RS63583B1 - Himerni proteini faktora viii i njihova upotreba - Google Patents

Description

Opis

OBLAST ТЕHNIKЕ

[0001] Hemofilija A je poremećaj krvarenja uzrokovan defektima u genu koji kodira faktor koagulacije VIII (FVIII) i pogađa 1-2 od 10.000 muških novorođenih. Graw et al., Nat. Rev. Genet. 6(6): 488-501 (2005). Pacijenti oboleli od hemofilije A mogu se lečiti infuzijom prečišćenog ili rekombinantno proizvedenog FVIII. Međutim, poznato je da svi komercijalno dostupni proizvodi FVIII imaju poluživot od oko 8-12 časova, što zahteva čestu intravensku primenu pacijentima. Vidi Weiner M.A. and Cairo, M.S., Pediatric Hematology Secrets, Lee, M.T., 12. Disorders of Coagulation, Elsevier Health Sciences, 2001; Lillicrap, D. Thromb. Res. 122 Suppl 4:S2-8 (2008). Pored toga, pokušano je i sa brojnim pristupima kako bi se produžio poluživot FVIII. Na primer, pristupi u razvoju za produženje poluživota faktora zgrušavanja uključuju pegilaciju, glikopegilaciju i konjugaciju sa albuminom. Vidi Dumont et al., Blood.119(13): 3024-3030 (Objavljeno na mreži 13. januara 2012. godine). Međutim, bez obzira na proteinski inženjering koji se koristi, dugo delujući FVIII proizvodi koji se trenutno razvijaju imaju ograničen poluživot - samo oko 1,5 do 2 časa u pretkliničkim životinjskim modelima. Vidi id. Kod ljudi su dokazani konzistentni rezultati, na primer, prijavljeno je da rFVIIIFc poboljšava poluživot do ~ 1,7 puta u poređenju sa ADVATE<®>kod pacijenata sa hemofilijom A. Vidi Id. Stoga, povećanje poluživota, uprkos manjim poboljšanjima, može ukazivati na prisustvo drugih ograničavajućih faktora T1/2. Vidi Liu, T. et al., 2007 ISTH meeting, abstract # P-M-035; Henrik, A. et al., 2011 ISTH meeting, abstract #P= MO-181; Liu, T. et al., 2011 ISTH meeting abstract #P-WE-131.

[0002] Plazma von Willebrand faktora (VWF) ima poluživot od približno 16 časova (u rasponu od 13 do 18 časova). Goudemand J, et al. J Thromb Haemost 2005;3:2219-27. Na poluživot VWF mogu uticati brojni faktori: obrazac glikozilacije, ADAMTS-13 (dezintegrin i metaloproteaza sa motivom-13 trombospondina) i različite mutacije u VWF.

[0003] U plazmi, 95-98% FVIII cirkuliše u uskom ne-kovalentnom kompleksu sa VWF pune dužine. Formiranje ovog kompleksa je važno za održavanje odgovarajućeg nivoa FVIII u plazmi in vivo. Lenting et al., Blood.92(11): 3983-96 (1998); Lenting et al., J. Tromb.

Haemost. 5(7): 1353-60 (2007). Divlji FVIII pune dužine je uglavnom prisutan kao heterodimer koji ima teški lanac (MM 200kD) i laki lanac (MM 73kD). Kada je FVIII aktiviran zbog proteolize na pozicijama 372 i 740 u teškom lancu i na poziciji 1689 u lakom lancu, VWF vezan za FVIII se uklanja iz aktiviranog FVIII. Aktivirani FVIII, zajedno sa aktiviranim faktorom IX, kalcijumom i fosfolipidom ("kompleks tenaze"), indukuje aktivaciju faktora X, generišući velike količine trombina. Trombin, pak, zatim cepa fibrinogen da formira rastvorljive fibrin monomere, koji se zatim spontano polimerizuju da formiraju rastvorljivi fibrin polimer. Trombin takođe aktivira faktor XIII, koji, zajedno sa kalcijumom, služi za umrežavanje i stabilizaciju rastvorljivog polimera fibrina, formirajući umrežene (nerastvorljive) fibrine. Aktivirani FVIII se brzo uklanja iz cirkulacije proteolizom.

[0004] Zbog učestalog doziranja i neprijatnosti izazvanih rasporedom doziranja, još uvek postoji potreba za razvojem proizvoda sa FVIII koji zahtevaju ređu primenu, tj. proizvoda sa FVIII koji ima poluživot duži od 1,5 do 2 puta ograničenja poluživota.

KRATAK REZIME PRONALASKA

[0005] Ovaj pronalazak pruža himerni protein koji obuhvata

(i) prvi polipeptid koji obuhvata

a) protein faktor VIII ("FVIII"),

b) XTEN prvog polipeptida, i

c) prvi Fc region,

gde protein FVIII ima aktivnost FVIII; i

(ii) drugi polipeptid, koji obuhvata

a) fragment von Willebrand-ovog faktora ("VWF") koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 99% identična aminokiselinskoj sekvenci pokazanoj u aminokiselinama 764 do 1240 SEQ ID NO: 21,

b) XTEN drugog polipeptida,

c) linker od 10 do 50 aminokiselina koji se može cepati i koji obuhvata a2 region FVIII koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu Glu720 do Arg740 koja odgovara SEQ ID NO: 65, pri čemu je a2 region sposoban da se cepa trombinom, i

d) drugi Fc region,

gde se VWF fragment vezuje za protein FVIII;

gde XTEN drugog polipeptida obuhvata aminokiselinsku sekvencu kako je pokazano u SEQ ID NO: 58;

gde XTEN prvog polipeptida obuhvata aminokiselinsku sekvencu kako je pokazano u SEQ ID NO: 8;

gde je prvi Fc region asociran sa drugim Fc regionom disulfidnom vezom; i gde je poluživot himernog proteina produžen u poređenju sa proteinom FVIII bez VWF fragmenta.

[0006] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje himerni protein koji sadrži

(i) prvi polipeptid koji obuhvata

a) protein faktor VIII ("FVIII"),

b) XTEN prvog polipeptida, i

c) prvi Fc region,

gde protein FVIII ima aktivnost FVIII; i

(ii) drugi polipeptid, koji obuhvata

a) fragment von Willebrand-ovog faktora ("VWF") koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 99% identična aminokiselinskoj sekvenci pokazanoj u aminokiselinama 764 do 1240 SEQ ID NO: 21,

b) XTEN drugog polipeptida,

c) linker od 10 do 50 aminokiselina koji se može cepati i koji obuhvata a2 region FVIII koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu Glu720 do Arg740 koja odgovara SEQ ID NO: 65, pri čemu je a2 region sposoban da se cepa trombinom, i

d) drugi Fc region,

gde se VWF fragment vezuje za protein FVIII;

gde fragment VWF sadrži aminokiselinu različitu od cisteina supstuisanu za ostatak koji odgovara ostacima 1099 i 1142 iz SEQ ID NO: 21;

gde XTEN drugog polipeptida obuhvata aminokiselinsku sekvencu kako je prikazano u SEQ ID NO: 58;

gde XTEN prvog polipeptida obuhvata aminokiselinsku sekvencu kako je prikazano u SEQ ID NO: 8;

gde je prvi Fc region asociran sa drugim Fc regionom disulfidnom vezom; i gde je poluživot himernog proteina produžen u poređenju sa proteinom FVIII bez fragmenta VWF.

[0007] U određenim otelotvorenjima, prvi polipeptid se dalje sastoji od druge XTEN sekvence koja povezuje protein FVIII sa prvim Fc regionom. Takođe je obelodanjen himerni protein kao što je opisano u ovom dokumentu, gde prvi polipeptid obuhvata treću XTEN sekvencu koja je umetnuta na jedno ili više mesta insercije unutar proteina FVIII. U nekim otelotvorenjima prvi polipeptid se dalje sastoji od druge XTEN sekvence koja je umetnuta na jedno ili više mesta insercije unutar proteina FVIII. U određenim otelotvorenjima, prvi polipeptid obuhvata treću XTEN sekvencu koja povezuje protein FVIII sa prvim Fc regionom.

[0008] Takođe je obelodanjen himerni protein kao što je opisano u ovom dokumentu, gde su druga XTEN sekvenca, treća XTEN sekvenca, ili druga i treća XTEN sekvenca nezavisno izabrane iz grupe koju čine AE42, AE72, AE864, AE576, AE288, AE144, AG864, AG576, AG288 i AG144. U nekim otelotvorenjima, druga XTEN sekvenca, treća XTEN sekvenca, ili druga i treća XTEN sekvenca su izabrane nezavisno iz SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 62; ili SEQ ID NO: 63. U određenim otelotvorenjima, druga XTEN sekvenca, treća XTEN sekvenca, ili i druga i treća XTEN sekvenca su svaka nezavisno AE288 ili AG288.

[0009] Prvi Fc region i drugi Fc region mogu produžiti poluživot himernog proteina. U nekim otelotvorenjima prvi polipeptid i drugi polipeptid je fuzionisan pomoću linkera. U određenim otelotvorenjima, prvi polipeptid i drugi polipeptid su fuzionisani procesabilnim linkerom. U nekim otelotvorenjima prvi Fc region je asociran sa drugim Fc regionom. U određenim otelotvorenjima prvi Fc region je asociran sa drugim Fc regionom kovalentnom vezom. U nekim otelotvorenjima kovalentna veza je disulfidna veza.

[0010] U određenim otelotvorenjima linker sadrži fragment a2 regiona FVIII. Fragment a2 regiona može u nekim slučajevima da sadrži sekvencu DKNTGDYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 88). U jednom konkretnom otelotvorenju, linker sadrži aminokiselinsku sekvencu IEPRSFS (SEQ ID NO: 194). U drugom otelotvorenju, linker obuhvata aminokiselinsku sekvencu IEPRSFS (SEQ ID NO: 194), pri čemu linker nije a2 region FVIII pune dužine.

[0011] Takođe je obelodanjen himerni protein kao što je opisano u ovom dokumentu, gde a2 region FVIII obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95% ili 100% identična sa ili ISDKNTGDYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 106) ili DKNTGDYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 88).

[0012] Takođe je obelodanjen himerni protein kako je opisano u ovom dokumentu, pri čemu je poluživot himernog proteina najmanje oko 17 časova, najmanje oko 18 časova, najmanje oko 19 časova, najmanje oko 20 časova, najmanje oko 21 čas, najmanje oko 22 časa, najmanje oko 23 časa, najmanje oko 24 časa, najmanje oko 25 časova, najmanje oko 26 časova, najmanje oko 27 časova, najmanje oko 28 časova, najmanje oko 29 časova, najmanje oko 30 časova, najmanje oko 31 čas, najmanje oko 32 časa, najmanje oko 33 časa, najmanje oko 34 časa, najmanje oko 35 časova, najmanje oko 36 časova, najmanje oko 48 časova, najmanje oko 60 časova, najmanje oko 72 časa, najmanje oko 84 časa, najmanje oko 96 časova ili najmanje oko 108 časova. U nekim otelotvorenjima poluživot himernog proteina je oko 40 časa kod miševa HemA. U određenim otelotvorenjima, fragment VWF se ne vezuje u značajnoj meri za receptor VWF klirensa. U nekim otelotvorenjima, VWF fragment je sposoban da zaštiti protein FVIII od jednog ili više proteaza cepanja, štiteći protein FVIII od aktiviranja, stabilizujući teški lanac i/ili laki lanac proteina FVIII, ili sprečavajući klirens proteina FVIII od strane jednog ili više receptora sakupljača.

[0013] Neka otelotvorenja uključuju himerni protein kako je opisano u ovom dokumentu, pri čemu fragment VWF inhibira ili sprečava endogeni VWF da se veže za protein FVIII štiteći ili blokirajući mesto vezivanja VWF na proteinu FVIII. U određenim otelotvorenjima, VWF mesto vezivanja se nalazi u domenu A3 ili domenu C2 proteina FVIII ili i domenu A3 i domenu C2. U nekim otelotvorenjima mesto vezivanja VWF obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja odgovara aminokiselinama 1669 do 1689 i 2303 do 2332 SEQ ID NO: 65. U nekim otelotvorenjima, prvi Fc region i drugi Fc region su identični ili različiti.

[0014] Takođe je obelodanjen himerni protein kao što je ovde opisano, pri čemu protein FVIII obuhvata jedan ili više domena FVIII izabranih od A1 domena, a1 kiselog regiona, A2 domena, a2 kiselog regiona, B domena, A3 domena, a3 kiselog regiona, C1 domena, C2 domena, jednog ili više njihovih fragmenata i bilo koje njihove kombinacije.

[0015] Takođe je obelodanjen himerni protein kao što je opisano u ovom dokumentu, gde se jedno ili više mesta insercije u protein FVIII nalazi unutar jednog ili više domena proteina FVIII izabranog iz grupe koju čine A1 domen, a1 kiseli region, A2 domen, a2 kiseli region, A3 domen, domen B, domen C1, domen C2 i bilo koje njihove kombinacije ili između jednog ili više domena proteina FVIII izabranog iz grupe koju čine domen A1 i a1 kiseli region, a1 kiseli region i A2 domen, A2 domen i a2 kiseli region, a2 kiseli region i B domen, B domen i A3 domen, A3 domen i C1 domen, C1 domen i C2 domen, i sve njihove kombinacije ili između dva domena proteina FVIII izabranog iz grupe koju čine A1 domen i a1 kiseli region, a1 kiseli region i A2 domen, A2 domen i a2 kiseli region, a2 kiseli region i B domen, B domen i domen A3, domen A3 i domen C1, domen C1 i domen C2, i sve njihove kombinacije. U nekim otelotvorenjima jedno ili više mesta insercije u protein FVIII su jedna ili više aminokiselina izabranih iz grupe koja se sastoji od ostataka aminokiselina iz Tabele 7, Tabele 8, Tabele 9 i Tabele 10. U određenim otelotvorenjima mesta insercije u protein FVIII nalaze se neposredno nizvodno od aminokiseline 745 koja odgovara zrelom proteinu FVIII (SEQ ID NO: 65). U nekim otelotvorenjima mesta insercije u protein FVIII nalaze se neposredno nizvodno od ostatka 1656 i ostatka 1900 koji odgovara zrelom proteinu FVIII (SEQ ID NO: 65). U nekim otelotvorenjima mesta insercije u protein FVIII su neposredno nizvodno od ostataka 26, 1656 i 1900 koji odgovaraju zrelom proteinu FVIII (SEQ ID NO: 65). U određenim otelotvorenjima mesta insercije u protein FVIII nalaze se neposredno nizvodno od ostataka 403 i 745 koja odgovaraju zrelom proteinu FVIII (SEQ ID NO: 65). U nekim otelotvorenjima mesta insercije u protein FVIII su neposredno nizvodno od ostataka 745 i 1900 koji odgovaraju zrelom proteinu FVIII (SEQ ID NO: 65). U određenim otelotvorenjima mesta insercije u protein FVIII nalaze se neposredno nizvodno od ostataka 18 i 745 koji odgovaraju zrelom proteinu FVIII (SEQ ID NO: 65). U nekim otelotvorenjima, protein FVIII je izoforma dvolančanog FVIII. U nekim otelotvorenjima, protein FVIII je izoforma jednolančanog FVIII. U određenim otelotvorenjima, protein FVIII obuhvata domen B ili njegov deo. U nekim otelotvorenjima, protein FVIII je FVIII sa obrisanim B domenom.

[0016] Neka otelotvorenja uključuju himerni protein kao što je opisano u ovom dokumentu, pri čemu jednolančana izoforma FVIII sadrži najmanje jednu supstituciju aminokiselina na ostatku koji odgovara ostatku 1648, ostatku 1645, ili oba ostatka koji odgovaraju zrelom faktor VIII polipeptidu pune dužine (SEQ ID NO: 65) ili ostatku 754, ostatku 751 ili oba ostatka SQ BDD faktor VIII (SEQ ID NO: 67). U određenim otelotvorenjima supstitucija aminokiseline je aminokiselina različita od arginina. U nekim otelotvorenjima, dvolančana izoforma FVIII obuhvata prvi lanac koji se sastoji od teškog lanca FVIII i drugi lanac koji se sastoji od lakog lanca FVIII, pri čemu su teški lanac i laki lanac međusobno asocirani metalnom vezom. Obelodanjen ovde je D' domen koji može da sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnu aminokiselinama 764 do 866 SEQ ID NO: 21. Ovde je takođe obelodanjen D3 domen koji može da sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnu aminokiselinama 867 do 1240 SEQ ID NO: 21. VWF protein može biti monomer.

[0017] Takođe je obelodanjen himerni protein kao što je opisano u ovom dokumentu, koji se sastoji od najmanje dva VWF proteina, najmanje tri VWF proteina, najmanje četiri VWF proteina, najmanje pet VWF proteina ili najmanje šest VWF proteina. Ovde obelodanjeni su VWF proteini koji mogu da sadrže aminokiselinsku sekvencu najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnu aminokiselinama 764 do 1240 SEQ ID NO: 21. U nekim otelotvorenjima, VWF protein se u suštini sastoji od ili se sastoji od aminokiselina 764 do 1240 SEQ ID NO: 21. Protein VWF može da sadrži najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u ostatku koji odgovara ostatku 1099, ostatku 1142 ili oba ostatka 1099 i 1142 SEQ ID NO: 21. Protein VWF može da sadrži aminokiselinu različitu od cisteina koji je supstituisan za ostatak koji odgovara ostatku 1099, ostatku 1142, ili oba ostatka 1099 i 1142 SEQ ID NO: 21. U određenom otelotvorenju pronalaska, fragment VWF sadrži ostatak alanina supstituisan za ostatke koji odgovaraju ostacima 1099 i 1142 SEQ ID NO: 21. VWF protein se dalje može sastojati od D1 domena, D2 domena, ili D1 i D2 domena VWF.

[0018] U himernom proteinu kao što je opisano ovde, VWF protein može dalje da se sastoji od VWF domena izabranog iz grupe koju čine A1 domen, A2 domen, A3 domen, D4 domen, B1 domen, B2 domen, B3 domen, C1 domen, C2 domen, CK domen, jedan ili više njihovih fragmenata i bilo koje njihove kombinacije.

[0019] Takođe je obelodanjen himerni protein kako je ovde opisano, pri čemu protein VWF suštinski sadrži ili sadrži: (1) domene D' i D3 VWF ili njihove fragmente; (2) domene D1, D' i D3 VWF ili njihove fragmente; (3) domene D2, D' i D3 VWF ili njihove fragmente; (4) domene D1, D2, D' i D3 VWF ili njihove fragmente; ili (5) domene D1, D2, D', D3 i A1 VWF ili njihove fragmente.

[0020] Takođe je obelodanjen himerni protein kao što je opisano u ovom dokumentu, pri čemu VWF protein dalje sadrži signalni peptid VWF ili FVIII koji je operativno povezan sa VWF proteinom.

[0021] U nekim otelotvorenjima, himerni protein kao što je opisano ovde je polisijalizovan, pegilizovan ili hesilizovan.

[0022] Takođe je obelodanjen himerni protein kao što je opisano u ovom dokumentu, pri čemu prvi polipeptid obuhvata najmanje 80%, 90%, 95%, 99% ili 100% identičan FVIII161 (SEQ ID NO: 69), FVIII169 (SEQ ID NO: 70), FVIII173 (SEQ ID NO: 72), FVIII195 (SEQ ID NO: 73), FVIII196 (SEQ ID NO: 74), FVIII199 (SEQ ID NO: 75), FVIII201 (SEQ ID NO: 76), FVIII203 (SEQ ID NO: 77), FVIII204 (SEQ ID NO: 78), FVIII205 (SEQ ID NO: 79), FVIII266 (SEQ ID NO: 80), FVIII267 (SEQ ID NO: 81), FVIII268 (SEQ ID NO: 82), FVIII269 (SEQ ID NO: 83), FVIII271 (SEQ ID NO: 84), FVIII272 (SEQ ID NO: 85), ili FVIII282 (SEQ ID NO: 159), a drugi polipeptid sadrži najmanje oko 80%, 90%, 95%, 99%, ili 100% identičan VWF059 (SEQ ID NO: 197). U drugim otelotvorenjima prvi polipeptid sadrži FVIII169 (SEQ ID NO: 70), a drugi polipeptid sadrži VWF059 (SEQ ID NO: 197). U nekim otelotvorenjima, himerni protein je efikasan u sprečavanju i/ili zaustavljanju krvarenja kod ispitanika kome je to potrebno.

[0023] Takođe je obelodanjen polinukleotid ili skup polinukleotida koji kodiraju himerni protein kako je opisano u ovom dokumentu. U nekim otelotvorenjima, polinukleotid, kao što je ovde opisano, dalje se sastoji od polinukleotidnog lanca, koji kodira PC5 ili PC7.

[0024] Neka otelotvorenja uključuju vektor koji se sastoji od polinukleotida kako je ovde opisano i jednog ili više promotora operativno povezanih sa polinukleotidom ili skupom polinukleotida.

[0025] U nekim otelotvorenjima vektor, kao što je ovde opisano, dalje se sastoji od dodatnog vektora, koji se sastoji od polinukleotidnog lanca koji kodira PC5 ili PC7.

[0026] Takođe je obelodanjena ćelija domaćina koja sadrži polinukleotid ili vektor kako je ovde opisano. U nekim otelotvorenjima ćelija domaćina je ćelija sisara. U određenim otelotvorenjima ćelija sisara je izabrana od HEK293 ćelije, CHO ćelije i BHK ćelije.

[0027] Takođe je obelodanjen farmaceutski sastav koji se sastoji od himernog proteina i farmaceutski prihvatljivog nosača. U nekim otelotvorenjima himerni protein ima produženi poluživot u poređenju sa FVIII proteinom divljeg tipa. Kod određenih otelotvorenja, poluživot himernog proteina je produžen najmanje oko 1,5 puta, najmanje oko 2 puta, najmanje oko 2,5 puta, najmanje oko 3 puta, najmanje oko 4 puta, najmanje oko 5 puta, najmanje oko 6 puta, najmanje oko 7 puta, najmanje oko 8 puta, najmanje oko 9 puta, najmanje oko 10 puta, najmanje oko 11 puta ili najmanje oko 12 puta duže od FVIII divljeg tipa.

[0028] Neka otelotvorenja uključuju sastav kako je opisano u ovom dokumentu, pri čemu je poluživot himernog proteina najmanje oko 17 časova, najmanje oko 18 časova, najmanje oko 19 časova, najmanje oko 20 časova, najmanje oko 21 čas, najmanje oko 22 časa, najmanje oko 23 časa, najmanje oko 24 časa, najmanje oko 25 časova, najmanje oko 26 časova, najmanje oko 27 časova, najmanje oko 28 časova, najmanje oko 29 časova, najmanje oko 30 časova, najmanje oko 31 čas, najmanje oko 32 časa, najmanje oko 33 časa, najmanje oko 34 časa, najmanje oko 35 časova, najmanje oko 36 časova, najmanje oko 48 časova, najmanje oko 60 časova, najmanje oko 72 časa, najmanje oko 84 časa, najmanje oko 96 časova ili najmanje oko 108 časova. U nekim otelotvorenjima poluživot himernog proteina je oko 40 časova kod miševa HemA. U nekim otelotvorenjima, sastav opisan u ovom dokumentu se primenjuje putem koji je izabran iz grupe koja se sastoji od topikalne (lokalne) primene, intraokularne primene, parenteralne primene, intratekalne primene, subduralne primene i oralne primene. Kod određenih otelotvorenja parenteralna primena je intravenska ili supkutana primena. U nekim otelotvorenjima, sastav opisan u ovom dokumentu se koristi za lečenje bolesti ili stanja krvarenja u ispitaniku kome je to potrebno. U određenim otelotvorenjima bolest ili stanje krvarenja je izabrana iz grupe koja se sastoji od poremećaja koagulacije krvarenja, hemartroze, krvarenja iz mišića, krvarenja iz usta, hemoragije, hemoragije u mišićima, oralne hemoragije, traume, traume kapitis, gastrointestinalnog krvarenja, intrakranijalne hemoragije, intra-abdominalne hemoragije, intratorakalne hemoragije, preloma kostiju, krvarenja iz centralnog nervnog sistema, krvarenja u retrofaringealnom prostoru, krvarenja u retroperitonealnom prostoru, krvarenja u iliopsoasnom omotaču i njihovih bilo kojih kombinacija. U nekim otelotvorenjima, ispitanik treba da se podvrgne operaciji. Kod određenih otelotvorenja tretman je profilaktički ili na zahtev.

[0029] Takođe je obelodanjena metoda produženja ili povećanja vremena poluživota himernog proteina, pri čemu metoda obuhvata dodavanje efikasne količine himernog proteina ili sastava kako je ovde opisano ispitaniku kome je potrebno, pri čemu protein VWF, sekvenca XTEN, prvi konstantni region Ig ili njihov deo, a drugi konstantni region Ig ili njegov deo povećavaju poluživot himernog proteina.

[0030] Neka otelotvorenja uključuju himerni protein ili sastav kako je opisano u ovom dokumentu za upotrebu u metodi lečenja bolesti ili poremećaja krvarenja kod ispitanika kome je to potrebno, uključujući davanje efikasne količine himernog proteina ili sastava kako je ovde opisano, pri čemu se bolest ili poremećaj krvarenja bira iz grupe koja se sastoji od poremećaja koagulacije krvarenja, hemartroze, krvarenja iz mišića, krvarenja iz usta, hemoragije, hemoragije u mišićima, oralne hemoragije, traume, traume kapitis, gastrointestinalnog krvarenja, intrakranijalne hemoragije, intra-abdominalne hemoragije, intratorakalne hemoragije, preloma kostiju, krvarenja iz centralnog nervnog sistema, krvarenja u retrofaringealnom prostoru, krvarenja u retroperitonealnom prostoru, krvarenja u iliopsoasnom omotaču i njihovih bilo kojih kombinacija. U nekim otelotvorenjima ispitanik je životinja. U određenim otelotvorenjima životinja je čovek. Kod nekih otelotvorenja ispitanik pati od hemofilije A. Kod određenih otelotvorenja tretman je profilaktički ili na zahtev. U nekim otelotvorenjima efikasna količina je 0,1 µg/kg do 500 mg/kg.

[0031] Takođe je obelodanjena metoda opisana u ovom dokumentu, pri čemu se himerni protein ili sastav opisan u ovom dokumentu primenjuje putem izabranim iz grupe koja se sastoji od topikalne primene, intraokularne primene, parenteralne primene, intratekalne primene, subduralne primene i oralne primene. U određenim otelotvorenjima parenteralna primena se bira iz grupe koja se sastoji od intravenske primene, supkutane primene, intramuskularne primene i intradermalne primene.

[0032] Takođe je obelodanjena metoda pravljenja himernog proteina, koja se sastoji od transfekcije jedne ili više ćelija domaćina sa polinukleotidom ili vektorom kako je opisano ovde i ekspresije himernog proteina u ćeliji domaćina. Metoda opisana u ovom dokumentu može se dalje sastojati od izolovanja himernog proteina. Himerni protein je efikasan u zaustavljanju i/ili sprečavanju krvarenja u ispitaniku.

KRATAK OPIS SLIKA

[0033]

Na Slici 1 prikazan je šematski dijagram himernog proteina koji se sastoji od prvog polipeptida koji obuhvata protein FVIII (A1-A2-parcijalni ili puni B-A3-C1-C2) fuzionisan sa Fc regionom, pri čemu je XTEN insertovan na mestu insercije unutar FVIII proteina, a drugi polipeptid koji se sastoji od VWF proteina koji se sastoji od D'D3 domena, XTEN koji ima manje od 288 aminokiselina, linkera koji može cepati trombinom i drugog Fc regiona. XTEN insercije u protein FVIII i/ili fuzije sa proteinom VWF produžavaju poluživot himernog proteina povećanjem hidrodinamičkog radijusa i blokiranjem klirensa koji je posredovan receptorom. D'D3 domeni VWF blokiraju interakciju FVIII sa endogenim VWF, stabilizuju protein FVIII i produžavaju poluživot himernog proteina. Fc domeni mogu kovalentno povezati D'D3 domene sa FVIII proteinom i produžiti poluživot himernog proteina putem FcRn posredovanog puta recikliranja. Linker koji se može cepati trombinom omogućava oslobađanje D'D3 domena nakon aktivacije FVIII i obezbeđuje ispravno poređenje između FVIII i D'D3 domena VWF.

Na slici 2 prikazana su tri sistema ekspresije plazmida za heterodimere FVIII-XTEN-Fc: prvi plazmid koji se sastoji od nukleotidne sekvence koja kodira jednolančani FVIII-XTEN-Fc u kome je XTEN insertovan u B domen; drugi plazmid koji se sastoji od nukleotidne sekvence koja kodira D1D2D'D3-XTEN-Fc, u kome sekvenca XTEN sadrži manje od 288 aminokiselina; i treći plazmid koji se sastoji od nukleotidne sekvence koja kodira PACE, enzim za obradu propeptida. Kada su tri polipeptida eksprimirana iz tri plazmida, D1D2 propeptidni domeni VWF mogu se obraditi iz D'D3 domena intracelularnom obradom.

Rezultirajući kompleks sadrži tri proizvoda, prvi molekul su heterodimeri

FVIII-XTEN/D'D3, drugi molekul je sporedni proizvod, homodimer D'D3-XTEN-Fc, a treći molekul je još jedan sporedni proizvod, tj. FVIII(XTEN)-Fc.

Na slici 3 prikazani su aditivni efekti XTEN insercija na produženje poluživota heterodimera. FVIII169 sadrži protein FVIII sa obrisanim domenom B koji je fuzionisan sa Fc regionom, pri čemu je XTEN sekvenca (npr. AE288) insertovana kod aminokiseline 745 koja odgovara zrelom FVIII pune dužine. FVIII205 sadrži protein FVIII sa obrisanim domenom B koji je fuzionisan sa Fc regionom, pri čemu je XTEN sekvenca (npr.144XTEN) insertovana kod aminokiseline 18 koja odgovara zrelom FVIII pune dužine, a druga XTEN sekvenca (npr. AE288) je insertovana kod aminokiseline 745 koja odgovara zrelom FVIII pune dužine. VWF031 obuhvata D' domen i D3 domen VWF fuzionisanog sa Fc regionom putem linkera koji se može cepati trombinom (bez XTEN). VWF034 obuhvata D' domen i D3 domen VWF fuzionisanog sa AE288 i Fc regionom. Poluživot FVIII169/VWF031 (obrnuti trougao) je 16,7 časova kod miševa HemA; poluživot FVIII205/VWF031 (krug) je 29,4 časa kod miševa HemA; a poluživot FVIII169/VWF034 (kvadrat) je 31,1 čas kod miševa HemA.

Slika 4 pokazuje da aminokiselina 144 XTEN daje bolje produženje poluživota od aminokiseline 288 XTEN kada je insertovana između D'D3 domena VWF i Fc domena. Na primer, dok je poluživot VWF169/VWF034 (kvadrat) 31,1 čas kod miševa HemA, poluživot FVIII169/VWF057 (krug) je 42 časa kod miševa HemA. VWF057 obuhvata D'D3 domene VWF fuzionisane sa aminokiselinom 144 XTEN i Fc regionom.

Slika 5 pokazuje da su Fc domeni potrebni za produženje poluživota heterodimera himernih proteina. Kada je upoređen poluživot FVIII205/VWF031 (krug) kod miševa HemA sa poluživotom FVIII263/VWF050 (kvadrat), koji sadrži mutacije na mestima vezivanja FcRn (trostruka mutacija IHH Fc) i stoga se ne može reciklirati putem FcRn puta, poluživot FVIII263/VWF050 (23 časa) je kraći od poluživota VWF205/VWF031 (29,4 časa). Ovo ukazuje da su Fc regioni neophodni za produženje poluživota.

Slika 6A pokazuje sličnu akutnu efikasnost FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc heterodimera u poređenju sa FVIII sa obrisanim B domenom (SQ BDD FVIII) u modelu repne kopče kod HemA miševa. Miševima je dozirano 75 IU/kg, a aktivnost je izmerena aPTT testom. SQ BDD FVIII je prikazan kao krug, dok je FVIII169/VWF034 prikazan kao kvadrat, FVIII169/VWF057 je prikazan kao romb, a nosilac je prikazan kao obrnuti trougao. Detalji konstrukta FVIII169, VWF034 i VWF057 prikazani su na drugom mestu. Slika 6B prikazuje poređenje akutne efikasnosti FVIII169/VWF034 sa FVIII sa obrisanim B domenom (SQ BDD FVIII) kod miševa HemA pri dozi od 37,5 IU/kg, a aktivnost je merena aPTT testom. Medijana gubitka krvi (uL) miševa u svakoj terapijskoj grupi prikazana je horizontalnim linijama, gubitak krvi (uL) u miševima C57/BL6 prikazan je kao prazni trougao; gubitak krvi (uL) nakon doziranja 37,5 IU/kg rBDD-FVIII prikazan je kao prazni krug; gubitak krvi (uL) nakon doziranja 37,5 IU/kg FVIII169/VWF034 prikazan je kao prazni kvadrat, a gubitak krvi (uL) nakon doziranja nosioca prikazan je kao obrnuti trougao.

Slike 7A-B pokazuju da heterodimer rFVIII169/VWF057 pruža dužu zaštitu miševima HemA u modelu krvarenja transekcije repne vene. Na slici 7A prikazani su podaci o ponovnom krvarenju kod miševa koji su primili rFVIII169/VWF05772 pre povrede repa (kvadrat), SQ BDD-FVIII 48 časova pre povrede repa (romb), SQ BDD FVIII 24 časa pre povrede repa (obrnuti trougao) i nosilac (krug). Aktivnost je merena aPTT testom. X osa pokazuje vreme u časovima, a Y osa pokazuje procenat ne-krvarilaca. Na slici 7B prikazani su odgovarajući podaci o preživljavanju u četiri kategorije miševa prikazanih na slici 7A.

Miševi su primili 12 IU/kg FVIII169/VWF05772 časa pre povrede repa i pokazali sličnu zaštitu pri ponovnom krvarenju i preživljavanju u poređenju sa miševima koji su primili SQ BDD FVIII tretman 24 časa pre povrede repa.

Na slici 8A prikazani su uporedivi podaci o ponovnom krvarenju kod miševa koji su primili rFVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc heterodimere na 96 časova naspram rBDD-FVIII na 24 časa pre povrede. Ispunjeni kvadrati prikazuju podatke o ponovnom krvarenju kod miševa koji su primili FVIII169/VWF03424 časa pre povrede; prazni kvadrati prikazuju podatke o ponovnom krvarenju kod miševa koji su primili FVIII169/VWF03496 časova pre povrede; ispunjeni rombovi prikazuju podatke o ponovnom krvarenju kod miševa koji su primili FVIII169/VWF057 24 časa pre povrede; prazni rombovi prikazuju podatke o ponovnom krvarenju kod miševa koji su primili FVIII169/VWF05796 časova pre povrede; ispunjeni krugovi prikazuju podatke o ponovnom krvarenju kod miševa koji su primili rBD-FVIII 24 časa pre povrede; prazni krugovi prikazuju podatke o ponovnom krvarenju kod miševa koji su primili rBD-FVIII 48 časova pre povrede; i ispunjeni trougao prikazuje podatke o ponovnom krvarenju kod miševa koji su primili nosilac. X osa pokazuje vreme u časovima, a Y osa pokazuje procenat ne-krvarilaca.

Na slici 8B prikazana je kriva preživljavanja kod miševa koji su primili heterodimere rFVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc na 96 časova naspram rBDD-FVIII na 24 časa pre povrede. X osa pokazuje vreme u časovima, a Y osa pokazuje procenat preživljavanja. Simboli su isti kao na slici 8A.

Na slici 9 prikazan je dijagram reprezentativnih heterodimera FVIII-VWF i konstrukata FVIII169, FVIII286, VWF057, VWF059 i VWF062. Na primer, FVIII169 konstrukt obuhvata protein FVIII sa obrisanim B domenom sa supstitucijom R1648A fuzionisanom sa Fc regionom, pri čemu je XTEN sekvenca (npr. AE288) insertovana kod aminokiseline 745 koja odgovara zrelom FVIII pune dužine (A1-a1-A2-a2-288XTEN-a3-A3-C1-C2-Fc).

FVIII286 konstrukt obuhvata protein FVIII sa obrisanim B domenom sa supstitucijom R1648 fuzionisanom sa Fc regionom, pri čemu je XTEN sekvenca (npr. AE288) insertovana kod aminokiseline 745 koja odgovara zrelom FVIII pune dužine, sa dodatnim regionom a2 između FVIII i Fc (A1-a1-A2-a2-288XTEN-a3-A3-C1-C2-a2-Fc). VWF057 je VWF-Fc fuzioni konstrukt koji obuhvata D'D3 domen VWF proteina (sa dve aminokiselinske supstitucije u D' D3 domenu, tj., C336A i C379A) povezan za Fc region preko VWF linkera, koji obuhvata LVPRG mesto trombina ("LVPRG"; SEQ ID NO: 6) i GS linker ("GS"), pri čemu je između D'D3 domena i VWF linkera (D' D3-144XTEN-GS LVPRG-Fc) insertovana XTEN sekvenca (tj.144XTEN). VWF059 je VWF-Fc fuzioni konstrukt koji obuhvata D'D3 domen VWF proteina (sa dve aminokiselinske supstitucije u D'D3 domenu, tj., C336A i C379A) povezane za Fc region preko kiselinskog regiona 2 (a2) FVIII kao VWF linker, pri čemu je XTEN sekvenca (tj.144XTEN) insertovana između D'D3 domena i VWF linkera. VWF062 je VWF-Fc fuzioni konstrukt koji obuhvata D'D3 domen VWF proteina (sa dve aminokiselinske supstitucije u D'D3 domenu, tj., C336A i C379A) povezane za Fc region, gde je XTEN sekvenca (npr.144XTEN) insertovana između D'D3 domena i Fc regiona (D'D3-144XTEN-Fc).

Na slici 10 prikazan je šematski dijagram koji predstavlja konstrukte heterodimera FVIII/VWF, na primer, FVIII169/VWF057, FVIII169/VWF059, FVIII 169/VWF059A i FVIII169/VWF073. Strelica prikazuje mesto gde je dodat opcioni linker za uvođenje mesta cepanja trombinom. FVIII169/VWF057 ima linker koji se sastoji od LVPRG (SEQ ID NO: 6). FVIII169/VWF059 ima linker koji se sastoji od FVIII a2 regiona (tj .

ISDKNTGDYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSDKTH (SEQ ID NO: 106)).

FVIII169/VWF059A ima linker koji se sastoji od skraćenog FVIII a2 regiona (tj .

DKNTGDYEPSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSDKTH (SEQ ID NO: 88)).

FVIII169/VWF073 ima linker unutar konstrukta VWF073 (SEQ ID NO: 175) koji se sastoji od fragmenta FVIII a2 regiona koji se sastoji od IEPRSFS (SEQ ID NO: 194).

Na slikama 11A-C prikazane su slike SDS-PAGE nakon trombin digestije FVIII169/VWF057 i kontrole FVIII-Fc. Slika 11A prikazuje bojenje SDS-PAGE gela sa anti-D3 antitelom (AB 96340). Strelice ističu "LCFc:D 'D3-XTEN-Fc," što je ne-cepani FVIII169/VWF057 pune dužine; i "D' D3-144 XTEN," što je rezultirajući fragment nakon cepanja trombinom. Slika 11B prikazuje bojenje SDS-PAGE gela sa anti-HC antitelom (GMA012). Strelice ističu FVIII teški lanac ("HC") i FVIII A2 domen. Na slici 11C prikazano je pokrivanje panela A i B. Uzorci su prikupljeni u vremenskim tačkama naznačenim na vrhu svakog panela. Strelice ukazuju na relevantne proteine.

Na slikama 12A-C prikazane su SDS-PAGE slike nakon trombin digestije FVIII169/VWF059. Slika 12A prikazuje bojenje SDS-PAGE gela sa anti-D3 antitelom (AB 96340). Strelice ističu "LCFc:D 'D3-XTEN-Fc," koji je ne-cepani FVIII169/VWF059 pune dužine; i "D'D3-144 XTEN," koji je rezultirajući fragment nakon cepanja trombinom. Slika 12B prikazuje bojenje SDS-PAGE gela sa anti-HC antitelom (GMA012). Strelice ističu necepani FVIII169/VWF059 pune dužine; D'D3-144 XTEN-a3, koji je rezultirajući fragment nakon cepanja trombinom; i "A2," koji je A2 domen FVIII. Na slici 12C prikazano je pokrivanje panela A i B. Uzorci su prikupljeni u vremenskim tačkama naznačenim na vrhu svakog panela

Na slici 13 prikazani su podaci o akutnoj efikasnosti HemA miševa tretiranih sa FVIII169/VWF059 (krug) u poređenju sa HemA miševima tretiranih sa BDD-FVIII kontrolom (kvadrat). Vrednost gubitka krvi je izmerena nakon repne kopče. p = 0,9883.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0034] Ovaj pronalazak je usmeren na himerni protein kako je opisano u sažetku pronalaska.

I. Definicije

[0035] Treba napomenuti da se izraz "jedan" ili "neki" entitet odnosi na jedan ili više tog entiteta; na primer, "nukleotidna sekvenca", se podrazumeva da predstavlja jednu ili više nukleotidnih sekvenci. Kao takvi, izrazi "jedan" (ili "neki"), "jedan ili više" i "najmanje jedan" mogu se koristiti naizmenično u ovom dokumentu.

[0036] Pored toga, "i/ili" gde se koriste, ovde treba uzeti kao specifično obelodanjivanje svake od dve navedene karakteristike ili komponente sa ili bez druge. Dakle, izraz "i/ili" koji se koristi u frazi kao što je "A i/ili B" ovde ima za cilj da uključi "A i B", "A ili B", "A" (samo) i "B" (samo). Isto tako, izraz "i/ili" kako se koristi u frazi kao što je "A, B i/ili C" ima za cilj da obuhvati svaki od sledećih aspekata: A, B i C; A, B ili C; A ili C; A ili B; B ili C; A i C; A i B; B i C; A (samo); B (samo); i C (samo).

[0037] Podrazumeva se da gde god su vidovi opisani u ovom dokumentu sa govorom "koji se sastoji", inače su analogni vidovi opisani u smislu "koji se sastoji od' i/ili "koji se u suštini sastoji od" takođe su dati.

[0038] Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni izrazi koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što se obično podrazumeva kod stručnjaka u oblasti sa kojom je ovo obelodanjivanje povezano. Na primer, the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; i the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press, pružaju stručnjaku opšti rečnik mnogih izraza korišćenih u ovom obelodanjivanju.

[0039] Jedinice, prefiksi i simboli označeni su u prihvatljivom obliku Međunarodnog sistema jedinica (Système International de Unites) (SI). Numerički rasponi uključuju brojeve koji definišu raspon. Ukoliko nije drugačije naznačeno, aminokiselinske sekvence se zapisuju sleva nadesno u amino do karboksi orijentacije. Naslovi koji su ovde navedeni nisu ograničenja različitih vidova obelodanjivanja, koja se mogu imati pozivanjem na specifikaciju kao celinu. Shodno tome, izrazi definisani neposredno ispod su u potpunosti definisani pozivanjem na specifikaciju u celosti.

[0040] Izraz "oko" se ovde koristi da znači približno, otprilike, oko, ili u okolini. Kada se izraz „oko“ koristi zajedno sa numeričkim rasponom, on modifikuje taj raspon proširivanjem granica iznad i ispod numeričkih vrednosti. Generalno, izraz „oko“ može da izmeni numeričku vrednost iznad i ispod navedene vrednosti varijantom od, npr., 10 procenata, gore ili dole (više ili niže).

[0041] Izraz "polinukleotid" ili "nukleotid" je namenjen da obuhvati pojedinačnu nukleinsku kiselinu kao i množinu nukleinskih kiselina, i odnosi se na izolovani molekul nukleinske kiseline ili konstrukt, npr., glasničku RNK (iRNK) ili plazmidnu DNK (pDNK). U određenim otelotvorenjima, polinukleotid se sastoji od konvencionalne fosfodiestarske veze ili nekonvencionalne veze (npr. amidne veze, kao što se nalazi u peptidnim nukleinskim kiselinama (PNK)). Izraz "nukleinska kiselina" se odnosi na bilo koji jedan ili više segmenata nukleinske kiseline, npr. fragmente DNK ili RNK, prisutne u polinukleotidu. Pod "izolovanom" nukleinskom kiselinom ili polinukleotidom podrazumeva se molekul nukleinske kiseline, DNK ili RNK, koji je uklonjen iz svog izvornog okruženja. Na primer, rekombinantni polinukleotid koji kodira faktor VIII polipeptid sadržan u vektoru smatra se izolovanim za potrebe ovog pronalaska. Dalji primeri izolovanog polinukleotida uključuju rekombinantne polinukleotide koji se održavaju u heterolognim ćelijama domaćina ili su prečišćeni (delimično ili suštinski) od drugih polinukleotida u rastvoru. Izolovani RNK molekuli uključuju in vivo ili in vitro RNK transkripte polinukleotida ovog pronalaska.

Izolovani polinukleotidi ili nukleinske kiseline prema sadašnjem pronalasku dalje uključuju takve molekule koji su proizvedeni sintetički. Pored toga, polinukleotid ili nukleinska kiselina mogu uključivati regulatorne elemente kao što su promotori, pojačivači, mesta vezivanja ribosoma ili signali za prekid transkripcije.

[0042] Kao što se ovde koristi, "region kodiranja" ili "sekvenca kodiranja" je deo polinukleotida koji se sastoji od kodona koji se mogu prevesti u aminokiseline. Iako "stop kodon" (TAG, TGA ili TAA) obično nije preveden u aminokiselinu, može se smatrati da je deo regiona kodiranja, ali bilo koje bočne sekvence, na primer promotori, mesta vezivanja ribosoma, transkripcioni terminatori, introni i slično, nisu deo regiona kodiranja. Granice regiona kodiranja su obično određene start kodonom na 5' terminalu, koji kodira amino terminal rezultirajućeg polipeptida, i stop kodonom translacije na 3' terminalu, koji kodira karboksilni terminal rezultirajućeg polipeptida. Dva ili više regiona kodiranja ovog pronalaska mogu biti prisutna u jednom polinukleotidnom konstruktu, npr. na jednom vektoru, ili u odvojenim polinukleotidnim konstruktima, npr. na odvojenim (različitim) vektorima. Iz toga sledi da jedan vektor može da sadrži samo jedan region kodiranja, ili da se sastoji od dva ili više regiona kodiranja, npr. jedan vektor može odvojeno da kodira vezujući domen-A i vezujući domen-B kao što je opisano u nastavku. Pored toga, vektor, polinukleotid ili nukleinska kiselina pronalaska mogu da kodiraju heterologne regione kodiranja, bilo fuzionisane ili nefuzionisane sa nukleinskom kiselinom koja kodira domen vezivanja pronalaska. Heterologni regioni kodiranja uključuju bez ograničenja specijalizovane elemente ili motive, kao što su sekretorni signalni peptid ili heterologni funkcionalni domen.

[0043] Određeni proteini koje luče ćelije sisara asocirani su sa sekretornim signalnim peptidom koji je otcepljen iz zrelog proteina kada se pokrene izvoz rastućeg proteinskog lanca preko grubog endoplazmatskog retikuluma. Stručnjaci iz ove oblasti su svesni da su signalni peptidi generalno fuzionisani sa N-terminalom polipeptida, i da su odvojeni iz kompletnog ili polipeptida "pune dužine" da bi proizveli izlučeni ili "zreli" oblik polipeptida. U određenim otelotvorenjima, nativni signalni peptid ili funkcionalni derivat te sekvence koji zadržava sposobnost da usmerava sekreciju polipeptida koji je operativno povezan sa njim. Alternativno, može se koristiti heterologni signalni peptid sisara, npr. humani T-plazminogeni aktivator (TPA) ili mišji signalni peptid β-glukuronidaza, ili njegov funkcionalni derivat.

[0044] Izraz "nizvodno", kada se odnosi na nukleotidnu sekvencu, znači da je nukleinska kiselina ili nukleotidna sekvenca locirana 3' u odnosu na referentnu nukleotidnu sekvencu. U određenim otelotvorenjima, nizvodne nukleotidne sekvence se odnose na sekvence koje prate početnu tačku transkripcije. Na primer, kodon za inicijaciju translacije gena se nalazi nizvodno od mesta početka transkripcije. Izraz "nizvodno", kada se odnosi na polipeptidnu sekvencu, znači da se aminokiselina ili mesto insercije aminokiselina nalazi na C terminalu referentnih aminokiselina. Na primer, mesto insercije neposredno nizvodno od aminokiseline 745 koja odgovara zrelom proteinu FVIII divljeg tipa znači da je mesto insercije između aminokiseline 745 i aminokiseline 746 koje odgovara zrelom proteinu FVIII divljeg tipa.

[0045] Izraz "uzvodno" se odnosi na nukleotidnu sekvencu koja se nalazi 5' u odnosu na referentnu nukleotidnu sekvencu. U određenim otelotvorenjima, uzvodne nukleotidne sekvence se odnose na sekvence koje se nalaze na 5' strani regiona kodiranja ili početnoj tački transkripcije. Na primer, većina promotora se nalazi uzvodno od mesta početka transkripcije.

[0046] Kao što se ovde koristi, izraz "regulatorni region" se odnosi na nukleotidne sekvence locirane uzvodno (5' nekodirajuće sekvence), unutar ili nizvodno (3' nekodirajuće sekvence) od regiona kodiranja, i koje utiču na transkripciju, RNK obradu, stabilnost ili translaciju asociranog regiona kodiranja. Regulatorni regioni mogu uključivati promotore, navodeće sekvence translacije, introne, sekvence prepoznavanja poliadenilacije, mesta za obradu RNK, mesta vezivanja efektora i strukture matične petlje. Ako je region kodiranja namenjen za ekspresiju u eukariotskoj ćeliji, signal poliadenilacije i sekvenca završetka transkripcije će obično biti locirani 3' u odnosu na sekvencu kodiranja.

[0047] Polinukleotid koji kodira genski proizvod, npr. polipeptid, može uključivati promotor i/ili druge elemente za kontrolu transkripcije koji su operativno povezani sa jednim ili više regiona kodiranja. U operabilnoj asocijaciji, region kodiranja za genski proizvod, npr. polipeptid, asociran je sa jednim ili više regulatornih regiona na način da se ekspresija genskog proizvoda stavlja pod uticaj ili kontrolu regulatornog(ih) regiona. Na primer, region kodiranja i promotor su "operativno asocirani" ako indukcija funkcije promotora rezultira transkripcijom iRNK koja kodira genski proizvod koji kodira region kodiranja, i ako priroda veze između promotora i regiona kodiranja ne ometa sposobnost promotora da usmerava ekspresiju genskog proizvoda ili ometa sposobnost templata DNK da bude transkribovan. Drugi elementi kontrole transkripcije, osim promotora, na primer, pojačivači, operatori, represori i signali za prekid transkripcije, takođe mogu biti operativno asocirani sa regionom kodiranja za usmeravanje ekspresije genskog proizvoda.

[0048] Različiti regioni kontrole transkripcije poznati su stručnjacima u ovoj oblasti. Oni uključuju, bez ograničenja, regione kontrole transkripcije koji funkcionišu u ćelijama kičmenjaka, kao što su, ali ne ograničavajući se na, segmente promotora i pojačivača od citomegalovirusa (neposredni rani promotor, u kombinaciji sa intron-A), majmunskog virusa 40 (rani promotor) i retrovirusa (kao što je Raus sarkom virus). Drugi regioni kontrole transkripcije uključuju one koji potiču od gena kičmenjaka kao što su aktin, protein toplotnog šoka, goveđi hormon rasta i β-globin kunića, kao i druge sekvence koje mogu da kontrolišu ekspresiju gena u eukariotskim ćelijama. Dodatni pogodni regioni za kontrolu transkripcije uključuju promotore i pojačivače specifične za tkivo, kao i promotore indukovane limfokinom (npr. promotore indukovane interferonima ili interleukinima).

[0049] Slično tome, različiti elementi kontrole translacije poznati su prosečnom stručnjaku iz te oblasti. Oni uključuju, ali nisu ograničeni na, mesta vezivanja ribosoma, kodone za pokretanje i terminaciju transkripcije i elemente izvedene iz pikornavirusa (posebno mesto ulaska internog ribosoma, ili IRES, koji se takođe naziva CITE sekvenca).

[0050] Izraz "ekspresija" koji se ovde koristi odnosi se na proces kojim polinukleotid proizvodi genski proizvod, na primer, RNK ili polipeptid. On uključuje bez ograničenja transkripciju polinukleotida u glasničku RNK (iRNK), transfernu RNK (tRNK), RNK sa strukturom ukosnice (shRNK), malu interferirajuću RNK (siRNK) ili bilo koji drugi RNK proizvod, i transkripciju iRNK u polipeptid. Ekspresija proizvodi "genski proizvod". Kao što se ovde koristi, genski proizvod može biti ili nukleinska kiselina, npr., glasnička RNK proizvedena transkripcijom gena, ili polipeptid koji je translatiran iz transkripta. Genski proizvodi opisani ovde dalje uključuju nukleinske kiseline sa post-transkripcionim modifikacijama, npr. poliadenilacija ili splajsing (iskrajanje), ili polipeptide sa posttranslacionim modifikacijama, npr. metilacija, glikozilacija, adicija lipida, asocijacija sa drugim proteinskim pod-jedinicama ili proteolitičko cepanje.

[0051] "Vektor" se odnosi na bilo koji nosilac za kloniranje i/ili transfer nukleinske kiseline u ćeliju domaćina. Vektor može biti replikon na koji se može pričvrstiti drugi segment nukleinske kiseline kako bi se ostvarila replikacija pričvršćenog segmenta. "Replikon" se odnosi na bilo koji genetski element (npr. plazmid, faga, kosmid, hromozom, virus) koji funkcioniše kao autonomna jedinica replikacije in vivo, tj. sposoban je za replikaciju pod sopstvenom kontrolom. Izraz "vektor" uključuje i virusne i nevirusne nosioce za uvođenje nukleinske kiseline u ćeliju in vitro, ex vivo ili in vivo. Veliki broj vektora je poznat i koristi se u struci, uključujući, na primer, plazmide, modifikovane eukariotske viruse ili modifikovane bakterijske viruse. Insercija polinukleotida u odgovarajući vektor može se postići ligacijom odgovarajućih fragmenata polinukleotida u izabrani vektor koji ima komplementarne kohezivne terminale.

[0052] Vektori mogu biti modifikovani tako da kodiraju odabrane markere ili reportere koji obezbeđuju izbor ili identifikaciju ćelija koje su inkorporirale vektor. Ekspresija selektabilnih markera ili reportera omogućava identifikaciju i/ili selekciju ćelija domaćina koje inkorporiraju i eksprimiraju druge regione kodiranja sadržane na vektoru. Primeri selektivnih markerskih gena poznatih i korišćenih u struci uključuju: gene koji pružaju rezistenciju na ampicilin, streptomicin, gentamicin, kanamicin, higromicin, herbicid bialafos, sulfonamid i slično; i gene koji se koriste kao fenotipski markeri, tj, antocijanin regulatorni geni, gen izopentanil transferaze i slično. Primeri reportera poznatih i korišćenih u struci uključuju: luciferazu (Luc), zeleni fluorescentni protein (GFP), hloramfenikol acetiltransferazu (CAT), -galaktozidazu (LacZ), -glukuronidazu (Gus) i slično. Selektabilni markeri takođe se mogu smatrati reporterima.

[0053] Izraz "plazmid" se odnosi na ekstra-hromozomski element koji često nosi gen koji nije deo centralnog metabolizma ćelije, i obično u obliku kružnih dvolančanih DNK molekula. Takvi elementi mogu biti autonomno replicirajuće sekvence, sekvence koje integrišu genom, sekvence faga ili nukleotida, linearne, kružne ili supernamotane, jedno- ili dvolančane DNK ili RNK, izvedene iz bilo kog izvora, u kojima je jedan broj nukleotidnih sekvenci spojen ili rekombinovan u jedinstvenu konstrukciju koja je sposobna da uvede fragment promotora i sekvencu DNK za izabrani genski proizvod zajedno sa odgovarajućom 3' netransliranom sekvencom u ćeliju.

[0054] Eukariotski virusni vektori koji se mogu koristiti uključuju, ali nisu ograničeni na, vektore adenovirusa, vektore retrovirusa, adeno-asocirane virus vektore i poksvirus, npr., vektore virusa vakcinije, vektore baculovirusa ili vektore herpesvirusa. Ne-virusni vektori uključuju plazmide, liposome, električno naelektrisane lipide (citofeine), DNK-proteinske komplekse i biopolimere.

[0055] "Vektor kloniranja" se odnosi na "replikon", koji je jedinična dužina nukleinske kiseline koja se replicira sekvencijalno i koja sadrži poreklo replikacije, kao što su plazmid, faga ili kosmid, na koji se može pričvrstiti drugi segment nukleinske kiseline kako bi se ostvarila replikacija pričvršćenog segmenta. Određeni vektori kloniranja su sposobni za replikaciju u jednom tipu ćelija, npr. bakterijama i ekspresiju u drugom, npr. eukariotskim ćelijama. Vektori kloniranja obično obuhvataju jednu ili više sekvenci koje se mogu koristiti za selekciju ćelija koje sadrže vektor i/ili jedno ili više mesta kloniranja za inserciju sekvenci nukleinskih kiselina od interesa.

[0056] Izraz "vektor ekspresije" se odnosi na nosilac dizajniran da omogući ekspresiju insertovane sekvence nukleinske kiseline nakon insercije u ćeliju domaćina. Insertovana sekvenca nukleinske kiseline je postavljena u operativnu asocijaciju sa regulatornim regionima kao što je prethodno opisano.

[0057] Vektori se uvode u ćelije domaćina metodama koje su dobro poznate u struci, npr. transfekcija, elektroporacija, mikroinjekcija, transdukcija, fuzija ćelija, DEAE dekstran, taloženje kalcijum fosfata, lipofekcija (fuzija lizozoma), upotreba genskog pištolja ili transportera DNK vektora.

[0058] „Kultura“, „kultivisati“ i „kultivisanje“, kako se ovde koriste, znači inkubirati ćelije pod in vitro uslovima koji omogućavaju rast ili deobu ćelija ili održavanje ćelija u živom stanju. "Kultivisane ćelije", kao što se ovde koristi, označavaju ćelije koje se razmnožavaju in vitro.

[0059] Kao što se ovde koristi, izraz "polipeptid" je namenjen da obuhvati jedninu "polipeptid" kao i množinu "polipeptidi", i odnosi se na molekul sastavljen od monomera (aminokiselina) linearno povezanih amidnim vezama (takođe poznate kao peptidne veze). Izraz "polipeptid" se odnosi na bilo koji lanac ili lance dve ili više aminokiselina, i ne odnosi se na određenu dužinu proizvoda. Dakle, peptidi, dipeptidi, tripeptidi, oligopeptidi, "protein", "aminokiselinski lanac" ili bilo koji drugi izraz koji se koristi da se odnosi na lanac ili lance od dve ili više aminokiselina, uključeni su u definiciju "polipeptida", a izraz "polipeptid" može se koristiti umesto, ili zamenljivo, sa bilo kojim od ovih izraza. Izraz "polipeptid" se takođe odnosi na proizvode post-ekspresivnih modifikacija polipeptida, uključujući bez ograničenja glikozilaciju, acetilaciju, fosforilaciju, amidaciju, derivatizaciju poznatim zaštitnim/blokirajućim grupama, proteolitičko cepanje ili modifikaciju aminokiselinama koje nisu prisutne u prirodi. Polipeptid može biti izveden iz prirodnog biološkog izvora ili proizvedene rekombinantne tehnologije, ali nije nužno translatiran iz određene sekvence nukleinskih kiselina. Može se generisati na bilo koji način, uključujući hemijsku sintezu.

[0060] „Izolovani“ polipeptid ili njegov fragment, varijanta ili derivat se odnosi na polipeptid koji nije u svom prirodnom miljeu. Nije potreban poseban nivo prečišćavanja. Na primer, izolovani polipeptid se jednostavno može ukloniti iz svog nativnog ili prirodnog okruženja. Rekombinantno proizvedeni polipeptidi i proteini eksprimirani u ćelijama domaćina smatraju se izolovanim u svrhu pronalaska, kao i nativni ili rekombinantni polipeptidi koji su separisani, frakcionisani ili delimično ili suštinski prečišćeni bilo kojom odgovarajućom tehnikom.

[0061] Takođe su obelodanjeni fragmenti ili varijante polipeptida i bilo koja njihova kombinacija. Izraz "fragment" ili "varijanta" kada se odnosi na domene vezivanja polipeptida ili molekule vezivanja ovog pronalaska uključuje sve polipeptide koji zadržavaju bar neka od svojstava (npr. afinitet vezivanja FcRn za domen vezivanja FcRn ili varijantu Fc, aktivnost koagulacije za varijantu FVIII ili aktivnost vezivanja FVIII za fragment VWF) referentnog polipeptida. Fragmenti polipeptida uključuju proteolitičke fragmente, kao i fragmente delecije, pored specifičnih fragmenata antitela o kojima se ovde govori, ali ne uključuju prirodno prisutni polipeptid pune dužine (ili zreli polipeptid). Varijante domena vezivanja polipeptida ili molekula vezivanja ovog pronalaska uključuju fragmente kao što je prethodno opisano, kao i polipeptide sa izmenjenim sekvencama aminokiselina usled supstitucija, delecija ili insercija aminokiselina. Varijante mogu biti prisutne ili ne-prisutne u prirodi. Varijante koje nisu prisutne u prirodi se mogu proizvesti koristeći tehnike mutageneze poznate u struci. Varijantni polipeptidi se mogu sastojati od konzervativnih ili nekonzervativnih aminokiselinskih supstitucija, delecija ili adicija.

[0062] Izraz „protein VWF“ ili „proteini VWF“ koji se ovde koriste označava sve fragmente VWF koji su u interakciji sa FVIII i zadržavaju najmanje jedno ili više svojstava koje obično pruža VWF pune dužine FVIII-u, npr. sprečavanje preranog aktiviranja FVIIIa, sprečavanje preuranjene proteolize, sprečavanje asocijacije sa fosfolipidnim membranama koje bi mogle dovesti do prevremenog klirensa, sprečavanje vezivanja za receptore klirensa FVIII koji mogu da vežu ogoljeni FVIII ali ne i VWF-vezani FVIII i/ili stabilizovanje interakcija teškog lanca i lakog lanca FVIII.

[0063] "Konzervativna aminokiselinska supstitucija" je ona u kojoj se aminokiselinski ostatak zamenjuje aminokiselinskim ostatkom koji ima sličan bočni lanac. Porodice aminokiselinskih ostataka sa sličnim bočnim lancima definisane su u struci, uključujući bazne bočne lance (npr. lizin, arginin, histidin), kisele bočne lance (npr. asparaginska kiselina, glutaminska kiselina), nenaelektrisane polarne bočne lance (npr. glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein), nepolarne bočne lance (npr. alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), beta-razgranate bočne lance (npr. treonin, valin, izoleucin) i aromatične bočne lance (npr. tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). Dakle, ako se aminokiselina u polipeptidu zameni drugom aminokiselinom iz iste porodice bočnih lanaca, smatra se da je supstitucija konzervativna. U drugom otelotvorenju, niz aminokiselina može se konzervativno zameniti strukturno sličnim nizom koji se razlikuje po redosledu i/ili sastavu članova porodice bočnih lanaca.

[0064] Kao što je poznato u struci, "identičnost sekvence" između dva polipeptida određuje se upoređivanjem sekvence aminokiselina jednog polipeptida sa sekvencom drugog polipeptida. Kada se ovde raspravlja da li je bilo koji određeni polipeptid najmanje oko 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, ili 100% identičan sa drugim polipeptidom, to se može utvrditi korišćenjem metoda i računarskih programa/softvera poznatih u struci, kao što su, ali ne ograničavajući se na, BESTFIT program (Wisconsin Sequence Analysis Package, Verzija 8 za Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). BESTFIT koristi algoritam lokalne homologije: Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981), da pronađe najbolji segment homologije između dve sekvence. Kada se koristi BESTFIT ili bilo koji drugi program za upoređivanje sekvenci kako bi se utvrdilo da li je određena sekvenca, na primer, 95% identična referentnoj sekvenci prema ovom pronalasku, parametri se postavljaju, naravno, tako da se procenat identičnosti izračunava na celoj dužini referentne polipeptidne sekvence i da su dozvoljene praznine u homologiji do 5% od ukupnog broja aminokiselina u referentnoj sekvenci.

[0065] Kao što se ovde koristi, "aminokiselina koja odgovara" ili "ekvivalentna aminokiselina" u sekvenci VWF ili sekvenci proteina FVIII identifikuje se upoređivanjem kako bi se maksimalno povećala identičnost ili sličnost između prve sekvence VWF ili FVIII i druge sekvence VWF ili FVIII. Broj koji se koristi za identifikaciju ekvivalentne aminokiseline u drugoj sekvenci VWF ili FVIII se zasniva na broju koji se koristi za identifikaciju odgovarajuće aminokiseline u prvoj sekvenci VWF ili FVIII.

[0066] Kao što se ovde koristi, izraz "mesto insercije" odnosi se na poziciju u polipeptidu FVIII, ili njegovom fragmentu, varijanti ili derivatu, koji se nalazi neposredno uzvodno od pozicije na kojoj se može insertovati heterologni deo. "Mesto insercije" specificira se kao broj, a taj broj je broj aminokiseline u zrelom nativnom FVIII (SEQ ID NO: 65) kome odgovara mesto insercije, koje je neposredno N-terminalno u odnosu na poziciju insercije. Na primer, fraza "a3 obuhvata XTEN na mestu insercije koje odgovara aminokiselini 1656 SEQ ID NO: 65" označava da se heterologni deo nalazi između dve aminokiseline koje odgovaraju aminokiselini 1656 i aminokiselini 1657 SEQ ID NO: 65.

[0067] Fraza "neposredno nizvodno od aminokiseline" kao što se ovde koristi odnosi se na poziciju neposredno pored terminalne karboksilne grupe aminokiseline. Slično tome, fraza "neposredno uzvodno od aminokiseline" odnosi se na poziciju odmah pored terminalne amino grupe aminokiseline. Stoga se fraza "između dve aminokiseline mesta insercije", kao što se ovde koristi, odnosi na poziciju u kojoj je XTEN ili bilo koji drugi polipeptid insertovan između dve susedne aminokiseline. Tako se fraze "insertovan neposredno nizvodno od aminokiseline" i "insertovano između dve aminokiseline mesta insercije" koriste kao sinonimi sa "insertovano na mestu insercije".

[0068] Izrazi "insertovan“, "insertovan je“, "insertovan u“ ili gramatički povezani izrazi, kao što se ovde koristi, odnose se na poziciju XTEN u himernom polipeptidu u odnosu na analognu poziciju u nativnom zrelom humanom FVIII. Kao što se ovde koristi, izrazi se odnose na karakteristike rekombinantnog polipeptida FVIII u odnosu na nativni zreli humani FVIII i ne ukazuju, podrazumevaju ili zaključuju na bilo koje metode ili procese kojima je himerni polipeptid napravljen. Na primer, u vezi sa himernim polipeptidom navedenim u ovom dokumentu, fraza "XTEN je insertovan neposredno nizvodno od ostatka 745 polipeptida FVIII" znači da himerni polipeptid obuhvata XTEN neposredno nizvodno od aminokiseline koja odgovara aminokiselini 745 u nativnom zrelom humanom FVIII, npr., vezana aminokiselinama koje odgovaraju aminokiselinama 745 i 746 nativnog zrelog humanog FVIII.

[0069] "Fuzioni" ili "himerni" protein se sastoji od prve aminokiselinske sekvence povezane sa drugom aminokiselinskom sekvencom sa kojom nije prirodno povezan u prirodi.

Aminokiselinske sekvence koje inače postoje u odvojenim proteinima mogu se spojiti u fuzioni polipeptid, ili se aminokiselinske sekvence koje inače postoje u istom proteinu mogu smestiti u novi aranžman u fuzionom polipeptidu, npr. fuzija domena FVIII pronalaska sa domenom Ig Fc. Fuzioni protein se stvara, na primer, hemijskom sintezom, ili kreiranjem i translacijom polinukleotida u kojem su peptidni regioni kodirani u željenom odnosu. Himerni protein može dalje sadržati drugu aminokiselinsku sekvencu asociranu sa prvom aminokiselinskom sekvencom kovalentnom, ne-peptidnom vezom ili ne-kovalentnom vezom.

[0070] Kao što se ovde koristi, izraz "poluživot" se odnosi na biološki poluživot određenog polipeptida in vivo. Poluživot može biti predstavljen vremenom koje je potrebno da polovina količine koja se daje ispitaniku bude uklonjena iz cirkulacije i/ili drugih tkiva u životinji. Kada je klirens kriva datog polipeptida konstruisana kao funkcija vremena, kriva je obično dvofazna sa brzom α-fazom i dužom β-fazom. α-Faza obično predstavlja uravnoteženje primenjenog Fc polipeptida između intra- i ekstra-vaskularnog prostora i delimično je određena veličinom polipeptida. β-faza obično predstavlja katabolizam polipeptida u intravaskularnom prostoru. U nekim otelotvorenjima, FVIII i himerni proteini koji sadrže FVIII su monofazni i stoga nemaju alfa fazu, već samo jednu beta fazu. Stoga se u određenim otelotvorenjima pojam poluživot, kao što se ovde koristi, odnosi na poluživot polipeptida u βfazi. Tipični poluživot β-faze humanog antitela kod ljudi je 21 dan.

[0071] Izraz "povezan", kako se ovde koristi, odnosi se na prvu aminokiselinsku sekvencu ili nukleotidnu sekvencu kovalentno ili ne-kovalentno spojenu sa drugom aminokiselinskom sekvencom, odnosno nukleotidnom sekvencom. Prva aminokiselinska ili nukleotidna sekvenca može biti direktno spojena ili prirasla drugoj aminokiselinskoj ili nukleotidnoj sekvenci ili alternativno posrednička sekvenca može kovalentno spojiti prvu sekvencu sa drugom sekvencom. Izraz "povezan" ne podrazumeva samo fuziju prve aminokiselinske sekvence sa drugom aminokiselinskom sekvencom na C-terminalu ili N-terminalu, već uključuje i inserciju cele prve aminokiselinske sekvence (ili druge aminokiselinske sekvence) u bilo koje dve aminokiseline u drugoj aminokiselinskoj sekvenci (odnosno prvoj aminokiselinskoj sekvenci). U jednom otelotvorenju, prva aminokiselinska sekvenca može biti povezana sa drugom aminokiselinskom sekvencom peptidnom vezom ili linkerom. Prva nukleotidna sekvenca može biti povezana sa drugom nukleotidnom sekvencom fosfodiestarskom vezom ili linkerom. Linker može biti peptid ili polipeptid (za polipeptidne lance) ili nukleotid ili nukleotidni lanac (za nukleotidne lance) ili bilo koji hemijski deo (za polipeptidne i polinukleotidne lance). Izraz "povezan" se takođe označava crticom (-).

[0072] Kao što se ovde koristi, izraz "asociran sa" odnosi se na kovalentnu ili ne-kovalentnu vezu formiranu između prvog aminokiselinskog lanca i drugog aminokiselinskog lanca. U jednom otelotvorenju, izraz "asociran sa" označava kovalentnu, ne-peptidnu vezu ili nekovalentnu vezu. Ova asocijacija može biti označena dvotačkom, tj., (:). U drugom otelotvorenju, to znači kovalentnu vezu osim peptidne veze. Na primer, aminokiselina cistein sadrži tiolnu grupu koja može da formira disulfidnu vezu ili most sa tiolnom grupom na drugom ostatku cisteina. U većini prirodnih IgG molekula, CH1 i CL regioni su asocirani disulfidnom vezom i dva teška lanca su asocirana dvema disulfidnim vezama na pozicijama koje odgovaraju 239 i 242 koristeći Kabat sistem numeracije (pozicija 226 ili 229, sistem numeracije EU). Primeri kovalentnih veza uključuju, ali nisu ograničeni na, peptidnu vezu, metalnu vezu, vodoničnu vezu, disulfidnu vezu, sigma vezu, pi vezu, delta vezu, glikozidnu vezu, agnostičku vezu, savijenu vezu, dipolarnu vezu, Pi retrodonaciju, dvostruku vezu, trostruku vezu, četvorostruku vezu, petostruku vezu, šestostruku vezu, konjugaciju, hiperkonjugaciju, aromatičnost, haptičnost ili anti-vezivanje. Neograničavajući primeri nekovalentne veze uključuju jonsku vezu (npr. katjon-pi veza ili sona veza), metalnu vezu, vodoničnu vezu (npr. dihidrogenska veza, dihidrogenski kompleks, vodonična veza sa niskom barijerom ili simetrična vodonična veza), van der Valsove sile, Londonska disperziona sila, mehanička veza, halogena veza, aurofilnost, interkalacija, slaganje, entropijska sila ili hemijska polarnost.

[0073] Izraz "monomer-dimer hibrid" koji se ovde koristi odnosi se na himerni protein koji se sastoji od prvog polipeptidnog lanca i drugog polipeptidnog lanca, koji su međusobno asocirani disulfidnom vezom, pri čemu prvi lanac sadrži faktor zgrušavanja, npr. Faktor VIII, i prvi Fc region, a drugi lanac se sastoji, u suštini se sastoji od, ili se sastoji od drugog Fc regiona bez faktora zgrušavanja. Monomer-dimer hibridni konstrukt je, dakle, hibrid koji se sastoji od monomernog vida koji ima samo jedan faktor zgrušavanja i dimernog vida koji ima dva Fc regiona.

[0074] Kao što se ovde koristi, izraz "mesto cepanja" ili "mesto enzimskog cepanja" odnosi se na mesto koje enzim prepoznaje. Određena enzimska mesta cepanja sadrže mesto unutarćelijske obrade. U jednom otelotvorenju, polipeptid ima mesto enzimskog cepanja koje je cepano enzimom koji se aktivira tokom kaskade zgrušavanja, tako da dolazi do cepanja takvih mesta na mestu stvaranja ugruška. Primer takvih mesta uključuju, npr., ona koja su prepoznata trombinom, faktorom XIa ili faktorom Xa. Primerna FXIa mesta cepanja uključuju, npr. TQSFNDFTR (SEQ ID NO: 1) i SVSQTSKLTR (SEQ ID NO: 3). Primerna mesta trombinskog cepanja uključuju, npr. DFLAEGGGVR (SEQ ID NO: 4), TTKIKPR (SEQ ID NO: 5), LVPRG (SEQ ID NO: 6), ALRPR (SEQ ID NO: 7), ISDKNTGDYEDSYEDISAYLLNNAIPRSFS (SEQ ID NO: 106), DKNTGDYEDSYEDISAYLLNNAIPRSFS (SEQ ID NO: 88) i IEPRSFS (SEQ ID NO: 194). Druga enzimska mesta cepanja su poznata u struci i opisana na drugim mestima ovde.

[0075] Kao što se ovde koristi, izraz „mesto obrade“ ili „mesto intracelularne obrade“ odnosi se na vrstu mesta enzimskog cepanja u polipeptidu koji je cilj za enzime koji funkcionišu nakon translacije polipeptida. U jednom otelotvorenju, takvi enzimi funkcionišu tokom transporta od Golgijevog lumena do trans-Golgijevog kompartmenta. Intracelularni procesni enzimi cepaju polipeptide pre sekrecije proteina iz ćelije. Primeri takvih mesta obrade uključuju, npr., ona koja su ciljana od strane porodice endopeptidaza PACE/furin (gde je PACE akronim za Enzim za cepanje uparene bazne aminokiseline). Ovi enzimi su lokalizovani na Golgijevoj membrani i cepaju proteine na karboksiterminalnoj strani motiva sekvence Arg-[ostatak]-(Lys ili Arg)-Arg. Kao što se ovde koristi, "furin" familija enzima uključuje, npr. PCSK1 (takođe poznat kao PC1/Pc3), PCSK2 (takođe poznat kao PC2), PCSK3 (takođe poznat kao furin ili PACE), PCSK4 (takođe poznat kao PC4), PCSK5 (takođe poznat kao PC5 ili PC6), PCSK6 (takođe poznat kao PACE4) ili PCSK7 (takođe poznat kao PC7/LPC, PC8 ili SPC7). Druga mesta obrade su poznata u struci.

[0076] U konstruktima koji obuhvataju više od jednog mesta obrade ili mesta cepanja, podrazumevaće se da takva mesta mogu biti ista ili različita.

[0077] Izraz "furin" se odnosi na enzime koji odgovaraju EC No.3.4.21.75. Furin je proproteinska konvertaza slična subtilizinu, koja je takođe poznata kao PACE (enzim za cepanje uparene bazne aminokiseline). Furin briše delove neaktivnih prekursorskih proteina da bi ih pretvorio u biološki aktivne proteine. Tokom njegovog intracelularnog transporta, pro-peptid VWF se može cepati iz zrelog molekula VWF enzimom Furin. U nekim otelotvorenjima, Furin cepa D1D2 iz D'D3 VWF. U drugim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira Furin može se eksprimirati zajedno sa nukleotidnom sekvencom koja kodira fragment VWF tako da Furin može da rascepi domene D1D2 unutar ćelije.

[0078] U konstruktima koji obuhvataju više od jednog mesta obrade ili mesta cepanja, podrazumevaće se da takva mesta mogu biti ista ili različita.

[0079] "Obradivi linker", kao što se ovde koristi, odnosi se na linker koji se sastoji od najmanje jednog unutarćelijskog mesta obrade, koji su opisani na drugom mestu u ovom dokumentu.

[0080] Hemostatski poremećaj, kao što se ovde koristi, označava genetski nasledno ili stečeno stanje koje karakteriše sklonost ka krvarenju, bilo spontano ili kao rezultat traume, usled narušene sposobnosti ili nemogućnosti stvaranja fibrinskog ugruška. Primeri takvih poremećaja uključuju hemofiliju. Tri glavna oblika su hemofilija A (nedostatak faktora VIII), hemofilija B (nedostatak faktora IX ili "Božićna bolest") i hemofilija C (nedostatak faktora XI, blaga sklonost ka krvarenju). Ostali hemostatski poremećaji uključuju, npr., Von Willebrand-ovu bolest, nedostatak faktora XI (nedostatak PTA), nedostatak faktora XII, nedostatke ili strukturne abnormalnosti fibrinogena, protrombina, faktora V, faktora VII, faktora X ili faktora XIII, Bernard-Soulierov sindrom, koji je defekt ili nedostatak GPIb. GPIb, receptor za VWF, može biti neispravan i dovesti do nedostatka stvaranja primarnog ugruška (primarna hemostaza) i tendencije povećanog krvarenja) i trombastenije Glanzman-a i Naegeli-ja (Glanzman-ova trombastenija). Kod zatajenja jetre (akutnog i hroničnog oblika), postoji nedovoljna proizvodnja faktora koagulacije od strane jetre; što može povećati rizik od krvarenja.

[0081] Himerni molekuli pronalaska mogu se koristiti profilaktički. Kao što se ovde koristi, izraz "profilaktički tretman" odnosi se na primenu molekula pre epizode krvarenja. U jednom otelotvorenju, ispitanik kome je potreban opšti hemostatski agens je podvrgnut, ili će uskoro biti podvrgnut, operaciji. Himerni protein pronalaska može se primeniti pre ili posle operacije kao profilaktik. Himerni protein pronalaska može se primeniti tokom ili nakon operacije kako bi se kontrolisala epizoda akutnog krvarenja. Operacija može uključivati, ali nije ograničena na, transplantaciju jetre, resekciju jetre, stomatološke procedure ili transplantaciju matičnih ćelija.

[0082] Himerni protein pronalaska se takođe koristi za tretman na zahtev. Izraz "tretman na zahtev" odnosi se na primenu himernog molekula kao odgovor na simptome epizode krvarenja ili pre aktivnosti koja može izazvati krvarenje. U jednom vidu, tretman na zahtev može se dati ispitaniku kada počne krvarenje, kao što je nakon povrede, ili kada se očekuje krvarenje, kao što je pre operacije. U drugom vidu, tretman na zahtev može se primeniti pre aktivnosti koje povećavaju rizik od krvarenja, kao što su kontaktni sportovi.

[0083] Kao što se ovde koristi, izraz "akutno krvarenje" odnosi se na epizodu krvarenja bez obzira na osnovni uzrok. Na primer, ispitanik može imati traumu, uremiju, nasledni poremećaj krvarenja (npr. nedostatak faktora VII), poremećaj trombocita ili rezistenciju zbog razvoja antitela na faktore zgrušavanja.

[0084] Tretirati, tretman, tretiranje, kao što se ovde koristi, odnosi se na, npr., smanjenje težine bolesti ili stanja; smanjenje trajanja ciklusa bolesti; ublažavanje jednog ili više simptoma povezanih sa bolešću ili stanjem; pružanje korisnih efekata osobi sa bolešću ili stanjem, bez nužnog izlečenja bolesti ili stanja, ili profilaksa jednog ili više simptoma povezanih sa bolešću ili stanjem. U jednom otelotvorenju, termin „tretiranje“ ili „tretman“ označava održavanje najnižeg nivoa FVIII od najmanje oko 1 IJ/dL, 2 IJ/dL, 3 IJ/dL, 4 IJ/dL, 5 IJ/dL, 6 IJ/dL, 7 IJ/dL, 8 IJ/dL, 9 IJ/dL, 10 IJ/dL, 11 IJ/dL, 12 IJ/dL, 13 IJ/dL, 14 IJ/dL, 15 IJ/dL, 16 IJ/dL, 17 IJ/dL, 18 IJ/dL, 19 IJ/dL ili 20 IJ/dL u ispitaniku primenom himernog proteina pronalaska. U drugom otelotvorenju, tretiranje ili tretman znači održavanje najnižeg nivoa FVIII između oko 1 i oko 20 IU/dl, oko 2 i oko 20 IU/dl, oko 3 i oko 20 IU/dl, oko 4 i oko 20 IU/dl, oko 5 i oko 20 IU/dl, oko 6 i oko 20 IU/dl, oko 7 i oko 20 IU/dl, oko 8 i oko 20 IU/dl, oko 9 i oko 20 IU/dl, ili oko 10 i oko 20 IU/dl. Tretman ili tretiranje bolesti ili stanja takođe može uključivati održavanje aktivnosti FVIII u ispitaniku na nivou koji se može uporediti sa najmanje oko 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% ili 20% aktivnosti FVIII u nehemofiličnom ispitaniku. Minimalni najniži nivo potreban za tretman može se izmeriti jednom ili više poznatih metoda i može se podesiti (povećati ili smanjiti) za svaku osobu.

II. Himerni proteini

[0085] Sadašnje obelodanjivanje je usmereno na produženje poluživota himernog proteina pomoću proteina VWF fuzionisanog sa sekvencom XTEN sprečavanjem ili inhibiranjem faktora koji ograničava poluživot FVIII, tj. endogenog VWF, od asociranja sa proteinom FVIII. Endogeni VWF asocira sa oko 95% do oko 98% FVIII u ne-kovalentnim kompleksima. Iako je endogeni VWF ograničavajući faktor poluživota FVIII, poznato je takođe da endogeni VWF vezan za protein FVIII štiti FVIII na razne načine. Na primer, VWF pune dužine (kao multimer koji ima oko 250 kDa) može zaštititi FVIII od proteaza cepanja i aktivacije FVIII, stabilizovati teški lanac i/ili laki lanac FVIII, i prevenirati klirens FVIII pomoću receptora hvatača. Ali, u isto vreme, endogeni VWF ograničava poluživot FVIII sprečavajući pinocitozu i uklanjajući FVIII-VWF kompleks iz sistema preko puta klirensa VWF. Veruje se, iako nije vezano za teoriju, da je endogeni VWF ograničavajući faktor poluživota koji sprečava da vreme poluživota himernog proteina fuzionisanog sa produživačem poluživota bude oko dvostruko duže od vremena FVIII divljeg tipa. Stoga je ovo obelodanjivanje usmereno na sprečavanje ili inhibiranje interakcije između endogenog VWF i proteina FVIII korišćenjem VWF proteina koji se sastoji od D' domena i D3 domena (npr. fragment VWF) i istovremeno na povećanje poluživota rezultirajućih proteina FVIII korišćenjem XTEN sekvence u kombinaciji sa konstantnim regionom Ig ili njegovim delom. Konkretno, ovaj pronalazak pokazuje da je kraća XTEN sekvenca (tj. XTEN koji sadrži manje od 288 aminokiselina u dužini, tj. XTEN koji je kraći od 288 aminokiselina) bolja u produženju poluživota himernog proteina.

[0086] U jednom otelotvorenju, pronalazak je usmeren na himerni protein kako je opisano u Rezimeu pronalaska, pri čemu je drugi polipeptid, koji sadrži fragment VWF koji se sastoji od D' domena i D3 domena VWF, fuzionisan sa drugim Fc regionom pomoću XTEN sekvence između njih, obuhvata XTEN sekvencu koja sadrži manje od 288 aminokiselinskih ostataka i u kojoj je prvi polipeptid povezan ili asociran sa drugim polipeptidom. U drugim otelotvorenjima, himerni protein pokazuje duži poluživot u poređenju sa odgovarajućim fuzionim proteinom koji se sastoji od prvog polipeptida i drugog polipeptida, pri čemu drugi polipeptid sadrži XTEN sekvencu koja sadrži najmanje 288 aminokiselina, npr. AE288, npr. SEQ ID NO: 8. U drugim otelotvorenjima, XTEN sekvenca u drugom polipeptidu sadrži najmanje 144 aminokiseline, ali manje od 288 aminokiselina.

[0087] Himerni protein pronalaska može dalje da sadrži drugu XTEN sekvencu koja povezuje protein FVIII sa prvim Fc regionom.

[0088] U određenim otelotvorenjima, pronalazak je usmeren na himerni protein koji se sastoji od (i) prvog polipeptida koji se sastoji od proteina FVIII fuzionisanog sa prvim Fc regionom i (ii) drugog polipeptida koji se sastoji od fragmenta VWF koji se sastoji od D' domena i D3 domena VWF fuzionisanog sa drugim Fc regionom prvom XTEN sekvencom između, pri čemu XTEN sekvenca sadrži manje od 288 aminokiselinskih ostataka i pri čemu je prvi polipeptid povezan ili asociran sa drugim polipeptidom, i pri čemu prvi polipeptid dalje sadrži drugu XTEN sekvencu koja je insertovana na jedno ili više mesta insercije unutar FVIII proteina

[0089] Druga i/ili treća XTEN sekvenca može biti bilo koje dužine XTEN aminokiselina. Na primer, druga i/ili treća XTEN sekvence su obelodanjene na drugim mestima u ovom dokumentu, npr. AE42, AE72, AE864, AE576, AE288, AE144, AG864, AG576, AG288, i AG144, npr., SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 62; ili SEQ ID NO: 63. U određenom otelotvorenju, druga i/ili treća XTEN sekvenca je AE288 ili AG288, npr., SEQ ID NO: 8 ili 19.

[0090] U određenim otelotvorenjima, protein FVIII je fuzionisan sa prvim Fc regionom pomoću opcionog linkera, pri čemu je opciona sekvenca XTEN (X2) insertovana na jedno ili više mesta insercije unutar proteina FVIII ili je fuzionisana sa proteinom FVIII ili njegovim prvim Fc regionom, i (ii) drugi polipeptid koji se sastoji od fragmenta VWF koji se sastoji od D' domena i D3 domena VWF fuzionisanog sa drugim Fc regionom sekvencom XTEN (X1) između fragmenta VWF i drugog Fc regiona, pri čemu XTEN sekvenca (X1) sadrži manje od 288 ostataka aminokiselina i u kojem su prvi polipeptid i drugi polipeptid asocirani. U nekim otelotvorenjima, protein FVIII je fuzionisan sa prvim Fc regionom pomoću opcionog linkera, pri čemu je opciona XTEN sekvenca (X2) insertovana na jedno ili više mesta insercije unutar proteina FVIII ili je fuzionisana sa proteinom FVIII ili sa prvim Fc regionom, i (ii) fragment VWF je fuzionisan sa drugim Fc regionom pomoću XTEN sekvence (X1) između fragmenta VWF i drugog Fc regiona, pri čemu XTEN sekvenca (X1) sadrži manje od 288 aminokiselinskih ostataka i fuzionisana je sa drugim Fc regionom pomoću linkera koji se može cepati i gde su asocirani prvi polipeptid i drugi polipeptid. U određenom otelotvorenju, linker koji se može cepati je linker koji se može cepati trombinom.

[0091] U nekim otelotvorenjima, himerni protein pronalaska su dva polipeptidna lanca, prvi lanac koji se sastoji od prvog gore opisanog polipeptida i drugi lanac koji se sastoji od drugog gore opisanog polipeptida. Na primer, dva polipeptidna lanca se sastoje od (i) prvog lanca koji se sastoji od jednolančanog proteina FVIII, prvog Fc regiona i sekvence XTEN koja je insertovana na jedno ili više mesta insercije unutar proteina FVIII, i (ii) drugog lanca koji se sastoji od fragmenta VWF fuzionisanog sa drugim Fc regionom pomoću sekvence XTEN (X1) između njih, pri čemu sekvenca XTEN (X1) sadrži manje od 288 aminokiselina.

[0092] U određenim otelotvorenjima, himerni protein pronalaska su dva polipeptidna lanca, a prvi lanac se sastoji od teškog lanca proteina FVIII i drugi lanac koji sadrži, od N-terminala do C-terminala, laki lanac proteina FVIII, sekvencu XTEN koja je insertovana na jedno ili više mesta insercije unutar proteina FVIII ili je fuzionisana sa proteinom FVIII ili sa prvim Fc regionom, i prvi Fc region, opcioni linker (npr., obradivi linker), fragment VWF, XTEN sekvencu (X1), linker koji se može cepati, i drugi Fc region.

II.A. Von Willebrand Faktor (VWF) proteini

[0093] VWF (takođe poznat kao F8VWF) je veliki multimerni glikoprotein prisutan u krvnoj plazmi i konstitutivno se proizvodi u endotelu (u telima Weibel-Palade), megakariocitima (agranulama trombocita) i subendotelnom vezivnom tkivu. Osnovni VWF monomer je 2813 aminokiselinski protein. Svaki monomer sadrži niz specifičnih domena sa specifičnom funkcijom, D'/D3 domen (koji se vezuje za FVIII), A1 domen (koji se vezuje za GPIbreceptor trombocita, heparin i/ili eventualno kolagen), A3 domen (koji se vezuje za kolagen), C1 domen (u kojem se RGD domen vezuje za integrin trombocita αIIbβ3 kada je ovaj aktiviran) i "cisteinski čvor" domen na C-terminalnom kraju proteina (koji VWF deli sa faktorom rasta trombocita (PDGF), transformišući faktor rasta-β (TGFβ) i β-humani horionski gonadotropin (βHCG)).

[0094] U ovom obelodanjivanju, VWF protein može biti VWF fragment. Izraz "VWF fragment", koji se ovde koristi, uključuje, ali nije ograničen na, funkcionalne VWF fragmente koji se sastoje od D' domena i D3 domena, koji su sposobni da inhibiraju vezivanje endogenih VWF za FVIII. U jednom otelotvorenju, VWF fragment se vezuje za FVIII protein. U drugom otelotvorenju, fragment VWF blokira mesto vezivanja VWF na proteinu FVIII, čime inhibira interakciju proteina FVIII sa endogenim VWF. Fragmenti VWF uključuju derivate, varijante, mutante ili analoge koji zadržavaju ove aktivnosti VWF.

[0095] Aminokiselinska sekvenca 2813 monomera za humani VWF je prijavljena kao pristupni broj _NP_000543.2_ u Banci gena. Nukleotidna sekvenca koja kodira humani VWF je prijavljena kao pristupni broj _NM_000552.3_ u Banci gena. Nukleotidna sekvenca humanog VWF označena je kao SEQ ID NO: 20. SEQ ID NO: 21 je aminokiselinska sekvenca VWF pune dužine. Svaki domen VWF-A naveden je u Tabeli 1.

TABELA 1. VWF sekvence

[0096] Fragment VWF koji se ovde koristi obuhvata domen D' i domen D3 VWF, pri čemu se fragment VWF vezuje za Faktor VIII (FVIII) i inhibira vezivanje endogenog VWF (VWF pune dužine) za FVIII. Fragment VWF koji obuhvata domen D' i domen D3 može dalje da obuhvata domen VWF izabran iz grupe koja se sastoji od domena A1, domena A2, domena A3, domena D1, domena D2, domena D4, domena B1, domena B2, domena B3, domena C1, domena C2, domena CK, jednog ili više njihovih fragmenata i svih njihovih kombinacija. U jednom otelotvorenju, fragment VWF se sastoji, u suštini od, ili se sastoji od: (1) domena D' i D3 domena VWF ili njihovih fragmenata; (2) domena D1, D' i D3 domena VWF ili njihovih fragmenata; (3) D2, D' i D3 domena VWF ili njihovih fragmenata; (4) D1, D2, D' i D3 domena VWF ili njihovih fragmenata; ili (5) D1, D2, D', D3 i A1 domena VWF ili njihovih fragmenata. Ovde opisani fragment VWF ne sadrži mesto vezivanja za receptor za klirens VWF. Fragment VWF ovog pronalaska može se sastojati od bilo kojih drugih sekvenci povezanih za ili fuzionisanih sa fragmentom VWF. Na primer, ovde opisani fragment VWF može dalje da sadrži signalni peptid.

[0097] U jednom otelotvorenju, VWF fragment koji se sastoji od D' domena i D3 domena se vezuje za protein FVIII ili je asociran sa njim. Vezivanjem ili asocijacijom sa proteinom FVIII, VWF fragment pronalaska štiti FVIII od proteaznog cepanja i aktiviranja FVIII, stabilizuje teški lanac i laki lanac FVIII i sprečava klirens FVIII pomoću receptora hvatača. U drugom otelotvorenju, fragment VWF se vezuje za ili asocira sa proteinom FVIII i blokira ili sprečava vezivanje proteina FVIII za fosfolipid i aktivirani protein C. Sprečavanjem ili inhibiranjem vezivanja proteina FVIII sa endogenim VWF pune dužine, fragment VWF pronalaska smanjuje klirens FVIII pomoću receptora za klirens VWF i na taj način produžava poluživot himernog proteina. Produženje poluživota himernog proteina je stoga posledica vezivanja ili asocijacije sa fragmentom VWF kome nedostaje mesto vezivanja receptora VWF klirensa za protein FVIII i zaklanjanja ili zaštite proteina FVIII fragmentom VWF iz endogenog VWF koji sadrži mesto vezivanja receptora VWF klirensa. Protein FVIII vezan za fragment VWF ili zaštićen njime takođe može omogućiti recikliranje proteina FVIII.

Eliminacijom mesta vezivanja za receptore na putu klirensa VWF sadržanih u molekulu VWF pune dužine, heterodimeri FVIII/VWF pronalaska su zaštićeni od putanje klirensa VWF, što dalje produžava poluživot FVIII.

[0098] Kao što je ovde obelodanjeno, VWF protein može da sadrži D' domen i D3 domen VWF, pri čemu je D' domen najmanje 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičan aminokiselinama 764 do 866 SEQ ID NO: 21, pri čemu VWF protein sprečava ili inhibira vezivanje endogenog VWF za FVIII. VWF protein može da obuhvata D' domen i D3 domen VWF, pri čemu je D3 domen najmanje 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičan aminokiselinama 867 do 1240 SEQ ID NO: 21, pri čemu VWF protein sprečava ili inhibira vezivanje endogenog VWF za FVIII. VWF protein obelodanjen u ovom dokumentu može da obuhvati, sastojati se u suštini od, ili se sastojati od D' domena i D3 domena VWF, koji su najmanje 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identični aminokiselinama 764 do 1240 SEQ ID NO: 21, pri čemu VWF protein sprečava ili inhibira vezivanje endogenog VWF za FVIII. Protein VWF može obuhvatiti, sastojati se suštinski od ili se sastojati od D1, D2, D' i D3 domena najmanje 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnih aminokiselinama 23 do 1240 SEQ ID NO: 21, pri čemu protein VWF sprečava ili inhibira vezivanje endogenog VWF za FVIII. VWF protein se dalje može sastojati od signalnog peptida koji je operativno povezan sa njim.

[0099] U nekim otelotvorenjima, fragment VWF koristan za pronalazak sastoji se u osnovi od ili se sastoji od (1) domena D'D3, domena D1D' D3, domena D2D'D3 ili domena D1D2D' D3 i (2) dodatne sekvence VWF do oko 10 aminokiselina (npr. bilo koje sekvence od aminokiselina 764 do 1240 SEQ ID NO: 21 do aminokiselina 764 do 1250 SEQ ID NO: 21), do oko 15 aminokiselina (npr. bilo koje sekvence od aminokiselina 764 do 1240 SEQ ID NO: 21 do aminokiselina 764 do 1255 SEQ ID NO: 21), do oko 20 aminokiselina (npr. bilo koje sekvence od aminokiselina 764 do 1240 SEQ ID NO: 21 do aminokiselina 764 do 1260 SEQ ID NO: 21), do oko 25 aminokiselina (npr. bilo koje sekvence od aminokiselina 764 do 1240 SEQ ID NO: 21 do aminokiselina 764 do 1265 broj SEQ ID NO: 21), ili do oko 30 aminokiselina (npr., bilo koje sekvence od aminokiselina 764 do 1240 SEQ ID NO: 21 do aminokiselina 764 do 1260 SEQ ID NO: 21). U određenom otelotvorenju, fragment VWF koji obuhvata ili se sastoji u osnovi od D' domena i D3 domena nije zreli VWF pune dužine. U nekim otelotvorenjima, D1D2 domen je eksprimiran u trans sa D'D3 domenom. U nekim otelotvorenjima, D1D2 domen je eksprimiran u cis sa D'D3 domenom.

[0100] U drugim otelotvorenjima, fragment VWF koji obuhvata D'D3 domene povezane sa D1D2 domenima dalje obuhvata mesto unutarćelijskog cepanja, npr. (mesto cepanja putem PACE (furin) ili PC5), što omogućava cepanje D1D2 domena od D'D3 domena nakon ekspresije. Neograničavajući primeri mesta unutarćelijskog cepanja su obelodanjeni na drugim mestima u ovom dokumentu.

[0101] U drugim otelotvorenjima, fragment VWF obuhvata domen D' i domen D3, ali ne obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od (1) aminokiselina 1241 do 2813 koje odgovaraju SEQ ID NO: 21, (2) aminokiselina 1270 do aminokiselina 2813 koje odgovaraju SEQ ID NO: 21, (3) aminokiselina 1271 do aminokiselina 2813 koje odgovaraju SEQ ID NO: 21, (4) aminokiselina 1272 do aminokiselina 2813 koje odgovaraju SEQ ID NO: 21, (5) aminokiselina 1273 do aminokiselina 2813 koje odgovaraju SEQ ID NO: 21, (6) aminokiselina 1274 do aminokiselina 2813 koje odgovaraju SEQ ID NO: 21, i bilo koje njihove kombinacije.

[0102] U nekim otelotvorenjima, VWF fragment pronalaska obuhvata D' domen i D3 domen, ali ne obuhvata najmanje jedan VWF domen izabran iz grupe koja se sastoji od (1) A1 domena, (2) A2 domena, (3) A3 domena, (4) D4 domena, (5) B1 domena, (6) B2 domena, (7) B3 domena, (8) C1 domena, (9) C2 domena, (10) CK domena, (11) CK domena i C2 domena, (12) CK domena, C2 domena i C1 domena, (13) CK domena, C2 domena, C1 domena, B3 domena, (14) CK domena, C2 domena, C1 domena, B3 domena, B2 domena, (15) CK domena, C2 domena, C1 domena, B3 domena, B2 domena i B1 domena, (16) CK domena, C2 domena, C1 domena, B3 domena, B2 domena, B1 domena i D4 domena, (17) CK domena, C2 domena, C1 domena, B3 domena, B2 domena, B1 domena, D4 domena i A3 domena, (18) CK domena, C2 domena, C1 domena, B3 domena, B2 domena, B1 domena, D4 domena, A3 domena i A2 domena, (19) CK domena, C2 domena, C1 domena, B3 domena, B2 domena, B1 domena, D4 domena, A3 domena, A2 domena i A1 domena, i (20) sve njihove kombinacije.

[0103] U drugim otelotvorenjima, fragment VWF obuhvata domene D'D3 i jedan ili više domena ili modula. Primeri takvih domena ili modula uključuju, ali nisu ograničeni na, domene i module obelodanjene u Zhour et al. Blood - publikovano na mreži 6. aprila, 2012: DOI 10.1182/blood-2012-01-405134. Na primer, fragment VWF može da obuhvata domen D'D3 i jedan ili više domena ili modula izabranih iz grupe koja se sastoji od A1 domena, A2 domena, A3 domena, D4N modula, VWD4 modula, C8-4 modula, TIL-4 modula, C1 modula, C2 modula, C3 modula, C4 modula, C5 modula, C5 modula, C6 modula i svih njihovih kombinacija.

[0104] U još drugim otelotvorenjima, fragment VWF je povezan sa heterolognim delom, pri čemu je heterologni deo povezan sa N-terminalom ili C-terminalom fragmenta VWF.

Heterologni deo može biti produživač poluživota.

[0105] U određenim otelotvorenjima, VWF fragment je monomer koji ima samo jedan VWF fragment. U nekim otelotvorenjima, VWF fragment ovog pronalaska može imati jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, delecija, adicija ili modifikacija. U jednom otelotvorenju, fragment VWF može uključivati aminokiselinske supstitucije, delecije, adicije ili modifikacije tako da fragment VWF nije u stanju da formira disulfidnu vezu ili formira dimer ili multimer. U drugom otelotvorenju, aminokiselinska supstitucija je unutar D' domena i D3 domena. U određenom otelotvorenju, fragment VWF koristan za pronalazak sadrži najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju na ostatku koji odgovara ostatku 1099, ostatku 1142, ili oba ostatka 1099 i 1142 koji odgovaraju SEQ ID NO: 21. Najmanje jedna aminokiselinska supstitucija može biti bilo koja aminokiselina koja se ne javlja prirodno u VWF divljeg tipa. Na primer, aminokiselinska supstitucija može biti bilo koja aminokiselina različita od cisteina, npr. izoleucin, alanin, leucin, asparagin, lizin, asparaginska kiselina, metionin, fenilalanin, glutaminska kiselina, treonin, glutamin, triptofan, glicin, valin, prolin, serin, tirozin, arginin ili histidin. U određenom otelotvorenju pronalaska, fragment VWF sadrži ostatak alanina supstituisan za ostatke koji odgovaraju ostacima 1099 i 1142 SEQ ID NO: 21. U drugom primeru, aminokiselinska supstitucija ima jednu ili više aminokiselina koje sprečavaju ili inhibiraju VWF fragmente da formiraju multimere.

[0106] U određenim otelotvorenjima, fragment VWF koji je ovde koristan može se dodatno modifikovati kako bi se poboljšala njegova interakcija sa FVIII, npr., kako bi se poboljšao afinitet vezivanja za FVIII. Kao neograničavajući primer, fragment VWF se sastoji od ostatka serina u ostatku koji odgovara aminokiselini 764 SEQ ID NO: 21 i ostatka lizina u ostatku koji odgovara aminokiselini 773 SEQ ID NO: 21. Ostaci 764 i/ili 773 mogu doprineti afinitetu vezivanja VWF fragmenata za FVIII. U drugim otelotvorenjima, fragmenti VWF korisni za pronalazak mogu imati druge modifikacije, npr. protein može biti pegiliran, glikoziliran, hesiliran ili polisijalizovan.

II. B. XTEN sekvence

[0107] Kao što se ovde koristi, "XTEN sekvenca" odnosi se na polipeptide produžene dužine, sa suštinski neponavljajućim sekvencama koje nisu prisutne u prirodi i koje su sastavljene uglavnom od malih hidrofilnih aminokiselina, sa sekvencom koja ima nizak stepen ili nema sekundarnu ili tercijarnu strukturu u fiziološkim uslovima. Kao partner himernih proteina, XTENi mogu poslužiti kao nosač, dajući određena poželjna farmakokinetička, fizičkohemijska i farmaceutska svojstva kada su vezani za fragment VWF ili FVIII sekvencu pronalaska da bi se stvorio himerni protein. Takva poželjna svojstva uključuju, ali nisu ograničena, na poboljšane farmakokinetičke parametre i karakteristike rastvorljivosti. Kao što se ovde koristi, "XTEN" posebno isključuje antitela ili fragmente antitela kao što su jednolančana antitela ili Fc fragmenti lakog lanca ili teškog lanca.

[0108] Ovaj pronalazak pruža to da kraća XTEN sekvenca pruža poboljšano svojstvo produženja poluživota u poređenju sa dužom XTEN sekvencom kada je XTEN sekvenca fuzionisana sa fragmentom VWF i/ili drugim Fc regionom. Stoga, XTEN sekvenca fuzionisana sa VWF fragmentom i/ili drugim Fc regionom sadrži manje od 288 aminokiselina po dužini, tj. kraća je od 288 aminokiselina. U drugom otelotvorenju, XTEN sekvenca fuzionisana sa VWF proteinom i/ili drugim Fc regionom sastoji se od najmanje 144 aminokiseline, ali manje od 288 aminokiselina. U drugim otelotvorenjima, XTEN sekvenca fuzionisana sa VWF fragmentom i/ili drugim Fc regionom. Himerni protein pronalaska može dalje da sadrži dodatne (drugu, treću ili više) XTEN sekvence. Dodatna XTEN sekvenca se može dalje fuzionisati sa proteinom FVIII ili prvim Fc regionom. Dodatne XTEN sekvence mogu biti bilo koje dužine. Na primer, dodatna XTEN sekvenca fuzionisana sa proteinom FVIII ili prvim Fc regionom je peptid ili polipeptid koji ima više od oko 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800 ili 2000 ostataka aminokiselina. U određenim otelotvorenjima, dodatna XTEN sekvenca je peptid ili polipeptid koji ima više od oko 20 do oko 3000 aminokiselinskih ostataka, više od oko 30 do oko 2500 ostataka, više od oko 40 do oko 2000 ostataka, više od oko 50 do oko 1500 ostataka, više od oko 60 do oko 1000 ostataka, više od oko 70 do oko 900 ostataka, više od oko 80 do oko 800 ostataka, više od oko 90 do oko 700 ostataka, više od oko 100 do oko 600 ostataka, više od oko 110 do oko 500 ostataka, ili više od oko 120 do oko 400 ostataka.

[0109] XTEN sekvence mogu da sadrže jedan ili više motiva sekvence od 9 do 14 aminokiselinskih ostataka ili aminokiselinsku sekvencu najmanje 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnu motivu sekvence, pri čemu motiv sadrži, sastoji se u suštini, ili se sastoji od 4 do 6 vrsta aminokiselina izabranih iz grupe koja se sastoji od glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamata (E) i prolina (P). Vidi SAD 2010-0239554 A1.

[0110] XTEN sekvenca može da obuhvata motive sekvenci koje se ne preklapaju u kojima najmanje oko 80%, ili najmanje oko 85%, ili najmanje oko 90%, ili najmanje oko 91%, ili najmanje oko 92%, ili najmanje oko 93%, ili najmanje oko 94%, ili najmanje oko 95%, ili najmanje oko 96%, ili najmanje oko 97%, ili najmanje oko 98%, ili najmanje oko 99% ili oko 100% sekvence sastoji se od više jedinica sekvenci koje se ne preklapaju izabranih iz jedne porodice motiva izabranih iz tabele 2A, što rezultira porodičnom sekvencom. Kao što se ovde koristi, "porodica" znači da XTEN ima motive izabrane samo iz jedne kategorije motiva iz Tabele 2A; tj. AD, AE, AF, AG, AM, AQ, BC ili BD XTEN, i da su sve druge aminokiseline u XTEN koje nisu iz porodičnog motiva odabrane da bi se postigla potrebna svojstva, kao što je omogućavanje inkorporacije restrikciona mesta nukleotidima koji kodiraju, inkorporacija sekvence cepanja ili da bi se postigla bolja povezanost sa FVIII ili VWF. U XTEN porodicama, XTEN sekvenca može da se sastoji od više jedinica motiva sekvenci koji se ne preklapaju iz AD porodice motiva, ili AE porodice motiva, ili AF porodice motiva, ili AG porodice motiva, ili AM porodice motiva, ili AQ porodice motiva, ili BC porodice, ili BD porodice, sa rezultujućim XTEN koji pokazuje prethodno opisani raspon homologije. XTEN može da sadrži više jedinica sekvenci motiva iz dve ili više porodica motiva iz Tabele 2A. Ove sekvence mogu biti izabrane da bi se postigle željene fizičko/hemijske karakteristike, uključujući svojstva kao što su neto naelektrisanje, hidrofilnost, nedostatak sekundarne strukture ili nedostatak repetitivnosti koji su dodeljeni aminokiselinskim sastavom motiva, opisanih u nastavku. Motivi ugrađeni u XTEN mogu biti izabrani i sastavljeni metodama opisanim u ovom dokumentu kako bi se postigao XTEN od oko 36 do oko 3000 aminokiselinskih ostataka.

Tabela 2A. Motivi XTEN sekvence za 12 porodica aminokiselina i motiva

[0111] U ovom obelodanjivanju, XTEN sekvenca može biti najmanje 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sekvenci izabranoj iz grupe koja se sastoji od AE42, AG42, AE48, AM48, AE72, AG72, AE108,

AG108, AE144, AF144, AG144, AE180, AG180, AE216, AG216, AE252, AG252, AE288,

AG288, AE324, AG324, AE360, AG360, AE396, AG396, AE432, AG432, AE468, AG468,

AE504, AG504, AF504, AE540, AG540, AF540, AD576, AE576, AF576, AG576, AE612,

AG612, AE624, AE648, AG648, AG684, AE720, AG720, AE756, AG756, AE792, AG792,

AE828, AG828, AD836, AE864, AF864, AG864, AM875, AE912, AM923, AM1318,

BC864, BD864, AE948, AE1044, AE1140, AE1236, AE1332, AE1428, AE1524, AE1620,

AE1716, AE1812, AE1908, AE2004A, AG948, AG1044, AG1140, AG1236, AG1332, AG1428, AG1524, AG1620, AG1716, AG1812, AG1908, i AG2004. Vidi US 2010-0239554 A1.

[0112] U ovom obelodanjivanju, XTEN sekvenca može biti najmanje 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koja se sastoji od AE42 (SEQ ID NO: 9), AE72 (SEQ ID NO: 10), AE1442A (SEQ IDNO:

55), AE144_3B (SEQ ID NO: 56), AE1444A (SEQ ID NO: 57), AE144_5A (SEQ ID NO:

58), AE144_6B (SEQ ID NO: 59), AG144_A (SEQ ID NO: 60), AG144 B (SEQ ID NO: 61), AG144_C (SEQ ID NO: 62), AG144 F (SEQ IDNO: 63), AE864 (SEQ ID NO: 15),

AE576 (SEQ ID NO: 16), AE288 (SEQ ID NO: 8), AE2882 (SEQ ID NO: 54), AE144 (SEQ

ID NO: 11), AG864 (SEQ ID NO: 17), AG576 (SEQ ID NO: 18), AG288 (SEQ ID NO: 19),

AG144 (SEQ ID NO: 14), i bilo koje njihove kombinacije. XTEN sekvenca može biti izabrana iz grupe koja se sastoji od AE42 (SEQ ID NO: 9), AE72 (SEQ ID NO: 10), AE144

2A (SEQ ID NO: 55), AE144_3B (SEQ ID NO: 56), AE1444A (SEQ ID NO: 57), AE144

5A (SEQ ID NO: 58), AE144_6B (SEQ ID NO: 59), AG144_A (SEQ ID NO: 60), AG144_B

(SEQ ID NO: 61), AG144_C (SEQ ID NO: 62), AG144_F (SEQ IDNO: 63), AE864 (SEQ

ID NO: 15), AE576 (SEQ ID NO: 16), AE288 (SEQ ID NO: 8), AE2882 (SEQ ID NO: 54),

AE144 (SEQ ID NO: 11), AG864 (SEQ ID NO: 17), AG576 (SEQ ID NO: 18), AG288 (SEQ ID NO: 19), AG144 (SEQ ID NO: 14), i bilo koje njihove kombinacije. Konkretno, XTEN sekvenca može biti AE288. Aminokiselinske sekvence za određene XTEN sekvence prikazane su u Tabeli 2B.

Tabela 2B. XTEN sekvence

[0113] Tamo gde komponente XTEN koje su ovde obelodanjene imaju manje od 100% svojih aminokiselina koje se sastoje od 4, 5 ili 6 vrsta aminokiselina izabranih iz grupe koja se sastoji od glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamata (E) i prolina (P), ili manje od 100% sekvence koja se sastoji od motiva sekvenci iz Tabele 3 ili sekvenci XTEN iz Tabela 4 i 13-17, ostali aminokiselinski ostaci XTEN su izabrani iz bilo kojih od 14 prirodnih L-aminokiselina, ali su preferencijalno izabrani iz hidrofilnih aminokiselina, tako da XTEN sekvenca sadrži najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 ili najmanje oko 99% hidrofilnih aminokiselina. XTEN aminokiseline koje nisu glicin (G), alanin (A), serin (S), treonin (T), glutamat (E) i prolin (P) su ili ispresecane po celoj XTEN sekvenci, nalaze se unutar ili između motiva sekvence, ili su koncentrisane u jednom ili više kratkih odsečaka XTEN sekvence, npr. da bi se stvorio linker između XTEN i FVIII ili VWF komponenti. U slučajevima kada XTEN komponenta obuhvata aminokiseline koje nisu glicin (G), alanin (A), serin (S), treonin (T), glutamat (E) i prolin (P), poželjno je da manje od 2% ili manje od 1% aminokiselina budu hidrofobni ostaci tako da rezultirajućim sekvencama generalno nedostaje sekundarna struktura, npr. da nemaju više od 2% alfa zavojnica ili 2% beta-ploča, kako je utvrđeno metodama koje su ovde obelodanjene. Hidrofobni ostaci koji su manje favorizovani u konstrukciji XTEN uključuju triptofan, fenilalanin, tirozin, leucin, izoleucin, valin i metionin. Pored toga, može se dizajnirati da XTEN sekvence sadrže manje od 5% ili manje od 4% ili manje od 3% ili manje od 2% ili manje od 1% ili nijednu od sledećih aminokiselina: cistein (za izbegavanje stvaranja disulfida i oksidacije), metionin (za izbegavanje oksidacije), asparagin i glutamin (za izbegavanje dezamidacije). Dakle, XTEN komponenta koja se sastoji od drugih aminokiselina pored glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamata (E) i prolina (P) može imati sekvencu sa manje od 5% ostataka koji doprinose alfa-zavojnicama i beta-pločama kako je izmereno Chou-Fasman-ovim algoritmom i ima najmanje 90%, ili najmanje 95% ili više formiranja random zavojnice kako je izmereno GOR algoritmom.

[0114] U daljim otelotvorenjima, XTEN sekvenca koja se koristi u pronalasku utiče na fizičko ili hemijsko svojstvo, npr. farmakokinetiku himernog proteina sadašnjeg pronalaska. XTEN sekvenca koja se koristi u ovom pronalasku može da pokaže jedno ili više sledećih povoljnih svojstava: konformaciona fleksibilnost, povećana rastvorljivost u vodi, visok stepen otpornosti na proteazu, niska imunogenost, nisko vezivanje za receptore sisara ili povećani hidrodinamički (ili Stokes) poluprečnici. U specifičnom otelotvorenju, XTEN sekvenca povezana sa proteinom FVIII u ovom pronalasku povećava farmakokinetička svojstva kao što su duži terminalni poluživot ili povećana površina ispod krive (AUC), tako da ovde opisani himerni protein ostaje in vivo duži vremenski period u poređenju sa FVIII divljeg tipa. U daljim otelotvorenjima, XTEN sekvenca koja se koristi u ovom pronalasku povećava farmakokinetička svojstva kao što su duži terminalni poluživot ili povećana površina ispod krive (AUC), tako da protein FVIII ostaje in vivo duži vremenski period u poređenju sa FVIII divljeg tipa.

[0115] Ovde obelodanjen je fuzioni protein FVIII/VWF koji se sastoji od FVIII fuzionisanog sa Fc regionom i VWF dela fuzionisanog sa Fc regionom, pri čemu je sekvenca XTEN (npr. AE288) insertovana unutar dela FVIII, pri čemu je XTEN sekvenca koja ima manje od 288 aminokiselina (npr. AE144) insertovana između VWF dela i Fc dela. Kao što je opisano u primerima, insercija XTEN koji ima manje od 288 aminokiselina između VWF dela i Fc dela ima veći uticaj na farmakokinetiku himernog proteina nego insercija XTEN koji ima 288 aminokiselina između VWF dela i Fc dela. Na primer, insercija XTEN sekvence koja ima manje od 288 aminokiselina između VWF dela i Fc dela u FVIII/VWF fuzionom proteinu može povećati terminalni poluživot himernog proteina u poređenju sa XTEN koji ima 288 aminokiselina. Kod nekih otelotvorenja, terminalni poluživot je povećan za najmanje oko 5%, najmanje oko 10%, najmanje oko 15%, najmanje oko 20%, najmanje 25%, ili najmanje oko 30%, u odnosu na inserciju XTEN sekvence koja ima 288 aminokiselina. U jednom određenom otelotvorenju, terminalni poluživot je povećan za najmanje 35% u odnosu na inserciju XTEN koji ima 288 aminokiselina. Insercija XTEN sekvence koja ima manje od 288 aminokiselina takođe može povećati AUC vrednost himernog proteina. U nekim otelotvorenjima, AUC je povećana za najmanje oko 50%, najmanje oko 100%, ili najmanje oko 200% u odnosu na inserciju XTEN koji ima 288 aminokiselina. U jednom određenom otelotvorenju, AUC je povećana za oko dva puta. Insercija XTEN sekvence koja ima manje od 288 aminokiselina takođe može smanjiti klirens himernog proteina. Na primer, klirens se može smanjiti za najmanje oko 5%, najmanje oko 10%, najmanje oko 15%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, ili najmanje oko 30%, u odnosu na inserciju XTEN sekvence koja ima 288 aminokiselina. Insercija XTEN sekvence koja ima manje od 288 aminokiselina može povećati srednje vreme boravka (MRT) i/ili smanjiti prividni volumen distribucije u stacionarnom stanju (Vss) u odnosu na inserciju XTEN sekvence koja ima 288 aminokiselina.

[0116] Različite metode i testovi mogu se koristiti za određivanje fizičkih/hemijskih svojstava proteina koji obuhvataju XTEN sekvencu. Takve metode uključuju, ali nisu ograničene na, analitičko centrifugiranje, EPR, HPLC-jonsku izmenu, dimenziono ekskluzivnu HPLC, HPLC reverzne faze, rasipanje svetlosti, kapilarnu elektroforezu, cirkularni dihroizam, diferencijalnu skenirajuću kalorimetriju, fluorescenciju, IR, NMR, Ramanovu spektroskopiju, refraktometriju i UV/vidljivu spektroskopiju. Dodatne metode su obelodanjene u Amau et al., Prot Expr and Purif 48, 1-13 (2006).

[0117] Dalji primeri XTEN sekvenci su obelodanjeni u SAD Patent Publikaciji br.

2010/0239554 A1, 2010/0323956 A1, 2011/0046060 A1, 2011/0046061 A1, 2011/0077199 A1, ili 2011/0172146 A1, ili Publikaciji međunarodnog patenta br. WO 2010091122 A1, WO 2010144502 A2, WO 2010144508 A1, WO 2011028228 A1, WO 2011028229 A1, WO 2011028344 A2, ili WO 20130122617 A1.

II.C. Faktor VIII (FVIII) Protein

[0118] "Protein FVIII" koji se koristi ovde označava funkcionalni polipeptid FVIII u njegovoj normalnoj ulozi u koagulaciji, osim ako nije drugačije navedeno. Izraz FVIII protein uključuje funkcionalni fragment, njegovu varijantu, analog ili derivat koji zadržava funkciju faktora VIII pune dužine divljeg tipa u putanji koagulacije. "Protein FVIII" se koristi naizmenično sa FVIII polipeptidom (ili proteinom) ili FVIII. Primeri funkcija FVIII uključuju, ali ne ograničavajući se na, sposobnost aktiviranja koagulacije, sposobnost da deluje kao kofaktor za faktor IX, ili sposobnost formiranja kompleksa tenaze sa faktorom IX u prisustvu Ca<2+>i fosfolipida, koji zatim konvertuje faktor X u aktivirani oblik Xa. Protein FVIII može biti humani, svinjski, pseći, pacovski ili mišji protein FVIII. Pored toga, poređenja između FVIII kod ljudi i drugih vrsta identifikovala su očuvane ostatke koji su verovatno potrebni za funkciju (Cameron et al., Thromb. Haemost.79:317-22 (1998); US 6,251,632).

[0119] Dostupni su brojni testovi za procenu funkcije koagulacionog sistema: test vremena aktiviranog parcijalnog tromboplastina (aPTT), hromogeni test, ROTEM test, test protrombinskog vremena (PT) (koji se takođe koristi za određivanje INR), test fibrinogena (često Clauss-ovom metodom), broj trombocita, test funkcije trombocita (često po PFA-100), TCT, vreme krvarenja, test mešanja (da li se nenormalnost koriguje ako je pacijentova plazma pomešana sa normalnom plazmom), testovi koagulacionog faktora, antifosfolipidna antitela, D-dimer, genetski testovi (npr. faktor V Leiden, protrombinska mutacija G20210A), vreme razblaženog Russel-ovog zmijskog otrova (dRVVT), razni testovi funkcije trombocita, trombocitografija (TEG ili Sonoclot), trombocitija (npr. TEM<®>, ROTEM ®, ili vreme lize euglobulina (ELT).

[0120] aPTT test je indikator performansi koji meri efikasnost i "sopstvenog" (koji se takođe naziva i put kontaktne aktivacije) i opštih puteva koagulacije. Ovaj test se obično koristi za merenje aktivnosti zgrušavanja komercijalno dostupnih rekombinantnih faktora zgrušavanja, npr., FVIII ili FIX. Koristi se zajedno sa protrombinskim vremenom (PT), koje meri spoljni put.

[0121] Analiza ROTEM pruža informacije o celokupnoj kinetici hemostaze: vreme zgrušavanja, stvaranje ugrušaka, stabilnost ugruška i liza. Različiti parametri u tromboelastometriji zavise od aktivnosti plazmatskog koagulacionog sistema, funkcije trombocita, fibrinolize ili mnogih faktora koji utiču na ove interakcije. Ovaj test može pružiti kompletan prikaz sekundarne hemostaze.

[0122] Poznate su polipeptidne i polinukleotidne sekvence FVIII, kao i mnogi funkcionalni fragmenti, mutanti i modifikovane verzije. Primeri humanih sekvenci FVIII (pune dužine) prikazani su u nastavku.

TABELA 3. Sekvenca aminokiseline faktora VIII pune dužine

TABELA 4. Nukleotidna sekvenca koja kodira FVIII pune dužine (SEQ ID NO: 66)*

[0123] Polipeptidi FVIII obuhvataju FVIII pune dužine, FVIII pune dužine minus Met na N-terminalu, zreli FVIII (minus signalna sekvenca), zreli FVIII sa dodatnim Met na N-terminalu i/ili FVIII sa potpunom ili delimičnom delecijom domena B. U određenim otelotvorenjima, varijante FVIII uključuju deleciju domena B, bilo delimične ili potpune delecije.

[0124] Sekvenca prirodnog zrelog humanog FVIII prikazana je kao SEQ ID NO: 65. Prirodni protein FVIII ima sledeću formulu: A1-a1-A2-a2-B-a3-A3-C1-C2, gde su A1, A2 i A3 strukturno povezani "A domeni", B je "B domen", C1 i C2 su strukturno povezani "C domeni", a a1, a2 i a3 su kiseli razdvajački regioni. Pozivajući se na položaj primarne aminokiselinske sekvence u SEQ ID NO:65, A1 domen humanog FVIII se proteže od Ala1 do oko Arg336, a1 razdvajački region se proteže od oko Met337 do oko Val374, A2 domen se proteže od oko Ala375 do oko Tyr719, a2 razdvajački region se proteže od oko Glu720 do oko Arg740, B domen se proteže od oko Ser741 do oko Arg 1648, a3 razdvajački region se proteže od oko Glu1649 do oko Arg1689, A3 domen se proteže od oko Ser1690 do oko Leu2025, C1 domen se proteže od oko Gly2026 do oko Asn2072, a C2 domen se proteže od oko Ser2073 do Tyr2332. Osim specifičnih proteolitičkih mesta cepanja, određivanje lokacija granica između domena i regiona FVIII može varirati u različitim referencama iz literature. Granice koje su ovde zabeležene su stoga označene kao približne korišćenjem izraza „oko“.

[0125] Humani gen FVIII je izolovan i eksprimiran u ćelijama sisara (Toole, J.J., et al., Nature 312:342-347 (1984); Gitschier, J., et al., Nature 312: 326-330(1984); Wood, W. I., et al., Nature 312: 330-337(1984); Vehar, G. A., et al., Nature 312:337-342 (1984); WO 87/04187; WO 88/08035; WO 88/03558; i SAD Pat. Br.4.757.006). Aminokiselinska sekvenca FVIII je dedukovana iz cDNK kao što je prikazano u SAD Pat. br.4.965.199. Pored toga, FVIII sa delimično ili potpuno izbrisanim B domenom prikazan je u SAD Pat. Br. 4.994.371 i 4.868.112. U nekim otelotvorenjima, B-domen humanog FVIII zamenjen je sa B-domenom humanog faktora V, kao što je prikazano u SAD Pat. br.5.004.803. Sekvenca cDNK koja kodira humani FVIII i aminokiselinska sekvenca prikazane su u SEQ ID NO: 1 i 2, SAD Publ. Prijave patenta br.2005/0100990.

[0126] Svinjska FVIII sekvenca objavljena je u Toole, J.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5939-5942 (1986). Dalje, kompletna svinjska cDNK sekvenca dobijena iz PCR amplifikacije FVIII sekvenci iz biblioteke cDNK slezine svinja je prijavljena u Healey, J. F., et al., Blood, 88:4209-4214 (1996). Hibridni humani/svinjski FVIII koji imaju supstitucije svih domena, svih podjedinica i specifičnih aminokiselinskih sekvenci obelodanili su Lollar i Runge u SAD Pat. Br.5.364.771, i u WO 93/20093. U skorije vreme, nukleotidne i odgovarajuće aminokiselinske sekvence domena A1 i A2 svinjskog FVIII i himernog FVIII sa svinjskim domenima A1 i/ili A2 supstituisanim za odgovarajuće humane domene su objavljene u WO 94/11503. SAD Pat. br.5,859,204, Lollar, J. S., takođe obelodanjuje svinjsku cDNK i dedukovane aminokiselinske sekvence. SAD Pat. Br.6,458,563 obelodanjuje FVIII svinje sa izbrisanim B-domenom.

[0127] SAD Pat. Br.5,859,204 prema Lolaru, J.S. izveštava da funkcionalni mutanti FVIII imaju smanjenu antigenost i smanjenu imunoreaktivnost. SAD Pat. br.6.376.463 prema Lolaru, J. S. takođe prijavljuje mutante FVIII koji imaju smanjenu imunoreaktivnost. SAD prijava patenta br.2005/0100990, Saenko et al., izveštava o funkcionalnim mutacijama u A2 domenu FVIII.

[0128] U jednom otelotvorenju, FVIII (ili FVIII deo himernog proteina) može biti najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičan FVIII aminokiselinskoj sekvenci aminokiselina 1 do 1438 SEQ ID NO: 67 ili aminokiselina 1 do 2332 SEQ ID NO: 65 (bez signalne sekvence) ili aminokiselinskoj sekvenci FVIII aminokiselina 1 do 19 SEQ ID NO: 64 i 1 do 1438 SEQ ID NO: 67 ili aminokiselina 1 do 19 SEQ ID NO: 64 i aminokiselina 1 do 2332 SEQ ID NO: 65 (sa signalnom sekvencom), pri čemu FVIII ima aktivnost zgrušavanja, npr. aktivira faktor IX kao kofaktor za konverziju faktora X u aktivirani faktor X. FVIII (ili FVIII deo himernog proteina) može biti identičan aminokiselinskoj sekvenci FVIII aminokiselina 1 do 1438 SEQ ID NO: 67 ili aminokiselina 1 do 2332 SEQ ID NO: 65 (bez signalne sekvence). FVIII dalje može sadržati signalnu sekvencu.

[0129] "B-domen" FVIII, kao što se ovde koristi, je isti kao i B-domen poznat u struci koji je definisan internim identitetom aminokiselinske sekvence i mestima proteolitičkog cepanja, npr., ostaci Ser741-Arg1648 humanog FVIII pune dužine. Ostali humani domeni FVIII definisani su sledećim aminokiselinskim ostacima: A1, ostaci Ala1-Arg372; A2, ostaci Ser373-Arg740; A3, ostaci Ser1690-Asn2019; C1, ostaci Lys2020-Asn2172; C2, ostaci Ser2173-Tyr2332. Sekvenca A3-C1-C2 uključuje ostatke Ser1690-Tyr2332. Preostala sekvenca, ostaci Glu1649-Arg1689, obično se naziva a3 kiseli region. U struci su poznate i lokacije granica za sve domene, uključujući B domene, za svinjski, mišji i pseći FVIII. U jednom otelotvorenju, B domen FVIII je izbrisan ("FVIII sa brisanim B-domenom" ili "BDD FVIII"). Primer BDD FVIII je REFACTO<®>(rekombinantni BDD FVIII), koji ima istu sekvencu kao i FVIII deo sekvence u Tabeli 5. (BDD FVIII teški lanac je dvostruko podvučen; B domen je italizovan; a BDD FVIII laki lanac je u običnom tekstu). Sekvenca nukleotida koja kodira Tabelu 6 (SEQ ID NO: 68) prikazana je u tabeli 6.

TABELA 5. sekvenca aminokiseline izbrisanog Faktora VIII B-domena (BDD FVIII)

TABELA 6. Nukleotidna sekvenca koja kodira BDD FVIII (SEQ ID NO: 68)*

* podvučene nukleinske kiseline kodiraju signalni peptid

[0130] „FVIII sa izbrisanim domenom B“ može imati potpune ili delimične delecije obelodanjene u SAD Pat. br.6,316,226, 6,346,513, 7,041,635, 5,789,203, 6,060,447, 5,595,886, 6,228,620, 5,972,885, 6,048,720, 5,543,502, 5,610,278, 5,171,844, 5,112,950, 4,868,112, i 6,458,563. U nekim otelotvorenjima, FVIII sekvenca sa izbrisanim B-domenom ovog pronalaska obuhvata bilo koju deleciju obelodanjenu u kol.4, red 4 do kol.5, red 28 i primerima 1-5 SAD Pat. Br.6,316,226 (takođe u SAD 6,346,513). U drugom otelotvorenju, FVIII sa izbrisanim B-domenom je FVIII sa izbrisanim S743/Q1638 B-domenom (SQ BDD FVIII) (npr. Faktor VIII koji ima deleciju od aminokiseline 744 do aminokiseline 1637, npr. Faktor VIII koji ima aminokiseline 1-743 i aminokiseline 1638-2332 SEQ ID NO: 65, tj., SEQ ID NO: 67). U nekim otelotvorenjima, FVIII sa obrisanim B-domenom ovog pronalaska ima deleciju obelodanjenu u kol.2, redovi 26-51 i primerima 5-8 SAD patenta br.5,789,203 (takođe SAD 6,060,447, SAD 5,595,886 i 6,228,620). U nekim otelotvorenjima, FVIII sa obrisanim B-domenom ima deleciju opisanu u kol.1, red 25 do kol.2, red 40 SAD patenta br.

5.972,885; kol.6, redovi 1-22 i primer 1 SAD patenta br.6,048,720; kol.2, linije 17-46 SAD patenta br.5,543,502; kol.4, linija 22 do kol.5, red 36 SAD patenta br.5,171,844; kol.2, redovi 55-68, slika 2, i primer 1 SAD patenta br.5,112,950; kol.2, red 2 do kol.19, red 21 i tabela 2 SAD patenta br.4,868,112; kol.2, red 1 do kol.3, red 19, kol.3, red 40 do kol.4, red 67, kol.7, red 43 do kol.8, red 26, i kol.11, red 5 do kol.13, red 39 SAD patenta br.

7,041,635; ili kol.4, redovi 25-53, SAD patenta br.6,458,563. U nekim otelotvorenjima, FVIII sa obrisanim B-domenom ima deleciju većine B domena, ali i dalje sadrži aminoterminalne sekvence B domena koje su od suštinskog značaja za in vivo proteolitičku obradu primarnog proizvoda translacije u dva polipeptidna lanca, kako je obelodanjeno u WO 91/09122. U nekim otelotvorenjima, FVIII sa obrisanim B-domenom je konstruisan sa delecijom aminokiselina 747-1638, tj. praktično kompletnom delecijom B-domena. Hoeben R.C., et al. J. Biol. Chem. 265 (13): 7318-7323 (1990). Faktor VIII sa obrisanim B-domenom takođe može da sadrži deleciju aminokiselina 771-1666 ili aminokiselina 868-1562 FVIII. Meulien P., et al. Protein Eng. 2(4): 301-6 (1988). Dodatne delecije B-domena koje su deo pronalaska uključuju: deleciju aminokiselina 982 do 1562 ili 760 do 1639 (Toole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1986) 83, 5939-5942)), 797 do 1562 (Eaton, et al. Bichemistry (1986) 25:8343-8347)), 741 do 1646 (Kaufman (PCT publikovana prijava br. WO 87/04187), 747-1560 (Sarver, et al., DNA (1987) 6:553-564)), 741 do 1648 (Pasek (PCT prijava br.88/00831))), ili 816 do 1598 ili 741 do 1648 (Lagner (Behring Inst. Mitt. (1988) No.

82:16-25, EP 295597)). U drugim otelotvorenjima, BDD FVIII uključuje polipeptid FVIII koji sadrži fragmente domena B koji zadržavaju jedno ili više N-vezanih mesta glikozilacije, npr. ostatke 757, 784, 828, 900, 963, ili opciono 943, koji odgovaraju aminokiselinskoj sekvenci FVIII sekvence pune dužine. Primeri fragmenata B-domena uključuju 226 aminokiselina ili 163 aminokiselina B-domena, kao što je obelodanjeno u Miao, H.Z., et al., Blood 103(a): 3412-3419 (2004), Kasuda, A, et al., J. Thromb. Haemost.6: 1352-1359 (2008), i Pipe, S.W., et al., J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011) (tj. zadržano je prvih 226 aminokiselina ili 163 aminokiselina B domena). U drugim otelotvorenjima, BDD FVIII dalje obuhvata tačkastu mutaciju na ostatku 309 (od Phe do Ser) kako bi se poboljšala ekspresija proteina BDD FVIII. Vidi Miao, H.Z., et al.Blood, 103(a): 3412-3419 (2004). U drugim otelotvorenjima, BDD FVIII uključuje polipeptid FVIII koji sadrži deo domena B, ali ne sadrži jedno ili više mesta cepanja furina (npr. Arg1313 i Arg 1648). Vidi Pipe, S.W., et al., J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011). Svaka od gore navedenih delecija može biti izvršena u bilo kojoj FVIII sekvenci.

[0131] U nekim otelotvorenjima, FVIII ima parcijalni B-domen. U nekim otelotvorenjima, protein FVIII sa parcijalnim B-domenom je FVIII198. FVIII198 je parcijalni B-domen koji sadrži molekul-226N6 jednolančanog FVIIIFc. Broj 226 predstavlja N-terminal 226 aminokiseline FVIII B-domena, a N6 predstavlja šest mesta N-glikozilacije u B-domenu.

[0132] U jednom otelotvorenju, FVIII je cepan odmah posle Arginina na aminokiselini 1648 (u faktoru VIII pune dužine ili SEQ ID NO: 65), aminokiselini 754 (u Faktoru VIII sa obrisanim S743/Q1638 B-domenom ili SEQ ID NO: 67), ili odgovarajućem ostatku Arginina (u drugim varijantama), što rezultira teškim lancem i lakim lancem. U drugom otelotvorenju, FVIII se sastoji od teškog lanca i lakog lanca, koji su linkovani ili asocirani metalnom jonskiposredovanom ne-kovalentnom vezom.

[0133] U drugim otelotvorenjima, FVIII je jednolančani FVIII koji nije rascepljen odmah posle Arginina na aminokiselini 1648 (u FVIII pune dužine ili SEQ ID NO: 65), aminokiselini 754 (u FVIII sa obrisanim S743/Q1638 B-domenom ili SEQ ID NO: 67) ili odgovarajućem ostatku Arginina (u drugim varijantama). Jednolančani FVIII može da sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija. U jednom otelotvorenju, aminokiselinska supstitucija je na ostatku koji odgovara ostatku 1648, ostatku 1645, ili oba kod zrelog polipeptida faktor VIII pune dužine (SEQ ID NO: 65) ili ostatku 754, ostatku 751 ili oba kod SQ BDD FVIII (SEQ ID NO: 67). Aminokiselinska supstitucija može biti bilo koja aminokiselina različita od arginina, npr. izoleucin, leucin, lizin, metionin, fenilalanin, treonin, triptofan, valin, alanin, asparagin, asparaginska kiselina, cistein, glutaminska kiselina, glutamin, glicin, prolin, selenocistein, serin, tirozin, histidin, ornitin, pirolizin ili tavrin.

[0134] FVIII se dalje može cepati trombinom, a zatim aktivirati kao FVIIIa, služeći kao kofaktor za aktivirani faktor IX (FIXa). A aktivirani FIX zajedno sa aktiviranim FVIII formira Xaze kompleks i konvertuje faktor X u aktivirani faktor X (FXa). Za aktivaciju, FVIII se cepa trombinom posle tri ostatka arginina, na aminokiselinama 372, 740 i 1689 (što odgovara aminokiselinama 372, 740 i 795 u sekvenci FVIII sa obrisanim B-domenom), cepanje koje generiše FVIIIa koji ima lance 50kDa A1, 43kDa A2 i 73kDa A3-C1-C2. U jednom otelotvorenju, protein FVIII koristan za ovaj pronalazak je neaktivni FVIII. U drugom otelotvorenju, FVIII protein je aktivirani FVIII.

[0135] Protein koji ima polipeptid FVIII povezan ili asociran sa proteinom VWF može da sadrži sekvencu najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnu sa SEQ ID NO: 65 ili 67, pri čemu sekvenca ima aktivnost zgrušavanja FVIII, npr. aktivirajući faktora IX kao kofaktor za konverziju faktora X u aktivirani faktor X (FXa).

[0136] "Hibridni" ili "himerni" polipeptidi i proteini, kao što se ovde koristi, uključuje kombinaciju prvog polipeptidnog lanca, npr., VWF protein fuzionisan sa XTEN sekvencom koja ima manje od 288 aminokiselina i prvi Ig konstantni region ili njegov deo, sa drugim polipeptidnim lancem, npr., FVIII protein fuzionisan sa drugim Ig konstantnim regionom ili njegovim delom, čime se formira heterodimer. Prvi polipeptid i drugi polipeptid u hibridu mogu biti međusobno asocirani putem protein-protein interakcija, kao što su naelektrisanjenaelektrisanje ili hidrofobne interakcije. Prvi polipeptid može da sadrži fuzioni protein VWF-protein-XTEN-Fc, a drugi polipeptid može da sadrži FVIII-Fc fuzioni protein, što hibrid čini heterodimerom, pri čemu XTEN sadrži manje od 288 aminokiselina. Prvi polipeptid može da sadrži VWF protein-XTEN-Fc, a drugi polipeptid može da sadrži FVIII(X)–Fc fuzioni protein, što hibrid čini heterodimerom, pri čemu XTEN sadrži manje od 288 aminokiselina. Prvi polipeptid i drugi polipeptid mogu biti asocirani kovalentnom vezom, npr. disulfidnom vezom, između prvog Fc regiona i drugog Fc regiona. Prvi polipeptid i drugi polipeptid mogu dalje biti međusobno asocirani vezivanjem između fragmenta VWF i proteina FVIII.

[0137] Protein FVIII koji je koristan u ovom pronalasku može uključivati FVIII koji ima jednu ili više dodatnih XTEN sekvenci, koje ne utiču na aktivnost koagulacije FVIII. Takve XTEN sekvence mogu biti fuzionisane sa C-terminalom ili N-terminalom proteina FVIII ili insertovane između jednog ili više od dva aminokiselinska ostatka u proteinu FVIII, dok insercije ne utiču na aktivnost koagulacije FVIII ili funkciju FVIII. U jednom otelotvorenju, insercije poboljšavaju farmakokinetička svojstva proteina FVIII (npr. poluživot). U drugom otelotvorenju, insercije mogu biti višestruke insercije, npr. više od dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet ili deset insercija. Primeri mesta insercije uključuju, ali nisu ograničeni na, mesta navedena u Tabelama 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ili bilo koje njihove kombinacije.

[0138] Protein FVIII povezan sa jednom ili više sekvenci XTEN može se predstaviti kao FVIII(X2) ili FVIII(a→b)-X-FVIII(c→d), pri čemu FVIII(a→b)sadrži, sastoji u suštini od, ili se sastoji od prvog dela proteina FVIII od aminokiselinskog ostatka "a" do aminokiselinskog ostatka "b"; X2 sadrži, u suštini se sastoji od, ili se sastoji od jedne ili više sekvenci XTEN, FVIII(c→d)sadrži, sastoji se u suštini od, ili se sastoji od drugog dela proteina FVIII od aminokiselinskog ostatka "c" do aminokiselinskog ostatka "d";

a je N-terminalni aminokiselinski ostatak prvog dela proteina FVIII,

b je C-terminalni aminokiselinski ostatak prvog dela proteina FVIII, ali je i N-terminalni aminokiselinski ostatak dve aminokiseline mesta insercije u koje je insertovana XTEN sekvenca,

c je N-terminalni aminokiselinski ostatak drugog dela proteina FVIII, ali je i C-terminalni aminokiselinski ostatak dve aminokiseline mesta insercije u koje je insertovana XTEN sekvenca, i

d je C-terminalni aminokiselinski ostatak proteina FVIII, i

pri čemu prvi deo proteina FVIII i drugi deo proteina FVIII nisu međusobno identični i dovoljne su dužine zajedno tako da protein FVIII ima aktivnost koagulacije FVIII.

[0139] U jednom otelotvorenju, prvi deo proteina FVIII i drugi deo proteina FVIII su fragmenti SEQ ID NO: 65 [zrela sekvenca FVIII pune dužine] ili SEQ ID NO: 67 [FVIII sa obrisanim B-domenom], npr., N-terminalni deo, odnosno C-terminalni deo. U određenim otelotvorenjima, prvi deo proteina FVIII obuhvata domen A1 i domen A2 proteina FVIII. Drugi deo proteina FVIII obuhvata domen A3, domen C1 i opciono domen C2. U drugim otelotvorenjima, prvi deo proteina FVIII obuhvata domen A1 i domen A2, a drugi deo proteina FVIII sadrži deo domena B, domena A3, domena C1 i opciono domena C2. U ostalim otelotvorenjima, prvi deo proteina FVIII obuhvata domen A1, domen A2 i deo domena B proteina FVIII, a drugi deo proteina FVIII čini domen A3, domen C1 i opciono domen C2. U ostalim otelotvorenjima, prvi deo proteina FVIII obuhvata domen A1, domen A2 i prvi deo domena B proteina FVIII. Drugi deo proteina FVIII obuhvata drugi deo domena B, domena A3, domena C1 i opciono domena C2. U nekim otelotvorenjima, dve aminokiseline ("b" i "c") mogu biti bilo koje ili više od mesta insercije aminokiselinskih ostataka prikazanih u Tabelama 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 i 15. Na primer, "b" može biti aminokiselinski ostatak neposredno uzvodno od mesta na koje se insertuje ili povezuje jedna ili više XTEN sekvenci, a "c" može biti aminokiselinski ostatak neposredno nizvodno od mesta na koje se insertuje ili povezuje jedna ili više XTEN sekvenci. U nekim otelotvorenjima, "a" je prva zrela aminokiselinska sekvenca proteina FVIII, a "d" je poslednja aminokiselinska sekvenca proteina FVIII. Na primer, FVIII(a→b)može biti aminokiselinska sekvenca najmanje 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinama 1 do 745 SEQ ID NO: 67 [aminokiselinska sekvenca FVIII sa obrisanim B domenom] ili SEQ ID NO: 65 [FVIII pune dužine] i FVIII(c→d)mogu biti aminokiseline 746 do 1438 SEQ ID NO: 67 ili aminokiseline 1641 do 2332 SEQ ID NO: 65.

[0140] U nekim vidovima, mesto insercije u proteinu FVIII nalazi se u jednom ili više domena proteina FVIII, što je N-terminal, domen A1, domen A2, domen A3, domen B, domen C1, domen C2, C-terminal, ili dve ili više njihovih kombinacija ili između dva domena proteina FVIII, koji su domen A1 i a1 kiseli region, a1 kiseli region i domen A2, domen A2 i a2 kiseli region, a2 kiseli region i domen B, domen B i domen A3 i domen C1, domen C1 i domen C2, ili bilo koje njihove kombinacije. Na primer, mesta insercije u koja se može insertovati XTEN sekvenca izabrani su iz grupe koju čine N-terminal i A1 domen, N-terminal i A2 domen, N-terminal i A3 domen, N-terminal i B domen, N-terminal i C1 domen, N-terminal i C2 domen, N-terminal i C-terminal, domeni A1 i A2, domeni A1 i A3, domeni A1 i B, domeni A1 i C1, domeni A1 i C2, domen A1 i C-terminal, domeni A2 i A3, domeni A2 i B, domeni A2 i C1, domeni A2 i C1, domeni A2 i C2, domen A2 i C-terminal, domeni A3 i B, domeni A3 i C1, domeni A3 i C2, domen A3 i C-terminal, domeni B i C1, domeni B i C2, domen B i C-terminal, domeni C1 i C2, domen C1 i C-terminal, domen C2 i C-terminal, i dve ili više njihovih kombinacija. Primeri bez ograničenja mesta insercije navedeni su u Tabelama 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 i 15.

[0141] Protein FVIII, u kome je sekvenca XTEN insertovana neposredno nizvodno od jedne ili više aminokiselina (npr. jedno ili više mesta insercije XTEN) u proteinu FVIII ili je povezana na C-terminalu ili N-terminalu, zadržava aktivnost FVIII nakon povezivanja sa sekvencom XTEN ili njene insercije. XTEN sekvenca se može insertovati u protein FVIII jednom ili više puta, dva puta, tri puta, četiri puta, pet puta ili šest puta tako da insercija ne utiče na aktivnost FVIII (tj. protein FVIII i dalje zadržava svojstvo koagulacije).

[0142] Protein FVIII koji je koristan u ovom pronalasku može se povezati sa jednim ili više polipeptida XTEN na N-terminalu ili C-terminalu proteina FVIII pomoću opcionog linkera ili insertovati neposredno nizvodno od jedne ili više aminokiselina (npr. jedno ili više mesta insercije XTEN) u protein FVIII pomoću jednog ili više opcionih linkera. U jednom otelotvorenju, dva aminokiselinska ostatka u koje je insertovana sekvenca XTEN ili aminokiselinski ostatak sa kojima je povezana sekvenca XTEN odgovaraju dvama ili jednom aminokiselinskom ostatku SEQ ID NO: 65 [zreli FVIII pune dužine] izabranim iz grupe koja se sastoji od ostataka iz Tabele 7, Tabele 8, Tabele 9 i Tabele 10 i svih njihovih kombinacija.

[0143] U drugim otelotvorenjima, najmanje jedna XTEN sekvenca je insertovana na jedno ili više XTEN mesta insercije koja su ovde obelodanjena ili bilo koje njihove kombinacije. U jednom vidu, najmanje jedna XTEN sekvenca se insertuje u jedno ili više XTEN mesta insercije koja su obelodanjena u jednoj ili više aminokiselina koje su obelodanjene u Tabeli 7.

TABELA 7: Primeri XTEN lokacija za inserciju

[0144] U nekim otelotvorenjima, jedna ili više XTEN sekvenci su insertovane unutar oko šest aminokiselina gore ili dole od aminokiselina 32, 220, 224, 336, 339, 399, 416, 603, 1656, 1711, 1725, 1905 ili 1910, što odgovara SEQ ID NO: 65 ili bilo kojoj njihovoj kombinaciji.

TABELA 8. Primeri XTEN opsega insercije

[0145] U drugim otelotvorenjima, jedna ili više XTEN sekvenci su insertovane neposredno nizvodno od jedne ili više aminokiselina koje odgovaraju zrelom humanom FVIII pune dužine izabranom iz grupe koja se sastoji od jednog ili više mesta insercije u Tabeli 9. TABELA 9. Primeri XTEN lokacija ili opsega insercije

[0146] U drugim otelotvorenjima, jedan ili više XTEN su insertovani u domen B FVIII. U jednom primeru, XTEN je insertovan između aminokiselina 740 i 1640 što odgovara SEQ ID NO: 65, pri čemu FVIII sekvenca između aminokiselina 740 i 1640 nije opciono prisutna. U drugom primeru, XTEN je insertovan između aminokiselina 741 i 1690 što odgovara SEQ ID NO: 65, pri čemu FVIII sekvenca između aminokiselina 740 i 1690 nije opciono prisutna. U drugim primerima, XTEN je insertovan između aminokiselina 741 i 1648 koje odgovaraju SEQ ID NO: 65, pri čemu FVIII sekvenca između aminokiselina 741 i 1648 nije opciono prisutna. U drugim primerima, XTEN je insertovan između aminokiselina 743 i 1638 što odgovara SEQ ID NO: 65, pri čemu FVIII sekvenca između aminokiselina 743 i 1638 nije opciono prisutna. U drugim primerima, XTEN je insertovan između aminokiselina 745 i 1656 koje odgovaraju SEQ ID NO: 65, pri čemu FVIII sekvenca između aminokiselina 745 i 1656 nije opciono prisutna. U nekim primerima, XTEN je insertovan između aminokiselina 745 i 1657 što odgovara SEQ ID NO: 65, pri čemu FVIII sekvenca između aminokiselina 745 i 1657 nije opciono prisutna. U nekim primerima, XTEN je insertovan između aminokiselina 745 i 1667, što odgovara SEQ ID NO: 65, pri čemu FVIII sekvenca između aminokiselina 745 i 1667 nije opciono prisutna. U još drugim primerima, XTEN je insertovan između aminokiselina 745 i 1686, što odgovara SEQ ID NO: 65, pri čemu FVIII sekvenca između aminokiselina 745 i 1686 nije opciono prisutna. U nekim drugim primerima, XTEN je insertovan između aminokiselina 747 i 1642, što odgovara SEQ ID NO: 65, pri čemu FVIII sekvenca između aminokiselina 747 i 1642 nije opciono prisutna. U drugim primerima, XTEN je insertovan između aminokiselina 751 i 1667, što odgovara SEQ ID NO: 65, pri čemu FVIII sekvenca između aminokiselina 751 i 1667 nije opciono prisutna.

[0147] U nekim otelotvorenjima, jedan ili više XTEN su insertovani u jednu ili više aminokiselina neposredno nizvodno od aminokiseline na mestu insercije izabranom iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka u Tabeli 10.

TABELA 10: FVIII XTEN mesta insercije i oznake konstrukta

<∗>Označava broj aminokiseline zrelog proteina FVIII

[0148] U jednom otelotvorenju, jedno ili više mesta insercije XTEN nalaze se unutar jedne ili više površinski izloženih fleksibilnih struktura petlje proteina FVIII (npr. permisivna petlja). Na primer, najmanje jedna XTEN sekvenca može biti insertovana u svaki FVIII "A" domen koji se sastoji od najmanje dve "permisivne petlje" u koje može biti insertovan najmanje jedan XTEN polipeptid bez eliminisanja prokoagulantne aktivnosti rekombinantnog proteina ili sposobnosti rekombinantnih proteina da budu eksprimirani in vivo ili in vitro u ćeliji domaćina. Permisivne petlje su regioni koji omogućavaju inserciju najmanje jedne XTEN sekvence sa, između ostalih atributa, visokom površinskom ili rastvaračkom izloženošću i visokom konformacionom fleksibilnošću. A1 domen obuhvata region permisivne petlje-1 (A1-1) i region permisivne petlje-2 (A1-2), A2 domen obuhvata region permisivne petlje-1 (A2-1) i region permisivne petlje-2 (A2-2), A3 domen obuhvata region permisivne petlje-1 (A3-1) i region permisivne petlje-2 (A3-2).

[0149] U jednom vidu, prva permisivna petlja u FVIII domenu A1 (A1-1) se nalazi između beta lanca 1 i beta lanca 2, a druga permisivna petlja u FVIII domenu A2 (A1-2) se nalazi između beta lanca 11 i beta lanca 12. Prva permisivna petlja u FVIII domenu A2 (A2-1) nalazi se između beta lanca 22 i beta lanca 23, a druga permisivna petlja u FVIII domenu A2 (A2-2) nalazi se između beta lanca 32 i beta lanca 33. Prva permisivna petlja u FVIII domenu A3 (A3-1) nalazi se između beta lanca 38 i beta lanca 39, a druga permisivna petlja u FVIII A3 (A3-2) nalazi se između beta lanca 45 i beta lanca 46. U određenim vidovima, površinski izložena, fleksibilna struktura petlje koja obuhvata A1-1 odgovara regionu u nativnom zrelom humanom FVIII od oko aminokiseline 15 do oko aminokiseline 45 SEQ ID NO: 65, npr. od oko aminokiseline 18 do oko aminokiseline 41 SEQ ID NO: 65. U drugim aspektima, površinski izložena, fleksibilna struktura petlje koja obuhvata A1-2 odgovara regionu u nativnom zrelom humanom FVIII od oko aminokiseline 201 do oko aminokiseline 232 SEQ ID NO: 65, npr. od oko aminokiseline 218 do oko aminokiseline 229 SEQ ID NO: 65. U još drugim vidovima, površinski izložena, fleksibilna struktura petlje koja obuhvata A2-1 odgovara regionu u nativnom zrelom humanom FVIII od oko aminokiseline 395 do oko aminokiseline 421 SEQ ID NO: 65, npr. od oko aminokiseline 397 do oko aminokiseline 418 SEQ ID NO: 65. U drugim otelotvorenjima, površinski izložena, fleksibilna struktura petlje koja obuhvata A2-2 odgovara regionu u nativnom zrelom humanom FVIII od oko aminokiseline 577 do oko aminokiseline 635 SEQ ID NO: 65, npr. od oko aminokiseline 595 do oko aminokiseline 607 SEQ ID NO: 65. U određenim aspektima, površinski izložena, fleksibilna struktura petlje koja obuhvata A3-1 odgovara regionu u nativnom zrelom humanom FVIII od oko aminokiseline 1705 do oko aminokiseline 1732 SEQ ID NO: 65, npr. od oko aminokiseline 1711 do oko aminokiseline 1725 SEQ ID NO: 65. U još drugim aspektima, površinski izložena, fleksibilna struktura petlje koja obuhvata A3-2 odgovara regionu u nativnom zrelom humanom FVIII od oko aminokiseline 1884 do oko aminokiseline 1917 SEQ ID: 65, npr. od oko aminokiseline 1899 do oko aminokiseline 1911 SEQ ID NO: 65.

[0150] U drugom otelotvorenju, jedna ili više aminokiselina u koje je insertovana najmanje jedna XTEN sekvenca nalazi se u domenu a3, npr. aminokiseline 1649 do 1689, što odgovara zrelom polipeptidu FVIII pune dužine. U određenom otelotvorenju, XTEN sekvenca je insertovana između aminokiselina 1656 i 1657 SEQ ID NO: 65 (zreli FVIII pune dužine). U specifičnom otelotvorenju, protein FVIII koji sadrži XTEN sekvencu insertovanu neposredno nizvodno od aminokiseline 1656 koja odgovara SEQ ID NO: 65 dalje obuhvata deleciju od aminokiseline 745 do aminokiseline 1656 koja odgovara SEQ ID NO: 65.

[0151] U nekim otelotvorenjima, jedno ili više mesta insercije za jednu ili više XTEN insercija su neposredno nizvodno od jedne ili više aminokiselina koje odgovaraju zrelom FVIII pune dužine, izabranom iz grupe koju čine:

[0152] U jednom otelotvorenju, protein FVIII koristan za pronalazak sastoji se od dve XTEN sekvence, prve XTEN sekvence insertovane u prvo mesto insercije XTEN i druge XTEN insertovane u drugo mesto insercije XTEN. Neograničavajući primeri prvog mesta insercije XTEN i drugog mesta insercije XTEN navedeni su u Tabeli 11.

TABELA 11. Primeri mesta insercije za dva XTEN-a

[0153] Dva XTEN insertovana ili povezana sa proteinom FVIII mogu biti identična ili različita. U nekim otelotvorenjima, protein FVIII koristan za pronalazak sastoji se od dve XTEN sekvence insertovane u protein FVIII, prve XTEN sekvence insertovane neposredno nizvodno od aminokiseline 745 koja odgovara SEQ ID NO: 65, i druge XTEN sekvence insertovane neposredno nizvodno od aminokiseline 2332 koja odgovara SEQ ID NO: 65 (C-terminal). U drugim otelotvorenjima, prva XTEN sekvenca je insertovana neposredno nizvodno od aminokiseline 18, 26, 40, 1656 ili 1720 koja odgovara SEQ ID NO: 65, a druga XTEN sekvenca je insertovana neposredno nizvodno od aminokiseline 403 koja odgovara SEQ ID NO: 65. U još drugim otelotvorenjima, prva XTEN sekvenca je insertovana neposredno nizvodno od aminokiseline 18, 26 ili 40 što odgovara SEQ ID NO: 65, a druga XTEN sekvenca je insertovana neposredno nizvodno od aminokiseline 599 koja odgovara SEQ ID NO: 65. Kod drugih otelotvorenja, prva XTEN sekvenca je insertovana neposredno nizvodno od aminokiseline 1656 koja odgovara SEQ ID NO: 65, a druga XTEN sekvenca je insertovana neposredno nizvodno od aminokiseline 18, 26, 40, 399, 403, 1725, 1720, 1900, 1905, ili 2332 koja odgovara SEQ ID NO: 65. U nekim otelotvorenjima, prva XTEN sekvenca je insertovana neposredno nizvodno od aminokiseline 1900 koja odgovara SEQ ID NO: 65, a druga XTEN sekvenca insertovana neposredno nizvodno od aminokiseline 18, 26, ili 40 koje odgovaraju SEQ ID NO: 65. U nekim otelotvorenjima, prva XTEN sekvenca je insertovana neposredno nizvodno od aminokiseline 18, 26, ili 40 koje odgovaraju SEQ ID NO: 65, a druga XTEN sekvenca insertovana neposredno nizvodno od aminokiseline 399 koja odgovara SEQ ID NO: 65. U drugim otelotvorenjima, prva XTEN sekvenca je insertovana neposredno nizvodno od aminokiseline 1720 koja odgovara SEQ ID NO: 65, a druga XTEN sekvenca insertovana neposredno nizvodno od aminokiseline 18, 26, ili 40 koja odgovara SEQ ID NO: 65. U još drugim otelotvorenjima, prva XTEN sekvenca je insertovana neposredno nizvodno od aminokiseline 1720 koja odgovara SEQ ID NO: 65, a druga XTEN sekvenca je insertovana neposredno nizvodno od aminokiseline 18 koja odgovara SEQ ID NO: 65. U određenom otelotvorenju, FVIII protein obuhvata dve XTEN sekvence, prva XTEN sekvenca je insertovana neposredno nizvodno od aminokiseline 745 koja odgovara SEQ ID NO: 65, a druga XTEN sekvenca je insertovana neposredno nizvodno od aminokiseline 2332 koja odgovara SEQ ID NO: 65, pri čemu FVIII protein dalje ima deleciju od aminokiseline 745 koja odgovara SEQ ID NO: 65 do aminokiseline 1685 koja odgovara SEQ ID NO: 65, mutaciju ili supstituciju na aminokiselini 1680 koja odgovara SEQ ID NO: 65, npr., Y1680F, mutaciju ili supstituciju na aminokiselini 1648 koja odgovara SEQ ID NO: 65, npr., R1648A,ili najmanje dve mutacije ili supstitucije na aminokiselini 1648 koja odgovara SEQ ID NO: 65, npr., R1648A, i aminokiseline 1680 koja odgovara SEQ ID NO: 65, npr., Y1680F. U specifičnom otelotvorenju, FVIII protein obuhvata dve XTEN sekvence, prvu XTEN insertovanu neposredno nizvodno od aminokiseline 1656 koja odgovara SEQ ID NO: 65 i druge XTEN sekvence insertovane neposredno nizvodno od aminokiseline 2332 SEQ ID NO: 65, pri čemu FVIII protein dalje ima deleciju od aminokiseline 745 do aminokiseline 1656 koja odgovara SEQ ID NO: 65.

[0154] U određenim otelotvorenjima, protein FVIII sadrži tri XTEN sekvence, prvu XTEN sekvence insertovanu u prvo mesto insercije XTEN, drugu XTEN sekvence insertovanu u drugu XTEN sekvencu, i treću XTEN sekvencu insertovanu u treće mesto insercije XTEN. Prva, druga ili treća XTEN sekvenca mogu biti identične ili različite. Prvo, drugo i treće mesto insercije mogu biti izabrana iz grupe bilo kog od mesta insercije koja su ovde obelodanjena. U nekim otelotvorenjima, protein FVIII koji obuhvata tri XTEN sekvence može dalje da sadrži mutaciju ili supstituciju, npr., aminokiseline 1648 koja odgovara SEQ ID NO: 65, npr., R1648A. Na primer, neograničavajući primeri prvog, drugog i trećeg mesta insercije XTEN navedeni su u Tabeli 12.

TABELA 12. Primeri mesta insercije za tri XTEN-a

[0155] U nekim otelotvorenjima, protein FVIII sadrži tri XTEN sekvence, prvu XTEN sekvencu insertovanu neposredno nizvodno od aminokiseline 26 koja odgovara SEQ ID NO: 65, drugu XTEN sekvencu insertovanu nizvodno od aminokiseline 403 koja odgovara SEQ ID NO: 65, i treću XTEN sekvencu insertovanu nizvodno od aminokiseline 1656, 1720 ili 1900 koja odgovara SEQ ID NO: 65. U drugim otelotvorenjima, prva XTEN sekvenca je insertovana neposredno nizvodno od aminokiseline 26 koja odgovara SEQ ID NO: 65, druga XTEN sekvenca je insertovana nizvodno od aminokiseline 1656 koja odgovara SEQ ID NO: 65, a treća XTEN sekvenca je insertovana nizvodno od aminokiseline 1720 ili 1900 koja odgovara SEQ ID NO: 65. U još drugim otelotvorenjima, prva XTEN sekvenca je insertovana neposredno nizvodno od aminokiseline 26 koja odgovara SEQ ID NO: 65, druga XTEN sekvenca je insertovana nizvodno od aminokiseline 1720 koja odgovara SEQ ID NO.: 65, a treća XTEN sekvenca je insertovana nizvodno od aminokiseline 1900 koja odgovara SEQ ID NO: 65. U drugim otelotvorenjima, prva XTEN sekvenca je insertovana neposredno nizvodno od aminokiseline 403 ili 1656 koja odgovara SEQ ID NO: 65, druga XTEN sekvenca je insertovana nizvodno od aminokiseline 1720 koja odgovara SEQ ID NO: 65, a treća XTEN sekvenca je insertovana nizvodno od aminokiseline 1900 koja odgovara SEQ ID NO: 65. U drugim otelotvorenjima, prva XTEN sekvenca je insertovana neposredno nizvodno od aminokiseline 18, 26, 40, 399, 403, 1711, 1720, 1725, 1900, 1905, ili 1910 koja odgovara SEQ ID NO: 65, druga XTEN sekvenca je insertovana nizvodno od aminokiseline 745 koja odgovara SEQ ID NO: 65, a treća XTEN sekvenca je insertovana nizvodno od aminokiseline 2332 koja odgovara SEQ ID NO: 65.

[0156] U drugim otelotvorenjima, protein FVIII u pronalasku obuhvata četiri XTEN sekvence, prva XTEN sekvenca insertovana u prvo mesto insercije, druga XTEN sekvenca insertovana u drugo mesto insercije, treća XTEN sekvenca insertovana u treće mesto insercije i četvrta XTEN sekvenca insertovana u četvrto mesto insercije. Prva, druga, treća i četvrta XTEN sekvenca mogu biti identične, različite ili njihove kombinacije. U nekim otelotvorenjima, protein FVIII koji se sastoji od četiri XTEN sekvence može dalje da sadrži mutaciju ili supstituciju, npr., aminokiseline 1648 koja odgovara SEQ ID NO: 65, npr., R1648A. Neograničavajući primeri prvog, drugog, trećeg i četvrtog mesta insercije XTEN navedeni su u Tabeli 13.

TABELA 13. Primeri mesta insercija za četiri XTEN-a

[0157] U nekim otelotvorenjima, protein FVIII se sastoji od pet XTEN sekvenci, prve XTEN sekvence insertovane u prvo mesto insercije, druge XTEN sekvence insertovane u drugo mesto insercije, treće XTEN sekvence insertovane u treće mesto insercije XTEN, četvrte XTEN sekvence insertovane u četvrto mesto insercije XTEN i pete XTEN sekvence insertovane u peto mesto insercije XTEN. Prva, druga, treća, četvrta i peta XTEN sekvenca mogu biti identične, različite ili njihove kombinacije. Neograničavajući primeri prvog, drugog, trećeg, četvrtog i petog mesta insercije XTEN navedeni su u Tabeli 14.

TABELA 14. Primeri mesta insercija za pet XTEN-ova

[0158] U konkretnom primeru, prvi XTEN je insertovan između aminokiselina 26 i 27 koje odgovaraju SEQ ID NO: 65, a drugi XTEN je insertovan između aminokiselina 1720 i 1721 koje odgovaraju SEQ ID NO: 65 (zreli FVIII pune dužine). U drugom primeru, prvi XTEN je insertovan između aminokiselina 403 i 404 koje odgovaraju SEQ ID NO: 65, a drugi XTEN je insertovan između aminokiselina 1720 i 1721 koje odgovaraju SEQ ID NO: 65. U nekim primerima, prvi XTEN je insertovan između aminokiselina 1656 i 1657 koje odgovaraju SEQ ID NO: 65, a drugi XTEN je insertovan između aminokiselina 1720 i 1721 koje odgovaraju SEQ ID NO: 65. U drugim primerima, prvi XTEN je insertovan između aminokiselina 26 i 27 koje odgovaraju SEQ ID NO: 65, drugi XTEN je insertovan između aminokiselina 1656 i 1657 koje odgovaraju SEQ ID NO: 65, a treći XTEN je insertovan između aminokiselina 1720 i 1721 koje odgovaraju SEQ ID NO: 65. U još drugim otelotvorenjima, prvi XTEN je insertovan između aminokiselina 403 i 404 koje odgovaraju SEQ ID NO: 65, drugi XTEN je insertovan između aminokiselina 1656 i 1657 koje odgovaraju SEQ ID NO: 65, a treći XTEN je insertovan između aminokiselina 1720 i 1721 koje odgovaraju SEQ ID NO: 65. U još drugim otelotvorenjima, prvi XTEN je insertovan između aminokiselina 403 i 404 koje odgovaraju SEQ ID NO: 65, drugi XTEN je insertovan između aminokiselina 1656 i 1657 koje odgovaraju SEQ ID NO: 65, a treći XTEN je insertovan između aminokiselina 1720 i 1721 koje odgovaraju SEQ ID NO: 65. U određenim otelotvorenjima, prvi XTEN je insertovan između aminokiselina 26 i 27 koje odgovaraju SEQ ID NO: 65, drugi XTEN je insertovan između aminokiselina 1720 i 1721 koje odgovaraju SEQ ID NO: 65, a treći XTEN je insertovan između aminokiselina 1900 i 1901 koje odgovaraju SEQ ID NO: 65. U nekim otelotvorenjima, prvi XTEN je insertovan između aminokiselina 26 i 27 koje odgovaraju SEQ ID NO: 65, drugi XTEN je insertovan između aminokiselina 1656 i 1657 koje odgovaraju SEQ ID NO: 65, treći XTEN je insertovan između aminokiselina 1720 i 1721 koje odgovaraju SEQ ID NO: 65, a četvrti XTEN je insertovan između 1900 i 1901 koje odgovaraju SEQ ID NO: 65.

[0159] U određenom otelotvorenju, XTEN sekvenca je insertovana između aminokiselina 745 i 746 FVIII pune dužine ili odgovarajućeg mesta insercije faktora VIII sa obrisanim B domenom.

[0160] Ovde obelodanjeni su himerni proteini koji se sastoje od dve polipeptidne sekvence, prve polipeptidne sekvence koja se sastoji od aminokiselinske sekvence najmanje oko 80%, 90%, 95% ili 100% identične sekvenci odabranoj od FVIII-161 (SEQ ID NO: 69), FVIII-169 (SEQ ID NO: 70), FVIII-170 (SEQ ID NO: 71), FVIII-173 (SEQ ID NO: 72); FVIII-195 (SEQ ID NO: 73); FVIII-196 (SEQ ID NO: 74), FVIII199 (SEQ ID NO: 75), FVIII-201 (SEQ ID NO: 76); FVIII-203 (SEQ ID NO: 77), FVIII-204 (SEQ ID NO: 78), FVIII-205 (SEQ ID NO: 79), FVIII-266 (SEQ ID NO: 80), FVIII-267 (SEQ ID NO: 81), FVIII-268 (SEQ ID NO: 82), FVIII-269 (SEQ ID NO: 83), FVIII-271 (SEQ ID NO: 84) ili FVIII-272 (SEQ ID NO: 85) i druge polipeptidne sekvence koja se sastoji od aminokiselinske sekvence najmanje oko 80%, 90%, 95%, ili 100% identične sekvenci izabranoj od VWF031 (SEQ ID NO: 86), VWF034 (SEQ ID NO: 87), ili VWF-036.

II.D. Konstantni region Ig ili njegov deo

[0161] Himerni proteini obelodanjeni ovde takođe uključuju dva Ig konstantna regiona ili njihove delove, prvi Ig konstantni region ili njegov deo fuzionisan sa proteinom FVIII opcionim linkerom i drugi Ig konstantni region ili njegov deo fuzionisan sa proteinom VWF putem XTEN sekvence koja ima manje od 288 aminokiselina. Ig konstantni region ili njegov deo mogu poboljšati farmakokinetička ili farmakodinamička svojstva himernog proteina u kombinaciji sa XTEN sekvencom i VWF proteinom. Ig konstantni region ili njegov deo mogu produžiti poluživot molekula fuzionisanog sa Ig konstantnim regionom ili njegovim delom.

[0162] Ig konstantni region se sastoji od domena označenih kao CH (konstantni teški) domeni (CH1, CH2, itd.). U zavisnosti od izotipa, (tj. IgG, IgM, IgA, IgD, ili IgE), konstantni region se može sastojati od tri ili četiri CH domena. Neki izotipovi (npr. IgG) konstantni regioni takođe sadrže region šarke. Vidi Janeway et al.2001, Imunobiology, Garland Publishing, N.Y., N.Y.

[0163] Ig konstantni region ili njegov deo za proizvodnju himernog proteina ovog pronalaska može se dobiti iz više različitih izvora. Ig konstantni region ili njegov deo može biti izveden iz humanog Ig. Podrazumeva se, međutim, da Ig konstantni region ili njegov deo može biti izveden iz Ig druge sisarske vrste, uključujući na primer glodara (npr. miša, pacova, zeca, zamorca) ili ne-humanog primata (npr. šimpanza, makaki). Štaviše, Ig konstantni region ili njegov deo mogu biti izvedeni iz bilo koje klase Ig, uključujući IgM, IgG, IgD, IgA i IgE, i bilo kog izotipa Ig, uključujući IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. Konkretno, koristi se humani IgG1 izotip.

[0164] Različite sekvence gena konstantnog regiona Ig (npr. sekvence gena humanog konstantnog regiona) dostupne su u obliku javno dostupnih depozita. Može biti izabrana sekvenca domena konstantnog regiona sa određenom efektorskom funkcijom (ili bez određene efektorske funkcije) ili sa određenom modifikacijom kako bi se smanjila imunogenost. Objavljene su mnoge sekvence antitela i geni za kodiranje antitela, te se odgovarajuće sekvence konstantnog regiona Ig (npr. sekvence šarke, CH2 i/ili CH3 ili njihovi delovi) mogu izvesti iz ovih sekvenci koristeći tehnike priznate u struci. Genetski materijal dobijen korišćenjem bilo koje od gore navedenih metoda može se zatim izmeniti ili sintetizovati da bi se dobili polipeptidi ovog pronalaska. Dalje će se ceniti da obim ovog pronalaska obuhvata alele, varijante i mutacije sekvenci konstantnog regiona DNK.

[0165] Sekvence konstantnog regiona Ig ili njegovog dela mogu se klonirati, npr. pomoću lančane reakcije polimeraze i prajmera koji su izabrani za amplifikaciju domena od interesa. Da bi se klonirala sekvenca Ig konstantnog regiona ili njegov deo iz antitela, iRNK može biti izolovana iz hibridoma, slezine ili limfnih ćelija, reverzno transkribovanih u DNK, i gena antitela amplifikovanih pomoću PCR. Metode PCR amplifikacije su detaljno opisane u SAD Pat. Br.4.683.195; 4.683.202; 4.800.159; 4.965.188; i u npr. "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications" Innis et al. eds., Academic Press, San Diego, CA (1990); Ho et al.

1989. Gene 77:51; Horton et al.1993. Methods Enzymol.217:270). PCR može biti iniciran konsenzus prajmerom konstantnog regiona ili specifičnijim prajmerima na osnovu objavljenih sekvenci teškog i lakog lanca DNK i aminokiselina. Kao što je gore navedeno, PCR se takođe može koristiti za izolovanje DNK klonova koji kodiraju lake i teške lance antitela. U ovom slučaju, biblioteke se mogu pregledati konsenzus prajmerima ili većim homolognim sondama, kao što su sonde mišjeg konstantnog regiona. U struci su poznati brojni osnovni setovi pogodni za amplifikaciju gena antitela (npr.5' prajmeri na bazi Nterminalne sekvence prečišćenih antitela (Benhar i Pastan.1994. Protein Engineering 7:1509); brza amplifikacija cDNK krajeva (Ruberti, F. et al.1994. J. Immunol. Methods 173:33); navodeće sekvence antitela (Larrick et al.1989 Biochem. Biophys. Res. Commun.

160:1250). Kloniranje sekvenci antitela je dalje opisano u Newman et al., SAD patent br. 5.658.570, podnet 25. januara 1995. godine.

[0166] Ig konstantni region koji se koristi ovde može da obuhvati sve domene i region šarke ili njihove delove. Konstantni region Ig ili njegov deo može da obuhvata domen CH2, domen CH3 i region šarke, tj. region Fc ili partnera koji vezuje FcRn.

[0167] Kao što se ovde koristi, izraz "Fc region" je definisan kao deo polipeptida koji odgovara Fc regionu nativnog Ig, tj., kako je formiran dimernom asocijacijom odgovarajućih Fc domena dvaju njegovih teških lanaca. Nativni Fc region formira homodimer sa drugim Fc regionom. Nasuprot tome, izraz "genetički fuzionisani Fc region" ili "jednolančani Fc region" (scFc region), kako se ovde koristi, odnosi se na sintetički dimerni Fc region koji se sastoji od Fc domena genetski povezanih unutar jednog polipeptidnog lanca (tj. kodiranih u jednoj susednoj genetskoj sekvenci).

[0168] U jednom otelotvorenju, "Fc region" se odnosi na deo jednog Ig teškog lanca koji počinje u regionu šarke neposredno uzvodno od mesta cepanja papaina (tj. ostatka 216 u IgG, uzimajući da je prvi ostatak konstantnog regiona teškog lanca 114) i završava se na C terminalu antitela. Shodno tome, kompletan Fc domen obuhvata najmanje domen šarke, domen CH2 i domen CH3.

[0169] Fc region Ig konstantnog regiona, u zavisnosti od izotipa Ig, može uključivati domene CH2, CH3 i CH4, kao i region šarke. Himerni proteini koji se sastoje od Fc regiona Ig daju nekoliko poželjnih svojstava na himernom proteinu, uključujući povećanu stabilnost, povećani poluživot seruma (vidi Capon et al., 1989, Nature 337:525), kao i vezivanje za Fc receptore kao što je neonatalni Fc receptor (FcRn) (SAD Pat. Br.6,086,875, 6,485,726, 6,030,613; WO 03/077834; US2003-0235536A1).

[0170] Ig konstantni region ili njegov deo mogu biti FcRn vezujući partneri. FcRn je aktivan u tkivima epitela odraslih i eksprimiran je u lumenu creva, pulmonalnim putevima, nazalnim površinama, vaginalnim površinama, površinama debelog creva i rektuma (SAD Pat. Br. 6.485.726). FcRn vezujući partner je deo Ig koji se vezuje za FcRn.

[0171] FcRn receptor je izolovan od nekoliko sisarskih vrsta, uključujući ljude. Poznate su sekvence humanog FcRn, majmunskog FcRn, pacovskog FcRn i mišjeg FcRn (Story et al. 1994, J. Exp. Med.180:2377). FcRn receptor vezuje IgG (ali ne i druge Ig klase kao što su IgA, IgM, IgD i IgE) pri relativno niskom pH, aktivno transportuje IgG transcelularno u luminalnom do seroznom smeru, a zatim oslobađa IgG pri relativno višem pH koji se nalazi u intersticijalnim tečnostima. Eksprimira se u tkivu epitela odraslih (SAD Pat. Br.6,485,726, 6,030,613, 6,086,875; WO 03/077834; US2003-0235536A1) uključujući plućni i crevni epitel (Israel et al.1997, Immunology 92:69), bubrežni proksimalni tubularni epitel (Kobayashi et al.2002, Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282:F358) kao i nazalni epitel, vaginalne površine i površine bilijarnog stabla.

[0172] Učesnici FcRn vezivanja korisni u ovom pronalasku obuhvataju molekule koji mogu biti specifično vezani FcRn receptorom, uključujući ceo IgG, Fc fragment IgG i druge fragmente koji uključuju kompletan vezni region FcRn receptora. Region Fc dela IgG koji se vezuje za FcRn receptor je opisan na osnovu rendgenske kristalografije (Burmeister et al. 1994, Nature 372:379). Glavno kontaktno područje Fc sa FcRn je blizu spoja domena CH2 i CH3. Fc-FcRn kontakti su svi unutar jednog teškog lanca Ig. FcRn vezujući partneri uključuju ceo IgG, Fc fragment IgG i druge fragmente IgG koji uključuju kompletan vezni region FcRn. Glavna mesta kontakta uključuju aminokiselinske ostatke 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 i 314 domena CH2 i aminokiselinske ostatke 385-387, 428 i 433-436 domena CH3. Upućivanja na numeraciju aminokiselina Ig ili Ig fragmenata, ili regiona, su zasnovana na Kabat et al.1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md.

[0173] FcRn regioni ili FcRn vezujući partneri vezani za FcRn mogu se efikasno prebaciti preko epitelnih barijera pomoću FcRn, čime se obezbeđuje neinvazivno sredstvo za sistemsku primenu željenog terapeutskog molekula. Pored toga, fuzione proteine koji se sastoje od Fc regiona ili FcRn vezujućeg partnera endocitoziraju ćelije koje eksprimiraju FcRn. Ali umesto da budu markirani za degradaciju, ovi fuzioni proteini se ponovo recikliraju u cirkulaciju, čime se povećava poluživot in vivo ovih proteina. Delovi Ig konstantnih regiona mogu biti Fc region ili FcRn vezujući partner koji obično asocira, preko disulfidnih veza i drugih nespecifičnih interakcija, sa drugim Fc regionom ili drugim FcRn vezujućim partnerom za formiranje dimera i multimera višeg reda.

[0174] Dva FcRn receptora mogu da vežu jedan Fc molekul. Kristalografski podaci ukazuju da svaki FcRn molekul vezuje jedan polipeptid Fc homodimera. U jednom otelotvorenju, povezivanje FcRn vezujućeg partnera, npr., Fc fragmenta IgG, sa biološki aktivnim molekulom pruža sredstvo za isporuku biološki aktivnog molekula oralno, bukalno, sublingvalno, rektalno, vaginalno, kao aerosola koji se primenjuje nazalno ili pulmonalnim putem, ili preko okularnog puta. U drugom otelotvorenju, himerni protein se može primeniti invazivno, npr. supkutano, intravenski.

[0175] Region FcRn vezujućeg partnera je molekul ili njegov deo koji može biti specifično vezan FcRn receptorom sa posledičnim aktivnim transportom pomoću FcRn receptora Fc regiona. Specifično vezani se odnosi na dva molekula koji formiraju kompleks koji je relativno stabilan u fiziološkim uslovima. Specifično vezivanje se odlikuje visokim afinitetom i niskim do umerenim kapacitetom, što se razlikuje od nespecifičnog vezivanja koje obično ima nizak afinitet sa umerenim do visokim kapacitetom. Tipično, vezivanje se smatra specifičnim kada je konstanta afiniteta KA veća od 10<6>M<-1>, ili veća od 10<8>M<-1>. Ako je potrebno, nespecifično vezivanje može se smanjiti bez suštinskog uticaja na specifično vezivanje promenom uslova vezivanja. Odgovarajuće uslove vezivanja kao što su koncentracija molekula, jonska jačina rastvora, temperatura, vreme potrebno za vezivanje, koncentracija sredstva za blokiranje (npr. serumski albumin, mlečni kazein), itd., može optimizovati kvalifikovani stručnjak koristeći rutinske tehnike.

[0176] U određenim otelotvorenjima, himerni protein pronalaska se sastoji od jednog ili više skraćenih Fc regiona koji su ipak dovoljni da prenesu svojstva vezivanja Fc receptora (FcR) za Fc region. Na primer, deo Fc regiona koji se vezuje za FcRn (tj. FcRn deo koji vezuje) obuhvata od oko aminokiselina 282-438 IgG1, EU numerisanje (sa primarnim mestima kontakta aminokiselina 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 i 314 domena CH2 i aminokiselinske ostatke 385-387, 428 i 433-436 domena CH3. Dakle, Fc region pronalaska može obuhvatiti ili se sastojati od FcRn vezivnog dela. FcRn vezujući delovi mogu biti izvedeni iz teških lanaca bilo kog izotipa, uključujući IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. U jednom otelotvorenju, koristi se FcRn vezujući deo iz antitela humanog izotipa IgG1. U drugom otelotvorenju, koristi se deo za vezivanje FcRn iz antitela humanog izotipa IgG4.

[0177] U drugom otelotvorenju, "Fc region" uključuje aminokiselinsku sekvencu Fc domena ili izvedenu iz Fc domena. U određenim otelotvorenjima, Fc region se sastoji od najmanje jednog od: domena šarke (npr. regiona gornje, srednje i/ili donje šarke) (oko aminokiselina 216-230 antitela Fc regiona prema EU numeraciji), CH2 domena (oko aminokiselina 231-340 antitela Fc regiona prema EU numeraciji), CH3 domena (oko aminokiselina 341-438 antitela Fc regiona prema EU numeraciji), CH4 domena, ili njegove varijante, dela ili fragmenta. U drugim otelotvorenjima, Fc region se sastoji od kompletnog Fc domena (tj. domena šarke, CH2 domena i CH3 domena). U nekim otelotvorenjima, Fc region se sastoji od, ili se suštinski sastoji od domena šarke (ili njegovog dela) fuzionisanog sa domenom CH3 (ili njegovim delom), domena šarke (ili njegovog dela) fuzionisanog sa domenom CH2 (ili njegovim delom), domena CH2 (ili njegovog dela) fuzionisanog sa domenom CH3 (ili njegovim delom), domena CH2 (ili njegovog dela) fuzionisanog sa domenom šarke (ili njegovim delom) i domenom CH3 (ili njegovim delom). U drugim otelotvorenjima, Fc regionu nedostaje najmanje deo CH2 domena (npr. ceo ili deo CH2 domena). U određenom otelotvorenju, Fc region obuhvata ili se sastoji od aminokiselina koje odgovaraju EU brojevima 221 do 447.

[0178] Fc regioni označeni kao F, F1 ili F2 ovde mogu biti dobijeni iz više različitih izvora. U jednom otelotvorenju, Fc region polipeptida je izveden iz humanog Ig. Podrazumeva se, međutim, da se Ig konstantna regija ili njen deo može izvesti iz Ig druge sisarske vrste, uključujući na primer glodara (npr. miša, pacova, zeca, zamorca) ili ne-humanog primata (npr. šimpanza, makaki). Štaviše, polipeptid Fc domena ili njihovih delova može biti izveden iz bilo koje klase Ig, uključujući IgM, IgG, IgD, IgA i IgE, i bilo kog izotipa Ig, uključujući IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. U drugom otelotvorenju, koristi se humani izotip IgG1.

[0179] U određenim otelotvorenjima, varijanta Fc omogućava promenu najmanje jedne efektorske funkcije koju dodeljuje Fc region koji obuhvata navedeni Fc domen divljeg tipa (npr. poboljšanje ili smanjenje sposobnosti Fc regiona da se veže za Fc receptore (npr. FcγRI, FcγRII ili FcγRIII) ili komplementarne proteine (npr. C1q), ili da pokrene citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), fagocitozu ili citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDCC)). U drugim otelotvorenjima, varijanta Fc pruža inženjerski cisteinski ostatak.

[0180] Fc regioni pronalaska mogu koristiti stručno prepoznate Fc varijante za koje se zna da daju promenu (npr. poboljšanje ili smanjenje) u funkciji efektora i/ili FcR ili FcRn vezivanju. Konkretno, vezujući molekul pronalaska može uključivati, na primer, promenu (npr. supstituciju) na jednoj ili više pozicija aminokiselina koje su obelodanjene u Međunarodnim PCT publikacijama WO88/07089A1, WO96/14339A1, WO98/05787A1, WO98/23289A1, WO99/51642A1, WO99/58572A1, WO00/09560A2, WO00/32767A1, WO00/42072A2, WO02/44215A2, WO02/060919A2, WO03/074569A2, WO04/016750A2, WO04/029207A2, WO04/035752A2, WO04/063351A2, WO04/074455A2, WO04/099249A2, WO05/040217A2, WO04/044859, WO05/070963A1, WO05/077981A2, WO05/092925A2, WO05/123780A2, WO06/019447A1, WO06/047350A2, i WO06/085967A2; SAD Patent prijavama br. US2007/0231329, US2007/0231329, US2007/0237765, US2007/0237766, US2007/0237767, US2007/0243188, US20070248603, US20070286859, US20080057056 ; ili SAD patentima br.5,648,260; 5,739,277; 5,834,250; 5,869,046; 6,096,871; 6,121,022; 6,194,551; 6,242,195; 6,277,375; 6,528,624; 6,538,124; 6,737,056; 6,821,505; 6,998,253; 7,083,784; 7,404,956, i 7,317,091. U jednom otelotvorenju, specifična promena (npr. specifična supstitucija jedne ili više aminokiselina obelodanjenih u stanju tehnike) može se izvršiti na jednoj ili više obelodanjenih pozicija aminokiselina. U drugom otelotvorenju, može se izvršiti drugačija promena na jednoj ili više obelodanjenih pozicija aminokiselina (npr. različita supstitucija jedne ili više pozicija aminokiselina obelodanjenih u struci).

[0181] Fc region ili FcRn vezujući partner IgG može se modifikovati u skladu sa dobro priznatim procedurama kao što je mutacija usmerena ka lokaciji i slično kako bi se dobili modifikovani IgG ili Fc fragmenti ili njihovi delovi koji će biti vezani putem FcRn. Takve modifikacije uključuju modifikacije udaljene od FcRn mesta kontakta, kao i modifikacije unutar mesta kontakta koje čuvaju ili čak poboljšavaju vezivanje za FcRn. Na primer, sledeći prosti aminokiselinski ostaci u humanom IgG1 Fc (Fc y1) mogu biti supstituisani bez značajnog gubitka afiniteta vezivanja Fc za FcRn: P238A, S239A, K246A, K248A, D249A, M252A, T256A, E258A, T260A, D265A, S267A, H268A, E269A, D270A, E272A, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, E283A, H285A, N286A, T289A, K290A, R292A, E293A, E294A, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A, T307A, L309A, Q311A, D312A, N315A, K317A, E318A, K320A, K322A, S324A, K326A, A327Q, P329A, A330Q, P331A, E333A, K334A, T335A, S337A, K338A, K340A, Q342A, R344A, E345A, Q347A, R355A, E356A, M358A, T359A, K360A, N361A, Q362A, Y373A, S375A, D376A, A378Q, E380A, E382A, S383A, N384A, Q386A, E388A, N389A, N390A, Y391F, K392A, L398A, S400A, D401A, D413A, K414A, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, E430A, N434A, T437A, Q438A, K439A, S440A, S444A, i K447A, gde na primer P238A predstavlja prolin divljeg tipa supstituisan alaninom na poziciji broj 238. Kao primer, specifično otelotvorenje uključuje mutaciju N297A, uklanjajući visoko očuvano mesto N-glikozilacije. Pored alanina, druge aminokiseline mogu biti supstituisane aminokiselinama divljeg tipa na gore navedenim pozicijama. Mutacije se mogu uneti pojedinačno u Fc, što dovodi do više od stotinu Fc regiona koji se razlikuju od nativnog Fc. Pored toga, kombinacije dve, tri ili više ovih pojedinačnih mutacija mogu biti uvedene zajedno, što dovodi do stotina novih Fc regiona. Štaviše, jedan od Fc regiona konstrukta pronalaska može biti mutiran, a drugi Fc region konstrukta uopšte sasvim nemutiran, ili oba mogu biti mutirana, ali sa različitim mutacijama.

[0182] Neke od gore navedenih mutacija mogu dati novu funkcionalnost Fc regionu ili FcRn vezujućem partneru. Na primer, jedno otelotvorenje uključuje N297A, uklanjajući visoko očuvano mesto N-glikozilacije. Efekat ove mutacije je smanjenje imunogenosti, čime se povećava cirkulišući poluživot Fc regiona, i da se Fc region učini nesposobnim da se veže za FcγRI, FcyRIIA, FcyRIIB i FcyRIIIA, bez ugrožavanja afiniteta za FcRn (Routledge et al.

1995, Transplantation 60:847; Friend et al.1999, Transplantation 68:1632; Shields et al. 1995, J. Biol. Chem.276:6591). Kao dodatni primer novih funkcionalnosti koje proizilaze iz prethodno opisanih mutacija, afinitet za FcRn može se povećati iznad onog kod divljeg tipa u nekim slučajevima. Ovaj povećani afinitet može odražavati povećanu stopu "uključenja", smanjenu stopu "isključenja" ili i povećanu stopu "uključenja" i smanjenu stopu "isključenja". Primeri mutacija za koje se veruje da daju povećan afinitet za FcRn uključuju, ali ne ograničavajući se na, T256A, T307A, E380A i N434A (Shields et al.2001, J. Biol. Chem. 276:6591).

[0183] Pored toga, najmanje tri humana Fc gama receptora izgleda da prepoznaju mesto vezivanja na IgG unutar donjeg regiona šarke, generalno aminokiselina 234-237. Stoga još jedan primer nove funkcionalnosti i potencijalno smanjene imunogenosti može nastati iz mutacija ovog regiona, kao na primer zamenom aminokiselina 233-236 humanog IgG1 "ELLG" odgovarajućom sekvencom iz IgG2 "PVA" (sa jednom delecijom aminokiselina). Pokazalo se da se FcγRI, FcyRII i FcyRIII, koji posreduju u različitim efektorskim funkcijama, neće vezati za IgG1 kada su takve mutacije uvedene. Ward i Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77 and Armour et al.1999, Eur. J. Immunol.29:2613.

[0184] Ig konstantni region ili njegov deo, npr. Fc region, može biti polipeptid, uključujući sekvencu PKNSSMISNTP (SEQ ID NO: 89 ili SEQ ID NO:3; SAD pat. br.5,739,277) i opciono dodatno uključujući sekvencu izabranu iz HQSLGTQ (SEQ ID NO: 90), HQNLSDGK (SEQ ID NO: 91), HQNISDGK (SEQ ID NO: 92), ili VISSHLGQ (SEQ ID NO: 93) (ili SEQ ID NOs: 11, 1, 2, odnosno 31, SAD Pat. Br.5,739,277).

[0185] Konstantni region imunoglobulina ili njegov deo može da se sastoji od aminokiselinske sekvence u regionu šarke ili njenog dela koji formira jednu ili više disulfidnih veza sa drugim konstantnim regionom imunoglobulina ili njegovim delom.

Disulfidna veza preko konstantnog regiona imunoglobulina ili njegovog dela smešta prvi polipeptid koji obuhvata FVIII i drugi polipeptid koji obuhvata fragment VWF zajedno tako da endogeni VWF ne zamenjuje fragment VWF i ne vezuje se za FVIII. Stoga disulfidna veza između prvog konstantnog regiona imunoglobulina ili njegovog dela i drugog konstantnog regiona imunoglobulina ili njegovog dela sprečava interakciju između endogenog VWF i proteina FVIII. Ova inhibicija interakcije između VWF i FVIII proteina omogućava da poluživot himernog proteina pređe dvostruko ograničenje. Regija šarke ili njen deo mogu se dalje povezati sa jednim ili više domena CH1, CH2, CH3, njihovim fragmentom i bilo kojim kombinacijama. Konkretno, konstantni region imunoglobulina ili njegov deo može biti region šarke i CH2.

[0186] Konstantni region Ig ili njegov deo može biti hemi-glikoziliran. Na primer, himerni protein koji se sastoji od dva Fc regiona ili FcRn vezujućih partnera može da sadrži prvi, glikozilirani, Fc region (npr. glikozilirani CH2 region) ili FcRn vezujući partner i drugi, aglikozilirani, Fc region (npr. aglikozilirani CH2 region) ili FcRn vezujući partner. U jednom otelotvorenju, linker može biti smešten između glikoziliranih i aglikoziliranih Fc regiona. U drugom otelotvorenju, Fc region ili FcRn vezujući partner je potpuno glikoziliran, tj. svi Fc regioni su glikozilirani. U drugim otelotvorenjima, Fc region može biti aglikoziliran, tj. nijedan od Fc delova nije glikoziliran.

[0187] Himerni protein, kako je obelodanjen, može se sastojati od supstitucije aminokiselina u Ig konstantnom regionu ili njegovom delu (npr. Fc varijante), što menja antigenski nezavisne efektorske funkcije Ig konstantnog regiona, posebno cirkulišućeg poluživota proteina.

[0188] Takvi proteini pokazuju ili povećano ili smanjeno vezivanje za FcRn u poređenju sa proteinima kojima nedostaju ove supstitucije i stoga imaju povećan ili smanjen poluživot u serumu. Očekuje se da će Fc varijante sa poboljšanim afinitetom za FcRn imati duži poluživot u serumu, a takvi molekuli imaju korisne primene u metodama tretiranja sisara gde se želi dugi poluživot primenjenog polipeptida, npr. za tretiranje hronične bolesti ili poremećaja (vidi, npr. SAD patente 7.348.004, 7.404.956 i 7.862.820). Nasuprot tome, očekuje se da Fc varijante sa smanjenim afinitetom vezivanja FcRn imaju kraći poluživot, a takvi molekuli su takođe korisni, na primer, za primenu na sisaru gde skraćeno vreme cirkulacije može biti povoljno, npr. za dijagnostičko snimanje in vivo ili u situacijama kada početni polipeptid ima toksične neželjene efekte kada je prisutan u cirkulaciji tokom dužih perioda. Fc varijante sa smanjenim afinitetom vezivanja FcRn takođe imaju manju verovatnoću da pređu placentu i stoga su korisne i u tretiranju bolesti ili poremećaja kod trudnica. Pored toga, druge primene u kojima se može želeti smanjen afinitet vezivanja FcRn uključuju one primene u kojima se želi lokalizacija mozga, bubrega i/ili jetre. U jednom primernom otelotvorenju, himerni protein pronalaska pokazuje smanjen transport preko epitela bubrežnih glomerula iz vaskulature. U drugom otelotvorenju, himerni protein pronalaska pokazuje smanjen transport preko krvne moždane barijere (BBB) iz mozga u vaskularni prostor. U jednom otelotvorenju, protein sa izmenjenim FcRn vezivanjem se sastoji od najmanje jednog Fc regiona ili FcRn vezujućeg partnera (npr. jedan ili dva Fc regiona ili FcRn vezujuća partnera) koji imaju jednu ili više aminokiselinskih supstitucija unutar "FcRn vezivne petlje" u Ig konstantnom regionu. FcRn vezivna petlja se sastoji od ostataka aminokiselina 280-299 (prema EU numeraciji) divljeg tipa, pune dužine, Fc regiona. Ig konstantni region ili njegov deo u himernom proteinu, kao što je obelodanjeno, sa izmenjenim FcRn afinitetom vezivanja, može da obuhvata najmanje jedan Fc region ili FcRn vezujućeg partnera koji ima jednu ili više aminokiselinskih supstitucija unutar FcRn "kontaktne zone" od 15 Ǻ. Kao što se ovde koristi, izraz FcRn "kontaktna zona" od 15 Ǻ uključuje ostatke na sledećim pozicijama Fc dela pune dužine, divljeg tipa: 243-261, 275-280, 282-293, 302-319, 336- 348, 367, 369, 372-389, 391, 393, 408, 424, 425-440 (EU numeracija). Ig konstantni region ili njegov deo koji je obelodanjen sa izmenjenim afinitetom vezivanja FcRn može da obuhvata najmanje jedan region Fc ili FcRn vezujućeg partnera koji ima jednu ili više supstitucija aminokiselina na poziciji aminokiselina koja odgovara bilo kojoj od sledećih pozicija po EU numeraciji: 256, 277-281, 283-288, 303-309, 313, 338, 342, 376, 381, 384, 385, 387, 434 (npr. N434A ili N434K) i 438. Primerne aminokiselinske supstitucije koje su izmenile FcRn aktivnost vezivanja su obelodanjene u Međunarodnoj PCT publikaciji br. WO05/047327.

[0189] Fc region ili FcRn vezujući partner koji se koristi u pronalasku takođe može da se sastoji od stručno prepoznate aminokiselinske supstitucije koja menja glikozilaciju himernog proteina. Na primer, Fc region ili FcRn vezujući partner himernog proteina povezanog sa VWF fragmentom ili FVIII proteinom može se sastojati od Fc regiona koji ima mutaciju koja dovodi do smanjene glikozilacije (npr. N- ili O-vezana glikozilacija) ili se može sastojati od izmenjene glikoforme Fc dela divljeg tipa (npr. glikan sa niskim nivoom fukoze ili bez fukoze).

[0190] Neprerađeni himerni protein može se sastojati od genetski fuzionisanog Fc regiona (tj. ScFc regiona) koji ima dva ili više njegovih sastavnih Ig konstantnih regiona ili njihov deo nezavisno izabran iz Ig konstantnog regiona ili njegovog dela opisanog u ovom dokumentu. U jednom otelotvorenju, Fc regioni dimernog Fc regiona su isti. U drugom otelotvorenju, najmanje dva Fc regiona su različita. Na primer, Fc regioni ili FcRn vezujući partneri proteina pronalaska sadrže isti broj aminokiselinskih ostataka ili se mogu razlikovati po dužini za jedan ili više aminokiselinskih ostataka (npr. za oko 5 aminokiselinskih ostataka (npr. 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselinskih ostataka), oko 10 ostataka, oko 15 ostataka, oko 20 ostataka, oko 30 ostataka, oko 40 ostataka ili oko 50 ostataka). U još drugim otelotvorenjima, Fc regioni ili FcRn vezujući partneri proteina pronalaska mogu se razlikovati u sekvenci na jednoj ili više pozicija aminokiselina. Na primer, najmanje dva od Fc regiona ili FcRn vezujuća partnera mogu se razlikovati na oko 5 pozicija aminokiselina (npr.1, 2, 3, 4, ili 5 pozicija aminokiselina), oko 10 pozicija, oko 15 pozicija, oko 20 pozicija, oko 30 pozicija, oko 40 pozicija ili oko 50 pozicija).

II.E. Linkeri

[0191] Himerni protein ovog pronalaska dalje obuhvata jedan ili više linkera. Jedna vrsta linkera je cepivi linker, koji se može cepati raznim proteazama kada se daje ispitaniku in vivo, npr. na mestu koagulacije. Cepivi linker može omogućiti cepanje dela, npr., VWF proteina, od XTEN sekvence, dakle od himernog proteina na mestu koagulacione kaskade, čime se omogućava aktiviranom FVIII (FVIIIa) da ima svoju aktivnost FVIIIa. Drugi tip linkera je procesabilni linker, koji sadrži mesto unutarćelijskog cepanja i tako se može cepati enzimom unutarćelijske obrade u ćeliji domaćinu, omogućavajući pogodnu ekspresiju polipeptida i formiranje himernog proteina.

[0192] Jedan ili više linkera može biti prisutan između bilo koja dva proteina u himernom proteinu. Himerni protein prema pronalasku obuhvata prvi polipeptid koji obuhvata (i) protein FVIII i (ii) njegov prvi Fc region i drugi polipeptid koji obuhvata (iii) fragment VWF, (iv) cepivi linker, (v) sekvencu XTEN i (vi) drugi Fc region. U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptid dalje obuhvata linker, npr., cepivi linker između proteina FVIII i prvog Fc regiona.

[0193] Himerni protein može da se sastoji od jednog lanca koji sadrži (i) protein FVIII, (ii) prvi konstantni region Ig ili njegov deo, (iii) linker (npr. procesabilni linker), (iv) protein VWF, (v) XTEN sekvenca i (vi) drugi konstantni region Ig ili njegov deo. Himerni protein može se sastojati od jednog lanca koji obuhvata (i) protein FVIII, (ii) prvi konstantni region Ig ili njegov deo, (iii) prvi linker (npr. procesabilni linker), (iv) protein VWF, (v) drugi linker (npr. cepivi linker), (vi) XTEN sekvencu, i (vii) drugi konstantni region Ig ili njegov deo. Procesabilni linker se može obraditi nakon što je himerni protein eksprimiran u ćeliji domaćina; tako himerni protein proizveden u ćeliji domaćina može biti u konačnom obliku koji se sastoji od dva ili tri polipeptidna lanca.

[0194] Linker može da sadrži bilo koji organski molekul. U jednom otelotvorenju, linker se sastoji od polimera, npr. polietilen glikola (PEG) ili hidroksietil skroba (HES). U drugom otelotvorenju, linker se sastoji od aminokiselinske sekvence. Linker može da sadrži najmanje oko 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400 ,500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 ili 2000 aminokiselina. Linker može da sadrži 1-5 aminokiselina, 1-10 aminokiselina, 1-20 aminokiselina, 10-50 aminokiselina, 50-100 aminokiselina, 100-200 aminokiselina, 200-300 aminokiselina, 300-400 aminokiselina, 400-500 aminokiselina, 500-600 aminokiselina, 600-700 aminokiselina, 700-800 aminokiselina, 800-900 aminokiselina ili 900-1000 aminokiselina. U jednom otelotvorenju, linker se sastoji od XTEN sekvence. Dodatni primeri XTEN mogu se koristiti prema ovom pronalasku i obelodanjeni su u SAD Patentnoj prijavi br.2010/0239554 A1, 2010/0323956 A1, 2011/0046060 A1, 2011/0046061 A1, 2011/0077199 A1, ili 2011/0172146 A1, ili Međunarodnoj patentnoj prijavi br. WO 2010091122 A1, WO 2010144502 A2, WO 2010144508 A1, WO 2011028228 A1, WO 2011028229 A1, ili WO 2011028344 A2. U drugom otelotvorenju, linker je PAS sekvenca.

[0195] U jednom otelotvorenju, linker je polimer, npr. polietilen glikol (PEG) ili hidroksietil skrob (HES). U drugom otelotvorenju, linker se sastoji od aminokiselinske sekvence. Linker može da sadrži najmanje oko 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400 ,500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 ili 2000 aminokiselina. Linker može da sadrži 1-5 aminokiselina, 1-10 aminokiselina, 1-20 aminokiselina, 10-50 aminokiselina, 50-100 aminokiselina, 100-200 aminokiselina, 200-300 aminokiselina, 300-400 aminokiselina, 400-500 aminokiselina, 500-600 aminokiselina, 600-700 aminokiselina, 700-800 aminokiselina, 800-900 aminokiselina ili 900-1000 aminokiselina.

[0196] Primeri linkera su dobro poznati u struci. U jednom otelotvorenju, linker se sastoji od sekvence Gn. Linker može da sadrži sekvencu (GA)n. Linker može da sadrži sekvencu (GGS)n. U drugim otelotvorenjima, linker sadrži (GGGS)n(SEQ ID NO: 101). U drugim otelotvorenjima, linker se sastoji od sekvence (GGS)n(GGGGS)n(SEQ ID NO: 95). U ovim slučajevima, n može biti ceo broj od 1-100. U drugim slučajevima, n može biti ceo broj od 1-20, tj.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20. Primeri linkera uključuju, ali nisu ograničeni na, GGG, SGGSGGS (SEQ ID NO: 96), GGSGGSGGSGGGGGGG (SEQ ID NO: 97), GGSGGGGGS (SEQ ID NO: 98), GGSGGGSGGGGGGGGGS (SEQ ID NO: 99), ili GGGGSGGGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 100). Linker ne eliminiše ili umanjuje aktivnost proteina VWF ili aktivnost zgrušavanja faktora VIII. Opciono, linker pojačava aktivnost proteina VWF ili aktivnost zgrušavanja proteina faktor VIII, npr. tako što dodatno umanjuje efekte sternih smetnji i čini deo proteina VWF ili faktora VIII pristupačnijim svom ciljnom mestu vezivanja.

[0197] U jednom otelotvorenju, linker koristan za himerni protein je dug 15-25 aminokiselina. U drugom otelotvorenju, linker koristan za himerni protein je dug 15-20 aminokiselina. Kod nekih otelotvorenja, linker za himerni protein je dug 10-25 aminokiselina. U drugim otelotvorenjima, linker za himerni protein je dug 15 aminokiselina. U drugim otelotvorenjima, linker za himerni protein je (GGGGS)n(SEQ ID NO: 94) gde G predstavlja glicin, S predstavlja serin i n je ceo broj od 1-20.

II. F. Mesta cepanja

[0198] Cepivi linker može da uključi deo koji može da se rascepi bilo hemijski (npr. hidroliza estarske veze), enzimski (tj. inkorporacija sekvence proteaza cepanja), ili fotolitički (npr. hromofor kao što je 3-amino-3-(2-nitrofenil) propionska kiselina (ANP)) kako bi se oslobodio jedan molekul od drugog.

[0199] U jednom otelotvorenju, cepivi linker se sastoji od jednog ili više mesta cepanja na N-terminalu ili C-terminalu ili oba. U drugom otelotvorenju, cepivi linker se u suštini sastoji ili se sastoji od jednog ili više cepivih mesta. U drugim otelotvorenjima, cepivi linker obuhvata heterologne aminokiselinske sekvence linkera opisane ovde ili polimere i jedno ili više cepivih mesta.

[0200] U određenim otelotvorenjima, cepiva veza obuhvata jedno ili više mesta cepanja koja se mogu cepati u ćeliji domaćina (tj., mesta unutarćelijske obrade). Neograničavajući primeri mesta cepanja uključuju RRRR (SEQ ID NO: 102), RKRRKR (SEQ ID NO: 103) i RRRS (SEQ ID NO: 104).

[0201] U nekim otelotvorenjima, cepiva veza obuhvata region a1 iz FVIII, region a2 iz FVIII, region a3 iz FVIII, mesto cepanja trombina koje obuhvata X-V-P-R (SEQ ID NO: 105) i motiv interakcije PARI egzomesta, gde je X alifatska aminokiselina, ili bilo koje njihove kombinacije. U jednom otelotvorenju, cepivi linker obuhvata a2 region koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu najmanje oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95%, ili 100% identičnu sa Glu720 do Arg740 koja odgovara FVIII pune dužine, pri čemu je a2 region sposoban da se cepa trombinom. U određenom otelotvorenju, cepivi linker obuhvata a2 region koji obuhvata ISDKNTGDYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 106). U drugim otelotvorenjima, cepivi linker obuhvata region a1 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence najmanje oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95%, ili 100% identične sa Met337 do Arg372 što odgovara FVIII pune dužine, pri čemu je region a1 sposoban da se cepa trombinom. U konkretnom otelotvorenju, region a1 obuhvata ISMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSV (SEQ ID NO: 107). U nekim otelotvorenjima, cepivi linker pronalaska obuhvata a3 region koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu najmanje oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95%, ili 100% identičnu sa Glu720 do Arg740 koja odgovara FVIII pune dužine, pri čemu je a3 region sposoban da se cepa trombinom. U konkretnom otelotvorenju, cepivi linker za pronalazak obuhvata a3 region koji obuhvata ISEITRTLQSDQEEEIDYDDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQ (SEQ ID NO: 108).

[0202] U drugim otelotvorenjima, cepivi linker se sastoji od mesta cepanja trombina koje se sastoji od X-V-P-R (SEQ ID NO: 105) i motiva interakcije PARI egzomesta i gde motiv interakcije PARI egzomesta obuhvata S-F-L-L-R-N (SEQ ID NO: 109). Motiv interakcije PARI egzomesta dalje može da se sastoji od aminokiselinske sekvence izabrane od P, P-N, P-N-D, P-N-D-K (SEQ ID NO: 110), P-N-D-K-Y (SEQ ID NO: 111), P-N-D-K-Y-E (SEQ ID NO: 112), P-N-D-K-Y-E-P (SEQ ID NO: 113), P-N-D-K-Y-E-P-F (SEQ ID NO: 114), P-N-D-K-Y-E-P-F-W (SEQ ID NO: 115), P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E (SEQ ID NO: 116), P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D (SEQ ID NO: 117), P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D-E (SEQ ID NO: 118), P-N-D-K-YE-P-F-W-E-D-E-E (SEQ ID NO: 119), P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D-E-E-S (SEQ ID NO: 120), ili bilo koje njihove kombinacije. U nekim otelotvorenjima, alifatska aminokiselina se bira iz Glicina, Alanina, Valina, Leucina ili Izoleucina.

[0203] U drugim otelotvorenjima, cepivi linker obuhvata jedno ili više mesta cepanja koja se cepaju proteazom nakon što se ispitaniku primeni himerni protein koji sadrži cepivi linker. U jednom otelotvorenju, mesto cepanja se cepa proteazom izabranom iz grupe koja se sastoji od faktora XIa, faktora XIIa, kalikreina, faktora VIIa, faktora IXa, faktora Xa, faktora IIa (trombina), elastaze-2, MMP-12, MMP-13, MMP-17 i MMP-20. U drugom otelotvorenju, mesto cepanja je izabrano iz grupe koja se sastoji od mesta cepanja FXIa (npr. KLTR↓AET (SEQ ID NO: 121)), mesta cepanja FXIa (npr. DFTR↓VVG (SEQ ID NO: 122)), mesta cepanja FXIIa (npr. TMTR↓IVGG (SEQ ID NO: 123)), mesta cepanja Kalikreina (npr. SPFR ↓STGG (SEQ ID NO: 124)), mesta cepanja FVIIa (npr. LQVR↓ IVGG (SEQ ID NO: 125)), mesta cepanja FIXa (npr. PLGR↓ IVG (SEQ ID NO: 126)), mesta cepanja FXa (npr. IEGR↓ TVGG (SEQ ID NO: 127)), mesta cepanja FIIa (trombin) (npr. LTPR↓ SLVV (SEQ ID NO: 128)), mesta cepanja Elastaze-2 (npr. LGPV↓ SGVP (SEQ ID NO: 129)), mesta cepanja Granzyme-B (npr. VAGD↓ SLEE (SEQ ID NO: 130))), mesta cepanja MMP-12 (npr. GPAG ↓LGGA (SEQ ID NO: 131)), mesta cepanja MMP-13 (npr. GPAG↓ LRGA (SEQ ID NO: 132))), mesta cepanja MMP-17 (npr., APLG↓LRLR (SEQ ID NO: 133)), mesta cepanja MMP-20 (npr. PALP↓ LVAQ (SEQ ID NO: 134)), mesta cepanja TEV (npr. ENLYFQ↓ G (SEQ ID NO: 135)), mesta cepanja Enterokinaze (npr. DDDK↓ IVGG (SEQ NO: 136)), mesta cepanja Proteaze 3C (PRESCISSION<™>) (npr., LEVLFQ↓GP (SEQ ID NO: 137)), i mesta cepanja Sortaze A (npr., LPKT↓GSES) (SEQ ID NO: 138). U određenim otelotvorenjima, FXIa mesta cepanja uključuju, ali nisu ograničena na, npr. TQSFNDFTR (SEQ ID NO: 1) i SVSQTSKLTR (SEQ ID NO: 3). Neograničavajuća egzemplarna mesta cepanja trombinom uključuju, npr. DFLAEGGGVR (SEQ ID NO: 4), TTKIKPR (SEQ ID NO: 5), LVPRG (SEQ ID NO: 6), DKNTGDYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 88) ili IEPRSFS (SEQ ID NO: 194), i sekvencu koja se sastoji od, u suštini sastoji od ALRPR (SEQ ID NO: 7) (npr. ALRPRVVGGA (SEQ ID NO: 145)).

[0204] U konkretnom otelotvorenju, mesto cepanja je TLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEEK (SEQ ID NO: 146). U drugom otelotvorenju, mesto cepanja obuhvata DKNTGDYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 88) ili njegov fragment. U jednom konkretnom otelotvorenju, mesto cepanja obuhvata IEPRSFS (SEQ ID NO: 194). U drugom otelotvorenju, mesto cepanja obuhvata EPRSFS (SEQ ID NO: 195), pri čemu mesto cepanja nije region a2 FVIII pune dužine. U još jednom otelotvorenju, mesto cepanja obuhvata IEPR (SEQ ID NO: 200). U drugom otelotvorenju, mesto cepanja obuhvata IEPR (SEQ ID NO: 200), pri čemu mesto cepanja nije region a2 FVIII pune dužine ili ne obuhvata region a2 FVIII pune dužine. U drugim otelotvorenjima, mesto cepanja obuhvata DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 88), KNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 139), NTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 140), TGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 141), GDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 142), DYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 143), YYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 144), YEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 176), EDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 177), DSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 178), SYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 179), YEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 180), EDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 181), DISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 182), ISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 183), SAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 184), AYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 185), YLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 186), LLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 187), LSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 188), SKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 189), KNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 190), NNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 191), NAIEPRSFS (SEQ ID NO: 192), AIEPRSFS (SEQ ID NO: 193), ili IEPRSFS (SEQ ID NO: 194). U drugim otelotvorenjima, mesto cepanja obuhvata DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 88), KNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 139), NTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 140), TGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 141), GDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 142), DYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 143), YYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 144), YEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 176), EDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 177), DSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 178), SYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 179), YEDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 180), EDISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 181), DISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 182), ISAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 183), SAYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 184), AYLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 185), YLLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 186), LLSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 187), LSKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 188), SKNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 189), KNNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 190), NNAIEPRSFS (SEQ ID NO: 191), NAIEPRSFS (SEQ ID NO: 192), AIEPRSFS (SEQ ID NO: 193), ili IEPRSFS (SEQ ID NO: 194), pri čemu mesto cepanja nije a2 region FVIII pune dužine. U određenim otelotvorenjima, cepivi linker je cepiv u testu trombinskog cepanja kao što je ovde navedeno ili kao što je poznato u struci.

III. Polinukleotidi, vektori i ćelije domaćina

[0205] Takođe, u pronalasku se nalazi polinukleotid koji kodira himerni protein pronalaska. U jednom otelotvorenju, prvi polipeptidni lanac i drugi polipeptidni lanac mogu biti kodirani jednim polinukleotidnim lancem. U drugom otelotvorenju, prvi polipeptidni lanac i drugi polipeptidni lanac su kodirani sa dva različita polinukleotida, tj. prvom nukleotidnom sekvencom i drugom nukleotidnom sekvencom. U drugom otelotvorenju, prva nukleotidna sekvenca i druga nukleotidna sekvenca su na dva različita polinukleotida (npr. različiti vektori).

[0206] Obelodanjeno ovde je polinukleotid koji kodira jedan polipeptidni lanac (npr.

FVIII(X2)-F1-L3-F2-L2-X1-L1-V), pri čemu FVIII(X2) obuhvata protein FVIII u koji je insertovana sekvenca XTEN na jednom ili više mesta insercije, F1 obuhvata prvi konstantni region Ig ili njegov deo, npr. prvi region Fc, L1 obuhvata prvi linker, V obuhvata protein VWF, X1 obuhvata sekvencu XTEN koja ima manje od 288 aminokiselina u dužini, L2 obuhvata drugi linker, L3 obuhvata treći linker, a F2 obuhvata drugi konstantni region Ig ili njegov deo, npr. drugi region Fc. Ovde su takođe obelodanjena dva polinukleotida, prva polinukleotidna sekvenca koja kodira prvi polipeptid koji se sastoji od proteina FVIII fuzionisanog sa prvim konstantnim regionom Ig ili njegovim delom i druge polinukleotidne sekvence koja kodira drugi polipeptid koji se sastoji od proteina VWF, XTEN sekvence koja ima manje od 288 aminokiselina u dužini, i drugog konstantnog regiona Ig ili njegovog dela. Himerni protein koji se sastoji od dva polipeptidna lanca ili tri polipeptidna lanca može biti kodiran jednim polinukleotidnim lancem, a zatim obrađen u dva ili tri (ili više) polipeptidna lanca. Takođe, himerni protein koji se sastoji od ovih polipeptidnih lanaca može biti kodiran sa dva ili tri polinukleotidna lanca.

[0207] U nekim otelotvorenjima, skup polinukleotida dalje obuhvata dodatni nukleotidni lanac (npr. drugi nukleotidni lanac kada je himerni polipeptid kodiran jednim polinukleotidnim lancem ili trećim nukleotidnim lancem kada je himerni protein kodiran sa dva polinukleotidna lanca) koji kodira protein konvertazu. Protein konvertaza se može izabrati iz grupe koja se sastoji od proproteina konvertaze subtilizin/keksin tip 5 (PCSK5 ili PC5), proprotein konvertaze subtilizin/keksin tip 7 (PCSK7 ili PC5), kvasca Kex 2, proprotein konvertaze subtilizin/keksin tip 3 (PACE ili PCSK3) i dve ili više njihovih kombinacija. U nekim otelotvorenjima, protein konvertaza je PACE, PC5, ili PC7. U određenom otelotvorenju, protein konvertaza je PC5 ili PC7. Vidi Međunarodnu prijavu br. PCT/US2011/043568.

[0208] Kao što se ovde koristi, vektor ekspresije se odnosi na bilo koji konstrukt nukleinske kiseline koji sadrži neophodne elemente za transkripciju i translaciju insertovane sekvence kodiranja, ili u slučaju RNK viralnog vektora, neophodnih elemenata za replikaciju i translaciju, kada se unose u odgovarajuću ćeliju domaćina. Vektori ekspresije mogu uključivati plazmide, fagemide, viruse i njihove derivate.

[0209] Vektori ekspresije obelodanjivanja će uključivati polinukleotide koji kodiraju ovde opisani himerni protein. Jedna ili više sekvenci kodiranja za prvi polipeptid koji obuhvata protein FVIII i prvi konstantni region Ig, drugi polipeptid koji obuhvata protein VWF, sekvencu XTEN koja ima manje od 288 aminokiselina i drugi konstantni region Ig ili njegov deo, ili oba mogu biti operativno povezana sa sekvencom kontrole ekspresije. Kao što se ovde koristi, dve sekvence nukleinskih kiselina su operativno povezane kada su kovalentno povezane na način koji omogućava svakoj komponenti sekvence nukleinskih kiselina da zadrži svoju funkcionalnost. Za sekvencu kodiranja i sekvencu kontrole ekspresije gena se kaže da su operabilno povezane kada su kovalentno povezane na takav način da stavljaju ekspresiju ili transkripciju i/ili translaciju sekvence kodiranja pod uticaj ili kontrolu sekvence kontrole ekspresije gena. Za dve DNK sekvence se kaže da su operativno povezane ako indukcija promotora u 5'sekvenci ekspresije gena rezultira transkripcijom sekvence kodiranja i ako priroda veze između dve DNK sekvence ne (1) rezultira uvođenjem mutacije pomeranja okvira čitanja, (2) ometa sposobnost regiona promotora da usmerava transkripciju sekvence kodiranja, ili (3) ometa sposobnost odgovarajućeg RNK transkripta da bude translatiran u protein. Dakle, sekvenca ekspresije gena bi operativno bila povezana sa sekvencom nukleinske kiseline kodiranja ako bi sekvenca ekspresije gena bila u stanju da izvrši transkripciju te sekvence nukleinske kiseline koja kodira tako da se dobijeni transkript prevede u željeni protein ili polipeptid.

[0210] Kontrolna sekvenca ekspresije gena koja se koristi ovde je bilo koja regulatorna nukleotidna sekvenca, kao što je sekvenca promotora ili kombinacija promotora i pojačavača, koja olakšava efikasnu transkripciju i translaciju kodirajuće nukleinske kiseline sa kojom je operabilno povezana. Sekvenca kontrole ekspresije gena može, na primer, biti promotor sisara ili virusa, kao što je konstitutivni ili inducibilni promotor. Konstitutivni sisarski promotori uključuju, ali nisu ograničeni na, promotore za sledeće gene: hipoksantin fosforibozil transferaza (HPRT), adenozin deaminaza, piruvat kinaza, beta-aktin promotor i drugi konstitutivni promotori. Primerni virusni promotori koji konstitutivno funkcionišu u eukariotskim ćelijama uključuju, na primer, promotore iz citomegalovirusa (CMV), virusa majmuna (npr. SV40), virusa papiloma, adenovirusa, virusa humane imunodeficijencije (HIV), virusa Rous sarkoma, citomegalovirusa, dugog terminalnog ponavljanja (LTR) virusa Moloney leukemije i drugih retrovirusa, i promotora timidin kinaze virusa herpes simpleks. Drugi konstitutivni promotori poznati su stručnjacima iz ove oblasti. Promotori korisni kao sekvence ekspresije gena pronalaska takođe uključuju inducibilne promotore. Inducibilni promotori su eksprimirani u prisustvu indukcionog agensa. Na primer, promotor metalotioneina je indukovan da promoviše transkripciju i translaciju u prisustvu određenih jona metala. Drugi inducibilni promotori poznati su stručnjacima iz ove oblasti.

[0211] Generalno, sekvenca kontrole ekspresije gena uključuje, po potrebi, 5' netranskribujuće i 5' ne-translatirajuće sekvence uključene u inicijaciju transkripcije, odnosno translacije, kao što su TATA kutija, sekvenca zatvaranja, CAAT sekvenca i slično. Posebno će takve 5' ne-transkribujuće sekvence uključivati promotorski region koji uključuje promotor sekvencu za transkripcionu kontrolu operativno spojene kodirajuće nukleinske kiseline. Sekvence ekspresije gena opciono uključuju sekvence pojačavača ili sekvence uzvodnog aktivatora po želji.

[0212] Virusni vektori uključuju, ali nisu ograničeni na, sekvence nukleinskih kiselina iz sledećih virusa: retrovirus, kao što su virus mišje leukemije, Harvey virus mišjeg sarkoma, virus mišjeg tumora dojke i Rous sarkom virus; adenovirus, adeno-asocirani virus; virusi tipa SV40; poliomavirusi; Epstein-Barr virusi; papiloma virusi; herpes virus; virus vakcine; polio virus; i RNK virus kao što je retrovirus. Mogu se koristiti i drugi dobro poznati vektori u struci. Određeni virusni vektori su zasnivani na ne-citopatskim eukariotskim virusima kod kojih su ne-esencijalni geni zamenjeni genima od interesa. Ne-citopatski virusi uključuju retroviruse, čiji životni ciklus uključuje reverznu transkripciju genomske virusne RNK u DNK sa naknadnom proviralnom integracijom u ćelijsku DNK domaćina. Retrovirusi su odobreni za ispitivanja humane genske terapije. Najkorisniji su oni retrovirusi kojima nedostaje replikacija (tj. sposobni su da usmeravaju sintezu željenih proteina, ali nesposobni da proizvedu infektivnu česticu). Takvi genetski izmenjeni vektori retrovirusne ekspresije imaju opštu korisnost za visoku efikasnost transdukcije gena in vivo. Standardni protokoli za proizvodnju replikaciono deficijentnih retrovirusa (uključujući korake ugradnje egzogenog genetičkog materijala u plazmid, transfekciju ćelijske linije pakovanja sa plazmidom, proizvodnju rekombinantnih retrovirusa ćelijskom linijom pakovanja, prikupljanje virusnih čestica iz hranljive podloge tkiva i infekciju ciljnih ćelija virusnim česticama) dati su u Kriegler, M., Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, W.H. Freeman Co., New York (1990) amd Murry, E. J., Methods in Molecular Biology, Vol.7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J. (1991).

[0213] U jednom otelotvorenju, virus je adeno-asocirani virus, dvolančani DNK virus.

Adeno-asocirani virus može biti projektovan da bude replikaciono deficijentni i sposoban da inficira širok spektar tipova i vrsta ćelija. On dalje ima prednosti kao što su toplotna stabilnost i stabilnost lipidnog rastvarača; visoke frekvencije transdukcije u ćelijama različitih loza, uključujući hematopoetske ćelije; i nedostatak inhibiranja superinfekcije, što omogućava višestruke serije transdukcija. Navodno, adeno-asocirani virus može da se integriše u humanu ćelijsku DNK na specifičan način, čime se minimizira mogućnost insercione mutageneze i varijabilnosti ekspresije insertovanog gena karakteristične za retrovirusnu infekciju. Pored toga, infekcije adeno-asociranim virusom divljeg tipa praćene su u kulturi tkiva duže od 100 pasaža u odsustvu selektivnog pritiska, što implicira da je genomska integracija adeno-asociranog virusa relativno stabilan događaj. Adeno-asocirani virus takođe može da funkcioniše na ekstrahromozomski način.

[0214] Ostali vektori uključuju plazmidne vektore. Plazmidni vektori su opširno opisani u struci i dobro su poznati stručnjacima. Vidi, npr., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. U poslednjih nekoliko godina, otkriveno je da su plazmidni vektori posebno povoljni za isporuku gena ćelijama in vivo zbog njihove nemogućnosti da se repliciraju unutar i integrišu u genom domaćina. Ovi plazmidi, međutim, imaju promotor kompatibilan sa ćelijom domaćina, mogu eksprimirati peptid iz gena koji je operabilno kodiran unutar plazmida. Neki često korišćeni plazmidi dostupni od komercijalnih dobavljača uključuju pBR322, pUC18, pUC19, različite pcDNA plazmide, pRC/CMV, različite pCMV plazmide, pSV40 i pBlueScript. Dodatni primeri specifičnih plazmida uključuju pcDNA3.1, kataloški broj V79020; pcDNA3.1/hygro, kataloški broj V87020; pcDNA4/myc-His, kataloški broj V86320; i pBudCE4.1, kataloški broj V53220, svi iz Invitrogen (Carlsbad, CA.). Drugi plazmidi su dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti. Pored toga, plazmidi mogu biti dizajnirani po meri koristeći standardne tehnike molekularne biologije za uklanjanje i/ili dodavanje specifičnih fragmenata DNK.

[0215] U jednom sistemu ekspresije insekata koji se može koristiti za proizvodnju proteina pronalaska, virus nuklearne polihidroze Autographa californica (AcNPV) se koristi kao vektor za ekspresiju stranih gena. Virus se razvija u ćelijama Spodoptera frugiperda.

Sekvenca kodiranja može biti klonirana u neesencijalne regione (na primer, poliedar gen) virusa i stavljena pod kontrolu ACNPV promotora (na primer, poliedar promotor). Uspešna insercija sekvence kodiranja će rezultirati inaktivacijom poliedar gena i proizvodnjom neokludovanog rekombinantnog virusa (tj. virusa kojem nedostaje proteinska prevlaka kodiran za poliedar gen). Ovi rekombinantni virusi se zatim koriste za inficiranje ćelija Spodoptera frugiperda u kojima je eksprimiran insertovani gen. (vidi, npr. Smith et al. (1983) J Virol 46:584; SAD Pat. Br.4.215.051). Dalji primeri ovog sistema ekspresije mogu se naći u Ausubel et al., eds. (1989) Current Protocols in Molecular Biology,Vol. 2, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience.

[0216] Drugi sistem koji se može koristiti za ekspresiju proteina pronalaska je sistem ekspresije gena glutaminske sintetaze, koji se takođe naziva "GS ekspresijski sistem" (Lonza Biologics PLC, Berkshire UK). Ovaj sistem ekspresije je detaljno opisan u SAD Pat. br. 5.981.216.

[0217] U ćelijama domaćina sisara mogu se koristiti brojni sistemi ekspresije na bazi virusa. U slučajevima kada se adenovirus koristi kao vektor ekspresije, sekvenca kodiranja može biti ligirana za kompleks za kontrolu transkripcije/translacije adenovirusa, npr., kasni promotor i tripartitna navodeća sekvenca. Ovaj himerni gen zatim može biti insertovan u adenovirusni genom in vitro ili in vivo rekombinacijom. Insercija u ne-esencijalni region virusnog genoma (npr. region E1 ili E3) rezultiraće rekombinantnim virusom koji je vijabilan i sposoban da eksprimira peptid kod inficiranih domaćina. Vidi , npr. Logan & Shenk (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:3655). Alternativno, može se koristiti promotor vakcine 7,5 K. Vidi, npr., Mackett et al. (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79:7415; Mackett et al. (1984) J Virol 49:857; Panicali et al. (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79:4927.

[0218] Da bi se povećala efikasnost proizvodnje, polinukleotidi mogu biti dizajnirani da kodiraju više jedinica proteina pronalaska odvojene mestima enzimskog cepanja. Nastali polipeptid se može cepati (npr. tretmanom sa odgovarajućim enzimom) kako bi se povratile polipeptidne jedinice. To može povećati prinos polipeptida koje pokreće jedan promotor. Kada se koristi u odgovarajućim sistemima virusne ekspresije, translacija svakog polipeptida kodiranog od strane iRNK je interno usmerena u transkript; npr., od strane internog mesta ulaska ribosoma, IRES. Dakle, policistronski konstrukt usmerava transkripciju jedne, velike policistronske iRNK koja, zauzvrat, usmerava translaciju višestrukih, pojedinačnih polipeptida. Ovaj pristup eliminiše proizvodnju i enzimsku obradu poliproteina i može značajno povećati prinos polipeptida koje pokreće jedan promotor.

[0219] Vektori koji se koriste u transformaciji obično će sadržati selektabilni marker koji se koristi za identifikaciju transformanata. U bakterijskim sistemima to može uključivati gen rezistencije na antibiotike kao što su ampicilin ili kanamicin. Selektabilni markeri za upotrebu u kultivisanim sisarskim ćelijama uključuju gene koji pružaju rezistenciju na lekove, kao što su neomicin, higromicin i metotreksat. Selektabilni marker može biti amplifikabilni selektabilni marker. Jedan selektabilni amplifikabilni marker je gen dihidrofolat reduktaze (DHFR). Simonsen C C et al. (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80:2495-9. Pregled selektabilnih markera dat je u: Thilly (1986) Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, Mass., a izbor selektabilnih markera je u granicama uobičajenog poznavanja u struci.

[0220] Selektabilni markeri mogu se uvesti u ćeliju na zasebnom plazmidu u isto vreme kada i gen od interesa, ili se mogu uvesti na istom plazmidu. Ako je na istom plazmid, selektabilni marker i gen od interesa mogu biti pod kontrolom različitih promotora ili istog promotora, a potonji aranžman proizvodi dicistronsku poruku. Konstrukti ovog tipa su poznati u struci (na primer, SAD Pat. br.4,713,339).

[0221] Vektori ekspresije mogu da kodiraju oznake koje dozvoljavaju lako prečišćavanje rekombinantno proizvedenog proteina. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, vektor pUR278 (Ruther et al. (1983) EMBO J 2:1791), u kome sekvence kodiranja za protein koji se eksprimira mogu biti ligirane u vektor u okviru sa regionom kodiranja lac z tako da se proizvodi označeni fuzioni protein; pGEX vektori se mogu koristiti za ekspresiju proteina pronalaska sa oznakom glutation S-transferaze (GST). Ovi proteini su obično rastvorljivi i mogu se lako prečišćavati iz ćelija adsorpcijom na perle glutation-agaroze, praćeno eluiranjem u prisustvu slobodnog glutationa. Vektori uključuju mesta cepanja (trombin ili proteaza faktora Xa ili PRESCISSION PROTEASE<™>(Pharmacia, Peapack, N.J.)) za lako uklanjanje oznake nakon prečišćavanja.

[0222] Vektor ekspresije ili vektori su zatim transfektovani ili ko-transfektovani u odgovarajuću ciljnu ćeliju, koja će eksprimirati polipeptide. Tehnike transfekcije poznate u struci uključuju, ali nisu ograničene na, taloženje kalcijum fosfata (Wigler et al. (1978) Cell 14:725), elektroporaciju (Neumann et al. (1982) EMBO J 1:841), i reagense na bazi liposoma. Različiti vektorski sistemi za ekspresiju domaćina mogu se koristiti za ekspresiju proteina opisanih u ovom dokumentu, uključujući i prokariotske i eukariotske ćelije. Oni uključuju, ali nisu ograničeni na, mikroorganizme kao što su bakterije (npr. E. coli) transformisane sa rekombinantnom DNK bakteriofaga ili vektorima ekspresije plazmidne DNK koji sadrže odgovarajuću sekvencu kodiranja; kvasac ili filamentozne gljive transformisane sa rekombinantnim vektorima ekspresije kvasca ili gljivica koji sadrže odgovarajuću sekvencu kodiranja; ćelijske sisteme insekata inficiranih sa vektorima ekspresije rekombinantnog virusa (npr. Baculovirus) koji sadrže odgovarajuću sekvencu kodiranja; ćelijske sisteme biljaka inficirane sa vektorima ekspresije rekombinantnog virusa (npr. karfiol mozaik virus ili mozaik virus duvana) ili transformisane sa vektorima ekspresije rekombinantnog plazmida (npr. Ti plazmid) koji sadrže odgovarajuću sekvencu kodiranja; ili ćelijske sisteme životinja, uključujući ćelije sisara (npr. HEK 293, CHO, Cos, HeLa, HKB11 i BHK ćelije).

[0223] U jednom otelotvorenju, ćelija domaćina je eukariotska ćelija. Kao što se ovde koristi, eukariotska ćelija se odnosi na svaku životinjsku ili biljnu ćeliju koja ima definitivno jezgro. Eukariotske ćelije životinja uključuju ćelije kičmenjaka, npr. sisara, i ćelije beskičmenjaka, npr. insekata. Eukariotske ćelije biljaka mogu posebno uključivati, bez ograničenja, ćelije kvasca. Eukariotska ćelija se razlikuje od prokariotske ćelije, npr. bakterije.

[0224] U određenim otelotvorenjima, eukariotska ćelija je ćelija sisara. Ćelija sisara je svaka ćelija dobijena od sisara. Ćelije sisara posebno uključuju, ali nisu ograničene na, ćelijske linije sisara. U jednom otelotvorenju, ćelija sisara je humana ćelija. U drugom otelotvorenju, ćelija sisara je HEK 293 ćelija, koja je ćelijska linija humanih embrionalnih ćelija bubrega. HEK 293 ćelije su dostupne kao CRL-1533 iz Zbirke kulture američkog tipa (American Type Culture Collection, Manassas, VA), i kao 293-H ćelije, Kataloški broj 11631-017 ili 293-F ćelije, Kataloški broj 11625-019 iz Invitrogena (Carlsbad, Calif.). U nekim otelotvorenjima, ćelija sisara je PER.C6<®>ćelija, koja je humana ćelijska linija izvedena iz mrežnjače. Ćelije PER.C6<®>dostupne su iz Crucell (Leiden, The Netherlands). U drugim otelotvorenjima, ćelija sisara je ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO). CHO ćelije su dostupne iz American Type Culture Collection, Manassas, VA. (npr., CHO-K1; CCL-61). U još drugim otelotvorenjima, ćelija sisara je ćelija bubrega mladunca hrčka (BHK). BHK ćelije su dostupne iz American Type Culture Collection, Manassas, VA. (npr., CRL-1632). U nekim otelotvorenjima, ćelija sisara je ćelija HKB11, koja je hibridna ćelijska linija ćelije HEK293 i humane B ćelijske linije. Mei et al., Mol. Biotechnol. 34(2): 165-78 (2006).

[0225] Plazmid koji uključuje FVIII(X2) -Fc fuzionu sekvencu kodiranja, sekvencu kodiranja VWF protein-L1-X1-L2-Fc, ili oboje i selektabilni marker, npr. rezistentnost na zeocin, može se transfektovati u HEK 293 ćelije, za proizvodnju himernog proteina.

[0226] Plazmid koji uključuje FVIII-Fc fuzionu sekvencu kodiranja, VWF protein-L1-X-L2-Fc sekvencu kodiranja, ili oba i selektabilni marker, npr. otpornost na zeocin, može se transfektovati u HEK 293 ćelije, za proizvodnju himernog proteina.

[0227] Prvi plazmid koji uključuje FVIII(X2) -Fc fuzionu sekvencu kodiranja i prvi selektabilni marker, npr. gen rezistencije na zeocin, i drugi plazmid koji uključuje VWF protein-L1-X1-L2-Fc sekvencu kodiranja i drugi selektabilni marker, npr. gen rezistencije na neomicin, i treći plazmid koji uključuje sekvencu kodiranja za protein konvertazu i treći selektabilni marker, npr. gen rezistencije na higromicin, mogu biti ko-transfektovani u HEK 293 ćelije, za proizvodnju himernog proteina. Prvi i drugi plazmid se mogu uvoditi u jednakim količinama (tj.1:1 molarni odnos), ili se mogu uvoditi u nejednakim količinama.

[0228] Prvi plazmid koji uključuje FVIII-Fc fuzionu sekvencu kodiranja i prvi selektabilni marker, npr. gen rezistentan na zeocin, i drugi plazmid koji uključuje sekvencu kodiranja VWF protein-L1-X-L2-Fc i drugi selektivni marker, npr. gen rezistentan na neomicin, i treći plazmid koji uključuje sekvencu kodiranja za protein konvertaze i treći selektabilni marker, npr. gen rezistentan na higromicin, mogu biti ko-transfektovani u HEK 293 ćelije, za proizvodnju himernog proteina. Prvi i drugi plazmid se mogu uvoditi u jednakim količinama (tj. molarni odnos 1:1), ili se mogu uvoditi u nejednakim količinama.

[0229] Prvi plazmid koji uključuje FVIII(X2) -Fc fuzionu sekvencu kodiranja i prvi selektabilni marker, npr. gen rezistentan na zeocin, i drugi plazmid koji uključuje VWF protein-L1-X1-L2-Fc sekvencu kodiranja i drugi selektabilni marker, npr. gen rezistentan na neomicin, i treći plazmid koji uključuje sekvencu kodiranja za protein konvertaze i treći selektabilni marker, npr. gen rezistentan na higromicin, mogu biti ko-transfektovani u HEK 293 ćelije, za proizvodnju himernog proteina. Prvi i drugi plazmid se mogu uvoditi u jednakim količinama (tj. molarni odnos 1:1), ili se mogu uvoditi u nejednakim količinama.

[0230] Prvi plazmid, uključujući himerni protein koji kodira FVIII (sa ili bez XTEN) -F1-L3-F2-L2-X-L1-V sekvencu kodiranja i prvi selektabilni marker, npr. gen rezistentan na zeocin, i drugi plazmid, uključujući sekvencu kodiranja za protein konvertaze i drugi selektabilni marker, npr. gen rezistentan na higromicin, mogu biti ko-transfektovani u HEK 293 ćelije, za proizvodnju himernog proteina. Promotori za FVIII(X)-F1 sekvencu kodiranja i V-L2-X-L1-F2 sekvencu kodiranja mogu biti različiti ili mogu biti isti.

[0231] U nekim otelotvorenjima, transfektovane ćelije su stabilno transfektovane. Ove ćelije mogu biti izabrane i održavane kao stabilna ćelijska linija, koristeći konvencionalne tehnike poznate stručnjacima iz ove oblasti.

[0232] Ćelije domaćina koje sadrže DNK konstrukte proteina se uzgajaju u odgovarajućoj hranljivoj podlozi. Kao što se ovde koristi, izraz "odgovarajuća hranljiva podloga" označava medijum koji sadrži hranljive materije potrebne za rast ćelija. Hranljive materije potrebne za rast ćelija mogu uključivati izvor ugljenika, izvor azota, esencijalne aminokiseline, vitamine, minerale i faktore rasta. Opciono, mediji mogu da sadrže jedan ili više faktora selekcije. Opciono, medijum može da sadrži goveđi ili fetalni teleći serum (FCS). U jednom otelotvorenju, mediji u suštini ne sadrže IgG. Hranljiva podloga će generalno izabrati za ćelije koje sadrže DNK konstrukt tako što će, na primer, izabrati lek ili nedostatak u esencijalnom nutrijentu koji je dopunjen selektabilnim markerom na DNK konstruktu ili kotransfektovan sa DNK konstruktom. Kultivisane ćelije sisara se generalno uzgajaju na komercijalno dostupnim podlogama koje sadrže serum ili su bez seruma (npr., MEM, DMEM, DMEM/F12). U jednom otelotvorenju, podloga je CD293 (Invitrogen, Carlsbad, CA.). U drugom otelotvorenju, podloga je CD17 (Invitrogen, Carlsbad, CA.). Izbor medijuma odgovarajućeg za određenu ćelijsku liniju koja se koristi je u okviru nivoa stručnjaka iz ove oblasti.

[0233] U cilju ko-ekspresije dva polipeptidna lanca himernog proteina, ćelije domaćina se kultivišu pod uslovima koji omogućavaju ekspresiju oba lanca. Kao što se ovde koristi, kultivisanje se odnosi na održavanje živih ćelija in vitro najmanje određeno vreme.

Održavanje može, ali i ne mora, uključivati povećanje populacije živih ćelija. Na primer, ćelije koje se održavaju u kulturi mogu biti statične u populaciji, ali i dalje vijabilne i sposobne da proizvedu željeni proizvod, npr. rekombinantni protein ili rekombinantni fuzioni protein. Pogodni uslovi za kultivaciju eukariotskih ćelija su dobro poznati u struci i uključuju odgovarajući izbor hranljivih podloga, medijskih suplemenata, temperature, pH, zasićenja kiseonikom i slično. U komercijalne svrhe, kultivisanje može uključivati upotrebu bilo koje od različitih vrsta sistema za povećanje, uključujući tikvice za tresenje, kivete, bioreaktore sa šupljim vlaknima, bioreaktore sa mešalicom, bioreaktore sa uzgonskim strujanjem vazduha, vibracione bioreaktore i druge.

[0234] Uslovi ćelijske kulture su takođe izabrani da omoguće asocijaciju VWF fragmenta sa proteinom FVIII. Uslovi koji omogućavaju ekspresiju VWF fragmenta i/ili proteina FVIII mogu uključivati prisustvo izvora vitamina K. Na primer, u jednom otelotvorenju, stabilno transfektovane HEK 293 ćelije su kultivisane u CD293 medijumu (Invitrogen, Carlsbad, CA) ili OptiCHO medijumu (Invitrogen, Carlsbad, CA) dopunjenom sa 4 mM glutaminom.

[0235] U jednom vidu, sadašnji pronalazak je usmeren na metod ekspresije, izrade ili proizvodnje himernog proteina pronalaska koji se sastoji od: a) transfekcije ćelije domaćina koja obuhvata polinukleotid koji kodira himerni protein i b) kultivacije ćelije domaćina u hranljivoj podlozi pod uslovom pogodnim za ekspresiju himernog proteina, pri čemu se himerni protein eksprimira.

[0236] Proteinski proizvod koji sadrži protein FVIII povezan sa prvim Ig konstantnim regionom ili njegovim delom i/ili VWF protein fuzionisan sa drugim Ig konstantnim regionom ili njegovim delom XTEN sekvencom može biti izlučen u medije. Medijum je separisan od ćelija, koncentrisan, filtriran, a zatim prelazio preko dve ili tri kolone afiniteta, npr, kolone proteina A i jedne ili dve kolone za anjonsku izmenu.

[0237] U određenim vidovima, ovaj pronalazak se odnosi na himerni protein proizveden metodama opisanim u ovom dokumentu.

[0238] Proizvodnja in vitro omogućava povećanje da bi se dobile velike količine željenih izmenjenih polipeptida pronalaska. Tehnike za kultivisanje ćelija sisara u uslovima kulture tkiva poznate su u struci i uključuju kulturu homogene suspenzije, npr. u reaktoru vazdušnog transporta ili u reaktoru kontinuiranog mešanja, ili imobilizovanu ili zarobljenu ćelijsku kulturu, npr. u šupljim vlaknima, mikrokapsulama, na agaroznim mikroperlicama ili keramičkim patronama. Po potrebi i/ili želji, rastvori polipeptida mogu se prečistiti uobičajenim metodama hromatografije, na primer gel filtracijom, jonoizmenjivačkom hromatografijom, hromatografijom hidrofobne interakcije (HIC, hromatografijom preko DEAE-celuloze ili afinitetnom hromatografijom.

IV. Farmaceutski sastav

[0239] Sastavi koji sadrže himerni protein ovog pronalaska mogu da sadrže odgovarajući farmaceutski prihvatljiv nosilac. Na primer, oni mogu sadržati ekscipijense i/ili pomoćne materijale koji olakšavaju obradu aktivnih jedinjenja u preparatima koji su dizajnirani za isporuku na mesto delovanja.

[0240] Farmaceutski sastav se može formulisati za parenteralnu primenu (tj. intravensku, supkutanu ili intramuskularnu) bolus injekcijom. Formulacije za ubrizgavanje se mogu predstaviti u obliku jediničnog doziranja, npr. u ampulama ili u višedoznim kontejnerima sa dodatim konzervansom. Sastavi mogu biti u obliku suspenzija, rastvora ili emulzija u uljnim ili vodenim nosiocima i sadržati formulatorska sredstva kao što su suspenzioni, stabilizacioni i/ili disperzioni agensi. Alternativno, aktivni sastojak može biti u obliku praha za konstituisanje sa odgovarajućim nosiocem, npr. vodom bez pirogena.

[0241] Pogodne formulacije za parenteralnu primenu takođe uključuju vodene rastvore aktivnih jedinjenja u obliku rastvorljivom u vodi, na primer, soli rastvorljive u vodi. Pored toga, mogu se primeniti suspenzije aktivnih jedinjenja kao odgovarajuće uljne suspenzije za ubrizgavanje. Odgovarajući lipofilni rastvarači ili nosioci uključuju masna ulja, na primer, susamovo ulje ili sintetičke estre masnih kiselina, na primer, etil oleat ili trigliceride. Vodene suspenzije za ubrizgavanje mogu da sadrže supstance koje povećavaju viskozitet suspenzije, uključujući, na primer, natrijum karboksimetil celulozu, sorbitol i dekstran. Opciono, suspenzija takođe može da sadrži stabilizatore. Liposomi se takođe mogu koristiti za inkapsuliranje molekula pronalaska za isporuku u ćelije ili intersticijske prostore. Primerno farmaceutski prihvatljivi nosači su fiziološki kompatibilni rastvarači, disperzioni mediji, prevlake, antibakterijska i antifungalna sredstva, izotonična i sredstva za odlaganje apsorpcije, voda, fiziološki rastvor, puferski rastvor fosfata, dekstroza, glicerol, etanol i slično. U nekim otelotvorenjima, sastav se sastoji od izotoničnih agenasa, na primer, šećera, polialkohola kao što su manitol, sorbitol ili natrijum hlorid. U drugim otelotvorenjima, sastavi obuhvataju farmaceutski prihvatljive supstance kao što su sredstva za kvašenje ili manje količine pomoćnih supstanci kao što su sredstva za kvašenje ili emulgovanje, konzervansi ili puferi, koji poboljšavaju rok trajanja ili efikasnost aktivnih sastojaka.

[0242] Sastavi pronalaska mogu biti u različitim oblicima, uključujući, na primer, tečnost (npr. rastvori za ubrizgavanje i infuzije), disperzije, suspenzije, polučvrste i čvrste oblike doziranja. Poželjna forma zavisi od načina primene i terapijske primene.

[0243] Sastav se može formulisati kao rastvor, mikro emulzija, disperzija, liposom ili druga uređena struktura pogodna za visoku koncentraciju leka. Sterilni rastvori za ubrizgavanje mogu se pripremiti ugradnjom aktivnog sastojka u potrebnu količinu u odgovarajućem rastvaraču sa jednim ili kombinacijom gore nabrojanih sastojaka, po potrebi, nakon čega sledi filterska sterilizacija. Generalno, disperzije se pripremaju ugradnjom aktivnog sastojka u sterilni nosilac koji sadrži osnovni disperzioni medijum i potrebne druge sastojke od gore nabrojanih. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih rastvora za ubrizgavanje, poželjni načini pripreme su vakuumsko sušenje i sušenje zamrzavanjem koje daje prah aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz prethodno sterilno filtriranog rastvora. Pravilna fluidnost rastvora se može održavati, na primer, upotrebom prevlaka, kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzija, i upotrebom površinski aktivnih materija. produžena apsorpcija sastava za ubrizgavanje može se postići uključivanjem u sastav sredstva koje odlaže apsorpciju, na primer, monostearatnih soli i želatina.

[0244] Aktivni sastojak se može formulisati formulacijom ili uređajem sa kontrolisanim oslobađanjem. Primeri takvih formulacija i uređaja uključuju implantate, transdermalne flastere i mikrokapsulirane sisteme isporuke. Mogu se koristiti biorazgradivi, biokompatibilni polimeri, na primer, etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri i polimlečna kiselina. Metode za pripremu takvih formulacija i uređaja poznate su u struci. Vidi, npr., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R.

Robinson, ed., Marsel Dekker, Inc., New York, 1978.

[0245] Formulacije depoa za ubrizgavanje mogu se napraviti formiranjem mikrokapsuliranih matrica leka u biorazgradivim polimerima kao što je polilaktid-poliglikolid. U zavisnosti od odnosa leka i polimera, i prirode konkretnog korišćenog polimera, brzina oslobađanja leka može se kontrolisati. Drugi egzemplarni biorazgradivi polimeri su poliortoestri i polianhidridi. Depo formulacije koje se ubrizgavaju mogu se pripremiti i zarobljavanjem leka u liposome ili mikroemulzije.

[0246] Dopunska aktivna jedinjenja se mogu ugraditi u sastave. U jednom otelotvorenju, himerni protein pronalaska je formulisan sa drugim faktorom zgrušavanja, ili varijantom, fragmentom, analogom ili njihovim derivatom. Na primer, faktor zgrušavanja uključuje, ali nije ograničen na, faktor V, faktor VII, faktor VIII, faktor IX, faktor X, faktor XI, faktor XII, faktor XIII, protrombin, fibrinogen, faktor von Willebrand ili rekombinantni rastvorljivi tkivni faktor (rsTF) ili aktivirani oblici bilo kog od prethodnih. Faktor zgrušavanja hemostatskog agensa takođe može uključivati anti-fibrinolitičke lekove, npr., epsilon-aminokaproinsku kiselinu, traneksaminsku kiselinu.

[0247] Režimi doziranja se mogu prilagoditi kako bi se obezbedio optimalan željeni odgovor. Na primer, može se primeniti jedan bolus, nekoliko podeljenih doza se može primeniti tokom vremena, ili doza može biti proporcionalno smanjena ili povećana, kao što je naznačeno u urgentnosti terapijske situacije. Povoljno je formulisati parenteralne sastave u obliku dozne jedinice radi lakše primene i ujednačenosti doze. Vidi, npr., Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub). Co., Easton, Pa. - 1980.

[0248] Pored aktivnog jedinjenja, tečni dozni oblik može sadržati inertne sastojke kao što su voda, etil alkohol, etil karbonat, etil acetat, benzil alkohol, benzil benzoat, propilenglikol, 1,3-butilen glikol, dimetilformamid, ulja, glicerol, tetrahidrofurfuril alkohol, polietilen glikole i estre masnih kiselina sorbitana.

[0249] Neograničavajući primeri odgovarajućih farmaceutskih nosilaca je takođe opisao E. W. Martin u Remington's Pharmaceutical Sciences. Neki primeri ekscipijenasa uključuju skrob, glukozu, laktozu, saharozu, želatin, slad, pirinač, brašno, kredu, silikagel, natrijum stearat, glicerol monostearat, talk, natrijum hlorid, sušeno obrano mleko, glicerol, propilen, glikol, vodu, etanol i slično. Sastav takođe može da sadrži pufer reagense za pH i sredstva za kvašenje ili emulgovanje.

[0250] Za oralnu primenu, farmaceutski sastav može biti u obliku tableta ili kapsula pripremljenih konvencionalnim sredstvima. Sastav se može pripremiti i kao tečnost, na primer kao sirup ili suspenzija. Tečnost može uključivati suspenzione agense (npr. sorbitol sirup, derivate celuloze ili hidrogenizovane jestive masti), emulgatore (lecitin ili akacija), nevodene nosioce (npr. bademovo ulje, uljni estri, etil alkohol ili frakcionisana biljna ulja) i konzervanse (npr. metil ili propil-p-hidroksibenzoati ili sorbinska kiselina). Preparati takođe mogu uključivati sredstva za aromatizaciju, bojenje i zaslađivanje. Alternativno, sastav se može predstaviti kao suv proizvod za konstituisanje sa vodom ili drugim odgovarajućim nosiocem.

[0251] Za bukalnu primenu, sastav može biti u obliku tableta ili pastila u skladu sa konvencionalnim protokolima.

[0252] Za primenu inhaliranjem, jedinjenja koja se koriste u skladu sa ovim pronalaskom povoljno se isporučuju u obliku nebulizovanog aerosola sa ili bez ekscipijenasa ili u obliku aerosolnog spreja iz pakovanja pod pritiskom ili nebulizatora, uz opcioni propelant, npr. dihlorodifluorometan, trihlorfluorometan, dihlorotetrafluorometan, ugljen-dioksid ili drugi odgovarajući gas. U slučaju aerosola pod pritiskom, jedinica za doziranje se može odrediti obezbeđivanjem ventila za isporuku izmerene količine. Kapsule i ulošci, npr. želatin za upotrebu u inhalatoru ili insuflatoru mogu se formulisati tako da sadrže mešavinu jedinjenja u prahu i odgovarajuću praškastu bazu, kao što su laktoza ili skrob.

[0253] Farmaceutski sastav se takođe može formulisati za rektalnu primenu kao čepić ili retencioni klistir, npr., koji sadrži konvencionalne baze supozitorija kao što je kakao puter ili drugi gliceridi.

[0254] Farmaceutski sastav pronalaska obuhvata himerni protein pronalaska i farmaceutski prihvatljivog nosioca. Protein FVIII u himernom proteinu ima produžen poluživot u poređenju sa proteinom FVIII divljeg tipa ili odgovarajućim proteinom FVIII bez fragmenta VWF. U jednom otelotvorenju, poluživot himernog proteina je produžen najmanje oko 1,5 puta, najmanje oko 2 puta, najmanje oko 2,5 puta, najmanje oko 3 puta, najmanje oko 4 puta, najmanje oko 5 puta, najmanje oko 6 puta, najmanje oko 7 puta, najmanje oko 8 puta, najmanje oko 9 puta, najmanje oko 10 puta, najmanje oko 11 puta ili najmanje oko 12 puta duže od FVIII divljeg tipa. U drugom otelotvorenju, poluživot Faktora VIII iznosi najmanje oko 17 časova, najmanje oko 18 časova, najmanje oko 19 časova, najmanje oko 20 časova, najmanje oko 21 čas, najmanje oko 22 časa, najmanje oko 23 časa, najmanje oko 24 časa, najmanje oko 25 časova, najmanje oko 26 časova, najmanje oko 27 časova, najmanje oko 28 časova, najmanje oko 29 časova, najmanje oko 30 časova, najmanje oko 31 čas, najmanje oko 32 časa, najmanje oko 33 časa, najmanje oko 34 časa, najmanje oko 35 časova, najmanje oko 36 časova, najmanje oko 48 časova, najmanje oko 60 časova, najmanje oko 72 časa, najmanje oko 84 časa, najmanje oko 96 časova, ili najmanje oko 108 časova.

[0255] U nekim otelotvorenjima, sastav opisan u ovom dokumentu se primenjuje putem izabranim iz grupe koja se sastoji od topikalne primene, intraokularne primene, parenteralne primene, intratekalne primene, subduralne primene i oralne primene. Parenteralna primena može biti intravenska ili supkutana primena.

[0256] U drugim otelotvorenjima, sastav se koristi za tretiranje bolesti ili stanja krvarenja u ispitaniku kome je to potrebno. U određenim otelotvorenjima bolest ili stanje krvarenja je izabrano iz grupe koja se sastoji od poremećaja koagulacije krvarenja, hemartroze, krvarenja iz mišića, krvarenja iz usta, hemoragije, hemoragije u mišićima, oralne hemoragije, traume, traume kapitis, gastrointestinalnog krvarenja, intrakranijalne hemoragije, intra-abdominalne hemoragije, intratorakalne hemoragije, preloma kostiju, krvarenja iz centralnog nervnog sistema, krvarenja u retrofaringealnom prostoru, krvarenja u retroperitonealnom prostoru, krvarenja u iliopsoasnom omotaču i bilo kojih njihovih kombinacija. U drugim otelotvorenjima, ispitanik bi trebalo da se podvrgne operaciji. U drugim otelotvorenjima, tretman je profilaktički ili na zahtev.

V. Genska terapija

[0257] Himerni protein ovog pronalaska može se proizvesti in vivo u sisaru, npr. humanom pacijentu, koristeći pristup genske terapije za lečenje bolesti ili poremećaja koji se sastoji od poremećaja koagulacije krvarenja, hemartroze, krvarenja iz mišića, krvarenja iz usta, hemoragije, hemoragije u mišićima, oralne hemoragije, traume, traume kapitis, gastrointestinalnog krvarenja, intrakranijalne hemoragije, intra-abdominalne hemoragije, intratorakalne hemoragije, preloma kostiju, krvarenja iz centralnog nervnog sistema, krvarenja u retrofaringealnom prostoru, krvarenja u retroperitonealnom prostoru, krvarenja u iliopsoasnom omotaču, bili bi terapeutski korisni. Bolest ili poremećaj krvarenja može biti hemofilija, npr. hemofilija A. To uključuje primenu odgovarajuće himerne nukleinske kiseline koja kodira proteine, operativno povezane sa odgovarajućim sekvencama kontrole ekspresije. Ove sekvence mogu biti inkorporirane u virusni vektor. Pogodni virusni vektori za takvu genetsku terapiju uključuju adenovirusne vektore, lentivirusne vektore, bakulovirusne vektore, Epstein Barr virusne vektore, papovavirusne vektore, vaccinia virusne vektore, herpes simplex virusne vektore i vektore asocirane sa adeno virusom (AAV). Virusni vektor može biti replikaciono defektan virusni vektor. Adenovirusni vektor može imati deleciju u svom genu E1 ili genu E3. Kada se koristi adenoviralni vektor, sisar ne sme biti izložen nukleinskoj kiselini koja kodira selektabilni marker gen. Sekvence mogu biti inkorporirane u ne-virusni vektor poznat stručnjacima iz ove oblasti.

V. Metode korišćenja himernih proteina

[0258] Ovaj pronalazak je usmeren na himerni protein pronalaska koji se koristi u metodi za sprečavanje ili inhibiciju endogenog vezivanja VWF za protein FVIII. Obelodanjena je metoda korišćenja himernog proteina koji ima protein FVIII povezan sa XTEN i Ig konstantnim regionom ili njegovim delom.

[0259] Jedan vid je usmeren na sprečavanje ili inhibiranje interakcije FVIII sa endogenim VWF blokirajući ili štiteći mesto vezivanja VWF na FVIII od endogenog VWF i istovremeno produžavajući poluživot himernog proteina koristeći XTEN sekvencu u kombinaciji sa konstantnim regionom Ig ili njegovim delom, koji takođe može biti produživač poluživota. Obelodanjena je metoda izgradnje proteina FVIII koji ima poluživot duži od FVIII divljeg tipa. Himerni protein koji je koristan u metodi uključuje bilo koji ovde opisani himerni protein ili više njih.

[0260] Takođe je obelodanjena metoda davanja ispitaniku kome je to potrebno himerni protein koji se sastoji od proteina FVIII sa vremenom poluživota dužim od FVIII divljeg tipa, pri čemu metoda obuhvata davanje ispitaniku ovde opisani himerni protein.

[0261] Takođe je obelodanjena metoda korišćenja XTEN sekvence i Ig konstantnog regiona ili njegovog dela za poboljšanje poluživota himernog proteina koji se sastoji od proteina FVIII i proteina VWF, koji sprečava ili inhibira endogenu interakciju VWF sa proteinom FVIII. Protein FVIII povezan sa XTEN sekvencom (npr. FVIII(X)) i zatim vezan za ili asociran sa proteinom VWF fuzionisanim sa XTEN i Ig konstantnim regionom ili njegovim delom, je zaklonjen ili zaštićen od puta klirensa VWF i tako ima smanjen klirens u poređenju sa proteinom FVIII koji nije vezan za protein VWF. Zaštićeni FVIII protein tako ima maksimalno produženje poluživota u poređenju sa FVIII proteinom koji nije vezan ili asociran sa XTEN sekvencom i VWF proteinom. U jednom vidu, protein FVIII asociran ili zaštićen VWF proteinom i povezan sa XTEN sekvencom nije uklonjen od strane receptora VWF klirensa. Protein FVIII asociran ili zaštićen VWF proteinom i povezan sa XTEN sekvencom može se ukloniti iz sistema sporije od proteina FVIII koji nije asociran ili zaštićen VWF proteinom i povezan sa XTEN sekvencom.

[0262] U jednom vidu, himerni protein koji obuhvata protein FVIII povezan sa sekvencom XTEN ili protein FVIII vezan za ili asociran sa protein VWF povezan sa XTEN ima smanjen klirens iz cirkulacije pošto protein VWF ne sadrži mesto vezivanja receptora za klirens VWF. VWF protein sprečava ili inhibira klirens FVIII vezan za ili asociran sa VWF proteinom iz sistema putem puta VWF klirensa. VWF proteini takođe mogu da pruže najmanje jedno ili više FVIII zaštitnih svojstava sličnih VWF, koja obezbeđuje endogeni VWF. Protein VWF ili sekvenca XTEN takođe mogu da prikriju jedno ili više mesta vezivanja receptora za klirens FVIII, čime se sprečava klirens FVIII sopstvenim putem klirensa.

[0263] Prevencija ili inhibicija vezivanja proteina FVIII za endogeni VWF od strane proteina VWF ili sekvence XTEN može biti in vitro ili in vivo.

[0264] Takođe je obelodanjena metoda povećanja poluživota himernog proteina koja obuhvata davanje ovde opisanog himernog proteina ispitaniku kome je to potrebno. Poluživot neaktiviranog FVIII vezanog za ili asociranog sa VWF pune dužine je oko 12 do 14 časova u plazmi. Kod VWD tipa 3, gde gotovo da nema VWF u cirkulaciji, poluživot FVIII je samo oko šest časova, što dovodi do simptoma blage do umerene hemofilije A kod takvih pacijenata usled smanjene koncentracije FVIII. Vreme poluživota himernog proteina povezanog ili asociranog sa fragmentom VWF ili XTEN sekvencom ovog pronalaska može se povećati najmanje oko 1,5 puta, 1,6 puta, 1,7 puta, 1,8 puta, 1,9 puta, 2,0 puta, 2,1 puta, 2,2 puta, 2,3 puta, 2,4 puta, 2,6 puta, 2,7 puta, 2,8 puta, 2,9 puta, 3,0 puta, 3,1 puta, 3,2 puta, 3,3 puta, 3,4 puta, 3,5 puta, 3,6 puta, 3,7 puta, 3,8 puta, 3,9 puta ili 4,0 puta više od poluživota neaktiviranog FVIII vezanog za ili asociranog sa VWF pune dužine.

[0265] Himerni protein koji se sastoji od prvog polipeptida koji se sastoji od proteina FVIII i prvog Ig konstantnog regiona ili njegovog dela i drugog polipeptida koji se sastoji od VWF proteina, XTEN koji ima manje od 288 aminokiselina i Ig konstantnog regiona ili njegovog dela, može da pokaže poluživot najmanje 2 puta, 2,5 puta, 3,0 puta, 3,5 puta, 4,0 puta, 4,5 puta, 5,0 puta, 5,5 puta, 6,0 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta ili 10 puta duži od odgovarajućeg himernog proteina koji se sastoji od istog prvog polipeptida i drugog polipeptida bez XTEN sekvence ili FVIII divljeg tipa. Himerni protein koji se sastoji od prvog polipeptida koji obuhvata protein FVIII i prvi konstantni region Ig ili njegov deo i drugog polipeptida koji se sastoji od proteina VWF, XTEN koji ima manje od 288 aminokiselina i Ig konstantnog regiona ili njegovog dela, može imati poluživot oko 2 do oko 5 puta, oko 3 do oko 10 puta, oko 5 do oko 15 puta, oko 10 do oko 20 puta, oko 15 do oko 25 puta, oko 20 do oko 30 puta, oko 25 do oko 35 puta, oko 30 do 40 puta, oko 35 do oko 45 puta duži od odgovarajućeg himernog proteina koji se sastoji od istog prvog polipeptida i drugog polipeptida bez XTEN sekvence ili FVIII divljeg tipa. U određenom otelotvorenju, poluživot himernog proteina pronalaska se povećava najmanje oko 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ili 40 puta više od poluživota FVIII divljeg tipa kod FVIII i VWF dvostrukog nokaut miša.

[0266] U određenim otelotvorenjima, himerni protein pokazuje vreme poluživota od oko 40 časova kod miševa.

[0267] U nekim otelotvorenjima, poluživot himernog proteina je duži od poluživota FVIII asociranog sa endogenim VWF. U drugim otelotvorenjima, poluživot himernog proteina je najmanje oko 1,5 puta, 2 puta, 2,5 puta, 3,5 puta, 3,6 puta, 3,7 puta, 3,8 puta, 3,9 puta, 4,0 puta, 4,5 puta ili 5,0 puta poluživot FVIII divljeg tipa ili proteina FVIII asociranog sa endogenim VWF.

[0268] U nekim otelotvorenjima, kao rezultat pronalaska, poluživot himernog proteina je produžen u poređenju sa proteinom FVIII bez fragmenta VWF ili FVIII divljeg tipa.

Poluživot himernog proteina pronalaska je najmanje oko 1,5 puta, najmanje oko 2 puta, najmanje oko 2,5 puta, najmanje oko 3 puta, najmanje oko 4 puta, najmanje oko 5 puta, najmanje oko 6 puta, najmanje oko 7 puta, najmanje oko 8 puta, najmanje oko 9 puta, najmanje oko 10 puta, najmanje oko 11 puta ili najmanje oko 12 puta duži nego poluživot himernog proteina bez VWF fragmenta ili FVIII divljeg tipa. U jednom otelotvorenju, poluživot FVIII je oko 1,5 puta do oko 20 puta, oko 1,5 puta do oko 15 puta, ili oko 1,5 puta do oko 10 puta duži od poluživota FVIII divljeg tipa. U drugom otelotvorenju, poluživot FVIII je produžen oko 2 puta do oko 10 puta, oko 2 puta do oko 9 puta, oko 2 puta do oko 8 puta, oko 2 puta do oko 7 puta, oko 2 puta do oko 6 puta, oko 2 puta do oko 5 puta, oko 2 puta do oko 4 puta, oko 2 puta do oko 3 puta, oko 2,5 puta do oko 10 puta, oko 2,5 puta do oko 9 puta, oko 2,5 puta do oko 8 puta, oko 2,5 puta do oko 7 puta, oko 2,5 puta do oko 6 puta, oko 2,5 puta do oko 5 puta, oko 2,5 puta do oko 4 puta, oko 2,5 puta do oko 3 puta, oko 3 puta do oko 10 puta, oko 3 puta do oko 9 puta, oko 3 puta do oko 8 puta, oko 3 puta do oko 7 puta, oko 3 puta do oko 6 puta, oko 3 puta do oko 5 puta, oko 3 puta do oko 4 puta, oko 4 puta do oko 6 puta, oko 5 puta do oko 7 puta, ili oko 6 puta do oko 8 puta u poređenju sa FVIII divljeg tipa ili FVIII proteinom bez VWF fragmenta. U drugim otelotvorenjima, poluživot himernog proteina pronalaska je najmanje oko 17 časova, najmanje oko 18 časova, najmanje oko 19 časova, najmanje oko 20 časova, najmanje oko 21 čas, najmanje oko 22 časa, najmanje oko 23 časa, najmanje oko 24 časa, najmanje oko 25 časova, najmanje oko 26 časova, najmanje oko 27 časova, najmanje oko 28 časova, najmanje oko 29 časova, najmanje oko 30 časova, najmanje oko 31 čas, najmanje oko 32 časa, najmanje oko 33 časa, najmanje oko 34 časa, najmanje oko 35 časova, najmanje oko 36 časova, najmanje oko 40 časova, najmanje oko 48 časova, najmanje oko 60 časova, najmanje oko 72 časa, najmanje oko 84 časa, najmanje oko 96 časova, ili najmanje oko 108 časova. U još drugim otelotvorenjima, poluživot himernog proteina pronalaska iznosi oko 15 časova do oko dve nedelje, oko 16 časova do oko jedne nedelje, oko 17 časova do oko jedne nedelje, oko 18 časova do oko jedne nedelje, oko 19 časova do oko jedne nedelje, oko 20 časova do oko jedne nedelje, oko 21 čas do oko jedne nedelje, oko 22 časa do oko jedne nedelje, oko 23 časa do oko jedne nedelje, oko 24 časa do oko jedne nedelje, oko 36 časova do oko jedne nedelje, oko 48 časova do oko jedne nedelje, oko 60 časova do oko jedne nedelje, oko 24 časa do oko šest dana, oko 24 časa do oko pet dana, oko 24 časa do oko četiri dana, oko 24 časa do oko tri dana ili oko 24 časa do oko dva dana.

[0269] U nekim otelotvorenjima, prosečni poluživot himernog proteina pronalaska po ispitaniku je oko 15 časova, oko 16 časova, oko 17 časova, oko 18 časova, oko 19 časova, oko 20 časova, oko 21 čas, oko 22 časa, oko 23 časa, oko 24 časa (1 dan), oko 25 časova, oko 26 časova, oko 27 časova, oko 28 časova, oko 29 časova, oko 30 časova, oko 31 čas, oko 32 časa, oko 33 časa, oko 34 časa, oko 35 časova, oko 36 časova, oko 40 časova, oko 44 časa, oko 48 časova (2 dana), oko 54 časa, oko 60 časova, oko 72 časa (3 dana), oko 84 časa, oko 96 časova (4 dana), oko 108 časova, oko 120 časova (5 dana), oko šest dana, oko sedam dana (jedna nedelja), oko osam dana, oko devet dana, oko 10 dana, oko 11 dana, oko 12 dana, oko 13 dana, ili oko 14 dana.

[0270] Pored toga, pronalazak pruža himerni protein za upotrebu u metodi lečenja ili sprečavanja bolesti ili poremećaja krvarenja koja se sastoji od primene efikasne količine himernog proteina. U određenim otelotvorenjima bolest ili stanje krvarenja se bira iz grupe koja se sastoji od poremećaja koagulacije krvarenja, hemartroze, krvarenja iz mišića, krvarenja iz usta, hemoragije, hemoragije u mišićima, oralne hemoragije, traume, traume kapitis, gastrointestinalnog krvarenja, intrakranijalne hemoragije, intra-abdominalne hemoragije, intratorakalne hemoragije, preloma kostiju, krvarenja iz centralnog nervnog sistema, krvarenja u retrofaringealnom prostoru, krvarenja u retroperitonealnom prostoru, krvarenja u iliopsoasnom omotaču. Kod specifičnog otelotvorenja, bolest ili poremećaj krvarenja je hemofilija A.

[0271] Himerni protein koji se sastoji od XTEN sekvence i Ig konstantnog regiona ili njegovog dela u kombinaciji sa VWF proteinom opisanim u ovom dokumentu, koji sprečava ili inhibira interakciju FVIII proteina sa endogenim VWF pripremljenim u skladu sa sadašnjim obelodanjivanjem, ima mnogo primena koje će prepoznati stručnjaci iz ove oblasti, uključujući, ali ne ograničavajući se na metode lečenja ispitanika koji ima hemostatski poremećaj i metode lečenja ispitanika kome je potreban opšti hemostatski agens. U jednom otelotvorenju, pronalazak se odnosi na himerni protein pronalaska za upotrebu u metodi lečenja ispitanika koji ima hemostatski poremećaj, koja se sastoji od davanja terapeutski efikasne količine himernog proteina.

[0272] Deo proteina FVIII u himernom proteinu tretira ili sprečava hemostatski poremećaj služeći kao ko-faktor faktora IX na negativno naelektrisanoj površini fosfolipida, čime se formira kompleks Xaze. Vezivanje aktivnih koagulacionih faktora za fosfolipidnu površinu lokalizuje ovaj proces na mesta vaskularnih oštećenja. Na fosfolipidnoj površini, Faktor VIIIa povećava maksimalnu brzinu aktivacije faktora X faktorom IXa, za približno 200.000 puta, što dovodi do velikog drugog naleta generisanja trombina.

[0273] Himerni protein pronalaska može se koristiti za lečenje bilo kog hemostatskog poremećaja. Hemostatski poremećaji koji se mogu lečiti primenom himernog proteina pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, hemofiliju A, kao i nedostatke ili strukturne nenormalnosti koje se odnose na Faktor VIII. U jednom otelotvorenju hemostatski poremećaj je hemofilija A.

[0274] Himerni protein pronalaska može se koristiti profilaktički za lečenje ispitanika sa hemostatskim poremećajem. Himerni protein pronalaska može se koristiti za lečenje epizode akutnog krvarenja kod ispitanika sa hemostatskim poremećajem. Kod drugog otelotvorenja, hemostatski poremećaj može biti rezultat neispravnog faktora zgrušavanja, npr. von Willebrand-ovog faktora. U jednom otelotvorenju, hemostatski poremećaj je nasledni poremećaj. U drugom otelotvorenju, hemostatski poremećaj je stečeni poremećaj. Stečeni poremećaj može biti posledica osnovne sekundarne bolesti ili stanja. Nepovezano stanje može biti, kao primer, ali ne kao ograničenje, rak, autoimuna bolest ili trudnoća. Stečeni poremećaj može biti posledica starosti ili lekova za lečenje osnovnog sekundarnog poremećaja (npr.hemoterapije karcinoma).

[0275] Pronalazak se takođe odnosi na himerni protein pronalaska za upotrebu u metodama lečenja ispitanika koji nema urođeni hemostatski poremećaj, ali ima sekundarno oboljenje ili stanje koje dovodi do sticanja hemostatskog poremećaja, npr. usled razvoja anti-FVIII antitela ili operacije. Pronalazak se tako odnosi na himerni protein pronalaska za upotrebu u metodi lečenja ispitanika kome je potreban opšti hemostatski agens koji obuhvata davanje terapeutski efikasne količine himernog proteina pripremljenog ovim metodama.

[0276] Ovaj pronalazak je takođe povezan sa himernim proteinom pronalaska koji se koristi u metodama smanjenja imunogenosti FVIII ili indukovanja manje imunogenosti protiv FVIII koji se sastoji od primene efikasne količine himernog proteina ili polinukleotida koji ga kodiraju.

[0278] U jednom otelotvorenju, ispitanik kome je potreban opšti hemostatski agens podvrgava se, ili će uskoro biti podvrgnut, operaciji. Himerni protein pronalaska može se primeniti pre, za vreme ili posle operacije kao profilaktički režim. Himerni protein pronalaska može se primeniti pre, tokom ili nakon operacije kako bi se kontrolisala epizoda akutnog krvarenja.

[0278] Himerni protein pronalaska može se koristiti za lečenje ispitanika sa epizodom akutnog krvarenja koji nema hemostatski poremećaj. Epizoda akutnog krvarenja može biti posledica teške traume, npr. operacije, automobilske nesreće, rane, rane od pucnja iz pištolja ili bilo kog drugog traumatskog događaja koji dovodi do nekontrolisanog krvarenja.

Neograničavajući primeri epizoda krvarenja uključuju poremećaj koagulacije pri krvarenju, hemartrozu, krvarenja iz mišića, krvarenja iz usta, hemoragiju, hemoragiju u mišićima, oralnu hemoragiju, traume, traume kapitis, gastrointestinalno krvarenje, intrakranijalnu hemoragiju, intra-abdominalnu hemoragiju, intratorakalnu hemoragiju, prelom kostiju, krvarenja iz centralnog nervnog sistema, krvarenja u retrofaringealnom prostoru, krvarenja u retroperitonealnom prostoru, krvarenja u iliopsoasnom omotaču i njihovih bilo kojih kombinacija.

[0279] U profilaktičkim primenama, jedan ili više sastava koji sadrže himerni protein pronalaska ili njegov koktel daju se pacijentu koji još nije u stanju bolesti kako bi se povećala otpornost pacijenta ili smanjili simptomi povezani sa bolešću ili poremećajem. Takva količina je definisana kao "profilaktički efikasna doza". U terapijskim primenama, ponekad je potrebna relativno visoka doza (npr. od oko 1 do 400 mg/kg polipeptida po dozi, pri čemu se doze od 5 do 25 mg češće koriste za radioimunokonjugate i veće doze za polipeptide modifikovane citotoksin-lekom) u relativno kratkim intervalima dok se progresija bolesti ne smanji ili prekine, i dok pacijent ne pokaže delimično ili potpuno poboljšanje simptoma bolesti. Nakon toga, pacijentu se može dati profilaktički režim.

[0280] U nekim otelotvorenjima, himerni protein ili sastav pronalaska koristi se za lečenje na zahtev, što uključuje lečenje epizode krvarenja, hemartroze, krvarenja iz mišića, krvarenja iz usta, hemoragije, hemoragije u mišićima, oralne hemoragije, traume, traume kapitis, gastrointestinalnog krvarenja, intrakranijalne hemoragije, intra-abdominalne hemoragije, intratorakalne hemoragije, preloma kostiju, krvarenja iz centralnog nervnog sistema, krvarenja u retrofaringealnom prostoru, krvarenja u retroperitonealnom prostoru, krvarenja u iliopsoasnom omotaču. Ispitaniku može biti potrebna hirurška profilaksa, perioperativno upravljanje ili tretman za operaciju. Takve operacije uključuju, npr., manju operaciju, veliku operaciju, vađenje zuba, tonzilektomiju, ingvinalnu herniotomiju, sinovektomiju, potpunu zamenu kolena, kraniotomiju, osteosintezu, operaciju traume, intrakranijalnu operaciju, intraabdominalnu operaciju, intratorakalnu operaciju ili operaciju zamene zglobova.

[0281] U jednom otelotvorenju, himerni protein ovog pronalaska se daje intravenski, supkutano, intramuskularno ili preko bilo koje površine sluznice, npr. oralno, sublingvalno, bukalno, nazalno, rektalno, vaginalno ili pulmonalnim putem. Himerni protein koji se sastoji od fragmenta VWF i proteina FVIII ovog pronalaska može se implantiratii unutar ili povezati sa čvrstim biopolimernim nosačem koji omogućava sporo oslobađanje himernog proteina na mestu krvarenja ili implantiran u zavoj/povoj. Doza himernog proteina će varirati u zavisnosti od ispitanika i određenog načina primene. Doze mogu biti od 0,1 do 100.000 µg/kg telesne težine. U jednom otelotvorenju, raspon doziranja je 0,1-1.000 µg/kg. U drugom otelotvorenju, raspon doziranja je 0,1-500 µg/kg. Protein se može primenjivati kontinuirano ili u određenim vremenskim intervalima. In vitro testovi se mogu koristiti za određivanje optimalnih raspona doza i/ili rasporeda za primenu. In vitro testovi koji mere aktivnost faktora zgrušavanja poznati su u struci, npr. STA-CLOT VIIa-rTF test zgrušavanja ili ROTEM test zgrušavanja. Pored toga, efikasne doze se mogu ekstrapolisati iz krivih odgovora na doze, dobijenih od životinjskih modela, npr. hemofiličnog psa (Mount et al. 2002, Blood 99(8):2670).

[0282] Nakon što je sada detaljno opisan ovaj pronalazak, isti će se jasnije razumeti pozivanjem na sledeće primere, koji su ovde uključeni samo u svrhu ilustracije i nisu namenjeni ograničavanju pronalaska.

Primeri

[0283] U primerima su korišćeni sledeći materijali i metode, osim ako nije drugačije navedeno.

Materijali i metode

[0284] Generalno, praksa ovog pronalaska koristi, osim ako nije drugačije naznačeno, konvencionalne metode hemije, biofizike, molekularne biologije, tehnologije rekombinantne DNK, imunologije (posebno, npr., tehnologije antitela) i standardne tehnike u elektroforezi. Vidi, npr. Sambrook, Fritsch i Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antbody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antbody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., CS.H.L. Press, Pub. (1999); i Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992).

Primer 1: FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc heterodimeri

[0285] Ovaj pronalazak je usmeren na generisanje himernog molekula FVIII koji je povezan sa D'D3 domenom proteina fon Willebrand faktora (VWF) preko Fc domena IgG. Priključeni D'D3 domen sprečava interakciju FVIII sa endogenim VWF multimerima. Ovaj molekul služi kao platforma za uključivanje drugih tehnologija produženja poluživota u cilju poboljšanja farmakokinetike himernog proteina. XTEN sekvence su inkorporirane u B-domen FVIII i između D 'D3 i Fc regiona kako bi se povećao poluživot heterodimera FVIII/VWF.

[0286] Mesto cepanja trombina između D'D3 i Fc omogućava oslobađanje D'D3 domena nakon aktiviranja molekula FVIII trombinom.

Primer 2: Plazmidna konstrukcija FVIII-XTEN-Fc/D'D3-Fc heterodimera Kloniranje VWF050- IHH trostruke mutacije u VWF031

[0287] IHH trostruka mutacija u Fc sprečava interakciju sa FcRn, tako da nema recikliranja molekula koji sadrži Fc putem FcRn. Tri mutacije u Fc su I253A, H310A, H435A.

[0288] VWF050 je generisan razmenom Fc regiona VWF031 plazmida sa Fc fragmentom koji sadrži IHH trostruku mutaciju između RsRII i Not 1 restrikciona mesta.

[0289] Kloniranje VWF057- Kloniranje VWF-Fc sa 144 AE XTEN 35aa trombin cepivim linkerom.

Oligonukleotidi

[0290]

[0291] PCR je urađen dva puta da bi se dobio 144 AE-XTEN 35 aa GS linker sa mestom cepanja trombinom.

[0292] Prva PCR reakcija je urađena korišćenjem 144- AE XTEN koji kodira DNK kao šablon i ESC 157/ESC155 prajmer par. Oko 550 bp dugi PCR proizvod dobijen iz ove reakcije korišćen je kao templat za drugu PCR reakciju i amplifikovan je pomoću ESC 157/156 prajmer para. Ova reakcija je dala proizvod dužine ~ 700 bp. Ovaj PCR proizvod od 700 bp i VWF034 plazmid je zatim digestiran sa EcoRV-HF i RsRII. Plazmidna okosnica iz digestiranog.

[0293] VWF034 je zatim korišćen za ligaciju 700bp PCR proizvoda.

Kloniranje VWF058- IHH trostruke mutacije u VWF034

[0294] IHH trostruka mutacija u Fc sprečava interakciju sa FcRn, tako da nema recikliranja molekula koji sadrži Fc putem FcRn. Tri mutacije u Fc su I253A, H310A, H435A.

[0295] VWF050 je generisan razmenom Fc regiona VWF031 plazmida sa Fc fragmentom koji sadrži IHH trostruku mutaciju između RsRII i Not 1 restrikcionih mesta.

Kloniranje FVIII-263- FVIII 205 sa IHH trostrukom mutacijom

[0296] IHH trostruka mutacija u Fc sprečava interakciju sa FcRn, tako da nema recikliranja molekula koji sadrži Fc putem FcRn. Tri mutacije u Fc su I253A, H310A, H435A.

[0297] FVIII-263 je generisan razmenom Fc regiona FVIII 205 plazmida sa Fc fragmentom koji sadrži IHH trostruku mutaciju između RsRII i Not 1 restrikcionih mesta.

Kloniranje FVIII-282- FVIII-Fc sa 144 AE XTEN u B-domenu

[0298]

[0299] Prva PCR reakcija je urađena korišćenjem 144- AE XTEN koji kodira DNK kao templat i ESC 158/ESC159 prajmer para. Iz ove reakcije dobijen je PCR proizvod dužine oko 550 bp, a plazmid FVIII 169 je zatim digestiran sa AscI i Cla1. Plazmidna kičma iz digestiranog FVIII 169 je zatim korišćena za ligaciju PCR proizvoda od 550 bp kako bi se dobio FVIII 282.

Kloniranje FVIII-263- FVIII 205 sa trostrukom mutacijom IHH

[0300] IHH trostruka mutacija u Fc sprečava interakciju sa FcRn, tako da nema recikliranja molekula koji sadrži Fc putem FcRn. Tri mutacije u Fc su I253A, H310A, H435A.

[0301] FVIII-263 je generisan razmenom Fc regiona FVIII 205 plazmida sa Fc fragmentom koji sadrži IHH trostruku mutaciju između RsRII i Not 1 restrikcionih mesta.

Primer 3: Proizvodnja FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc u HEK293 ćelijama [0302] Slika 2. Šematski dijagram koji prikazuje ekspresiju konstrukta FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc. Ko-transfekcija tri plazmida je izvršena u HEK293 ćelijama koristeći polietilenimin (PEI). Prvi plazmid izvodi ekspresiju FVIII-XTEN-Fc, drugi plazmid eksprimira D1D2DD3-XTEN-Fc, a treći plazmid eksprimira PACE/furin, koji je potreban za enzimsko uklanjanje propeptida, tj. D1D2 domena iz D1D2D'D3-XTEN-Fc. Proizvodi ovog sistema tri plazmidne ekspresije uključuju FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc heterodimer, D' D3-XTEN-Fc homodimer i tragove FVIII-XTEN-Fc hemizigotnih vrsta.

Primer 4: Prečišćavanje FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc heterodimera

[0303] Za prečišćavanje heterodimera FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc, korak tangencijalne protočne filtracije (TFF) je korišćen za prvo koncentrisanje kondicionisanog medija za 10 puta. Proizvodi u filtratu su zatim dodatno prečišćeni pomoću afinitetne hromatografije, nakon čega je usledila kolona za desalinizaciju. Čistoća molekula je bila prihvatljiva za HPLC-SEC i dalje je potvrđena "western bloting"-om. Specifična aktivnost molekula je bila uporediva sa FVIII sa obrisanim domenom B, mereno testom aktivnosti FVIII (primer 5) i merenjem OD280.

Primer 5: Specifična aktivnost FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc heterodimera [0304] Aktivnost heterodimera FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc merena je hromogenim testom FVIII i testom aktiviranog parcijalnog tromboplastinskog vremena (aPTT). Specifična hromogena aktivnost i specifična aPTT aktivnost SQ BDD-FVIII, rFVIII169/VWF034 i rFVIII169/VWF057 navedene su u Tabeli 15. U poređenju sa SQ BDD-FVIII, uočili smo uporedive specifične hromogene aktivnosti i smanjenje od 60% na specifičnoj aPTT aktivnosti za rFVIII169/VWF034 i rFVIII169/VWF057.

Tabela 15: Specifična aktivnost varijanti heterodimera

FVIII hromogeni test

[0305] Aktivnost FVIII izmerena je korišćenjem COATEST SP FVIII kompleta iz DiaPharma (produce #: K824086) i sve inkubacije su izvedene na grejnoj ploči na 37°C sa potresanjem.

[0306] Kao standard za ispitivanje korišćen je 8. međunarodni standard WHO za faktor koagulacije krvi VIII:C, koncentrat, kodiran 07/350, opseg standarda je bio od 100 mIU/mL do 0,78 mIU/mL. Objedinjeni uzorci za kontrolu i testiranje normalne humane plazme (razblaženi sa IX Coatest puferom) dodati su u Immulon 2HB ploče sa 96 bunara u duplikatu (25 µL/bunaru). Sveže pripremljena mešavina IXa/FX/Fosfolipid (50 µL), 25 µL 25mM CaCl2i 50 µL supstrata FXa dodato je po redu u svaki bunar sa 5 minuta inkubacije između svakog dodavanja. Nakon inkubacije sa podlogom, dodato je 25 µL 20% sirćetne kiseline za prekid bojene reakcije, a apsorbancija OD405 merena je instrumentom SpectraMAX plus (Molecular Devices). Podaci su analizirani softverom SoftMax Pro (verzija 5.2). Najniži nivo kvantifikacije (LLOQ) je 7,8 miu/mL.

FVIII aPTT test

[0307] Test FVIII aPTT izveden je na analizatoru koagulacije Sysmex CA-1500 na sledeći način: Prvo, 50 uL ručno razblaženih uzoraka, standarda i kontrola u aPTT puferu (50 mM Tris, 100 mM NaCl, 1% HSA, pH 7.4) dodato je instrumentom u reakcionu kivetu, nakon čega je dodato 50 uL plazme sa nedostatkom FVIII (George King Bio-Medical, proizvod #: 0800). Nakon inkubacije na 37°C tokom 1 minuta, u reakcionu smešu je dodato 50 uL aPTT reagensa (Actin<®>FSL aktivni cefaloplastinski reagens - Dade Behring, referenca # B4219-2) i inkubirano na 37°C tokom 4 minuta. Nakon toga, dodato je 50 ul 20 mM CaCl2(Dade Behring, referenca # ORFO37), i reakciona kiveta je odmah prebačena na jednu od četiri pozicije kanala spektrofotometra za merenje količine refraktirane svetlosti u smeši, koja je konvertovana u početak zgrušavanja softverskim algoritmom instrumenta. Prijavljeno vreme zgrušavanja je bilo vreme od dodavanja CaCl2do početka stvaranja ugruška. Test standard je generisan razblaživanjem 8. WHO međunarodnog standarda FVIII u aPTT puferu u opsegu od 100 mIU/ml do 0,78 mIU/ml. Standardna kriva je nacrtana kao vreme zgrušavanja (u sekundama) kao Y-ose naspram logaritma (osnova 10) aktivnosti FVIII (mIU/mL) kao X-ose u MS Excel, a aktivnost pojedinačnih uzoraka je izračunata pomoću formule za linearnu regresionu liniju ove standardne krive. Na osnovu performansi testa donja granica kvantifikacije (LLOQ) iznosila je 7,8 mIU/mL.

Primer 6: Aditivni efekat XTEN insercija na produženje poluživota heterodimera [0308] XTEN insercije su inkorporirane u heterodimere za produženje poluživota. Insercija jedne 288 aminokiseline (aa) AE-XTEN u B-domen FVIII rezultirala je poluživotom heterodimera od 16,7 časova u miševima HemA, kao što je prikazano sa rFVIII169/VWF031 na Slici 3. Da bi se dodatno poboljšao poluživot heterodimera, druga XTEN insercija na 144 aa ili 288 aa dužine je inkorporirana u FVIII169/VWF031 ili u A1 domenu FVIII ili neposredno nizvodno od D'D3 fragmenta, varijante heterodimera su imenovane kao FVIII205/VWF031 i FVIII169/VWF034.

[0309] Poluživot rFVIII169/VWF031, rFVIII205/VWF031 i rFVIII169/VWF034 procenjeni su kod miševa sa deficitom FVIII (HemA) pomoću jedne intravenske primene test molekula u dozi od 200 IU/kg. Uzorci plazme su prikupljeni na određenim vremenskim tačkama kao što je prikazano na Slici 3, aktivnost FVIII uzoraka je određena hromogenim testom FVIII, PK parametri su izračunati pomoću programa WinNonlin-Phoenix i navedeni u Tabeli 16.

[0310] Kao što je prikazano na Slici 3 i u Tabeli 16, dodavanje druge XTEN insercije ili na domenu A1 FVIII ili nizvodno od D'D3 dodatno poboljšava poluživot heterodimera na 29,45 odnosno 31,10. Pored toga, više od dvostrukog poboljšanja klirensa i AUC takođe je primećeno iz obe XTEN insercije.

Tabela 16: PK parametar heterodimera kod HemA miševa

Primer 7: 144 aa AE-XTEN daje bolji dobitak poluživota nego 288 aa AE-XTEN kada se insertuje između D'D3 i Fc domena.

[0311] Konstruisan je još jedan heterodimer-FVIII169/VWF057 u nastojanju da se identifikuje optimalna dužina XTEN insercije unutar lanca D'D3-XTEN-Fc, u kome je dužina XTEN insercije smanjena na 144aa sa 288aa. Kao što je prikazano na Slici 4, u poređenju sa rFVIII169/VWF034, poluživot rFVIII169/VWF057 je povećan sa 31 čas na 42 časa.

Poboljšani klirens i AUC su takođe primećeni za rFVIII169/VWF057, podaci su navedeni u Tabeli 17. Dakle, 144aa AE-XTEN insercija je optimalnija od AE-288aa XTEN kada se insertuje između D'D3 i Fc domena FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc heterodimera.

Tabela 17: PK parametri za rFVIII169/VWF034 i rFVIII169/VWF057 kod HemA miševa

Primer 8: Fc domen produžava poluživot heterodimera

[0312] Fc domeni produžavaju poluživot svog fuzionog proteina putem FcRn posredovanog puta recikliranja. Da bi se potvrdila neophodnost Fc domena na produženje poluživota heterodimera, Fc domeni divljeg tipa su zamenjeni trostrukim mutantom (I253A/H310A/H435A; IHH) u rFVIII205/VWF031 za formiranje rFVIII263/VWF050, a kompletna eliminacija FcRn vezivanja je potvrđena testom rezonancije površinskog plazmona (Biacore) za rFVIII263/VWF050. Poluživot FVIII263/VWF050 je procenjen na HemA miševima u poređenju sa rFVIII205/VWF031. Povećana brzina klirensa, kao i smanjen poluživot i AUC su primećeni za rFVIII263/VWF050, kao što je prikazano na Slici 5 i Tabeli 18. Ovaj rezultat je pokazao da su, pored obezbeđivanja kovalentnog vezivanja FVIII i D'D3, Fc domeni takođe neophodni za poboljšanje poluživota heterodimera.

Tabela 18: PK parametri za rFVIII205/VWF031 i rFVIII263/VWF040 kod HemA miševa

Primer 9: Akutna efikasnost heterodimera FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc u HemA modelu krvarenja iz repne kopče miša

[0313] Akutna efikasnost kandidata za vodeći heterodimer procenjena je pomoću modela krvarenja iz repa HemA miša.

[0314] Muški HemA miševi stari 8-12 nedelja randomizovani su u 4 grupe tretiranja i tretirani jednom intravenskom primenom SQ BDD-FVIII, rFVIII169/VWF034, rFVIII169/VWF057, odnosno rastvorom nosioca. Da bi se imitirala epizodna terapija FVIII (da bi se rekonstituisalo 50-100% normalnog nivoa FVIII u plazmi), izabrana doza tretmana FVIII je 75 IU/kg, mereno aktivnošću FVIII aPTT. Na ovom nivou doze, sve varijante ispitivanja FVIII će rekonstituisati ~70% normalne aktivnosti FVIII u plazmi miša 5 minuta nakon doziranja.

[0315] Zapremina gubitka krvi kod svake pojedinačne životinje u studiji prikazana je na Slici 6. Zapaženo je značajno smanjenje volumena gubitka krvi za sve grupe tretmana FVIII u poređenju sa životinjama tretiranim nosiocem. U okviru tri grupe tretmana sa FVIII, nisu pronađeni statistički značajni različiti podaci o smanjenju gubitka krvi, što ukazuje da bi heterodimerni molekuli mogli biti potencijalno efikasni kao SQ BDD-FVIII za tretman na zahtev.

[0316] Zapremina gubitka krvi kod svake pojedinačne životinje u studiji prikazana je na Slici 6. Zapaženo je značajno smanjenje volumena gubitka krvi za sve grupe tretiranih sa FVIII u poređenju sa životinjama tretiranim nosiocem. U okviru tri grupe FVIII tretmana, nisu pronađeni statistički značajni različiti podaci o smanjenju gubitka krvi, što ukazuje da bi heterodimerni molekuli mogli biti potencijalno efikasni kao SQ BDD-FVIII za tretman na zahtev.

[0317] Pored toga, miševi HemA su tretirani nižom dozom (37,5 IU/kg) rBDD-FVIII ili rFVIII169/VWF034, a rezultati su prikazani na Slici 6B. Isto kao i doza od 75 IU/kg, rFVIII169/VWF034 je pružio sličnu zaštitu kao BDD-FVIII miševi nakon povrede repa, što ukazuje da je molekul i dalje bio efikasan za tretman teških epizoda krvarenja na ~35% normalnog nivoa FVIII u cirkulaciji kod miševa HemA.

[0318] Postupak repne kopče je sproveden na sledeći način. Ukratko, miševi su anestezirani sa 50 mg/kg ketamina/0,5 mg/kg deksmedetomidina pre povrede repa i stavljeni na grejnu podlogu od 37°C kako bi se održala telesna temperatura. Repovi miševa su zatim bili uronjeni u fiziološki rastvor na 37°C 10 minuta kako bi dilatirala bočna vena. Nakon dilatacije vena, rastvor varijanti FVIII ili nosioca su ubrizgani kroz repnu venu i distalnih 5 mm repa je zatim odsečeno pomoću ravnog skalpela #115min nakon doziranja. Prolivena krv je sakupljena u 13 ml fiziološkog rastvora na 37°C tokom 30 minuta, a volumen gubitka krvi je određen promenom težine epruvete za prikupljanje krvi: volumen gubitka krvi = (završna težina epruvete - početna težina 0,10 ml). Statistička analiza je sprovedena pomoću t testa (Mann Whitney test) i jednosmernog ANOVA (KRUSKAL-Wallis testa, post-test: Dunn-ov test višestrukog poređenja).

Primer 10: Profilaktička efikasnost heterodimera FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc u modelu transekcije repne vene miša HemA

[0319] Profilaktička efikasnost FVIII169/VWF057 testirana je na modelu transekcije repne vene (TVT) HemA miša. TVT model izaziva krvarenje uvođenjem povrede bočne vene mišjeg repa, koja imitira epizode spontanog krvarenja kod pacijenata sa poremećajem hemofiličnog krvarenja.

[0320] 8-10 nedelja stari mužjaci HemA miševa su randomizovani u četiri grupe tretiranja, i tretirani sa ili FVIII169/VWF057 na 72 časa pre povrede repne vene, ili sa SQ BDD-FVIII na 24 časa ili 48 časova pre povrede. Kao negativna kontrola korišćene su životinje tretirane nosiocem. Događaji ponovnog krvarenja ili eutanazije usled prekomernog gubitka krvi u roku od 24 časa nakon povrede prikazani su na Slici 7.

[0321] Kao što je prikazano na Slici 7, za razliku od miševa tretiranih sa SQ BDD-FVIII 48 časova pre TVT, od kojih je zapažena samo ograničena zaštita nakon povrede, miševi koji su primili rFVIII169/VWF05772 časa pre povrede repa imali su sličnu zaštitu na ponovnom krvarenju i preživljavanju u poređenju sa miševima koji su primili SQ BDD-FVIII tretman 24 časa pre TVT, što ukazuje da rFVIII169/VWF057 može pružiti najmanje trostruko ili više (npr. četvorostruko) dužu zaštitu HemA miševima u TVT modelu. Zbog toga rFVIII169/VWF057 može značajno smanjiti učestalost tretiranja trenutne FVIII profilakse.

[0322] Slično tome, miševi HemA tretirani su heterodimerima FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc: rFVIII169/VWF034 i rFVIII169/VWF057 na 24 ili 96 časova pre povrede repne vene. Podaci o ponovnom krvarenju i preživljavanju za tretman upoređeni su sa podacima koje su prikupljeni za rBDD-FVIII 24 ili 48 časova pre povrede i nosioca. Dok je ponovno krvarenje kod miševa tretiranih sa rBDD-FVIII na 24 časa pre povrede repne vene bilo slično kao kod miševa tretiranih samo nosiocem, podaci o ponovnom krvarenju miševa tretiranih heterodimerima 24 časa pre povrede su značajno bolji nego kod grupe koja je tretirana nosiocem. Nadalje, podaci o ponovnom iskrvarenju miševa tretiranih heterodimerima na 96 časova pre povrede bili su uporedivi sa podacima o miševima koji su primili rBDD-FVIII na 24 časa pre povrede. Što se tiče stope preživljavanja 24 sata nakon povrede TVT, za razliku od manje od 50% stope preživljavanja miševa tretiranih sa rBDD-FVIII, više od 90% miševa je preživelo povredu TVT sa heterodimerima FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc kada su molekuli FVIII primenjeni na 24 časa pre povrede. Pored toga, preživljavanje kod miševa tretiranih sa heterodimerima FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc 96 časova pre povrede repne vene bilo je bolje (u slučaju rFVIII169/VWF034) ili uporedivo (u slučaju rFVIII169/VWF057) u poređenju sa miševima koji su primili tretman rBDD-FVIII 24 časa pre povrede. I podaci o ponovnom krvarenju i o preživljavanju ukazuju na četvorostruko produženje efikasnosti tretiranja heterodimerom FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc u odnosu na tretman sa rBDD-FVIII.

Model transekcije repne vene HemA miša

[0323] Postupak presecanja repne vene sproveden je na sledeći način. Miševi su anestezirani koktelom koji sadrži 50 mg/kg ketamina, 0,125 mg/kg deksmedetomidina i 0,1 mg/kg Bupreneksa. Na adekvatnoj anestetičkoj dubini, bočna repna vena miševa presečena je hirurškim sečivom broj 11 sa ravnom ivicom u području gde je prečnik repa približno 2,7 mm. Izlivena krv je isprana toplim fiziološkim rastvorom kako bi se osiguralo jasno sagledavanje rane. Tretirani miševi su bili smešteni pojedinačno u čistom kavezu sa belom papirnom posteljinom sledeća 24 časa. Ponovno krvarenje iz repa i fizička aktivnost miša su opservirani i zabeleženi svakog časa do 12 časova nakon povrede repa. Umirući miševi su odmah eutanazirani, a konačna opservacija izvršena je 24 sata nakon povrede repa. Da bi se imitirala situacija sa krvarenjem kod pacijenata sa hemofilijom i da bi se osigurao potpuni oporavak životinje od anestezije, dat je 1 mg/kg Atipamezola da bi se poništio efekat deksmedetomidina na početku transekcije repne vene. Dodatna doza od 0,1 mg/kg Buprenexa primenjena je na kraju 12-časovnog perioda opserviranja za kontrolu bola preko noći. Kriva preživljavanja vreme do ponovnog krvarenja i vremena do eutanazije generisana je za analizu podataka, a za statističku procenu korišćen je Log-rank (Mantel-COX) test.

Primer 11: Preparacija FVIII169/VWF059 i drugih konstrukata

kloniranja pSYN FVIII 310:

[0324] Komercijalno je izrađen sintetički fragment DNK sa BamHl mestom na N terminalu i Cla 1 lokacijom na C terminalu. Ova sintetička DNK je korišćena za zamenu BamHl u Cla1 regionu u pSYN FVIII 169 konstruktu (SEQ ID NO: 155). I sintetička DNK i pSYN FVIII 169 DNK su dvostruko digestirani sa BamHl i Cla1, digestirana sintetička DNK je insertovana u digestirani pSYN FVIII 169 da bi se kreirao pSYN FVIII 310 (SEQ ID NO:168; Tabela 19).

[0325] Kloniranje pSYN FVIII 312:

Komercijalno je izrađen sintetički fragment DNK sa BamHl lokacijom na N-terminalu i Afe 1 lokacijom na C-terminalu. Ova sintetička DNK je korišćena za zamenu BamHl u Afe1 regionu u pSYN FVIII 169 konstruktu (SEQ ID NO: 155). I sintetička DNK i pSYN FVIII 169 DNK su dvostruko digestirani sa BamHl i Afe1, digestirana sintetička DNK je insertovana u digestirani pSYN FVIII 169 radi kreiranja pSYN FVIII 312 (SEQ ID NO: 169; Tabela 19). pSYN FVIII 312A (SEQ ID NO: 2; Tabela 19) je kreiran od pSYN FVIII312 da bi se uklonilo AscI mesto koje kodira aminokiselinske ostatke GAP na spoju FVIII i XTEN.

Tabela 19: Sintetički konstrukti FVIII.

Kloniranje pSYN VWF059 i VWF073:

[0326] Izrađeni su različiti sintetički fragmenti DNK koji kodiraju različite regione linkera između D'D3-XTEN i Fc. Ovi sintetički fragmenti DNK bili su nastavljeni sa mestom Asc1 na N-terminusu, i mestom Not 1 na C-terminusu. Ovi sintetički DNK korišćeni su za zamenu Asc1 do Not1 regiona u pSYN VWF057 konstruktu (SEQ ID NO: 152). Konstrukt pSYN VWF059 (Tabela 20) obuhvata region linkera (SEQ ID NO: 13), koji obuhvata ceo kiselinski region 2 FVIII (a2). Prijavljeno je da se ovo mesto cepa trombinom, a nakon aktiviranja FVIII oslobađa se D'D3XTEN. Konstrukt pSYN VWF073 (Tabela 20) sadrži samo mesto trombinskog cepanja kiselog regiona 2 FVIII (a2) (tj. IEPRSFS) (ID SEQ NO: 23). I sintetička DNK i pSYN VWF057 DNK su dvostruko digestirani sa Asc1 i Not1. Digestirana sintetička DNK je insertovana u digestirani pSYN VWF057 da bi se kreirali pSYN VWF059 i pSYN VWF073. Konstrukt pSYN VWF59A (Tabela 20) generisan je iz pSYN VWF059 uklanjanjem restrikcionih mesta EcoRV. FVIII169/VWF057 i FVIII169/VWF059 heterodimerni proteini su generisani ko-ekspresijom FVIII169 i VWF057 ili VWF059 u HEK293 ćelijama.

Tabela 20: Sintetički VWF konstrukti – regioni linkera koji se mogu odvojiti.

Primer 12: Trombinska digestija heterodimera FVIII za analizu oslobađanja D'D3 iz Fc [0327] Dva heterodimerna proteina FVIII testirana su u eksperimentima trombinske digestije i ispitana je njihova brzina cepanja trombinom. Dva heterodimerna konstrukta koja su korišćena u ovom eksperimentu su FVIII169/VWF057 heterodimer i FVIII169/VWF059 heterodimer zajedno sa FVIIIFc. Prethodno su opisani heterodimeri FVIII169/VWF057 i FVIII169/VWF059. Izvršene su tri reakcije digestije: i) FVIIIFc ii) FVIII169/VWF057 (Slika 11) i iii) FVIII 169/VWF059 (Slika 12). Test uzorci su tretirani humanim α-trombinom u molarnom odnosu FVIII:trombin približno 22:1. Svaka reakcija je inkubirana u vodenom kupatilu na 37°C. Na svakoj naznačenoj vremenskoj tački (t = 5, 15, 30, 45, 60 minuta), izvučen je uzorak od 22,5 µL, zaustavljen sa 22,5 µL ne-redukcionom 2x SDS bojom punjenja i zagrejan na 3 minuta. Digestirani protein je zatim stavljen na SDS-PAGE gel. "Western blotting" je izvršeno korišćenjem anti-FVIII teškog lanca (GMA012) i antiVWF-D3 (Ab96340) antitela koristeći LICOR sistem.

[0328] Kao što je prikazano na slici 11, izlaganje FVIII169/VWF057 trombinu rezultiralo je postepenim smanjenjem detektovanog nivoa D'D3-XTEN-Fc, u korelaciji sa povećanjem nivoa D'D3-144 XTEN, cepanog proizvoda. Ne-rascepljeni FVIII169/VWF057 preostao je nakon 15 minuta. Nasuprot tome, slika 12 pokazuje da se FVIII 169/VWF059 brže cepa trombinom, o čemu svedoči malo do nimalo detektovanog ne-cepanog FVIII 169/VWF059 nakon 5 minuta. Shodno tome, FVIII 169/VWF059 je pokazao bolje oslobađanje D'D3 iz Fc nakon aktivacije trombina u poređenju sa FVIII169/VWF057.

[0329] Paralelni eksperimenti su urađeni za istraživanje trombinskog cepanja pomoću masene spektroskopije (MS). Po MS, FVIII 169/VWF059 je ponovo pokazao bolje oslobađanje D'D3 iz Fc u poređenju sa VWF057.

Primer 13: In vivo procena FVIII169/VWF059 kod miševa HemA

[0330] Za dalju procenu farmakokinetičkog profila i in vivo potencije FVIII169/VWF059, miševi HemA su tretirani sa FVIII169/VWF059 intravenskom primenom u dozi od 150 IU/kg. Uzorci plazme prikupljeni su prikupljanjem krvi iz vena cava na 5 minuta, 24, 48, 72, 96 i 120 časova nakon ubrizgavanja. Aktivnost FVIII u uzorcima plazme merena je hromogenim testom FVIII, a PK parametri su izračunati programom Phoenix. Sličan PK profil FVIII169/VWF059 je opserviran u poređenju sa FVIII169/VWF057, kao što je prikazano u Tabeli 21, što ukazuje na to da linker a2 trombinskog cepanja nema negativan uticaj na PK profil heterodimera.

Tabela 21: PK profil za FVIII169/VWF057 i FVIII169/VWF059 kod HemA miševa

[0331] Akutna efikasnost FVIII169/VWF059 je procenjena u modelu repne kopče HemA miša (opisanom u Primeru 9) u poređenju sa BDD-FVIII divljeg tipa. HemA miševi su tretirani sa 75 IU/kg bilo FVIII169/VWF059 ili BDD-FVIII, a zapremina gubitka krvi svakog eksperimentalnog miša je prikazana na Slici 13. U poređenju sa BDD-FVIII, FVIII169/VWF059 je pružio isti stepen zaštite miševima HemA (p= 0,9883), što ukazuje da je FVIII169/VWF059 potpuno funkcionalan in vivo.

Konstrukcija plazmida FVIII-XTEN-Fc/D'D3-Fc heterodimera

[0332]

VWF031 nukleotidna sekvenca (SEQ ID NO: 147)

)

u

u

pSYN-FVIII-161 sekvenca proteina (SEQ ID NO: 69) (FVIII sekvenca aminokiseline pozicija 1-1457; podvučena regija predstavlja Fc regiju; zakrivljena donja linija predstavlja cepajući linker između prvog Fc i VWF fragmenta; dvostruko podvučena regija predstavlja VWF fragment; podebljana regija predstavlja cepajući linker između VWF fragmenta i Fc).

Claims (26)

Patentni zahtevi

1. Himerni protein koji obuhvata

(i) prvi polipeptid koji obuhvata

a) protein FVIII ("FVIII"),

b) XTEN prvog polipeptida, i

c) prvi Fc region,

gde protein FVIII ima aktivnost FVIII; i

(ii) drugi polipeptid, koji obuhvata

a) fragment von Willebrand-ovog faktora ("VWF") koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 99% identična aminokiselinskoj sekvenci prikazanoj u aminokiselinama 764 do 1240 SEQ ID NO: 21, b) XTEN drugog polipeptida,

c) linker od 10 do 50 aminokiselina koji se može cepati i koji obuhvata a2 region FVIII koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu Glu720 do Arg740 FVIII koja odgovara SEQ ID NO: 65, pri čemu je a2 region sposoban da se cepa trombinom, i

d) drugi Fc region,

gde se VWF fragment vezuje za protein FVIII;

gde XTEN drugog polipeptida obuhvata aminokiselinsku sekvencu kako je prikazano u SEQ ID NO: 58;

gde XTEN prvog polipeptida obuhvata aminokiselinsku sekvencu kako je prikazano u SEQ ID NO: 8;

gde je prvi Fc region asociran sa drugim Fc regionom disulfidnom vezom; i gde je poluživot himernog proteina produžen u poređenju sa proteinom FVIII bez fragmenta VWF.

2. Himerni protein koji obuhvata

(i) prvi polipeptid koji obuhvata

a) protein FVIII ("FVIII"),

b) XTEN prvog polipeptida, i

c) prvi Fc region,

gde protein FVIII ima aktivnost FVIII; i

(ii) drugi polipeptid, koji obuhvata

a) fragment von Willebrand-ovog faktora ("VWF") koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 99% identična aminokiselinskoj sekvenci prikazanoj u aminokiselinama 764 do 1240 SEQ ID NO: 21, b) XTEN drugog polipeptida,

c) linker od 10 do 50 aminokiselina koji se može cepati i koji obuhvata a2 region FVIII koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu Glu720 do Arg740 FVIII koja odgovara SEQ ID NO: 65, pri čemu je a2 region sposoban da se cepa trombinom, i

d) drugi Fc region,

gde se VWF fragment vezuje za protein FVIII;

gde fragment VWF sadrži aminokiselinu različitu od cisteina supstituisanu za ostatak koji odgovara ostacima 1099 i 1142 iz SEQ ID NO: 21;

gde XTEN drugog polipeptida obuhvata aminokiselinsku sekvencu kako je prikazano u SEQ ID NO: 58;

gde XTEN prvog polipeptida obuhvata aminokiselinsku sekvencu kako je prikazano u SEQ ID NO: 8;

gde je prvi Fc region asociran sa drugim Fc regionom disulfidnom vezom; i pri čemu je poluživot himernog proteina produžen u poređenju sa proteinom FVIII bez fragmenta VWF.

3. Himerni protein prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu je protein FVIII izoforma dvolančanog FVIII.

4. Himerni protein prema zahtevu 3, pri čemu izoforma dvolančanog FVIII obuhvata prvi lanac koji se sastoji od teškog lanca FVIII i drugi lanac koji se sastoji od lakog lanca FVIII, pri čemu su teški lanac i laki lanac međusobno povezani metalnom vezom.

5. Himerni protein prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu je protein FVIII izoforma jednolančanog FVIII.

6. Himerni protein prema bilo kom od zahteva 1, 2 ili 5, pri čemu protein FVIII ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 99% identična aminokiselinama 1 do 1438 SEQ ID NO: 67, i pri čemu protein FVIII ima aktivnost zgrušavanja.

7. Himerni protein prema zahtevu 6, pri čemu je XTEN prvog polipeptida insertovan neposredno nizvodno od ostatka koji odgovara ostatku 745 SEQ ID NO: 67.

8. Himerni protein prema bilo kom od zahteva 1-7, pri čemu drugi polipeptid obuhvata D' domen i D3 domen VWF fuzionisan sa drugim Fc regionom od strane XTEN drugog polipeptida između njih,

gde XTEN sekvenca sadrži manje od 288 aminokiselinskih ostataka, i

gde je XTEN drugog polipeptida fuzionisan sa drugim Fc regionom putem linkera koji se može cepati.

9. Himerni protein prema zahtevu 2, pri čemu fragment VWF sadrži ostatak alanina supstituisan za ostatke koji odgovaraju ostacima 1099 i 1142 SEQ ID NO: 21.

10. Himerni protein prema bilo kom od zahteva 1-9, pri čemu su prvi Fc region i drugi Fc region identični.

11. Himerni protein prema zahtevu 10, pri čemu su prvi Fc region i drugi Fc region izvedeni iz humanog IgG1.

12. Himerni protein prema zahtevu 8, pri čemu fragment VWF dalje obuhvata D1 domen, D2 domen, ili D1 i D2 domene VWF.

13. Himerni protein prema zahtevu 12, gde:

(i) prvi polipeptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 70; i

(ii) drugi polipeptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 197.

14. Himerni protein prema zahtevu 13, gde:

(i) prvi polipeptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 70; i

(ii) drugi polipeptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 197.

15. Himerni protein prema bilo kom od zahteva 1-14, pri čemu se himerni protein može dobiti metodom izrade himernog proteina koji sadrži

a) transfekciju ćelije domaćina koja se sastoji od polinukleotida ili skupa polinukleotida koji kodiraju himerni protein, i

b) kultivisanje ćelije domaćina u hranljivoj podlozi pod uslovom pogodnim za ekspresiju himernog proteina, pri čemu je eksprimiran himerni protein,

gde polinukleotid ili skup polinukleotida obuhvata sekvencu nukleinskih kiselina prema SEQ ID NO:172 koja kodira za prvi polipeptid.

16. Himerni protein prema bilo kom od zahteva 1-15, pri čemu prvi polipeptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 173.

17. Himerni protein prema bilo kom od zahteva 1-11, pri čemu se VWF fragment sastoji od D' domena i D3 domena.

18. Polinukleotid ili skup polinukleotida koji kodiraju himerni protein prema bilo kom od zahteva 1 do 14 i 17.

19. Vektor ili skup vektora koji obuhvataju polinukleotid ili skup polinukleotida prema zahtevu 18 i jedan ili više promotora operativno povezanih sa polinukleotidom ili skupom polinukleotida.

20. Ćelija domaćina koja se sastoji od polinukleotida ili skupa polinukleotida prema zahtevu 18 ili vektora ili skupa vektora prema zahtevu 19.

21. Stabilna ćelijska linija koja se sastoji od ćelije domaćina prema zahtevu 20.

22. Farmaceutski sastav koji se sastoji od himernog proteina prema bilo kom od zahteva 1 do 11 i 15 do 17 i farmaceutski prihvatljivog nosioca.

23. Himerni protein prema bilo kom od zahteva 1 do 11 i 15 do 17 za upotrebu u tretiranju bolesti ili stanja krvarenja kod ispitanika kome je to potrebno.

24. Farmaceutski sastav prema zahtevu 22 za primenu u tretiranju bolesti ili stanja krvarenja kod ispitanika kome je to potrebno.

25. Himerni protein prema bilo kom od zahteva 1 do 11 i 15 do 17 za upotrebu u tretiranju hemofilije A kod ispitanika kome je to potrebno.

26. Farmaceutski sastav prema zahtevu 22 za primenu u tretmanu hemofilije A kod ispitanika kome je to potrebno.