MX2007008619A

MX2007008619A - Moleculas de union al antigeno que fijan egfr, vectores que las codifican y usos de las mismas.

Info

Publication number: MX2007008619A
Application number: MX2007008619A
Authority: MX
Inventors: Pablo Umana; Ekkehard Mossner
Original assignee: Glycart Biotechnology Ag
Priority date: 2005-02-07
Filing date: 2006-02-07
Publication date: 2007-09-11
Also published as: RU2488597C2; DK1871805T3; RU2610688C2; KR20070119629A; IL184498A0; HK1110873A1; CA2596835A1; US8614065B2; US7846432B2; TWI387602B; IL184498A; US8097436B2; ES2755976T3; US20200332012A1; HK1199470A1; EP2404937A1; HRP20192134T1; US7722867B2; JP2008529489A; KR20140031985A

Abstract

La presente invencion se refiere a moleculas de union al antigeno (ABM). En modalidades particulares, la presente invencion se refiere a anticuerpos monoclonales recombinantes que incluyen anticuerpos quimericos primatizados o humanizados especificos para EGFR humano. Ademas, la presente invencion se refiere a moleculas de acido nucleico, que codifican dichas ABM, y a los vectores y celulas huesped caracterizados porque comprenden dichas moleculas de acido nucleico. La invencion se refiere ademas a metodos para producir las ABM de la invencion, y a los metodos de uso de estas ABM en el tratamiento de la enfermedad. Ademas, la presente invencion se refiere a ABM con glicosilacion modificada que tiene propiedades terapeuticas mejoradas, que incluyen anticuerpos con un incremento de la union al receptor Fc y un incremento de la funcion efectora.

Description

MOLÉCULAS DE UNION AL ANTIGENO QUE FIJAN EGFR, VECTORES QUE LAS CODIFICAN Y USOS DE LAS MISMAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a moléculas de unión al antígeno (ABM) . En modalidades particulares, la presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales recombinantes, incluyendo anticuerpos quiméricas, primatizados o humanizados que son específicos para el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (EGFR, por sus siglas en inglés) . Además, la presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican dichas ABM, y vectores y células huésped que comprenden dichas moléculas de ácido nucleico. La invención se refiere además a métodos para producir las ABM de la invención y a los métodos de uso de estas ABM en el tratamiento de la enfermedad.

Además, la presente invención se refiere a ABM con glicosilación modificada que tiene propiedades terapéuticas mejoradas, incluyendo anticuerpos con unión al receptor Fe incrementada y función efectora incrementada. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Anticuerpos EGFR y anti-EGFR El receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (también conocido como HER-1 o Erb-Bl, y denominado aquí "EGFR") es un receptor de transmembrana de 170 kDa Ref.: 183791 codificado por el proto-oncogen c-erbB, y exhibe actividad tirosina cinasa intrínseca (Modjtahedi y otros, Br . J. Cáncer 73:228-235 (1996); Herbst and Shin, Cáncer 94:1593-1611 (2002)). La base de datos SwissProt, entrada P00533 provee la secuencia de EGFR. Existen también isoformas y variantes de EGFR (por ejemplo transcripciones de ARN alternativas, versiones truncadas, polimorfismos, etc.) incluyendo pero sin limitarse a los que se han identificados en la base de datos Swissprot, números de entrada P00533-1, P00533-2, P00533-3 y P00533-4. Se sabe que el EGFR une ligandos que incluyen el factor de crecimiento epidérmico (RGF) , el factor-a de crecimiento transformante (TGF-a) , anfiregulina, EGF de unión a heparina (hb-EGF) , betacelulina y epiregulina (Herbst and Shin, Cáncer 94:1593-1611 (2002); Mendelsohn and Baselga, Oncogene 19:6550-6565 (2000)). El EGFR regula numerosos procesos celulares a través de las vías de transducción de señal mediadas por tirosina cinasa, que incluyen pero que no están limitadas a la activación de las vías de transducción de señal que controlan la proliferación de células, diferenciación, supervivencia celular, apoptosis, angiogénesis, mitogénesis y metástasis (Atalay y otros , Ann .

Oncology 14:1346-1363 (2003); Tsao and Herbst, Signal 4:4-9 (2003); Herbst and Shin, Cáncer 94:1593-1611 (2002); Modjtahedi y otros , Br . J. Cáncer 73:228-235 (1996)). La sobreexpresión de EGFR ha sido mencionada en numerosas enfermedades malignas humanas, incluyendo cánceres de vejiga, cerebro, cabeza y cuello, páncreas, pulmón, mama, ovario, colon, próstata y riñon. (Atalay y otros , Ann . Oncology 14:1346-1363 (2003); Herbst and Shin, Cáncer 94:1593-1611 (2002) Modjtahedi y otros , Br . J. Cáncer 73:228-235 (1996)). En muchas de estas condiciones, la sobreexpresión de EGFR está correlacionada o está asociada con una prognosis baja de los pacientes. (Herbst and Shin, Cáncer 94:1593-1611 (2002) Modjtahedi y otros , Br . J. Cáncer 73:228-235 (1996)). El EGFR está también expresado en las células de los tejidos normales, particularmente los tejidos epiteliales de la piel, hígado y tracto gastrointestinal, aunque generalmente a niveles más bajos que los de las células malignas (Herbst and Shin, Cáncer 94:1593-1611 (2002) ) . Los anticuerpos monoclonales no conjugados (mAb) pueden ser medicamentos útiles para el tratamiento del cáncer, tal como ha sido demostrado por la aprobación de la U.S. Food and Drug Administration de Trastuzumab (Herceptin™; Genentech Inc, ) para el tratamiento del cáncer de mama avanzado (Grillo-Lopez, A.-J., y otros , Semin . Oncol . 26: 66-73 (1999); Goldenberg, M. M., Clin . Ther . 21:309-18 (1999)), Rituximab (Rituxan™; IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA, y Genentech Inc., San Francisco, CA) , para el tratamiento del linfoma no de Hodgkin de bajo grado o folicular, de célula B CD20 positiva, (Mylotarq™, Celltech/Wyeth-Ayerst ) , para el tratamiento de leucemia mieloide aguda con reincidida y (CAMPATH™, Millenium Pharmaceuticals/Schering AG) para el tratamiento de leucemia linfocítica crónica de célula B. El éxito de estos productos se basa no sólo en su eficacia, sino también en sus sobresalientes perfiles de seguridad (Grillo-Lopez, A.J., y otros , Semin . Oncol . 26: 66-13 (1999); Goldenberg, M. M., Clin . Ther . 21:309-18 (1999)). A pesar de los logros de estos fármacos, existe corrientemente un gran interés en obtener una actividad de anticuerpo específica superior a la que se permite típicamente para la terapia mAb no conjugada. Los resultados de una variedad de estudios sugieren que los mecanismos que dependen del receptor Fe contribuyen sustancialmente a la acción de los anticuerpos citotóxicos contra los tumores e indican que un anticuerpo óptico contra tumores se uniría preferiblemente a los receptores de Fe de activación y mínimamente al par inhibidor FcyRIIB. (Clynes, R. A., y otros , Na ture Medi cine 6 (4) : 443-446 (2000); Kalergis, A.M., y Ravetch, J. V., J. Exp . Med. 195 (12) : 1653-1659 (Junio de 2002) . Los resultados de por lo menos un estudio sugieren que el polimorfismo en el receptor Fc?RIIIa, en particular, está fuertemente asociado a la eficacia de la terapia con anticuerpos. (Cartron, G., y otros , Blood 99 (3) X 5A -151 (Febrero de 2002)). Ese estudio mostró que los pacientes homocigotas para FcyRIIIa tienen una mejor respuesta para el Rituximab que los pacientes heterocigotas . Los autores llegaron a la conclusión de que esta respuesta superior era debida a una mejor unión in vivo del anticuerpo al Fc?RIIIa, que como resultado proporciona mejor actividad de ADCC contra células de linfoma. (Cartron, G., y otros , Bl ood 99 (3) -. 154 -151 (Febrero de 2002)). Se conocen varias estrategias para llegar al EGFR y bloquear las vías de señalización de EGFR. Los inhibidores de tirosina cinasa de moléculas pequeñas tales como gefitinib, eriotinib, y CI-1033 bloquean la autofosforilación de EGFR en la región de tirosina cinasa intracelular, inhibiendo de este modo los eventos de señalización cadena abajo (Tsao and Herbst, Signal 4: 4-9 (2003)). Los anticuerpos monoclonales, por otra parte, llegan a la porción extracelular de EGFR, lo cual da como resultado el bloqueo de la unión al ligando y de este modo inhiben los eventos cadena abajo tal como la proliferación de células (Tsao and Herbst, Signal A : 4-9 (2003) ) . Se han generado varios anticuerpos monoclonales murinos que logran dicho bloqueo in vi tro y que han sido evaluados por su capacidad para afectar el crecimiento tumoral en modelos de xenoinjertos en ratones (Masui, y otros , Cáncer Res . 46:5592-5598 (1986); Masui, y otros , Cáncer Res . 44:1002-1007 (1984); Goldstein, y otros , Clin .

Cáncer Res . 1: 1311-1318 (1995)). Por ejemplo, EMD 55900 (EMD Pharmaceuticals) es un anticuerpo monoclonal anti-EGFR murino que fue creado contra la línea A431 de la célula de carcinoma epidérmico humano y que fue sometido a prueba en estudios clínicos en pacientes con carcinoma avanzado de células escamosas de la laringe o de la hipofaringe (Bier y otros , Eur . Arch . Otohinolaryngol . 252:433-9 (1995)). Además, los anticuerpos ICR16, ICR62 e ICR80 monoclonales de rata, que se unen al dominio extracelular de EGFR, han demostrado que son eficaces para inhibir la unión de EGF y TGF-a al receptor. (Modjtahedi y otros , In t . J. Cáncer 75:310-316 (1998)). El anticuerpo monoclonal murino 425 es otro MAb que fue creado contra la línea de células de carcinoma A431 humana y que se halló que se unía a un epítopo del polipéptido en el dominio externo del receptor del factor de crecimiento epidérmico humano. (Murthy y otros , Arch . Biochem . Biophys . 252 (2) :549-560 (1987) . Un problema potencial con el uso de anticuerpos murinos en los tratamientos terapéuticos es que los anticuerpos monoclonales no humanos pueden ser reconocidos por el huésped humano como una proteína extraña; por lo tanto, las inyecciones repetidas de dichos anticuerpos extraños pueden conducir a la inducción de respuestas inmunitarias que conducen a reacciones de hipersensibilidad per udiciales. Para anticuerpos monoclonales de base murina, esto es denominado a menudo respuesta de Anticuerpo Anti- Ratón Humano, o respuesta "HAMA", o una respuesta de Anticuerpo Anti-Rata Humana, o respuesta "HARÁ". Adicionalmente, estos anticuerpos "extraños" pueden ser atacados por el sistema inmunitario del huésped de modo que estos son efectivamente neutralizados antes de que puedan alcanzar su objetivo. Además, los anticuerpos monoclonales no humanos (por ejemplo anticuerpos monoclonales murinos) carecen típicamente de funcionalidad efectora humana, es decir, son incapaces, entre otras cosas, de mediar en la lisis que depende de complemento o usar células objetivo humanas a través de la toxicidad celular que depende de los anticuerpos o por fagocitosis mediada por el receptor Fe. Se han desarrollado anticuerpos quiméricos que comprenden porciones de anticuerpos de dos o más especies diferentes (por ejemplo ratón y humanos) como alternativa para anticuerpos "conjugados". Por ejemplo, la Patente Estadounidense N° 5,891,996 (Mateo de Acosta del Rio y otros , ) revela un anticuerpo quimérico de humano/ratón R3 dirigido contra EGFR y la Patente Estadounidense N° 5,558,864 revela la generación de las formas quiméricas y humanizadas del anti-EGFR murino MAb 425. Además, IMC-C225 (Erbitux®; ImClone) es un anticuerpo monoclonal anti-EGFR de ratón/humano quimérico (basado en el anticuerpo monoclonal M225 de ratón que da como resultado respuestas HAMA en pruebas clínicas humanas) que de acuerdo a lo informado ha demostrado eficacia antitumoral en varios modelos de xenoinjerto humano. (Herbst and Shin, Cáncer 94:1593-1611 (2002)). La eficacia de IMC-225 ha sido atribuida a varios mecanismos que incluyen la inhibición de eventos celulares regulados por las vías de señalización de EGFR y posiblemente por la actividad de toxicidad celular dependiente de anticuerpo incrementada (ADCC) (Herbst and Shin, Cáncer 94:1593-1611 (2002)). La IMC-C225 se usó también en pruebas clínicas incluyendo la combinación con radioterapia y quimioterapia (Herbst and Shin, Cáncer 94:1593-1611 (2002)). Recientemente, Abgenix, Inc. (Fremont, CA) desarrolló ABX-EGF para terapia de cáncer. ABX-EGF es un anticuerpo monoclonal anti-EGFR completamente humano. (Yang y otros , Cri t . Rev. Oncol . /Hema tol . 38 : 17-23 (2001)). Glicosilación de Anticuerpos El componente de oligosacárido puede afectar significativamente propiedades relevantes para la eficacia de una glicoproteína terapéutica, incluyendo la estabilidad física, la resistencia al ataque de proteasa, interacciones con el sistema inmunitario, farmacocinética y actividad biológica específica. Estas propiedades pueden depender no solamente de la presencia o ausencia sino también de las estructuras específicas de los oligosacáridos. Pueden efectuarse algunas generalizaciones entre la estructura de los oligosacáridos y la función de la glicoproteína. Por ejemplo, ciertas estructuras de oligosacáridos median la rápida supresión de la glicoproteína de la corriente sanguínea a través de interacciones con proteínas de unión específica a los carbohidratos, mientras que otras pueden unirse mediante anticuerpos y desencadenar reacciones inmunitarias indeseables. (Jenkins y otros , Na ture Biotechnol . 14:975-81 (1996)). Las células de mamífero son los huéspedes preferidos para la producción de glicoproteínas terapéuticas debido a su capacidad para glicosilar proteínas en la forma más compatible para aplicación humana. (Cumming y otros , Glycobiology 1:115-30 (1991); Jenkins y otros , Na ture Biotechnol . 14:975-81 (1996)). Las bacterias muy raramente glicosilan las proteínas y tal como otros tipos de huéspedes comunes tales como levaduras, hongos filamentosos, insectos y células de plantas proveen patrones de glicosilación asociados con un rápida supresión de la corriente sanguínea, interacciones inmunitarias indeseables y en algunos casos específicos, actividad biológica reducida. Entre las células de mamífero, se han usado más comúnmente células de ovario de hámster chino (CHO) durante las dos últimas décadas. Además de proporcionar patrones de glicosilación apropiados, estas células permiten una generación coherente de líneas celulares clónales altamente productivas, genéticamente estables. Estas pueden ser cultivadas hasta altas densidades en bioreactores simples usando medios libres de suero, y pueden permitir el desarrollo de bioprocesos seguros y reproducibles . Otras células de animales comúnmente usadas incluyen células de riñon de hámster bebé (BHK) , células de mieloma NSO- y SP2/0-ratón. Más recientemente, la producción de animales transgénicos ha sido también ensayada. (Jenkins y otros , Na ture Biotechnol . 14:975-81 (1996)). Todos los anticuerpos contienen estructuras de carbohidratos en posiciones conservadas en las regiones constantes de la cadena pesada, donde cada isótopo posee una disposición distinta de estructuras de carbohidrato ligadas a N, las cuales afectan en forma variada la unión de las proteínas, la secreción o su actividad funcional. (Wright, A., and Morrison, S. L., Trends Biotech . 15 : 26-32 (1997)). La estructura del carbohidrato ligado a N adherido varía considerablemente, dependiendo del grado de procesamiento y puede incluir un alto contenido de mañosa, múltiples ramificaciones así como también oligosacáridos complejos biantenarios . (Wright, A., and Morrison, S. L., Trends Bi otech . 15 : 26-32 (1997)). Típicamente existe un proceso heterogéneo de las estructuras nucleares de oligosacáridos unidas a un sitio de glicosilación particular de modo que incluso los anticuerpos monoclonales existen como glicoformas múltiples. Asimismo, se demostró que las diferencias principales en la glicosilación ocurren entre líneas celulares e incluso se observan diferencias menores para la línea celular determinada cultivada bajo diferentes condiciones de cultivo. (Lifely, M. R. y otros , Glycobiology 5 (8) :813-22 (1995) ) . Una forma de obtener grandes aumentos de potencia y mantener al mismo tiempo un proceso de producción simple y evitar potencialmente efectos secundarios significativos indeseables, es el de mejorar las funciones efectoras naturales mediadas por células, de los anticuerpos monoclonales mediante la manipulación por modificación genética de su componente oligosacárido tal como ha sido descrito en Umaña, P. y otros , Na ture Biotechnol . 17:176-180 (1999) y Patente Estadounidense N° 6.602.684, cuyo contenido se incorpora aquí como referencia en su totalidad. Los anticuerpos de tipo IgGl, que son los anticuerpos más comúnmente usados en inmunoterapia de cáncer, son glicoproteínas que tienen un sitio de glicosilación ligada a N conservado en Asn297 en cada domino CH2. Los dos oligosacáridos biantenarios complejos unidos a Asn297 están enterrados entre los dominios CH2, que forman extensos contactos con la estructura polipeptídica, y su presencia es esencial para que el anticuerpo actúe como intermediario en las funciones efectoras tales como citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) (Lifely, M. R., y otros , Glycobiology 5:813-822 (1995); Jefferis, R., y otros , Immunol Rev. 1 63 : 59-16 (1998); Wright, A. and Morrison, S. L., Trends Biotechnol . 15 : 26-32 (1997)). Umaña y otros , mostraron previamente que la sobreexpresión en las células de ovario de hámster chino (CHO) de ß ( 1, 4 ) -N-acetilglucosaminiltransferasa III ("GnTIII"), que es una glicotransferasa que cataliza la formación de oligosacáridos divididos, aumenta significativamente la actividad de ADCC in vitro de un anticuerpo monoclonal quimérico anti-neuroblastoma (chCE7) producida por las células CHO modificadas por modificación genética. (Ver Umaña, P. y otros , Na ture Biotechnol . 1 7 : 116-180 (1999); y la Publicación Internacional N° WO 99/54342, cuyos contenidos se incorporan aquí en su totalidad como referencia). El anticuerpo chCE7 pertenece a una amplia clase de mAb no conjugados que tienen una elevada afinidad y especificidad tumoral, pero que tienen demasiada baja potencia para ser clínicamente útiles cuando se producen en líneas de células industriales estándar que carecen de la enzima GnTIII (Umaña, P. y otros , Na ture Biotechnol . 1 7 : 116-180 (1999)). Ese estudio fue el primero que mostró que podían obtenerse grandes cantidades de actividad de ADCC mediante la manipulación genética de las células producidas por anticuerpos, para expresar GnTIII, que conduce también a la obtención de un aumento de la proporción de la región constante asociada a (Fe), oligosacáridos divididos incluyendo oligosacáridos divididos no fucosilados, por arriba de los niveles que se encuentran en los anticuerpos naturales . Sigue existiendo la necesidad de mejorar modalidades terapéuticas dirigidas a EGFR para el tratamiento de trastornos de proliferación de células en primates, incluyendo pero sin limitarlo a seres humanos, donde dichos trastornos se caracterizan por la expresión de EGFR, particularmente una expresión anormal (por ejemplo sobreexpresión) incluyendo, pero sin limitar a cánceres de la vejiga, cerebro, cabeza y cuello, páncreas, pulmón, mama, ovario, colon, próstata y riñon. El reconocimiento del tremendo potencial terapéutico de las moléculas de unión al antígeno (ABM) que tienen la especificidad de unión del anticuerpo ICR62 de rata (por ejemplo se unen al mismo epítopo) y que han sido glicomodificadas para mejorar la afinidad de unión y función efectora del receptor Fe, los presentes inventores desarrollaron un método para producir dichos ABM. Entre otras cosas, este método involucra producir anticuerpos quiméricos recombinantes o fragmentos quiméricos de los mismos. La eficacia de estos ABM es adicionalmente mejorada por la manipulación del perfil de glicosilación de la región Fe del anticuerpo . Por consiguiente, en un aspecto la invención está dirigida a un polinucleótido aislado que comprende: (a) una secuencia seleccionada de un grupo que consiste en: SEC ID NO:54, SEC ID NO:56, SEC ID NO:58, SEC ID NO:60, SEC ID NO:62, SEC ID NO:64, SEC ID NO:66, SEC ID NO:68, SEC ID NO:70, SEC ID NO:72, SEC ID NO:74, SEC ID NO:122 y SEC ID NO: 124; (b) una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID NO:76, SEC ID NO:78, SEC ID NO:80, SEC ID NO:82, SEC ID NO:84, SEC ID NO:86, SEC ID NO:88, SEC ID NO:90, SEC ID NO:92, SEC ID NO:94, SEC ID NO:96, SEC ID NO:98, SEC ID NO:100, SEC ID NO:102, SEC ID NO:104, SEC ID NO:106 y SEC ID NO: 126; y (c) SEC ID NO: 108. En otro aspecto, la invención está dirigida a un polinucleótido aislado que comprende (a) una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 112 y SEC ID NO: 114; (b) una secuencia seleccionada del qrupo que consiste en SEC ID N0.116 y SEC ID N0.118 y (c) SEC ID NO: 119. En una modalidad, cualquiera de estos polinucleótidos codifica un polipéptido de fusión. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un aspecto adicional, la invención está dirigida a un polinucleótido aislado que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID No: 2; SEC ID No: 4; SEC ID No: 6; SEC ID No: 8; SEC ID No: 10; SEC ID No: 12; SEC ID No:14; SEC ID No:16; SEC ID No:18; SEC ID No:20; SEC ID No:22; SEC ID No:24; SEC ID No:26; SEC ID No:28; SEC ID No:30; SEC ID No:32; SEC ID No:34; SEC ID No:36; SEC ID No:38; SEC ID No:40 y SEC ID No:120. En otro aspecto, la invención está dirigida a un polinucleótido aislado que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID No:44; SEC ID No:46; SEC ID No:50 y SEC ID No:52. En una modalidad, dichos polinucleótidos codifican polipéptidos de fusión. La invención está además dirigida a un polinucleótido aislado que comprende una secuencia que tiene por lo menos 80%, 85%, 90%, 95% o 99% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID No: 2; SEC ID No: 4; SEC ID No: 6; SEC ID No SEC ID No: 10; SEC ID No:12; SEC ID No:14; SEC ID No:16 SEC ID No:18 SEC ID No:20; SEC ID No:22; SEC ID No:24 SEC ID No:26 SEC ID No:28; SEC ID No:30; SEC ID No:32 SEC ID No:34 SEC ID No:36; SEC ID No:38; SEC ID No:40 y SEC ID No:120, donde dicho polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión. En un aspecto adicional, la invención está dirigida a un polinucleótido aislado que comprende una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID No: 44; SEC ID No:46; SEC ID No:50 y SEC ID No:52, donde dicho polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión. La invención está también dirigida a un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido quimérico que tiene la secuencia de SEC ID No: 1. En una modalidad, el polinucleótido que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de SEC ID No: 1 y una secuencia que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de una región Fe de anticuerpo, o un fragmento de la misma, de una especie distinta de rata. La invención está también dirigida a un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido quimérico que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID No: 3; SEC ID No: 5; SEC ID No:7; SEC ID No:9; SEC ID No.ll; SEC ID No:13; SEC ID No:15; SEC ID No:17; SEC ID No:19; SEC ID No:21; SEC ID No:23; SEC ID No: 25; SEC ID No: 27; SEC ID No: 29; SEC ID No: 31; SEC ID No:33; SEC ID No:35; SEC ID No:37; SEC ID No:39 y SEC ID No: 121. En una modalidad, el polinucleótido comprende una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID No: 3; SEC ID No:5; SEC ID No:7; SEC ID No:9; SEC ID No: 11; SEC ID No:13; SEC ID No: 15; SEC ID No: 17; SEC ID No: 19; SEC ID No: 21; SEC ID No: 23; SEC ID No: 25; SEC ID No: 27; SEC ID No: 29; SEC ID No:31; SEC ID No:33; SEC ID No:35; SEC ID No:37; SEC ID No:39 y SEC ID No: 121; y una secuencia que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de una región Fe del anticuerpo, o una fragmento de la misma, de una especie distinta de rata. En un aspecto más, la invención está dirigida a un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido quimérico que tiene la secuencia de SEC ID No: 43. En una modalidad, el polinucleótido comprende una secuencia que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de SEC ID No: 43 y una secuencia que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de una región Fe de anticuerpo, o un fragmento de la misma, de una especie distinta de rata. En un aspecto más, la invención está dirigida a un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido quimérico que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID No: 45; SEC ID No: 49 y SEC ID No: 51. En una modalidad, el polinucleótido comprende una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID No:45; SEC ID No:49 y SEC ID No:51, y una secuencia que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de una región constante de una cadena ligera de anticuerpo (CL) , o una fragmento de la misma, de una especie distinta de rata. La invención está también dirigida a un polinucleótido aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que tiene la región VH del anticuerpo ICR62 o variantes funcionales del mismo, y una secuencia que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de una región Fe de anticuerpo, o un fragmento de la misma, de una especie distinta de rata. En otro aspecto, la invención está dirigida a un polinucleótido aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que tiene la región VL del anticuerpo ICR62 o variantes funcionales del mismo, y una secuencia que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de una región CL del anticuerpo, o una fragmento de la misma, de una especie distinta de rata. La invención se dirige además a un vector de expresión que comprende cualquiera de los polinucleótidos aislados descritos anteriormente, y a una célula huésped que comprende tal vector de expresión. En un aspecto preferido, la invención está dirigida a una célula huésped que comprende cualquiera de los polinucleótidos aislados descritos anteriormente. En un aspecto, la invención está dirigida a un polinucleótido aislado que comprende: (a) una secuencia seleccionada de un grupo que consiste en SEC ID NO: 53 SEC ID NO:55, SEC ID NO:57, SEC ID NO:59, SEC ID NO:61, SEC ID NO: 63, SEC ID NO: 65, SEC ID NO: 67, SEC ID NO: 69, SEC ID NO:71, SEC ID NO:73, SEC ID NO:123 y SEC ID NO:125; (b) una secuencia seleccionada de un grupo que consiste en: SEC ID NO:75, SEC ID NO:77, SEC ID NO:79, SEC ID NO:81, SEC ID NO:83, SEC ID NO:85, SEC ID NO:87, SEC ID NO:89, SEC ID NO:91, SEC ID NO:93, SEC ID NO:95, SEC ID NO:97, SEC ID NO:99, SEC ID NO:101, SEC ID NO:103, SEC ID NO:105 y SEC ID NO: 127; y (c) SEC ID NO: 107, donde dicho polipéptido es un polipéptido de fusión. En otro aspecto, la invención está dirigida a un polipéptido aislado que comprende (a) una secuencia seleccionada de un grupo que consiste en SEC ID NO: 111 y SEC ID NO:113; (b) SEC ID NO:115; y (c) SEC ID NO: 117, donde dicho polipéptido es un polipéptido de fusión. La invención está también diriqida a un polipéptido quimérico que comprende la secuencia de la SEC ID No:l o una variante de la misma. La invención está también dirigida a un polipéptido quimérico que comprende la secuencia de la SEC ID No: 43 o una variante de la misma. En una modalidad, cualquiera de estos polipéptidos comprende además una región Fe humana y/o una región CL humana. La invención está también dirigida a un polipéptido quimérico que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID No: 3; SEC ID No:5; SEC ID No:7; SEC ID No:9; SEC ID No:ll; SEC ID No: 13; SEC ID No: 15; SEC ID No: 17; SEC ID No: 19; SEC ID No:21; SEC ID No:23; SEC ID No:25; SEC ID No:27; SEC ID No:29; SEC ID No:31; SEC ID No:33; SEC ID No:35; SEC ID No:37; SEC ID No:39 y SEC ID No:121, o una variante de las mismas. La invención está también dirigida a un polipéptido quimérico que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID No:45; SEC ID No:49 y SEC ID No:51, o una variante de las mismas. En una modalidad, cualquiera de estos polipéptidos comprende además una región Fe humana y/o una región CL humana. En una modalidad, la región Fe humana comprende IgGl. En otro aspecto, la invención está dirigida a un polipéptido que comprende una secuencia derivada del anticuerpo ICR62 y una secuencia derivada de un polipéptido heterólogo y una molécula de unión al antigeno que comprende tal polipéptido. En una modalidad, la molécula de unión al antígeno es un anticuerpo. En una modalidad preferida, el anticuerpo es quimérico. En otra modalidad preferida, el anticuerpo es humanizado o primatizado. En otro aspecto, la invención está dirigida a un ABM que es capaz de competir con el anticuerpo ICR62 de rata para la unión con EGFR y que es quimérico. En una modalidad, el ABM es un anticuerpo o un fragmento del mismo. En una modalidad adicional, el ABM es un anticuerpo recombinante que comprende una región VH que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N0:1; SEC ID No: 3; SEC ID No: 5; SEC ID No: 7; SEC ID No: 9; SEC ID No: 11; SEC ID No: 13; SEC ID No: 15; SEC ID No: 17; SEC ID No:19; SEC ID No:21; SEC ID No:23; SEC ID No:25; SEC ID No:27; SEC ID No:29; SEC ID No:31; SEC ID No:33; SEC ID No:35; SEC ID No:37; SEC ID No:39; y SEC ID No:121. En otra modalidad, el ABM es un anticuerpo recombinante que comprende una región VL que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 43; SEC ID No: 45; y SEC ID No: 51. En una modalidad adicional, el ABM es un anticuerpo recombinante que está primatizado. En una modalidad adicional, el ABM es un anticuerpo recombinante que está humanizado. En una modalidad adicional, el ABM es un anticuerpo recombinante que comprende una región Fe humana. En una modalidad adicional, cualquiera de los ABM comentados anteriormente puede estar conjugado con una porción tal como una toxina o un radio rótulo. La invención está además relacionada con un ABM de la presente invención donde dicho ABM tiene oligosacáridos modificados. En una modalidad, los oligosacáridos modificados tienen fucosilación reducida en comparación con los oligosacáridos no modificados. En otras modalidades, los oligosacáridos modificados son híbridos o complejos. En una modalidad adicional, el ABM tiene una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados u oligosacáridos no fucosilados divididos en la región Fe de la molécula. En una modalidad, los oligosacáridos no fucosilados divididos son híbridos. En una modalidad, los oligosacáridos no fucosilados divididos son complejos. En una modalidad, al menos el 20% de los oligosacáridos en la región Fe de dicho polipéptido son no fucosilados o no fucosilados divididos. En modalidades más preferidas, por lo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% o 75% o más de los oligosacáridos son no fucosilados o no fucosilados divididos. La invención se refiere además a un polinucleótido que codifica cualquiera de los ABM comentados anteriormente, y a los vectores de expresión y células que comprenden dicho polinucleótido.

La invención se refiere además a un método para producir un ABM que es capaz de competir con el anticuerpo ICR62 de rata para la unión al EGFR y donde dicho ABM es quimérico; dicho método comprende: (a) cultivar una célula huésped que comprende un polinucleótido que codifica un ABM de la presente invención en un medio bajo condiciones que permiten la expresión de dicho polinucleótido que codifica dicho ABM; y (b) recuperar dicho ABM del cultivo resultante. En otro aspecto, la invención está relacionada con una composición farmacéutica que comprende el ABM de la invención. Se contempla que la composición farmacéutica puede comprender además un portador farmacéuticamente aceptable, un adyuvante o una combinación de los mismos. En un aspecto adicional, la invención está relacionada con un método para el tratamiento de una enfermedad caracterizada por la expresión de EGFR (por ejemplo anormal o sobreexpresión de EGFR). El método comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del ABM de la presente invención a un sujeto, preferentemente a un sujeto mamífero, y más preferentemente a un ser humano que lo necesite. En una modalidad preferida, la enfermedad se trata mediante la administración de un ABM que es un anticuerpo quimérico (por ejemplo humanizado), o un fragmento quimérico de un anticuerpo. En una modalidad, el ABM se administra en una cantidad de aproximadamente 1.0 mg/kg a aproximadamente 15.0 mg/kg. En otra modalidad, el ABM se administra en una cantidad de aproximadamente 1.5 mg/kg a aproximadamente 12.0 mg/kg. En otra modalidad, el ABM se administra en una cantidad de aproximadamente 1.5 mg/kg a aproximadamente 4.5 mg/kg. En otra modalidad, el ABM se administra en una cantidad de aproximadamente 4.5 mg/kg a aproximadamente 12.0 mg/kg. En otra modalidad, el ABM se administra en una cantidad seleccionada del grupo que consiste en aproximadamente 1.5, en aproximadamente 4.5 y aproximadamente 12.0 mg/kg. En un aspecto más, la invención se relaciona con una célula huésped manipulada para expresar por lo menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad GnTIII en un cantidad suficiente para modificar los oligosacáridos en la región Fe de la ABM producida por la célula huésped, donde la ABM es capaz de competir con el anticuerpo ICR62 de rata para la unión al EGFR y donde la ABM es quimérica. En una modalidad, el polipéptido que tiene actividad GnTIII es un polipéptido de fusión. En otra modalidad, la ABM producida por la célula huésped es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. En una modalidad, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es humanizado. En una modalidad más, el ABM comprende una región equivalente a la región Fe de una IgG humano. La invención está también dirigida a un polinucleótido aislado que comprende por lo menos una región (por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco, o seis) determinante de complementariedad del anticuerpo ICR62 de rata o una variante o forma truncada del mismo que contiene por lo menos los residuos determinantes de especificidad para dicha región determinante de complementariedad, donde dicho polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión. Preferiblemente, dichos polinucleótidos aislados codifican un polipéptido de fusión que es una molécula de unión al antígeno. En una modalidad, el polinucleótido comprende tres regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo ICR62 de rata, o variantes o formas truncadas del mismo que contienen por lo menos los residuos determinantes de especificidad para cada una de las tres regiones determinantes de complementariedad. En otra modalidad, el polinucleótido codifica la región variable entera de la cadena ligera o pesada de un anticuerpo quimérico (por ejemplo, humanizado) . La invención está además dirigida a los polipéptidos codificados por dichos polinucleótidos. En otra modalidad, la invención está dirigida a una molécula de unión al antígeno que comprende por lo menos una (por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco o seis) regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo ICR62 de rata, o una variante o forma truncada del mismo, que contiene por lo menos los residuos determinantes de especificidad para dicha región determinante de complementariedad, y que comprende una secuencia derivada de un polipéptido heterólogo. En una modalidad, la molécula de unión al antígeno comprende tres regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo ICR62 de rata o variantes o formas truncadas del mismo que contienen por lo menos los residuos determinantes de especificidad para cada una de dichas tres regiones determinantes de complementariedad. En otro aspecto, la molécula de unión al antígeno comprende la región variable de un anticuerpo de cadena ligera o pesada. En una modalidad particularmente útil, la molécula de unión al antígeno es un anticuerpo quimérico, (por ejemplo humanizado) . La invención está también dirigida a los métodos para preparar dichas moléculas de unión al antígeno, y al uso de estas en el tratamiento de la enfermedad, incluyendo las malignas tales como cánceres de la vejiga, cerebro, cabeza y cuello, páncreas, pulmón, mama ovario, colon próstata piel y riñon . La célula huésped de la presente invención puede seleccionarse del grupo que incluye, pero que no está limitada a una célula HEK293-EBNA una célula CHO, una célula BHK, una célula NSO, una célula SP2/0, una célula de mieloma YO, una célula de mieloma de ratón P3X63, una célula PR, una célula PER, una célula PER.C6 o una célula de hibridoma. En una modalidad, la célula huésped de la invención comprende además un polinucleótido transfectado que comprende un polinucleótido que codifica la región VL del anticuerpo ICR62 de rata o variantes del mismo y una secuencia que codifica una región equivalente a la región Fe de una inmunoglobulina humana. En otra modalidad la célula huésped de la invención comprende además un polinucleótido transfectado que comprende un polinucleótido que codifica la región VH del anticuerpo ICR62 de rata o variantes del mismo y una secuencia que codifica una región equivalente a la región Fe de una inmunoglobulina humana. En un aspecto adicional, la invención está dirigida a una célula huésped que produce una ABM que exhibe una afinidad incrementada de unión al receptor Fe y/o una función efectora incrementada como resultado de la modificación de sus oliqosacáridos . En una modalidad, el aumento de la afinidad de unión es para un receptor Fe, particularmente Fc?RIIIA. La función efectora contemplada aquí puede seleccionarse del grupo que incluye, pero que no está limitada a, aumento de la citotoxicidad celular mediada por Fe; aumento de la unión a las células NK; aumento de la unión a macrófagos; aumento de la unión poliformonucleares; aumento de la unión a monolitos; aumento de la señalización directa inductora de apoptosis; aumento de la maduración de células dendríticas; y aumento de la preparación de célula T. En una modalidad adicional, la célula huésped de la presente invención comprende por lo menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad GnTIII que está ligado emparejado a un elemento promotor constitutivo. En otro aspecto la invención está dirigida a un método para producir una ABM en una célula huésped, que comprende: (a) cultivar una célula huésped manipulada para expresar por lo menos un polinucleótido que codifica un polipéptido de fusión que tiene actividad GnTIII bajo condiciones que permiten la producción de dicha ABM y que permiten la modificación de los oligosacáridos presentes en la región Fe de dicha ABM; y (b) aislar dicha ABM; donde dicha ABM es capaz de competir con el anticuerpo ICR62 de rata para la unión con EGFR y donde dicha ABM es quimérica (por ejemplo humanizada) . En una modalidad, el polipéptido que tiene actividad GnTIII es un polipéptido de fusión, preferiblemente uno que comprende el dominio catalítico de GnTIII y el dominio de localización Golgi de un polipéptido Golgi heterólogo seleccionado del grupo que consiste en el dominio de localización de manosidasa II, el dominio de localización de ß ( 1, 2 ) -N-acetilglucosaminiltransferasa II ("GnTII"), el dominio de localización de manosidasa I, el dominio de localización de ß(l,2)-N-acetilglucosaminiltransferasa II ("GnTII"), y el domino de localización de una fucosiltransferasa del núcleo al-6. Preferiblemente, el domino de localización Golgi es de manosidasa II o GnTI. En un aspecto más la invención está dirigida a un método para modificar el perfil de glicosilación de un ABM anti-EGFR producido por una célula huésped que comprende introducir dentro la célula huésped, por lo menos un ácido nucleico o un vector de expresión de la invención. En una modalidad la ABM es un anticuerpo de un fragmento de la misma; preferiblemente comprende la región Fe de una IgG. Alternativamente, el polipéptido es una proteína de fusión que incluye una región equivalente a la región Fe de un IgG. En un aspecto la invención está relacionada con un anticuerpo quimérico recombinante o con un fragmento del mismo, capaz de competir con el anticuerpo ICR62 de rata para la unión a EGFR y que tiene fucosilación reducida. En otro aspecto, la presente está dirigida a un método para modificar la glicosilación del anticuerpo recombinante o un fragmento del mismo de acuerdo con la invención mediante el uso de un polipéptido de fusión que tiene actividad GnTIII y que comprende el dominio de localización Golgi de un polipéptido residente Golgi heterólogo. En una modalidad los polipéptidos de fusión de la invención comprenden el dominio catalítico de GnTIII. En otra modalidad, el dominio de localización Golgi está seleccionado del grupo que consiste en el dominio de localización de manosidasa II, el dominio de localización de GnTI, el dominio de localización de manosidasa I, el dominio de localización de manosidasa I, el dominio de localización de GnTII y el dominio de localización de GnTII y el dominio de localización de una fucosiltransferasa de núcleo al-6. Preferiblemente, el dominio de localización Golgi es de manosidasa II o GnTI. En una modalidad, el método de la invención está dirigido a la producción de un anticuerpo recombinante, quimérico, o un fragmento del mismo, con oligosacáridos modificados donde dichos oligosacáridos modificados tienen fucosilación reducida en comparación con los oligosacáridos no modificados. De acuerdo con la presente invención estos oligosacáridos modificados pueden ser híbridos o complejos. En otra modalidad el método de la invención está dirigido a la producción de un anticuerpo recombinante, quimérico (por ejemplo humanizado) o un fragmento del mismo que tiene una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados divididos en la región Fe de dicho polipéptido. En una modalidad, los oligosacáridos divididos no fucosilados son híbridos. En otra modalidad, los oligosacáridos no fucosilados divididos son complejos. En una modalidad adicional el método de la invención está dirigido a la producción de un anticuerpo quimérico recombinante o un fragmento del mismo que tiene por lo menos 20% de los oligosacáridos en la región Fe de dicho polipéptido que están divididos, no fucosilados. En una modalidad preferida, por lo menos el 30% de los oligosacáridos en la región Fe de dicho polipéptido que están divididos, no fucosilados. En otra modalidad preferida, por lo menos el 35% de los oligosacáridos en la región Fe de dicho polipéptido están divididos, no fucosilados. En un aspecto adicional, la invención está dirigida a un anticuerpo recombinante, quimérico o a un fragmento del mismo, que exhibe un aumento de la afinidad de unión al receptor Fe y/o un aumento de la función efectora como resultado de la modificación de sus oligosacárido . En una modalidad, el aumento de afinidad de unión es para un receptor activador de Fe. En una modalidad más el receptor Fe es el receptor activador Fe y particularmente el receptor Fc?RIIIA. La función efectora contemplada aqui puede seleccionarse del grupo que incluye, pero que no está limitado a un aumento de la citotoxicidad celular mediada por Fe; aumento de la unión a la células NK; aumento de la unión a macrófagos; aumento de la unión a células polimorfonucieares; aumento de la unión monolitos; aumento de señalización directa que induce apoptosis; aumento de maduración de células dendríticas; y aumento de la preparación de células T. En otro aspecto, la invención está dirigida a un fragmento de anticuerpo recombinante, quimérico (por ejemplo humanizado) , que tiene la especificidad de unión del anticuerpo ICR62 de rata y que contiene la región Fe, que está manipulada genéticamente para tener una función efectora incrementada producida por cualquiera de los métodos de la presente invención. En otro aspecto la presente invención está dirigida a una proteína de fusión que incluye un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO.: 1; SEC ID No: 3; SEC ID No: 5; SEC ID No: 7; SEC ID No: 9; SEC ID No: 11; SEC ID No: 13; SEC ID No: 15; SEC ID No: 17; SEC ID No:19; SEC ID No:21; SEC ID No:23; SEC ID No:25; SEC ID No:27; SEC ID No:29; SEC ID No:31; SEC ID No:33; SEC ID No:35; SEC ID No:37; SEC ID No:39; y SEC ID No:121, y una región equivalente a la región Fe de un a inmunoglobulina y que está manipulada para tener una función efectora incrementada producida por cualquiera de los métodos de la presente invención. En otro aspecto la presente invención está dirigida a una proteína de fusión que incluye a un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID No: 43, SEC ID No: 45; SEC ID No:49; y SEC ID No:51 y una región equivalente a la región Fe de una inmunoglobulina y manipulada para tener una función efectora incrementada producida por cualquiera de los métodos de la presente invención . En un aspecto, la presente invención está dirigida a una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo recombinante, quimérico (por ejemplo humanizado), producido por cualquiera de los métodos de la presente invención, y un portador farmacéuticamente aceptable. En otro aspecto, la presente invención está dirigida a una composición farmacéutica que comprende un fragmento de anticuerpo recombinante, quimérico (por ejemplo: humanizado), producido por cualquiera de los métodos de la presente invención, y un portador farmacéuticamente aceptable. En otro aspecto, la presente invención está dirigida a una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión producida por cualquiera de los métodos de la presente invención, y un portador farmacéuticamente aceptable. En un aspecto más, la invención está dirigida a un método para seleccionar el objetivo in vivo o in vi tro en células que expresan el EGFR. En una modalidad, la presente invención está dirigida a un método para seleccionar células que expresan EGFR en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una ABM de la invención. En un aspecto más, la presente invención está dirigida a un método para detectar in vivo o in vi tro la presencia de EGFR en una muestra, por ejemplo para diagnosticar un trastorno relacionado con la expresión de EGFR. En una modalidad, la detección se lleva a cabo mediante el contacto de una muestra que debe ser ensayada, opcionalmente con una muestra de control, con un ABM de la presente invención bajo condiciones que permiten la formación de un complejo entre el ABM y EGFR. La formación del complejo es luego detectada (por ejemplo mediante ELISA u otros métodos conocidos en la técnica) . Cuando se usa una muestra de control con la muestra de ensayo, cualquier diferencia estadísticamente significativa en la formación de los complejos ABM-EGFR cuando se comparan las muestras de ensayo y de control, es indicativa de la presencia de EGFR en la muestra de ensayo. La invención está además dirigida a un método para el tratamiento de un trastorno relacionado con la expresión EGFR en particular un trastorno de proliferación de células donde se expresa el EGFR, y más particularmente donde el EGFR está expresado anormalmente (por ejemplo sobreexpresa), incluyendo cánceres de vejiga, cerebro, cabeza y cuello, páncreas, pulmón, mama, ovario, colon, próstata, piel y riñon que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo recombinante, quimérico (por ejemplo humanizado) o un fragmento del mismo producido por cualquiera de los métodos de la presente invención, a un sujeto humano que lo necesite BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra la actividad funcional de cadenas individuales pesadas y ligeras quiméricas de polipéptido ICR62 de rata-humano, cuando se combina con las construcciones I-HHC de ICR62 humanizado (cadena pesada) y I-KB (cadena ligera) . rVL representa la cadena ligera quimérica, y rVH representa la cadena pesada quimérica. La designación "r" indica que los dominios variables son del anticuerpo de rata original. La Figura 2 muestra la actividad de unión de los anticuerpos ICR62 humanizados que comprenden construcciones I-HHC, I-HHA y I-HLA de la región variable de cadena pesada y construcciones I-KA y I-KB de construcciones de región variable de cadenas ligeras humanizadas, emparejado en varias configuraciones . La Figura 3 muestra la actividad de unión de los anticuerpos ICR62 humanizados que comprende las construcciones I-HLB, I-HLC y I-HLA de región variable de cadena pesada y las regiones I-KA y I-KC de construcciones de región variable de cadena ligera humanizada emparejado en varias configuraciones. La Figura 4 muestra la actividad de unión de los anticuerpos ICR62 humanizados que comprenden las construcciones I-HLA2, I-HLA3 y I-HLA4 de región variable de cadena pesada y la construcción I-KC de región variable de cadena ligera humanizada en comparación con el anticuerpo ICR62 de rata-humano quimérico. La Figura 5 muestra la actividad de unión de los anticuerpos ICR62 humanizados que comprenden las construcciones de la región variable de cadena pesada y la construcción I-KC de región variable de cadena ligera humanizada en comparación con el anticuerpo ICR62 de rata-humano quimérico. La Figura 6 muestra la actividad de unión de los anticuerpo ICR62 humanizados que comprenden las construcciones I-HLA7, I-HLA6, de región variable de cadena pesada y la construcción I-KC de cadena ligera en comparación con el anticuerpo ICR62 de rata-humano quimérico. La Figura 7 muestra la actividad de unión de los anticuerpos ICR62 humanizados que comprenden las construcciones I-HHF, I-HLA9, y I-HLA8 de región variable de cadena pesada y la construcción I-KC de región variable de cadena ligera en comparación con el anticuerpo ICR62 de rata - humano quimérico. La Figura 8 muestra la actividad de unión de los anticuerpos humanizados que comprenden las construcciones I-HHB, I-HHD, I-HHG, I-HHF, I-HLA7, y I-HLA9 de la región variable de cadena pesada y la construcción I-KC de la región variable de cadena humanizada. La Figura 9 muestra una comparación de la citotoxicidad celular mediada por anticuerpos (ADCC) para varias glicoformas del anticuerpo ICR62 quimérico así como también para la variante I-HLA4 humanizada. "G2"se refiere a la glicomodificación del anticuerpo mediante la co-expresión con GnTIII. y ManíI. "WT" se refiere a los anticuerpos que no han sido sometidos a glicomanipulación. Las construcciones de cadena pesada humanizada se acoplaron con la construcción de cadena ligera I-KC. Las Figuras 10A y 10B muestran una comparación ADCC para la forma no glicomodificada (WT) y la glicoforma G2 (es decir, glicomodificada con mediante la co-expresión con GnTIII y ManíI) de las construcciones I-HHB y I-HLA7 de la anticuerpo ICR62 humanizado. Los mismos anticuerpos fueron aplicados a dos líneas de células objetivo diferentes: en la figura 10A se usó la línea de célula objetivo LN229; en la figura 10B, se usó la línea de la célula A431. Las construcciones de cadena pesada humanizadas se acoplaron con la construcción de cadena ligera I-KC. La Figura HA y Figura 11B muestran una comparación de ADCC para las formas no glicomodificadas (WT) y la glicoformas G2 de ICR62 quimérico, y las construcciones IHHB y I-HLA7 de anticuerpo de ICR62 humanizado. Se usó la línea celular objetivo A431. Las construcciones de cadena pesada humanizadas se acoplaron con la construcción de cadena ligera I-KC. La Figura 12 muestra una comparación de ADCC a las 72 horas para la glicoformas G2 de ICR62 quimérico, y las construcciones I-HHB y I-HLA7 de anticuerpos ICR62 humanizados. Las construcciones de cadena pesada humanizada se acoplaron con la construcción de cadena ligera I-KC. La Figura 13 muestra una alineación de secuencia de aminoácido de las construcciones de región variable de cadena pesada ICR62 humanizadas y en comparación con la secuencias ICR62 de rata. Los puntos representan la identidad de los residuos aminoácidos en una posición determinada dentro de una construcción determinada. La Figura 14 muestra un ensayo de unión FCgamaRIIIa-Fc usando células CHO que exhiben FCgamaRIIIa humana recombinante. Un anticuerpo IgGl anti-EGFR humanizado IHHB/KC glicomodificado, se comparó con un anticuerpo no-glicomodificado (WT) . La Figura 15 muestra un perfil de oligosacárido MALD/TOF-MS para el anticuerpo IgGl anti-EGFR humanizado glicomodificado, I-HHB/KC. La glicomanipulación lograda por la sobreexpresión en la células productoras de anticuerpo de genes que codifican encimas con actividades GnTIII y Golgi Manosidasa II, que proporcionan más de 70% de oligosacáridos ligados a Fc-Asn297-no fucosilados. La Figura 16 muestra un perfil de precisión anti-EGFR (n=6 replicas a través del intervalo de calibración) para la determinación de anti-EGFR en una matriz de suero de mono al 1% (CMS255/31/33 suero de mono provisto por HLS) . La Figura 17 muestra una curva de calibración anti- EGFR representativa para la determinación de anti-EEGFR en una matriz de suero de mono al 1%. La Figura 18 muestra concentraciones de suero de anti-EGFR en el dia 1 de administración intravenosa semanal de anti-EGFR a macacos machos. La Figura 19 muestra concentraciones de suero de suero anti-EGFR en el dia 1 de una administración intravenosa semanal de anti-EGFR a macacos hembra. La Figura 20 muestra la relación entre las áreas bajo las curva de concentración anti-EGFR en el suero tiempo (AUC168) y el nivel de dosis en el día 1 de una administración intravenosa semanal de anti-EGFR a macacos. La Figura 21 muestra la concentración de suero de anti-EGFR durante una administración intravenosa semanal de anti-EGFR a macacos machos. La Figura 22 muestra las concentraciones en el suero del anti-EGFR durante una administración intravenosa semanal de anti-EGFR a macacos hembras. La Figura 23 muestra el perfil MALDI/TOF-MS de oligosacáridos de anticuerpo anti-EGFR Fc-modificado (glico-modificado) para ser usado en los estudios in vivo llevados a cabo en monos, que se describen en los Ejemplos de la presente que figuran más abajo. La Figura 24 muestra la unión a EGFR que se expresa en la superficie de células de carcinoma epidermoide A431 humanas. El anticuerpo usado para el estudio de unión fue el anticuerpo anti-EGFR Fc-modificado (construcción I-HHB) que se usó en los estudios in vivo llevados a cabo en monos, que se describen en los Ejemplos de la presente que figuran más abajo. La Figura 25 muestra la unión a EGFR que se expresa en la superficie de células de riñon de mono COS-7. El anticuerpo usado fue el anticuerpo anti-EGFR (cadena pesada I-HHB; cadena ligera I-KC) . A modo de referencia, se muestra la unión a células que expresan EGFR humano inferior, células de cáncer de mama MCF-7. La Figura 26 muestra la unión Fc-FcgammaRIIIa usando una célula completa (células CHO modificadas para expresar FcgRIIIa humano en su superficie). El anticuerpo usado fue el anticuerpo anti-EGFR Fc-modificado (glicomodificado) que se usó en los estudios in vivo llevados a cabo en monos, que se describen en los Ejemplos de la presente que figuran más abajo. Se muestra con fines comparativos la unión de un anticuerpo IgGl control (no modificado) no Fc-modificado . La Figura 27 muestra la ADCC mediada por el anticuerpo anti-EGFR Fc-modificado (glicomodificado) . Las células objetivo son células de carcinoma de pulmón humano A549. Se muestra con fines comparativos la actividad ADCC para la forma del anticuerpo no Fc-manipulada (no modificada) . La Figura 28 muestra la ADCC mediada con anticuerpo anti-EGFR Fc-modificado (glicomodificado) . Las células objetivo son células de queratinocitos de mono cinomolgus CYNOM-Kl. Se muestra con fines comparativos la actividad ADCC para la forma del anticuerpo no Fc-manipulada (no modificada) . La Figura 29 muestra la unión objetivo a EGFR de diversas variantes de construcciones de cadena ligera en base a la construcción I-KC emparejado con la construcción I-HHD de cadena pesada. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los términos que se emplean aquí son los que son generalmente usados en la materia a menos que se definan de la manera siguiente. Tal como se usa aquí, el término an ti cuerpo incluye moléculas de anticuerpo enteras incluyendo anticuerpos monoclonales, policlonales y multi-específieos (por ejemplo bi-específieos ) , así como también fragmentos de anticuerpos que tienen una región Fe que retienen especificidad de unión, y proteínas de fusión que incluyen una región equivalente a la región Fe de una inmunoglobulina y que retienen especificidad de unión. Asimismo están también abarcados fragmentos que retienen especificidad de unión que incluyen pero que no están limitados a fragmentos VH, fragmentos VL, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos scFv, fragmentos Fv, minicuerpos, diacuerpos, triacuerpos y tretracuerpos (ver por ejemplo Hudson and Souriau, Na ture Med. 9: 129-134 (2003)). Asimismo están también abarcados los anticuerpos humanizados, privatizados y quiméricos. Tal como se usa aquí el término región Fe se refiere a una región C terminal de una cadena pesada de IgG. Aunque los límites de la región Fe de una cadena IgG podrían variar muy ligeramente, la región Fe de la cadena pesada de IgG humana está usualmente definida para estirarse desde el residuo aminoácido en la posición Cys226 hasta el término carboxilo . Tal como se usa aquí, el término región equivalente a la región Fe de una inmunoglobulina incluye variantes alélicas naturales de la región Fe de una inmunoglobulina así como también variantes que tienen alteraciones que producen sustituciones adiciones o eliminaciones pero que no disminuyen sustancialmente la capacidad de la inmunoglobulina para intermediar las funciones efectoras (tales como citotoxicidad celular dependientes de anticuerpos). Por ejemplo pueden eliminaciones 1 o más aminoácidos del N-término o C-término de la región Fe de una inmunoglobulina sin pérdida sustancial de la función biológica. Dichas variantes pueden seleccionarse de acuerdo con las reglas generales que se conocen en la materia de modo que tengan un efecto mínimo sobre la actividad. Ver por ejemplo Bowie, J. U. y otros , Science 247:1306-1310 (1990). Tal como se usa aquí, el término EGFR se refiere al receptor de factor de crecimiento epidérmico humano (conocido también como HER-1 o Erb-Bl) (Ulrich, A. y otros , Na ture 309:418-425 (1984); No. de acceso SwissProt #P00533; números de acceso secundarios: 000688, 000732, P06268, Q14225, Q92795, Q9BZS2, Q9GZX1, Q9H2C9, Q9H3C9, Q9UMD7, Q9UMD8, Q9UMG5), así como también las isoformas naturales y las variantes de las mismas. Las isoformas y variantes incluyen peor no están limitadas a la variante EGFRvIII, a productos alternativos de corte y empalme (por ejemplo tal como los identificado por SwissProt Números de Acceso #P00533-1, P00533-1, P00533-2, P00533-3, P00533-4), variantes GLN-98, ARG-266, Lys-521, ILE-674, GLY-962, y PR0-988 (Livingston, R.J. y otros , NIEHS-SNPs, proyecto de genoma ambiental, NIEHS ES15478, Department of Genome Sciences, Seattle, WA (2004)), y otros identificados por los números de acceso siguientes: NM_005228.3, NM_201282.1, NM_201283.1, NM_201284.1 (REFSEC mRNAs); AF125253.1, AF277897.1, AF288738.1, AI217671.1, AK127817.1, AL598260.1, AU137334.1, AW163038.1, AW295229.1, BC057802.1, CB160831.1, K03193.1, U48722.1, U95089.1, X00588.1, X00663.1; H54484S1, H54484S3, H54484S2 (ensamble MIPS); DT.453606, DT.86855651, DT.95165593, DT.97822681, DT.95165600, DT .100752430, DT.91654361, DT.92034460, DT.92446349, DT.97784849, DT .101978019 , DT.418647, DT.86842167, DT.91803457, DT.92446350, DT.95153003, DT.95254161, DT.97816654, DT.87014330, DT.87079224 (Ensamble DOTS) . Tal como se usa aqui, el término ligando EGFR se refiere a un polipéptido que se une y/o activa el EGFR. El término incluye formas precursores unidas a membranas del ligando EGFR, así como también formas solubles proteolíticamente procesadas del ligando EGF. Tal como se usa aquí el término a ctiva ción del ligando de EGFR se refiere a la transducción de señales (por ejemplo la causada por dominio cinasa intracelular de los residuos tirosinafosforilantes del receptor EGF, en el EGFR o un sustito polipeptídico) intermediado por la unión del ligando EGFR. Tal como se usa aquí, el término enfermedad o trastorno cara cterizado por una a ctivación o producción anorma l de EGFR o de un ligando EGFR o un trastorno rela cionado con la expresión de EGFR se refiere a un trastorno, que puede involucrar o no para tener la certeza de tumores malignos o cáncer, donde la activación y/o producción anormal de EGFR y/o de un ligando EGFR, ocurre en células o tejidos de un sujeto que tiene o que está predispuesto a tener la enfermedad o trastorno. Tal como se usan aquí, los términos sobreexpresa , sobreexpresado y sobreexpresión que se usan con referencia a células que expresan EGFR, se refiere a células que tienen niveles mencionablemente más elevados de EGFR en la superficie de los mismos en comparación con una célula normal del mismo tejido. Dicha sobreexpresión puede ser causada por amplificación génica o por el aumento de la transcripción o traducción. La expresión de EGFR (por lo tanto sobreexpresión) puede determinarse en una ensayo de diagnóstico o pronóstico evaluando los niveles de EGFR presentes en la superficie de una célula o en un lisado de célula mediante técnicas que son conocidas en la técnica por ejemplo a través de un ensayo de inmunohistoquímica, inmunofluorescencia, un ensayo de inmunoenzimas, un ELISA, por citometría de flujo, radioinmunoensayo, Western blot, unión de ligando, actividad de cinasa etc. (ver en términos generales, CELL BIOLOGY: A LABORATORY HANDBOOK, Celis, J. , ed., Academic Press (2d ed., 1998); CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE, Coligan, J.E. y otros , eds., John Wiley & Sons (1995-2003); ver también , Sumitomo y otros , Clin . Cáncer Res . 10: 794-801 (2004) (que describe Western blot, citometría de flujo e inmunohistoquímica) los contenidos completos de los cuales se incorporan aquí como referencia)). Alternativamente o adicionalmente, pueden medirse los niveles de moléculas de ácido nucleico que codifican EGFR en la célula por ejemplo mediante hibridación fluorescente in si tu, Southern blotting o técnicas de PCR. Los niveles de EGFR en células normales se compararon con los niveles de células afectadas por un trastorno de proliferación de células (por ejemplo cáncer) para determinar si el EGFR estaba sobreexpresado . Tal como se usa aquí el término molécula de unión al an tígeno se refiere en su sentido más amplio a una molécula que se une específicamente a un determinante antigénico más específicamente, una molécula de unión al antígeno que se une a EGFR es una molécula que específicamente se une a un receptor de transmembrana de 170 kDa, designado típicamente como receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) pero se conoce también como HER-1 o ErbBl. Mediante "que se une específicamente" se indica que la unión es selectiva para el antígeno y que puede ser discriminada de las interacciones no deseadas o no específicas . Tal como se usan aquí los términos fusión y quimérico, cuando se usan con referencia a los polipéptidos tales como ABM, se refieren a polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos derivados de 2 o más polipéptidos heterólogos, tales como porciones de anticuerpos de especies diferentes. Para los ABM quiméricos, por ejemplo los componentes de unión que no son de antígeno, pueden derivar de una amplia variedad de especies incluyendo primates tales como chimpancés y seres humanos. La región constante del ABM quimérico es más preferiblemente y sustancialmente idéntica a la región constante de un anticuerpo humano natural; la región variable del anticuerpo quimérico es más preferiblemente y sustancialmente idéntica a la de un anticuerpo anti-EGFR recombinante que tiene la secuencia de amino ácido de la región variable murina. Los anticuerpos humanizados son una forma o fusión particularmente preferida o un anticuerpo quimérico. Tal como se usa aquí, un pol ipéptido que tiene a ctividad Gn TIII se refiere a polipéptidos que son capaces de catalizar la adición de un residuo (N-acetilglucosamina (GlcNAc) en un enlace ß-1-4 con la manosida ligada a ß del núcleo trimanosilo de oligosacáridos N-ligados. Esto incluye polipéptidos de fusión que exhiben actividad enzimático similar pero o necesariamente idéntica, a la actividad de la ß ( 1, 4 ) -N-acetilglucosaminiltransferasa III, conocida también como ßl , 4-manosil-glicoproteína 4-beta-N-acetilglucosaminiltransferasa (EC 2.4.1.144), de acuerdo con el comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (NC-IUBMB, por sus siglas en inglés), medida en un ensayo biológico particular con o sin dependencia de dosis. En caso de que exista la dependencia de dosis, no es necesario que sea idéntica a la de GnTII, sino que debe ser sustancialmente similar a la dependencia de dosis en una actividad determinada, en comparación con el GnTIII (es decir el polipéptido candidato exhibirá mayor actividad o no más de aproximadamente 25 veces menos, y preferiblemente no más de aproximadamente 10 veces menos actividad y aún más preferiblemente, no más de aproximadamente 3 veces menos actividad en relación al GnTIII) . Tal como se usa aquí, el término varian te (o análogo) se refiere a un polipéptido que difiere del polipéptido específicamente mencionado de la invención por las inserciones, eliminaciones y sustituciones, de aminoácido, creadas usando por ejemplo, técnica de ADN recombinante. Las variantes de la ABM de la presente invención incluyen moléculas de unión de antígeno quimérica, privatizadas o humanizadas donde uno o varios de los residuos aminoácidos están modificados por sustitución, adhesión y/o eliminación de tal manera que no afectan sustancialmente la afinidad de unión del antigeno (por ejemplo, EGFR). La guía para determinar cuáles residuos aminoácido pueden ser reemplazados, agregados o eliminaciones sin anular las actividades de interés, pueden encontrarse comparando la secuencia del polipéptido particular con la de los péptidos homólogos y minimizando la cantidad de cambios de secuencia de aminoácido efectuada en las regiones de alta homología (regiones conservadas) o reemplazando aminoácidos con secuencia de consenso.

Alternativamente, las variantes recombinantes que codifican péptidos similares o los mismos polipéptidos pueden sintetizarse o seleccionarse utilizando la "redundancia" del código genético. Varias sustituciones de codones, tales como los cambios silentes que producen varios sitios de restricción, pueden ser introducidas para optimizar la clonación en un plásmido o en un vector viral o para la expresión en un sistema procariótico o eucariótico particular. Las mutaciones en la secuencia polinucleotídica pueden estar reflejadas en el polipéptido o en los dominios de otros péptidos agregados al polipéptido para modificar las propiedades de cualquier parte del polipéptido, para cambiar las características tales como las afinidades de unión al ligando, las afinidades de intercadena o el ritmo de degradación/renovación. Preferiblemente, las "sustituciones" son el resultado del reemplazo de un aminoácido por otro aminoácido que tenga propiedades estructurales y/o químicas similares, es decir reemplazos de aminoácido conservadora. Las sustituciones de aminoácido "Conservadoras" pueden efectuarse en base a la similitud de polaridad, carga, solubilidad, hidrofungicidad, hidrofiligidad, y/o naturales anfifática de los residuos involucrados. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrofóbicos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano, y metionina; los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, y glutamina: los aminoácidos positivamente cargados (básicos) incluyen arginina, lisina, e histidina; y los aminoácidos negativamente cargados (ácidos) incluyen ácidos aspártico y glutámico. Las "Inserciones" o "Eliminaciones" están preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 1 a 20 aminoácidos más preferiblemente 1 a 10 aminoácidos. La variación permitida puede ser determinada experimentalmente mediante inserciones, eliminaciones o sustituciones sistemáticas de aminoácidos en una molécula de polipéptido usando de ADN recombinante y ensayando las variantes recombinante resultantes para determinar la actividad. Tal como se usa aquí, el término humani zado se usa para referirse a una molécula de unión al antígeno derivada, de una molécula de unión al antigeno no humana, por ejemplo un anticuerpo murino, que retiene, o que retiene sustancialmente las propiedades de unión al antíqeno de la molécula principal pero que es meno inmunogénica en los seres humanos. Esto puede lograrse por varios métodos que incluyen (a) insertar los dominios variables no humanos enteros sobre regiones constantes humanas para generar anticuerpos quiméricos, (b) injertar únicamente los CDR no humanos sobre una estructura humana y regiones constantes con o sin retención de residuos estructurales críticos (por ejemplo, que sean importantes para retener buenas funciones de afinidad o de anticuerpo de unión al antígeno) , o (c) trasplantar los dominios variables no humanos enteros, pero "disimularlos" con una sección de tipo humano mediante el reemplazo de residuos superficiales. Dichos métodos pueden estar descritos en Jones y otros, Morrison y otros, Proc. Na ti . Acad . Sci . , 81:6851-6855 (1984); Morrison y Oi, Adv. Immunol . , 44:65-92 (1988); Verhoeyen y otros, Science, 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec . Immun . , 28:489-498 (1991); Padlan, Molec . Immun . , 31 ( 3 ): 169-217 (1994), todos los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad. Existen generalmente 3 regiones determinantes complementarias o CDR, (CDR1, CDR2 y CDR3) en cada uno de los dominios variables de cadena pesada y de cadena ligera de un anticuerpo, que están flanqueadas por cuatro sub-regiones estructurales (es decir, FR1, FR2 , FR3, y FR4 ) en cada uno de los dominios variables de cadena pesa y ligera de un anticuerpo: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Una discusión de los anticuerpos humanizados puede encontrarse, entre otras, en la Patente Norteamericana No. 6,632,927, y en la Solicitud Norteamericana Publicada No. 2003/0175269, incorporándose ambas aquí como referencia en su totalidad. De manera similar, a la que se usa aquí, el término prima tizados se emplea para referirse a una molécula de unión al antigeno derivada de una molécula de unión al antígeno, que no es de primate, por ejemplo un anticuerpo murino, que retiene o retiene substancialmente las propiedades de unión al antígeno de la molécula principal pero que es menos inmunogénica en primates. Cuando existen dos o más definiciones de un término que se usa y/o que es aceptado en la técnica, la definición de los mismos que se emplea aquí incluirá todos dichos significados al menos que se manifieste explícitamente lo contrario. Un ejemplo específico es el uso del término "región determinante de complementariedad" ("CDR") para describir los sitios de combinación de antígeno no contiguos que se encuentran dentro de la región variables tanto de los polipéptidos de cadena pesada como de cadena ligera. Esta región particular ha sido descrita por Kabat y otros, U.S. Dept . of Health y Human Services, "SECuences of Proteins of Immunological Interest" (1983) y de Chothia y otros, J. Mol . Biol . 196:901-917 (1987), que se incorporan aquí como referencia donde las definiciones incluyen la superposición o sub-grupos de residuos aminoácidos cuando se comparan entre sí. Sin embargo la aplicación de cualquier definición para hacer referencia a las CDR de un anticuerpo o variantes del mismo debe estar dentro del alcance del término definido y usado aquí. Lo residuos aminoácidos apropiados que abarcan la CDR definidas en cualquiera de las referencias anteriormente citadas se establecen a continuación en la Tabla I como comparación. Las cantidades exactas de residuos que abarcan una CDR particular, variarán dependiendo de la secuencia y del tamaño de la CDR. Los expertos en la materia podrán determinar en forma rutinaria cuales son los residuos que comprenden una CDR particular dada la secuencia de aminoácido de región variable del anticuerpo. TABLA 1. Definiciones de CDR 1 La numeración de todas las definiciones de CDR en la Tabla 1 está de acuerdo con las convenciones de numeración establecidas por Kabat y otros, (ver a continuación). 2 "AbM" se refiere a la CDR definidas por el software de modelación de anticuerpos Oxford Molecular' s "AbM".

Kabat y otros, define también un sistema de numeración par secuencias de dominio variable que es aplicable a cualquier anticuerpo. Un experto en la materia podrá asignar sin ambigüedades este sistema de "numeración Kabat" a cualquier secuencia de dominio variable sin basarse en ningún dato experimental más allá de la secuencia misma. Tal como se usa aquí, "Numeración Kabat" se refiere al sistema de numeración establecido por Kabat y otros, U.S. Dept . of Health y Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). A menos que se especifique lo contrario, la referencia a la numeración de las posiciones de los residuos aminoácidos específicos en una ABM se efectúan de acuerdo con el sistema de numeración Kabat. Las secuencias del listado de secuencias (es decir, SEC ID NO:l a SEC ID NO: 127) no están numeradas de acuerdo con el sistema de numeración Kabat. Sin embargo tal como se manifestó previamente está dentro de la experiencia normal en la materia, determinar el esquema de numeración Kabat de cualquier secuencia de región variable en el Listado de Secuencias en base a la numeración de las secuencias que se presentan allí. Mediante un ácido nucleico o polinucleótido que tiene una secuencia nucleotídica que es por lo menos por ejemplo, 95% "idéntica" a una secuencia nucleotídica de referencia de la presente invención, se indica que la secuencia nucleotídica del polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia polinucleotídica puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia nucleotidica de referencia. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tenga una secuencia nucleotídica, por lo menos 95% idéntica a una secuencia nucleotídica de referencia, hasta 5% de los nucleótidos de la secuencia de referencia pueden ser eliminaciones o sustituidos con otro nucleótido, o, una cantidad de nucleótidos hasta el 5% de los nucleótidos totales en la secuencia de referencia pueden insertarse dentro de la secuencia de referencia. En la práctica, si cualquier molécula de aminoácido particular o polipéptido es por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico a una secuencia nucleotidica o secuencia polipeptídica de la presente invención, puede ser determinado convencionalmente usando programas de computadora conocido. Un método preferido para determinar cuál es el mejor emparejamiento general entre una secuencia de consulta (una secuencia de la presente invención) y una secuencia sometida, denominada también alineación de secuencia global, puede determinarse usando el programa de computadora FASTDB en base al algoritmo de Brutlag y otros , Comp . App . Biosci . 6:237-245 (1990). En una alineación de secuencia la secuencia de consulta y sometida son ambas secuencias de ADN. Una secuencia de ARN puede compararse para convertir las U' a T'. El resultado de dicha alineación de secuencia global está en identidad porcentual. Los parámetros preferidos que se usan en una alineación FASTDB de secuencias de ADN para calcular el porcentaje de identidad son: Matriz=Unitaria, k-tupla=4, Penalidad por Error de Coincidencia=l, Penalidad de unión=30, Longitud de Grupo al Azar=0, Puntuación de corte=l, Penalidad de hueco=5, Penalidad de Tamaño de Hueco 0.05, Tamaño de Ventana=500 o longitud de la secuencia nucleotídica sometida, cualquiera que sea la más corta. Si la secuencia sometida es más corta que la secuencia de consulta debido a eliminaciones 5' o 3', y no debido a eliminaciones internas, debe efectuarse una corrección manual en los resultados. Esto se debe a que el programa FASTDB no cuenta las truncaciones 5' y 3' de la secuencia sometida cuando calcula la identidad porcentual. Para la secuencia sometida truncada en los extremos 5' o 3', en relación a la secuencia de consulta, el porcentaje de identidad se corrige calculando la cantidad de bases de la secuencia de consulta que están en 5' y 3' de la secuencia sometida, que no están emparejado/alineadas, como un porcentaje de las bases totales de la secuencia de consulta. Si un nucleótido está emparejado/alineado se determina por los resultados de la alineación de secuencia FASTDB. Este porcentaje se extrae luego de la identidad porcentual, se calcula mediante el programa FASTDB anterior usando los parámetros especificados, para llegar a un resultado final de identidad porcentual. Este resultado corregido es el que se usa para los propósitos de la presente invención. Únicamente las bases que están fuera de las bases 5' y 3' de las secuencias sometida, tal como se exhiben en la alineación FASTDB, que no están emparejadas/alineadas con la secuencia de consulta, son calculadas para los propósitos de ajuste manual del resultado de identidad porcentual. Por ejemplo, una secuencia sometida de 90 bases se alinea con una secuencia de consulta de 100 bases para determinar el porcentaje de identidad. Las eliminaciones ocurren en el extremo 5' de las secuencias sometidas y por lo tanto, la alineación FASTDB no muestra un emparejamiento/alineación de las primeras 10 bases en el extremo 5'. Las 10 no emparejadas representan el 10% de la secuencia (numeración de bases en los extremos 5' y 3' no emparejado/cantidad total de bases en la secuencia de consulta) de manera que se extrae el 10% del resultado de identidad porcentual calculado por el programa FASTDB. Si las 90 bases restantes estuvieran perfectamente emparejadas el porcentaje final de identidad sería del 90%. En otro ejemplo, se compara una secuencia sometida de 90 bases con una secuencia de consulta de 100 bases. Esta vez, las eliminaciones son eliminaciones internas de manera que no hay bases en 5' o 3' de las secuencias sometida que no estén emparejado/alineadas con la de consulta. En este caso el porcentaje de identidad calculado para FASTDB no está manualmente corregido. Una vez más, únicamente las bases 5' y 3' de las secuencias sometida que no están emparejado/alineadas con la secuencia de consulta son manualmente corregidas. No se efectúa ninguna otra corrección manual para los propósitos de la presente invención. Mediante un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido que es por lo menos, por ejemplo, 95% "idéntica" a una secuencia de aminoácido de consulta de la presente invención, se indica que la secuencia de aminoácido del polipéptido sometida es idéntica a la secuencia de consulta excepto que la secuencia del polipéptido sometida puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácido por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácido de consulta. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácido por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácido de consulta, hasta el 5% de los residuos aminoácido en la secuencia sometida puede ser insertada, eliminada, o sustituida con otro aminoácido. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden ocurrir en las posiciones amino o carboxi terminales de la secuencia de aminoácido de referencia o en cualquier otra parte entre aquellas posiciones terminales, interdispersadas ya sea individualmente entre residuos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. En la práctica, si cualquier polipéptido particular es por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico a un polipéptido de referencia, puede determinarse convencionalmente usando programas de computadora conocidos. Un método preferido para determinar el mejor emparejamiento general entre una secuencia de consulta (una secuencia de la presente invención) y una secuencia sometida, denominada también alineación de secuencia global, puede determinarse usando el programa de computadora FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag y otros , Comp . App . Biosci . 6:237-245 (1990). En una alineación de secuencias las secuencias de consulta y sometida son o bien ambas secuencias nucleotídicas o ambas secuencias de aminoácido. El resultado de dicha alineación de secuencia global se da en porcentaje de identidad. Los parámetros preferidos usados en una alineación de aminoácido FASTDB son: Matriz=PAM 0, k-tupla=2, Penalidad por error emparejamiento=l, Penalidad de unión=20, Longitud del Grupo al azar=0, Puntuación del Corte=l, Tamaño de Ventana=longitud de secuencia, Penalidad del hueco=5, Penalidad por el Tamaño del huevo=0.05, Tamaño de Ventana=500 o la longitud de la secuencia de aminoácido sometida cualquiera sea más corta.

Si la secuencia sometida es más corta que la secuencia de consulta debido a eliminaciones N- o C-terminales, y no debido a eliminaciones internas, debe efectuarse una corrección manual en los resultados. Esto es debido a que el programa FASTDB no cuenta las truncaciones N-y C-terminales de las secuencias sometida cuando calcula la identidad de porcentaje global. Para las secuencias sometida truncadas en los términos N- y C-, en relación a la secuencia de consulta, los porcentajes de identidad se corrige calculando la cantidad de residuos de la secuencia de consulta que son N- y C-terminales de las secuencias sometida, que no han sido emparejado/alineadas con un residuo sometida correspondiente, como un porcentaje de las bases totales de la secuencia de consulta. Si un residuo está emparejado/alineado se determina por los resultados de la alineación de secuencia FASTDB. Este porcentaje es luego restado de la identidad porcentual, calculada mediante el programa FASTDB anterior usando los parámetros especificados para llegar a un resultado final de identidad porcentual. Este resultado de identidad porcentual final es el que se usará para los propósitos de la presente invención. Únicamente los residuos de los términos N- y C- de las secuencias sometida, que no han sido emparejados/alineados con la secuencia de consulta, se considerarán para los propósitos de ajuste manual del resultado de identidad porcentual. Es decir, únicamente las posiciones de residuos de consulta fuera de los residuos N y C-terminales más alejados de la secuencia sometida. Por ejemplo, una secuencia sometida de 90 residuos aminoácidos, es alineada con una secuencia de consulta de 100 residuos para determinar el porcentaje de identidad. La eliminación ocurre en el término N de las secuencias sometida y por lo tanto, la alineación FASTDB no muestra un emparejamiento/alineación de los primeros 10 residuos en el término N. Los 10 residuos no emparejados representan el 10% de la secuencia (cantidad de residuos en los términos N- y C-no emparejados/cantidad total de residuos en la secuencia de consulta) de modo que se resta el 10% de identidad del resultado calculado por el programa FASTDB. Si los 90 residuos remanentes están perfectamente emparejados la identidad porcentual final sería del 90%. En otro ejemplo, se compara una secuencia sometida de 90 residuos con una secuencia de consulta de 100 residuos. Esta vez, las eliminaciones son eliminaciones internas de manera que no existe ningún residuo en los N- o C-términos de la secuencia sometida que no esté emparejado/alineado con la de consulta. En este caso el porcentaje de identidad calculado por FASTDB no se corrige manualmente. Nuevamente, únicamente las posiciones de residuos fuera de los extremos N- y C-terminales de la secuencia sometida, tal como se exhibe en la alineación FASTDB, que no están emparejados/alineados con la secuencia de consulta son corregidas manualmente. Ninguna otra corrección manual debe efectuarse para los propósitos de la presente invención. Tal como se usa aquí, un ácido nucleico que "híbrida baj o condiciones rigurosas" con una secuencia de ácido nucleico de la invención, se refiere a un polinucleótido que se hibrida en una incubación nocturna a 42°C en una solución que comprende el 50% de formamida, 5x SSC (750 mM NaCl, 75 mM de citrato de sodio), 50 mM de fosfato de sodio (pH 7,6), 5x de solución de Denhardt, 10% de sulfato de dextrina, y 20 µg/ml de ADN de esperma de salmón fundido, desnaturalizado, seguido del lavado de los filtros en O.lx SSC a aproximadamente 65°C. Tal como se emplea aquí el término Dominio de locali za ción Golgi se refiere a la secuencia de aminoácido de un polipéptido residente Golgi que es responsable del anclaje del polipéptido en la ubicación dentro del complejo Golgi. En general los dominios de localización comprenden "colas" terminales amino, de una enzima. Tal como se emplea aquí el término función efectora se refiere a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fe (una región Fe de secuencia natural o una región Fe variante de secuencia de aminoácido) de un anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpos se incluyen, pero no están limitadas a, una afinidad de unión al receptor Fe, citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) , fagocitosis celular dependiente del anticuerpo (ADCP) , secreción de citocina, absorción de antígeno mediada por inmunidad-complejo, por células presentadoras de antígeno, regulación hacia abajo de los receptores de superficie de células, etc. Tal como se emplean aquí, los término, modifi car, modifi ca ción por modificación, modifi cación de gli cosi la ción se considera que incluyen cualquier manipulación del patrón de glicosilación de un polipéptido recombinante natural o un fragmento del mismo. La modificación de glicosilación incluye modificación metabólica de la maquinaria de glicosilación de una célula, que incluye manipulaciones genéticas de las vías de síntesis de los oligosacáridos para lograr una glicosilación alterada de las glicoproteínas expresadas en las células. Además, la modificación de glicosilación incluye los efectos de las mutaciones y del ambiente celular en la glicosilación. En una modalidad, la modificación de glicosilación es una alteración de la actividad de glicosiltransferasa . En una modalidad particular, la modificación da como resultado una actividad alterada de la glucosaminiltransferasa y/o de la actividad de fucosiltransferasa. Tal como se usa aquí, el término cél ula huésped cubre cualquier clase de sistema celular que pueda ser modificado por modificación por ingeniería para generar los polipéptidos y moléculas de unión al antígeno de la presente invención. En una modalidad, la célula huésped es manipulada por modificación genética para permitir la producción de una molécula de unión al antígeno con glicoformas modificadas. En una modalidad preferida, la molécula de unión al antígeno es un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, o una proteína de fusión. En algunas modalidades, las células huésped han sido adicionalmente modificadas para expresar niveles incrementados de uno o más polipéptidos que tienen actividad GnTIII. Las células huésped incluyen células cultivadas, por ej emplo, células cultivadas de mamífero, tales como células CHO, células HEK293-EBNA, células BHK, células NSO, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de ratón P3X63, células PER, células PER.C6 o células de hibridoma, células de levadura, células de insectos, y células de plantas, para nombrar unas pocas, pero también las células comprendidas dentro de un animal transgénica, una planta transgénica o un tejido de planta cultivada o de animal. Tal como se usa aquí, el término ci totoxicidad cel ular mediada por Fe incluye la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos y la citotoxicidad celular mediada por una proteína de fusión-Fe soluble que contiene una reqión Fe humana. Este es un mecanismo de inmunidad que conduce a la lisis de las "células específicas de anticuerpos" mediante "células efectoras inmunitarias humanas", donde: Las cél ulas efectoras inmunes humanas son una población de leucocitos que exhiben receptores Fe en su superficie a través de las cuales se unen a la región Fe de los anticuerpos o de las proteínas Fe-fusión y llevan a cabo funciones efectoras. Dicha población puede incluir, pero no está limitada a, células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y/o células asesinas naturales (NK) . Las cél ulas específicas de an ticuerpo son células unidas por los anticuerpos o por las proteínas de Fc-fusión. Los anticuerpos o proteína de Fc-fusión se unen a las células objetivo a través de la parte N-terminal de la proteína a la región Fe. Tal como se usa aquí, el término ci totoxicidad cel ular mediada por Fe incremen tada se define como cualquier aumento en la cantidad de "células específicas del anticuerpo" que han sido usadas en un tiempo determinado, en una concentración de anticuerpo determinada, o de proteína de Fc-fusión, en el medio que rodea las células objetivo, mediante el mecanismo de citotoxicidad celular mediada por Fe definida anteriormente y/o una reducción en la concentración de anticuerpo o en la proteína de Fc-fusión, en el medio que rodea las células objetivo, requerido para lograr la lisis de una cantidad determinada de "células específicas del anticuerpo", en un tiempo determinado, mediante el mecanismo de citotoxicidad celular mediada por Fe. El aumento de la citotoxicidad celular mediada por Fe está relacionado con la citotoxicidad celular mediada por el mismo anticuerpo, o la proteína de Fc-fusión, producida por el mismo tipo de células huésped, usando los mismos métodos de producción estándar, purificación, formulación y almacenamiento, que son conocidos por los expertos en la materia, pero que no han sido producidos por células huésped modificadas por modificación por ingeniería de manera de expresar la glicosiltransferasa GnTIII mediante los métodos descritos aquí. Por an ticuerpo que tiene ci totoxicidad cel ular incremen tada dependien te del an ticuerpo (ADCC) se indica un anticuerpo, tal como ha sido definido aquí el término, que tiene un aumento de ADCC determinada mediante cualquier método apropiado conocido por los expertos en la materia. Un ensayo de ADCC in vi tro aceptado es el siguiente: 1) el ensayo usa células objetivo que se sabe que expresan el antígeno objetivo reconocido por la región de unión al antígeno del anticuerpo; 2) el ensayo usa células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC), aisladas de la sangre de un dador sano elegido al azar, como células efectoras; 3) el ensayo se lleva a cabo de acuerdo con el protocolo siguiente: i) las PBMCs son aisladas usando procedimientos de centrifugación de densidad estándar, y son suspendidas como 5 x 106 células/ml en un medio de cultivo de células RPMI; ii) las células objetivo son cultivadas mediante métodos estándar para cultivo de tejidos, son cosechadas desde la fase de crecimiento exponencial con una viabilidad superior al 90%, son lavadas en un medio de cultivo de células RPMI, rotuladas con 100 micro-Curies de 51Cr, son lavadas dos veces con un medio de cultivo de células, y resuspendidas en un medio de cultivo de células a una densidad de 105 células/ml; iii) 100 microlitros de la suspensión final de células objetivo anterior, son transferidas a cada receptáculo de una placa microevaluadora de 96 cavidades; iv) el anticuerpo excluido en forma seriada a partir de 4000 ng/ml a 0,04 ng/ml en un medio de cultivo de células, y se agregan 50 microlitros de las soluciones de anticuerpo resultantes a las células objetivo en la placa microevaluadora de 96 cavidades, para ensayar por triplicado varias concentraciones de anticuerpo que cubren el intervalo de concentración total anterior; v) para controles de liberación máxima (MR) , 3 cavidades adicionales de la placa que contiene las células objetivo rotuladas reciben 50 microlitros de una solución acuosa al 2% (V/V) de detergente no iónico (Nonidet, Sigma, St. Louis), en lugar de la solución de anticuerpo (punto iv anterior) ; vi) para los controles de liberación espontánea (SR), 3 cavidades adicionales en la placa que contiene las células objetivo rotuladas, reciben 50 microlitros de medio de cultivo de células RPMI en lugar de la solución de anticuerpo (punto iv anterior) ; vii) la placa microevaluadora de 96 cavidades es luego centrifugada a 50 x g durante 1 minuto y es incubada durante 1 hora a 4°C; viii) 50 microlitros de la suspensión de PBMC (punto i anterior) son agregadas a cada receptáculo para proporcionar una relación de efector : célula objetivo de 25:1 y las placas son colocadas en una incubadora bajo una atmósfera de C02 al 5% a 37°C durante 4 horas; ix) el sobrenadante libre de células de cada receptáculo es cosechado y la radioactividad liberada experimentalmente (ER) es cuantificada usando un contador gamma; x) el porcentaje de lisis específica se calcula para cada concentración de anticuerpo de acuerdo con la fórmula (ER-MR) / (MR-SR) x 100, donde ER es la radioactividad promedio cuantificada (ver punto ix anterior) para esta concentración de anticuerpo, MR es la radioactividad promedio cuantificada (ver punto ix anterior) para los controles MR (ver punto v anterior) , y SR es la radioactividad promedio cuantificada (ver punto ix anterior) para los controles SR (ver punto vi anterior) ; 4) "ADCC incrementada" se define como un aumento en el porcentaje máximo de lisis específica observado dentro del intervalo de concentración de anticuerpos ensayado anteriormente, y/o una reducción de la concentración de anticuerpo requerida para lograr la mitad del porcentaje máximo de lisis especifica que se observa dentro del intervalo de concentración de anticuerpos ensayada anteriormente. El aumento de ADCC es relativo a la ADCC, medida con el ensayo anterior, mediada por el mismo anticuerpo, producida por el mismo tipo de células huésped, usando la misma producción, purificación, formulación y métodos de almacenamiento estándar que son conocidos por los expertos en la materia, pero que no ha sido producida por las células huésped modificadas para que sobreexpresa GnTIII. En un aspecto, la presente invención está relacionada con moléculas de unión al antígeno que tiene la especificad de unión de la ICR62 de rata (es decir, que se unan a sustancialmente el mismo epítopo) , y al descubrimiento de que puede incrementarse cualquiera de las funciones efectoras mediante glicosilación alterada. En una modalidad, la molécula de unión al antígeno, es un anticuerpo quimérico. En una modalidad preferida la invención está dirigida a un anticuerpo quimérico, o a un fragmento del mismo, que comprende uno o más (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco, o seis) de los CDR de cualquiera de las SEC ID NOs: 53-108 y/o SEC ID NOs: 122-127. Específicamente, en una modalidad preferida, la invención está dirigida a un polinucleótido aislado que comprende: (a) una secuencia seleccionada de un grupo que consiste en: SEC ID NO: 54 SEC ID NO:56, SEC ID NO:58, SEC ID NO:60, SEC ID NO:62, SEC ID NO:64, SEC ID NO:66, SEC ID NO:68, SEC ID NO:70, SEC ID NO:72, SEC ID NO:74, SEC ID NO:122, y SEC ID NO:124; (b) una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID NO:76, SEC ID NO:78, SEC ID NO:80, SEC ID NO:82, SEC ID NO:84, SEC ID NO:86, SEC ID NO:88, SEC ID NO:90, SEC ID NO: 92, SEC ID NO: 94, SEC ID NO: 96, SEC ID NO: 98, SEC ID NO:100, SEC ID NO:102, SEC ID NO:104, SEC ID NO:106, y SEC ID NO: 126; y (c) SEC ID NO: 108. En otra modalidad preferida, la invención está dirigida a un polinucleótido aislado que comprende (a) una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO:112 y SEC ID NO:114; (b) una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO: 116 y SEC ID NO: 118; y (c) SEC ID NO: 119. En una modalidad, cualquiera de estos polinucleótidos codifica un polipéptido de fusión. En otra modalidad, la molécula de unión al antígeno comprende el dominio VH en el anticuerpo ICR62 de rata codificado por la SEC ID NO:l o SEC ID NO:2, o una variante del mismo, y un polipéptido no murino. En otra modalidad preferida, la invención está dirigida a una molécula de unión al antígeno que comprende el dominio VL de anticuerpo de rata codificada por la SEC ID NO: 43 o SEC ID NO: 44, o una variante del mismo, y un polipéptido no murino. En otro aspecto, la invención está dirigida a las moléculas de unión al antígeno que comprende una o más (por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco, o seis) CDR truncadas de ICR62. Dicha CDR truncadas contendrán, como mínimo, los residuos aminoácidos determinante de especificidad para los CDR determinados. Mediante "residuo determinante de especificidad" se indica cualquiera residuo que está directamente involucrado en la interacción con el antígeno.

En general, únicamente aproximadamente una quinta hasta una tercera parte de los residuos en una CDR determinada participa en la unión al antígeno. Los residuos determinantes de especificidad en una CDR particular pueden identificarse, por ejemplo, por computación de contactos inter-atómicos a partir de la modelación tri-dimensional y la determinación de la variabilidad de secuencias en una posición de residuo determinada de acuerdo con los métodos descritos en Padlan y otros , FASEB J. 9 (1 ) -. 133- 139 (1995), cuyo contenido se incorpora aquí como referencia en su totalidad. Por consiguiente, la invención está también dirigida a un polinucleótido aislado que comprende por lo menos una (por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco, o seis) regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo ICR62 de rata, o una variante o forma truncada del mismo que contiene por lo menos los residuos determinantes de especificidad para dicha región determinante de complementariedad, donde dicho polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión. Preferiblemente, dichos polinucleótidos aislados codifican un polipéptido de fusión que es una molécula de unión al antígeno. En una modalidad, el polinucleótido comprende tres regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo ICR62 de rata, o variantes o formas truncadas del mismo que contienen por lo menos los residuos determinantes de especificidad para cada una de tres regiones determinantes de complementariedad. En una modalidad, el polinucleótido comprende por lo menos una de las CDR que se indican en las Tablas 2-5, siguientes. En otra modalidad, el polinucleótido codifica la región variable entera de la cadena ligera o pesada de un anticuerpo quimérico (por ejemplo humanizada). La invención está además dirigida a los polipéptidos codificados por dichos polinucleótidos. En otra modalidad, la invención está dirigida a una molécula de unión al antígeno que comprende por lo menos una (por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco, o seis) regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo ICR62 de rata, o una variante o forma truncada del mismo que contiene por lo menos los residuos determinantes de especificidad para dicha región determinante de complementariedad, y que comprende una secuencia derivada de un polipéptido heterólogo. En una modalidad, la molécula de unión al antígeno comprende tres regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo ICR62 de rata, o variantes o formas truncadas del mismo que contienen por lo menos los residuos determinantes de especificidad para cada una de tres regiones determinantes de complementariedad. En una modalidad, la molécula de unión al antígeno comprende por lo menos una de las CDR indicada en las Tablas 2-5, siguientes. En otro aspecto, la molécula de unión al antígeno comprende la región variable de una cadena ligera o pesada del anticuerpo. En una modalidad particularmente útil, la molécula de unión al antígeno es un anticuerpo quimérico, por ejemplo humanizado. La invención está también dirigida a métodos para preparar dichas moléculas de unión al antígeno, y al uso de las mismas en el tratamiento de la enfermedad, particularmente trastornos de proliferación de células donde el EGFR está expresado, particularmente donde el EGFR está anormalmente expresado (por ejemplo, sobreexpresa) en comparación con el tejido normal de un mismo tipo de célula. Dichos trastornos incluyen pero no están limitados a cáncer de vejiga, cerebro, cabeza y cuello, páncreas, pulmón, mama, ovario, colon, próstata, piel y riñon. Los niveles de expresión de EGFR pueden determinarse por métodos conocidos en la técnica, y aquellos que se describen aquí (por ejemplo, a través de ensayo de inmunohistoquímica, ensayo de inmunofluorescencia, ensayo de inmunoenzima, ELISA, citometría de flujo, radio-inmunoensayo, Western blot, unión al ligando, actividad de cinasa, etc.) . La invención está también dirigida a un método para apuntar a células in vivo o in vi tro que expresen EGFR. Las células que expresan EGFR pueden ser tomadas como blanco para propósitos terapéuticos (por ejemplo para tratar un trastorno que es tratable mediante la interrupción de la señalización mediada por EGFR, por ejemplo mediante bloqueo de la unión al ligando, o haciendo blanco en las células que expresan EGFR para la destrucción mediante el sistema inmunitario) . En una modalidad, la presente invención está dirigida a un método para hacer blanco en las células que expresan EGFR en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una ABM de la invención. Las células que expresan EGFR pueden ser luego tomadas como blanco con propósitos de diagnóstico (por ejemplo, para determinar si expresan EGFR, en forma normal o anormal) . Por lo tanto la invención está también dirigida a métodos para detectar la presencia de EGFR o de una célula que expresa EGFR, in vi vo o in vi tro . Un método para detectar la expresión de EGFR de acuerdo con la presente invención comprende poner en contacto una muestra que debe ser testeada, opcionalmente con una muestra de control, con una ABM de la presente invención, bajo condiciones que permiten la formación de un complejo entre ABM y EGFR. La formación del complejo es luego detectada (por ejemplo, mediante ELISA u otros métodos conocidos en la técnica) . Cuando se usa una muestra de control con la muestra en ensayo, una diferencia estadísticamente significativa en la formación de los complejos de ABM-EGFR cuando se compara con las muestras de ensayo y de control es indicativa de la presencia del EGFR en la muestra de ensayo.

TABLA 2 TABLA 3 TABLA 4 TABLA 5 Se sabe que varios mecanismos están involucrados en la eficacia terapéutica de los anticuerpos anti-EGFR, incluyendo el bloqueo de la unión de ligando (por ejemplo, EGF, TGF-a, etc. ) al EGFR y la subsiguiente activación de las vías de señalización, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) , y la inducción de la detención del crecimiento o diferenciación terminal. El anticuerpo monoclonal de rata ICR62 (IgG2b), fue discutido en la publicación de PCT No. WO 95/20045, que se incorpora aquí como referencia en su totalidad. Fue dirigida al epítopo C de EGFR, y demostró que inhibía la unión al ligando, inhibía al crecimiento in vi tro del EGFR que expresa carcinoma de células escamosas, e inducía a la regresión de xenoinjertos de tumores en ratones atímicos (WO 95/20045; Modjtahedi y otros , Br . J. Cáncer 73:228-235 (1996)). Como anticuerpo totalmente de roedores, la administración del anticuerpo monoclonal de rata ICR62 a seres humanos, dio como resultado una respuesta HARÁ en algunos pacientes después de incluso una sola dosis. (WO 95/20045; Modjtahedi y otros , Br . J. Cáncer 73:228-235 (1996)). Se han descrito anticuerpos quiméricos de ratón/humano. Ver, por ejemplo, Morrison, S. L. y otros, PNAS 11:6851-6854 (Noviembre 1984); Publicación de Patente Europea No. 173494; Boulianna , G. L, y otros , Na ture 312:642 (Diciembre 1984); Neubeiger, M. S. y otros, Na ture 314:268 (Marzo 1985); Publicación de Patente Europea No. 125023; Tan y otros, J. Immunol . 135:8564 (Noviembre 1985); Sun, L. K y otros, Hybridoma 5(1): 517 (1986); Sahagan y otros, J. Immunol . 137:1066-1074 (1986). Ver en general, Muron, Na ture 312:597 (Diciembre 1984); Dickson, Geneti c Engineering News 5(3) (Marzo 1985); Marx, Science 229:455 (Agosto 1985); y Morrison, Science 229:1202-1207 (Septiembre 1985). El IMC-C225 (Erbitux®, Imclone) es un anticuerpo monoclonal quimérico dirigido contra EGFR y que tiene una región variable de ratón y una región constante humana (Ver Herbst and Shin, Cáncer 94: 1593-1611 (2002)). La porción murina de IMC-225 deriva de M225, que se halló que se unía a EGFR y que inhibía la fosforilación dependiente de tirosinquinasa inducida por EGF, así como también indicó apoptosis en líneas de células tumorales que hiper-expresaban EGFR (Herbst and Shin, Cáncer 94: 1593-1611 (2002)). Sin embargo, la IM225 produjo una reacción HAMA en pacientes tratados con el anticuerpo en pruebas clínicas en Fase I (Herbst and Shin, Cáncer 94: 1593-1611 (2002)). La IMC-225 ha sido ensayada in vivo e in vi tro, y ha sido usada en combinación con terapia y quimioterapia de radiación en una cantidad de tipos de tumores, incluyendo los que están asociados con una baja prognosis (Herbst and Shin, Cáncer 94: 1593-1611 (2002)). Sin embargo, la IMC-225 ha sido asociada con toxicidades tales como reacciones alérgicas y de la piel en pacientes a los que se les administró el anticuerpo IMC-225 en pruebas clínicas (Herbst and Shin, Cáncer 94: 1593-1611 (2002)). En una modalidad particularmente preferida, el ABM quimérica de la presente invención es un anticuerpo humanizado. Los métodos para humanizar anticuerpos no-humanos son conocidos en el arte. Por ejemplo, los ABM humanizados de la presente invención pueden prepararse de acuerdo con los métodos de la Patente Norteamericana No. 5,225,539 de Winter, U.S. Patente Norteamericana No. 6,180,370 de Queen y otros , Patente Norteamericana No. 6,632,927 de Adair y otros , o Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 2003/0039649 de Foote, cuyo contenido completo de cada una se incorpora aquí como referencia. Preferiblemente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos aminoácidos introducidos en el mismo a partir de una fuente que no humana. Estos residuos aminoácidos no humanos se denominan a menudo residuos "importados", que se recogen típicamente de un dominio variable de "importación". La humanización puede efectuarse esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones y otros, Na ture, 321:522-525 (1986); Riechmann y otros, Na ture, 332:323-327 (1988); Verhoeyen y otros, Science, 239:1534-1536 (1988)), mediante la substitución de secuencias de la región hipervariable con las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente Norteamericana No. 4.816.567) donde substancialmente menos de un dominio variable intacto ha sido substituido con la secuencia correspondiente de una especia no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos de la región hipervariable y posiblemente algunos residuos FR han sido substituidos con residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores. Los anticuerpos anti-EGFR humanizados sometida comprenderán regiones constantes de inmunoglobulina humana. La selección de los dominios variables humanos, tanto los livianos como los pesados, para emplearlos en la preparación de anticuerpos humanizados, es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con los que se denomina método de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor es rastreado contra la genoteca entera de secuencias de dominio variable humano conocidas. La secuencia humana que está más próxima a la del roedor es luego aceptada como región estructural humana (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims y otros, J. Immunol . , 151:2296 (1993); Chothia y otros, J. Mol . Biol . , 196:901 (1987)) . Otro método para seleccionar una secuencia estructural humana es el de comparar la secuencia de cada subregión individual de la estructura de roedor completa (es decir, FR1, FR2 , FR3 y FR4 ) o alguna combinación de las subregiones individuales (por ejemplo, FR1 y FR2 ) contra una genoteca de secuencias de región variable humana conocidas que corresponden a las subregión estructural (por ejemplo, determinado por numeración Kabat), y elegir la secuencia humana para cada subregión o combinación que sea más próxima a la del roedor (Leung, Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 2003/0040606A1, publicada el 27de Febrero del 2003) (cuyo contenido se incorpora en forma incompleta aqui como referencia) . Oro método usa una región estructural particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. Puede usarse la misma estructura para varios anticuerpos humanos diferentes (Cárter y otros, Proc . Na ti . Acad. Sci . USA, 89:4285 (1992); Presta y otros, J. Immunol . , 151:2623 (1993)) (donde el contenido entero de cada uno de ellas se incorpora aquí como referencia) . Es además importante que los anticuerpos sean humanizados con retención de alta afinidad para el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo de acuerdo con un método preferido, se preparan anticuerpos humanizados mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y varios productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos inmunoglobulina tridimensionales pueden generarse usando programas de computadora con los cuales están familiarizados los expertos en la materia (por ejemplo, InsightlI, Accelrys, Inc. (formerly MSI), o at http://swissmodel.expasy.org). Estos programas de computadora pueden ilustrar y exhibir probables estructuras conformacionales tridimensionales de secuencia de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas exhibiciones permite el análisis del probable rol de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata es decir el análisis de residuos que influencian la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De esta manera, puede seleccionarse residuos FR y puede combinarse a partir del receptor y secuencias importadas de manera de lograr la característica de anticuerpo deseada tal como un aumento de la afinidad con el antígeno objetivo. En general, los residuos de la región hipervariable están directa y muy substancialmente involucrados en la influencia sobre la unión del antígeno. En una modalidad, los anticuerpos de la presente invención comprenden una región Fe humana. En una modalidad específica, la región constante humana es IgGl, tal como se indica en la SEC ID NOs 109 y 110, y tal como se indica a continuación : Secuencia Nucleotídica IgGl (SEC ID NO: 110) ACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCT GGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGT CGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTC AGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACC TACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGCAGAGCCCA AATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACC GTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAG GTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACG TGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCAC GTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTAC AAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCA AAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAA GAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAG TGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCG ACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAA CGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC TCCCTGTCTCCGGGTAAATGA Secuencia de Aminoácido IgGl (SEC ID NO: 109) TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSCDKTHTCPPCPA PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Sin embargo, las variantes e isoformas de la región Fe humana están también abarcadas en la presente invención.

Por ejemplo, las regiones Fe variantes apropiadas para ser usadas en la presente invención pueden producirse de acuerdo con los métodos que se enseñan en la Patente Norteamericana No. 6.737.056 de Presta (variantes de región Fe con función efectora alterada de vida a una o más modificaciones de aminoácidos); o en las Solicitudes de Patentes Norteamericanas Nos. 60/439,498; 60/456,041; 60/514,549; o WO 2004/063351 (las regiones Fe variantes con una afinidad de unión incrementada debido a la modificación de aminoácidos); o en la Solicitud de Patente Norteamericana No. 10/672.280 o WO 2004/099249 (variantes de Fe con unión alterada al FcyR debido a la modificación de aminoácidos), los contenidos de cada una de las cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad. En otra modalidad, las moléculas de unión al antígeno de la presente invención son modificadas por modificación genética para tener una afinidad de unión mejorada de acuerdo con, por ejemplo, los métodos descritos en la Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 2004/0132066 de Balint y otros , cuya descripción completa se incorpora aquí como referencia. En una modalidad, la molécula de unión al antígeno de la presente invención es conjugada con una porción adicional, tal como un radio-rótulo o una toxina. Dichos ABM conjugados pueden producirse mediante numerosos métodos que son bien conocidos en el arte. Son aplicables una variedad de radionúclidos a la presente invención, y los expertos en la materia están acreditados con la capacidad de determinar rápidamente cual radio nucleótido es el más apropiado bajo una variedad de circunstancias. Por ejemplo, el 131iodo es un radionúclido bien conocido usado para la inmunoterapia dirigida a un blanco específico. Sin embargo, la utilidad clínica del 131iodo puede estar limitado por varios factores que incluyen: vida media física de ocho días; deshalogenación del anticuerpo iodado tanto en la sangre como en los sitios tumorales; y características de emisión (por ejemplo, componente gamma grande) , que puede ser sub-óptima para depositar una dosis localizada en un tumor. Con el advenimiento de agentes quelantes superiores, la emparejado de unir grupos quelantes metálicos a proteínas a aumentado las emparejado de utilizar otros radionúclidos tales como ?nindio y a la 90itrio. El 90itrio provee varios beneficios para la utilización en aplicaciones radioinmunoterapéuticas : la vida media de 64 horas de 90itrio es suficientemente prolongada para permitir la acumulación de anticuerpo en el tumor y, a diferencia por ejemplo, del 131iodo, 90itrio es un emisor beta puro de alta engría sin ninguna irradiación gamma que acompaña su descomposición, con un intervalo en el tejido de diámetros de células de 100 a 1000. Además, la cantidad mínima de radiación que penetra permite la administración externa del paciente de los anticuerpos rotulados con 90itrio. Adicionalmente, la internalización del anticuerpo rotulado no es necesaria para la muerte de las células, y la emisión local de la radiación ionizante deberla ser letal para las células tumorales adyacentes que carecen del antígeno objetivo . Las dosis de tratamiento únicas eficaces (es decir, cantidades terapéuticamente eficaces) de los anticuerpos anti-EGFR rotulados con a 90itrio, están comprendidas dentro de un intervalo de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 75 mCi, más preferiblemente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 40 mCi. Las dosis para un tratamiento único eficaz no-ablativas de médula de anticuerpos anti-EGFR rotulados con 131iodo, están en un intervalo comprendido entre 5 y aproximadamente 70 mCi, más preferiblemente entre aproximadamente 5 y aproximadamente 40 mCi . Cada dosis ablativa de tratamiento único eficaz (por ejemplo, puede requerir trasplante autólogo de médula ósea) de los anticuerpos anti-EGFR rotulados con 131iodo, puede estar en un intervalo comprendido entre aproximadamente 30 y aproximadamente 600 mCi, más preferiblemente entre 50 y menos de aproximadamente 500 mCi. Conjuntamente con un anticuerpo anti-EGFR quimérico, debido a la vida media de circulación más prolongada frente a los anticuerpos murinos, las dosis ablativas no de médula para un tratamiento único eficaz de anticuerpos anti-EGFR quiméricos rotulados con 131iodo, están en un intervalo comprendido entre desde aproximadamente 5 y aproximadamente 40 mCi, más preferiblemente menos de aproximadamente 30 mCi. Los criterios para, por ejemplo, el rótulo ?:L1indio, son típicamente inferiores a aproximadamente 5 mCi. Con respecto a los anticuerpos anti-EGFR radiomarcados, la terapia con los mismos puede producirse también usando un tratamiento de terapia único o usando tratamientos múltiples. Debido al componente radionúclido, se prefiere que antes del tratamiento, las células progenituras periféricas ("PSC") o de médula ósea ("BM") sean "cosechadas" en pacientes que experimentan toxicidad de médula ósea potencialmente fatal resultante de la radiación. Las BM y/o PSC son cosechadas usando técnicas convencionales y luego son purgadas y congeladas para la posible re-infusión. Adicionalmente, se prefiere que antes del tratamiento se efectúe un estudio de dosimetría de diagnóstico usando un anticuerpo rotulado de diagnóstico (por ejemplo, usando ?nindio) en el paciente, un propósito de lo cual es el de asegurar que el anticuerpo terapéuticamente rotulado (usando por ejemplo, 90itrio) no es que quede innecesariamente "concentrado" en ningún órgano o tejido normal. En una modalidad preferida, la presente invención está dirigida a un polinucleótido aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido en la Tabla 7 siguiente. En una modalidad preferida, la invención está dirigida a un polinucleótido aislado que comprende una secuencia que se muestra en la Tabla 6 siguiente. La invención está dirigida además a un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una secuencia nucleotidica mostrada en la Tabla 6 siguiente. En otra modalidad, la invención está dirigida a un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido de por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una secuencia de aminoácido de la Tabla 7. La invención abarca también un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de cualquiera de las construcciones de la Tabla 7 con substituciones de aminoácido constitutivas.

TABLA 6 TABLA 7 En otra modalidad, la presente invención está dirigida a un vector de expresión y/o una célula huésped que comprende uno o más polinucleótidos aislados de la presente invención . En general, puede usarse cualquier tipo de línea de célula de cultivo para expresar la ABM de la presente invención. En una modalidad preferida, células HEK293-EBNA, células CHO, células BHK, células NSO, células SP2/0, célula de mieloma YO, células de mieloma de ratón P3X63, células PER, células PER.C6 o células de hibridoma, otras células de mamífero, células de levadura, células de insectos, o células de plantas, son usadas como línea de célula de base para generar las células huésped modificadas genéticamente de la invención . La eficacia terapéutica de las ABM de la presente invención puede realzarse produciéndolas en una célula huésped que expresa además un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad GnTIII. En una modalidad preferida, el polipéptido que tiene actividad GnTIII es un polipéptido de fusión que comprende el dominio de localización Golgi de un polipéptido residente Golgi. En otra modalidad preferida, la expresión de los ABM de la presente invención en una célula huésped que expresa un nucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad GnTIII da como resultado ABM con un aumento de la afinidad de unión al recepto Fe y con un aumento de la función efectora. Por consiguiente, en una modalidad, la presente invención está dirigida a una célula huésped que comprende (a) un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que tiene actividad GnTIII; y (b) un polinucleótido aislado que codifica una ABM de la presente invención, tal como un anticuerpo quimérico, primatizado o humanizado que se une a EGFR humano. En una modalidad preferida, el polipéptido que tiene actividad GnTIII es un polipéptido de fusión que comprende el dominio catalítico de GnTIII y el dominio de localización Golgi es el dominio de localización de la manosidasa II. Los métodos para generar los polipéptidos de fusión y usarlos para producir anticuerpos con funciones efectoras incrementadas han sido descritos en la Solicitud de Patente Provisional No. 60/495.142 y Publicación de la Solicitud de Patente Norteamericana No. 2004/0241817 Al, cuyos contenidos completos de cada una se incorporan expresamente aquí como referencia. En otra modalidad preferida, la ABM quimérica es un anticuerpo quimérico o un fragmento del mismo, que tiene la especificidad de unión del anticuerpo ICR62 de rata. En una modalidad particularmente preferida, el anticuerpo quimérico comprende una Fe humana. En otra modalidad preferida, el anticuerpo es primatizado o humanizado. En una modalidad, uno o varios polinucleótidos que codifican una ABM de la presente invención, pueden expresarse bajo un control constitutivo o, alternativamente, un sistema de expresión regulada. Los sistemas de expresión regulada incluyen, pero no están limitados a, sistemas de expresión regulado con tetraciclina, un sistema de expresión inducible por eedisoma, un sistema de expresión lac-switch, un sistema de expresión inducible por glucocorticoide, un sistema promotor inducible por temperatura, y un sistema de expresión inducible por el metal metalotioneina . Si varios de los ácido nucleicos diferentes que codifican un ABM de la presente invención están comprendidos dentro del sistema de célula huésped, algunos de ellos pueden expresarse bajo el control de un promotor constitutivo mientras que otros se expresarán bajo el control de un promotor regulado. El nivel de expresión máximo se considera que es el nivel más alto posible de la expresión estable de un polipéptido que no tiene un efecto adverso significativo sobre el régimen de crecimiento de las células, y podrá ser determinado usando experimentación de rutina. Los niveles de expresión se determinan por métodos generalmente conocidos en la técnica que incluyen análisis de Western blot usando un anticuerpo específico para ABM o un anticuerpo específico para un marbete específico para ABM o un anticuerpo específico para un marbete peptídico fusionado con el ABM; y análisis de Western blot. En una alternativa adicional, el polinucleótido puede estar ligado emparejado a un gen informante; los niveles de expresión de una ABM quimérica (por ejemplo, humanizada) que tiene sustancialmente la misma especificidad de unión del anticuerpo ICR62 de rata, se determinan viviendo una señal que está correlacionada con el nivel de expresión del gen informante. El gen informante puede transcribirse conjuntamente con los ácidos nucleicos que codifican dichos polipéptido de fusión en forma de una molécula de ARNm única; sus secuencias codificadoras respectivas pueden estar ligadas ya sea por sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) o por incrementador por incrementador de traducción independiente de la punta (CITE) . El gen informante puede ser traducido conjuntamente con por lo menos un ácido nucleico que codifica ABM quimérico (es decir, humanizado) que tiene sustancialmente la misma especificidad de unión del anticuerpo ICR62 de rata de manera que se forma una cadena polipeptídica única. Los ácidos nucleicos que codifican AMBs de la presente invención pueden estar emparejado ligado al gen informante bajo el control de un promotor único, tal como el ácido nucleico que codifica al polipéptido de fusión y el gen informante que son transcriptos en una molécula de ARN que está alternativamente empalmada en dos moléculas de ARN mensajero (ARNm) separadas; una de las ARNm resultantes es traducida a dicha proteína informante, y la otra es traducida a un polipéptido de fusión. Los métodos que son bien conocidos por los expertos en la materia pueden emplearse para construir vectores de expresión que contienen la secuencia codificadora de una ABM que tiene substancialmente la misma especificidad de unión del anticuerpo ICR62 de rata junto con señales de control apropiadas de transcripción/traducción. Estos métodos incluyen técnicas de ADN recombinante in vi tro, técnicas de síntesis y recombinación/recombinación genética in vivo . Ver , por ejemplo, las técnicas descritas en Maniatis y otros , Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989) and Ausubel y otros , Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989).

Pueden utilizarse una variedad de sistemas vectores de expresión huésped para expresar la secuencia codificadora de las ABM de la presente invención. Preferiblemente, se usan células de mamífero como sistemas de células huésped transfectadas con vectores de expresión de ADN plásmido recombinante o ADN cósmido, que contienen la secuencia codificadora de la proteína de interés y la secuencia codificadora del polipéptido de fusión. Más preferiblemente, las células HEK293-EBNA, células CHO, células BHK, células NSO, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de ratón P3X63, células PER, células PER.C6 o células de hibridoma, otras células de mamífero, células de levadura, células de insecto, o células de planta, se usan como sistema de célula huésped. Algunos ejemplos de los sistemas de expresión y de los métodos de selección se describen en las referencias siguientes, y en las referencias de las mismas: Borth y otros , Biotechnol . Bioen . 71(4):266-73 (2000-2001), in Werner y otros , Arzneimi t telforschung/Drug Res . 48(8): 870-80 (1998), in Andersen and Krummen, Curr . Op . Biotechnol . 13:117-123 (2002), in Chadd and Chamow, Curr . Op . Biotechnol . 12:188-194 (2001), y en Giddings, Curr. Op . Biotechnol . 12: 450-454 (2001). En modalidades alternativas, pueden usarse otras sistemas de células huésped de eucarióticas, incluyendo células de levaduras transformadas con vectores de expresión de levaduras recombinantes que contienen la secuencia codificadora de una ABM de la presente invención tal como los sistemas de expresión que se enseñan en la Solicitud de patente Nortemaricana No. 60/344.169 y WO 03/056914 (métodos para producir glicoproteína de tipo humano en una célula huésped eucariótica no humana) (el contenido de cada una de las cuales se incorpora como referencia en su totalidad) ; sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contiene una secuencia codificadora de una ABM quimérica que tiene substancialmente la misma especificidad de unión del anticuerpo ICR62 de rata; sistemas de células de plantas infectados con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo, virus mosaico del coliflor, CaMV; virus mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión plásmido recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti) que contiene la secuencia codificadora del ABM de la invención, incluyendo, pero sin limitarlo a, los sistemas de expresión que se enseñan en la Patente Norteamericana No. 6,815,184 (métodos para la expresión y secreción de polipéptidos biológicamente activos a partir de lentejas de agua manipulada genéticamente); WO 2004/057002 (producción de proteínas glicosiladas en células de planta de briofitos mediante introducción de un gen de glicosil transferasa) y la WO 2004/024927 (métodos para generar proteínas que no son de plantas heterólogas extracelulares en protoplastos de moho) ; y las Solicitudes de Patentes Norteamericanas Nos. 60/365.769, 60/368.047, y WO 2003/078614 (procesamiento de glicoproteínas en plantas transgénicas que comprende una enzima GnTIII de mamífero funcional) (el contenido de cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia en su totalidad) ; o sistemas de células de animales infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ej emplo, adenovirus, virus de vacuna) que incluyen líneas de células modificadas por la modificación genética para contener copias múltiples del ADN que codifica las ABM quiméricas que tienen sustancialmente la misma especificidad de unión del anticuerpo ICR62 de rata ya sea amplificado en forma estable (CHO/dhfr) o amplificado en forma inestable en cromosomas doble-minuto (por ejemplo, lineas celulares de murino) . En una modalidad, el vector que comprende el/los polinucleótido (s) que codifica/n la ABM de la invención es policistrónico . Asimismo, en una modalidad de ABM discutida anteriormente, está un anticuerpo o un fragmento del mismo. En una modalidad preferida, la ABM es un anticuerpo humanizado. Para los métodos de esta invención, la expresión estable es generalmente preferida a la expresión transitoria debido a que típicamente logra resultados más reproducibles y también es más propensa al a producción a gran escala. En vez de usar vectores de expresión que contienen orígenes de réplica virales, las células huésped pueden transformarse con los respectivos ácidos nucleicos codificadores controlados por elementos de control de expresión apropiados (por ejemplo, promotores, incrementadores, secuencias, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etc.), y un marcador seleccionable. Después de la introducción de ADN extraño, las células modificadas genéticamente pueden dejarse desarrollar durante 1-2 días en un medio enriquecido, y luego se traspasan a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite la sección de células que integran establemente el plásmido en sus cromosomas y se desarrollan para formar focos que a su vez pueden clonarse y expandirse dentro de las líneas de células. Pueden usarse una variedad de sistemas de selección, incluyendo, pero sin limitarlo a, genes de timidinquinasa del virus de herpes simplex (Wigler y otros, Cell 11 : 223 (1977)), hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (Szybalska & Szybalski, Proc. Na ti . Acad. Sci . USA 48 : 2026 (1962)), y adenina fosforibosiltransferasa (Lowy y otros , Cell 22 : 811 (1980)), que pueden emplearse en células tk-, hgprt- o emparejado-, respectivamente. Asimismo, puede usarse resistencia a los antimetabolitos como base para la selección de dhfr, lo cual confiere resistencia a los genes de metotrexato (Wigler y otros, Nati. Acad. Sci. USA 77:3567 (1989); O'Hare y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:1521 (1981)); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan & Berg, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:2012 (1981)); neo, que confiere resistencia al aminoglicósido G-418 (Colberre-Garapin y otros, J. Mol. Biol. 150:1 (1981)); e higro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre y otros, Gene 30:141 (1984). Recientemente, se han descritos seleccionados adicionales, por ejemplo trpB, que permiten a las células utilizar indol en lugar de triptófano; hisD, que permiten a las células utilizar histinol en lugar de histidina (Hartman & Mulligan, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:8047 (1988)); sistema de glutamina sintasa; y ODC (ornitina descarboxilasa) que confiere resistencia al inhibidor de ornitina descarboxilasa, 2- (difluorometil) -DL-ornitina, DFMO (McConlogue, in: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed. (1987)). La presente invención está dirigida además a un método para modificar el perfil de glicosilación de los ABM de la presente invención que se producen mediante una células huésped, que comprende expresar en dicha célula huésped un ácido nucleico que codifica un ABM de la invención y un ácido nucleico que codifica un polipéptido con actividad GnTIII, o un vector que comprende dichos ácidos nucleicos.

Preferiblemente, el polipéptido modificado es IgG o un fragmento del mismo que comprende la región Fe. En una modalidad particularmente preferida, la ABM es un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo. Las ABM modificadas producidas por las células huésped de la invención exhiben un aumento de la afinidad de unión al recetor Fe y/o un aumento de la función efectora como resultado de la modificación. En una modalidad particularmente preferida la ABM es un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo que contiene la región Fe. Preferiblemente, el aumento de afinidad de unión al receptor Fe se incrementa por la unión al receptor activador Fc?, tal como el receptor Fc?RIIIa. El aumento de la función efectora es preferiblemente un aumento en uno o más de los siguientes: aumento de la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo, aumento de la fagocitosis celular dependiente del anticuerpo (ADCP) , aumento de la secreción de citocina, aumento de la absorción de antígeno mediada por un complejo inmunitario mediante células presentadoras de antígeno, aumento de la citotoxicidad celular mediada por Fe, aumento de la unión a las células NK, aumento de la unión a macrófagos, aumento de la unión a células polimorfonucieares (PMNs), aumento de la unión a monocitos, aumento del entrecruzamiento a anticuerpos unidos a el objetivo, aumento señalización directa inductoras de apoptosis, aumento de la maduración células dendríticas, y aumento de preparación de células T. La presente invención está también dirigida a un método para producir una ABM de la presente invención que tiene oligosacáridos modificados en una célula huésped que comprende (a) cultivar una célula huésped manipulada por modificación genética de manera de expresar por lo menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad GnTIII bajo condiciones que permiten la producción de una ABM de acuerdo con la presente invención, donde dicho polipéptido que tiene actividad GnTIII se expresa en una cantidad suficiente para modificar los oligosacáridos en la región Fe de dicha ABM producida mediante dicha célula huésped; y (b) aislar dicha ABM. En una modalidad preferida, el polipéptido que tiene actividad GnTIII es un polipéptido de fusión que comprende el dominio catalítico de GnTIII. En una modalidad particularmente preferida, el polipéptido de fusión comprende además el dominio de localización Golgi de un polipéptido residente Golgi. Preferiblemente, el dominio de localización Golgi es el dominio de localización de manosidasa II o GnTI. Alternativamente, el dominio de localización Golgi está seleccionado del grupo que consiste: el dominio de localización de manosidasa I, el dominio de localización de GnTII, y el dominio de localización de una focositransferasa de núcleo a 1-6. Las ABM producidas por los métodos de la presente invención, tienen un aumento de la afinidad de unión al receptor Fe y/o un aumento de la función efectora. Preferiblemente, el aumento de la función efectora es uno o más de los siguientes: aumento de la citotoxicidad celular mediada por Fe (que incluye un aumento de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos), aumento de la fagocitosis celular que depende de anticuerpos (ADCP) , aumento de la secreción de citocina, aumento de la absorción de antígeno mediada por complejo inmunitario, mediante células presentadoras de antígeno, aumento de unión a las células NK, aumento de la unión a macrófagos, aumento de la unión a monocitos, aumento de la unión a células polimorfonucieares, aumento de apoptosis inducida por señalización directa, aumento del entrecruzamiento de anticuerpos unido al objetivo, aumento de maduración de células dendríticas, o aumento de preparación de células T. El aumento de la afinidad de unión al receptor Fe es preferiblemente un aumento de la unión a los receptores activadores Fe tales como Fc?RIIIa. En una modalidad particularmente preferida, el ABM es un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo. En otra modalidad, la presente invención está dirigida a una ABM quimérica que tiene substancialmente la misma especificidad de unión del anticuerpos ICR62 de rata producidos por lo métodos de la invención, que tiene un aumento de la proporción de oligosacáridos divididos en la región Fe de dicho polipéptido. Se ha contemplado que dicha ABM abarca anticuerpos y fragmentos del mismo que comprenden la región Fe. En una modalidad preferida, la ABM es un anticuerpo humanizado. En una modalidad, el porcentaje de oligosacáridos divididos en la región Fe de la ABM es de por lo menos 50%, más preferiblemente, de por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, o de por lo menos 90%, y aún más preferiblemente por lo menos 90-95% de los oligosacáridos totales. En una modalidad más, la ABM producida por los métodos de la invención tiene una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fe como resultado de la modificación de sus oligosacáridos mediante los métodos de la presente invención. En una modalidad, el porcentaje de oligosacáridos no fucosilados es de por lo menos 50%, preferiblemente, de por lo menos 60% a 70%, más preferiblemente de por lo menos 75%. Los oligosacáridos no fucosilados pueden ser de tipo híbrido o complejo. En una modalidad particularmente preferida, la ABM producida por las células huésped y los métodos de la invención tiene un incremento de la proporción de oligosacáridos no fucosilados divididos en la región Fe. Los oligosacáridos no fucosilados, divididos pueden ser híbridos o complejos. Específicamente, los métodos de la presente invención pueden usarse para producir ABM en las cuales por lo menos el 15%, más preferiblemente por lo menos el 20%, más preferiblemente por lo menos el 25%, más preferiblemente por lo menos el 30%, más preferiblemente por lo menos el 35% de los oligosacáridos en la región Fe del ABM son divididos, no fucosilados. Los métodos de la presente invención pueden usarse también para producir polipéptidos en los cuales por lo menos el 15%, más preferiblemente por lo menos 20%, más preferiblemente por lo menos el 25%, más preferiblemente por lo menos el 30%, más preferiblemente por lo menos el 35% de los oligosacáridos en la región Fe del polipéptido son híbridos divididos no fucosilados . En otra modalidad, la presente invención está dirigida a una ABM quimérica que tiene sustancialmente la misma especificidad de unión del anticuerpo ICR62 de rata modificado genéticamente para tener una función efectora incrementada y/o una afinidad de unión al receptor Fe incrementada, que se produce por los métodos de la invención. Preferiblemente, la función efectora incrementada es una o más de las siguientes: aumento de la citotoxicidad celular mediada por Fe (que incluye el incremento de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos), aumento de la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) , aumento de la secreción de citocina, aumento de la absorción de antígeno mediada por complejo inmunitario, mediante células presentadoras de antígeno, aumento de la unión a las células NK, aumento de la unión a macrófagos, aumento de la unión a monocitos, aumento de la unión a células polimorfonucieares, aumento de la señalización directa inductora de apoptosis, aumento del entrecruzamiento de anticuerpos ligados al objetivo, aumento de la maduración de células dendríticas o aumento del preparación de células T. En una modalidad preferida, el aumento de la afinidad de unión al receptor Fe, se incrementa por la unión a un receptor activador de Fe, más preferiblemente Fc?RIIIa. En una modalidad, la ABM es un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo que contiene la región Fe, o una proteína de fusión que incluye una región equivalente a la región Fe de una inmunoglobulina. En una modalidad particularmente preferida, la ABM es un anticuerpo humanizado. La presente invención está además dirigida a composiciones farmacéuticas que comprenden las ABM de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptable. La presente invención está además dirigida al uso de dichas composiciones farmacéuticas en el método de tratamiento de cáncer. Específicamente, la presente invención está dirigida a un método para el tratamiento de cáncer que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica de la invención. La presente invención provee además métodos para la generación y uso de sistemas de células huésped para la producción de glicoformas de las ABM de la presente invención, que tienen un aumento de la afinidad de unión al receptor Fe, preferiblemente un aumento de la unión a los receptores activadores de Fe y/o que tiene un aumento de las funciones efectoras, incluyendo citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. La metodología de glicomodificación que puede usarse con las ABM de la presente invención ha sido descrita en forma más detallada en la Patente Norteamericana N° 6,602,684, la publicación de la solicitud de Patente Norteamericana N° 2004/0241817 Al, la publicación de la solicitud de Patente Norteamericana N° 2003/0175884 Al, solicitud de Patente Norteamericana Provisional N° 60/441.307 y WO 2004/065540, cuyos contenidos completos de cada una de ellas se incorpora aquí como referencia en su totalidad. Las ABM de la presente invención pueden estar alternativamente glicomodificadas para tener residuos de fucosa reducidos en la región Fe de acuerdo con las técnicas descritas en la publicación de solicitud de Patente Norteamericana N° 2003/0157108 (Genentech) , o en EP 1 176 195 Al, WO 03/084570, WO 03/085119 y la publicación de las solicitudes de Patentes Norteamericanas Nos. 2003/0115614, 2004/093621, 2004/110282, 2004/110704, 2004/132140 (Kyowa). El contenido de cada uno de estos documentos se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

Las ABM glicomodificadas de la invención pueden producirse también en sistemas de expresión que producen glicoproteínas modificadas tales como las que se enseñan en la publicación de solicitud de Patente Norteamericana N° 60/344.169 y WO 03/056914 (GlycoFi, Inc.) o en WO 2004/057002 y WO 2004/024927 (Greenovation) , el contenido de los cuales se incorpora aquí como referencia en su totalidad. Generación De Lineas De Células Para La Producción De Proteínas Con Un Patrón De Glicosilación Alterado La presente invención provee sistema de expresión de células huésped para la generación de las ABM de la presente invención que tienen patrones de glicosilación modificados. En particular, la presente invención provee sistemas de células huésped para la generación de glicoformas de las ABM de la presente invención que tienen un valor terapéutico mejorado. Por lo tanto, la invención provee sistemas de expresión de células huésped seleccionadas o modificadas por modificación genética para expresar un polipéptido que tiene actividad GnTIII. En una modalidad, el polipéptido que tiene actividad GnTIII es un polipéptido de fusión que comprende dominio de localización Golgi de un polipéptido residente Golgi heterólogo. Específicamente, dichos sistemas de expresión de células huésped pueden ser modificadas por modificación de manera de contener una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido que tiene GnTIII, ligado emparejado a un sistema promotor constitutivo o regulado. En una modalidad específica, la presente invención provee una célula huésped que ha sido modificada por modificación genética para expresar por lo menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión que tiene una actividad GNTIII y que comprende el dominio de localización Golgi de un polipéptido residente heterólogo Golgi. En un aspecto, la célula huésped es manipulada por modificación dentro de una molécula de ácido nucleico que comprende por lo menos un gen que codifica un polipéptido de fusión que tiene actividad GnTIII y que comprende el dominio de localización Golgi de un polipéptido residente Golgi heterólogo. En general, cualquier tipo de línea de célula cultivada, incluyendo las líneas de células discutidas anteriormente, pueden usarse como base para manipular por modificación las líneas de células huésped de la presente invención. En una modalidad preferida, las células HEK293-EBNA, células CHO, células BHK, células NSO, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de ratón P3X63, células PER, células PER.C6 o células de hibridoma, otras células de mamífero, células de levadura, células de insecto o células de plantas se usan como línea de célula base para generar las células huésped modificadas por modificación de la invención.

La invención contempla abarcar cualquier célula huésped manipulada por modificación que exprese un polipéptido que tiene actividad GnTIII, incluyendo un polipéptido de fusión que comprende el dominio de localización Golgi de un polipéptido residente Golgi heterólogo tal como el que se define aqui. Uno o varios ácidos nucleicos que codifican un polipéptido que tiene actividad GnTIII puede expresarse bajo el control de un promotor constitutivo o, alternativamente un sistema de expresión regulado. Dichos sistemas son bien conocidos en la técnica e incluyen los sistemas discutidos anteriormente. Si varios ácidos nucleicos diferentes que codifican polipéptidos de fusión que tienen actividad GnTIII y que comprenden el dominio de localización Golgi de un polipéptido residente Golgi heterólogo, están comprendidas dentro del sistema de célula huésped, algunos de ellos pueden expresarse bajo el control de un promotor constitutivo, mientras que otros se expresan bajo el control de un promotor regulado. Los niveles de expresión de los polipéptidos de fusión que tienen actividad GnTIII, están determinados por métodos que son generalmente conocidos en la técnica, incluyendo análisis de Western blot, análisis de Western blot, análisis de expresión génica informante o medición de la actividad GnTIII. Alternativamente, puede emplearse una lectina que se une a los productos biosintéticos del GnTIII, por ejemplo la lectina E4-PHA. Alternativamente, puede usarse un ensayo funcional que mide el aumento de la unión al receptor Fe, o el aumento de la función efectuada mediada por los anticuerpos producidos por las células modificadas por modificación con el ácido nucleico que codifica un polipéptido con actividad GnTIII. Identificación De Transfectantes o Transformantes Que Expresan La Proteina Que Tiene Un Patrón de Glicosilación Modificado Las células huésped que contienen la secuencia codificadora de una ABM quimérica (por ejemplo, humanizada) que tiene sustancialmente la misma especificidad de unión del anticuerpo ICR62 de rata, que expresa los productos génicos biológicamente activos, puede ser identificada mediante por lo menos cuatro modalidades generales; (a) hibridación de ADN-ADN o ADN-ARN; (b) la presencia o ausencia de funciones del gen "marcador"; (c) verificación del nivel de transcripción medido por la expresión de las transcripciones ARNm respectiva en la célula huésped; y (d) detección del producto génico medido por inmunoensayo o por su actividad biológica . En la primera modalidad, la presencia de la secuencia codificadora de una ABM quimérica (por ejemplo, humanizada) que tiene sustancialmente la misma especificidad de unión del anticuerpo ICR62 de rata, y la secuencia codificadora del polipéptido que tiene actividad GnTIII puede ser detectada por la hibridación de ADN-ADN o ADN-ARN usando sondas que comprenden secuencias nucleotídicas que son homologas de las respectivas secuencias codificadoras, respectivamente, o porciones o derivados de éstas. En la segunda modalidad, el sistema recombinante de vector de expresión/huésped puede identificarse y seleccionarse en base a la presencia o ausencia de ciertas funciones del gen "marcador" (por ejemplo, actividad de timidina cinasa, resistencia a los antibióticos, resistencia al metotrexato, fenotipo de transformación, formación de cuerpos de oclusión en baculovirus, etc.). Por ejemplo, si la secuencia codificadora de la ABM de la invención, o un fragmento de la misma, y la secuencia codificadora del polipéptido que tiene actividad GnTIII, se insertan dentro de una secuencia génica marcadora del vector, los recombinantes que contienen las secuencias de codificación respectivas, pueden identificarse por la ausencia de la función génica marcadora. Alternativamente, el gen marcador puede colocarse en tándem con las secuencias codificadoras bajo el control del mismo promotor o un promotor diferente usado para controlar la expresión de las secuencias codificadoras. La expresión del marcador en respuesta a la inducción o selección indica la expresión de la secuencia codificadora de la ABM de la invención y la secuencia codificadora del polipéptido que tiene actividad GnTIII. En la tercera modalidad, la actividad transcripcional para la región codificadora de la ABM de la invención o un fragmento de la misma, y la secuencia codificadora del polipéptido que tiene actividad GnTIII, puede verificarse mediante ensayos de hibridación. Por ejemplo, el ARN puede aislarse y analizarse mediante Western blot usando una sonda homologa de las secuencias codificadoras de la ABM de la invención o un fragmento de las mismas, y la secuencia codificadora del polipéptido que tiene actividad GnTIII o porciones particulares del mismo. Alternativamente, los ácidos nucleicos totales de la célula huésped pueden extraerse y ensayarse para la hibridación a dichas sondas. En la cuarta modalidad, la expresión de los productos de proteína puede verificarse inmunológicamente, por ejemplo mediante Western blots, inmunoensayos tales como radioinmunoprecipitación, inmunoensayos ligados a enzimas y similares. El ensayo final del éxito de los sistemas de expresión sin embargo involucra la detección de los productos génicos biológicamente activos. Generación y Uso de las ABM Que Tienen Un Aumento De La Función Efectora Que Incluye Citotoxicidad Celular Dependiente De Anticuerpos En modalidades preferidas, la presente invención provee glicoformas de ABM quiméricos (es decir, humanizados) que tienen sustancialmente la misma especificidad de unión del anticuerpo ICR62 de rata y que tienen un aumento de la función efectora que incluye citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. La glicosilación manipulada por modificación de los anticuerpos ha sido previamente descrita. Ver por ejemplo, la Patente Norteamericana N° 6,602,684, que se incorpora aqui como referencia en su totalidad. Las pruebas clínicas de anticuerpos monoclonales no conjugados (mAb) para el tratamiento de algunos tipos de cáncer, han proporcionado recientemente resultados alentadores. Dillman, Cáncer Biother . & Radiopharm . 12 : 223-25 (1997); Deo y otros , Immunology Today 18 : 121 (1997). Una IgGl no conjugada, quimérica ha sido aprobada para el linfoma no de Hodgkin de células B foliculares o de bajo grado. Dillman, Cáncer Biother . & Radiopharm . 12 : 223-25 (1997), mientras que otros mAb no conjugados, una IgGl humanizada, que tiene como objetivo tumores de mama sólidos, ha demostrado también resultados prometedores en pruebas clínicas de fase III. Deo y otros , Immunology Today 18 : 121 (1997) . Los antígenos de estos dos mAb están expresados altamente en sus respectivas células tumorales, y los anticuerpos son intermediarios en una potente destrucción de tumores mediante células efectoras in vi tro e in vivo . En contraste, muchos otros mAb no conjugados con especificidades tumorales finas, no pueden desencadenar funciones efectoras de suficiente potencia para resultar clínicamente útiles. Frost y otros , Cáncer 80 : 317-33 (1997); Surfus y otros , J. Immunother . 19:184-91 (1996). Para algunos de estos mAb más débiles, se ha ensayado corrientemente terapia agregada con citocinas. La adición de citocinas puede estimular la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) , mediante el aumento de la actividad y de la cantidad de linfocitos circulantes. Frost y otros , Cáncer 80 : 311 -33 (1997); Surfus y otros , J. Immunother . 19:184-91 (1996). ADCC, un ataque lítico sobre células que es blanco del anticuerpo, se desencadena por unión de los receptores leucocíticos a la región constante (Fe) de los anticuerpos. Deo y otros , Immunology Today 18 : 121 (1997) . Una modalidad diferente, pero complementaria para aumentar la actividad de ADCC de las IgGls no conjugadas, consiste en manipular por modificación la región Fe del anticuerpo. Los estudios de manipulación de modificación en proteínas han demostrado que las FcyRs interactúan con la región de bisagra más baja, del dominio CH2 de IgG. Lund y otros , J. Immunol . 157:4963-69 (1996). Sin embargo, la unión FcyR requiere también la presencia de oligosacáridos unidos covalentemente a la Asn 297 conservada, en la región CH2. Lund y otros , J. Immunol . 157:4963-69 (1996); Wright and Morrison, Trends Biotech . 15 : 26-31 (1997), sugieren que cualquiera del oligosacárido y el polipéptido contribuyen ambos directamente al sitio de interacción o que el oligosacárido es necesario para mantener una conformación de polipéptido CH2 activa. La modificación de la estructura de oligosacárido puede ser por lo tanto explorada como un medio para aumentar la afinidad de la interacción. Una molécula IgG es portadora de dos oligosacáridos N-ligados en su región Fe, uno en cada cadena pesada. Tal como con cualquier glicoproteína, se produce un anticuerpo como población de glicoformas que comparten la misma estructura polipeptídica pero que tienen diferentes oligosacáridos unidos a los sitios de glicosilación. Los oligosacáridos que se encuentran normalmente en la región Fe de la IgG del suero son de un tipo biantenario complejo (Wormald y otros, Bíochemístry 36:130-38 (1997), con un bajo nivel de ácido siálico terminal y con bisección de N-acetilglucosamina (GlcNAc) y con un grado variable de galactosilación terminal y fucosilación de núcleo. Algunos estudios sugieren que la estructura de carbohidrato mínima requerida para la unión de FcyR radica dentro del núcleo de oligosacáridos. Lund y otros , J. Immunol . 157:4963-69 (1996). Las líneas de células derivadas de ratón o de hámster usadas en la industria y en la academia para la producción de mAb terapéuticos no conjugados, adhieren normalmente los determinantes oligosacáridos requeridos a los sitios Fe. Las IgG expresadas en estas líneas de células carecen, sin embargo, de la GlcNAc divisible que se encuentra en bajas cantidades en las IgGs del suero. Lifely y otros , Glycobiology 318 : 813-22 (1995). En contraste, se observó recientemente que un IgGl humanizado, producido por mieloma de rata, (CAMPATH-1H) es portador de un GlcNAc divisible en algunas de sus glicoformas. Lifely y otros , Glycobiology 318 : 813-22 (1995). El anticuerpo derivado de célula de rata alcanza una actividad ADCC máxima similar in vi tro como anticuerpos CAMPATH-1H producidos en líneas de células estándar pero en concentraciones de anticuerpo significativamente inferiores. El antígeno CAMPATH está presente normalmente en altos niveles en las células de linfomas, y este mAb quimérico tiene una alta actividad en ausencia de un GlcNAc divisible. Lifely y otros , Glycobiology 318 : 813-22 (1995). En la vía de glicosilación ligada a N, se agrega un GlcNAc divisible a GnTIII. Schachter, Biochem . Cel l Biol . 64:163-81 (1986) . Los estudios previos usaron una línea de célula CHO productora de un anticuerpo único, que fue previamente modificado por modificación genética para expresar, de una manera externamente regulada, diferentes niveles de una enzima génica GnTIII clonada (Umana, P., y otros , Na ture Biotechnol . 17:176-180 (1999)). Esta modalidad estableció por primera vez una correlación rigurosa entre la expresión de GnTIII y la actividad de ADCC del anticuerpo modificado. Por lo tanto, la invención contempla un anticuerpo quimérico recombinante o un fragmento del mismo con la especificidad de unión del anticuerpo ICR62 de rata que tiene una glicosilación alterada resultante del aumento de la actividad de GnTIII. La actividad incrementada de GnTIII da como resultado un aumento del porcentaje de oligosacáridos divididos, así como también una disminución en el porcentaje de los residuos fucosa, en la región Fe de la ABM. Este anticuerpo, o fragmento del mismo tiene un aumento de la afinidad de unión al receptor Fe y un aumento de la función efectora. Además, la invención está dirigida al fragmento de anticuerpo y a las proteínas de fusión que comprenden una región que es equivalente a la región Fe de las inmunoglobulinas. En una modalidad preferida, el anticuerpo está humanizado. Aplicaciones Terapéuticas de ABM Producidos de Acuerdo con los Métodos de la Invención . En su sentido más amplio, las ABM de la presente invención pueden usarse como células objetivo in vivo o in vi tro que expresan el EGFR. Las células que expresan el EGFR, pueden ser elegidas para diagnóstico o para propósitos terapéuticos. En un aspecto, las ABM de la presente invención pueden usarse para detectar la presencia de EGFR en una muestra. En otro aspecto las ABM de la presente invención pueden usarse para inhibir o reducir la transducción de señales mediada por EGFR en células que expresan EGFR en la superficie. El EGFR se expresa anormalmente (es decir, sobreexpresa) en muchos tumores humanos en comparación con tejidos no tumorales del mismo tipo de célula. Por lo tanto, las ABM de la invención son particularmente útiles en la prevención de la formación de tumores, en la erradicación de tumores y en la inhibición del crecimiento tumoral. Mediante bloqueo de la unión de los ligandos de EGFR a EGFR, las ABM de la invención inhiben la activación de las células tumorales que dependen de EGF incluyendo la fosforilación de tirosina de EGFR, el aumento del régimen de acidificación extracelular y la proliferación de células. Las ABM de la invención actúan también para detener el ciclo celular, para causar la apoptosis de las células objetivo (es decir, las células tumorales) y para inhibir la angiogénesis y/o la diferenciación de las células objetivo. Las ABM de la invención pueden usarse para tratar cualquier tumor que expresa EGFR. Las enfermedades malignas que pueden tratarse con las ABM de la invención incluyen, pero no están limitadas a, carcinomas de células escamosos y epidérmicos, carcinomas pulmonares de células no pequeñas, gliomas, cáncer pancreático, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello y carcinomas de células renales. Las ABM de la presente invención pueden usarse solas para hacer diana y matar células tumorales in vivo . Las ABM pueden usarse también conjuntamente con un agente terapéutico apropiado para tratar carcinoma humano. Por ejemplo, las ABM pueden usarse en combinación con métodos de tratamiento estándar o convencional tales como quimioterapia, terapia de radiación o bien pueden conjugarse o ligarse con un fármaco terapéutico o toxina, así como también con una limosina o con un factor de crecimiento inhibidor de tumores, para liberar el agente terapéutico al sitio del carcinoma. Los conjugados de la ABM de esta invención que son de importancia primordial son (1) inmunotoxinas (conjugados de la ABM y una porción citotóxica) y (2) ABM rotuladas (por ejemplo, radiomarcadas, rotuladas con enzimas o rotuladas con fluorocromo) en las cuales el rótulo provee un medio para identificar los complejos inmunitarios que incluyen el ABM rotulado. Los ABM pueden usarse también para inducir lisis a través del procedimiento de complemento natural, y para interactuar con las células citotóxicas dependientes de anticuerpos que están normalmente presentes. La porción citotóxica de la inmunotoxina puede ser un fármaco citotóxico, o una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano o vegetal, o un fragmento enzimáticamente activo ("cadena A") de dicha toxina. Las toxinas enzimáticamente activas y los fragmentos de las mismas que se usaron son cadena A de difteria, fragmentos activos no adherentes de la toxina de difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolacca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de momordica carantia, inhibidor de curcina, crotina, sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina y enomicina. En otra modalidad, las ABM están conjugadas con fármacos anticáncer de moléculas pequeñas. Los conjugados de la ABM y dichas porciones de citocina se preparan usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncionales. Ejemplos de dichos reactivos son SPDP, IT, derivados bifuncionales de imidoésteres tales como HCl de adipimidato de dimetilo, esteres activos tales como suberato de disuccinimidilo, aldehidos tales como glutaraldehído, compuestos bis-azido tales como bis- (p-azidobenzoil) -hexanodiamina, derivados de bis-diazonio tales como diisocianatos de bis- (p-diazoniobenzoil) -etilenodiamina tales como 2 , 6-diisocianato de tolueno y compuestos de flúor bis-activos tales como 1 , 5-difluoro-2 , 4-dinitrobenceno . La porción de lisado de una toxina puede unirse al fragmento Fab de las ABM. Se conocen en la técnica toxinas adicionales apropiadas, tal como se evidencia en por ejemplo, la solicitud de Patente Norteamericana publicada N° 2002/0128448, que se incorpora aquí como referencia en su totalidad. En una modalidad, una ABM glicomodificada quimérica (por ejemplo, humanizada) , que tiene sustancialmente la misma especificidad de unión del anticuerpo ICR62 de rata, se conjuga con la cadena A de ricina. Más ventajosamente, la cadena A de ricina esté glicosilada y producida a través de medios recombinantes. Un método ventajoso para preparar la inmunotoxina de ricina ha sido descrito en Vitetta y otros, Science 238, 1098 (1987), que se incorpora aquí como referencia . Cuando se usa para matar células de cáncer humano in vi tro para propósitos de diagnóstico, los conjugados se agregarán típicamente al medio de cultivo de células en una concentración de por lo menos aproximadamente 10 nM . La formulación y el modo de administración para el uso in vi tro no es crítico. Normalmente se usarán formulaciones acuosas que son compatibles con el medio de cultivo o de perfusión. La citotoxicidad puede leerse por técnicas convencionales para determinar la presencia o el grado de cáncer. Tal como se discutió anteriormente, puede prepararse un radiofarmacéutico citotóxico para el tratamiento del cáncer, mediante conjugación de un isótopo radioactivo (por ejemplo, I, Y, Pr) para una ABM quimérica glicomodificada que tiene sustancialmente la misma especificidad de unión del anticuerpo ICR62 de rata. El término "porción citotóxica" tal como se usa aquí incluye dichos isótopos. En otra modalidad, se llenan liposomas con un fármaco citotóxico y dichos liposomas son recubiertos con las ABM de la presente invención. Debido a que existen muchas moléculas de EGFR en la superficie de la célula maligna que expresa EGFR, este método permite liberar grandes cantidades de fármaco al tipo de célula correcta. Las técnicas para conjugar dichos agentes terapéuticos a anticuerpos son bien conocidas (ver, por ejemplo, Arnon y otros, "Monoclonal Antibodies for Immunoobjetivoing of Drugs in Cáncer Therapy", in Monoclonal An tibodies and Cáncer Therapy, Reisfeld y otros , (eds.), pp . 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom y otros , "Antibodies For Drug Delivery", in Con trolled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson y otros , (eds.), pp . 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review", in Monoclonal An tibodies ' 84 : Biologi cal And Clinical Appli ca tions, Pinchera y otros, (eds.), pp. 475-506 (1985); and Thorpe y otros , "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol . Rev. , 62:119-58 (1982)). Otras aplicaciones terapéuticas para las ABM de la invención incluyen la conjugación o enlace, por ejemplo mediante técnicas de ADN recombinante, a una enzima capaz de convertir un profármaco en un fármaco citotóxico y al uso de este conjugado de anticuerpo-enzima en combinación con el profármaco para convertir el profármaco en un agente citotóxico en el sitio del tumor (ver por ejemplo Senter y otros, "Anti-Tumor Effects of Antibody-alkaline Phosphatase" , Proc. Na ti . Acad . Scí . USA 85:4842-46 (1988); "Enhancement of the in vi tro and ín vivo Antitumor Activites of Phosphorylated Mitocycin C and Etoposide Derivatives by Monoclonal Antibody-Alkaline Phosphatase Conjugates", Cáncer Research 49:5789-5792 (1989); y Senter, "Activation of Prodrugs by Antibody-Enzyme Conjugates: A New Approach to Cáncer Therapy," FASEB J. 4:188-193 (1990)). Otro uso terapéutico más para las ABM de la invención involucra el uso ya sea sin conjugar, en presencia de complemento, o como parte de un conjugado anticuerpo-fármaco o anticuerpo-toxina, para remover las células tumorales de la médula ósea de los pacientes con cáncer. De acuerdo con esta modalidad, la médula ósea autóloga puede purgarse ex vivo mediante tratamiento con el anticuerpo, y la médula puede ser nuevamente infusionada en el paciente [ver por ejemplo, Ramsay y otros, "Bone Marrow Purging Using Monoclonal Antibodies", J. Clin . Immunol . , 8(2): 81-88 (1988) ] .

Además, se contempla que la invención comprende una inmunotoxina de cadena única que comprende dominios de unión al antígeno que permiten sustancialmente la misma especificidad de unión que el anticuerpo ICR62 de rata (por ejemplo polipéptidos que comprenden los CDR del anticuerpo ICR62 de rata) y que comprende además un polipéptido de toxina. Las inmunotoxinas de una sola cadena de la invención pueden usarse para tratar carcinoma humano in vivo . Similarmente, una proteína de fusión que comprende por lo menos la región de unión al antígeno de una ABM de la invención unida a por lo menos una porción funcionalmente activa de una segunda proteína que tiene actividad antitumoral, por ejemplo una linfocina u oncostatina, puede usarse para tratar carcinoma humano in vivo . La presente invención provee un método para matar selectivamente células tumorales que expresan EGFR. Este método comprende hacer reaccionar el inmunoconjugado (por ejemplo la inmunotoxina) de la invención con dichas células tumorales. Estas células tumorales pueden ser de carcinoma humano. Adicionalmente, esta invención provee un método para el tratamiento de carcinomas (por ejemplo carcinomas humanos) in vivo . Este método comprende administrar a un sujeto una cantidad farmacéuticamente eficaz de una composición que contiene por lo menos uno de los inmunoconjugados (por ejemplo la inmunotoxina) de la invención . En otro aspecto, la invención está dirigida a un método mejorado para tratar trastornos de proliferación de células en las cuales se expresa el EGFR, particularmente en las cuales el EGFR se expresa en forma anormal (por ejemplo sobreexpresa), incluyendo cánceres de vejiga, cerebro, cabeza y cuello, páncreas, pulmón, mama, ovario, colon, próstata, piel y riñon, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una ABM de la presente invención a un sujeto humano que lo necesita. En una modalidad preferida, la ABM es un anticuerpo anti-EGFR de glico-modificación, con una especificidad de unión sustancialmente igual a la del anticuerpo ICR62 de rata. En otra modalidad preferida, el anticuerpo está humanizado. Ejemplos de trastornos de proliferación celular que pueden tratarse con una ABM de la presente invención incluyen pero no están limitadas a neoplasmas localizados en: el abdomen, huesos, mama, sistema digestivo, hígado, páncreas, peritoneo, glándulas endocrinas (adrenal, paratiroidea, pituitaria, testículos, ovario, timo, tiroides), ojo, cabeza y cuello, sistema nervioso (central y periférico), sistema linfático, pelvis, piel, tejido blando, bazo, región torácica y sistema urogenital. De manera similar, otros trastornos de proliferación de células pueden tratarse mediante las ABM de la presente invención. Ejemplos de dichos trastornos de proliferación de células incluyen pero no están limitados a: hipergamaglobulinemia, trastornos linfoproliferativos, paraproteinemias, púrpura, sarcoidosis, Síndrome de Sezary, Macroglobulinemia de Waldenstron, Enfermedad de Gaucher, histiocitosis y cualquier otra enfermedad de proliferación celular, además de neoplasia, localizada en un sistema de órganos enumerado anteriormente. De acuerdo con la práctica de esta invención, el sujeto puede ser un ser humano, equino, porcino, bovino, murino, canino, felino y aves. Se incluyen también otros animales de sangre caliente en esta invención. La presente invención provee además métodos para inhibir el crecimiento de células tumorales humanas, para tratar un tumor en un sujeto y para tratar una enfermedad de tipo proliferativo en un sujeto. Estos métodos comprenden administrar al sujeto una cantidad eficaz de la composición de la invención. La invención está además dirigida a métodos para el tratamiento de enfermedades o trastornos no malignos en un mamífero, que se caracterizan por una activación o producción anormal de EGFR o uno o más ligandos EGFR, que comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de las ABM de la invención. El sujeto tendrá generalmente células que expresan EGFR, por ejemplo en un tejido enfermo del mismo, tal como las ABM de la invención que son capaces de unirse a células dentro del sujeto. La activación o expresión anormal de EGFR o de un ligando de EGFR puede ocurrir en células de un sujeto, por ejemplo de tejido enfermo del sujeto. La activación anormal de EGFR puede atribuirse a una amplificación, sobreexpresión o producción aberrante del EGFR y/o del ligando de EGFR. En una modalidad de la invención, se llevará a cabo un ensayo de diagnóstico o pronóstico para determinar si ocurre una producción anormal o activación de EGFR (o ligando de EGFR) en el sujeto. Por ejemplo, la amplificación génica y/o la sobreexpresión de EGFR y/o ligando puede ser determinada. Varios ensayos para determinar dicha amplificación/sobreexpresión se encuentran disponibles en el arte e incluyen los ensayos IHC, FISH y ensayos de pérdida de antígeno descritos anteriormente. Alternativamente o adicionalmente, los niveles de un ligando de EGFR, tal como TGF-a en o asociado con la muestra pueden determinarse de acuerdo con procedimientos conocidos. Dichos ensayos pueden detectar proteína y/o ácido nucleico que la codifica en la muestra a ensayarse. En una modalidad, los niveles de ligando EGFR en una muestra pueden determinarse usando inmunohistoquimica (IHC); ver por ejemplo, Scher y otros, Clin . Cáncer Research 1:545-550 (1995). Alternativamente o adicionalmente, se pueden evaluar los niveles de ácido nucleico codificador de EGFR en la muestra a ensayar; por ejemplo a través de FISH, Southern blot o técnicas de PCR. Además, la sobreexpresión o amplificación de EGFR o de ligando de EGFR pueden evaluarse usando un ensayo de diagnóstico in vivo, por ejemplo mediante la administración de una molécula (tal como un anticuerpo) que une la molécula que se desea detectar y es marcada con una etiqueta detectable (por ejemplo un isótopo radioactivo) y el paciente es escaneado externamente para la localización del rótulo. Alternativamente, pueden detectarse los heterodímeros de EGFR, especialmente los heterodímeros EGFR-ErbB2, EGFR-ErbB3 o EGFR-ErbB4, en el paciente, por ejemplo en tejido enfermo del mismo, antes de la terapia. Se encuentran disponibles varios métodos para detectar interacciones de proteína-proteína no covalentes o indicar de otra manera la proximidad entre proteínas de interés. Ejemplos de métodos para detectar heterodímeros EGFR incluyen sin limitación métodos a base de inmunoafinidad tales como inmunoprecipitación; transferencia de energía de resonancia por fluorescencia (FRET) (Selvin, Na t . Struct . Biol . 7:730-34 (2000); Gadella & Jovin, J. Cell Biol . 129:1543-58 (1995); y Nagy y otros , Cytometry 32:120-131 (1998)); co-localización de EGFR ya sea con ErbB2 o ErbB3 usando técnicas de inmunofluorescencia directa o indirecta convencionales y microscopía de escaneo láser confocal; formación de imagen por escaneo con láser (LSI) para detectar la unión del anticuerpo y para la co-localización del EGFR ya sea con ErbB2 o ErbB3 en un formato de alto rendimiento, tal como una placa de microcavidades (Zuck y otros , Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 96:11122-11127 (1999)); o sistema de ensayo eTag/m (Aclara Bio Sciences, Mountain View, Calif.; y solicitud de Patente Estadounidense N° 2001/0049105, publicada el 6 de diciembre de 2001) . Es evidente por lo tanto que la presente invención abarca composiciones farmacéuticas, combinaciones y métodos para tratar tumores malignos humanos tales como cánceres de vejiga, cerebro, cabeza y cuello, páncreas, pulmón, mama, ovario, colon, próstata, piel y riñon. Por ejemplo, la invención incluye composiciones farmacéuticas para ser usadas en el tratamiento de tumores malignos humanos que comprenden una cantidad farmacéuticamente eficaz de un anticuerpo de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones de ABM de la invención pueden administrarse usando modos convencionales de administración que incluyen pero que no están limitados a, endovenoso, intraperitoneal, oral, intralinfático o administración directamente dentro del tumor. Se prefiere la administración endovenosa . En un aspecto de la invención, se preparan las formulaciones terapéuticas que contienen ABM de la invención para almacenamiento mediante mezcla de un anticuerpo que tiene el grado de pureza deseado, con portadores, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables opcionales (REMINGTON'S PHARMACEUTIC?L SCIENCES, 16a edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos para los que los reciben, en las dosis y concentraciones empleadas e incluyen regulador de pHs tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio; alcohol fenólico, butílico o bencílico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciciohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trahalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tal como sodio; complejos metálicos (por ejemplo complejos Zn-proteína) ; y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG) . Las ABM de la presente invención pueden administrarse a un sujeto para tratar una enfermedad o un trastorno que se caracteriza por una actividad anormal de EGFR o un ligando de EGFR tal como un tumor, ya sea solo o en terapia de combinación con por ejemplo un agente quimioterapéutico y/o terapia de radiación. Ejemplos de formulaciones de anticuerpos anti-EGFR se describen en Herbst and Shen, Cáncer 94 (5) : 1593-1611. Los agentes quimioterapéuticos apropiados incluyen cisplatina, doxorubicina, topotecan, paclitaxel, vinblastina, carboplatina y etoposida. Las formulaciones liofilizadas adaptadas para administración subcutánea se describen en WO97/04801. Tales formulaciones liofilizadas pueden ser reconstituidas con un diluyente apropiado hasta una concentración elevada de proteína y luego la formulación reconstituida puede administrarse subcutáneamente al mamífero que se trata aquí. La formulación presente puede contener también más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular tratada, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan entre sí. Por ejemplo, puede ser conveniente proveer además un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, citocina o un agente inmunosupresor (por ejemplo uno que actúa sobre las células T, tal como ciclosporina o un anticuerpo que se une a las células T, por ejemplo uno que se une a LFA-1) . La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de antagonista presente en la formulación, del tipo de enfermedad o trastorno o tratamiento, y de otros factores discernidos anteriormente. Estos generalmente se usan en las mismas dosis y con las vías de administración que se usaron anteriormente o desde aproximadamente 1 a 99% de las dosis empleadas hasta el presente. Los ingredientes activos pueden estar también atrapados en microcápsulas preparadas por ejemplo por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metacrilato de metilo) respectivamente, en sistemas de liberación de fármacos coloidales (por ejemplo liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Dichas técnicas se describen en Remington ' s Pharma ceutí cal Sciences l ßth edi tion , Osol, A. Ed . (1980) . Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos apropiados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el antaqonista, donde dichas matrices tienen la forma de artículos configurados, por ejemplo películas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo poli (2-hidroxietil-metacrilato) o poli (vinil alcohol)), poliláctidos (Patente Estadounidense N° 3,773,919), copolimeros de ácido L-glutámico y ?etil-L-glutamato, acetato de etilenvinilo no degradable, copolímeros de ácido glicólico-ácido láctico degradables tales como LUPRON DEPOTTM (microesferas inyectables compuestas por un copolimero de ácido glicólico-ácido láctico y acetato de leuprolida) y ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico . Las formulaciones que se usan para la administración in vivo deben ser esterilizadas. Esto se loqra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. Las composiciones de la invención pueden estar en una variedad de formas de dosificación que incluyen pero que no están limitadas a soluciones o suspensiones líquidas, tabletas, pildoras, polvos, supositorios, microcápsulas o microvesículas poliméricas, liposomas y soluciones inyectables o infusibles. La forma preferida depende del modo de administración y de la aplicación terapéutica. Las composiciones de la invención incluyen también preferentemente portadores y adyuvantes convencionales farmacéuticamente aceptable conocidos en la materia tales como albúmina de suero humano, intercambiadores de iones, alúmina, lecitina, sustancias reguladoras tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio y sales o electrolitos tales como sulfato de protamina. El modo de administración y el régimen de dosificación más eficaces para las composiciones farmacéuticas de esta invención dependen de la gravedad y del curso de la enfermedad, de la salud y respuesta del paciente al tratamiento y de la opinión del médico que lo trata. Por consiguiente, las dosis de composiciones deben ser evaluadas para cada paciente individual. Sin embargo, una dosis eficaz de las composiciones de la invención estará generalmente dentro de un intervalo de desde aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 2000 mg/kg. En una modalidad, la dosis eficaz está en el intervalo de desde aproximadamente 1.0 mg/kg a aproximadamente 15.0 mg/kg. En una modalidad más específica, la dosis eficaz está en el intervalo de desde aproximadamente 1.5 mg/kg hasta aproximadamente 12 mg/kg. En otras modalidades, la dosis está en el intervalo de desde aproximadamente 1.5 mg/kg hasta aproximadamente 4.5 mg/kg, o desde aproximadamente 4.5 mg/kg hasta aproximadamente 12 mg/kg. La dosis de la presente invención puede ser cualquier dosis dentro de estos intervalos incluyendo pero sin limitarlo a 1.0 mg/kg, 1.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 2.5 mg/kg, 3.0 mg/kg, 3.5 mg/kg, 4.0 mg/kg, 4.5 mg/kg, 5.0 mg/kg, 5.5 mg/kg, 6.0 mg/kg, 6.5 mg/kg, 7.0 mg/kg, 7.5 mg/kg, 8.0 mg/kg, 8.5 mg/kg, 9.0 mg/kg, 9.5 mg/kg, 10.0 mg/kg, 10.5 mg/kg, 11.0 mg/kg, 11.5 mg/kg, 12.0 mg/kg, 12.5 mg/kg, 13.0 mg/kg, 13.5 mg/kg, 14.0 mg/kg, 14.5 mg/kg o 15.0 mg/kg. Las moléculas aquí descritas pueden estar en una variedad de formas de dosificación que incluyen pero que no están limitadas a soluciones o suspensiones liquidas, tabletas, pildoras, polvos, supositorios, microcápsulas o microvesículas poliméricas, liposomas y soluciones inyectables o infusibles. La forma preferida depende del modo de administración y de la aplicación terapéutica. Las dosis de la presente invención pueden estar determinadas en algunos casos mediante el uso de biomarcadores predictivos. Los biomarcadores predictivos son marcadores moleculares que se usan para determinar (es decir, observar y/o cuantificar) un patrón de expresión y/o activación de los genes o proteínas relacionadas con el tumor, o de los componentes celulares de una vía de señalización relacionada con un tumor. Para verificar los efectos biológicos de las terapias dirigidas a un objetivo en los tejidos tumorales y para correlacionar estos efectos con la respuesta clínica, ayudaría la identificación de las vías de supervivencia y crecimiento predominantes que son emparejado en tumores, estableciendo de este modo un perfil de la terapia que tendrá probabilidades de responder bien y a la inversa, proveer un fundamento para diseñar estrategias para superar la resistencia. Por ejemplo, lo biomarcadores para terapia anti-EGFR pueden comprender moléculas que están en la vía de señalización cadena abajo de EGFR que conduce a un trastorno de proliferación de células que incluye pero que no está limitado a Akt, RAS, RAF, MAPK, ERK1, ERK2 , PKC, STAT3, STAT5 (Mitchell, Na ture Biotech . 22: 363-364 (2004); Becker, Na ture Biotech 22:15-18 (2004); Tsao and Herbst, Signal 4:4-9 (2003)). Los biomarcadores para terapia anti-EGFR pueden comprender también receptores del factor de crecimiento tales como EGFR, ErbB-2 (HER2/neu) y ErbB-3 (HER3), y pueden ser pronosticadores positivos o negativos de la respuesta del paciente a una terapia anti-EGFR. Por ejemplo, se determinó que el receptor del factor de crecimiento ErbB-3 (HER3) era un biomarcador de pronóstico negativo para el anticuerpo anti-EGFR ABX-EGF (publicación de solicitud de Patente Estadounidense N° 2004/0132097 Al) . Los biomarcadores pronosticadores pueden medirse mediante ensayos celulares que son bien conocidos en la técnica y que incluyen pero que no están limitados a inmunohistoquímica, citometría de flujo, inmunofluorescencia, ensayos de captura y detección, y ensayos de fase inversa y/o los ensayos establecidos en la publicación de solicitud de Patente Estadounidense N° 2004/0132097 Al, cuyos contenidos en su totalidad se incorporan aquí como referencia. Los biomarcadores pronosticadores de terapia anti-EGFR por sí mismos pueden ser identificados de acuerdo con las técnicas que se indican en la publicación de solicitud de Patente Estadounidense N° 2003/0190689 Al, cuyos contenidos en su totalidad se incorporan aquí como referencia. En un aspecto, la presente invención provee un método para el tratamiento de un trastorno relacionado con EGFR que comprende pronosticar una respuesta para una terapia anti-EGFR en un sujeto humano que necesita tratamiento, mediante el ensayo de una muestra del sujeto humano antes de recibir la terapia con una o una pluralidad de reactivos que detectan la expresión y/o activación de los biomarcadores pronosticadores para un trastorno relacionado con EGFR tal como cáncer; determinar un patrón de expresión y/o activación de uno o más de los biomarcadores pronosticadores donde el patrón pronostica la respuesta del sujeto humano a la terapia anti-EGR; y administrar a un sujeto humano que se ha pronosticado que responde positivamente al tratamiento anti-EGFR, una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende una ABM de la presente invención. Tal como se usa aquí, un sujeto humano al que se ha pronosticado que responde posi tivamen te a un tra tamien to an ti -EGFR, es uno para el cual el anti-EGFR tendrá un efecto mensurable sobre el trastorno relacionado con EGFR (por ejemplo regresión/encogimiento del tumor) y para el cual los beneficios de terapia anti-EGFR no son superados por efectos adversos (por ejemplo toxicidad) . Tal como se usa aquí, una muestra significa cualquier muestra biológica de un organismo, particularmente de un ser humano que comprende una o más células que incluyen células únicas de cualquier origen, muestras de tejido o biopsias que han sido removidos de los órganos tales como de mama, pulmón, tracto gastrointestinal, piel, cuello uterino, ovario, próstata, riñon, cerebro, cabeza y cuello o cualquier otro órgano o tejido del cuerpo, y otras muestras del cuerpo que incluyen pero que no están limitadas a sustancias grasosas, esputos, secreciones, fluido cerebroespinal, bilis, sangre, fluido linfático, orina y heces. La composición que comprende una ABM de la presente invención se formulará, dosificará y administrará de manera coherente con una buena práctica médica. Los factores que hay que tener en cuenta en este contexto incluyen la enfermedad o trastorno particular a ser tratado, el mamífero particular que se trata, el estado clínico del paciente individual, la causa de la enfermedad o trastorno, el sitio de liberación del agente, el método de administración, el esquema de administración y otros factores conocidos por los médicos. La cantidad terapéuticamente eficaz del antagonista que debe administrarse estará gobernada por dichas consideraciones. Como proposición general, la cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo que se administra por vía parenteral, por dosis, estará en el intervalo de aproximadamente 0.1 a 20 mg/kg de peso corporal del paciente por día, con un intervalo inicial típico de antagonista usado dentro del intervalo de aproximadamente 2 a 10 mg/kg. En una modalidad, la cantidad terapéuticamente eficaz está en el intervalo de desde aproximadamente 1.0 mg/kg a aproximadamente 15.0 mg/kg. En una modalidad más específica, la dosis eficaz está en el intervalo de desde aproximadamente 1.5 mg/kg hasta aproximadamente 12 mg/kg. En otras modalidades, la dosis está en el intervalo de desde aproximadamente 1.5 mg/kg hasta aproximadamente 4.5 mg/kg, o desde aproximadamente 4.5 mg/kg hasta aproximadamente 12 mg/kg. La dosis de la presente invención puede ser también cualquier dosis dentro de estos intervalos incluyendo pero sin limitarlo a 1.0 mg/kg, 1.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 2.5 mg/kg, 3.0 mg/kg, 3.5 mg/kg, 4.0 mg/kg, 4.5 mg/kg, 5.0 mg/kg, 5.5 mg/kg, 6.0 mg/kg, 6.5 mg/kg, 7.0 mg/kg, 7.5 mg/kg, 8.0 mg/kg, 8.5 mg/kg, 9.0 mg/kg, 9.5 mg/kg, 10.0 mg/kg, 10.5 mg/kg, 11.0 mg/kg, 11.5 mg/kg, 12.0 mg/kg, 12.5 mg/kg, 13.0 mg/kg, 13.5 mg/kg, 14.0 mg/kg, 14.5 mg/kg o 15.0 mg/kg. En una modalidad preferida, al ABM es un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo humanizado. Las dosis apropiadas para dicho anticuerpo no conjugado están por ejemplo dentro del intervalo de desde aproximadamente 20 mg/m2 a aproximadamente 1000 mg/m2. Por ejemplo, puede administrarse al paciente una o más dosis de sustancialmente menos de 375 mg/m2 del anticuerpo, por ejemplo donde la dosis está en el intervalo de desde aproximadamente 20 mg/m2 hasta aproximadamente 250 mg/m2, por ejemplo desde aproximadamente 50 mg/m2 hasta aproximadamente 200 mg/m2. Además, puede administrarse una o más dosis iniciales de anticuerpo seguido de una o más dosis subsiguientes donde la dosis de mg/m2 del anticuerpo de las dosis subsiguientes exceden la dosis de mg/m2 del anticuerpo en la dosis inicial. Por ejemplo, la dosis inicial puede estar en el intervalo de desde aproximadamente 20 mg/m2 hasta aproximadamente 250 mg/m2 (por ejemplo desde aproximadamente 50 mg/m2 hasta aproximadamente 200 mg/m2) y la dosis subsiguiente puede estar en el intervalo de desde aproximadamente 250 mg/m2 a aproximadamente 1000 mg/m2. Tal como se observó anteriormente, sin embargo, estas cantidades sugeridas de ABM están sujetas en gran medida a la discreción terapéutica. El factor clave para seleccionar una dosis apropiada y para programarla es el resultado obtenido tal como se indicó anteriormente. Por ejemplo, inicialmente pueden ser necesarias dosis relativamente elevadas para el tratamiento de las enfermedades ya declaradas y agudas. Para obtener los resultados más eficaces dependiendo de la enfermedad o trastorno, el antagonista se administrará lo más pronto posible a la aparición de la primera señal, diagnóstico, aparición u ocurrencia de la enfermedad o trastorno o durante las remisiones de la enfermedad o trastorno. En el caso de anticuerpos anti-EGFR usados para tratar tumores, generalmente se han logrado resultados terapéuticos óptimos con una dosis que es suficiente para saturar completamente los receptores EGF en las células objetivo. La dosis necesaria para lograr la saturación dependerá de la cantidad de receptores EGF expresados por célula tumoral (los cuales pueden variar significativamente entre diferentes tipos de tumores). Concentraciones de suero tan bajas como 30 nM han sido eficaces en el tratamiento de ciertos tumores mientras que para lograr un efecto terapéutico óptimo con otros tumores, pueden ser necesarias concentraciones por arriba de 100 nM. La dosis necesaria para lograr la saturación para un tumor determinado puede ser fácilmente determinada in vi tro mediante radioinmunoensayo o inmunoprecipitación. En general, para la terapia de combinación con radiación, un régimen terapéutico apropiado involucra 8 infusiones semanales de una ABM anti-EGFR de la invención, en una dosis de carga de 100-500 mg/m2 seguido de dosis de mantenimiento de 100-250 mg/m2 y radiación en una cantidad de 70.0 Gy a una dosis de 2.0 Gy al día. Para terapia de combinación con quimioterapia, un régimen terapéutico apropiado involucra administrar una ABM anti-EGFR de la invención como dosis de carga/mantenimiento semanalmente de 100/100 mg/m2, 400/250 mg/m2 o 500/250 mg/m2 en combinación con cisplatina en una dosis de 100 mg/m2 cada tres semanas. Alternativamente, puede usarse gemcitabina o irinotecan en lugar de cisplatina. La ABM de la presente invención se administra por cualquier medio apropiado incluyendo administración parenteral, subcutánea, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal, y si se desea para tratamiento inmunosupresor local, administración intralesional. Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, endovenosa, intra-arterial, intraperitoneal o subcutánea. Además, el antagonista puede administrarse convenientemente por infusión pulsátil, por ejemplo con dosis declinantes del antagonista. Preferentemente, la dosis se administra mediante inyecciones, más preferentemente inyecciones endovenosas o subcutáneas, dependiendo en parte si la administración es breve o crónica. Pueden administrarse otros compuestos tales como agentes citotóxicos, agentes quimioterapéuticos, agentes inmunosupresores y/o citocinas con los presentes antagonistas. La administración combinada incluye coadministración usando formulaciones separadas o una formulación farmacéutica única, y la administración consecutiva en cualquier orden, donde preferiblemente existe un período de tiempo en el que ambos (o todos) los agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas. Sería evidente que la dosis de la composición de la invención requerida para lograr la curación puede ser más reducida con una optimización de programa. De acuerdo con la práctica de la invención, el portador farmacéutico puede ser un portador lípido. El portador lípido puede ser un fosfolípido. Además, el portador lípido puede ser un ácido graso, Asimismo, el portador lípido puede ser un detergente. Tal como se usa aquí, un detergente es cualquier sustancia que altera la tensión superficial de un líquido, generalmente disminuyéndola. En un ejemplo de la invención, el detergente puede ser un detergente no iónico. Ejemplos de detergentes no iónicos incluyen pero no están limitados a polisorbato 80 (también conocido como Tween 80 o (polioxietilensorbitano monooleato), Brij y Tritón (por ejemplo Tritón WR-1339 y Tritón A-20) . Alternativamente, el detergente puede ser un detergente iónico. Un ejemplo de un detergente iónico incluye pero no está limitado a bromuro de alquiltrimetilamonio . Adicionalmente, de acuerdo con la invención, el portador lípido puede ser un liposoma. Tal como se usa en esta solicitud, un "liposoma" es cualquier membrana unida a una vesícula que contiene cualquier molécula de la invención o combinaciones de las mismas. En incluso otra forma de modalidad, la invención se refiere a una ABM de acuerdo con la presente invención para ser usado como medicamento, en particular para el uso en un tratamiento o profilaxis de cáncer o para usar en una afección o lesión precancerosa . El cáncer puede ser, por ejemplo, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCL) , cáncer de pulmón de células bronquioalveolares, cáncer de hueso, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma intraocular o cutáneo, cáncer uterino, cáncer de ovario, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer uterino, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma de endometrio, carcinoma de vagina, carcinoma de vulva, enfermedad de Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer de intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroidea, cáncer de la glándula paratiroidea, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma del tejido liso, cáncer de uretra, cáncer de pene, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de riñon o uretra, carcinoma de células renales, carcinoma de pelvis renal, mesotelioma, cáncer hepatocelular, cáncer biliar, leucemia crónica o aguda, linfomas linfocíticos, neoplasmas del sistema nervioso central (CNS), tumores de la médula espinal, glioma cerebral, glioblastoma multiforme, astrocitomas, schwannomas, ependimomas, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas de células escamosas, adenomas de la pituitaria, incluyendo versiones refractarias de cualquiera de los cánceres mencionados o una combinación de los mismos. La lesión o afección precancerosa incluye, por ejemplo, el grupo formado por oral leucoplasia oral, queratosis actínica (queratosis solar), pólipos precancerosos del colon o recto, displasia epitelial gástrica, displasia adenomatosa, síndrome de cáncer de colon no poliposo hereditario (HNPCC) , esófago de Barrett, displasia de la vejiga, y afecciones cervicales precancerosas. Preferentemente dicho cáncer se selecciona del grupo formado por cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de piel, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de riñon y cáncer de cerebro. Incluso otra forma de modalidad es el uso de la ABM de acuerdo con la presente invención para la elaboración de un medicamento para el tratamiento o profilaxis del cáncer. Cáncer se define anteriormente. Preferentemente dicho cáncer se selecciona del grupo formado por cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de piel, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de riñon y cáncer de cerebro. Además preferiblemente, la molécula de unión al antígeno se usa en una cantidad terapéuticamente efectiva de desde aproximadamente 1,0 mg/kg a aproximadamente 15 mg/kg. Además más preferiblemente, la molécula de unión al antígeno se usa en una cantidad terapéuticamente efectiva de desde aproximadamente 1.5 mg/kg a aproximadamente 12 mg/kg. Además más preferiblemente, la molécula de unión al antígeno se usa en una cantidad terapéuticamente efectiva de desde aproximadamente 1.5 mg/kg a aproximadamente 4.5 mg/kg . Además más preferiblemente, la molécula de unión al antígeno se usa en una cantidad terapéuticamente efectiva de desde aproximadamente 4.5 mg/kg a aproximadamente 12 mg/kg. Muy preferiblemente, la molécula de unión al antígeno se usa en una cantidad terapéuticamente efectiva de aproximadamente 1.5 mg/kg. Incluso más preferiblemente, la molécula de unión al antigeno se usa en una cantidad terapéuticamente efectiva de aproximadamente 4.5 mg/kg. Incluso más preferiblemente, la molécula de unión al antígeno se usa en una cantidad terapéuticamente efectiva de aproximadamente 12 mg/kg. Artículos de manufactura En otra modalidad de la invención, se provee un artículo de manufactura que contiene materiales útiles para el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de manufactura comprende un recipiente y una etiqueta o inserto de paquete que está sobre o asociado con el recipiente. Los recipientes apropiados incluyen por ejemplo botellas, frascos, jeringas, etc. Los recipientes pueden estar formados por una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es eficaz para tratar la enfermedad y puede tener una puerta de acceso estéril (por ejemplo el recipiente puede ser una bolsa con una solución intravenosa o un frasco que tiene un tapón perforable mediante una aguja hipodérmica para inyección) . Por lo menos un agente activo en la composición es un anticuerpo anti-EGFR. El inserto de paquete o rótulo indica que la composición de usa para tratar la enfermedad de elección tal como un trastorno o enfermedad no maligna, donde la enfermedad o trastorno involucra una activación anormal o la producción de un receptor EGFR y/o un ligando EGFR, por ejemplo una enfermedad o trastorno hiperproliferativo benigno. Además, el artículo de manufactura puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, donde la composición comprende un primer anticuerpo que se une a EGFR y que inhibe el crecimiento de las células que sobreexpresa EGFR; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo donde la composición comprende un segundo anticuerpo que se une a EGFR y bloquea la activación del ligando de un receptor EGFR. El artículo de manufactura en esta modalidad de la invención puede comprender además un inserto para un paquete que indica que la primera y segunda composición de anticuerpo puede usarse para tratar una enfermedad o trastorno no maligno de una lista de dichas enfermedades o trastornos en la sección de Definición anterior. Además, el inserto para el paquete puede instruir al usuario de la composición (que comprende el anticuerpo que se une a EGFR y bloquea la activación del ligando de un receptor EGFR) para combinar la terapia con el anticuerpo y cualquiera de las terapias adjuntas descritas en la sección precedente (por ejemplo, un agente quimioterapéutico, un fármaco dirigido a EGFR, un agente anti-angiogénico, un agente inmunosupresor, un inhibidor de tirosina cinasa, un compuesto anti-hormonal, un cardioprotector y/o una citocina). Alternativamente o adicionalmente, el artículo de manufactura puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un regulador de pH farmacéuticamente aceptable tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina regulada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, que incluyen otros regulador de pHs, diluyentes, filtros, agujas y jeringas . Los ejemplos siguientes explican la invención en forma más detallada. Las preparaciones y ejemplos siguientes se proveen para capacitar a los expertos en la materia para comprender más claramente y llevar a la práctica la presente invención. La presente invención sin embargo, no está limitada en su alcance por modalidades ejemplificadas, que se proveen como ilustraciones de aspecto único de la invención solamente, y los métodos que son funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de la invención. En realidad, varias modificaciones de la invención además de las descritas aquí resultarán aparentes para los expertos en la materia a partir de la descripción precedente y de los dibujos que se acompañan. Tales modificaciones entran dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Todas las patentes, solicitudes y publicaciones citadas en esta solicitud se incorporan aqui como referencia en su totalidad. EJEMPLOS A menos que se especifique lo contrario, las referencias a la numeración de las posiciones de los residuos de aminoácidos específicos en los ejemplos siguientes están de acuerdo con el sistema de numeración Kabat. A menos que se indique lo contrario, los materiales y métodos usados para preparar los anticuerpos descritos en estos ejemplos de trabajo están de acuerdo con lo que se estableció en los ejemplos de la solicitud de Patente Estadounidense N° 10/981.736, que se incorpora aqui como referencia en su totalidad. EJEMPLO 1 Materiales y métodos Realización de un aceptor de alta homología La búsqueda de la estructura que el aceptor de alta homología se llevó a cabo alineando la secuencia de proteínas ICR62 de rata en una colección de secuencias de línea germinal humana y seleccionando la secuencia humana que mostraba la identidad de secuencia más elevada, mientras conservaba todo los residuos canónicos a un nivel funcional. Aquí, la secuencia 1-e de la familia VH1 dentro de la base de datos VBase se seleccionó para constituir un aceptor estructural para la cadena ligera. En estas dos estructuras aceptoras, se injertaron las tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) y/o los residuos determinantes de especificidad de aquellos CDR de los dominios variables livianos y pesados de ICR62 de rata. Debido a que la región de la estructura 4 no forma parte de la región variable del gen de linea germinal, la alineación para esa posición se efectuó individualmente. La región JH6 se eligió para la cadena pesada y la región JK2 se eligió para la cadena ligera. La modelación molecular del dominio de inmunoglobulina diseñada reveló una posición fuera de la CDR1 Kabat que requirió potencialmente residuos aminoácidos murinos en lugar de los humanos fuera del CDR. La reintroducción de los residuos aminoácidos murinos en la estructura humana generaría lo que se denomina "retromutaciones". Por ejemplo, el residuos aminoácido aceptor humano en la posición 27 Kabat (Glicina en 1-e) , fue mutada nuevamente a un residuo tirosina. Para demostrar la importancia de los residuos para la unión al antigeno, se diseñaron variantes de anticuerpo humanizadas que incluían o bien omitían las retromutaciones. La cadena ligera de anticuerpo humanizado no requirió ninguna retromutación . Después de diseñar la secuencia de proteínas, se sintetizaron las secuencias de ADN codificadoras de estas proteínas tal como se detalla a continuación. Realización de la estructura mixta Para evitar la necesidad de introducir retromutaciones de posiciones críticas (críticas para retener buenas funciones de afinidad de unión al antígeno o del anticuerpo) de la estructura aceptora humana, se investigó si la región de estructura 1 (FR1), las regiones 1 (FR1) y 2 ( FR2 ) conjuntamente, o la región de estructura 3 (FR3) de un anticuerpo funcionalmente humanizado podria ser reemplazado por secuencias de anticuerpos humanos que ya tienen residuos dadores, o residuos de aminoácido que son funcionalmente equivalentes a los residuos dadores, en posiciones importantes de los residuos en la secuencia de la línea germinal humana natural. Para las estructura de VH 1, 2 y 3 de la secuencia VH de ICR62 de rata, fueron alineadas individualmente con secuencias de línea germinal humana. Aquí, no se usó la identidad de secuencia más elevada para elegir estructuras aceptoras; en lugar de esto se llevó a cabo un emparejamiento de varios residuos críticos. Esos residuos críticos comprenden los denominados residuos canónicos, y también aquellos residuos en las posiciones 27, 28, y 30 (numeración Kabat), que están fuera de la definición de CDRl de Kabat, pero que a menudo están involucrados en la unión de antígeno. Además, residuos críticos son aquellos que muestran una importante interacción con los CDR, tal como puede determinarse usando moderación molecular. La secuencia de IMGT IGHV1-58 (Acceso No. M29809), IGHV5-51 (Acceso No. M99686), así como también la secuencia VBase 1-02 de la familia VH1, fueron elegidas como las secuencias apropiadas para reemplazar FR1, 2, o 3. Resumiendo: la IGHV1-58 mostró un modelo promisorio en las posiciones 27 a 30 Kabat, pero no cumplió con los criterios para la posición canónica 71. La IGHV5-51 tiene un emparejamiento de residuo 71 de modo que su FR3 podría ser usado. Asimismo su FR1 está próximo a la secuencia FR1 deseada . La 1-e de VH1 cumplió con todos los criterios emparejado de la posición 27. La secuencia 1-02 se consideró aceptable para las regiones FR1 y FR2 pero requeriría una retromutación en FR3. Después de diseñar la secuencia de proteína, se sintetizaron las secuencias de ADN que codificaban estas proteínas tal como detallará a continuación. Usando esta modalidad no fueron necesarias retromutaciones en la mayoría de las construcciones de la cadena pesada, para retener buenos niveles de unión al antígeno. La cronología y el razonamiento de las construcciones de estructura mixta se explican en la sección de resultados. Síntesis de los genes de anticuerpos Después de haber diseñado la secuencia de aminoácido de la región de anticuerpo humanizada, se generó la secuencia de ADN. Los datos de la secuencia de ADN de las regiones de estructura individual se hallaron en las bases de datos (por ejemplo IMGT o VBase) para las secuencias de la línea germinal humana. La información de la secuencia de ADN de las regiones CDR se recogió una secuencia publicada del anticuerpo ICR62 de rata (ver por ejemplo, la Publicación PCT WO 95/20045) . Con estas secuencias, la secuencia de ADN completa fue virtualmente reunida Una vez obtenidos estos datos de secuencia de ADN, se introdujeron los sitios de restricción de diagnóstico en la secuencia virtual mediante la introducción de mutaciones silentes, lo cual creó sitios de reconocimiento para las endonucleasas de restricción. Para obtener la obtener la cadena de ADN física, se llevó a cabo una síntesis de genes (ver por ejemplo Wheeler y otros , 1995). En este método, se diseñaron oligonucleótidos a partir de los genes de interés, de tal modo que se derivó una serie de oligonucleótidos a partir del filamento codificador, y otra serie a partir del filamento no codificador. Los extremos 3' y 5' de cada oligonucleótido (excepto el primero y el último de la hilera) muestran siempre secuencias complementarias para las dos preparaciones derivadas del filamento opuesto. Cuando se ponen estos oligonucleótidos dentro de un regulador de pH de reacción apropiado para cualquier polimerasa estable al calor, y se les agrega Mg2+, dNTPs y una polimerasa de ADN, cada uno de los oligonucleótidos se extiende desde su extremo 3' . El extremo 3' recientemente formado de una preparación se acopla luego con la preparación siguiente del filamento opuesto, y su secuencia se extiende más bajo las condiciones apropiadas para la elongación de cadena de ADN dependiente del modelo. El producto final fue clonado en un vector convencional para la propagación en E . coli .

Producción de anticuerpos Para la construcción de los vectores de expresión de cadena pesada y ligera anti-EGFR quiméricos (es decir de región V completamente de rata y de región C humana), y humanizados, se agregaron secuencias líder de cadena pesada y cadena ligera humana (para la secreción) cadena arriba de las secuencias de ADN de región variable. Cadena abajo de las regiones variables, se agregaron a regiones constantes de la IgGl para la cadena pesada, y la región constante kappa para la cadena ligera usando técnicas convencionales de biología molecular. Las secuencias de ADN de cadena ligera y pesada del anticuerpo completo resultante fueron subclonadas en vectores de expresión de mamíferos (una para la cadena ligera y una para la cadena pesada) bajo el control del promotor MPSV y cadena arriba de un sitio poliA sintético, siendo cada vector portador de una secuencia OriP de EBV Se produjeron anticuerpos mediante co-transfección de células HEK293-EBNA con los vectores de expresión de cadena ligera y pesada de anticuerpos de mamífero, usando una modalidad de transfección de fosfato de calcio. Las células HEK293-EBNA que se desarrollaban exponencialmente fueron transfectadas mediante un método con fosfato de calcio. Para la producción del anticuerpo no modificado, las células fueron transfectadas únicamente con vectores de expresión de cadena pesada y cadena ligera de anticuerpos en una relación de 1:1. Para la producción del anticuerpo glico modificado por modificación genética las células fueron co-transfectadas con cuatro plásmidos, dos para la expresión del anticuerpo, uno para la expresión del polipéptido GnTIII, y una para la expresión de manosidasa II en una relación de 4:4:1:1 respectivamente. Las células fueron cultivadas como cultivadas como cultivos de de monocapas adherente en frascos T usando un medio de cultivo DMEM suplementado con 10% de FCS, y fueron transfectadas cuando estaban con una confluencia de entre 50 y 80%. Para la transfección de un frasco T75, se sembraron 8 millones de células 24 horas antes de la transfección en 14 ml de medio de cultivo DMEM suplementado con FCS (al 10% de V/V final), 250 µg/ml de neomicina, y las células se colocaron a 37°C en una incubadora con una atmósfera de C02 al 5% durante la noche. Para cada frasco T75 que debía ser transfectado, se preparó una solución de ADN, CaC12 y agua, mezclando 47 µg de ADN de vector de plásmido total divido igualmente entre los vectores de expresión de cadena ligera y cadena pesada, 235 µl de una solución CaC12 1M, y se agregó agua hasta un volumen final de 469. µl . A esta solución se le agregaron 469 µl de una solución de 50mM de HEPES, 280 mM de NaCl, 1.5 mM de solución Na2HP04 a pH 7.05, se mezclaron inmediatamente durante 10 segundos y se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 20 segundos. La suspensión se diluyó con 12 ml de DMEM suplementado con 2% de FCS, y se agregó al T75 en lugar de al medio existente. Estas células fueron incubadas a 37°C, 5% de C02 durante aproximadamente 17 a 20 horas, y luego el medio fue reemplazado con 12 ml de DMEM, 10% de FCS. El medio de cultivo acondicionado fue cosechado 5 a 7 días después de la transfección, se centrifugó durante 5 minutos a 1200 rpm, seguido de una segunda centrifugación durante 10 minutos a 4000 rpm y se mantuvo a 4°C. Los anticuerpos secretados se purificaron mediante cromatografía de afinidad de Proteína A, seguido de cromatografía de intercambio catiónico, y una etapa cromatográfica final de exclusión por tamaño, en una columna Superdex 200 (Amersham Pharmacia) intercambiando el regulador de pH por regulador de pH de fosfato salino y recogiendo los anticuerpos IgGl monoméricos puros. La concentración de anticuerpos se evaluó usando un espectrofotómetro desde la absorbancia a 280 nm. Los anticuerpos se formularon en fosfato de potasio 25 mM, cloruro de sodio 125 mM, solución de glicina 100 mM, con un pH de 6.7. Las variantes glicomodificadas por modificación genética del anticuerpo humanizado se produjeron mediante co-transfección de los vectores de expresión de anticuerpos conjuntamente con un vector de expresión de glicosiltransferasa GnT-III, o conjuntamente con un vector de expresión GnT-III más un vector de expresión Golgi de manosidasa II. Los anticuerpos glico modificados fueron purificados y formulados tal como se describió anteriormente para los anticuerpos no glico modificados. Los oligosacáridos unidos a la región Fe de los anticuerpos fueron analizados mediante MALDI/TOF-MS tal como se describe a continuación. Análisis de oligosacáridos Los oligosacáridos fueron liberados enzimáticamente a partir de los anticuerpos mediante digestión con PNGaseF, inmovilizándose los anticuerpos sobre una membrana de PVDF o en solución. La solución digerida resultante y que contenia los oligosacáridos liberados se preparó directamente para análisis de MALDI/TOF-MS, o bien fue digerida con glicosidasa EndoH antes de la preparación de la muestra para el análisis de MALDI/TOF-MS. Método de liberación de oligosacáridos para anticuerpos inmovilizados en membrana PVDF Los cavidades de una placa de 96 cavidades preparados con una membrana de PVDF (Immobilon P, Millipore, Bedford, Massachusetts) fueron humedecidos con 100 µl de metanol, y el líquido se extrajo a través de la membrana de PVDF usando un vacío aplicado al conducto de vacío Multiscreen (Millipore, Bedford, Massachusetts). Las membranas de PVDF se lavaron tres veces con 300 µl de agua. Luego las cavidades se lavaron con 50 µl de regulador de pH RCM (8M de Urea, 360mM de Tris, 3,2mM de EDTA, pH 8,6). Se cargaron entre 30-40 µg de anticuerpo en una cavidad que contenía 10 µl de regulador de pH de RCM. El líquido en el receptáculo, se extrajo a través de la membrana mediante la aplicación de vacío, y la membrana se lavó subsiguientemente dos veces con 50 µl de regulador de pH de RCM. La reducción de los puentes disulfuro se efectuó mediante la adición de 50 µl de ditiotreitol 0.1M en y con una incubación a 37°C durante 1 hora. Después de la reducción se aplicó vacío para remover la solución de ditiotreitol del receptáculo. Las cavidades se lavaron tres veces con 300 µl de agua antes de efectuar la carboximetilación de los residuos cisteína mediante la adición de 50 µl de ácido yodoacético 0.1M en regulador de pH RCM y con incubación a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos. Después de la carboximetilación, se sacaron las cavidades con vacío y subsiguientemente se lavaron tres veces con 300 µl de agua. Luego se bloqueó la membrana de PVDF, para evitar la absorción de la endoglicosidasa, mediante incubación de 100 µl de una solución acuosa al 1% de polivinilpirrolidona 360 a temperatura ambiente durante 1 hora. El reactivo de bloqueo fue extraído luego mediante suave vacío seguido de tres lavados con 300 µl de agua. Se liberaron los oligosacáridos N-ligados mediante adición de 2.5 mU de péptido N-glicosidasa F (N-Glicanasa recombinante, GLYKO, Novato, CA) y 0.1 mU de Sialidasa (GLYKO, Novato, CA) , para remover cualquier residuo de monosacárido potencial cargado, en un volumen final de 25 µl en 20mM de NaHC03, pH7,0) . La digestión se llevó a cabo durante 3 horas a 37°C. Método de liberación de oligosacáridos para anticuerpos en solución Entre 40 y 50 µg de anticuerpo se mezclaron con 2.5 mU de PNGaseF (Glyko, U.S. A.) en 2 mM de Tris, pH 7.0 en un volumen final de 25 microlitros, y la mezcla se incubó durante 3 horas a 37°C. Uso de digestión de endoglicosidasa H, de oligosacáridos liberados por PNGaseF- para asignación de estructuras de oligosacáridos divididos híbridos a picos de oligosacáridos neutro MALDI/TOF-MS Los oligosacáridos liberados por PNGaseF, fueron subsiguientemente digeridos con endoglicosidasa H (EC 3.2.1.96) . Para la digestión con EndoH, se agregaron 15 mU de EndoH (Roche, Suiza) al digesto de PNGaseF (anticuerpo en solución método anterior) para obtener un volumen final de 30 microlitros, y la mezcla se incubó durante 3 horas a 37°C. El EndoH se disocia entre los residuos N-acetilglucosamina del núcleo de quitobiosa de los oligosacáridos N ligados. La enzima puede digerir únicamente oligomanosa y los glicanos de tipo más híbrido, mientras que los oligosacáridos de tipo complejo no son hidrolizados. Preparaciones de muestras para MALDI/TOF-MS Los digestos enzimáticos que contenían los oligosacáridos liberados fueron incubados durante 3 horas más a temperatura ambiente después de agregar ácido acético hasta una concentración final de 150 mM, y luego se hicieron pasar subsiguientemente a través de 0.6 ml de una resina de intercambio catiónico (resina AG50W-X8, forma hidrógeno, malla 100-200, BioRad, Suiza), cargada en una columna de cromatografía micro-bio-spin (BioRad, Suiza) para remover los cationes y las proteínas. Se aplicó un microlitro de la muestra resultante a una placa objetivo de acero inoxidable, y se mezcló en la placa con 1 µl de matriz sDHB. La matriz sDHB se preparó disolviendo 2 mg de ácido 2.5-dihidroxibenzoico además de 0.1 mg de ácido 5-metoxisalicílico en 1 ml de etanol/10 mM de cloruro de socio acuoso 1:1 (v/v) . Las muestras se secaron al aire, se aplicaron 0.2 µl de etanol, y luego las muestras se dejaron finalmente recristalizar bajo el aire. MALDI/TOF-MS El espectrómetro de masa MALDI-TOF usado para adquirir la espectrografía de masa fue un Voyager Élite (Perspective Biosystems) . El instrumento funcionó en la configuración lineal con una aceleración de 20kV y una demora de 80 ns. La calibración externa usando modelos de oligosacáridos se usó para la asignación de masa de los iones. Los espectros para las aplicaciones de 200 láseres se sumaron para obtener el espectro final. Ensayo de unión al antígeno Las variantes de anticuerpo humanizadas monoméricas purificadas fueron ensayadas para la unión al receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (EGFR, denominado también en la literatura HER-1 o ErbBl) en la línea de células epidérmicas humanas A431, usando un ensayo a base de citometría de flujo. Se transfirieron 200,000 (por ejemplo de una línea de célula A431 humana) en 180 µl de regulador de pH FACS (PBS que contenía 2% de FCS y 5mM de EDTA), a tubos de poliestireno de 5 ml, y se agregaron 20 µl de muestras de anticuerpo anti-EGFR 10 veces concentrado (anticuerpo primario) (concentración final 1-5000 ng/ml) , o PBS solamente. Después de mezclar suavemente las muestras, los tubos fueron incubados a 4°C durante 30 minutos en la oscuridad. Subsiguientemente se lavaron dos veces las muestras con regulador de pH FACS y se granularon a 300 x g durante 3 minutos. El sobrenadante se aspiró y se recogieron las células en 50 µl de regulador de pH FACS y 2 µl de fragmentos de anticuerpo secundario (anti-Fc-específico F(ab')2-FITC (Jackson Immuno Research Laboratories, USA)), y los tubos se incubaron a 4°C durante 30 minutos. Las muestras se lavaron dos veces con regulador de pH FACS y se recogieron en 500 µl de regulador de pH FACS para el análisis mediante citometría de flujo. La unión se determinó graficando la fluorescencia promedio geométrica contra las concentraciones de anticuerpo. Unión de glicovariantes IgGl monoméricas a la linea de células CHO que expresan Fc?RIIIA Se transfectaron células CHO por electroporación (280 V, 950 µF, 0,4 cm) con un vector de expresión que codifica para la cadena a y la cadena y de FcgammaRIIIA-Vall58. Se seleccionaron transfectantes por adición de 6 µg/ml de puromicina y se analizaron los clones estables mediante FACS usando 10 µl de anticuerpo monoclonal 3G8 de FITC-conjugado-anti-FcgammaRIII (BD Biosciences, Allschwil/Suiza) para 106 células. Se llevó a cabo la unión de IgGl a células CHO que expresan FcqammaRIIIA-Vall58. Resumiendo, se agregaron los fragmentos anti-FcgammaRIIIA 3G8 F(ab')2 (Ancell, Bayport, MN/USA) en una concentración de 10 µg/ml para competir con la unión de las glicovariantes del anticuerpo (3 µg/ml) . La intensidad de la fluorescencia con referencia a las variantes de anticuerpo unidas, se determinó en un FACSCalibur (BD Biosciences, Allschwil /Suiza). Ensayo ADCC Se usaron células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) como células efectoras y se prepararon usando Histopaque-1077 (Sigma Diagnostics Inc., St . Louis, M063178 USA), siguiendo esencialmente las instrucciones del fabricante. Resumiendo, se extrajo sangre venosa con jeringas heparinizadas de voluntarios sanos. La sangre se diluyó a 1:0.75-1.3 con PBS (que no contenía Ca++ o Mg++) y se depositó en capas sobre Histopaque-1077. El gradiente se centrifugó a 400 x g durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT, por sus siglas en inglés) sin rupturas. La interfaz que contenía la PBMC se recogió y se lavó con PBS (50 ml para células de dos gradientes) y se cosechó por centrifugación a 300 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de la resuspensión del granulado con PBS, se contó la PBMC y se lavó por segunda vez por centrifugación a 200 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego las células fueron resuspendidas en el medio apropiado para los procedimientos subsiguientes. La relación de efector a objetivo que se usó para los ensayos de ADCC fue de 25:1 y de 10:1 para PBMC y para células NK, respectivamente. Se prepararon células efectoras en un medio AIM-V en la concentración apropiada con el fin de agregar 50 µl por receptáculo en placas de 96 cavidades de fondo redondo. Las células objetivo fueron células que expresan EGFR humana (por ejemplo, A431, EBC-1, o LN229) cultivadas en DMEM que contenía 10% de FCS. Las células objetivo se lavaron en PBS, se contaron y se resuspendieron en AIM-V a razón de 0.3 millones por ml para agregar 30.000 células en lOOµl por microcavidad. Los anticuerpos se diluyeron en AIM-V, se agregaron en 50 µl a las células objetivo predepositadas y se dejaron unir a los objetivos durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego se agregaron células efectoras y la placa se incubó durante 4 horas a 37°C en una atmósfera humedecida que contenía 5% C02. Se verificó la muerte de las células objetivo por medición y la liberación de la lacto deshidrogenasa (LDH) de células deterioradas usando el equipo de Detección de Citotoxicidad (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Suiza). Después de 4 horas de incubación las placas se centrifugaron a 800 x g. Se transfirieron 100 µl de sobrenadante de cada receptáculo a una placa de 96 cavidades transparente de fondo plano. Se agregaron 100 µl de regulador de pH de sustrato de color del equipo por cada receptáculo Los valores Vmax de la reacción de color se determinaron en un lector ELISA a 490 nm durante por lo menos 10 minutos usando el software SOFTmax PRO (Molecular Devices, Sunnyvale, CA94089, USA) . Se midió la liberación de LDH espontánea de los cavidades que contenían únicamente células objetivo y efectoras pero ningún anticuerpo. La liberación máxima se determinó a partir de las cavidades que contenían únicamente células objetivo y 1% de Tritón X-100. El porcentaje de muerte mediada por anticuerpo específico se calculó de la manera siguiente: ( (x - SR) / (MR - SR)*100, donde x es el promedio de Vmax en una concentración de anticuerpo específica, SR es el promedio de Vmax de la liberación espontánea y MR es el promedio de Vmax de la liberación máxima. EJEMPLO 2 Resultados y discusión La comparación de la unión al receptor EGF humano de las variantes de anticuerpo I-HHA, I-HHB, I-HHC, I-HLA, I-HLB, I-HLC, I-HLA1, I-HLA2, I-HLA3, I-HLA4, I-HLA5, I-HLA6, I-HLA7, I-HLA8, I-HLA-9, I-HHD, I-HHE, I-HHF, y I-HHG, ya sea el complejo con la cadena ligera ICR62 quimérica o con las cadenas ligeras ICR62 (I-KA, I-KB, o I-KC) y el anticuerpo quimérico parental, ch-ICR62 muestran que todos los anticuerpo tienen adentro una unidad logarítimica similar a los valores CE50. Únicamente la I-HHA tiene una actividad de unión enormemente disminuida (ver Figura 2). La figura 1 muestra la actividad funcional de las cadenas de polipéptidos ICR62 (ch-ICR62) quiméricas individuales, cuando se combina con las construcciones I-HHC e I-KB humanizadas, respectivamente .En este experimento, la cadena ligera, o bien la cadena pesada o ambas cadenas simultáneamente de ch-ICR62 fueron reemplazadas con las construcciones humanizadas antes mencionadas. Esto muestra que la formación de la interfaz VH/VL parece funcionar también en el anticuerpo roedor como en las construcciones humanizadas.

Tal como se muestra en la figura 2, la cadena I-HHA pesada humanizada no pudo restaurar la actividad de unión ni con la cadena ligera I-KA, ni la I-KB. Debido a que la I-HLA no mostró unión con I-KA, y la I-KB, los inventores llegaron a la conclusión de que la cadena pesada de I-HHA no es funcional en la unión del antígeno. Las figuras 1 y 2, combinadas con la figura 3, muestran que las construcciones de cadena ligera I-KA, I-KB, y I-KC muestran un comportamiento de unión que no es distinguible de la contraparte del roedor. La variante I-KC no posee ninguna retromutación y adicionalmente tiene su CDRl parcialmente humanizado de modo que los residuos 24-29 pueden ser derivados de secuencia aceptora humana (A30 de VK1, tal como se mencionó anteriormente). En las series I-HHA, I-HHB, y I-HHC, únicamente las últimas dos variantes mostraron un comportamiento de unión satisfactorio (Figuras 2 y 3) . El análisis de secuencia de I-HHA reveló tres potenciales residuos aminoácidos responsables para este comportamiento: Lys33, His35, y Tyr50. Las construcciones que tienen Lys33 reemplazado por tirosina mostraron una buena unión así como también las construcciones que tienen Tyr50 reemplazado con triptófano. Únicamente cuando estos dos residuos fueron reemplazados con alanina y glicina respectivamente se perdió la unión. Debido a que I-HHC no muestra una unión mejor que la de I-HHB, los presente inventores llegaron a la conclusión que no es necesario que los residuos Asn60, Glu61, Lys64, y Ser65 sean de origen roedor; o pueden reemplazarse con Ala, Gln, Gln, y Gly, respectivamente. Este procedimiento conduce a una construcción en la cual la CDR2 está más humanizada, debido a que las posiciones 60 a 65 del aminoácido forman parte de la definición CDR de Kabat, pero no hay ninguna necesidad de injertar los residuos dadores de roedor para este anticuerpo. Las figuras 4 y 5 comparan las construcciones de las series I-HLA1, I-HLA2, I-HLA3, I-HLA4, I-HLA5, y I-HLA6. El mejor comportamiento de unión se observó en las construcciones ch-ICR62, I-HLA1, y IHLA2, con un valor de EC50 de aproximadamente 300 ng/ml. Las otras construcciones tenían este valor incrementado por un factor de dos y por lo tanto tienen una actividad de unión ligeramente reducida. La primera conclusión que surge de estos datos es que, dentro de las CDRl Kabat, se toleraron las sustituciones Lys33Tyr, e Ile34Met. Estas dos posiciones se localizaron dentro de la definición Kabat de CDRl, pero fuera de los límites de CDR Chothia (los cuales estaban basados en análisis estructural en vez de análisis de secuencia) . En la última parte de la CDRl, se permite entonces, por lo menos cierta promiscuidad. La segunda conclusión es que, dentro de la CDR2, además del reemplazo antes mencionado de los residuos AsndO y Glu61 con residuos no dadores, se permitieron también las sustituciones Asn60Ser, Glu61Pro, y Lys62Ser no dadoras dentro de la CDR Kabat. Estos residuos fueron derivados de la secuencia aceptora IGHV5-51 de línea germinal humana, que se usó como secuencia aceptora FR3. Las construcciones I-HLA3 y I-HLA4 difieren de I-HLA1 y I-HLA2 únicamente por la remoción de la retromutación Phe27Tyr y ambas construcciones la I-HLA3 e I-HLA4 pierden afinidad en comparación con su construcción parental. Por lo tanto, la tercera conclusión de la comparación de I-HLA1, I-HLA2, I-HLA3, I-HLA4, I-HLA5, y I-HLA6 es la involucración de Phe27 en la unión del antígeno, ya sea en forma directa o indirecta, a través de la modificación de la conformación de rizo de la CDRl. Las variantes I-HLA5 y I-HLA6 tienen la FR1 de I-HLAl y I-HLA2, respectivamente, reemplazadas por otra secuencia aceptora de línea germinal con el Phe27 naturalmente presente (es decir, IGHV1-58). Esto pudo lograrse únicamente por la introducción simultánea de varias otras mutaciones que son: Val2Met, Ala9Pro, y AlaldThr. Al hacer esto, se anuló nuevamente el efecto beneficioso de la (re-) introducción del Phe27. Se investigó la construcción I-HLA7 para determinar si la restauración de los residuos dadores adicionales en la CDRl y CDR2 de cadena pesada de la construcción I-HLA6 restauraría la actividad de unión completa en comparación con la ICR62. Tal como se muestra en la figura 6, esto no sucedió . Tal como se muestran las figuras 7 y 8, dos construcciones adicionales, I-HLA8 y I-HLA9, fueron ensayados para determinar si podía lograrse la actividad de unión total en comparación con ch-ICR62. A partir de la construcción I-HHB, las regiones FR1 fueron reemplazadas por regiones FR1 que tenían una homología máxima dentro de la región CDRl Chothia. La construcción 8 tiene la FRl de la secuencia IGHV1-58, y la I-HLA9 tiene la región FRl de IGHV5-51. Ambas construcciones unen el antigeno por lo menos tan bien como el anticuerpo ch-ICR62. La construcción I-HLA8 puede ser en realidad incluso mejor con la CE50 disminuirá en un factor de 2. La construcción I-HLA8 tiene la misma secuencia de FRl que las construcciones I-HLA5 e I-HLA6 y por lo tanto tiene los mismos residuos no dadores (es decir, Val2Met, Ala9Pro, y Alal6Thr) , lo cual sugiere que la presencia de estos residuos no dadores no tienen ningún efecto negativo sobre la unión. Las mutaciones no beneficiosas que ocurren en las I-HLA5 y 6 surgen de la combinación de la FRl de VH1 emparejado con una FR3 de VH5, que podría compensarse potencialmente si tuviere una FRl y una FR3 de la misma familia VH . En la figura 8 se muestran construcciones que contienen residuos no dadores dentro de la CDR. Por lo tanto, estas construcciones son incluso más humanizadas dentro de la CDR debido a que los residuos no dadores ocurren en las regiones estructurales humanas que fueron elegidas para estas construcciones. Las construcciones I-HHE (His35Ser) , I-HHF (Thr58Asn) e I-HHG (Ser57Ala) tienen un residuo dentro de la CDRl o CDR2 que está humanizado (comparación con la construcción I-HHB) . La construcción I-HHD (Gly24Ala) no fue ensayada. La I-HHF mostró una reducción de la unión lo cual indica la importancia de Thr58. Del contraste con el residuo 58 de CDR Kabat, el aminoácido 57 es más tolerante a las sustituciones, debido que la mutación Ser57Ala no tienen aparentemente ninguna influencia sobre la unión (Figura 8). Debido a que la región FR3 de IGHV5-51 parecía mostrar propiedades promisorias en las construcciones I-HLA1 y 2, y que la FRl de la misma secuencia de línea germinal demostró que era útil en la construcción de I-HLA9, las FRl, FR2 y FR3 de IGHV5-51 se diseñaron para ser usadas conjuntamente como aceptor para el injerto de rizo. Resumen del análisis de los residuos canónicos en construcciones de ICR62 humanizadas: VL : posición 2 Kabat: lie probablemente requerido. posición 71 Kabat: lie o Phe aceptada. VH: Pos. 24, Gly, Thr, Ala, Val, Ser aceptada. Pos. 26, Gly aceptada. Pos. 29, Phe, lie, Leu, Val, Ser aceptada. Pos. 34, lie, Met, Leu, Val, Trp, Tyr, Thr aceptada.

Pos. 71, Ala, Leu, Val, Thr aceptada. Pos 94, Arg, Gly, Asn, Lys, Ser, His, Thr, Ala aceptada . Resultados de los experimentos de ADCC La figura 9 muestra una comparación de la citotoxicidad celular mediada por anticuerpos (ADCC) que se muestra para las varias glicoformas del anticuerpo ICR62 quimérico, así como también para la variante humanizada I-HLA4. Las diferentes glicoformas se marcaron con una etiqueta que o bien indicaba que no había sido glicomodificadas por modificación (WT), Glicoforma 1 (Gl), o Glicoforma 2 (G2). "Gl" se refiere a la glicomanipulación por modificación del anticuerpo por co-expresión con GnTIII. "G2" se refiere glicomanipulación del anticuerpo mediante la co-expresión con GnTIII y Manll. "WT" se refiere a los anticuerpos que no fueron glicomodificados . La cadena ligera para todas las construcciones humanizadas es la variante I-KC y no fue explícitamente rotulada. El anticuerpo quimérico así como también el anticuerpo humanizado mejoraron en cuanto a su potencia y eficacia mediante las dos modalidades de glicomanipulación diferentes. La construcción ch-ICR62 funcionó ligeramente mejor que la I-HLA4 para el tipo silvestre o las glicoformas, respectivamente. Tal como se observa en la figura 4, cuando se comparan las afinidades de los dos anticuerpo con respecto a su antígeno, el ch-ICR62 tenía un valor de CE50 dos veces menor. Esta diferencia de afinidad se refleja aquí en diferencias con relación a la eficacia. Las Figuras 10A y 10B muestran una comparación de la citotoxicidad celular mediada por anticuerpos (ADCC) para la no-glicomodificada ("de tipo silvestre") y la glicoforma G2 de las construcciones I-HHB e I-HLA7 del anticuerpo ICR62 humanizado. Se aplicaron los mismos anticuerpos a dos líneas de células objetivo diferentes. En la figura 10A, se usó la línea de células objetivo LN229 ; y en la figura 10B, se usó la línea celular A431. Las células A431 son aparentemente más susceptibles a la muerte celular mediada por anticuerpos que las células L?229. Lo que es más importante es que la glicomanipulación mejoró la potencia de ambos anticuerpos. Este efecto parecía ser más pronunciado para la I-HLA7 que para la I-HHB. El porcentaje de muerte celular en una concentración de anticuerpos máxima para I-HHB pudo desplazarse de -30% a -40% mediante la introducción de la variante glicomodificada G2 cuando se usó la línea de células objetivo LN229 . Cuando se usó la línea de células A431, este valor permaneció aparentemente sin cambios. Este comportamiento fue completamente diferente para el anticuerpo I-HLA7. La muerte de las células objetivo en una concentración de anticuerpos máxima cambió de aproximadamente 10% hasta aproximadamente 50%, para las células L?229 y desde aproximadamente 40% hasta aproximadamente 70% para las células A431 mediante la introducción de las variantes de glicomanipulación G2. En este caso, a pesar de que había menor actividad en el anticuerpo glicomodificado para la I-HLA7 en relación a I-HHB, el intervalo de actividad se invirtió para los anticuerpos glicomodificados . Las Figuras 11 y 12 muestran también comparaciones de las formas no glicomodificadas (WT) y las glicoformas G2 de ICR62 quimérico y las construcciones del anticuerpo ICR62 humanizadas I-HHB e I-HLA7. EJEMPLO 3 Estudio de Toxicidad Preliminar mediante Administración Intravenosa (Bolo) para los Macacos - Análisis Bioanalítico INTRODUCCIÓN Ensayo Anti-EGFR glico-modificado Este Análisis Bioanalítico describe la medición del anti-EGFR en muestras originadas en macacos después de administración intravenosa (bolo) , de anti-EGFR (anticuerpo anti-EGFR glicomodificado recombinante producido a partir de células de mamíferos transfectadas en cultivo con vectores de expresión de anticuerpos que poseen los genes de cadena pesada I-HHB y genes de cadena ligera I-KC que se describen anteriormente, y purificados según la descripción anterior) tal como se describe en el protocolo que sigue a continuación. Un total de muestras de suero de 78 monos se almacenó congelado a aproximadamente -20°C hasta el momento de su uso. Los métodos bioanalíticos usados para la determinación de anti-EGFR usaron un método ELISA para medir las concentraciones de anti-EGFR en el suero. Los criterios de aceptación fueron de ±20% (±25% QC bajo) para la precisión e inexactitud. MATERIALES Y MÉTODOS Objetivo : El objetivo de este estudio es la verificación del potencial tóxico sistémico de la administración intravenosa de Glico-mAb (anti-EGFR) (bolo) a macacos seguido de un período de recuperación de 8 semanas. TABLA 8 TABLA 9: Grupos y dosis de tratamiento Fundamentos para la selección del nivel de dosificiación 1.5-7.5 mg/kg es el intervalo esperado para estudios en humanos (7.5 mg/kg de la dosis correspondiente para un compuesto similar en seres humanos) . TABLA 10: Identidad de los grupos de tratamiento # Expresado en términos de la sustancia de ensayo suministrada.

TABLA 11: Animales TABLA 12: Administración de Anti-EGFR TABLA 13: Observaciones clínicas TABLA 14: Frecuencia de la dosis Frecuencia 1. Pre-dosis inmediatamente. 2. de a 2 horas después de completar la dosis. 3. Lo más tarde posible en el día laboral. Sitios de Diarios . inyección TABLA 15: Toxicocinética TABLA 16: Muestras Histología TABLA 17: Fijación del tejido Estándar Formalina de pH regulado 10% neutra . Otros Testículos y epididimidas : Inicialmente en flui do de Bouin. Ojos: Inicialmente en fluido de Davidson .

TABLA 18: Histología Procedimiento de Inmunoensayo Se recubrió una placa con 100 µl por cavidades de solución de recubrimiento (5 µl de IgG anti-humano de oveja (IgG adsorbido de mono, El sitio de unión, UK) agregado 11495 µl de regulador de pH de bicarbonato (0,05M, pH 9,6) e incubado durante aproximadamente 2 horas a temperatura ambiente. La placa se lavó 3 veces con 400 µl por receptáculo de solución de lavado (PBS (Sigma Chemical Co., UK) 0,01% (v/v) Triton-XlOO (Sigma Chemical Co., UK) ) y se secó. Se agregó regulador de pH de ensayo (1% p/v BSA, Sigma Chemical Ce, UK) a razón de 200 µl por receptáculo y se incubó durante aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó 3 veces con 400 µl por receptáculo de solución de lavado y se secó. Los estándares de calibración, lo Controles de Calidad (QC) y/o las muestras se agregaron a razón de 100 µl por receptáculo y se incubaron durante aproximadamente 2 horas a temperatura ambiente, después de lo cual la placa se lavó 3 veces con 400 µl por receptáculo de solución de lavado y se secó. La solución de conjugado (6 µl de conjugado kappa- HRP IgG antihumano de cabra (Bethyl Laboratories Inc., USA) se agregó a 100 µl por receptáculo y se incubó durante aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó 3 veces con 400 µl por receptáculo de solución de lavado y se secó. Se agregó trimetilbencidina (TMB; Europa Bioproducts, Ely, UK) a 100 µl por receptáculo. La placa se cubrió y se incubó durante aproximadamente 15 minutos a temperatura ambiente. Luego se agregaron a cada receptáculo 100 µl de solución de interrupción (0,5M HCl, Fisher, UK) . Las absorbancias se leyeron a 450 nm (filtro de referencia 630 nm) en un lector de microplacas DYNATECH MRX (Mettler Instruments, UK) . RESULTADOS Y EXPOSICIÓN Análisis de la Muestra de Ensayo Las concentraciones de anti-EGFR se midieron mediante un método de inmunoensayo (ELISA) en 78 muestras de suero de mono generadas de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente. Estos resultados se presentan en las Tablas 19-21, siguientes.

TABLA 19 Concentración de anti-EGFR en el suero de monos (µg/ml) después de administración intravenosa de 1,5 mg/kg de anti- EGFR en los días 1, 8, 15 y 22 (GRUPO 1) Tiempo Número de animal Promedio sd 1M 623 1F 590 Día 1 1 hora 33.42 30.86 32.14 1.8 Día 1 4 27.33 27.49 27.41 0.1 horas Día 1 12 13.09 17.01 15.05 2.8 horas Dia 1 24 9.656 9.468 9.562 0.1 horas Día 1 72 2.528 0.786 1.657 1.2 horas Día 1 120 0.845 0.431 0.638 0.3 horas Día 8 0.538 0.287 0.413 0.2 predosis Día 8 1 hora 30.02 19.07 24.55 7.7 Día 15 0.902 0.382 0.642 0.4 predosis Día 15 1 17.91 33.08 25.50 10.7 hora Día 22 1.065 0.595 0.830 0.3 predosis Día 22 lhour 19.41 33.00 26.21 9.6 Día 1 672 1.202 0.362 0.782 0.6 horas sd desviación estándar TABLA 20 Concentración en el suero de anti-EGFR en suero de mono (µg/ml) después de administración intravenosa de 5,0 mg/kg de anti-EGFR en los días 1, 8, 15 y 22 (GRUPO 2) Tiempo Cantidad animal Promedio sd 2M 461 2F 462 Día 1 1 hora 32.45 29.51 30.98 2.1 Día 1 4 horas 32.39 29.57 30.98 2.0 Día 1 12 horas 28.05 25.88 26.97 1.5 Día 1 24 horas 23.70 23.78 23.74 0.1 Día 1 72 horas 14.03 14.38 14.21 0.2 Día 1 120 10.42 8.137 9.279 1.6 horas Día 8 predosis 4.672 3.683 4.178 0.7 Dia 8 1 hora 25.91 31.06 28.49 3.6 Día 15 5.752 5.450 5.601 0.2 predosis Día 15 1 hora 32.20 35.38 33.79 2.2 Día 22 BLQ 6.497 3.249 - predosis Día 22 1 hora 26.98 30.23 28.61 2.3 Día 1 672 BLQ 4.845 2.42 - horas BLQ por debajo del limite de cuantificación !<0,195 µg/ml) sd desviación estándar Nota: BLQ entró como cero en los cálculos TABLA 21 Concentración de anti-EGFR en el suero de monos (µg/ml) después de administración intravenosa de 15 mg/kg de anti-EGFR los días 1, 8, 15 y 22 (GRUPO 3) Tiempo Cantidad animal Promedio sd 3M 463 3F 612 Día 1 1 hora 262.2 168.0 215.1 66.6 Día 1 4 horas 223.3 174.5 198.9 34.5 Día 1 12 horas 164.9 165.7 165.3 0.6 Día 1 24 horas 141.7 146.0 143.9 3.0 Día 1 72 horas 99.54 86.64 93.09 9.1 Día 1 120 horas 86.64 69.08 77.86 12.4 Día 8 predosis 65.86 45.21 55.54 14.6 Día 8 1 hora 282.1 209.9 246.0 51.1 Día 15 predosis 98.43 71.21 84.82 19.2 Día 15 1 hora 385.9 231.4 308.7 109.2 Día 22 predosis 117.3 105.6 111.5 8.3 Día 22 1 hora 234.1 402.5 318.3 119.1 Día 1 672 horas 127.5 122.9 125.2 3.3 sd desviación estándar EJEMPLO 4 Estudio de toxicidad preliminar mediante administración intravenosa (bolo) a macacos - Toxicocinética Resumen Se administraron a tres grupos de macacos (1 macho y 1 hembra por grupo) dosis intravenosa de bolos de anti-EGFR en los Días 1, 8, 15 y 22 de un estudio de toxicidad de 28 días para verificar la exposición sistémica de los animales a anti-EGFR. Las concentraciones de anti-EGFR en el suero, en las muestras recogidas hasta 672 horas después de la primera dosis, se determinaron por medio de un método de inmunoensayo. El análisis farmacocinético de los datos de concentración en el suero-tiempo dan como resultado los parámetros de farmacocmética siguientes: TABLA 22 Las relaciones entre áreas bajo las curvas de concentración de anti-EGFR - tiempo (AUCißß) y el nivel de dosis en el Dia 1 se presentan a continuación: TABLA 23 El régimen y grado de exposición sistémica de los mono al anti-EGFR, caracterizado por AUC?68, aumentó en forma aproximadamente proporcional al aumentar la dosis en un intervalo de dosificación de 1.5 a 4.5 mg/kg/por ocasión, pero en más que el aumento de dosis proporcionada con respecto al intervalo de dosis de 4.5 al2 mg/kg/ocasión el Día 1. En la dosis más alta (12 mg/kg/ocasión) la AUC?68 fue de ca 2,8-veces más elevada que la pronosticada por una relación lineal. El grado de (AUC?6s) de exposición sistémica de los monos hembra al anti-EGFR fue generalmente similar a la exposición de los monos macho. Después de dosis intravenosas repetidas, las concentraciones de anti-EGFR en el suero en pre-dosis, fueron generalmente más elevadas que los valores después de una dosis única e indicaron una acumulación de anti-EGFR en el suero a través de todo el período del estudio. La vida media terminal no pudo ser estimada adecuadamente para todos los animales, pero donde pudo ser estimada fue en el intervalo de 32.5 a 63.1 horas, y pareció aumentar con la dosis en los animales macho. La supresión total en el suero de anti-EGFR, pareció ser independiente de la dosis en un intervalo de 1.5 - 4.5 mg/kg/ocasión, pero se redujo al nivel de dosificación máximo en los monos macho y hembra . Concluyendo, el grado de exposición sistémica de los macacos al anti-EGFR pareció estar caracterizado por cinética no lineal (dependencia de dosis) en un intervalo de dosificación de 1.5 a 12 mg/kg/ocasión en el Día 1 del estudio de toxicidad intravenosa. El aumento de dosis de anti-EGFR por arriba de 4.5 mg/kg/ocasión probablemente dará como resultado una exposición sistémica mayor de la que se había pronosticado a partir de la relación lineal, lo cual es coherente con la posibilidad de un proceso de capacidad limitada para la eliminación del anti-EGFR. Además, el estudio proporcionó también evidencia de que en general no había ninguna diferencia en la exposición sistémica de monos macho y hembra al anti-EGFR y que había acumulación después de administración intravenosa repetida. Introducción Tres grupos de monos macacos uno macho y uno hembra, recibieron inyección en bolo intravenoso con anti-EGFR, a niveles de dosificación de 1.5, 4.5 y 12 mg/kg/ocasión en los Días 1, 8, 15 y 22 de un estudio de toxicidad preliminar. Se recogieron muestras de sangre de cada animal en los siguientes puntos de tiempo después de la administración en Día 1: 1, 4, 12, 24, 72 y 120 horas de post-dosis. Además, se recogieron muestras en pre-dosis y al cabo de 1 hora de post-dosis en los Días 8, 15 y 22 y a las 672 horas después de la primera dosis el Día 1. El suero separado se congeló a ca -20°C antes del análisis de la concentración de suero de anti-EGFR mediante un método de inmunoensayo . Abreviaturas AUC Áreas bajo la curva de concentración de suero-tiempo hasta tiempo infinito AUC?68 Áreas bajo la curva de concentración de suero-tiempo durante un intervalo de dosificación de 168-horas BLQ Por debajo del límite de cuantificación ca Aproximadamente CL Supresión total del suero Cmax Concentración máxima en el suero F Hembra k Constante de Régimen terminal M Macho ti, Vida media terminal Tmax Tiempo en el cual se produce Cmax Vss Volumen de distribución en estado fijo Anticuerpo usado para el estudio Se produjo, purificó y caracterizó según lo arriba descrito un anticuerpo anti-EGFR Glico-mAb (Anti-EGFR) Fe- modificado para una mayor afinidad de unión al receptor Fc-FcgamMaRIII y mayor ADCC. En pocas palabras, el anticuerpo fue producido por cotransfección de células HEK-293-EBNA con vectores de ADN plasmídico para la expresión de la cadena pesada del anticuerpo I-HHB, la cadena ligera del anticuerpo I-KC, GnT-III y Manll. Se utilizó una versión en escala linealmente mayor del método de transfección descrito anteriormente, transfectando monocapas celulares cultivadas en botellas de rodillos en lugar de recipientes en forma de T. Se incluyó una paso cromatográfico de intercambio aniónico de flujo pasante adicional empleando una matriz de Q-sefaros en el proceso de purificación inmediatamente anterior al paso cromatográfico de exclusión por tamaño que se describió anteriormente . El patrón de glicosilación del anticuerpo Fc-modificado se analizó según lo descrito anteriormente utilizando espectrometría MALDI/TOF-MS de oligosacáridos Fc-derivados liberados enzimáticamente. El perfil de los oligosacáridos se muestra en la Fig. 23. La unión a EGFR humano y EGFR de mono se demostró por medio de la unión de célula entera según lo descrito anteriormente utilizando células A431 y COSA, respectivamente y un análisis en base a FACS. Las curvas de unión se muestran en las Figuras 24 y 25 respectivamente. La mayor unión al receptor FcgammaRIII que resulta de la Fc-manipulación aplicada se demostró según lo descrito anteriormente usando unión de célula entera a células CHO modificadas para la expresión superficial de FcgammaRIII humano y análisis en base a FACS. Los resultados se muestran en la figura 26. Adicionalmente el anticuerpo modificado tiene un grado equivalente de FCmanipulación a anticuerpo "Glico 2" (siendo el 75% de los Fc-oligosacáridos de tipo no fucosilado) descrito en otra parte (Ferrara, C. y otros , J Biol Chem. 2005 Dec 5; [publicación electrónica anterior a la impresión] . Dichos anticuerpos Fcmodificados tienen una afinidad de unión de hasta 50 veces mayor para FcgammaRIII humano en comparación con un anticuerpo no Fc-modificado convencional (las constantes de disociación de equilibrio de 15 y 150 nM para las variantes polimórficas 158V y 158F del receptor humano vs. 750 y 5000 nM para las mismas variantes del receptor, respectivamente, cuando se unen a anticuerpos IgGl humanos no Fc-modificados ) . La ADCC se midió según lo descrito anteriormente usando dos líneas celulares objetivos: células de carcinoma de pulmón humano A549 y células de queratinocito de mono cinomolgus. Los resultados se muestran en las figuras 27 y 28 respectivamente . Procesamiento de Datos Los parámetros farmacocinéticos se calcularon usando el programa de computadora WinNonlin Pro versión 3.3 (Pharsight Corporation, USA). Todas las concentraciones de suero suministradas como parte de este estudio se informan como 4 cantidades significativas o 3 lugares decimales. Los parámetros de farmacocinética se informaron de la manera siguiente: Cmax, AUC168/ CL y Vss a 4 figuras significativas; k a 4 lugares decimales; t?¡ a 1 lugar decimal. Los valores que fueron BLQ (<0.195 µg/ml) entraron como cero en el procesamiento far acocinético . Toxicocinética Las concentraciones máximas de suero de anti-EGFR (Cmax) y las veces que ocurren (Tmax) fueron los valores observados. Las áreas bajo las curvas de concentración anti-EGFR en el suero-tiempo dentro de un intervalo de dosificación de 168-horas (AUC?68) , fueron estimadas por la regla trapezoidal lineal. En el cálculo de los valores AUC168 las concentraciones de anti-EGFR a las cero horas se estimaron por retro-extrapolación usando el análisis de regresión logarítmica-lineal, en base a las dos primeras veces de muestras, pero sin embargo si la concentración de suero no declinada durante este período, entonces la concentración de suero a las cero horas se considerada equivalente a la concentración en el primer tiempo de las muestras. Las áreas bajo las curvas de concentración de anti-EGFR en el suero-tiempo hasta tiempo infinito (AUC) , se estimaron mediante la expresión siguiente: AUC = AUC?68 + Clast/k Cuando Clast es la concentración de suero pronosticada en el último punto de muestra cuantificable y k es la constante de régimen terminal. Las constantes de régimen termina (k) se estimaron mediante el ajuste de una regresión lineal de concentración logarítmica versus tiempo. Para que la estimación de k se acepte como fiable, se impusieron los criterios siguientes: 1. Los puntos de datos terminales fueron aparentemente distribuidos al azar alrededor de una línea recta única (inspección visual) 2. Un mínimo de 3 puntos de datos estuvo disponible para la regresión 3. El coeficiente de regresión fue >0.95, y la fracción de la variación considerada fue de >0.90 4. El intervalo que incluye los puntos de datos que se eligió para la regresión fue por lo menos dos veces mayor que la misma vida media Las vidas medias terminales (t^) se calcularon como ln2/k. La supresión total de suero (CL) se calculó como Dosis / AUC. El volumen de distribución en estado fijo (Vss) se calculó como Dosis .AUMC/AUC2. La acumulación (R) se verificó como la relación de la concentración mínima después de la última dosis (Día 22) hasta la concentración mínima después de la primera dosis (Dia 1) es decir, concentración de suero a las 672 horas/ concentración de suero a las 168 horas (predosis el Día 8 ) . Resultados y Exposición Se tomaron muestras de sangre a las 20 horas después de la dosificación el Día 1; en la pre-dosis y al cabo de 1 hora de post-dosis en los Dias 8, 15 y 22 y a las 672 horas post-dosis en el Día 1 durante un estudio de toxicidad para verificar la exposición sistémica de monos macho y hembra al anti-EGFR después de administración intravenosa de bolos de anti-EGFR a niveles de dosis de 1,5, 4.5 y 12 mg/kg/ocasión en los Días 1, 8, 15 y 22 del estudio. Las concentraciones de anti-EGFR en el suero, de muestras recogidas a las 168 horas post-dosis se presentan en las Tablas 27-29, y son los perfiles promedio de concentración en el suero-tiempo que se ilustran en las Figuras 18 y 19. Los parámetros farmacocinéticos de anti-EGFR se presentan en la Tabla 50, y los valores de AUC?68 se resumen a continuación: TABLA 24 Las veces que en las cuales se produjeron concentraciones máximas en el suero (Tmax) fueron generalmente 1 hora post-dosis (el primer punto de muestra) pero ocurrieron a las 4 oras post-dosis (el segundo punto de muestra) en las hembras 2F462 (4.5 mg/kg) y 3F612 (12 mg/kg). Sin embargo, para ambas hembras, las concentraciones a las 4 horas de post-dosis fueron muy similares a aquellas concentraciones al cabo de 1 hora post-dosis, y probablemente estuvieron dentro de la variabilidad del ensayo. Por lo tanto, la demora aparente en la Tmax seguramente no tendrá ningún significado. Las concentraciones de anti-EGFR en el suero antes de la dosis siguiente fueron cuantificables en todos los animales excepto en machos 2M461 en el Día 22 (nivel de dosis 4.5 mg/kg/ocasión) y, por lo tanto, en general los animales quedaron continuamente expuestos a concentraciones cuantificables de anti-EGFR durante un intervalo de dosificación.

Las relaciones entre áreas bajo las curvas de concentración de anti-EGFR en el suero-tiempo ( UCißs) y el nivel de dosificación en el Dia 1 se presentan a continuación TABLA 25 El régimen y el grado de exposición sistémica de los monos al anti-EGFR, caracterizado por AUCies/ aumentó aproximadamente en forma proporcional al aumentar la dosis en un intervalo de dosis de 1.5 a 4.5 mg/kg/ocasión, pero en más del aumento de dosis proporcional en un intervalo de dosis de 4.5 a 12 mg/kg/ocasión en el Dia 1. En la dosis más alta (12 mg/kg/ocasión) las AUC?d8 fueron de ca 2,8-veces más elevadas que las pronosticadas por una relación lineal (Figura 20) . El grado (AUCi6s) de exposición sistémica de monos hembra a anti-EGFR fue generalmente similar a la exposición en los monos macho. Después de dosis intravenosa repetida, las concentraciones de anti-EGFR de pre-dosis en el suero fueron generalmente superiores que aquellos valores después de una dosis única (Figuras 21-22) e indicaron la acumulación de anti-EGFR en el suero a través del período del estudio. Esta acumulación fue generalmente inferior en las hembras que en los machos, excepto al nivel de dosificación más alto. Las relaciones de las concentraciones mínimas (pre-dosis) después de la última dosis el Día 22 (672 horas post Día 1 dosis) hasta la concentración mínima después de la primera dosis en el Día 1 se presentan en la Tabla 26, siguiente. TABLA 26 Las constantes del régimen terminal (k) y las correspondientes vidas medias terminales (ti,) , del anti-EGFR en el Día 1 se presentan en la Tabla 30. La medida terminal no pudo ser estimada adecuadamente para todos los animales, pero donde sí pudo ser estimada fue en el intervalo de 32,5 a 63,1 horas, y pareció aumentar con la dosis en los animales macho. La supresión de anti-EGFR total en el suero pareció ser independiente de la dosis en el intervalo de 1.5 - 4.5 mg/kg/ocasión, pero se redujo al nivel de dosis más alto en monos macho y hembra.

Concluyendo, el grado de exposición sistémica de los monos macacos al anti-EGFR pareció caracterizarse por cinética lineal (dependiente de dosis) en un intervalo de dosis de 1.5 a 12 mg/kg/ocasión en el Día 1 del estudio de toxicidad intravenosa. El aumento de la dosis de anti-EGFR anterior a 4.5 mg/kg/ocasión es probablemente el resultado de una exposición sistémica mayor que la que podría pronosticarse a partir de una relación lineal, lo cual es coherente con la posibilidad de un proceso de capacidad limitada para la eliminación de anti-EGFR. Además, el estudio proporcionó también evidencia de que en general no había ninguna diferencia en la exposición sistémica de los monos macho y hembra al anti-EGFR y que se observó una acumulación después de administración intravenosa repetida.

TABLA 27 Concentraciones (µg/ml) de anti-EGFR en el suero, en sueros de monos después de la administración intravenosa de 15 mg/kg de anti-EGFR en los Días 1, 8, 15 y 22 TABLA 28 Concentraciones (µg/ml) de anti-EGFR en el suero, en sueros e monos macacos después de administración intravenosa de 4.5 mg/kg de anti-EGFR en los Días 1, 8, 15 y 22 TABLA 29 Concentraciones (µg/ml) de anti-EGFR en el suero, en sueros de monos macacos después de administración intravenosa de 12 mg/kg de anti-EGFR en los Dias 1, 8, 15 y 22 TABLA 30 Parámetros farmacocinéticos de anti-EGFR en el Día 1 de una administración intravenosa semanal de anti-EGFR a monos macacos Dosis T AUQ. AUC CL ss k tl/2 (mg/kg) Animal (µg/mL) (h) (µg/h/p?L) (µg/h/mL) (piL/h/kg) (mL/kg) (1/h) (h) 1, 5 1M623 33.42 1 830.4 849.4 1.778 60.79 0.0214 32.5 1, 5 1F590 30.86 1 748.4 774 .9a 1.962a 57.85a 0.0105a 66.0a 4 , 5 2M461 32.45 1 2537 3005 1.488 133. 6 0.0110 63. 1 4, 5 2F462 29.57 4 2378 2719 1. 663 133.2 0.0121 57. 4 12 3M463 262.2 1 18310 29870a 0.4058a 71.33a 0.0056a 124 .3a 12 3F612 174 .5 4 15980 21400a 0.5552a 66. 94a 0.0082a 84 .4a El valor es una estimación de que los datos no coincidieron con los criterios de aceptación definidos en los Datos a Procesamiento y deberían tratarse con cautela Química de la sangre y Hematología Se recogieron muestras de sangre de la vena femoral de monos macacos a los cuales se les había administrado una inyección de bolo intravenoso de GlicoMAB anti-EGFR en los días 1, 8, 15 y 22. Se recogieron muestras de la extremidad no usada para la administración de la dosis, después de un ayuno nocturno (no difunto) . Se examinaron las muestras en el pre-tratamiento tres dias después de la segunda dosis, y al terminar para determinar los parámetros siguientes, usando heparina de litio como anticoagulante: Fosfatasa alcalina Alanina amino-transferasa Aspartato amino-transferasa Bilirrubina - total Urea Creatinina Glucosa Colesterol - total Triglicéridos Sodio Potasio Cloruro Calcio Fósforo Proteína total Electroforetograma de proteína Relación de albúmina/globulina Los datos de los análisis químicos de la sangre de mono cinomolgus normal promedio se presentan en la Tabla 31.

TABLA 31 Monos macacos (origen Mauritius ) --Química de la sangre Se extrajeron muestras para el análisis hematológico de sangre periférica, de la vena femoral de un mono macaco que había recibido una inyección intravenosa de un bolo de GlicoMAB anti-EGFR en los dias 1, 8, 15 y 22. Las muestras se tomaron de la extremidad que no había sido usada para la administración de las dosis, después de un ayuno nocturno (no difunto) . Se examinaron las muestras en el pre- tratamiento tres días después de la segunda dosis, y al terminar, para la determinación de los parámetros siguientes: 1) Usando EDTA como anticoagulante Concentración de hematocrito hemoglobina Recuento de eritrocitos Retículocitos Promedio de hemoglobina en las células Concentración promedio de hemoglobina en las células Volumen de células promedio Recuento total de leucocitos Recuento diferencial de leucocitos Recuento de plaquetas Anormalidades de la morfología de la sangre Anisocitosis Microcitosis Macrocitosís Hipocromasia Hipercromasia 2) Se usó citrato como anticoagulante Tiempo de protrombina Tiempo de tromboplastina parcial activada Los datos de los análisis hematológicos correspondientes a los monos cinomolgus normales promedio se presentan en la Tabla 32.

TABLA 32 Monos macacos (origen Mauritius) --Hematología Los valores individuales acumulativos de bioquímica para los monos se presentan en las Tablas 33a-h, que siguen: TABLA 33a Animal Grupo Occn. ALP ALT AST Bilí Urea Creat duc Col Numero /Sexo CódLigo U/L U/L U/L µmol/L pmol/L µmol/L rmol/L itimol L 615 1M PT 740 36 39 3 5.35 69 3.65 2.34 Dll 743 35 33 3 5.43 73 3.66 2.00 TERM 597 29 31 2 5.16 76 3.74 2.30 465 2M PT 647 44 33 3 5.73 70 4.69 2.50 PD 775 47 36 2 3.60 73 4.50 2.72 Dll 655 74 46 5 4.34 74 3.35 2.64 TERM 768 48 38 3 4.42 73 3.67 2.54 639 2M PD 741 29 26 2 4.41 87 3.31 3.22 Dll 629 29 28 3 3.87 99 2.64 2.99 TERM 599 34 22 2 3.62 83 3.46 2.45 613 3M PT 1003 37 31 5 3.80 90 5.72 2.61 Dll 793 36 29 4 4.45 80 3.28 2.70 TERM 931 34 32 5 5.16 83 2.78 2.46 631 4M PD 590 34 37 2 3.43 83 3.92 2.49 Dll 508 38 36 3 3.33 82 3.38 2.30 TERM 578 25 25 2 4.00 89 3.70 2.26 TABLA 33b Animal Grupo Occn . Trig Na Cl Ca Fos Prot Alb Total Número /Sexo Código mmol/L mmol/L mmol/L mmol/L mmol/L mmol/L g/L g/L 615 1M PT 0.24 146 4.7 108 2.54 1.77 91 35 Dll 0.39 145 3.9 106 2.55 1.85 94 41 TERM 0.34 147 4.2 107 2.47 1.63 87 38 465 2M PT 0.74 147 3.7 108 2.71 1.32 81 37 PD 0.93 147 4.1 109 2.70 1.54 84 46 Dll 0.66 151 3.9 111 2.70 1.98 83 39 TERM 0.51 146 3.6 105 2.67 1.85 80 40 639 2M PD 0.27 146 4.2 107 2.68 1.85 84 44 Dll 0.32 150 4.8 108 2.81 2.07 85 42 TERM 0.38 146 4.5 107 2.70 2.03 74 39 613 3M PT 0.47 151 4.5 106 2.75 1.85 83 41 Dll 0.44 147 4.2 106 2.69 1.76 80 45 TERM 0.69 147 4.3 106 2.63 1.62 76 40 631 4M PD 0.45 149 4.2 107 2.67 2.00 87 46 Dll 0.77 151 5.0 112 2.68 2.00 84 39 TERM 0.64 150 4.7 107 2.77 1.89 86 46 TABLA 33c Relac Animal Grupo Ocon. al a2 Beta Gamma ion Alb al a2 Número /Sexo Código g/L g/L g/L g/L A/G % 615 1M PT 3 25 23 0.63 39.0 3.4 5.1 Dll 3 22 25 0.77 43.1 3.0 4.5 TERM 3 21 21 0.78 43.5 3.3 4.9 465 2M PT 22 13 0.84 45.7 4.5 5.9 PD 18 12 1.21 54.9 3.6 5.0 Dll 20 15 0.89 46.7 4.9 6.4 TERM 20 11 1.00 50.5 4.0 5.8 639 2M PD 3 5 17 14 1.10 52.9 3.5 5.8 Dll 3 6 18 16 0.98 49.1 4.1 6.6 TERM 3 4 17 11 1.11 52.2 3.7 6.0 613 3M PT 20 14 0.98 49.5 5.0 4.7 Dll 17 13 1.29 55.8 3.7 3.7 TERM 15 14 1.11 53.0 4.6 3.9 631 4M PD 8 16 1.12 53.3 3.6 4.3 Dll 9 18 0.87 46.4 4.4 4.4 TERM 9 15 1.15 53.1 3.4 4.3 TABLA 33d Animal Grupo Occn . Beta Gamma Número /Sexo Código % % 615 1M PT 27.3 25.3 Dll 23.2 26.2 TERM 24.4 23.9 465 2M PT 27.4 16.6 PD 21.8 14.7 Dll 24.0 17.9 TERM 25.5 14.2 639 2M PD 20.7 17.0 Dll 21.5 18.7 TERM 23.2 14.9 613 3M PT 24.5 16.3 Dll 21.0 15.8 TERM 20.0 18.5 631 4M PD 20.7 18.0 Dll 22.8 22.0 TERM 22.1 17.1 TABLA 33e Animal Grupo Occn. ALP ALT AST Bili Urea Creat Gluc Col Número /Sexo Código U/L U/L U/L umol/ mmol/L µmol/L mmol/L mmol/L L 614 1F PT 687 71 50 3 4.92 60 4.45 2.77 Dll 576 63 44 2 5.22 63 4.32 2.73 TERM 517 59 41 3 4.78 70 3.98 2.83 652 1F PT 598 43 25 3 7.26 69 3.26 2.42 Dll 540 40 28 3 6.94 78 3.28 2.46 TERM 511 40 27 4 6.78 80 3.46 2.38 624 2F PD 533 56 35 3 3.85 73 3.91 2.31 Dll 410 40 34 13 4.18 78 2.72 2.56 TERM 432 41 25 3 3.70 78 3.30 2.16 632 3F PT 559 35 34 5 5.44 80 3.08 2.47 Dll 510 37 31 5 4.36 85 3.89 2.61 TERM 428 37 34 5 5.32 88 3.10 2.63 640 4F PD 343 23 32 4 4.09 65 3.46 1.24 Dll 292 25 28 4 4.12 63 2.69 1.13 TERM 266 22 27 2 4.55 69 3.69 1.00 TABLA 33f Prot Animal Grupo Occn. Trig Na K Cl Ca Fos total Alb Número /Sex Código mmol/L mmol/L mmol/L mmol/L mmol/L mmol/L g/L g/L 614 1F PT 0.37 148 4. ,6 109 2.69 2.03 80 39 Dll 0.33 147 4. ,1 109 2.72 2.08 82 43 TERM 0.54 148 3. .6 108 2.59 1.84 80 41 652 1F PT 0.57 147 4. .3 105 2.58 1.52 78 35 Dll 0.43 149 4, .7 108 2.74 1.80 88 43 TERM 0.59 149 4, .4 108 2.59 1.51 80 40 624 2F PD 0.60 145 4 .1 108 2.54 1.50 77 40 Dll 0.51 148 4 .0 111 2.58 1.42 77 39 TERM 0.43 146 3. .9 108 2.56 1.46 76 44 632 3F PT 0.31 151 4 .5 109 2.48 1.72 76 34 Dll 0.34 149 4 .6 109 2.58 1.85 80 39 TERM 0.49 150 4 .5 111 2.55 1.47 78 38 640 4F PD 0.36 144 4 .8 111 2.31 1.45 68 29 Dll 0.31 145 4 .3 112 2.24 1.53 63 25 TERM 0.27 144 4 .7 108 2.20 1.33 60 25 TABLA 33g Relaci Animal Grupo Occn. al a2 Beta Gamma ón Alb al a2 Número /Sexo Código g/L g/L g/L g/L A/G % 614 1F PT 4 5 20 13 0.95 49.2 4.4 5.9 Dll 3 4 19 13 1.10 52.7 3.3 4.9 TERM 3 4 18 13 1.05 51.7 3.8 5.2 652 1F PT 4 5 19 15 0.81 45.1 4.6 5.9 Dll 3 5 20 17 0.96 49.3 3.4 5.5 TERM 4 5 18 14 1.00 49.4 4.7 6.2 624 2F PD 16 14 1.08 52.2 4.1 5.4 Dll 17 14 1.03 50.1 4.9 5.5 TERM 15 10 1.38 58.5 3.4 5.3 632 3F PT 19 15 0.81 44.7 5.1 5.0 Dll 17 16 0.95 49.2 4.2 4.7 TERM 17 15 0.95 49.2 4.6 4.9 640 4F PD 17 15 0.74 42.2 5.7 5.6 Dll 17 13 0.66 40.1 6.6 5.5 TERM 16 13 0.71 41.4 6.4 4.6 TABLA 33h Animal Grupo Occn . Beta Gamma Número /Sexo Código % % 61' 1F PT 24. 8 15. ,7 Dll 23. .1 16. .0 TERM 22. 8 16. ,5 652 1F PT 24. ,7 19. ,7 Dll 22. ,3 19. ,4 TERM 22. ,1 17. ,6 624 2F PD 20. ,7 17. .6 Dll 21. ,6 18. .0 TERM 19. .9 12. .9 632 3F PT 24. .9 20. .2 Dll 21. .5 20. .4 TERM 21. .8 19. .5 640 4F PD 24. .9 21. .6 Dll 26. .9 20. .9 TERM 26, .5 21, .1 Los valores Individuales Acumulativos de Hematología para los monos se presentan en la Tabla 34a-l, siguiente : TABLA 34a Animal Grupo O 3ccccnn .. Het Hb RBC Retic MCH MCHC MCV ódigo L/L g/dL xl012/L % pg g/dL fL 615 1M PT 0.389 12.4 5.94 0.38 20.9 31.9 65.5 Dll 0.366 11.5 5.59 0.76 20.6 31.4 65.5 TERM 0.381 11.8 5.91 0.25 20.0 31.0 64.5 465 2M PT 0.439 13.2 6.76 0.56 19.5 30.1 65.0 PTR PD 0.460 13.7 7.22 0.50 19.0 29.9 63.8 Dll 0.391 11.7 6.11 1.62 19.1 29.9 64.0 TERM 0.441 13.6 6.93 0.65 19.7 30.9 63.7 639 2M PD 0.419 12.7 6.23 0.51 20.4 30.3 67.2 Dll 0.400 11.7 5.99 0.52 19.6 29.3 66.7 TERM 0.388 12.2 5.70 1.14 21.4 31.4 68.1 613 3M PT 0.461 14.1 6.79 0.48 20.7 30.5 67.8 PTR Dll 0.396 12.7 6.05 0.92 21.0 32.1 65.4 TERM 0.410 12.9 6.23 0.49 20.8 31.5 65.9 TABLA 34b Animal Grupo Occn . WBC N L E Basófilo Mono- LUC Plt Número /Sexo Código xl0 /L xl09/L xl09/L xl09/L cito xl09/L xl09/L xlO-9/L xlO-9/L 615 1M PT 7.57 3.06 3.68 0.06 0.03 0.53 0.20 236 Dll 7.56 2.78 4.35 0.06 0.02 0.21 0.13 284 TERM 7.93 3.77 3.52 0.06 0.02 0.49 0.07 254 465 2M PT 14.19 1.78 10.37 1.24 0.05 0.55 0.20 302 PTR 13.69 3.69 8.25 0.93 0.04 0.47 0.29 PD 13.36 1.55 9.95 1.01 0.04 0.58 0.25 325 Dll 12.26 4.70 5.63 1.27 0.04 0.51 0.11 403 TERM 15.45 1.54 11.57 1.65 0.07 0.42 0.20 356 639 2M PD 10.02 5.21 3.42 0.90 0.01 0.39 0.10 306 Dll 8.26 4.06 2.47 1.17 0.01 0.45 0.10 371 TERM 8.70 2.55 4.20 1.04 0.02 0.80 0.09 253 613 3M PT 20.21 12.99 6.45 0.02 0.04 0.50 0.21 438 PTR 16.85 8.87 6.90 0.08 0.06 0.67 0.26 Dll 10.85 6.11 4.15 0.03 0.02 0.41 0.12 441 TERM 23.26 17.70 4.27 0.05 0.04 1.11 0.08 434 TABLA 34c Animal Grupo O )ccccnn. PT APTT ódigo sec sec 615 1M PT 11.3 37.3 Dll 10.3 32.7 TERM 11.3 33.3 465 2M PT 10.0 33.9 PTR PD 9.9 26.1 Dll 10.0 31.6 TERM 10.2 29.4 639 2M PD 10.6 22.6 Dll 10.5 26.3 TERM 10.3 28.9 613 3M PT 10.3 35.5 PTR Dll 11.4 26.7 TERM 10.3 30.8 TABLA 34d Animal Grupo Occn. Aniso- Micro- Macro- Hipo- Hiper-Nú ero /Sexo Código citosis citosis citosis cromasia cromasia 615 1M PT Dll TERM 465 2M PT PTR PD Dll TERM 639 2M PD Dll TERM 613 3M PT PTR Dll TERM TABLA 34 e Animal Grupo Dccn. Het Hb RBC Retic M H M?C M.V Número /Sexo C lóóddiiggoo L/L g/dL xlOu/L % pg g/dL fL 631 4M PD 0.460 13.6 7.11 0.43 19.1 29.5 64.6 Dll 0.395 11.9 6.36 0.45 18.7 30.2 62.1 TERM 0.449 13.7 6.97 0.30 19.6 30.5 64.4 614 1F PT CTD CTD CTD CTD CTD CTD CTD PTR Dll 0.404 13.1 6.33 0.57 20.6 32.3 63.8 TERM 0.424 13.0 6.59 0.68 19.7 30.7 64.3 652 1F PT 0.390 11.3 5.72 1.15 19.8 29.1 68.2 Dll 0.374 11.9 5.55 1.06 21.4 31.7 67.4 TERM 0.384 11.5 5.71 0.58 20.2 30.0 67.2 624 2F PD 0.407 11.8 7.14 0.73 16.6 29.0 57.1 Dll 0.377 10.8 6.69 0.48 16.1 28.6 56.3 TERM 0.401 11.7 6.99 1.07 16.7 29.1 57.4 TABLA 34 f Animal Grupo Occn. WBC N L E Basóflo Mano- ÜC Plt Número /Sexo Código xl09/L xl09/L xl09/L xl09/L cito XIO9/L xl09/L 631 4M PD 10.53 2.82 6.36 0.62 0.02 0.58 0.13 378 Dll 7.97 2.86 3.81 0.61 0.01 0.53 0.16 424 TERM 8.08 1.73 5.04 0.63 0.02 0.60 0.05 384 614 1F PT CTD CTD CTD CTD CTD CTD CTD CTD PTR 11.32 3.47 6.36 0.17 0.05 0.96 0.31 Dll 9.70 4.74 3.73 0.09 0.02 0.84 0.28 429 TERM 9.64 3.65 5.09 0.13 0.01 0.62 0.13 414 652 1F PT 10.66 3.21 6.05 0.42 0.03 0.80 0.15 373 Dll 12.01 5.53 5.20 0.34 0.02 0.78 0.13 380 TERM 11.88 7.59 3.24 0.35 0.02 0.61 0.08 338 624 2F PD 9.06 3.10 5.02 0.41 0.02 0.33 0.18 362 Dll 7.82 5.14 2.06 0.14 0.02 0.34 0.13 353 TERM 11.69 4.33 5.46 0.96 0.02 0.76 0.16 426 TABLA 34g Animal Grupo Occn. PT APTT Número /Sexo Código sec sec 631 4M PD 10.9 29.3 Dll 11.3 27.9 TERM 10.8 32.1 614 1F PT CTD CTD PTR Dll 10.2 32.1 TERM 10.5 29.3 652 1F PT 10.2 33.0 Dll 9.6 27.9 TERM 10.3 30.3 624 2F PD 10.6 27.1 Dll 10.6 29.7 TERM 10.8 33.3 TABLA 34h Animal Grupo Occn. Aniso- Micro- Macro- Hipo- Hiper-Número /Sexo Código citosis citosis citosis cromasia cromasia 631 4M PD Dll TERM 614 1F PT CTD CTD CTD CTD CTD PTR Dll TERM 652 1F PT Dll TERM 624 2F PD Dll TERM TABLA 34 i Animal Grupo Occn. Het Hb RBC Retic MB M3C 1CV Número /Sexo Código L/L g/dL xlO^/L % pg g/dL fL 632 3F PT 0.416 12.4 6.36 0.83 19.6 29.9 65.4 PTR 0.410 12.2 6.29 0.64 19.5 29.8 65.3 Dll 0.392 12.2 6.19 0.73 19.7 31.0 63.4 TERM 0.412 12.3 6.46 0.55 19.1 29.9 63.8 640 4F PD 0.398 11.8 5.81 0.95 20.3 29.7 68.5 Dll 0.369 11.0 5.30 1.17 20.7 29.8 69.6 TERM 0.401 11.9 5.58 0.83 21.3 29.6 71.9 TABLA 34 j Animal Grupc i Occn. WBC N L E Basófilo Mano- LUC Plt Número /Sexo Código xl09/L xl09/L xl09/L xl09/L cito xl09/L ?io9/L 632 3F PT 18.12 10.58 5.61 1.07 0.04 0.61 0.21 335 PTR 15.16 5.99 7.24 0.95 0.03 0.63 0.31 308 Dll 10.23 4.69 4.15 0.66 0.01 0.48 0.23 348 TERM 13.04 6.89 4.62 0.44 0.03 0.93 0.13 321 640 4F PD 12.49 8.29 2.91 0.46 0.02 0.64 0.17 567 Dll 13.71 10.31 2.18 0.34 0.01 0.74 0.12 578 TERM 11.49 5.41 4.18 0.63 0.03 1.12 0.12 555 TABLA 34 k Animal Grupo Occn . PT APTT Número /Sexo Código sec sec 632 3 F PT 10. .6 47. .8 PTR 10. .6 44. .7 Dll 10. .2 33. .1 TERM 10. .6 37. .2 640 4 F PD 12. .0 25. .8 Dll 12. .4 28. .0 TERM 12. .8 30. .1 TABLA 341 Animal Grupo Occn . Aniso- Micro- Macro- Hipo- Hiper- Número /Sexo Código citosis citosis citosis cromasia cromasia 632 3 F PT PTR Dl l TERM 640 4 F PD Dl l TERM _ _ _ _ _ Patología microscópica -- Hechos relacionados con el tratamiento Se informó sobre una pericolangitis (inflamación del tejido conjuntivo alrededor del conducto biliar) en monos hembra que recibieron dosis de 12 mg/kg/día, pero en ningún otro mono hembra o macho. Estos hechos pueden relacionarse con el tratamiento con Glico-mAb (Anti-EGFR) , pero en cantidades tan pequeñas de animales que el significado es incierto. Todos los otros hechos que se descubrieron se consideraron incidentales y sin ningún significado toxicológico . Macropatología e Histopatologia El resumen histopatológico para todos los animales sometidos a ensayo se indican en la Tabla 35 siguiente: TABLA 35 Histopatología - distribución del grupo y gravedad de los hechos descubiertos para todos los animales Descubrimientos Individuales para todos los Animales Las observaciones de las patologías para animales individuales se indican en la Tabla 36 siguiente: TABLA 36 Macropatología e histopatología - descubrimientos individuales para todos los animales Observaciones patológicas Los pesos corporales individuales de los monos macacos se presentan en la Tabla 37, siguiente: TABLA 37: Pasos corporales: Valores Individuales ñmriQ Peso corporal (kg) en el día 1 -17 -9 1* 8* 15* 22* 29 36 50 57 64 71 77 Captao de peso No (kg) D í a D 29 71 a 71 Grrpo 1 S_01-ge, 1 5 mg/kg/ocasion 623m 2 67 2 65 2 69 2 72 2 76 2 62 2 72 2 65 2 71 2 73 2 61 2 74 2 71 2 75 +0 06 +0 03 (-0 02) (+0 04) (+0 03) (+0 04) (-0 14) (+0 10) (-0 07) (+0 06) (+0 02) (-0 12) (+0 13) (-0 03) (+0 04) 590f 2 98 2 92 2 97 3 14 3 13 3 01 3 06 3 00 3 19 3 16 3 11 3 18 3 27 3 23 +0 27 +0 17 (-0 06) (+0 05) (+0 17) (-0 01) (-0 12) (+0 05) (-0 06) (+0 19) (-0 03) (-0 05) (+0 07) (+0 09) (-0 04) Grupo 2 GA201-ge, 4 5 mg/kg/ocasion 461m 2 50 2 56 2 53 2 47 2 53 2 53 2 53 2 61 2 53 2 45 2 54 2 60 2 59 +0 03 +0 06 (+0 06) (-0 03) (-0 06) (+0 06) NC NC (+0 08) (-0 08) (-0 08) (+0 09) (+0 06) (-0 01) 462f 2 87 2 96 2 91 2 82 2 95 2 89 2 88 2 79 2 91 2 95 3 05 3 02 2 96 +0 05 +0 08 (+0 09) (-0 05) (-0 09) (+0 13) (-0 06) (-0 01) (-0 09) (+0 12) (+0 04) (+0 10) (-0 03) (-0 06) Grupo 3 <3_01-ge, 12 mg/kg/ocasion 463m 2 69 2 81 2 86 2 74 2 81 2 81 2 81 2 81 2 75 2 71 2 92 2 98 3 09 +0 23 +0 28 (+0 12) (+0 05) (-0 12) (+0 07) NC NC NC (-0 06) (-0 04) (+0 21) (+0 06) (+0 11) 10 612f 2 84 2 96 2 92 2 98 3 06 3 01 3 01 2 94 2 91 2 81 3 04 3 05 3 10 +0 18 +0 09 (+0 12) (-0 04) (+0 06) (+0 08) (-0 05) NC (-0 07) (-0 03) (-0 10) (+0 23) (+0 01) (0 05) No hubo ningún efecto de tratamiento en los sitios de inyección y ningún hallazgo clínico que se considerara que estuviese en relación al tratamiento con Glyco-mAb (anti-EGFR) . Los cambios del peso corporal se encontraban dentro de los intervalos esperados. No hubo hallazgos que se considerara que estuviesen relacionados para tratamiento en estudios microscópicos y el peso de los órganos de los animales se encontraba en los intervalos normales esperados. En conclusión, el estudio con 1,5; 4,5 o 12 mg/kg/ocasión fue bien tolerado sin hallarse claramente toxicidad sistémica . EGFR no es un objetivo específico del tumor ya que se encuentra en la superficie de varios tejidos normales incluyendo hígado, riñon y piel. Los anticuerpos Anti-EGFR con región Fe de la IgGl humana, fueron previamente suministrados a humanos y mostraron un perfil con efectos colaterales tolerables. (Vanhoefer, U. y otros, Clin. Oncol. 2004 Jan 1; 22 ( 1 ): 175-84 ; Needle MN, Semin Oncol. 2002 Oct; 29 (5 Suppl 14):55-60). Claramente, habria preocupaciones significantes para suministrar a un humano o a otro mamífero un anticuerpo anti-EGFR con ADCC muy aumentado, debido a una actividad destructiva mejorada que puede presentarse contra tejidos normales críticos tales como hígado, riñon y piel. Sorpresivamente, los presentes inventores han descubierto que administrar dicho anticuerpo anti-EGFR, Fe modificado según se describe anteriormente y con hasta 1000 veces aumentada la actividad ADCC in vivo a mamíferos, no condujeron a toxicidades significantes. Las concentraciones de anticuerpo ser mantuvieron por encima de 1 microgramo por mililitro por lo menos durante 4 semanas (y por encima de 100 microgramos por mililitro para algunos animales). Tales niveles de exposición son típicos para la terapia de anticuerpo. El ADCC máximo para el anticuerpo del presente estudio ya se encuentra alcanzado en concentraciones de 1 microgramo por milímetro. Suministración de dosis únicas de dosis de 40 a 100 mg del anticuerpo anti-EGFR (el anticuerpo ICR62 de la rata parental) a pacientes con cáncer humano mostraron objetivos específicos de tumores in vivo (Modjtahedi, H. y otros, Br J Cáncer. 1996 Jan; 3 (2 ) : 228-35. ) Las células efectoras de los monos Cinomolgos contienen receptores FcgammaRIII altamente homólogos y han mostrado mediar ADCC mejorada con anticuerpos Fe modificados (y con anticuerpos glicomodificados para niveles aumentados de oligosacáridos no fucosilados en la región Fe) . El nivel de ADCC aumentada es muy similar a aquel observado con células efectoras humanas (PBMCs) . Finalmente, encontramos que los anticuerpos anti-EGFR Fe modificados para Fc-FcgammaRIII aumentado con afinidad de unión y para ADCC aumentada, pueden ser suministrados a los mamíferos para dar concentraciones por encima de 1 microgramo del anticuerpo por milímetro de suero para un período de al menos 4 semanas para dar exposiciones de la droga normalmente asociadas con acumulación importante de anticuerpo en las células objetivo in vivo, sin llegar a una toxicidad significante. La toxicidad de una molécula de antígeno de unión de la presente invención puede ser medida y/o determinada usando cualquiera de los métodos y/o parámetros (e.g. valores químicos de sangre, indicadores histopatológicos, etc.) descritos anteriormente, o por cualquier medio conocido por aquellos expertos en la materia. EJEMPLO 5 Modificaciones a la Cadena de Liviana CDR Utilizando métodos descritos anteriormente, las variantes de la región variable de la cadena ligera de anti-EGFR fueron generadas de la construcción I-KC de la región variable de la cadena ligera (SEC ID NO:43 y SEC ID NO:45), donde la secuencia que codifica el residuo del aminoácido en posiciones varias en la rata ICR62 CDR fue reemplazada con el correspondiente residuo del aminoácido de una secuencia de gen variable de una linea de germen humana. Tabla 38 muestra las sustituciones que fueron realizadas en la CDR de la construcción I-KC de la región variable de la cadena ligera (SEC ID NO:45) : Tabla 38: Cadena ligera minimizada CDR * Identificado de acuerdo con la nomenclatura estándar (por ej . , "N30R" significa el residuo Asparagina (N) en la posición 30 de la secuencia SEC ID NO: 45 está reemplazado con el residuo Arginina (R) ) . Todos los residuos de sustitución identificados anteriormente fueron obtenidos de la secuencia aceptora VK1_6 humana salvo el intercambio Y32 , donde la W de una secuencia de línea germinal humana relacionada se sustituyó por Y en la posición 32 de SECID NO:45. Cada una de las construcciones de la variante I-KC (I-KC1 a I-KC9) fue emparejado con la región variable de cadena pesada que comprende la construcción I-HHD (SEC ID NO: 16 y SEC ID NO: 15) y se llevó a cabo un ensayo de unión de acuerdo con los métodos descritos en los ejemplos anteriores. Las construcciones I-KC1 a I-KC9 fueron comparadas con la construcción I-KC (SEC ID NO:46 y SEC ID NO:45) para determinar la afinidad de unión a EGFR en células objetivo A431 (Figura 29) . Tal como puede verse en la Figura 29, sólo la modificación del residuo 34 a su correspondiente secuencia humana (N34G) dio como resultado una leve disminución en la afinidad de unión (el valor EC50 aumentó en un factor 10) . Todas las demás construcciones mantuvieron una actividad de unión comparable con la construcción I-KC (SEC ID NO: 45) . Por ende, cuando se aparea con una construcción de cadena pesada quimérica (por ejemplo, humanizada) especifica para EGFR, la cadena ligera puede ser totalmente humana (por ejemplo, de una secuencia genética V de cadena ligera humana) y conserva aún la unión específica para EGFR. En particular, CDR2 y CDR 3 pueden estar totalmente en forma de línea germinal humana Moléculas de unión al antígeno que comprenden CDR EGRF-específieos El presente invento contempla por lo tanto una molécula que se une al antígeno que comprende una región variable de cadena quimérica (por ej . humanizada) que comprende un CDR EGRF-específico en par con una región variable de cadena ligera en donde la región de cadena variable tiene menos que diez residuos de aminoácidos no humanos. En otras modalidades, la región variable de cadena ligera tiene menos que nieve, ocho, siete, seis, cinco, cuatro, tres, dos o uno residuo (s) de aminoácidos no humanos. En modalidades preferidas, la región variable de cadena ligera tiene menos que dos o menos que uno (por ej . no tiene) residuos de aminoácidos no humanos. En una modalidad, la región variable de cadena ligera comprende una o más secuencias de genes de línea germinal humana. Las secuencias de genes de región variable de línea germinal humana que codifican regiones variables de cadena ligeras son conocidas en el arte y pueden ser encontradas por ejemplo, en la bases de datos IMGT disponible en: http://imgt.cines.fr/home.html. En una modalidad preferida, la secuencia de línea germinal humana es derivada de la secuencia de línea germinal VKl-6. En otras modalidades, los residuos de aminoácidos dentro de la región de cadena variable ligera de línea germinal humana pueden estar substituidos con uno o más residuos de otra secuencia de región de cadena variable ligera de línea germinal humana. En otra modalidad, la presente invención está dirigida a una molécula que se une a un antígeno que comprende una secuencia seleccionada del grupo consistente de: SEC ID N0.:1; SEC ID No: 3; SEC ID No: 5; SEC ID No: 7; SEC ID No: 9; SEC ID No: 11; SEC ID No: 13; SEC ID No: 15; SEC ID No:17; SEC ID No:19; SEC ID No:21; SEC ID No:23; SEC ID No: 25; SEC ID No: 27; SEC ID No: 29; SEC ID No: 31; SEC ID No33; SEC ID No:35; SEC ID No:37; SEC ID No:39; y SEC ID No:121, y una cadena ligera que comprende un polipéptido codificado por una o más secuencias de genes de línea germinal humana variable. En una modalidad preferida la secuencia de línea germinal humana está derivada de la secuencia de línea germinal VKl-6. En otra modalidad, la presente invención está dirigida a una molécula que se une a un antigeno que comprende una secuencia seleccionada del grupo consistente en: SEC ID N0:54, SEC ID NO:56, SEC ID NO:58, SEC ID NO:60, SEC ID NO:62, SEC ID NO:64, SEC ID NO:66, SEC ID NO:68, SEC ID NO:70, SEC ID NO:72, SEC ID NO:74, SEC ID NO:122, y SEC ID NO: 124; (b) una secuencia seleccionada del grupo consistente en: SEC ID NO:76, SEC ID NO:78, SEC ID NO:80, SEC ID NO:82, SEC ID NO:84, SEC ID NO:86, SEC ID NO:88, SEC ID NO:90, SEC ID NO:92, SEC ID NO:94, SEC ID NO:96, SEC ID NO:98, SEC ID NO:100, SEC ID NO:102, SEC ID NO:104, SEC ID NO:106, y SEC ID NO: 126; (c) SEC ID NO: 108; y (d) un polipéptido que comprende una región variable de cadena ligera humana codificada por una o más secuencias de genes de línea germinal humana. En una modalidad particular, la secuencia de línea germinal humana está derivada de la línea de secuencia germinal VKl-6. En otra modalidad, la secuencia de genes de región variable de linea germinal humana comprende la línea de secuencia germinal VKi-6 con una substitución de uno o más codones de aminoácidos con una secuencia de una secuencia de región variable de cadena ligera de línea germinal humana diferente . En otras modalidades, la molécula que se une al antigeno de la presente invención comprende una región variable de cadena pesada específica para EGFR de la presente invención, y una variante de la SEC ID NO: 45. En una modalidad, la variante de la SEC ID NO: 45 comprende una sustitución de amino ácidos en una o más posiciones en las regiones que determinan la complementaridad (CDR) . En modalidades específicas la sustitución es de un residuo amino ácido en la posición seleccionada del grupo que consiste en la: posición del amino ácido 30 de la SEC ID NO: 45; posición del amino ácido 32 de la SEC ID NO: 45; posición del amino ácido 34 de la SEC ID NO: 45; posición del amino ácido 50 de la SEC ID NO: 45; posición del amino ácido 51 de la SEC ID NO: 45; posición del amino ácido 52 de la SEC ID NO: 45; posición del amino ácido 53 de la SEC ID NO: 45; posición del amino ácido 56 de la SEC ID NO: 45; posición del amino ácido 94 de la SEC ID NO: 45; y cualquier combinación de sustituciones de las mismas. En modalidades más especificas, la sustitución en la SEC ID NO: 45 es seleccionada del grupo que consiste en: sustitución de una arginina (R) por la asparagina (N) en la posición 30 de la SEC ID NO: 45; sustitución de un triptófano (W) por la tirosina (Y) en la posición 32 de la SEC ID NO: 45; sustitución de una glicina (G) por la asparagina (N) en la posición 34 de la SEC ID NO: 45; sustitución de una treonina (T) por la asparagina (N) en la posición 50 de la SEC ID NO: 45; sustitución de una alanina (A) por la treonina (T) en la posición 51 de la SEC ID NO: 5; sustitución de una serina (S) por la asparagina (N) en la posición 52 de la SEC ID NO: 45; sustitución de una serina (S) por la asparagina (N) en la posición 53 de la SEC ID NO: 45; sustitución de una serina (S) por treonina (T) en la posición 56 de la SEC ID NO: 45; sustitución de una tirosina (Y) por la fenilalanina (F) en la posición 94 de la SEC ID NO: 45; y cualquier combinación de las mismas. En una modalidad particular, todas las sustituciones de residuos de amino ácidos en la SEC ID NO: 45 se incorporan en una sola variante de cadena ligera. En modalidades preferidas, las moléculas que se unen al antigeno que comprenden variantes de cadena ligera con sustituciones de amino ácidos para CDR de ICR62 retienen la unión especifica a EGFR (en comparación con una molécula de unión al antígeno que comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEC ID NO: 45) cuando la variante de la cadena ligera es emparejado con un polipéptido que comprende una región variable de cadena pesada de la presente invención. La presente invención también se refiere a polinucleótidos que codifican para uno cualquiera de los polipéptidos y/o a moléculas que se unen a antígenos anteriores. La presente invención se relaciona además con las moléculas que unen antígenos descritas anteriormente, con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Todas las publicaciones tales como libros de texto, artículos de diarios, entradas al GenBank u a otras bases de datos de secuencias y las solicitudes publicadas, y las solicitudes de patente mencionadas en esta memoria se incorporan aquí como referencia en el mismo grado que si cada publicación o solicitud de patente individual estuviera específica e individualmente indicada para ser incorporada como referencia. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. - Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende (a) una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID NO:56, SEC ID NO:58, SEC ID NO:62, SEC ID NO:64, SEC ID NO:68, SEC ID NO:70, SEC ID NO:72, SEC ID NO:74, SEC ID NO:122, y SEC ID NO:124; y (b) una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID NO:76, SEC ID NO:78, SEC ID NO:80, SEC ID
NO: 82, SEC ID NO: 84, SEC ID NO: 86, SEC ID NO: SEC ID
NO:90, SEC ID NO:92, SEC ID NO:94, SEC ID NO:96, SEC ID NO:98, SEC ID NO:100, SEC ID NO:102, SEC ID NO:104, SEC ID
NO:106, y SEC ID NO:126; y (c) SEC ID NO:108. 2.- Un polinucleótido aislado caracterizado que comprende (a) una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID NO:54, SEC ID NO:56, SEC ID NO:58, SEC ID
NO:60, SEC ID NO:62, SEC ID NO:64, SEC ID NO:66, SEC ID
NO:68, SEC ID NO:70, SEC ID NO:72, SEC ID NO:74, SEC ID
NO:122, y SEC ID NO:124; y (b) una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID NO:78, SEC ID NO:80, SEC ID NO:82, SEC ID NO:84, SEC ID NO:86, SEC ID NO:88, SEC ID NO:90, SEC ID NO:94, SEC ID NO:96, SEC ID NO:100, SEC ID NO:102, SEC ID NO:104, SEC ID NO:106, y SEC ID NO:126 y (c) SEC ID NO:108. 3.- Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende (a) SEC ID NO:112 o SEC ID NO:114; (b) SEC ID N0.118; y (c) SEC ID NO:119. 4.- Un polinucleótido aislado que comprende (a) SEC ID NO: 114; (b) SEC ID N0.116 y SEC ID N0.118; y (c) SEC ID NO:119. 5.- Un polinucleótido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque codifica un polipéptido de fusión. 6.- Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO: 4; SEC ID NO: 6; SEC ID NO: 8; SEC ID NO: 10; SEC ID NO: 12; SEC ID NO: 14; SEC ID NO: 16; SEC ID NO: 18; SEC ID NO:20; SEC ID NO:22; SEC ID NO:24; SEC ID NO:26; SEC ID NO:28; SEC ID NO:30; SEC ID NO:32; SEC ID NO:34; SEC ID NO:36; SEC ID NO:38; SEC ID NO:40, y SEC ID NO:120. 7. - Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el polinucleótido aislado comprende la SEC ID NO: 36.
8.- Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el polinucleótido aislado comprende la SEC ID NO: 38.
9.- Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el polinucleótido aislado comprende la SEC ID NO: 40.
10.- Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO:46, SEC ID NO:50, y SEC ID NO:52.
11.- Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el polinucleótido comprende la SEC ID NO: 46.
12.- Un polinucleótido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, caracterizado porque el polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión .
13.- Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende (a) una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO: 2; SEC ID NO: 4; SEC ID NO: 6; SEC ID NO: 8; SEC ID NO: 10; SEC ID NO: 12; SEC ID NO: 14; SEC ID NO: 16; SEC ID NO:18; SEC ID NO:20; SEC ID NO:22; SEC ID NO:24; SEC ID NO:26; SEC ID NO:28; SEC ID NO:30; SEC ID NO:32; SEC ID NO:34; SEC ID NO:36; SEC ID NO:38; SEC ID NO:40 y SEC ID NO: 120; y (b) una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO:44, SEC ID NO:46, SEC ID NO:50 y SEC ID NO:52.
14.- Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO:2; SEC ID NO: 4; SEC ID NO: 6; SEC ID NO: 8; SEC ID NO: 10; SEC ID NO: 12; SEC ID NO: 14; SEC ID NO: 16; SEC ID NO:18; SEC ID NO:20; SEC ID NO:22; SEC ID NO:24; SEC ID NO:26; SEC ID NO:28; SEC ID NO:30; SEC ID NO:32; SEC ID NO: 34; SEC ID NO: 36; SEC ID NO: 38; SEC ID NO: 40 y SEC ID NO: 120, caracterizado porque el polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión.
15.- Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque comprende una secuencia que tiene por lo menos 85% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO:2; SEC ID NO:4; SEC ID NO:6; SEC ID NO:8; SEC ID NO:10; SEC ID NO: 12; SEC ID NO: 14; SEC ID NO: 16; SEC ID NO: 18; SEC ID NO:20; SEC ID NO:22; SEC ID NO:24; SEC ID NO:26; SEC ID NO:28; SEC ID NO: 30; SEC ID NO: 32; SEC ID NO: 34; SEC ID NO:36; SEC ID NO:38; SEC ID NO:40 y SEC ID NO:120, caracterizado porque el polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión.
16.- Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 14 o 15, caracterizado porque comprende una secuencia que tiene por lo menos 90% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO: 2; SEC ID NO: 4; SEC ID NO: 6; SEC ID NO: 8; SEC ID NO: 10; SEC ID NO: 12; SEC ID NO: 14; SEC ID NO: 16; SEC ID NO: 18; SEC ID NO:20; SEC ID NO:22; SEC ID NO:24; SEC ID NO:26; SEC ID NO:28; SEC ID NO:30; SEC ID NO:32; SEC ID NO:34; SEC ID NO:36; SEC ID NO:38; SEC ID NO:40 y SEC ID NO:120, caracterizado porque el polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión.
17.- Un polinucleótido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, caracterizado porque comprende una secuencia que tiene por lo menos 95% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO:2; SEC ID NO:4; SEC ID NO: 6; SEC ID NO:8; SEC ID NO:10; SEC ID NO:12; SEC ID NO:14; SEC ID NO:16; SEC ID NO:18; SEC ID NO:20; SEC ID NO:22; SEC ID NO:24; SEC ID NO:26; SEC ID NO:28; SEC ID NO:30; SEC ID NO:32; SEC ID NO:34; SEC ID NO:36; SEC ID NO:38; SEC ID NO:40 y SEC ID NO: 120, caracterizado porque el polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión.
18.- Un polinucleótido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17 caracterizado porque comprende una secuencia que tiene por lo menos 99% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO : 2 ; SEC ID NO: 4; SEC ID NO: 6; SEC ID NO: 8; SEC ID NO: 10; SEC ID NO: 12; SEC ID NO: 14; SEC ID NO: 16; SEC ID NO:18; SEC ID NO:20; SEC ID NO:22; SEC ID NO:24; SEC ID NO:26; SEC ID NO:28; SEC ID NO:30; SEC ID NO:32; SEC ID NO:34; SEC ID NO:36; SEC ID NO:38; SEC ID NO:40 y SEC ID NO: 120, caracterizado porque el polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión.
19.- Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID NO:44, SEC ID NO:46, SEC ID NO:50, y SEC ID NO: 52, caracterizado porque el polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión.
20.- Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque comprende una secuencia que tiene por lo menos 85% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID NO:44, SEC ID NO:46, SEC ID NO:50, y SEC ID NO:52, caracterizado porque el polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión.
21.- Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque comprende una secuencia que tiene por lo menos 90% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID NO:44, SEC ID NO:46, SEC ID NO:50, y SEC ID NO:52, caracterizado porque el polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión.
22.- Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque comprende una secuencia que tiene por lo menos 95% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID NO:44, SEC ID NO:46, SEC ID NO:50, y SEC ID NO:52, caracterizado porque el polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión.
23.- Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque comprende una secuencia que tiene por lo menos 99% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID NO:44, SEC ID NO:46, SEC ID NO:50, y SEC ID NO:52, caracterizado porque el polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión.
24.- Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO: 4; SEC ID NO: 6; SEC ID NO: 8; SEC ID NO: 10; SEC ID NO: 12; SEC ID NO: 14; SEC ID NO: 16; SEC ID NO:18; SEC ID NO:20; SEC ID NO:22; SEC ID NO:24; SEC ID NO:26; SEC ID NO:28; SEC ID NO:30; SEC ID NO:32; SEC ID NO:34; SEC ID NO:36; SEC ID NO:38; SEC ID NO:40, y SEC ID NO:120.
25.- Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO:46; SEC ID NO:50, SEC ID NO:52.
26.- Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque comprende una secuencia que tiene por lo menos 85% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO: 4; SEC ID NO: 6; SEC ID NO: 8; SEC ID NO: 10; SEC ID NO: 12; SEC ID NO: 14; SEC ID NO: 16; SEC ID NO: 18; SEC ID NO:20; SEC ID NO:22; SEC ID NO:24; SEC ID NO:26; SEC ID NO:28; SEC ID NO:30; SEC ID NO:32; SEC ID NO:34; SEC ID NO:36; SEC ID NO:38; SEC ID NO:40, y SEC ID NO:120.
27.- Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque comprende una secuencia que tiene por lo menos 85% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO:46; SEC ID NO:50, SEC ID NO:52.
28.- Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque comprende una secuencia que tiene por lo menos 90% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO: 4; SEC ID NO: 6; SEC ID NO: 8; SEC ID NO: 10; SEC ID NO: 12; SEC ID NO: 14; SEC ID NO: 16; SEC ID NO: 18; SEC ID NO:20; SEC ID NO:22; SEC ID NO:24; SEC ID NO:26; SEC ID NO:28; SEC ID NO: 30; SEC ID NO: 32; SEC ID NO: 34; SEC ID NO: 36; SEC ID NO:38; SEC ID NO:40, y SEC ID NO:120.
29.- Un polinucleótido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 o 27, caracterizado porque comprende una secuencia que tiene por lo menos 90% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO:46; SEC ID NO:50; y SEC ID NO:52.
30.- Un polinucleótido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26 o 28, caracterizado porque comprende una secuencia que tiene por lo menos 95% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO: 4; SEC ID NO: 6; SEC ID NO: 8; SEC ID NO: 10; SEC ID NO: 12; SEC ID NO: 14; SEC ID NO: 16; SEC ID NO:18; SEC ID NO:20; SEC ID NO:22; SEC ID NO:24; SEC ID NO:26; SEC ID NO:28; SEC ID NO:30; SEC ID NO:32; SEC ID NO:34; SEC ID NO:36; SEC ID NO:38; SEC ID NO:40; y SEC ID NO:120.
31.- Un polinucleótido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25, 27 o 29, caracterizado porque comprende una secuencia que tiene por lo menos 95% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO:46, SEC ID NO:50, y SEC ID NO:52.
32.- Un polinucleótido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26, 28 o 30, caracterizado porque comprende una secuencia que tiene por lo menos 99% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO: 4; SEC ID NO: 6; SEC ID NO: 8; SEC ID NO: 10 SEC ID NO: 12; SEC ID NO: 14; SEC ID NO: 16 SEC ID NO: 18 SEC ID NO:20; SEC ID NO:22; SEC ID NO:24 SEC ID NO: 26 SEC ID NO:28; SEC ID NO:30; SEC ID NO:32 SEC ID NO:34 SEC ID NO:36; SEC ID NO:38; SEC ID NO:40 y SEC ID NO:120.
33.- Un polinucleótido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25, 27, 29 o 31, caracterizado porque comprende una secuencia que tiene por 1o menos 99% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO: 46, SEC ID NO: 50, y SEC ID NO:52.
34.- Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende (a) una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO:l; SEC ID NO: 3; SEC ID NO: 5; SEC ID NO: 7; SEC ID NO: 9; SEC ID NO: 11; SEC ID NO: 13; SEC ID NO: 15; SEC ID NO: 17; SEC ID NO: 19; SEC ID NO: 21; SEC ID NO: 23; SEC ID NO: 25; SEC ID NO:27; SEC ID NO:29; SEC ID NO:31; SEC ID NO:33; SEC ID NO:35; SEC ID NO:37; SEC ID NO:39; y SEC ID NO: 121; y (b) una secuencia que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de una región Fe de anticuerpo, o un fragmento de la misma, a partir de una especie distinta de rata .
35.- Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el polipéptido que tiene una secuencia de la región Fe de anticuerpo es una región constante de anticuerpo.
36.- Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende (a) una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO: 43; SEC ID NO: 45, SEC ID NO: 49, y SEC ID NO: 51; y (b) una secuencia que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de una región constante de cadena ligera del anticuerpo, o un fragmento de la misma, de una especie distinta de rata.
37.- Un polinucleótido aislado caracterizado porque codifica un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO: 3; SEC ID NO: 5; SEC ID NO:7; SEC ID NO:9; SEC ID NO: 11; SEC ID NO:13; SEC ID NO:15; SEC ID NO: 17; SEC ID NO: 19; SEC ID NO:21; SEC ID NO:23; SEC ID NO:25; SEC ID NO:27; SEC ID NO:29; SEC ID NO:31; SEC ID NO:33; SEC ID NO:35; SEC ID NO:37; SEC ID NO:39, y SEC ID NO:121.
38.- Un polinucleótido aislado caracterizado porque codifica un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO:45, SEC ID NO:49, y
SEC ID NO: 51. 39.- Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEC
ID NO: 3; SEC ID NO: 5; SEC ID NO: 7; SEC ID NO: 9; SEC ID NO: 11;
SEC ID NO: 13; SEC ID NO: 15; SEC ID NO: 17; SEC ID NO: 19; SEC ID NO:21; SEC ID NO:23; SEC ID NO:25; SEC ID NO:27; SEC ID
NO:29; SEC ID NO: 31; SEC ID NO: 33; SEC ID NO: 35; SEC ID
NO:37; SEC ID NO:39; y SEC ID NO:121. 40.- Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una secuencia selecciona del grupo que consiste en la SEC ID
NO:45, SEC ID NO:49, y SEC ID NO:51. 41.- Un vector de expresión caracterizado porque comprende un polinucleótido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-40. 42.- El vector de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque el vector es policistrónico. 43.- Una célula huésped caracterizada porque comprende el vector de expresión de la reivindicación 41. 44.- Una célula huésped caracterizada porque comprende un polinucleótido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-37.
45.- Un polinucleótido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-10 caracterizado porque comprende además una secuencia que codifica una región constante de cadena pesada o cadena ligera de un anticuerpo humano .
46.- Una célula huésped que co-expresa un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 39 y un polinucleótido caracterizado porque comprende una secuencia que codifica la región variable de una cadena ligera del anticuerpo.
47.- Un polipéptido caracterizado porque comprende una secuencia derivada del anticuerpo ICR62 de rata y una secuencia derivada de un péptido heterólogo.
48.- Una molécula de unión al antígeno caracterizada porque comprende el polipéptido de la reivindicación 47.
49.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 48, caracterizada porque se une al EGFR humano.
50.- Una molécula de unión al antigeno de conformidad con la reivindicación 48 o 49, caracterizada porque es un anticuerpo.
51.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 50, caracterizada porque el anticuerpo es quimérico.
52.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 51, caracterizada porque el anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado.
53.- Un polipéptido quimérico caracterizado porque comprende la secuencia de la SEC ID NO:l o una variante del mismo .
54.- Un polipéptido quimérico caracterizado porque comprende la secuencia de la SEC ID NO: 43 o una variante del mismo .
55.- Un polipéptido quimérico caracterizado porque comprende : (a) un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO: 53, SEC ID NO:55, SEC ID NO:57, SEC ID NO:123, SEC ID NO:59, SEC ID N0:61, SEC ID NO:63, SEC ID NO:65, SEC ID NO:67, SEC ID NO:69, SEC ID NO:71, SEC ID NO:73, y SEC ID NO:125; (b) un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO: 75 SEC ID NO:77, SEC ID NO:79, SEC ID NO:81, SEC ID NO:83, SEC ID NO:85, SEC ID NO:87, SEC ID NO:89, SEC ID NO:127, SEC ID NO:91, SEC ID NO:93, SEC ID NO:95, SEC ID NO:97, SEC ID NO:99, SEC ID NO:101, SEC ID NO:101, SEC ID NO:103, SEC ID NO: 105, y SEC ID NO: 105; y (c) un polipéptido que tiene la secuencia de la SEC ID NO:107.
56.- Un polipéptido quimérico caracterizado porque comprende: (a) un polipéptido que tiene una secuencia de SEC ID NO: 111 o SEC ID NO: 113; (b) un polipéptido que tiene una secuencia de SEC ID NO: 115; y (c) un polipéptido que tiene una secuencia de SEC ID NO:117.
57.- Un polipéptido aislado caracterizado porque comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO: 1; SEC ID NO: 3; SEC ID NO: 5; SEC ID NO: 7; SEC ID N0:9; SEC ID N0:11; SEC ID NO:13; SEC ID N0:15; SEC ID NO:17; SEC ID N0:19; SEC ID NO:21; SEC ID NO:23; SEC ID NO:25; SEC ID NO:27; SEC ID NO:29; SEC ID NO:31; SEC ID NO:33; SEC ID NO:35; SEC ID NO:37; SEC ID NO:39; y SEC ID NO: 121, o una variante del mismo.
58.- Un polipéptido aislado caracterizado porque comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID NO: 43, SEC ID NO:45, SEC ID NO:49, y SEC ID NO: 51, o una variante del mismo.
59.- El polipéptido aislado de acuerdo a reivindicación 57 o 58, caracterizado porque el polipéptido es un polipéptido de fusión.
60.- Una molécula de unión al antígeno caracterizada porque comprende el polipéptido de la reivindicación 57 y el polipéptido de la reivindicación 58.
61.- Una molécula de unión al antígeno caracterizada porque comprende el polipéptido aislado de la reivindicación 59.
62.- La molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 61, caracterizada porque la molécula de unión al antígeno es un anticuerpo.
63.- La molécula de unión al antígeno de de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 61-62, caracterizada porque la molécula de unión al antígeno se une a EGFR.
64.- La molécula de unión al antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 61-63, caracterizada porque la molécula de unión al antígeno se une a la variante III del EGFR.
65.- La molécula de unión al antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 61-64, caracterizada porque la molécula de unión al antígeno se une al mismo epítopo que el ICR62 de anticuerpo de rata.
66.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.
67.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo primatizado.
68.- La molécula de unión al antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 61 o 63-65, caracterizada porque la molécula de unión al antígeno es un fragmento de anticuerpo.
69.- La molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 68, caracterizada porque el fragmento de anticuerpo es humanizado.
70.- La molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 68 o reivindicación 69, caracterizada porque el fragmento de anticuerpo está seleccionado del grupo que consiste en un fragmento scFv, un fragmento Fv, un fragmento F(ab')2, un minicuerpo, un diacuerpo, triacuerpo, y un tetracuerpo.
71.- La molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 61 o reivindicación 62, caracterizada porque la molécula de unión al antigeno es un anticuerpo recombinante.
72.- La molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 71, caracterizada porque el anticuerpo recombinante está humanizado.
73.- La molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 71 o reivindicación 72, caracterizada porque el anticuerpo recombinante comprende una región Fe humana.
74.- La molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 73, caracterizada porque la región Fe humana es una región Fe de IgG humana.
75.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 61-74, caracterizada porque la molécula de unión al antígeno ha sido glicomodificada para tener una estructura de oligosacárido alterada en la región Fe.
76.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 75, caracterizada porque la región Fe tiene una cantidad reducida de residuos fucosa en comparación con la molécula de unión al antigeno no glicomodificada .
77.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 75 o reivindicación 76, caracterizada porque la región Fe tiene una proporción incrementada de oligosacáridos divididos en comparación con el anticuerpo no glicomodificado
78.- Una molécula de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicación 75-77, caracterizada porque los oligosacáridos modificados son un complejo dividido .
79.- Una molécula de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicación 75-77, caracterizado porque los oligosacáridos modificados tienen una proporción incrementada de oligosacáridos divididos, no fucosilados en la región Fe de la molécula de unión al antígeno en comparación con la molécula de unión al antígeno no glicomodificada .
80.- Una molécula de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 75-79, caracterizada porque el anticuerpo glicomodificado tiene una relación incrementada de residuos GlcNAc a residuos fucosa en la región Fe en comparación con la molécula de unión al antígeno no glicomodificada .
81.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 79, caracterizada porque los oligosacáridos divididos, no fucosilados son híbridos.
82.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 79, caracterizada porque las oligosacáridos divididos, no fucosilados son complejos.
83.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 75, caracterizada porque al menos el 20% de los oligosacáridos en la región Fe de dicho polipéptido son divididos, no fucosilados
84.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 83, caracterizada porque al menos el 30% de oligosacáridos en la región Fe de dicho polipéptido son divididos, no fucosilados.
85.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 84, caracterizada porque al menos el 35% de los oligosacáridos en la región Fe de dicho polipéptido son divididos no fucosilados.
86.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 85, caracterizada porque al menos el 70% de los oligosacáridos en la región Fe de dicho polipéptido son divididos, no fucosilados.
87.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 75, caracterizada porque al menos el 50% de los oligosacáridos en la región Fe son divididos .
88.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 87, caracterizada porque al menos el 60% de los oligosacáridos en la región Fe son divididos.
89.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 88, caracterizada porque al menos el 70% de los oligosacáridos en la región Fe son divididos .
90.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 89, caracterizada porque al menos el 80% de los oligosacáridos en la región Fe están divididos .
91.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 90, caracterizada porque al menos el 90% de los oligosacáridos en la región Fe son divididos .
92.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 75, caracterizada porque al menos el 50% de los oligosacáridos en la región Fe son no fucosilados .
93.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 92, caracterizada porque al menos el 60% de los oligosacáridos en la región Fe son no fucosilados.
94.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 93, caracterizada porque al menos el 70% de los oligosacáridos en la región Fe son no fucosilados .
95.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 94, caracterizada porque al menos el 75% de los oligosacáridos en la región Fe son no fucosilados .
96.- Un método para producir una molécula de unión al antígeno que es capaz de competir con el anticuerpo ICR62 de rata para la unión al EGFR humano, y en donde la molécula de unión al antígeno es quimérica; el método caracterizado porque comprende: a) cultivar la célula huésped de conformidad con la reivindicación 43 o reivindicación 44 en un medio bajo condiciones que permiten la expresión de dicho polinucleótido que codifica la molécula de unión al antígeno; y b) recuperar la molécula de unión al antígeno .
97.- El método de conformidad con la reivindicación 96, caracterizado porque la molécula de unión al antígeno es un anticuerpo.
98.- El método de conformidad con la reivindicación 96 o reivindicación 97, caracterizado porque la molécula de unión al antígeno quimérica es humanizada.
99.- Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende la molécula de unión al antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 45-52 o 60-95 y un portador farmacéuticamente aceptable.
100.- Un método para el tratamiento de un trastorno relacionado con EGFR caracterizado porque comprende: a) pronosticar una respuesta a una terapia anti-EGFR en un sujeto humano mediante el ensayo de una muestra de un sujeto humano antes de la terapia con una pluralidad de reactivos que detectan la expresión y/o activación de biomarcadores pronosticadores de cáncer; b) determinar un patrón de expresión y/o activación de uno más de dichos biomarcadores pronosticadores donde el patrón pronostica la respuesta del sujeto humano a la terapia anti-EGFR; c) administrar a un sujeto humano que se ha pronosticado que responde a la terapia dirigida a anti-EGFR, de una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición de conformidad con la reivindicación 99.
101.- El método de conformidad con la reivindicación 100, caracterizado porque el biomarcador pronosticador es un receptor factor de crecimiento o una molécula de señalización cadena abajo relacionado con el receptor del factor de crecimiento.
102.- El método de conformidad con la reivindicación 101, caracterizado porque el receptor del factor de crecimiento es EGFR, EGFR fosforilado, HER2/neu, HER3, o cualquier combinación de éstos.
103.- El método de conformidad con la reivindicación 101, caracterizado porque las moléculas de señalización cadena abajo relacionadas con el receptor factor de crecimiento, están seleccionadas del grupo que consiste en Akt, RAS, RAF, MAPK, ERK1, ERK2 , PKC, STAT3, y STAT5.
104.- El método de conformidad con la reivindicación 100, caracterizado porque los biomarcadores pronosticadores son EGFR y HER3.
105.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 99 caracterizada porque la composición comprende además un coadjuvante.
106.- Un método para seleccionar células que expresan EGFR en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 99.
107.- Un método de conformidad con la reivindicación 106, caracterizado porque las células sobreexpresa EGFR.
108.- Un método de conformidad con la reivindicación 106, caracterizado porque el método se lleva a cabo para diagnosticar un trastorno caracterizado por la expresión de EGFR en dicho sujeto.
109.- Un método de conformidad con la reivindicación 106, caracterizado porque el método se lleva a cabo para tratar un trastorno caracterizado por la expresión de EGFR en dicho sujeto.
110.- Un método para el tratamiento de un trastorno de proliferación de células tratable por bloqueo de la señalización mediada por EGFR, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 99 a un sujeto humano que lo necesita.
111.- Un método para detectar in vivo o in vi tro la presencia de EGFR en una muestra, caracterizado porque comprende : a) poner en contacto una muestra a ser ensayada, opcionalmente con una muestra de control, con la molécula de unión al antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 47-52 o 60-95 bajo condiciones que permiten la formación de un complejo entre la molécula de unión al antígeno y el EGFR; y b) detectar dichos complejos de molécula de unión antígeno-EGFR.
112.- Una célula huésped manipulada para expresar por lo menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad de ß (1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III en una cantidad suficiente para modificar los oligosacáridos en la región Fe de un polipéptido producido por dicha célula huésped, caracterizado porque el polipéptido es una molécula de unión al antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 47-52 o 60-95.
113.- La célula huésped de conformidad con la reivindicación 112 caracterizada porque el polipéptido que tiene una actividad de ß (1,4) ) -N-acetilglucosaminiltransferasa III es un polipéptido de fusión.
114.- La célula huésped de conformidad con la reivindicación 112 o reivindicación 113 caracterizada porque la molécula de unión al antígeno es un anticuerpo.
115.- La célula huésped de conformidad con la reivindicación 112 o reivindicación 113, caracterizada porque la molécula de unión al antígeno es un fragmento de anticuerpo .
116.- La célula huésped de conformidad con la reivindicación 112 o reivindicación 113, caracterizada porque la molécula de unión al antígeno comprende una región equivalente a la región Fe de un a IgG humana.
117.- La célula huésped de conformidad con la reivindicación 112 o reivindicación 113 caracterizada porque la molécula de unión al antígeno producida por dicha célula huésped exhibe una afinidad de unión al receptor Fe incrementada como resultado de dicha modificación.
118.- La célula huésped de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 112, 113 o 117, caracterizada porque la molécula de unión al antígeno producida por dicha célula huésped exhibe una aumento de la función efectora como resultado de dicha modificación.
119.- Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 113, caracterizada porque el polipéptido de fusión comprende el dominio catalítico de ß(l,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III.
120.- Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 119, caracterizada porque el polipéptido de fusión comprende además el dominio de localización Golgi de un polipéptido residente Golgi heterólogo.
121.- Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 120, caracterizada porque el dominio de localización Golgi es el dominio de localización de manosidasa II.
122.- Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 120, caracterizada porque el domino de localización Golgi es el dominio de localización ß(l,2)-N-acetilglucosaminiltransferasa I.
123.- Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 120, caracterizada porque el domino de localización Golgi es el dominio de localización ß(l,2)-N-acetilglucosaminiltransferasa II
124.- Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 120, caracterizada porque el domino de localización Golgi es el dominio de localización de manosidasa I .
125.- Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 120, caracterizada porque el domino de localización Golgi es el dominio de localización de una al-6 núcleo fucosiltransferasa .
126.- Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 118, caracterizada porque la función efectora incrementada está incrementada por citotoxicidad celular mediada por Fe.
127.- Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 118, caracterizada porque la función efectora incrementada es incrementada por la adición a la célula NK.
128.- Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 118, caracterizada porque la función efectora incrementada está incrementada por la unión a macrófagos.
129.- Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 118, caracterizada porque la función efectora incrementada es la unión incrementada a células polimorfonucieares .
130.- Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 118, caracterizada porque la función efectora incrementada es la unión incrementada a monocitos.
131.- Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 118, caracterizada porque la función efectora incrementada es apoptosis inductora de señalización directa incrementada.
132.- Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 118, caracterizada porque la función efectora incrementada es maduración de célula dendrítica incrementada.
133.- Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 118, caracterizada porque la función efectora incrementada es preparación de célula T incrementada.
134.- Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 117, caracterizada porque el receptor Fe es el receptor activador Fcy.
135.- Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 117, caracterizada porque el receptor Fe es el receptor FcyRIIIA.
136.- Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 112, caracterizada porque la célula huésped es una célula HEK293-EBNA, una célula CHO, una célula BHK, una célula NSO, una célula SP2/0, una célula de mieloma YO, una célula de mieloma de ratón P3X63, una célula PER, una célula PER.C6 o una célula de hibridoma.
137.- Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 112, caracterizada porque la célula huésped es una célula de planta o una célula de levadura.
138.- La célula huésped de conformidad con la reivindicación 112, caracterizada porque comprende además por lo menos un polinucleótido transfectado que codifica un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 47 y 53-56, y en donde el ácido nucleico comprende una secuencia que codifica una región equivalente a la región Fe de una inmunoglobulina humana.
139.- La célula huésped de conformidad con la reivindicación 112, caracterizada porque por lo menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad de ß ( 1, 4 ) -N-acetilglucosaminiltransferasa III, está ligado emparejado a un elemento promotor constitutivo.
140.- La célula huésped de conformidad con la reivindicación 139, caracterizada porque el polipéptido que tiene actividad ß ( 1 , 4 ) -N-acetilglucosaminiltransferasa III es polipéptido de fusión.
141.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 73, caracterizada porque al menos el 50% de los oligosacáridos en las regiones Fe están divididos .
142.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 141, caracterizada porque por lo menos el 60% de los oligosacáridos en las regiones Fe están divididos.
143.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 142, caracterizada porque por lo menos el 70% de los oligosacáridos en las regiones Fe están divididos.
144.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 143, caracterizada porque por lo menos el 80% de los oligosacáridos en las regiones Fe están divididos.
145.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 144, caracterizada porque por lo menos el 90% de los oligosacáridos en las regiones Fe están divididos.
146.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 73, caracterizada porque al menos el 50% de los oligosacáridos en las regiones Fe son no fucosilados .
147.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 146, caracterizada porque al menos el 60% de los oligosacáridos en las regiones Fe son no fucosilados.
148.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 147, caracterizada porque al menos el 70% de los oligosacáridos en las regiones Fe son no fucosilados.
149.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 148, caracterizada porque al menos el 75% de los oligosacáridos en las regiones Fe son no fucosilados.
150.- El método de conformidad con la reivindicación 110, caracterizado porque el trastorno es un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de piel, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de riñon y cáncer de cerebro.
151.- Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende por lo menos una región determinante de complementariedad del anticuerpo ICR62 de rata, o una variante o forma truncada del mismo que contiene por lo menos los residuos determinantes de especificidad para dicha región determinante de complementariedad, caracterizado porque el polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión.
152.- Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 151, caracterizado porque la región determinante de complementariedad, está seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID NO:54, SEC ID NO:56, SEC ID NO:58, SEC ID NO:60, SEC ID NO:62, SEC ID NO:64, SEC ID NO:66, SEC ID NO:68, SEC ID NO:70, SEC ID NO:72, SEC ID NO:74, SEC ID NO:122, SEC ID NO:124, SEC ID NO:76, SEC ID NO:78, SEC ID NO:80, SEC ID NO:82, SEC ID NO:84, SEC ID NO:86, SEC ID NO:88, SEC ID NO:90, SEC ID NO:92, SEC ID NO:94, SEC ID NO:96, SEC ID NO:98, SEC ID NO:100, SEC ID NO:102, SEC ID NO:104, SEC ID NO:106, SEC ID NO:126, SEC ID NO:108, SEC ID NO:112, SEC ID NO:14, SEC ID NO:116, SEC ID NO:118, y SEC ID NO:119.
153.- un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 151, caracterizado porque el polinucleótido aislado codifica una molécula de unión al antígeno.
154.- Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende por lo menos dos regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo ICR62 de rata, o una variante o forma truncada del mismo que contienen por lo menos los residuos determinantes de especificidad para dichas regiones determinantes de complementariedad caracterizado porque el polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión .
155.- Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 154, caracterizado porque las por lo menos dos regiones determinantes de complementariedad están seleccionadas del grupo que consiste en SEC ID NO: 54, SEC ID NO:56, SEC ID NO:58, SEC ID NO:60, SEC ID NO:62, SEC ID NO:64, SEC ID NO:66, SEC ID NO:68, SEC ID NO:70, SEC ID NO:72, SEC ID NO:74, SEC ID NO:122, SEC ID NO:124, SEC ID NO:76, SEC ID NO:78, SEC ID NO:80, SEC ID NO:82, SEC ID NO:84, SEC ID NO:86, SEC ID NO:88, SEC ID NO:90, SEC ID NO:92, SEC ID NO:94, SEC ID NO:96, SEC ID NO:98, SEC ID NO:100, SEC ID NO:102, SEC ID NO:104, SEC ID NO:106, SEC ID NO:126, SEC ID NO:108, SEC ID NO:112, SEC ID NO:14, SEC ID NO:116, SEC ID NO:118, y SEC ID NO:119.
156.- Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende por lo menos tres regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo ICR62 de rata o variantes o formas truncadas de las mismas que contienen por lo menos los residuos determinantes de especificidad para cada uno de tres regiones determinantes de complementariedad caracterizado porque el polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión.
157.- Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 156 caracterizado porque las por lo menos tres regiones determinantes de complementariedad están seleccionadas del grupo que consiste en: SEC ID NO: 54, SEC ID NO:56, SEC ID NO:58, SEC ID NO:60 SEC ID NO: 62, SEC ID NO:64, SEC ID NO:66, SEC ID NO:68 SEC ID NO:70, SEC ID NO:72, SEC ID NO:74, SEC ID NO:122 SEC ID NO:124, SEC ID NO:76, SEC ID NO:78, SEC ID NO:80, SEC ID NO:82, SEC ID NO:84, SEC ID NO:86, SEC ID NO:8 SEC ID NO: 90, SEC ID NO:92, SEC ID NO:94, SEC ID NO:96, SEC ID NO:98, SEC ID NO:100, SEC ID NO:102, SEC ID NO:104, SEC ID NO:106, SEC ID NO:126, SEC ID NO:108, SEC ID NO:112, SEC ID NO:14, SEC ID NO:116, SEC ID NO:118, y SEC ID NO:119.
158.- Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 156, caracterizado porque las regiones determinantes de complementariedad comprenden por lo menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID NO:54, SEC ID NO:56, SEC ID NO:58, SEC ID NO:60, SEC ID NO:62, SEC ID NO:64, SEC ID NO:66, SEC ID NO:68, SEC ID NO:70, SEC ID NO:72, SEC ID NO:74, SEC ID NO:122, y SEC ID NO: 124; y por lo menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID NO:76, SEC ID NO:78, SEC ID NO:80, SEC ID NO:82, SEC ID NO:84, SEC ID NO:86, SEC ID NO:88, SEC ID NO:90, SEC ID NO:92, SEC ID NO:94, SEC ID NO:96, SEC ID NO:98, SEC ID NO:100, SEC ID NO:102, SEC ID NO:104, SEC ID NO: 106, y SEC ID NO: 126; y SEC ID NO: 108, o formas truncadas de dichas secuencias que contienen por lo menos los residuos determinantes de especificidad para cada una de dichas regiones determinantes de complementariedad.
159.- Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende por lo menos cuatro regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo ICR62 de rata o una variante o forma truncada del mismo que contiene por lo menos los residuos determinantes de especificidad para dichas regiones determinantes de complementariedad en donde el polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión.
160.- Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 159, caracterizado porque las por lo menos cuatro regiones determinantes de complementariedad están seleccionados del grupo que consiste en: SEC ID NO: 54, SEC ID NO:56, SEC ID NO:58, SEC ID NO:60, SEC ID NO:62, SEC ID NO:64, SEC ID NO:66, SEC ID NO:68, SEC ID N0:70, SEC ID NO:72, SEC ID NO:74, SEC ID NO:122, SEC ID NO:124, SEC ID NO:76, SEC ID NO:78, SEC ID NO:80, SEC ID NO:82, SEC ID NO:84, SEC ID NO:86, SEC ID NO:88, SEC ID N0:90, SEC ID NO: 92, SEC ID NO: 94, SEC ID NO: 96, SEC ID NO: 98, SEC ID NO:100, SEC ID NO:102, SEC ID NO:104, SEC ID NO:106, SEC ID NO-.126, y SEC ID NO:108, SEC ID N0:112, SEC ID NO:14, SEC ID NO:116, SEC ID NO:118, y SEC ID NO:119.
161.- Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende por lo menos cinco regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo ICR62 de rata o una forma variante o truncada del mismo que contiene por lo menos los residuos determinantes de especificidad para dichas regiones determinantes de complementariedad, en donde el polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión.
162.- Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 161, caracterizado porque las por lo menos cinco regiones determinantes de complementariedad están seleccionadas del grupo que consiste en: SEC ID NO: 54, SEC ID NO:56, SEC ID NO:58, SEC ID NO:60, SEC ID NO:62, SEC ID NO:64, SEC ID NO:66, SEC ID NO:68, SEC ID NO:70, SEC ID NO:72, SEC ID NO:74, SEC ID NO:122, SEC ID NO:124, SEC ID NO:76, SEC ID NO:78, SEC ID NO:80, SEC ID NO:82, SEC ID NO:84, SEC ID NO:86, SEC ID NO:88, SEC ID NO:90, SEC ID NO:92, SEC ID NO:94, SEC ID NO:96, SEC ID NO:98, SEC ID NO:100, SEC ID NO:102, SEC ID NO:104, SEC ID NO:106, SEC ID NO:126, y SEC ID NO:108, SEC ID NO:112, SEC ID NO:14, SEC ID NO:116, SEC ID NO:118, y SEC ID NO:119.
163.- Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende seis regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo ICR62 de rata, o una variante o forma truncada del mismo que contiene por lo menos los residuos determinantes de especificidad para dichas regiones determinantes de complementariedad, en donde el polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión.
164.- Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 163, caracterizada porque las regiones determinantes de complementariedad están seleccionadas del grupo que consiste en: SEC ID NO: 54, SEC ID NO: 56, SEC ID NO:58, SEC ID NO:60, SEC ID NO:62, SEC ID NO:64, SEC ID NO:66, SEC ID NO:68, SEC ID NO:70, SEC ID NO:72, SEC ID NO:74, SEC ID NO:122, SEC ID NO:124, SEC ID NO:76, SEC ID NO:78, SEC ID NO:80, SEC ID NO:82, SEC ID NO:84, SEC ID NO:86, SEC ID NO:88, SEC ID NO:90, SEC ID NO:92, SEC ID NO:94, SEC ID NO:96, SEC ID NO:98, SEC ID NO:100, SEC ID NO:102, SEC ID NO:104, SEC ID NO:106, SEC ID NO:126, y SEC ID NO:108, SEC ID NO:112, SEC ID NO:14, SEC ID NO:116, SEC ID NO:118, y SEC ID NO: 119.
165.- Un polipéptido aislado caracterizado porque está codificado por los polinucleótidos aislados de cualquiera de las reivindicaciones 151-164.
166.- Una molécula de unión al antigeno caracterizada porque comprende por lo menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo ICR62 de rata o una variante o forma truncada del mismo que contiene por lo menos los residuos determinantes de especificidad para dichas regiones determinantes de complementariedad y comprende además una secuencia derivada de un polipéptido heterólogo.
167.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 166, caracterizada porque la molécula de unión al antígeno comprende por lo menos tres regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo ICR62 de rata o variantes o formas truncadas de la misma que contienen por lo menos tres residuos determinantes de especificidad para cada una de las regiones determinantes de complementariedad.
168.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 167, caracterizada porque la molécula de unión al antígeno comprende la región variable de una cadena pesada o ligera del anticuerpo.
169.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 167 o reivindicación 168, caracterizada porque la molécula de unión al antígeno es un anticuerpo quimérico o humanizado.
170.- Un método para producir una molécula de unión al antígeno que tiene oligosacáridos modificados en una célula huésped, caracterizado porque el método comprende: a) cultivar una célula huésped manipulada para expresar por lo menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad de ß(l,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III bajo condiciones que permiten la producción de la molécula de unión al antígeno y que permiten la modificación de los oligosacáridos presentes en la regiones Fe de la molécula de unión al antígeno; y b) aislar la molécula de unión al antigeno caracterizada porque la molécula de unión al antigeno es capaz de competir con el anticuerpo ICR62 para la unión a EGFR y en donde la molécula de unión al antígeno o fragmento de la misma es quimérica.
171.- Un método de conformidad con la reivindicación 170 caracterizado porque los oligosacáridos modificados tienen fucosilación reducida en comparación con los oligosacáridos no modificados.
172.- Un método de conformidad con la reivindicación 170 o reivindicación 171 caracterizado porque los oligosacáridos modificados son híbridos.
173.- Un método de conformidad con la reivindicación 170 o reivindicación 171 caracterizado porque los oligosacáridos modificados son complejos.
174.- Un método de conformidad con la reivindicación 170 o reivindicación 171 caracterizado porque el anticuerpo recombinante o fragmento del mismo producido por dicha célula huésped tiene una proporción incrementada de oligosacáridos divididos no fucosilados en la región Fe del polipéptido .
175.- Un método de conformidad con la reivindicación 174, caracterizado porque los oligosacáridos divididos no fucosilados son híbridos.
176.- Un método de conformidad con la reivindicación 174, caracterizado porque los oligosacáridos divididos no fucosilados son complejos.
177.- Un método de conformidad con la reivindicación 170, caracterizado porque al menos el 20% de los oligosacáridos en la región Fe de los polipéptidos son divididos, no fucosilados.
178.- Un método de conformidad con la reivindicación 177, caracterizada porque al menos el 30% de los oligosacáridos en la región Fe de los polipéptidos son divididos no fucosilados.
179.- Un método de conformidad con la reivindicación 178, caracterizado porque al menos el 35% de los oligosacáridos para la región Fe de los polipéptidos son divididos no fucosilados.
180.- Una molécula de unión al antigeno caracterizada porque se manipula para tener una función efectora incrementada producida por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 170-179.
181.- Una molécula de unión al antigeno de conformidad con la reivindicación 180, caracterizada porque la molécula de unión al antígeno son anticuerpos.
182.- Las moléculas de unión al antígeno modificadas caracterizadas porque son para tener una afinidad de unión al receptor Fe incrementada, producidas por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 170-179.
183.- La molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 182 caracterizada porque la molécula de unión al antígeno es un anticuerpo.
184.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 180, caracterizada porque la función efectora incrementada es citotoxicidad celular mediada por Fe incrementada.
185.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 180, caracterizada porque la función efectora incrementada es una unión incrementada a las células NK.
186.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 180, caracterizada porque la función efectora incrementada es una unión incrementada a los macrófagos.
187.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 180, caracterizada porque la función efectora incrementada es unión incrementada a monocitos .
188.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 180 caracterizada porque la función efectora incrementada es unión incrementada a células polimorfonucieares .
189.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 180, caracterizada porque la función efectora incrementada es señalización directa que induce apoptosis.
190.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 180, caracterizada porque la función efectora incrementada es un aumento de la maduración de células dendríticas.
191.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 180, caracterizada porque la función efectora incrementada es un incremento del preparación de la célula T.
192.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 182, caracterizada porque el receptor Fe es un receptor activador Fe.
193.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 192, caracterizada porque el receptor Fe es el receptor FcyRIIIa.
194.- Una molécula de unión al antígeno producida por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 170-179 caracterizada porque la molécula de unión al antígeno es un fragmento de anticuerpo que contiene la región Fe y es manipulada para tener una función efectora incrementa .
195.- Una molécula de unión al antígeno producida por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 170-179, caracterizada porque la molécula de unión al antígeno es una proteína de fusión que incluye un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID No:l; SEC ID No: 3; SEC ID No: 5; SEC ID No:7; SEC ID No:9; SEC ID No:ll; SEC ID No:13; SEC ID No:15; SEC ID No:17; SEC ID No:19; SEC ID No:21; SEC ID No:23; SEC ID No:25; SEC ID No:27; SEC ID No:29; SEC ID No: 31; SEC ID No: 33; SEC ID No: 35; SEC ID No: 37; SEC ID No: 39, y SEC ID NO: 121, y una región equivalente a la región Fe de una inmunoglobulina y está manipulada por modificación de modo de incrementar la función efectora.
196.- Una molécula de unión la antígeno producida por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 170-179, caracterizada porque la molécula de unión al antígeno es una proteína de fusión que incluye un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID NO:43, SEC ID NO:45, SEC ID NO:49, y SEC ID N051, y una región equivalente a la región Fe de una inmunoglobulina y está manipulada por modificación para tener un incremento de la función efectora.
197.- Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende la molécula de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 180 a 196 y un portador farmacéuticamente aceptable.
198.- Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el fragmento de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 68 y un portador farmacéuticamente aceptable .
199.- Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el polipéptido de fusión de conformidad con la reivindicación 59 y un portador farmacéuticamente aceptable.
200.- Un método para el tratamiento de una enfermedad tratable mediante una actividad de EGFR reducida caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la molécula de unión al antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 180-196 a un sujeto humano que lo necesita.
201.- El método de conformidad con la reivindicación 110 o 200 caracterizado porque la cantidad terapéuticamente eficaz es de aproximadamente de 1.0 mg/kg hasta aproximadamente 15 mg/kg.
202.- El método de conformidad con la reivindicación 201, caracterizado porque la cantidad terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 1.5 mg/kg hasta 12 mg/kg.
203.- El método de conformidad con la reivindicación 202, caracterizado porque la cantidad terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 1.5 mg/kg hasta 4.5 mg/kg.
204.- El método de conformidad con la reivindicación 202, caracterizado porque la cantidad terapéuticamente eficaz es desde aproximadamente 4.5 mg/kg hasta aproximadamente 12 mg/kg.
205.- El método de conformidad con la reivindicación 202, caracterizado porque la cantidad terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 1.5 mg/kg.
206.- El método de conformidad con la reivindicación 202, caracterizado porque la cantidad terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 4.5 mg/kg.
207.- El método de conformidad con la reivindicación 202, caracterizado porque la cantidad terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 12 mg/kg.
208.- El método para el tratamiento del trastorno relacionado con EGFR en un sujeto que necesita dicho tratamiento caracterizado porque comprende administrar al sujeto la molécula de unión al antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 48-52, 60-95, 141-149, 166-169, o 180-196 en una cantidad de desde aproximadamente 1.0 mg/kg hasta aproximadamente 15 mg/kg.
209.- el método de conformidad con la reivindicación 208, caracterizado porque la cantidad terapéuticamente eficaz es de desde aproximadamente 1.5 mg/kg hasta aproximadamente 12 mg/kg.
210.- El método de conformidad con la reivindicación 208, caracterizado porque la cantidad terapéuticamente eficaz es de desde aproximadamente 1.5 mg/kg hasta aproximadamente 4.5 mg/kg.
211.- El método de conformidad con la reivindicación 208, caracterizado porque la cantidad terapéuticamente eficaz es de desde aproximadamente 4.5 mg/kg hasta aproximadamente 12 mg/kg.
212.- El método de conformidad con la reivindicación 208, caracterizado porque la cantidad terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 1.5 mg/kg.
213.- El método de conformidad con la reivindicación 208, caracterizado porque la cantidad terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 4.5 mg/kg.
214.- El método de conformidad con la reivindicación 208, caracterizado porque la cantidad terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 12 mg/kg.
215.- El método de conformidad con la reivindicación 208, caracterizado porque el sujeto es un mamífero .
216.- El método de conformidad con la reivindicación 215, caracterizado porque el mamífero es un ser humano.
217.- El método de conformidad con la reivindicación 208, caracterizado porque el trastorno es un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de piel, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de riñon y cáncer de cerebro.
218.- La molécula de unión al antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 48-52, 60-95, 141-149, 166-169, o 180-196, caracterizada porque es para ser usada como medicamento, en particular para ser usada en cáncer .
219.- La molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 218, caracterizada porque el cáncer está seleccionado del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de piel, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de riñon y cáncer de cerebro.
220.- Uso de la molécula de unión al antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 48-52, 60-95, 141-149, 166-169, o 180-196 para la manufactura de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de cáncer.
221.- El uso de conformidad con la reivindicación 220, en donde el cáncer está seleccionado del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de piel, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de riñon y cáncer de cerebro.
222.- El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 220 a 221, en donde la molécula de unión al antígeno se usa en una cantidad terapéuticamente eficaz de desde aproximadamente 1.0 mg/kg hasta aproximadamente 15 mg/kg .
223.- El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 220 a 222, en donde la cantidad terapéuticamente eficaz es de desde aproximadamente 1.5 mg/kg hasta aproximadamente 12 mg/kg.
224.- El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 220 a 223, en donde la cantidad terapéuticamente eficaz es de desde aproximadamente 1.5 mg/kg hasta aproximadamente 4.5 mg/kg.
225.- El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 220 a 224, en donde la cantidad terapéuticamente eficaz es de desde aproximadamente 4.5 mg/kg hasta aproximadamente 12 mg/kg.
226.- El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 220 a 225, en donde la cantidad terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 1.5 mg/kg.
227.- El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 220 a 226 en donde la cantidad terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 4.5 mg/kg.
228.- El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 220 a 227, en donde la cantidad terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 12 mg/kg.
229.- Los nuevos compuestos, procedimientos, composiciones farmacéuticas, métodos y usos caracterizados porque son tal como se describen aquí.
230.- Un polipéptido aislado caracterizado porque se codifica por el polinucleótido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 39.
231.- Una molécula de unión al antígeno caracterizada porque comprende el polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 230.
232.- Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el polinucleótido aislado comprende SEC ID NO: 6.
233.- Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el polinucleótido aislado comprende SEC ID NO: 10.
234.- Una molécula de unión al antígeno caracterizada porque comprende un polipéptido aislado codificado por el polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 232 o 233.
235.- Una molécula de unión al antígeno caracterizada porque comprende (a) una secuencia seleccionada del grupo formado por: SEC ID NO:54, SEC ID NO:56, SEC ID NO:58, SEC ID NO:60, SEC ID NO:62, SEC ID NO:64, SEC ID NO:66, SEC ID NO:68, SEC ID NO:70, SEC ID NO:72, SEC ID NO:74, SEC ID NO:122, y SEC ID NO:124; (b) una secuencia seleccionada del grupo formado por:: SEC ID NO:76, SEC ID NO:78, SEC ID NO:80, SEC ID NO:82, SEC ID NO:84, SEC ID NO:86, SEC ID NO:88, SEC ID NO:90, SEC ID NO:92, SEC ID NO:94, SEC ID NO:96, SEC ID NO:98, SEC ID NO:100, SEC ID NO:102, SEC ID NO:104, SEC ID NO:106, y SEC ID NO: 126; (c) SEC ID NO:108; y un polipéptido que comprende una región variable de cadena ligera humana codificada por una o varias secuencias genéticas de línea germinal humana.
236.- Una molécula de unión al antígeno caracterizada porque comprende una secuencia seleccionada del grupo formado por: SEC ID NO.:l; SEC ID No: 3; SEC ID No: 5; SEC ID No:7; SEC ID No:9; SEC ID No: 11; SEC ID No:13; SEC ID No: 15; SEC ID No: 17; SEC ID No: 19; SEC ID No:21; SEC ID No:23; SEC ID No:25; SEC ID No:27; SEC ID No:29; SEC ID No:31; SEC ID No33; SEC ID No:35; SEC ID No:37; SEC ID No:39; y SEC ID No: 121, y una cadena ligera que comprende un polipéptido codificado por una o varias secuencias genéticas de región variable de línea germinal humana.
237.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 235 o 236, caracterizada porque la secuencia genética de región variable de línea germinal humana comprende la secuencia genética de línea germinal VK1_6.
238.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 237, caracterizada porque la secuencia genética de región variable de línea germinal humana comprende la secuencia genética de línea germinal VK1_6 con una sustitución de uno o varios codones de aminoácidos con una secuencia de una secuencia genética de región variable de cadena ligera de línea germinal humana diferente .
239.- Una molécula de unión al antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 48-52, 60-95, 141-149, 166-169, 180-196, o 234-238, caracterizada porque la molécula de unión al antígeno, cuando se administra a un sujeto mamífero en concentraciones superiores a un microgramo por mililitro de suero, no causa un nivel significativo de toxicidad en dicho sujeto mamífero en comparación con un sujeto control no tratado.
240.- La molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 239, caracterizada porque el nivel de toxicidad de determina midiendo una serie de valores químicos de la sangre.
241.- La molécula de unión al antígeno de conformidad con la reivindicación 239, caracterizada porque el nivel de toxicidad se determina observando una serie de parámetros histopatológicos .
242.- El uso de la molécula de unión al antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 234-241 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento o profilaxis del cáncer.