SK14392002A3 - Modifikovaný faktor VIII a DNA, ktorá ho kóduje - Google Patents

Description

Predkladaný vynález sa týka oblasti krvnej koagulácie, najmä faktora VIII. Konkrétne sa vynález týka modifikovanej formy prasačieho faktora VIII, ktorému chýba doména B, DNA, ktorá kóduje túto formu a ich použitia v lekárstve.

Doterajší stav techniky

Koagulácia (zrážanie) krvi začína tým, že doštičky adherujú na plochu rezu v poranenej krvnej cieve v mieste lézie. Následne sa v kaskáde enzymaticky regulovaných reakcií premieňajú rozpustné molekuly fibrinogénu za účasti enzýmu trombínu na nerozpustné vlákna fibrínu, ktoré držia doštičky pohromade v trombe. V každom kroku tejto kaskády je proteínový prekurzor premieňaný na proteázu, ktorá štiepi nasledujúci proteínový prekurzor v rade. Vo väčšine krokov sú potrebné kofaktory.

Faktor VIII cirkuluje ako inaktívny prekurzor v krvi, tesne a nekovalentne viazaný na von Willebrandov faktor. Faktor VIII je proteolyticky aktivovaný trombínom alebo faktorom Xa, ktorý ho disociuje od von Willebrandovho faktora a aktivuje jeho prokoagulačnú funkciu v kaskáde. Vo svojej aktívnej forme je proteínový faktor VlIIa kofaktorom, ktorý zvyšuje katalytickú účinnosť faktora IXa na aktiváciu faktora X až o niekolko rádov.

Ľudia s deficienciami faktora VIII alebo protilátkami proti faktoru VIII, ktorí nie sú liečení faktorom VIII, trpia nekontrolovaným vnútorným krvácaním, ktoré môže spôsobovať rad vážnych symptómov, od zápalových reakcií v kĺboch až po predčasné úmrtie. Ťažkí hemofilici, ktorých je iba v USA približne 10 000, sa môžu liečiť infúziami ludského faktora VIII, ktorý obnoví normálnu koagulačnú schopnosť krvi, pokial je liečenie uskutočňované v dostatočnej frekvencii a koncentrácii. Klasická definícia faktora VIII je, že je to. látka prítomná v normálnej krvnej plazme, ktorá koriguje defekty koagulácie v plazme pochádzajúcej od jedincov s hemofíliou A.

Vytváranie protilátok (inhibítorov alebo inhibičných protilátok), ktoré inhibujú aktivitu faktora VIII, je vážnou komplikáciou pri liečení pacientov s hemofíliou. Autoprotilátky sa vyvíjajú približne u 20% pacientov s hemofíliou A v reakcii na terapeutickú infúziu faktora VIII. U pacientov s hemofíliou A, ktorí neboli predtým liečení, a- u ktorých sa vyvinuli inhibítory, sa zvyčajne inhibítor vyvinie v priebehu jedného roku liečenia. Navyše autoprotilátky, ktoré inaktivujú faktor VIII, sa príležitostne vyvíjajú aj u jedincov, ktorí mali aj predtým normálnu hladinu faktora VIII. Keď je titer inhibítorov dostatočne nízky, pacient sa môže liečiť zvyšujúcimi sa dávkami faktora VIII. Avšak často je titer inhibítora tak vysoký, že sa nemôže prekonať ani faktorom VIII. Alternatívnou stratégiou je preto obídenie potreby faktora VIII v priebehu normálnej homeostázy použitím komplexných prípravkov faktora IX (napríklad KONYNE®, Proplex®) alebo rekombinantného ludského faktora VlIIa. Navyše sa použil aj prípravok čiastočne purifikovaného prasačieho faktora VIII (HYATE:C®), pretože prasačí faktor VIII má zvyčajne podstatne nižšiu inhibičnú reaktivitu ako ľudský faktor VIII. Mnoho pacientov, u ktorých sa vyvinuli inhibičné protilátky na ľudský faktor VIII, sa úspešne liečilo prasačím faktorom VIII a toto liečenie bolo dlho tolerované. Avšak podávanie prasačieho faktora VIII nie je úplným riešením, pretože sa u niektorých pacientov po jednej alebo viacerých infúziách vyvinú protilátky na prasačí faktor VIII.

Niekoľko prípravkov ľudského, z plazmy pochádzajúceho faktora VIII s rôznym stupňom čistoty, je dostupných komerčne na liečenie hemofílie A. Patrí k nim tiež čiastočne purifikovaný faktor VIII pochádzajúci zo zlúčenej krvi mnohých darcov, ktorá bola protivírusovo ošetrená pôsobením tepla a detergentov, avšak obsahuje významnú hladinu antigénnych proteínov, faktor VIII purifikovaný pomocou monoklonálnych protilátok, ktorý má nižšiu hladinu antigénnych nečistôt a vírusovej kontaminácie a rekombinantný ludskýy faktor VIII, ktorý je zatial v štádiu klinických skúšok. Nanešťastie ľudský faktor VIII je nestabilný pri fyziologických koncentráciách a pH, je prítomný v krvi v mimoriadne nízkej koncentrácii (0,2 μς/ιηΐ plazmy) a má velmi nízku špecifickú koagulačnú aktivitu. Obavy v zdravotníctve, ktoré sa týkajú rizika vírusovej. infekcie alebo inej krvou prenášanej kontaminácie obmedzujú užitočnosť prasačieho faktora VIII purifikovaného z prasačej krvi.

Hemofilici vyžadujú denné dopĺňanie faktora VIII na prevenciu krvácania a v dôsledku toho vznikajúcej deformujúcej artropatie hemofilikov. Avšak prísun je nedostatočný a terapeutické použitie je problematické z dôvodu namáhavej izolácie, ’imunogenicity, a tiež nutnosti odstrániť riziko infekcií AIDS a hepatitídy. Ani použitie rekombinantného ľudského faktora VIII alebo čiastočne purifikovaného prasačieho faktora VIII nerieši všetky už skôr uvedené problémy.

Problémy spojené so všeobecne používaným, komerčne dostupným faktorom VIII, ktorý pochádza z plazmy, významne stimulovali záujem o vývoj lepšieho prípravku faktora VIII. Existuje potreba účinnejšieho faktora VIII, aby sa mohlo jednou molekulou podať viac jednotiek koagulačnej aktivity, stabilnejšieho faktora VIII, ktorého molekula je stabilná vo vybranom pH a fyziologickej koncentrácii, faktora VIII, ktorého molekula je menej náchylná k tomu, aby vyvolávala tvorbu inhibičných protilátok, a nakoniec faktora VIII, ktorého molekula unikne imunitnej detekcii (rozpoznaniu) v organizme pacienta, ktorý už získal protilátky na ľudský faktor VIII

Preto je cielom predkladaného vynálezu poskytnúť faktor VIII, ktorý lieči hemofíliu u pacienta s deficienciou faktora VIII alebo s inhibíciou ľudského faktora VIII.

Ďalším cielom predkladaného vynálezu je poskytnúť spôsoby liečenia hemofilikov.

Ešte ďalším cielom predkladaného vynálezu je poskytnúť faktor VIII, ktorý je stabilný pri vybranom pH a fyziologických koncentráciách.

Ešte ďalším cielom predkladaného vynálezu je poskytnúť faktor VIII, ktorý má väčšiu koagulačnú aktivitu ako ľudský faktor VIII.

A ešte ďalším cielom predkladaného vynálezu je poskytnúť faktor VIII, na ktorý sa bude tvoriť menej protilátok.

A ešte ďalším cielom vynálezu je poskytnúť spôsob výroby rekombinantného prasačieho faktora VIII a najmä špecificky modifikovaného prasačieho faktora VIII.

Podstata vynálezu

Určenie celej DNA sekvencie, kódujúcej prasačí faktor VIII, ktorá je uvedená v zozname sekvencií, umožnilo po prvýkrát syntézu úplného prasačieho faktora VIII použitím expresie DNA, ktorá kóduje prasačí faktor VIII vo vhodných hostiteľských bunkách. Purifikovaný rekombinantný prasačí faktor VIII je preto jedným aspektom predkladaného vynálezu. DNA, ktorá kóduje každú z domén prasačieho faktora VIII rovnako tak ako akýkoľvek jeho špecifický fragment, sa môžu obdobne exprimovať. Okrem toho prasačí faktor VIII (fVIII), ktorý má deletovanú (odstránenú) časť alebo celú doménu B (prasačí fVIII bez domény B) je poskytnutý ako súčasť predkladaného vynálezu, a to tým, že sa exprimuje DNA, ktorá kóduje prasačí fVIII, ktorý má deléciu jedného alebo viacerých kodónov v B doméne.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje farmaceutické kompozície a spôsoby liečenia pacientov, ktorí. trpia deficienciou faktora VIII, ktoré zahŕňajú podávanie rekombinantného prasačieho faktora VIII alebo modifikovaného rekombinantného prasačieho faktora VIII, najmä prasačieho faktora VIII, ktorému chýba doména B.

Podrobný opis vynálezu

Pokiaľ nie je uvedené inak, používaný termín faktor VIII označuje akúkoľvek funkčnú molekulu proteínu faktora VIII z akéhokoľvek cicavca.

Termín cicavčí faktor VIII, ako je používaný, zahŕňa faktor VIII, ktorého aminokyselinová sekvencia je odvodená z akéhokoľvek cicavca, okrem človeka, pokial nie je konkrétne uvedené inak. Termín zviera alebo živočích označuje napr. prasa a ďalšie cicavce s výnimkou človeka.

Termín fúzny proteín alebo fúzny faktor VIII alebo jeho fragment v predkladanom opise označuje produkt hybridného génu, kde kódujúca sekvencia jedného proteínu je zmenená, napríklad spojením s časťou kódujúcej sekvencie druhého proteínu z iného génu v správnom čítacom rámci, takže dochádza, k neprerušenej transkripcii a transiácii spojených segmentov, takže vzniká hybridný gén kódujúci fúzny proteín.

Zodpovedajúca nukleová kyselina alebo aminokyselina alebo ich sekvencia, tak ako sa tu používa, je prítomná v mieste molekuly faktora VIII alebo jej fragmentu, ktoré má rovnakú štruktúru a/alebo funkciu ako miesto molekuly faktora VIII iného biologického druhu, aj keď počet báz nukleových kyselín alebo aminokyselín nemusí byť identický. DNA sekvencia zodpovedajúca inej sekvencii faktora VIII v podstate zodpovedá takej sekvencii a hybridizuje s takto označenou sekvenciou za stringentných podmienok. DNA sekvencia zodpovedajúca inej sekvencii faktora VIII tiež zahŕňa sekvenciu, ktorá je výsledkom expresie faktora VIII alebo jeho fragmentu a hybridizovala by s označenou sekvenciou, ak by neexistovala redundancia genetického kódu.

Termín jedinečný aminokyselinový zvyšok alebo sekvencia označujú akýkoľvek aminokyselinový zvyšok alebo akúkoľvek sekvenciu v molekule faktora VIII. jedného biologického druhu, ktorá je odlišná od homologického zvyšku alebo sekvencie molekuly faktora VIII iného biologického druhu.

Termín špecifická aktivita ako sa používa, sa týka aktivity, ktorá napraví defekt koagulácie v ludskej plazme, ktorá je deficientna na faktor VIII. Špecifická aktivita sa meria v jednotkách aktivity zrážania na jeden miligram celkového proteínu faktora VIII v štandardnom teste, keď je koagulačný čas ludskej plazmy deficientny na faktor VIII porovnávaný s normálnou ľudskou plazmou. Jedna jednotka aktivity faktora VIII je aktivita prítomná v jednom mililitri normálnej ludskej plazmy. V tomto teste, čím kratší čas je potrebný na vytvorenie trombu, tým väčšia je aktivita testovaného faktora VIII. Prasačí faktor VIII prejavuje koagulačnú aktivitu v teste na ľudský faktor VIII.

Termín expresia sa týka súboru procesov, ku ktorým dochádza, keď sa používa genetická informácia na to, aby poskytla produkt. DNA, ktorá kóduje aminokyselinovú sekvenciu prasačieho faktora VIII sa môže exprimovať v cicavčej hostiteľskej bunke, aby sa získal proteín prasačieho faktora VIII. Materiály, genetické štruktúry, hostiteľské bunky a podmienky, ktoré umožňujú expresiu danej DNA sekvencie sú odborníkom dobre známe, a môžu sa upraviť tak, aby sa ovplyvnil čas a množstvo expresie, rovnako ako intra- alebo extracelulárna lokalizácia exprimovaného proteínu. Napríklad po vložení DNA, ktorá kóduje signálny peptid na 5' konci DNA kódujúcej prasačí faktor VIII (5' koniec je zvyčajne koniec DNA, ktorý kóduje NH₂ terminálnu časť proteínu), je exprimovaný proteín exportovaný z vnútra hostiteľskej bunky do kultivačného média. Vytvorenie kombinácie DNA, ktorá kóduje signálny peptid s DNA, ktorá kóduje prasačí faktor VIII je výhodné, pretože exprimovaný faktor VIII je exportovaný do kultivačného média, čo zjednodušuje proces purifikácie. Výhodný signálny peptid je signálny peptid cicavčieho faktora VIII.

ktorá definuje doménovú V molekule faktora VIII

Nukleotidové sekvencia cDNA ludského faktora VIII a predikovaná aminokyselinová sekvencia sú v zozname sekvencií uvedené ako sekvencia SEQ ID NO: 1 a 2, v uvedenom poradí. Faktor VIII sa syntetizuje ako približne 300 kDa jednoreťazcový proteín s vnútornou sekvenčnou homológiou, sekvenciu NH₂-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOH.

termín doména označuje súvislú sekvenciu aminokyselín, ktorá je definovaná internou aminokyselinovou sekvenčnou identitou a miestami proteolytického štiepenia trombínom. Pokial nie je uvedené inak, domény faktora VIII zahŕňajú nasledujúce aminokyselinové zvyšky, keď sa sekvencie priradia (align) k ľudskej aminokyselinovej sekvencii (sekvencia SEQ ID NO: 2) : Al, zvyšky Alal-Arg372; A2, zvyšky Ser373-Arg740; B, zvyšky Ser741-Argl648; A3, zvyšky Serl690-Ile2032; Cl, zvyšky Arg2033-Asn2172; C2, zvyšky Ser2173-Tyr2332. Sekvencia A3-C1-C2 zahŕňa zvyšky

Serl690-Tyr2332. Zostávajúci segment, ktorý zahŕňa zvyšky

Glul649-Argl689, je zvyčajne označovaný ako aktivačný peptid ľahkého reťazca faktora VIII. Faktor VIII je proteolyticky aktivovaný trombínom alebo faktorom Xa, ktorý ho disociuje od von Willebrandovho faktora, vytvára sa tak faktor VlIIa, ktorý má prokoagulačnú funkciu. Biologická funkcia faktora VlIIa je zvyšovanie katalytickej účinnosti faktora IXa voči aktivácii faktora X až o niekoľko rádov. Trombínom aktivovaný faktor VlIIa je 160 kDa veľký heterotrimér A1/A2/A3-C1-C2, ktorý vytvára komplex s faktorom IXa a faktorom X na povrchu doštičiek alebo monocytov. Čiastočná doména v texte označuje súvislú sekvenciu aminokyselín, ktorá tvorí časť domény.

Podjednotky ľudského alebo zvieracieho faktora VIII označujú ťažké a ľahké proteínové reťazce. Ťažký reťazec faktora VIII obsahuje tri domény, Al, A2 a B. Ľahký reťazec faktora VIII obsahuje tiež tri domény, a to A3, Cl· a C2.

Termíny epitop, antigénne miesto a antigénny determinant sú v texte používané ako synonymá, a sú definované ako časť ľudského alebo zvieracieho faktora VIII, alebo fragmenty, ktoré sú špecificky rozpoznávané protilátkou. Môže pozostávať z ľubovoľného počtu aminokyselinových zvyškov a môže závisieť od primárnej, sekundárnej alebo terciárnej štruktúry proteínu.

Termín imunogénne miesto je v texte definovaný ako úsek ľudského alebo zvieracieho faktora VIII, alebo jeho fragmentu, ktorý špecificky vyvoláva tvorbu protilátok proti faktoru VIII, alebo jeho fragment, u človeka alebo zvieraťa, ktorý je detegovaný rutinným postupom, ako je napr. imunotest, napr. ELISA alebo opísaný tzv. Bethesda test. Môže pozostávať z ľubovoľného počtu aminokyselinových zvyškov a môže závisieť od primárnej, sekundárnej alebo terciárnej štruktúry proteínu. V niektorých uskutočneniach hybridný alebo hybridný ekvivalentný faktor VIII alebo jeho fragment nie je imunogénny alebo je menej imunogénny u zvieraťa alebo človeka než ľudský alebo prasačí faktor VIII.

Deficiencia faktora VIII tak ako sa tu používa zahŕňa deficienciu koagulačnej aktivity spôsobenú tvorbou defektného faktora VIII, nedostatočnou alebo nulovou tvorbou faktora VIII, alebo čiastočnou alebo úplnou inhibíciou faktora VIII vplyvom inhibítorov. Hemofília A je typ deficiencie faktora VIII, ktorý je dôsledkom defektu na X-viazanom géne a absencie alebo deficiencie proteínu faktora VIII, ktorý gén kóduje.

Termín diagnostický test sa týka všetkých testov, ktoré nejakým spôsobom využívajú interakcie antigénu s protilátkou na detekciu a/alebo kvantifikáciu množstva sledovanej protilátky, ktorá je prítomná v testovanej vzorke, ako pomoc pri stanovení vhodnej terapie. Odborníkom je známy celý rad takých testov. Je zrejmé, že ľudská, prasačia alebo modifikovaná prasačia DNA faktora VIII alebo jej fragment a z nej exprimovaný proteín, celý alebo jeho časť, sa môžu využiť na nahradenie zodpovedajúcich reagencií v známych testoch, takže potom sa takto modifikovaný test môže použiť na detekciu a/alebo kvantifikáciu protilátok proti faktoru VIII. Je to práve použitie týchto reagencií, DNA faktora VIII alebo jej fragmentu alebo z nich exprimovaného proteínu, čo dovoľuje modifikovať známe testy, aby boli vhodné na detekciu protilátok proti ľudskému alebo zvieraciemu faktoru VIII. K takýmto testom patria, bez toho aby bol zoznam obmedzujúci, ELISA testy, imunodifúzne testy a imunoprenosové testy (imunobloty). Vhodné postupy na realizáciu týchto testov sú odborníkom dobre známe. Faktor VIII alebo jeho fragment, ktorý obsahuje aspoň jeden epitop proteínu, sa môže použiť ako diagnostická reagencia. Medzi príklady ďalších testov, kde sa môže využiť ludský, prasačí alebo modifikovaný prasačí faktor VIII lebo jeho fragment, je Bethesda test a antikoagulačný test.

Termín DNA kódujúca proteín, ako prasačí faktor VIII znamená polydeoxynukleovú kyselinu, ktorej nukleotidová sekvencia predstavuje kódujúcu informáciu pre hostiteľskú bunku na expresiu aminokyselinovéj sekvencie proteínu, teda napr. prasačieho faktora VIII, v súlade so známymi vzťahmi genetického kódu.

Termín „expresný produkt DNA, ktorý kóduje ľudský alebo zvierací faktor VIII alebo modifikovaný faktor .VIII je produkt získaný expresiou príslušnej DNA vo vhodnej hostiteľskej bunke, pričom expresia zahŕňa také pre- alebo posttranslačné modifikácie proteínu kódovaného príslušnou DNA, ako je, bez toho aby bol zoznam obmedzujúci, glykozylácía, proteolytické štiepenie a pod. Odborníkovi je známe, že k takýmto modifikáciám dochádza a môžu sa mierne líšiť v závislosti od typu hostiteľskej bunky a ďalších faktorov a v ich dôsledku dochádza k vzniku molekulárnych izoforiem produktu, ktorý si však uchováva prokoagulačnú aktivitu. Pozri napr. publikácie Lind, P. et al., Eur. J. Biochem, 232:1927 (1995), zahrnutá formou odkazu.

Termín „expresný vektor označuje DNA element, často s kruhovou štruktúrou, ktorý má schopnosť autonómne sa replikovať v požadovanej hostiteľskej bunke alebo sa integrovať do genómu hostiteľskej bunky a má tiež určité, odborníkom dobre známe, rysy, ktoré umožňujú expresiu kódujúcej DNA, ktorá sa vložila do sekvencie vektora vo vhodnom mieste a vo vhodnej orientácii. Medzi tieto rysy patrí, avšak bez obmedzenia, prítomnosť promótorovej sekvencie na riadenie iniciácie transkripcie kódujúcej DNA a tiež ďalšie DNA elementy ako sú napr. enhancery, polyadenylačné miesta a pod., všetko odborníkom dobre známe. Termín „expresný vektor sa používa na označenie ako vektorov, ktoré majú DNA kódujúcu sekvenciu, ktorá sa má exprimovať, vloženú do svojej sekvencie, tak aj vektorov, ktoré majú potrebné elementy na kontrolu expresie vzhladom na miesto inzercie usporiadané tak, že môžu slúžiť na expresiu akejkoľvek sekvencie DNA, ktorá je vložená do tohto miesta inzercie, všetko v odbore dobre známe. Tak napríklad vektor, ktorý postráda promótor sa môže stať expresným vektorom tak, že sa do neho vloží promótor kombinovaný s kódujúcou DNA.

Všeobecný opis metód

Patent USA č. 5,364,771 opísal objav molekuly hybridného ľudského/prasačieho faktora VIII, ktorá mala koagulačnú aktivitu, v ktorej boli elementy molekuly faktora VIII iných biologických druhov nahradené zodpovedajúcimi elementmi ľudského alebo prasačieho faktora VIII. Patent USA č. 5,663,060 opisuje prokoagulačné hybridné ľudské/zvieracie a hybridné ekvivalentné molekuly faktora VIII, kde elementy v molekule faktora VIII jedného biologického druhu boli nahradené elementmi molekuly faktora VIII iného biologického druhu.

Pretože súčasné informácie naznačujú, že B doména nemá žiadny inhibičný epitop a nemá žiadny známy účinok na funkciu faktora VIII, v niektorých uskutočneniach vynálezu je B doména, celá alebo aspoň jej časť, deletovaná v aktívnej hybridnej molekule alebo hybridnej ekvivalentnej molekule faktora VIII alebo jej fragmentoch („B(-) faktor VIII), pripravených ktoroukolvek z opísaných metód.

Gén pre ľudský faktor VIII sa izoloval· a exprimoval v cicavčích bunkách ako publikovali Toole, J. J. et al. (1984) Náture 312:342-347 (Genetics Inštitúte); Gitschier, J. et al. (1984) Náture 312:326-330 (Genetech); Wood, W.I. et al. (1984) Náture 312:330-337 (Genetech); Vehar, G. A. et al. (1984) Náture 312:337-342 (Genetech); WO 87/04187; WO 88/08035; WO 88/03558; Patent USA č. 4,757,006 a aminokyselinová sekvencia sa dedukovala z cDNA. Patent USA č. 4,965,199 (Capon et al.) odhaluje metódu rekombinantnej DNA na prípravu faktora VIII v cicavčích hostiteľských bunkách a purifikáciu ľudského faktora VIII. Opísala sa tiež expresia ľudského faktora VIII v bunkách CHO (ovárium čínskeho škrečka, Chinese hamster ovary) a bunkách BHKC (obličkové bunky novorodených škrečkov, baby hamster kidney cells). Ľudský faktor VIII sa modifikoval tým, že sa odstránila B doména, buď celá alebo jej časť (Patent USA č. 4,868,112) a vyskúšalo sa nahradenie B domény ľudského faktora VIII B domé12 nou ľudského faktora V (Patent USA č. 5,004,803). cDNA sekvencia, ktorá kóduje ľudský faktor VIII a predikovaná aminokyselinová sekvencia sú uvedené v zozname sekvencií ako sekvencia SEQ s

ID NO: la sekvencia SEQ ID NO: 2, v uvedenom poradí. V sekvencii SEQ ID NO: 1 začína kódujúci úsek nukleotidom v polohe 208, pričom triplet GCC je kodónom pre aminokyselinu číslo 1 (Ala) zrelého proteínu, ktorý je uvedený ako sekvencia SEQ ID NO: 2.

Prasačí faktor VIII sa izoloval z plazmy (Fass, D.N. et al. (1982) Blood 59:594). Čiastočná aminokyselinová sekvencia prasačieho faktora VIII zodpovedajúca úsekom N-konca ľahkého reťazca, ktorá má homológiu s ceruloplazmínom a koagulačným faktorom V je opísaná v publikácii Church et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6934. Toole, J.J. et al. (1984) Náture 312:342-347 opísal čiastočné sekvenovanie N-koncovej časti štyroch aminokyselinových fragmentov prasačieho faktora VIII, avšak necharakterizoval fragmenty vzhladom na ich pozíciu v molekule faktora VIII. Aminokyselinová sekvencia B domény a časti A2 domény prasačieho faktora VIII sú opísané v publikácii Toole, J.J. et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 81:5939-5942. cDNA sekvencia kódujúca úplnú A2 doménu prasačieho faktora VIII a predikovaná aminokyselinová sekvencia a tiež hybridný ľudský/prasačí faktor VIII, ktorý má substitúciu všetkých domén, všetkých podjednotiek a špecifických aminokyselinových sekvencií, sú opísané v patente USA č. 5,364,771 nazvanom „Hybridný/prasačí faktor VIII, ktorý bol udelený 15 novembra 1994 a tiež v medzinárodnej prihláške 93/20093 zverejnenej 14. apríla 1993. cDNA sekvencia, ktorá kóduje A2 doménu prasačieho faktora VIII, zodpovedajúca zvyškom 373-740 zrelého ludského faktora VIII, ako je uvedené v sekvencii SEQ ID NO: la predikovaná aminokyselinová sekvencia sú uvedené ako sekvencie SEQ ID NO: 3 a 4. Nedávno nukleotidová sekvencia a zodpovedajúca aminokyselinová sekvencia časti Al domény, ktorej chýba prvých 198 aminokyselín a A2 domény prasačieho faktora VIII boli opísané v medzinárodnej prihláške

WO 94/11503 zverejnenej 26. mája 1994. Celá nukleotidová sekvencia, ktorá kóduje prasačí faktor VIII, vrátane úplnej Al domény, aktivačného peptidu, domén A3, Cl a C2 a tiež kódovaná aminokyselinová sekvencia, sa nakoniec získali a opísali Lollarom v patente USA č. 5,859,204, udelenom 12. januára 1999 a tiež v medzinárodnej prihláške WO 97/49725, zverejnenej 31. decembra 1997, pričom obe publikácie sú zahrnuté formou odkazu.

Ako prasačí tak aj ludský faktor VIII sa izoloval z plazmy ako proteín zložený z dvoch podjednotiek. Podjednotky, známe ako ťažký reťazec a lahký reťazec, držia pohromade nekovalentnou väzbou, ktorá vyžaduje kalcium alebo iný divalentý kovový ión. Ťažký reťazec faktora VIII obsahuje tri domény Al, A2 a B, ktoré sú spojené kovalentne. Ľahký reťazec faktora VIII tiež obsahuje tri domény, označené A3, Cl a C2. B doména nemá žiadnu známu biologickú funkciu a teda sa môže odstrániť, celá alebo jej časť, z molekuly proteolyticky alebo metódami rekombinantnej DNA, bez toho, aby sa významne zmenil akýkoľvek meratelný parameter faktora VIII. Ľudský rekombinantný faktor VIII má podobnú štruktúru a funkciu ako faktor VIII, ktorý pochádza z plazmy, aj keď nie je glykozylovaný, pokial nie je exprimovaný v cicavčích bunkách.

Ako ludský tak aj prasačí aktivovaný faktor VIII („faktor VlIIa) má tri podjednotky a to vďaka štiepeniu ťažkého reťazca medzi doménami Al a A2. Táto štruktúra je označená ako A1/A2/A3-C1-C2. Ľudský faktor VlIIa nie je stabilný v podmienkach, ktoré stabilizujú prasačí faktor VlIIa, pravdepodobne preto, že je slabšia asociácia A2 podjednotky ľudského faktora VlIIa. Disociácia A2 podjednotky ľudského a prasaČieho faktora VlIIa je spojená so stratou aktivity molekuly faktora VlIIa. Yakhyaev, A. et al. (1997) Blood 90: Suppl. 1, Abstract #126) opísali väzbu A2 domény pomocou proteínu príbuzného receptoru lipoproteínu s nízkou hustotou (low density lipoproteín receptor-related protein), čo vedie k domnienke, že bunkový príjem A2 sprostred14 kovaný takouto väzbou pôsobí na down-reguláciu aktivity faktora

VIII.

Expresia „faktora VIII, ktorý nemá B doménu je zosilovaná vložením časti B domény. Vloženie časti B domény označenej „SQ viedlo, ako je publikované (Lind, P. et al. (1995) supra), k priaznivej expresii. „SQ konštrukty nemajú celú ľudskú B doménu s výnimkou 5 aminokyselín N-konca B domény a 9 aminokyselín C-konca B domény.

Purifikovaný hybridný faktor VIII alebo jeho fragment sa preto môžu testovať na imunoreaktivitu a koagulačnú aktivitu v štandardných testoch, ku ktorým patrí napríklad test s plazmou bez faktora VIII, jednofázový koagulačný test a ELISA test využitím purifikovaného rekombinantného ludského faktora VIII ako štandardu.

Ďalšie vektory, ktoré zahŕňajú ako plazmidy, tak aj eukaryotické vírusové vektory sa môžu využiť na expresiu rekominantného génového konštruktu v eukaryotických bunkách v závislosti od požiadaviek a posúdenia odborníka (pozri napr. Sambrook et al., kapitola 16) . Medzi ďalšie vektory a expresné systémy, ktoré sa môžu použiť patria tiež bakteriálne, kvasinkové systémy a systém buniek hmyzu, ale nie sú výhodné lebo poskytujú 'odlišnú glykozyláciu alebo ju vôbec nemajú.

Proteín rekombinantného faktora VIII sa môže exprimovať v celom rade rôznych buniek všeobecne používaných na kultiváciu a expresiu rekombinantných cicavčích proteínov. Najmä sa našiel rad vhodných bunkových línií hlodavcov, ktoré sú zvlášť užitočnými hostiteľskými systémami na expresiu veľkých proteínov.

Výhodné bunkové línie, ktoré sa môžu získať z Americkej zbierky mikroorganizmov (American Type Culture Collection, Rockville, MD) sú predovšetkým obličkové bunky novorodených škrečkov (BHK) a bunky ovárií čínskeho škrečka (CHO), ktoré sa kultivujú rutinným spôsobom v známych kultivačných médiách.

Základnou príčinou vyššej koagulačnej aktivity prasačieho faktora VIII je ako sa zdá rýchlejšia spontánna disociácia ľudskej A2 podjednotky od ľudského faktora VlIIa než prasačej A2 podjednotky od prasačieho faktora VlIIa. Disociácia A2 podjednotky vedie k strate aktivity (Lollar, P. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:1688-1692; Lollar, P. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:23652-23657; Fay, P. J. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:13246-13250).

Molekuly faktora VIII so zníženou imunoreaktivitou

Epitopy, ktoré sú imunoreaktívne s protilátkami, ktoré inhibujú koagulačnú aktivitu faktora VIII („inhibítory alebo „inhibičné protilátky), boli charakterizované na základe známych vzťahov štruktúra-funkcia faktora VIII. Inhibítory najskôr pôsobia tým, že porušia niektorú z makromolekulárnych interakcií spojených s doménovou štruktúrou faktora VIII alebo s jeho naviazaním na von Willebrandov faktor, trombín, faktor Xa, faktor IXa alebo faktor X. Avšak väčšina inhibičných protilátok na ludský faktor VIII pôsobí tým, že sa naviaže na epitopy lokalizované na 40 kDa A2 doméne alebo 20 kDa C2 doméne faktora VIII a tým narušia špecifické funkcie spojené s týmito doménami, ako to predpokladali Fulcher et al. (1985 Proc. Natl. Acad. Sci USA 82:7728-7732; a Scandella et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85:6152-6156. Navyše k A2 a C2 epitopom môže patriť ešte tretí epitop v A3 alebo Cl doméne ľahkého reťazca faktora VIII, podlá publikácie Scandella et al. (1993) Blood 82:1767-1775. Význam predpokladaného tretieho epitopu je neznámy, ale mohol by byť zodpovedný za malú frakciu epitopovej reaktivity faktora VIII.

Anti-A2 protilátky blokujú aktiváciu faktora X, ako ukázali Lollar et al. (1994) J. Clin. Invest. 93:2497-2504. Predchádza16 júce mapovacie štúdie delečnej mutagenézy, opísané v Ware et al. (1992) Blood Coagul. Fibrinolysis 3:703-716, lokalizovali A2 epitop do 20 kDa úseku NH₂ koncového úseku 40 kDa A2 domény. Kompetitívne imunorádiometrické testy ukázali, že A2 inhibítory rozpoznávajú buď spoločný epitop alebo tesne zluknuté (clustered) epitopy, ako opísali Scandella et al. (1992) Throm. Haemostas 67:665-671, a ako je ukázané v patente USA č. 5,859,204.

Zvieracie alebo modifikované zvieracie molekuly faktora VIII sa môžu testovať u ludí na zníženú antigenicitu a/alebo imunogenicitu v príslušných klinických skúškach. V jednom type klinických skúšok, navrhnutých na zistenie toho, či je faktor VIII imunoreaktívny s inhibičnými protilátkami sa faktor VIII podáva, výhodne intravenózne infúziou, približne 25 pacientom, ktorí trpia deficienciou faktora VIII a majú protilátky, ktoré inhibujú koagulačnú aktivitu terapeutického ľudského faktora VIII. Dávky zvieracieho alebo modifikovaného zvieracieho faktora VIII sú v rozmedzí 5 až 50 jednotiek/kg telesnej hmotnosti, výhodne 10 až 50 jednotiek/kg telesnej hmotnosti a najvýhodnejšie 40 jednotiek/kg telesnej hmotnosti. Približne 1 hodinu po každom podaní je nové obnovenie faktora VIII vo vzorkách krvi merané jednofázovým koagulačným testom. Vzorky sa odoberajú približne 5 hodín po infúzii a meria sa obnovenie. Celková hladina a rýchlosť vymiznutia faktora VIII zo vzoriek slúži na predpoveď titra protilátky a inhibičnej aktivity. Ak je titer protilátky vysoký, obnovenie hladiny faktora VIII sa nemôže merať. Výsledky meraní sa porovnávajú s výsledkami získanými od pacientov, ktorí boli liečení ľudským faktorom VIII pochádzajúcim z plazmy, prasačím faktorom vili alebo inou všeobecne používanou terapeutickou formou faktora VIII alebo substituenta faktora VIII.

Po identifikácii klinicky významných epitopov sa môžu exprimovať také rekombinantné molekuly faktora VIII, ktoré vykazujú menšiu alebo rovnakú skríženú reaktivitu v porovnaní s prasačím faktorom VIII pochádzajúcim z plazmy, keď sú testované in vitro oproti celému spektru plazmy s inhibítormi. Dodatočná mutagenéza v úsekoch epitopov sa môže uskutočniť s cielom redukovať skríženú reaktivitu. Znížená reaktivita, pretože je žiaduca, nie je nevyhnutná na prípravu výsledného produktu, ktorý aj tak môže mať výhody v porovnaní s existujúcimi koncentrátmi prasačieho faktora VIII získaného z plazmy, ktoré majú rad nežiaducich vedlajších príznakov v dôsledku kontaminácie prasačími proteínmi alebo kontaminácie infekčnými agens ako sú vírusy alebo prióny. Rekombinantný prasačí alebo modifikovaný prasačí faktor VIII neobsahuje cudzorodé prasačie proteíny.

Diagnostické testy cDNA faktora VIII a/alebo proteín z nej exprimovaný, buď z celej alebo z jej časti, sa môžu použiť v testoch ako diagnostické reagencie na detekciu inhibičných protilátok proti ľudskému alebo zvieraciemu faktoru VIII alebo modifikovanému zvieraciemu faktoru VIII v substrátoch, ku ktorým patria napr. vzorky séra a telesných tekutín pacientov s deficienciou faktora VIII. Medzi takého protilátkové testy patria najmä ELISA testy, imunobloty, rádioimunotesty, imunodifúzne testy a testy biologickej aktivity faktora VIII (napr. koagulačný test). Techniky na prípravu týchto reagencií a metódy ich použitia sú odborníkom dobre známe. Tak napríklad imunotest na detekciu inhibičných protilátok vo vzorke séra pacienta môže zahŕňať kroky, keď sa nechá reagovať testovaná vzorka s dostatočným množstvom testovaného faktora VIII a keď sa vytvorí s inhibičnými protilátkami detegovatelný komplex, potom testovaný faktor VIII je skutočne antigénny.

Sondy nukleových kyselín a aminokyselín sa môžu pripraviť na základe sekvencií cDNA hybridného faktora VIII alebo proteínu alebo ich fragmentov. V niektorých uskutočneniach vynálezu sa môžu tieto sondy označiť, buď použitím farbiva alebo enzymaticky, fluorescenčnými, chemiluminiscenčnými alebo rádioaktívnymi značkami, ktoré sú komerčne dostupné. Aminokyselinové sondy sa môžu použiť na skríning napríklad séra alebo iných telesných tekutín podozrivých z prítomností inhibítorov ludského, zvieracieho alebo hybridného ľudského/zvieracieho faktora VIII. Hladiny inhibítorov sa môžu kvantifikovať u pacientov a porovnávať so zdravými kontrolami a môžu sa použiť napríklad na stanovenie, či sa pacient s deficienciou faktora VIII môže liečiť zvieracím alebo modifikovaným zvieracím faktorom VIII. cDNA sondy sa môžu použiť napríklad vo výskume na skríning DNA knižníc.

Farmaceutické kompozície

Farmaceutické kompozície, ktoré obsahujú rekombinantný prasačí alebo modifikovaný prasačí faktor VIII, samotný alebo v kombinácii s vhodnými farmaceutickými stabilizujúcimi látkami, nosičmi alebo prostriedkami na podávanie (vehikulá), sa pripravujú metódami, ktoré sú odborníkom známe, napr. ako sú opísané v príručke Remington's Pharmaceutical Science (E. W. Martin).

V jednom výhodnom uskutočnení sú vhodnými nosičmi alebo prostriedkami na podávanie intravenóznou infúziou fyziologický roztok soli alebo roztok soli pufrovaný fosfátom.

V inom výhodnom uskutočnení sú vhodným stabilizátorom, nosičom alebo prostriedkom na podávanie, ale 'bez obmedzenia, ľudské alebo zvieracie proteíny ako je napr. albumín.

Fosfolipidové vezikuly alebo lipozómové suspenzie sú tiež výhodnými farmaceutický prijateľnými nosičmi alebo prostriedkami na podávanie. Môžu sa pripraviť štandardnými postupmi, ktoré sú odborníkom známe a obsahujú napríklad fosfatidylserín/fosfatidylcholín alebo iné kompozície fosfolipidov alebo detergentov, ktoré spoločne vytvárajú negatívny náboj na povrchu, pretože faktor VIII sa viaže na negatívne nabité fosfolipidové membrány. Lipozómy sa môžu pripraviť rozpustením vhodných lipidov (ako je napr. stearoylfosfatidyletanolamín, stearoylfosfatidylcholín, arachadoylfosfatidylcholín a cholesterol) v anorganickom rozpúšťadle, ktoré sa nechá odpariť a na povrchu použitej nádoby zostane tenký film vyschnutého lipidu. Do nádoby sa potom vnesie vodný roztok hybridného faktora VIII. Nádobou sa potom krúži, aby sa uvoľnil lipidový materiál zo stien nádoby a lipidové agregáty dispergovali, čím sa vytvorí lipozómová suspenzia.

Rekombinantný prasačí alebo modifikovaný prasačí faktor VIII sa môžu kombinovať s ďalšími vhodnými stabilizujúcimi zlúčeninami, prostriedkami na podávanie a/alebo nosičmi, vrátane koagulačných faktorov závislých od vitamínu K, tkanivových faktorov a von Willebrandovho faktora (vWf) alebo fragmentu vWf, ktorý obsahuje väzbové miesto pre faktor VIII a polysacharidov ako je napr. sacharóza.

Rekombinantný prasačí alebo modifikovaný prasačí faktor VIII sa môže tiež podávať metódami génovej terapie rovnakým spôsobom, ako sa podáva ľudský faktor VIII a to použitím retrovírusových vektorov. Táto metóda spočíva v tom, že sa konštrukt s požadovanou cDNA faktora VIII vnesie do ľudských buniek, ktoré sú potom priamo transplantované pacientovi s deficienciou faktora VIII alebo sú vložené do implantovaného zariadenia, ktoré je priepustné pre molekuly faktora VIII avšak nepriepustné pre bunky, a toto zariadenie je potom transplantované. Vhodným spôsobom je prenos génu sprostredkovaný retrovírusovým vektorom. Pri tomto spôsobe je exogénny gén (napr. faktor VIII cDNA) klonovaný do genómu modifikovaného retrovírusu. Gén sa potom-vloží do genómu hostiteľskej bunky prostredníctvom vírusového mechanizmu, kde je potom bunkou exprimovaný. Retrovírusový vektor je modifikovaný tak, že neprodukuje vírus, čo zabraňuje vírusovej infekcii hostiteľa. Všeobecné princípy génovej terapie sú odborníkom známe a boli publikované v odbornej literatúre (napr. Kohn, D. B. et al. (1989) Transfusion 29:812-820).

Prasačí alebo modifikovaný prasačí faktor VIII sa môže ucho20 vávať naviazaný na vWf, čo zvyšuje polčas a tiež čas uskladnenia hybridnej molekuly. Navyše lyofilizáciou faktora VIII sa môže zlepšiť výťažok aktívnych molekúl v prítomnosti vWf. Súčasné metódy uchovávania (uskladnenia) ľudského a zvieracieho faktora VIII používané komerčnými dodávateľmi, sa môžu využiť tiež na uchovanie rekombinantného faktora VIII. Tieto metódy zahŕňajú: (1) lyofilizáciu faktora VIII v čiastočne purifikovanom stave (ako je „koncentrát faktora VIII, ktorý sa môže použiť na infúziu bez ďalšej purifikácie) (2) imunoafinitnú purifikáciu faktora VIII Zimmermanovou metódou a lyofilizáciou v prítomnosti albumínu, ktorý stabilizuje faktor VIII; (3) lyofilizáciu rekombinantného faktora VIII v prítomnosti albumínu.

Navyše sa zistilo, že prasačí alebo modifikovaný prasačí faktor VIII je prakticky nekonečne stabilný pri 4°C v 0,6 M NaCI, 20 mM MES a 5 mM CaCl₂ a pri pH 6,0 a môže sa tiež uchovávať zamrazený v takýchto pufroch, pričom po rozmrazení prejavuje minimálnu stratu aktivity.

Liečenie

Rekombinantný prasačí alebo modifikovaný prasačí faktor VIII sa používajú na liečenie spontánneho krvácania spôsobeného deficienciou faktora VIII (napr. intraartikulárn.a, intrakraniálna alebo gastrointestinálna hemorágia) u hemofilikov s alebo bez inhibičných protilátok, a tiež u pacientov so získanou deficienciou faktora VIII spôsobenou rozvojom inhibičných protilátok. Účinné látky sa podávanú výhodne intravenózne.

Navyše sa môže rekombinantný prasačí alebo modifikovaný prasačí faktor VIII podávať transplantáciou buniek, ktoré sa geneticky modifikovali tak, aby produkovali tento proteín alebo implantáciou zariadenia, ktoré obsahuje také modifikované bunky, ako už bolo opísané.

Vo výhodnom uskutočnení farmaceutické kompozície obsahujú rekombinantný prasačí alebo modifikovaný prasačí faktor VIII, samotný alebo v kombinácii so stabilizátormi, prostriedkami na prenos (doručenie) a/alebo nosičmi, sú podávané pacientom intravenózne infúziou, teda rovnako ako sa podávajú prípravky ľudského alebo zvieracieho faktora VIII.

Liečebné dávky kompozície rekombinantného prasačieho alebo modifikovaného prasačieho faktora VIII, ktoré je potrebné podávať pacientom, ktorí takéto liečenie potrebujú, sa velmi líšia v závislosti od závažnosti deficiencie faktora VIII. Všeobecne sa dávky, ich frekvencia, trvanie a počet jednotiek, určia tak, aby zodpovedali závažnosti a trvaniu krvácavých periód u každého pacienta. Teda faktor VIII sa vmieša do farmaceutický prijateľného nosiča, vehikulá alebo stabilizátora v takom množstve, ktoré je postačujúce na to, aby sa pacientovi podalo terapeuticky účinné množstvo proteínu, ktoré zastaví krvácanie, čo sa meria pomocou štandardných koagulačných testov.

Faktor VIII je klasicky definovaný ako taká látka prítomná v normálnej krvnej plazme, ktorá koriguje defekty koagulácie v plazme pochádzajúce od jedincov s hemofíliou A. Koagulačná aktivita in vitro purifikovanej a čiastočne purifikovanej formy faktora VIII sa používa na vypočítanie dávky faktora VIII pre infúzie ľudským pacientom a je spoľahlivým indikátorom aktivity získanej z plazmy pacienta a korekcie in vivo krvácavých porúch. Doteraz neboli opísané žiadne nezhody medzi štandardným testom nových molekúl faktora VIII in vitro a ich správaním na infúznom modeli psa alebo u ľudských pacientov, podía Lusher, J. M. et al. 328 New Engl. J. Med. 328:453-459;· Pittman, D.D. et al. (1992) Blood 79:389-397; a Brinkhous et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:8752-8755.

Zvyčajne požadovaná plazmatická hladina aktivity faktora VIII, ktorá sa má dosiahnuť u pacientov podávaním rekombinantného prasačieho alebo modifikovaného prasačieho faktora VIII je v rozmedzí 30 až 100% normálnych hodnôt. Pri výhodnom spôsobe podávania terapeutického faktora VIII je kompozícia podávaná intravenózne vo výhodných dávkach v rozsahu 5 až 50 jednotiek/kg telesnej hmotnosti, výhodnejšie 10 až 50 jednotiek/kg telesnej hmotnosti a najvýhodnejšie v rozsahu 20 až 40 jednotiek/kg telesnej hmotnosti, v intervale frekvencie 8 až 24 hodín (u pacientov s ťažkou hemofíliou) a trvania liečenia v rozsahu 1 až 10 dní alebo do zastavenia krvácania, (pozri napr. Roberts, H. R., a M. R. Jones, „Hemophiiia and Reiated Conditions-Congenital Deficiencies of Prothrombin (Factor II, Factor V, and Factors

VII to XII), „Ch. 153, 1453-1474, 1460, in Hematology, Williams, W. J., et al. ed. (1990)). Pacienti s inhibítormi môžu vyžadovať odlišné množstvá rekombinantného alebo modifikovaného prasačieho faktora VIII, ktoré dostávali. Napríklad pacient môže vyžadovať menej rekombinantného alebo modifikovaného prasačieho faktora VIII, pretože má vyššiu špecifickú aktivitu ako ludský faktor

VIII a zníženú protilátkovú reaktivitu. Rovnako ako pri liečení ludským alebo z plazmy získaným prasačím faktorom VIII, množstvo terapeutického faktora VIII podávané infúziou je definované jednofázovým koagulačným testom faktora VIII a vo vybratých prípadoch, in vivo opäť dosiahnutá hladina sa meria stanovením faktora VIII v plazme pacientov po infúzii. Je však potrebné pochopiť, že pre akéhokoľvek konkrétneho jedinca by sa mal prispôsobiť dávkovací režim podía jeho individuálnej potreby a na základe úsudku odborníka, ktorý podáva alebo dohliada na podávanie kompozícií a teda dávky a uvedené koncentrácie sú iba príklady a nijako neobmedzujú rozsah predkladaného vynálezu.

Liečenie môže mať podobu jediného intravenózneho podania kompozície alebo periodického alebo súvislého podávania po dlhší čas, podía toho, ako je to potrebné. Alternatívne sa môže terapeutický faktor VIII podávať subkutánne alebo perorálne s lipozómami v jednej alebo niekolkých dávkach v rôznych časových intervaloch.

Rekombinantný prasačí alebo modifikovaný prasačí faktor VIII sa môže tiež použiť na liečenie nekontrolovaného krvácania spôsobeného deficienciou faktora VIII u hemofilikov, u ktorých sa vyvinuli protilátky proti ľudskému faktoru VIII. V takomto prípade nie je nutná koagulačná aktivita, ktorá je vyššia než aktivita samotného ľudského alebo zvieracieho faktora VIII. Koagulačná aktivita, ktorá je nižšia než aktivita ľudského faktora VIII (t.j. napr. nižšia než 3000 jednotiek/mg) je užitočná, ak táto aktivita nie je neutralizovaná protilátkami v plazme pacientov.

Demonštrovalo sa, že rekombinantný prasačí a modifikovaný prasačí faktor VIII sa môžu líšiť v špecifickej aktivite od ľudského faktora VIII. Proteíny faktora VIII, ktoré majú vyššiu prokoagulačnú aktivitu než ľudský faktor VIII . sú užitočné na liečenie hemofílie, pretože sú potrebné nižšie dávky, aby sa korigovala deficiencia faktora VIII u pacientov. Faktor VIII, ktorý má nižšiu prokoagulačnú aktivitu než ľudský faktor VIII je tiež vhodný na terapeutické použitie za predpokladu, že má aspoň 1% špecifickej aktivity v porovnaní s normálnym ľudským faktorom VIII. Faktor VIII podľa predkladaného vynálezu, ktorý má prokoagulačnú aktivitu je teda definovaný ako faktor, ktorý má aspoň 1% špecifickej aktivity ľudského faktora VIII.

Molekula rekombinantného prasačieho alebo modifikovaného prasačieho faktora VIII a spôsoby jej izolácie, .charakterizácie, prípravy a použitia, všeobecne opísané, budú podrobnejšie vysvetlené pomocou príkladov, ktoré sú opísané ďalej.

Prehlad obrázkov na výkresoch

Obrázky 1A-1H spolu poskytujú porovnania priradených sekvencií nukleovej kyseliny ľudského, prasačieho a myšieho faktora VIII.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Test prasačieho faktora VIII a hybridného ludského/prasačieho faktora VIII

Prasačí faktor VIII má vyššiu koagulačnú aktivitu než ludský faktor VIII, pokial ide o špecifickú aktivitu molekuly. Tento záver je založený na použití vhodných štandardných kriviek, ktoré umožňujú uskutočniť správne porovnanie ľudského a prasačieho faktora VIII. Koagulačné testy sú založené na schopnosti faktora VIII skracovať koagulačný čas plazmy, ktorá pochádza od pacientov s hemofíliou A. Použili sa dva typy testov: jednofázový a dvojfázový test.

V jednofázovom teste sa 0,1 ml plazmy s hemofíliou A (George King Biomedical, Inc.) inkubuje s 0,1 ml činidla pre aktivovaný parciálny tromboplastínový test (APTT) (Organon Teknika) a 0,01 ml vzorky alebo štandardu, ktorým je nariedená normálna ľudská plazma s citrátom, počas 5 minút pri 37°C vo vodnom kúpeli. Po inkubácii sa pridá 0,1 ml 20 mM CaCl2 a čas potrebný na vývoj fíbrínovej zrazeniny sa stanoví vizuálnym hodnotením vzorky.

Jednotka faktora VIII je definovaná ako množstvo prítomné v 1 ml citrátom ošetrenej normálnej ľudskej plazmy. S ľudskou plazmou ako štandardom sa priamo porovnali aktivity prasačieho a ľudského faktora VIII. Riedenia plazmového .štandardu alebo purifikovaných proteínov sa uskutočnili v 0,15 M NaCI, 0,02 M HEPES, pH 7,4. Štandardná (kalibračná) krivka sa skonštruovala pomocou 3 alebo 4 riedení plazmy, kde najväčšie riedenie bolo 1/50, vynesením logio koagulačného času oproti logio koncentrácie v plazme, čo poskytlo lineárnu závislosť. Jednotky faktora VIII v neznámej vzorke sa stanovili interpoláciou z tejto štandardnej krivky.

Jednofázový test sa spolieha na aktiváciu faktora VIII pomocou aktivátorov, ktoré sú vytvárané v plazme s hemofíliou A, zatial čo dvojfázový test meria prokoagulačnú aktivitu preaktivovaného faktora VIII. V dvojfázovom teste sú vzorky obsahujúce faktor VIII, ktoré sa ponechali reagovať s trombínom, pridané k zmesi aktivovaného čiastočného tromboplastínu a ludskej plazmy s hemofíliou A, ktorá sa preinkubovala 5 minút pri 37°C. Výsledný koagulačný čas je potom prepočítaný na .jednotky/ml a to pomocou rovnakej štandardnej krivky, aká bola opísaná. Relatívna aktivita v dvojfázovom teste je vyššia ako v jednofázovom teste, pretože faktor VIII sa preaktivoval.

Príklad 2

Charakterizácia funkčných rozdielov medzi ľudským a prasačím faktorom VIII

Izolácia prasačieho a ľudského faktora VIII, ktorý pochádza z plazmy a ludského rekombinantného faktora VIII už sú opísané v odbornej literatúre, pozri Fulcher C. A. et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1648-1652; Toole et al. (1984) Náture 312:342-347 (Genetics Inštitúte); Gitschier et al. (1984) Náture 312:326-330 (Genentech); Wood et al. (1984) Náture 312:330-337 (Genentech); Vehar et al. Náture 312:337-342 (Genentech); Fass et al. (1982) Blood 59:594; Toole et al. (19-86) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5939-5942. Táto sa môže uskutočniť rôznymi spôsobmi. Všetky preparáty sú podobné svojim podjednotkovým zložením, hoci v stabilite je funkčný rozdiel medzi ľudským a prasačím faktorom VIII.

Na porovnanie ludského rekombinantného a prasačieho faktora VIII sa preparáty vysoko purifikovaného ludského rekombinantného faktora VIII (Cutter Laboratories, Berkeley, CA) a prasačieho faktora VIII (imunopurifikovaného, ako sa opísalo vo Fass at al.

(1982) Blood 59:594) podrobili analýze vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou (HPLC) na aniónovej ionomeničovej kolóne Mono Q™ (Pharmacia-LKB; Piscataway, NJ). Cielom kroku na Mono Q™ HPLC bolo eliminovať malé nečistoty po prevedení ľudského a prasačieho faktora VIII do spoločného pufru na účely porovnania. Fiolky, ktoré obsahovali 1000 až 2000 jednotiek faktora VIII sa rekonštituovali 5 ml H2O. Potom sa pridal Hepes (2 M s pH 7,4) do výslednej koncentrácie 0,02 M. Faktor VIII sa naniesol na kolónu Mono Q™ HR 5/5 ekvilibrovanú v 0,15 M NaCl, 0,02 M Hepes, 5 mM CaCl2, pri pH 7,4 (Pufor A plus 0,15 M NaCl); premyl 10 ml Pufru A + 0,15 M NaCl; a eluoval 20 ml lineárneho gradientu, 0,15 M až 0,90 M NaCl v Pufri A pri prietoku 1 ml/min.

Na porovnanie ľudského faktora VIII pochádzajúceho z plazmy (purifikovaného na Mono Q™ HPLC) a prasačieho faktora VIII (imunoafinitne purifikovaného) pochádzajúceho z plazmy sa prasačí faktor VIII nariedil 1:4 s 0,04 M He.pes, 5 mM CaCl2, 0,01% Tween-80, pH 7,4 a potom čistil na Mono Q™ HPLC za rovnakých podmienok, ako sa opísalo v predchádzajúcom odstavci pre ľudský faktor VIII. Tieto postupy izolácie ľudského a prasačieho faktora VIII sú štandardné a odborníkom dobre známe.

Frakcie z kolóny sa testovali na aktivitu faktora VIII jednofázovým koagulačným testom. Priemerné hodnoty výsledkov testov vyjadrené v jednotkách aktivity na jednotku A₂₈o materiálu sú uvedené v Tabuľke II a ukazujú, že prasačí faktor VIII má prinajmenšom šesťkrát vyššiu aktivitu než ľudský faktor VIII pri použití jednorázového testu.

Tabuľka II

Porovnanie koagulačnej aktivity ľud- Aktivita (U/A₂₈o) ského a prasačieho faktora VIII

Prasačí

Ľudský, pochádzajúci z plazmy Ľudský rekombinantný

21300

3600

2400

Príklad 3

Porovnanie stability ľudského a prasačieho faktora VIII

Výsledky jednofázového testu na faktor VIII odrážajú aktiváciu faktora VIII na faktor VHIa vo vzorke a možnú stratu aktivity vytvoreného faktora VHIa. Uskutočnilo sa priame porovnanie stability ludského a prasačieho faktora VIII. Vzorky z Mono Q™ HPLC (Pharmacia, Inc., Piscataway, N. J.) sa nariedili na rovnakú koncentráciu a rovnakým pufrom a uskutočnila sa reakcia s trombínom. Vzorky sa odoberali v rôznych časoch na dvojfázový koagulačný test. Typický vrchol aktivity (v 2 minúte) bol 10 x vyšší pre prasačí faktor VHIa než ludský faktor VHIa a aktivity ako prasačieho tak aj ludského faktora VHIa postupne klesali, pričom aktivita ludského faktora VHIa klesala rýchlejšie .

Všeobecne môžeme povedať, že pokusy izolovať stabilný ludský faktor VHIa neboli úspešné dokonca ani v podmienkach, keď sa použili podmienky, ktoré umožnili izolovať stabilný prasačí faktor VHIa. Na demonštráciu tejto skutočnosti ludský faktor VIII purifikovaný na Mono Q™ HPLC sa aktivoval trombínom a vystavil Mono S™ ionomeničovej HPLC (Pharmacia, Inc.) v podmienkach, ktoré viedli k získaniu stabilného prasačieho faktora VlIIa, ako to opísali Lollar et al. (1989) Biochemistry 28:666.

Ľudský faktor VIII, 43 pg/ml (0,2 μΜ) v 0,2 M NaCl, 0,01 M Hepes, 2,5 mM CaCl₂, pH 7,4 v 10 ml celkového objemu, sa nechal reagovať s trombínom (0,036 μΜ) 10 minút, kedy sa pridal FPR-CH₂Cl-D-fenyl-prolyl-arginyl-chlórmetylketón do koncentrácie 0,2 μΜ pre ireverzibilnú inaktiváciu trombínu.· Zmes sa potom nariedila 1:1 so 40 mM 2-(N-morfolino)etán-sulfónovou kyselinou (MES), 5 mM CaCl₂, pH 6,0 a naniesla sa prietokom 2 ml/min na kolónu Mono S™ HR5/5 HPLC (Pharmacia, Inc.) ekvilibrovanú v 5 mM

CaCl₂, pH 6,0 (Pufor B) + 0,1 M NaCI. Faktor VlIIa sa eluoval bez premytia kolóny 20 ml gradientu od 0,1 M NaCI do 0,9 M NaCI v Pufri Bl pri prietoku 1 ml/min.

Frakcie s koagulačnou aktivitou v dvojfázovom teste sa eluovali za týchto podmienok ako jediný vrchol. Špecifická aktivita vrcholovej frakcie bola približne 7500 U/A₂8o- Elektroforéza na polyakrylamidovom géli s dodecylsulfátom sodným (SDS-PAGE) vrcholovej frakcie faktora VlIIa po Mono S™, doplnená farbením proteínu striebrom, ukázala dva pásy zodpovedajúce heterodimérickému (A3-C1-C2/A1) derivátu faktora VIII. Hoci v týchto podmienkach fragment nebol identifikovaný farbením striebrom vzhladom na jeho nízku koncentráciu, identifikoval sa ako stopová zložka po značení pomocou ¹²⁵I.

V kontraste s výsledkami s ľudským faktorom VIII, prasačí faktor VIII izolovaný pomocou Mono S™ HPLC za rovnakých podmienok mal špecifickú aktivitu 1,6 x 10⁶ U/A₂₈o· Analýza prasačieho faktora VlIIa použitím SDS-PAGE odhalila tri fragmenty zodpovedajúce Al, A2 a A3-C1-C2 podjednotkám, čo ukázalo, že prasačí faktor VIII obsahuje tri podjednotky.

Výsledky analýzy použitím Mono S™ HPLC preparátov ľudského trombínom aktivovaného faktora VIII pri pH 6,0 ukázali, že ľudský faktor VlIIa je labilný v podmienkach, v ktorých sa môže získať stabilný prasačí faktor VlIIa. Hoci boli identifikované stopové množstvá A2 fragmentu vo vrcholovej frakcii, určenie toho, či koagulačná aktivita vyplývajúca z malého množstva heterotrimérického faktora VlIIa alebo z heterodimérického faktora VlIIa, ktorý má nízku špecifickú aktivitu, by nebolo možné len touto samotnou metódou.

Spôsob, ako izolovať ľudský faktor VlIIa ešte predtým, než stratí svoju A2 podjednotku, je potrebný na rozhodnutie tejto otázky. S týmto cielom sa uskutočnila izolácia postupom, ktorý zahŕňal redukciu pH Mono S™ pufru na pH 5. Mono Q™ purif ikovaný ľudský faktor VIII (0,5 mg) sa nariedil vodou takže poskytol výslednú kompozíciu 0,25 mg/ml (1 μΜ) faktora VIII v 0,25 M NaCl, 0,01 M Hepes, 2,5 mM CaCl₂, 0,005% Tween 80, pH 7,4 (celkový objem 7,0 ml). Trombín sa pridal do výslednej koncentrácie 0,072 μΜ a ponechal reagovať 3 minúty. Trombín sa potom inaktivoval s FPR-CH₂C1 (0,2 μΜ) . Zmes sa nariedila 1:1 so 40 mM acetátom sodným, 5 mM CaCl₂, 0,01% Tween-80, pH 5,0 a bola nanesená prietokom 2 ml/min na kolónu Mono S™ HR5/5 HPLC ekvilibrovanú v 0,01 M acetáte sodnom, 5 mM CaCl₂, 0,01% Tween 80, pH 5,0, plus 0,1 M NaCl. Faktor VlIIa sa eluoval bez premytia kolóny a s 20 ml gradientu 0,1 M NaCl až 1,0 M NaCl v rovnakom pufri prietokom 1 ml/min. Takto sa získala koagulačná aktivita vo vrcholovej frakcii, ktorá obsahovala detegovateľné množstvo A2 fragmentov, ako sa dokázalo pomocou SDS-PAGE a. farbením striebrom. Špecifická aktivita vrcholovej frakcie bola desaťkrát vyššia než aktivita izolovaná pri pH 6, 0 (75000 U/A_28Q oproti

7500 U/A₂₈₀. Avšak v kontraste s prasačím faktorom VlIIa izolovaným pri pH 6,0, ktorý je prakticky nekonečne stabilný pri 4°C, aktivita ľudského faktora VIII sa trvalo znižuje počas niekolkých hodín po elúcii z kolóny Mono S™. Navyše špecifická aktivita faktora VIII purifikovaného pri pH 5,0 a testovaného bezprostredne potom je iba 5% aktivity prasačieho faktora VlIIa, čo ukazuje na značnú disociáciu, ku ktorej došlo pred testom.

Tieto výsledky ukazujú, že ako ľudský tak aj prasačí faktor VlIIa sú zložené z troch podjednotiek (Al, A2, a A3-C1-C2) . Disociácia A2 podjednotky má za následok stratu aktivity ako ľudského, tak aj prasačieho faktora VlIIa za istých podmienok, ako je napr. fyziologická iónová sila, pH a koncentrácia. Relatívna stabilita prasačieho faktora VlIIa za určitých podmienok je lepšia z dôvodu silnejšej asociácie A2 podjednotky.

Príklad 4

Izolácia a sekvenovanie DNA, ktorá kóduje A2 doménu prasačieho faktora VIII.

Iba nukleotidová sekvencia, ktorá kóduje B doménu a časť A2 domény prasačieho faktora VIII sa sekvenovala už skôr (pozri Toole et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5939-5942). cDNA a predikovaná aminokyselinová sekvencia (sekvencia SEQ ID NO: 3 a 4, v uvedenom poradí) celej A2 domény prasačieho faktora VIII sú prvý krát opísané v predkladanej prihláške.

Ά2 doména prasačieho faktora VIII sa klonovala reverznou transkripciou celkovej RNA z prasačej sleziny a potom PCR amplifikáciou. Použili sa degenerované priméry navrhnuté podlá známej cDNA sekvencie ľudského faktora VIII a presné prasačie priméry založené na čiastočnej sekvencií prasačieho faktora VIII. 1 kb PCR produkt sa izoloval a amplifikoval po vložení do fagemidového vektora Bluescript™ (Stratagen).

Prasačia A2 doména sa kompletne sekvenovala dideoxy-sekvenovaním. cDNA a predikovaná aminokyselinová sekvencia sú uvedené v zozname sekvencií ako sekvencie SEQ ID NO: 3 a 4, v uvedenom poradí.

Príklad 5

Úplná sekvencia DNA, ktorá kóduje prasačí faktor VIII

Klenowov fragment, fosforylované Clal linkery, Notl linkery, T4 ligáza a Taq DNA polymeráza sa kúpili od firmy Promega (Madison, Wisconsin). Polynukleotidkináza sa kúpila od firmy Life Technologies, Inc., Gaithersburg, Maryland. γ-³²-ΑΤΡ (Redivue, >5000 Ci/mmol) bol kúpený od firmy Amersham. pBluescript II KSa bunky E. coli Epicurean XL1 Blue boli kúpené od firmy Stratagen (La Jolla, California). Syntetické oligonukleotidy boli kúpené od firmy Life Technologies, Inc. alebo Cruachem, Inc. 5'-fosforylované priméry sa použili, keď sa PCR produkty pripravovali na účely klonovania. Číslovanie nukleotidov (nt) v oligonukleotidoch, ktoré sa použili ako priméry na polymerázovú reťazovú reakciu (PCR) na amplifikáciu prasačej fVIII cDNA alebo genómovej DNA, je na základe ludskej fVIII cDNA ako referencie (Wood et al. (1984) supra).

Celková RNA z prasačej sleziny sa izolovala kyslou extrakciou použitím guanidíntiokyanát-fenol-chloroformu (Chomezynski et al. (1987) Anál. Biochem. 162:156-159). Prasačia cDNA sa pripravila z celkovej RNA zo sleziny použitím reverznej transkriptázy (RT) z Moloneyho myšieho leukemického vírusu (First Strand cDNA Synthesis Kit, Pharmacia Biotech), pokial nie je uvedené inak. RT reakcia obsahovala 45 mM Tris-Cl, pH 8,3; 68 mM KC1, 15 mM DTT, 9 mM MgCl₂, 0,08 mg/ml hovädzieho sérového albumínu a 1,8 mM deoxynukleotidtrifosfátu. Prasačia genómová DNA sa izolovala zo sleziny štandardným protokolom (Strauss, W. M. (1995) v Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., editors, John Wiley & Sons, pp. 2.2.1-2.2.3. Izolácia DNA z agarózových gélov sa uskutočnila pomocou súpravy Genclean II (Bio 101) alebo Quiex II Gel Extraction Kit (Qiagen).

PCR reakcie sa uskutočňovali pomocou termocykléra Hybaid OmniGen. Pre PCR reakciu uskutočňovanú s Taq DNA polymerázou, reakčná zmes obsahovala 0,6 mM MgCl₂, 0,2 mM dNTPs, 0,5 μΜ oligonukleotidové priméry, 50 U/ml polymerázy a 0,1 objemu reakčnej zmesi prvého reťazca cDNA. S výnimkou, keď je uvedené inak, sa PCR produkty purifikovali z gélu, zatupili sa Klenowým fragmentom, precipitovali etanolom a buď ligovali do EcoRV miesta defosforylovaného pBluescript II KS- alebo ligovali s fosforylovanými Clal linkermi použitím T4 ligázy, poštiepili Clal a purifikovali pomocou chromatografie na Sephacryl S400 a potom ligovali do Clal poštiepeného, defosforylovaného pBluescript II KS-. Ligácie sa uskutočnili pomocou DNA ligázy (Rapid DNA ligation kit; Boehringer Mannheim) s výnimkou prípadov, keď je špecificky uvedené inak. Plazmidy pBluescript II KS-, ktoré obsahovali inzert sa použili na transformáciu buniek E. coli Epicurean

XLl-Blue.

Sekvenovanie plazmidovej DNA sa uskutočnilo použitím automatického sekvenátora Applied Biosystems 373a a farbiacej terminačnej súpravy PRISM alebo manuálne použitím kitu na sekvenovanie Sequenase v. 2.0 (Amersham Corporation). Priame sekvenovanie PCR produktov, ktoré obsahovali ³²P-koncovo značené oligonukleotidy sa uskutočnilo použitím protokolu na cyklické sekvenovanie (dsDNA Cycle Sequencing Systen, Life Technologies) .

Izolácia klonov prasačej cDNA pre fVIII, ktoré obsahujú sekvenciu 5'UTR signálny peptid a doménu Al

5' úsek prasačej fVIII cDNA až po doménu A2 sa amplifikoval „hniezdovou („nested) RT-PCR z celkovej RNA, ktorá sa odobrala zo sleziny prasnice použitím metódy 5' rýchlej amplifikácie cDNA koncov (5'-RAČE) (Marathon cDNA Amplification, Clontech, Version PR55453). Metóda zahŕňa syntézu prvého reťazca cDNA použitím oligo(dT) „lock-docking priméru (Borson, N. D. et al. (1992) PCR Methods Appl. 2:144-148), syntézu druhého reťazca cDNA použitím E. coli DNA polymerázy I, a ligáciu s 5'-predĺženým dvojreťazcovým adaptorom, sekvencia SEQ ID NO: 5:

5'-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CTC GAG CGG CCG CCC GGG CAG GT-3' 3'-H₂N-CCC GTC CA-PO₄-5' , ktorého krátky reťazec sa blokoval na 3'konci aminoskupinou, aby sa redukovalo nešpecifické nasadanie priméru, a ktorý bol komplementárny k 8 nukleotidom na 3'-konci (Siebert, P. D., et al. (1995) Nucleic. Acids. Res. 23: 1087-1088). Prvý cyklus PCR sa uskutočnil použitím adaptor-špecifického oligonukleotidu, sekvencia SEQ ID NO: 6: 5'-CCA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC-3' (označený API) ako „sense priméru, a oligonukleotidu špecifického pre A2 doménu prasačieho fVIII sekvencia SEQ ID NO: 7:

5'-CCA TTG ACA TGA AGA CCG TTT CTC-3' (nt 2081-2104) ako „antisense priméru. Druhý cyklus PCR sa uskutočnil použitím „hniezdového („nested), adaptor-špecifického oligonukleotidu sekven33 cia SEQ ID NO: 8: 5'-ACT CAC TAT AGG GCT CGA GCG GC-3' (označený AP2) ako „sense priméru, a hniezdového oligonukleotidu špecifického pre prasačiu doménu A2, sekvencia SEQ ID NO: 9: 5'-GGG TGC AAA GCG CTG ACA TCA GTG-3' (nt 1497-1520) ako „antisense priméru. PCR sa uskutočnila použitím komerčnej súpravy (Advantage cDNA PCR core kit), ktorá používa protilátkami-sprostredkovaný postup horúceho štartu (Kellogg, D.E. et al., (1994) BioTechniques 16:1134-1137).

Podmienky na PCR boli nasledujúce: denaturácia pri 94°C po 60 sekúnd, nasledovaná 34 cyklami (prvá PCR) alebo 25 cyklami (druhá PCR) denaturácia 30 sekúnd pri 94°C, nasadnutie primérov („annealing) 30 sekúnd pri 60°C a predlžovanie (syntéza) 4 minúty pri 68 °C použitím kontroly .teploty priamo v skúmavke. Tento postup poskytol vylúčený produkt približne velkosti 1,6 kb, čo bolo v súlade ' s amplifikáciou fragmentu zahŕňajúceho približne úsek 150 bp z 5'UTR. PCR produkt sa klonoval do pBluescript použitím Clal linkerov. Inzerty štyroch klonov sa sekvenovali v oboch smeroch.

Sekvencie týchto klonov zahŕňali úseky zodpovedajúce 137 bp 5'UTR, signálnemu peptidu, Al doméne a časti A2 domény. Zhoda sa dosiahla aspoň v 3 zo 4 miest. Avšak klony obsahovali v priemere 4 mutácie zjavne vnesené v priebehu PCR, zrejme v dôsledku viacerých cyklov PCR potrebných na získanie klonovatelného produktu. Teda sa použila sekvencia získaná z úseku signálneho peptidu na prípravu fosforylovaného PCR priméru „sense reťazca so sekvenciou SEQ ID NO: 10

5'-CCT CTC GAG CCA CCA TGT CGA GCC ACC ATG CAG CTA GAG TCT TCC ACC TG-3', nazvaného RENEOPIGSP, na syntézu ďalšieho PCR produktu na potvrdenie sekvencie a na klonovanie do expresného vektora. Sekvencia vyznačená hrubo predstavuje štart-kodón. Sekvencia 5'smerom od neho predstavuje sekvenciu identickú s 5'inzerčným miestom cicavčieho expresného vektora ReNeo použitého na expresiu fVIII (Lubín et al. (1994) supra). Toto miesto obsahuje Xhol štiepne miesto (podčiarknuté). RENEOPIGSP a nt 1497-1520 oligonukleotid sa použili ako priméry pre Taq DNA polymerázou sprostredkovanú PCR reakciu, kde sa použila ako templát cDNA zo sleziny prasnice. DNA polymeráza od niekoľkých ďalších výrobcov neposkytla detegovatelný produkt. Podmienky na PCR boli nasledujúce: denaturácia pri 94°C 4 minúty, nasledovaná 35 cyklami denaturácie pri 94°C 1 minútu, nasadnutie primérov pri 55°C 2 minúty a predlžovanie pri 72°C 2 minúty, nasledovaná konečným predlžovacím krokom 5 minút pri 72°C. PCR produkt sa klonoval do pBluescript použitím Clal linkerov. Inzerty z dvoch týchto klonov sa sekvenovali a v oboch smeroch a zhodli sa s kanonickou (consensus) sekvenciou.

Izolácia klonov prasačej fVIII cDNA, ktorá obsahuje kodóny pre domény A3, Cl a 5'-polovicu C2 domény

Najskôr sa dva produkty RT-PCR z prasačej sleziny zodpovedajúce fragmentu B-A3 domény (nt 4519-5571) a' fragmentu C1-C2 domény (nt 6405-6990) klonovali. 3' koniec C2 domény, ktorý sa získal predĺžením do úseku exónu 26, ktorý je terminálnym exónom fVIII. B-A3 produkt sa pripravil použitím priméru špecifického pre prasačiu B doménu, sekvencia SEQ ID NO: 11:

5'-CGC GCG GCC GCG CAT CTG GCA AAG CTG AGT T-3',kde podčiarknutý úsek zodpovedá úseku v prasačom fVIII, ktorý nasadá na úsek nt 4519-45530 ľudského fVIII. 5'úsek oligonukleotidu obsahuje Nôti miesto, ktoré sa pôvodne zamýšľalo použiť na účely klonovania. „Antisense primér použitý na generovanie B-A3 produktu sekvencie SEQ ID NO: 12: 5'-GAA ATA AGC CCA GGC TTT GCA GTC RAA-3' je založený na reverznom komplemente ludskej fVIII cDNA sekvencie, ktorá zahŕňa nt 5545-5571. PCR reakcia obsahovala 50 mM KC1, 10 mM Tris-Cl, pH 9,0, 0,1% Tween X-100, 1,5 mM MgCl₂, 2,5 mM dNTPs, 20 μΜ priméry, 25 jednotiek/ml Taq DNA polymerázy a 1/20 objemu RT reakčnej zmesi. PCR podmienky boli denaturácia pri 94°C 3 minúty, nasledovaná 30 cyklami denaturácie 1 minútu pri 94 °C, nasadnutie primérov 2 minúty pri 50°C a predlžovanie 2 minúty pri 72°C. PCR produkty sa fosforylovali použitím T4 DNA kinázy a pridali sa Nôti linkery. Po poštiepení Nôti sa PCR fragmenty klonovali do Nôti miesta plazmidu BlueScript II KSa transformovali do buniek XLl-Blue.

C1-C2 produkt sa pripravil použitím známej ľudskej cDNA sekvencie pre syntézu „sense a „antisense primérov, sekvencia SEQ ID NO: 13: 5'-AGG AAA TTC CAC TGG AAC CTT N-3' (nt 6405-6426) a sekvencia SEQ ID NO: 14:

5'-CTG GGG GTG AAT TCG AAG GTA GCG N-3' (reverzný komplement k nt 6966-6990) v uvedenom poradí. PCR podmienky boli identické s podmienkami použitými na prípravu B-A2 produktu. Vzniknutý fragment sa ligoval do pNOT klonovacieho vektora použitím súpravy Prime PCR Cloner Cloning System (5' Prime-3 Prime, Inc., Boulder, Colorado) a pestoval v bunkách JM109.

Plazmidy B-A3 a C1-C2 sa čiastočne sekvenovali na prípravu „sense a „antisense oligonukleotidov špecifických pre prasačiu sekvenciu, sekvencia SEQ ID NO: 15:

5'-GAG TTC ATC GGG AAG ACC TGT TG-3' (nt 4551-4573) a sekvencia SEQ ID NO: 16: 5'-ACA GCC CAT CTIA CTC CAT GCG AAG-3' (nt 6541-6564), v uvedenom poradí. Tieto oligonukleotidy sa použili ako priméry na vytvorenie 2013 bp RT-PCR produktu použitím súpravy Clontech Advantage cDNA PCR. Tento produkt, ktorý zodpovedá ľudskému úseku nt 4551-6564, obsahuje úsek zodpovedajúci aktivačnému peptidu ľahkého reťazca (nt 5002-5124), A3 doméne (nt 5125-6114) a väčšine Cl domény (nt 6115-6573). Sekvenovaním C1-C2 klonu sa stanovilo, že ľudská a prasačia cDNA od nt 6565 až do 3'konca Cl domény sú identické. PCR produkt sa klonoval do EcoRV miesta pBluescript II KS-. Štyri klony sa úplne sekvenovali v oboch smeroch. Zhoda sa dosiahla aspoň v troch zo štyroch miest.

Izolácia prasačích klonov fVIII cDNA, ktoré obsahujú kodóny pre 3'polovicu C2 domény

C2 doména ľudského fVIII (nukleotidy 6574-7053) je obsiahnutá vo vnútri exónov 24 až 26 (Gitschier J. at al. (1984) Náture 312:326-330). Ľudský exón 26 obsahuje 1958 bp a zodpovedá nukleotidom 6901-8858. Zahŕňa tiež 1478 bp úsek 3'netranslatovanej sekvencie. Pokusy o klonovanie cDNA exónu 26 zodpovedajúce 3'koncu C2 domény 3'UTR metódou „3'RAČE (Siebert et al. (1995) supra), inverznou PCR (Ochman, H. et al. (1990) Biotechnology (N.Y.) 8:759-760), PCR reštrikčných miest (Sarkar, G, et al. (1993) PCR Meth. Appl. 2:318-322), PCR s nepredvídateľnými primérmi („unpredictably primed PCR) (Dominiguez, O. et al. (1994) Nucleic. Acids Res. 22:3247-3248) alebo skríningom cDNA knižnice z prasačej pečene celkom zlyhali. Metóda 3'RAČE sa úspešne použila s rovnakou adaptor-ligovanou dvojreťazcovou cDNA knižnicou na klonovanie 5'konca prasačej fVIII cDNA. Takže neúspech tejto metódy nebol dôsledkom absencie cDNA zodpovedajúcej exónu 26.

Postup „cielenej prechádzky po géne s PCR („targeted gene walking PCR; Parker, J.D. et al. (1991) Nucleic. Acids. Res. 19:3055-3060) sa použil na klonovanie 3'polovice C2 domény. „Sense primér špecifický pre prasačiu sekvenciu, sekvencia SEQ ID NO: 17:

5'-TCAGGGCAATCAGGACTCC-3' (nt 6904-6924) sa syntetizoval na podklade začiatočnej sekvencie C2 domény a použil sa na PCR reakcie s nešpecifickými „walking primérmi vybranými z oligonukleotidov dostupných v laboratóriu. PCR produkty sa potom zacielili analýzou extenzie primérov (Parker et al. (1991) BioTechniques 10:94-101 použitím a ³²P-koncovo značeného interného priméru špecifického pre prasačiu sekvenciu, sekvencia SEQ ID NO: 18: 5'-CCGTGGTGAACGCTCTGGACC-3' (nt 6932-6952). Je zaujímavé, že zo 40 testovaných nešpecifických primérov iba dva poskytli pozitívne produkty v analýze extenzie primérov a tieto dva produkty zodpovedali presnej a degenerovanej ľudskej sekvencií 3'konca C2 domény: sekvencia SEQ ID NO:19: 5'-GTAGAGGTCCTGTGCCTCGCAGCC-3' (nt 7030-7453) a sekvencia SEQ ID NO: 20:

5'-GTAGAGSTSCTGKGCCTCRCAKCCYAG-3', (nt 7027-7053). Tieto priméry sa pôvodne navrhli na získanie dostatočného množstva produktu pomocou konvenčnej RT-PCR, ale neviedli k získaniu dostatočného množstva produktu, ktoré by sa mohlo vizualizovať väzbou etídiumbromidového farbiva. Avšak PCR produkt sa mohol identifikovať omnoho citlivejšie metódou extenzie primérov. Tento produkt sa purifikoval z gélu a priamo sekvenoval. To viedlo k extenzii sekvencie prasačieho fVIII 3'až k nt 7026.

Ďalšia sekvencia sa získala analýzou extenzie primérov produktov pripravených hniezdovou PCR použitím adaptor-ligovanej dvojreťazcovej cDNA knižnice postupom „5'RAČE už skôr opísaným. Prvý cyklus reakcie sa uskutočnil použitím presného prasačieho priméru sekvencie SEQ ID NO: 21: 5'-CTTCGCATGGAGTTGATGGCCTGT-3' (nt 6541-6564) a priméru API. Druhý cyklus reakcie sa uskutočnil použitím priméru sekvencie SEQ ID NO: 22: 5'-AATCAGGACTCCTCCACCCCCG-3' (nt 6913-6934) a AP2 priméru. Priame PCR sekvenovanie predĺžilo sekvenciu k 3'koncu C2 domény (nt 7053). Sekvencia C2 domény je jedinečná s výnimkou nt 7045 v blízkosti 3'konca C2 domény. Analýza opakovaných PCR reakcií poskytla buď A, G alebo dokonca dvojité čítanie A/G v tejto pozícii.

Sekvenovanie sa predĺžilo po 3'UTR použitím dvoch ďalších primérov a to sekvencie SEQ ID NO: 23:

5'-GGA TCC ACC CCA CGA GCT GG-3' (nt 6977-6996) a sekvencie SEQ ID NO:24: 5'-CGC CCT GAG GCT CGA GGT TCT AGG-3' (nt 7008-7031). Približne 15 bp fragment 3'UTR sekvencie sa získal, hoci sekvencia bola v niektorých miestach nejasná. Niekolko „antisense primérov sa potom syntetizovalo na základe čo najlepšieho určenia 3'netranslatovanej sekvencie. Tieto priméry zahŕňali reverzný komplement TGA stop kodónu na ich 3'konci. PCR produkty ako z genómovej DNA prasačej sleziny tak aj z cDNA prasačej sleziny, vizualizované elektroforézou na agarózovom géli a zafarbené etídiumbromidom, sa získali použitím špecifického „sense primé38 ru sekvencie SEQ ID NO: 25: 5'-AAT CAG GAC TCC TCC ACC CCC G-3' (nt 6913-6934) a 3'UTR „antisense priméru sekvencie SEQ ID NO: 26 5'-CCTTGCAGGAATTCGATTCA-3'. Na získanie dostatočného množstva materiálu na účely klonovania, sa uskutočnil druhý cyklus PCR použitím hniezdového „sense priméru sekvencie SEQ ID NO: 27 5'-CCGTGGTGAACGCTCTGGACC-3' (nt 6932-6952) a rovnakého „antisense priméru. PCR produkt veľkosti 141 bp sa klonoval do EcoRV poštiepeného pBluescript II KS-. Sekvencia troch klonov získaných z genómovej DNA a troch klonov získaných z cDNA sa určila v oboch smeroch. Sekvencia bola jednoznačná s výnimkou polohy 7045, kde v genómovej DNA bolo vždy A, zatial čo v cDNA bolo vždy G.

Viacnásobné priradenie sekvencie DNA· ľudského, prasačieho a myšieho fVIII (pozri obrázky IA až IH)

Porovnanie sekvencií signálneho peptidu a úsekov Al, A2, A3, Cl a C2 úsekov sa uskutočnilo použitím programu CLUSTALW (Thompson, J.D. et al. (1994) Nucleic. Acids. Res. 22:4 67 3-4 680). „Trestné body za medzery „gap open a „gap extension v porovnávaných sekvenciách boli 10 a 0,05 v uvedenom poradí. Porovnanie ľudskej, myšej a prasačej sekvencie B domény bolo už opísané skôr (Elder et al. (1993) supra). Ľudská A2 sekvencia zodpovedá aminokyselinám 373-740 v sekvencií SEQ ID NO 2. Prasačia aminokyselinová sekvencia A2 je uvedená ako sekvencia SEQ ID NO: 4 a myšia aminokyselinová sekvencia A2 domény je uvedená ako sekvencia SEQ ID NO: 28, aminokyseliny 392-759.

Príklad 6

Expresia aktívneho rekombinantného prasačieho faktora VIII postrádajúceho doménu B (PB~)

Materiály

Citrátom ošetrená krv s hemofíliou A a normálna ľudská plazma sa kúpili od George King Biomedical, Inc. Fetálne hovädzie sérum, geneticin, penicilín, streptomycín a DMEM/F12 médium a AIM-V médium boli kúpené od Life Technologies, Inc. Taq DNA polymeráza bola zakúpená od firmy Promega. Vent DNA polymeráza bola zakúpená od firmy New England Biolabs. Pfu DNA polymeráza a fagemid pBluescript II KS boli zakúpené od firmy Stratagen. Syntetické oligonukleotidy boli kúpené od firmy Life Technologies alebo Cruachem, Inc. Reštrikčné enzýmy boli od firmy New England Biolabs alebo Promega. 5'-fosforylované priméry sa použili, keď sa PCR produkty pripravovali na klonovacie účely. Číslovanie nukleotidov (nt) v oligonukleotidoch, ktoré sa použili ako priméry na amplifikáciu prasačej fVIII cDNA alebo genómovej DNA v polymerázovej reťazovej reakcii (PCR) vychádzalo z ludskej fVIII cDNA ako referenčnej sekvencie (Wood et al. (1984) Náture 312:330-337). A fVIII expresný vektor nazvaný HB'/ReNeo sa získal od firmy Biogen, Inc. HB’/ReNeo obsahuje gény rezistencie na ampicilín' a geneticin a cDNA ľudského fVIII, ktorému chýba celá B doména, definovanú ako štiepny fragment Ser741-Argl648 produkovaný trombínom. Na ' uľahčenie mutagenézy cDNA fVIII C2 domény, ktorá je na 3' konci inzertu fVIII v ReNeo, sa miesto Nôti vnieslo 2 bázy od 3'stop kodónu HB.’/ReNeo použitím mutagenézy typu „splicing-by-overlap extension(SOE) (Horton, R.M. et al. (1993) Methods Enzymol. 217:270-279). Tento konštrukt bol nazvaný HB’ReNeo/NotI.

Celková RNA sa izolovala metódou kyslej guanidínium tiokyanát-fenol-chloroformovej extrakcie (Chromczynski, P. et al. (1987) Anál. Biochem. 162:156-159). cDNA sa syntetizovala z mRNA použitím reverznej transkriptázy (RT) z Moloneyho myšieho leukemického vírusu a náhodných hexamérov podľa inštrukcií výrobcu kitu (First Strand cDNA Synthesis Kit, Pharmacia Biotech). Plazmidová DNA sa purifikovala použitím súpravy Qiagen Plasmid Maxi Kit (Qiagen, Inc.). PCR reakcie sa uskutočnili použitím termocykléra Hybaid OmniGen použitím Taq, Vent alebo Pfu DNA polymeráz. PCR produkty sa purifikovali na géli, precipitovali etanolom a ligovali do plazmidovej DNA použitím T4 DNA ligázy (Rapid DNA Ligation Kit, Boehringer Mannheim). Inzerty obsahujúce plazmidy sa použili na transformáciu buniek E. coli Epicurean XLl-Blue. Všetky nové fVIII DNA sekvencie vytvorené pomocou PCR sa potvrdili dideoxy-sekvenovaním použitím automatického DNA sekvenátora Applied Biosystems 373a a kitu terminačných farbív PRISM.

Konštrukcia hybridného expresného vektora fVIII HP20 obsahujúceho prasačiu C2 doménu

Prasačia fVIII cDNA zodpovedajúca 3'koncu Cl domény a celej C2 doméne sa klonovala do pBluescript použitím RT PCR z celkovej RNA zo sleziny použitím primérov založených na známej prasačej fVIII cDNA sekvencii (Healey, J.F. et al. (1996) Blood 88:4209-4214) . Tento konštrukt a konštrukt HB'/ReNeo sa použili ako templáty na konštrukciu fúzneho produktu „ludský Cl- prasačí C2 v pBlueScript mutagenézou SOE. C1-C2 fragment z tohto plazmidu sa vyštiepil s Apal a Botl a ligoval do Apal/Notl-poštiepeného konštruktu HB~/ReNeoNotI, aby tak vznikol HP20/ReNeo/NctI konštrukt .

Konštrukcia hybridného ludského/prasačieho fVIII obsahujúceho prasačí lahký reťazec (HP18)Ľahký reťazec ľudského fVIII pozostáva z aminokyselinových zvyškov Aspl649 až Tyr2332. Zodpovedajúcimi zvyškami prasačej fVIII cDNA sa tento úsek nahradil v HB-, . Čím sa pripravila hybridná ludsko/prasačia fVIII molekula nazvaná HP18. Uskutočnilo sa to tak, že zodpovedajúci úsek v HP20 sa nahradil PCR produktmi, ktoré zodpovedajú prasačiemu úseku A2, doméne A3, Cl a časti C2 domény. Na uľahčenie konštrukcie sa synonymné AvrlI miesto SOE mutagenézou vnieslo do nt 2273 na spojnicu A2 a A3 domény v HP20.

Konštrukcia hybridu ludského/prasačieho fVIII, ktorý nemá B doménu, a ktorý obsahuje prasačí signálny peptid, Al doménu a A2 doménu (HP22)

Signálny peptid ľudského fVIII s Al doménou a A2 doménou pozostáva z aminokyselinových zvyškov Met(-19)-Arg740. Tento úsek HB- sa nahradil zodpovedajúcimi zvyškami prasačej fVIII cDNA a takto sa pripravila molekula nazvaná HP22. Navyše sa synonymné AvrlI miesto SOE mutagenézou vnieslo do nt 2273 na spojnicu A2 a A3 domény v HP20. HP22 sa skonštruoval fúziou fragmentu prasačí signálny peptid-Al-parciálny fragment A2 v pBlueScript (Healy et al. (1996) supra) s hybridným ludským/prasačím fVIII, ktorý nemá doménu B, obsahujúcim prasačiu A2 doménu, označovanú HP1 (Lubín et al. (1994) supra).

Konštrukcia prasačieho fVIII bez B domény (PB)

Spel/Notl fragment HP18/BS (+AvrII) sa poštiepil AvrlI/NotI a ligoval sa do AvrlI/Notl-poštiepeného HP22BS (+AvrII), čím sa pripravil konštrukt PB~/BS (+AvrII), ktorý pozostáva z prasačieho fVIII, ktorý nemá celú B doménu. PB- sa klonoval do ReNeo ligovaním Xbal/Notl fragmentu z PB/BS (+AvrII) do HP22/ReNeo/NotI (+AvrII).

Expresia rekombinantných molekúl fVIII

PB’/ReNeo/NotI (+AvrII) a HP22/ReNeo/NotI (+AvrII) sa prechodne transfekovali do COS buniek a exprimovali, ako už je opísané (Lubin, LM. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:8639-8641). Ako kontroly sa uskutočnili transfekcie HB/ReNeo/NotI a bez DNA.

Aktivita fVIII PB, HP22 a HB sa merali chromogénnym testom nasledujúcim spôsobom. Vzorky fVIII v supernatantoch COS bunkových kultúr sa aktivovali 40 nM trombínom v 0,15 M NaCI, 20 mM HEPES, 5 mM CaCl2, 0,01% Tween-80, pH 7,4 v prítomnosti 10 nM faktora IXa, 425 nM faktora X a 50 μΜ unilamelárnych fosfati42 dylserín/fosfatidylcholínových (25/75 hmotn./hmotn.) vezikúl. Po 5 minútach sa reakcia zastavila 0,05 M EDTA a 100 nM rekombinantného desulfatohirudínu a výsledný faktor Xa sa meral testom s chromogénnym substrátom. Pri teste s chromogénnym substrátom sa pridalo 0,4 mM Spectrozym Xa a sledovalo sa uvoľňovanie paranitroanilidu meraním absorbancie roztoku pri 405 nm.

Výsledky zo supernatantov dvoch nezávisle transfekovaných bunkových kultúr (absorbancia 405 nm za 1 minútu) boli nasledujúce :

HB: 13,9

PB: 139

HP22: 100 „slepá kontrola: < 0,2

Tieto výsledky ukazujú, že prasačí fVIII, ktorému chýba doména B a fVIII, ktorý nemá doménu B pozostávajúcu z prasačej Al a A2 podjednotky sú aktívne a vedú k predpokladu, že majú dokonca vyššiu aktivitu než ľudský fVIII, ktorý nemá doménu B.

PB’ sa čiastočne purifikoval a koncentroval z rastového média chromatografiou na heparín-Sepharose. Heparín-Sepharose (10 ml) sa ekvilibrovala s 0,075 M NaCl, 10 mM HEPES, 2,5 mM CaCl2, 0,005% Tween-80, 0,02% azid sodný, pH 7,4. Médium (100 až 200 ml) z exprimujúcich buniek sa nanieslo na heparín-Sepharose, ktorá sa potom premyla 30 ml ekvilibračného pufru bez azidu sodného. PB' sa eluoval 0,65 M NaCl, 20 mM HEPES, 5 mM CaCl₂, 0,01% Tween-80, pH 7,4 a potom sa uskladnil pri -80°C. Výťažok fVIII koagulačnej aktivity bol typicky 50 až 75%.

Stabilná expresia prasačieho fVIII, ktorému chýba doména B (PB)

Transfekované bunkové línie sa udržiavali v Dulbeccovom modifikovanom Eaglovom médiu F12, ktoré obsahovalo 10% fetálne hovädzie sérum, 50 U/ml penicilínu, 50 μg/ml streptomycínu.

Fetálne hovädzie sérum sa tepelne inaktivovalo pri 50°C jednu hodinu pred použitím. HB'/ReNeo a PB'ReNeo/NotI (+AvrII) sa stabilne transfekovali do buniek BHK a selektovali na rezistenciu na geneticín použitím všeobecne známeho postupu, ktorý sa už publikoval skôr (Lubin et al. (1994) Biol. Chem. 269:8639-8641) s výnimkou toho, že bunky, ktoré sa exprimujú sa udržiavali v rastovom médiu, ktoré obsahovalo 600 μς/πιΐ geneticínu. Bunky z kultivačných fliaš Corning T-75 pestované do konfluencie sa preniesli do trojhranných kultivačných fliaš Nunc s médiom, ktoré obsahovalo 600 μg/ml geneticínu . a ďalej pestovali až do konfluencie. Médium sa odoberalo a nahradilo AIM-V médiom bez séra (Life Technologies, Inc.) a bez geneticínu. Expresia faktora VIII sa monitorovala jednofázovým testom koagulačnej aktivity faktora VIII (pozri vyššie) a 100 až 150 ml sa odoberalo jedenkrát denne počas štyroch až piatich dní. Maximálne hladiny expresie v médiu pre HB' a PB' boli 102 jednotiek koagulačnej aktivity faktora VIII na jeden ml a 10 až 12 jednotiek na ml, v uvedenom poradí.

Purifikácia PB

PB” sa precipitoval zo supernatantu kultúry použitím 60% saturovaného roztoku síranu amónneho a potom sa purifikoval W3-3 imunoafinitnou chromatografiou na mono Q HPLC, ako sa už skôr opísalo pre purifikáciu z plazmy pochádzajúceho prasačieho faktora VIII (Lollar et al. (1993) Factor VIII/Factor VlIIa. Methods Enzymol. 222:128-143). Špecifická koagulačná aktivita PB sa merala jednofázovým koagulačným testom (Lollar et al. (1993) supra) a podobala sa aktivite prasačieho faktora VIII pochádzajúceho z plazmy.

Keď sa PB' preparát analyzoval elektroforézou na SDS polyakrylamidovom géli, obsahoval tri pásy s molekulovou hmotnosťou 160 kDa, 82 kDa a 76 kDa. 82 kDa a 76 kDa pásy boli už skôr opísané ako heterodiméry obsahujúce A1-A2 a ap-A3-Cl-C2 domény (kde ap označuje aktivačný peptid) (pozri Toole at al. (1984) Náture 312:342-347). 160 kDa pás sa preniesol na polyvinylidénfluoridovú membránu a potom sa podrobil NH2~koncovému sekvenovaniu, ktoré poskytlo fragment Arg-Ile-Xx-Xx-Tyr (kde Xx predstavuje neurčenú polohu), čo je NH2~koncová sekvencia jednoreťazcovej molekuly faktora VIII (Toole et al. (1984) supra). Takže PB je čiastočne opracovávaný štiepením medzi doménami A2 a A3, takže pozostáva z dvoch foriem a to jednoreťazcového proteínu Al-A2-ap-A3-Cl-C2 a heterodiméru Al-A2-ap-A3-Cl-C2 Podobné opracovanie rekombinantného HB” tiež opísali (Línd et al. (1995) Eur. J. Biochem. 232:19-27).

Charakterizácia prasačieho faktora VIII

Stanovila sa cDNA sekvencia prasačieho fVIII zodpovedajúca 137 bp 5'UTR, úsek kódujúci signálny peptid (57 bp) a Al (1119 bp), A3 (990 bp) , Cl (456 bp) a C2 (483 bp) domény.

Spoločne so skôr publikovanou sekvenciou B domény a úsekov aktivačného peptidu ľahkého reťazca (Toole et al. (1986) supra) a A2 domény (Lubín et al. (1994) supra), sekvencia opísaná v predkladanej prihláške dokončuje stanovenie úplnej sekvencie cDNA prasačieho fVIII zodpovedajúcej translatovanému produktu. Fragment, ktorý zahŕňal cDNA pre 5'UTR úsek, signálny peptid a Al doménu sa klonoval použitím postupu 5'-RAČE RT PCR. Primér odvodený z ľudskej C2 sekvencie úspešne viedol k vytvoreniu RT PCR produktu, ktorý potom umožnil klonovanie domén A3, Cl a 5'-časti C2 domény. cDNA zodpovedajúca 3'-časti C2 domény a 3'UTR cDNA sa ukázali ako velmi namáhavé substráty na klonovanie. Zvyšok C2 domény sa nakoniec klonoval postupom „targeted gene walking PCR (Parker et al. (1991) supra).

Sekvencia opísaná v zozname sekvencií ako sekvencia SEQ ID NO: 29 bola stanovená jednoznačne s výnimkou nukleotidu 7045 blízko 3'konca C2 domény, kde bolo buď A alebo G, ako sa opísalo. Zodpovedajúci kodón je GAC (Asp) alebo AAC (Asn).

Ľudské a myšie kodóny sú GAC a CAG (Gin), v uvedenom poradí. Či sa, v tomto prípade jedná o polymorfizmus alebo reprodukovateľný artefakt vnesený PCR je doteraz neznáme. cDNA pre rekombinantný hybridný ludský/prasačí fVIII, ktorý postráda doménu B obsahujúcu substitúcie prasačej C2 domény zodpovedajúcej ako GAC tak aj AAC kodónu sa stabilne exprimovali bez detegovatelného rozdielu v prokoagulačnej aktivite. Tento výsledok ukazuje, že nie je funkčný rozdiel medzi dvoma variantmi C2 domény.

Porovnanie predikovanej aminokyselinovej sekvencie úplného prasačieho fVIII (sekvencia SEQ ID NO: 30) s publikovanou ľudskou sekvenciou (Wood et al. (1984) supra) a myšou sekvenciou (Elder et al. (1993) supra) je ukázané na Obrázku IA až IH, spoločne s miestami pre post-translačné modifikácie, proteolytické štiepenie, a rozpoznávanie inými makromolekulami. Stupeň identity porovnaných/priradených sekvencií je uvedený v Tabuľke VII. Ako bolo už skôr uvedené, B domény týchto biologických druhov sú viac divergentné (viac sa odlišujú) ako A alebo C domény. To je však v súlade s pozorovaním, že B doména nemá žiadnu známu funkciu, bez ohľadu na značnú velkosť tejto domény. (Elder et al. (1993) supra; Toole at al. (1986) supra). Výsledky získané v predkladanom vynáleze potvrdzujú, že B doména prasačieho fVIII nie je nevyhnutná na jeho aktivitu. Na základe opísaných sekvenčných údajov sa syntetizoval prasačí fVIII, ktorý má deletovanú (odstránenú) aspoň časť alebo celú B-doménu a potom sa exprimoval prasačí fVIIIa z kódujúcej DNA, ktorá má deletované všetky alebo časť kodónov prasačej B domény. Existuje tiež vyššia divergencia sekvencií, ktoré zodpovedajú šiepnemu peptidu Al doména APC/faktor IXa (zvyšky 337-372) a aktivačnému peptidu ľahkého reťazca (Tabuľka VII). Trombínové štiepne miesto v polohe 336 na vytvorenie peptidu 337-372 je u myší zjavne stratené, lebo tento zvyšok je glutamín namiesto arginínu (Elder et al. (1993) supra). Relatívne rýchla divergencia trombínových štiepnych peptidov (alebo u myšieho fVIII možno zvyškového aktivačného peptidu 337-372) sa poznala už skôr u fibrinopeptidov (Creighton, T. E. (1993) Proteins: Structures a Molecular Properties, W. H. Ereeman, New York, pp. 105-138). Nedostatok biologickej funkcie týchto peptidov, akonáhle sú poštiepené, bol citovaný ako jeden z možných dôvodov rýchlej divergencie. Arg562 v ľudskom fVIII sa navrhol ako dôležité štiepne miesto pre aktivačný proteín C v priebehu inaktivácie fVIII a fVIIIa (Fay, P. J. at al. (1991) J. Biol. Chem. 266:20139-20145). Tieto miesta sú konzervatívne (sú zachované) ako v ľudskej, tak aj v prasačej a myšej sekvencii fVIII.

Potenciálne miesta N-glykozylácie (NXS/T,' kde X nie je prolín) sú vidieť na obrázku IA až IH. Je tam osem konzervatívnych N-viažucich glykozylačných miest: jedno je v Al doméne, jedno v A2 doméne, štyri v B doméne, jedno v A3 doméne a jedno v Cl doméne. 19 cysteínových zvyškov v A a C doméne je tiež zachovaných, zatial čo existuje divergencia cysteínových zvyškov v B doméne. Šesť zo siedmych disulfidických väzieb v molekule fVIII sú na homologických miestach s faktorom V a ceruloplazmínom a obe disulfidické väzby C domény sa našli tiež vo faktore V (McMullen, B. A. et al. (1995) Protein Sci. 4:740-746). Ľudský fVIII obsahuje sulfátovaný tyrozín v pozíciách 346, 718, 719, 723, 1664 a 1680 (Pitman, D.D. et al. (1992) Biochemistry 31:3315-3325; Michnick, D.A. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:20095-20102). Tieto zvyšky sú zachované aj v myšom a prasačom fVIII (Obrázok 1), hoci program CLUSTALW zlyhal v priradení tyrozínového zvyšku v myšej sekvencii zodpovedajúcemu Tyr346 v ľudskom fVIII.

Myšia a prasačia plazma môžu korigovať defekty koagulácie v ľudskej plazme s hemofíliou A, čo je v súlade s hladinou konzervatívnych zvyškov v doménach A a C týchto biologických druhov. Prokoagulačná aktivita prasačieho fVIII je vyššia než ľudského fVIII (Lollar, P. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:23652-23657). Rekombinantný prasačí faktor VIII (s deletovanou B doménou) exprimovaný a purifikovaný ako už je opísané, tiež vykazuje vyššiu špecifickú koagulačná aktivitu než ľudský fVIII, porovnateľnú s prasačím fVIII pochádzajúcim z plazmy. To by mohlo byť spôsobené zníženou spontánnou rýchlosťou disociácie A2 podjednotky z aktívneho heterotriméru fVIIIa: A1/A2/A3-C1-C2. Či rozdiely v prokoagulačnej aktivite odrážajú evolučnú zmenu vo funkcii ako príklad adaptácie druhov (Perutz, M. F. (1996) Adv. Protein Chem. 36:213-244) nie je známe. Teraz, keď je prasačia cDNA fVIII sekvencia zodpovedajúca translatovanému produktu úplná, homologická skenovacia mutagenéza (Cunningham, B. C. et al. (1989) Science 243:1330-1336) môže poskytnúť spôsob na identifikáciu štruktúrnych rozdielov medzi ľudským a prasačím fVIII, ktoré sú príčinou vyššej aktivity prasačieho proteínu.

Prasačí fVIII je typicky menej reaktívny s inhibičnými protilátkami, ktoré sa tvoria u hemofilikov, ktorým bola podaná transfúzia s fVIII, alebo ktoré sa tvoria ako autoprotilátky vo všeobecnej populácii. To predstavuje základ na použitie koncentrátu prasačieho fVIII pri liečení pacientov s inhibičnými protilátkami (Hay a Lozier (1995) supra). Väčšina inhibičných protilátok je namierená proti epitopom, ktoré sú lokalizované v doméne A2 alebo C2 (Fulcher, C.A. et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7728-7732; Scandella, D. et al. . (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85:6152-6156; Scandella, D. et al. (1989) Blood 74:1618-1626). Navyše sa identifikoval epitop neznámeho významu, ktorý leží buď v doméne A3 alebo Cl (Scandella et al. (1989) supra; Scandella, D. et al. (1993) Blood 82:1767-1775; Nakai, H. et al. (1994) Blood 84:224a). A2 epitop sa mapoval do polohy zvyškov 484 až 508 metódou homologickej skenovacej mutagenézy (Healey et al. (1995) supra). V tomto segmente s veľkosťou 25 aminokyselinových zvyškov je relatívne nízky podiel identických sekvencií (16/25 alebo 64%) . Je zaujímavé, že tento úsek, ktorý ako sa zdá je funkčne dôležitý a to na základe faktu, že protilátky proti nemu majú inhibičný účinok, bol zjav48 ne vystavený relatívne rýchlejšiemu genetickému driftu. Porovnanie prasačej A2 domény a A3 domény ukazuje, že A2 epitop nezdiela žiadnu detegovatelnú homológiu so zodpovedajúcim úsekom v A3 doméne.

Pomocou delečného mapovania sa navrhla . lokalizácia C2 inhibičného epitopu ľudského fVIII do úsekov zvyškov 2248 až 2312 (Scandella, D. et al. (1995) Blood 86:1811-1819). Ľudský a prasačí fVIII sú na 83% identické v tomto segmente 65 aminokyselinových zvyškov. Avšak homologická skenovacia mutagenéza tohto úseku s cielom charakterizovať C2 epitop viedla k odhaleniu, že hlavný determinant C2 epitopu je neočakávane lokalizovaný v úseku, ktorý zodpovedá aminokyselinám 2181 až 2243 (pozri sekvencia SEQ ID NO: 2 a obrázok IH)..

Pripravili sa proteíny hybridného ludského-prasačieho faktora VIII, v ktorých sa rôzne úseky C2 domény ludského faktora VIII nahradili zodpovedajúcimi časťami prasačieho faktora VIII a to použitím opísanej stratégie (pozri príklad 5). Syntéza rôznych 02 hybridných faktorov VIII sa uskutočnila prostredníctvom konštrukcie hybridnej kódujúcej sekvencie DNA, využitím nukleotidovej sekvencie, ktorá kóduje prasačí C2 úsek uvedený ako sekvencia SEQ ID NO:30. Každá hybridná DNA sa exprimovala v transfekovaných bunkách, takže sa hybridné faktory VIII mohli čiastočne purifikovať z rastového média. Aktivita sa merala, v neprítomnosti inhibítorov, jednofázovým koagulačným testom.

Zostava piatich ľudských inhibítorov sa použila na testovanie každého z hybridných faktorov VIII. Už skôr sa dokázalo, že inhibičné plazmy, ktoré obsahujú protilátky anti-faktor VIII sú namierené proti ludskej C2 doméne, a to na základe schopnosti rekombinantnej ľudskej C2 domény neutralizovať inhibíciu. Vo všetkých testovaných plazmách sa titer inhibítorov neutralizoval viac než na 79% C2 doménou alebo lahkým reťazcom, avšak menej než na 10% rekombinantnou ľudskou A2 doménou. Navyše C2-hybridné faktory VIII sa testovali proti myšej monoklonálnej protilátke, ktorá sa viaže na C2 doménu, a podobne ako ludské C2 inhibičné protilátky, inhibovala väzbu faktora VIII na fosfolipid a na von

Willebrandov faktor.

Porovnaním titrov inhibičných protilátok proti C2-hybridným faktorom VIII sa ukázalo, že hlavný determinant epitopu ľudského C2 inhibítora je úsek aminokyselinových zvyškov 2181 až 2243 (pozri sekvencia SEQ ID NO: 2 a tiež obrázok IH) . Anti-C2 protilátky namierené proti úsekom smerom k COOH-koncu od zvyšku 2253 sa neidentifikovali v štyroch z piatich sér pacientov. Porovnaním hybridov, ktoré majú prasačie sekvencie zodpovedajúce ludským aminokyselinovým zvyškom v polohách 2181 až 2199 a 2207 až 2243 sa ukázalo, že oba úseky prispievajú k väzbe protilátky. Prasačia aminokyselinová sekvencia zodpovedajúca ludským zvyškom 2181 až 2243 je číslovaná 1982 až 2044 v sekvencii SEQ ID NO: 30. Sekvencia prasačej DNA, ktorá kóduje prasačie aminokyseliny očíslované 1982 až 2044 je sekvencia nukleotidov 5944 až 6132 v sekvencii SEQ ID NO: 29.

S odkazom na obrázok IH vidieť, že v úseku 2181 až 2243, je 16 aminokyselinových rozdielov medzi ľudskou a prasačou sekvenciou. Rozdiely sa našli vo zvyškoch 2181, 2182, 2188, 2195 až 2197, 2199, 2207, 2216, 2222, 2224 až 2227, 2234, 2238 a 2243. Nahradenie jedného alebo viacerých z týchto aminokyselinových zvyškov sa môže uskutočniť, čím sa získa modifikovaný ľudský faktor VIII, ktorý je nereaktívny s ľudskými anti-C2 inhibičnými protilátkami. Alanínová skenovacia mutagenéza poskytuje vhodný spôsob na vytváranie alanínových substitúcií prirodzene sa vyskytujúcich zvyškov, ako už bolo opísané. Tiež aminokyseliny iné než alanín sa môžu nahradiť. Alanínové substitúcie jednotlivých aminokyselín, najmä tých, ktoré sú odlišné v ľudskéj/prasačej alebo ludskej/myšej sekvencii, alebo ktoré s najväčšou pravdepodobnosťou prispievajú k väzbe protilátky, môžu poskytnúť modifikovaný faktor VIII so zníženou reaktivitou a inhibičnými protilátkami.

Obrázky IA až IH spolu dohromady ukazujú priradené (porovnané) aminokyselinové sekvencie. (Ľudského, prasačieho a myšieho faktora VIII. Obrázok IA porovnáva úseky signálneho peptidu (ludskej sekvencie SEQ ID NO: 31; prasačej sekvencie SEQ ID NO: 30, aminokyseliny 1 až 19; myšej sekvencie SEQ ID NO: 28, aminokyseliny 1 až 19) . Aminokyseliny na obrázkoch IA až IH sú číslované tak, že prvý alanín zrelého proteínu je označený ako č. la teda aminokyseliny signálneho peptidu majú negatívne čísla. Ľudská fVIII sekvencia v sekvencií SEQ ID NO: 2 tiež začína prvým alanínom zrelého proteínu ako aj aminokyselinou č. 1. V aminokyselinovej sekvencií myšieho fVIII (sekvencia SEQ ID NO: 28) a prasačieho fVIII (sekvencia SEQ ID NO: 30) je prvá aminokyselina (alanín) zrelého proteínu označená ako aminokyselina č. 20. Obrázky IA až IH ukazujú porovnanie zodpovedajúcich sekvencií ludského, myšieho a prasačieho fVIII a to tak, že úseky s najväčšou aminokyselinovou identitou ležia vedia seba. Číslovanie aminokyselín na obrázkoch IA až IH . platí len pre ľudský fVIII. Obrázok IB ukazuje aminokyselinovú sekvenciu ludskej (sekvencia SEQ ID NO: 2, aminokyseliny 1 až 372), prasačej (sekvencia SEQ ID NO: 30, aminokyseliny 20 až 391) a myšej (sekvencia SEQ ID NO: 28, aminokyseliny 20 až 391) Al domény. Obrázok IC ukazuje aminokyselinovú sekvenciu ľudskej (sekvencia SEQ ID NO: 2, aminokyseliny 373 až 740), prasačej (sekvencia SEQ ID NO: 30, aminokyseliny 392 až 759) a myšej (sekvencia SEQ ID NO: 28, aminokyseliny 392 až 759) domény A2 faktora VIII. Obrázo'k 1D poskytuje aminokyselinovú sekvenciu ludskej (sekvencia SEQ ID NO: 2, aminokyseliny 741 až 1648), prasačej (sekvencia SEQ ID NO: 30, aminokyseliny 760 až 1449) a myšej (sekvencia SEQ ID NO: 28, aminokyseliny 760 až 1644) B domény faktora VIII. Obrázok IE porovnáva aminokyselinové sekvencie ludského, prasačieho a myšieho (sekvencia SEQ ID NO: 2, aminokyseliny 1649 až 1689; sekvencia SEQ ID NO: 30, aminokyseliny 1450 až 1490; a sekvencie

SEQ ID NO: 28, aminokyseliny 1641 až 1678, v uvedenom poradí) aktivačného peptidu lahkého reťazca faktora VIII. Obrázok IE poskytuje porovnanie ludskej, prasačej a myšej sekvencie (sekvencia SEQ ID NO: 2, aminokyseliny 1690 až 2019; sekvencia SEQ ID NO: 30, aminokyseliny 1491 až 1820; a sekvencie SEQ ID NO: 28, aminokyseliny 1679 až 2006, v uvedenom poradí) A3 domény faktora VIII. Obrázok IG ukazuje aminokyselinové sekvencie Cl domény ludského, prasačieho a myšieho (sekvencia SEQ ID NO: 2, aminokyseliny 2020 až 2172; sekvencia SEQ ID NO: 30, aminokyseliny 1821 až 1973; a sekvencie SEQ ID NO: 28, aminokyseliny 2007 až 2159, v uvedenom poradí) faktora VIII. Obrázok 1H ukazuje sekvencie C2 domény ludského, prasačieho a myšieho (sekvencia SEQ ID NO: 2, aminokyseliny 2173 až 2332; sekvencia SEQ ID NO: 30, aminokyseliny 1974 až 2133; a sekvencie SEQ ID NO: 28, aminokyseliny 2160 až 2319, v uvedenom poradí) faktora VIII.

Kosoštvorce označujú miesta sulfátovaného tyrozínu, predpokladané väzbové miesta faktora IXa, fosfolipidu a proteínu C sú dvakrát podčiarknuté a úseky, ktoré sa . podi'elajú na väzbe anti-A2 a anti-C2 inhibičných protilátok sú vyznačené kurzívou. Hviezdičky vyznačujú konzervatívne aminokyselinové sekvencie. Pozri tiež sekvenciu SEQ ID NO: 29 (cDNA prasačieho faktora VIII) a sekvenciu SEQ ID NO: 30 (dedukovaná aminokyselinová sekvencia prasačieho faktora VIII). Použil sa systém číslovania ludskej sekvencie ako referencia (Wood et al. (1984) supra). Al, A2 a B domény sú definované trombínovými štiepnymi miestami v pozícii 372 a 740 a štiepnym miestom neznámej proteázy v polohe 1648 ako segmenty zvyškov 1 až 372, 373 až 740 a 741 až 1648, v uvedenom poradí (Eaton, D.L. et al. (1986) Biochemistry 25:8343-8347). A3, Cl a C2 domény sú definované ako zvyšky 1690 až 2019, 2020 až 2172 a 2173 a až 2332, v uvedenom poradí (Vehar et al. (1984) supra). Štiepne miesta pre trombín (faktor Ha) , faktor IXa, faktor Xa a APC (Fay et al: (1991) supra; Eaton, D. et al. (1986) Biochemistry 25:505-512; Lamphear, B.J. et al, (1992) Blood 80:3120-3128) sú ukázané tak, že meno enzýmu je umiestnené nad reaktívnym arginínom. Kyslý peptid je odštiepený od lahkého reťazca fVIII trombínom alebo faktorom Xa v polohe 1689. Predpokladané väzbové miesta pre faktor IXa (Fay, P.J. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:20522-20527; Lenting, P.J. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:7150-7155), fosofolipid (Foster, P.A. et al. (1990) Blood 75:1999-2004) a proteín C (Walker, F.J. et al. (1990)J. Biol. Chem. 265:1484-1489) sú dvakrát podčiarknuté. Úseky, ktoré sa zúčastňujú na väzbe anti-A2 (Lubin et al. (1994) supra; Healey et al. (1995) supra) ; a už skôr navrhnuté pre anti-C2 inhibičné protilátky sú vyznačené kurzívou. C2 inhibítorový epitop identifikovaný, ako už bolo opísané (aminokyseliny 2181 až 2243 v ľudskej sekvencií) je ukázaný ako jedenkrát podčiarknutý úsek na obrázku IH. Miesta sulfátovaného tyrozínu (Pittman et al. (1992) supra; Michnick et al. (1994) supra) sú označené symbolom ♦.

Príklad 7

Konštrukcia POL1212 a expresia v bunkách obličiek novorodených škrečkov

POL1212 je prasačí faktor VIII čiastočne bez domény B, ktorý má B doménu deletovanú okrem toho, že 12 aminokyselín NH₂ konca B domény a 12 aminokyselín -COOH konca sú zachované.

cDNA kódujúce sekvencie pre domény Al, A2, ap-A3-Cl a C2 prasačieho fVIII sa získali, ako už bolo opísané v príklade 5. Nukleotidová sekvencia DNA a odvodená aminokyselinová sekvencia prasačieho faktora VIII sú uvedené v zozname sekvencií ako sekvencia SEQ ID NO: 29 a sekvencia SEQ ID NO: 30 v uvedenom poradí. Amplifikované fragmenty sa oddelene klonovali do plazmidu pBluescript II KS' (pBS).

POL1212 sa týka cDNA kódujúcej prasačí fVIII, ktorá nemá väčšinu B domény, ale obsahuje DNA sekvenciu, ktorá kóduje 24 aminokyselinový linker medzi doménami A2 a ap. POL1212 sa skonštruoval v cicavčom expresnom vektore, ReNeo, ktorý sa získal od firmy Biogen. ReNeo sa môže replikovať v baktériách, môže sa replikovať ako epizóm v bunkách COS na prechodnú expresiu faktora VIII alebo sa môže stabilne integrovať do celého radu cicavčích buniek. Skladá sa zo 1) sekvencií odvodených z plazmidu pBR322, ktoré obsahujú počiatok replikácie a gén rezistencie na ampicilín, 2) génu rezistencie na neomycín, ktorého expresia je pod kontrolou SV40 promótora/enhancera, SV40 malého t intrónu a regulačného elementu SV40 polyadenylačného signálu, 3) miesta pre inzerciu fVIII a jeho signálneho peptidu, ktorého expresia je pod kontrolou SV40 enhancera, hlavného neskorého promótora adenovírusu typu 2 a tripartitnej vedúcej sekvencie adenovírusu typu 2. Namiesto ReNeo vektora sa 'môže použiť každý vektor, ktorý má podobné funkčné zložky.

POL1212/ReNeo sa pripravil v niekoľkých krokoch. Najskôr sa cDNA, ktoré kódujú ťažký reťazec prasačieho fVIII (A1-A2) a cDNA, ktoré kódujú ľahký reťazec prasačieho fVIII (ap-A3-Cl-C2) oddelene zostavili v pBS. Z týchto konštruktov sa DNA, ktorá kóduje prasačí fVIII bez domény B zostavila v pBS (PB-/pBS). Táto forma prasačieho fVIII nemá celú B doménu, definované ako aminokyseliny zodpovedajúce zvyškom 741-1648 v ľudskom fVIII (nukleotidy 2278-5001 v ľudskej sekvencií). Ďalej bola ľudská A2 doména v expresnom vektore ReNeo (ΗΒ/ReNeo) s ľudským fVIII, ktorému chýba doména B substituovaná DNA, ktorá kóduje prasačí A2. Ľudské domény sa substituovali DNA, ktorá kóduje zvyšok prasačieho ťažkého reťazca a DNA, ktorá kóduje prasačí ľahký reťazec v dvoch ďalších krokoch použitím konštruktov s prasačím ťažkým reťazcom/pBS a PB/pBS, ktoré boli vytvorené skôr. Fragment ľudskej B domény kódujúci 5 C-koncových a 9 N-koncových aminokyselín sa vložil medzi A2 a A3 domény za vzniku konštruktu nazvaného PSQ/ReNeo (Healey et al., 1998, 92: 3701-3709). Zvyšky Glu2181-Vall2234 obsahujú hlavný determinant inhibičného epitopu v C2 doméne ľudského faktora VIII. Tento konštrukt sa použil ako templát na vytvorenie fragmentu prasačej B domény kódujúcej 12 C-koncových a 12 N-koncových aminokyselín. Tento fragment sa vložil medzi domény A2 a A3, čo malo za následok konečný konštrukt, POL1212/ReNeo.

POL1212 linker s 24 aminokyselinami sa skladá z prvých 12 a posledných 12 zvyškov B domény prasačieho fVIII. POL1212 linker má nasledujúcu sekvenciu:

SFAQNSRPPSASAPKPPVLRRHQR (sekvencia SEQ ID NO: 32)

Nukleotidová sekvencia zodpovedajúca 1212 linkeru a susediacim aminokyselinám je (sekvencia SEQ ID NO: 33)

GTC

ATT

GAA

CCT

AGG

AGC

TTT

GCC

CAG

AAT

TCA

AGA

CCC

CCT

AGT

V

I

E

P

R

S

F

A

Q

N

S

R

P

P

S

GCG

AGC

GCT

CCA

AAG

CCT

CCG

GTC

CTG

CGA

CGG

CAT

CAG

AGG

GAC

A

S

A

P

K

P

P

V

L

R

R

H

Q

R

D

ATA

AGC

CTT

CCT

ACT

I

S

L

P

T

POL1212 linker sa syntetizoval mutagenézou „splicing-by-overlap extension (SOE) takto:

PCR reakcie použité na vytváranie SOE produktov boli tieto:

Reakcia č. 1

Vonkajší primér: Rev 4, ' čo je primér pre prasačí A2, nukleotidy 1742-1761. (sekvencia SEQ ID NO: 29). Sekvencia je: 5' -GAGGAAAACCAGATGATGTCA-3' (sekvencia SEQ ID NO: 34).

Vnútorný primér: 0L12 čo je prasačí reverzný primér pokrývajúci prvých (5') 15 aminokyselín OL1212 a posledných (3') 5 aminokyselín prasačí A2. Sekvencia je:

5' -CTTTGGAGCGCTCGCACTAGGGGGTCTTGAATTCTGGGCAAAGCTCCTAGGTTCAATGAC- 3' (sekvencia SEQ ID NO: 35)

Templát: PSQ/ReNeo

Produkt: prasačia DNA od nukleotidu 1745 v A2 doméne k 2322 v OL1212, 580 bp

Reakcia č. 2

Vonkajší primér: P2949 je prasačí reverzný A3 primér, nukleotidy 2998-3021 zo sekvencie SEQ ID NO: 29. Sekvencia je: 5'-GGTCACTTGTCTACCGTGAGCAGC-3' (pozri sekvencia SEQ ID NO: 29)

Vnútorný primér: OL12+, prasačí primér pokrývajúci posledných (3') 16 aminokyselín OL1212 a prvých (5') 6 aminokyselín aktivačného peptidu, nukleotidy 2302-2367 zo sekvencie SEQ ID NO: 29. Sekvencia je:

5'-CCTAGTGCGAGCGCTCCAAAGCCTCCGGTCCTGCGACGGCATCAGAGGGACATAAGCCTTC

CTACT-3' (sekvencia SEQ ID NO: 36)

Templát: PSQ/ReNeo

Produkt: prasačí od nukleotidu 2302 v OL1212 do nukleotidu 3021 v doméne A3, 719 bp

SOE reakcia

Priméry: Rev 4, P2949Templáty: Fragment z reakcie č. 1 (bp) a fragment s nízkou teplotou topenia z reakcie č. 2 (bp)

Produkt: prasačia DNA od nukleotidu 1742 v A2 doméne do nukleotidu 3021 v A3 doméne (sekvencia SEQ ID NO: 29) vrátane OL1212, 1279 bp. Reakčný produkt bol precipitovaný etanolom.

1212 linker sa vložil do PSQ/ReNeo štiepením SOE produktu (inzertu) a PSQ/ReNeo (vektora) s BsaBI. Vektor a inzert sa ligovali použitím T4 ligázy a produkt sa použil na transformáciu buniek E. coli XLl-Blue. Plazmidová DNA sa pripravila z niekoľkých kolónií a sekvencia 1212 linkera a ďalšia PCR generovaná sekvencia sa overili sekvenčnou analýzou DNA.

Pestovanie buniek obličiek novorodených škrečkov (BHK) CRL-1632

Bunková línia BHK sa získala zo zbierky ATCC, prístupová identifikácia CRL-1632 a uložila sa zamrazená pri -20°C až do ďalšieho použitia. Bunky sa rozmrazili pri 37°C a vložili do 10 ml kompletného média, definovaného ako DMEM/F12, 50 LJ/ml penicilínu, 50 μς/πιΐ streptomycínu plus 10% fetálne hovädzie sérum (FBS). FSB bolo kúpené od firmy Hyclone, Logan, Utah. Bunky sa centrifugovali počas 2 minút v 300 RPM. Médium sa odsalo a bunky sa resuspendovali v 2 ml kompletného média vo fľaši T-75 obsahujúcej 20 ml kompletného média.

POL1212 sa exprimoval v bunkách ako obličiek novorodených škrečkov (BHK), tak v bunkách vaječníkov čínskeho škrečka (CHO). Použili sa dve BHK línie, línia CRL-1632 z ATCC a ďalšia BHK línia získaná od R. Mcgillivray, University of British Columbia, (Funk, et al., (1990) Biochemistry, 29:1654-1660). Posledné uvedené sa pestovali bez selekcie v laboratóriu pôvodcov a nazvali sa BHK1632 (Emory). CHO bunková línia bola CHO-K1, ATCC prístupové č. CCL-61. Expresia priemerného klonu z bunkovej línie Emory a z buniek CHO-K1 bola vyššia než z buniek CRL-1632, ako sa usúdilo z aktivity v chromogénnom teste.

Bunky pestované vo fľašiach T-75 vytvorili konfluentnú monovrstvu. Pripravilo sa 60 ml kultúry buniek E coli XLl-Blue, ktoré nesú plazmid POL1212/ReNeo v médiu LB/ampicilín (50 mg/ml).

Transfekcia buniek CRL-1632 BHK plazmidom POL1212/ReNeo

DNA z kultúry buniek POL1212/ReNeo XLl-Blue pestovaných cez noc sa pripravila použitím súpravy na minipreparáciu Spin Miniprep kit (Qiagen, Valencia, CA). Jedna fľaša buniek CRL-1632 sa rozdelila do zásobnej fľaše s 0,2 ml a do fľaše na transfekciu s 0,3 ml z celkových 2 ml. Ďalšia fľaša bola doplnená čerstvým médiom. Médium bolo DMEM/F12 + 10% Hyclone FBS + 50 U/ml penicilínu, 50 μ9/πι1 streptomycínu. Bunky CRL-1632 sa rozdelili do 6 jamkových doštičiek s cielom dosiahnuť 50 až 90% konfluenciu na transfekciu (0,3 ml buniek z fľaše T-75 v 2 ml 1:5000 Versene [Life Technologies, Gaithersburg, MD] v každej jamke) použitím čerstvého média DMEM/F12 + 10% Hyclone FBS + 50 U/ml penicilín, 50 μg/ml streptomycín.

Nasledujúce roztoky sa pripravili v sterilných skúmavkách s objemom 1 až 2 ml:

A) 48 μΐ (10 μg) Miniprep POL1212/ReNeo DNA plus μΐ médium bez séra (DMEM/F12) plus 10 ml Lipofectin™ (Life Technologies, Gaithersburg, MD).

B) 10 μΐ Lipofectin plus 190 μΐ média („slepá transfekcia) sa jemne zmiešalo a DNA a Lipofectin sa nechali reagovať 15 minút pri teplote miestnosti. Počas tohto času sa bunky premyli dvakrát s 2 ml DMEM/F12. 1,8 ml DMEM/F12 sa potom pridalo k bunkám. Komplex DNA/Lipofectin sa pridal po kvapkách k bunkám a -jemne pretrepal, aby sa premiešal. Bunky sa ponechali v inkubátore cez noc. DNA/Lipofectin sa odobral a pridali sa 3 ml média so sérom k bunkám. Bunky sa potom inkubovali 30 až 48 hodín. Geneticín sa zakúpil od firmy Life Technologies, Gaithersburg, MD. Bunkové kultúry sa nariedili 1:20, 1:50 a 1:100, 1:250, 1:500 a naniesli na 10 cm misky v 10 ml média so sérom obsahujúcim 535 μg/ml geneticínu. Za niekoľko dní bunky, ktoré neprijali plazmid POL1212/ReNeo sa usmrtili pôsobením geneticínu. Zvyšné bunky pokračovali v replikácii v médiu s geneticínom a vytvorili na miskách viditelné monovrstvové kolónie.

Expresia a test POL1212 v bunkách BHK CRL-1632

Malé plastové krúžky sa umiestnili okolo kolónií. Kolónie sa odsali oddelene použitím kompletného média a preniesli do skúmaviek. Tieto kolónie sú označované ako „kruhovo klonované kolónie. Tieto kruhovo klonované kolónie sa naniesli na 24 jamkové doštičky a ďalej sa pestovali v kompletnom médiu.

Test s chromogénnym substrátom na expresiu faktora VIII pomocou buniek transfekovaných CRL-1632

Vzorky POL1212 zo supernatantov bunkových kultúr sa zmiešali s 50 nM purifikovaného prasačieho faktora IXa a 0,05 mM fosfatidylcholín/fosfatidylserínových (PCPS) vezikúl v 0,15 M NaCl, 20 m HEPES, 5 mM CaCl2, 0,01% Tween 80, pH 7,4. Ako kontrola sa použilo médium z bunkových kultúr „slepo transfekovaných buniek. Trombín a faktor X sa pridali simultánne do výslednej koncentrácie 40 a 425 nM, v uvedenom poradí. Trombín aktivuje faktor VIII, ktorý potom spolu s PCPS slúži ako kofaktor pre faktor IXa v priebehu aktivácie faktora X.

Po 5 minútach aktivácia faktora X pomocou faktora IXa/faktora VlIIa/PCPS sa zastavila pridaním EDTA na výslednú koncentráciu 50 mM. V rovnakom čase sa aktivácia faktora VIII trombínom zastavila pridaním inhibítora trombínu, rekombinantného desulfatohirudínu, do výslednej koncentrácie 100 nM. 25 μΐ vzorka reakčnej zmesi sa preniesla do jamky mikrotitračnej doštičky, kam sa pridalo 74 μΐ Spectrozymu Xa (America Diagnostica, Greenwich, CT) čo je chromogénny substrát pre faktor Xa. Výsledná koncentrácia Spectrozymu Xa bola 0,6 mM. Zmena absorbancie pri 405 nm v dôsledku štiepenia Spectrozymu’ Xa faktorom Xa sa monitorovala súvisle počas 5 minút pomocou čítacieho zariadenia pre mikrotitračné doštičky Vmax Kinetic Plate Reader (Molecular Devices, Inc., Menlo Park, CA). Výsledky sú vyjadrené ako hodnoty A₄o₅/min.

Chromogénny test na Faktor VIII desiatich kruhovo-klonovaných kolónií:

Počet kolónií	A4o5/min (xlO3)
Pufor	0,2
1	2,1
2	8,4
3	6,4
4	10,7
5	12,5
6	7,6 .
7	51,3
8	139,5
9	3,8
10	8,4

Tieto výsledky ukazujú, že všetkých desať kolónií, ktoré sa vybrali, prejavuje aktivitu faktora VIII aspoň desaťkrát vyššiu než je hodnota pozadia.

Aktivita z média kolónie 8, ktorá bola kolóniou s najvyššou expresiou sa ďalej skúmala pomocou jednofázového koagulačného testu faktora VIII. V tomto teste sa 50 ml plazmy deficientnej na faktor VIII (George King Biomedical Overland Park, KA) , 5 ml vzorky alebo štandardu a 50 ml aktivovanej partikulárnej tromboplastínovej časovej reagencie (activated particulate thromboplastin time reagent) (Organon Teknika, Durham, NC) inkubovalo 3 minúty pri 37 °C. Vzorky obsahujú médium z kolónie 8 nariedené v 0,15 M NaCl, mM Hepes, pH 7,4 (HBS) alebo ako kontrolu, kompletné médium. Koagulácia sa iniciovala pridaním 50 ml 20 mM CaCl2- Koagulačný čas sa meral použitím zariadenia ST4 BIO

Coagulation Inštrument (Diagnostica Stago, Parsippany, NJ) . Štandardná (kalibračná) krivka sa ' získala pomocou riedenia zlúčenej, citrátom ošetrenej normálnej ludskej plazmy, šarža č. 0641 (George King Biomedical, Overland Park, KA) . Koncentrácia štandardu faktora VIII bola 0,9 jednotky na 1 ml.

Štandardná (kalibračná) krivka:

Riedenie	U/ml	Koagulačný čas
1) neriedené	0,96	45,2
2) 1/3 (HBS)	0,32	53,7
3) 1/11 (HBS)	0, 087	62,5
4) 1/21 (HBS)	0,046	68,9
Lineárna koncentrácie	regresia funkcie koagulačného času oproti logaritmu štandardu poskytla korelačný koeficient 0,997.
Test látok poskytol nasledujúce koagulačné časy, ktoré sa previedli na hodnoty jednotky/ml použitím štandardnej krivky:

	Vzorka	Koagulačný čas (s)	U/ml
D	Kolónia 8 (24h) ,	1/10 v HBS	40, 6	1,74	x 10 =	17,4
2)	Kolónia 8 (24h),	1/10 v HBS	41,1	1, 63	x 10 =	16, 3
3)	Kolónia 8 (24h),	1/20 v HBS	47,7	0, 69	x 20 =	13,8
4)	Kolónia 8 (24h) ,	1/20 v HBS	47,2	0,73	x 20 =	14,6
5)	Úplné médium		82, 9		0,007
6)	Úplné médium		83,3		0,006
	Tieto výsledky	ukazujú, že	koagulačná	aktivita	kolónie	8 je

približne 2000 krát vyššia než pri kontrolnej vzorke.

DNA sekvencia kódujúca POL1212 je uvedená v zozname sekvencii ako sekvencia SEQ ID NO: 37. Kódovaná aminokyselinová sekvencia POL1212 je uvedená v zozname sekvencii ako sekvencia

SEQ ID NO 38. Ďalšie purifikácie POL1212 sa môžu uskutočňovať pomocou celého radu známych metód ako je napr. imunoafinitná chromatografia a HPLC chromatografia-pozri príklady 2 a 3.

Všeobecné poznámky na záver

Treba mať na zreteli, že malé variácie aminokyselinovéj sekvencie alebo DNA sekvencie, ktoré kódujú aminokyselinovú sekvenciu týkajúcu sa POL1212 sa môžu vniesť, bez toho aby sa podstatne zmenili ich základné funkcie. Napríklad dĺžka sekvencie B domény, ktorá sa ponechala ako linker medzi A2 doménou a aktivačným peptidom sa môže zväčšiť alebo zmenšiť v rámci možností, ktoré vyplývajú zo stavu techniky. Sekvenčné varianty sa môžu vniesť do úseku linkera, pričom sa zachová ekvivalentne funkčný POL1212 a prasačí faktor VIII bez domény B, ako je ukázané v tomto texte, a ako je známe v stave techniky. Na základe porovnaní známych aminokyselinových sekvencii faktorov VIII, ktoré majú koagulačnú aktivitu v ľudskej krvi, sa môžu pripraviť na základe aminokyselinovéj sekvencie POL1212 sekvenčného variantu ako substitúciami jednotlivých aminokyselín tak aj substitúciami peptidových segmentov známymi funkčnými variantmi, ktoré si zachovajú svoje základné funkcie. Uvedené varianty nie sú nijako vyčerpávajúce ani obmedzujúce, sú uvedené iba ako príklad modifikácií sekvencii, ktoré môžu byť pripravené odborníkom na základe stavu techniky, bez toho aby sa podstatne zmenili vlastnosti proteínu. Všetky takéto varianty a modifikácie spadajú do nárokov predkladaného vynálezu alebo ich ekvivalentov.

Prehlad sekvencií uvedených v zozname sekvencií

Sekvencia SEQ ID NO:	Identifikácia
1	cDNA ľudského faktora VIII, kód pre aminokyselinu NO: 1 zrelého proteínu začína nukleotidom NO: 208
2	Aminokyselinová sekvencia ľudského faktora
3	cDNA A2 domény prasačieho faktora VIII
4	Aminokyselinová sekvencia A2 domény prasačieho faktora VIII
5 až 27	Sekvencia oligonukleotidových primérov (pozri príklad 5)
28	Aminokyselinová sekvencia myšieho faktora VIII
29	cDNA prasačieho faktora VIII
30	Aminokyselinová sekvencia prasačieho faktora VIII
31	Aminokyselinová sekvencia signálneho peptidu ľudského faktora VIII.
32 až 36	Sekvencia oligonukleotidových primérov (pozri príklad 7)
37	DNA kódujúca POL1212
38	Aminokyselinová sekvencia POL1212

Zoznam sekvencií <110> Emory University <120> Modifikovaný factor VIII <130> 75-951 WO <140> PCT/US01/05076 <141> 2001-02-16 <150> US 09/523,656 <151> 2000-03-10 <150> US 09/037,601 <151> 1998-03-10 <150> US 08/670,707 <151> 1996-06-26 <160> 38 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 9009 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (208) . . (7203) <400> 1 cagtgggtaa gttccttaaa tgctctgcaa agaaattggg acttttcatt aaatcagaaa 60 ttttactttt ttcccctcct gggagctaaa gatattttag agaagaatta accttttgct 120 tctccagttg aacatttgta gcaataagtc atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ISO ctgtgccttt tgcgattctg ctttagt gcc acc aga aga tac tac ctg ggt gca 234 Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala

5

gtg gaa

ctg Leu

tca tgg gac tat

atg Met

caa Gin

agt Ser

gat Asp 20

ctc Leu

ggt Gly

gag Glu

ctg cct

23 2

Val 10

Glu

Ser

Trp Asp Tyr 15

Leu

Pro 25

gtg

gac

gca

aga

ttt

cct

cct

aga

gtg

cca

aaa

tct

ttt

cca

ttc

aac

330

Val

Asp

Ala

Arg

Phe

Pro

Pro

Arg

Val

Pro

Lys

Ser

Phe

Pro

Phe

Asn

30

35

40

acc

tca

gtc

gtg

tac

aaa

aag

act

ctg

ttt

gta

gaa

ttc

acg

gtt

cac

378

Thr

Ser

Val

Val

Tyr

Lys

Lys

Thr

Leu

Phe

Val

Glu

Phe

Thr

Val

His

45

50

55

ctt

ttc

aac

atc

get

aag

cca

agg

cca

CCC

tgg

atg

ggt

ctg

cta

ggt

426

Leu

Phe

Asn

íle

Ala

Lys

Pro

Arg

Pro

Pro

Trp

Met

Gly

Leu

Leu

Gly

60

65

70

474

cct Pro

acc Thr 75

atc cag

get Ala

gag Glu

gtt Val 80

tat Tyr

gat Asp

aca Thr

gtg gtc

att íle

aca Thr

ctt Leu

aag Lys

íle

Gin

Val

Val 85

aac

atg

get

tcc

cat

cct

gtc

agt

ctt

cat

get

gtt

ggt

gta

tcc

tac

Asn

Met

Ala

Ser

His

Pro

Val

Ser

Leu

His

Ala

Val

Gly

Val

Ser

Tyr

90

95

100

105

tgg

aaa

get

tet

gag

gga

get

gaa

tat

gat

gat

cag

acc

agt

caa

agg

Trp

Lys

Ala

Ser

Glu

Gly

Ala

Glu

Tyr

Asp

Asp

Gin

Thr

Ser

Gin

Arg

110

115

120

gag

aaa

gaa

gat

gat

aaa

gtc

ttc

cct

ggt

gga

age

cat

aca

tat

gtc

Glu

Lys

Glu

Asp

Asp

Lys

Val

Phe

Pro

Gly

Gly

Ser

His

Thr

Tyr

Val

125

130

135

tgg

cag

gtc

ctg

aaa

gag

aat

ggt

cca

atg

gcc

tet

gac

cca

ctg

tgc

Trp

Gin

Val

Leu

Lys

Glu

Asn

Gly

Pro

Met

Ala

Ser

Asp

Pro

Leu

Cys

140

145

150

ctt

acc

tac

tca

tat

ctt

tet

cat

gtg

gac

ctg

gta

aaa

gac

ttg

aat

Leu

Thr

Tyr

Ser

Tyr

Leu

Ser

His

Val

Asp

Leu

Val

Lys

Asp

Leu

Asn

155

160

165

tca

ggc

ctc

att

gga

gcc

cta

cta

gta

tgt

aga

gaa

ggg

agt

ctg

gcc

Ser

Gly

Leu

íle

Gly

Ala

Leu

Leu

Val

Cys

Arg

Glu

Gly

Ser

Leu

Ala

170

175

180

185

aag

gaa

aag

aca

cag

acc

ttg

cac

aaa

ttt

ata

cta

ctt

ttt

get

gta

Lys

Glu

Lys

Thr

Gin

Thr

Leu

His

Lys

Phe

íle

Leu

Leu

Phe

Ala

Val

190

195

200

ttt

gat

gaa

ggg

aaa

agt

tgg

cac

tca

gaa

aca

aag

aac

.tcc

ttg

atg

Phe

Asp

Glu

Gly

Lys

Ser

Trp

His

Ser

Glu

Thr

Lys

Asn

Ser

Leu

Met

205

210

215

cag

gat

agg

gat

get

gca

tet

get

cgg

gcc

tgg

cct

aaa

atg

cac

aca

Gin

Asp

Arg

Asp

Ala

Ala

Ser

Ala

Arg

Ala

Trp

Pro

Lys

Met

His

Thr

220

225

230

gtc

aat

ggt

tat

gta

aac

agg

tet

ctg

cca

ggt

ctg

att

gga

tgc

cac

Val

Asn

Gly

Tyr

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

Pro

Gly

Leu

íle

Gly

Cys

His

235

240

245

agg

aaa

tca

gtc

tat

tgg

cat

gtg

att

gga

atg

ggc

acc

act

cct

gaa

Arg

Lys

Ser

Val

Tyr

Trp

His

Val

íle

Gly

Met

Gly

Thr

Thr

Pro

Glu

250

255

260

265

gtg

cac

tca

ata

ttc

ctc

gaa

ggt

cac

aca

ttt

ctt

gtg

agg

aac

cat

Val

His

Ser

íle

Phe

Leu

Glu

Gly

His

Thr

Phe

Leu

Val

Arg

Asn

His

270

275

280

cgc

cag

gcg

tcc

ttg

gaa

atc

tcg

cca

ata

act

ttc

ctt

act

get

caa

Arg

Gin

Ala

Ser

Leu

Glu

íle

Ser

Pro

íle

Thr

Phe

Leu

Thr

Ala

Gin

285

290

295

aca

ctc

ttg

atg

gac

ctt

gga

cag

ttt

cta

ctg

ttt

tgt

cat

atc

tet

Thr

Leu

Leu

Met

Asp

Leu

Gly

Gin

Phe

Leu

Leu

Phe

Cys

His

Ilé

Ser

300

305

310

tcc

cac

caa

cat

gat

ggc

atg

gaa

get

tat

gtc

aaa

gta

gac

age

tgt

Ser

His

Gin

His

Asp

Gly

Met

Glu

Ala

Tyr

Val

Lys

Val

Asp

Ser

Cys

522

570

618

666

714

762

810

858

906

954

1002

1050

1098

1146

1194

315 320 325

cca gag

gaa Glu

ccc caa

cta ega atg aaa aat

aat Asn 340

gaa gaa gcg gaa

gac Asp 345

1242

Pro 330

Glu

Pro

Gin

Leu 335

Arg Met

Lys

Asn

Glu

Glu

Ala

Glu

tat

gat

gat

gat

ctt

act

gat

tct

gaa

atg

gat

gtg

gtc

agg

ttt

gat

1290

Tyr

Asp

Asp

Asp

Leu

Thr

Asp

Ser

Glu

Met

Asp

Val

Val

Arg

Phe

Asp

350

355

360

gat

gac

aac

tct

cct

tcc

ttt

atc

caa

att

ege

tca

gtt

gcc

aag

aag

1338

Asp

Asp

Asn

Ser

Pro

Ser

Phe

íle

Gin

íle

Arg

Ser

Val

Ala

Lys

Lys

365

370

375

cat

cct

aaa

act

tgg

gta

cat

tac

att

get

get

gaa

gag

gag

gac

tgg

1386

His

Pro

Lys

Thr

Trp

Val

His

Tyr

íle

Ala

Ala

Glu

Glu

Glu

Asp

Trp

380

385

390

gac

tat

get

ccc

tta

gtc

ctc

gcc

ccc

gat

gac

aga

agt

tat

aaa

agt

1434

Asp

Tyr

Ala

Pro

Leu

Val

Leu

Ala

Pro

Asp

Asp

Arg

Ser

Tyr

Lys

Ser

395

400

405

caa

tat

ttg

aac

aat

ggc

cct

cag

cgg

att

ggt

agg

aag

tac

aaa

aaa

1462

Gin

Tyr

Leu

Asn

Asn

Gly

Pro

Gin

Arg

íle

Gly

Arg

Lys

Tyr

Lys

Lys

410

415

420

425

gtc

ega

ttt

atg

gca

tac

aca

gat

gaa

acc

ttt

aag

act

cgt

gaa

get

1530

Val

Arg

Phe

Met

Ala

Tyr

Thr

Asp

Glu

Thr

Phe

Lys

Thr

Arg

Glu

Ala

430

435

440

att

cag

cat

gaa

tca

gga

atc

ttg

gga

cct

tta

ctt

tat

ggg

gaa

gtt

1573

íle

Gin

His

Glu

Ser

Gly

íle

Leu

Gly

Pro

Leu

Leu

Tyr

Gly

Glu

Val

445

450

455

gga

gac

aca

ctg

ttg

att

ata

ttt

aag

aat

caa

gca

age

aga

cca

tat

1626

Gly

Asp

Thr

Leu

Leu

íle

íle

Phe

Lys

Asn

Gin

Ala

Ser

Arg

Pro

Tyr

460

465

470

aac

atc

tac

cct

cac

gga

atc

act

gat

gtc

cgt

cct

ttg

tat

tca

agg

1674

Asn

íle

Tyr

Pro

His

Gly

íle

Thr

Asp

Val

Arg

Pro

Leu

Tyr

Ser

Arg

475

480

485

aga

tta

cca

aaa

ggt

gta

aaa

cat

ttg

aag

gat

ttt

cca

att

ctg

cca

1722

Arg

Leu

Pro

Lys

Gly

Val

Lys

His

Leu

Lys

Asp

Phe

Pro

íle

Leu

Pro

490

495

500

505

gga

gaa

ata

ttc

aaa

tat

aaa

tgg

aca

gtg

act

gta

gaa

gat

ggg

cca

1770

Gly

Glu

íle

Phe

Lys

Tyr

Lys

Trp

Thr

Val

Thr

Val

Glu

Asp

Gly

Pro

510

515

520

act

aaa

tca

gat

cct

cgg

tgc

ctg

acc

ege

tat

tac

tct

agt

ttc

gtt

1818

Thr

Lys

Ser

Asp

Pro

Arg

Cys

Leu

Thr

Arg

Tyr

Tyr

Ser

Ser

Phe

Val

525

530

535

aat

atg

gag

aga

gat

cta

get

tca

gga

ctc

att

ggc

cct

ctc

ctc

atc

1866

Asn

Met

Glu

Arg

Asp

Leu

Ala

Ser

Gly

Leu

íle

Gly

Pro

Leu

Leu

íle

540

545

550

tgc

tac

aaa

gaa

tct

gta

gat

caa

aga

gga

aac

cag

ata

atg

tca

gac

1914

Cys

Tyr

Lys

Glu

Ser

Val

Asp

Gin

Arg

Gly

Asn

Gin

íle

Met

Ser

Asp

555

560

565

aag agg aat gtc atc ctg ttt tct gta ttt gat gag aac ega age tgg 1962

Lys Arg Asn Val 570

íle Leu Phe 575

Ser

Val

Phe Asp Glu 580

Asn

Arg

Ser

Trp 585

tac

ctc

aca

gag

aat

ata

caa

ege

ttt

ctc

ccc

aat

cca

get

gga

gtg

2010

Tyr

Leu

Thr

Glu

Asn

íle

Gin

Arg

Phe

Leu

Pro

Asn

Pro

Ala

Gly

Val

590

595

600

cag

Ctt

gag

gat

cca

gag

ttc

caa

gcc

tcc

aac

atc

atg

cac

age

atc

2058

Gin

Leu

Glu

Asp

Pro

Glu

Phe

Gin

Ala

Ser

Asn

íle

Met

His

Ser

íle

605

610

615

aat

ggc

tat

gtt

ttt

gat

agt

ttg

cag

ttg

tca

gtt

tgt

ttg

cat

gag

2106

Asn

Gly

Tyr

Val

Phe

Asp

Ser

Leu

Gin

Leu

Ser

Val

Cys

Leu

His

Glu

620

625

630

gtg

gca

tac

tgg

tac

att

cta

age

att

gga

gca

cag

act

gac

ttc

ctt

2154

Val

Ala

Tyr

Trp

Tyr

íle

Leu

Ser

íle

Gly

Ala

Gin

Thr

Asp

Phe

Leu

635

640

645

tct

gtc

ttc

ttc

tct

gga

tat

acc

ttc

aaa

cac

aaa

atg

gtc

tat

gaa

2202

Ser

Val

Phe

Phe

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Lys

His

Lys

Met

Val

Tyr

Glu

650

655

660

665

gac

aca

ctc

acc

cta

ttc

cca

ttc

tca

gga

gaa

act

gtc

ttc

atg

tcg

2250

Asp

Thr

Leu

Thr

Leu

Phe

Pro

Phe

Ser

Gly

Glu

Thr

Val

Phe

Met

Ser

670

675

680

atg

gaa

aac

cca

ggt

cta

tgg

att

ctg

ggg

tgc

cac

aac

tca

gac

ttt

2298

Met

Glu

Asn

Pro

Gly

Leu

Trp

íle

Leu

Gly

Cys

His

Asn

Ser

Asp

Phe

685

690

695

cgg

aac

aga

ggc

atg

acc

gcc

tta

ctg

aag

gtt

tct

agt

tgt

gac

aag

2346

Arg

Asn

Arg

Gly

Met

Thr

Ala

Leu

Leu

Lys

Val

Ser

Ser

Cys

Asp

Lys

700

705

710

aac

act

ggt

gat

tat

tac

gag

gac

agt

tat

gaa

gat

att

tca

gca

tac

2394

Asn

Thr

Gly

Asp

Tyr

Tyr

Glu

Asp

Ser

Tyr

Glu

Asp

íle

Ser

Ala

Tyr

715

720

725

ttg

ctg

agt

aaa

aac

aat

gcc

att

gaa

cca

aga

age

ttc

tcc

cag

aat

2442

Leu

Leu

Ser

Lys

Asn

Asn

Ala

íle

Glu

Pro

Arg

Ser

Phe

Ser

Gin

Asn

730

735

740

745

tca

aga

cac

cct

age

act

agg

caa

aag

caa

ttt

aat

gcc

acc

aca

att

2490

Ser

Arg

His

Pro

Ser

Thr

Arg

Gin

Lys

Gin

Phe

Asn

Ala

Thr

Thr

íle

750

755

760

cca

gaa

aat

gac

ata

gag

aag

act

gac

cct

tgg

ttt

gca

cac

aga

aca

2538

Pro

Glu

Asn

Asp

íle

Glu

Lys

Thr

Asp

Pro

Trp

Phe

Ala

His

Arg

Thr

765

770

775

cct

atg

cct

aaa

ata

caa

aat

gtc

tec

tct

agt

gat

ttg

ttg

atg

ctc

2586

Pro

Met

Pro

Lys

íle

Gin

Asn

Val

Ser

Ser

Ser

Asp

Leu

Leu

Met

Leu

780

785

790

ttg

ega

cag

agt

cct

act

cca

cat

ggg

cta

tcc

tta

tct

gat

ctc

caa

2634

Leu

Arg

Gin

Ser

Pro

Thr

Pro

His

Gly

Leu

Ser

Leu

Ser

Asp

Leu

Gin

795

800

805

gaa

gcc

aaa

tat

gag

act

ttt

tct

gat

gat

cca

tca

cct

gga

gca

ata

2682

Glu

Ala

Lys

Tyr

Glu

Thr

Phe

Ser

Asp

Asp

Pro

Ser

Pro

Gly

Ala

íle

810

815

820

825

gac Asp

agt Ser

aat Asn

aac Asn

agc Ser 830

ctg Leu

tet Ser

gaa Glu

atg Met

aca Thr 835

cac His

ttc Phe

agg Arg

cca Pro

cag Gin 840

ctc Leu

2730

cať

cac

agt

ggg

gac

atg

gta

ttt

acc

cct

gag

tca

ggc

ctc

caa

tta

2778

His

His

Ser

Gly 845

Asp

Met

Val

Phe

Thr 850

Pro

Glu

Ser

Gly

Leu 855

Gin

Leu

aga

tta

aat

gag

aaa

ctg

ggg

aca

act

gca

gca

aca

gag

ttg

aag

aaa

2826

Arg

Leu

Asn 860

Glu

Lys

Leu

Gly

Thr 865

Thr

Ala

Ala

Thr

Glu 870

Leu

Lys

Lys

ctt

gat

ttc

aaa

gtt

tet

agt

aca

tca

aat

aat

ctg

att

tca

aca

att

2874

Leu

Asp 875

Phe

Lys

Val

Ser

Ser 880

Thr

Ser

Asn

Asn

Leu 885

íle

Ser

Thr

íle

cca

tca

gac

aat

ttg

gca

gca

ggt

act

gat

aat

aca

agt

tcc

tta

gga

2922

Pro 890

Ser

Asp

Asn

Leu

Ala 895

Ala

Gly

Thr

Asp

Asn 900

Thr

Ser

Ser

Leu

Gly 905

ccc

cca

agt

atg

cca

gtt

cat

tat

gat

agt

caa

tta

gat

acc

act

cta

2970

Pro

Pro

Ser

Met

Pro 910

Val

His

Tyr

Asp

Ser 915

Gin

Leu

Asp

Thr

Thr 920

Leu

ttt

ggc

aaa

aag

tca

tet

ccc

ctt

act

gag

tet

ggt

gga

cct

ctg

agc

3013

Phe

Gly

Lys

Lys 925

Ser

Ser

Pro

Leu

Thr 930

Glu

Ser

Gly

Gly

Pro 935

Leu

Ser

ttg

agt

gaa

gaa

aat

aat

gat

tca

aag

ttg

tta

gaa

tca

ggt

tta

atg

3066

Leu

Ser

Glu 940

Glu

Asn

Asn

Asp

Ser 945

Lys

Leu

Leu

Glu

Ser 950

Gly

Leu

Met

aat

agc

caa

gaa

agt

tca

tgg

gga

aaa

aat

gta

tcg

tca

aca

gag

agt

3114

Asn

Ser 955

Gin

Glu

Ser

Ser

Trp 960

Gly

Lys

Asn

Val

Ser 965

Ser

.Thr

Glu

Ser

ggt

agg

tta

ttt

aaa

ggg

aaa

aga

get

cat

gga

cct

get

ttg

ttg

act

3162

Gly 970

Arg

Leu

Phe

Lys

Gly 975

Lys

Arg

Ala

His

Gly 980

Pro

Ala

Leu

Leu

Thr 985

aaa

gat

aat

gcc

tta

ttc

aaa

gtt

agc

atc

tet

ttg

tta

aag

aca

aac

3210

Lys

Asp

Asn

Ala

Leu 990

Phe

Lys

Val

Ser

íle 995

Ser

Leu

Leu

Lys

Thr 1000

Asn

aaa

act

tcc

aat

aat

tca

gca

act

aat

aga

aag

act

cac

att

gat

ggc

3253

Lys

Thr

Ser Asn 1005

Asn

Ser

Ala

Thr Asn 1010

Arg

Lys

Thr

His

íle 1015

Asp

Gly

cca

tca

tta

tta

att

gag

aat

agt

cca

tca

gtc

tgg

caa

aat

ata

tta

3306

Pro

Ser Leu 1020

Leu

íle

Glu

Asn Ser 1025

Pro

Ser

Val

Trp Gin 1030

Asn

íle

Leu

gaa

agt

gac

act

gag

ttt

aaa

aaa

gtg

aca

cct

ttg

att

cat

gac

aga

3354

Glu Ser 1035

Asp

Thr

Glu

Phe Lys 1040

Lys

Val

Thr

Pro Leu 1045

íle

His

Asp

Arg

atg

ctt

atg

gac

aaa

aat

get

aca

get

ttg

agg

cta

aat

cat

atg

tca

3402

Met 1050

Leu 1

Met

Asp

Lys Asn 1055

Ala

Thr

Ala

Leu Arg 1060

Leu

Asn

His

Met

Ser 1065

aat

aaa

act

act

tca

tca

aaa

aac

atg

gaa

atg

gtc

caa

cag

aaa

aaa

3450

Asn

Lys

Thr

Thr Ser 1070

Ser

Lys

Asn

Met Glu 1075

Met

Val

Gin

Gin Lys 1080

Lys

gag ggc ccc att cca cca gat gca caa aat cca gat atg tcg ttc ttt 3498

Glu Gly Pro íle Pro Pro Asp Ala Gin Asn Pro Asp Met Ser Phe Phe

1085 1090 1095 aag atg cta ttc ttg cca gaa tca gca agg tgg ata caa agg act cat 3546

Lys Met Leu Phe Leu Pro Glu Ser Ala Arg Trp íle Gin Arg Thr His

1100 1105 1110 gga aag aac tct ctg aac tct ggg caa ggc ccc agt cca aag caa tta 3594

Gly Lys Asn Ser Leu Asn Ser Gly Gin Gly Pro Ser Pro Lys Gin Leu

1115 1120 1125 gta tcc tta gga cca gaa aaa tct gtg gaa ggt cag aat ttc ttg tct 3642

Val Ser Leu Gly Pro Glu Lys Ser Val Glu Gly Gin Asn Phe Leu Ser 1130 1135 1140 1145

gag Glu

aaa Lys

aac Asn

aaa Lys

gtg Val 1150

gta Val

gta Val

gga Gly

aag Lys

ggt Gly 1155

gaa Glu

ttt Phe

aca Thr

aag gac Lys Asp 1160

gta Val

3690

gga

ctc

aaa

gag

atg

gtt

ttt

cca

age

age

aga

aac

cta

ttt ctt

act

3738

Gly

Leu

Lys

Glu

Met

Val

Phe

Pro

Ser

Ser

Arg

Asn

Leu

Phe Leu

Thr

1165

1170

1175

aac

ttg

gat

aat

tta

cat

gaa

aat

aat

aca

cac

aat

caa

gaa aaa

aaa

3786

Asn

Leu

Asp

Asn

Leu

His

Glu

Asn

Asn

Thr

His

Asn

Gin

Glu Lys

Lys

1180

1185

1190

att

cag

gaa

gaa

ata

gaa

aag

aag

gaa

aca

tta

atc

caa

gag aat

gta

3834

íle

Gin

Glu

Glu

íle

Glu

Lys

Lys

Glu

Thr

Leu

íle

Gin

Glu Asn

Val

1195

1200

1205

gtt

ttg

cct

cag

ata

cat

aca

gtg

act

ggc

act

aag

aat

ttc atg

aag

3882

Val

Leu

Pro

Gin

íle

His

Thr

Val

Thr

Gly

Thr

Lys

Asn

Phe Met

Lys

1210

1215

1220

1225

aac

ctt

ttc

tta

ctg

age

act

agg

caa

aat

gta

gaa

ggt

tca tat

gag

3930

Asn

Leu

Phe

Leu

Leu

Ser

Thr

Arg

Gin

Asn

Val

Glu

Gly

Ser Tyr

Glu

1230

1235

124Ô

ggg

gca

tat

get

cca

gta

ctt

caa

gat

ttt

agg

tca

tta

aat gat

tca

3978

Gly

Ala

Tyr

Ala

Pro

Val

Leu

Gin

Asp

Phe

Arg

Ser

Leu

Asn Asp

Ser

1245

1250

1255

aca

aat

aga

aca

aag

aaa

cac

aca

get

cat

ttc

tca

aaa

aaa ggg

gag

4026

Thr

Asn

Arg

Thr

Lys

Lys

His

Thr

Ala

His

Phe

Ser

Lys

Lys Gly

Glu

1260

1265

1270

gaa

gaa

aac

ttg

gaa

ggc

ttg

gga

aat

caa

acc

aag

caa

att gta

gag

4074

Glu

Glu

Asn

Leu

Glu

Gly

Leu

Gly

Asn

Gin

Thr

Lys

Gin

íle Val

Glu

1275

1280

1285

aaa

tat

gca

tgc

acc

aca

agg

ata

tct

cct

aat

aca

age

cag cag

aat

4122

Lys

Tyr

Ala

Cys

Thr

Thr

Arg

íle

Ser

Pro

Asn

Thr

Ser

Gin Gin

Asn

1290

1295

1300

1305

ttt

gtc

acg

caa

cgt

agt

aag

aga

get

ttg

aaa

caa

ttc

aga ctc

cca

4170

Phe

Val

Thr

Gin

Arg

Ser

Lys

Arg

Ala

Leu

Lys

Gin

Phe

Arg Leu

Pro

1310

1315

1320

cta

gaa

gaa

aca

gaa

ctt

gaa

aaa

agg

ata

att

gtg

gat

gac acc

tca

4218

Leu

Glu

Glu

Thr

Glu

Leu

Glu

Lys

Arg

íle

íle

Val

Asp

Asp Thr

Ser

1325 1330 1335

acc cag

tgg

tcc

aaa

aac

atg

aaa

cat

ttg

acc

ccg

age

acc

ctc

aca

4266

Thr Gin

Trp 1340

Ser

Lys

Asn

Met

Lys 1345

His

Leu

Thr

Pro

Ser 1350

Thr

Leu

Thr

cag ata

gac

tac

aat

gag

aag

gag

aaa

ggg

gcc

att

act

cag

tct

ccc

4314

Gin íle 1355

Asp

Tyr

Asn

Glu

Lys 1360

Glu

Lys

Gly

Ala

íle 1365

Thr

Gin

Ser

Pro

tta tca

gat

tgc

ctt

acg

agg

agt

cat

age

atc

cct

caa

gca

aat

aga

4362

Leu Ser 1370

Asp

Cys

Leu

Thr 1375

Arg

Ser

His

Ser

íle 1380

Pro

Gin

Ala

Asn Arg 1385

tct cca

tta

CCC

att

gca

aag

gta

tca

tca

ttt

cca

tct

att

aga

cct

4410

Ser Pro

Leu

Pro

íle 1390

Ala

Lys

Val

Ser

Ser 1395

Phe

Pro

Ser

íle

Arg 1400

Pro

ata tat

ctg

acc

agg

gtc

cta

ttc

caa

gac

aac

tct

tct

cat

ctt

cca

4458

íle Tyr

Leu

Thr 1405

Arg

Val

Leu

Phe

Gin 1410

Asp

Asn

Ser

Ser

His 1415

Leu

Pro

gca gca

tct

tat

aga

aag

aaa

gat

tct

ggg

gtc

caa

gaa

age

agt

cat

4506

Ala Ala

Ser 1420

Tyr

Arg

Lys

Lys

Asp 1425

Ser

Gly

Val

Gin

Glu 1430

Ser

Ser

His

ttc tta

caa

gga

gcc

aaa

aaa

aat

aac

ctt

tct

tta

gcc

att

cta

acc

4554

Phe Leu 1435

Gin

Gly

Ala

Lys

Lys 1440

Asn

Asn

Leu

Ser

Leu 1445

Ala

íle

Leu

Thr

ttg gag

atg

act

ggt

gat

caa

aga

gag

gtt

ggc

tcc

Ctg

ggg

aca

agt

4602

Leu Glu 1450

Met

Thr

Gly

Asp 1455

Gin

Arg

Glu

Val

Gly 1460

Ser

Leu

Gly

Thr

Ser 1465

gcc aca

aat

tca

gtc

aca

tac

aag

aaa

gtt

gag

aac

act

gtt

ctc

ccg

4650

Ala Thr

Asn

Ser

Val 1470

Thr

Tyr

Lys

Lys

Val 1475

Glu

Asn

Thr

Val

Leu 1480

Pro

aaa cca

gac

ttg

CCC

aaa

aca

tct

ggc

aaa

gtt

gaa

ttg

ctt

cca

aaa

4698

Lys Pro

Asp

Leu 1485

Pro

Lys

Thr

Ser

Gly 1490

Lys

Val

Glu

Leu

Leu 1495

Pro

Lys

gtt cac

att

tat

cag

aag

gac

cta

ttc

cct

acg

gaa

act

age

aat

ggg

4746

Val His

íle L500

Tyr

Gin

Lys

Asp

Leu 1505

Phe

Pro

Thr

Glu

Thr 1510

Ser

Asn

Gly

tct cct

ggc

cat

ctg

gat

ctc

gtg

gaa

ggg

age

ctt

ctt

cag

gga

aca

4 7 94

Ser Pro 1515

Gly

His

Leu

Asp

Leu L520

Val

Glu

Gly

Ser

Leu 1525

Leu

Gin

Gly

Thr

gag gga

gcg

att

aag

tgg

aat

gaa

gca

aac

aga

cct

gga

aaa

gtt

ccc

4842

Glu Gly 1530

Ala

íle

Lys Trp 1535

Asn

Glu

Ala

Asn

Arg 1540

Pro

Gly

Lys

Val

Pro 1545

ttt ctg

aga

gta

gca

aca

gaa

age

tct

gca

aag

act

ccc

tcc

aag

cta

4890

Phe Leu

Arg

Val Ala 1550

Thr

Glu

Ser

Ser Ala 1555

Lys

Thr

Pro

Ser

Lys 1560

Leu

ttg gat

cct

ctt

get

tgg

gat

aac

cac

tat

ggt

act

cag

ata

cca

aaa

4938

Leu Asp

Pro Leu 1565

Ala

Trp

Asp

Asn His 1570

Tyr

Gly

Thr

Gin

íle 1575

Pro

Lys

gaa gag

tgg

aaa

tcc

caa

gag

aag

tca

cca

gaa

aaa

aca

get

ttt

aag

4986

ΊΟ

Glu Glu

Trp 1580

Lys

Ser

Gin

Glu

Lys 1585

Ser

Pro

Glu

Lys

Thr 1590

Ala

Phe

Lys

aaa aag

gat

acc

att

ttg

tcc

ctg

aac

get

tgt

gaa

agc

aat

cat

gca

5034

Lys Lys 1595

Asp

Thr

íle

Leu

Ser 1600

Leu

Asn

Ala

Cys

Glu 1605

Ser

Asn

His

Ala

ata gca

gca

ata

aat

gag

gga

caa

aat

aag

CCC

gaa

ata

gaa

gtc

acc

5082

íle Ala 1610

Ala

íle

Asn

Glu 1615

Gly

Gin

Asn

Lys

Pro 1620

Glu

íle

Glu

Val

Thr 1625

tgg gca

aag

caa

ggt

agg

act

gaa

agg

ctg

tgc

tet

caa

aac

cca

cca

5130

Trp Ala

Lys

Gin

Gly 1630

Arg

Thr

Glu

Arg

Leu 1635

Cys

Ser

Gin

Asn

Pro 1640

Pro

gtc ttg

aaa

ege

cat

caa

cgg

gaa

ata

act

cgt

act

act

ctt

cag

tca

5178

Val Leu

Lys

Arg 1645

His

Gin

Arg

Glu

íle 1650

Thr

Arg

Thr

Thr

Leu 1655

Gin

Ser

gat caa

gag

gaa

att

gac

tat

gat

gat

acc

ata

tca

gtt

gaa

atg

aag

5226

Asp Gin

Glu 1660

Glu

íle

Asp

Tyr

Asp 1665

Asp

Thr

íle

Ser

Val 1670

Glu

Met

Lys

aag gaa

gat

ttt

gac

att

tat

gat

gag

gat

gaa

aat

cag

agc

ccc

ege

5274

Lys Glu 1675

Asp

Phe

Asp

íle

Tyr 1680

Asp

Glu

Asp

Glu

Asn 1685

Gin

Ser

Pro

Arg

agc ttt

caa

aag

aaa

aca

ega

cac

tat

ttt

att

get

gca

gtg

gag

agg

5322

Ser Phe 1690

Gin

Lys

Lys

Thr L695

Arg

His

Tyr

Phe

íle 1700

Ala

Ala

Val

Glu

Arg 1705

ctc tgg

gat

tat

ggg

atg

agt

agc

tcc

cca

cat

gtt

cta

aga

aac

agg

5370

Leu Trp

Asp

Tyr

Gly L710

Met

Ser

Ser

Ser

Pr.o 1715

His

Val

Leu

Arg

Asn 1720

Arg

get cag

agt

ggc

agt

gtc

cct

cag

ttc

aag

aaa

gtt

gtt

ttc

cag

gaa

5418

Ala Gin

Ser Gly 1725

Ser

Val

Pro

Gin Phe 1730

Lys

Lys

Val

Val

Phe 1735

Gin

Glu

ttt ačt

gat

ggc

tcc

ttt

act

cag

CCC

tta

tac

cgt

gga

gaa

cta

aat

5466

Phe Thr Asp 1740

Gly

Ser

Phe

Thr Gin 1745

Pro

Leu

Tyr

Arg

Gly 1750

Glu

Leu

Asn

gaa cat

ttg

gga

ctc

ctg

ggg

cca

tat

ata

aga

gca

gaa

gtt

gaa

gat

5514

Glu His 1755

Leu

Gly

Leu

Leu Gly 1760

Pro

Tyr

íle

Arg

Ala 17 65

Glu

Val

Glu

Asp

aat atc

atg

gta

act

ttc

aga

aat

cag

gcc

tet

cgt

CCC

tat

tcc

ttc

5562

Asn íle 1770

Met

Val

Thr Phe 1775

Arg

Asn

Gin

Ala Ser 1780

Arg

Pro

Tyr

Ser

Phe 1785

tat tet

agc

ctt

att

tet

tat

gag

gaa

gat

cag

agg

caa

gga

gca

gaa

5610

Tyr Ser

Ser

Leu íle 1790

Ser

Tyr

Glu

Glu Asp 1795

Gin

Arg

Gin

Gly

Ala 1800

Glu

cct aga

aaa

aac

ttt

gtc

aag

cct

aat

gaa

acc

aaa

act

tac

ttt

tgg

5658

Pro Arg

Lys Asn 1805

Phe

Val

Lys

Pro Asn 1810

Glu

Thr

Lys

Thr Tyr 1815

Phe

Trp

aaa gtg

caa

cat

cat

atg

gca

CCC

act

aaa

gat

gag

ttt

gac

tgc

aaa

5706

Lys Val

Gin

His

His

Met

Ala

Pro

Thr

Lys

Asp

Glu

Phe

Asp

Cys

Lys

1820 1825 1830

gcc tgg get

tat Tyr

ttc tet

gat Asp 1840

gtt Val

gac Asp

ctg Leu

gaa aaa gat Glu Lys Asp 1845

gtg Val

cac His

tca Ser

5754

Ala Trp 1835

Ala

Phe

Ser

ggc ctg

att

gga

CCC

ctt

ctg

gtc

tgc

cac

act aac aca

ctg

aac

cct

5802

Gly Leu 1850

íle

Gly

Pro

Leu 1855

Leu

Val

Cys

His

Thr Asn Thr 1860

Leu

Asn

Pro 1865

get cat

ggg

aga

caa

gtg

aca

gta

cag

gaa

ttt get ctg

ttt

ttc

acc

5850

Ala His

Gly

Arg

Gin 1870

Val

Thr

Val

Gin

Glu 1875

Phe Ala Leu

Phe

Phe 1880

Thr

atc ttt

gat

gag

acc

aaa

age

tgg

tac

ttc

act gaa aat

atg

gaa

aga

5898

íle Phe

Asp

Glu 1885

Thr

Lys

Ser

Trp

Tyr 1890

Phe

Thr Glu Asn

Met 1895

Glu

Arg

aac tgc

agg

get

CCC

tgc

aat

atc

cag

atg

gaa gat ccc

act

ttt

aaa

5946

Asn Cys

Arg 1900

Ala

Pro

Cys

Asn

íle 1905

Gin

Met

Glu Asp Pro 1910

Thr

Phe

Lys

gag aat

tat

ege

ttc

cáť

gca

atc

aat

ggc

tac ata atg

gat

aca

cta

5554

Glu Asn 1915

Tyr

Arg

Phe

His

Ala 1920

íle

Asn

Gly

Tyr íle Met 1925

Asp

Thr

Leu

cct ggc

tta

gta

atg

get

cag

gat

caa

agg

att ega tgg

tat

ctg

ctc

6042

Pro Gly 1930

Leu

Val

Met

Ala L935

Gin

Asp

Gin

Arg

íle Arg Trp 1940

Tyr

Leu

Leu 1945

age atg

ggc

age

aat

gaa

aac

atc

cat

tet

att cat ttc

agt

gga

cat

6050

Ser Met

Gly

Ser

Asn L950

Glu

Asn

íle

His

Ser 1955

íle His Phe

Ser

Gly 1960

His

gtg ttc

act

gta

ega

aaa

aaa

gag

gag

tat

aaa atg gca

ctg

tac

aat

613S

Val Phe

Thr

Val 1965

Arg

Lys

Lys

Glu

Glu L970

Tyr

Lys Met Ala

. Leu 1975

Tyr

Asn

ctc tat

cca

ggt

gtt

ttt

gag

aca

gtg

gaa

atg tta cca

tec

aaa

get

61:6

Leu Tyr Pro 1980

Gly

Val

Phe

Glu Thr 1985

Val

Glu

Met Leu Pro 1990

Ser

Lys

Ala

gga att

tgg

cgg

gtg

gaa

tgc

ctt

att

ggc

gag cat cta

cat

get

ggg

6234

Gly íle 1995

Trp

Arg

Val

Glu Cys 2000

Leu

íle

Gly

Glu His Leu 2005

His

Ala

Gly

atg age

aca

ctt

ttt

ctg

gtg

tac

age

aat

aag tgt cag

act

ccc

ctg

6282

Met Ser 2010

Thr

Leu

Phe Leu 2015

Val

Tyr

Ser

Asn Lys Cys Gin 2020

Thr

Pro

Leu 2025

gga atg

get

tet

gga

cac

att

aga

gat

ttt

cag att aca

get

tca

gga

6330

Gly Met

Ala

Ser Gly 2030

His

íle

Arg

Asp Phe 2035

Gin íle Thr

Ala

Ser 2040

Gly

caa tat

gga

cag

tgg

gcc

cca

aag

ctg

gcc

aga ctt cat

tat

tcc

gga

6378

Gin Tyr

Gly Gin 2045

Trp

Ala

Pro

Lys Leu 2050

Ala

Arg Leu His

Tyr 2055

Ser

Gly

tca atc

aat

gcc

tgg

age

acc

aag

gag

CCC

ttt tet tgg

atc

aag

gtg

6426

Ser íle Asn 2060

Ala

Trp

Ser

Thr Lys 2065

Glu

Pro

Phe Ser Trp 2070

íle

Lys

Val

gat ctg

ttg

gca

cca

atg

att

att

cac

ggc

atc aag acc

cag

ggt

gcc

6474

Asp Leu

Leu

Ala

Pro

Met

íle

íle

His

Gly

íle Lys Thr

Gin

Gly

Ala

2075 2080 2085

cgt cag Arg Gin 20.90

aag Lys

ttc Phe

tcc agc Ser Ser 2095

ctc Leu

tac Tyr

atc íle

tct cag Ser Gin 2100

ttt Phe

atc íle

atc íle

atg tat Met Tyr 2105

6522

agt ctt

gat

ggg

aag aag

tgg

cag

act

tat ega

gga

aat

tcc

act gga

6570

Ser Leu

Asp

Gly

Lys Lys 2110

Trp

Gin

Thr

Tyr Arg 2115

Gly

Asn

Ser

Thr Gly 2120

acc tta

atg

gtc

ttc ttt

ggc

aat

gtg

gat tca

tct

ggg

ata

aaa cac

6618

Thr Leu

Met

Val 2125

Phe Phe

Gly

Asn

Val 2130

Asp Ser

Ser

Gly

íle 2135

Lys His

aat att

ttt

aac

cct cca

att

att

get

ega tac

atc

cgt

ttg

cac cca

6666

Asn íle

Phe 2140

Asn

Pro Pro

íle

íle 2145

Ala

Arg Tyr

íle

Arg 2150

Leu

His Pro

act cat

tat

agc

att cgc

agc

act

ctt

cgc atg

gag

ttg

atg

ggc tgt

6714

Thr His 2155

Tyr

Ser

íle Arg

Ser 2160

Thr

Leu

Arg Met

Glu 2165

Leu

Met

Gly Cys

gat tta

aat

agt

tgc agc

atg

cca

ttg

gga atg

gag

agt

aaa

gca ata

67 62

Asp Leu 2170

Asn

Ser

Cys Ser 2175

Met

Pro

Leu

Gly Met 2180

Glu

Ser

Lys

Ala íle 2185

tca gat

gca

cag

att act

get

tca

tcc

tac ttt

acc

aat

atg

ttt gcc

6810

Ser Asp

Ala

Gin

íle Thr 2190

Ala

Ser

Ser

Tyr Phe 2195

Thr

Asn

Met

Phe Ala 2200

acc tgg

tct

cct

tca aaa

get

ega

ctt

cac ctc

caa

ggg

agg

agt aat

6858

Thr Trp

Ser

Pro 2205

Ser Lys

Ala

Arg

Leu 2210

His Leu

Gin

Gly

Arg 2215

Ser Asn

gcc tgg

aga

cct

cag gtg

aat

aat

cca

aaa gag

tgg

ctg

caa

gtg gac

6906

Ala Trp Arg 2220

Pro

Gin Val

Asn Asn 2225

Pro

Lys Glu

Trp

Leu 2230

Gin

Val Asp

ttc cag

aag

aca

atg aaa

gtc

aca

gga

gta act

act

cag

gga

gta aaa

6954

Phe Gin 2235

Lys

Thr

Met Lys Val 2240

Thr

Gly

Val Thr Thr 2245

Gin

Gly

Val Lys

tct ctg

ctt

acc

agc atg

tat

gtg

aag

gag ttc

ctc

atc

tcc

agc agt

7002

Ser Leu 2250

Leu

Thr

Ser Met 2255

Tyr

Val

Lys

Glu Phe 2260

Leu

íle

Ser

Ser Ser 2265

caa gat

ggc

cat

cag tgg

act

ctc

ttt

ttt cag

aat

ggc

aaa

gta aag

7050

Gin Asp

Gly

His Gin Trp 2270

Thr

Leu

Phe Phe Gin 2275

Asn

Gly

Lys

Val Lys 2280

gtt ttt

cag

gga

aat caa

gac

tcc

ttc

aca cct

gtg

gtg

aac

tct cta

7098

Val Phe

Gin Gly 2285

Asn Gin

Asp

Ser Phe 2290

Thr Pro

Val

Val Asn 2295

Ser Leu

gac cca

ccg

tta

ctg act

cgc

tac

ctt

ega att

cac

CCC

cag

agt tgg

7146

Asp Pro Pro 2300

Leu

Leu Thr

Arg Tyr 2305

Leu

Arg íle

His Pro 2310

Gin

Ser Trp

gtg cac

cag

att

gcc ctg

agg

atg

gag

gtt ctg

ggc

tgc

gag

gca cag

7194

Val His

Gin

íle

Ala Leu

Arg

Met

Glu

Val Leu

Gly

Cys

Glu

Ala Gin

2315 2320 2325 gac ctc tac tgagggtggc cactgcagca cctgccactg ccgtcacctc Asp Leu Tyr

7243

2330

tccctcctca	gctccagggc	agtgtccctc	cctggcttgc	cttctacctt	tgtgctaaat	7303
cctagcagac	actgccttga	agcctcctga	attaactatc	atcagtcctg	catttctttg	7363
gtggggggcc	aggagggtgc	atccaattta	acttaactct	tacctatttt	ctgcagctgc	7423
tcccagatta	ctccttcctt	ccaatataac	taggcaaaaa	gaagtgagga	gaaacctgca	7483
tgaaagcatt	cttccctgaa	aagttaggcc	tctcagagtc	accacttcct	ctgttgtaga	7543
aaaactatgt	gatgaaactt	tgaaaaagat	atttatgatg	ttaacatttc	aggttaagcc	7603
tcatacgttt	aaaataaaac	tctcagttgt	ttattatcct	gatcaagcat	ggaacaaagc	7663
atgtttcagg	atcagatcaa	tacaatcttg	gagtcaaaag	gcaaatcatt	tggacaatct	7723
gcaaaatgga	gagaatacaa	taactactac	agtaaagtct	gtttctgctt	ccttacacat	7783
agatataatt	atgttattta	gtcattatga	ggggcacatt	cttatctcca	aaactagcat	7843
tcttaaactg	agaattatag	atggggttca	agaatcccta	agtcccctga	aattatataa	7903
ggcattctgt	ataaatgcaa	atgtgcattt	ttctgacgag	tgtccataga	tataaagcca	7963
ttggtcttaa	ttctgaccaa	taaaaaaata	agtcaggagg	atgcaattgt	tgaaagcttt	8023
gaaataaaat	aacatgtctt	cttgaaattt	gtgatggcca	agaaagaaaa	tgatgatgac	8083
attaggcttc	taaaggacat	acatttaata	tttctgtgga	aatatgagga	aaatccatgg	8143
ttatctgaga	taggagatac	aaactttgta	attctaataa	tgcactcagt	ttactctctc	8203
cctctactaa	tttcctgctg	aaaataacac	aacaaaaatg	taacagggga	aattatatac	8263
cgtgactgaa	aactagagtc	ctacttacat	agttgaaata	tcaaggaggt	cagaagaaaa	8323
ttggactggt	gaaaacagaa	aaaacactcc	agtctgccat	atcaccacac	aataggatcc	8383
cccttcttgc	cctccacccc	cataagattg	tgaagggttt	actgctcctt	ccatctgcct	8443
gcaccccttc	actatgacta	cacagaactc	tcctgatagt	aaagggggct	ggaggcaagg	8503
ataagttata	gagcagttgg	aggaagcatc	caaagactgc	aacccagggc	aaatggaaaa	8563
caggagatcc	taatatgaaa	gaaaaatgga	tcccaatctg	agaaaaggca	aaagaatggc	8623
tacttttttc	tatgctggag	tattttctaa	taatcctgct	tgacccttat	ctgacctctt	8683
tggaaactat	aacatagctg	tcacagtata	gtcacaatcc	acaaatgatg	caggtgcaaa	8743
tggtttatag	ccctgtgaag	ttcttaaagt	ttagaggcta	acttacagaa	atgaataagt	8803
tgttttgttt	tatagcccgg	tagaggagtt	aaccccaaag	gtgatatggt	tttatttcct	8863
gttatgttta	acttgataat	cttattttgg	cattcttttc	ccattgacta	tatacatctc	8923
tatttctcaa	atgttcatgg	aactagctct	tttattttcc	tgctggtttc	ttcagtaatg	8983

agttaaataa aacattgaca cataca

9009 <210> 2 <211> 2332 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Ala Thr Arg Arg Tyr 1 5

Met Gin Ser Asp Leu 20

Arg Val Pro Lys Ser 35

Thr Leu Phe Val Glu 50

Arg Pro Pro Trp Met 65

Tyr Asp Thr Val Val 85

Ser Leu His Ala Val 100

Glu Tyr Asp Asp Gin 115

Phe Pro Gly Gly Ser 130

Gly Pro Met Ala Ser ¹⁴⁵

His Val Asp Leu Val 165

Leu Val Cys Arg Glu 180

His Lys Phe íle Leu 195

His Ser Glu Thr Lys 210

Ala Arg Ala Trp Pro 225

Ser Leu Pro Gly Leu 245

Val íle Gly Met Gly 260

Gly His Thr Phe Leu 275

Ser Pro íle Thr Phe 290

Tyr Leu Gly Ala Val Glu 10

Gly Glu Leu Pro Val Asp 25

Phe Pro Phe Asn Thr Ser 40

Phe Thr Val His Leu Phe 55

Gly Leu Leu Gly Pro Thr 70 75 íle Thr Leu Lys Asn Met 90

Gly Val Ser Tyr Trp Lys 105

Thr Ser' Gin Arg Glu Lys 120

His Thr Tyr Val Trp Gin 135

Asp Pro Leu Cys Leu Thr 150 155

Lys Asp Leu Asn Ser Gly 170

Gly Ser Leu Ala Lys Glu 185

Leu Phe Ala Val Phe Asp 200

Asn Ser Leu Met Gin Asp 215

Lys Met His Thr Val Asn 230 235 íle Gly Cys His Arg Lys 250

Thr Thr Pro Glu Val His 265

Val Arg Asn His Arg Gin 280

Leu Thr Ala Gin Thr Leu 295

Leu Ser Trp Asp Tyr

Ala Arg Phe Pro Pro 30

Val Val Tyr Lys Lys 45

Asn íle Ala Lys Pro 60 íle Gin Ala Glu Val 80

Ala Ser His Pro Val 95

Ala Ser Glu Gly Ala 110

Glu Asp Asp Lys Val 125

Val Leu Lys Glu Asn 140

Tyr Ser.Tyr Leu Ser 160

Leu íle Gly Ala Leu 175

Lys Thr Gin Thr Leu 190

Glu Gly Lys Ser Trp 205

Arg Asp Ala Ala Ser 220

Gly Tyr Val Asn Arg ' 240

Ser Val Tyr Trp His 255

Ser íle Phe Leu Glu 270

Ala Ser Leu Glu íle 285

Leu Met Asp Leu Gly 300

Gin Phe Leu Leu Phe Cys

His

íle

Ser

Ser

His Gin His Asp Gly Met

305

310

315

320

Glu

Ala

Tyr

Val

Lys

Val

Asp

Ser

Cys

Pro

Glu

Glu

Pro

Gin

Leu

Arg

325

330

335

Met

Lys

Asn

Asn

Glu

Glu

Ala

Glu

Asp

Tyr

Asp

Asp

Asp

Leu

Thr

Asp

340

345

350

Ser

Glu

Met

Asp

Val

Val

Arg

Phe

Asp

Asp

Asp

Asn

Ser

Pro

Ser

Phe

355

360

365

íle

Gin

íle

Arg

Ser

Val

Ala

Lys

Lys

His

Pro

Lys

Thr

Trp

Val

His

370

375

380

Tyr

íle

Ala

Ala

Glu

Glu

Glu

Asp

Trp

Asp

Tyr

Ala

Pro

Leu

Val

Leu

385

390

395

400

Ala

Pro

Asp

Asp

Arg

Ser

Tyr

Lys

Ser

Gin

Tyr

Leu

Asn

Asn

Gly

Pro

405

410

415

Gin

Arg

íle

Gly

Arg

Lys

Tyr

Lys

Lys

Val

Arg

Phe

Met

Ala

Tyr

Thr

420

425

430

Asp

Glu

Thr

Phe

Lys

Thr

Arg

Glu

Ala

íle

Gin

His

Glu

Ser

Gly

íle

435

440

445

Leu

Gly

Pro

Leu

Leu

Tyr

Gly

Glu

Val

Gly

Asp

Thr

Leu

Leu

íle

íle

450

455

460

Phe

Lys

Asn

Gin

Ala

Ser

Arg

Pro

Tyr

Asn

íle

Tyr

Pro

His

Gly

íle

465

470

475

480

Thr

Asp

Val

Arg

Pro

Leu

Tyr

Ser

Arg

Arg

Leu

Pro

Lys

Gly

Val

Lys

485

490

495

His

Leu

Lys

Asp

Phe

Pro

íle

Leu

Pro

Gly

Glu

íle

Phe

Lys

Tyr

Lys

500

505

510

Trp

Thr

Val

Thr

Val

Glu

Asp

Gly

Pro

Thr

Lys

Ser

Asp

Pro

Arg

Cys

515

520

525

Leu

Thr

Arg

Tyr

Tyr

Ser

Ser

Phe

Val

Asn

Met

Glu

Arg

Asp

Leu

Ala

530

535

540

Ser

Gly

Leu

íle

Gly

Pro

Leu

Leu

íle

Cys

Tyr

Lys

Glu

Ser

Val

Asp

545

550

555

560

Gin

Arg

Gly

Asn

Gin

íle

Met

Ser

Asp

Lys

Arg

Asn

Val

íle

Leu

Phe

565

570

575

Ser

Val

Phe

Asp

Glu

Asn

Arg

Ser

Trp

Tyr

Leu

Thr

Glu

Asn

íle

Gin

580

585

590

Arg

Phe

Leu

Pro

Asn

Pro

Ala

Gly

Val

Gin

Leu

Glu

Asp

Pro

Glu

Phe

595

600

605

Gin

Ala

Ser

Asn

íle

Met

His

Ser

íle

Asn

Gly

Tyr

Val

Phe

Asp

Ser

610 615 620

Leu Gin Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr íle Leu 625 630 635 640

Ser

íle Gly Ala Gin Thr Asp 645

Phe

Leu Ser Val 650

Phe

Phe

Ser

Gly 655

Tyr

Thr

Phe

Lys

His

Lys

Met

Val

Tyr

Glu

Asp

Thr

Leu

Thr

Leu

Phe

Pro

660

665

670

Phe

Ser

Gly

Glu

Thr

Val

Phe

Met

Ser

Met

Glu

Asn

Pro

Gly

Leu

Trp

675

680

685

íle

Leu

Gly

Cys

His

Asn

Ser

Asp

Phe

Arg

Asn

Arg

Gly

Met

Thr

Ala

690

695

700

Leu

Leu

Lys

Val

Ser

Ser

Cys

Asp

Lys

Asn

Thr

Gly

Asp

Tyr

Tyr

Glu

705

710

715

720

Asp

Ser

Tyr

Glu

Asp

íle

Ser

Ala

Tyr

Leu

Leu

Ser

Lys

Asn

Asn

Ala

725

730

735

íle

Glu

Pro

Arg

Ser

Phe

Ser

Gin

Asn

Ser

Arg

His

Pro

Ser

Thr

Arg

740

745

750

Gin

Lys

Gin

Phe

Asn

Ala

Thr

Thr

íle

Pro

Glu

Asn

Asp

íle

Glu

Lys

755

760

765

Thr

Asp

Pro

Trp

Phe

Ala

His

Arg

Thr

Pro

Met

Pro

Lys

íle

Gin

Asn

770

775

780

Val

Ser

Ser

Ser

Asp

Leu

Leu

Met

Leu

Leu

Arg

Gin

Ser

Pro

Thr

Pro

785

790

795

800

His

Gly

Leu

Ser

Leu

Ser

Asp

Leu

Gin

Glu

Ala

Lys

Tyr

Glu

Thr

Phe

805

810

815

Ser

Asp

Asp

Pro

Ser

Pro

Gly

Ala

íle

Asp

Ser

Asn

Asn

Ser

Leu

Ser

820

825

830

Glu

Met

Thr

His

Phe

Arg

Pro

Gin

Leu

His

His

Ser

Gly

Asp

Met

Val

835

840

845

Phe

Thr

Pro

Glu

Ser

Gly

Leu

Gin

Leu

Arg

Leu

Asn

Glu

Lys

Leu

Gly

850

855

860

Thr

Thr

Ala

Ala

Thr

Glu

Leu

Lys

Lys

Leu

Asp

Phe

Lys

Val

Ser

Ser

865

870

875

880

Thr

Ser

Asn

Asn

Leu

íle

Ser

Thr

íle

Pro

Ser

Asp

Asn

Leu

Ala

Ala

885

890

895

Gly

Thr

Asp

Asn

Thr

Ser

Ser

Leu

Gly

Pro

Pro

Ser

Met

Pro

Val

His

900

905

910

Tyr

Asp

Ser

Gin

Leu

Asp

Thr

Thr

Leu

Phe

Gly

Lys

Lys

Ser

Ser

Pro

915

920

925

Leu

Thr

Glu

Ser

Gly

Gly

Pro

Leu

Ser

Leu

Ser

Glu

Glu

Asn

Asn

Asp

930

935

940

Ser

Lys

Leu

Leu

Glu

Ser

Gly

Leu

Met

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Ser

Trp

945

950

955

960

Gly

Lys

Asn

Val

Ser

Ser

Thr

Glu

Ser

Gly

Arg

Leu

Phe

Lys

Gly

Lys

965 970 975

Arg Ala	His	Gly 980	Pro	Ala Leu	Leu	Thr 985	Lys	Asp Asn Ala	Leu 990	Phe	Lys
Val Ser	íle 995	Ser	Leu	Leu Lys	Thr 1000	Asn	Lys	Thr Ser Asn 1005	Asn	Ser	Ala
Thr Asn 1010	Arg	Lys	Thr	His íle 1015	Asp	Gly	Pro	Ser Leu Leu 1020	íle	Glu	Asn
Ser Pro 1025	Ser	Val	Trp	Gin Asn 1030	íle	Leu	Glu	Ser Asp Thr 1035	Glu	Phe	Lys 1040
Lys Val	Thr	Pro	Leu 1045	íle His	Asp	Arg	Met 105C	Leu Met Asp l	Lys	Asn 1055	Ala
Thr Ala	Leu	Arg 1060	Leu	Asn His	Met	Ser 1065	Asn	Lys Thr Thr	Ser 1070	Ser	Lys
Asn Met	Glu 1075	Met	Val	Gin Gin	Lys 1080	Lys	Glu	Gly Pro íle 1085	Pro	Pro	Asp
Ala Gin 1090	Asn	Pro	Asp	Met Ser 1095	Phe	Phe	Lys	Met Leu Phe 1100	Leu	Pro	Glu
Ser Ala 1105	Arg	Trp	íle	Gin Arg 1110	Thr	His	Gly	Lys Asn Ser 1115	Leu	Asň	Ser 1120
Gly Gin	Gly	Pro	Ser 1125	Pro Lys	Gin	Leu	Val 113C	Ser Leu Gly 1	Pro	Glu 1135	Lys
Ser Val	Glu	Gly 1140	Gin	Asn Phe	Leu	Ser 1145	Glu	Lys Asn Lys	Val 1150	Val	Val
Gly Lys	Gly 1155	Glu	Phe	Thr Lys	Asp 1160	Val	Gly	Leu Lys Glu 1165	. Met	Val	Phe
Pro Ser 1170	Ser	Arg	Asn	Leu Phe 1175	Leu	Thr	Asn	Leu Asp Asn 1180	Leu	His	Glu
Asn Asn 1185	Thr	His	Asn	Gin Glu 1190	Lys	Lys	íle	Gin Glu Glu 1195	íle	Glu	Lys 1200
Lys Glu	Thr	Leu	íle 1205	Gin Glu	Asn	Val	Val 121C	Leu Pro Gin 1	íle	His 1215	Thr
Val Thr	Gly	Thr L220	Lys	Asn Phe	Met	Lys 1225	Asn	Leu Phe Leu	Leu 1230	Ser	Thr
Arg Gin	Asn 1235	Val	Glu	Gly Ser	Tyr 1240	Glu	Gly	Ala Tyr Ala 1245	Pro	Val	Leu
Gin Asp 1250	Phe	Arg	Ser	Leu Asn 1255	Asp	Ser	Thr	Asn Arg Thr 1260	Lys	Lys	His
Thr Ala 1265	His	Phe	Ser	Lys Lys 1270	Gly	Glu	Glu	Glu Asn Leu 1275	Glu	Gly	Leu 1280
Gly Asn	Gin	Thr Lys 1285	Gin íle	Val	Glu	Lys 1290	Tyr Ala Cys	Thr	Thr 1295	Arg
íle Ser	Pro	Asn	Thr	Ser Gin	Gin	Asn	Phe	Val Thr Gin	Arg	Ser	Lys

1300 1305 1310

Arg Ala	Leu 1315	Lys	Gin	Phe Arg	Leu 1320	Pro	Leu Glu Glu Thr 1325	Glu	Leu	Glu
Lys Arg 1330	íle	íle	Val	Asp Asp 1335	Thr	Ser	Thr Gin Trp Ser 1340	Lys	Asn	Met
Lys His 1345	Leu	Thr	Pro	Ser Thr 1350	Leu	Thr	Gin íle Asp Tyr 1355	Asn	Glu	Lys 1360
Glu Lys	Gly	Ala	íle 1365	Thr Gin	Ser	Pro	Leu Ser Asp Cys 1370	Leu	Thr 1375	Arg
Ser His	Ser	íle 1380	Pro	Gin Ala	Asn	Arg 1385	Ser Pro Leu Pro	íle 1390	Ala	Lys
Val Ser	Ser 1395	Phe	Pro	Ser íle	Arg 1400	Pro	íle Tyr Leu Thr 1405	Arg	Val	Leu
Phe Gin 1410	Asp	Asn	Ser	Ser His 1415	Leu	Pro	Ala Ala Ser Tyr 1420	Arg	Lys	Lys
Asp Ser 1425	Gly	Val	Gin	Glu Ser 1430	Ser	His	Phe Leu Gin Gly 1435	Ala	Lys	Lys 1440
Asn Asn	Leu	Ser	Leu 1445	Ala íle	Leu	Thr	Leu Glu Met Thr 1450	Gly	Asp 1455	Gin
Arg Glu	Val	Gly 1460	Ser	Leu Gly	Thr	Ser 1465	Ala Thr Asn Ser	Val 1470	Thr	Tyr
Lys Lys	Val 1475	Glu	Asn	Thr Val	Leu 1480	Pro	Lys Pro Asp Leu 1485	Pro	Lys	Thr
Ser Gly 1490	Lys	Val	Glu	Leu Leu 1495	Pro	Lys	Val His íle Tyr 1500	Gin	Lys	Asp
Leu Phe 1505	Pro	Thr	Glu	Thr Ser 1510	Asn	Gly	Ser Pro Gly His 1515	Leu	Asp	Leu 1520
Val Glu	Gly	Ser	Leu 1525	Leu Gin	Gly	Thr	Glu Gly Ala íle 1530	Lys	Trp 1535	Asn
Glu Ala	Asn Arg 1540	Pro	Gly Lys	Val	Pro L545	Phe Leu Arg Val	Ala 1550	Thr	Glu
Ser Ser	Ala L555	Lys	Thr	Pro Ser Lys 1560	Leu	Leu Asp Pro Leu 1565	Ala	Trp	Asp
Asn His 1570	Tyr	Gly	Thr	Gin íle 1575	Pro	Lys	Glu Glu Trp Lys 1580	Ser	Gin	Glu
Lys Ser 1585	Pro	Glu	Lys	Thr Ala 1590	Phe	Lys	Lys Lys Asp Thr 1595	íle	Leu	Ser 1600
Leu Asn	Ala	Cys Glu 1605	Ser Asn	His	Ala	íle Ala Ala íle 1610	Asn	Glu 1615	Gly
Gin Asn	Lys	Pro	Glu	íle Glu	Val	Thr	Trp Ala Lys Gin	Gly Arg	Thr

1620 1625 1630

Glu Arg Leu Cys Ser Gin Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gin Arg 1635 1640 1645

Glu íle Thr Arg Thr	Thr Leu Gin Ser	Asp Gin Glu Glu íle Asp	Tyr
1650	1655	1660
Asp Asp Thr íle Ser	Val Glu Met Lys	Lys Glu Asp Phe Asp íle	Tyr
1665	1670	1675	1680
Asp Glu Asp Glu Asn 1685	Gin Ser Pro Arg	Ser Phe Gin Lys Lys Thr 1690 1695	Arg
His Tyr Phe íle Ala	Ala Val Glu Arg	Leu Trp Asp Tyr Gly Met	Ser
1700	1705	1710
Ser Ser Pro His Val	Leu Arg Asn Arg	Ala Gin Ser Gly Ser Val	Pro
1715	1720	1725
Gin Phe Lys Lys Val	Val Phe Gin Glu	Phe Thr Asp Gly Ser Phe	Thr
1730	1735	1740
Gin Pro Leu Tyr Arg	Gly Glu Leu Asn	Glu His Leu Gly Leu Leu	Gly
1745	1750	1755	1760
Pro Tyr íle Arg Ala 1765	Glu Val Glu Asp	Asn íle Met Val Thr Phe 1770 1775	Arg
Asn Gin Ala Ser Arg	Pro Tyr Ser Phe	Tyr Ser Ser Leu íle Ser	Tyr
1780	1785	1790
Glu Glu Asp Gin Arg	Gin Gly Ala Glu	Pro Arg Lys Asn Phe Val	Lys
1795	1800	1805
Pro Asn Glu Thr Lys	Thr Tyr Phe Trp	Lys Val Gin His His Met	Ala
1810	1815	1820
Pro Thr Lys Asp Glu	Phe Asp Cys Lys	Ala Trp Ala Tyr Phe Ser	Asp
1825	1830	1835	1840
Val Asp Leu Glu Lys 1845	Asp Val His Ser	Gly Leu íle Gly Pro Leu 1850 1855	Leu
Val Cys His Thr Asn	Thr Leu Asn Pro	Ala His Gly Arg Gin Val	Thr
1860	1865	1870
Val Gin Glu Phe Ala	Leu Phe Phe Thr	íle Phe Asp Glu Thr Lys	Ser
1875	1880	1885
Trp Tyr Phe Thr Glu	Asn Met Glu Arg	Asn Cys Arg Ala Pro Cys	Asn
1890	1895	1900
íle Gin Met Glu Asp	Pro Thr Phe Lys	Glu Asn Tyr Arg Phe His	Ala
1905	1910	1915	1920
íle Asn Gly Tyr íle 1925	Met Asp Thr Leu	Pro Gly Leu Val Met Ala 1930 1935	Gin
Asp Gin Arg íle Arg	Trp Tyr Leu Leu	Ser Met Gly Ser Asn Glu	Asn
1940	1945	1950
íle His Ser íle His	Phe Ser Gly His	Val Phe Thr Val Arg Lys	Lys
1955	1960	1965
Glu Glu Tyr Lys Met	Ala Leu Tyr Asn	Leu Tyr Pro Gly Val Phe	Glu
1970	1975	1980

Thr Val Glu Met 1985	Leu	Pro Ser Lys Ala 1990	Gly íle Trp Arg Val Glu Cys
1995	2000
Leu íle Gly Glu	His	Leu His Ala Gly	Met Ser Thr	Leu Phe Leu Val
2005		2010	2015
Tyr Ser Asn Lys	Cys	Gin Thr Pro Leu	Gly Met Ala	Ser Gly His íle
2020		2025		2030
Arg Asp Phe Gin	íle	Thr Ala Ser Gly	Gin Tyr Gly	Gin Trp Ala Pro
2035		2040	2045
Lys Leu Ala Arg	Leu	His Tyr Ser Gly	Ser íle Asn	Ala Trp Ser Thr
2050		2055	2060
Lys Glu Pro Phe	Ser	Trp íle Lys Val	Asp Leu Leu	Ala Pro Met íle
2065		2070	2075	2080
íle His Gly íle	Lys	Thr Gin Gly Ala	Arg Gin Lys	Phe Ser Ser Leu
2085		2090	2095
Tyr íle Ser Gin	Phe	íle íle Met Tyr	Ser Leu Asp	Gly Lys Lys Trp
2100		2105		2110
Gin Thr Tyr Arg	Gly	Asn Ser Thr Gly	Thr Leu Met	Val Phe Phe Gly
2115		2120		2125
Asn-Val Asp Ser	Ser	Gly íle Lys His	Asn íle Phe	Asn Pro Pro íle
2130		2135	2140
íle Ala Arg Tyr	íle	Arg Leu His Pro	Thr His Tyr	. Ser íle Arg Ser
2145		2150	2155	2160
Thr Leu Arg Met	Glu	Leu Met Gly Cys	Asp Leu Asn	Ser Cys Ser Met
2165		2170	2175
Pro Leu Gly Met	Glu	Ser Lys Ala íle	Ser Asp Ala	Gin íle Thr Ala
2180		2185		2190
Ser Ser Tyr Phe	Thr	Asn Met Phe Ala	Thr Trp Ser	Pro Ser Lys Ala
2195		2200	2205
Arg Leu His Leu	Gin	Gly Arg Ser Asn	Ala Trp Arg	Pro Gin Val Asn
2210		2215	2220
Asn Pro Lys Glu	Trp	Leu Gin Val Asp	Phe Gin Lys	Thr Met Lys Val
2225 f		2230	2235	2240
Thr Gly Val Thr	Thr	Gin Gly Val Lys	Ser Leu Leu	Thr Ser Met Tyr
2245		2250	2255
Val Lys Glu Phe	Leu	íle Ser Ser Ser	Gin Asp Gly	His Gin Trp Thr
2260		2265		2270
Leu Phe Phe Gin	Asn	Gly Lys Val Lys	Val Phe Gin	Gly Asn Gin Asp
2275		2280	2285
Ser Phe Thr Pro	Val	Val Asn Ser Leu	Asp Pro Pro	Leu Leu Thr Arg
2290		2295	2300
Tyr Leu Arg íle	His	Pro Gin Ser Trp	Val His Gin	íle Ala Leu Arg
2305		2310	2315	2320

Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gin Asp Leu Tyr 2325 2330 <210> 3 <211> 1130 <212> DNA <213> Prasa <400> 3 taagcaccct aagacgtggg tgcactacat ctctgcagag gaggaggact gggactacgc 60 ccccgcggtc cccagcccca gtgacagaag ttataaaagt ctctacttga acagtggtcc 120 tcagcgaatt ggtaggaaat acaaaaaagc tcgattcgtc gcttacacgg atgtaacatt 180 taagactcgt aaagctattc cgtatgaatc aggaatcctg ggacctttac tttatggaga 240 agttggagac acacttttga ttatatttaa gaataaagcg agccgaccat ataacatcta 300 ccctcatgga atcactgatg tcagcgcttt gcacccaggg agacttctaa aaggttggaa 360 acatttgaaa gacatgccaa ttctgccagg agagactttc aagtataaat ggacagtgac 420 tgtggaagat gggccaacca agtccgatcc tcggtgcctg acccgctact actcgagctc 480 cattaatcta gagaaagatc tggcttcggg actcattggc cctctcctca tctgctacaa 540 agaatctgta gaccaaagag gaaaccagat gatgtcagac aagagaaacg tcatcctgtt 600 ttctgtattc gatgagaatc aaagctggta cctcgcagag aatattcagc gcttcctccc 660 caatccggat ggattacagc cccaggatcc agagttccaa gcttctaaca tcatgcacag 720 catcaatggc tatgtttttg atagcttgca gctgtcggtt tgtttgcacg aggtggcata 780 ctggtacatt ctaagtgttg gagcacagac ggacttcctc tccgtcttct tctctggcta 840 caccttcaaa cacaaaatgg tctatgaaga cacactcacc ctgttcccct tctcaggaga 900 aacggtcttc atgtcaatgg aaaacccagg tctctgggtc ctagggtgcc acaactcaga 960 cttgcggaac agagggatga cagccttact gaaggtgtat agttgtgaca gggacattgg 1020 tgattattat gacaacactt atgaagatat tccaggcttc ttgctgagtg gaaagaatgt 1080 cattgaaccc agaagctttg cccagaattc aagaccccct agtgcgagca 1130 <210> 4 <211> 368 <212> PRT <213> Prasa <400> 4

Ser 1

Val

Ala

Lys Lys His 5

Pro Lys Thr

Trp Val 10

His

Tyr

íle

Ser 15

Ala

Glu

Glu

Glu

Asp

Trp

Asp

Tyr

Ala

Pro

Ala

Val

Pro

Ser

Pro

Ser

Asp

20

25

30

Arg

Ser

Tyr

Lys

Ser

Leu

Tyr

Leu

Asn

Ser

Gly

Pro

Gin

Arg

íle

Gly

35

40

45

Arg Lys Tyr Lys

Lys

Ala

Arg Phe Val Ala Tyr Thr

Asp

Val

Thr

Phe

50

55

60

Lys

Thr

Arg

Lys

Ala

íle

Pro

Tyr

Glu

Ser

Gly

íle

Leu

Gly

Pro

Leu

65

70

75

80

Leu

Tyr

Gly

Glu

Val

Gly

Asp

Thr

Leu

Leu

íle

íle

Phe

Lys

Asn

Lys

85

90

95

Ala

Ser

Arg

Pro

Tyr

Asn

íle

Tyr

Pro

His

Gly

íle

Thr

Asp

Val

Ser

100

105

110

Ala

Leu

His

Pro

Gly

Arg

Leu

Leu

Lys

Gly

Trp

Lys

His

Leu

Lys

Asp

115

120

125

Met

Pro

íle

Leu

Pro

Gly

Glu

Thr

Phe

Lys

Tyr

Lys

Trp

Thr

Val

Thr

130

135

140

Val

Glu

Asp

Gly

Pro

Thr

Lys

Ser

Asp

Pro

Arg

Cys

Leu

Thr

Arg

Tyr

145

150

155

160

Tyr

Ser

Ser

Ser

íle

Asn

Leu

Glu

Lys

Asp

Leu

Ala

Ser

Gly

Leu

íle

165

170

175

Gly

Pro

Leu

Leu

íle

Cys

Tyr

Lys

Glu

Ser

Val

Asp

Gin

Arg

Gly

Asn

180

185

190

Gin

Met

Met

Ser

Asp

Lys

Arg

Asn

Val

íle

Leu

Phe

Ser

Val

Phe

Asp

195

200

205

Glu

Asn

Gin

Ser

Trp

Tyr

Leu

Ala

Glu

Asn

íle

Gin

Arg

Phe

Leu

Pro

210

215

220

Asn

Pro

Asp

Gly

Leu

Gin

Pro

Gin

Asp

Pro

Glu

Phe

Gin

Ala

Ser

Asn

225

230

235

240

íle

Met

His

Ser

íle

Asn

Gly

Tyr

Val

Phe

Asp

Ser

Leu

Gin

Leu

Ser

245

250

255

Val

Cys

Leu

His

Glu

Val

Ala

Tyr

Trp

Tyr

íle

Leu

Ser

Val

Gly

Ala

260

265

270

Gin

Thr

Asp

Phe

Leu

Ser

Val

Phe

Phe

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Lys

His

275

280

285

Lys

Met

Val

Tyr

Glu

Asp

Thr

Leu

Thr

Leu

Phe

Pro

Phe

Ser

Gly

Glu

290

295

300

Thr

Val

Phe

Met

Ser

Met

Glu

Asn

Pro

Gly

Leu

Trp

Val

Leu

Gly

Cys

305

310

315

320

His

Asn

Ser

Asp

Leu

Arg

Asn

Arg

Gly

Met

Thr

Ala

Leu

Leu

Lys

Val

325

330

335

Tyr

Ser

Cys

Asp

Arg

Asp

íle

Gly

Asp

Tyr

Tyr

Asp

Asn

Thr

Tyr

Glu

340 345 350

Asp íle Pro Gly Phe Leu Leu Ser Gly Lys Asn Val íle Glu Pro Arg 355 360 365 <210> 5 <211> 44 <21'2> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primér <400> 5 ctaatacgac tcactatagg gctcgagcgg ccgcccgggc aggt 44 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primér <400> 6 ccatcctaat acgactcact atagggc 27 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primér <400> 7 ccattgacat gaagaccgtt tete 24 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primér <400>'8 actcactata gggctcgagc ggc 23 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primér <400> 9 gggtgcaaag cgctgacatc agtg 24 <210> 10 <211> 50 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primér <400> 10 cctctcgagc caccatgtcg agccaccatg cagctagagc tctccacctg 50 <210> 11 <211> 31 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primér <400> 11 cgcgcggccg cgcatctggc aaagctgagt t 31 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primér <400> 12 gaaataagcc caggctttgc agtcraa 27 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primér <220>

<221> rôzne znaky <222> (22) <223> N v polohe 22 je A, T, G or C.

<400> 13 aggaaattcc actggaacct tn 22 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primér <220>

<221> rôzne znaky <222> (25) <223> N v polohe 25 je A, T, G or C.

<400> 14 ctgggggtga attcgaaggt agcgn <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primér <400> 15 gagttcatcg ggaagacctg ttg <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: Oligonukleotidový primér <400> 16 acagcccatc aactccatgc gaag <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primér <400> 17 tcagggcaat caggactcc <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primér <400> 18 ccgtggtgaa cgctctggac c <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primér <400> 19 gtagaggtcc tgtgcctcgc agcc 24 <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primér <400> 20 gtagagstsc tgkgcctcrc akccyag 2~ <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primér <400>.21 cttcgcatgg agttgatggg ctgt 24 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primér <400> 22 aatcaggact cctccacccc g 21 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primér <400> 23

ggatccaccc cacgagctgg			20
<210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Umelá sekvencia
<220> <223> Opis umelej sekvencie:	oligonukleotidový	primér
<400> 24 cgccctgagg ctcgaggttc tagg			24
<210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Umelá sekvencia
<220> <223> Opis umelej sekvencie:	oligonukleotidový	primér
<400> 25 aatcaggact cctccacccc cg			22
<210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia
<220> <223> Opis umelej sekvencie:	oligonukleotidový	primér
<400> 26 cctťgcagga attcgattca			20
<210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia
<220> <223> Opis umelej sekvencie:	oligonukleotidový	primér
<400> 27 ccgtggtgaa cgctctggac c			21

<210> 28 <211> 2319 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 28

Met Gin 1

íle

Ala

Leu Phe 5

Ala

Cys

Phe

Phe 10

Leu

Ser

Leu

Phe

Asn 15

Phe

Cys Ser

Ser

Ala

íle Arg

Arg

Tyr

Tyr

Leu

Gly

Ala

Val

Glu

Leu

Ser

20

25

30

Trp Asn

Tyr

íle

Gin Ser

Asp

Leu

Leu

Ser

Val

Leu

His

Thr

Asp

Ser

35

40

45

Arg Phe

Leu

Pro

Arg Met

Ser

Thr

Ser

Phe

Pro

Phe

Asn

Thr

Ser

íle

50

55

60

Met Tyr

Lys

Lys

Thr Val

Phe

Val

Glu

Tyr

Lys

Asp

Gin

Leu

Phe

Asn

65

70

75

80

íle Ala

Lys

Pro

Arg Pro

Pro

Trp

Met

Gly

Leu

Leu

Gly

Pro

Thr

íle

85

90

95

Trp Thr

Glu

Val

His Asp

Thr

Val

Val

íle

Thr

Leu

Lys

Asn

Met

Ala

100

105

110

Ser His

Pro

Val

Ser Leu

His

Ala

Val

Gly

Val

Ser

Tyr

Trp

Lys

Ala

115

120

125

Ser Glu

Gly

Asp

Glu Tyr

Glu

Asp

Gin

Thr

Ser

Gin

Met

Glu

Lys

Glu

130

135

140

Asp Asp

Lys

Val

Phe Pro

Gly

Glu

Ser

His

Thr

Tyr

Val

Trp

Gin

Val

145

150

155

160

Leu Lys

Glu

Asn

Gly Pro

Met

Ala

Ser

Asp

Pro

Pro

Cys

Leu

Thr

Tyr

165

170

175

Ser Tyr

Met

Ser

His Val

Asp

Leu

Val

Lys

Asp

Leu

Asn

Ser

Gly

Leu

180

185

190

íle Gly

Ala

Leu

Leu Val

Cys

Lys

Glu

Gly

Ser

Leu

Ser

Lys

Glu

Arg

195

200

205

Thr Gin

Met

Leu

Tyr Gin

Phe

Val

Leu

Leu

Phe

Ala

Val

Phe

Asp

Glu

210

215

220

Gly Lys

Ser

Trp

His Ser

Glu

Thr

Asn

Asp

Ser

Tyr

Thr

Gin

Ser

Met

225

230

235

240

Asp Ser

Ala

Ser

Ala Arg

Asp

Trp

Pro

Lys

Met

His

Thr

Val

Asn

Gly

245

250

255

Tyr Val

Asn

Arg

Ser Leu

Pro

Gly

Leu

íle

Gly

Cys

His

Arg

Lys

Ser

260

265

270

Val Tyr

Trp

His

Val íle

Gly

Met

Gly

Thr

Thr

Pro

Glu

íle

His

Ser

275

280

285

íle Phe

Leu

Glu

Gly His

Thr

Phe

Phe

Val

Arg

Asn

His

Arg

Gin

Ala

290

295

300

Ser Leu

Glu

íle

Ser Pro

íle

Thr

Phe

Leu

Thr

Ala

Gin

Thr

Leu

Leu

305

310

315

320

íle Asp

Leu

Gly

Gin Phe

Leu

Leu

Phe

Cys

His

íle

Ser

Ser

His

Lys

325

330

335

His Asp Gly Met 340

Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys 345

Pro 350

Glu

Glu

Ser

Gin

Trp

Gin

Lys

Lys

Asn

Asn

Asn

Glu

Glu

Met

Glu

Asp

Tyr

Asp

355

360

365

Asp

Asp

Leu

Tyr

Ser

Glu

Met

Asp

Met

Phe

Thr

Leu

Asp

Tyr

Asp

Ser

370

375

380

Ser

Pro

Phe

íle

Gin

íle

Arg

Ser

Val

Ala

Lys

Lys

Tyr

Pro

Lys

Thr

385

390

395

400

Trp

íle

His

Tyr

íle

Ser

Ala

Glu

Glu

Glu

Asp

Trp

Asp

Tyr

Ala

Pro

405

410

415

Ser

Val

Pro

Thr

Ser

Asp

Asn

Gly

Ser

Tyr

Lys

Ser

Gin

Tyr

Leu

Ser

420

425

430

Asn

Gly

Pro

His

Arg

íle

Gly

Arg

Lys

Tyr

Lys

Lys

Val

Arg

Phe

íle

435

440

445

Ala

Tyr

Thr

Asp

Glu

Thr

Phe

Lys

Thr

Arg

Glu

Thr

íle

Gin

His

Glu

450

455

460

Ser

Gly

Leu

Leu

Gly

Pro

Leu

Leu

Tyr

Gly

Glu

Val

Gly

Asp

Thr

Leu

465

470

475

480

Leu

íle

íle

Phe

Lys

Asn

Gin

Ala

Ser

Arg

Pro

Tyr

Asn

íle

Tyr

Pro

485

4 90

495

His

Gly

íle

Thr

Asp

Val

Ser

Pro

Leu

His

Ala

Arg

Arg

Leu

Pro

Arg

500

505

510

Gly

íle

Lys

His

Val

Lys

Asp

Leu

Pro

íle

His

Pro

Gly

Glu

íle

Phe

515

520

525

Lys

Tyr

Lys

Trp

Thr

Val

Thr

Val

Glu

Asp

Gly

Pro

Thr

Lys

Ser

Asp

530

535

540

Pro

Arg

Cys

Leu

Thr

Arg

Tyr

Tyr

Ser

Ser

Phe

íle

Asn

Pro

Glu

Arg

545

550

555

560

Asp

Leu

Ala

Ser

Gly

Leu

íle

Gly

Pro

Leu

Leu

íle

Cys

Tyr

Lys

Glu

565

570

575

Ser

Val

Asp

Gin

Arg

Gly

Asn

Gin

Met

Met

Ser

Asp

Lys

Arg

Asn

Val

580

585

590

íle

Leu

Phe

Ser

íle

Phe

Asp

Glu

Asn

Gin

Ser

Trp

Tyr

íle

Thr

Glu

595

600

605

Asn

Met

Gin

Arg

Phe

Leu

Pro

Asn

Ala

Ala

Lys

Thr

Gin

Pro

Gin

Asp

610

615

620

Pro

Gly

Phe

Gin

Ala

Ser

Asn

íle

Met

His

Ser

íle

Asn

Gly

Tyr

Val

625

630

635

640

Phe

Asp

Ser

Leu

Glu

Leu

Thr

Val

Cys

Leu

His

Glu

Val

Ala

Tyr

Trp

645

650

655

His

íle

Leu

Ser

Val

Gly

Ala

Gin

Thr

Asp

Phe

Leu

Ser

íle

Phe

Phe

660

665

670

Ser Gly Tyr Thr

Phe

Lys His

Lys 680

Met Val Tyr

Glu

Asp 685

Thr

Leu

Thr

675

Leu

Phe

Pro

Phe

Ser

Gly

Glu

Thr

Val

Phe

Met

Ser

Met

Glu

Asn

Pro

690

695

700

Gly

Leu

Trp

Val

Leu

Gly

Cys

His

Asn

Ser

Asp

Phe

Arg

Lys

Arg

Gly

705

710

715

720

Met

Thr

Ala

Leu

Leu

Lys

Val

Ser

Ser

Cys

Asp

Lys

Ser

Thr

Ser

Asp

725

730

735

Tyr

Tyr

Glu

Glu

íle

Tyr

Glu

Asp

íle

Pro

Thr

Gin

Leu

Val

Asn

Glu

740

745

750

Asn

Asn

Val

íle

Asp

Pro

Arg

Ser

Phe

Phe

Gin

Asn

Thr

Asn

His

Pro

755

760

765

Asn

Thr

Arg

Lys

Lys

Lys

Phe

Lys

Asp

Ser

Thr

íle

Pro

Lys

Asn

Asp

770

775

780

Met

Glu

Lys

íle

Glu

Pro

Gin

Phe

Glu

Glu

íle

Ala

Glu

Met

Leu

Lys

785

790

795

800

Val

Gin

Ser

Val

Ser

Val

Ser

Asp

Met

Leu

Met

Leu

Leu

Gly

Gin

Ser

805

810

815

His

Pro

Thr

Pro

His

Gly

Leu

Phe

Leu

Ser

Asp

Gly

Gin

Glu

Ala

íle

820

825

830

Tyr

Glu

Ala

íle

His

Asp

Asp

His

Ser

Pro

Asn

Ala

íle

Asp

Ser

Asn

835

840

845

Glu

Gly

Pro

Ser

Lys

Val

Thr

Gin

Leu

Arg

Pro

Glu

Ser

' His

His

Ser

850

855

860

Glu

Lys

íle

Val

Phe

Thr

Pro

Gin

Pro

Gly

Leu

Gin

Leu

Arg

Ser

Asn

865

870

875

880

Lys

Ser

Leu

Glu

Thr

Thr

íle

Glu

Val

Lys

Trp

Lys

Lys

Leu

Gly

Leu

885

890

895

Gin

Val

Ser

Ser

Leu

Pro

Ser

Asn

Leu

Met

Thr

Thr

Thr

íle

Leu

Ser

900

905

910

Asp

Asn

Leu

Lys

Ala

Thr

Phe

Glu

Lys

Thr

Asp

Ser

Ser

Gly

Phe

Pro

915

920

925

Asp

Met

Pro

Val

His

Ser

Ser

Ser

Lys

Leu

Ser

Thr

Thr

Ala

Phe

Gly

930

935

940

Lys

Lys

Ala

Tyr

Ser

Leu

Val

Gly

Ser

His

Val

Pro

Leu

Asn

Ala

Ser

945

950

955

960

Glu

Glu

Asn

Ser

Asp

Ser

Asn

íle

Leu

Asp

Ser

Thr

Leu

Met

Tyr

Ser

965

970

975

Gin

Glu

Ser

Leu

Pro

Arg

Asp

Asn

íle

Leu

Ser

íle

Glu

Asn

Asp

Arg

980

985

990

Leu

Leu

Arg

Glu

Lys

Arg

Phe

His

Gly

íle

Ala

Leu

Leu

Thr

Lys

Asp

995

1000

1005

Asn	Thr 1010	Leu	Phe Lys Asp	Asn Val Ser Leu Met Lys	Thr	Asn	Lys	Thr
1015	1020
Tyr Asn	His	Ser Thr Thr	Asn Glu	Lys Leu His Thr	Glu	Ser	Pro	Thr
1025		1030		1035			1040
Ser	íle	Glu	Asn Ser Thr	Thr Asp	Leu Gin Asp Ala	íle	Leu	Lys	Val
			1045		1050		1055
Asn	Ser	Glu	íle Gin Glu	Val Thr	Ala Leu íle His	Asp	Gly	Thr	Leu
			1060		1065		1070
Leu	Gly	Lys	Asn Ser Thr	Tyr Leu	Arg Leu Asn His	Met	Leu	Asn	Arg
		1075		1080		1085
Thr	Thr	Ser	Thr Lys Asn	Lys Asp	íle Phe His Arg	Lys	Asp	Glu	Asp
	1090			1095	1100
Pro	íle	Pro	Gin Asp Glu	Glu Asn	Thr íle Met Pro	Phe	Ser	Lys	Met
1105		1110		1115				1120
Leu	Phe	Leu	Ser Glu Ser	Ser Asn	Trp Phe Lys Lys	Thr	Asn	Gly	Asn
			1125		1130		1135
Asn	Ser	Leu	Asn Ser Glu	Gin Glu	His Ser Pro Lys	Gin	Leu	Val	Tyr
			1140	1145		1150
Leu	Met	Phe	Lys Lys Tyr	Val Lys	Asn Gin Ser Phe	Leu	Ser	Glu	Lys
	1155		1160		1165
Asn	Lys	Val	Thr Val Glu	Gin Asp	Gly Phe Thr Lys	Asn	íle	Gly	Leu
1170		1175	1180
Lys	Asp	Met	Ala Phe Pro	His Asn	Met Ser íle Phe	Leu	Thr	Thr	Leu
1185		1190		1195				1200
Ser	Asn	Val	His Glu Asn	Gly Arg	His Asn Gin Glu	Lys	Asn	Ilé	Gin
			1205		1210		1215
Glu	Glu	íle	Glu Lys Glu	Ala Leu	íle Glu Glu Lys	Val	Val	Leu	Pro
		1220	1225		1230
Gin	Val	His	Glu Ala Thr	Gly Ser	Lys Asn Phe Leu	Lys	Asp	íle	Leu
	1235		1240	1245
íle	Leu	Gly	Thr Arg Gin	Asn íle	Ser Leu Tyr Glu	Val	His	Val	Pro
1250		1255	1260
Val	Leu	Gin	Asn íle Thr	Ser íle	Asn Asn Ser Thr	Asn	Thr	Val	Gin
1265		1270		1275			1280
íle	His	Met	Glu His Phe	Phe Lys	Arg Arg Lys Asp	Lys	Glu	Thr	Asn
			1285		1290		1295
Ser	Glu	Gly	Leu Val Asn	Lys Thr	Arg Glu Met Val	Lys	Asn	Tyr	Pro
		1300	1305	1310
Ser	Gin	Lys	Asn íle Thr	Thr Gin	Arg Ser Lys Arg	Ala	Leu	Gly	Gin

1315 1320 1325

Phe Arg Leu Ser Thr Gin Trp Leu Lys Thr íle Asn Cys Ser Thr Gin 1330 1335 1340

Cys íle 1345	íle	Lys	Gin	íle 1350	Asp His	Ser Lys Glu 1355	Met	Lys	Lys	Phe íle 1360
Thr Lys	Ser	Ser	Leu	Ser	Asp Ser	Ser Val íle	Lys	Ser	Thr	Thr Gin
			1365			1370			1375
Thr Asn	Ser	Ser	Asp	Ser	His íle	Val Lys Thr	Ser	Ala	Phe	Pro Pro
		1380				1385			1390
íle Asp	Leu	Lys	Arg	Ser	Pro Phe	Gin Asn Lys	Phe	Ser	His	Val Gin
	1395				1400			1405
Ala Ser	Ser	Tyr	íle	Tyr	Asp Phe	Lys Thr Lys	Ser	Ser	Arg	íle Gin
1410					1415		1420
Glu Ser	Asn	Asn	Phe	Leu	Lys Glu	Thr Lys íle	Asn	Asn	Pro	Ser Leu
1425				1430		1435				1440
Ala íle	Leu	Pro	Trp	Asn	Met Phe	íle Asp Gin	Gly	Lys	Phe	Thr Ser
			1445			1450				1455
Pro Gly	Lys	Ser	Asn	Thr	Asn Ser	Val Thr Tyr	Lys	Lys	Arg	Glu Asn
	1460			1465			1470
íle íle	Phe	Leu	Lys	Pro	Thr Leu	Pro Glu Glu	Ser	Gly	Lys	íle Glu
1475				1480			1485
Leu Leu	Pro	Gin	Val	Ser	íle Gin	Glu Glu Glu	íle	Leu	Pro	Thr Glu
1490				1495	1500
Thr Ser	His	Gly	Ser	Pro	Gly His	Leu Asn Leu	Met	Lys	Glu	Val Phe
1505			1510		1515				' 1520
Leu Gin	Lys	íle	Gin	Gly	Pro Thr	Lys Trp Asn	Lys	Ala	Lys	Arg His
		1525			1530				1535
Gly Glu	Ser	íle	Lys	Gly	Lys Thr	Glu Ser Ser	Lys	Asn	Thr	Arg Ser
	1540			1545			1550
Lys Leu	Leu	Asn	His	His	Ala Trp	Asp Tyr His	Tyr	Ala	Ala	Gin íle
1555				1560		1565
Pro Lys	Asp	Met	Trp	Lys	Ser Lys	Glu Lys Ser	Pro	Glu	íle	íle Ser
1570				1575	1580
íle Lys	Gin	Glu	Asp	Thr	íle Leu	Ser Leu Arg	Pro	His	Gly	Asn Ser
1585			1590		1595				1600
His Ser	íle	Gly	Ala	Asn	Glu Lys	Gin Asn Trp	Pro	Gin	Arg	Glu Thr
		1605			1610			1615
Thr Trp	Val	Lys	Gin	Gly	Gin Thr	Gin Arg Thr	Cys	Ser	Gin	íle Pro
	1620			1625		1630
Pro Val	Leu	Lys	Arg	His	Gin Arg	Glu Leu Ser	Ala	Phe	Gin	Ser Glu
1635				1640		1645
Gin Glu	Ala	Thr	Asp	Tyr	Asp Asp	Ala íle Thr	íle	Glu	Thr	íle Glu
1650				1655	1660
Asp Phe	Asp	íle	Tyr	Ser	Glu Asp	íle Lys Gin	Gly	Pro	Arg	Ser Phe
1665			1670		1675				1680

Gin Gin Lys Thr Arg	His	Tyr	Phe	íle Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp
	168.5	1690	1695
Asp	Tyr Gly Met Ser	Thr	Ser	His	Val Leu Arg Asn Arg	Tyr Gin Ser
	1700			1705 1710
Asp	Asn Val Pro Gin	Phe	Lys	Lys	Val Val Phe Gin Glu	Phe Thr Asp
	1715		1720	1725
Gly	Ser Phe Ser Gin	Pro	Leu	Tyr	Arg Gly Glu Leu Asn	Glu His Leu
1730	1735		1740
Gly	Leu Leu Gly Pro	Tyr	íle	Arg	Ala Glu Val Glu Asp	Asn íle Met
1745	1750			1755	1760
Val	Thr Phe Lys Asn	Gin	Ala	Ser	Arg Pro Tyr Ser Phe	Tyr Ser Ser
	1765				1770	1775
Leu	íle Ser Tyr Lys	Glu	Asp	Gin	Arg Gly Glu Glu Pro	Arg Arg Asn
	1780			1785 :	L790
Phe	Val Lys Pro Asn	Glu	Thr	Lys	íle Tyr Phe Trp Lys	Val Gin His
	1795		1800	1805
His	Met Ala Pro Thr	Glu	Asp	Glu	Phe Asp Cys Lys Ala	Trp Ala Tyr
1810	1815		1820
Phe	Ser Asp Val Asp	Leu	Glu	Arg	Asp Met His Ser Gly	Leu íle Gly
1825	1830			1835	1840
Pro	Leu Leu íle Cys	His	Ala	Asn	Thr Leu Asn Pro Ala	His Gly Arg
	1845				1850	1855
Gin	Val Ser Val Gin	Glu	Phe	Ala	Leu Leu Phe Thr íle	Phe Asp Glu
	1860			1865	1870
Thr	Lys Ser Trp Tyr	Phe	Thr	Glu	Asn Val Lys Arg Asn	Cys Lys Thr
	1875		1880	1885
Pro	Cys Asn Phe Gin	Met	Glu	Asp	Pro Thr Leu Lys Glu	Asn Tyr Arg
1890	1895		1900
Phe	His Ala íle Asn	Gly	Tyr	Val	Met Asp Thr Leu Pro	Gly Leu Val
1905 :	L910			1915	1920
Met	Ala Gin Asp Gin	Arg	íle	Arg	Trp Tyr Leu Leu Ser	Met Gly Asn
	1925				1930	1935
Asn	Glu Asn íle Gin	Ser	íle	His	Phe Ser Gly His Val	Phe Thr Val
	1940			1945	1950
Arg	Lys Lys Glu Glu	Tyr	Lys	Met	Ala Val Tyr Asn Leu	Tyr Pro Gly
	1955		1960	1965
Val	Phe Glu Thr Leu	Glu	Met	íle	Pro Ser Arg Ala Gly	íle Trp Arg
1970	1975		1980
Val	Glu Cys Leu íle	Gly	Glu	His	Leu Gin Ala Gly Met	Ser Thr Leu
1985 1990			1995	2000
Phe	Leu Val Tyr Ser	Lys	Gin	Cys	Gin íle Pro Leu Gly	Met Ala Ser
	2005				2010	2015

Gly	Ser	íle Arg Asp 2020	Phe	Gin	íle Thr Ala Ser Gly His Tyr Gly	Gin
2025	2030
Trp	Ala	Pro Asn Leu	Ala	Arg	Leu His	Tyr Ser Gly Ser íle Asn	Ala
		2035		2040	2045
Trp	Ser	Thr Lys Glu	Pro	Phe	Ser Trp	íle Lys Val Asp Leu Leu	Ala
2050		2055		2060
Pro	Met	íle Val His	Gly	íle	Lys Thr	Gin Gly Ala Arg Gin Lys	Phe
2065	2070			2075	2080
Ser	Ser	Leu Tyr íle	Ser	Gin	Phe íle	íle Met Tyr Ser Leu Asp	Gly
		2085			2090 2095
Lys	Lys	Trp Leu Ser	Tyr	Gin	Gly Asn	Ser Thr Gly Thr Leu Met	Val
		2100			2105	2110
Phe	Phe	Gly Asn Val	Asp	Ser	Ser Gly	íle Lys His Asn Ser Phe	Asn
		2115		2120	2125
Pro	Pro	íle íle Ala	Arg	Tyr	íle Arg	Leu His Pro Thr His Ser	Ser
2130		2135		2140
íle	Arg	Ser Thr Leu	Arg	Met	Glu Leu	Met Gly Cys Asp Leu Asn	Ser
2145	2150			2155	2160
Cys	Ser	íle Pro Leu	Gly	Met	Glu Ser	Lys Val íle Ser Asp Thr	Gin
		2165			2170 2175
íle	Thr	Ala Ser Ser	Tyr	Phe	Thr Asn	Met Phe Ala Thr Trp Ser	Pro
		2180			2185	2190
Ser	Gin	Ala Arg Leu	His	Leu	Gin Gly	Arg Thr Asn Ala Trp Arg	Pro
	2195		2200	2205
Gin	Val	Asn Asp Pro	Lys	Gin	Trp Leu	Gin Val Asp Leu Gin Lys	Thr
2210		2215		2220
Met	Lys	Val Thr Gly	íle	íle	Thr Gin	Gly Val Lys Ser Leu Phe	Thr
2225	2230			2235 :	2240
Ser	Met	Phe Val Lys	Glu	Phe	Leu íle	Ser Ser Ser Gin Asp Gly	His
		2245			2250 2255
His	Trp	Thr Gin íle	Leu	Tyr	Asn Gly	Lys Val Lys Val Phe Gin	Gly
		2260			2265	2270
Asn	Gin	Asp Ser Ser	Thr	Pro	Met Met	Asn Ser Leu Asp Pro Pro	Leu
	2275		2280	2285
Leu	Thr	Arg Tyr Leu	Arg	íle	His Pro	Gin íle Trp Glu His Gin	íle
2290		2295		2300
Ala	Leu	Arg Leu Glu	íle	Leu	Gly Cys	Glu Ala Gin Gin Gin Tyr

2305 2310 2315 <210> 29 <211> 6402 <212> DNA <213> Prasa <220>

<221> CDS <222> (1)..(6399) <400> 29

atg cag cta

gag Glu

ctc tcc acc

tgt Cys

gtc Val

ttt Phe 10

ctg Leu

tgt Cys

ctc Leu

ttg Leu

cca Pro 15

ctc Leu

48

Met 1

Gin

Leu

Leu 5

Ser

Thr

ggc

ttt

agt

gcc

atc

agg

aga

tac

tac

ctg

ggc

gca

gtg

gaa

ctg

tcc

96

Gly

Phe

Ser

Ala

íle

Arg

Arg

Tyr

Tyr

Leu

Gly

Ala

Val

Glu

Leu

Ser

20

25

30

tgg

gac

tac

cgg

caa

agt

gaa

ctc

ctc

cgt

gag

ctg

cac

gtg

gac

acc

14 4

Trp

Asp

Tyr

Arg

Gin

Ser

Glu

Leu

Leu

Arg

Glu

Leu

His

Val

Asp

Thr

35

40

45

aga

ttt

cct

get

aca

gcg

cca

gga

get

ctt

ccg

ttg

ggc

ccg

tca

gtc

192

Arg

Phe

Pro

Ala

Thr

Ala

Pro

Gly

Ala

Leu

Pro

Leu

Gly

Pro

Ser

Val

50

55

60

ctg

tac

aaa

aag

act

gtg

ttc

gta

gag

ttc

acg

gat

caa

ctt

ttc

age

240

Leu

Tyr

Lys

Lys

Thr

Val

Phe

Val

Glu

Phe

Thr

Asp

Gin

Leu

Phe

Ser

65

70

75

80

gtt

gcc

agg

ccc

agg

cca

cca

tgg

atg

ggt

ctg

ctg

ggt

cct

acc

atc

288

Val

Ala

Arg

Pro

Arg

Pro

Pro

Trp

Met

Gly

Leu

Leu

Gly

Pro

Thr

íle

85

90

95

cag

get

gag

gtt

tac

gac

acg

gtg

gtc

gtt

acc

ctg

aag

aac

atg

get

336

Gin

Ala

Glu

Val

Tyr

Asp

Thr

Val

Val

Val

Thr

Leu

Lys

Asn

Met

Ala

100

105

110

tct

cat

ccc

gtt

agt

ctt

cac

get

gtc

ggc

gtc

tcc

ttc

tgg.

aaa

tct

384

Ser

His

Pro

Val

Ser

Leu

His

Ala

Val

Gly

Val

Ser

Phe

Trp

Lys

Ser

115

120

125

tcc

gaa

ggc

get

gaa

tat

gag

gat

cac

acc

age

caa

agg

gag

aag

gaa

432

Ser

Glu

Gly

Ala

Glu

Tyr

Glu

Asp

His

Thr

Ser

Gin

Arg

Glu

Lys

Glu

130

135

140

gac

gat

aaa

gtc

ctt

ccc

ggt

aaa

age

caa

acc

tac

gtc

tgg

cag

gtc

480

Asp

Asp

Lys

Val

Leu

Pro

Gly

Lys

Ser

Gin

Thr

Tyr

Val

Trp

Gin

Val

145

150

155

160

ctg

aaa

gaa

aat

ggt

cca

aca

gcc

tct

gac

cca

cca

tgt

ctc

acc

tac

528

Leu

Lys

Glu

Asn

Gly

Pro

Thr

Ala

Ser

Asp

Pro

Pro

Cys

Leu

Thr

Tyr

165

170

175

tca

tac

ctg

tct

cac

gtg

gac

ctg

gtg

aaa

gac

ctg

aat

tcg

ggc

ctc

576

Ser

Tyr

Leu

Ser

His

Val

Asp

Leu

Val

Lys

Asp

Leu

Asn

Ser

Gly

Leu

180

185

190

att

gga

gcc

ctg

ctg

gtt

tgt

aga

gaa

ggg

agt

ctg

acc

aga

gaa

agg

624

íle

Gly

Ala

Leu

Leu

Val

Cys

Arg

Glu

Gly

Ser

Leu

Thr

Arg

Glu

Arg

195

200

205

acc

cag

aac

ctg

cac

gaa

ttt

gta

cta

ctt

ttt

get

gtc

ttt

gat

gaa

672

Thr

Gin

Asn

Leu

His

Glu

Phe

Val

Leu

Leu

Phe

Ala

Val

Phe

Asp

Glu

210

215

220

ggg aaa agt tgg cac tca gca aga aat gac tcc tgg aca cgg gcc atg 720

Gly 225

Lys

Ser

Trp

His

Ser Ala Arg Asn Asp Ser

Trp Thr Arg Ala Met . 240

230

235

gat

ccc

gca

cct

gcc

agg

gcc

cag

cct

gca

atg

cac

aca

gtc

aat

ggc

768

Asp

Pro

Ala

Pro

Ala

Arg

Ala

Gin

Pro

Ala

Met

His

Thr

Val

Asn

Gly

245

250

255

tat

gtc

aac

agg

tet

ctg

cca

ggt

ctg

atc

gga

tgt

cat

aag

aaa

tca

816

Tyr

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

Pro

Gly

Leu

íle

Gly

Cys

His

Lys

Lys

Ser

260

265

270

gtc

tac

tgg

cac

gtg

att

gga

atg

ggc

acc

age

ccg

gaa

gtg

cač

tcc

864

Val

Tyr

Trp

His

Val

íle

Gly

Met

Gly

Thr

Ser

Pro

Glu

Val

His

Ser

275

280

285

att

ttt

ctt

gaa

ggc

cac

acg

ttt

ctc

gtg

agg

cac

cat

ege

cag

get

9.2

íle

Phe

Leu

Glu

Gly

His

Thr

Phe

Leu

Val

Arg

His

His

Arg

Gin

Ala

290

295

300

tcc

ttg

gag

atc

tcg

cca

cta

act

ttc

ctc

act

get

cag

aca

ttc

ctg

960

Ser

Leu

Glu

íle

Ser

Pro

Leu

Thr

Phe

Leu

Thr

Ala

Gin

Thr

Phe

Leu

305

310

315

320

atg

gac

ctt

ggc

cag

ttc

cta

ctg

ttt

tgt

cat

atc

tet

tcc

cac

cac

1008

Met

Asp

Leu

Gly

Gin

Phe

Leu

Leu

Phe

Cys

His

íle

Ser

Ser

His

His

325

330

335

cat

ggt

ggc

atg

gag

get

cac

gtc

aga

gta

gaa

age

tgc

gcc

gag

gag

1056

His

Gly

Gly

Met

Glu

Ala

His

Val

Arg

Val

Glu

Ser

Cys

Ala

Glu

Glu

340

345

350

ccc

cag

ctg

cgg

agg

aaa

get

gat

gaa

gag

gaa

gat

tat

gat

gac

aat

1104

Pro

Gin

Leu

Arg

Arg

Lys

Ala

Asp

Glu

Glu

Glu

Asp

Tyr

Asp

Asp

Asn

355

360

365

ttg

tac

gac

tcg

gac

atg

gac

gtg

gtc

cgg

ctc

gat

ggt

gac

gac

gtg

11Ξ2

Leu

Tyr

Asp

Ser

Asp

Met

Asp

Val

Val

Arg

Leu

Asp

Gly

Asp

Asp

Val

370

375

380

tet

ccc

ttt

atc

caa

atc

ege

tcg

gtt

gcc

aag

aag

cat

ccc

aaa

acc

1200

Ser

Pro

Phe

íle

Gin

íle

Arg

Ser

Val

Ala

Lys

Lys

His

Pro

Lys

Thr

385

390

395

400

tgg

gtg

cac

tac

atc

tet

gca

gag

gag

gag

gac

tgg

gac

tac

gcc

ccc

1248

Trp

Val

His

Tyr

íle

Ser

Ala

Glu

Glu

Glu

Asp

Trp

Asp

Tyr

Ala

Pro

405

410

415

gcg

gtc

ccc

age

ccc

agt

gac

aga

agt

tat

aaa

agt

ctc

tac

ttg

aac

1296

Ala

Val

Pro

Ser

Pro

Ser

Asp

Arg

Ser

Tyr

Lys

Ser

Leu

Tyr

Leu

Asn

420

425

430

agt

ggt

cct

cag

ega

att

ggt

agg

aaa

tac

aaa

aaa

get

ega

ttc

gtc

1344

Ser

Gly

Pro

Gin

Arg

íle

Gly

Arg

Lys

Tyr

Lys

Lys

Ala

Arg

Phe

Val

435

440

445

get

tac

acg

gat

gta

aca

ttt

aag

act

cgt

aaa

get

att

ccg

tat

gaa

1392

Ala

Tyr

Thr

Asp

Val

Thr

Phe

Lys

Thr

Arg

Lys

Ala

íle

Pro

Tyr

Glu

450

455

460

tca

gga

atc

ctg

gga

cct

tta

ctt

tat

gga

gaa

gtt

gga

gac

aca

ctt

1440

Ser

Gly

íle

Leu

Gly

Pro

Leu

Leu

Tyr

Gly

Glu

Val

Gly

Asp

Thr

Leu

465

470

475

480

ttg att

ata íle

ttt Phe

aag aat Lys Asn 4 85

aaa gcg agc ega

cca Pro

tat Tyr

aac atc tac cct

1488

Leu

íle

Lys Ala

Ser

Arg 4 90

Asn

íle

Tyr 495

Pro

cat

gga

atc

act

gat

gtc

agc

get

ttg

cac

cca

ggg

aga

ctt

cta

aaa

1536

His

Gly

íle

Thr

Asp

Val

Ser

Ala

Leu

His

Pro

Gly

Arg

Leu

Leu

Lys

500

505

510

ggt

tgg

aaa

cat

ttg

aaa

gac

atg

cca

att

ctg

cca

gga

gag

act

ttc

1584

Gly

Trp

Lys

His

Leu

Lys

Asp

Met

Pro

íle

Leu

Pro

Gly

Glu

Thr

Phe

515

520

525

aag

tat

aaa

tgg

aca

gtg

act

gtg

gaa

gat

ggg

cca

acc

aag

tcc

gat

1632

Lys

Tyr

Lys

Trp

Thr

Val

Thr

Val

Glu

Asp

Gly

Pro

Thr

Lys

Ser

Asp

530

535

540

cct

cgg

tgc

ctg

acc

cgc

tac

tac

tcg

agc

tcc

att

aat

cta

gag

aaa

1680

Pro

Arg

Cys

Leu

Thr

Arg

Tyr

Tyr

Ser

Ser

Ser

íle

Asn

Leu

Glu

Lys

545

550

555

560

gat

ctg

get

tcg

gga

ctc

att

ggc

cct

ctc

ctc

atc

tgc

tac

aaa

gaa

1728

Asp

Leu

Ala

Ser

Gly

Leu

íle

Gly

Pro

Leu

Leu

íle

Cys

Tyr

Lys

Glu

565

570

575

tct

gta

gac

caa

aga

gga

aac

cag

atg

atg

tca

gac

aag

aga

aac

gtc

1776

Ser

Val

Asp

Gin

Arg

Gly

Asn

Gin

Met

Met

Ser

Asp

Lys

Arg

Asn

Val

580

585

590

atc

ctg

ttt

tct

gta

ttc

gat

gag

aat

caa

agc

tgg

tac

ctc

gca

gag

1824

íle

Leu

Phe

Ser

Val

Phe

Asp

Glu

Asn

Gin

Ser

Trp

Tyr

Leu

Ala

Glu

595

600

605

aat

att

cag

cgc

ttc

ctc

ccc

aat

ccg

gat

gga

tta

cag

ccc

cag

gat

1872

Asn

íle

Gin

Arg

Phe

Leu

Pro

Asn

Pro

Asp

Gly

Leu

Gin

. Pro

Gin

Asp

610

615

620

cca

gag

ttc

caa

get

tct

aac

atc

atg

cac

agc

atc

aat

ggc

tat

gtt

1920

Pro

Glu

Phe

Gin

Ala

Ser

Asn

íle

Met

His

Ser

íle

Asn

Gly

Tyr

Val

625

630

635

640

ttt

gat

agc

ttg

cag

ctg

tcg

gtt

tgt

ttg

cac

gag

gtg

gca

tac

tgg

1968

Phe

Asp

Ser

Leu

Gin

Leu

Ser

Val

Cys

Leu

His

Glu

Val

Ala

Tyr

Trp

645

650

655

tac

att

cta

agt

gtt

gga

gca

cag

acg

gac

ttc

ctc

tcc

gtc

ttc

ttc

2016

Tyr

íle

Leu

Ser

Val

Gly

Ala

Gin

Thr

Asp

Phe

Leu

Ser

Val

Phe

Phe

660

665

670

tct

ggc

tac

acc

ttc

aaa

cac

aaa

atg

gtc

tat

gaa

gac

aca

ctc

acc

2064

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Lys

His

Lys

Met

Val

Tyr

Glu

Asp

Thr

Leu

Thr

675

680

685

ctg

ttc

CCC

ttc

tca

gga

gaa

acg

gtc

ttc

atg

tca

atg

gaa

aac

cca

2112

Leu

Phe

Pro

Phe

Ser

Gly

Glu

Thr

Val

Phe

Met

Ser

Met

Glu

Asn

Pro

690

695

700

ggt

ctc

tgg

gtc

cta

ggg

tgc

cac

aac

tca

gac

ttg

cgg

aac

aga

ggg

2160

Gly

Leu

Trp

Val

Leu

Gly

Cys

His

Asn

Ser

Asp

Leu

Arg

Asn

Arg

Gly

705

710

715

720

atg

aca

gcc

tta

ctg

aag

gtg

tat

agt

tgt

gac

agg

gac

att

ggt

gat

2208

Met

Thr

Ala

Leu

Leu

Lys

Val

Tyr

Ser

Cys

Asp

Arg

Asp

íle

Gly

Asp

725

730

735

tat Tyr

tat Tyr

gac Asp

aac Asn 740

act Thr

tat Tyr

gaa Glu

gat Asp

att íle 745

cca Pro

ggc Gly

ttc Phe

ttg ctg agt Leu Leu Ser 750

gga Gly

2256

aag

aat

gtc

att

gaa

ccc

aga

age

ttt

gcc

cag

aat

tca

aga

ccc

cct

2304

Lys

Asn

Val

íle

Glu

Pro

Arg

Ser

Phe

Ala

Gin

Asn

Ser

Arg

Pro

Pro

755

760

765

agt

gcg

age

caa

aag

caa

ttc

caa

acc

atc

aca

agt

cca

gaa

gat

gac

2352

Ser

Ala

Ser

Gin

Lys

Gin

Phe

Gin

Thr

íle

Thr

Ser

Pro

Glu

Asp

Asp

770

775

780

gtg

gag

ctt

gac

ccg

cag

tet

gga

gag

aga

acc

caa

gca

ctg

gaa

gaa

2400

Val

Glu

Leu

Asp

Pro

Gin

Ser

Gly

Glu

Arg

Thr

Gin

Ala

Leu

Glu

Glu

785

790

795

800

cta

agt

gtc

ccc

tet

ggt

gat

ggg

tcg

atg

ctc

ttg

gga

cag

aat

cct

2448

Leu

Ser

Val

Pro

Ser

Gly

Asp

Gly

Ser

Met

Leu

Leu

Gly

Gin

Asn

Pro

805

810

815

get

cca

cat

ggc

tca

tcc

tca

tet

gat

ctt

caa

gaa

gcc

agg

aat

gag

2496

Ala

Pro

His

Gly

Ser

Ser

Ser

Ser

Asp

Leu

Gin

Glu

Ala

Arg

Asn

Glu

820

825

830

get

gat

gat

tat

tta

cct

gga

gca

aga

gaa

aga

ggc

acg

gcc

cca

tcc

2544

Ala

Asp

Asp

Tyr

Leu

Pro

Gly

Ala

Arg

Glu

Arg

Gly

Thr

Ala

Pro

Ser

835

840

845

gca

gcg

gca

cgt

ctc

aga

cca

gag

ctg

cat

cac

agt

gcc

gaa

aga

gta

2592

Ala

Ala

Ala

Arg

Leu

Arg

Pro

Glu

Leu

His

His

Ser

Ala

Glu

Arg

Val

850

855

860

ctt

act

cct

gag

cca

gag

aaa

gag

ttg

aag

aaa

ctt

gat

tca

aaa

atg

2640

Leu

Thr

Pro

Glu

Pro

Glu

Lys

Glu

Leu

Lys

Lys

Leu

Asp

Ser

Lys

Met

865

870

875

880

tet

agt

tca

tca

gac

ctt

cta

aag

act

tcg

cca

aca

att

cca

tca

gac

26SS

Ser

Ser

Ser

Ser

Asp

Leu

Leu

Lys

Thr

Ser

Pro

Thr

íle

Pro

Ser

Asp

885

890

895

acg

ttg

tca

gcg

gag

act

gaa

agg

aca

cat

tcc

tta

ggc

ccc

cca

cac

2736

Thr

Leu

Ser

Ala

Glu

Thr

Glu

Arg

Thr

His

Ser

Leu

Gly

Pro

Pro

His

900

905

910

ccg

cag

gtt

aat

ttc

agg

agt

caa

tta

ggt

gcc

att

gta

ctt

ggc

aaa

2784

Pro

Gin

Val

Asn

Phe

Arg

Ser

Gin

Leu

Gly

Ala

íle

Val

Leu

Gly

Lys

915

920

925

aat

tca

tet

cac

ttt

att

ggg

get

ggt

gtc

cct

ttg

ggc

tcg.

act

gag

2832

Asn

Ser

Ser

His

Phe

íle

Gly

Ala

Gly

Val

Pro

Leu

Gly

Ser

Thr

Glu

930

935

940

gag

gat

cat

gaa

age

tcc

ctg

gga

gaa

aat

gta

tca

cca

gtg

gag

agt

2880

Glu

Asp

His

Glu

Ser

Ser

Leu

Gly

Glu

Asn

Val

Ser

Pro

Val

Glu

Ser

945

950

955

960

gac

ggg

ata

ttt

gaa

aag

gaa

aga

get

cat

gga

cct

get

tca

ctg

acc

2928

Asp

Gly

íle

Phe

Glu

Lys

Glu

Arg

Ala

His

Gly

Pro

Ala

Ser

Leu

Thr

965

970

975

aaa

gac

gat

gtt

tta

ttt

aaa

gtt

aat

atc

tet

ttg

gta

aag

aca

aac

2976

Lys

Asp

Asp

Val

Leu

Phe

Lys

Val

Asn

íle

Ser

Leu

Val

Lys

Thr

Asn

980 985 990

aag Lys

gca Ala

ega gtt Arg Val 995

tac Tyr

tta Leu

aaa act Lys Thr 1000

aat Asn

aga Arg

aag Lys

att cac íle His 1005

att íle

gat Asp

gac Asp

3024

gca

get

tta tta

act

gag

aat agg

gca

tet

gca

acg ttt

atg

gac

aaa

3072

Ala

Ala

Leu Leu

Thr

Glu

Asn Arg

Ala

Ser

Ala

Thr Phe

Met

Asp

Lys

1010

1015

1020

aat

act

aca get

tcg

gga

tta aat

cat

gtg

tca

aat tgg

ata

aaa

ggg

3120

Asn

Thr

Thr Ala

Ser

Gly

Leu Asn

His

Val

Ser

Asn Trp

íle

Lys

Gly

1025

1030

1035

1040

ccc

ctt

ggc aag

aac

ccc

cta age

tcg

gag

ega

ggc ccc

agt

cca

gag

3168

Pro

Leu

Gly Lys

Asn

Pro

Leu Ser

Ser

Glu

Arg

Gly Pro

Ser

Pro

Glu

1045

1050

1055

ctt

ctg

aca tet

tca

gga

tca gga

aaa

tet

gtg

aaa ggt

cag

agt

tet

3216

Leu

Leu

Thr Ser

Ser

Gly

Ser Gly

Lys

Ser

Val

Lys Gly

Gin

Ser

Ser

1060

1065

1070

ggg

cag

ggg aga

ata

cgg

gtg gca

gtg

gaa

gag

gaa gaa

ctg

age

aaa

3264

Gly

Gin

Gly Arg

íle

Arg

Val Ala

Val

Glu

Glu

Glu Glu

Leu

Ser

Lys

1075

1080

1085

ggc

aaa

gag atg

atg

ctt

ccc aac

age

gag

ctc

acc ttt

ctc

act

aac

3312

Gly

Lys

Glu Met

Met

Leu

Pro Asn

Ser

Glu

Leu

Thr Phe

Leu

Thr

Asn

1090

1095

1100

tcg

get

gat gtc

caa

gga

aac gat

aca

cac

agt

caa gga

aaa

aag

tet

3360

Ser

Ala

Asp Val

Gin

Gly

Asn Asp

Thr

His

Ser

Gin Gly

Lys

Lys

Ser

1105

1110

1115

1120

cgg

gaa

gag atg

gaa

agg

aga gaa

aaa

tta

gtc

caa gaa

aaa

gtc

gac

3408

Arg

Glu

Glu Met

Glu

Arg

Arg Glu

Lys

Leu

Val

Gin Glu

Lys

Val

Asp

1125

1130

1135

ttg

cct

cag gtg

tat

aca

gcg act

gga

act

aag

aat ttc

ctg

aga

aac

3456

Leu

Pro

Gin Val

Tyr

Thr

Ala Thr

Gly

Thr

Lys

Asn Phe

Leu

Arg

Asn

1140

1145

1150

att

ttt

cac caa

age

act

gag ccc

agt

gta

gaa

ggg ttt

gat

ggg

ggg

3504

íle

Phe

His Gin

Ser

Thr

Glu Pro

Ser

Val

Glu

Gly Phe

Asp

Gly

Gly

1155

1160

1165

tca

cat

gcg ccg

gtg

cct

caa gac

age

agg

tca

tta aat

gat

tcg

gca

3552

Ser

His

Ala Pro

Val

Pro

Gin Asp

Ser

Arg

Ser

Leu Asn

Asp

Ser

Ala

1170

1175

1180

gag

aga

gca gag

act

cac

ata gcc

cat

ttc

tca

gca att

agg

gaa

gag

3600

Glu Arg

Ala Glu

Thr

His

íle Ala

His

Phe

Ser

Ala íle

Arg

Glu

Glu

1185

1190

1195

1200

gca

ccc

ttg gaa

gcc

ccg

gga aat

ega

aca

ggt

cca ggt

ccg

agg

agt

3648

Ala

Pro

Leu Glu

Ala

Pro

Gly Asn

Arg

Thr

Gly

Pro Gly

Pro

Arg

Ser

1205

1210

1215

gcg

gtt

ccc ege

ege

gtt

aag cag

age

ttg

aaa

cag atc

aga

ctc

ccg

3696

Ala

Val

Pro Arg

Arg

Val

Lys Gin

Ser

Leu

Lys

Gin íle

Arg

Leu

Pro

1220

1225

1230

cta

gaa

gaa ata

aag

cct

gaa agg

ggg

gtg

gtt

ctg aat

gcc

acc

tca

3744

100

Leu Glu

Glu 1235

íle

Lys

Pro

Glu Arg 1240

Gly

Val

Val

Leu

Asn 1245

Ala

Thr

Ser

acc cgg

tgg

tct

gaa

age

agt

cct

atc

tta

caa

gga

gcc

aaa

aga

aat

3792

Thr Arg 1250

Trp

Ser

Glu

Ser

Ser 1255

Pro

íle

Leu

Gin

Gly 1260

Ala

Lys

Arg

Asn

aac ctt

tct

tta

cct

ttc

ctg

acc

ttg

gaa

atg

gcc

gga

ggt

caa

gga

3840

Asn Leu 1265

Ser

Leu

Pro

Phe 1270

Leu

Thr

Leu

Glu

Met 1275

Ala

Gly

Gly

Gin

Gly 1280

aag atc

age

gcc

ctg

ggg

aaa

agt

gcc

gca

ggc

ccg

ctg

gcg

tcc

ggg

3888

Lys íle

Ser

Ala

Leu 1285

Gly

Lys

Ser

Ala

Ala 1290

Gly

Pro

Leu

Ala

Ser 1295

Gly

aag ctg

gag

aag

get

gtt

ctc

tct

tca

gca

ggc

ttg

tct

gaa

gca

tct

3936

Lys Leu

Glu

Lys 1300

Ala

Val

Leu

Ser

Ser 1305

Ala

Gly

Leu

Ser

Glu 1310

Ala

Ser

ggc aaa

get

gag

ttt

ctt

cct

aaa

gtt

ega

gtt

cat

cgg

gaa

gac

ctg

3984

Gly Lys

Ala 1315

Glu

Phe

Leu

Pro

Lys 1320

Val

Arg

Val

His

Arg 1325

Glu

Asp

Leu

ttg cct

caa

aaa

acc

age

aat

gtt

tct

tgc

gca

cac

ggg

gat

ctc

ggc

4032

Leu Pro 1330

Gin

Lys

Thr

Ser

Asn 1335

Val

Ser

Cys

Ala

His 1340

Gly

Asp

Leu

Gly

cag gag

atc

ttc

ctg

cag

aaa

aca

cgg

gga

cct

gtt

aac

ctg

aac

aaa

4080

Gin Glu 1345

íle

Phe

Leu

Gin 1350

Lys

Thr

Arg

Gly

Pro 1355

Val

Asn

Leu

Asn

Lys 1360

gta aat

aga

cct

gga

agg

act

ccc

tcc

aag

ctt

ctg

ggt

ccc

ccg

atg

4128

Val Asn

Arg

Pro

Gly 1365

Arg

Thr

Pro

Ser

Lys 1370

Leu

Leu

Gly

Pro

Pro 1375

Met

ccc aaa

gag

tgg

gaa

tcc

cta

gag

aag

tca

cca

aaa

age

aca

get

ctc

4176

Pro Lys

Glu

Trp 1380

Glu

Ser

Leu

Glu

Lys 1385

Ser

Pro

Lys

Ser

Thr 1390

Ala

Leu

agg acg

aaa

gac

atc

atc

agt

tta

ccc

ctg

gac

cgt

cac

gaa

age

aat

4224

Arg Thr

Lys L395

Asp

íle

íle

Ser

Leu 1400

Pro

Leu

Asp

Arg

His 1405

Glu

Ser

Asn

cat tca

ata

gca

gca

aaa

aat

gaa

gga

caa

gcc

gag

acc

caa

aga

gaa

4272

His Ser 1410

íle

Ala

Ala

Lys Asn 1415

Glu

Gly

Gin

Ala

Glu 1420

Thr

Gin

Arg

Glu

gcc gcc

tgg

acg

aag

cag

gga

ggg

cct

gga

agg

ctg

tgc

get

cca

aag

4320

Ala Ala 1425

Trp

Thr

Lys Gin 1430

Gly

Gly

Pro

Gly

Arg 1435

Leu

Cys

Ala

Pro

Lys 1440

cct ccg

gtc

ctg

ega

cgg

cat

cag

agg

gac

ata

age

ctt

cct

act

ttt

4368

Pro Pro

Val

Leu Arg 1445

Arg

His

Gin

Arg

Asp 1450

íle

Ser

Leu

Pro

Thr 1455

Phe

cag ccg

gag

gaa

gac

aaa

atg

gac

tat

gat

gat

atc

ttc

tca

act

gaa

4416

Gin Pro

Glu Glu 1460

Asp

Lys

Met

Asp Tyr 1465

Asp

Asp

íle

Phe

Ser 1470

Thr

Glu

acg aag

gga

gaa

gat

ttt

gac

att

tac

ggt

gag

gat

gaa

aat

cag

gac

4464

Thr Lys Gly Glu 1475

Asp

Phe

Asp íle 1480

Tyr

Gly

Glu

Asp

Glu 1485

Asn

Gin

Asp

101

cct cgc Pro Arg 1490

age Ser

ttt Phe

cag Gin

aag aga Lys Arg 1495

acc Thr

ega Arg

cac His

tat ttc Tyr Phe 1500

att íle

get Ala

gcg Ala

gtg Val

4512

gág cag

ctc

tgg

gat

tac ggg

atg

age

gaa

tcc ccc

cgg

gcg

cta

aga

4560

Glu Gin 1505

Leu

Trp

Asp

Tyr Gly 1510

Met

Ser

Glu

Ser Pro 1515

Arg

Ala

Leu

Arg 1520

aac agg

get

cag

aac

gga gag

gtg

cct

cgg

ttc aag

aag

gtg

gtc

ttc

4608

Asn Arg

Ala

Gin

Asn 1525

Gly Glu

Val

Pro

Arg 1530

Phe Lys

Lys

Val

Val 1535

Phe

cgg gaa

ttt

get

gac

ggc tcc

ttc

acg

cag

ccg tcg

tac

cgc

ggg

gaa

4656

Arg Glu

Phe

Al'a 1540

Asp

Gly Ser

Phe.

Thr 1545

Gin

Pro Ser

Tyr

Arg 1550

Gly

Glu

ctc aac

aaa

cac

ttg

ggg ctc

ttg

gga

ccc

tac atc

aga

gcg

gaa

gtt

4704

Leu Asn

Lys 1555

His

Leu

Gly Leu

Leu 1560

Gly

Pro

Tyr íle

Arg 1565

Ala

Glu

Val

gaa gac

aac

atc

atg

gta act

ttc

aaa

aac

cag gcg

tet

cgt

ccc

tat

4752

Glu Asp 1570

Asn

íle

Met

Val Thr 1575

Phe

Lys

Asn

Gin Ala 1580

Ser

Arg

Pro

Tyr

tcc ttc

tac

tcg

age

ctt att

tet

tat

ccg

gat gat

cag

gag

caa

ggg

4800

Ser Phe 1585

Tyr

Ser

Ser

Leu íle 1590

Ser

Tyr

Pro

Asp Asp 1595

Gin

Glu

Gin

Gly 1600

gca gaa

cct

ega

cac

aac ttc

gtc

cag

cca

aat gaa

acc

aga

act

tac

4848

Ala Glu

Pro

Arg

His 1605

Asn Phe

Val

Gin

Pro 1610

Asn Glu

Thr

Arg

Thr 1615

Tyr

ttt tgg

aaa

gtg

cag

cat cac

atg

gca

ccc

aca gaa

gac

gag

ttt

gac

4896

Phe Trp

Lys

Val 1620

Gin

His His

Met

Ala 1625

Pro

Thr Glu

Asp

.Glu 1630

Phe

Asp

tgc aaa

gcc

tgg

gcc

tac ttt

tet

gat

gtt

gac ctg

gaa

aaa

gat

gtg

4944

Cys Lys

Ala 1635

Trp

Ala

Tyr Phe

Ser 1640

Asp

Val

Asp Leu

Glu 1645

Lys

Asp

Val

cac tca

ggc

ttg

atc

ggc ccc

ctt

ctg

atc

tgc cgc

gcc

aac

acc

ctg

4992

His Ser 1650

Gly

Leu

íle

Gly Pro 1655

Leu

Leu

íle

Cys Arg 1660

Ala

Asn

Thr

Leu

aac get

get

cac

ggt

aga caa

gtg

acc

gtg

caa gaa

ttt

get

ctg

ttt

5040

Asn Ala 1665

Ala

His

Gly Arg Gin 1670

Val

Thr

Val

Gin Glu 1675

Phe

Ala

Leu

Phe 1680

ttc act

att

ttt

gat

gag aca

aag

age

tgg

tac ttc

act

gaa

aat

gtg

5088

Phe Thr

íle

Phe Asp 1685

Glu Thr

Lys

Ser Trp 1690

Tyr Phe

Thr

Glu

Asn 1695

Val

gaa agg

aac

tgc

cgg

gcc ccc

tgc

cac

ctg

cag atg

gag

gac

ccč

act

5136

Glu Arg

Asn Cys 1700

Arg

Ala Pro

Cys His 1705

Leu

Gin Met

Glu

Asp 1710

Pro

Thr

ctg aaa

gaa

aac

tat

cgc ttc

cat

gca

atc

aat ggc

tat

gtg

atg

gat

5184

Leu Lys Glu 1715

Asn

Tyr

Arg Phe His 1720

Ala

íle

Asn Gly Tyr 1725

Val

Met

Asp

aca ctc

cct

ggc

tta

gta atg

get

cag

aat

caa agg

atc

ega

tgg

tat

5232

Thr Leu 1730

Pro

Gly

Leu

Val Met 1735

Ala

Gin

Asn

Gin'Arg 1740

íle

Arg

Trp

Tyr

102

ctg ctc

agc

atg

ggc

agc

aat

gaa

aat

atc

cat

tcg

att

cat

ttt

agc

5280

Leu Leu 1745

Ser

Met

Gly

Ser 1750

Asn

Glu

Asn

íle

His 1755

Ser

íle

His

Phe

Ser 1760

gga cac

gtg

ttc

agt

gta

cgg

aaa

aag

gag

gag

tat

aaa

atg

gcc

gtg

5328

Gly His

Val

Phe

Ser 1765

Val

Arg

Lys

Lys

Glu 1770

Glu

Tyr

Lys

Met

Ala 1775

Val

tac aat

ctc

tat

ccg

ggt

gtc

ttt

gag

aca

gtg

gaa

atg

cta

ccg

tcc

5376

Tyr Asn

Leu

Tyr 1780

Pro

Gly

Val

Phe

Glu 1785

Thr

Val

Glu

Met

Leu 1790

Pro

Ser

aaa gtt

gga

att

tgg

ega

ata

gaa

tgc

ctg

att

ggc

gag

cac

ctg

caa

5424

Lys Val

Gly 1795

íle

Trp

Arg

íle

Glu 1800

Cys

Leu

íle

Gly

Glu 1805

His

Leu

Gin

get ggg

atg

agc

acg

act

ttc

ctg

gtg

tac

agc

aag

gag

tgt

cag

get

5472

Ala Gly 1810

Met

Ser

Thr

Thr

Phe 1815

Leu

Val

Tyr

Ser

Lys 1820

Glu

Cys

Glň

Ala

cca ctg

gga

atg

get

tet

gga

ege

att

aga

gat

ttt

cag

atc

aca

get

5520

Pro Leu 1825

Gly

Met

Ala

Ser 1830

Gly Arg

íle

Arg

Asp 1835

Phe

Gin

íle

Thr

Ala 1840

tca gga

cag

tat

gga

cag

tgg

gcc

cca

aag

ctg

gcc

aga

ctt

cat

tat

5568

Ser Gly

Gin

Tyr

Gly 1845

Gin

Trp

Ala

Pro

Lys 1850

Leu

Ala

Arg

Leu

His 1855

Tyr

tcc gga

tca

atc

aat

gcc

tgg

agc

acc

aag

gat

ccc

cac

tcc

tgg

atc

5616

Ser Gly

Ser

íle 1860

Asn

Ala

Trp

Ser

Thr 1865

Lys

Asp

Pro

His

Ser 1870

Trp

íle

aag gtg

gat

ctg

ttg

gca

cca

atg

atc

att

cac

ggc

atc

atg

acc

cag

5664

Lys Val

Asp 1875

Leu

Leu

Ala

Pro

Met 1880

íle

íle

His

Gly

íle 1885

Met

Thr

Gin

ggt gcc

cgt

cag

aag

ttt

tcc

agc

ctc

tac

atc

tcc

cag

ttt

atc

atc

5712

Gly Ala 1890

Arg

Gin

Lys

Phe Ser 1895

Ser

Leu

Tyr

íle

Ser 1900

Gin

Phe

íle

íle

atg tac

agt

ctt

gac

ggg

agg

aac

tgg

cag

agt

tac

ega

ggg

aat

tcc

5760

Met Tyr 1905

Ser

Leu

Asp Gly 1910

Arg

Asn

Trp

Gin

Ser L915

Tyr

Arg

Gly

Asn

Ser 1920

acg ggc

acc

tta

atg

gtc

ttc

ttt

ggc

aat

gtg

gac

gca

tet

ggg

att

5808

Thr Gly

Thr

Leu Met 1925

Val

Phe

Phe

Gly Asn 1930

Val

Asp

Ala

Ser

Gly 1935

íle

aaa cac

aat

att

ttt

aac

cct

ccg

att

gtg

get

cgg

tac

atc

cgt

ttg

5856

Lys His

Asn íle 1940

Phe

Asn

Pro

Pro íle 1945

Val

Ala

Arg

Tyr

íle L950

Arg

Leu

cac cca

aca

cat

tac

agc

atc

ege

agc

act

ctt

ege

atg

gag

ttg

atg

5904

His Pro Thr 1955

His

Tyr

Ser

íle Arg 1960

Ser

Thr

Leu

Arg Met 1965

Glu

Leu

Met

ggc tgt

gat

tta

aac

agt

tgc

agc

atg

ccc

ctg

gga

atg

cag

aat

aaa

5952

Gly Cys 1970

Asp

Leu

Asn

Ser Cys 1975

Ser

Met

Pro

Leu Gly 1980

Met

Gin

Asn

Lys

gcg ata

tca

gac

tca

cag

atc

acg

gcc

tcc

tcc

cac

cta

agc

aat

ata

6000

Ala íle

Ser

Asp

Ser

Gin

íle

Thr

Ala

Ser

Ser

His

Leu

Ser

Asn

íle

103

1985	1990	1995	2000
ttt gcc acc	tgg tet cct tca caa gcc	ega ctt cac ctc cag	ggg cgg 6048
Phe Ala Thr	Trp Ser Pro Ser Gin Ala	Arg Leu His Leu Gin	Gly Arg
	2005 :	2010 2015
acg aat gcc	tgg ega ccc cgg gtg age	age gca gag gag tgg	ctg cag 6096
Thr Asn Ala	Trp Arg Pro Arg Val Ser	Ser Ala Glu Glu Trp	Leu Gin
2020 2025	2030
gtg gac ctg	cag aag acg gtg aag gtc	aca ggc atc acc acc	cag ggc 6144
Val Asp Leu	Gin Lys Thr Val Lys Val	Thr Gly íle Thr Thr	Gin Gly
2035	2040	2045
gtg aag tcc	ctg ctc age age atg tat	gtg aag gag ttc ctc	gtg tcc 6192
Val Lys Ser	Leu Leu Ser Ser Met Tyr	Val Lys Glu Phe Leu	Val Ser
2050	2055	2060
agt agt cag	gac ggc cgc cgc tgg acc	ctg ttt ctt cag gac	ggc cac 6240
Ser Ser Gin	Asp Gly Arg Arg Trp Thr	Leu Phe Leu Gin Asp	Gly His
2065	2070	2075	2080
acg aag gtt	ttt cag ggc aat cag gac	tcc tcc acc ccc gtg	gtg aac 6288
Thr Lys Val	Phe Gin Gly Asn Gin Asp	Ser Ser Thr Pro Val	Val Asn
	2085 ;	2090 ;	2095
get ctg gac	ccc ccg ctg ttc acg cgc	tac ctg agg atc cac	ccc acg 6336
Ala Leu Asp	Pro Pro Leu Phe Thr Arg	Tyr Leu Arg íle His	Pro Thr
2100 2105	2110
age tgg gcg	cag cac atc gcc ctg agg	ctc gag gtt cta gga	tgt gag 6384
Ser Trp Ala	Gin His íle Ala Leu Arg	Leu Glu Val Leu Gly	Cys Glu
2115	2120	2125
gca cag gat	ctc tac tga		6402
Ala Gin Asp	Leu Tyr

2130 <210> 30 <211> 2133 <212> PRT <213> Prasa <400> 30

Met 1

Gin Leu

Glu Leu Ser 5

Thr

Cys

Val

Phe 10

Leu

Cys

Leu

Leu

Pro 15

Leu

Gly

Phe

Ser

Ala

íle

Arg

Arg

Tyr

Tyr

Leu

Gly

Ala

Val

Glu

Leu

Ser

20

25

30

Trp

Asp

Tyr

Arg

Gin

Ser

Glu

Leu

Leu

Arg

Glu

Leu

His

Val

Asp

Thr

35

40

45

Arg

Phe

Pro

Ala

Thr

Ala

Pro

Gly

Ala

Leu

Pro

Leu

Gly

Pro

Ser

Val

50

55

60

Leu

Tyr

Lys

Lys

Thr

Val

Phe

Val

Glu

Phe

Thr

Asp

Gin

Leu

Phe

Ser

65

70

75

80

Val

Ala

Arg

Pro

Arg

Pro

Pro

Trp

Met

Gly

Leu

Leu

Gly

Pro

Thr

íle

85

90

95

104

Gin Ala Glu Val 100

Tyr

Asp Thr Val Val Val Thr Leu Lys Asn Met Ala

105

110

Ser

His

Pro

Val

Ser

Leu

His

Ala

Val

Gly

Val

Ser

Phe

Trp

Lys

Ser

115

120

125

Ser

Glu

Gly

Ala

Glu

Tyr

Glu

Asp

His

Thr

Ser

Gin

Arg

Glu

Lys

Glu

130

135

140

Asp

Asp

Lys

Val

Leu

Pro

Gly

Lys

Ser

Gin

Thr

Tyr

Val

Trp

Gin

Val

145

150

155

160

Leu

Lys

Glu

Asn

Gly

Pro

Thr

Ala

Ser

Asp

Pro

Pro

Cys

Leu

Thr

Tyr

165

170

175

Ser

Tyr

Leu

Ser

His

Val

Asp

Leu

Val

Lys

Asp

Leu

Asn

Ser

Gly

Leu

180

185

190

íle

Gly

Ala

Leu

Leu

Val

Cys

Arg

Glu

Gly

Ser

Leu

Thr

Arg

Glu

Arg

195

200

205

Thr

Gin

Asn

Leu

His

Glu

Phe

Val

Leu

Leu

Phe

Ala

Val

Phe

Asp

Glu

210

215

220

Gly

Lys

Ser

Trp

His

Ser

Ala

Arg

Asn

Asp

Ser

Trp

Thr

Arg

Ala

Met

225

230

235

240

Asp

Pro

Ala

Pro

Ala

Arg

Ala

Gin

Pro

Ala

Met

His

Thr

Val

Asn

Gly

245

250

255

Tyr

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

Pro

Gly

Leu

íle

Gly

Cys

His

Lys

Lys

Ser

260

265

270

Val

Tyr

Trp

His

Val

íle

Gly

Met

Gly

Thr

Ser

Pro

Glu

Val

His

Ser

275

280

285

íle

Phe

Leu

Glu

Gly

His

Thr

Phe

Leu

Val

Arg

His

His

Arg

Gin

Ala

290

295

300

Ser

Leu

Glu

íle

Ser

Pro

Leu

Thr

Phe

Leu

Thr

Ala

Gin

Thr

Phe

Leu

305

310

315

320

Met

Asp

Leu

Gly

Gin

Phe

Leu

Leu

Phe

Cys

His

íle

Ser

Ser

His

His

325

330

335

His

Gly

Gly

Met

Glu

Ala

His

Val

Arg

Val

Glu

Ser

Cys

Ala

Glu

Glu

340

345

350

Pro

Gin

Leu

Arg

Arg

Lys

Ala

Asp

Glu

Glu

Glu

Asp

Tyr

Asp

Asp

Asn

355

360

365

Leu

Tyr

Asp

Ser

Asp

Met

Asp

Val

Val

Arg

Leu

Asp

Gly

Asp

Asp

Val

370

375

380

Ser

Pro

Phe

íle

Gin

íle

Arg

Ser

Val

Ala

Lys

Lys

His

Pro

Lys

Thr

385

390

395

400

Trp

Val

His

Tyr

íle

Ser

Ala

Glu

Glu

Glu

Asp

Trp

Asp

Tyr

Ala

Pro

405

410

415

Ala

Val

Pro

Ser

Pro

Ser

Asp

Arg

Ser

Tyr

Lys

Ser

Leu

Tyr

Leu

Asn

420 425 430

105

Ser Gly Pro

Gin Arg

íle Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Ala Arg Phe Val

435

440

445

Ala

Tyr

Thr

Asp

Val

Thr

Phe

Lys

Thr

Arg

Lys

Ala

íle

Pro

Tyr

Glu

450

455

4 60

Ser

Gly

íle

Leu

Gly

Pro

Leu

Leu

Tyr

Gly

Glu

Val

Gly

Asp

Thr

Leu

465

470

475

480

Leu

íle

íle

Phe

Lys

Asn

Lys

Ala

Ser

Arg

Pro

Tyr

Asn

íle

Tyr

Pro

485

490

495

His

Gly

íle

Thr

Asp

Val

Ser

Ala

Leu

His

Pro

Gly

Arg

Leu

Leu

Lys

500

505

510

Gly

Trp

Lys

His

Leu

Lys

Asp

Met

Pro

íle

Leu

Pro

Gly

Glu

Thr

Phe

515

520

525

Lys

Tyr

Lys

Trp

Thr

Val

Thr

Val

Glu

Asp

Gly

Pro

Thr

Lys

Ser

Asp

530

535

540

Pro

Arg

Cys

Leu

Thr

Arg

Tyr

Tyr

Ser

Ser

Ser

íle

Asn

Leu

Glu

Lys

545

550

555

560

Asp

Leu

Ala

Ser

Gly

Leu

íle

Gly

Pro

Leu

Leu

íle

Cys

Tyr

Lys

Glu

565

570

575

Ser

Val

Asp

Gin

Arg

Gly

Asn

Gin

Met

Met

Ser

Asp

Lys

Arg

Asn

Val

580

585

590

íle

Leu

Phe

Ser

Val

Phe

Asp

Glu

Asn

Gin

Ser

Trp

Tyr

Leu

Ala

Glu

595

600

605

Asn

íle

Gin

Arg

Phe

Leu

Pro

Asn

Pro

Asp

Gly

Leu

Gin

Pro

Gin

Asp

610

615

620

Pro

Glu

Phe

Gin

Ala

Ser

Asn

íle

Met

His

Ser

íle

Asn

Gly

Tyr

Val

625

630

635

640

Phe

Asp

Ser

Leu

Gin

Leu

Ser

Val

Cys

Leu

His

Glu

Val

Ala

Tyr

Trp

645

650

655

Tyr

íle

Leu

Ser

Val

Gly

Ala

Gin

Thr

Asp

Phe

Leu

Ser

Val

Phe

Phe

660

665

670

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Lys

His

Lys

Met

Val

Tyr

Glu

Asp

Thr

Leu

Thr

675

680

685

Leu

Phe

Pro

Phe

Ser

Gly

Glu

Thr

Val

Phe

Met

Ser

Met

Glu

Asn

Pro

690

695'

700

Gly

Leu

Trp

Val

Leu

Gly

Cys

His

Asn

Ser

Asp

Leu

Arg

Asn

Arg

Gly

705

710

715

720

Met

Thr

Ala

Leu

Leu

Lys

Val

Tyr

Ser

Cys

Asp

Arg

Asp

íle

Gly

Asp

725

730

735

Tyr

Tyr

Asp

Asn

Thr

Tyr

Glu

Asp

íle

Pro

Gly

Phe

Leu

Leu

Ser

Gly

740

745

750

Lys Asn Val íle Glu Pro Arg Ser Phe Ala Gin Asn Ser Arg Pró Pro 755 760 765

106

Ser Ala	Ser	Gin Lys Gin Phe Gin Thr 775	íle	Thr Ser 780	Pro	Glu	Asp	Asp
	770
Val 785	Glu	Leu	Asp Pro Gin Ser Gly Glu 790	Arg	Thr Gin 795	Ala	Leu	Glu	Glu 800
Leu	Ser	Val	Pro Ser Gly Asp Gly Ser 805	Met 810	Leu Leu	Gly	Gin	Asn 815	Pro
Ala	Pro	His	Gly Ser Ser Ser Ser Asp 820 825	Leu	Gin Glu	Ala	Arg 830	Asn	Glu
Ala	Asp	Asp 835	Tyr Leu Pro Gly Ala Arg 840	Glu	Arg Gly	Thr 845	Ala	Pro	Ser
Ala	Ala 850	Ala	Arg Leu Arg Pro Glu Leu 855	His	His Ser 860	Ala	Glu	Arg	Val
Leu 865	Thr	Pro	Glu Pro Glu Lys Glu Leu 870	Lys	Lys Leu 875	Asp	Ser	Lys	Met 880
Ser	Ser	Ser	Ser Asp Leu Leu Lys Thr 885	Ser 890	Pro Thr	íle	Pro	Ser 895	Asp
Thr	Leu	Ser	Ala Glu Thr Glu Arg Thr 900 905	His	Ser Leu	Gly	Pro 910	Pro	His
Pro	Gin	Val 915	Asn Phe Arg Ser Gin Leu 920	Gly	Ala íle	Val 925	Leu	Gly	Lys
Asn	Ser 930	Ser	His Phe íle Gly Ala Gly 935	Val	Pro Leu 940	Gly	Ser	Thr	Glu
Glu 945	Asp	His	Glu Ser Ser Leu Gly Glu 950	Asn	Val Ser 955	Pro	Val	Glu	Ser 960
Asp	Gly	íle	Phe Glu Lys Glu Arg Ala 965	His 970	Gly Pro	Ala	Ser	Leu 975	Thr
Lys	Asp	Asp	Val Leu Phe Lys Val Asn 980 985	íle	Ser Leu	Val	Lys 990	Thr	Asn
Lys	Ala	Arg 995	Val Tyr Leu Lys Thr Asn 1000	Arg	Lys íle His 1005	íle	Asp	Asp
Ala Ala 1010	Leu	Leu Thr Glu Asn Arg Ala 1015	Ser	Ala Thr 1020	Phe	Met	Asp	Lys
Asn 1025	Thr	Thr	Ala Ser Gly Leu Asn His 1030	Val Ser Asn 1035	Trp	íle	Lys	Gly 104 0
Pro	Leu	Gly	Lys Asn Pro Leu Ser Ser Glu 1045 1050	Arg Gly	Pro	Ser	Pro 1055	Glu
Leu	Leu	Thr Ser Ser Gly Ser Gly Lys 1060 1065	Ser	Val Lys	Gly Gin 1070	Ser	Ser
Gly	Gin	Gly Arg íle Arg Val Ala Val	Glu	Glu Glu	Glu	Leu	Ser	Lys

1075 1080 1085

Gly Lys Glu Met Met Leu Pro Asn Ser Glu Leu Thr Phe Leu Thr Asn 1090 1095 1100

107

Ser Ala Asp 1105	Val Gin Gly Asn Asp Thr His Ser Gin Gly Lys Lys Ser
1110	1115	1120
Arg Glu Glu	Met Glu Arg Arg	Glu Lys Leu Val Gin Glu Lys	Val Asp
	1125	1130 1135
Leu Pro Gin	Val Tyr Thr Ala	Thr Gly Thr Lys Asn Phe Leu	Arg Asn
1140	1145 1150
íle Phe His	Gin' Ser Thr Glu	Pro Ser Val Glu Gly Phe Asp	Gly Gly
1155	1160 1165
Ser His Ala	Pro Val Pro Gin	Asp Ser Arg Ser Leu Asn Asp	Ser Ala
1170	1175	1180
Glu Arg Ala	Glu Thr His íle	Ala His Phe Ser Ala íle Arg	Glu Glu
1185	1190	1195	1200
Ala Pro Leu	Glu Ala Pro Gly	Asn Arg Thr Gly Pro Gly Pro	Arg Ser
	1205	1210	1215
Ala Val Pro	Arg Arg Val Lys	Gin Ser Leu Lys Gin íle Arg	Leu Pro
1220	1225 1230
Leu Glu Glu	íle Lys Pro Glu	Arg Gly Val Val Leu Asn Ala	Thr Ser
1235	1240 1245
Thr Arg Trp	Ser Glu Ser Ser	Pro íle Leu Gin Gly Ala Lys	Arg Asn
1250	1255	1260
Asn Leu Ser	Leu Pro Phe Leu	Thr Leu Glu Met Ala Gly Gly	Gin Gly
1265	1270	1275	1280
Lys íle Ser	Ala Leu Gly Lys	Ser Ala Ala Gly Pro Leu Ala	Ser Gly
	1285	1290	1295
Lys Leu Glu	Lys Ala Val Leu	Ser Ser Ala Gly Leu Ser Glu	Ala Ser
1300	1305 1310
Gly Lys Ala	Glu Phe Leu Pro	Lys Val Arg Val His Arg Glu	Asp Leu
1315	1320 1325
Leu Pro Gin	Lys Thr Ser Asn	Val Ser Cys Ala His Gly Asp	Leu Gly
1330	1335	1340
Gin Glu íle	Phe Leu Gin Lys	Thr Arg Gly Pro Val Asn Leu	Asn Lys
1345	1350	1355	1360
Val Asn Arg	Pro Gly Arg Thr	Pro Ser Lys Leu Leu Gly Pro	Pro Met
	1365	1370	1375
Pro Lys Glu	Trp Glu Ser Leu	Glu Lys Ser Pro Lys Ser Thr	Ala Leu
1380	1385 1390
Arg Thr Lys	Asp íle íle Ser	Leu Pro Leu Asp Arg His Glu	Ser Asn
1395	1400 1405
His Ser íle	Ala Ala Lys Asn	Glu Gly Gin Ala Glu Thr Gin	Arg Glu
1410	1415	1420
Ala Ala Trp	Thr Lys Gin Gly Gly Pro Gly Arg Leu Cys Ala	Pro Lys

1425 1430 1435 1440

108

Pro Pro	Val	Leu Arg Arg His Gin Arg Asp íle Ser Leu Pro Thr	Phe
1445	1450	1455
Gin Pro	Glu	Glu Asp Lys Met Asp	Tyr Asp Asp	íle Phe Ser Thr	Glu
	1460	1465	1470
Thr Lys	Gly	Glu Asp Phe Asp íle	Tyr Gly Glu	Asp Glu Asn Gin	Asp
1475	1430		1485
Pro Arg	Ser	Phe Gin Lys Arg Thr	Arg His Tyr	Phe íle Ala Ala	Val
1490		1495	1500
Glu Gin	Leu	Trp Asp Tyr Gly Met	Ser Glu Ser	Pro Arg Ala Leu	Arg
1505		1510	1515	1520
Asn Arg	Ala	Gin Asn Gly Glu Val	Pro Arg Phe	Lys Lys Val Val	Phe
		1525	1530	1535
Arg Glu	Phe	Ala Asp Gly Ser Phe	Thr Gin Pro	Ser Tyr Arg Gly	Glu
	1540	1545	1550
Leu Asn	Lys	His Leu Gly Leu Leu	Gly Pro Tyr	íle Arg Ala Glu	Val
1555	1560		1565
Glu Asp	Asn	íle Met Val Thr Phe	Lys Asn Gin	Ala Ser Arg Pro	Tyr
1570		1575	1580
Ser Phe	Tyr	Ser Ser Leu íle Ser	Tyr Pro Asp	Asp Gin Glu Gin	Gly
1585		1590	1595	1600
Ala Glu	Pro	Arg His Asn Phe Val	Gin Pro Asn	Glu Thr Arg Thr	Tyr
		1605	1610	1615
Phe Trp	Lys	Val Gin His His Met	Ala Pro Thr	Glu Asp Glu Phe	Asp
	1620	1625	1630
Cys Lys	Ala	Trp Ala Tyr Phe Ser	Asp Val Asp	Leu Glu Lys Asp	Val
1635	1640		1645
His Ser	Gly	Leu íle Gly Pro Leu	Leu íle Cys	Arg Ala Asn Thr	Leu
1650		1655	1660
Asn Ala	Ala	His Gly Arg Gin Val	Thr Val Gin	Glu Phe Ala Leu	Phe
1665		1670	1675	1680
Phe Thr	íle	Phe Asp Glu Thr Lys	Ser Trp Tyr	Phe Thr Glu Asn	Val
		1685	1690	1695
Glu Arg	Asn	Cys Arg Ala Pro Cys	His Leu Gin	Met Glu Asp Pro	Thr
	1700 :	L705	1710
Leu Lys	Glu	Asn Tyr Arg Phe His	Ala íle Asn	Gly Tyr Val Met	Asp
1715	1720		1725
Thr Leu	Pro	Gly Leu Val Met Ala	Gin Asn Gin	Arg íle Arg Trp	Tyr
1730		1735	1740
Leu Leu	Ser	Met Gly Ser Asn Glu	Asn íle His	Ser íle His Phe	Ser

1745 1750 1755 1760

Gly His Val Phe Ser Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Val 1765 1770 1775

109

Tyr Asn Leu Tyr 1780	Pro Gly	Val	Phe	Glu 1785	Thr	Val	Glu Met	Leu 1790	Pro Ser
Lys Val Gly íle 1795	Trp Arg	íle	Glu 1800	Cys	Leu	íle	Gly Glu 1805	His	Leu Gin
Ala Gly Met Ser 1810	Thr Thr	Phe 1815	Leu	Val	Tyr	Ser	Lys Glu 1820	Cys	Gin Ala
Pro Leu Gly Met 1825	Ala Ser 1830	Gly	Arg	íle	Arg	Asp 1835	Phe Gin	íle	Thr Ala 1840
Ser Gly Gin Tyr	Gly Gin 1845	Trp	Ala	Pro	Lys 1850	Leu	Ala Arg	Leu	His Tyr 1855
Ser Gly Ser íle 1860	Asn Ala	Trp	Ser	Thr 1865	Lys	Asp	Pro His	Ser 1870	Trp íle
Lys Val Asp Leu 1875	Leu Ala	Pro	Met 1880	íle	íle	His	Gly íle 1885	Met	Thr Gin
Gly Ala Arg Gin 1890	Lys Phe	Ser 1895	Ser	Leu	Tyr	íle	Ser Gin 1900	Phe	íle íle
Met Tyr Ser Leu 1905	Asp Gly 1910	Arg	Asn	Trp	Gin	Ser 1915	Tyr Arg	Gly	Asn Ser 1920
Thr Gly Thr Leu	Met Val 1925	Phe	Phe	Gly	Asn 1930	Val	Asp Ala	Ser	Gly íle 1935
Lys His Asn íle 1940	Phe Asn	Pro	Pro	íle 1945	Val	Ala	Arg Tyr	íle 1950	Arg Leu
His Pro Thr His 1955	Tyr Ser	íle	Arg 1960	Ser	Thr	Leu	Arg Met 1965	Glu	Leu Met
Gly Cys Asp Leu 1970	Asn Ser	Cys 1975	Ser	Met	Pro	Leu	Gly Met 1980	Gin	Asn Lys
Ala íle Ser Asp 1985	Ser. Gin 1990	íle	Thr	Ala	Ser	Ser 1995	His Leu	Ser	Asn íle '2000
Phe Ala Thr Trp Ser Pro 2005	Ser	Gin	Ala	Arg 2010	Leu	His Leu	Gin	Gly Arg 2015
Thr Asn Ala Trp 2020	Arg Pro	Arg	Val	Ser 2025	Ser	Ala	Glu Glu	Trp 2030	Leu Gin
Val Asp Leu Gin 2035	Lys Thr	Val	Lys 2040	Val	Thr	Gly	íle Thr 2045	Thr	Gin Gly
Val Lys Ser Leu 2050	Leu Ser	Ser 2055	Met	Tyr	Val	Lys	Glu Phe 2060	Leu	Val Ser
Ser Ser Gin Asp 2065	Gly Arg 2070	Arg	Trp	Thr	Leu	Phe 2075	Leu Gin	Asp	Gly His 2080
Thr Lys Val Phe	Gin Gly	Asn	Gin	Asp	Ser	Ser	Thr Pro	Val	Val Asn

2085 2090 2095

Ala Leu Asp Pro Pro Leu Phe Thr Arg Tyr Leu Arg íle His Pro Thr 2100 2105 2110

110

Ser Trp Ala Gin His íle Ala Leu Arg Leu Glu Val Leu Gly Cys Glu 2115 2120 2125

Ala,Gin Asp Leu Tyr 2130 <210> 31 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31

Met Gin íle Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe 15 10 15

Cys Phe Ser <210> 32 <211> 24 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: linker <400> 32

Ser Phe Ala Gin Asn Ser Arg Pro Pro Ser Ala Ser Ala Pro Lys Pro 1 5 10 15

Pro Val Leu Arg Arg His Gin Arg 20 <210> 33 <211> 105 <212> DNA <213>- Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: linker <400> 33 gtcattgaac ctaggagctt tgcccagaat tcaagacccc ctagtgcgag cgctccaaag 60 cctccggtcc tgcgacggca tcagagggac ataagccttc ctact 105 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primér <400> 34 gaggaaaacc agatgatgtc a

111 <210> 35 <211> 60 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primár <400> 35 ctttggagcg ctcgcactag ggggtcttga attctgggca aagctcctag gttcaatgac 60 <210> 36 <211> 66 <2l2> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukleotidový primár <400> 36 cctagtgcga gcgctccaaa gcctccggtc ctgcgacggc atcagaggga cataagcctt 60 cctact 66 <210> 37 <211> 4404 <212> DNA <213> Prasa <220>

<221> CDS <222> (1, .. (4401) <400> 37

atg cag Met Gin 1

cta Leu

gag ctc tcc

acc Thr

tgt Cys

gtc Val

ttt Phe 10

ctg Leu

tgt Cys

ctc ttg cca ctc

48

Glu

Leu 5

Ser

Leu

Leu

Pro 15

Leu

ggc

ttt

agt

gcc

atc

agg

aga

tac

tac

ctg

ggc

gca

gtg

gaa

ctg

tcc

96

Gly

Phe

Ser

Ala

íle

Arg

Arg

Tyr

Tyr

Leu

Gly

Ala

Val

Glu

Leu

Ser

20

25

30

tgg

gac

tac

cgg

caa

agt

gaa

ctc

ctc

cgt

gag

ctg

cac

gtg

gac

acc

144

Trp

Asp

Tyr

Arg

Gin

Ser

Glu

Leu

Leu

Arg

Glu

Leu

His

Val

Asp

Thr

35

40

45

aga

ttt

cct

get

aca

gcg

cca

gga

get

ctt

ccg

ttg

ggc

ccg

tca

gtc

192

Arg

Phe

Pro

Ala

Thr

Ala

Pro

Gly

Ala

Leu

Pro

Leu

Gly

Pro

Ser

Val

50

55

60

ctg

tac

aaa

aag

act

gtg

ttc

gta

gag

ttc

acg

gat

caa

ctt

ttc

age

240

Leu

Tyr

Lys

Lys

Thr

Val

Phe

Val

Glu

Phe

Thr

Asp

Gin

Leu

Phe

Ser

65

70

75

80

gtt

gcc

agg

ccc

agg

cca

cca

tgg

atg

ggt

ctg

ctg

ggt

cct

acc

atc

288

Val

Ala

Arg

Pro

Arg

Pro

Pro

Trp

Met

Gly

Leu

Leu

Gly

Pro

Thr

íle

90 95 cag get gag gtt tac gac acg gtg gtc gtt acc ctg aag aac atg get 336

112

Gin Ala Glu Val 100

Tyr Asp Thr Val

Val Val 105

Thr

Leu

Lys

Asn 110

Met

Ala

tct

cat

ccc

gtt

agt

ctt

cac

get

gtc

ggc

gtc

tcc

ttc

tgg

aaa

tct

384

Ser

His

Pro

Val

Ser

Leu

His

Ala

Val

Gly

Val

Ser

Phe

Trp

Lys

Ser

115

120

125

tcc

gaa

ggc

get

gaa

tat

gag

gat

cac

acc

age

caa

agg

gag

aag

gaa

432

Ser

Glu

Gly

Ala

Glu

Tyr

Glu

Asp

His

Thr

Ser

Gin

Arg

Glu

Lys

Glu

130

135

140

gac

gat

aaa

gtc

ctt

ccc

ggt

aaa

age

caa

acc

tac

gtc

tgg

cag

gtc

480

Asp

Asp

Lys

Val

Leu

Pro

Gly

Lys

Ser

Gin

Thr

Tyr

Val

Trp

Gin

Val

145

150

155

160

ctg

aaa

gaa

aat

ggt

cca

aca

gcc

tct

gac

cca

cca

tgt

ctt

acc

tac

528

Leu

Lys

Glu

Asn

Gly

Pro

Thr

Ala

Ser

Asp

Pro

Pro

Cys

Leu

Thr

Tyr

165

170

175

tca

tac

ctg

tct

cac

gtg

gac

ctg

gtg

aaa

gac

ctg

aat

tcg

ggc

ctc

576

Ser

Tyr

Leu

Ser

His

Val

Asp

Leu

Val

Lys

Asp

Leu

Asn

Ser

Gly

Leu

180

185

190

att

gga

gcc

ctg

ctg

gtt

tgt

aga

gaa

ggg

agt

ctg

acc

aga

gaa

agg

624

íle

Gly

Ala

Leu

Leu

Val

Cys

Arg

Glu

Gly

Ser

Leu

Thr

Arg

Glu

Arg

195

200

205

acc

cag

aac

ctg

cac

gaa

ttt

gta

cta

ctt

ttt

get

gtc

ttt

gat

gaa

672

Thr

Gin

Asn

Leu

His

Glu

Phe

Val

Leu

Leu

Phe

Ala

Val

Phe

Asp

Glu

210

215

220

ggg

aaa

agt

tgg

cac

tca

gca

aga

aat

gac

tcc

tgg

aca

cgg

gcc

atg

720

Gly

Lys

Ser

Trp

His

Ser

Ala

Arg

Asn

Asp

Ser

Trp

Thr

Arg

Ala

Met

225

230

235

240

gat

ccc

gca

cct

gcc

agg

gcc

cag

cct

gca

atg

cac

aca

gtc

aat

ggc

768

Asp

Pro

Ala

Pro

Ala

Arg

Ala

Gin

Pro

Ala

Met

His

Thr

Val

Asn

Gly

245

250

255

tat

gtc

aac

agg

tct

ctg

cca

ggt

ctg

atc

gga

tgt

cat

aag

aaa

tca

816

Tyr

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

Pro

Gly

Leu

íle

Gly

Cys

His

Lys

Lys

Ser

260

265

270

gtc

tac

tgg

cac

gtg

att

gga

atg

ggc

acc

age

ccg

gaa

gtg

cac

tcc

864

Val

Tyr

Trp

His

Val

íle

Gly

Met

Gly

Thr

Ser

Pro

Glu

Val

His

Ser

275

280

285

att

ttt

ctt

gaa

ggc

cac

acg

ttt

ctc

gtg

agg

cac

cat

ege

cag

get

912

íle

Phe

Leu

Glu

Gly

His

Thr

Phe

Leu

Val

Arg

His

His

Arg

Gin

Ala

290

295

300

tcc

ttg

gag

atc

tcg

cca

cta

act

ttc

ctc

act

get

cag

aca

ttc

ctg

960

Ser

Leu

Glu

íle

Ser

Pro

Leu

Thr

Phe

Leu

Thr

Ala

Gin

Thr

Phe

Leu

305

310

315

320

atg

gac

ctt

ggc

cag

ttc

cta

ctg

ttt

tgt

cat

atc

tct

tcc

cac

cac

1008

Met

Asp

Leu

Gly

Gin

Phe

Leu

Leu

Phe

Cys

His

íle

Ser

Ser

His

His

325

330

335

cat

ggt

ggc

atg

gag

get

cac

gtc

aga

gta

gaa

age

tgc

gcc

gag

gag

1056

His

Gly

Gly

Met

Glu

Ala

His

Val

Arg

Val

Glu

Ser

Cys

Ala

Glu

Glu

340

345

350

113

ccc cag ctg cgg Pro Gin Leu Arg

agg Arg

aaa Lys

get Ala

gat gaa gag gaa gat

tat Tyr 365

gat Asp

gac Asp

aat Asn

1104

Asp 360

Glu

Glu

Glu

Asp

355

ttg

tac

gac

tcg

gac

atg

gac

gtg

gtc

cgg

ctc

gat

ggt

gac

gac

gtg

1152

Leu

Tyr

Asp

Ser

Asp

Met

Asp

Val

Val

Arg

Leu

Asp

Gly

Asp

Asp

Val

370

375

380

tct

ccc

ttt

atc

caa

atc

ege

tcg

gtt

gcc

aag

aag

cat

ccc

aaa

acc

1200

Ser

Pro

Phe

íle

Gin

íle

Arg

Ser

Val

Ala

Lys

Lys

His

Pro

Lys

Thr

385

390

395

400

tgg

gtg

cac

tac

atc

tct

gca

gag

gag

gag

gac

tgg

gac

tac

gcc

ccc

1248

Trp

Val

His

Tyr

íle

Ser

Ala

Glu

Glu

Glu

Asp

Trp

Asp

Tyr

Ala

Pro

405

410

415

gcg

gtc

ccc

age

ccc

agt

gac

aga

agt

tat

aaa

agt

ctc

tac

ttg

aac

1296

Ala

Val

Pro

Ser

Pro

Ser

Asp

Arg

Ser

Tyr

Lys

Ser

Leu

Tyr

Leu

Asn

420

425

430

agt

ggt

cct

cag

ega

att

ggt

agg

aaa

tac

aaa

aaa

get

ega

ttc

gtc

1344

Ser

Gly

Pro

Gin

Arg

íle

Gly

Arg

Lys

Tyr

Lys

Lys

Ala

Arg

Phe

Val

435

440

445

get

tac

acg

gat

gta

aca

ttt

aag

act

cgt

aaa

get

att

ccg

tat

gaa

1392

Ala

Tyr

Thr

Asp

Val

Thr

Phe

Lys

Thr

Arg

Lys

Ala

íle

Pro

Tyr

Glu

450

455

460

tca

gga

atc

ctg

gga

cct

tta

ctt

tat

gga

gaa

gtt

gga

gac

aca

ctt

1440

Ser

Gly

íle

Leu

Gly

Pro

Leu

Leu

Tyr

Gly

Glu

Val

Gly

Asp

Thr

Leu

465

470

475

480

ttg

att

ata

ttt

aag

aat

aaa

gcg

age

ega

cca

tat

aac

atc

tac

cct

1488

Leu

íle

íle

Phe

Lys

Asn

Lys

Ala

Ser

Arg

Pro

Tyr

Asn

íle

Tyr

Pro

485

490

495

cat

gga

atc

act

gat

gtc

age

get

ttg

cac

cca

ggg

aga

ctt

cta

aaa

1536

His

Gly

íle

Thr

Asp

Val

Ser

Ala

Leu

His

Pro

Gly

Arg

Leu

Leu

Lys

500

505

510

ggt

tgg

aaa

cat

ttg

aaa

gac

atg

cca

att

ctg

cca

gga

gag

act

ttc

1584

Gly

Trp

Lys

His

Leu

Lys

Asp

Met

Pro

íle

Leu

Pro

Gly

Glu

Thr

Phe

515

520

525

aag

tat

aaa

tgg

aca

gtg

act

gtg

gaa

gat

ggg

cca

acc

aag

tcc

gat

1632

Lys

Tyr

Lys

Trp

Thr

Val

Thr

Val

Glu

Asp

Gly

Pro

Thr

Lys

Ser

Asp

530

535

540

cct

cgg

tgc

ctg

acc

ege

tac

tac

tcg

age

tcc

att

aat

cta

gag

aaa

1680

Pro

Arg

Cys

Leu

Thr

Arg

Tyr

Tyr

Ser

Ser

Ser

íle

Asn

Leu

Glu

Lys

545

550

555

560

gat

ctg

get

tcg

gga

ctc

att

ggc

cct

ctc

ctc

atc

tgc

tac

aaa

gaa

1728

Asp

Leu

Ala

Ser

Gly

Leu

íle

Gly

Pro

Leu

Leu

íle

Cys

Tyr

Lys

Glu

565

570

575

tct

gta

gac

caa

aga

gga

aac

cag

atg

atg

tca

gac

aag

aga

aac

z gtc

1776

Ser

Val

Asp

Gin

Arg

Gly

Asn

Gin

Met

Met

Ser

Asp

Lys

Arg

Asn

Val

580

585

590

atc

ctg

ttt

tct

gta

ttc

gat

gag

aat

caa

age

tgg

tac

ctc

gca

gag

1824

íle

Leu

Phe

Ser

Val

Phe

Asp

Glu

Asn

Gin

Ser

Trp

Tyr

Leu

Ala

Glu

595

600

605

114

aat Asn

att íle 610

cag ege ttc ctc ccc aat

ccg gat

gga Gly

tta Leu 620

cag ccc cag gat

1872

Gin

Arg

Phe

Leu

Pro Asn 615

Pro

Asp

Gin

Pro

Gin

Asp

cca

gag

ttc

caa

get

tct

aac

atc

atg

cac

age

atc

aat

ggc

tat

gtt

1920

Pro

Glu

Phe

Gin

Ala

Ser

Asn

íle

Met

His

Ser

íle

Asn

Gly

Tyr

Val

625

630

635

640

ttt

gat

age

ttg

cag

ctg

tcg

gtt

tgt

ttg

cac

gag

gtg

gca

tac

tgg

1968

Phe

Asp

Ser

Leu

Gin

Leu

Ser

Val

Cys

Leu

His

Glu

Val

Ala

Tyr

Trp

645

650

655

tac

att

cta

agt

gtt

gga

gca

cag

acg

gac

ttc

ctc

tcc

gtc

ttc

ttc

2016

Tyr

íle

Leu

Ser

Val

Gly

Ala

Gin

Thr

Asp

Phe

Leu

Ser

Val

Phe

Phe

660

665

670

tct

ggc

tac

acc

ttc

aaa

cac

aaa

atg

gtc

tat

gaa

gac

aca

ctc

acc

2064

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Lys

His

Lys

Met

Val

Tyr

Glu

Asp

Thr

Leu

Thr

675

680

685

ctg

ttc

ccc

ttc

tca

gga

gaa

acg

gtc

ttc

atg

tca

atg

gaa

aac

cca

2112

Leu

Phe

Pro

Phe

Ser

Gly

Glu

Thr

Val

Phe

Met

Ser

Met

Glu

Asn

Pro

690

695

700

ggt

ctc

tgg

gtc

ctt

ggg

tgc

cac

aac

tca

gac

ttg

cgg

aac

aga

ggg

2160

Gly

Leu

Trp

Val

Leu

Gly

Cys

His

Asn

Ser

Asp

Leu

Arg

Asn

Arg

Gly

705

710

715

720

atg

aca

gcc

tta

ctg

aag

gtg

tat

agt

tgt

gac

agg

gac

att

ggt

gat

2208

Met

Thr

Ala

Leu

Leu

Lys

Val

Tyr

Ser

Cys

Asp

Arg

Asp

íle

Gly

Asp

725

730

735

tat

tat

gac

aac

act

tat

gaa

gat

att

cca

ggc

ttc

ttg

ctg

agt

gga

2256

Tyr

Tyr

Asp

Asn

Thr

Tyr

Glu

Asp

íle

Pro

Gly

Phe

Leu

Leu

Ser

Gly

740

745

750

aag

aat

gtc

att

gaa

cct

agg

age

ttt

gcc

cag

aat

tca

aga

ccc

cct

2304

Lys

Asn

Val

íle

Glu

Pro

Arg

Ser

Phe

Ala

Gin

Asn

Ser

Arg

Pro

Pro

755

760

765

agt

gcg

age

get

cca

aag

cct

ccg

gtc

ctg

ega

cgg

cat

cag

agg

gac

2352

Ser

Ala

Ser

Ala

Pro

Lys

Pro

Pro

Val

Leu

Arg

Arg

His

Gin

Arg

Asp

770

775

780

ata

age

ctt

cct

act

ttt

cag

ccg

gag

gaa

gac

aaa

atg

gac

tat

gat

2400

íle

Ser

Leu

Pro

Thr

Phe

Gin

Pro

Glu

Glu

Asp

Lys

Met

Asp

Tyr

Asp

785

790

795

800

gat

atc

ttc

tca

act

gaa

acg

aag

gga

gaa

gat

ttt

gac

att

tac

ggt

2448

Asp

íle

Phe

Ser

Thr

Glu

Thr

Lys

Gly

Glu

Asp

Phe

Asp

íle

Tyr

Gly

805

810

815

gag

gat

gaa

aat

cag

gac

cct

ege

age

ttt

cag

aag

aga

acc

ega

cac

2496

Glu

Asp

Glu

Asn

Gin

Asp

Pro

Arg

Ser

Phe

Gin

Lys

Arg

Thr

Arg

His

820

825

830

tat

ttc

att

get

gcg

gtg

gag

cag

ctc

tgg

gat

tac

ggg

atg

age

gaa

2544

Tyr

Phe

íle

Ala

Ala

Val

Glu

Gin

Leu

Trp

Asp

Tyr

Gly

Met

Ser

Glu

835

840

845

tcc

ccc

cgg

gcg

cta

aga

aac

agg

get

cag

aac

gga

gag

gtg

cct

cgg

2592

Ser

Pro

Arg

Ala

Leu

Arg

Asn

Arg

Ala

Gin

Asn

Gly

Glu

Val

Pro

Arg

115

850	855	860
ttc aag aag gtg	gtc ttc cgg gaa ttt	get gac ggc tcc ttc acg cag 2640
Phe Lys Lys Val	Val Phe Arg Glu Phe	Ala Asp Gly Ser Phe Thr Gin
865	870	875 880
ccg tcg tac cgc	ggg gaa ctc aac aaa	cac ttg ggg ctc ttg gga ccc 2688
Pro Ser Tyr Arg	Gly Glu Leu Asn Lys	His Leu Gly Leu Leu Gly Pro
	885	890 895
tac atc aga gcg	gaa gtt gaa gac aac	atc atg gta act ttc aaa aac 2736
Tyr íle Arg Ala	Glu Val Glu Asp Asn	íle Met Val Thr Phe Lys Asn
900	905	910
cag gcg tet cgt	ccc tat tcc ttc tac	tcg age ctt att tet tat ccg 2784
Gin Ala Ser Arg	Pro Tyr Ser Phe Tyr	Ser Ser Leu íle Ser Tyr Pro
915	920	925
gat gat cag gag	caa ggg gca gaa cct	ega cac aac ttc gtc cag cca 2832
Asp Asp Gin Glu	Gin Gly Ala Glu Pro	Arg His Asn Phe Val Gin Pro
930	935	940
aat gaa acc aga	act tac ttt tgg aaa	gtg cag cat cac atg gca ccc 2880
Asn Glu Thr Arg	Thr Tyr Phe Trp Lys	Val Gin His His Met Ala Pro
945	950	955 . 960
aca gaa gac gag	ttt gac tgc aaa gcc	tgg gcc tac ttt tet gat gtt 2928
Thr Glu Asp Glu	Phe Asp Cys Lys Ala	Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val
	965	970 975
gac ctg gaa aaa	gat gtg cac tca ggc	ttg atc ggc ccc ctt ctg atc 2976
Asp Leu Glu Lys	Asp Val His Ser Gly	Leu íle Gly Pro Leu Leu íle
980	985	990
tgc cgc gcc aac	acc ctg aac get get	cac ggt aga caa gtg acc gtg 3024
Cys Arg Ala Asn	Thr Leu Asn Ala Ala	His Gly Arg Gin Val Thr Val
995	1000	1005
caa gaa ttt get	ctg ttt ttc act att	ttt gat gag aca aag age tgg 3072
Gin Glu Phe Ala	Leu Phe Phe Thr íle	Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp
1010	1015	1020
tac ttc act gaa	aat gtg gaa agg aac	tgc cgg gcc ccc tgc cat ctg 3120
Tyr Phe Thr Glu	Asn Val Glu Arg Asn	Cys Arg Ala Pro Cys His Leu
1025	1030	1035 1040
cag atg gag gac	ccc act ctg aaa gaa	aac tat cgc ttc cat gca atc 3168
Gin Met Glu Asp	Pro Thr Leu Lys Glu	Asn Tyr Arg Phe His Ala íle
1045	L050 1055
aat ggc tat gtg	atg gat aca ctc cct	ggc tta gta atg get cag aat 3216
Asn Gly Tyr Val	Met Asp Thr Leu Pro	Gly Leu Val Met Ala Gin Asn
1060	1065	1070
caa agg atc ega	tgg tat ctg ctc age	atg ggc age aat gaa aat atc 3264
Gin Arg íle Arg	Trp Tyr Leu Leu Ser	Met Gly Ser Asn Glu Asn íle
1075	1080	1085
cat tcg att cat	ttt age gga cac gtg	ttc agt gta cgg aaa aag gag 3312
His Ser íle His	Phe Ser Gly His Val	Phe Ser Val Arg Lys Lys Glu
1090	1095	1100
gag tat aaa atg	gcc gtg tac aat ctc	tat ccg ggt gtc ttt gag aca 3360

116

Glu Tyr 1105

Lys

Met

Ala

Val 1110

Tyr

Asn

Leu

Tyr

Pro 1115

Gly

Val

Phe

Glu

Thr 1120

gtg gaa

atg

cta

ccg

tcc

aaa

gtt

gga

att

tgg

ega

ata

gaa

tgc

ctg

3408

Val Glu

Met

Leu

Pro 1125

Ser

Lys

Val

Gly

íle 1130

Trp

Arg

íle

Glu

Cys 1135

Leu

att ggc

gag

cac

ctg

caa

get

ggg

atg

agc

acg

act

ttc

ctg

gtg

tac

3456

íle Gly

Glu

His 1140

Leu

Gin

Ala

Gly

Met 1145

Ser

Thr

Thr

Phe

Leu 1150

Val

Tyr

agc aag

gag

tgt

cag

get

cca

ctg

gga

atg

get

tet

gga

ege

att

aga

3504

Ser Lys

Glu 1155

Cys

Gin

Ala

Pro

Leu 1160

Gly

Met

Ala

Ser

Gly 1165

Arg

íle

Arg

gat ttt

cag

atc

aca

get

tca

gga

cag

tat

gga

cag

tgg

gcc

cca

aag

3552

Asp Phe 1170

Gin

íle

Thr

Ala

Ser 1175

Gly

Gin

Tyr

Gly

Gin 1180

Trp

Ala

Pro

Lys

ctg gcc

aga

ctt

cat

tat

tcc

gga

tca

atc

aat

gcc

tgg

agc

acc

aag

3600

Leu Ala 1185

Arg

Leu

His

Tyr 1190

Ser

Gly

Ser

íle

Asn 1195

Ala

Trp

Ser

Thr

Lys 1200

gat ccc

cac

tcc

tgg

atc

aag

gtg

gat

ctg

ttg

gca

cca

atg

atc

att

3648

Asp Pro

His

Ser

Trp 1205

íle

Lys

Val

Asp

Leu 1210

Leu

Ala

Pro

Met

íle 1215

íle

cac ggc

atc

atg

acc

cag

ggt

gcc

cgt

cag

aag

ttt

tcc

agc

ctc

tac

3696

His Gly

íle

Met 1220

Thr

Gin

Gly

Ala

Arg L225

Gin

Lys

Phe

Ser

Ser 1230

Leu

Tyr

atc tcc

cag

ttt

atc

atc

atg

tac

agt

ctt

gac

ggg

agg

aac

tgg

cag

3744

íle Ser

Gin L235

Phe

íle

íle

Met

Tyr L240

Ser

Leu

Asp

Gly

Arg L245

Asn

Trp

Gin

agt tac

ega

ggg

aat

tcc

acg

ggc

acc

tta

atg

gtc

ttc

ttt

ggc

aat

3792

Ser Tyr 1250

Arg

Gly

Asn

Ser Thr 1255

Gly

Thr

Leu

Met

Val L260

Phe

Phe

Gly

Asn

gtg gac

gca

tet

ggg

att

aaa

cac

aat

att

ttt

aac

cct

ccg

att

gtg

3840

Val Asp 1265

Ala

Ser

Gly íle 1270

Lys

His

Asn

íle Phe 1275

Asn

Pro

Pro

íle

Val 1280

get cgg

tac

atc

cgt

ttg

cac

cca

aca

cat

tac

agc

atc

ege

agc

act

3888

Ala Arg

Tyr

íle Arg 1285

Leu

His

Pro

Thr His 1290

Tyr

Ser

íle

Arg

Ser 1295

Thr

ctt ege

atg

gag

ttg

atg

ggc

tgt

gat

tta

aac

agt

tgc

agc

atg

ccc

3936

Leu Arg

Met Glu 1300

Leu

Met

Gly

Cys Asp 1305

Leu

Asn

Ser

Cys

Ser 1310

Met

Pro

ctg gga

atg

cag

aat

aaa

gcg

ata

tca

gac

tca

cag

atc

acg

gcc

tcc

3984

Leu Gly Met 1315

Gin

Asn

Lys

Ala íle 1320

Ser

Asp

Ser

Gin íle 1325

Thr

Ala

Ser

tcc cac

cta

agc

aat

ata

ttt

gcc

acc

tgg

tet

cct

tca

caa

gcc

ega

4032

Ser His 1330

Leu

Ser

Asn

íle Phe 1335

Ala

Thr

Trp

Ser Pro 1340

Ser

Gin

Ala

Arg

ctt cac

ctc

cag

ggg

cgg

acg

aat

gcc

tgg

ega

ccc

cgg

gtg

agc

agc

4080

Leu His 1345

Leu

Gin

Gly Arg 1350

Thr

Asn

Ala

Trp Arg 1355

Pro

Arg

Val

Ser

Ser 1360

117

gca Ala

gag Glu

gag Glu

tgg ctg Trp Leu 1365

cag Gin

gtg Val

gac Asp

ctg cag Leu Gin 1370

aag Lys

acg Thr

gtg Val

aag gtc Lys Val 1375

aca Thr

4128

ggc

atc

acc

acc cag

ggc

gtg

aag

tcc ctg

ctc

age

age

atg tat

gtg

4176

Gly

íle

Thr

Thr Gin

Gly

Val

Lys

Ser Leu

Leu

Ser

Ser

Met Tyr

Val

1380

1385

1390

aag

gag

ttc

ctc gtg

tcc

agt

agt

cag gac

ggc

ege

ege

tgg acc

ctg

4224

Lys

Glu

Phe

Leu Val

Ser

Ser

Ser

Gin Ásp

Gly

Arg

Arg

Trp Thr

Leu

1395

1400

1405

ttt

ctt

cag

gac ggc

cac

acg

aag

gtt ttt

cag

ggc

aat

cag gac

tcc

4272

Phe

Leu

Gin

Asp Gly

His

Thr

Lys

Val Phe

Gin

Gly

Asn

Gin Asp

Ser

1410

1415

1420

tcc

acc

ccc

gtg gtg

aac

get

ctg

gac ccc

ccg

ctg

ttc

acg ege

tac

4320

Ser

Thr

Pro

Val Val

Asn

Ala

Leu

Asp Pro

Pro

Leu

Phe

Thr Arg

Tyr

1425

1430

1435

1440

ctg

agg

atc

cac ccc

acg

age

tgg

gcg cag

cac

atc

gcc

ctg agg

ctc

4368

Leu

Arg

íle

His Pro

Thr

Ser

Trp

Ala Gin

His

íle

Ala

Leu Arg

Leu

1445

1450

1455

gag

gtt

cta

gga tgt

gag

gca

cag

gat ctc

tac

tga

4404

Glu

Val

Leu

Gly Cys

Glu

Ala

Gin

Asp Leu

Tyr

1460 1465 <210> 38 <211> 1467 <212> PRT <213> Prasa <400> 38

Met 1

Gin

Leu

Glu

Leu 5

Ser Thr

Cys

Val

Phe 10

Leu

Cys

Leu

Leu

Pro 15

Leu

Gly

Phe

Ser

Ala

íle

Arg

Arg

Tyr

Tyr

Leu

Gly

Ala

Val

Glu

Leu

Ser

20

25

30

Trp

Asp

Tyr

Arg

Gin

Ser

Glu

Leu

Leu

Arg

Glu

Leu

His

Val

Asp

Thr

35

40

45

Arg

Phe

Pro

Ala

Thr

Ala

Pro

Gly

Ala

Leu

Pro

Leu

Gly

Pro

Ser

Val

50

55

60

Leu

Tyr

Lys

Lys

Thr

Val

Phe

Val

Glu

Phe

Thr

Asp

Gin

Leu

Phe

Ser

65

70

75

80

Val

Ala

Arg

Pro

Arg

Pro

Pro

Trp

Met

Gly

Leu

Leu

Gly

Pro

Thr

íle

85

90

95

Gin

Ala

Glu

Val

Tyr

Asp

Thr

Val

Val

Val

Thr

Leu

Lys

Asn

Met

Ala

100

105

110

Ser

His

Pro

Val

Ser

Leu

His

Ala

Val

Gly

Val

Ser

Phe

Trp

Lys

Ser

115

120

125

Ser

Glu

Gly

Ala

Glu

Tyr

Glu

Asp

His

Thr

Ser

Gin

Arg

Glu

Lys

Glu

130

135

140

Asp

Asp

Lys

Val

Leu

Pro

Gly

Lys

Ser

Gin

Thr

Tyr

Val

Trp

Gin

Val

118

145 150

Leu	Lys	Glu	Asn	Gly 165	Pro	Thr	Ala
Ser	Tyr	Leu	Ser 180	His	Val	Asp	Leu
íle	Gly	Ala 195	Leu	Leu	Val	Cys	Arg 200
Thr	Gin 210	Asn	Leu	His	Glu	Phe 215	Val
Gly 225	Lys	Ser	Trp	His	Ser 230	Ala	Arg
Asp	Pro	Ala	Pro	Ala 245	Arg	Ala	Gin
Tyr	Val	Asn	Arg 260	Ser	Leu	Pro	Gly
Val	Tyr	Trp 275	His	Val	íle	Gly	Met 280
íle	Phe 290	Leu	Glu	Gly	His	Thr 295	Phe
Ser 305	Leu	Glu	íle	Ser	Pro 310	Leu	Thr
Met	Asp	Leu	Gly	Gin 325	Phe	Leu	Leu
His	Gly	Gly	Met 340	Glu	Ala	His	Val
Pro	Gin	Leu 355	Arg	Arg	Lys	Ala	Asp 360
Leu	Tyr 370	Asp	Ser	Asp	Met	Asp 375	Val
Ser 385	Pro	Phe	íle	Gin	íle 390	Arg	Ser
Trp	Val	His	Tyr	íle 405	Ser	Ala	Glu
Ala	Val	Pro	Ser 420	Pro	Ser	Asp	Arg
Ser	Gly	Pro 435	Gin	Arg	íle	Gly	Arg 440
Ala	Tyr 450	Thr	Asp	Val	Thr	Phe 455	Lys
Ser 465	Gly	íle	Leu	Gly	Pro 470	Leu	Leu

		155					160
Ser	Asp 170	Pro	Pro	Cys	Leu	Thr 175	Tyr
Val 185	Lys	Asp	Leu	Asn	Ser 190	Gly	Leu
Glu	Gly	Ser	Leu	Thr 205	Arg	Glu	Arg
Leu	Leu	Phe	Ala 220	Val	Phe	Asp	Glu
Asn	Asp	Ser 235	Trp	Thr	Arg	Ala	Met 240
Pro	Ala 250	Met	His	Thr	Val	Asn 255	Gly
Leu 265	íle	Gly	Cys	His	Lys 270	Lys	Ser
Gly	Thr	Ser	Pro	Glu 285	Val	His	Ser
Leu	Val	Arg	His 300	His	Arg	Gin	Ala
Phe	Leu	Thr 315	Ala	Gin	Thr	Phe	Leu 320
Phe	Cys 330	His	íle	Ser	Ser	His 335	His
Arg 345	Val	Glu	Ser	Cys	Ala 350	Glu	Glu
Glu	Glu	Glu	Asp	Tyr 365	Asp	Asp	Asn
Val	Arg	Leu	Asp 380	Gly	Asp	Asp	Val
Val	Ala	Lys 395	Lys	His	Pro	Lys	Thr 400
Glu	Glu 410	Asp	Trp	Asp	Tyr	Ala 415	Pro
Ser 425	Tyr	Lys	Ser	Leu	Tyr 430	Leu	Asn
Lys	Tyr	Lys	Lys	Ala 445	Arg	Phe	Val
Thr	Arg	Lys	Ala 460	íle	Pro	Tyr	Glu
Tyr	Gly	Glu 475	Val	Gly	Asp	Thr	Leu 480

Leu íle íle Phe Lys Asn Lys Ala Ser Arg Pro Tyr Asn íle Tyr Pro

119

485 490 495

His Gly íle Thr

Asp

Val

Ser Ala

Leu 505

His

Pro

Gly Arg

Leu 510

Leu

Lys

500

Gly

Trp

Lys

His

Leu

Lys

Asp

Met

Pro

íle

Leu

Pro

Gly

Glu

Thr

Phe

515

520

525

Lys

Tyr

Lys

Trp

Thr

Val

Thr

Val

Glu

Asp

Gly

Pro

Thr

Lys

Ser

Asp

530

535

540

Pro

Arg

Cys

Leu

Thr

Arg

Tyr

Tyr

Ser

Ser

Ser

íle

Asn

Leu

Glu

Lys

545

550

555

560

Asp

Leu

Ala

Ser

Gly

Leu

íle

Gly

Pro

Leu

Leu

íle

Cys

Tyr

Lys

Glu

565

570

575

Ser

Val

Asp

Gin

Arg

Gly

Asn

Gin

Met

Met

Ser

Asp

Lys

Arg

Asn

Val

580

585

590

íle

Leu

Phe

Ser

Val

Phe

Asp

Glu

Asn

Gin

Ser

Trp

Tyr

Leu

Ala

Glu

595

600

605

Asn

íle

Gin

Arg

Phe

Leu

Pro

Asn

Pro

Asp

Gly

Leu

Gin

Pro

Gin

Asp

610

615

620

Pro

Glu

Phe

Gin

Ala

Ser

Asn

íle

Met

His

Ser

íle

Asn

Gly

Tyr

Val

625

630

635

640

Phe

Asp

Ser

Leu

Gin

Leu

Ser

Val

Cys

Leu

His

Glu

Val

Ala

Tyr

Trp

645

650

655

Tyr

íle

Leu

Ser

Val

Gly

Ala

Gin

Thr

Asp

Phe

Leu

Ser

Val

Phe

Phe

660

665

.670

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Lys

His

Lys

Met

Val

Tyr

Glu

Asp

Thr

Leu

Thr

675

680

685

Leu

Phe

Pro

Phe

Ser

Gly

Glu

Thr

Val

Phe

Met

Ser

Met

Glu

Asn

Pro

690

695

700

Gly

Leu

Trp

Val

Leu

Gly

Cys

His

Asn

Ser

Asp

Leu

Arg

Asn

Arg

Gly

705

710

715

720

Met

Thr

Ala

Leu

Leu

Lys

Val

Tyr

Ser

Cys

Asp

Arg

Asp

íle

Gly

Asp

725

730

735

Tyr

Tyr

Asp

Asn

Thr

Tyr

Glu

Asp

íle

Pro

Gly

Phe

Leu

Leu

Ser

Gly

740

745

750

Lys

Asn

Val

íle

Glu

Pro

Arg

Ser

Phe

Ala

Gin

Asn

Ser

Arg

Pro

Pro

755

760

765

Ser

Ala

Ser

Ala

Pro

Lys

Pro

Pro

Val

Leu

Arg

Arg

His

Gin

Arg

Asp

770

775

780

íle

Ser

Leu

Pro

Thr

Phe

Gin

Pro

Glu

Glu

Asp

Lys

Met

Asp

Tyr

Asp

785

7 90

795

800

Asp

íle

Phe

Ser

Thr

Glu

Thr

Lys

Gly

Glu

Asp

Phe

Asp

íle

Tyr

Gly

805 810 815

Glu Asp Glu Asn Gin Asp Pro Arg Ser Phe Gin Lys Arg Thr Arg His

120

	820	825	830
Tyr Phe íle 835	Ala Ala	Val Glu Gin Leu Trp Asp Tyr Gly 840 845	Met Ser Glu
Ser Pro Arg 850	Ala Leu	Arg Asn Arg Ala Gin Asn Gly Glu 855 860	Val Pro Arg
Phe Lys Lys 865	Val Val	Phe Arg Glu Phe Ala Asp Gly Ser 870 875	Phe Thr Gin 880
Pro Ser Tyr	Arg Gly 885	Glu Leu Asn Lys His Leu Gly Leu 890	Leu Gly Pro 895
Tyr íle Arg	Ala Glu 900	Val Glu Asp Asn íle Met Val Thr 905	Phe Lys Asn 910
Gin Ala Ser 915	Arg Pro	Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu íle 920 925	Ser Tyr Pro
Asp Asp Gin 930	Glu Gin	Gly Ala Glu Pro Arg His Asn Phe 935 940	Val Gin Pro
Asn Glu Thr 945	Arg Thr	Tyr Phe Trp Lys Val Gin His His 950 955	Met Ala Pro 960
Thr Glu Asp	Glu Phe 965	Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe 970	Ser Asp Val 975
Asp Leu Glu	Lys Asp 980	Val His Ser Gly Leu íle Gly Pro 985	Leu Leu íle 990
Cys Arg Ala 995	Asn Thr	Leu Asn Ala Ala His Gly Arg Gin 1000 1005	Val Thr Val
Gin Glu Phe 1010	Ala Leu	Phe Phe Thr íle Phe Asp Glu Thr 1015 .1020	Lys Ser Trp
Tyr Phe Thr 1025	Glu Asn Val Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro 1030 1035	Cys His Leu 1040
Gin Met Glu	Asp Pro 1045	Thr Leu Lys Glu Asn Tyr Arg Phe 1050	His Ala íle 1055
Asn Gly Tyr Val Met 1060	Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met 1065 :	Ala Gin Asn L070
Gin Arg íle 1075	Arg Trp	Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn 1080 1085	Glu Asn íle
His Ser íle 1090	His Phe	Ser Gly His Val Phe Ser Val Arg 1095 1100	Lys Lys Glu
Glu Tyr Lys 1105	Met Ala Val Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val 1110 1115	Phe Glu Thr 1120
Val Glu Met	Leu Pro 1125	Ser Lys Val Gly íle Trp Arg íle 1130	Glu Cys Leu 1135
íle Gly Glu	His Leu	Gin Ala Gly Met Ser Thr Thr Phe	Leu Val Tyr

1140 1145 1150

Ser Lys Glu Cys Gin Ala Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly Arg íle Arg

121

1155	1160	1165
Asp Phe Gin íle Thr	Ala Ser Gly	Gin Tyr Gly Gin Trp Ala Pro Lys
1170	1175	1180
Leu Ala Arg Leu His	Tyr Ser Gly	Ser íle Asn Ala Trp Ser Thr Lys
1185	1190	1195 1200
Asp Pro His Ser Trp	íle Lys Val	Asp Leu Leu Ala Pro Met íle íle
1205		1210 1215
His Gly íle Met Thr	Gin Gly Ala	Arg Gin Lys Phe Ser Ser Leu Tyr
1220		1225 1230
íle Ser Gin Phe íle	íle Met Tyr	Ser Leu Asp Gly Arg Asn Trp Gin
1235	1240	1245
Ser Tyr Arg Gly Asn	Ser Thr Gly	Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn
1250	1255	1260
Val Asp Ala Ser Gly	íle Lys His	Asn íle Phe Asn Pro Pro íle Val
1265	1270	1275 1280
Ala Arg Tyr íle Arg	Leu His Pro	Thr His Tyr Ser íle Arg Ser Thr
1285		1290 1295
Leu Arg Met Glu Leu	Met Gly Cys	Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro
1300		1305 1310
Leu Gly Met Gin Asn	Lys Ala íle	Ser Asp Ser Gin íle Thr Ala Ser
1315	1320	1325
Ser His Leu Ser Asn	íle Phe Ala	Thr Trp Ser Pro Ser Gin Ala Arg
1330	1335	1340
Leu His Leu Gin Gly	Arg Thr Asn	Ala Trp Arg Pro Arg Val Ser Ser
1345	1350	1355 1360
Ala Glu Glu Trp Leu	Gin Val Asp	Leu Gin Lys Thr Val Lys Val Thr
1365		1370 1375
Gly íle Thr Thr Gin	Gly Val Lys	Ser Leu Leu Ser Ser Met Tyr Val
1380	1385 1390
Lys Glu Phe Leu Val	Ser Ser Ser	Gin Asp Gly Arg Arg Trp Thr Leu
1395	1400	1405
Phe Leu Gin Asp Gly	His Thr Lys	Val Phe Gin Gly Asn Gin Asp Ser
1410	1415	1420
Ser Thr Pro Val Val	Asn Ala Leu	Asp Pro Pro Leu Phe Thr Arg Tyr
1425 1430	1435 1440
Leu Arg íle His Pro	Thr Ser Trp	Ala Gin His íle Ala Leu Arg Leu

1445 1450 1455

Claims (12)

1. DNA, ktorá kóduje aminokyselinovú sekvenciu POL1212 uvedenú v zozname sekvencii ako sekvencia SEQ ID NO: 38.

2. Expresný vektor, ktorý obsahuje DNA podľa nároku 1.

3. DNA podlá nároku 1, ktorá má nukleotidovú sekvenciu uvedenú v zozname sekvencii ako sekvencia SEQ ID NO: 37.

4. Expresný vektor, ktorý obsahuje DNA podľa nároku 3.

5. Modifikovaný prasačí faktor VIII, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako sekvencia SEQ ID NO: 38.

6. Terapeutická kompozícia vyznačujúca sa tým, že obsahuje modifikovaný prasačí faktor VIII podľa nároku 5 a fyziologicky prijateľný nosič.

7. Spôsob prípravy proteínu modifikovaného prasačieho faktora VIII, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako sekvencia SEQ ID NO: 38, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa krok, keď sa v cicavčej hostiteľskej bunke exprimuje DNA, ktorá kóduje aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako sekvencia SEQ ID NO: 38.

8. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že DNA kódujúca aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 38 kóduje tiež signálny peptid, prostredníctvom ktorého je proteín modifikovaného prasačieho faktora VIII exportovaný z cicavčej hostiteľskej bunky.

123

9. Spôsob podľa nároku 8 vyznačujúci sa tým, že signálny peptid má sekvenciu aminokyselín 1 až 19 zo sekvencie SEQ ID NO: 30.

10. Cicavčia bunka, ktorá obsahuje a replikuje expresný vektor obsahujúci DNA, ktorá kóduje aminokyselinovú sekvenciu POL1212 uvedenú v zozname sekvencií ako sekvencia SEQ ID NO. 38.

11. Cicavčia bunka podľa nároku 10, kde vektor obsahuje DNA, ktorá má nukleotidovú sekvenciu SEQ ID NO: 37.

12. Bunka podľa nároku 11, kde hostiteľská bunka je BHK CRL-1632.