CN109790529A

CN109790529A - 包含FVIII和vWF因子的嵌合蛋白及其用途

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Publication number: CN109790529A
Application number: CN201780046626.8A
Authority: CN
Inventors: 吴寅在; 李承勋; 赵义哲; 吴美淑; 柳在奂; 金用栽; 金少罗; 朴镇炫
Original assignee: Mogam Institute for Biomedical Research
Current assignee: Mogam Institute for Biomedical Research
Priority date: 2016-06-24
Filing date: 2017-06-23
Publication date: 2019-05-21
Also published as: KR102175878B1; US20190330311A1; EP3476937A4; WO2017222337A1; US11046749B2; KR20190018528A; JP6877469B2; EP3476937A1; JP2019522977A

Abstract

根据本申请的嵌合蛋白在施用时由于与FVIII偶联的vWF结构域而具有显著延长的体内半衰期，使得当用作血友病A治疗剂时，可提高患者的便利性并且可降低医疗费用。

Description

包含FVIII和vWF因子的嵌合蛋白及其用途

技术领域

本发明涉及用于治疗血友病的重组因子VIII。

背景技术

血友病是由于缺乏凝血因子而无法实现止血而连续发生出血的疾病。血液中的凝血因子由I至XIII构成，并且其中，与血友病有关的因子是VIII、IX和XI。血友病由上述因子的遗传缺陷引起。根据缺乏的凝血因子类型，血友病可分为因子VIII缺乏的血友病A、因子IX缺乏的血友病B和因子XI缺乏的血友病C。血友病A占血友病的约80％至85％。

用于施用的药物根据血友病的类型而变化，并且一种类型血友病的施用剂量和方法还根据施用部位而变化。然而，血友病治疗的目标是止血，并且使用酶替代治疗(enzymereplacement therapy，ERT)在预防和按需治疗两个方面进行治疗。目前的治疗显示出转向预防方面的趋势。

至于用于ERT的酶，过去使用从全血和血浆提取并浓缩的FVIII(血友病A)和FIX(血友病B)。然而，当从全血和血浆提取血友病因子时，使用了感染有病毒(例如AIDS和HBV)的人的一些血液，并且由于在凝血因子提取过程中这样的病毒去除不充分而发生不良事件和并发症(例如病毒感染)。并因此，最近已经开发并使用了通过重组DNA技术产生的多种因子。例如，正在开发不同形式的FVIII，例如完整形式的FVIII、其中B结构域缺失的FVIII、以及通过在特定残基处修饰而延长半衰期的FVIII。

当将FVIII用于预防性治疗时，FVIII在血液中的半衰期短至12小时(人)，这是不方便的，因为其应每2至3天施用一次。另外，由于这样的施用是静脉内(I.V.)施用，因此就患者的便利性而言降低施用频率是重要的。因此，最近开发了长效FVIII以提高FVIII的半哀期。

其中之一是FVIII-Fc融合蛋白(FVIII-Fc)，其中抗体的Fc结构域与FVIII的C端融合，并且该物质采用使用FcRn再循环来延长其半衰期的策略。已公开数种聚乙二醇化FVIII，其中PEG(聚乙二醇)在结合位点附近与LRP(低密度脂蛋白受体相关蛋白，lowdensity lipoprotein receptor related protein)缀合，已知所述LRP负责在体内清除FVIII。然而，这些长效FVIII的半衰期平均值为18小时，与常规FVIII的12小时相比仅提高了约1.5倍，这意味着施用频率在常规FVIII为每周3至4次的情况下，下降至每周2至3次。FVIII-Fc和聚乙二醇化FVIII的半衰期没有大幅提高的原因是因为FVIII在血液中以与血液中的vWF的强非共价相互作用的状态循环。FVIII-Fc和聚乙二醇化FVIII也倾向于具有与血液中存在的vWF的非共价相互作用，并因此具有受vWF半衰期影响以收敛至vWF半衰期(12小时)的限制(Tiede A.Journal of Thrombosis and Haemostasis，13(Suppl.1)：S176-S179)。

迄今为止开发的治疗剂在功能方面仍然具有短的施用(静脉内注射)间隔，并且存在由于半衰期不够长导致的体内作用丧失而频繁出血的问题。因此，为了将施用频率降低至每周一次或更少，有必要开发半衰期延长3倍或更多的长效FVIII。

发明内容

技术问题

本发明的一个目的是提供改进的FVIII，其由于在体内停留时间延长而可以以每周一次或更少的施用频率施用。

问题的解决方案

在一个实施方案中，本发明提供了包含人因子VIII(FVIII)的嵌合蛋白，所述人FVIII包含轻链和重链，所述人FVIII包含以其整个长度完全缺失或部分缺失的B结构域；以及至少一个vWF D′D3结构域。根据本发明的蛋白质具有延长至少2倍的半衰期。

在根据本发明的嵌合蛋白中，轻链和重链可表达为一个多肽或两个多肽。

根据本发明，如果轻链和重链表达为一个多肽，则FVIII与vWF D′D3结构域连接，并且嵌合蛋白包含具有位于其之间的酶切割位点的接头，其中基于接头，vWF D′D3结构域的N端位于N端或C端方向上，或者基于接头，FVIII和vWF D′D3结构域分别位于N端方向和C端方向上，或者C端方向和N端方向上。在一个实施方案中，例如，它们可在N至C方向上以FVIII-接头-D′D3或D′D3-接头-FVIII的顺序排列。

根据本发明，如果轻链和重链表达为两个多肽，则vWF D′D3结构域的N端可与包含在重链中的B结构域的C端连接。

在一个实施方案中，基于SEQ ID NO：01的第1648和1649位残基，所述部分缺失的B结构域在N端方向和/或C端方向中的每一个上具有至少5个氨基酸缺失，所述缺失包含所述残基；或者所述B结构域部分缺失，使得其包含至少4个糖基化位点，或4至6个糖基化位点。

在另一个实施方案中，基于SEQ ID NO：01的序列，可包含在本发明的部分缺失的B结构域中的B结构域由第741至902和1654至1689位氨基酸残基、或者第741至936位氨基酸残基的序列表示。

在另一个实施方案中，根据本发明的嵌合蛋白还包含至少一个Fc，其中Fc可与vWFD′D3结构域和/或FVIII连接。

在根据本发明的另一个实施方案中，根据本发明的嵌合蛋白还可包含两个或更多个vWF D′D3结构域和/或两个或更多个Fc。在本文中，在多个vWF D′D3结构域和多个Fc中，它们可通过具有或不具有酶切割位点的接头彼此连接，和/或它们可通过彼此之间的共价键形成复合物，例如，如果包括它们中的两个，则可形成二聚体。对于本文中使用的酶切割位点和接头，可参考本文中所述的那些。

在另一个实施方案中，如果在根据本发明的嵌合蛋白中使用包含酶切割位点的接头，则酶切割位点是可被凝血酶、FVIIa、FXa或FXIa切割的序列；并且具有酶切割位点的接头中的其他序列由[G₄S]_n的氨基酸序列表示，其中n是0，或1至100的整数，特别地，n是6、8、10、12、18、24或60。

在另一个实施方案中，在包含在根据本发明嵌合蛋白中的接头中的酶切割位点处，可被凝血酶切割的氨基酸序列是DFLAEGGGVR(SEQ ID NO：36)、TTKIKPR(SEQ ID NO：37)或LVPRGS(SEQ ID NO：38)；可被FVIIa切割的氨基酸序列是ASKPQGRIVGG(SEQ ID NO：39)；可被FXa切割的氨基酸序列是IDGR(SEQ ID NO：40)或IEGR(SEQ ID NO：41)；可被FXIa切割的序列可由SKLTRAETVF(SEQ ID NO：42)表示。

在另一个实施方案中，根据本发明的嵌合蛋白以第一和第二多肽的形式表达，其中第一多肽包含FVIII的重链和全部或一部分B结构域，并且第二多肽包含FVIII的轻链或一部分B结构域；并且vWF D′D3结构域位于第一多肽的N端或C端方向上，或者位于第二多肽的N端或C端方向上。如果vWF D′D3结构域与第一多肽的C端或第二多肽的C端连接，则其结构类似于其中vWF D′D3结构域与scFVIII的N端或C端连接的结构，并且在这些情况下，不同之处在于FVIII是单链还是双链。

在一个实施方案中，当以第一和第二多肽的形式表达时，vWF D′D3结构域位于第一多肽的C端方向上。

根据本发明的嵌合蛋白可包含一个或更多个(特别是两个)vWF D′D3结构域，并且可在vWF D′D3结构域之间形成复合物(二聚体)。

任选地，根据本发明的嵌合蛋白还包含至少一个(特别是两个)Fc，其中Fc可与vWFD′D3结构域和/或第二多肽连接。可在Fc之间形成复合物(二聚体)。

在一个实施方案中，在根据本发明的嵌合蛋白中，Fc或vWF D′D3结构域通过具有或不具有酶切割位点的接头连接。

在一个实施方案中，当根据本发明的嵌合蛋白表达为一个多肽时，可包括在本发明中的是由SEQ ID NO：6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、21或25表示的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列关于其生物学功能等同或具有至少90％同源性的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，当根据本发明的嵌合蛋白表达为两个多肽时，可包括在本发明中的是由以下表示的氨基酸序列：SEQ ID NO：4和5(分别为重链和轻链)、SEQ ID NO：23和24(分别为重链和轻链)、SEQ ID NO：26和27(分别为重链和轻链)、SEQ ID NO：28和29(分别为重链和轻链)、SEQ ID NO：30和31(分别为重链和轻链)、SEQ ID NO：32和33(分别为重链和轻链)、或SEQ ID NO：34和35(分别为重链和轻链)，或者与所述氨基酸序列关于其生物学功能等同或具有至少90％同源性的氨基酸序列。

根据本发明的嵌合蛋白可在FVIII的A和/或B结构域片段的一个或更多个氨基酸残基处与亲水性聚合物缀合，并且缀合位置是选自B结构域中基于SEQ ID NO：01的序列的第754、781、782、788、789、825和897位氨基酸残基中的至少一个，以及选自A结构域中基于SEQ ID NO：01的序列的第491、495、498和1806位氨基酸残基中的至少一个，并且缀合位置处的所述一个或更多个残基被半胱氨酸替换用于与亲水性聚合物缀合。

在一个实施方案中，亲水性聚合物是聚乙二醇、聚环氧乙烷或葡聚糖。

在另一个实施方案中，亲水性聚合物是聚乙二醇(PEG)，并且使用的PEG的平均分子量为20kDa或更高，特别是40kDa或60kDa。

在一个实施方案中，根据本发明的嵌合蛋白在FVIII的B结构域片段中(特别是在第782位残基处)被修饰。

在另一个实施方案中，本发明提供了编码上述嵌合蛋白的核酸、包含所述核酸的载体和包含所述载体的细胞。

在另一个实施方案中，本发明提供了嵌合蛋白、编码所述嵌合蛋白的核酸、包含所述核酸的载体和包含所述载体的细胞的用途。

根据本申请的本发明的用途，其包括用于治疗血友病的组合物、用于治疗血友病的方法、凝血组合物、凝血方法或用于产生根据本发明的蛋白质的方法。

发明的有益效果

根据本发明的其中FVIII和vWF结构域连接的嵌合蛋白或为经PEG修饰的形式的嵌合蛋白在施用时在体内具有高度延长的半衰期，从而将施用频率从常规药剂的每周2～4次降低至每周不到一次。并因此，作为血友病A的治疗剂，这样的嵌合蛋白导致提高患者的便利性，并降低治疗费用。

附图简述

图1是根据本发明具有延长的半衰期的重组FVIII的半衰期延长机制的示意图。第一种策略是用PEG和D′D3(vWF的结构域)掩蔽LRP结合位点，已知该LRP结合位点对体内消除FVIII具有最大作用。同时，第二种策略是将D′D3(其是vWF的结构域)与根据本发明的嵌合蛋白共价结合，以防止血液中内源性vWF与嵌合蛋白的结合。

图2a和2b分别是表示为根据本发明的单链(单多肽)和双链(双多肽)的嵌合蛋白的多种分子结构的示意图。

图3是根据本发明一个实施方案编码表示为单多肽的嵌合蛋白的载体的示意图。

图4示出了对包含根据本发明一个实施方案的多种长度接头的嵌合蛋白进行表达和纯化之后的SDS-PAGE分析的结果。

图5示出了分别具有重链、轻链和D′D3的抗体的包含根据本发明一个实施方案的多种长度接头的嵌合蛋白的western印迹分析的结果，并且使用的每种抗体如下：重链：Green mountain，GMA-012；轻链：Abcam，41188；以及D′D3：Abcam，96340。

图6示出了根据本发明一个实施方案对聚乙二醇化嵌合蛋白进行纯化后的SDS-PAGE分析的结果，所述聚乙二醇化嵌合蛋白通过由PEG对scFVIII/D′D3-60、-120和-300进行修饰制备。

图7示出了根据本发明一个实施方案的嵌合FVIII(scFVIII/D′D3-120-TH1)和聚乙二醇化嵌合FVIII(PEG-scFVIII/D′D3-120-TH1)的vWF结合分析的结果。将用作比较组。

图8示出了根据本发明一个实施方案的嵌合FVIII(scFVIII/D′D3-120-TH1)和聚乙二醇化嵌合FVIII(PEG-scFVIII/D′D3-120-TH1)的LRP结合分析的结果。将用作比较组。

图9示出了在HA小鼠中根据本发明一个实施方案制备的聚乙二醇化嵌合FVIII(PEG-scFVIII/D′D3-120)的PK分析的结果。作为比较组。

图10示出了在HA小鼠中根据本发明一个实施方案制备的聚乙二醇化嵌合FVIII(40kDa PEG-scFVIII/D′D3-120，60kDa PEG-scFVIII/D′D3-120)的PK分析的结果。将用作比较组。

图11示出了在HA小鼠中根据本发明一个实施方案制备的聚乙二醇化嵌合FVIII(PEG-scFVIII/D′D3-60，PEG-scFVIII/D′D3/Fc-120，Fc)的PK结果。将用作比较组。

图12示出了在HA小鼠中根据本发明一个实施方案制备的聚乙二醇化嵌合FVIII(PEG-scFVIII/D′D3-300，PEG-scFVIII/D′D3/D′D3-120)的PK结果。将用作比较组。

图13示出了在HA小鼠中根据本发明一个实施方案制备的聚乙二醇化嵌合FVIII(PEG-scFVIII/D′D3-60，PEG-scFVIII/D′D3-120，PEG-scFVIII/D′D3-300)的PK结果。将用作比较组。

图14示出了在HA小鼠中根据本发明一个实施方案制备的聚乙二醇化嵌合FVIII(PEG-scFVIII/D′D3-120，PEG-scFVIII/D′D3-120-TH1，PEG-scFVIII/D′D3-120-TH2)的PK结果。将用作比较组。

图15示出了根据本发明一个实施方案制备的聚乙二醇化嵌合FVIII(20kDa线型PEG-scFVIII/D′D3-120-TH1，20kDa支化PEG-scFVIII/D′D3-120-TH1，40kDa支化PEG-scFVIII/D′D3-120-TH1)的PK结果。将用作比较组。

图16示出了根据本发明一个实施方案制备的聚乙二醇化嵌合FVIII(PEG-scFVIII/D′D3-120-TH1)的凝血酶产生分析的结果。

图17示出了尾部剪切模型中关于聚乙二醇化嵌合FVIII(PEG-scFVIII/D′D3-120，PEG-scFVIII/D′D3-120-TH1，PEG-scFVIII/D′D3-120-TH2)的急性效力研究的结果。将用作比较组。

图18示出了根据本发明一个实施方案制备的聚乙二醇化嵌合FVIII(PEG-scFVIII/D′D3-120，PEG-scFVIII/D′D3-120-TH1，PEG-scFVIII/D′D3-120-TH2)的PK结果。将用作比较组。

本发明的最佳实施方式

本发明提供了用于预防或抑制FVIII与内源性vWF蛋白形成复合物并同时抑制FVIII与LRP(低密度脂蛋白受体相关蛋白)结合以延长FVIII蛋白半衰期的技术。这导致同时降低vWF依赖性消除以及延迟LRP和蛋白酶依赖性FVIII消除，导致半衰期延长。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了其中人因子VIII(因子VIII或FVIII)和一个或更多个vWF D′D3结构域融合的嵌合蛋白。

根据本发明的嵌合蛋白可具有单链(sc)形式，其中由野生形式的轻链和重链构成的FVIII的轻链和重链表达为单多肽；或者它可具有dc(双链)形式，其中FVIII的每个轻链和重链表达为单独的多肽。

在一个实施方案中，根据本发明的嵌合蛋白体现为单链(单多肽)，其中vWF D′D3结构域位于FVIII的N端或C端方向上，并且通过具有酶切割位点的氨基酸接头连接。

根据本发明的嵌合蛋白还体现为双链(双多肽)，其中vWF D′D3结构域可在FVIII的重链或轻链的N端或C端方向上连接。在一个实施方案中，其可在B结构域的C端方向上连接。

可包含在根据本发明的嵌合蛋白中的FVIII蛋白可具有多种长度或来源，只要它通过与vWF结合实现根据本发明的目的即可。

FVIII由A1-A2-B-A3-C1-C2结构域构成，并在肝细胞中合成为单链蛋白质。合成后，通过加工使其成熟，以形成由重链和轻链构成的280kDa异二聚体。其中，轻链分子量为80kDa并由A3-C1-C2结构域构成，并且重链由A1-A2-B结构域构成且分子量为90至200kDa，其根据B结构域的长度变化很大。异二聚体通过与vWF结合而在血液中以失活状态存在，并且当暴露于刺激(例如血管损伤)时，其在精氨酸残基之后(即，在基于SEQ ID NO：01的序列的第372、740和1689位残基之后)被凝血酶切割。结果，它与vWF分离并被激活以形成A1、A2和A3-C1-C2的三聚体。然后三聚体通过FIXa催化FX的激活，并迅速分解。

可包含在根据本发明的嵌合蛋白中的FVIII蛋白包括在凝血途径中具有全长野生型FVIII因子功能的全长FVIII蛋白、其功能片段、其变体、类似物或衍生物。术语“FVIII蛋白”可与“FVIII多肽”或“FVIII”互换使用。FVIII功能的实例包括但不限于激活凝血的能力、作为因子IX的辅因子的能力、或在存在Ca²⁺和磷脂的情况下与因子IX形成因子X酶复合物(tenase complex)的能力(此后，因子X转化为激活形式因子Xa)。

此外，可使用多种来源的FVIII蛋白，例如人、猪科、猫科、大鼠或鸡科的FVIII蛋白。FVIII氨基酸和核酸序列的非限制性实例可包括如所公开的GenBank NO：NM_000132、NP_000123、1012296A、AAA52420.1、CAA25619.1、AAA52484.1、1012298A、EAW72647.1、EAW72646.1、XP_001498954.1、ACK44290.1、ACO95359.1、NP_001138980.1、ABZ10503.1、NP_032003.2。

在根据本发明的一个实施方案中，使用人FVIII，并且例如，人FVIII可由SEQ IDNO：01的序列(不包括信号肽)表示，并且在野生型序列中，重链由第1至740位残基构成，B结构域由第741至1689位残基构成(其包含a3结构域)，并且轻链由第1690至2332位残基构成。

此外，FVIII的变体、衍生物、突变体、复合物或类似物也是本领域中已知的，其包括在本发明中。例如，美国专利No.5,668,108公开了其中第1241位的天冬氨酸被谷氨酸替换并具有附加的核酸变化的FVIII变体；美国专利No.5,149,637描述了包含糖基化或非糖基化C端片段的FVIII变体；并且美国专利No.5,661,008公开了包含第1至740位氨基酸的FVIII变体，所述第1至740位氨基酸通过至少三个氨基酸残基与第1649至2332位氨基酸连接。

可包含在根据本发明的嵌合蛋白中的FVIII包括其中其B结构域缺失的FVIII，并且这样的FVIII的实例包括但不限于以下中公开的FVIII：美国专利No.6,316,226、6,346,513、7,041,635、5,789,203、6,060,447、5,595,886、6,228,620、5,972,885、6,048,720、5,543,502、5,610,278、5,171,844、5,112,950、4,868,112和6,458,563。

可包含在根据本发明的嵌合蛋白中的FVIII包括其中其B结构域部分缺失的FVIII，并且这样的FVIII包含重链和轻链，但是缺失一些残基以免包含蛋白水解酶(例如弗林蛋白酶)的切割位点。

在一个实施方案中，部分缺失的B结构域包括基于SEQ ID NO：01的第1648和1649位残基，在N端方向和C端方向中的每一个上具有至少5个氨基酸缺失的B结构域，所述缺失包含所述残基；和/或包括部分缺失使得其包含4至6个糖基化位点的B结构域。

在一个实施方案中，可包含在根据本发明的嵌合蛋白中的FVIII具有B结构域缺失，并且这样的部分缺失的B结构域包含基于SEQ ID NO：01的第741至902和1654至1689位氨基酸残基。

在另一个实施方案中，这样的部分缺失的B结构域包含基于SEQ ID NO：01的第741至902和1654至1689位氨基酸残基的氨基酸序列，并且包含其中一些残基(特别是第782位的异亮氨酸残基)被半胱氨酸替换用于通过亲水性聚合物进行修饰的B结构域。

在另一个实施方案中，可包含在其B结构域缺失的根据本发明嵌合蛋白中的FVIII具有由SEQ ID NO：03表示的氨基酸序列或与其具有90％或更高同源性的氨基酸序列。包含在SEQ ID NO：03的氨基酸序列中的B结构域包含基于SEQ ID NO：01的第741至902位残基。

可包含在根据本发明的嵌合蛋白中的FVIII可通过在A结构域和/或B结构域片段的一些氨基酸残基处与亲水性聚合物缀合来进行修饰。

特别地，在本发明中，为了通过修饰抑制LRP与根据本发明的嵌合蛋白结合，可以以位点特异性方式并在多个位置处进行修饰以实现以上目的。

在一个实施方案中，根据本发明的嵌合蛋白中的缀合位置是选自A结构域中基于SEQ ID NO：01的序列的第491、495、498和1806位氨基酸残基中的至少一个，以及选自B结构域中基于SEQ ID NO：01的序列的第754、781、782、788、789、825和897位氨基酸残基中的至少一个。

在根据本发明的另一个实施方案中，嵌合蛋白被聚乙二醇化，特别是在B结构域，并且特别是在上述位置处。

在根据本发明的另一个实施方案中，嵌合蛋白在B结构域的第782位的异亮氨酸残基处被修饰，特别地，其是聚乙二醇化的，并且对于聚乙二醇化，如下所述，残基可被半胱氨酸替换或者可插入半胱氨酸基团。

可用于修饰根据本发明FVIII的亲水性聚合物可以是本领域中已知的亲水性聚合物，只要它们实现该目的，并且其实例可包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚环氧乙烷、葡聚糖。

在根据本发明的一个实施方案中，使用PEG，特别地，使用分子量为20kDa或更高的PEG。根据本发明，PEG在LRP结合区附近结合并且通过PEG阻碍发挥抑制FVIII与LRP结合的作用。因此，如果PEG的长度太短，则可能无法提供足够的阻碍，并且重要的是长度为20kDa或更高。在一个实施方案中，特别地，使用分子量为40kDa、60kDa或更高的PEG。

用于根据本发明的修饰中的聚乙二醇化的PEG可使用本领域中已知的多种官能团与相应的残基连接。

在根据本发明的一个实施方案中，PEG通过存在于残基(例如半胱氨酸)中的游离-SH基团以位点特异性方式连接，在这种情况下，PEG可通过(但不限于)巯基、正吡啶基二硫化物、丙烯酰基、砜或马来酰亚胺基团来进行连接。

在根据本发明的FVIII中，将与亲水性聚合物连接的残基可被替换或插入以通过亲水性聚合物进行修饰，并且用于替换或插入的残基可根据用于修饰的物质而变化，并且合适的残基可由普通技术人员选择。

在根据本发明的一个实施方案中，将聚乙二醇化用作修饰，在这种情况下，用于修饰的残基可被半胱氨酸替换，或者可将半胱氨酸残基插入合适的位置。

在根据本发明的一个实施方案中，B结构域的第782位异亮氨酸残基被修饰(特别是聚乙二醇化)，并且该残基被半胱氨酸替换用于聚乙二醇化。

可使用已知方法进行聚乙二醇化反应。例如，在聚乙二醇化反应之前去除用于掩蔽游离半胱氨酸的半胱氨酸或谷胱甘肽，以便恢复引入的半胱氨酸的游离巯基。可进行上述方法，包括用还原剂(例如TCEP、DTT、β-巯基乙醇、半胱氨酸和谷胱甘肽(还原型))处理的步骤，以及用于恢复通过还原切割的FVIII的原始二硫键的氧化步骤。可使用本领域中已知的方法进行具有用半胱氨酸替换进行修饰的蛋白质的表达。例如，在聚乙二醇化蛋白质的情况下，由于在表达期间或从细胞排出后，引入的游离半胱氨酸与包含巯基的半胱氨酸或谷胱甘肽(其为低分子物质)形成二硫键，有必要通过掩蔽游离半胱氨酸并使其稳定化直至聚乙二醇化来提高聚乙二醇化效率。

根据本发明的嵌合蛋白包含vWF D′D3结构域。

vWF(也称为F8vWF)是存在于血浆中并在内皮、怀布尔-帕拉德(Weibel-Palade)体、巨核细胞(血小板的α颗粒)和内皮下(subendothelian)结缔组织中产生的大的多聚体糖蛋白。基本的vWF单体由2813个氨基酸(包含信号肽)构成，并且每个单体包含许多具有特定功能的特定结构域，即D′/D3结构域(其与因子VIII结合)、A1结构域(其与血小板GPIb受体、肝素和/或可能的胶原蛋白结合)、A3结构域(其与胶原蛋白结合)、C1结构域(其中当血小板整合素αIIβ3被激活时，RGD结构域与其结合)和蛋白质C端处的“半胱氨酸结”结构域。半胱氨酸结也存在于血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子-β(TGF-β)和β-人绒毛膜促性腺激素(HCG)中。

编码vWF或其一部分的vWF氨基酸序列和核酸序列的非限制性实例包括如所公开的GenBank NO：NP_000543、NM_000552、AAE20723、AAB59512、P04275、EAW88815、ACP57027、EAW88816和AAD04919；美国专利No.5,260,274；Titani等，Biochemistry，25：3171-84(1986)；以及Sadler等，PNAS，82：6391-6398(1985)。

例如，全长人vWF的氨基酸序列由SEQ ID NO：02(不包含信号肽)表示。基于SEQ IDNO：02，vWF的“前肽”部分(D1-D2)由第1位氨基酸残基至Arg-741构成并且“成熟”vWF蛋白由第742至2791位氨基酸残基构成。可将各个结构域表示为D′：742-842；D3：843-1248；A1：1249-1457；A2：1458-1650；A3：1651-1850；D4：1851-2232；C1：2233-2311；C2：2312-2380；C3：2407-2474；C4：2475-2555；C5：2556-2644；C6：2625-2700和CK：2701-2791(Lenting.P.J.BLOOD，2015年3月26日.第125卷，第13期)。或者，依据作为替代的vWF结构域映射和命名系统的EXPASY蛋白质数据库命名法(worldwideweb.uniprot.org/uniprot/P04275)，可将各个结构域表示为D1：12-218；D2：365-576；D′：754-805；D3：844-1052；A1：1255-1431；A2：1476-1643；A3：1669-1849；D4：1927-2131；B：2233-2306(在EXPASY中命名为C1)；C1：2407-2473(在EXPASY中命名为C2)；C2：2558-2623(在EXPASY中命名为C3)；以及CK：2701-2790。

包含在根据本发明的嵌合蛋白中的vWF D′D3结构域与FVIII融合，以抑制根据本发明的重组FVIII与内源性vWF(全长vWF)结合。

包含在根据本发明的嵌合蛋白中的vWF D′D3结构域可具有多种长度或来源，只要其保持这样的活性即可，并且包括其突变体、衍生物、变体、复合物或类似物。

在一个实施方案中，包含在根据本发明的嵌合蛋白中的vWF D′D3结构域由第742至1248位氨基酸构成或与其具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性，并防止内源性vWF与根据本发明的重组FVIII结合。

如上所述，根据本发明的嵌合蛋白可体现为将FVIII的轻链和重链表达为一个多肽的单多肽，或将轻链和重链中的每一个表达为单独的多肽的双多肽。

关于图2A，当根据本发明的嵌合蛋白体现为单链或单多肽时，vWF D′D3结构域可位于FVIII的N端或C端方向上，并且可通过氨基酸接头连接，所述氨基酸接头包含酶切割位点用于分离体内的D′D3。

在一个实施方案中，包含在根据本发明的嵌合蛋白中的FVIII和D′D3结构域可通过由[G₄S]_n(G是甘氨酸，S是丝氨酸，并且n是1至100的整数)的氨基酸序列表示的接头连接，并且所述接头包含酶切割位点。接头将D′D3和FVIII连接，并具有为D′D3提供柔性以使其与FVIII的vWF结合位点精确结合的功能。特别地，D′D3可与FVIII融合的位置是FVIII重链的N端或C端，或者是FVIII轻链的N端或C端。考虑到对应于D′D3结构域的N端的D′结构域与FVIII的A3结构域部分结合，并且D3结构域与FVIII的C2结构域部分结合，确定当D′D3与FVIII轻链的C端融合时，D′结构域与FVIII的A3结构域之间的距离最大。因此，当D′D3与FVIII融合时，选择柔性接头以允许D′D3恰当地与FVIII结合。基于先前报道的FVIII的晶体结构，测量了从C2结构域的C端至A3结构域的N端的直线距离，并且通过将距离转换为氨基酸的数量来选择接头的长度。因此，如果接头的长度短于上述直线距离，则D′结构域不能达到FVIII的A3结构域，从而，如果接头的长度太短，则D′D3不能与FVIII结合位点精确结合。因此，需要具有满足上述条件的足够长度的接头。接头的最佳长度可根据D′D3融合的位置而变化。可使用多种长度的接头，只要它们具有上述功能即可。在一个实施方案中，n至少是6。在另一个实施方案中，式中的n可以是6、8、10、12、18、24或60。

另外，由于接头包含酶切割位点，因此当FVIII被激活时，接头还具有从FVIII切割出vWF D′D3、或者vWF D′D3和接头的功能。

包含在根据本发明的接头中的酶切割位点可在接头的N端或C端方向上连接。

在根据本发明的一个实施方案中，酶切割位点是可被凝血酶切割的位点，其可由DFLAEGGGVR(SEQ ID NO：36)、TTKIKPR(SEQ ID NO：37)或LVPRGS(SEQ ID NO：38)表示。在这种情况下，根据本发明的嵌合蛋白在体内被凝血酶切割以激活为FVIIIa，并用激活的因子IX(FIXa)激活因子X以将其转化为激活的因子X(FXa)。

此外，可包含在本发明的接头中的酶切割位点可包括可由凝血剂级联中的FVIIa、FXa或FXIa、以及凝血酶切割的位点，其可由ASKPQGRIVGG(SEQ ID NO：39)、IDGR(SEQ IDNO：40)、IEGR(SEQ ID NO：41)、或SKLTRAETVF(SEQ ID NO：42)表示。

在根据本发明的一个实施方案中，酶切割位点包含在接头的N端方向上，并且当该位点被酶(例如凝血酶)切割时，接头和D′D3结构域与FVIII分离。

在根据本发明的另一个实施方案中，酶切割位点包含在接头的C端方向上，并且当该位点被凝血酶切割时，接头和D′D3结构域与FVIII分离。

参照图2B，如上所述，根据本发明的嵌合蛋白体现为双链的形式，其中重链和轻链中的每一个表达为单独的多肽，或者重链和轻链表达为第一和第二多肽的两个多肽。在本文中，轻链和重链可通过金属离子介导的非共价键偶联。

当根据本发明的嵌合蛋白体现为双链时，第一多肽包含FVIII重链的A1、A2结构域和全部或一部分B结构域，并且第二多肽包含FVIII轻链的A3、C1、C2结构域和/或一部分B结构域。

当根据本发明的蛋白质体现为双链时，可参考前面和以下关于包含在第一多肽中的B结构域的描述。

当根据本发明的蛋白质体现为双链时，第二多肽可不包含B结构域或可使用一部分B结构域。在后一种情况下，例如，它包含从B结构域的C端残基的N端方向上的86个残基。当排出到细胞外时，切掉由第二多肽表达的一部分B结构域。

当根据本发明的嵌合蛋白体现为双链时，vWF D′D3结构域在第一多肽的C端方向上连接。在本文中，B结构域可充当一种类型的接头。当根据本发明的蛋白质体现为双链时，与蛋白质以单链表达的情况相比，可使用具有相同或更长长度的B结构域。

在根据本发明的一个实施方案中，将基于SEQ ID NO：01的序列的第741至902和1654至1689位残基的B结构域用于单链，并且将基于SEQ ID NO：01的第741至936位残基的B结构域(其为196个残基长)用于双链。当以双链形式表达时，D′结构域可与B结构域连接，这是为了使得待融合的蛋白质之间的连接在结构上更自然，但不限于该理论。特别地，在一个实施方案中，用于本发明的196个残基长的B结构域的C端的氨基酸残基序列是-SGGPLSLS。D′结构域的N端的氨基酸序列以SLSCR PPMVKLVCPA-开始。因此，如上所示，使用196个残基长的B结构域以与SLS的三个氨基酸残基重叠。计算了196个残基长的B结构域，其仅在-SGGPLSLS中包含多至SGGPL的残基。

根据本发明的嵌合蛋白可包含一个或更多个vWF D′D3。

D′D3是位于vWF的N端的两个结构域，并且D3结构域实际上通过D3结构域与另一分子的vWF形成二聚体。因此，在本发明中D′D3可以以单体或二聚体形式与FVIII融合。

当包含多个vWF D′D3(例如两个vWF D′D3)时，它们可体现为与FVIII连接的第一D′D3和与第一D′D3连接的第二D′D3。

当包含多个vWF D′D3时，第一和第二D′D3可通过接头连接，或者第二D′D3可单独表达以与嵌合蛋白形成复合物。例如，当使用如scFVIII/D′D3/D′D3-120嵌合蛋白中的接头连接第一和第二D′D3时，可参考前面关于接头的描述，但它不包含酶切割位点。

此外，当以二聚体的形式使用D′D3时，D′D3可通过D3结构域中的S-S键形成二聚体。例如，当多个D′D3在双链中的单独载体中表达时，FVIII-D′D3的DNA和D′D3的DNA可在一个细胞中同时表达以在D′D3之间形成二聚体，并排出到细胞外，然后其可在分离和纯化之后使用。

此外，根据本发明的嵌合蛋白还可包含一种或更多个Fc蛋白。如果Fc与D′D3进一步与FVIII融合，除通过D′D3抑制与血液中vWF结合的作用之外，还可预期通过FVIII通过FcRn再循环来延长半衰期的作用。在一个实施方案中，特别地，融合约50kDa的Fc，并且Fc的空间位阻可使血液中的vWF更难以与该物质结合。

因此，可包含多种长度或来源的Fc，只要其实现根据本发明的目的即可。在根据本发明的一个实施方案中，使用由SEQ ID NO：22表示的Fc或来源于人IgG的Fc。

当根据本发明的嵌合蛋白体现为单链时，Fc可与vWF D′D3连接。在此，它们可使用接头连接，并且可参考前面关于接头的描述，但是它不包含酶切割位点。

当根据本发明的嵌合蛋白体现为双链时，Fc可与表达为重链的一部分的vWF D′D3和/或与轻链的C端方向连接。在本文中，它们可使用接头进行连接。可参考前面关于接头的描述。特别地，当它与轻链连接时，它包含酶切割位点，但当它与D′D3连接时，它不包含酶切割位点。

根据本发明的嵌合蛋白中可包含两个或更多个Fc。

在一个实施方案中，当包含多个Fc(例如两个Fc)时，它们可体现为与嵌合FVIII连接的第一Fc和与第一Fc连接的第二Fc。在另一个实施方案中，第一Fc可与表达为双链的嵌合FVIII的重链连接，并且第二Fc可与轻链连接(或反之亦然)，在这种情况下，复合物(例如二聚体)可在多个Fc之间形成。

当包含多个Fc时，第一和第二Fc可通过接头连接，或者第二Fc区可在一个细胞中的单独载体中表达以在细胞中的Fc之间形成二聚体，然后其可在分离和纯化之后使用。

如上所述，根据本发明的嵌合蛋白可体现为单链或双链。

在一个实施方案中，根据本发明的单链的嵌合蛋白可由SEQ ID NO：6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、21或25表示。蛋白质可与单独的D′D3和/或Fc形成复合物，并且在一个实施方案中，SEQ ID NO：19的嵌合蛋白可与SEQ ID NO：20的至少一个D′D3形成复合物，或SEQ ID NO：21的嵌合蛋白可与由SEQ ID NO：22表示的至少一个Fc形成复合物。

在一个实施方案中，根据本发明的双链的嵌合蛋白可由以下表示：SEQ ID NO：4和5(分别为重链和轻链)、SEQ ID NO：23和24(分别为重链和轻链)、SEQ ID NO：26和27(分别为重链和轻链)、SEQ ID NO：28和29(分别为重链和轻链)、SEQ ID NO：30和31(分别为重链和轻链)、SEQ ID NO：32和33(分别为重链和轻链)或SEQ ID NO：34和35(分别为重链和轻链)。蛋白质可与单独的D′D3和/或Fc形成复合物，并且在一个实施方案中，SEQ ID NO：28和29(分别为重链和轻链)或SEQ ID NO：32和33(分别为重链和轻链)的嵌合蛋白可与由SEQID NO：22表示的至少一个Fc形成复合物。

由上述SEQ ID NO：04至35表示的氨基酸序列还包括与其具有90％或更高同源性或基本上相同序列的蛋白质。

可使用本领域中已知的序列比较方法确定这样的显著同一性或同源性。基本上相同的序列是指当将本文中公开的序列和任何其他序列比对以获得它们之间的最大对应性并使用本领域中常用的算法分析比对的序列时，显示优选至少80％同源性、特别是85％或更高、更特别的是90％或更高同源性、甚至更特别的是95％或更高同源性的那些。用于序列比较的比对方法是本领域中公知的。例如，它们在以下中公开：Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.(1981)2：482；Needleman和Wunsch，J.Mol.Bio.(1970)48：443；Pearson和Lipman，Methods in Mol.Biol.(1988)24：307-31；Higgins和Sharp，Gene(1988)73：237-44；Higgins和Sharp，CABIOS(1989)5：151-3；Corpet等，Nuc.Acids Res.(1988)16：10881-90；Huang等，Comp.Appl.BioSci.(1992)8：155-65以及Pearson等，Meth.Mol.Biol.(1994)24：307-31。NCBI基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)(Altschul等，J.MoI.Biol.215：403-10(1990))可从国家生物信息中心(National Centerfor Biological Information，NBCI，Bethesda，Md.)等获得，用于与序列分析程序(例如blastp、blasm、blastx、tblastn和tblastx)相联合。使用它的序列同源性比较方法可在http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BI-AST/blast help.html处获得。

与野生型FVIII相比，根据本发明的嵌合蛋白具有延长至少1.5倍、至少2倍和至少3倍的半衰期。公开了用于测量半衰期的方法，并且考虑到本发明的描述、技术和本领域参考文献的描述，本领域技术人员将能够选择合适的方法以测量半衰期和活性，并随后基于测量结果确定包括在本发明范围内的嵌合蛋白。

在另一个实施方案中，本发明还涉及编码本发明中公开的嵌合蛋白的核酸分子或多核苷酸，涉及包含该多核苷酸的载体，或者涉及用该载体转化的细胞(系)。

根据本发明的核酸分子包括已针对其中表达根据本发明嵌合蛋白的细胞的类型进行密码子优化的核酸分子。在根据本发明的一个实施方案中，核酸序列针对CHO密码子进行了优化，并且这样的核酸序列可由SEQ ID NO：58、59、60、62、63、64、65或66的序列表示。

如上所述，编码根据本发明的嵌合蛋白的核酸分子还包括编码基本上相同且生物学上等同的FVIII的核酸分子。

此外，编码根据本发明的嵌合蛋白的核酸分子也可通过将它们克隆到多种表达载体中用于多种目的。表达载体的具体组成可根据其中表达根据本发明的嵌合蛋白的宿主细胞而变化。然而，它包含调节本发明的核酸分子表达为mRNA或mRNA表达为蛋白质的序列，例如启动子和/或增强子等。可用于以上或多种其他目的的多种载体和调节序列是本领域中已知的，并且可由本领域技术人员根据本发明的具体目的和效果适当地选择，并且这样的载体和序列可包括例如在本发明的实施例和附图中公开的那些，但不限于此。

包含编码根据本发明的嵌合蛋白的核酸分子的载体可通过本领域中已知的方法(例如，通过将编码根据本发明的嵌合蛋白的核酸分子与启动子和/或增强子有效地连接)来制备。在一个实施方案中，将其插入到能够在细胞中表达外源基因的重组表达载体中，并且这样的载体的实例包括但不限于一般的蛋白质表达载体，例如pMSGneo和pcDNA3.1(+)。pMSGneo载体是包含与核基质结合的MAR(基质附着区(Matrix attachment region))元件的表达载体，并且当用于表达载体时，MAR元件通过诱导位置非依赖性表达(position-independent expression)而发挥增强基因表达的作用。因此，当使用pMSGneo载体时，可实现稳定且高的表达水平。另外，pcDNA3.1(+)载体包含强CMV启动子，并因此广泛用于蛋白质表达。在本发明的一个实施方案中，使用图3中所示的载体。如上所述，根据本发明的嵌合蛋白可表达为单多肽或双多肽。

另外，可将包含编码根据本发明的嵌合蛋白的核酸分子的重组表达载体转染到合适的宿主细胞中用于多种目的。宿主细胞包括在其中可扩增根据本发明的载体和/或可表达包含在载体中的核酸分子的原核细胞和真核细胞二者。可用于上述目的的多种细胞是本领域中已知的，并且本领域技术人员将能够考虑本发明的具体目的和效果选择合适的细胞，包括本发明的实施例和附图中所述的那些，但不限于此。例如，可包括大肠杆菌(E.coli)、哺乳动物细胞、酵母、植物细胞和昆虫细胞。在根据本发明的一个实施方案中，将真核细胞(特别是哺乳动物细胞系)用于表达重组FVIII。考虑到根据本发明的重组FVIII的特征，本领域技术人员将能够选择能够表达具有这样的特征的蛋白质的合适细胞系，并且例如，可将本领域中已知的CHO、BHK、COS7、HEK细胞系等用作这样的哺乳动物细胞系，优选地，可使用CHO细胞系，特别是CHO-S细胞系或CHO-K1细胞系或CHO-DG44细胞系，或者HEK细胞系，特别是HEK293细胞系，但是本发明不限于此。

将根据本发明的载体转移至上述宿主细胞进行表达。用于将载体转移至这样的宿主细胞的方法是本领域中已知的，其可通过本领域中已知的方法来实施，所述方法例如磷酸钙沉淀、鸟枪法、使用脂质体的方法、纳米针法或电穿孔，但不限于此。

在另一方面，本发明还涉及用于产生嵌合蛋白的方法，其包括将上述根据本发明的载体转染至真核细胞；在培养液中培养细胞；收集培养液以对引入半胱氨酸的嵌合蛋白进行纯化；并用聚乙二醇化缓冲溶液处理经纯化的引入半胱氨酸的蛋白质；通过还原过程恢复引入的半胱氨酸的游离巯基；在还原过程期间氧化生成物以恢复嵌合蛋白中分离的二硫键；特别地，对用还原的巯基恢复的嵌合蛋白上的半胱氨酸进行聚乙二醇化，并分离聚乙二醇化嵌合蛋白。

关于在根据本发明的方法中使用的特定载体、细胞和处理步骤，可参考本文实施例中描述的的那些。

根据本发明的嵌合蛋白可用于患有需要凝血的疾病，血友病(特别是血友病A)的患者，或用于治疗血友病A。

在另一个实施方案中，本发明还提供了用于治疗血友病(特别是血友病A)或用于凝血的方法，其包括向患有需要凝血的疾病或血友病(特别是血友病A)的患者以治疗有效量施用根据本发明的嵌合蛋白、编码编码所述嵌合蛋白的核酸分子、包含所述核酸分子的载体、或者包含所述核酸分子或载体的细胞，或者除上述成分之外还包含可药用载体的药物组合物，如上所述。

可以以药物组合物的形式提供根据本发明的嵌合蛋白、编码所述嵌合蛋白的核酸分子、包含所述核酸分子的载体，用于治疗血友病(特别是血友病A)，所述药物组合物除包含上述成分之外，还包含可药用载体。

另外，本发明的药物组合物可单独使用或与使用生物应答调节剂的其他药物治疗和方法组合使用。

除了上述活性成分之外，本发明的组合物还可通过进一步包含至少一种可药用或生理学上可接受的载体来制备。

如本文中使用的术语“载体”意欲意指在所用剂量和浓度下对暴露于其中的细胞或哺乳动物无毒的可药用载体、赋形剂或稳定剂。这样的载体的实例包括盐水、林格溶液(Ringer′s solution)、缓冲盐水、缓冲剂(例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸)、抗氧化剂(例如抗坏血酸)、具有低分子量的多肽(约小于10个氨基酸)、蛋白质(例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；亲水性聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)、氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)、碳水化合物(例如单糖、二糖、以及葡萄糖、甘露糖或糊精)、螯合剂(例如EDTA)、糖醇(例如甘露糖醇或山梨糖醇)、用于盐形成的反荷离子、和/或非离子表面活性剂(例如吐温、聚乙二醇(PEG)和)。

如果期望的话，该组合物可进一步包含本领域中已知的其他添加剂，例如抗氧化剂、缓冲剂、抗菌剂。通过添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、黏合剂和润滑剂，可将本发明的组合物配制成可注射制剂，例如溶液剂、混悬剂、乳剂等。此外，可使用本领域中的合适方法或如Remington′s Pharmaceutical Science(最近版；Mack Publishing Company，EastonPA)中所公开，优选根据疾病或成分配制组合物。

本发明的组合物优选根据期望的方法肠胃外(例如，静脉内、皮下、腹膜内)施用。剂量根据疾病状况和患者体重、疾病程度、药物类型、施用途径和时间而变化，但可由本领域技术人员适当选择。

根据本发明的组合物以治疗有效量施用。在本发明中，“治疗有效量”是指以合理的效益/风险比足以治疗疾病的量，其适用于药物治疗。有效剂量的水平可根据包括以下的因素来确定：患者的疾病类型、严重程度、药物的活性、对药物的敏感性、施用时间、施用途径、排泄速率、治疗周期、同时使用的药物、以及药物领域公知的其他因素。本发明的组合物可作为单一治疗剂施用或与其他治疗剂组合施用。此外，本发明的组合物可与常规治疗剂相继或同时施用，并且该组合物可用于单次或多次施用。考虑到上述所有因素，重要的是以引起最大作用而没有副作用的最小剂量施用组合物，并且剂量可由本领域技术人员容易地确定。

本文中使用的术语“治疗”是指通过施用本发明的组合物以有益的方式改善或改变疾病症状的任何作用。使用根据本发明方法的对象可以是灵长类(包括人)，但不限于此。

根据本发明的重组嵌合蛋白可原样或以如上所述组合物的形式以治疗有效量施用于患有血友病或需要凝血的对象，并且可以以凝血的方法或用于治疗血友病的方法的形式提供，并且可参考前面的描述。

在下文中，通过实施例详细说明本发明。以下实施例旨在进一步举例说明本发明而不限制其范围。

具体实施方式

实施例

实施例1.嵌合FVIII的构建

实施例1-1.scFVIII(单链FVIII)的制备

为了构建以单链形式表达的FVIII，构建了其中包含弗林蛋白酶切割位点(第1648位残基(基于SEQ ID NO：01的氨基酸序列，其表示全长FVIII氨基酸序列))的一部分B结构域缺失的FVIII。每种构建的scFVIII包含从B结构域的N端(SEQ ID NO：01的第741位氨基酸残基)计算的特定长度的B结构域，并且构建所包含的B结构域以便包含最初原样存在的糖链，并且通过半胱氨酸来修饰位于B结构域中第782位的异亮氨酸残基用于位点特异性聚乙二醇化。

制备方法如下。

基于人FVIII核酸序列(NM000132)合成具有表1中所示缺失的B结构域的每种scFVIII。为了制备scFVIII基因表达载体，基于人FVIII核酸序列(NM000132)，通过GeneArt合成CSL形式的整个基因(前导序列-重链-B结构域(741至764、1653至1689位)-轻链)以包含5′端的PacI-XhoI酶切割位点和3′端的PacI-XhoI酶切割位点。通过将合成的基因克隆到pcDSW载体的NotI/XhoI位点中来构建pcDSW-CSL表达载体。通过使用AsisI/PacI酶的切割条带的大小比较来确定表达载体构建的准确性。然后，通过GeneArt合成其中缺失B结构域的每种scFVIII，以包含从存在于FVIII重链的A2结构域中的BamHI位点(GGATCC)至轻链3′端的PacI酶切割位点的序列。然后，使用酶BamHI/PacI从先前制备的pcDSW-CSL表达载体中去除预先存在的FVIII区，并用BamHI/PacI酶切割合成的基因并将其克隆到pcDSW-CSL表达载体的BamHI/PacI位点，以构建pcDSW-scFVIII表达载体。通过用BamHI/PacI酶切割后的大小比较来确定表达载体构建的准确性。

表1.本发明中构建的scFVIII

对于其中引入半胱氨酸的scFVIII G4(B3，SEQ ID NO：3)，该基因由GeneArt合成以包含从半胱氨酸替换位点和FVIII重链A2结构域中的BamHI位点(GGATCC)至轻链3′端处的PacI酶切割位点的序列。然后，使用酶BamHI/PacI从先前制备的表达载体pcDSW-scFVIIIG4去除预先存在的FVIII区，并将合成的基因克隆到BamHI/PacI位点中以构建其中半胱氨酸被替换的pcDSW-scFVIII G4(B3)表达载体，并且通过序列分析确定表达载体构建的准确性。

实施例1-2.dcFVIII(双链FVIII)的制备

为了构建以包含D′D3的二聚体形式表达的FVIII，在一个细胞中使用不同载体表达轻链和包含D′D3的重链。所述包含D′D3的重链包含对应于实施例1-1中使用的B3的B结构域，并且所述轻链是参照表达韩国专利No.251286中所述的轻链的载体产生的。

实施例1-3.嵌合FVIII的制备

基于实施例1-1和1-2中制备的单链FVIII和二聚体FVIII，将嵌合FVIII与一个或两个D′D3融合，并使用接头用于将融合的D′D3与FVIII有效结合。对于该接头，使用FVIII的B结构域的一部分或[G₄S]_n。并且，除上述组合物之外，一些嵌合FIII还包含Fc(图2和图3，以及表2)。

表2.本发明中构建的嵌合FVIII

使用专利实施例1-1中描述的scFVIII G4(B3)进行嵌合FVIII的克隆。对于SEQ IDNO：04的FVIII重链，该基因由GeneArt合成以包含从存在于FVIII的A2结构域中的KpnI酶切割位点至3′端处的PacI酶切割位点的序列。然后，使用酶KpnI/PacI从scFVIII G4(B3)表达载体pcDSW-scFVIII G4(B3)去除预先存在的FVIII区，并将合成的基因克隆到KpnI/PacI位点中以构建对应于SEQ ID NO：4的重链的表达载体，并通过酶切割通过长度分析来确定表达载体构建的准确性。对于SEQ ID NO：05的轻链，该基因由GeneArt合成以包含从5′端处的Asis-前导序列至存在于FVIII轻链C1结构域的BspEI酶切割位点的序列。然后，使用酶AsiSI/BspEI从实施例1-1中制备的scFVIII G4(B3)表达载体pcDSW-scFVIII G4(B3)去除预先存在的FVIII区，并将合成的基因克隆到AsiSI/BspEI位点中以构建对应于SEQ ID NO：5的轻链的表达载体，并通过酶切割通过长度分析来确定载体构建的准确性。通过GeneArt合成SEQ ID NO：06、07、08、09、10、11、12、13、14、15和16的基因以包含从存在于FVIII轻链的C1结构域的BspEI酶位点序列至3′端处的PacI酶切割位点的序列。然后使用酶BspEI/PacI从实施例1-1中制备的scFVIII G4(B3)表达载体pcDSW-scFVIII G4(B3)去除预先存在的FVIII区，并将合成的基因克隆到BspEI/PacI位点中以构建对应于SEQ ID NO：06、07、08、09、10、11、12、13、14、15和16的嵌合FVIII表达载体，并通过酶切割通过长度分析和序列分析来确定表达载体构建的准确性。与SEQ ID NO：14相比，由SEQ ID NO：15表示的肽在接头中凝血酶切割位点的位置上不同，并且由SEQ ID NO：16表示的肽在凝血酶切割位点的位置和接头自身的序列上不同，并且它们被指定为TH1和TH2。

对于SEQ ID NO：17、18和21，通过Cosmogenetech进行CHO密码子优化和基因合成以包含从FVIII轻链C1结构域中的BspEI酶位点至3′端处的PacI酶切割位点的序列。然后，使用酶BspEI/PacI从实施例1-1中制备的scFVIII G4(B3)表达载体pcDSW-scFVIII G4(B3)中去除预先存在的FVIII区，并将合成的基因克隆到BamHI/PacI位点中以构建对应于SEQID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：21的嵌合FVIII表达载体，并通过酶切割通过长度分析来确定表达载体构建的准确性。

对于SEQ ID NO：19，通过Cosmogenetech进行CHO密码子优化和基因合成以包含从在5′端处添加的NotI-AsiSI酶切割位点至存在于FVIII重链A1结构域中的AflII酶切割位点的序列。然后，使用酶AsiSI/AflII从实施例1-1中制备的scFVIII G4(B3)表达载体pcDSW-scFVIII G4(B3)去除预先存在的FVIII区，并将合成的基因克隆到BamHI/PacI位点中以构建对应于SEQ ID NO：19的嵌合FVIII表达载体，并通过酶切割通过长度分析来确定表达载体构建的准确性。

对于SEQ ID NO：20，使用酶MfeI/XbaI从在Cosmogenetech中合成的由SEQ ID NO：64表示的基因去除预先存在区基因，并用酶MfeI/XbaI处理由SEQ ID：63表示的合成基因以获得插入物，然后将该插入物初步克隆到MfeI/XbaI位点中。为了将初级克隆基因转移至表达载体，从使用酶NotI/PacI之前制备的scFVIII G4(B3)表达载体pcDSW-scFVIII G4(B3)中去除预先存在的FVIII区，并随后用酶NotI/PacI消化初级克隆基因以切割出插入物，将该插入物克隆到表达载体的NotI/PacI位点中以构建对应于SEQ ID NO：20的表达载体。通过酶切割通过长度分析来确定表达载体构建的准确性。

对于SEQ ID NO：22，该基因由GeneArt合成以在5′端处包含AsisI且在3′端处包含PacI酶切割位点。然后，使用酶AsisI/PacI从实施例1-1中制备的scFVIII G4(B3)表达载体pcDSW-scFVIII G4(B3)中去除预先存在的FVIII区，并将合成的基因克隆到AsisI/PacI位点中以构建对应于SEQ ID NO：22的表达载体。通过酶切割通过长度分析来确定表达载体构建的准确性。

另外，对于SEQ ID NO：15，进一步制备CHO表达载体以制备CHO转化的细胞系。该基因由Biobasics Co.、GeneArt Co.和Genscript Co合成以在5′端处包含AatII-AscI且在3′端处包含BsiWI-PacI酶切割位点，或者合成以针对CHO表达对其进行优化。将合成的基因克隆到CHO表达载体pMSID2的AscI/PacI位点中以构建对应于SEQ ID NO：15的CHO表达载体。通过酶切割通过长度分析来确定表达载体构建的准确性。

实施例2.嵌合FVIII的表达

将实施例1中构建的嵌合FVIII在细胞中表达，并将显示表达的细胞在细胞培养基中培养。为了表达，使用Expi293F^TM表达系统试剂盒(Thermofisher Co.，目录号A14635)将实施例1中构建的表达载体转移并导入Expi293F^TM细胞。基于30mL规模如下进行转染方法和培养，并根据蛋白质需要量调节实际培养体积。在转染之前24小时，使用Expi293培养基根据预期需要量以2.0×10⁶个细胞/mL对Expi293F^TM细胞进行传代培养。在转染当天，测量细胞数和细胞生存力，并且当细胞生存力为95％或更高时进行转染。将Expi293培养基添加至125mL烧瓶中以获得7.5×10⁷个细胞的量，并将其调节至25.5mL。将30μg实施例1中构建的表达载体与Opti-MEM混合至总体积为1.5mL。将80μL转染试剂与Opti-MEM混合至总体积为1.5mL，并在室温下孵育5分钟。5分钟后，将含有转染试剂的Opti-MEM添加至含有DNA的Opti-MEM，然后将其轻轻混合。反应在室温下进行20至30分钟。将3mL的DNA：转染试剂复合物逐滴添加至之前制备的125mL烧瓶的Expi293F^TM细胞(总体积：28.5mL)，并在37℃下，5％CO₂摇动培养箱中以125rpm孵育。16至20小时之后，分别向其中添加150μL和1.5mL的增强剂1和增强剂2，并将细胞在34℃下在5％CO₂摇动培养箱中以125rpm培养。在培养的第二天，将所有细胞离心并完全去除预先存在的培养基，并将所有细胞分配到30mL新培养基中并在34℃下在5％CO₂摇动培养箱中以125rpm培养。在引入的第三天，将表达嵌合FVIII的所有细胞离心并回收培养液。将培养基回收后剩余的细胞分配到相同体积的新培养基中，并在34℃下培养1天。重复该过程直至培养的第5天，并回收第3天、第4天和第5天的培养液，并对引入半胱氨酸的嵌合FVIII进行活性分析和纯化。通过与以上类似的方法在CHO-DG44细胞中进行FVIII表达。

另外，制备CHO转化细胞系并表达嵌合FVIII。在转染之前24小时，根据需要量，将CHO DG44细胞以5×10⁵至6×10⁵个细胞/mL的量在CDM4CHO培养基(Hyclone，目录号，SH30557.02)中传代培养。在转染当天，使用OptiPro培养基(Thermo fisher，目录号12309-019)以1×10⁷个细胞/mL将细胞以3mL的量分配到125mL烧瓶。将30μg实施例1中构建的CHO表达载体与OptiPro混合至总体积为1.5mL。使用90μL PEI MAX(1μg/μL)和OptiPro将所得混合物混合至总体积为1.5mL。5分钟后，将1.5mL含有PEI MAX的OptiPro添加至1.5mL含有DNA的OptiPro，然后将其在室温下轻轻混合30分钟。将3mL的DNA：PEI复合物逐滴添加至之前制备的CHO DG44细胞。将细胞在37℃下在5％CO₂摇动培养箱中以140rpm孵育4小时。向其中添加24mL CDM4CHO培养基并将细胞以140rpm孵育，并且在48小时后进行细胞筛选。

使用含有20nM MTX的CDM4CHO培养基以5×10⁶个细胞/mL将经转化的CHO DG44细胞悬浮于T-175烧瓶中以获得50mL的体积，将其在37℃下在5％CO₂培养箱中进行静置培养持续7天。如果细胞数目不足，则降低总体积并继续进行。在7天的细胞筛选之后，对细胞数目进行计数，并在37℃下在5％CO₂摇动培养箱中，将细胞使用含有20nM MTX的培养基以5×10⁵个细胞/mL在125mL烧瓶中以140rpm进行传代培养。将细胞以3至4天的间隔在125mL烧瓶中进行传代培养，并且当细胞浓度为1×10⁶个细胞/mL或更高且生存力为90％或更高时，确定筛选完成。

为了表达嵌合FVIII，将CHO转化细胞系以3×10⁵个细胞/mL接种，并在37℃下在5％CO₂摇动培养箱中以140rpm孵育。在培养的第四天，将所有细胞离心，并完全去除预先存在的培养基，并将所有细胞分配到相同体积的新培养基中，并在31℃下在5％CO₂摇动培养箱中以140rpm孵育1天。重复进行培养基交换和培养过程直至培养的第8天，并回收第6天、第7天和第8天的培养液，并对嵌合FVIII进行活性分析和纯化。

实施例3.嵌合FVIII表达的确定

例3-1.嵌合FVIII表达水平的测量

两种广泛使用的FVIII活性测量测试方法是一步凝血法和显色法。其中，通过显色法测量嵌合FVIII表达水平。显色法是基于显色物质的显色程度来测量FVIII活性的方法，其中将FIXa、FX、凝血酶、钙、磷脂和FVIII样品混合并向其中添加在FXa切割后显示显色的显色底物，以测量由FVIII样品激活的FXa的量。

对于显色法的实验方法，使用CHROMOGENIX Co.销售的显色测定试剂盒作为终点法，并且通过将制造商提供的测试方法修改为适合于本测试来进行测试。使用1×稀释缓冲液将样品稀释至标准范围(0.25至1IU/mL)。使用1×稀释缓冲液制备浓度为0、0.25、0.5和1IU/mL的校准血浆。将制备的样品和10μl校准血浆用790μl的1×稀释缓冲液稀释，并将50μl经稀释的样品分配到96孔板中并使其在37℃下静置5分钟。使用自动分配器移液管将50μl因子试剂分配到各个孔中，然后使其在37℃下反应2分钟。将50μl底物分配到各个孔中，然后使其在37℃下静置2分钟用于显色。通过向显示显色的样品中添加50μL的2％柠檬酸来终止反应。在405nm波长处测量吸光度以绘制线性校准曲线，并将样品的吸光度代入校准曲线以测量样品的活性。

表3.嵌合FVIII表达水平

测量的未与D′D3融合的scFVIII-B3的表达水平为1.6至8.0IU/mL。在与D′D3融合的嵌合FVIII的情况下，发现当其以单链形式表达时，表达水平和与D′D3融合前的scFVIII-B3的表达水平相似。然而，发现当表达为二聚体时，表达水平为0.1IU/mL，其比预先存在的scFVIII-B3低10倍或更多，并且测量的结果示于表3中。

例3-2.表达模式分析

在根据实施例4对本发明中构建的嵌合FVIII进行纯化后，通过Western印迹分析确定经纯化样品的表达模式。

将培养液和LDS样品缓冲液以3∶1的比例混合，并将30μL混合样品负载到4％至12％bis-tris(BT)凝胶上，并以150伏运行约1小时。将完成运行的凝胶转移至硝酸纤维素(NC)膜，并使其在封闭缓冲液(Thermo Scientific)中静置1小时。通过在TBST缓冲液中进行稀释来制备识别因子VIII的重链(GMA-012，Green Mountain Antibodies)、轻链(ab41188，Abcam)和D′D3(96340，Abcam)的一抗，并与完成封闭的NC膜反应1小时。使用TBST缓冲液以5分钟间隔洗涤所得物3次。通过用TBST缓冲液稀释来制备二抗(山羊抗小鼠IgG-HRP缀合物)，并与NC膜反应10分钟。使用TBST缓冲液以5分钟间隔洗涤所得物5次。将ECLPrime Western印记检测试剂分散到其中以使NC膜显色，并将膜暴露于Hyperfilm ECL(GEhealthcare)并在暗室中显影。

结果确定，以单链表达的所有嵌合FVIII都以本发明中设计的形式表达，并且表达模式不根据接头长度而变化(图5)。

实施例4.嵌合FVIII产生

嵌合FVIII的产生过程主要由五个步骤组成。使用实施例2中用于培养的培养液进行纯化。

在第一步中，使用由GE Inc.开发的用于纯化的VIIISelect树脂进行从培养基中分离并纯化嵌合FVIII的过程。将VIIISelect树脂塞进柱中，并用2％柠檬酸洗涤柱。通过使平衡缓冲液(20mM组氨酸，5mM CaCl₂，1M NaCl，0.02％80，pH 7.0)流动而使其平衡。将5M NaCl缓冲液添加至培养溶液至终浓度为1M NaCl，然后滴定至pH 7.0，并负载到柱上。负载培养液后，通过使平衡缓冲液流动而使其平衡，直至UV降至基线。通过使洗脱缓冲液(20mM组氨酸，5mM CaCl₂，0.9M精氨酸，45％丙二醇，0.02％80，pH 6.5)流动而洗脱scFVIII。

在第二步中，使用来自GE Inc.的Q快速流动树脂进行在第一步中去除在第一步中混合在洗脱剂中的丙二醇并去除一些混合杂质的过程。在将Q快速流动树脂塞进柱中之后，通过使洗涤缓冲液(0.5M NaOH，1M NaCl)流动而洗涤柱。通过使平衡缓冲液(20mM组氨酸，5mM CaCl₂，0.02％80，pH 7.0)流动而使其平衡。将VIIISelect过程中的洗脱剂用平衡缓冲液稀释10倍，滴定至pH 7.0，并负载到柱上。负载后，通过使平衡缓冲液流动而使其平衡，直至UV降至基线。通过使洗脱缓冲液(20mM组氨酸，5mM CaCl₂，500mM NaCl，0.02％80，pH 7.0)流动而洗脱嵌合FVIII。

在第三步中，进行将经纯化的嵌合FVIII与PEG缀合的过程。将TCEP添加至经纯化的嵌合FVIII溶液至终浓度为0.1mM，并使其在4℃下静置1小时以还原插入的半胱氨酸。使用用聚乙二醇化缓冲液(20mM组氨酸，5mM CaCl₂，200mM NaCl，0.02％80，pH 7.0)平衡的PD-10柱(GE healthcare)去除残留的TCEP。将其在4℃下静置2小时以氧化经还原的嵌合FVIII本身的二硫键。通过以PEG与蛋白质比例为1∶20添加在DMSO中溶解的PEG溶液(50mg/mL)进行PEG缀合，然后使所得物在4℃下静置12至16小时。

在第四步中，使用GE Inc.的Superdex 200树脂进行去除不含PEG的嵌合FVIII和含有两种或更多种PEG的嵌合FVIII的过程，所述不含PEG的嵌合FVIII和含有两种或更多种PEG的嵌合FVIII是在聚乙二醇化期间形成的杂质。通过使平衡缓冲液(20mM组氨酸，5mMCaCl₂，200mM NaCl，0.02％80，pH 7.0)流动而平衡预塞满的superdex 200柱。使用样品环将聚乙二醇化过程样品负载到柱上。负载后，使平衡缓冲液流动以收集峰，并通过SDS-PAGE进行分析用于合并合适的级分。

在第五步中，进行浓缩在第四步中合并的聚乙二醇化嵌合FVIII的过程。对于该过程，使用Millipore Inc.制造的Amicon 30kDa将FVIII浓缩至浓度为25IU/mL。

对该过程的中间样品和最终样品进行SDS-PAGE以分析纯化和聚乙二醇化的程度(图4和图6)。在scFVIII/D′D3的情况下，确定具有不同接头长度的样品的纯化模式几乎相似。发现大多数HCP在VIIISelect过程(第一过程)中被去除，并且在Q FF过程(第二过程)中仅对单体形式的scFVIII/D′D3进行纯化。此后，进行聚乙二醇化过程，并随后对样品进行纯化以确定仅对PEG-scFVIII/D′D3进行纯化。

实施例5.嵌合FVIII物质比活性的确定

为了确定嵌合FVIII的比活性，通过显色法测量嵌合FVIII活性，并使用BSA作为标准品通过BCA方法测量嵌合FVIII蛋白的量。通过将活性测量的结果除以蛋白质的量来测量比活性。结果示于表4中。

表4.嵌合FVIII的比活性

样品	scFVIII/D′D3-60	scFVIII/D′D3-90	scFVIII/D′D3-120
				CS(IU/mL)	941.6	812.7	811.2
BCA(μg/mL)	101.2	95.9	86 6
				比活性(IU/mg)	9304.3	8474.5	9367.2

在scFVIII/D′D3的情况下，确定即使当接头长度改变，比活性值也没有显著差异，并且在该实施例中测量的比活性与其他重组FVIII的比活性相似。

实施例6.嵌合FVIII与LRP或vWF的结合亲和力的测量

通过ELISA方法测量嵌合FVIII与LRP或vWF的结合亲和力。将vWF(HCVWF-0191，Haemtech，200μg/mL)或LRP(#04-03，Biomac，260μg/mL)以每孔100μL的量包被在96孔板上，并使其在室温下静置2小时。孵育2小时之后，将孔用通过向PBS添加0.1％20而产生的洗涤缓冲液洗涤。通过向每个孔添加200μL的通过向PBS添加1％BSA而产生的封闭缓冲液进行封闭，并随后在室温下孵育1小时。孵育1小时之后，将孔用通过向PBS添加0.1％20而产生的洗涤缓冲液洗涤。使用封闭缓冲液将FVIII样品稀释至合适的浓度，以每孔100μL的量负载到孔上，并在室温下孵育1小时。将孔用通过向PBS添加0.1％20而产生的洗涤缓冲液洗涤。使用封闭缓冲液将抗因子VIII生物素(SAF8C-APBIO，Affinity Biologicals，100μg/mL)稀释至1/2000，并以每孔100μL的量负载到孔上，并使其在室温下静置1小时。将孔用通过向PBS添加0.1％20而产生的洗涤缓冲液洗涤。

使用封闭缓冲液将链霉亲和素-HRP(S2438，Sigma-Aldrich)稀释至1/3000，并以每孔100μL的量负载孔，并在室温下孵育45分钟。将孔用通过向PBS添加0.1％20而产生的洗涤缓冲液洗涤。用TMB底物(52-00-03，KPL)以每孔100μL的量处理孔之后并孵育10分钟。将停止液(1N硫酸)以每孔100μL的量放进孔中以使反应停止，并测量490nM处的吸光度。

作为实验的结果，确定与相比，嵌合FVIII与LRP或vWF的结合显著降低。另外，确定当嵌合FVIII被聚乙二醇化时，其与LRP或vWF的结合进一步降低(图7和图8)。

实施例7.动物PK测试：PEG-scFVIII/D′D3-120

为了测量聚乙二醇化嵌合FVIII在体内的半衰期，进行了使用血友病A小鼠模型(HA小鼠)的PK测试。将8周龄小鼠(20±2g)用作HA小鼠，并在施用前对它们进行体重测量，并随后进行分组(n＝3/时间点)。然后，将对照和聚乙二醇化嵌合FVIII(在该实施例中使用PEG-scFVIII/D′D3-120)以125IU/kg的剂量静脉内施用一次。通过在施用组中施用之后0、0.083、2、6、9、16、22和30小时，以及在PEG-scFVIII/D′D3-120施用组中施用之后0、0.083、2、6、16、30、40、48、64和72小时采样200μl血液收集PK血液样品。采样后，立即将样品与抗凝剂(柠檬酸钠3.2％缓冲液)以1∶9的体积比混合并离心以分离血浆。使用显色法测量和PEG-scFVIII/D′D3-120的效价，并使用WinNonLin软件(版本6.4)的非房室(NCA)模型计算药代动力学参数。作为PK测定结果(图9)，测量的的半衰期为约7.86小时，并且PEG-scFVIII/D′D3-120的半衰期为26.12小时，其比长3.3倍。与相比，PEG-scFVIII/D′D3-120的平均停留时间(MRT)也提高了3.6倍。另外，与相比，PEG-scFVIII/D′D3-120的消除速率(CL)降低了约2倍，并且曲线下面积(AUC)提高了约2倍。

表5.聚乙二醇化嵌合FVIII的药代动力学参数

由于在实际预防性治疗中血液中FVIII的浓度保持在1％或3％或更高，因此可通过使用长半衰期的持续FVIII来延迟血液中FVIII浓度降至或低于1％或3％的时间点，这引起施用频率降低。在迄今为止开发的持续FVIII的情况下，与对照相比，在HA小鼠中的半衰期延长了2倍或更低。这表明FVIII的半衰期没有变得比vWF的半衰期更长，因为如上所述，FVIII以与vWF强烈的非共价键合的状态在血液中循环。由于本发明中开发的嵌合FVIII抑制与血液中的vWF结合，并且还防止LRP清除嵌合FVIII，因此考虑本发明中开发的嵌合FVIII的半衰期如所相比提高2倍或更多，这是迄今为止开发的持续FVIII不能实现的水平。这被认为是非常有意义的结果。

实施例8.动物PK测试：与不同大小PEG缀合的scFVIII/D′D3-120

与实施例7类似，进行使用血友病A型小鼠模型(HA小鼠)的PK测试。将8周龄小鼠(20±2g)用作HA小鼠，并在施用前对它们进行体重测量，并随后进行分组(n＝3/时间点)。然后，将对照和聚乙二醇化嵌合FVIII以125IU/kg的剂量静脉内施用一次。在该实施例中，使用与不同大小PEG缀合的scFVIII/D′D3-120进行PK测试。通过在施用组(对照)中施用之后0、0.083、2、6、9、16、22和30小时，以及在测试组中施用之后0、0.083、2、6、16、30、40、48、64、72和96小时采样200μl血液收集PK血液样品。采样后，立即将样品与抗凝剂(柠檬酸钠3.2％缓冲液)以1∶9的体积比混合并离心以分离血浆。使用显色法测量和嵌合FVIII的效价，并使用WinNonLin软件(版本6.4)的非房室(NCA)模型计算药代动力学参数。

作为PK测定结果，测量的40kDa PEG-scFVIII/D′D3-120和60kDa PEG-scFVIII/D′D3-120的半衰期分别为约7.88小时、约20.93小时和约28.09小时。药代动力学曲线和药代动力学参数示于图10和表6中。

表6.聚乙二醇化嵌合FVIII的药代动力学参数

实施例9.动物PK测试：PEG-scFVIII/D′D3-60和PEG和与Fc融合的scFVIII/D′D3-120的缀合

进行使用血友病A小鼠模型(HA小鼠)的PK测试。将8周龄小鼠(20±2g)用作HA小鼠，并在施用前对它们进行体重测量，并随后进行分组(n＝3/时间点)。然后，将对照和聚乙二醇化嵌合FVIII以125IU/kg的剂量静脉内施用一次。在该实施例中，使用PEG-scFVIII/D′D3-60和通过将PEG和与Fc融合的scFVIII/D′D3-120缀合而获得的物质进行PK测试。通过在施用组(对照)中施用之后0、0.083、2、6、9、16、22和30小时，以及在测试组中施用之后0、0.083、2、6、16、30、40、48、64、72和96小时采样200μl血液收集血液样品。采样后，立即将样品与抗凝剂(柠檬酸钠3.2％缓冲液)以1∶9的体积比混合并离心以分离血浆。使用显色法测量和嵌合FVIII的效价，并使用WinNonLin软件(版本6.4)的非房室(NCA)模型计算药代动力学参数。

作为PK测定结果，测量的PEG-scFVIII/D′D3-60和PEG-scFVIII/D′D3/Fc-120，Fc的半衰期分别为约7.08小时、约16.53小时和约18.89小时。药代动力学曲线和药代动力学参数示于图11和表7中。

表7.聚乙二醇化嵌合FVIII的药代动力学参数

实施例10.动物PK测试：PEG-scFVIII/D′D3-300和将PEG与scFVIII/D′D3-120缀合(其中FVIII与二聚体形式的D′D3在C端融合)

进行使用血友病A小鼠模型(HA小鼠)的PK测试。将8周龄小鼠(20±2g)用作HA小鼠，并在施用前对它们进行体重测量，并随后进行分组(n＝3/时间点)。然后，将对照和聚乙二醇化嵌合FVIII以125IU/kg的剂量静脉内施用一次。在该实施例中，使用PEG-scFVIII/D′D3-300和通过将PEG与scFVIII/D′D3-120缀合(其中FVIII与二聚体形式的D′D3在C端融合)而获得的物质进行PK测试。通过在施用组(对照)中施用之后0、0.083、2、6、9、16、22和30小时，以及在测试组中施用之后0、0.083、2、6、16、30、40、48、64、72和96小时采样200μl血液收集PK血液样品。采样后，立即将样品与抗凝剂(柠檬酸钠3.2％缓冲液)以1∶9的体积比混合并离心以分离血浆。使用显色法测量和嵌合FVIII的效价，并使用WinNonLin软件(版本6.4)的非房室(NCA)模型计算药代动力学参数。

作为PK测定结果，测量的PEG-scFVIII/D′D3-300和PEG-scFVIII/D′D3/D′D3-120的半衰期分别为约9.02小时、约15.76小时和约18.00小时。药代动力学曲线和药代动力学参数示于图12和表8中。

表8.聚乙二醇化嵌合FVIII的药代动力学参数

实施例11.动物PK测试：PEG-scFVIII/D′D3-60、PEG-scFVIII/D′D3-120和PEG-scFVIII/D′D3-300

进行使用血友病A小鼠模型(HA小鼠)的PK测试。将8周龄小鼠(20±2g)用作HA小鼠，并在施用前对它们进行体重测量，并随后进行分组(n＝3/时间点)。然后，将对照和聚乙二醇化嵌合FVIII以125IU/kg的剂量静脉内施用一次。在该实施例中，使用PEG-scFVIII/D′D3-60、PEG-scFVIII/D′D3-120和PEG-scFVIII/D′D3-300进行PK测试。通过在施用组(对照)中施用之后0、0.083、2、6、9、16、22和30小时，以及在测试组中施用之后0、0.083、2、6、16、30、40、48、64、72和96小时采样200μl血液收集血液样品。采样后，立即将样品与抗凝剂(柠檬酸钠3.2％缓冲液)以1∶9的体积比混合并离心以分离血浆。使用显色法测量和嵌合FVIII的效价，并使用WinNonLin软件(版本6.4)的非房室(NCA)模型计算药代动力学参数。

作为PK测定结果，的测量半衰期为约6.99小时，并且PEG-scFVIII/D′D3-60、PEG-scFVIII/D′D3-120和PEG-scFVIII/D′D3-300的测量半衰期分别为约20.07、24.48和17.13小时。药代动力学曲线和药代动力学参数示于图13和表9中。

表9.聚乙二醇化嵌合FVIII的药代动力学参数

实施例12.动物PK测试：PEG-scFVIII/D′D3-120、PEG-scFVIII/D′D3-120-TH1和PEG-scFVIII/D′D3-120-TH2

进行使用血友病A小鼠模型(HA小鼠)的PK测试。将8周龄小鼠(20±2g)用作HA小鼠，并在施用前对它们进行体重测量，并随后进行分组(n＝3/时间点)。然后，将对照和聚乙二醇化嵌合FVIII以125IU/kg的剂量静脉内施用一次。在该实施例中，使用PEG-scFVIII/D′D3-120、PEG-scFVIII/D′D3-120-TH1和PEG-scFVIII/D′3-120-TH2进行PK测试。通过在施用组(对照)中施用之后0、0.083、2、6、9、16、22和30小时，以及在测试组中施用之后0、0.083、2、6、16、30、40、48、64、72和96小时采样200μl血液收集血液样品。采样后，立即将样品与抗凝剂(柠檬酸钠3.2％缓冲液)以1∶9的体积比混合并离心以分离血浆。使用显色法测量和嵌合FVIII的效价，并使用WinNonLin软件(版本6.4)的非房室(NCA)模型计算药代动力学参数。

作为PK测定结果，的测量半衰期为约6.26小时，并且PEG-scFVIII/D′D3-120、PEG-scFVIII/D′D3-120-TH1和PEG-scFVIII/D′D3-120-TH2的测量半衰期分别为约21.28、24.19和25.28小时。药代动力学曲线和药代动力学参数示于图14和表10中。

表10.聚乙二醇化嵌合FVIII的药代动力学参数

实施例13.动物PK测试：与多种大小和形式的PEG缀合的scFVIII/D′D3-120-TH1

进行使用血友病A小鼠模型(HA小鼠)的PK测试。将8周龄小鼠(20±2g)用作HA小鼠，并在施用前对它们进行体重测量，并随后进行分组(n＝3/时间点)。然后，将对照和聚乙二醇化嵌合FVIII以125IU/kg的剂量静脉内施用一次。在该实施例中，使用通过将多种PEG与scFVIII/D′D3-120-TH1缀合而获得的物质进行PK测试。通过在施用组(对照)中施用之后0、0.083、2、6、9、16、22和30小时，以及在测试组中施用之后0、0.083、2、6、16、30、40、48、64、72和96小时采样200μl血液收集血液样品。采样后，立即将样品与抗凝剂(柠檬酸钠3.2％缓冲液)以1∶9的体积比混合并离心以分离血浆。使用显色法测量和嵌合FVIII的效价，并使用WinNonLin软件(版本6.4)的非房室(NCA)模型计算药代动力学参数。

作为PK测定结果，的测量半衰期为约7.66小时，并且20kDa线型PEG-scFVIII/D′D3-120-TH1、20kDa支化PEG-scFVIII/D′D3-120-TH1、40kDa支化PEG-scFVIII/D′D3-120-TH1的半衰期分别为约22.98、16.10和27.33小时。药代动力学曲线和药代动力学参数示于图15和表11中。

表11.聚乙二醇化嵌合FVIII的药代动力学参数

实施例14.凝血酶产生测定

为了检查聚乙二醇化嵌合FVIII的凝血酶生成曲线，进行凝血酶产生测定。将Fluoroskan Ascent^TM FL微板荧光计和发光计(5210460，Thermofisher)装置预热至37℃，并用37℃预热的DW洗涤机器线。通过将FVIII缺乏血浆(OTXW17，Siemens)、校准物(TS20.00，Thrombinoscope)和PPP-低-试剂(TS31.00，Thrombinoscope)在室温下放置15分钟或更长时间来使其变暖，并随后通过1mL经37℃预热的DW重构。将20μL校准物或PPP-低-试剂放入96孔板中，将其放入先前准备的Fluoroskan装置中以将其加热至37℃。使用先前制备的FVIII缺乏血浆将样品稀释至合适的浓度。通过升温至37℃来制备FluCa-Kit(TS50.00，Thrombinoscope)中的Fluo-缓冲液。将80μL每种制备的样品添加至Fluoroskan仪器中的板，并将40μL Fluo-底物置于在37℃下加热的1小瓶Fluo-缓冲液中。将制备的Flu-Ca放入机器中后，运行预编程软件以每孔20μL分配Flu-Ca，并进行凝血酶产生。

凝血酶产生测定显示，在FVIII缺乏血浆中凝血酶生成曲线显著较低，而在嵌合FVIII中凝血酶生成曲线以浓度依赖性方式逐渐提高。嵌合FVIII1IU/mL的凝血酶生成曲线类似于正常血浆的凝血酶生成曲线(图16)。

实施例15.动物急性效力测试

为了检查嵌合FVIII的效力，使用血友病A型小鼠(HA小鼠)的尾部剪切模型进行急性效力测试。对于野生型小鼠(WT)，使用由Orient Bio提供的体重为19～25g的雄性C57BL/6小鼠。对于HA小鼠，选择并使用由Green Cross提供的体重为19～25g的雄性小鼠。在测试当天，在15mL圆锥管(1/小鼠)中将盐水填充至14mL后，将管保持在热的水浴中以将盐水的温度维持在37℃，并测量施用前小鼠的体重。以60mg/kg的剂量腹膜内(IP)施用戊巴比妥钠以使它们麻醉，并随后将0.9％生理盐水、阴性对照、或和聚乙二醇化嵌合FVIII、阳性对照以5mL/kg体积单剂量地以100IU/kg的剂量施用到颈静脉中。5分钟后，在距离尾端4mm的点处切割HA小鼠尾部，并将尾部置于盐水缓冲液中30分钟以收集血液。将收集30分钟的血液样品以1,500g离心5分钟以去除上清液，并随后使用10mL移液管将10mL三级蒸馏水添加至圆锥管，并使用涡旋使血液完全溶血。为了测量失血，使用血红蛋白测定试剂盒(MAK115-1KT，Sigma-Aldrich)分析溶血的样品。

野生型小鼠(WT)中血红蛋白浓度为约100nM，并且阴性对照HA小鼠(KO)中血红蛋白浓度为约1,000nM。发现和聚乙二醇化嵌合FVIII显示血红蛋白浓度为约140至450nM，比阴性对照的血红蛋白浓度低约55％。发现和聚乙二醇化嵌合FVIII之间没有统计学显著性差异(图17)。

实施例16.动物PK测试：多种大小和形式的PEG与在CHO细胞中表达的scFVIII/D′D3-120-TH1的缀合

进行使用血友病A小鼠模型(HA小鼠)的PK测试。将8周龄小鼠(20±2g)用作HA小鼠，并在施用前对它们进行体重测量，并随后进行分组(n＝3/时间点)。然后，将对照和聚乙二醇化嵌合FVIII以125IU/kg的剂量静脉内施用一次。在该实施例中，使用通过将多种PEG与在CHO细胞中表达的scFVIII/D′D3-120-TH1缀合而获得的物质进行PK测试。通过在施用组(对照)中施用之后0、0.083、2、6、9、16、22和30小时，以及在测试组中施用之后0、0.083、2、6、16、30、40、48、64、72和96小时采样200μl血液收集血液样品。采样后，立即将样品与抗凝剂(柠檬酸钠3.2％缓冲液)以1∶9的体积比混合并离心以分离血浆。使用显色法测量和嵌合FVIII的效价，并使用WinNonLin软件(版本6.4)的非房室(NCA)模型计算药代动力学参数。

作为PK测定结果，的测量半哀期为约8.22小时，并且20kDa线型PEG-scFVIII/D′D3-120-TH1和40kDa线型PEG-scFVIII/D′3-120-TH1的测量半衰期分别为约25.01和26.88小时。药代动力学曲线和药代动力学参数示于图18和表12中。

表12.聚乙二醇化嵌合FVIII的药代动力学参数

虽然已经结合一些示例性实施方案描述了本发明，但是应理解本公开内容不限于所公开的实施方案，而是旨在覆盖使用本发明基本概念的各种修改和改进。

除非另有指明，否则本发明中使用的所有技术术语具有与本领域技术人员理解的相同含义。将本说明书中公开的所有出版物的内容作为参考文献并入本发明中。

Claims

1.嵌合蛋白，其包含：

包含轻链和重链的人因子VIII(FVIII)，所述人FVIII包含以其整个长度完全缺失或部分缺失的B结构域；以及

至少一个vWF D′D3结构域，

其中所述轻链和重链表达为一个多肽或两个多肽，其中：

如果所述轻链和重链表达为一个多肽，则所述嵌合蛋白包含连接所述FVIII和所述vWFD′D3结构域并且具有位于其之间的酶切割位点的接头，其中基于所述接头，所述FVIII和所述vWF D′D3结构域分别位于N端方向和C端方向上或者位于C端方向和N端方向上；并且

如果所述轻链和重链表达为两个多肽，则所述vWF D′D3结构域与包含在所述重链中的所述B结构域的C端连接。

2.权利要求1所述的嵌合蛋白，其中基于SEQ ID NO：01的第1648和1649位残基，所述部分缺失的B结构域在N端方向和/或C端方向中的每一个上具有至少5个氨基酸缺失，所述缺失包含所述残基；或者

所述B结构域部分缺失，使得其包含4至6个糖基化位点。

3.权利要求1或2所述的嵌合蛋白，其中基于SEQ ID NO：01的序列，所述部分缺失的B结构域由第741至902和1654至1689位氨基酸残基或者第741至936位氨基酸残基的序列表示。

4.权利要求1至3中任一项所述的嵌合蛋白，其包含两个vWF D′D3结构域，其中所述两个vWF D′D3结构域通过具有或不具有酶切割位点的接头连接和/或通过其共价键形成二聚体。

5.权利要求1至4中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白还包含至少一个Fc，其中所述Fc通过具有或不具有酶切割位点的接头与所述vWF D′D3结构域和/或所述FVIII连接。

6.权利要求5所述的嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包含两个Fc，其中所述两个Fc通过具有或不具有酶切割位点的接头连接和/或通过其之间的共价键形成二聚体。

7.权利要求1至6中任一项所述的嵌合蛋白，其中：

所述酶切割位点是可被凝血酶、FVIIa、FXa或FXIa切割的序列；并且

具有所述酶切割位点的所述接头中的其他序列由[G₄S]_n的氨基酸序列表示，其中n是0、或1至100的整数。

8.权利要求7所述的嵌合蛋白，其中n是6、8、10、12、18、24或60。

9.权利要求7所述的嵌合蛋白，可被凝血酶切割的氨基酸序列是DFLAEGGGVR(SEQ IDNO：36)、TTKIKPR(SEQ ID NO：37)或LVPRGS(SEQ ID NO：38)；可被FVIIa切割的氨基酸序列是ASKPQGRIVGG(SEQ ID NO：39)；可被FXa切割的氨基酸序列是IDGR(SEQ ID NO：40)或IEGR(SEQ ID NO：41)；可被FXIa切割的序列是SKLTRAETVF(SEQ ID NO：42)。

10.权利要求1所述的嵌合蛋白，其中所述两个多肽是第一和第二多肽，其中：

所述第一多肽包含所述FVIII的重链和全部或一部分B结构域，并且所述第二多肽包含所述FVIII的轻链或一部分B结构域；并且

所述vWF D′D3结构域位于所述第一多肽的N端或C端方向上，或者位于所述第二多肽的N端或C端方向上；并且

任选地，所述嵌合蛋白还包含至少一个Fc，其中所述Fc与所述vWF D′D3结构域和/或所述第二多肽连接。

11.权利要求10所述的嵌合蛋白，其中所述第一多肽包含所述FVIII的重链和一部分B结构域，并且所述一部分B结构域基于SEQ ID NO：01包含第741至936位氨基酸残基的氨基酸序列。

12.权利要求10所述的嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包含两个或更多个vWF D′D3结构域，其中所述两个或更多个vWF D′D3结构域通过具有或不具有酶切割位点的接头连接，和/或所述vWF D′D3结构域通过所述结构域之间的共价键形成复合物。

13.权利要求10至12中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述Fc或所述vWF D′D3结构域通过具有或不具有酶切割位点的接头连接。

14.权利要求1所述的嵌合蛋白，其中表达为一个多肽的所述嵌合蛋白具有由SEQ IDNO：6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、21或25表示的氨基酸序列，或者与所述氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列。

15.权利要求10所述的嵌合蛋白，其中表达为两个多肽的所述嵌合蛋白具有由以下表示的氨基酸序列：SEQ ID NO：4和5(分别为重链和轻链)、SEQ ID NO：23和24(分别为重链和轻链)、SEQ ID NO：26和27(分别为重链和轻链)、SEQ ID NO：28和29(分别为重链和轻链)、SEQ ID NO：30和31(分别为重链和轻链)、SEQ ID NO：32和33(分别为重链和轻链)或SEQ IDNO：34和35(分别为重链和轻链)，或者与所述氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列。

16.权利要求1至15中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述FVIII在A和/或B结构域片段的一个或更多个氨基酸残基处与亲水性聚合物缀合，并且缀合位置是选自所述B结构域中基于SEQ ID NO：01的序列的第754、781、782、788、789、825和897位氨基酸残基中的至少一个，和/或选自所述A结构域中基于SEQ ID NO：01的序列的第491、495、498和1806位氨基酸残基中的至少一个，并且缀合位置处的所述一个或更多个残基被半胱氨酸替换用于与所述亲水性聚合物缀合。

17.权利要求16所述的嵌合蛋白，其中所述亲水性聚合物是聚乙二醇(PEG)、聚环氧乙烷、葡聚糖，并且所述PEG通过丙烯酰基、砜或马来酰亚胺在缀合位置处连接。

18.权利要求16或17所述的嵌合蛋白，其中所述FVIII在所述B结构域片段的一个或更多个氨基酸残基处与亲水性聚合物缀合，并且缀合位置是第782位氨基酸残基。

19.权利要求17或18所述的嵌合蛋白，其中所述PEG的平均分子量为20kDa或更高。

20.权利要求19所述的嵌合蛋白，其中所述PEG的平均分子量为40kDa或60kDa。

21.权利要求1至20中任一项所述的嵌合蛋白，其中与野生型FVIII蛋白相比，所述蛋白质至少具有延长至少2倍的半衰期。

22.核酸分子，其编码权利要求14所述的多肽。

23.核酸分子，其编码权利要求15所述的多肽。

24.权利要求22所述的核酸分子，其由SEQ ID NO：48至64、66或70表示。

25.权利要求23所述的核酸分子，其中所述核酸分子由SEQ ID NO：46、47、68、69、或71至80表示。

26.载体，其包含权利要求22至25中任一项所述的核酸分子。

27.细胞，其包含权利要求26所述的载体。

28.用于治疗A型血友病的药物组合物，其包含权利要求1至21中任一项所述的嵌合蛋白、权利要求22至25中任一项所述的核酸分子、权利要求26所述的载体或权利要求27所述的细胞，以及药理学上可接受的载体。

29.权利要求27所述的药物组合物，其中所述组合物具有这样的半衰期，使得所述组合物可每天或者更长时间一次、优选每周一次、或尤其是每月一次施用。

30.用于治疗A型血友病的方法，其包括向需要血友病治疗的对象施用治疗有效量的权利要求28或29所述的组合物。

31.凝血方法，其包括向需要血友病治疗的对象施用有效量的权利要求28或29所述的组合物。

32.权利要求1至21中任一项所述的嵌合蛋白、权利要求22至25中任一项所述的核酸分子、权利要求26所述的载体、或权利要求27所述的细胞在治疗血友病中的用途。