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CN105163751A - 复合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及血管性血友病因子(VWF)与因子VIII的共价复合物，其中所述复合物经修饰而具有延长的体内半衰期。本发明进一步涉及生产所述复合物的方法，以及该复合物用于治疗或预防出血事件的治疗性或预防性用途。

Description

复合物
本发明涉及血管性血友病因子或其变体(VWF)与因子VIII或其变体(因子VIII)的共价复合物，其中所述复合物经修饰而具有延长的体内半衰期。本发明进一步涉及生产所述复合物的方法，以及该复合物用于治疗或预防出血事件的治疗性或预防性用途。
血液凝集因子缺乏可引起多种出血障碍。最常见的障碍包括A型和B型血友病，其分别由血液凝集因子VIII和因子IX的缺乏造成。血管性血友病则是另一种已知的出血障碍。
在血浆中，因子VIII(FVIII)大多以与血管性血友病因子的以非共价复合物的形式存在。原肽切割后形成的成熟FVIII为由多达2332个氨基酸构成的多肽，其由若干结构域组成，如图1中所示。FVIII在凝血中的功能为加速因子IXa依赖的X因子向Xa因子的转化。由于FVIII和血管性血友病因子形成复合物，所以长期以来人们认为FVIII和血管性血友病因子的功能是同一分子的两种功能。到了70年代才清楚FVIII和血管性血友病因子是分开的分子，只是在生理条件下形成复合物。80年代，人们确定了FVIII和血管性血友病因子的解离常数为约0.2nmol/L(Leyte等人,BiochemJ1989,257:679-683)，并确定了两个分子的DNA序列。
典型血友病，或称为A型血友病是一种遗传性出血障碍。其由X染色体连锁的血液凝集因子FVIII缺乏导致，几乎只在男性中发生，几率为每10,000人中1-2人。该X染色体缺陷是由自身不是血友病患者的女性携带者递送下来的。A型血友病临床表现为增加的出血倾向。在引入FVIII浓缩物进行治疗前，患有严重血友病的患者平均寿命不到20岁。使用来自血浆的FVIII浓缩物显著改善了A型血友病患者的状况，极大地增加了平均平均寿命，使其中大多数和患者有可能过上差不多正常的生活。然而，源于血浆的浓缩物及其用途存在特定问题，其中最严重的问题为病毒传播，如引起乙型肝炎、非甲非乙型肝炎以及HIV的病毒。然而，近年开发了不同的病毒灭活方法及新型高度纯化的FVIII浓缩物为血浆来源的FVIII建立了非常高的安全标准。
接受预防性FVIII治疗的严重A型血友病患者需要每周静脉(i.v.)施用约三次，这是因为FVIII的血浆半衰期只有约12小时。每次i.v.施用是繁琐的，伴随着疼痛，并具有感染的风险，特别是当由患者自身在家中进行或由被诊断患有A型血友病的患儿父母进行时。
因此，非常需要创造一种具有增加的功能半衰期的FVIII，使得能够制造更低频率施用的含FVIII的药学组合物。
已经做出一些尝试来延长FVIII的功能半衰期，如通过减少其与细胞受体的相互作用(WO03/093313A2、WO02/060951A2)，通过将聚合物与FVIII共价连接(WO94/15625、WO97/11957和US4970300)，通过将FVIII胶囊化(WO99/55306)，通过引入新型金属结合位点(WO97/03193)，通过用肽键(WO97/40145和WO03/087355)或二硫键(WO02/103024A2)将A2结构域共价连接至A3结构域，或通过引入防止凝血酶活化后在A1和A2结构域间进行切割从而保持A1结构域与A2结构域间的共价连接的突变(WO2006/108590)。
另一种增强FVIII或血管性血友病因子的功能半衰期的方法是将FVIII进行PEG化(WO2007/126808、WO2006/053299、WO2004/075923)或将血管性血友病因子进行PEG化(WO2006/071801),其中的想法是PEG化的血管性血友病因子具有增加的半衰期，也会间接地增强血浆中存在的FVIII的半衰期。此外，还有人描述了FVIII与半衰期增强多肽如白蛋白或免疫球蛋白Fc的恒定区的融合蛋白(WO2004/101740、WO2008/077616和WO2009/156137)。
血管性血友病因子在不同形式的血管性血友病(VWD)中有缺失、功能缺陷或量减少的情况，其是一种多聚的粘性糖蛋白，存在于哺乳动物的血浆中，其具有多重生理学功能。在初期止血(primaryhemostasis)过程中，血管性血友病因子在血小板表面上的特定受体与细胞外基质组分如胶原蛋白之间扮演“协调者”的作用。此外，血管性血友病因子是促凝血FVIII的携带者，并稳定该蛋白质。血管性血友病因子在内皮细胞和巨核细胞中合成为2813个氨基酸的前体分子。野生型VWF的氨基酸序列与cDNA序列公开于Collins等人1987,ProcNatl.Acad.Sci.USA84:4393–4397。所述前体多肽，前体血管性血友病因子原由22残基的信号肽、741残基的原肽以及存在于成熟的血浆血管性血友病因子中的2050残基的多肽构成(Fischer等人,FEBSLett.351:345-348,1994)，也参见图2中血管性血友病因子原及成熟血管性血友病因子单体单元。当信号肽在内质网中切割时，两个单体血管性血友病因子之间形成C末端的二硫桥。在其通过分泌途径的进一步运输过程中，加上12个N-连接和10个O-连接的碳水化合物侧链。更重要地，血管性血友病因子二聚体经N-末端的二硫桥多聚化，而741个氨基酸长的原肽在晚期高尔基体中被PACE/弗林蛋白酶所切割。原肽及血管性血友病因子的高分子量多聚体(VWF-HMWM)储存于内皮细胞的Weibel-Pallade小体中或血小板的α-粒细胞中。
一旦分泌入血浆中，蛋白酶ADAMTS13会在血管性血友病因子的A2结构域内部切割超大的血管性血友病因子多聚体。血浆血管性血友病因子由全范围的多聚体组成，从近似500kDa的单个二聚体到分子量超过10,000kDa的由高达或超过20个二聚体构成的多聚体。VWF-HMWM具有最强的止血活性，可通过瑞斯托霉素辅助因子活性测定(VWF:RCo)而测量。VWF:RCo/血管性血友病因子抗原的比率越高，高分子量多聚体的相对量则越高。
血管性血友病因子缺陷是血管性血友病(VWD)的起因，该病的特征为或多或少都有显著的出血表型。3型VWD是最严重的形式，其中血管性血友病因子基本上完全缺失，1型VWD涉及血管性血友病因子的水平减少，其表型可以非常温和。2型VWD与血管性血友病因子的性质缺陷有关，可与3型VWD一样严重。2型VWD有很多子形式，其中一些与高分子量多聚体的缺失或减少有关。2A型VWD的特征为中间体和大的多聚体同时缺失，并因此特征在于性质缺陷的VWF，其与血小板糖蛋白1受体的结合能力下降。2B型VWD的特征在于最高分子量多聚体的缺失。性质缺陷的VWF结合血小板膜上糖蛋白1受体的能力有异常增强，导致其自发结合于血小板以及随后结合的血小板和大的血管性血友病因子多聚体的清除。2M型VWD也是一种血管性血友病因子的性质缺陷，其特征为结合血小板膜上糖蛋白1受体的能力下降，但具有正常的多聚体分布，如血管性血友病因子抗原水平正常。2N型VWD(Normandy)在血管性血友病因子中有性质缺陷，其中血管性血友病因子结合凝集因子FVIII缺乏。尽管血管性血友病因子和血管性血友病因子多聚体的量正常，但患者显示出下降的FVIII水平，这产生与A型血友病类似的表型。
VWD是人类最常见的遗传性出血障碍，治疗可以根据VWD的类型通过使用1-脱氨-8-D-精氨酸-加压素(1-Desamino-8-D-Arginin-Vasopressin，DDAVP)的疗法进行治疗,从细胞内储存库释放血管性血友病因子,或通过用血浆或重组来源的含血管性血友病因子的浓缩物进行替代治疗。血管性血友病因子可由人血浆制备，如EP0503991中描述的实例。EP0784632描述了一种分离血管性血友病因子的方法。
在血浆中，FVIII与血管性血友病因子以高亲和力结合，其防止前者被成熟前代谢，因而除了在初期止血(primaryhemostasis)中的作用之外，还在调控FVIII的血浆水平中起至关重要的作用。因此，血管性血友病因子还是对继发止血(secondaryhemostasis)的控制中的中心要素。血浆中结合于血管性血友病因子的未活化FVIII的半衰期为约12小时。3型VWD中几乎没有或很少存在血管性血友病因子，FVIII的半衰期只有约2小时，导致这些患者中由于FVIII浓度下降而产生轻度到中度A型血友病的症状。
血管性血友病因子对FVIII的稳定效应已被用于帮助在CHO细胞中重组表达FVIII(Kaufman等人，1989,MolCellBiol)。近来其他使用血管性血友病因子来稳定FVIII的尝试已经公开于几个近期的专利申请中(WO2011060242、WO2013083858、WO2013106787、WO2014011819)。
仍然有需要获得增加FVIII半衰期的其他更好的方法。本申请的发明者发现FVIII分子与半衰期延长的血管性血友病因子分子的共价连接会使FVIII部分的半衰期也延长到与未融合的半衰期延长的血管性血友病因子分子类似。使用所述方法，使大鼠PK模型中FVIII的半衰期是游离FVIII的约3倍。本发明提供了血管性血友病因子或其变体(VWF)与因子VIII的共价复合物，具体而言使用了方法以增加复合物中VWF组分的半衰期，这样使能够提供具有延长半衰期的稳定复合物，所述复合物在治疗和预防出血障碍上有优势。
发明概述
本发明的第一个方面涉及包含血管性血友病因子或其变体(VWF)与因子VIII(FVIII)或其变体(因子VIII)的共价复合物，其中所述复合物经修饰从而其具有延长的体内半衰期。优选地，其经修饰而包含半衰期延长部分。VWF和因子VIII形成共价复合物；半衰期延长的部分连接至该复合物任何部位，优选地连接至VWF部分。优选地，VWF和因子VIII通过直接的共价键相连，例如通过作为VWF一部分的半胱氨酸与作为FVIII一部分的半胱氨酸形成的二硫桥连接，或通过将VWF可选地经由肽连接子与VIII融合，前提条件是所述共价复合物不是Fc融合蛋白，其中Fc的一条链融合于VWF而另一条Fc链融合于FVIII或其变体。优选地，所述共价连接不是由所述半衰期延长部分提供。
在第一个实施方式中，因子VIII经修饰而与VWF形成二硫桥(条件是该二硫桥不是在Fc分子中分别融合于VWF和因子VIII的两条链之间)。优选地，通过用半胱氨酸残基置换天然存在的氨基酸或插入半胱氨酸残基以修饰因子VIII，所述半胱氨酸残基与VWF中半胱氨酸残基形成二硫桥。优选地，因子VIII中被置换的天然存在的氨基酸选自a3结构域中的氨基酸，或半胱氨酸残基是插入a3结构域(SEQIDNo.6中残基1649-1689)中的。更优选地，所述天然存在的氨基酸为酸性残基，优选地为保守的酸性残基，或参与血友病表型的残基，或FVIIIa3结构域中可能硫化的Tyr残基。更优选地，因子VIII中被置换的天然存在的氨基酸位于因子VIIIa3结构域的氨基酸1653至1660中、或氨基酸1667至1674中、或氨基酸1675至1688中，或者将半胱氨酸残基引入因子VIIIa3结构域的氨基酸1653至1660中、或氨基酸1667至1674中、或氨基酸1675至1688中。甚至更优选地，因子VIIIa3结构域中被半胱氨酸置换的天然存在的氨基酸选自SEQIDNO:6中的T1653、L1655、D1658、E1660、S1669、V1670、N1672、K1673、K1674、E1675、D1676和/或N1685，或因子VIII的遗传工程化形式中的等同位置。最优选地，a3结构域中被半胱氨酸置换的天然存在的氨基酸选自SEQIDNO:6中的T1654、Q1656、F1677、D1678、I1679、Y1680、D1681、E1682、D1683、E1684、Q1686、S1687和/或P1688，或因子VIII的遗传工程化形式中的等同位置。
在另一个实施方式中，将半胱氨酸残基插入因子VIII的C末端结构域，或被半胱氨酸置换的天然存在的氨基酸位于因子VIII的C末端结构域，优选地所述残基选自SEQIDNO:6中的I2098、S2119、N2129、R2150、P2153、W2229、Q2246，或因子VIII的遗传工程化形式中的等同位置。
在本发明第一方面的进一步的优选实施方式中，还通过用半胱氨酸置换天然存在的氨基酸或插入半胱氨酸残基而修饰VWF，所述半胱氨酸残基与引入因子VIII的半胱氨酸残基形成二硫桥。优选地，将半胱氨酸残基插入D’或D3结构域(见图2)，或者VWF中用半胱氨酸残基置换的天然存在的氨基酸为D’或D3结构域中的残基或者为D’或D3结构域中碱性或高度保守的残基或者为N型VWD中涉及的残基或者为暴露于VWF分子表面的氨基酸。在本发明一个优选的实施方式中，将半胱氨酸残基插入TIL’结构域、E’结构域、VWD3结构域、C8-3结构域、TIL-3结构域或E-3结构域，或者VWF中被半胱氨酸残基置换的天然存在的氨基酸为TIL’结构域、E’结构域、VWD3结构域、C8-3结构域、TIL-3结构域或E-3结构域中的残基(以上结构域皆由Zhou等人(2012)Blood120(2),449-458确定)。例如，VWF中的天然存在的氨基酸选自K773、G785、E787、A/T789、K790、T791、Q793、N794、M800、R820、R826、F830、H831、K834、E835、P838、K843、R852、R854、K855、W856、H861、H874、K882、L884、R906、K912、H916、K920、K923、R924、K940、R945、K948、H952、R960、K968、R976、H977、K985、K991、K1026、R1035、K1036、K1052、Q1053、K1073或H1074。优选地，VWF中的所述天然存在的氨基酸选自SEQIDNO:2中的Y795、R816、H817、P828、D853、D879、K922、D951、E1078、E1161和/或R1204，或VWF的工程化形式中的等同位置。更优选地，VWF中的天然存在的氨基酸选自SEQIDNO:2中的R768、R782、H817、D853、E933、L984、E1015、D1076、E1078、P1079、K1116和/或N1134，或例如VWF的工程化形式中的等同位置。
更优选地，引入了VWF和FVIII中天然存在的氨基酸残基的置换的一种或多种以下组合：A/T789C:D1658C、M800C:D1658C、P828C:D1658C、F830C:D1658C、P838C:D1658C、D853C:D1658C、R924C:D1658C、E1078C:D1658C、F830C:D1663C、P838C:D1663C、D853C:D1663C、E1078C:D1663C、E1078C:Y1664C、P838C:D1665C、R816C:D1666C、F830C:D1666C、E835C:D1666C、T791C:E1671C、F830C:E1671C、E835C:E1671C、D879C:E1671C、A/T789C:E1675C、T791C:E1675C、N794C:E1675C、P828C:E1675C、F830C:E1675C、E835C:E1675C、P838C:E1675C、D879CE1675C、R924C:E1675C、E1078C:E1675C、A/T789C:D1676C、T791C:D1676C、N794C:D1676C、F830C:D1676C、E835C:D1676C、A/T789C:D1678C、F830C:D1678C、E835C:D1678C、A/T789C:I1679C、M800C:I1679C、F830C:I1679C、E835C:I1679C、R854C:I1679C、D879C:I1679C、A/T789C:Y1680C、T791C:Y1680C、Y795C:Y1680C、M800C:Y1680C、R816C:Y1680C、F830C:Y1680C、E835C:Y1680C、R854C:Y1680C、D879C:Y1680C、A/T789C:E1682C、Y795C:E1682C、R816C:E1682C、P828C:E1682C、E835C:E1682C、P838C:E1682C、R854C:E1682C、D879C:E1682C、Q1053C:E1682C。
甚至更优选地，引入了VWF和FVIII中天然存在的氨基酸残基的置换的一种或多种以下组合：F1677C:R768C、I1679C:R768C、Y1680C:R768C、N1685C:R768C、T1654C:R782C、E1675C:R782C、N1685C:R782C、Q1686C:Y795C、S1687C:Y795C、P1688C:Y795C、P1688C:Y795C、E1675C:H816C、D1676C:R816C、Y1680C:R816C、E1682C:R816C、P1688C:R816C、Y1680C:H817C、N1685C:H817C、Q1686C:H817C、S1687C:H817C、I1679C:P828C、Y1680C:D853C、N1685C:D853C、T1654C:D879C、P1688C:E933C、P1688:T951C、T1653C:L984C、T1654C:L984C、L1655C:L984C、S1669C:L984C、K1673C:L984C、D1683C:L984C、T1653C:E1015C、L1655C:E1015C、S1669C:E1015C、V1670C:E1015C、N1672C:E1015C、K1673C:E1015C、D1678C:E1015C、I1679C:E1015C、E1684C:E1015C、S1687C:E1015C、F1677C:V1027C、I1679C:V1027C、P1688C:V1027C、S1657C:D1076C、K1673C:D1076C、D1676C:D1076C、F1677C:D1076C、I1679C:D1076C、E1682C:D1076C、D1683C:D1076C、Q1686C:D1076C、D1676C:E1078C、I1679C:E1078C、Y1680C:E1078C、T1653C:P1079C、L1655C:P1079C、S1657C:P1079C、D1658C:P1079C、E1682C:P1079C、V1670C:K1116C、K1673C:K1116C、D1676C:K1116C、D1678C:K1116C、D1681C:K1116C、Q1686C:K1116C、P1688C:K1116C、T1653C:N1134C、L1655C:N1134C、E1660C:N1134C、D1678C:N1134C、D1683C:N1134C、E1684C:N1134C、Q1686C:N1134C、T1653C:E1161C、L1655C:E1161C、K1674C:E1161C、D1676C:E1161C、E1684C:E1161C、S1687C:E1161C、P1688C:R1204C。
最优选地，引入了FVIII和VWF中天然存在的氨基酸残基的置换的一种或多种以下组合：T1654:P1079、T1654:N1134、Q1656:D1076、F1677:K1116、D1678:R782、I1679:K1116、Y1680:H817、Y1680:D853、Y1680:E1078、D1681:R768、E1682:R768、D1683:R768、E1684:R768、Q1686:R768、Q1686:E1015、S1687:R768、S1687:N1134、P1688:R768、P1688:H817、P1688:E933、P1688:L984、P1688:E1015、P1688:D1076和P1688:N1134。
优选地，VWF和因子VIII中一个或多个插入的半胱氨酸残基的组合中天然存在的氨基酸是如下进行选择，按实施例6中所示实验评估的共价结合的因子VIII与VWF的相对比率高于0.5以及按实施例9中所示实验评估的因子VIII的活性。最优选地，VWF和因子VIII中一个或多个插入的半胱氨酸残基的组合中天然存在的氨基酸是根据上述比率大于1.0进行选择的。
优选地，本发明复合物中的因子VIII为遗传工程化的因子VIII。工程化的因子VIII可具有部分或全部的B结构域删除，可以是包含一个或多个氨基酸置换、插入、删除或其组合的突变的因子VIII，或可以是具有半衰期延长部分的融合多肽，或化学修饰的因子VIII，如通过连接半衰期延长部分而修饰，所述半衰期延长部分例如聚乙二醇(PEG化)、糖基化的PEG、羟乙基淀粉(HES化)、聚唾液酸、弹性蛋白样多肽、细菌肝素前体聚合物或透明质酸。
在一个优选的实施方式中，本发明复合物中的VWF是半衰期延长形式的VWF，优选地为遗传工程化形式的VWF。更优选地，遗传工程化的VWF是VWF与半衰期延长部分的融合蛋白。优选地，半衰期延长部分为半衰期延长多肽(HLEP)，更优选地，所述HLEP选自白蛋白或其片段、免疫球蛋白恒定区及其部分例如Fc片段、具有大的流体动力学体积的溶剂化随机链(例如XTEN(Schellenberger等人，2009)、同源氨基酸重复(HAP)或脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸重复(PAS))、afamin、甲胎蛋白、维生素D结合蛋白质、转铁蛋白或其变体、人绒毛促性腺激素β亚基的羧基端肽(CTP)、能够在生理学条件下结合白蛋白或免疫球蛋白恒定区的多肽或脂类。在另一个优选的实施方式中，所述复合物的VWF是以二聚体形式表达的。在一个进一步优选的实施方式中，所述复合物的VWF形成多聚体。
在本发明的另一个实施方式中，本发明复合物的半衰期通过化学修饰而延长，例如连接半衰期延长部分如聚乙二醇(PEG化)、糖基化的PEG、羟乙基淀粉(HES化)、多唾液酸、弹性蛋白样多肽、细菌肝素前体聚合物或透明质酸。
本发明的第二个实施方式为包含VWF和因子VIII的共价复合物，其中所述复合物经修饰而具有延长的体内半衰期，并且其中因子VIII经修饰而包含一个或多个VWF结构域。优选地，通过在复合物中使用半衰期延长形式的VWF而得到复合物的延长半衰期。
优选地，因子VIII与VWF的一个或多个C末端结构域融合(见图4)，优选地VWF的一个或多个C末端结构域融合于因子VIII的C末端。所述VWF的C末端结构域包含VWF的C末端胱氨酸结(CystineKnot，CK)结构域，并除C或CK结构域外还包含VWF的一个或多个其他结构域，例如A或D结构域。更优选地，FVIII(优选地在C末端)包含SEQIDNO：2的残基2723-2813、2724-2813、2722-2813、2578-2813、2580-2813、2497-2813、2429-2813、2400-2813、2334-2813、2255-2813、1873-2813、1683-2813、1277-2813、1264-2813或764-2813或其变体，前提是保留半胱氨酸残基2773(或其对等物)。
优选地，VWF的C末端CK结构域(任选地还包括上文描述的进一步的VWF结构域)通过可切割连接子连接至FVIII。更优选地，所述可切割连接子包含可被血液凝集(bloodcoagulation)相关蛋白酶切割的切割位点，甚至更优选地，所述可切割连接子包含凝血酶切割位点，优选地为FVIII的凝血酶切割位点之一。优选地，所述连接子序列还包含其他的氨基酸残基，优选地，其他的氨基酸残基被插入到VWF的C末端结构域和连接子的可切割部位之间。优选地，其他的氨基酸残基提供长度足以允许FVIII和VWF分别经由FVIII的a3区域及VWF的D’D3区域而发生相互作用的肽。其他的氨基酸残基可以超过10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120或150个氨基酸。优选地，其他的氨基酸残基形成了弹性的“非结构性”肽，并且更优选地，其包含或甚至由以下组成：甘氨酸-丝氨酸重复、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸重复、同源氨基酸重复或FVIII的B结构域序列。
在另一个实施方式中，因子VIII在N末端与VWF的一个或多个C末端结构域融合。这些C末端结构域可源自VWF的C末端胱氨酸结(CK)结构域并可另外包含VWF的一个或多个其他结构域。更优选地，因子VIII(优选地在其N末端)包含SEQIDNO:2的残基2723-2813、2724-2813、2722-2813、2580-2813、2578-2813、2497-2813、2429-2813、2400-2813、2334-2813、2255-2813、1873-2813、1683-2813、1277-2813、1264-2813或764-2813或其变体，前提是保留半胱氨酸残基2773(或其对等物)。对这些实施方式，表达产物从N末端到C末端将依次包括信号肽、VWF的CK结构域、可选地具有VWF的其他结构域、优选地可切割(任选地为弹性的)连接子、及因子VIII。
本发明的另一个实施方式为包含VWF和因子VIII的共价复合物，其中VWF为半衰期延长形式的VWF，并且其中因子VIII经修饰而含有VWF的D’D3或D1D2D’D3区域，或其中维持有野生型血管性血友病因子至少10％的FVIII结合活性的其片段。优选地，因子VIII经修饰使得其部分或全部B结构域由VWFD’D3区域或其片段所取代(见图5)。更优选地，因子VIII分别包含SEQIDNO:2的残基764-1241、764-1242、764-1247、764-1270或764和1241-1270之间的任何序列，或者其变体或片段，优选地代替其(部分)B结构域。
在一个优选的实施方式中，VWF的D’D3结构域连接至因子VIII而在该分子分泌进入细胞培养基时生成双链分子，并且使D’D3结构域位于因子VIII轻链的N末端。这一点可通过例如在因子VIIIa2结构域或B结构域的剩余部分与VWFD’D3结构域之间引入含有可切割连接子例如PACE/弗林蛋白酶的可切割连接子而完成(图5d和e)。优选地，连接子在VWF的D’D3结构域与因子VIIIa3结构域之间包含其他的残基，所述其他的残基包含长度足以允许FVIII和VWF分别经由a3及D’D3结构域而发生分子内相互作用的肽(图5e)。优选地，所述其他的残基包含少于200个氨基酸，更优选地少于100个氨基酸，甚至更优选地少于90、80、70、60、50个氨基酸，少于40个氨基酸，少于30个氨基酸，少于20个氨基酸，最优选地少于10个氨基酸。优选地，所述其他的残基包含弹性的“非结构性”肽，更优选地，其包含或甚至由以下组成：甘氨酸-丝氨酸重复、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸重复或同源氨基酸重复。可将要表达以获得上文描述的成熟形式的蛋白质构建为包括其他的序列，例如，在N末端包含一段信号序列。
备选地，因子VIII的N末端连接至VWFD’D3结构域的C末端或其片段，后者优选地在N末端由VWF的其他结构域(如D1和D2结构域)所延长；这将有助于其表达以及与半衰期延长VWF之间共价键的形成细胞内。更优选地，因子VIII在N末端包含SEQIDNO:2的残基1-1241或(在原肽切割后)残基764-1241或者其变体或片段。
优选地，VWF的D’D3或D1D2D’D3结构域分别通过可切割连接子与因子VIII的N末端相连。更优选地，可切割连接子包含可由血液凝集相关蛋白酶切割的切割位点，甚至更优选地，所述可切割连接子包含凝血酶切割位点，优选地为FVIII的凝血酶切割位点之一。优选地，所述连接子在VWF的D’D3或D1D2D’D3结构域与因子VIII分子之间包含其他的残基，所述其他的残基包含长度足以允许FVIII和VWF分别经由a3及D’D3结构域而发生相互作用的肽(图5e)。优选地，添加超过20、30、50、100或150个其他的氨基酸。优选地，所述其他的残基包含弹性的非结构性肽，更优选地，其包含或甚至由以下组成：甘氨酸-丝氨酸重复、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸重复、同源氨基酸重复或FVIII的B结构域。
进一步地，可通过加入其他源自VWF的VWF结构域将如上文所描述的经由连接子融合至FVIII的N末端的VWF的D’D3或D1D2D’D3结构域在D3及所描述的连接子之间延长，将其他的VWF相关功能部分并入构建体。
本发明的第二个方面为生产上文描述的因子VIII和VWF共价复合物的方法，包括将因子VIII和VWF分子在真核细胞系中共表达。优选地，所述真核细胞系经修饰而表达PACE/弗林蛋白酶以确保进行充分加工。备选地，这些蛋白质(因子VIII和VWF)可分别进行生产然后在体外进行组合，例如在能够形成二硫桥并保留因子VIII和VWF的功能性完整的中等氧化环境下进行组合。
在本发明这一方面的另一个实施方式中，(经修饰的)因子VIII和(经修饰的)VWF通过化学交联而共价连接(见图7)。
本发明第三个方面是如上文描述的共价复合物用于医药，优选地用于出血障碍的治疗或预防。优选地，所述出血障碍为A型血友病或VWD。
本发明第四个方面是包含上文描述的共价复合物的药学组合物。
本发明进一步的方面是治疗或预防出血障碍的方法，通过对有需要的受试者施用有效量的上文描述的复合物。
发明详述
如上文提出的，具有长半衰期的FVIII对于患血友病特别是患A型血友病的患者的长期治疗是非常有益的。本发明者现在惊奇地发现可生产血管性血友病因子(VWF)和FVIII的共价复合物，其提供更长的FVIII半衰期。尤其当复合物经修饰而延长其体内半衰期时，例如当使用半衰期延长形式的VWF或FVIII时，FVIII的半衰期得到显著增强，使该方法成为一种很具吸引力的方法，用于改善对患出血障碍如A型血友病的患者的预防和治疗。优选地，通过此方法还可加速体内恢复。
因此，在第一个方面，本发明涉及共价复合物，其包含血管性血友病因子或其变体(VWF)及因子VIII或其变体(因子VIII)，其中所述复合物经修饰而具有延长的体内半衰期。例如，VWF可为半衰期延长形式的VWF；备选地(或此外地)，因子VIII可为半衰期延长形式的因子VIII，或可将半衰期延长部分通过连接子连接至所述共价化合物。优选地，复合物中的VWF包含半衰期延长部分。优选地，所述共价复合物不是异源二聚体的Fc，其中一个Fc单体连接至VWF而另一Fc单体连接至因子VIII。更优选地，所述共价连接不是由半衰期延长部分提供的。
如本文所使用的，术语“血管性血友病因子”或“VWF”是指具有野生型VWF的生物学功能的任意多肽，包括变体，如具有一个或多个氨基酸置换、插入、轻微或重大删除(如一个或多个结构域的删除)的VWF，或与另一个肽或蛋白质部分例如半衰期增加性多肽或非蛋白质部分的其融合蛋白，只要保留了血管性血友病因子的至少部分活性。VWF活性可以是胶原蛋白结合活性，和/或血小板结合活性，和/或FVIII结合活性。对于没有经由VWF上的结合位点共价结合FVIII的VWF，可确定其FVIII结合活性。已经建立了测量VWF活性的测定法，例如胶原蛋白结合测定法、瑞斯托霉素辅助因子测定法或FVIII结合测定。如果具有删除和/或其他修饰的VWF保留了对野生型VWF所测量的任意活性的至少10％、优选地15％、20％、25％、或30％，更优选地至少40％或50％，甚至更优选地至少60％、70％或75％，则在本发明的意义上，生物学活性得到保留。术语“因子VIII结合结构域”是指VWF的片段或一部分，其保留野生型血管性血友病因子的因子VIII结合活性的至少10％、优选地15％、20％、25％或30％，更优选地至少40％或50％、甚至更优选地至少60％、70％或75％。因子VIII结合结构域位于成熟VWF的N末端，例如在D’D3结构域或其片段中。
编码野生型血管性血友病因子的基因被转录成一段9kb的mRNA，其被翻译成为2813个氨基酸的前体-原多肽，分子量估计为310,000Da。所述前体-原多肽含有22个氨基酸长的信号肽，741个氨基酸的原多肽以及成熟亚基。从N末端切割741个氨基酸长的原多肽形成了由2050个氨基酸构成的成熟VWF。VWF前体-原多肽的氨基酸序列显示于SEQIDNO:2，并且也公布了若干变体，例如NCBI参考序列NP_000543.2。除非有其他说明，本申请中VWF残基的氨基酸编码都是根据SEQIDNO:2，即使VWF分子并不需要包含SEQIDNO:2的所有残基。成熟野生型VWF的氨基酸序列对应SEQIDNO:2的残基764至2813。如本文所使用的，术语“VWF”是指显示了上文提到的任意VWF功能的至少部分VWF活性的任何形式的VWF或其变体。
野生型VWF的原多肽包含多个结构域，其按下列顺序排列(原-VWF结构域D1-D4的结构域结构根据Schneppenheim和Budde(2011)JThrombosisHaemostasis9(Suppl.1)209-215,C结构域的结构域结构和命名根据Zhou等人(2012)Blood120,449-458):
D1-D2-D'-D3-A1-A2-A3-D4-C1-C2-C3-C4-C5-C6-CK
D1和D2结构域代表原肽，其被切割下而生成成熟VWF。分别地，D'结构域包含SEQIDNO:2的氨基酸764至865号；D’D3结构域包含SEQIDNO:2的氨基酸764至1241、764至1242、764至1247或764至1270、或者764和1241至1270之间的任意序列。羧基末端的90个残基包含与“胱氨酸结”蛋白质超家族同源的“CK”结构域。这些家族成员易于经二硫键发生二聚化。如Zhou等人确定的C末端结构域C1至C6对应着SEQIDNO:2中的残基2255至2333(C1)、2334至约2402(C2)、2429至2496(C3)、2497至2577(C4)、2578至2646(C5)及2647至2722(C6)。
野生型血管性血友病因子包含如SEQIDNO:2中所示的成熟血管性血友病因子的氨基酸序列，残基764至2813。只要能保留VWF的生物学活性，还可包含VWF的碱基添加，插入，N末端、C末端或内部的删除。如果具有删除和/或其他修饰的VWF保留了对野生型VWF所测量的任意活性的至少10％，优选地15％、20％、25％或30％，更优选地至少40％或50％，甚至更优选地至少60％、70％或75％，则在本发明的意义上，生物学活性得到保留。技术人员能够确定野生型VWF的生物学活性，例如使用测量瑞斯托霉素辅助因子活性的方法(FedericiAB等人，2004.Haematologica89:77-85),测量其与血小板糖蛋白复合物Ib-V-IX的GPIbα的结合的方法(Sucker等人，2006.ClinApplThrombHemost.12:305-310)，或胶原蛋白结合测定法(Kallas&Talpsep.2001.AnnalsofHematology80:466-471)，或例如通过表面等离子共振法测量胶原蛋白结合的方法。可使用的其他确定VWF生物学活性的方法包括确定FVIII结合能力(Veyradier等人，Haemophilia2011)。
术语“血液凝集因子VIII”、“因子VIII”和“FVIII”在本文交换使用。“血液凝集因子VIII”或“因子VIII”包括野生型血液凝集FVIII以及野生型血液凝集FVIII的衍生物或变体，其中野生型血凝FVIII的促凝活性至少得到了保留。衍生物可能具有类似于B结构域或部分B结构域的删除，与野生型FVIII的氨基酸序列相比的插入和/或添加。术语因子VIII包括蛋白切割加工形式的FVIII，例如包括重链和轻链的活化前双链形式，也包括未切割的单链因子VIII。
术语“因子VIII”包括任意FVIII变体或突变体，其保留野生型FVIII的生物学活性的至少10％，优选地至少15％、20％或25％，更优选地至少30％,40％或50％，最优选地至少60％、70％或甚至75％。
FVIII是以单个多肽链的形式合成的，分子量为约280kDa。当FVIII转位到内质网中时，氨基末端信号肽被去除，然后成熟的(即信号肽切割后的)原生FVIII分子在其分泌过程中在B和a3结构域之间或在B结构域内部受到蛋白水解切割。这导致释放出由约80kDa的C末端轻链与以金属离子依赖的方式相联系的约90-200KDa的N末端重链片段构成的异源二聚体(另见Kaufman的综述,TransfusionMed.Revs.6:235(1992))。
所述异源二聚体的生理学活化是通过凝血酶对蛋白质链进行蛋白水解性切割进行的。凝血酶将重链切割成90kDa的蛋白质，然后切割为54kDa和44kDa的片段。凝血酶将80kDa的轻链切割成72kDa的蛋白质。正是后者的蛋白质以及由钙离子结合在一起的两条重链片段(上文的54kDa和44kDa大小片段)组成了活性FVIII。当44kDa的A2重链片段从分子上解离或当凝血酶、活化的蛋白质C或FXa进一步切割所述72kDa和54kDa蛋白质时，则会失活。在血浆中，FVIII通过与摩尔量过量约50倍的血管性血友病因子蛋白质(“VWF”)相联系而得以稳定，后者似乎抑制了上文描述的FVIII的蛋白水解性降解。
FVIII的氨基酸序列组织成三个结构性结构域：三重复的A结构域，各有330个氨基酸，980个氨基酸的单个B结构域，以及双重复的C结构域，各有150个氨基酸。所述B结构域与其他蛋白质无同源性，并为该蛋白质提供了25个潜在的天冬氨酸(N)连接的糖基化位点中的18个。B结构域显然在凝集中没有功能，并且因为B结构域删除的FVIII分子仍然具有促凝活性而被删除。
作为非限制性实例，如本文使用的因子VIII包括提供了减少的或防止APC切割的FVIII突变体(Amano1998.Thromb.Haemost.79:557-563)，具有进一步稳定化的a2结构域的FVIII突变体(WO97/40145)，使表达增加的FVIII突变体(Swaroop等人，1997.JBC272:24121-24124)，免疫原性减少的FVIII突变体(Lollar1999.Thromb.Haemost.82:505-508)，由独立表达的重链和轻链重构的FVIII(Oh等人，1999.Exp.Mol.Med.31:95-100)，与受体结合减少致使FVIII样HSPG(硫酸乙酰肝素蛋白多糖)和/或LRP(低密度脂蛋白相关蛋白质)发生代谢的FVIII突变体(Ananyeva等人，2001.TCM,11:251-257)，二硫键稳定化的FVIII变体(Gale等人，2006.J.Thromb.Hemost.4:1315-1322)，分泌特性改善的FVIII突变体(Miao等人，2004.Blood103:3412-3419)，辅助因子特异性活性增加的FVIII突变体(Wakabayashi等人，2005.Biochemistry44:10298-304)，生物合成和分泌改善、ER伴侣蛋白相互作用减少、ER-高尔基体转运改善、活化增加或对失活抵抗增加以及半衰期改善的FVIII突变体(总结于Pipe2004.Sem.Thromb.Hemost.30:227-237)，以及不可由弗林蛋白酶切割的单链FVIII突变体。所有这些FVIII突变体和变体都以其全文并入本文作为参考。
优选地，因子VIII包含SEQIDNO:6中所示的FVIII全长序列，更优选地，所述因子VIII是具有B结构域的部分或全部删除的FVIII的变体。只要至少部分保留FVIII的生物学活性，还包含FVIII的添加，插入，N末端、C末端或内部的删除。如果具有修饰的FVIII保留了野生型FVIII的生物学活性的至少10％，优选地15％、20％或25％，更优选地至少30％、40％或50％，最优选地至少60％、70％或甚至75％，则在本发明的意义上，生物学活性得到保留。本领域技术人员能够如下文描述的方法确定F因子VIII的生物学活性。
确定因子VIII生物学活性的合适测试是例如一步凝集测定法(Rizza等人，1982.CoagulationassayofFVIII:CandFIXainBloomed.TheHemophilias.NYChurchchillLivingston1992)或(两步)发色底物FVIII活性测定法(S.Rosen,1984.ScandJHaematol33:139-145,suppl.)。这些参考文献的内容并入本文作为参考。
成熟野生型形式的人血液凝集FVIII的氨基酸序列显示于SEQIDNO:6。参考特定序列中某一氨基酸位置指的是所述氨基酸在FVIII野生型蛋白质中的位置，并且不排除在所参考序列的其他位置存在突变，如删除、插入和/或置换。例如，参考SEQIDNO:6序列的残基2004的突变不排除在所修饰的同源物中在SEQIDNO:6的位置1直到2332缺失一个或多个氨基酸。
上文定义中的“因子VIII”和/或“VWF”还包括天然的等位基因变异，其可在个体之间存在和发生，并包括来自其他哺乳动物物种的FVIII，如猪FVIII。上文定义中的“因子VIII”和/或“VWF”进一步包括FVIII和/或VWF的变体。这些变体与野生型序列有一个或多个氨基酸残基的差异。这些差异的实例可包括保守性氨基酸置换，即，在具有类似性质的氨基酸组内的置换，例如(1)小氨基酸、(2)酸性氨基酸、(3)极性氨基酸、(4)碱性氨基酸、(5)疏水氨基酸和(6)芳香氨基酸。这些保守性置换的实例显示于下文表1。
表1:
在FVIII或VWF中，术语“保守残基”涉及进化保守的残基，即，在至少两种、优选地至少三种哺乳动物序列中在相应位置上是相同的残基或保守性置换。
术语FVIII、VWF或其结构域的“变体”是指蛋白质或结构域，其分别与SEQIDNO6或2中所示的序列或序列相关部分具有至少50％序列同一性、优选地至少55％、60％、65％、70％、75％或80％的序列同一性，更优选地至少82％、84％、85％、86％或88％的序列同一性，甚至更优选地有至少90％、92％、94％、95％的序列同一性，前提是所述变体分别保留了蛋白质或其结构域的生物学活性的至少10％，优选地至少15％、20％、25％或30％，更优选地至少40％或50％，甚至更优选地至少60％、70％或75％。人们认识到特定位置可能比其他位置更适合变化。例如，VWF的CK结构域的变体需要在位置2773保留半胱氨酸(或其等同物)，这一点似乎对于形成二聚体至关重要。CK结构域的其他半胱氨酸残基(Zhou等人(2012)Blood120,449-458),以及VWF及FVIII的其他结构域也可能至关重要。
为确定序列同一％性，使用合适的序列比对程序对这些序列进行比对，如GCG工具包的GAP程序，使用缺省参数(Devereux等人(1984)NuclAcidsRes12,387)。可用来比对序列的其他程序包括FASTA(Lipman&Pearson(1985)Science227,1436-1441)、BLAST(Altschul等人(1990)JMolBiol215,403-410)及ClustalW(Thompson等人(1994)NuclAcidsRes22,4673-4680)。
在本发明的一个实施方式中，由FVIII中通过遗传工程引入FVIII的半胱氨酸残基与VWF中的半胱氨酸残基(其可以是野生型VWF序列中发现的半胱氨酸，也可以是通过遗传工程化引入VWF序列中适当位置)形成二硫桥而建立共价连接。
本发明的一个优选的实施方式涉及共价复合物，其包含半衰期延长的VWF和因子VIII，其中通过将至少一个天然存在的氨基酸用半胱氨酸残基置换或在FVIII中适当位置插入至少一个半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基与VWF中的半胱氨酸残基形成二硫桥，而对因子VIII进行修饰(图3)。
因此，根据本发明，所述复合物的因子VIII组分的氨基酸序列与SEQIDNO:6所示的野生型FVIII的氨基酸序列不同。经修饰的因子VIII具有至少一个突变，例如天然存在的氨基酸被半胱氨酸置换，或在适当位置例如在a3结构域或C末端结构域中插入半胱氨酸残基。因此，本发明复合物的因子VIII中可以有一个或更多，例如两个、三个、四个、五个或更多的其他半胱氨酸残基；更优选地，只引入了一个或两个其他的半胱氨酸残基，最优选地，引入了一个其他的半胱氨酸残基。
更优选地，因子VIII中被置换的天然存在的氨基酸是a3结构域中的氨基酸。更优选地，因子VIII中被置换的天然存在的氨基酸位于FVIIIa3结构域的氨基酸1653至1660中、或氨基酸1667至1674中、或氨基酸1675至1688中。更优选地，a3结构域中的天然存在的氨基酸是酸性残基，优选地为保守的酸性残基，或涉及血友病表型的残基，或Tyr残基，其可以在FVIIIa3结构域中被硫化。甚至更优选地，a3结构域中被半胱氨酸置换的天然存在的氨基酸选自SEQIDNO:6中的E1649、D1658、E1660、D1663、Y1664、D1665、D1666、E1671、E1675、D1676、D1678、I1679、Y1680、E1682、D1683、E1684，甚至更优选地，选自T1653、L1655、D1658、E1660、S1669、V1670、N1672、K1673、K1674、E1675、D1676和/或N1685，或等同位置，例如在遗传工程化形式的因子VIII中。最优选地，a3结构域中被半胱氨酸置换的天然存在的氨基酸选自SEQIDNO:6中的T1654、Q1656、F1677、D1678、I1679、Y1680、D1681、E1682、D1683、E1684、Q1686、S1687和/或P1688，或等同位置，例如在遗传工程化形式的FVIII中。
优选地，VWF中的天然存在的氨基酸是根据按实施例6中所示实验评估的共价结合的因子VIII与VWF的相对比率高于0.5以及按实施例9中所示实验评估的因子VIII的活性而选择的。最优选地，VWF中的天然存在的氨基酸是根据所述比率高于1.0而选择的。
在本发明第一个方面的另一个优选的实施方式中，所述被半胱氨酸置换的天然存在的氨基酸在FVIII的C末端结构域中，优选地为FVIII区域中氨基酸2051和2270之间的氨基酸，更优选地，所述残基选自SEQIDNO:6中的I2098、S2119、N2129、R2150、P2153、W2229、Q2246，或等同位置，例如在工程化形式的FVIII中。
在本发明第一个方面的一个进一步优选的实施方式中，还通过用半胱氨酸残基置换天然存在的氨基酸，或插入半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基与引入因子VIII的半胱氨酸残基形成二硫桥，而修饰VWF。VWF中天然存在的氨基酸是D或D3区域中的残基，优选地为D’或D3区域中的碱性残基或D’或D3区域中的保守残基或参与N型VWD的残基或暴露于VWF分子表面的氨基酸。在本发明一个优选的实施方式中，半胱氨酸残基被插入到TIL’构域、E’构域、VWD3结构域、C8-3结构域、TIL-3结构域或E-3结构域中，或者VWF中被半胱氨酸残基所置换的天然存在的氨基酸为TIL’构域、E’构域、VWD3结构域、C8-3结构域、TIL-3结构域或E-3结构域中的残基(这些结构域如Zhou等人(2012)Blood120(2)449-458所定义)。例如，VWF中天然存在的氨基酸选自R768、R782、R816、R820、R826、R852、R854、R906、R924、R945、R960、R976、R1035、H817、H831、H861、H874、H916、H952、H977、H1047、K773、K790、K834、K843、K855、K882、K912、K920、K922、K923、K940、K948、K968、K985、K991、K1026、K1036、K1052、K1073、G785、M800、D879、Q1053、E1078、E787、A789、T789、T791、Q793、N794、Y795、P828、F830、E835、P838、D853、W856、L884。优选地，VWF中天然存在的氨基酸选自SEQIDNO:2中的T795、R816、D879、D951、E1161和/或R1204，或者等同位置，例如在工程化形式的VWF中。更优选地，VWF中天然存在的氨基酸选自SEQIDNO:2中的R768、R782、H817、D853、E933、L984、E1015、D1076、E1078、P1079、K1116和/或N1134，或者等同位置，例如在工程化形式的VWF中。
优选地，VWF中天然存在的氨基酸是根据按实施例6中所示实验评估的共价结合的因子VIII与VWF的相对比率高于0.5以及按实施例9中所示实验评估的因子VIII的活性而选择的。最优选地，VWF中的天然存在的氨基酸是根据所述比率高于1.0而选择的。
优选地，引入对FVIII和VWF中天然存在的氨基酸残基的置换的一种或多种以下组合：A/T789C:D1658C、M800C:D1658C、P828C:D1658C、F830C:D1658C、P838C:D1658C、D853C:D1658C、R924C:D1658C、E1078C:D1658C、F830C:D1663C、P838C:D1663C、D853C:D1663C、E1078C:D1663C、E1078C:Y1664C、P838C:D1665C、R816C:D1666C、F830C:D1666C、E835C:D1666C、T791C:E1671C、F830C:E1671C、E835C:E1671C、D879C:E1671C、A/T789C:E1675C、T791C:E1675C、N794C:E1675C、P828C:E1675C、F830C:E1675C、E835C:E1675C、P838C:E1675C、D879CE1675C、R924C:E1675C、E1078C:E1675C、A/T789C:D1676C、T791C:D1676C、N794C:D1676C、F830C:D1676C、E835C:D1676C、A/T789C:D1678C、F830C:D1678C、E835C:D1678C、A/T789C:I1679C、M800C:I1679C、F830C:I1679C、E835C:I1679C、R854C:I1679C、D879C:I1679C、A/T789C:Y1680C、T791C:Y1680C、Y795C:Y1680C、M800C:Y1680C、R816C:Y1680C、F830C:Y1680C、E835C:Y1680C、R854C:Y1680C、D879C:Y1680C、A/T789C:E1682C、Y795C:E1682C、R816C:E1682C、P828C:E1682C、E835C:E1682C、P838C:E1682C、R854C:E1682C、D879C:E1682C、Q1053C:E1682C。
更优选地，引入FVIII和VWF中天然存在的氨基酸残基的置换的一种或多种以下组合：F1677C:R768C、I1679C:R768C、Y1680C:R768C、N1685C:R768C、T1654C:R782C、E1675C:R782C、N1685C:R782C、Q1686C:Y795C、S1687C:Y795C、P1688C:Y795C、P1688C:Y795C、E1675C:H816C、D1676C:R816C、Y1680C:R816C、E1682C:R816C、P1688C:R816C、Y1680C:H817C、N1685C:H817C、Q1686C:H817C、S1687C:H817C、I1679C:P828C、Y1680C:D853C、N1685C:D853C、T1654C:D879C、P1688C:E933C、P1688:T951C、T1653C:L984C、T1654C:L984C、L1655C:L984C、S1669C:L984C、K1673C:L984C、D1683C:L984C、T1653C:E1015C、L1655C:E1015C、S1669C:E1015C、V1670C:E1015C、N1672C:E1015C、K1673C:E1015C、D1678C:E1015C、I1679C:E1015C、E1684C:E1015C、S1687C:E1015C、F1677C:V1027C、I1679C:V1027C、P1688C:V1027C、S1657C:D1076C、K1673C:D1076C、D1676C:D1076C、F1677C:D1076C、I1679C:D1076C、E1682C:D1076C、D1683C:D1076C、Q1686C:D1076C、D1676C:E1078C、I1679C:E1078C、Y1680C:E1078C、T1653C:P1079C、L1655C:P1079C、S1657C:P1079C、D1658C:P1079C、E1682C:P1079C、V1670C:K1116C、K1673C:K1116C、D1676C:K1116C、D1678C:K1116C、D1681C:K1116C、Q1686C:K1116C、P1688C:K1116C、T1653C:N1134C、L1655C:N1134C、E1660C:N1134C、D1678C:N1134C、D1683C:N1134C、E1684C:N1134C、Q1686C:N1134C、T1653C:E1161C、L1655C:E1161C、K1674C:E1161C、D1676C:E1161C、E1684C:E1161C、S1687C:E1161C、P1688C:R1204C。
最优选地，引入FVIII和VWF中天然存在的氨基酸残基的置换的一种或多种以下组合:T1654:P1079、T1654:N1134、Q1656:D1076、F1677:K1116、D1678:R782、I1679:K1116、Y1680:H817、Y1680:D853、Y1680:E1078、D1681:R768、E1682:R768、D1683:R768、E1684:R768、Q1686:R768、Q1686:E1015、S1687:R768、S1687:N1134、P1688:R768、P1688:H817、P1688:E933、P1688:L984、P1688:E1015、P1688:D1076和P1688:N1134。
优选地，VWF和因子VIII中一个或多个插入的半胱氨酸残基的组合中天然存在的氨基酸是根据按实施例6中所示实验评估的共价结合的因子VIII与VWF的相对比率高于0.5以及按实施例9中所示实验评估的因子VIII的活性而选择的。最优选地，VWF和因子VIII中一个或多个插入的半胱氨酸残基的组合中天然存在的氨基酸是根据所述比率高于1.0而选择的。
优选地，本发明复合物中的因子VIII是遗传工程化的因子VIII。所述工程化的因子VIII含有部分或全部的B结构域删除，其可以是包含一个或多个氨基酸置换、插入、删除或其组的突变的因子VIII，其可以是因子VIII的单链形式，或其可以是与半衰期延长部分如半衰期延长多肽(HLEP)的融合多肽。其还可以是化学修饰的因子VIII，例如通过连接半衰期延长部分如聚乙二醇(PEG化)、糖基化的PEG、羟乙基淀粉(HES化)、多唾液酸、弹性蛋白样多肽细菌肝素前体聚合物或透明质酸而修饰。其还可以是来自另一物种例如另一哺乳动物物种的因子VIII，如猪因子VIII。
优选地，本发明复合物中的VWF为半衰期延长形式的VWF。
如本文所使用的，术语“半衰期”表示相应蛋白质的功能半衰期，即，体内(即血液中)失去一半活性所花费的时间。
在一个优选的实施方式中，本发明复合物中半衰期延长形式的VWF是遗传工程化的VWF。更优选地，所述遗传工程化的VWF是VWF与半衰期延长部分如半衰期延长多肽(HLEP)的融合蛋白。
如本文所使用的，“半衰期增强多肽”或“半衰期延长多肽”(HLEP)是融合于目的蛋白质，特别是VWF，以延长其半衰期的部分。优选的HLEP选自：白蛋白，白蛋白家族成员，免疫球蛋白G的恒定区及其片段，能够在生理条件下结合白蛋白、白蛋白家族成员、以及免疫球蛋白恒定区的部分的多肽或脂类。其可为本文描述的全长半衰期增强蛋白质(例如白蛋白、白蛋白家族成员、免疫球蛋白G的恒定区)或者其一个或多个能稳定或延长所述凝集因子的治疗活性或生物学活性的结构域或片段。这些片段长度上可由长度为10个或更多氨基酸组成，或可包括至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约50、至少约100或更多来自HLEP序列的连续氨基酸，或可包括相应HELP的部分或所有的特定结构域，只要所述HLEP片段提供相比野生型VWF或因子VIII至少25％的功能半衰期延长。
所述HLEP可以是HLEP的变体。术语“变体”包括保守性或非保守性的插入、删除和置换，其中这些改变使得HLEP的半衰期延长特性至少得到部分维持。
具体而言，所提出的本发明的VWFHLEP融合构建体包括HELP的天然存在的多态性变体和HLEP片段。HLEP可源自任何脊椎动物，尤其是任何哺乳动物，例如人类、猴、牛、羊或猪。非哺乳动物HLEP包括但不限于鸡和鲑鱼。
优选地，所述半衰期延长部分选自白蛋白或者其变体或片段、免疫球蛋白恒定区或其变体及部分如Fc片段、具有大的流体动力学体积的溶剂化随机链(例如XTEN、同源氨基酸重复(HAP)或脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸重复(PAS))、afamin或其变体、甲胎蛋白或其变体、维生素D结合蛋白质或其变体、转铁蛋白或其变体、人绒毛促性腺激素β亚基的羧基端肽(CTP)，能够在生理学条件下结合白蛋白或免疫球蛋白恒定区的多肽或脂类。最优选地，所述HLEP为人血清白蛋白。
术语“人血清白蛋白”(HSA)和“人白蛋白”(HA)在本申请中交换使用。术语“白蛋白”和“血清白蛋白”的范围更广，并包括了人血清白蛋白(及其片段和变体)以及来自其他物种的白蛋白(及其片段和变体)。
如本文所使用的，“白蛋白”总体是指白蛋白多肽或氨基酸序列，或者白蛋白片段或变体，其具有白蛋白的一种或多种功能活性(如生物学活性)例如结合Ca2+、Na+、K+、Zn2+离子、脂肪酸、激素、胆红素或结合FcRn。具体而言，“白蛋白”是指人白蛋白或其片段，尤其本文SEQIDNO:7中所示的成熟形式的人白蛋白或来自其他脊椎动物的白蛋白或其片段，或这些分子的类似物或变体或其片段。
具体而言，所提出的本发明的VWF融合构建体可包括人白蛋白的天然存在的多态性变体和人白蛋白的片段。通常而言，白蛋白片段或变体长度至少为30个氨基酸，最优选地超过70个氨基酸。所述白蛋白变体可优选地由以下组成或备选地包含以下：白蛋白的至少一个完整结构域或所述结构域的片段，例如结构域1(SEQIDNO:7的氨基酸1至194)、结构域2(SEQIDNO:7的氨基酸195至387)、结构域3(SEQIDNO:7的氨基酸388至585)、结构域1+结构域2(SEQIDNO:7的氨基酸1至387)、结构域2+结构域3(SEQIDNO:7的氨基酸195至585号氨基酸)或结构域1+结构域3(SEQIDNO:3的氨基酸1至194+SEQIDNO:7的氨基酸388至585)。各结构域自身由两个同源的亚结构域组成，即1至105、120至194、195至291、316至387、388至491及512至585,其中弹性亚结构域内连接子包含残基Lys106至Glu119、Glu292至Val315和Glu492至Ala511。
本发明复合物中的VWF融合构建体的白蛋白部分可包含HA的至少一个亚结构域或结构域，或其保守性修饰。
在一个优选的实施方式中，将白蛋白N末端融合于修饰VWF的氨基酸序列的C末端。也即，本发明的复合物可包含以下结构：
mVWF-L-A
其中mVWF是如本文上文所描述的经修饰的VWF，L是可选的肽连接子序列，A是如本文上文限定的白蛋白。
本发明的经修饰的VWF或者FVIII与经修饰的VWF的复合物可包含多于一个HLEP序列，例如两个或三个HLEP序列。这些多重HLEP序列可以以串联(如连续重复)的形式融合至VWF的C末端。
HLEP还可通过肽连接子偶联于VWF。所述连接子应当是非免疫原性的，并且可是非可切割或可切割连接子。非可切割连接子可包括例如交替的甘氨酸和丝氨酸残基，如示例于WO2007/090584中。
VWF部分和HLEP部分之间的可能肽连接子还可由在人类蛋白质中起天然的结构域间连接子的肽序列组成。优选地，这些肽序列在其天然环境中位于靠近蛋白质表面的位置，并且免疫系统可以接近，因此人们可以认为有针对此序列的天然耐受。WO2007/090584中给出了一些实例。优选地，所述连接子区域包含VWF的序列，这使得表达的融合蛋白的新生抗原特性的风险降低。
可切割连接子应当有足够的可弹性以便被蛋白酶切割。所述连接子肽优选地被凝集系统的蛋白酶切割，例如FIIa、FIXa、FXa、FXIa、FXIIa和/或FVIIa。
HLEP还可为可非共价地结合于半衰期延长部分(如人类血浆中天然存在的蛋白质，例如白蛋白、免疫球蛋白)的肽。在此情况下，VWF会被修饰为(优选地在D’D3的C末端或N末端)具有结合半衰期延长部分的肽。
在本发明的另一个实施方式中，VWF的半衰期通过化学修饰而延长，例如连接半衰期延长部分如聚乙二醇(PEG化)、糖基化的PEG、羟乙基淀粉(HES化)、多唾液酸、弹性蛋白样多肽，细菌肝素前体聚合物或透明质酸。
本发明的另一个实施方式为因子VIII和半衰期延长的VWF的共价复合物，其中的因子VIII经由添加至因子VIII的其他肽或多肽序列而连接至VWF。优选地，所添加的序列包含一个或多个VWF结构域。
如上文提到的，在内质网的生物合成过程中，VWF原肽单体通过在不同C末端胱氨酸结构域(CK)之间形成的C末端二硫桥装配成二聚体。本发明人现在惊奇地发现当该CK结构域与因子VIII融合时，会使引入因子VIII的CK结构域与VWF中天然存在的CK结构域之间形成共价二硫键连接。因此，这提出了另一种新型的方式以获得本发明的因子VIII和VWF之间的共价复合物。当融合至因子VIII的VWF的部分包括其他的C结构域，共价连接形成效率可得到增强。这些可以是例如C5-C6结构域、C3-C6结构域或C1-C6结构域，如Zhou等人定义的(2012,Blood120,449-458),可选地，通过其他VWF结构域而延长。
因此，本发明的另一个实施方式是包含VWF和因子VIII的共价复合物，其中VWF为半衰期延长形式的VWF，其中VIII经修饰而含有VWF的C末端结构域CK，可选地包含其他VWF结构域。优选地，因子VIII在其C末端得到这样的修饰。更优选地，所述因子VIII(优选地在其C末端)包含SEQIDNO:2的残基2723至2813、2722至2813、2724至2813、2580至2813、2578至2813、2497至2813、2429至2813、2400至2813、2334至2813、2255至2813、1873至2813、1683至2813、1277至2813、1264至2813或764至2813或其变体，前提是保留半胱氨酸残基2773(或其对等物)。优选地，所述经修饰的因子VIII除了CK结构域外还包含VWF的C6、C5至C6、C4至C6、C3至C6、C2至C6或C1至C6结构域或其变体，如Zhou等人所定义(2012,Blood120,449-458)。可选地，所述CK和C结构域可由其他的VWF结构域而延长。
在本发明的另一个实施方式中，因子VIII在N末端与VWF的一个或多个C末端结构域融合(见图6)。这些C末端结构域可源于VWF的C末端胱氨酸结(CK)结构域并可另外包含VWF的C结构域、D结构域或A结构域中一种或多种，以至于可包含整个VWF序列(见图2中所示的VWF结构)。更优选地，所述因子VIII(优选地在其N末端)包含SEQIDNO:2的残基2723至2813、2722至2813、2724至2813、2580至2813、2578至2813、2497至2813、2429至2813、2400至2813、2334至2813、2255至2813、1873至2813、1683至2813、1277至2813、1264至2813或764至2813或其变体，前提是保留半胱氨酸残基2773(或其对等物)。在此实施方式中，在VWF结构域N末端添加信号肽，且将VWF结构域直接或通过多肽连接子融合至成熟因子VIII(无信号肽)的N末端。
优选地，VWF的C末端CK结构域(其可选地通过添加其他结构域而延长)通过可切割连接子连接至因子VIII。连接子序列可由一个或多个氨基酸构成，例如由1至200、1至150、1至100、1至50、1至30、1至20、1至15、1至10、1至5或1至3(例如1、2或3)个氨基酸构成，其可是彼此相同或不同的。通常，所述连接子序列在野生型凝集因子的对应位置并不存在。优选地，所述连接子为可切割连接子，即，其包含蛋白酶的切割位点，优选地，其包含可被与血液凝集相关的蛋白酶切割的切割位点，更优选地，所述可切割连接子包含凝血酶切割位点，甚至更优选地，其包含FVIII的凝血酶切割位点之一。
可切割连接子的实例如下
EDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRN(SEQIDNO:6(FVIII)的aa1675-1720)或
NTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHRSTRQKQFNATTIPEN(SEQIDNO:6的aa714-764)或
VVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLV(SEQIDNO:6的aa357-399)或
VVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYA(SEQIDNO:6的aa357-396)或
VVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWD(SEQIDNO:6的aa357-394)
只要保留可切割性，则还可包括以上的删除、插入和/或置换。
可选地，所述连接子还包含其他的氨基酸残基，优选地将后者引入源自VWF的结构域以及连接子的可切割部位之间。优选地，所述其他的氨基酸残基提供长度足以允许FVIII和VWF特别地分别经由a3区域及D’D3区域而发生相互作用的肽。所述其他的氨基酸残基可以超过10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120或150个氨基酸。优选地，所述其他的氨基酸残基形成了弹性的“非结构性”肽，更优选地，其包含甘氨酸-丝氨酸重复、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸重复、同源氨基酸重复或FVIIIB结构域的序列。
本发明的另一个实施方式为包含VWF和因子VIII的共价复合物，其中VWF为半衰期延长形式的VWF，其中因子VIII经修饰而含有VWF的D’D3区域，以及可选地VWF的其他结构域(见图5)。优选地，因子VIII被修饰为其部分或全部B结构域由VWFD’D3区域或其片段所取代(图5d和e)。更优选地，因子VIII包含SEQIDNO:2分别的残基764至1241、764至1242、764至1247或764至1270或者764和1241至1270之间的任何序列或者其变体或片段，优选地代替其(或其部分)B结构域。
优选地，VWF的D’D3结构域连接至因子VIII使得在该分子分泌进入细胞培养基时生成双链分子，并且使D’D3结构域位于因子VIII轻链的N末端。这一点可通过引入例如在因子VIIIa2结构域与VWFD’D3结构域之间含有PACE/弗林蛋白酶的切割位点的可切割连接子而完成(图5d和e)。可选地，该连接子在VWF的D’D3结构域与因子VIIIa3结构域之间包含其他的残基(图5e)。所述其他的残基包含长度足以允许因子VIII和VWF分别经由a3及D’D3区域而发生分子内相互作用的肽。优选地，所述其他的残基包含少于300、250、200、150、120、100、90、80、70、60、50、40、30、25、20、15或10个氨基酸。所述其他的氨基酸残基包含弹性的“非结构性”肽，优选地，其包含或甚至由以下组成：甘氨酸-丝氨酸重复、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸重复、或同源氨基酸重复或源自FVIIIB结构域的序列。
上文描述的实施方式指的是其成熟形式；本领域技术人员能够例如通过加入其他序列如在N末端的信号序列，而构建待表达蛋白质以获得所述成熟形式。
备选地，因子VIII的N末端连接至VWFD’D3结构域或其片段的C末端，可选地含有VWF的其他结构域(例如D1和D2结构域)，其优选地在N末端通过信号肽而延长。这将有助于其表达以及与半衰期延长的VWF的共价键的细胞内形成。更优选地，所述VWF部分在N末端包含SEQIDNO:2的残基1-1241或(在原肽切割后为)残基764-1241或者其变体或片段。
优选地，VWF的D’D3或D1D2D’D3结构域分别通过可切割连接子连接至因子VIII的N末端。更优选地，所述可切割连接子包含蛋白酶切割位点，更优选地，凝集系统的某种蛋白酶的切割位点，甚至更优选地凝血酶切割位点，优选地，FVIII的凝血酶切割位点之一。可选地，连接子在VWF的D’D3或D1D2D’D3结构域与因子VIII分子之间包含其他的残基，所述其他的残基包含长度足以允许FVIII和VWF分别经由a3及D’D3结构域而发生分子内相互作用的肽。优选地，添加超过20、30、40、50、70、100或150个其他的氨基酸。优选地，所述其他的氨基酸残基包含弹性的非结构性肽，更优选地，其包含或甚至由以下组成：甘氨酸-丝氨酸重复、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸重复、同源氨基酸重复或FVIIIB结构域的序列。
作为进一步的备选方案，将因子VIII的C末端与VWFD’D3结构域或其片段的N末端相连。这将有助于其表达以及与共表达的半衰期延长的VWF的共价键的细胞内形成。更优选地，所述VWF包含SEQIDNO:2分别的氨基酸764至1241、764至1242、764至1247或764至1270，或者764和1241至1270之间任意序列，或者其变体或片段。
优选地，VWF的D’D3结构域(或D1D2D’D3结构域)通过可切割连接子连接至因子VIII的N末端；在VWF结构域的N末端包含信号肽会使该蛋白质在哺乳动物细胞中表达时得到分泌。更优选地，所述可切割连接子包含凝血酶切割位点，优选地为FVIII的凝血酶位点之一，其由那些分别在SEQIDNO.6的氨基酸位置372、740和/或1689包含凝血酶切割位点的序列组成。
可选地，该连接子在VWF的D’D3结构域与因子VIII分子之间包含其他的残基，所述其他的残基包含长度足以允许因子VIII和VWF分别经由a3及D’D3区域而发生相互作用的肽。优选地，添加超过20、30、40、50、70、100、120或150个其他的氨基酸。优选地，所述其他的氨基酸残基包含弹性的非结构性肽，更优选地，其包含或甚至由以下组成：甘氨酸-丝氨酸重复、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸重复、同源氨基酸重复或FVIIIB结构域的序列。
具有不同连接子的所述融合蛋白的实例显示于SEQIDNO:144-177；其中每个所示的序列，即DNA及其翻译产物(融合蛋白)，以及根据遗传密码简并性而编码相同翻译产物的DNA序列(例如这些DNA序列的密码子优化版本)都是本发明的特定实施方式。然而，技术人员能够设计这类融合蛋白的更多实例，这些都在本发明的范围之内。
优选地，本发明复合物的VWF部分如天然状态下一样形成多聚体。出于特定原因，可能需要让复合物中的VWF部分形成不超过二聚体。这可通过删除VWF的原肽序列并将VWF信号肽直接融合于D’的N末端，而表达缺少原肽序列的VWF分子而完成。由于缺少原肽，通过D’D3结构域进行多聚化的过程将被阻断。出于其他特定原因，可能需要让复合物中的VWF部分形成不超过单体的结构。这可通过删除VWF的原肽序列并将VWF信号肽直接融合于D’，而表达缺少原肽序列的VWF分子，此外引入Cys2773向另一种合适的氨基酸如丙氨酸的突变而完成。
本发明的另一个实施方式是上文描述的任意实施方式的组合，以形成因子VIII/VWF复合物，其中在因子VIII和VWF的结合位点之间直接存在一个或多个共价键(优选地为二硫键)，且其中分子的因子VIII和VWF部分之间存在另一个共价键，并且一个或多个HLEP连接至因子VIII、VWF，或二者(图12)。所述因子VIII/VWF复合物可能具有优势，因为其与只在VIII和VWF部分之间有二硫键的复合物相比，以更高产率进行生产。
本发明的第二个方面是生产上文描述的因子VIII和VWF的共价复合物的方法，包括在真核细胞系中共表达因子VIII和VWF。因此，本发明还涉及编码形成本发明复合物的蛋白质的多肽。
术语“多核苷酸”通常是指任意多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，可以是未修饰的RNA或DNA或者经修饰的RNA或DNA。多核苷酸可为单链或双链DNA，单链或双链RNA。如本文所使用的，术语“多核苷酸”还包括包含一个或多个经修饰的碱基和/或稀有碱基如肌苷的DNA或RNA。应当理解的是可对DNA和RNA进行多种修饰，达到本领域技术人员已知的很多有用的目的。如本文所采用的，术语“多核苷酸”包含化学、酶学或代谢修饰形式的多核苷酸，以及病毒和细胞(包括例如简单和复杂细胞)特征性的DNA和RNA的化学形式。
技术人员会理解的是，由于遗传密码的简并性，给定的多肽可由不同多核苷酸编码。这些“变体”也包括在本发明内。
优选地，本发明的多核苷酸是分离的多核苷酸。术语“分离的”多核苷酸是指基本上不含其它核酸序列的多核苷酸，例如但不限于其它染色体或染色体外DNA和RNA。分离的多核苷酸可从宿主细胞中纯化而得。可使用技术人员已知的常规核酸纯化方法以获得分离的多核苷酸。该术语还包括重组的多核苷酸及化学合成的多核苷酸。
本发明进一步涉及一组核苷酸，其共同编码本发明的经修饰的VWF和/或经修饰的因子VIII，或者包含经修饰的VWF和/或经修饰的因子VIII的本发明的多肽。例如，该组中第一种多核苷酸可以编码经修饰的因子VIII的重链，第二种多核苷酸可以编码经修饰的因子VIII的轻链，而第三种多核苷酸可以编码经修饰的VWF。
而本发明的另一方面是包含根据本发明的多核苷酸的质粒或载体。优选地，所述质粒或载体为表达载体。在一个具体实施方式中，所述载体是用于人类基因治疗的转移载体。
本发明还涉及包含上文多核苷酸组的一组质粒或载体。第一种质粒或载体可含有所述第一种多核苷酸，而第二种质粒或载体可含有所述第二种多核苷酸。备选地，将两个或更多个编码序列通过使用分别的启动子序列或使用一个启动子和内部核糖体进入序列(IRES)元件，而克隆至一个表达载体内，以引导成为发明复合物的部分的超过一种蛋白质的表达。
本发明的另一方面是包含本发明的多核苷酸、质粒或载体，或者如本文描述的一组多核苷酸或一组质粒或载体的宿主细胞。
本发明的宿主细胞可在生产本发明共价复合物的方法中采用。所述方法包括：
(a)将本发明的宿主细胞在所需蛋白质复合物得到表达的条件下培养；以及
(b)可选地从宿主细胞或从培养基中回收所需的蛋白质复合物。
在合适的宿主细胞中生产高水平的重组突变体蛋白质要求根据本领域技术人员已知方法，在能在多种表达系统中繁殖的重组表达载体中，将上文提到的修饰的cDNA与合适的调控元件装配成有效的转录单元。有效的转录调控元件可源于将动物细胞作为其天然宿主的病毒或源于动物细胞的染色体DNA。优选地，可使用源自猴多瘤病毒40、腺病毒、BK多瘤病毒、人巨细胞病毒或Rous肉瘤病毒的长末端重复的启动子-增强子组合，或包括在动物细胞中为强组成型转录的基因如β-肌动蛋白或GRP78的启动子-增强子组合。为从cDNA上稳定转录高水平的mRNA，转录单元应当在其近3’端部分包括编码转录终止-多聚腺嘌呤化的DNA区域。优选地，此序列源自后多瘤病毒40早期转录区域，兔β球蛋白基因或人组织纤维蛋白原激活子基因。
然后可将所述cDNA整合入合适宿主细胞系的基因组以表达经修饰的因子VIII和/或VWF蛋白质，后者然后可装配成本发明的共价复合物。备选地，也可使用稳定的附加体载体，其在细胞中保持为染色体外元件。优选地，此细胞系应当为脊椎动物来源的动物细胞系，以确保正确的折叠、二硫键形成、天冬酰胺连接的糖基化以及其他翻译后修饰，并确保分泌进入培养基。其他翻译后修饰的实例为酪氨酸O-硫化及新生多肽链的蛋白水解加工。能够使用的细胞系的实例为猴COS细胞、小鼠L细胞、小鼠C127细胞、仓鼠BHK-21细胞、人HEK-293细胞以及仓鼠CHO细胞。
编码对应cDNA的重组表达载体可以以几种不同的方式被引入动物或人类细胞系中。例如，重组表达载体可由基于不同动物病毒的载体创造。实例为基于杆状病毒、牛痘病毒、腺病毒，优选地为牛乳头状牛病毒的载体。
编码对应DNA的转录单元还可与在动物细胞中可行使显性选择标记物功能的另一重组基因一同引入这些细胞以促进重组DNA整合入其基因组的特定细胞克隆的选择。此类型的显性选择标记物基因的实例是Tn5氨基糖苷磷酸转移酶，提供对遗传霉素(G418)的抗性,潮霉素磷酸转移酶,提供对潮霉素的抗性，以及嘌呤霉素乙酰基转移酶，提供对嘌呤霉素的抗性。编码所述选择性标记物的重组表达载体可位于与编码所需蛋白质的cDNA的相同载体上，或其可在与之同时引入并整合于宿主细胞基因组的分别的载体上编码，常常在不同转录单元之间形成紧密的物理连接。
其他可与编码所需蛋白质的cDNA一同使用的选择性标记物基因类型基于编码二氢叶酸还原酶(dhfr)的多种转录单元。在此类型的基因引入缺乏内源dhfr活性的细胞后，优选地为CHO细胞(DUKX-B11,DG-44)，所述基因会允许细胞在缺乏核苷的基质中生长。所述培养基的实例为不含次黄嘌呤、胸苷和甘氨酸的Ham’sF12。这些dhfr基因可与cDNA转录单元连接在相同载体上或在不同载体上一同被引入上文的CHO细胞类型，由此创造出能生产重组蛋白质的dhfr阳性细胞系。
如果上文细胞系在细胞毒性的抑制剂甲氨蝶呤存在下生长，则会出现抗甲氨蝶呤的新细胞系。由于所连的dhfr和所需蛋白质转录单元数量扩大，因此这些细胞系可以以增加的速率生产重组蛋白质。当在不断增加浓度的甲氨蝶呤(1-10000nM)下繁殖这些细胞系时，可获得以极高速率生产所需蛋白质的新细胞系。
上文生产所需蛋白质的细胞系可在悬浮培养或在多种固态支持物上大规模培养。这些支持物的实例是基于葡聚糖或胶原蛋白基质的微载体，或中空纤维形式的固态支持物，或多种陶瓷材料。在细胞悬浮培养或微载体上培养时，上文的细胞系可以以批式培养或灌注培养的方式进行，在很长时间内持续产生条件培养基。因此，根据本发明，上文细胞系很适合开发生产所需重组突变体蛋白质的工业化过程。
优选地，将本发明的复合物纯化至≥80％的纯度，更优选地≥95％的纯度，具体优选地为药学纯状态，即相对来自细胞培养基的污染性大分子(具体而言是其他蛋白质和核酸)而言超过99.9％的纯度，并不含感染性和热原性试剂。优选地，分离的或纯化的本发明的修饰的共价复合物基本上不含其他不相关多肽。
本发明的共价复合物在上文分泌细胞类型的培养基中积累，可通过多种生化和色谱方法进行浓缩和纯化，包括利用所需蛋白质和细胞培养基中其他物质在大小、电荷、疏水性、溶解性、特异性亲和力等方面的差异的方法。
所述纯化的一个实例为将重组突变体蛋白质吸附至单克隆抗体上，后者针对固定化于固态支持物上的如HLEP、优选地为人白蛋白，或相应的凝集因子。在复合物吸附至支持物上后，进行洗涤和解吸，所述蛋白质可通过基于上述特性的多种色谱技术进行进一步纯化。纯化步骤的顺序是根据例如这些步骤的容量和选择性，支持物的稳定性或其他方面而进行选择。优选的纯化步骤为例如但不限于离子交换色谱步骤、免疫亲和色谱步骤、亲和色谱步骤、疏水相互作用色谱步骤、染料色谱步骤、羟磷灰石色谱步骤、复合色谱步骤以及尺寸排阻色谱步骤。
为了最小化病毒污染的理论风险，可在加工中添加有效灭活和/或消除病毒的其他步骤。这些步骤例如是在液体或固体状态下进行热处理、用溶剂和/或去垢剂处理、可见或UV光谱的光辐照、γ辐射或纳米过滤。
本发明的经修饰多核苷酸(例如DNA)还可整合入转移载体用于人类基因疗法。
在本发明这一方面的另一个实施方式中，所述(修饰的)因子VIII和所述(修饰的)VWF是通过化学交联而共价连接的。
本发明的多种产物可用作医疗品。因此，本发明的第三个方面是上文描述的共价复合物用于医疗，具体而言是用于治疗或预防出血障碍。优选地，所述出血障碍为A型血友病或VWD。
本发明的第四个方面是包含上文描述的共价复合物的药学组合物。本发明描述的共价复合物可配制成药学制备物用于治疗用途。可将纯化的蛋白质溶解于常规的生理学相容的水性缓冲溶液，可选地向其中添加药学赋形剂以提供药学制备物。
所述药学载体和赋形剂以及合适的药学制剂在本领域熟知(见例如“PharmaceuticalFormulationDevelopmentofPeptidesandProteins”,Frokjaer等人，Taylor&Francis(2000)或“HandbookofPharmaceuticalExcipients”,第三版,Kibbe等人，PharmaceuticalPress(2000))。标准的药学制剂技术为本领域技术人员熟知(见例如2005Physicians’ThomsonHealthcare:Montvale,NJ,2004；Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,20thed.,Gennaro等人，Eds.LippincottWilliams&Wilkins:Philadelphia,PA,2000)。具体而言，包含本发明共价复合物的药学组合物可配制成冻干或稳定的液体形式。多肽变体可用本领域已知的多种步骤进行冻干。在使用前通过添加一种或多种药学可接受稀释剂如用于注射的灭菌水或灭菌生理盐水溶液，而重构冻干制剂。
通过任何药学合适的施用方式将组合物的制剂递送至个体。已知多种递送系统，并可用于以任意简便的途径施用所述组合物。优选地，将本发明的组合物进行系统性施用。为进行系统性使用，将本发明的复合物配制成用于根据常规方法进行肠道外(例如静脉、皮下、肌内、腹膜内、颅内、肺内、鼻内或透皮)或肠道(例如口腔、阴道或直肠)递送。最优选的施用途径为静脉和皮下施用。可通过输注或推注(bolusinjection)持续施用所述制剂。一些制剂包括缓释系统。
将本发明的共价复合物以治疗有效剂量施用于患者，所述治疗有效剂量指足以产生期望效果，防止或减少正在治疗病况或适应症的严重性或扩散，而不达到产生不可耐受的不利副作用的剂量。准确的剂量取决于许多因素，如适应症、制剂、施用模式，并需要对每种相应的适应症在临床前和临床试验中确定。
本发明的药学组合物可单独施用或与其他治疗性试剂一同施用。这些试剂可作为同一种药学制备物的部分并入。
本发明一个进一步的方面是通过向有需要的受试者施用有效量的上文描述的复合物而治疗或预防出血障碍。在另一个实施方式中，该方法包括向个体施用有效量的本发明的多核苷酸或者本发明的质粒或载体。备选地，所述方法可包括向个体施用有效量的本文描述的本发明的宿主细胞。
本发明将在下文非限制性实例中得到进一步描述。将结合附图对本发明的特定实施方式进行描述。
图1:a)成熟FVIII蛋白质的结构域结构；b)B结构域删除的成熟FVIII蛋白质的结构域结构；c)B结构域删除的单链成熟FVIII蛋白质的结构域结构。箭头显示了PACE/弗林蛋白酶切割位点，三角形表示产生活化的凝血酶切割位点。
图2:根据Zhou等人2012的原-VWF(A)和成熟VWF(B)的结构域结构。未显示VWF二聚化和多聚化。
图3:共价复合物的实例，其中因子VIII和VWF经由二硫桥连接。VWF结构域以灰色表示，因子VIII以白色表示。
图4:具有VWF结构域(包括VWFCK结构域的)的经修饰的FVIII的实例。FVIII用白色表示，VWF结构域以灰色表示。黑色三角形显示凝血酶切割位点，空心三角形显示引入连接子的蛋白酶切割位点。
图5:具有VWF结构域(包括D’D3结构域的)的经修饰的FVIII的实例。箭头显示了PACE/弗林蛋白酶切割位点，黑色三角形显示凝血酶切割位点，空心三角形显示引入连接子的蛋白酶切割位点。
图6:经修饰而具有其他VWF结构域的FVIII。符号意义如上文所阐明。
图7:通过化学交联而连接的共价复合物的实例。
图8:共价连接的FVIII-SC/VWF-FP分子的Western印迹。M，分子大小标记物。A，抗FVIII、B、抗VWF抗体印迹。
图9:纯化后的共价连接的FVIII-SC/VWF-FP分子在还原性SDS-PAGE上分离的情况(泳道1)及后续凝血酶切割后的情况(泳道2)。
图10:用抗VWF(A)和抗-FVIII(B)抗体对共价连接的FVIII-SC/VWF-FP多聚体分子进行多聚体凝胶分析。泳道1，血浆来源VWF；泳道2和3，表达共价连接的FVIII-SC/VWF-FP多聚体的两个克隆的上清；泳道4，rVWF-FP。
图11:大鼠中共价连接的FVIII-SC/VWF-FP多聚体(圆圈)的药代动力学分析。A，FVIII数据，B，VWF数据。
图12:具有以二硫桥以及(可选地经由肽连接子)的VWF与因子VIII的融合的构建体的实例。
序列列表:
SEQIDNO:1:人VWF的cDNA序列
SEQIDNO:2:人VWF的蛋白质序列
SEQIDNO:3:PCR引物VWF+
SEQIDNO:4:PCR引物VWF-
SEQIDNO:5:人FVIII的cDNA序列
SEQIDNO:6:成熟人FVIII的蛋白质序列
SEQIDNO:7:成熟的人血清白蛋白的蛋白质序列
SEQIDNO:8-143:如实施例中列出的多种用于诱变的引物和寡核苷酸。
SEQIDNO:144-177:具有多种含VWF-CK序列的人单链FVIII的融合蛋白的序列(DNA和蛋白质)，其通过多种连接子相连。
实施例
实施例1:生成在D’D3区域内具有半胱氨酸残基的VWF突变体
先前已经产生在其多克隆位点含有全长VWF的cDNA序列的表达质粒(pIRESpuro3；BDBiosciences,FranklinLakes,NJ,USA)(pVWF-2448)。该载体中包含的VWFcDNA序列如SEQIDNo.1所示，其相应的蛋白质序列如SEQIDNo.2所示。
为生成所述表达载体，使用引物组VWF+和VWF-(SEQIDNO.3和4)在本领域技术人员已知的标准条件(并且如CurrentProtocolsinMolecularBiology,AusubelFM等人，(eds.)JohnWiley&Sons,Inc.；http://www.currentprotocols.com/WileyCDA/中描述的)下通过聚合酶链反应(PCR)从含VWFcDNA的质粒(如商业可得的，例如来自ATCC的pMT2-VWFATCC,No.67122)中扩增VWFcDNA。可用限制性内切酶EcoRI消化所得到的PCR片段并连接至已经由EcoRI进行线性化的表达载体pIRESpuro3。筛选出的插入片段方向正确的所得表达载体在适合VWF表达的CMV启动子下游含有VWF的野生型cDNA。
为向VWF序列引入突变，根据下文试剂盒制造商建议的操作流程对质粒pVWF-2448进行了定点诱变(QuickChangeXLSiteDirectedMutagenesisKit,AgilentTechnologies,LaJolla,CA,USA)。对每个诱变反应，混合5μl的10x反应缓冲液、1μl的质粒DNApVWF-2448(50ng)、相应两条诱变寡核苷酸各1μl(10pmol/μl)、1μldNTPMix、3μlQuick-Solution、1μlTurboPolymerase(2.5U/μl)和37μlH2O，并进行聚合酶链反应，起始变性步骤为95℃2min，接着为18个循环的a)95℃变性50秒，b)60℃退火50秒，以及c)68℃延伸14min，接着是终止延长期，68℃7min。随后加入1μl的试剂盒的DpnI酶，在37℃下将反应继续孵育60min。此后，将3μl的诱变反应物转化到大肠杆菌感受态细胞中(例如XL10Gold,AgilentTechnologies)。分离克隆，提取质粒DNA并通过DNA测序确认VWF序列的突变。
下表列出了用于VWFcDNA序列诱变的寡核苷酸以及引入的相应突变。
使用上文描述的操作流程和质粒并应用本领域技术人员已知(并且如例如CurrentProtocolsinMolecularBiology中描述的，同上)的分子生物学技术，技术人员可建立其他在SEQIDNo.2内部任意氨基酸残基处突变的构建体。
为了达到半衰期延长的目的，这些实施例中选择了白蛋白融合至VWF。这由后缀FP表示。
为生成VWF和VWF突变体的白蛋白融合子，与WO2009/156137中描述的实施例类似地插入连接子和白蛋白cDNA序列。
为生成含有VWF突变体(其不含原肽序列)的表达盒，使用SEQID54和55的引物按上文描述的方法进行诱变。
这会产生VWF序列，其中信号肽(SEQIDNO.2的氨基酸1至22)直接融合至D’区域(SEQIDNO.2的氨基酸764)。
下表中列出在分散方式与VWFD’D3结构域的半胱氨酸交换的残基:
实施例2:生成在a3结构域中具有半胱氨酸残基的FVIII突变体
克隆到表达质粒中的任意FVIIIcDNA序列可用于向a3结构域中引入Cys突变。优选地，使用了部分B结构域缺失的单链FVIII构建体(见WO2004/067566的实施例)。
为生成FVIII表达载体，使用引物组SEQIDNO56和57在本领域技术人员已知的标准条件下(并且如例如在CurrentProtocolsinMolecularBiology,AusubelFM等人，(eds.)JohnWiley&Sons,Inc.；http://www.currentprotocols.com/WileyCDA/中描述的)通过聚合酶链反应(PCR)从含FVIIIcDNA的质粒中扩增FVIII的cDNA。可用限制性内切酶NheI和NotI消化所得PCR片段并连接至已经由NheI和NotI惊喜线性化的表达载体pIRESpuro3(BDBiosciences,FranklinLakes,NJ,USA)。所得表达载体将在CMV启动子下游含有FVIII的cDNA并且适合在动物细胞培养物中表达FVIII。
为了向FVIII序列引入突变，根据下文试剂盒制造商建议的操作流程对所述FVIII表达质粒进行定点诱变(QuickChangeXLSiteDirectedMutagenesisKit,AgilentTechnologies,LaJolla,CA,USA)。
下表列出了用于FVIIIcDNA序列诱变的寡核苷酸以及引入的相应突变。
使用上文及WO2004/067566中描述的操作流程和质粒并应用本领域技术人员已知的(并且例如在CurrentProtocolsinMolecularBiology中描述的，同上)分子生物学技术，技术人员可建立在FVIII的a3结构域内有任意其他氨基酸残基的突变的构建体。
下表列出与因子VIIIa3、C1和C2结构域中半胱氨酸交换的残基。
实施例3:生成具有VWF来源的C末端延伸的FVIII分子的表达载体
使用本领域技术人员已知的分子生物学方法生成在羧基末端添加了VWF结构域或片段的FVIII分子。将这些分子用于与VWF-FP共转染以生成含有经修饰的FVIII及VWF-FP的异源二聚体，二者在这两种蛋白质的C末端经由CK结构域共价连接。
对于所述FVIIIcDNA，用以下引物进行扩增
We4323
GTGGCTAGCGCATGGAAATAGAGCTCTCCAC(SEQIDNO:82)
We4324
CACGCGGCCGCGTTACCGGTGTAGAGGTCCTGTGCCTCGC(SEQIDNO:83)
将所得PCR片段插入合适的表达载体，例如由NheI和NotI打开的pIRESpuro3(同上)。通过所得的AgeI和NotI位点，插入了分别用以下引物对通过PCR扩增的VWF来源的C末端结构域C3-C4-C5-C6-CK(VWF氨基酸2400至2813)、C5-C6-CK(VWF氨基酸2544至2813)或单独CK结构域(VWF氨基酸2724至2813)的编码序列
We4264
GTGACCGGTAACTCCACAGTGAGCTGTCCC(SEQIDNO:84)
We4267
ACAGCGGCCGCTATCACTTGCTGCACTTCCTGG(SEQIDNO:85)和
We4265
GTGACCGGTCAAAGGAACGTCTCCTGCCC(SEQIDNO:142)
We4267
ACAGCGGCCGCTATCACTTGCTGCACTTCCTGG(SEQIDNO:85)和
We4266
GTGACCGGTTGCAACGACATCACTGCCAG(SEQIDNO:86)
We4267
ACAGCGGCCGCTATCACTTGCTGCACTTCCTGG(SEQIDNO:85)。
这产生了含有具有C末端延长的FVIIIcDNA的表达载体，所述C末端延长分别是VWFC末端结构域C3-C4-C5-C6-CK、C5-C6-CK或CK
向AgeI限制性位点引入可切割连接子序列会在FVIII活化过程中从VWF-FP释放出FVIII。所述连接子序列选自FVIII的凝血酶切割位点之一周围的序列，但任意其他凝血酶切割位点(如WO03/035861描述的)也可使用。作为实例，以下cDNA序列显示凝血酶切割位点372和1689:
CS372(SEQIDNO:87):
5’ACCGGTGATGACAACTCTCCTTCCTTTATCCAAATTCGCTCA
GTTGCCAAGAAGCATCCTAAAACTTGGACCGGT3’
CS1689(SEQIDNO:88):
5’ACCGGTGATGAGGATGAAAATCAGAGCCCCCGCAGCTTTCA
AAAGAAAACACGACACTATTTTATTGCTGCAGTGGAGAGGCTC
TGGACCGGT3’
这些序列可使用在其末端含有AgeI限制性位点的合适PCR引物进行扩增。然后用AgeI切割PCR片段并插入上文描述的AgeI打开的表达载体。
技术人员可使用类似的手段构建含有FVIIIcDNA分子的表达质粒，其中B结构域或其部分由VWFD’D3区域取代，或其中VWFD’D3区域直接或经由连接子而连接至FVIII的N末端或C末端。
实施例4:在CHO细胞中转染用于稳定表达VWF突变体的质粒
基于pIRESneo3的表达质粒在XL10Gold(AgilentTechnologies)中培养并使用标准操作流程进行纯化(Qiagen,Hilden,Germany)。
使用标准方法例如核转染或脂质体转染来转染CHO细胞，优选地为CHO-K1细胞，并选择表达所需VWF-FP突变体的单克隆。
为恰当地切割VWF原肽，将编码蛋白酶弗林蛋白酶(NM002569.2)的表达质粒与VWF质粒以1:4(弗林蛋白酶:VWF突变体)的摩尔比率共转染。
实施例5:表达VWF-FP突变体的CHO细胞的转染及FVIII突变体的瞬时表达
如上文描述的，纯化FVIII突变体表达质粒。根据标准方法向稳定的VWF-FP变体的CHO克隆中进行瞬时转染(实施例4)。
离心分离细胞与上清以收获瞬时转染物。将上清分装成等分试样并定性重组产物。
下表描述了FVIII突变体表达质粒(第1列)瞬时转染进入稳定表达VWF-FP突变体(第2列)的CHO细胞的代表性结果。挑选结果使得共价连接的FVIII抗原与总FVIII活性之比(第7列)或共价连接的FVIII抗原与总FVIII抗原之比(第8列)等于或大于1.0，这是我们用于选择最优选的突变体组合的标准。
共价连接的FVIII抗原的量由实施例6中描述的测定法确定，FVIII和VWF活性及抗原由描述于实施例9和10中描述的测定法确定。
1每ml相对毫单位
实施例6:通过Elisa检测共价连接至VWF突变体的FVIII突变体
用AmiconUltracell-30K(MilliporeUFC903024；3000g离心)浓缩来自瞬时转染物的细胞培养物上清样品(10ml)。用标准ELISA方法确定培养物上清(浓缩物)中共价连接至VWF-FP的FVIII。简言之，在室温下孵育每孔有100μl捕获抗体(兔抗人VWF-IgG,DakoA0082[Dako,Hamburg,Germany],1:2000稀释于缓冲液A[SigmaC3041,Sigma-Aldrich,Munich,Germany])的微孔板过夜。用缓冲液B(SigmaT9039)洗板三次，每孔用200μl缓冲液C(SigmaT6789)在室温下孵育1.5小时(封闭)。在用缓冲液B再次洗涤三次的步骤后，用缓冲液B对测试样品进行系列稀释，并系列稀释对照共价连接FVIII-VWF-FP的制备物，(缓冲液B中为2.0至0.03相对U/ml(我们称其为“相对单位”，因为其可能并不对应用标准人血浆确定的标准FVIII单位)；每孔体积为:100μl))，将二者室温下孵育1.5小时。用缓冲液B洗涤三次的步骤后，将200μl的350mMCaCl2加入各孔并在室温下孵育1小时。移除(但不洗涤)CaCl2并向各孔加入另外的200μl，再孵育1小时。经过缓冲液B洗涤三次的步骤后，向各孔中加入100μl的1:2稀释于缓冲液B的检测抗体(FVIII:C的检测抗体,过氧化物酶标记,CedarlaneCL20035K-D)在室温下孵育1小时。用缓冲液B洗涤三次的步骤后，向各孔中加入100μl的底物溶液(OUVF,SiemensHealthcareDiagnostics)，室温下避光孵育15分钟。加入100μl未稀释的终止稀释液(OSFA,SiemensHealthcareDiagnostics)制备样品，用于在合适的微孔板读数仪中在450nm下读取数值。然后使用对照制备物得到的标准曲线计算测试样品的浓度。
实施例7:用Western印迹和考马斯亮蓝染色来检测共价连接至VWF突变体的FVIII突变体
备选地，通过染色或Western印迹检测共价复合物。在还原或非还原条件下用变性SDS-PAGE检测样品，随后进行Western印迹分析。为检测FVIII，使用了自制的小鼠抗FVIII的单克隆抗体混合物，随后使用偶联有碱性磷酸酶的抗小鼠二抗(Invitrogen)，为检测VWF，使用HRP标记的多克隆兔抗人VWF抗体(Fa.DakoP0226)。
图8显示了通过上文描述的两条准则共价连接至rVWF-FP二聚体的FVIII(FVIII-单链)的非还原性SDS-PAGE的Western印迹分析。A：使用抗FVIII抗体检测，B：使用抗VWF抗体。
泳道1代表连接的物质，其中FVIII部分通过连接至其C末端的源自VWF的C3-C4-C5-C6-CK序列连接至VWF-FP二聚体，而FVIII和C3-C4-C5-C6-CK序列之间有其他的凝血酶切割位点。如实施例8中描述的特异性Elisa方法测量的共价FVIII与总FVIII活性的比率为5.78，与总FVIII抗原之比为7.47。抗FVIII和抗VWF抗体都能显示出超过460kDa的高分子量条带，这证明了共价连接的FVIII-VWF-FP复合物的存在。M表示分子大小标记物。泳道2和3分别代表FVIII-SC和VWF-FP的对照制备物。
泳道4和5代表通过相应Cys突变在FVIIIa3和VWF-FPD3之间的二硫桥连接的共价复合物。泳道4代表FVIII-SCI1679C突变体连接至VWF-FPE1078C突变体。泳道5代表FVIII-SCI1675C突变体连接至VWF-FPE1078C突变体。泳道6是只含有VWF-FP突变体E1078C的对照制备物。印迹证明除了游离的FVIII分子外，存在相互共价连接的高分子量FVIII-VWF-FP复合物。
图9显示了还原性SDS-PAGE，用GelcodeBlueStain反应剂染色。泳道1含有共价连接至rVWF-FP二聚体的纯化的FVIII(FVIII-单链)，泳道2显示相同制备物在凝血酶在消化后释放出在连接子序列中的共价连接的FVIII部分，同时活化了FVIII。泳道1中条带代表共价复合物及FVIII二聚体，泳道2中的主要条带位于268和460kDa的标记物之间，代表了VWF-FP部分，而在71KDa以下范围的条带代表FVIII片段。
实施例8:FVIII至VWF的化学交联
在含有优选地生理学NaCl和CaCl2浓度的水缓冲溶液中，在恒定的温度优选地4℃和37℃下，FVIII与分子量为500Da至100KDa之间的双特异性双琥珀酰胺酯(PEG)n发生反应，FVIII与交联剂的摩尔比为2:1至1:1000(优选地为约1:1)。FVIII浓度优选地低至使FVIII与自身的交联达到最小。在1min至60min后，将半衰期延长的VWF加至FVIII溶液，以VWF的单体构建单元计摩尔过量为2:1至200:1。在上文给定温度下，孵育1至300min，然后使用优选地低分子量的含有伯胺基团的化合物淬灭残留的反应剂，然后使用本领域专业人员已知的方法纯化FVIII和VWF的共价化合物，移除未反应的FVIII或FVIII寡聚体以及未反应VWF。不同孵育步骤的反应次数和温度由本领域专业人员已知的方法进行优化，例如，通过使用SDS-PAGE/Western印迹分析(使用抗FVIII或抗VWF抗体)，以达到所需共价化合物含量最大化，而副产物含量最小化的目标。
不同反应剂可用于经修饰的FVIII和VWF分子之间的化学交联。其基于FVIII和VWF的不同反应性基团的交联:
a)胺-胺交联剂(例如双亚氨酸酯(PEG)n或双琥珀酸酯(PEG)n)
b)羧基-羧基交联剂
c)巯基-巯基交联剂(例如双马来酰亚胺(PEG)n)
d)碳水化合物-碳水化合物交联剂
e)-巯基交联剂
f)巯基-碳水化合物交联剂
g)巯基-羟基交联剂
h)羧基-胺交联剂
实施例9:因子VIII活性和抗原的分析
为体外FVIII:C活性测定，可使用凝集测定法(例如DadeBehring,Germany提供PathromtinSL反应剂及的FVIII缺乏血浆)或发色测定法(例如Haemochrom提供的CoamaticFVIII:C测定法)。这些测定根据制造商说明书进行。
用标准ELISA确定FVIII抗原(FVIII:Ag)。简言之，孵育每孔有100μl捕获抗体(羊抗人FVIIIIgG,CedarlaneCL20035K-C,1:200稀释于缓冲液A[SigmaC3041])的微孔板，室温下2小时。用缓冲液B(SigmaP3563)洗板三次，用样品稀释缓冲液(Cedarlane)对测试样品进行系列稀释，并用样品稀释缓冲液系列稀释FVIII制备物(CSLBehring；200至2mU/mL)每孔体积为:100μl，将二者室温下孵育2小时。用缓冲液B洗涤三次后，向各孔中加入100μl的1:2稀释于缓冲液B的检测抗体(羊抗人FVIIIIgG,CedarlaneCL20035K-D,过氧化物酶标记)在室温下再孵育1小时。经过缓冲液B洗涤三次的步骤后，向各孔中加入100μl的底物溶液(1:10(v/v)TMBOUVF:OUVG溶于TMB缓冲液,DadeBehring)，室温下避光孵育30分钟。加入100μl终止溶液(DadeBehring,OSFA)制备样品，用于在合适的微孔板读数仪中在450nm下读取数值。然后使用FVIII制备物作为参考得到的标准曲线计算测试样品的浓度。
实施例10:VWF活性及抗原的分析
按制造商描述的方法，用免疫比浊法确定VWF:Ag(OPAB03,SiemensHealthcareDiagnostics,Marburg,Germany)分析样品并分析其胶原结合情况(TechnozymVWF:CBAELISA,参考编码5450301，校准组为5450310对照组为5450312,Technoclone,Vienna,Austria)。
根据制造商的描述使用SiemensHealthcareDiagnostics,Marburg,Germany的BCVWF反应剂完成VWF:RCo测试。国际浓缩物标准品被用作主要的标准品制备物来校对日常使用的自制标准品制备物。
用标准ELISA确定VWF抗原以进行药代动力学分析。简言之，在室温下孵育每孔有100μl捕获抗体(兔抗人VWF-IgG,DakoA0082[Dako,Hamburg,Germany],1:2000稀释于缓冲液A[SigmaC3041,Sigma-Aldrich,Munich,Germany])的微孔板过夜。用缓冲液B(SigmaP3563)洗板三次后，每孔用200μl缓冲液C(SigmaP3688)在室温下孵育1.5小时(封闭)。在再次用缓冲液B洗涤三次的步骤后，用缓冲液B对测试样品进行系列稀释，并在缓冲液B中系列稀释标准人血浆(ORKL21；20至0.2mU/mL；SiemensHealthcareDiagnostics,Marburg,Germany)每孔体积为100μl，将二者室温下孵育1.5小时。用缓冲液B洗涤三次的步骤后，将100μl以1:16000稀释于缓冲液B中的检测抗体(兔抗人vWF-IgG,DakoP0226,过氧化物酶标记，)加入各孔并在室温下孵育1小时。经过用缓冲液B洗涤三次的步骤后，向各孔中加入100μl的底物溶液(OUVF,SiemensHealthcareDiagnostics)，并室温下避光孵育30分钟。加入100μl未稀释的终止稀释液(OSFA,SiemensHealthcareDiagnostics)以制备样品，用于在合适的微孔板读数仪中在450nm下读取数值。然后使用标准人血浆作为参考得到的标准曲线计算测试样品的浓度。
实施例11:VWF多聚体分析
VWF多聚体分析是通过SDS-琼脂糖凝胶电泳进行的，按近期描述的方法进行(Tatewaki等人，Thromb.Res.52:23-32(1988),及Metzner等人，Haemophilia4(Suppl.3):25-32(1998))，略有变动。简言之，在工作缓冲液中平衡后，使用即用型1％的琼脂糖mini胶(BioRad)尽可能地标准化所述方法。对量类似的VWF抗原进行SDS-琼脂糖凝胶电泳。进行Western印迹后，使用抗VWF、抗FVIII或抗白蛋白抗体，并随后使用碱性磷酸酶标记的抗IgG抗体(SIGMA,货号1305)并用密度测定定量发色反应而检测蛋白质条带。
用多聚体凝胶分析法分析了共价FVIII-SC/VWF-FP多聚体复合物的两种制备物。图10的泳道2和3代表了这样的物质，其中FVIII部分通过源自VWF的C3-C4-C5-C6-CK序列连接至VWF-FP二聚体，其中该序列连接至FVIII的C末端，而FVIII和C3-C4-C5-C6-CK序列之间有其他的凝血酶切割位点(实施例3)。泳道1代表源自血浆的VWF，泳道4为VWF-FP。结果证明共价FVIII/VWF-FP复合物确实与VWF-FP或天然VWF类似的程度进行多聚化。其他条带代表添加有一个或多个共价FVIII分子。抗VWF抗体(A)检测到的大多数多聚体条带也可被抗FVIII(B)染色，证明是FVIII/VWF-FP多聚体。
实施例12:纯化共价连接的FVIII/VWF-FP复合物
将含有共价连接的FVIII/VWF-FP二聚体复合物的细胞培养物上清通过0.2μm膜进行过滤除菌并使用30kDa的UF单元(CentramateTM,Pall)将其浓缩达20倍。将含有共价连接的FVIII/VWF-FP多聚体复合物的细胞培养物上清通过0.2μm膜进行过滤除菌并用CadenceTMSingle-UseInlineConcentrator(截留分子量30kDa，Pall)进行浓缩。然后将此物质加至以平衡缓冲液(EB,20mMTrispH7.0)平衡过的HumanAlbuminCaptureSelect柱子(BAC)上。用EB洗涤柱子并用溶于EB的2MMgCl2洗脱FVIII/VWF-FP复合物。合并洗脱峰并针对SECHiPrepSephacrylS-500HighResolution(GEHealthcare)的工作缓冲液(含有50mMHEPES,400mMCaCl2,50mMNaCl,pH7)进行透析，如McCue等人，,2009；J.Chrom.A,1216(45):7824-30中描述的方法，略作改动。然后将所述材料加至预平衡的SECHiPrepSephacrylS-500HighResolution(GEHealthcare)，并且在根据大小分离后，只有含共价连接的FVIII/VWF-FP的级分合并并且SECHiPrepSephacrylS-500HighResolution(GEHealthcare)。将合并物针对1.7mMCaCl2,10mML-His,308mMNaCl,8.76mM蔗糖,0.01％Tween80,pH7进行透析。最后将这些物质分成等分试样而冷冻。
备选地，对于特定的构建体，VIIISelect柱子(GEHealthcare)可比HumanAlbuminCaptureSelect柱子提供更好的纯化结果。在这种情况下，将细胞培养物上清浓缩物加至预平衡的VIIISelect柱子(GEHealthcare)，用平衡缓冲液(10mMHEPES,5mMCaCl2,150mMNaCl,0.03％Tween80pH7)洗涤后，用高盐浓度(1MNaCl)的平衡缓冲液平衡，然后再次用平衡缓冲液平衡。用20mML-His,5mMCaCl2,150mMNaCl,60％乙二醇,0.03％Tween80,pH7洗脱FVIII/VWF-FP。合并洗脱峰并针对随后SEC柱的工作缓冲液(含有50mMHEPES,400mMCaCl2,50mMNaCl,pH7)进行透析。然后将该物质加至预平衡的SECHiPrepSephacrylS-500HighResolution(GEHealthcare)柱子。合并含有共价连接的FVIII/VWF-FP的部分。将合并物针对1.7mMCaCl2,10mML-His,308mMNaCl,8.76mM蔗糖,0.01％Tween80,pH7进行透析。最后将这些物质分成等分试样而冷冻。
实施例13:共价连接的FVIII/VWF复合物在FVIII缺乏的小鼠及大鼠中的药代动力学分析
将FVIII/VWF复合物静脉施用于FVIII缺乏小鼠(每种物质使用12只受试小鼠)，剂量为100IU(FVIII:Ag)/kg体重，在恰当的间隔用交替采样方案取血样，得到来自3只动物/时间点(对于亚群1号，t＝0min及16h，对于亚群2号，t＝5min及24h，对于亚群3号，t＝2h及4h，对于亚群4号，t＝8h及32h)的样品。该方案这样设计以最小化采血样对要定量的血浆浓度的潜在影响。将血液处理成血浆并深度冷冻保存直到用于分析。随后通过特异性ELISA测定法对FVIII和VWF抗原的含量进行定量(见实施例7,9和10)。使用治疗组的平均值计算5min后的体内回收率。根据公式t1/2＝ln2/k使用β消除阶段的时间点计算半衰期，其中k是回归线的斜率。通常将抗原作为药代动力学研究中的一种度量。预期的是抗原和功能活性成正比。
将FVIII/VWF复合物静脉施用于麻醉后的CD/Lewis大鼠(每种物质使用6只受试大鼠)，剂量为100IU(VWF:Ag)/kg体重。在使用测试物质后5分钟之后的恰当间隔用交替采样方案取血样，得到来自3只动物/时间点(对于亚群1号，t＝0、5、30、90min、4h、1d，对于亚群2号，t＝0、15min、1、2、8h及2d)的样品。该方案这样设计以最小化采血样对要定量的血浆浓度的潜在影响。将血液处理成血浆并深度冷冻保存直到用于分析。随后通过特异性ELISA测定法对FVIII和VWF抗原的含量进行定量(见上文)。使用治疗组的平均值计算5min后的体内回收率。根据公式t1/2＝ln2/k使用β消除阶段的时间点计算半衰期，其中k是回归线的斜率。通常将抗原作为正常动物药代动力学研究中的一种度量以消除测量中得到的动物内在FVIII活性产生的背景。预期的是抗原和功能活性成正比。
在大鼠PK模型中就其半衰期，测试由具有经由可切割连接子连接至其羧基末端的VWFC3至C6和CK结构域的单链FVIII序列和融合有白蛋白的VWF构成的共价FVIII/VWF-FP制备物(如实施例3中所描述的)。图11显示了所述共价复合物(圆圈表示，在图注中称为FVIII-CK+VWF-FP)的消除动力学，并与重组FVIII(Advate,A中方块)、VWF-FP(B中方块)和血浆来源的FVIII-VWF复合物(Haemate,三角形)的消除动力学相比较。A显示了FVIII数据(如实施例6中描述的通过特异性Elisa测量的共价复合物；所有其他化合物都由FVIIIElisa测量)，B显示了VWFElisa的数据。当测量FVIII和VWF抗原时，共价构建体的消除动力学是类似的，如在两部分共价连接的情况所预期的。计算所得的FVIII抗原的消除半衰期为7.9小时，而VWF的为7.8小时。惊奇地，计算所得的VWF-FP对照(VWF抗原)的消除半衰期非常类似，为8.1小时。清除速率也很类似，为共价复合物9.8IU/mL/h，而VWF-FP为10.1IU/mL/h。计算rFVIII(Advate)的半衰期为2.5小时，意味着所述共价复合物的半衰期是游离FVIII的约3倍。
这些结果表明FVIII序列共价连接至半衰期延长的VWF分子显著地延长FVIII分子的半衰期，并且程度达到其可以媲美未融合的半衰期延长的VWF分子的半衰期。

Claims (38)

1.共价连接的复合物，其包含血管性血友病因子或其变体(VWF)及因子VIII或其变体(因子VIII)，所述复合物包含半衰期延长部分，前提是其不是一个Fc单体连接至VWF且另一个Fc单体连接至因子VIII的异源二聚体Fc融合物。
2.权利要求1的共价连接的复合物，其中共价连接不是由半衰期延长部分提供。
3.权利要求1或权利要求2的共价连接的复合物，其中因子VIII经修饰使得其与VWF形成二硫桥。
4.权利要求3的共价复合物，其中通过用半胱氨酸残基置换天然存在的氨基酸或插入半胱氨酸残基而修饰因子VIII，所述半胱氨酸残基与VWF中的半胱氨酸残基形成二硫桥。
5.权利要求4的复合物，其中因子VIII中被置换的天然存在的氨基酸选自因子VIIIa3结构域中的氨基酸。
6.权利要求4或权利要求5的复合物，其中因子VIII中被置换的天然存在的氨基酸位于因子VIIIa3结构域的氨基酸1653-1660中或氨基酸1667-1674中或氨基酸1675-1688中，或者将半胱氨酸引入FVIIIa3结构域的氨基酸1653-1660或氨基酸1667-1674或氨基酸1675-1688的序列中。
7.权利要求3的复合物，其中因子VIII中被置换的天然存在的氨基酸位于C末端结构域中。
8.权利要求1-7中任一项的复合物，其中通过用半胱氨酸残基置换天然存在的氨基酸或插入半胱氨酸残基而修饰VWF，所述半胱氨酸残基与引入因子VIII中的半胱氨酸残基形成二硫桥。
9.权利要求8的复合物，其中VWF中的天然存在的氨基酸为D’或D3结构域中的氨基酸，或其中半胱氨酸残基的插入在D’或D3结构域中。
10.权利要求8或权利要求9的复合物，其中将半胱氨酸残基插入TIL′结构域、E′结构域、D3结构域、C8-3结构域、TIL-3结构域或E-3结构域，或者VWF中用半胱氨酸残基置换的天然存在的氨基酸为TIL′结构域、E′结构域、D3结构域、C8-3结构域、TIL-3结构域或E-3结构域中的残基。
11.权利要求1-10中任一项的复合物，其中VWF包含FVIII结合结构域或由FVIII结合结构域组成。
12.前述任意权利要求的复合物，其中因子VIII经修饰而包含VWF的一个或多个结构域。
13.权利要求12的复合物，其中因子VIII经修饰而包含VWF的C末端结构域CK。
14.权利要求13的复合物，其中因子VIII经修饰而还包含VWF结构域C6、或C5和C6、C3至C6、或结构域C1至C6中的任意一个或多个、或其变体。
15.权利要求12-14中任一项的复合物，其中因子VIII包含SEQIDNO:2中残基2724-2812或其变体，前提是保留半胱氨酸残基2773(或其对等物)。
16.权利要求13-15中任一项的复合物，其中C末端VWF结构域通过可切割连接子连接至因子VIII。
17.权利要求16的复合物，其中可切割连接子包含因子VIII的凝血酶切割位点之一。
18.权利要求16或权利要求17的复合物，其中连接子序列包含其他的氨基酸残基，以提供长度足以允许因子VIII和VWF分别经由a3和D′D3结构域而发生分子内相互作用的肽。
19.权利要求12-18中任一项的复合物，其中在因子VIII的C末端或N末端，或者在因子VIII的B-结构域内，或者部分或全部地取代因子VIII的B-结构域，而对因子VIII进行修饰。
20.权利要求12或权利要求19的复合物，其中因子VIII经修饰而包含VWF的D′D3结构域或其片段。
21.权利要求20的复合物，其中通过用VWFD′D3结构域或者其片段或变体部分或全部地取代因子VIII的B结构域而修饰因子VIII。
22.权利要求21的复合物，其中因子VIII在其B结构域内或取代其B结构域或取代其B结构域的部分，而包含SEQIDNO:2的残基746至1241号或者其变体或片段。
23.权利要求19-21中任一项的复合物，其中因子VIII以双链分子的形式表达，其中VWFD′D3结构域代表因子VIII轻链的氨基末端。
24.权利要求19-22中任一项的复合物，其中在VWF的D′D3区域和因子VIII轻链结构域之间引入其他的连接子序列。
25.前述任意权利要求的复合物，其中因子VIII为遗传工程化的因子VIII。
26.权利要求25的复合物，其中遗传工程化的因子VIII具有全部或部分的B-结构域删除，是突变的因子VIII，或具有半衰期延长部分的融合多肽。
27.前述任意权利要求的复合物，其中VWF为半衰期延长形式的VWF。
28.权利要求26的复合物，其中半衰期延长形式的VWF是VWF与半衰期延长部分的遗传工程化的融合蛋白。
29.权利要求26-29中任一项的复合物，其中半衰期延长部分选自白蛋白或者其变体或片段、免疫球蛋白恒定区及其部分和变体例如Fc片段或其变体、具有大的流体动力学体积的溶剂化随机链(例如XTEN或PAS)、afamin或其变体、甲胎蛋白或其变体、维生素D结合蛋白质或其变体、转铁蛋白或其变体，人绒毛促性腺激素β亚基的羧基端肽(CTP)、能够在生理学条件下结合白蛋白或免疫球蛋白恒定区的多肽或脂类。
30.权利要求1、2或27中任一项的复合物，其中VWF的血浆半衰期通过化学修饰而延长，所述化学修饰例如连接聚乙二醇(PEG化)、糖基化的PEG、羟乙基淀粉(HES化)、多唾液酸、细菌肝素前体多聚物、弹性蛋白样多肽、或透明质酸。
31.权利要求1-30中任一项的复合物，其中VWF以单体形式表达，或其中VWF以二聚体形式表达。
32.权利要求1-30中任一项的复合物，其中VWF形成多聚体。
33.权利要求1或权利要求30的复合物，其中通过使用一种或多种化学合成的交联剂获得共价连接。
34.前述任意权利要求的复合物，特征在于因子VIII和VWF通过超过一个共价二硫键或者肽或蛋白质性质的连接子连接。
35.生产权利要求1-32或权利要求34中任一项的因子VIII和VWF的共价复合物的方法，包括将因子VIII和VWF在真和细胞系中共表达。
36.权利要求1-34中任一项的共价复合物，用于治疗或预防出血障碍。
37.权利要求36的复合物，其中所述出血障碍为A型血友病或血管性血友病。
38.药学组合物，其包含权利要求1-34中任一项的复合物。
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