúzí, tedy stejně jako se podávají přípravky humánního nebo zvířecího faktoru VIII.

Léčebné dávky přípravku rekombinantního prasečího nebo modifikovaného prasečího faktoru VIII, které je třeba podávat pacientům, kteří takové léčení potřebují, se velmi liší v závislosti na závažnosti deficitu faktoru VIII. Obecně se dávky, jejich frekvence, trvání a počet jednotek, určí tak, aby odpovídaly závažnosti a trvání krvácivých period u každého pacienta. Tudíž faktor VIII je vmíchán do farmaceuticky přijatelného nosiče, vehikula nebo stabilizátoru v takovém množství, které je postačující k tomu, aby byla pacientovi podáno terapeuticky účinné množství proteinu, které zastaví krvácení, což se měří pomocí standardních koagulačních testů.

Faktor VIII je klasicky definován jako taková látkapřítomná v normální krevní plazmě, která koriguje defekty koagulace v plazmě pocházející od jedinců s hemofilií A. Koagulační aktivita v vitro purifikované a částečně purifikované formy faktoru VIII jsou užívány k výpočtu dávky faktoru VIII pro infúze pacientům v humánní medicíně, a je spolehlivým indikátorem aktivity získané z plazmy pacientů a v vivo korekce krvácivých poruch. Nebyl dosud popsány žádné neshody mezi standardním testem nových molekul faktoru VIII v vitro a jejich chováním na infúzním modelu psa nebo u humánních pacientů, viz Lusher, J.M. et al. 328 New Engl. J.

•· · ·· ·· ·· • ·· · · · · · · · ·

- 24 Med. 328:453-459; Pittman, D.D. et al. (1992) Blood 79:389397; a Brinkhous et al. (1985) Proč. Nati. Acad. Sci. 82:87528755.

Obvykle požadovaná plazmatická hladina aktivity faktoru VIII, která má být dosažena u pacientů podáváním rekombinantního prasečího nebo modifikovaného prasečího faktoru VIII je v rozmezí 30 až 100 % normálních hodnot. Při výhodném způsobu podávání terapeutického faktoru VIII je přípravek podáván intravenózně ve výhodných dávkách v rozsahu 5 až 50 jednotek/kg tělesné hmotnosti, výhodněji 10 až 50 jednotek/kg tělesné hmotnost, a nejvýhodněji v rozsahu 20 až 40 jednotek/kg tělesné hmotnosti, v intervalu frekvence 8 až 24 hodin (u pacientů s těžkou hemofilií) a trvání léčení v rozsahu 1 až 10 dnů nebo do zastavené epizody krvácení, viz např. Roberts, H.R., a M.R. Jones, Hemophilia and Related Podmínky - Congenital Deficiencies of Protrombin (Factor II,, Factor V, and Factors VII to XII), Ch. 153, 1453-1474, 1460, v Hematology, Williams, W. J., et al., ed. (1990). Pacienti s inhibitory mohou vyžadovat odlišná množství rekombinantního prasečího nebo modifikovaného prasečího faktoru VIII, než dostávali dosavadního faktoru VIII. Například pacient může. vyžadovat méně rekombinantního prasečího nebo modifikovaného prasečího faktoru VIII, protože má vyšší specifickou aktivitu než humánní faktor VIII a sníženou protilátkovou reaktivitu. Stejně jako při léčení humánním nebo z plazmy získaným prasečím faktorem VIII, množství terapeutického faktoru VIII podávané infúzí je definováno jednofázovým koagulačním testem faktoru VIII, a ve vybraných případech, in vivo znovudosažená hladina je měřena stanovením faktoru VIII v plazmě pacientů po infúzi. Je však třeba chápat, že pro jakéhokoliv konkrétního pacienta by měl být nastaven vhodný dávkovači režim podle jeho individuálních potřeb a na základě úsudku odborníka, který

ordinuje přípravek, a že tudíž dávky a koncentrace výše zmíněné jsou pouhé příklady a nijak neomezují rozsah předkládaného vynálezu.

Léčení může mít podobu jediného intravenózního podání přípravku nebo periodického nebo souvislého podávání po delší dobu, podle toho, jak je to potřebné. Alternativně může být terapeutický faktor VIII být podáván subkutánně nebo perorálně s lipozómy v jedné nebo několika dávkách v různých časových intervalech.

Rekombinantní prasečí nebo modifikovaný prasečí faktor VIII může být také použit k léčení spontánního krvácení způsobeného deficitem faktoru VIII u hemofiliků, u kterých se vyvinuly protilátky proti humánnímu faktoru VIII. V takovém případě není nutná koagulační aktivita, která je vyšší než aktivita samotného humánního nebo zvířecího faktoru VIII. Koagulační aktivita, která je nižší než aktivita humánního faktoru VIII (tj. např. nižší než 3000 jednotek/mg) je užitečná, jestliže tato aktivita není neutralizována protilátkami v plazmě pacientů.

Bylo zde ukázáno, že rekombinantní prasečí a modifikovaný prasečí faktor VIII se mohou lišit ve specifické aktivitě od humánního faktoru VIII. Proteiny faktoru VIII mající vyšší prokoagulační aktivitu než humánní faktor VIII jsou užitečné při léčení hemofiliků, protože jsou třeba nižší dávky, aby byl korigován deficit faktoru VIII u pacientů. Faktor VIII mající nižší prokoagulační aktivitu než humánní faktor VIII je také vhodný terapeutické použití za předpokladu, že má alespoň 1 % specifické aktivity ve srovnání s normálním humánním faktorem VIII. Faktor VIII podle předkládaného vynálezu mající prokoagulační aktivitu je tudíž definován jako faktor mající alespoň 1 % specifické aktivity humánního faktoru VIII.

·· ·« ·« • * * · · • · · ·

Molekula rekombinantního prasečího nebo modifikovaného prasečího faktoru VIII a způsoby její izolace, charakterizace, přípravy a použití, obecně popsané výše, budou podrobněji vysvětleny pomocí příkladů, popsaných dále.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Test prasečího faktoru VIII a hybridního humánního/prasečího faktoru VIII

Prasečí faktor VIII má vyšší koagulační aktivitu než humánní faktor VIII, pokud jde o specifickou aktivitu molekuly. Tento závěr je založen na použití vhodných standardních křivek, které umožňují provést správné srovnání humánního a prasečího faktoru VIII. Koagulační testy jsou založeny na schopnosti faktoru VIII to zkracovat koagulační čas plazmy pocházející od pacientů s hemofilií A. byly použity dva typy testů: jednofázový a dvojfázový test.

V jednofázovém testu se 0,1 ml plazmy s hemofilií A (George King Biomedical, lne.) inkubuje s 0,1 ml činidla pro aktivovaný parciální tromboplastinový test (APTT) (Organon Teknika) a 0,01 ml vzorku nebo standardu, kterým je naředěná normální humánní plazma s citrátem, po dobu 5 minut při 37 °C ve vodní lázni. Po inkubaci se přidá 0,1 ml 20 mM CaCl2, a čas potřebný pro vývoj fibrinové sraženiny se stanoví vizuálním hodnocením vzorku.

Jednotka faktoru VIII je definována jako množství přítomné v 1 ml citrátem ošetřené normální humánní plazmy.

S humánní plazmou jako standardem byly přímo srovnány aktivity prasečího a humánního faktoru VIII. Ředění plazmového standardu nebo purifikovaných proteinů bylo provedeno do 0,15 M NaCl, 0,02 M HEPES, pH 7,4. Standardní (kalibrační) křivka byla konstruována pomocí 3 nebo 4 ředění plazmy, kdy největší ředění bylo 1/50, vynesením logio koagulačního času proti logio koncentrace v plazmě, což poskytlo lineární závislost. Jednotky faktoru VIII v neznámém vzorku byly stanoveny interpolací z této standardní křivky.

Jednofázový test spoléhána endogenní aktivaci faktoru VIII pomocí aktivátorů, které jsou vytvářeny v plazmě s hemofilii A, zatímco dvoj fázový test měří prokoagulační aktivitu preaktivovaného faktoru VIII. Ve dvoj fázovém testu jsou vzorky obsahující faktor Vlili, které byly ponechány reagovat s trombinem, přidány ke směsi aktivovaného částečného tromboplastinu a humánní plazmy s hemofilii A, která byla preinkubována 5 minut ve 37 °C. Výsledný koagulační čas je pak přepočten na jednotky/ml, a sice pomocí stejné standardní křivky, jaká byla popsána výše. Relativní aktivita ve dvoj fázovém testu je vyšší než v jednofázovém testu, protože faktor Vlil byl preaktivován.

Příklad 2

Charakterizace funkčních rozdílů mezi humánním a prasečím faktorem Vlil

Izolace prasečího a humánního faktoru VIII pocházejícího z plazmy a humánního rekombinantního faktoru VIII byly již popsány v odborné literatuře, viz Fulcher C.A. et al. (1982) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79:1648-1652; Toole et al. (1984)

Nátuře 312:342-347 (Genetice Institute); Gitschier et al. (1984) Nátuře 312:326-330 (Genentech); Wood et al. (1984) Nátuře 312:330-331 (Genentech); Vehar et al. Nátuře 312:337342 (Genentech); Fass et al. (1982) Blood 59:594; Toole et al. (1986) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83:5939-5942. Může se provádět různými způsoby. Všechny preparáty byly podobně svým podjednotkovým složením, ačkoliv ve stabilitě byly funkční rozdíly mezi humánním a prasečí faktorem VIII.

Pro porovnání humánního rekombinantního a prasečího faktoru VIII byly preparáty vysoce purifikovaného humánního rekombinantního faktoru VIII (Cutter Laboratories, Berkeley, CA) a prasečího faktoru VIII (imunopurifikovaného, jak bylo popsáno ve Fass et al. (1982) Blood 59:594) podrobeny analýze vysokotlakovou kapalinovou chromatografií (HPLC) na aniontové iontoměničové koloně Mono Q™ (Pharmacia-LKB; Piscataway, NJ) . Cílem tohoto kroku na Mono Q™ HPLC bylo eliminovat malé nečistoty po převedení humánního a prasečího faktoru VIII do společného pufru pro účely porovnání. Viálky obsahující 1000 až 2000 jednotek faktoru VIII byly rekonstituovány 5 ml H2O. Pak byl přidán Hepes (2 M s pH 7,4) na výslednou koncentraci 0,02 M. Faktor VIII byl nanesen na kolonu Mono Q™ HR 5/5 ekvilibrovanou v 0,15 M NaCl, 0,02 M Hepes, 5 mM CaCl2, při pH 7,4 (Pufr A plus 0,15 M NaCl); propláchnut 10 ml Pufru A + 0,15 M NaCl; a eluován 20 ml lineárního gradientu, 0,15 M až 0,90 M NaCl v Pufru A při průtoku 1 ml/min.

Pro porovnání humánní faktoru VIII pocházejícího z plazmy (purifikovaného na Mono Q™ HPLC) a prasečího faktoru VIII (imunoafinitně purifikovaného) pocházejícího z plazmy byl prasečí faktor naředěn 1:4 pomocí 0,04 M Hepes, 5 mM CaCl2, 0,01 % Tween-80, pH 7,4, a pak čištěn Mono Q™ HPLC za stejných podmínek jak bylo popsáno v předchozím odstavci pro humánní

faktor VIII. Tyto postupy izolace humánního a prasečího faktoru VIII jsou standardní a odborníkům jsou dobře známy.

Frakce z kolony byly testovány na aktivitu faktoru VIII jednofázovým koagulačním testem. Průměrné hodnoty výsledků testů vyjádřené v jednotkách aktivity na jednotku A₂₈o materiálu jsou uvedeny v Tabulce II, a ukazují, že prasečí faktor VIII má přinejmenším šestkrát vyšší aktivitu než humánní faktor VIII při použití jednofázového testu.

Tabulka II

Srovnání koagulační aktivity humánního a prasečího faktoru VIII

Aktivita (U/A280)

Prasečí 21300

Humánní, pocházející z plazmy 3600

Humánní rekombinantní 2400

Příklad 3

Porovnání stability humánního a prasečího faktoru VIII

Výsledky jednofázovového testu na faktor VIII odrážejí aktivaci faktoru VIII na faktor Vlila ve vzorku a možnou ztrátu aktivity vytvořeného faktoru Vlila. Bylo provedeno přímé porovnání stability humánního a prasečí faktoru VIII. Vzorky z Mono Q™ HPLC (Pharmacia, lne., Piscataway, N.J.) byly naředěny na stejnou koncentraci a stejným pufrem a byla «· «4 * »· ·· ·· • ·· · · · · · · * « • · ·♦ « · · · · · I» · · · · · · · * * · · ···· · · « · · · ·· ·· ·*· ·· ·· ···« provedena reakce s trombinem. V různých časech byly vzorky odebrány pro dvoj fázový koagulační test. Typicky vrchol aktivity (ve 2 minutách) byl 10 x vyšší než pro prasečí faktor Vlila než humánní faktor Vlila, a aktivity jak prasečího tak i humánního faktoru Vlila postupně klesaly, přičemž aktivita humánního faktoru Vlila klesala rychleji.

Obecně lez říci, že pokusy izolovat stabilní humánní faktor Vlila nebyly úspěšné dokonce ani v podmínkách, kdy byly užity podmínky, které umožnily izolovat stabilní prasečí faktor Vlila. Pro demonstraci této skutečnosti humánní faktor VIII purifikovaný na Mono Q™ HPLC byl aktivován s trombinem a vystaven Mono S” iontoměničové HPLC (Pharmacia, lne.) v podmínkách, které vedly k získání stabilního prasečího faktoru Vlila, jak to popsali Lollar et al. (1989) Biochemlstry 28:666.

Humánní faktor VIII, 43 pg/ml pg (0,2 μΜ) v 0,2 M NaCl, 0,01 M Hepes, 2,5 mM CaCl₂, pH 7,4 v 10 ml celkového objemu, se nechal reagovat s trombinem (0,036 μΜ po 10 minut, kdy se přidal FPR-CH2Cl-D-fenyl-prolyl-arginyl-chloromethylketon na koncentraci 0,2 μΜ pro ireverzibilní inaktivaci trombinu. Směs pak byla naředěn 1:1 s 40 mM 2-(N-morfolino)ethansulfonovou kyselinou (MES), 5 mM CaCl₂, pH 6,0, a nanesen průtokem 2 ml/min na kolonu Mono S™ HR5/5 HPLC (Pharmacia, lne.) ekvilibrovanou v 5 mM MES, 5 mM CaCl₂, pH 6,0 (Pufr B) plus 0,1 M NaCl. Faktor Vlila byl eluován bez promytí kolony 20 ml gradientu 0,1 M NaCl až 0,9 M NaCl v Pufru B1 při průtoku 1 ml/min.

Frakce s koagulační aktivitou ve dvoj fázovém testu byly eluované za těchto podmínek jako jediný vrchol. Specifická aktivita vrcholové frakce byla přibližně 7500 U/A₂₈₀. Elektroforéza na polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným (SDS-PAGE) vrcholové frakce faktoru Vlila po Mono S™, doplněná barvením proteinu stříbrem, ukázala dva pásy odpovídající heterodimerickému (A3-C1-C2/A1) derivátu faktoru VIII. Ačkoliv v těchto podmínkách fragment nebyl identifikován barvením stříbrem vzhledem k jeho nízké koncentraci, byl identifikován jako stopová složka po značení pomocí ¹²⁵I.

V kontrastu s výsledky s humánním faktorem VIII, prasečí faktor VIII izolovaný pomocí Mono S™ HPLC za stejných podmínek měl specifickou aktivitu 1,6 x 10⁶ U/A280. Analýza prasečího faktoru Vlila užitím SDS-PAGE odhalila 3 fragmenty odpovídající Al, A2, a A3-C1-C2 podjednotkám, což ukázalo, že prasečí faktor VIII obsahuje tři podjednotky.

Výsledky analýzy užitím Mono S™ HPLC preparátů humánního trombinem aktivovaného faktoru VIII při pH 6,0 ukázaly, že humánní faktor Vlila je labilní v podmínkách, ve kterých lze získat stabilní prasečí faktor Vlila. Ačkoliv byla identifikována stopová množství A2 fragmentu ve vrcholové frakci, určení toho, zda koagulační aktivita vyplývající z malého množství heterotrimerického faktoru Vlila nebo z heterodimerického faktoru Vlila, který má nízkou specifickou· aktivit, by nebylo možné samotnou touto metodou.

Způsob, jak izolovat humánní faktor Vlila ještě před tím, než ztratí svou A2 podjednotku, je nutný k rozhodnutí této otázky. Pro tento účel byla provedena izolace postupem, který zahrnoval redukci pH Mono S™ pufru na pH 5. Mono Q™ purifikovaný humánní faktor VIII (0,5 mg) byl naředěn vodou takže poskytl výslednou kompozici 0,25 mg/ml (1 μΜ) faktoru VIII v 0,25 M NaCl, 0,01 M Hepes, 2,5 mM CaCl₂, 0, 005 % Tween 80, pH 7,4 (celkový objem 7,0 ml). Trombin byl přidáni do výsledné koncentrace 0,072 μΜ a ponechán reagovat po 3 minuty.

·· ·· ··

Trombin byl pak inaktivován s FPR-CH₂C1 (0,2 μΜ) . Směs pak byla naředěna 1:1 s 40 mM acetátem sodným, 5 mM CaCl₂, 0,01 % Tween-80, pH 5,0 , a nanesena průtokem 2 ml/min na kolonu Mono S™ HR5/5 HPLC ekvilibrovanou v 0,01 M acetátu sodného, 5 mM CaCl₂, 0,01 % Tween 80, pH 5,0, plus 0,1 M NaCl. Faktor Vlila byl eluován bez promytí kolony s a 20 ml gradientu 0,1 M NaCl až 1,0 M NaCl ve stejném pufru průtokem 1 ml/min. Takto byla získána koagulační aktivita ve vrcholové frakci, která obsahovala detekovatelné množství A2 fragmentů, jak bylo ukázáno pomocí SDS-PAGE a barvení stříbrem. Specifická aktivita vrcholové frakce byla desetkrát vyšší než aktivita izolovaná při pH 6,0 (75000 U/A₂₈o proti 7500 U/A₂8o· Avšak v kontrastu s prasečím faktorem Vlila izolovaným při pH 6,0, který je prakticky nekonečně stabilní ve 4 °C, aktivita humánního faktoru VIII se trvale snižuje po dobu několika hodin po eluci z kolony Mono S™. Navíc specifická aktivita faktoru VIII purifikovaného při pH 5,0 a testovaného bezprostředně poté je pouze 5 % aktivity prasečího faktoru Vlila, což ukazuje na značnou disociaci, ke které došlo před testem.

Tyto výsledky ukazují, že jak humánní tak i prasečí faktor. Vlila jsou složeny ze tří podjednotek (AI, A2, a A3-C1-C2) . Disociace A2 podjednotky je ztrátu aktivity jak u humánního tak i prasečího faktoru Vlila za jistých podmínek, jako je např. fyziologická iontová síla, pH a koncentrace. Relativní stabilita prasečího faktoru Vlila za určitých podmínek je lepší z důvodu silnější asociace A2 podjednotky.

• •	·> « 9	99 9 · ·«	9 99	99	9 9	99 9 9
9 9 9 9 9	9 9	• 9
•
•	9	• ·	9 9	9	9		9	9
	9 9	9 9	999	9 9		99		9999

Příklad 4

Izolace a sekvencování DNA kódující A2 doménu prasečího faktoru VIII.

Pouze nukleotidová sekvence kódující B doménu část A2 domény prasečího faktoru VIII byla již dříve sekvencována [viz Toole et al. (1986) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83:5939-5942]. cDNA a predikovaná aminokyselinová sekvence (SEKVENCE ID. Č. 3 a 4, v uvedeném pořadí) celé A2 domény prasečího faktoru VIII jsou poprvé popsány v předkládané přihlášce.

A2 doména prasečího faktoru VIII byla klonována reverzní transkripcí celkové RNA z prasečí sleziny a pak PCR amplifikací. Degenerované primery navržené podle známé cDNA sekvence humánního faktoru VIII a přesné prasečí primery založené na částečné sekvenci prasečího faktoru VIII byly užity. 1 kb PCR produkt byl izolován a amplifikován po vložení do fagemidového vektoru Bluescript™ (Stratagen).

Prasečí A2 doména byla zcela sekvencována dideoxysekvencovací metodou. cDNA a predikovaná aminokyselinová sekvence jsou zde uvedeny v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID.Č. 3 a 4, v uvedeném pořadí.

Příklad 5

Úplná sekvence DNA kódující prasečí faktor VIII

Klenowův fragment, fosforylované Clal linkery, Notl linkery, T4 ligáza a Taq DNA polymeráza byly zakoupeny od firmy Promega (Madison, Wisconsin). Polynukleotidylkináza byla koupena od firmy Life Technologies, lne., Gaithersburg,

9« 99 · 99 99

99 9 9 9 9 9 · 99

99 99999 ·

9· 99 99 999 9 9

9999 999 999

99 9·9 99 99 9999

Maryland. γ³²-ΑΤΡ (Redivue, >5000Ci/mmol) byl koupen od firmy Amersham. pBluescript II KS- a buňky E. coli Epicurean XL1 Blue byly koupeny od firmy Stratagen (La Jolla, Caiifornia). Syntetické oligonukleotidy byly koupeny od firmy Life Technologies, lne. nebo Cruachem, lne. 5'-fosforylované primery byly použity při PCR, když byly produkty amplifikovány pro účely klonování. Číslování nukleotidů (nt) v oligonukleotidech použitých jako primery pro polymerázovou řetězovou reakci (PCR) pro amplifikaci prasečí fVIII cDNA nebo genomové DNA je na základě humánní fVIII cDNA jakožto reference (Wood et al. (1984) supra).

Celková RNA z prasečí sleziny byla izolována kyselou extrakcí užitím guanidinithiokyanát-fenol-chloroformu [Chomczynski et al. (1987) Anal. Biochem. 162:156-159]. Prasečí cDNA byla připravena z celkové RNA ze sleziny užitím reverzní transkriptázy (RT) z Moloneyho myšího leukemického viru (First Strand cDNA Synthesis Kit, Pharmacia Biotech), pokud není uvedeno jinak. RT reakce obsahovala 45 mM Tris-Cl, pH 8,3; 68 mM KC1, 15 mM DTT, 9 mM MgCl2, 0,08 mg/ml hovězího sérovéhop albuminu a 1,8 mM deoxynukleotidtrifosfátu. Prasečí genomová DNA byla izolována ze sleziny standardním protokolem (Strauss, W.M. (1995) v Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., editors, John Wiley & Sons, pp. 2.2.1-2.2:3). Izolace DNA z agarózovýcgh gelů byla provedena pomocí soupravy Genclean II (Bio 101) nebo Quiex II Gel Extraction Kit (Qiagen).

PCR reakce byly prováděny za pomoci termocykleru Hybaid OmniGen. Pro PCR reakci prováděnou a Taq DNA polymerázou, reakční směs obsahovala 0,6 mM MgCl2 0,2 mM dNTPs, 0,5 μΜ oligonukleotidové primery, 50 U/ml polymerázy a 0,1 objemu reakční směsi první řetězce cDNA. S výjimkou, kdy je uvedeno ·· ·· »·· ·· • 99

9999 jinak, PCR produkty byly gelově purifikovány, zatupeny Klenowovým fragmentem, precipitovány ethanolem a buďto ligovány do EcoRV místa defosforylovaného pBluescript II KSnebo ligovány s fosforylovanými Clal linkery užitím T4 ligázy, naštěpeny Clal a purifikovány pomocí chromatografie na Sephacryl S400, a pak ligovány do Clal naštěpeného, defosforylovaného pBluescript II KS-. Ligace byly provedeny pomocí DNA ligáza (Rapid DNA ligation kit; Boehringer Mannheim) s výjimkou případů, kdy je specificky uvedeno jinak. Plazmidy pBluescript II KS- obsahující inzert byly použity pro transformaci buněk E. coli Epicurean XLl-Blue.

Sekvencování plasmidové DNA bylo provedeno užitím automatického DNA sekvencéru Applied Biosystems 373a a barvící terminační soupravy PRISM, a nebo manuálně užitím kitu pro sekvencování Sequenase v. 2.0 (Amersham Corporation). Přímé sekvencování PCR produktů, obsahujících ³²P-koncově značené oligonukleotidy, bylo provedeno užitím protokolu pro cyklovací

sekvencování Technologies).	(dsDNA	Cycle	Sequencing	System, Life
Izolace klonů	prasečí	cDNA pro	fVIII obsahujících sekvenci
5'UTR, signální	peptid	a doménu Al

5'úsek prasečí fVIII cDNA až po doménu A2 byl amplifikován hnízdovou (nested) RT-PCR z celkové RNA odebrané ze sleziny prasnice užitím metody 5’ rychlé amplifikace cDNA konců. (5'-RACE) (Marathon cDNA Amplification, Clontech, Version PR55453). Metoda zahrnuje syntézu prvního řetězce cDNA užitím a oligo(dT) lock-docking primerů [Borson, N.D. et al. (1992) PCR Methods Appl. 2:144.-148], a druhého řetězce cDNA užitím E. coli DNA polymerázy I, ligace 5'-prodlouženým dvoj řetězovým adaptorem SEKVENCE ID. Č. 5:

• w ·« « ·# »» • ·· # ♦ · · * · ·· • · ·· ···»» · • · · · · · · · · · 9 · » · · · t « · ··· ·· ·· ··« «· ·· »···

5'-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CTC GAG CGG CCG CCC GGG CAG GT-3

3’-H₂N-CCC GTC CA-PO4-5’ jehož krátký řetězec byl blokován na 3'konci aminoskupinou, aby se redukovalo nespecifické nasedání primeru, a byl komplementární k 8 nukleotidům na 3'-konci (Siebert, P.D., et al. (1995) Nucleic. Acids. Res. 23: 1087-1088) . První běh PCR byl proveden užitím adaptorově specifického oligonukleotidu, SEKVENCE ID. Č. 6: 5'-CCA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC-3' (označený API) jakožto sense primeru, a oligonukleotidu specifického pro A2 doménu prasečího fVIII SEKVENCE ID. Č. 7: 5'-CCA TTG ACA TGA AGA CCG TTT CTC-3' (nt 2081-2104) jakožto antisense primeru. Druhý běh PCR byl proveden užitím hnízdového (nested), adaptorově specifického oligonukleotidu SEKVENCE ID. Č. 8: 5'-ACT CAC TAT AGG GCT CGA GCG GC-3' (označen AP2) jakožto sense primeru, a hnízdového oligonukleotidu specifického pro prasečí doménu A2 SEKVENCE ID. Č. 9: 5'-GGG TGC AAA GCG CTG ACA TCA GTG-3’ (nt 1497-1520) jakožto antisense primeru. PCR byly provedena užitím komerční soupravy (Advantage cDNA PCR core kit), která užívá protilátkami-zprostředkovaný postup horkého startu [Kellogg, D.E. et al.. (1994) BioTechniques 16:11341137].

Podmínky pro PCR byly následující: denaturace při 94 °C po 60 sekund, následovaná 34 cykly (první PCR) nebo 25 cykly (druhé PCR) denaturace po 30 sekund při 94 °C, nasednutí primerů (annealing) po 30 sekund při 60 °C a prodlužování (syntéza) po 4 minuty při 68 °C užitím kontroly teploty přímo ve zkumavce. Tento postup poskytl výlučný produkt přibližné velikosti 1,6 kb, což bylo v souladu s amplifikací fragmentu zahrnujícího přibližně úsek 150 bp z 5' UTR. PCR produkt byl klonován do pBluescript užitím Clal linkerů. Inzerty čtyřech klonů byly sekvencovány v obou směrech.

			*				·*		»*
•	«	» *	·· »		«	•		•	•
•	•	«·	• ·		•	•		•	4
•
•	•	• ·	• ·		*	•		•
		··		9·			··

Tyto klony zahrnovaly úseky odpovídající 137 bp 5' UTR, signálnímu peptidu, AI doméně a části A2 domény. Shoda byla dosažena v alespoň 3 ze 4 míst. Avšak klony obsahovaly v průměru 4 mutace zjevně vnesené v průběhu PCR, zřejmě v důsledku více běhů PCR potřebných pro získání klonovatelného produktu. Tudíž byla užita sekvence získaná z úseku signálního peptidu pro návrh sense fosforylovaného PCR primeru, a sice SEKVENCE ID. Č.10 5'-CCT CTC GAG CCA CCA TGT CGA GCC ACC ATG CAG CTA GAG CTC TCC ACC TG-3', nazvaného RENEOPIGSP, pro syntézu dalšího PCR produktu pro potvrzení sekvence a pro klonování do expresního vektoru. Sekvence vyznačená tučně představuje start-kodon. Sekvence 5’ směrem od něho představuje sekvenci identickou 5' inzerčního místa savčího expresního vektoru ReNeo užitého pro expresi fVIII (Lubin et al. (1994) supra). Toto místo obsahuje Xhol štěpné místo (podtrženo). RENEOPIGSP a ntl497-1520 oligonukleotid byly užity jako primery pro Taq DNA polymerázou zprostředkovanou PCR reakci, kde byla užita jako templát cDNA ze sleziny prasnice. DNA polymeráza od několika dalších výrobců neposkytla detekovatelný produkt. Podmínky pro PCR byly následující: denaturace při 94 °C po 4 minuty, následovaná 35 cykly denaturace při 94 °C po 1 minutu, nasednutí primerů při 55 °C po 2 minuty a prodlužování při 72 °C po 2 minuty, následovaná konečným prodlužovacím krokem 5 minut při 72 °C. PCR produkt byl klonován do pBluescript užitím Clal linkerů. Inzerty ze dvou těchto klonů byly sekvencovány a v obou směrech a byly shodné s kanonickou (konsenzní) sekvencí.

Izolace klonů prasečí fVIII cDNA obsahující kodony pro domény A3, Cl a 5’-polovinu C2 domény

Nejdříve byly dva produkty RT-PCR z prasečí sleziny,

	4·	β *4
'♦	•	♦ ·	·· ·	•		•	•
a	•	4·	• ·	•	•	•
•
•	•	• *	• ·	•	•	•	•
* ·		»»·			A·		• •A

odpovídající fragmentu B-A3 domény (nt 4519-5571) a fragmentu C1-C2 domény (nt 6405-6990) klonovány. 3’ konec C2 domény, který byl získán prodloužením do úseku exonu 26, který je terminálním exonem fVIII. B-A3 produkt byl připraven užitím primeru specifického pro prasečí B doménu, SEKVENCE ID. Č. 11: 5' CGC GCG GCC GCG CAT CTG GCA AAG CTG AGT T 3’, kde podtržený úsek odpovídá úseku v prasečím fVIII, který nasedá na úsek nt 4519-45530 humánního fVIII. 5' úsek oligonukleotidu obsahuje Notl místo, které bylo původně zamýšleno pro účely klonování. „Antisense primer použitý pro generování B-A3 produktu SEKVENCE ID. Č. 12: 5 ’-GAA ATA AGC CCA GGC TTT GCA

GTC RAA-3’ je založen na reverzním komplementu humánní fVIII cDNA sekvence zahrnujícího nt 5545-5571. PCR reakce obsahovala 50 mM KC1, 10 mM Tris-Cl, pH 9,0, 0,1 % Tween X-100, 1,5 mM MgCl2, 2,5 mM dNTPs, 20 μΜ primery, 25 jednotek/ml Taq DNA polymerázy a 1/20 objemu RT reakční směsi. PCR podmínky byly denaturace při 94 °C po 3 minuty, následovaná 30 cykly denaturace po 1 minutu při 94 °C, nasednutí primerů po 2 minuty při 50 °C a prodlužování pr 2 minuty při 72 °C. PCR produkty byly fosforylovány užitím T4 DNA kinázy byly přidány linkery Notl. Po naštěpení Notl byly PCR fragmenty klonovány do Notl místa plazmidu BlueScript II KS- a transformovány do buněk XLl-Blue.

C1-C2 produkt byl připraven užitím známé humánní cDNA sekvence pro syntézu „sense a „antisense primerů, SEKVENCE ID. Č.13: 5’-AGG AAA TTC CAC TGG AAC CTT N-3’ (nt 6405-6426) a SEKVENCE ID. Č. 14: 5'-CTG GGG GTG AAT TCG AAG GTA GCG N-3' (reverzní komplement k nt 6966-6990), v uvedeném pořadí. PCR podmínky byly identické s podmínkami užitými pro přípravu B-A2 produktu. Vzniklý fragment byl ligován do pNOT klonovacího vektoru užitím soupravy Prime PCR Cloner Cloning System (5 Prime - 3 Prime, lne., Boulder, Colorado) a pěstován v buňkách JM109.

Plazmidy B-A3 a C1-C2 byly částečně sekvencovány pro přípravu „sense a „antisense oligonukleotidů specifických pro prasečí sekvenci, a sice SEKVENCE ID. Č. 15: 5'-GAG TTC ATC GGG AAG ACC TGT TG-3’ (nt 4551-4S73) a SEKVENCE ID. Č. 16: 5'-ACA GCC CAT CAA CTC CAT GCG AAG-3’ (nt 6541-6564), v uvedeném pořadí. Tyto oligonukleotidy byly užity jako primery pro vytvoření 2013 bp RT-PCR produktu užitím soupravy Clontech Advantage cDNA PCR. Tento produkt, který představuje humánní úsek nt 4551-6564, obsahuje úsek odpovídající aktivačnímu peptidu lehkého řetězce (nt 5002-5124), A3 doméně (nt 51256114) a většině Cl domény (nt 6115-6573). Sekvencováním C1-C2 klonu bylo stanoveno, že humánní a prasečí cDNA od nt 6565 až do 3' konce Cl domény jsou identické. PCR produkt byl klonován do EcoRV místa pBluescript II KS-. Čtyři klony byly plně sekvencovány v obou směrech. Shoda byla dosažena alespoň ve 3 ze čtyřech míst.

Izolace prasečích klonů fVIII cDNA obsahujících kodony pro 3' polovinu C2 domény

C2 doména humánního fVIII (nukleotidy 6574-7053) je obsažena uvnitř exonů 24 až 26 [Gitschier J. et al. (1984) Nátuře 312:326-330]. Humánní exon 26 obsahuje 1958 bp, a odpovídá nukleotidům 6901-8858. Zahrnuje také 1478 bp úsek 3' netranslatované sekvence. Pokusy o klonování cDNA exonu 26 odpovídající 3' konci C2 domény 3’ UTR metodou 3' RACE [Siebert et al. (1995) supra], inverzní PCR [Ochman, H. et al. (1990) Biotechnology (N.Y.) 3:759-760], PCR restrikčních míst [Sarkar, G, et al. (1993) PCR Meth. Appl. 2:318-322], PCR s nepředvídatelnými primery (unpredictably primed PCR) [Dominguez, 0. et al. (1994) Nucleic. Acids Res. 22:3247-3248] • · · · » · · « * · ·· a nebo screeningem cDNA knihovny z prasečích jater zcela selhaly. Metody 3' RACE byla s úspěchem užita se stejnou adaptory-ligovanou dvoj řetězcovou cDNA knihovnou ke klonování 5' konce prasečí fVIII cDNA. Takže neúspěch této metody nebyl důsledkem absence cDNA odpovídající exonu 26.

Postup cílené procházky po genu s PCR (Parker, J.D. et al. (1991) Nucleic. Acids. Res. 19:3055-3060) byl užit pro klonování 3’ poloviny C2 domény. „Sense primer specifický pro prasečí sekvenci, SEKVENCE ID. Č.17: 5’-TCAGGGCAATCAGGACTCC-3’ (nt 6904-6924) byl syntetizován na podkladě počáteční sekvence C2 domény a byl užit pro PCR reakce s nespecifickými walking” primery vybranými z oligonukleotidů dostupných v laboratoři. PCR produkty byly pak zacíleny analýzou extenze primerů [Parker et al. (1991) BioTechniques 10:94-101] užitím a ³²P-koncově značeného interního primeru specifického pro prasečí sekvenci, SEKVENCE ID. Č. 18: 5'-CCGTGGTGAACGCTCTGGACC-3’ (nt 6932-6952). Je zajímavé, že ze 40 testovaných nespecifických primerů pouze dva poskytly pozitivní produkty v analýze extenze primerů tyto dva produkty odpovídají přesné a degenerované humánní sekvenci 3' konce C2 domény: SEKVENCE ID. Č. 19: 5'GTAGAGGTCCTGTGCCTCGCAGCC-3' (nt 7030-7453) a SEKVENCE ID. Č. 20: 5'-GTAGAGSTSCTGKGCCTCRCAKCCYAG 3’, (nt 7027-7053). Tyto primery byly původně navrženy k získání produktu pomocí konvenční RT-PCR, ale nevedly k získání dostatečného množství produktu, které by mohlo být vizualizováno vazbou ethidiumbromidového barviva. Avšak PCR produkt mohl být identifikován mnohem citlivější metodou extenze primerů. Tento produkt byl gelové purifikován a přímo sekvencován. To vedlo k extenzi sekvence prasečího fVIII 3' až k nt 7026.

Další sekvence byly získány analýzou extenze primerů • · · · produktů připravených v hnízdové PCR užitím adaptor-ligované dvoj řetězcové cDNA knihovny postupem 5’ RACE popsaným již dříve. První běh reakce užitím přesného prasečího primeru SEKVENCE ID. Č. 21: 5'-CTTCGCATGGAGTTGATGGCCTGT-3’ (nt 65416564) a primeru API. Druhý běh reakce byl proveden užitím primeru SEKVENCE ID. Č. 22: 5'-AATCAGGACTCCTCCACCCCCG-3’ (nt

6913-6934) a AP2 primeru. Přímé PCR sekvencování prodloužilo sekvenci ke 3' konci C2 domény (nt 7053). Sekvence C2 domény byla jedinečná s výjimkou nt 7045 v blízkosti 3’ konce C2 domény. Analýza opakovaných PCR reakcí poskytla buďto A, G nebo dokonce dvojité čtení A/G v této pozici.

Sekvencování byl prodlouženo do 3' UTR užitím dvou dalších primerů, a sice SEKVENCE ID. Č. 23: 5'-GGA TCC ACC CCA CGA GCT GG-3' (nt 6977-6996) a SEKVENCE ID. Č. 24: 5'-CGC CCT GAG GCT CGA GGT TCT AGG-3’ (nt 7008-7031). Přibližně 15 bp fragment 3' UTR sekvence byl získán, ačkoliv sekvence byla v několika místech nejasná. Několik „antisense primerů pak bylo syntetizováno na základě co nej lepšího určení 3’ netranslatované sekvence. Tyto primery zahrnovaly reverzní komplement TGA stop kodonu na jejich 3' konci. PCR produkty jak z genomové DNA prasečí sleziny tak i z cDNA prasečí sleziny, vizualizované elektroforézou na agarózovém gelu a obarveny ethidiumbromidem, byly získány užitím specifického „sense primeru SEKVENCE ID. Č. 25: 5'-AAT CAG GAC TCC TCC ACC CCC G-3' (nt 6913-6934) a 3' UTR „antisense primeru SEKVENCE ID. Č. 26: 5'CCTTGCAGGAATTCGATTCA-3'. Pro získání dostatečného množství materiálu pro účely klonování, byl proveden druhý běh PCR užitím hnízdového „sense primeru SEKVENCE ID. Č. 27: 5'-CCGTGGTGAACGCTCTGGACC-3' (nt 6932-6952) a stejného „antisense primeru. PCR produkt velikosti 141 bp byl klonován do EcoRV naštěpeného pBluescript II KS-. Sekvence tří klonů získaných z genomové DNA a tří klonů získaných z • · · « • · · ·

♦ · «· « ♦ · • · · • · · · · · cDNA byla určena v obou směrech. Sekvence byla jednoznačná s výjimkou polohy 7045, kde v genomové DNA byl vždy A, zatímco v cDNA byl vždy G.

Vícenásobné přiřazení sekvencí DNA humánního, prasečího a myšího fVIII (viz obrázky 1A až 1H)

Srovnání sekvencí signálního peptidu a úseků Al, A2, A3, Cl a C2 úseky bylo provedeno užitím programu CLUSTALW [Thompson, J.D. et al. (1994) Nucleic. Acids. Res. 22:46734680]. Trestné body za mezery gap open a gap extension ve srovnávaných sekvencích byly 10 a 0,05 v uvedeném pořadí. Srovnání humánní, myší a prasečí sekvence B domény bylo již popsáno dříve [Elder et al. (1993) supra]. Humánní A2 sekvence odpovídá aminokyselinám 373-740 v SEKVENCE ID. Č. 2. Prasečí aminokyselinová sekvence A2 je zde uvedena jako SEKVENCE ID. Č. 4a myší aminokyselinová sekvence A2 domény je zde uvedena jako SEKVENCE ID. Č. 28, aminokyseliny 392-159.

Příklad 6

Exprese aktivního rekombinantního prasečí faktoru VIII postrádajícího doménu B (PB)

Materiály

Citrátem ošetřená krev s hemofilií A a normální sloučená humánní plazma byly zakoupeny od George King Biomedical, lne. Fetální hovězí sérum, geneticin, penicilín, streptomycin, a média DMEM/F12 médium a AIM-V byly zakoupeny od Life Technologies, lne. Taq DNA polymeráza byla zakoupena od firmy

- 43 Promega. Vent DNA polymeráza byla zakoupena od firmy New

England Biolabs, pBlueScript II KS

Pfu DNA polymeráza a fagemid byly zakoupeny od firmy Stratagen. Syntetické oligonukleotidy byly zakoupeny od firmy Life Technologies nebo Cruachem, lne. Restrikčni enzymy byly od firmy New England Biolabs nebo Promega. 5'-fosforylované primery byly užity, když byly PCR produkty připravovány pro účely klonování. Číslování nukleotidů (nt) v oligonukleotidech užitých jako primery pro amplifikaci prasečí fVIII cDNA nebo genomové DNA v polymerázové řetězové reakci (PCR) vycházelo z humánní fVIII cDNA jako referenční sekvence [Wood et al. (1984) Nátuře 312:330-337]. A fVIII expresní vektor nazvaný HB“/ReNeo, byl získán od firmy Biogen, lne. HB-/ReNeo obsahuje gen rezistence k ampicilinu a genticinu a humánní fVIII cDNA, které chybí celá B doména, definovaný jako štěpný fragment Ser741-Argl648 produkovaný trombinem. Pro usnadnění mutageneze cDNA fVIII C2 domény, která je na 3’ konci inzertu fVIII v ReNeo, bylo místo Notl vneseno 2 báze od 3' stop kodonu HB/ReNeo užitím mutageneze typu „splicing-by-overlap extension (SOE) [Horton, R.M. et al. (1993) Methods Enzymol. 217:210-219]. Tento konstrukt byl nazván HBReNeo/NotI.

Celková RNA byla izolována metodou kyselé guanidinium thiokyanát-fenol-chloroformové extrakce [Chomczynski, P. et al. (1987) Anal. Biochem. 162:156-159]. cDNA byl syntetizována z mRNA užitím reverzní transkriptázy (RT) z Moloneyho myšího leukemického viru a náhodných hexamerů podle instrukcí výrobce soupravy (First Strand cDNA Synthesis Kit, Pharmacia Biotech). Plasmidová DNA byla purifikována užitím soupravy Qiagen Plasmid Maxi Kit (Qiagen, lne.). PCR reakce byly provedeny užitím termocyklovacího zařízení Hybaid OmniGen užitím Tag, Vent, nebo Pfu DNA polymerázy. PCR produkty byly purifikovány na gelu, precipitovány ethanolem, a ligovány do plasmidové DNA

užitím T4 DNA ligázy (Rapid DNA Ligation Kit, Boehringer Mannheim). Inserty obsahující plasmidy byly užity k transformaci buněk E. coli Epicurean XLl-Blue buňky. Všechny nové fVIII DNA sekvence vytvořené pomocí PCR byly potvrzeny dideoxy-sekvencováním užitím automatického DNA sekvencéru (Applied Biosystems 373a) a soupravy terminačních barviv PRISM.

Konstrukce hybridního expresního vektoru fVIII HP20 obsahujícího prasečí C2 doménu

Prasečí fVIII cDNA odpovídající 3’ konci Cl domény a celé C2 doméně byla klonována do pBluescript užitím RT PCR z celkové RNA ze sleziny užitím primerů založených na známé prasečí fVIII cDNA sekvenci [Healey, J.F. et al. (1996) Blood 88:4209-4214]. Tento konstrukt a konstrukt BB”/ReNeo byly užity jako templáty pro konstrukci fúzního produktu humánní Clprasečí C2 v pBlueScript mutagenezí SOE. C1-C2 fragment z tohoto plazmidu byl vyjmut s Apal a Notl a ligován do Apal/Notl-naštěpeného HB~/ReNeoINotI, aby tak vznikl HP20/ReNeo/NotI.

Konstrukce hybridního humánního/prasečího fVIII obsahujícího prasečí lehký řetězec (HP18)Lehký řetězec humánního fVIII sestává z aminokyselinových zbytků Aspl649 až Tyr2332. Odpovídajícími zbytky prasečí fVIII cDNA byl tento úsek nahrazen v HB-, . Čímž byla připravena hybridní humánní/prasečí fVIII molekula nazvaná HP18. To bylo provedeno tak, že odpovídající úsek v HP20 byl nahrazen PCR produkty odpovídajícími prasečímu úseku A2, doméně A3, Cl a části C2 domény. Pro usnadnění konstrukce bylo synonymní

·· «· • ·

AvrlI místo SOE mutagenezí vneseno do nt 2273 na spojnici A2 a A3 domény v HP20.

Konstrukce hybridu humánního/prasečího fVIII postrádajícího B doménu a obsahujícího prasečí signální peptid, Al doménu a A2 doménu (HP22)^-

Signální peptid humánního fVIII s Al doménou a A2 doménou sestávají z aminokyselinových zbytků Met(-19)-Arg740. Tento úsek HB- byl nahrazen odpovídajícími zbytky prasečí fVIII cDNA a byla tak připravena molekula nazvaná HP22. Navíc bylo synonymní AvrlI místo SOE mutagenezí vneseno do nt 2273 na spojnici A2 a A3 domény v HP20. HP22 byl konstruován fúzí prasečího fragmentu signální peptid-Al-část A2 v pBlueScript [Healy et al. (1996 supra] s hybridním humánním/prasečím fVIII postrádajícím doménu B obsahujícím prasečí A2 doménu označovaným HPl [Lubin et al. (1994) supra]

Konstrukce prasečího fVIII bez B domény (PB^-)

Spel/Notl fragment HP18/BS (+AvrII) byl naštěpen AvrlI/Notl a ligován do AvrlI/NotI-naštěpeného HP22BS (+AvrII), čímž byl připraven konstrukt PB“/BS (+AvrII), sestávající z prasečího fVIII postrádajícího celou B doménu. PB- byl klonován do ReNeo ligováním Xba/Notl fragmentu z PB~/BS (+ AvrlI) do HP22/ReNeo/NotI (+ AvrlI).

Exprese rekombinantních molekul fVIII

PB/ReNeo/NotI {+AvrlI) a HP22/ReNeo/NotI (+AvrII) byly tranzientně transfekovány do COS buněk a exprimovány jak bylo již dříve popsáno (Lubin, LM. et al. (1994) J. Biol. Chem.

- 46 269:8639-8641]. Jako kontroly byly provedeny transfekce HB-/ReNeo/NotI a bez DNA.

Aktivita fVIII PB-, HP22 a HB- byly měřeny chromogenním testem následujícím způsobem. Vzorky fVIII v supernatantech COS buněčných kultur byly aktivovány 40 nM trombinem v 0,15 M NaCl, 20 mM HEPES, 5Mm CaCl₂, 0,01 % Tween-80, pH 7,4 v přítomnosti 10 nM faktoru IXa, 425 nM faktoru X, a 50 μΜ unilamelárních fosfatidylserin/fosfatidycholinových (25/75 hmot.) vezikulů. Po 5 minutách byla reakce zastavena 0,05 M EDTA a 100 nM rekombinantního desulfatohirudinu a výsledný faktor Xa byl měřen testem s chromogenním substrátem. V testu s chromogenním substrátem bylo 0,4 mM Spectrozym Xa přidáno a bylo sledováno uvolňování paranitroanilidu měřením absorbance roztoku při 405 nm.

Výsledky ze supernatantů dvou nezávisle transfekovaných buněčných kultur (absorbance 405 nm za 1 minutu) byly následující:

HB“: 13,9

PB: 139

HP22: 100 slepá kontrola: <0,2

Tyto výsledky ukazují, že prasečí fVIII postrádající doménu B a fVIII postrádající doménu B sestávající z prasečí AI a A2 podjednotky jsou aktivní a vedou k předpokladu, že mají dokonce vyšší aktivitu než humánní fVIII postrádající doménu B.

PB- byl částečně purifikován a koncentrován z růstového média chromatografií na heparin-Sepharose. Heparin-Sepharose (10 ml) byla ekvilibrována s 0,075 M NaCl, 10 mM HEPES, 2,5 mM CaCl2, 0,005 % Tween-80, 0,02 % azid sodný, pH 7,4. Médium (100 až 200 ml) z exprimujících buněk bylo naneseno na

heparin-Sepharose, která pak byla promyta 30 ml ekvilibračního pufru bez azidu sodného. PB- byl eluován 0,65 M NaCl, 20 mM HEPES, 5 mM CaCl2, 0,01 % Tween-80, pH 7,4, a pak byl uskladněn při -80 °C. Výtěžek fVIII koagulační aktivity byl typicky 50 až 75 %.

(+AvrII) byly selektovány na

Stabilní exprese prasečího fVIII postrádajícího doménu B (PB-)

Transfekované buněčné linie byly udržovány v Dulbeccově Eaglem modifikovaném médiu F12 obsahujícím 10% fetální hovězí sérum, 50 U/ml penicilinu, 50 pg/ml streptomycinu. Fetální hovězí sérum bylo tepelně inaktivováno při 50 ’C jednu hodinu před použitím. HB-/ReNeo a PB-ReNeo/Notl stabilně transfekována do buněk BHK a rezistenci ke geneticinu užitím obecně známého postupu, který byl dříve publikován [Lubin et al. (1994) Biol. Chem. 269:86398641] s výjimkou toho, že exprimující buňky byly udržovány v růstovém médiu obsahujícím 600 pg/ml geneticinu. Buňky z kultivačních lahví Corning T-75 pěstované do konfluence byly přeneseny do trojhranných kultivačních lahví Nunc s médiem obsahujícím 600 pg/ml geneticinu a dále pěstovány až do konfluence. Médium bylo odebráno a nahrazenoTechnologies, lne.) a bez

VIII byla monitorována aktivity faktoru VIII (viz

AIM-V médiem bez séra (Life geneticinu. Exprese faktoru jednofázovým testem koagulační výše) a 100 až 150 ml bylo odebíráno jedenkrát denně po dobu čtyřech až pěti dnů. Maximální hladiny exprese v médiu pro HBa PB- byly 102 jednotek koagulační aktivity faktoru VIII na jeden ml a 10 až 12 jednotek na ml, v uvedeném pořadí.

Purifikace PBPB- byl precipitován ze supernatantu kultivačního média užitím 60% saturovaného roztoku síranu amonného a pak purifikován W3-3 imunoafinitní chromatografií na mono Q HPLC, jak bylo již dříve popsáno pro purifikaci z plazmy pocházejícího prasečího faktoru VIII [Lollar et al. (1993) Factor VIII/Factor Vlila. Methods Enzymol. 222:128-143]. Specifická koagulační aktivita PB- byla měřena jednofázovým koagulačním testem [Lollar et al. (1993) supra] a byla podobná aktivitě prasečího faktoru VIII pocházejícího z plazmy.

Když byl analyzován elektroforézou na SDS polyakrylamidovém gelu, PB- preparát obsahoval tři pásy se zjevnou molekulovou hmotností 160 kDa, 82 kDa, a 76 kDa. 82 kDa a 76 kDa pásy byly již dříve popsány jako heterodimery obsahující A1-A2 a ap-A3-Cl-C2 domény (kde ap označuje aktivační peptid ) [viz Toole et al. (1984) Nátuře 312:342347] . 160 kDa pás byl přenesen na polyvinylidenfluoridovou membránu a pak podroben NH2~koncovému sekvencování, které poskytlo fragment Arg-Ile-Xx-Xx-Tyr (kde Xx představuje neurčenou polohu), což je NH₂-koncová sekvence jednořetězcové molekuly faktoru VIII [Toole et al. (1984) supra]. Takže PB-. je částečně opracováván štěpením mezi doménami A2 a A3, takže setává ze dvou forem, a sice jednořetězcového proteinu Al-A2-ap-A3-Cl-C2 a heterodimeru Al-A2-ap-A3-Cl-C2. Podobné opracování rekombinantního HB- bylo také popsáno [Lind et al. (1995) Eur. J. Biochem. 232:19-27].

Charakterizace prasečí faktoru VIII

Byla stanovena cDNA sekvence prasečího fVIII odpovídající 137 bp 5’ UTR, úsek kódující signální peptid (57 bp), a Al (1119 bp), A3 (990 bp), Cl (456 bp) a C2 (483 bp) domény.

·· ·· • » * ♦ · ·

Společně s dříve publikovanou sekvencí B domény a úseků aktivačního peptidu lehkého řetězce [Toole et al. (1986) supra] a A2 domény (Lubin et al. (1994) supra), sekvence popsaná v předkládané přihlášce dokončuje stanovení úplné sekvence cDNA prasečího fVIII odpovídající translatovanému produktu. Fragment, který zahrnoval cDNA pro 5' UTR úsek, signální peptid a Al doménu byl klonován užitím postupu

5'-RACE RT PCR. Primer odvozený z humánní C2 sekvence úspěšně vedl k vytvoření RT PCR produktu, který pak umožnil klonování domén A3, Cl, a 5’-části C2 domény. cDNA odpovídající 3'-části C2 domény a 3' UTR cDNA se ukázaly jako velmi obtížné substráty pro klonování. Zbytek C2 domény byl nakonec klonován postupem cílené procházky po genu s PCR [Parker et al. (1991) supra].

Sekvence popsaná zde v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID. Č. 29 byla stanovena jednoznačně s výjimkou nukleotidu 7045 blízko 3' konce C2 domény, kde bylo buďto A nebo G, jak bylo již zmíněno výše. Odpovídající kodon je GAC (Asp) nebo AAC (Asn) . Humánní a myší kodony jsou GAC a CAG (Gin), v uvedeném pořadí. Zda se v tomto případě jedná o polymorfismus nebo reprodukovatelný artefakt vnesený PCR je dosud neznámo. CDNA pro rekombinantní hybridní humánní/prasečí fVIII postrádající doménu B obsahující substituce prasečí C2 domény odpovídající jak GAC tak i AAC kodonu byly stabilně exprimovány bez detekovatelného rozdílu v prokoagulační aktivitě. Tento výsledek ukazuje, že zde není funkční rozdíl mezi dvěma variantami C2 domény.

Srovnání predikované aminokyselinové sekvence úplného prasečího fVIII (SEKVENCE ID. Č. 30) s publikovanou humánní sekvencí [Wood et al. (1984) supra] a myší sekvencí [Elder et al. (1993) supra) je ukázáno na Obrázku 1A až 1H, společně ·* «* · »* ·* ·« • · · · · · · * ··« • · ·* · 4 · · · · * * · · · · · ··· · · ···· · · * · *· » ·· »· ··« ·· ·· ·Μ* s místy pro post-translační modifikace, proteolytické štěpení, rozpoznávání jinými makromolekulami. Stupeň identity srovnaných/přiřazených sekvencí je uveden v Tabulce VII. Jak bylo již dříve uvedeno, B domény těchto biologických druhů jsou více divergentní {více se odlišují) než A nebo C domény. To je ovšem v souladu s pozorováním, že B doména nemá žádnou známou funkci, bez ohledu na značnou velikost této domény. [Elder et al. (1993) supra; Toole et al. (1986) supra]. Výsledky získané v předkládaném vynálezu potvrzují, že B doména prasečího fVIII není nezbytná pro jeho aktivitu. Na základě sekvenčních údajů popsaných zde byl syntetizován prasečí fVIII mající deletovanou (odstraněnou) buďto alespoň část nebo celou B-doménu a pak byl exprimován prasečí fVIIIa z kódující DNA mající deletované všechny nebo část kodonů prasečí B domény. Existuje zde také vyšší divergence v sekvencích odpovídajících štěpnému peptidu Al doména APC/faktor IXa (zbytky 337 - 372) aktivačnímu peptidu lehkého řetězce (Tabulka VII). Trombinové štěpné místo v poloze 336 pro vytvoření peptid 337 - 372 je u myši zjevně ztraceno, neboť tento zbytek je glutamin místo argininu [Elder et al. (1993) supra]. Relativně rychlá divergence trombinových štěpných peptidů (nebo u myšího fVIII možná zbytkového' aktivačního peptidu 337-372) byly již dříve poznány u fibrinopeptidů [Creighton, T. E. (1993) Proteins: Structures a Molecular Properties, W.H. Freeman, New York, pp. 105-138]. Nedostatek biologické funkce těchto peptidů, jakmile jsou jednou naštěpeny, bal citován jako jeden z možných důvodů rychlé divergence. Arg562 v humánním fVIII byl navržen jako důležité štěpné místo pro aktivační protein C v průběhu inaktivace fVIII a fVIIIa [Fay, P.J. et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:20139-20145). Tato místa jsou konzervativní (jsou zachována) jak v humánní, tak i v prasečí a myší sekvenci

4*	4 4	* 44	• 4		4«
·	• 9'	4 4 4 ·	4	«	4
• ·	44	* 4 4	4	4	•
4 ·	• ·	4*4	•	4	4
44	44	44 4 44	Λ 4		444 4

fVIII.

Potenciální místa N-glykosylace (NXS/T, kde X není prolin) jsou vidět na obrázku 1A až 1H. Je zde osm konzervativních N-vázaných glykosylačních míst: jedno je v Al doméně, jedno v A2 doméně, čtyři v B doméně, jedno v A3 doméně a jedno v Cl doméně. 19 cysteinových zbytků v A a C doméně je také zachováno, zatímco existuje divergence cysteinových zbytků v B doméně. Šest ze sedmi disulfidických vazeb v molekule fVIII jsou na homologních místech s faktorem V a ceruloplasminem, a obě disulfidické vazby C domény byly nalezeny také ve faktoru V [McMullen, B.A. et al. (1995) Protein Sci. 4: 740-746]. Humánní fVIII obsahuje sulfatovaný tyrosin v pozicicíh 346, 718, 719, 723, 1664, a 1680 (Pitman, D.D. et al. (1992) Biochemistry 31:3315-3325; Michnick, D.A. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:20095-20102]. Tyto zbytky jsou zachovány i v myším a v prasečím fVIII (Obrázek 1), ačkoliv program CLUSTALW selhal v přiřazení tyrosinového zbytku v myší sekvenci odpovídajícímu Tyr346 v humánním fVIII.

Myší a prasečí plazma mohou korigovat defekty koagulace v humánní plazmě s hemofilií A, což je v souladu s hladinou konzervativních zbytků v doménách A a C těchto biologických, druhů. Prokoagulační aktivita prasečího fVIII je vyšší než humánního fVIII [Lollar, P. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:23652-23657]. Rekombinantní prasečí faktor VIII (s deletovanou B doménou) exprimovaný a purifikovaný jak zde bylo popsáno, také vykazuje vyšší specifickou koagulační aktivitu než humánní fVIII, srovnatelnou s prasečím fVIII pocházejícím z plazmy. To by mohlo být způsobeno sníženou spontánní rychlostí disociace A2 podjednotky z aktivního heterotrimeru fVIIIa: A1/A2/A3-C1-C2. Zda rozdíly v prokoagulační aktivitě odrážejí evoluční změnu ve funkci

91» ·♦ ♦· • · « »9 *9 Μ • 9 · * 99 9» ···* 9 · * * » 9

• *9 9 • 4 »9	999 ·· «
	- 52 -
jakožto	příklad adaptace druhů [Perutz, M.F.	(1996) Adv.
Protein	Chem. 36:213 244] není známo. Nyní, když	je prasečí

cDNA fVIII sekvence odpovídající translatovanému produktu úplná, homologní skenovací mutageneze [Cunningham, B.C., et al. (1989) Science 243:1330-1336] může poskytnout cestu k identifikaci strukturních rozdílů mezi humánním a prasečím fVIII, které jsou příčinou vyšší aktivity prasečího proteinu.

Prasečí fVIII je typicky méně reaktivní s inhibičními protilátkami, které se tvoří u hemofiliků, kterým byla podána transfúze s fVIII nebo které se tvoří jako autoprotilátky v obecné populaci. To představuje základ pro použití koncentrátu prasečího fVIII při léčení pacientů s inhibičními protilátkami [Hay a Lozier (1995) supra]. Většina inhibičních protilátek je namířena proti epitopům lokalizovaným v doméně A2 nebo C2 [Fulcher, C.A. et al. (1985) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 32:1128-1132; Scandella, D. et al. (1988) Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 85:6152-6156; Scandella, D. et al. (1989) Blood 74:1618-1626). Navíc byl identifikován epitop neznámého významu, který leží buďto v doméně A3 nebo Cl [Scandella et al. (1989) supra; Scandella, D. et al. (1993) Blood 82:17671775; Nakai, H. et al. (1994) Blood 84:224a]. A2 epitop byl mapován do polohy zbytků 484 až 508 metodou homologní skenovací mutageneze (Healey et al. (1995) supra]. V tomto segmentu velikosti 25 aminokyselinových zbytků je relativně nízký podíl identických sekvencí (16/25 neboli 64 %). Je zajímavé, že tento úsek, který se zdá být funkčně důležitý, a to na základě faktu, že protilátky proti němu mají inhibiční účinek, byl zjevně vystaven relativně rychlejšímu genetickému driftu. Srovnání prasečí A2 domény a A3 domény ukazuje, že A2 epitop nesdílí žádnou detekovatelnou homologii s odpovídajícím úsekem v A3 doméně.

Pomocí delečního mapování byla lokalizace C2 inhibičního epitopu humánního fVIII navržena do úseku zbytků 2248 až 2312 [Scandella, D. et al. (1995) Blood 86:1811-1819]. Humánní a prasečí fVIII jsou z 83 % identické v tomto segmentu 65 aminokyselinových zbytků. Avšak homologní skenovací mutageneze tohoto úseku s cílem charakterizovat C2 epitop vedla k odhalení, že hlavní determinanta C2 epitopu je neočekávaně lokalizovaná v úseku odpovídajícímu aminokyselinám 2181 až 2243 (viz SEKVENCE ID. Č. 2 a obrázek 1H).

Byly připraveny proteiny hybridního humánního-prasečího faktoru VIII, ve kterých různé úseky C2 domény humánního faktoru VIII byly nahrazeny odpovídajícími částmi prasečího faktoru VIII, a sice užitím strategie zde popsané (viz příklad 5) . Syntéza různých C2 hybridních faktorů VIII byla provedena prostřednictvím konstrukce hybridní kódující sekvence DNA, s využitím nukleotidové sekvence kódující prasečí C2 úsek uvedené zde jako SEKVENCE ID. Č. 30. Každá hybridní DNA byla exprimována v transfekovaných buňkách, takže hybridní faktory VIII mohly být částečně purifikována z růstového média. Aktivita, v nepřítomnosti inhibitorů, byla měřena jednofázovým koagulačním testem.

Panel pěti humánních inhibitorů byl užit k testování každého z hybridních faktorů VIII. Bylo již dříve prokázáno, že inhibiční plazmy obsahující protilátky anti-faktor VIII byly namířeny proti humánní C2 doméně, a sice na základě schopnosti rekombinantní humánní C2 domény neutralizovat inhibici. Ve všech testovaných plazmách byl titr inhibitorů neutralizován více než ze 79 % C2 doménou nebo lehkým řetězcem, avšak méně než z 10 % rekombinantní humánní A2 doménou. Navíc C2-hybridní faktory VIII byly testovány proti myším monoklonálním protilátkám, které s neváží na C2 doménu, • ·· ·· ·· • · · · · · · • · · · · · • · · · · · · • · · · · · ·· · ·· ·· ···· a podobně jako humánní C2 inhibiční protilátky, inhibují vazbu faktoru na fosfolipid a na von Willebrandův faktor.

Srovnáním titrů inhibičních protilátek proti C2-hybridním faktorům VIII bylo ukázáno, že hlavní determinanta humánního C2 inhibičního epitopu leží v úseku aminokyselinových zbytků 2181 až 2243 (viz SEKVENCE ID. Č. 2 a také obrázek 1H) . Anti-C2 protilátky namířené proti úseku směrem k COOH-konci od zbytku 2253 nebyly identifikovány ve čtyřech z pěti sér pacientů. Srovnáním hybridů majících prasečí sekvence odpovídající humánním aminokyselinovým zbytkům v polohách 2181 až 2199 a 2207 až 2243 se ukázalo, že oba úseky přispívají k vazbě protilátky. Prasečí aminokyselinová sekvence odpovídající humánním zbytkům 2181 až 2243 je číslována 1982 až 2044 v SEKVENCE ID. Č. 30. Sekvence prasečí DNA kódující prasečí aminokyseliny očíslované 1982 až 2044 je sekvence nukleotidů 5944 až 6132 v SEKVENCE ID. Č. 29.

S odkazem na obrázek 1H je vidět, že v úseku 2181 až 2243, je 16 aminokyselinových rozdílů mezi humánní a prasečí sekvencí. Rozdíly byly nalezeny ve zbytcích 2181, 2182, 2188, 2195 až 2197, 2199, 2207, 2216, 2222, 2224 až 2227, 2234, 2238 a 2243. Nahrazení jednoho nebo více z těchto aminokyselinových, zbytků může být provedeno, čímž se získá modifikovaný humánní faktor VIII, který je nereaktivní s humánními anti-C2 inhibičními protilátkami. Alaninová skenovací mutageneze poskytuje vhodný postup pro vytváření slaninových substitucí přirozeně se vyskytujících zbytků, jak bylo dříve popsáno. Také aminokyseliny jiné než alanin mohou být nahrazovány. Alaninové substituce jednotlivých aminokyselin, zejména těch, které jsou odlišné v humánní/prasečí nebo humánní/myší sekvenci nebo které s největší pravděpodobností přispívají k vazbě protilátky, mohou poskytnout modifikovaný faktor VIII • · ·· • · se sníženou reaktivitou s inhibičními protilátkami.

Obrázky 1A až 1H dohromady ukazují přiřazené (srovnané) aminokyselinové sekvence humánního, prasečího a myšího faktoru VIII. Obrázek 1A srovnává úseky signálního peptidu (humánní SEKVENCE ID. Č. 31; prasečí SEKVENCE ID. Č. 30, aminokyseliny 1 až 19; myší SEKVENCE ID. Č. 28, aminokyseliny 1 až 19) . Aminokyseliny na obrázcích 1A až 1H jsou číslovány tak, že první alanin zralého proteinu je označen jako č. 1, a tudíž aminokyseliny signálního peptidu mají negativní čísla. Humánní fVIII sekvence v SEKVENCI ID. Č. také začíná prvním alaninem zralého proteinu jakožto aminokyselinou č. 1. V aminokyselinové sekvenci myšího fVIII (SEKVENCE ID. Č. 28) a prasečího fVIII (SEKVENCE ID. Č. 30) je první aminokyselina (alanin) zralého proteinu označena jako aminokyselina č. 20. Obrázky 1A až 1H ukazují srovnání odpovídajících sekvencí humánního, myšího a prasečího fVIII, a to tak, že úseky s největší aminokyselinovou identitou leží vedle sebe. Číslování aminokyselin na obrázcích 1A až 1H platí pouze pro humánní fVIII. Obrázek 1B ukazuje aminokyselinovou sekvenci humánní (SEKVENCE ID. Č. 2, aminokyseliny 1 až 372), prasečí (SEKVENCE ID. Č. 30, aminokyseliny 20 až 391), a myší (SEKVENCE ID. Č. 28, aminokyseliny 20 až 391) Al domény. Obrázek 1C ukazuje aminokyselinovou sekvenci humánní (SEKVENCE ID. Č. 2, aminokyseliny 373 až 740), prasečí (SEKVENCE ID. Č. 30, aminokyseliny 392 až 759) a myší (SEKVENCE ID. Č. 28, aminokyseliny 392 až 759) domény A2 faktoru VIII. Obrázek ID poskytuje aminokyselinovou sekvenci humánní (SEKVENCE ID. Č. 2, aminokyseliny 741 až 1648), prasečí (SEKVENCE ID. Č. 30, aminokyseliny 760 až 1449) a myší (SEKVENCE ID. Č. 28, aminokyseliny 760 až 1644) B domény faktoru VIII. Obrázek 1E srovnává aminokyselinové sekvence humánního, prasečího a myšího (SEKVENCE ID. Č. 2, aminokyseliny 1649 až 1689;

- 56 SEKVENCE ID. Č. 30, aminokyseliny 1450 až 1490; a SEKVENCE ID. Č. 28, aminokyseliny 1641 až 1678, v uvedeném pořadí) aktivačního peptidu lehkého řetězce faktoru VIII. Obrázek 1F poskytuje srovnání humánní, prasečí a myší sekvence (SEKVENCE ID. Č. 2, aminokyseliny 1690 až 2019; SEKVENCE ID. Č. 30, aminokyseliny 1491 až 1820; a SEKVENCE ID. Č. 28, aminokyseliny 1679 až 2006, v uvedeném pořadí) A3 domény faktoru VIII. Obrázek 1G ukazuje aminokyselinové sekvence Cl domény humánního, prasečího a myšího (SEKVENCE ID. Č. 2, aminokyseliny 2020 až 2172; SEKVENCE ID. Č. 30, aminokyseliny 1821 až 1973; a SEKVENCE ID. Č. 28, aminokyseliny 2007 až 2159, v uvedeném pořadí) faktoru VIII . Obrázek 1H ukazuje sekvence C2 domény humánního, prasečího a myšího (SEKVENCE ID. Č. 2, aminokyseliny 2173 až 2332; SEKVENCE ID. Č. 30, aminokyseliny 1974 až 2133; a SEKVENCE ID. Č. 28, aminokyseliny 2160 až 2319, v uvedeném pořadí) faktoru VIII.

Kosočtverce označují místa sulfatovaného tyrosinu, předpokládaná vazebná místa faktoru IXa, fosfolipidu a proteinu C jsou dvojitě podtržena, a úseky podílející se na vazbě anti-A2 a anti-C2 inhibičních protilátek jsou vyznačeny kurzívou. Hvězdičky vyznačují konzervativní aminokyselinové sekvence. Viz také SEKVENCE ID. Č. 29 (cDNA prasečího faktoru VIII) a SEKVENCE ID. Č. 30(dedukovaná aminokyselinová sekvence prasečího faktoru VIII). Je užit systém číslování humánní sekvence jako reference [Wood et al. (1984) supra]. Al, A2, a B domény jsou definovány trombinovými štěpnými místy v pozici 372 a 740 a štěpným místem neznámé proteázy v poloze 1648 jako segmenty zbytků 1 až 372, 373 až 740, a 741 až 1648, v uvedeném pořadí [Eaton, D.L. et al. (1986) Biochemistry 25:8343-8347). A3, Cl, a C2 domény jsou definovány jako zbytky 1690 až 2019, 2020 až 2172, a 2173 až 2332, v uvedeném pořadí [Vehar et al. (1984) supra). Štěpná místa pro trombin (faktor

Ila), faktor IXa, faktor Xa a APC [Fay et al: (1991) supra; Eaton, D. et al. (1986) Biochemistry 25:505-512; Lamphear, B.J. et al. (1992) Blood 80:3120-3128] jsou ukázána tak, že je jméno enzymu umístěno nad reaktivním argininem. Kyselý peptid je odštěpen od lehkého řetězce fVIII trombinem nebo faktorem Xa v poloze 1689. Předpokládaná vazebná místa pro faktor IXa [Fay, P.J. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:20522-20527; Lenting, P.J. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:7150-7155), fosfolipid (Foster, P.A. et al. (1990) Blood 75:1999-2004) a protein C (Walker, F.J. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:14841489] jsou dvojitě podtržena. Úseky zúčastněné ve vazbě antiA2 [Lubin et al. (1994) supra; Healey et al. (1995) supra] a již dříve navržené pro anti-C2 inhibiční protilátky jsou vyznačena kurzívou. C2 inhibitorový epitop identifikovaný jak zde bylo popsáno (aminokyseliny 2181 až 2243 v humánní sekvenci) je ukázán jako jedenkrát podtržený úsek na obrázku 1H. Místa sulfatovaného tyrosinu (Pittman et al. (1992) supra; Michnick et al. (1994) supra] jsou označena symbolem ♦.

Příklad 7

Konstrukce POL1212 a exprese v buňkách ledvin novorozených křečků

POL1212 je prasečí faktor VIII částečně bez domény B, mající B doménu deletovanou kromě toho, že 12 aminokyselin NH2 konce B domény a 12 aminokyselin -COOH konce jsou zachovány.

cDNA kódující sekvence pro domény Al, A2, ap-A3-Cl, a C2 prasečího fVIII byly získány, jak bylo popsáno v příkladu 5. Nukleotidová sekvence DNA a odvozená aminokyselinová sekvence prasečího faktoru VIII jsou uvedeny v seznamu sekvencí jako ·· ·· ► * ·

SEKVENCE ID. Č. 29 a SEKVENCE ID. Č. 30, v uvedeném pořadí. Amplifikované fragmenty byly odděleně klonovány do plazmidu pBluescript II K5 (pBS).

POL1212 se týká cDNA kódující prasečí fVIII postrádající většinu B domény, ale obsahující DNA sekvenci kódující 24 aminokyselinový linker mezi doménami A2 a ap. POL1212 byl konstruován v savčím expresním vektoru, ReNeo, který byl získán od firmy Biogen. ReNeo se může replikovat v bakteriích, může se replikovat jako epizom v buňkách COS pro přechodnou expresi faktoru VIII, nebo může být integrován do celé řady savčích buněk. Skládá se ze 1) sekvencí odvozených z plazmidu pBR322, které obsahují počátek replikace a gen rezistence na ampicilin, 2) gen rezistence na neomycin, jehož exprese je pod kontrolou SV40 promotoru/enhanceru, SV40 malého t intronu, a regulačního elementu SV40 polyadenylačního signálu, 3) místa pro inzerci fVIII a jeho signálního peptidu, jehož exprese je pod kontrolou SV40 enhanceru, hlavní pozdní promotor adenoviru typu 2, a tripartitní vedoucí sekvence adenoviru typu 2. Místo ReNeo vektoru může být užit každý vektor mající podobné funkční složky.

POL1212/ReNeo byl připraven v několika krocích. Nejdříve, byly cDNA kódující těžký řetězec prasečího fVIII (A1-A2) a cDNA kódující lehký řetězec prasečího fVIII (ap-A3-Cl-C2) odděleně sestaveny v pBS. Z těchto konstruktů byla DNA kódující prasečí fVIII bez domény B sestavena v pBS (PB-/pBS). Tato forma prasečího fVIII postrádá celou B doménu, definováno jako aminokyseliny obsahující zbytkům 741-1648 v humánním fVIII (nukleotidy 2278 - 5001 v humánní sekvenci) . Dále byla humánní A2 doména v expresním vektoru ReNeo (ΗΒ/ReNeo) s humánním fVIII postrádajícím doménu B substituována DNA kódující prasečí A2. Humánní domény byly substituovány DNA ·· kódující zbytek prasečího těžkého řetězce a DNA kódující prasečí lehký řetězec ve dvou dalších krocích s použitím konstruktů s prasečím těžkým řetězcem/pBS a PB/pBS vytvořených dříve. Fragment humánní B domény kódující 5 C-koncových a 9 N-koncových aminokyselin byl vložen mezi A2 a A3 domény za vzniku konstruktu nazvaného PSQ/ReNeo [Healey et al., 1998, 92: 37013709]. Zbytky Glu2181-Val2243 obsahují hlavní determinantu inhibičního epitopu v C2 doméně humánního faktoru VIII. Tento konstrukt byl použit jako templát pro vytvoření fragmentu prasečí B domény kódujícího 12 C-koncových a 12 N-koncových aminokyselin. Tento fragment byl vložen mezi domény A2 a A3, což mělo za následek konečný konstrukt, POL1212/ReNeo.

POL1212 linker se 24 aminokyselinami se skládá z prvních 12 a posledních 12 zbytků B domény prasečího fVIII. POL1212 linker má následující sekvenci:

SFAQNSRPPSASAPKPPVLRRHQR (sekvence id. č. 32)

Nukleotidová sekvence odpovídající 1212 linkeru a sousedících aminokyselin je (SEKVENCE ID. Č. 33)

GTC

ATT

GAA CCT

AGG AGC

TTT GCC CAG AAT TCA AGA CCC CCT AGT

V

I

E

P

R

S

F

A

Q

N

S

R

P

S

GCG

AGC

! GCT CCA AAG

CCT

CCG

GTC

CTG

CGA

CGG

CAT

CAG

AGG

GAC

A

S

A

P

K

P

V

L

R

H

Q

R

D

ATA

AGC

CTT

CCT

ACT

I S L P

T

POL1212 linker byl syntetizován mutagenezí „splicing-byoverlap extension (SOE) takto:

PCR reakce použité pro vytváření SOE produktů byly tyto:

Reakce č. 1

Vnější primer: Rev 4, což je primer pro prasečí A2, nukleotidy 1742-1761. (SEKVENCE ID. Č. 29). Sekvence je: 5'-GAGGAAAACCAGATGATGTCA-3' (SEKVENCE ID. Č. 34).

Vnitřní primer: 0L12, což je prasečí reverzní primer pokrývající prvních (5') 15 aminokyselin OL1212 a posledních (3') 5 aminokyselin prasečí A2. Sekvence je:

5' -CTTTGGAGCGCTCGCACTAGGGGGTCTTGAATTCTGGGCAAAGCTCCTAGGTTC AATGAC-3' (SEKVENCE ID. Č. 35)

Templát: PSQ/ReNeo

Produkt: prasečí DNA od nukleotidu 1742 v A2 doméně k 2322 v OL1212, 580 bp

Reakce č. 2

Vnější primer: P2949 je prasečí reverzní A3 primer, nukleotidy 2998-3021 ze sekvence id. č. 29. Sekvence je: 5'-GGTCACTTGTCTACCGTGAGCAGC-3' (viz SEKVENCE ID. Č. 29)

Vnitřní primer: 0L12+, prasečí primer pokrývající posledních (3’) 16 aminokyselin OL1212 a prvních (5¹) 6 aminokyselin aktivačního peptidu, nukleotidy 2302-2367 ze SEKVENCE ID. Č. 29. Sekvence je:

5'-CCTAGTGCGAGCGCTCCAAAGCCTCCGGTCCTGCGACGGCATCAGAGGGACATA AGCCTTCCTACT-3’ (SEKVENCE ID. Č. 36)

Templát: PSQ/ReNeo

Produkt: prasečí od nukleotidu 2302 v OL1212 do nukleotidu 3021 v doméně A3, 719 bp

SOE reakce

Primery: Rev 4, P2949Templáty: Fragment z reakce č. 1 (bp) a fragment s nízkou teplotou tání z reakce č. 2 (bp)

Produkt: prasečí DNA od nukleotidu 1742 v A2 doméně do nukleotidu 3021 v A3 doméně (SEKVENCE ID. Č. 29) včetně OL1212, 1279 bp. Reakční produkt byl precipitován ethanolem.

1212 linker byl vložen do PSQ/ReNeo štěpením SOE produktu (inzertu) a PSQ/ReNeo (vektoru) s BsaBI. Vektor a inzert byly ligovány s použitím T4 ligázy a produkt byl užit k transformaci buněk E. coli XLl-Blue. Plazmidová DNA byla připravena z několika kolonií a sekvence 1212 linkeru a další PCR generovaná sekvence byly ověřeny sekvenční analýzou DNA.

Pěstování buněk ledvin novorozených křečků (BHK) CRL-1632

Buněčná linie BHK byla získána ze sbírky ATCC, přístupová identifikace CRL-1632, a byla uložena zmražená v -20 °C až do dalšího použití. Buňky byly rozmraženy ve 37° C a vloženy do 10 ml kompletního média, definovaného jako DMEM/F12, 50 U/ml penicilinu, 50 gg/ml streptomycinu plus 10% fetální hovězí sérum (FBS). FBS bylo zakoupeno od firmy Hyclone, Logan, Utah. Buňky byly stočeny po dobu 2 minut ve 300 RPM. Médium bylo odsáto a buňky byly resuspendovány ve 2 ml kompletního média v láhvi T-75 obsahující 20 ml kompletního média.

POL1212 byl exprimován v buňkách jak ledvin novorozených

křečků (BHK), tak v buňkách vaječníků čínského křečka (CHO). Byly použity dvě BHK linie, linie CRL-1632 z ATCC a další BHK linie získaná od R. Mcgillivray, University of British Columbia, [Funk, et al., (1990) Biochemistry, 29:1654-1660]. Poslední zmíněné byly pěstovány bez selekce v laboratoři původců a nazvány BHK1632 (Emory). CHO buněčná linie byla CHO-K1, ATCC přístupové č. CCL-61. Exprese průměrného klonu z buněčné linie Emory a z buněk CHO-Kl byla poněkud vyšší než z buněk CRL-1632 , jak usuzováno z aktivity v chromogenním testu.

Buňky pěstované v lahvích T-75 vytvořily konfluentní monovrstvu. Bylo připraveno 60 ml kultury buněk E. coli XL1Blue nesoucích plazmid POL1212/ReNeo v médiu LB/ampicilin (50 mg/ml)

Transfekce buněk CRL-1632 BHK plazmidem POL1212/ReNeo

DNA z kultury buněk POLl212/ReNeo XLl-Blue pěstovaných přes noc byla připravena užitím soupravy pro minipreparaci Spin Miniprep kit (Qiagen, Valencia, CA) . Jedna láhev buněk CRL-1632 byla rozdělena do zásobní lahve se 0,2 ml a do lahve pro transfekci s 0,3 ml z celkových 2 ml. Další láhev byla doplněna čerstvým médiem. Médium bylo DMEM/F12 + 10% Hyclone FBS + 50 U/ml penicilinu, 50 μg/ml streptomycinu. Buňky

CRL-1632 byly rozděleny do 6 jamkových destiček a po dosažení 50 až 90 % konfluence určeny pro transfekci (0,3 ml buněk z lahve T-75 ve 2 ml 1:5000 Versene [Life Technologies, Gaithersburg, MD] v každé jamce) užitím čerstvého média DMEM/F12 + 10 % Hyclone FBS + 50 U/ml penicilín, 50 gg/ml streptomycin.

Následující roztoky byly připraveny byly připraveny ve

• ·· ·

- 63 sterilních zkumavkách o objemu 1 až 2 ml:

A) 48 μΐ (10 μς) Miniprep POLl212/ReNeo DNA plus μΐ média bez séra (DMEM/F12) plus 10 μΐ Lipofectin™ (Life Technologies, Gaithersburg, MD).

B) 10 μΐ Lipofectin plus 190 μΐ média („slepá transfekce) bylo jemně smícháno a DNA s Lipofectinem ponechány reagovat 15 minut při teplotě místnosti. Během tohoto času byly buňky promyty dvakrát se 2 ml DMEM/F12. 1,8 ml DMEM/F12 pak bylo přidáno k buňkám. Komplex DNA/Lipofectin byl přidán po kapkách k buňkám, a jemně protřepán, aby se promíchal. Buňky byly ponechány v inkubátoru přes noc. DNA/Lipofectin byl odebrán a přidány 3 ml média se sérem k buňkám. Buňky pak byly inkubovány 30 až 48 hodin. Geneticin byl zakoupen od firmy Life Technologies, Gaithersburg, MD. Buněčné kultury byly naředěny 1:20, 1:50 a 1:100, 1:250, 1:500 a naneseny na 10 cm misky v 10 ml média se sérem obsahujícím 535 μg/ml geneticinu. Za několik dnů buňky, které nepřijaly plazmid POL1212/ReNeo byly usmrceny působením geneticinu. Zbylé buňky pokračovaly v replikaci v médiu s geneticinem a vytvořily na miskách viditelné monovrstevné kolonie.

Exprese a test POL1212 v buňkách BHK CRL-1632

Malé plastové kroužky byly umístěny kolem kolonií. Kolonie byly odsáty odděleně použitím kompletního média a přeneseny do zkumavek. Tyto kolonie jsou označovány jako „kruhově klonované kolonie. Tyto kruhově klonované kolonie byly naneseny na 24 jamkové destičky a dále pěstovány v kompletním médiu.

Test s chromogenním substrátem pro expresi faktoru VIII pomocí buněk transfekovaných CRL-1632

Vzorky POL1212 ze supernatantů buněčných kultur byly smíchány s 50 nM purifikovaného prasečího faktoru IXa a 0,05 mM fosfatidylcholin/fosfatidylserinových (PCPS) vezikulů v 0,15M NaCl, 20 m HEPES, 5mM CaCl₂, 0,01 % Tween 80, pH 7,4. Jako kontrola bylo použito médium z buněčných kultur „slepě transfekovaných buněk. Trombin a faktor X byly přidány simultánně v konečné koncentraci 40 a 425 nM, v uvedeném pořadí. Trombin aktivuje faktor VIII, který pak, spolu s PCPS, slouží jako kofaktor pro faktor IXa v průběhu aktivace faktoru X.

Po 5 minutách aktivace faktoru X pomocí faktoru IXa/faktoru VlIIa/PCPS byla zastavena přidáním EDTA na konečnou koncentraci 50 mM. Ve stejném čase aktivace faktoru VIII trombinem byla zastavena přidáním inhibitoru trombinu, rekombinantního desulfatohirudinu, na konečnou koncentraci 100 nM. 25 μΐ vzorek reakční směs byl přenesen do jamky mikrotitrační destičky, kam bylo přidáno 74 μΐ Spectrozymu Xa (America Diagnostica, Grreenwich, CT), což je chromogenní substrát pro faktor Xa. Konečná koncentrace Spectrozymu Xa byla 0,6 mM. Změna absorbance při 405 nm v důsledku štěpení Spectrozymu Xa faktorem Xa byla monitorován souvisle po dobu 5 minut pomocí čtecího zařízení pro mikrotitrační destičky Vmax Kinetic Plate Reader (Molecular Devices, lne., Menlo Park, CA) . Výsledky jsou vyjádřeny jako hodnoty Aíos/min.

♦ ·· ·· ·· «« · « · · · • * · · t • · · · · * • ·· · ♦ ·· · ···

Chromogenní test na Faktor VIII deseti kruhově-klonovaných kolonií:

Počet kolonií	A₄₀5/min (x 10³)
Pufr	0,2
1	2,1
2	00
3	6,4
4	10,7
5	12,5
6	7,6
7	51,3
8	139,5
9	3,8
10	8,4

Tyto výsledky ukazují, že všech deset kolonií, které byly vybrány, exprimuje aktivitu faktoru VIII alespoň desetkrát vyšší než je hodnota pozadí.

Aktivita z média kolonie 8, která byla kolonií s nejvyšší expresí, byla dále zkoumána pomocí jednofázového koagulačního testu faktoru VIII. V tomto testu bylo 50 ml plazmy deficitní' na faktor VIII (George King Biomedical Overland Park, KA), 5 ml vzorku nebo standardu, a 50 ml reagencie pro aktivovaný parciální tromboplastinový test, APTT (Organon Teknika, Durham, NC) byly inkubovány 3 minuty ve 37 °C. Vzorky obsahovaly médium z kolonie 8 naředěné v 0,15 M NaCl, Hepes, pH 7,4 (HBS) nebo,jako kontrola, kompletní médium. Koagulace byla iniciována přidáním 50 ml 20 mM CaCl₂. Koagulační čas byl měřen použitím zařízení ST4 BIO Coagulation Instrument (Diagnostica Stago, Parsippany, NJ] . Standardní (kalibrační) křivka byla získána pomocí ředění sloučené, citrátem ošetřené ·« ·· • · · • * # • · · • · · • · ··· · normální humánní plazmy, šarže č. 0641 (George King Biomedical, Overland Park, KA) . Koncentrace standardu faktoru VIII byla 0,9 jednotky na 1 ml.

Standardní (kalibrační) křivka:

	Ředění	U/ml	Koagulační čas
1)	neředěno	0, 96	45,2
2)	1/3 (HBS)	0, 32	53,7
3)	1/11 (HBS)	0,087	62,5
4)	1/21 (HBS)	0,046	68,9

Lineární regrese funkce koagulačního času proti logaritmu koncentrace standardu poskytla korelační koeficient 0,997.

Test látek poskytl následující koagulační časy, které byly převedeny na hodnoty jednotky/ml použitím standardní křivky:

Vzorek Koagulační U/ml čas (s)

1)	Kolonie	8 (24h),	1/10 v HBS	40,6	1,74 x 10 = 17,4
2)	Kolonie	8 (24h),	1/10 v HBS	41,1	1,63 x 10 = 16,3
3)	Kolonie	8 (24h),	1/20 v HBS	47,7	0,69 x 20 = 13,8
4)	Kolonie	8 (24h),	1/20 v HBS	47,2	0,73 x 20 = 14,6
5)	Úplné médium		82,9	0,007
6)	Úplné médium		83,3	0,006

·· ·· · ·· ·· « · · « ·· · · · · · ···« · · · · · · • · ♦ · · ·· · · · · · « « · · · ♦ · · · · ·· ♦· ··» ·· ·· ····

Tyto výsledky ukazují, že koagulační aktivita kolonie 8 je přibližně 2000krát vyšší než u kontrolního vzorku.

DNA sekvence kódující POL1212 je zde uvedena v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID. Č. 37. Kódovaná aminokyselinová sekvence POL1212 je uvedena v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID. Č. 38. Další purifikace POL1212 mohou být prováděny použitím celé řady známých metod jako je např. imunoafinitní chromatografie a HPLC chromatografie - viz příklady 2 a 3.

Obecné poznámky na závěr

Je třeba mít na třeteli, že malé variace aminokyselinové sekvence nebo DNA sekvence kódující takovou aminokyselinovou sekvenci týkající se POL1212 mohou být vneseny, aniž by se podstatně změnila jejich základní funkce. Například délka sekvence B domény ponechané jako linker mezi A2 doménou a aktivačním peptidem může být větší nebo menší v rámci možností vyplývajících ze známého stavu techniky. Sekvenční varianty mohou být vneseny do úsek linkeru, přičemž se uchová ekvivalentně funkční POL1212 a prasečí faktor VIII bez domény B, jak je ukázáno v tomto textu a jak je známo ve stavu techniky. Na základě porovnání známých aminokyselinových sekvencí faktorů VIII majících koagulační aktivitu v humánní krvi, mohou být připraveny na základě aminokyselinové sekvence POL1212 sekvenční varianty jak substitucemi jednotlivých aminokyselin tak i substitucemi peptidových segmentů známými funkčními variantami, kteréžto varianty si zachovají své základní funkce. Zmíněné varianty nejsou nijak vyčerpávající a omezující, jsou uvedeny pouze jako příklad modifikací sekvence, které mohou být připraveny odborníkem na základě stavu techniky, aniž by se podstatně změnily vlastnosti • *· ·· ·♦ ·« · « · · · • · · · · · ♦ · · · #· ·· • · · · * * ··· ·· ·· ···· proteinu. Všechny takové varianty a modifikace spadají do nároků předkládaného vynálezu nebo jejich ekvivalentů.

Přehled sekvencí uvedených v seznamu sekvencí:

SEKVENCE ID. Č.	Identifikace
1	cDNA humánního faktoru VIII, kód pro aminokyselinu č. 1 zralého proteinu začíná nukleotidem č. 208.
2	Aminokyselinová sekvence humánního faktoru
3	cDNA A2 domény prasečího faktoru VIII
4	Aminokyselinová sekvence A2 domény prasečího faktoru VIII
5 až 27	Sekvence oligonukleotidových primerů (viz příklad 5)
28	Aminokyselinová sekvence myšího faktoru VIII
29	cDNA prasečího faktoru VIII
30	Aminokyselinová sekvence prasečího faktoru VIII
31	Aminokyselinová sekvence signálního peptidu humánního faktoru VIII
32 až 36	Sekvence oligonukleotidových primerů (viz příklad 7)
37	DNA kódující POL1212
38	Aminokyselinová sekvence POL1212

• a

Claims

DNA kódující aminokyselinovou sekvenci POL1212 uvedenou v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID. Č. 38.
2. Expresní vektor obsahující DNA podle nároku 1.
3. DNA podle nároku 1 mající nukleotidovou sekvenci uvedenou v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID. Č. 37.
4. Expresní vektor obsahující DNA podle nároku 3.
5. Modifikovaný prasečí faktor VIII mající aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako SEKVENCE ID. Č. 38.
6. Terapeutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje modifikovaný prasečí faktor VIII podle nároku 5 a fyziologicky přijatelný nosič.
7. Způsob přípravy proteinu modifikovaného prasečího faktoru VIII, který má aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako SEKVENCE ID. Č. 38, vyznačující se tím, že zahrnuje krok, kdy se v savčí hostitelské buňce exprimuje DNA kódující aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako SEKVENCE ID. Č. 38.
8. Způsob podle nároku 7 vyznačující se tím, že DNA kódující aminokyselinovou SEKVENCI ID. Č. 38 kóduje také signální peptid, prostřednictvím kterého je modifikovaný prasečí faktor VIII exportován ze savčí hostitelské buňky.
9. Způsob podle nároku 8 vyznačující se tím, že ·· *· * · · ·

136 signální peptid má sekvenci aminokyselin 1 až 19 ze SEKVENCE ID. Č. 30.
10. Savčí buňka, která obsahuje a replikuje expresní vektor obsahující DNA kódující aminokyselinovou sekvenci POL1212 uvedenou v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID. Č. 38.
11. Savčí buňka podle nároku 10, kde vektor obsahuje DNA mající SEKVENCI ID. Č. 37.
12. Buňka podle nároku 11, kde hostitelská buňka je BHK CRL-1632.