BR112019020168A2

BR112019020168A2 - Receptores de ligação ao antígeno, células t transduzidas, polinucleotídeo isolado, vetor, kits, métodos para tratar uma doença e para induzir a lise de uma célula alvo e uso do receptor de ligação ao antígeno

Info

Publication number: BR112019020168A2
Application number: BR112019020168-8A
Authority: BR
Inventors: Klein Christian; Moessner Ekkehard; Stubenrauch Kay-Gunnar; Darowski Diana
Original assignee: F. Hoffmann-La Roche Ag
Priority date: 2017-03-27
Filing date: 2018-03-26
Publication date: 2020-06-02
Also published as: MY205503A; US12291561B2; RU2019133202A3; ZA201906358B; KR102712254B1; CL2019002717A1; TW201900673A; JP7642010B2; MA49990A; MA49270A; IL269531B2; CN110662560B; UA128717C2; SG11201908796XA; EP3600407B1; MX2019011526A; IL269531A; EP3600407A1; AU2018241624B2; CR20190440A

Abstract

a presente invenção refere-se, de modo geral, a receptores de ligação ao antígeno capazes de se ligarem especificamente a domínios fc mutados com ligação ao receptor fc reduzida e células t que expressam esses receptores de ligação ao antígeno. mais precisamente, a presente invenção refere-se a células t, transfectadas/ transduzidas com um receptor de ligação ao antígeno que é recrutado por ligação/ interação específica com o domínio fc mutado dos anticorpos terapêuticos. além disso, a invenção refere-se a um kit que compreende as células t da invenção e/ ou moléculas de ácido nucleico, vetores que expressam receptores de ligação ao antígeno da presente invenção e (a) anticorpo/ anticorpos direcionados a tumor compreendendo um domínio fc mutado. a invenção também fornece a produção e uso de células t em um método para o tratamento de doenças específicas em conjunto com anticorpos específicos para tumores, bem como composições/ medicamentos farmacêuticos que compreendem células t e/ ou anticorpos terapêuticos, em que as células t devem ser administradas em combinação com anticorpo/ anticorpos direcionados a tumor-terapêuticos compreendendo um domínio fc mutado com ligação ao receptor fc reduzida.

Description

“RECEPTORES DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO, CÉLULAS T TRANSDUZIDAS, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, VETOR, KITS, MÉTODOS PARA TRATAR UMA DOENÇA E PARA INDUZIR A LISE DE UMA CÉLULA ALVO E USO DO RECEPTOR DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO”

Campo da Invenção

[001] A presente invenção refere-se, de modo geral, a receptores de ligação ao antígeno capazes de se ligarem especificamente a domínios Fc mutados com ligação ao receptor Fc reduzida e células T que expressam esses receptores de ligação ao antígeno. Mais precisamente, a presente invenção refere-se a células T, transfectadas/ transduzidas com um receptor de ligação ao antígeno que é recrutado por ligação/ interação específica com o domínio Fc mutado dos anticorpos terapêuticos. Além disso, a invenção refere-se a um kit que compreende as células T da invenção e/ ou moléculas de ácido nucleico, vetores que expressam receptores de ligação ao antígeno da presente invenção e (a) anticorpo/ anticorpos direcionados a tumor compreendendo um domínio Fc mutado. A invenção também fornece a produção e uso de células T em um método para o tratamento de doenças específicas em conjunto com anticorpos específicos para tumores, bem como composições/ medicamentos farmacêuticos que compreendem células T e/ ou anticorpos terapêuticos, em que as células T devem ser administradas em combinação com anticorpo/ anticorpos direcionados a tumor-terapêuticos compreendendo um domínio Fc mutado com ligação ao receptor Fc reduzida.

Antecedentes da Invenção

[002] A terapia adotiva de células T (ACT) é uma abordagem de tratamento poderosa usando células T específicas para câncer (Rosenberg e Restifo, Science 348(6230) (2015), 62-68). A ACT pode usar células específicas de tumor de ocorrência natural ou células T tornadas específicas por engenharia genética usando células T ou receptores quiméricos de

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2/293 antigeno (Rosenberg e Restifo, Science 348(6230) (2015), 62-68). A ACT pode tratar e induzir remissão com sucesso em pacientes que sofrem até mesmo de doenças refratárias avançadas e de outro tipo de tratamento, tal como leucemia linfática aguda, linfoma não-hodgkins ou melanoma (Dudley et al., J Clin Oncol 26(32) (2008), 5233-5239; Grupp et al., N Engl J Med 368 (16) (2013), 15091518; Kochenderfer et al., J Clin Oncol. (2015) 33(6): 540-549, doi: 10.1200/ JCO.2014.56.2025. Epub 25 de agosto de 2014).

[003] No entanto, apesar da impressionante eficácia clínica, a ACT é limitada por toxicidades relacionadas ao tratamento. A especificidade, e os efeitos resultantes no alvo e fora do alvo, de células T projetadas usadas na ACT é principalmente acionada pela porção de ligação ao antígeno direcionada ao tumor implementada no receptor quimérico de antígeno (CAR). A expressão não exclusiva do antígeno tumoral ou a diferença temporal no nível de expressão podem resultar em efeitos colaterais graves ou mesmo aborto da ACT devido à toxicidade não tolerável do tratamento.

[004] Adicionalmente, a disponibilidade de células T específicas de tumor para lise eficiente de células tumorais depende da sobrevida a longo prazo e capacidade de proliferação de células T projetadas in vivo. Por outro lado, a sobrevida e a proliferação in vivo de células T podem resultar em efeitos indesejados a longo prazo devido à persistência de uma resposta CAR-T não controlada (Grupp et ai. 2013 N Engl J Med 368 (16):1509-18, Maude et ai. 2014 2014 N Engl J Med 371 (16): 1507-17).

[005] Uma abordagem para limitar toxicidades graves relacionadas ao tratamento e melhorar a segurança da ACT é restringir a ativação e proliferação de CAR-células T, introduzindo moléculas adaptadoras na sinapse imunológica. Tais moléculas adaptadoras compreendem pequenos comutadores bimodulares moleculares, como por exemplo recentemente descrito comutador de folato-FITC (Kim et al. J Am Chem Soc 2015; 137: 2832

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2835). Uma outra abordagem incluiu anticorpos modificados artificialmente, compreendendo um marcador para orientar e direcionar a especificidade de CAR-células T para células tumorais alvo (Ma et al. PNAS 2016; 113(4): E450458, Cao et al. Angew Chem 2016; 128: 1-6, Rogers et al. PNAS 2016; 113(4): E459-468, Tamada etal. Clin Cancer Res 2012; 18(23): 6436-6445).

[006] No entanto, as abordagens existentes têm várias limitações. As sinapses imunológicas que dependem de comutadores moleculares requerem a introdução de elementos adicionais que podem induzir uma resposta imune ou resultar em efeitos fora do alvo não específicos. Além disso, a complexidade de tais sistemas multicomponentes pode limitar a eficácia e tolerabilidade do tratamento. Por outro lado, a introdução da estrutura do marcador nos anticorpos monoclonais terapêuticos existentes pode afetar o perfil de eficácia e segurança desses construtos.

[007] Por conseguinte, a terapia tumoral direcionada, particularmente a terapia adotiva de células T, precisa ser aprimorada para atender às necessidades dos pacientes com câncer. Assim, existe ainda uma necessidade de fornecer meios aprimorados com potencial para melhorar a segurança e a eficácia da ACT e superar as desvantagens acima.

Descrição Resumida da Invenção

[008] A presente invenção refere-se, de modo geral, a receptores de ligação ao antígeno capazes de se ligarem especificamente a domínios Fc mutados com ligação ao receptor Fc reduzida e células T expressando esses receptores de ligação ao antígeno.

[009] Em um aspecto, a invenção se refere a um receptor de ligação ao antígeno que compreende um domínio transmembrana de ancoragem e um domínio extracelular compreendendo uma porção de ligação ao antígeno, em que a porção de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a um domínio de fragmento cristalizável (Fc) mutado, mas não

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4/293 é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado, em que o domínio Fc mutado compreende pelo menos uma substituição de aminoácido em comparação com o domínio Fc parental não mutado.

[010] Em uma forma de realização, a ligação do receptor Fc do domínio Fc mutado é reduzida em comparação com a ligação do receptor Fc do domínio Fc parental não mutado, particularmente em que o receptor Fc é um receptor Fcy ou um receptor Fc neonatal (FcRn). Em uma forma de realização, a ligação do receptor Fc é medida por Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR) a 25 °C.

[011] Em uma forma de realização, a porção de ligação ao antígeno é um scFv, um Fab, um crossFab ou um scFab. Em uma forma de realização preferida, a porção de ligação ao antígeno é um scFv. Em outra forma de realização preferida, a porção de ligação ao antígeno é um Fab ou um crossFab.

[012] Em uma forma de realização, o domínio transmembrana de ancoragem é um domínio transmembrana selecionado a partir do grupo que consiste no domínio transmembrana CD8, CD3z, FCGR3A, NKG2D, CD27, CD28, CD137, 0X40, ICOS, DAP10 ou DAP12 ou um fragmento dos mesmos.

[013] Em uma forma de realização, o domínio transmembrana de ancoragem é o domínio transmembrana de CD28, em particular em que o domínio transmembrana de ancoragem compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.

[014] Em uma forma de realização, o receptor de ligação ao antígeno compreende ainda pelo menos um domínio de sinalização de estímulo e/ ou pelo menos um domínio de sinalização de co-estímulo. Em uma forma de realização, o pelo menos um domínio de sinalização de estímulo é selecionado individualmente a partir do grupo que consiste no domínio intracelular de CD3z, de FCGR3A e de NKG2D, ou fragmentos dos mesmos.

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Em uma forma de realização, o pelo menos um domínio de sinalização de estímulo é um fragmento do domínio intracelular de CD3z, em particular em que o pelo menos um domínio de sinalização de estímulo compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13. Em uma forma de realização, o pelo menos um domínio de sinalização de co-estímulo é selecionado individualmente a partir do grupo que consiste no domínio intracelular de CD27, CD28, CD137, 0X40, ICOS, DAP10 e DAP12, ou fragmentos dos mesmos. Em uma forma de realização, o pelo menos um domínio de sinalização de coestímulo é um fragmento do domínio intracelular de CD28. Em uma forma de realização, o receptor de ligação ao antígeno compreende um domínio de sinalização de estímulo que compreende o domínio intracelular de CD3z, ou um fragmento do mesmo, e em que o receptor de ligação ao antígeno compreende um domínio de sinalização de co-estímulo que compreende o domínio intracelular de CD28, ou um fragmento do mesmo. Em uma forma de realização, o domínio de sinalização de estímulo compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 e o domínio de sinalização de co-estímulo compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.

[015] Em uma forma de realização, o domínio extracelular é conectado ao domínio transmembrana de ancoragem, opcionalmente através de um ligante peptídico. Em uma forma de realização, o ligante peptídico compreende a sequência de aminoácidos GGGGS (SEQ ID NO: 17). Em uma forma de realização, o domínio transmembrana de ancoragem é conectado a um domínio de co-sinalização ou a um domínio de sinalização, opcionalmente através de um ligante peptídico. Em uma forma de realização, os domínios de sinalização e/ ou co-sinalização são conectados, opcionalmente através de pelo menos um ligante peptídico.

[016] Em uma forma de realização, a porção de ligação ao antígeno é um fragmento scFv, em que o fragmento scFv é conectado no C

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6/293 terminal ao N-terminal do domínio transmembrana de ancoragem, opcionalmente através de um ligante peptídico.

[017] Em uma forma de realização, a porção de ligação ao antígeno é um fragmento Fab ou um fragmento crossFab, em que o fragmento Fab ou crossFab está conectado no C-terminal da cadeia pesada ao N-terminal do domínio transmembrana de ancoragem, opcionalmente através de um ligante peptídico.

[018] Em uma forma de realização, o receptor de ligação ao antígeno compreende um domínio de co-sinalização, em que o domínio de cosinalização está conectado no N-terminal ao C-terminal do domínio transmembrana de ancoragem. Em uma forma de realização, o receptor de ligação ao antígeno compreende um domínio de sinalização de estímulo, em que o domínio de sinalização de estímulo está conectado no N-terminal ao Cterminal do domínio de sinalização de co-estímulo.

[019] Em uma forma de realização, o domínio Fc parental não mutado é um domínio Fc de lgG1 ou lgG4, particularmente um domínio Fc de lgG1 humana. Em uma forma de realização, o domínio Fc mutado compreende pelo menos uma mutação de aminoácido em uma posição selecionada a partir do grupo que consiste em L234, L235, I253, H310, P331, P329 e H435 de acordo com a numeração EU, em particular em que a mutação de aminoácido é L234A, L235A, I253A, N297A, H310A, P329G e/ ou H435A.

[020] Em uma forma de realização, o domínio Fc mutado compreende pelo menos uma mutação de aminoácido em uma posição selecionada a partir do grupo que consiste em L234, L235 e P329 de acordo com a numeração EU, em particular as mutações de aminoácidos L234A, L235A e P329G (“PGLALA”).

[021] Em uma forma de realização, o domínio Fc mutado compreende a mutação de aminoácido P329G de acordo com a numeração

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EU, em que a ligação do receptor Fc of do domínio Fc mutado é reduzida em comparação com a ligação do receptor Fcy do domínio Fc parental não mutado, em particular em que o receptor Fcy é FcyRI I Ia e/ ou FcyRlla humano.

[022] Em uma forma de realização, o domínio Fc mutado compreende pelo menos uma mutação de aminoácido em uma posição selecionada a partir do grupo que consiste em 1253, H310 e H435 de acordo com a numeração EU, em particular as mutações de aminoácidos I253A, H310A e H435A (“AAA”), em que a ligação de FcRn do domínio Fc mutado é reduzida em comparação com a ligação de FcRn do domínio Fc parental não mutado.

[023] Em uma forma de realização, a pelo menos uma porção de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado que compreende a mutação P329G, mas não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado, em que a porção de ligação ao antígeno compreende:

(i) uma região variável da cadeia pesada (VH) que compreende:

(a) a sequência de aminoácidos RYWMN (SEQ ID NO: 1) da região determinante de complementaridade (CDR H) 1 da cadeia pesada;

(b) a sequência de aminoácidos EITPDSSTINYTPSLKD (SEQ ID NO: 2) da CDR H2; e (c) a sequência de aminoácidos PYDYGAWFAS (SEQ ID NO: 3) da CDR H3; e (ii) uma região variável da cadeia leve (VL) que compreende:

(d) a sequência de aminoácidos RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 4) da região determinante de complementaridade (CDR L) 1 da cadeia leve;

(e) a sequência de aminoácidos GTNKRAP (SEQ ID NO: 5) da CDR L2; e

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8/293 (f) a sequência de aminoácidos ALWYSNHWV (SEQ ID NO: 6) da CDR L3.

[024] Em uma forma de realização, a pelo menos uma porção de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado que compreende a mutação P329G, mas não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado, em que a porção de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 32 e uma região variável da cadeia leve (VL) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da grupo que consiste em SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 33.

[025] Em uma forma de realização, a pelo menos uma porção de ligação ao antígeno compreende a região variável da cadeia pesada (VH) de SEQ ID NO: 8 e a região variável da cadeia leve (VL) de SEQ ID NO: 9.

[026] Em uma forma de realização, a pelo menos uma porção de ligação ao antígeno é um scFv capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado que compreende a mutação P329G, mas não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado, em que o receptor de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 31. Em uma forma de realização, o receptor de ligação ao antígeno compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.

[027] Em uma forma de realização, a pelo menos uma porção de ligação ao antígeno é um fragmento Fab capaz de se ligar especificamente a

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9/293 um domínio Fc mutado que compreende a mutação P329G, mas não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado, em que o receptor de ligação ao antígeno compreende:

a) um polipeptídeo de fusão de cadeia pesada que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 48; e

b) um polipeptídeo de cadeia leve que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 41 e SEQ ID NO: 50.

[028] Em uma forma de realização, o receptor de ligação ao antígeno compreende:

a) o polipeptídeo de fusão de cadeia pesada de SEQ ID NO: 39; e

b) o polipeptídeo de cadeia leve de SEQ ID NO: 41.

[029] Em uma forma de realização, a pelo menos uma porção de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado que compreende as mutações I253A, H310A e H435A (“AAA”), mas não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado, em que a porção de ligação ao antígeno compreende:

(i) uma região variável da cadeia pesada (VH) que compreende:

(a) a sequência de aminoácidos SYGMS (SEQ ID NO: 53) da região determinante de complementaridade (CDR H) 1 da cadeia pesada;

(b) a sequência de aminoácidos SSGGSY (SEQ ID NO: 54) da CDR H2; e (c) a sequência de aminoácidos LGMITTGYAMDY (SEQ ID NO:

55) da CDR H3; e (ii) uma região variável da cadeia leve (VL) que compreende:

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10/293 (d) a sequência de aminoácidos RSSQTIVHSTGHTYLE (SEQ ID NO: 56) da região determinante de complementaridade (CDR L) 1 da cadeia leve;

(e) a sequência de aminoácidos KVSNRFS (SEQ ID NO: 57) da CDR L2; e (f) a sequência de aminoácidos FQGSHVPYT (SEQ ID NO: 58) da CDR L3.

[030] Em uma forma de realização, a pelo menos uma porção de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado que compreende as mutações I253A, H310A e H435A (“AAA”), mas não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado, em que a porção de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 e uma região variável da cadeia leve (VL) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62.

[031] Em uma forma de realização, a pelo menos uma porção de ligação ao antígeno compreende:

a) a região variável da cadeia pesada (VH) de SEQ ID NO: 61; e

b) a região variável da cadeia leve (VL) de SEQ ID NO: 62.

[032] Em uma forma de realização, a pelo menos uma porção de ligação ao antígeno é um scFv capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado que compreende as mutações I253A, H310A e H435A (“AAA”), mas não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado, em que o receptor de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%

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11/293 idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59. Em uma forma de realização, o receptor de ligação ao antígeno compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59.

[033] Em uma forma de realização, a pelo menos uma porção de ligação ao antígeno é um fragmento Fab capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado que compreende a mutação P329G, mas não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado, em que o receptor de ligação ao antígeno compreende:

a) um polipeptídeo de fusão de cadeia pesada que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; e

b) um polipeptídeo de cadeia leve que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41.

[034] Em uma forma de realização, o receptor de ligação ao antígeno compreende:

a) o polipeptídeo de fusão de cadeia pesada de SEQ ID NO: 39; e

b) o polipeptídeo de cadeia leve de SEQ ID NO: 41.

[035] Em uma forma de realização, é fornecido um polinucleotídeo isolado que codifica o receptor de ligação ao antígeno, como aqui descrito. Em uma forma de realização, é fornecido um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo de fusão de cadeia pesada ou um polipeptídeo de cadeia leve do receptor de ligação ao antígeno, como aqui descrito. Em uma forma de realização, é fornecida uma composição que codifica o receptor de ligação ao antígeno, como descrito aqui, compreendendo um primeiro polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo de fusão de cadeia pesada e um segundo polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo de cadeia leve.

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[036] Em uma forma de realização, é fornecido um polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo como aqui descrito ou pela composição como aqui descrita.

[037] Em uma forma de realização, é fornecido um vetor, particularmente um vetor de expressão, que compreende o(s) polinucleotídeo(s), como descrito aqui.

[038] Em uma forma de realização, é fornecida uma célula T transduzida que compreende o(s) polinucleotídeo(s) como aqui descrito ou o vetor como aqui descrito. Em uma forma de realização, é fornecida uma célula T transduzida capaz de expressar o receptor de ligação ao antígeno, como aqui descrito. Em uma forma de realização, é fornecida a célula T transduzida como aqui descrita, em que a célula T transduzida é co-transduzida com um receptor de célula T (TCR) capaz de se ligar especificamente a um antígeno alvo.

[039] Em uma forma de realização, é fornecido um kit que compreende:

(A) uma célula T transduzida capaz de expressar o receptor de ligação ao antígeno como aqui descrito; e (B) um anticorpo que compreende um domínio Fc mutado;

em que o receptor de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc mutado, mas não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado.

[040] Em uma forma de realização, é fornecido um kit que compreende:

(A) um polinucleotídeo isolado que codifica o receptor de ligação ao antígeno como aqui descrito; e (B) um anticorpo que compreende um domínio Fc mutado;

em que o receptor de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc mutado, mas não é capaz de se ligar

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13/293 especificamente ao domínio Fc parental não mutado.

[041] Em uma forma de realização, é fornecido um kit que compreende:

(A) a composição ou o vetor, como aqui descrito, codificando o receptor de ligação ao antígeno, como aqui descrito; e (B) um anticorpo que compreende um domínio Fc mutado;

[042] Em uma forma de realização, o domínio Fc parental não mutado é um domínio Fc de IgG 1 ou lgG4, particularmente um domínio Fc de lgG1 humana. Em uma forma de realização, é fornecido um domínio Fc mutado que compreende pelo menos uma mutação de aminoácido em uma posição selecionada a partir do grupo que consiste em L234, L235, I253, H310, P331, P329 e H435 de acordo com a numeração EU, em particular em que a mutação de aminoácido é L234A, L235A, I253A, N297A, H310A, P329G e/ ou H435A. Em uma forma de realização, o domínio Fc mutado compreende pelo menos uma mutação de aminoácido em uma posição selecionada a partir do grupo que consiste em L234, L235 e P329 de acordo com a numeração EU, em particular as mutações de aminoácidos L234A, L235A e P329G (“PGLALA”). Em uma forma de realização, o domínio Fc mutado compreende a mutação de aminoácido P329G de acordo com a numeração EU. Em uma forma de realização, o domínio Fc mutado compreende pelo menos uma mutação de aminoácido em uma posição selecionada a partir do grupo que consiste em I253, H310 e H435 de acordo com a numeração EU, em particular as mutações de aminoácidos I253A, H310A e H435A (“AAA”).

[043] Em uma forma de realização, o anticorpo que compreende o domínio Fc mutado é capaz de se ligar especificamente a um antígeno na

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14/293 superfície de uma célula tumoral, em particular em que o antígeno é selecionado a partir do grupo que consiste em FAP, CEA, p95, BCMA, EpCAM, MSLN, MCSP, HER-1, HER-2, HER-3, CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, CD52Flt3, FOLR1, Trop-2, CA-12-5, HLA-DR, MUC-1 (mucina), antígeno A33, PSMA, PSCA, receptor de transferrina, TNC (tenascina) e CA-IX e/ ou a um peptídeo ligado a uma molécula do complexo principal de histocompatibilidade humano (MHC). Em uma forma de realização, o anticorpo que compreende o domínio Fc mutado é capaz de se ligar especificamente a um antígeno selecionado a partir do grupo que consiste em proteína de ativação de fibroblastos (FAP), antígeno carcinoembrionário (CEA), mesotelina (MSLN), CD20, receptor de folato 1 (FOLR1) e tenascina (TNC).

[044] Em uma forma de realização, é fornecido o kit como descrito aqui para uso como um medicamento.

[045] Em uma forma de realização, é fornecido o receptor de ligação ao antígeno ou a célula T transduzida, conforme descrito aqui, para uso como um medicamento, em que a célula T transduzida que expressa o receptor de ligação ao antígeno é administrada antes, simultaneamente ou após a administração de um anticorpo que compreende um domínio Fc mutado, em que o receptor de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc mutado, mas não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado.

[046] Em uma forma de realização, é fornecido o kit, como descrito aqui, para uso no tratamento de uma doença maligna. Em uma forma de realização, é fornecido o receptor de ligação ao antígeno ou a célula T transduzida, como descritos aqui, para uso no tratamento de uma doença maligna, em que o tratamento compreende a administração de uma célula T transduzida que expressa o receptor de ligação ao antígeno antes, simultaneamente ou após a administração de um anticorpo que compreende

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15/293 um domínio Fc mutado em que o receptor de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc mutado, mas não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado.

[047] Em uma forma de realização, a referida doença maligna é selecionada a partir de câncer de origem epitelial, endotelial ou mesotelial e câncer de sangue.

[048] Em uma forma de realização, a célula T transduzida é derivada de uma célula isolada do sujeito a ser tratado. Em uma forma de realização, a célula T transduzida não é derivada de uma célula isolada do sujeito a ser tratado.

[049] Em uma forma de realização, é fornecido um método de tratamento de uma doença em um sujeito, que compreende administrar ao sujeito uma célula T transduzida capaz de expressar o receptor de ligação ao antígeno, conforme descrito aqui, e administrar antes, simultaneamente ou após a administração da célula T transduzida, uma a quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo que compreende um domínio Fc mutado, em que o receptor de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc mutado, mas não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado. Em uma forma de realização, a célula T é adicionalmente isolada do sujeito e a célula T transduzida é gerada através da transdução da célula T isolada com o polinucleotídeo, a composição ou o vetor, conforme descrito aqui. Em uma forma de realização, a célula T é transduzida com um construto de vetor retroviral ou lentiviral ou com um construto de vetor não viral. Em uma forma de realização, o construto de vetor não viral é um vetor de minicírculo sleeping beauty.

[050] Em uma forma de realização, a célula T transduzida é administrada ao sujeito por infusão intravenosa. Em uma forma de realização, a

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16/293 célula T transduzida é contatada com anticorpos anti-CD3 e/ ou anti-CD28 antes da administração ao sujeito. Em uma forma de realização, a célula T transduzida é contatada com pelo menos uma citocina antes da administração ao indivíduo, preferencialmente com interleucina-2 (IL-2), interleucina-7 (IL-7), interleucina-15 (IL-15) e/ ou interleucina-21, ou suas variantes.

[051] Em uma forma de realização, a doença é uma doença maligna. Em uma forma de realização, a doença maligna é selecionada a partir de câncer de origem epitelial, endotelial ou mesotelial e câncer de sangue.

[052] Em uma forma de realização, é fornecido um método para induzir a lise de uma célula alvo, compreendendo o colocar a célula alvo em contato com uma célula T transduzida capaz de expressar o receptor de ligação ao antígeno, conforme descrito aqui, na presença de um anticorpo que compreende um domínio Fc mutado, em que o receptor de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc mutado, mas não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado.

[053] Em uma forma de realização, a célula alvo é uma célula cancerígena. Em uma forma de realização, a célula alvo expressa um antígeno selecionado a partir do grupo que consiste em FAP, CEA, p95, BCMA, EpCAM, MSLN, MCSP, HER-1, HER-2, HER-3, CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, CD52Flt3, FOLR1, Trop-2, CA-12-5, HLA-DR, MUC-1 (mucina), antígeno A33, PSMA, PSCA, receptor de transferrina, TNC (tenascina) e CA-IX. Em uma forma de realização, a célula alvo expressa um antígeno selecionado a partir do grupo que consiste em antígeno carcinoembrionário (CEA), mesotelina (MSLN), CD20, receptor de folato 1 (FOLR1) e tenascina (TNC).

[054] Em uma forma de realização, os polinucleotídeos ou a célula T transduzida, como aqui descritos, são utilizados para a fabricação de um medicamento. Em uma forma de realização, o medicamento é para o tratamento de uma doença maligna.

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Breve Descrição das Figuras

[055] A Figura 1 representa a arquitetura de receptores de ligação a antígeno exemplificativos de acordo com a invenção. A Figura 1A mostra a arquitetura do formato anti-P329G-scFv-CD28ATD-CD28CSDCD3zSSD e do formato anti-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD. É representado o domínio extracelular que compreende uma porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado que compreende a mutação P329G. A porção de ligação ao antígeno consiste em uma cadeia leve variável e uma pesada variável. Ambas são conectadas por um ligante (Gly4Ser)4. Anexado à cadeia leve variável, um ligante Gly4Ser conecta o domínio de reconhecimento de antígeno ao domínio transmembrana de CD28 (TM), que é fundido ao domínio de sinalização de co-estímulo intracelular (CSD) de CD28, que por sua vez é fundido ao domínio de sinalização de estímulo (SSD) de CD3z. A Figura 1B mostra a arquitetura do formato anti-P329G-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD e do formato antiP329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD. É representado o domínio extracelular que compreende uma porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado que compreende a mutação P329G. A porção de ligação ao antígeno consiste em uma cadeia pesada de Ig e uma cadeia leve de Ig. Anexado à cadeia pesada, um ligante Gly4Ser conecta o domínio de reconhecimento de antígeno ao domínio transmembrana de CD28 que é fundido ao domínio de sinalização de co-estímulo intracelular de CD28 que, por sua vez, é fundido ao domínio de sinalização de estímulo de CD3z.

[056] A Figura 2 representa uma representação esquemática que ilustra a composição modular de construtos de expressão exemplificativos que codificam receptores de ligação a antígeno da invenção. A Figura 2A representa um formato scFv direcionado a P392G. A Figura 2B representa um

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18/293 formato Fab direcionado a P392G.

[057] A Figura 3 representa uma molécula de lgG1 exemplificativa que porta a mutação P329G no domínio Fc que é reconhecida por um receptor de ligação ao antígeno anti-P329G da invenção.

[058] A Figura 4 representa uma representação esquemática de uma IgG ligada ao antígeno associado ao tumor (TAA) que porta a mutação P329G. Este anticorpo pode, por sua vez, ser reconhecido por uma célula T que expressa o receptor de ligação ao antígeno anti-P329G, pelo qual a célula T é ativada.

[059] A Figura 5 mostra uma representação esquemática de um ensaio de células T Jurkat NFAT repórter. A IgG ligada ao TAA que porta a mutação P329G pode ser reconhecida pelo receptor de ligação ao antígeno anti-P329G que expressa a célula T Jurkat NFAT. Esse reconhecimento leva à ativação da célula que pode ser detectada pela medição da luminescência (cps).

[060] A Figura 6 representa o ensaio de células T Jurkat NFAT repórter usando células tumorais SUDHDL4 que expressam CD20 como células alvo. Foi utilizado um anticorpo IgG anti-CD20 (GA101) que porta a mutação P329G, que por um lado reconhece o antígeno associado ao tumor e, por outro lado, é reconhecido pelas células T Jurkat NFAT que expressam receptores de ligação ao antígeno de acordo com a invenção. Na Figura 6A, um conjunto classificado de células T Jurkat NFAT que expressam anti-P329Gds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD foi usado como células efetoras. Na Figura 6B, um conjunto classificado de células T Jurkat NFAT que expressam anti-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD foi usado como células efetoras.

[061] A Figura 7 representa o ensaio de células T Jurkat NFAT repórter usando células tumorais CD20 como células alvo. Foi utilizado um

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19/293 anticorpo IgG anti-CD20 (GA101) que porta a mutação P329G, o qual reconhece o antígeno associado ao tumor e é reconhecido pelas células T Jurkat NFAT que expressam receptores de ligação ao antígeno de acordo com a invenção. Na Figura 7A, o clone único 5 de células T Jurkat NFAT que expressam anti-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD foi usado como células efetoras e células WSUDLCL2 como células tumorais. Na Figura 7B, o clone único 2 de células T Jurkat NFAT que expressam anti-P329G-dsFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD foi usado como células efetoras e células WSUDLCL2 como células tumorais. Na Figura 7C, o clone único 5 de células T Jurkat NFAT que expressam anti-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSDCD3zSSD foi usado como células efetoras e células SUDHL4 como células tumorais. Na Figura 7D, o clone único 2 de células T Jurkat NFAT que expressam anti-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD foi usado como células efetoras e SUDHL4 como células tumorais.

[062] A Figura 8 ilustra o ensaio de células T Jurkat NFAT repórter realizado utilizando células tumorais NIH/3T3-huFAP cl 19 que expressam FAP aderentes como células alvo. Utilizou-se o clone de anticorpo anti-FAP IgG 4B9 que porta a mutação P329G, que o antígeno associado ao tumor e é reconhecido pelas células T Jurkat NFAT que expressam receptores de ligação ao antígeno de acordo com a invenção. A IgG DP47/vk3 que porta a mutação P329G foi incluída como controle de isotipo. Na Figura 8A, um conjunto classificado de células T Jurkat NFAT que expressam anti-P329G-dsFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD foi usado como células efetoras. Na Figura 8B, um conjunto classificado de células T Jurkat NFAT que expressam anti-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD foi usado como células efetoras. Na Figura 8C, um conjunto classificado de células T Jurkat NFAT que expressam anti-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD foi usado como células efetoras. Na Figura 8D, um conjunto classificado de células T

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Jurkat NFAT que expressam anti-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSDCD3zSSD foi usado como células efetoras.

[063] A Figura 9 representa o ensaio de células T Jurkat NFAT repórter usando células tumorais MKN45 que expressam CEA aderentes como células alvo. Foram utilizados o clone A5B7 anti-CEA de IgG ou o clone T84 LCHA anti-CEA de IgG que portam a mutação P329G, os quais reconhecem o antígeno associado ao tumor e são reconhecidos pelas células T Jurkat NFAT que expressam receptores de ligação ao antígeno de acordo com a invenção. Além disso, IgG DP47/vk3 que porta a mutação P329G foi incluída como controle de isotipo. Na Figura 9A e na Figura 9B, um conjunto classificado de células T NFAT que expressam anti-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSDCD3zSSD foi usado como células efetoras. Na Figura 9C e na Figura 9D, um conjunto classificado de células T NFAT que expressam anti-P329G-ds-scFvCD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD foi usado como células efetoras.

[064] A Figura 10 representa o ensaio de células T Jurkat NFAT repórter usando células tumorais MKN45 que expressam CEA aderentes como células alvo. Foram utilizados o clone anti-CEA CH1A1A 98 99 ou o clone antiCEA IgG hMN14 IgG que portam a mutação P329G, os quais reconhecem o antígeno associado ao tumor e são reconhecidos pelas células T Jurkat NFAT que expressam receptores de ligação a antígeno de acordo com a invenção. Além disso, IgG DP47/vk3 que porta a mutação P329G foi incluída como controle de isotipo. Na Figura 10A e na Figura 10B, um conjunto classificado de células T NFAT que expressam anti-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSDCD3zSSD foi usado como células efetoras. Na Figura 10C e na Figura 10D, um conjunto classificado de células T NFAT que expressam anti-P329G-ds-FabCD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD foi utilizado como células efetoras.

[065] A Figura 11 representa o ensaio de células T Jurkat NFAT repórter usando células tumorais CT26TNC cl 19 que expressam TNC

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21/293 aderentes como células alvo. O clone A2B10 anti-TNC de IgG que porta a mutação P329G foi usado como anticorpo IgG que reconhece o antígeno associado ao tumor e é reconhecido pelas células T Jurkat NFAT que expressam receptores de ligação ao antígeno de acordo com a invenção. Além disso, IgG DP47/vk3 que porta a mutação P329G foi incluída como controle de isotipo. Na Figura 11A e na Figura 11B, um conjunto classificado de células T NFAT que expressam anti-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD foi usado como células efetoras. Na Figura 110 e na Figura 11 D, um conjunto classificado de células T NFAT que expressam anti-P329G-ds-Fab-CD28ATDCD28CSD-CD3zSSD foi usado como células efetoras.

[066] A Figura 12A e a Figura 12B representam o ensaio de células T Jurkat NFAT repórter usando células tumorais CT26TNC cl 19 que expressam TNC aderentes como células alvo. Utilizou-se o clone A2B10 antiTNC IgG que porta a mutação P329G, o qual reconhece o antígeno associado ao tumor e é reconhecido pelas células T Jurkat NFAT que expressam receptores de ligação ao antígeno de acordo com a invenção. Além disso, IgG DP47/vk3 que porta a mutação P329G foi incluída como controle de isotipo. Um conjunto classificado de células T Jurkat NFAT que expressam anti-P329GFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD foi usado como células efetoras.

[067] A Figura 13 representa o ensaio de células T Jurkat NFAT repórter usando células tumorais CD20 como células alvo. Um anticorpo antiCD20 IgG (GA101) que porta a mutação P329G e LALA, uma mutação P329G e D265A, a mutação LALA sozinha ou nenhuma mutação foi usado para detectar o antígeno associado ao tumor e é reconhecido pelas células T Jurkat NFAT que expressam receptores de ligação ao antígeno de acordo com a invenção. Na Figura 13A, o conjunto de células de células T Jurkat NFAT que expressam anti-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD foi usado como células efetoras e células SUDHL4 como células tumorais. Na Figura

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13B, o conjunto de células de células T Jurkat NFAT que expressam antiP329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD foi usado como células efetoras e células SUDHL4 como células tumorais.

[068] A Figura 14 representa o ensaio de células T Jurkat NFAT repórter usando células tumorais CD20 como células alvo. Um anticorpo antiCD20 IgG (GA101) que porta a mutação P329G e LALA, uma mutação P329G sozinha, a mutação LALA sozinha ou nenhuma mutação foi utilizado para detectar o antígeno associado ao tumor e é reconhecido pelas células T Jurkat NFAT que expressam receptores de ligação ao antígeno de acordo com a invenção. Na Figura 14A, o conjunto de células de células T Jurkat NFAT que expressam anti-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD foi usado como células efetoras e células SUDHL4 como células tumorais. Na Figura 14B, o conjunto de células de células T Jurkat NFAT que expressam antiP329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD foi usado como células efetoras e células SUDHL4 como células tumorais.

Descrição Detalhada

Definições

[069] Os termos são usados aqui como geralmente usados na técnica, a menos que definido de outra forma a seguir.

[070] Um “receptor Fc de ativação” é um receptor Fc que, após o envolvimento de um domínio Fc de um anticorpo, provoca eventos de sinalização que estimulam a célula portadora do receptor a desempenhar funções efetoras. Os receptores Fc de ativação humanos incluem FcyRllla (CD16a), FcyRI (CD64), FcyRlla (CD32) e FcaRI (CD89).

[071] A citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (“ADCC”) é um mecanismo imune que leva à lise de células alvo revestidas por anticorpos por células efetoras imunes. As células alvo são células às quais os anticorpos ou seus derivados compreendendo uma região

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Fc se ligam especificamente, geralmente através da parte da proteína que é Nterminal à região Fc. Como aqui utilizado, o termo “ADCC reduzida” é definido como uma redução no número de células alvo que são lisadas em um determinado tempo, em uma dada concentração de anticorpo no meio que circunda as células alvo, pelo mecanismo de ADCC definido acima, e/ ou um aumento na concentração de anticorpo no meio circundante às células alvo, necessária para alcançar a lise de um determinado número de células alvo em um determinado tempo, pelo mecanismo de ADCC. A redução na ADCC é relativa à ADCC mediada pelo mesmo anticorpo produzido pelo mesmo tipo de células hospedeiras, usando os mesmos métodos padrão de produção, purificação, formulação e armazenamento (que são conhecidos dos técnicos no assunto), mas que não foi mutado. Por exemplo, a redução em ADCC mediada por um anticorpo compreendendo no seu domínio Fc uma mutação de aminoácido que reduz a ADCC, é relativa à ADCC mediada pelo mesmo anticorpo sem essa mutação de aminoácido no domínio Fc. Os ensaios adequados para medir a ADCC são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, a publicação PCT WO 2006/082515 ou a publicação PCT WO 2012/130831).

[072] Uma “quantidade eficaz” de um agente (por exemplo, um anticorpo) refere-se à quantidade que é necessária para resultar em uma alteração fisiológica na célula ou tecido ao qual é administrada.

[073] “Afinidade” refere-se à força da soma total de interações não covalentes entre um único sítio de ligação de uma molécula (por exemplo, um receptor) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um ligante). A menos que indicado de outro modo, tal como aqui utilizado, “afinidade de ligação” refere-se à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação 1:1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, uma porção de ligação ao antígeno e um antígeno e/ou um receptor e seu ligante). A afinidade de uma molécula X para

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24/293 o seu parceiro Y pode geralmente ser representada pela constante de dissociação (Kd), que é a razão entre as constantes de taxa de dissociação e de associação (k_Off e k_on, respectivamente). Assim, afinidades equivalentes podem compreender constantes de taxa diferentes, desde que a razão das constantes de taxa permaneça a mesma. A afinidade pode ser medida por métodos bem estabelecidos conhecidos na técnica, incluindo aqueles aqui descritos. Um método preferido para medir a afinidade é a Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR) e uma temperatura preferida para a medição é de 25 °C.

[074] O termo “aminoácido” refere-se a aminoácidos de ocorrência natural e sintéticos, bem como análogos de aminoácidos e miméticos de aminoácidos que funcionam de maneira semelhante aos aminoácidos de ocorrência natural. Os aminoácidos de ocorrência natural são aqueles codificados pelo código genético, bem como os aminoácidos que são posteriormente modificados, por exemplo, hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato e O-fosfoserina. Análogos de aminoácidos referem-se a compostos que possuem a mesma estrutura química básica de um aminoácido de ocorrência natural, ou seja, um carbono α que está ligado a um hidrogênio, um grupo carboxila, um grupo amino e um grupo R, por exemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metilsulfônio. Tais análogos têm grupos R modificados (por exemplo, norleucina) ou esqueletos peptídicos modificados, mas mantêm a mesma estrutura química básica que um aminoácido de ocorrência natural. Os miméticos de aminoácidos referem-se a compostos químicos que possuem uma estrutura diferente da estrutura química geral de um aminoácido, mas que funcionam de maneira semelhante a um aminoácido de ocorrência natural. Os aminoácidos podem ser aqui referidos por seus símbolos de três letras comumente conhecidos ou pelos símbolos de uma letra recomendados pela Comissão de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB.

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[075] O termo “mutação de aminoácido”, conforme aqui utilizado, visa abranger substituições, deleções, inserções e modificações de aminoácidos. Qualquer combinação de substituição, deleção, inserção e modificação pode ser feita para chegar ao construto final, desde que o construto final possua as características desejadas, por exemplo, ligação reduzida a um receptor Fc. As deleções e inserções da sequência de aminoácidos incluem deleções e inserções amino- e/ou carboxi-terminais de aminoácidos. Mutações específicas de aminoácidos são substituições de aminoácidos. Com a finalidade de alterar, por exemplo, as características de ligação de uma região Fc, substituições não conservatives de aminoácidos, isto é, substituição de um aminoácido com outro aminoácido com propriedades estruturais e/ ou químicas diferentes, são particularmente preferidas. As substituições de aminoácidos incluem a substituição por aminoácidos que não ocorrem naturalmente ou por derivados de aminoácidos que ocorrem naturalmente dos vinte aminoácidos padrão (por exemplo, 4-hidroxiprolina, 3metil-histidina, ornitina, homoserina, 5-hidroxilisina). Mutações de aminoácidos podem ser geradas usando métodos genéticos ou químicos bem conhecidos na técnica. Os métodos genéticos podem incluir mutagênese sítio-dirigida, PCR, síntese gênica e assim por diante. Está contemplado que métodos de alteração do grupo da cadeia lateral de um aminoácido por métodos diferentes da engenharia genética, tal como modificação química, também podem ser úteis. Várias designações podem ser usadas aqui para indicar a mesma mutação de aminoácido. Por exemplo, uma substituição da prolina na posição 329 do domínio Fc pela glicina pode ser indicada como 329G, G329, G329, P329G ou Pro329Gly.

[076] O termo “anticorpo” é aqui utilizado no sentido mais amplo e engloba várias estruturas de anticorpo, incluindo, mas não limitado a anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais e fragmentos de anticorpos,

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26/293 desde que exibam a atividade de ligação ao antígeno desejada. Por conseguinte, no contexto da presente invenção, o termo anticorpo refere-se a moléculas completas de imunoglobulina, bem como a partes dessas moléculas de imunoglobulina. Além disso, o termo refere-se, como discutido aqui, a moléculas de anticorpo modificadas e/ ou alteradas, em particular a moléculas de anticorpo mutadas. O termo também se refere a anticorpos gerados/ sintetizados de forma recombinante ou sintética. No contexto da presente invenção, o termo anticorpo é utilizado de forma intercambiável com o termo imunoglobulina.

[077] Um “fragmento de anticorpo” refere-se a uma molécula diferente de um anticorpo intacto que compreende uma porção de um anticorpo intacto que se liga ao antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não estão limitados a Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, diabodies, anticorpos lineares, moléculas de anticorpo de cadeia única (por exemplo, scFv) e anticorpos de domínio único. Para uma revisão de certos fragmentos de anticorpos, ver Hudson et al., Nat Med 9, 129134 (2003). Para uma revisão de fragmentos scFv, ver por exemplo Plückthun, em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag, Nova Iorque, pp. 269-315 (1994); ver também WO 93/16185; e as patentes US 5,571,894 e 5,587,458. Diabodies são fragmentos de anticorpo com dois sítios de ligação ao antígeno que podem ser bivalentes ou biespecíficos. Ver, por exemplo, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003); e Hollinger et al., Proc Natl Acad Sei USA 90, 6444-6448 (1993). Triabodies e tetrabodies também são descritos em Hudson et ai., Nat Med 9, 129-134 (2003). Anticorpos de domínio único são fragmentos de anticorpo que compreendem a totalidade ou uma porção do domínio variável da cadeia pesada ou a totalidade ou uma porção do domínio variável da cadeia leve de um anticorpo (Domantis, Inc., Waltham, MA; ver, por

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27/293 exemplo, Patente US 6,248,516 B1). Os fragmentos de anticorpo podem ser produzidos por vias técnicas, incluindo, mas não se limitando a digestão proteolítica de um anticorpo intacto, bem como produção por células hospedeiras recombinantes (por exemplo, E. coliou fago), como aqui descrito.

[078] Como aqui utilizado, o termo “molécula de ligação ao antígeno” refere-se, no seu sentido mais amplo, a uma molécula que se liga especificamente a um determinante antigênico. Exemplos de moléculas de ligação ao antígeno são imunoglobulinas e derivados, por exemplo, seus fragmentos, bem como receptores de ligação ao antígeno e seus derivados.

[079] Como aqui utilizado, o termo “porção de ligação ao antígeno” refere-se a uma molécula polipeptídica que se liga especificamente a um determinante antigênico. Em uma forma de realização, a porção de ligação ao antígeno é capaz de direcionar a entidade à qual está ligada (por exemplo, uma imunoglobulina ou um receptor de ligação ao antígeno) a um sítio alvo, por exemplo, a um tipo específico de célula tumoral ou estroma tumoral portador do determinante antigênico ou a uma imunoglobulina que se liga ao determinante antigênico em uma célula tumoral. Em outra forma de realização, uma porção de ligação ao antígeno é capaz de ativar a sinalização através do seu antígeno alvo, por exemplo, a sinalização é ativada após a ligação de um determinante antigênico a um receptor de ligação ao antígeno em uma célula T. No contexto da presente invenção, as porções de ligação ao antígeno podem ser incluídas em anticorpos e fragmentos dos mesmos, bem como em receptores de ligação ao antígeno e fragmentos dos mesmos, conforme aqui definido mais adiante. As porções de ligação ao antígeno incluem um domínio de ligação ao antígeno compreendendo uma região variável da cadeia pesada da imunoglobulina e uma região variável da cadeia leve da imunoglobulina. Em certas formas de realização, as porções de ligação ao antígeno podem compreender regiões constantes de imunoglobulina, como aqui definido adicionalmente e conhecido

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28/293 na técnica. As regiões constantes da cadeia pesada úteis incluem qualquer um dos cinco isotipos: α, δ, ε, γ ou μ. As regiões constantes da cadeia leve úteis incluem qualquer um dos dois isotipos: κ e λ.

[080] No contexto da presente invenção, o termo “receptor de ligação ao antígeno” refere-se a uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio transmembrana de ancoragem e um domínio extracelular que compreende pelo menos uma porção de ligação ao antígeno. Um receptor de ligação ao antígeno pode ser feito de partes de polipeptídeo de diferentes fontes. Por conseguinte, também pode ser entendido como uma “proteína de fusão” e/ ou uma “proteína quimérica”. Geralmente, as proteínas de fusão são proteínas criadas através da união de dois ou mais genes (ou preferencialmente cDNAs) que originalmente codificaram para proteínas separadas. A tradução deste gene de fusão (ou cDNA de fusão) resulta em um único polipeptídeo, preferencialmente com propriedades funcionais derivadas de cada uma das proteínas originais. As proteínas de fusão recombinantes são criadas artificialmente pela tecnologia de DNA recombinante para uso em pesquisa biológica ou terapêutica. Detalhes adicionais para os receptores de ligação ao antígeno da presente invenção são descritos abaixo. No contexto da presente invenção, um CAR (receptor quimérico de antígeno) é entendido como um receptor de ligação ao antígeno que compreende uma porção extracelular compreendendo uma porção de ligação ao antígeno fundida por uma sequência espaçadora a um domínio transmembrana de ancoragem que é fundido aos domínios de sinalização intracelular de CD3z e CD28.

[081] Um “sítio de ligação ao antígeno” refere-se ao local, isto é, um ou mais resíduos de aminoácidos, de uma molécula de ligação ao antígeno que fornece interação com o antígeno. Por exemplo, o sítio de ligação ao antígeno de um anticorpo ou um receptor de ligação ao antígeno compreende resíduos de aminoácidos das regiões determinantes de complementaridade

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29/293 (CDRs). Uma molécula de imunoglobulina nativa possui tipicamente dois sítios de ligação ao antígeno, uma molécula de Fab ou uma de scFv normalmente possui um único sítio de ligação ao antígeno.

[082] O termo “domínio de ligação ao antígeno” refere-se à parte de um anticorpo ou um receptor de ligação ao antígeno que compreende a área que se liga especificamente a e é complementar a parte ou a totalidade de um antígeno. Um domínio de ligação ao antígeno pode ser fornecido, por exemplo, por um ou mais domínios variáveis de imunoglobulina (também chamados de regiões variáveis). Particularmente, um domínio de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia leve da imunoglobulina (VL) e uma região variável da cadeia pesada da imunoglobulina (VH).

[083] O termo “região variável” ou “domínio variável” refere-se ao domínio de uma cadeia pesada ou leve de imunoglobulina que está envolvida na ligação ao antígeno. Os domínios variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo nativo geralmente possuem estruturas semelhantes, com cada domínio compreendendo quatro regiões estruturais (FRs) conservadas e três regiões hipervariáveis (HVRs). Ver, por exemplo, Kindt et al., Kuby Immunology, 6^a ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007). Um único domínio VH ou VL é geralmente suficiente para conferir especificidade de ligação ao antígeno.

[084] O termo “ATD”, tal como aqui utilizado, refere-se a “domínio transmembrana de ancoragem” que define um trecho de polipeptídeo capaz de integrar-se na(s) membrana(s) celular(es) de uma célula. O ATM pode ser fundido a outros domínios polipeptídicos extracelulares e/ ou intracelulares em que esses domínios polipeptídicos extracelulares e/ ou intracelulares também serão confinados à membrana celular. No contexto dos receptores de ligação ao antígeno da presente invenção, o ATM confere ligação à membrana e confinamento do receptor de ligação ao antígeno da presente invenção. Os

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30/293 receptores de ligação ao antígeno da presente invenção compreendem pelo menos um ATM e um domínio extracelular que compreende uma porção de ligação ao antígeno. Além disso, o ATM pode ser fundido a outros domínios de sinalização intracelular.

[085] O termo “ligação a”, conforme usado no contexto dos receptores de ligação ao antígeno da presente invenção, define uma ligação (interação) de um “sítio de interação do antígeno” e um antígeno entre si. O termo “sítio de interação do antígeno” define, de acordo com os receptores de ligação ao antígeno da presente invenção, um motivo de um polipeptídeo que mostra a capacidade de interação específica com um antígeno específico ou um grupo específico de antígenos (por exemplo, domínios Fc mutados). A referida ligação/ interação também é entendida para definir um “reconhecimento específico”. O termo “reconhecimento específico” significa, de acordo com esta invenção, que o receptor de ligação ao antígeno é capaz de interagir com e/ ou se ligar especificamente a uma molécula modificada como aqui definido, enquanto a molécula não modificada não é reconhecida. A porção de ligação ao antígeno de um receptor de ligação ao antígeno pode reconhecer, interagir e/ ou se ligar a diferentes epítopos na mesma molécula. Este termo refere-se à especificidade do receptor de ligação ao antígeno, isto é, à sua capacidade de distinguir entre as regiões específicas de uma molécula modificada, isto é, um domínio Fc mutado, como aqui definido. A interação específica do sítio de interação do antígeno com o seu antígeno específico pode resultar em uma iniciação de um sinal, por exemplo, devido à indução de uma alteração da conformação do polipeptídeo que compreende o antígeno, uma oligomerização do polipeptídeo que compreende o antígeno, uma oligomerização do receptor de ligação ao antígeno, etc. Assim, um motivo específico na sequência de aminoácidos do sítio de interação do antígeno e o antígeno se ligam um ao outro como resultado de sua estrutura primária,

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31/293 secundária ou terciária, bem como o resultado de modificações secundárias da referida estrutura. Por conseguinte, o termo ‘ligação a’ não se refere apenas a um epítopo linear, mas também pode se referir a um epítopo conformacional, um epítopo estrutural ou um epítopo descontínuo que consiste em duas regiões das moléculas alvo ou partes das mesmas. No contexto desta invenção, um epítopo conformacional é definido por duas ou mais sequências de aminoácidos discretas separadas na sequência primária que se reúne na superfície da molécula quando o polipeptídeo se dobra na proteína nativa (Sela, Science 166 (1969), 1365 e Laver, Cell 61 (1990), 553-536). Além disso, o termo “ligação a” é usado de forma intercambiável no contexto da presente invenção com o termo “interagindo com”. A capacidade da porção de ligação ao antígeno (por exemplo, um domínio Fab ou scFv) de um receptor de ligação ao antígeno ou um anticorpo de se ligar a um determinante antigênico alvo específico pode ser medida por meio de um ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) ou outras técnicas familiares a um técnico no assunto, por exemplo, técnica de ressonância plasmônica de superfície (SPR) (analisada em um instrumento BIAcore) (Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), e ensaios de ligação tradicionais (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). Em uma forma de realização, a extensão da ligação de uma porção de ligação ao antígeno a uma proteína não relacionada é inferior a cerca de 10% da ligação da porção de ligação ao antígeno ao antígeno alvo, conforme medido, em particular, por SPR. Em certas formas de realização, uma porção de ligação ao antígeno que se liga ao antígeno alvo tem uma constante de dissociação (Kd) de < 1 μΜ, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM, ou < 0,001 nM (por exemplo, 10’⁸ M ou menos, por exemplo, de 10’⁸ M a 10’¹³ M, por exemplo, de 10’⁹ M a 10’¹³ Μ). O termo “ligação específica”, conforme usado de acordo com a presente invenção, significa que as moléculas da invenção não reagem ou não reagem essencialmente de forma cruzada com (poli) peptídeos de

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32/293 estruturas semelhantes, isto é, com um domínio Fc parental não mutado em que um receptor de ligação ao antígeno da invenção é capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado. Por conseguinte, o receptor de ligação ao antígeno da invenção se liga especificamente a/ interage com um domínio Fc mutado. A reatividade cruzada de um painel de construtos sob investigação pode ser testada, por exemplo, avaliando a ligação de um painel de porções de ligação ao antígeno em condições convencionais (ver, por exemplo, Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988) e Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1999)) ao domínio Fc mutado de interesse, bem como ao domínio Fc parental não mutado. Somente aqueles construtos (isto é, fragmentos Fab, scFvs e similares) que se ligam ao domínio Fc mutado de interesse, mas não se ligam ou não se ligam essencialmente a um domínio Fc parental não mutado são considerados específicos para o domínio Fc mutado de interesse e selecionados para estudos adicionais de acordo com o método aqui fornecido. Esses métodos podem compreender, entre outros, estudos de ligação, estudos de bloqueio e competição com domínios Fc estruturalmente e/ ou funcionalmente relacionados. Os estudos de ligação também compreendem análise FACS, ressonância plasmônica de superfície (SPR, por exemplo, com BIAcore®), ultracentrifugação analítica, calorimetria de titulação isotérmica, anisotropia de fluorescência, espectroscopia de fluorescência ou por ensaios de ligação de ligantes radiomarcados.

[086] O termo “CDR”, conforme empregado aqui, refere-se a “região determinante de complementaridade”, que é bem conhecida na técnica. As CDRs são partes de imunoglobulinas ou receptores de ligação ao antígeno que determinam a especificidade das referidas moléculas e fazem contato com um ligante específico. As CDRs são a parte mais variável da molécula e contribuem para a diversidade de ligação ao antígeno dessas moléculas.

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Existem três regiões CDR: CDR1, CDR2 e CDR3 em cada domínio V. CDR-H representa uma região CDR de uma cadeia pesada variável e CDR-L refere-se a uma região CDR de uma cadeia leve variável. VH significa a cadeia pesada variável e VL significa a cadeia leve variável. As regiões CDR de uma região derivada de Ig podem ser determinadas como descrito em “Kabat” (“Sequences of Proteins of Immunological Interest’, 5- edição. Publicação NIH n^s 91-3242, Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA (1991); Chothia J Mol. Biol. 196 (1987), 901-917) ou “Chothia” (Nature 342 (1989), 877-883).

[087] O termo “CD3z” refere-se à cadeia zeta da glicoproteina CD3 da superfície das células T, também conhecida como “cadeia zeta T3 do receptor de células T” e “CD247”.

[088] O termo “receptor quimérico de antígeno” ou “receptor quimérico” ou “CAR” refere-se a um receptor de ligação ao antígeno constituído por uma porção extracelular de uma porção de ligação ao antígeno (por exemplo, um domínio de anticorpo de cadeia única) fundido por uma sequência espaçadora aos domínios de sinalização intracelular de CD3z e CD28. A invenção fornece adicionalmente receptores de ligação ao antígeno em que a porção de ligação ao antígeno é um fragmento Fab ou um crossFab. O termo “CAR” é entendido em sua forma mais ampla como compreendendo receptores de ligação ao antígeno constituídos por uma porção extracelular que compreende uma porção de ligação ao antígeno fundida a CD3z e seu fragmento e CD28 e seus fragmentos, opcionalmente através de um ou vários ligantes peptídicos.

[089] A “classe” de um anticorpo ou imunoglobulina refere-se ao tipo de domínio constante ou região constante possuído por sua cadeia pesada. Existem cinco classes principais de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias delas podem ser divididas adicionalmente em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG-ι, lgG2, IgGa, lgG4, IgAi e lgA2. Os domínios

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34/293 constantes da cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são chamados α, δ, ε, γ e μ, respectivamente.

[090] Por “molécula de Fab cruzada” (também denominada “CrossFab” ou “fragmento Fab cruzado”) entende-se uma molécula de Fab em que as regiões variáveis ou as regiões constantes da cadeia pesada e leve de Fab são trocadas, ou seja, o fragmento crossFab compreende um cadeia peptídica composta pela região variável da cadeia leve e pela região constante da cadeia pesada e uma cadeia peptídica composta pela região variável da cadeia pesada e pela região constante da cadeia leve. Para maior clareza, em um fragmento crossFab, em que as regiões variáveis da cadeia leve de Fab e da cadeia pesada de Fab são trocadas, a cadeia peptídica que compreende a região constante da cadeia pesada é aqui referida como a cadeia pesada da molécula de Fab cruzada. Por outro lado, em um fragmento crossFab em que as regiões constantes da cadeia leve de Fab e da cadeia pesada de Fab são trocadas, a cadeia peptídica que compreende a região variável da cadeia pesada é aqui referida como a cadeia pesada do fragmento crossFab. Por conseguinte, um fragmento crossFab compreende uma cadeia pesada ou leve composta pelas regiões variável da cadeia pesada e constante da cadeia leve (VH-CL) e uma cadeia pesada ou leve composta pela região variável da cadeia leve e pela região constante da cadeia pesada (VL-CH1). Em contraste, uma molécula de “Fab convencional” significa uma molécula de Fab em seu formato natural, ou seja, compreendendo uma cadeia pesada composta pelas regiões variável e constante da cadeia pesada (VH-CH1) e uma cadeia leve composta pelas regiões variável e constante da cadeia leve (VL-CL).

[091] O termo “CSD”, conforme aqui utilizado, refere-se ao domínio de sinalização de co-estímulo.

[092] O termo “funções efetoras” refere-se àquelas atividades biológicas atribuíveis à região Fc de um anticorpo, que variam com o isotipo do

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35/293 anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpo incluem: ligação a C1q e citotoxicidade dependente de complemento (CDC), ligação ao receptor Fc, citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC), fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP), secreção de citocinas, captação de antígeno mediada por complexos imunes por células apresentadoras de antígeno, regulação negativa de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de célula B) e ativação de células B.

[093] Como aqui utilizado, os termos “projetar”, “projetado”, “projetando” são considerados como incluindo qualquer manipulação do esqueleto peptídico ou as modificações pós-traducionais de um polipeptídeo recombinante ou de ocorrência natural ou um fragmento do mesmo. Projetar inclui modificações da sequência de aminoácidos, do padrão de glicosilação ou do grupo da cadeia lateral de aminoácidos individuais, bem como combinações dessas abordagens.

[094] O termo “cassete de expressão” refere-se a um polinucleotídeo gerado de forma recombinante ou sintética, com uma série de elementos de ácido nucleico especificados que permitem a transcrição de um ácido nucleico particular em uma célula alvo. O cassete de expressão recombinante pode ser incorporado em um plasmídeo, cromossomo, DNA mitocondrial, DNA de plastídeo, vírus ou fragmento de ácido nucleico. Tipicamente, a porção do cassete de expressão recombinante de um vetor de expressão inclui, entre outras sequências, uma sequência de ácido nucleico a ser transcrita e um promotor. Em certas formas de realização, o cassete de expressão da invenção compreende sequências polinucleotídicas que codificam moléculas de ligação ao antígeno da invenção ou fragmentos das mesmas.

[095] Uma “molécula de Fab” refere-se a uma proteína que consiste no domínio VH e CH1 da cadeia pesada (a “cadeia pesada de Fab”) e

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36/293 no domínio VL e CL da cadeia leve (a “cadeia leve de Fab”) de uma molécula de ligação ao antígeno.

[096] O termo “domínio Fc” ou “região Fc” é aqui utilizado para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina que contém pelo menos uma porção da região constante. O termo inclui regiões Fc de sequência nativa e regiões Fc variantes. Embora os limites da região Fc de uma cadeia pesada de IgG possam variar um pouco, a região Fc da cadeia pesada de IgG humana é geralmente definida para se estender de Cys226, ou de Pro230, até a carboxila-terminal da cadeia pesada. No entanto, a lisina Cterminal (Lys447) da região Fc pode ou não estar presente. A menos que especificado de outra forma aqui, a numeração de resíduos de aminoácidos na região Fc ou região constante está de acordo com o sistema de “numeração EU”, também chamado de índice EU, como descrito em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. Uma subunidade de urn domínio Fc, como aqui utilizado, refere-se a um dos dois polipeptideos que formam o domínio Fc dimérico, isto é, um polipeptídeo compreendendo regiões constantes C-terminais de uma cadeia pesada de imunoglobulina, capaz de auto-associação estável. Por exemplo, uma subunidade de um domínio Fc de IgG compreende um domínio constante de IgG CH2 e um de IgG CH3.

[097] “Estrutura” (“Framework’) ou “FR” refere-se a resíduos de domínio variável diferentes dos resíduos da região hipervariável (HVR). A FR de um domínio variável geralmente consiste em quatro domínios FR: FR1, FR2, FR3 e FR4. Por conseguinte, as sequências HVR e FR geralmente aparecem na seguinte ordem em VH (ou VL): FR1-H1 (L1)-FR2-H2(L2)-FR3H3(L3)-FR4.

[098] O termo “anticorpo completo” denota um anticorpo que consiste em duas “cadeias pesadas de anticorpo completo” e duas “cadeias

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37/293 leves de anticorpo completo”. Uma “cadeia pesada de anticorpo completo” é um polipeptídeo que consiste na direção do N-terminal ao C-terminal de um domínio variável da cadeia pesada do anticorpo (VH), um domínio constante 1 da cadeia pesada do anticorpo (CH1), uma região de dobradiça (hinge) do anticorpo (HR), um domínio constante 2 da cadeia pesada do anticorpo (CH2) e um domínio constante 3 da cadeia pesada do anticorpo (CH3), abreviado como VH-CH1-HR-CH2-CH3; e opcionalmente um domínio constante 4 da cadeia pesada do anticorpo (CH4) no caso de um anticorpo da subclasse IgE. Preferencialmente, a “cadeia pesada de anticorpo completo” é um polipeptídeo que consiste na direção do N-terminal ao C-terminal de VH, CH1, HR, CH2 e CH3. Uma “cadeia leve de anticorpo completo” é um polipeptídeo que consiste na direção do N-terminal ao C-terminal de um domínio variável da cadeia leve do anticorpo (VL) e um domínio constante da cadeia leve do anticorpo (CL), abreviado como VL-CL. O domínio constante da cadeia leve do anticorpo (CL) pode ser k (kappa) ou λ (lambda). As duas cadeias de anticorpo completo são ligadas através de ligações dissulfeto inter-polipeptídeos entre o domínio CL e o domínio CH1 e entre as regiões de dobradiça das cadeias pesadas de anticorpo completo. Exemplos de anticorpos dobradiça típicos são anticorpos naturais como IgG (por exemplo, IgG 1 e lgG2), IgM, IgA, IgD e IgE.) Os anticorpos completos usados de acordo com a invenção podem ser de uma única espécie, por exemplo, humana, ou podem ser anticorpos quimerizados ou humanizados. Em algumas formas de realização, os anticorpos completos usados de acordo com a invenção, isto é, um anticorpo terapêutico que compreende um domínio Fc mutado, compreendem dois sítios de ligação ao antígeno, cada um formado por um par de VH e VL, que se ligam especificamente ao mesmo antígeno. Em outras formas de realização, os anticorpos completos utilizados de acordo com a invenção compreendem dois sítios de ligação ao antígeno, cada um formado por um par de VH e VL, em

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38/293 que os dois sítios de ligação ao antígeno se ligam a antígenos diferentes, por exemplo, em que os anticorpos são biespecíficos. O C-terminal da cadeia pesada ou leve do referido anticorpo completo denota o último aminoácido no C-terminal da referida cadeia pesada ou leve.

[099] Por “fundido” entende-se que os componentes (por exemplo, um Fab e um domínio transmembrana) estão ligados por ligações peptídicas, diretamente ou através de um ou mais ligantes peptídicos.

[0100]0s termos “célula hospedeira”, “linhagem celular hospedeira” e “cultura de células hospedeiras” são utilizados de forma intercambiável e referem-se a células nas quais foi introduzido ácido nucleico exógeno, incluindo a progênie de tais células. As células hospedeiras incluem “transformantes” e “células transformadas”, que incluem a célula transformada primária e a progênie derivada a partir da mesma sem ter em conta o número de passagens. A progênie pode não ser completamente idêntica no conteúdo de ácido nucléico a uma célula-mãe, mas pode conter mutações. A progênie mutante que tem a mesma função ou atividade biológica como tríada ou selecionada na célula originalmente transformada está aqui incluída. Uma célula hospedeira é qualquer tipo de sistema celular que pode ser utilizado para gerar um anticorpo utilizado de acordo com a presente invenção. As células hospedeiras incluem células cultivadas, por exemplo células cultivadas em mamíferos, tais como células células CHO, células BHK, células NSO, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de camundongo P3X63, células PER, células PER.C6 ou células de hibridoma, células de levedura, células de insetos e células vegetais, para citar apenas algumas, mas também células compreendidas em um animal transgênico, planta transgênica ou vegetal ou tecido animal cultivado.

[0101]O termo “região hipervariável” ou “HVR”, como aqui

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39/293 utilizado, refere-se a cada uma das regiões de um domínio variável de anticorpo que são hipervariáveis em sequência e/ ou formam alças estruturalmente definidas (“alças hipervariáveis”). Geralmente, os anticorpos nativos de quatro cadeias compreendem seis HVRs; três no VH (H1, H2, H3) e três no VL (L1, L2, L3). As HVRs geralmente compreendem resíduos de aminoácidos das alças hipervariáveis e/ou das regiões determinantes de complementaridade (CDRs), sendo esta última de maior variabilidade de sequência e/ ou envolvida no reconhecimento de antígeno. Com exceção da CDR1 no VH, as CDRs geralmente compreendem os resíduos de aminoácidos que formam as alças hipervariáveis. As regiões hipervariáveis (HVRs) também são referidas como regiões determinantes de complementaridade (CDRs), e estes termos são aqui utilizados de forma intercambiável em referência a porções da região variável que formam as regiões de ligação ao antígeno. Esta região particular foi descrita por Kabat et al., Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983) e por Chothia et al., J. Mol Biol 196:901-917 (1987), em que as definições incluem sobreposição ou subconjuntos de resíduos de aminoácidos quando comparados entre si. No entanto, a aplicação de qualquer uma das definições para se referir a uma CDR de um anticorpo e/ ou um receptor de ligação ao antígeno ou variantes do mesmo, destina-se a estar dentro do escopo do termo como definido e usado aqui. Os resíduos de aminoácidos apropriados que abrangem as CDRs, conforme definido por cada uma das referências citadas acima, são apresentados abaixo na Tabela 1 como uma comparação. Os números exatos de resíduos que abrangem uma CDR específica variam de acordo com a sequência e o tamanho da CDR. Os técnicos no assunto podem determinar rotineiramente quais resíduos compreendem uma CDR específica, dada a sequência de aminoácidos da região variável do

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40/293 anticorpo.

Tabela 1. Definições de CDR¹

CDR	Kabat	Chothia	AbM²
VhCDRI	31-35	26-32	26-35
Vh CDR2	50-65	52-58	50-58
Vh CDR3	95-102	95-102	95-102
VlCDRI	24-34	26-32	24-34
VlCDR2	50-56	50-52	50-56
VlCDR3	89-97	91-96	89-97

¹ A numeração de todas as definições de CDR na Tabela 1 está de acordo com as convenções de numeração estabelecidas por Kabat et al. (ver abaixo).

² “AbM” com um “b” minúsculo, conforme usado na Tabela 1, refere-se às CDRs conforme definidas pelo software de modelagem de anticorpos “AbM” da Oxford Molecular.

[0102] Kabat etal. também definiu um sistema de numeração para sequências de regiões variáveis que é aplicável a qualquer anticorpo. Um técnico no assunto pode atribuir inequivocamente esse sistema de numeração de Kabat a qualquer sequência de região variável, sem depender de quaisquer dados experimentais além da própria sequência. Como aqui utilizado, “numeração Kabat” refere-se ao sistema de numeração estabelecido por Kabat et al., Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA, “Sequence of Proteins of Immunological Interest” (1983). A menos que especificado de outro modo, as referências à numeração de posições específicas de resíduos de aminoácidos em uma região variável da porção de ligação ao antígeno estão de acordo com o sistema de numeração de Kabat. As sequências polipeptídicas da listagem de sequências não são numeradas de acordo com o

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41/293 sistema de numeração Kabat. No entanto, é de conhecimento comum da técnica converter a numeração das sequências da Listagem de Sequências em numeração Kabat.

[0103] Um “indivíduo” ou “sujeito” é um mamífero. Os mamíferos incluem, mas não se limitam a animais domesticados (por exemplo, vacas, ovelhas, gatos, cães e cavalos), primatas (por exemplo, humanos e primatas não humanos, tais como macacos), coelhos e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). Particularmente, o indivíduo ou sujeito é um humano.

[0104] Por molécula ou polinucleotídeo de “ácido nucleico isolado”, entende-se uma molécula de ácido nucleico, DNA ou RNA, que foi removida de seu ambiente nativo. Por exemplo, um polinucleotídeo recombinante que codifica um polipeptídeo contido em um vetor é considerado isolado para os fins da presente invenção. Outros exemplos de um polinucleotídeo isolado incluem polinucleotídeos recombinantes mantidos em células hospedeiras heterólogas ou polinucleotídeos purificados (parcialmente ou substancialmente) em solução. Um polinucleotídeo isolado inclui uma molécula de polinucleotídeo contida nas células que normalmente contêm a molécula de polinucleotídeo, mas a molécula de polinucleotídeo está presente de forma extracromossômica ou em um local cromossômico que é diferente da sua localização cromossômica natural. Moléculas de RNA isoladas incluem transcritos de RNA in vivo ou in vitro da presente invenção, bem como formas de fita positiva e negativa e formas de fita dupla. Polinucleotídeos ou ácidos nucleicos isolados, de acordo com a presente invenção, incluem ainda essas moléculas produzidas sinteticamente. Além disso, um polinucleotídeo ou um ácido nucleico pode ser ou pode incluir um elemento regulador, tal como um promotor, um sítio de ligação ao ribossomo ou um terminador de transcrição.

[0105] Por um ácido nucleico ou polinucleotídeo que possui uma sequência de nucleotídeos pelo menos, por exemplo, 95% “idêntica” a uma

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42/293 sequência de nucleotídeos de referência da presente invenção, entende-se que a sequência de nucleotídeos do polinucleotídeo é idêntica à sequência de referência, exceto que a a sequência polinucleotídica pode incluir até cinco mutações pontuais por cada 100 nucleotídeos da sequência nucleotídica de referência. Em outras palavras, para obter um polinucleotídeo com uma sequência de nucleotídeos pelo menos 95% idêntica a uma sequência de nucleotídeos de referência, até 5% dos nucleotídeos na sequência de referência podem ser deletados ou substituídos com outro nucleotídeo ou um número de nucleotídeos até 5% do total de nucleotídeos na sequência de referência pode ser inserido na sequência de referência. Essas alterações da sequência de referência podem ocorrer nas posições 5' ou 3' terminal da sequência nucleotídica de referência ou em qualquer lugar entre essas posições terminais, intercaladas individualmente entre resíduos na sequência de referência ou em um ou mais grupos contíguos na sequência de referência. Por uma questão prática, se qualquer sequência polinucleotídica específica é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência nucleotídica da presente invenção, pode ser determinada convencionalmente usando programas de computador conhecidos, tais como os discutidos abaixo para polipeptídeos (por exemplo, ALIGN-2).

[0106] Por um “polipeptídeo isolado” ou uma variante ou derivado do mesmo, entende-se um polipeptídeo que não está em seu ambiente natural. Nenhum nível específico de purificação é necessário. Por exemplo, um polipeptídeo isolado pode ser removido de seu ambiente nativo ou natural. Os polipeptídeos e proteínas produzidos recombinantemente expressos nas células hospedeiras são considerados isolados para os fins da invenção, assim como os polipeptídeos nativos ou recombinantes que foram separados, fracionados ou parcialmente ou substancialmente purificados por qualquer técnica adequada.

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[0107] “Porcentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos” em relação a uma sequência de polipeptídeo de referência é definida como a porcentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácido na sequência polipeptídica de referência, após o alinhamento das sequências e introdução de intervalos, se necessário, para atingir a porcentagem máxima de identidade de sequência, e não considerando quaisquer substituições conservatives como parte da identidade da sequência O alinhamento para fins de determinação da porcentagem de identidade de sequência de aminoácidos pode ser conseguido de várias formas que estão dentro da habilidade na técnica, por exemplo, utilizando software de computador disponível publicamente tal como o software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Os técnicos no assunto podem determinar parâmetros apropriados para alinhar sequências, incluindo quaisquer algoritmos necessários para atingir o máximo alinhamento ao longo de toda a extensão das sequências que estão sendo comparadas. Para os propósitos aqui descritos, no entanto, os valores da % de identidade de sequência de aminoácidos são gerados usando o programa de computador para comparação de sequências ALIGN-2. O programa de computador para comparação de sequência ALIGN-2 foi de autoria da Genentech, Inc., e o código fonte foi depositado com documentação do usuário no Escritório de direitos autorais dos EUA, Washington D.C., 20559, onde está registrado sob o n^s. de registro de direitos autorais dos EUA TXU510087. O programa ALIGN-2 está disponível publicamente na Genentech, Inc., São Francisco do Sul, Califórnia, ou pode ser compilado a partir do código fonte. O programa ALIGN2 deve ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX, incluindo o UNIX digital V4.0D. Todos os parâmetros de comparação de sequência são definidos pelo programa ALIGN-2 e não variam. Em situações em que ALIGN-2 é empregado para comparações de sequências de aminoácidos, a % de

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44/293 identidade da sequência de aminoácidos de uma determinada sequência de aminoácidos A para, com ou contra uma dada sequência de aminoácidos B (que pode ser expressa alternativamente como uma determinada sequência de aminoácido A que possui ou compreende uma determinada % de identidade de sequência de aminoácidos para, com ou contra uma dada sequência de aminoácidos B) é calculada da seguinte forma:

100 vezes a fração X/ Y, em que X é o número de resíduos de aminoácidos classificados como correspondências idênticas pelo programa de alinhamento de sequência ALIGN-2 no alinhamento de A e B desse programa e onde Y é o número total de resíduos de aminoácidos em B. Será apreciado que, onde o comprimento da sequência de aminoácidos A não é igual ao comprimento da sequência de aminoácidos B, a % de identidade de sequência de aminoácidos de A para B não será igual à % de identidade de sequência de aminoácidos de B para A. A menos que seja especificado de outra forma, todos os valores de % de identidade de sequência de aminoácidos aqui utilizados são obtidos como descrito no parágrafo imediatamente anterior usando o programa de computador ALIGN-2.

[0108] O termo “molécula de ácido nucleico” refere-se à sequência de bases que compreende bases de purina e pirimidina que são compostas por polinucleotídeos, por meio do que as referidas bases representam a estrutura primária de uma molécula de ácido nucleico. Aqui, o termo molécula de ácido nucleico inclui DNA, cDNA, DNA genômico, RNA, formas sintéticas de DNA e polímeros mistos que compreendem duas ou mais dessas moléculas. Além disso, o termo molécula de ácido nucleico inclui ambos as fitas, senso e antisenso. Além disso, a molécula de ácido nucleico aqui descrita pode conter bases nucleotídicas não naturais ou derivatizadas, como será prontamente apreciado pelos técnicos no assunto.

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[0109] O termo “bula” é usado para se referir a instruções habitualmente incluídas em embalagens comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, uso, dosagem, administração, terapia combinada, contraindicações e / ou avisos referentes ao uso de tais produtos terapêuticos.

[0110] O termo “composição farmacêutica” refere-se a uma preparação que é de forma a permitir que a atividade biológica de um ingrediente ativo contido na mesma seja eficaz e que não contém componentes adicionais que são inaceitavelmente tóxicos para um sujeito ao qual a composição seria administrada. Uma composição farmacêutica geralmente compreende um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis.

[0111] Um “veículo farmaceuticamente aceitável” refere-se a um ingrediente em uma composição farmacêutica, diferente de um ingrediente ativo, que é não tóxico para um sujeito. Um veículo farmaceuticamente aceitável inclui, mas não está limitado a um tampão, excipiente, estabilizante ou conservante.

[0112] Como usado aqui, o termo “polipeptídeo” refere-se a uma molécula composta por monômeros (aminoácidos) linearmente ligados por ligações amida (também conhecidas como ligações peptídicas). O termo polipeptídeo refere-se a qualquer cadeia de dois ou mais aminoácidos e não se refere a um comprimento específico do produto. Assim, peptídeos, dipeptídeos, tripeptídeos, oligopeptídeos, proteínas, cadeia de aminoácidos ou qualquer outro termo usado para se referir a uma cadeia de dois ou mais aminoácidos, estão incluídos na definição de polipeptídeo, e o termo polipeptídeo pode ser usado em vez de, ou de forma intercambiável com qualquer um desses termos. O termo polipeptídeo também se refere aos produtos de modificações pósexpressão do polipeptídeo, incluindo, sem limitação, glicosilação, acetilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos de proteção/ bloqueio

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46/293 conhecidos, divagem proteolítica ou modificação por aminoácidos que não ocorrem naturalmente. Um polipeptídeo pode ser derivado de uma fonte biológica natural ou produzido por tecnologia recombinante, mas não é necessariamente traduzido de uma sequência de ácido nucleico designada. Pode ser gerado de qualquer maneira, inclusive por síntese química. Um polipeptídeo da invenção pode ter um tamanho de cerca de 3 ou mais, 5 ou mais, 10 ou mais, 20 ou mais, 25 ou mais, 50 ou mais, 75 ou mais, 100 ou mais, 200 ou mais, 500 ou mais, 1.000 ou mais, ou 2.000 ou mais aminoácidos. Os polipeptídeos podem ter uma estrutura tridimensional definida, embora não tenham necessariamente essa estrutura. Polipeptídeos com uma estrutura tridimensional definida são referidos como dobrados, e polipeptídeos que não possuem uma estrutura tridimensional definida, mas podem adotar um grande número de conformações diferentes e são chamados de desdobrados.

[0113] O termo “polinucleotídeo” refere-se a uma molécula ou construto de ácido nucleico isolado, por exemplo, RNA mensageiro (mRNA), RNA derivado de vírus ou DNA de plasmídeo (pDNA). Um polinucleotídeo pode compreender uma ligação fosfodiéster convencional ou uma ligação não convencional (por exemplo, uma ligação amida, tal como a encontrada em ácidos nucleicos peptídicos (PNA)). O termo “molécula de ácido nucleico” refere-se a qualquer um ou mais segmentos de ácido nucleico, por exemplo, fragmentos de DNA ou RNA, presentes em um polinucleotídeo.

[0114] “Ligação reduzida”, por exemplo ligação reduzida a um receptor Fc, refere-se a uma diminuição na afinidade para a respectiva interação, conforme medido, por exemplo, por SPR. Para maior clareza, o termo inclui também redução da afinidade a zero (ou abaixo do limite de detecção do método analítico), isto é, abolição completa da interação. Por outro lado, “ligação aumentada” refere-se a um aumento na afinidade de ligação para a respectiva interação.

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[0115] O termo “sequência reguladora” refere-se a sequências de DNA, que são necessárias para efetuar a expressão de sequências de codificação às quais estão ligadas. A natureza de tais sequências de controle difere dependendo do organismo hospedeiro. Em procariotos, as sequências de controle geralmente incluem promotor, sítio de ligação ribossômica e terminadores. Em eucariotos, as sequências de controle geralmente incluem promotores, terminadores e, em alguns casos, intensificadores, transativadores ou fatores de transcrição. O termo “sequência de controle” pretende incluir, no mínimo, todos os componentes cuja presença é necessária para a expressão e também pode incluir componentes vantajosos adicionais.

[0116] Como usado aqui, o termo “cadeia única” refere-se a uma molécula que compreende monômeros de aminoácidos linearmente ligados por ligações peptídicas. Em certas formas de realização, uma das porções de ligação ao antígeno é um fragmento scFv, isto é, um domínio VH e um domínio VL conectados por um ligante peptídico. Em certas formas de realização, uma das porções de ligação ao antígeno é uma molécula de Fab de cadeia única, isto é, uma molécula de Fab em que a cadeia leve de Fab e a cadeia pesada de Fab são conectadas por um ligante peptídico para formar uma única cadeia peptídica. Em uma forma de realização específica, o C-terminal da cadeia leve de Fab é conectado ao N-terminal da cadeia pesada de Fab na molécula de Fab de cadeia única.

[0117] O termo “SSD”, conforme usado aqui, refere-se ao domínio de sinalização de estímulo.

[0118] Conforme usado neste documento, “tratamento” (e suas variações gramaticais como “tratar” ou “tratando”) refere-se à intervenção clínica em uma tentativa de alterar o curso natural de uma doença no indivíduo a ser tratado, e pode ser realizada tanto para profilaxia quanto durante o curso da patologia clínica. Os efeitos desejáveis do tratamento incluem, mas não se

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48/293 limitam a prevenir a ocorrência ou recorrência da doença, alívio dos sintomas, diminuição de quaisquer consequências patológicas diretas ou indiretas da doença, prevenção de metástase, diminuição da taxa de progressão da doença, melhoria ou paliação do estado da doença e remissão ou melhora do prognóstico. Em algumas formas de realização, as células que expressam os receptores de ligação ao antígeno da invenção são utilizadas em conjunto com anticorpos terapêuticos que compreendem um domínio Fc mutado para retardar o desenvolvimento de uma doença ou diminuir a progressão de uma doença.

[0119] Como aqui utilizado, o termo “determinante antigênico alvo” é sinônimo de “antígeno alvo”, “epítopo alvo” e “antígeno de célula alvo” e refere-se a um sítio (por exemplo, um trecho contíguo de aminoácidos ou uma configuração conformacional feita de diferentes regiões de aminoácidos não contíguos) em uma macromolécula polipeptídica à qual um anticorpo se liga, formando um complexo de porção de ligação ao antígeno-antígeno. Determinantes antigênicos úteis podem ser encontrados, por exemplo, nas superfícies de células tumorais, nas superfícies de células infectadas por vírus, nas superfícies de outras células doentes, na superfície das células imunes, livres em soro sanguíneo e/ou na matriz extracelular (ECM). As proteínas mencionadas aqui como antígenos (por exemplo, CD20, CEA, FAP, TNC) podem ser qualquer forma nativa das proteínas de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos tais como primatas (por exemplo, humanos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), salvo indicação em contrário. Em uma forma de realização particular, o antígeno alvo é uma proteína humana. Onde aqui é feita referência a uma proteína alvo específica, o termo abrange a proteína alvo não processada “completa”, bem como qualquer forma da proteína alvo resultante do processamento na célula alvo. O termo também abrange variantes da proteína alvo de ocorrência natural, por exemplo,

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49/293 variantes de emenda (splice) ou variantes alélicas. Proteínas alvo humanas exemplificativas úteis como antígenos incluem, mas não estão limitadas a: CD20, CEA, FAP, TNC, MSLN, FolR1, HER1 e HER2. A capacidade de um anticorpo de se ligar a um determinante antigênico alvo específico pode ser medida por meio de um ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) ou outras técnicas familiares a um técnico no assunto, por exemplo, técnica de ressonância plasmônica de superfície (SPR) (analisada em um instrumento BIAcore) (Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), e ensaios de ligação tradicionais (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). Em uma forma de realização, a extensão da ligação do anticorpo a uma proteína não relacionada é inferior a cerca de 10% da ligação do anticorpo ao antígeno alvo, conforme medido, por exemplo, por SPR. Em certas formas de realização, 0 anticorpo se liga ao antígeno alvo com uma constante de dissociação de afinidade (Kd) de < 1 μΜ, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM, ou < 0,001 nM (por exemplo, 10’⁸ M ou menos, por exemplo, de 10’⁸ M a 10’¹³ M, por exemplo, de IO’⁹ M a 10’¹³ M).

[0120] “Anticorpos que compreendem um domínio Fc mutado” de acordo com a presente invenção, ou seja, anticorpos terapêuticos podem ter um, dois, três ou mais domínios de ligação e podem ser monoespecíficos, biespecíficos ou multiespecíficos. Os anticorpos podem ser completos de uma única espécie ou ser quimerizados ou humanizados. Para um anticorpo com mais de dois domínios de ligação ao antígeno, alguns domínios de ligação podem ser idênticos e/ ou ter a mesma especificidade.

[0121] “Ativação de células T”, conforme aqui utilizado, refere-se a uma ou mais respostas celulares de um linfócito T, particularmente um linfócito T citotóxico, selecionada a partir de: proliferação, diferenciação, secreção de citocinas, liberação de moléculas efetoras citotóxicas, atividade citotóxica e expressão de marcadores de ativação. Os receptores de ligação ao antígeno

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50/293 da invenção são capazes de induzir a ativação de células T. Os ensaios adequados para medir a ativação das células T são conhecidos na técnica aqui descrita.

[0122] De acordo com esta invenção, o termo “receptor de célula T” ou “TCR” é comumente conhecido na técnica. Em particular, aqui o termo “receptor de célula T” refere-se a qualquer receptor de célula T, desde que os três critérios a seguir sejam cumpridos: (i) especificidade do tumor, (ii) reconhecimento (da maioria) das células tumorais, o que significa que um antígeno ou o alvo deve ser expresso na (maioria das) células tumorais e (iii) que o TCR corresponde ao tipo HLA do sujeito a ser tratado. Nesse contexto, os receptores de células T adequados que atendem aos três critérios mencionados acima são conhecidos na técnica, tais como receptores que reconhecem NY-ESO-1 (para informações de sequências, ver, por exemplo, PCT/GB2005/001924) e/ou HER2neu (para informações de sequência, ver WO-A1 2011/0280894).

[0123] Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” de um agente, por exemplo, uma composição farmacêutica, refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado terapêutico ou profilático desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente, por exemplo, elimina, diminui, retarda, minimiza ou previne efeitos adversos de uma doença.

[0124] O termo “vetor” ou “vetor de expressão” é sinônimo de “construto de expressão” e refere-se a uma molécula de DNA que é utilizada para introduzir e dirigir a expressão de um gene específico ao qual está operativamente associada em uma célula alvo. O termo inclui o vetor como uma estrutura de ácido nucleico auto-replicante, bem como o vetor incorporado no genoma de uma célula hospedeira na qual foi introduzido. O vetor de expressão da presente invenção compreende um cassete de expressão. Os

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51/293 vetores de expressão permitem a transcrição de grandes quantidades de mRNA estável. Uma vez que o vetor de expressão está dentro da célula alvo, a molécula ou proteína de ácido ribonucleico que é codificada pelo gene é produzida pela maquinaria de transcrição e/ou tradução celular. Em uma forma de realização, o vetor de expressão da invenção compreende um cassete de expressão que compreende sequências polinucleotídicas que codificam os receptores de ligação ao antígeno da invenção ou fragmentos dos mesmos.

Receptores de Ligação ao Antígeno Capazes de se Ligarem Especificamente ao(s) Domínio(s) Fc Mutado(s)

[0125] A presente invenção refere-se a receptores de ligação ao antígeno capazes de se ligarem especificamente ao domínio Fc mutado de um anticorpo, isto é, um anticorpo terapêutico direcionado a uma célula cancerígena. Em particular, a presente invenção refere-se a receptores de ligação ao antígeno que compreendem um domínio extracelular compreendendo pelo menos uma porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado, mas que não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado. Em formas de realização preferidas, o domínio Fc mutado compreende pelo menos uma substituição de aminoácido em comparação com o domínio Fc parental não mutado, em que a ligação do receptor Fc pelo domínio Fc mutado é reduzida em comparação com a ligação do receptor Fc pelo domínio Fc não mutado. Em formas de realização particulares, a presente invenção refere-se a receptores de ligação ao antígeno que compreendem um domínio extracelular compreendendo pelo menos uma porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado, em que a pelo menos uma porção de ligação ao antígeno não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado, em que o domínio Fc mutado compreende pelo menos uma substituição de aminoácido selecionada a partir do grupo que

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52/293 consiste em L234, L235, 1253, H310, P331, P329 e H435, em particular em que a mutação de aminoácido é L234A, L235A, I253A, N297A, H310A, P329G e/ ou H435A, em comparação com o domínio Fc parental não mutado, em que a ligação do receptor Fc pelo domínio Fc mutado é reduzida em comparação com a ligação do receptor Fc pelo domínio Fc não mutado. Em uma forma de realização preferida, a mutação de aminoácido é P329G em que a ligação ao receptor Fc é reduzida conforme medido por SPR a 25 °C. Em uma outra forma de realização preferida, as mutações de aminoácidos são I253A, H310A e H435A, em que a ligação ao receptor Fc neonatal (FcRn) é reduzida conforme medido por SPR a 25 °C.

[0126] A presente invenção refere-se ainda à transdução de células T, tais como células T CD8+, células T CD4+, células T CD3+, células T γδ ou células T natural killer (NK), preferencialmente células T CD8+, com um receptor de ligação ao antígeno, conforme descrito aqui e seu recrutamento direcionado, por exemplo, a um tumor, por uma molécula de anticorpo, por exemplo um anticorpo terapêutico, que compreende um domínio Fc mutado. Em uma forma de realização, o anticorpo é capaz de se ligar especificamente a um antígeno tumor-específico que ocorre naturalmente na superfície de uma célula tumoral.

[0127] Como mostrado nos Exemplos anexos, como prova do conceito inventivo, o receptor de ligação ao antígeno que compreende um domínio transmembrana de ancoragem e um domínio extracelular de acordo com a invenção pETR17096 (SEQ ID NO: 7, como codificado pela sequência de DNA mostrada na SEQ ID NO: 19) foi construído, o qual é capaz de se ligar especificamente a um anticorpo terapêutico (representado pelo anticorpo antiCD20 que compreende uma cadeia pesada de SEQ ID NO: 112 e uma cadeia leve de SEQ ID NO: 113) que compreende a mutação P329G. As células T transduzidas (células T Jurkat NFAT) que expressam a proteína Anti-P329G

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53/293 scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD (SEQ ID NO: 7, codificada pela sequência de DNA mostrada na SEQ ID NO: 19), poderíam ser fortemente ativadas por co-incubação com o anticorpo anti-CD20 que compreende a mutação P329G no domínio Fc juntamente com células tumorais positivas para CD20. Os inventores forneceram ainda múltiplos formatos do receptor de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado, mas que não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado para suportar a prova do conceito inventivo.

[0128] O tratamento de células tumorais pela combinação de um anticorpo direcionado contra um antígeno tumoral em que o anticorpo compreende a mutação P329G juntamente com células T transduzidas que expressam a proteína Anti-P329G-Fab-ds-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD (SEQ ID NOs: 44 (DNA) e 39, 41 (proteína)) surpreendentemente leva a uma ativação mais forte da célula T transduzida em comparação com as células T transduzidas que expressam a proteína de fusão Anti-P329G-scFv-CD28ATDCD28CSD-CD3zSSD (SEQ ID NOs: 19 (DNA) e 7 (proteína)) (ver, por exemplo, as figuras 6 e 8 a 11).

[0129] Por conseguinte, foi surpreendente e inesperadamente verificado que as células T, de preferência células T CD8+, que foram transduzidas com um receptor de ligação ao antígeno da presente invenção, podem ser especificamente estimuladas pelo uso de um anticorpo específico de tumor compreendendo um domínio Fc mutado e recrutado pelo anticorpo específico do tumor como elemento de ligação à célula tumoral. Assim, foi surpreendentemente e inesperadamente mostrado na presente invenção que o emparelhamento de um anticorpo específico para um tumor, ou seja, um anticorpo terapêutico, que compreende um domínio Fc mutado com células T transduzidas com um receptor de ligação ao antígeno que compreende/ consiste em um domínio extracelular compreendendo uma porção de ligação

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54/293 ao antígeno capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc mutado resultaria em uma ativação específica das células T e subsequente lise da célula tumoral. Essa abordagem apresenta vantagens significativas de segurança em relação às abordagens convencionais baseadas em células T, pois a célula T seria inerte na ausência do anticorpo que compreende o domínio Fc mutado e sua disponibilidade pode ser controlada pelo formato da molécula de anticorpo escolhido (isto é, moléculas menores para meia-vida mais curta e vice-versa). Por conseguinte, a invenção fornece uma plataforma terapêutica versátil em que os anticorpos do tipo IgG podem ser utilizados para marcar ou classificar células tumorais como uma orientação para células T e em que as células T transduzidas são especificamente direcionadas para as células tumorais, fornecendo especificidade para um domínio Fc mutado do anticorpo do tipo IgG. Após a ligação ao domínio Fc mutado do anticorpo na superfície de uma célula tumoral, a célula T transduzida como aqui descrita é ativada e a célula tumoral será subsequentemente lisada. A plataforma é flexível e específica, permitindo o uso de diversos anticorpos alvo (existentes ou recém-desenvolvidos) ou a co-aplicação de múltiplos anticorpos com especificidade de antígeno diferente, mas que compreendem a mesma mutação no domínio Fc. O grau de ativação das células T pode ainda ser ajustado ajustando a dosagem do anticorpo terapêutico coaplicado ou mudando para diferentes especificidades ou formatos de anticorpos. As células T transduzidas de acordo com a invenção são inertes sem a coaplicação de um anticorpo alvo que compreende um domínio Fc mutado porque mutações no domínio Fc, como aqui descrito, não ocorrem em imunoglobulinas naturais ou não mutadas. Por conseguinte, em uma forma de realização, o domínio Fc mutado não ocorre naturalmente em imunoglobulinas do tipo selvagem.

[0130] Por conseguinte, a presente invenção refere-se a um receptor de ligação ao antígeno que compreende um domínio extracelular compreendendo

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55/293 pelo menos uma porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado, em que a pelo menos uma porção de ligação ao antígeno não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado, em que o domínio Fc mutado compreende pelo menos uma mutação de aminoácido em comparação com o domínio Fc parental não mutado, em que a ligação do receptor Fc pelo domínio Fc mutado e/ ou função efetora induzida pelo domínio Fc mutado é reduzida em comparação à ligação do receptor Fc e/ ou função efetora induzida pelo domínio Fc não mutado. Pode ser particularmente desejável utilizar anticorpos terapêuticos com função efetora reduzida na terapia do câncer, uma vez que a função efetora pode levar a efeitos colaterais graves das terapias tumorais baseadas em anticorpos, conforme descrito aqui mais adiante.

[0131] No contexto da presente invenção, o receptor de ligação ao antígeno compreende um domínio extracelular que não ocorre naturalmente em ou sobre as células T. Assim, o receptor de ligação ao antígeno é capaz de fornecer especificidade de ligação personalizada às células que expressam o receptor de ligação ao antígeno de acordo com a invenção. Células, por exemplo, as células T, transduzidas com (um) receptor(es) de ligação ao antígeno da invenção, tornam-se capazes de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado, mas não ao domínio Fc parental não mutado. A especificidade é fornecida pela porção de ligação ao antígeno do domínio extracelular do receptor de ligação ao antígeno; essas porções de ligação ao antígeno são consideradas específicas para o domínio Fc mutado, como aqui definido. No contexto da presente invenção e como aqui explicado, a porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado liga-se a/ interage com o domínio Fc mutado, mas não a/ com o domínio Fc parental não mutado.

Porções de Ligação ao Antígeno

[0132] Em uma forma de realização ilustrativa da presente

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56/293 invenção, como prova de conceito, os receptores de ligação ao antígeno são fornecidos compreendendo um domínio transmembrana de ancoragem e um domínio extracelular que compreende pelo menos uma porção de ligação ao antígeno, em que a pelo menos uma porção de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado, mas não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado, em que o domínio Fc mutado compreende pelo menos uma substituição de aminoácido em comparação com o Fc parental não mutado.

[0133] Em certa forma de realização, pelo menos uma das porções de ligação ao antígeno é um fragmento Fab convencional, isto é, uma molécula de Fab que consiste em uma cadeia leve de Fab e uma cadeia pesada de Fab. Em certa forma de realização, pelo menos uma das porções de ligação ao antígeno é um fragmento crossFab, isto é, uma molécula de Fab que consiste em uma cadeia leve de Fab e uma cadeia pesada de Fab, em que as regiões variáveis ou as regiões constantes da cadeia pesada e leve de Fab são trocadas. Em certas formas de realização, pelo menos uma das porções de ligação ao antígeno é um fragmento scFv. Em uma forma de realização específica, o C-terminal da cadeia pesada variável (VH) é conectado ao Nterminal da cadeia leve variável (VL) na molécula de scFv, opcionalmente através de um ligante peptídico. Em certas formas de realização, pelo menos uma das porções de ligação ao antígeno é uma molécula de Fab de cadeia única, isto é, uma molécula de Fab em que a cadeia leve de Fab e a cadeia pesada de Fab são conectadas por um ligante peptídico para formar uma única cadeia peptídica. Em uma forma de realização específica, o C-terminal da cadeia leve de Fab é conectado ao N-terminal da cadeia pesada de Fab na molécula de Fab de cadeia única, opcionalmente através de um ligante peptídico.

[0134] Por conseguinte, no contexto da presente invenção, a

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57/293 porção de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado, mas não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado, em que o domínio Fc mutado compreende pelo menos uma substituição de aminoácido em comparação com o domínio Fc parental não mutado.

[0135] As porções de ligação ao antígeno capazes de se ligarem especificamente a um domínio Fc mutado podem ser geradas por imunização de, por exemplo, um sistema imunológico de mamíferos. Tais métodos são conhecidos na técnica e, por exemplo, são descritos em Burns em Methods in Molecular Biology 295: 1-12 (2005). Alternativamente, as porções de ligação ao antígeno da invenção podem ser isoladas por triagem de bibliotecas combinatórias para anticorpos com a(s) atividade(s) desejada(s). Os métodos para fazer a triagem de bibliotecas combinatórias são revisados, por exemplo, em Lerner et al. em Nature Reviews 16: 498-508 (2016). Por exemplo, são conhecidos na técnica uma variedade de métodos para gerar bibliotecas de exibição de fagos e fazer a triagem dessas bibliotecas quanto a porções de ligação ao antígeno que possuam as características de ligação desejadas. Tais métodos são revistos, por exemplo, em Frenzel et al. em mAbs 8: 1177-1194 (2016); Bazan et al. em Human Vaccines and Immunotherapeutics 8: 18171828 (2012) e Zhao et al. em Critical Reviews in Biotechnology 36: 276-289 (2016), bem como em Hoogenboom et al. em Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) e ainda descrito, por exemplo, em McCafferty et al., Nature 348: 552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992) e em Marks e Bradbury em Methods in Molecular Biology 248: 161-175 (Lo, ed. Human Press, Totowa, NJ, 2003), Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); e Lee et al., J. Immunol.

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Methods 284(1-2): 119-132 (2004). Em certos métodos de métodos de exibição de fagos, os repertórios dos genes VH e VL são clonados separadamente por reação em cadeia da polimerase (PCR) e recombinados aleatoriamente em bibliotecas de fagos, que podem então ser tríadas quanto a fagos de ligação a antígenos, conforme descrito em Winter et al. em Annual Review of Immunology 12: 433-455 (1994). Os fagos apresentam tipicamente fragmentos de anticorpo, como fragmentos Fv de cadeia única (scFv) ou como fragmentos Fab. Bibliotecas de fontes imunizadas fornecem porções de ligação ao antígeno de alta afinidade ao imunogênio sem a necessidade de construir hibridomas. Alternativamente, o repertório simples pode ser clonado (por exemplo, do ser humano) para fornecer uma única fonte de porções de ligação ao antígeno para uma ampla gama de antígenos não próprios e também próprios sem nenhuma imunização, como descrito por Griffiths et al. em EMBO Journal 12:725-734 (1993). Finalmente, as bibliotecas simples também podem ser feitas sinteticamente, clonando segmentos do gene V não rearranjados de células-tronco e usando iniciadores de PCR contendo sequência aleatória para codificar as regiões CDR3 altamente variáveis e realizar rearranjo in vitro, conforme descrito por Hoogenboom e Winter em Journal of Molecular Biology 227: 381-388 (1992). As publicações de patentes que descrevem bibliotecas de fagos de anticorpos humanos incluem, por exemplo: Patentes US 5.750.373; US 7.985.840; US 7.785.903 e US 8.679.490, bem como as publicações de patentes US 2005/0079574, US 2007/0117126, US 2007/0237764 e US 2007/0292936 e US 2009/0002360. Outros exemplos de métodos conhecidos na técnica para fazer a triagem de bibliotecas combinatórias para anticorpos com uma atividade ou atividades desejadas incluem exibição de ribossomo e mRNA, bem como métodos para exibição e seleção de anticorpos em bactérias, células de mamíferos, células de insetos ou células de levedura. Os métodos para exibição da superfície da levedura são revisados, por exemplo,

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59/293 em Scholler et al. em Methods in Molecular Biology 503:135-56 (2012) e em Cherf et al. em Methods in Molecular biology 1319:155-175 (2015), bem como em Zhao et al. em Methods in Molecular Biology 889: 73-84 (2012). Os métodos para exibição do ribossomo são descritos, por exemplo, em He et al. em Nucleic Acids Research 25: 5132-5134 (1997) e em Hanes et al. em PNAS 94: 4937-4942(1997).

[0136] No contexto da presente invenção, são aqui fornecidos receptores de ligação ao antígeno que compreendem pelo menos uma fração de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado. Por conseguinte, as células transduzidas, isto é, as células T, que expressam um receptor de ligação ao antígeno de acordo com a invenção, são capazes de se ligar especificamente ao domínio Fc mutado de um anticorpo, isto é, de um anticorpo terapêutico. O domínio Fc confere aos anticorpos, isto é, anticorpos terapêuticos, propriedades farmacocinéticas favoráveis, incluindo uma meia-vida sérica longa que contribui para uma boa acumulação no tecido alvo e uma proporção favorável de distribuição tecido-sangue. Ao mesmo tempo, pode, no entanto, levar a um direcionamento indesejável de anticorpos terapêuticos para células que expressam receptores Fc, e não para as células portadoras de antígeno preferidas. Além disso, a co-ativação das vias de sinalização do receptor Fc pode levar à liberação de citocinas, o que resulta em ativação excessiva dos receptores de citocinas e efeitos colaterais graves na administração sistêmica de anticorpos terapêuticos. A ativação de células imunes (portadoras de receptor Fc) diferentes de células T pode até reduzir a eficácia de anticorpos terapêuticos devido à potencial destruição de células imunes. Por conseguinte, os anticorpos terapêuticos conhecidos na técnica podem ser projetados ou mutados para exibir uma afinidade de ligação reduzida a um receptor Fc e/ ou função efetora reduzida, em comparação com, por exemplo, um domínio Fc de lgG1 nativo. Os receptores de ligação ao

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60/293 antígeno de acordo com a invenção podem ser utilizados para direcionar células efetoras, por exemplo, células T, expressando os receptores de ligação ao antígeno de acordo com a invenção in vitro e/ ou in vivo para células alvo, ou seja, células tumorais, que são marcadas com um anticorpo capaz de se ligar especificamente às células alvo, em que o anticorpo compreende um domínio Fc mutado e/ ou projetado como aqui descrito.

[0137] Em uma forma de realização ilustrativa da presente invenção, como prova de conceito, são fornecidos receptores de ligação ao antígeno capazes de se ligarem especificamente a um domínio Fc mutado que compreende a mutação de aminoácido P329G e células efetoras que expressam os referidos receptores de ligação ao antígeno. A mutação P329G reduz a ligação aos receptores Fcy e a função efetora associada. Por conseguinte, o domínio Fc mutado que compreende a mutação P329G se liga a receptores Fcy com afinidade reduzida ou abolida em comparação com o domínio Fc não mutado. Em uma forma de realização ilustrativa alternativa da presente invenção, como prova de conceito, são fornecidos receptores de ligação ao antígeno capazes de se ligarem especificamente a um domínio Fc mutado que compreende as mutações de aminoácidos I253A, H310A e H435A (“AAA”). As mutações AAA abolem essencialmente a ligação ao FcRn.

[0138] No entanto, os anticorpos com ligação reduzida ou melhorada ou diminuída aos receptores Fc (FcRs) e/ou função efetora que compreende um domínio Fc mutado são amplamente utilizados na técnica. Por conseguinte, são aqui proporcionados receptores de ligação ao antígeno capazes de se ligarem especificamente a anticorpos que compreende um domínio Fc mutado, tais anticorpos são também aqui referidos como anticorpos alvo. Por conseguinte, em uma forma de realização, o receptor de ligação ao antígeno da presente invenção é capaz de se ligar especificamente a um anticorpo alvo que compreende um domínio Fc mutado com afinidade de

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61/293 ligação reduzida a um receptor Fc e/ ou função efetora reduzida. Os anticorpos alvo com função efetora reduzida incluem aqueles com mutação de um ou mais dos resíduos da região Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 (Patente U.S. 6.737.056). Esses mutantes Fc incluem mutantes Fc com mutações em duas ou mais posições de aminoácidos 265, 269, 270, 297 e 327, incluindo o chamado mutante Fc “DANA” com mutação dos resíduos 265 e 297 para alanina (Patente US 7.332.581). Certas variantes de anticorpos com ligação melhorada ou diminuída aos FcRs são descritas. (Ver, por exemplo, Patente US 6.737.056; WO 2004/056312, e Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 65916604 (2001).) Em certas formas de realização, um receptor de ligação ao antígeno é fornecido, capaz de se ligar especificamente a uma variante de anticorpo, compreende uma região Fc com uma ou mais mutações de aminoácidos que melhoram o ADCC, por exemplo, mutações nas posições 298, 333 e/ ou 334 da região Fc (numeração EU de resíduos). Em certas formas de realização, uma variante de anticorpo alvo compreende uma região Fc com uma ou mais mutações de aminoácidos, que reduzem ou diminuem a ligação a FcRn, por exemplo, mutações nas posições 253 e/ ou 310 e/ ou 435 da região Fc (numeração EU de resíduos). Em certas formas de realização, a variante de anticorpo alvo compreende uma região Fc com as mutações de aminoácidos nas posições 253, 310 e 435. Em uma forma de realização, as mutações são I253A, H310A e H435A em uma região Fc derivada de uma região Fc de lgG1 humana. Ver, por exemplo, Grevys, A., et al., J. Immunol. 194 (2015) 5497-5508.

[0139] Em certas formas de realização, um receptor de ligação ao antígeno é fornecido, capaz de se ligar especificamente a uma variante de anticorpo que compreende uma região Fc com uma ou mais mutações de aminoácidos, o que reduziu ou diminuiu a ligação ao FcRn, por exemplo, mutações em uma das posições 310 e/ ou 433 e/ ou 436 da região Fc

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62/293 (numeração EU de resíduos). Em certas formas de realização, a variante de anticorpo alvo compreende uma região Fc com as mutações de aminoácidos nas posições 310, 433 e 436. Em uma forma de realização, as mutações são H310A, H433A e Y436A em uma região Fc derivada de uma região Fc de IgG 1 humana. Em certas formas de realização, uma variante de anticorpo alvo compreende uma região Fc com uma ou mais mutações de aminoácidos, que aumentam a ligação ao FcRn, por exemplo, mutações nas posições 252 e/ ou 254 e/ ou 256 da região Fc (numeração EU de resíduos). Em certas formas de realização, a variante de anticorpo alvo compreende uma região Fc com as mutações de aminoácidos nas posições 252, 254 e 256. Em uma forma de realização, as mutações são M252Y, S254T e T256E em uma região Fc derivada de uma região Fc de IgG 1 humana. Em certas formas de realização, é fornecido um receptor de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a uma variante de anticorpo que compreende uma região Fc com mutações de aminoácidos, que diminuem a ligação a FcyR, por exemplo, mutações nas posições 234, 235 e 329 da região Fc (numeração EU de resíduos). Em uma forma de realização, as mutações são L234A e L235A (LALA). Em certas formas de realização, a variante de anticorpo alvo compreende ainda D265A e/ ou P329G em uma região Fc derivada de uma região Fc de lgG1 humana. Em uma forma de realização, a mutação é P329G (“PG”) em uma região Fc derivada de uma região Fc de lgG1 humana. Em outra forma de realização, as mutações são I253A, H310A e H435A (“AAA”) em uma região Fc derivada de uma região Fc de IgG 1 humana.

[0140] Em uma forma de realização, a porção de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado composto por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável. Em uma forma de realização, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG, especificamente de IgGi ou lgG4. Em uma forma de realização, o

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63/293 domínio Fc é um domínio Fc humano. Em uma forma de realização, o domínio Fc mutado exibe afinidade de ligação reduzida a um receptor Fc e/ ou função efetora reduzida, em comparação com um domínio Fc de IgGi nativo. Em uma forma de realização, o domínio Fc compreende uma ou mais mutações de aminoácidos que reduzem a ligação a um receptor Fc e/ ou função efetora.

[0141] Em uma forma de realização preferida, a um ou mais mutações de aminoácidos estão em uma ou mais posições selecionadas a partir do grupo de L234, L235 e P329 (numeração de Kabat). Em uma forma de realização particular, cada subunidade do domínio Fc compreende três mutações de aminoácidos que reduzem a ligação a um receptor Fc de ativação e/ ou função efetora, em que as referidas mutações de aminoácidos são L234A, L235A e P329G. Em uma forma de realização particular, o receptor Fc é um receptor Fey. Em uma forma de realização, a função efetora é citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC).

[0142] Em uma forma de realização particular, o domínio Fc mutado compreende a mutação P329G. Por conseguinte, o domínio Fc mutado que compreende a mutação P329G se liga a receptores Fcy com afinidade reduzida ou abolida em comparação com o domínio Fc não mutado. Em uma forma de realização, o domínio extracelular do receptor de ligação ao antígeno compreende uma porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc que compreende a mutação P329G, em que a porção de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende pelo menos um de:

(a) uma sequência de aminoácidos de RYWMN (SEQ ID NO: 1) da região determinante de complementaridade (CDR H) 1 da cadeia pesada;

(b) uma sequência de aminoácidos de EITPDSSTINYTPSLKD (SEQ ID NO: 2) da CDR H2; e (c) uma sequência de aminoácidos de PYDYGAWFAS (SEQ ID

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NO: 3) daCDR H3.

[0143] Em uma forma de realização, o domínio extracelular do receptor de ligação ao antígeno compreende uma porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc que compreende a mutação P329G, em que a porção de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia leve que compreende pelo menos um de:

(d) uma sequência de aminoácidos de RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 4) da cadeia leve (CDR L) 1;

(e) uma sequência de aminoácidos de GTNKRAP (SEQ ID NO: 5) daCDR L2; e (f) uma sequência de aminoácidos de ALWYSNHWV (SEQ ID NO: 6) daCDR L3.

[0144] Em uma forma de realização, o domínio extracelular do receptor de ligação ao antígeno compreende uma porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc que compreende a mutação P329G, em que a porção de ligação ao antígeno compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) da cadeia pesada que compreende um sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3 e pelo menos uma CDR de cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6.

[0145] Em uma forma de realização, o domínio extracelular do receptor de ligação ao antígeno compreende uma porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc que compreende a mutação P329G, em que a porção de ligação ao antígeno compreende a região determinante de complementaridade da cadeia pesada (CDRs) de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3 e as CDRs da cadeia leve de SEQ ID

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NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6.

[0146] Em uma forma de realização preferida, o domínio extracelular do receptor de ligação ao antígeno compreende uma porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc que compreende a mutação P329G, em que a porção de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo:

(b) uma sequência de aminoácidos de EITPDSSTINYTPSLKD (SEQ ID NO: 2) da CDR H2;

(c) uma sequência de aminoácidos de PYDYGAWFAS (SEQ ID NO: 3) da CDR H3;

e uma região variável da cadeia leve que compreende:

(d) uma sequência de aminoácidos de RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 4) da cadeia leve (CDR L)1;

(e) uma sequência de aminoácidos de GTNKRAP (SEQ ID NO: 5) CDR L2; e (f) uma sequência de aminoácidos de ALWYSNHWV (SEQ ID NO: 6) CDR L3.

[0147] Em uma forma de realização, o domínio extracelular do receptor de ligação ao antígeno compreende uma porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc que compreende a mutação P329G, em que a porção de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 32 e uma região variável da cadeia leve (VL) que compreende um sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%,

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98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 33.

[0148] Em uma forma de realização, o domínio extracelular do receptor de ligação ao antígeno compreende uma porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc que compreende a mutação P329G, em que a porção de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 32, e uma região variável da cadeia leve (VL) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 33.

[0149] Em uma forma de realização, o domínio extracelular do receptor de ligação ao antígeno compreende uma porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc que compreende a mutação P329G, em que a porção de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 e uma região variável da cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33.

[0150] Em uma forma de realização preferida, o domínio extracelular do receptor de ligação ao antígeno compreende uma porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc que compreende a mutação P329G, em que a porção de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma região variável da cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.

[0151 ] Em uma forma de realização, a pelo menos uma porção de ligação ao antígeno é um fragmento scFv, Fab, crossFab ou scFab. Em uma forma de realização, o domínio extracelular do receptor de ligação ao antígeno compreende uma porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar

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67/293 especificamente a um domínio Fc que compreende a mutação P329G, em que a porção de ligação ao antígeno é um fragmento Fab.

[0152] Em uma forma de realização preferida, o domínio extracelular do receptor de ligação ao antígeno compreende uma porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc que compreende a mutação P329G, em que o fragmento Fab compreende uma cadeia pesada de SEQ ID NO: 40 e uma cadeia leve de SEQ ID NO: 41.

[0153] Em uma forma de realização, o domínio extracelular do receptor de ligação ao antígeno compreende uma porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc que compreende a mutação P329G, em que a pelo menos uma porção de ligação ao antígeno é um fragmento scFv que é um polipeptídeo que consiste em um domínio variável de cadeia pesada (VH), um domínio variável de cadeia leve (VL) e um ligante, em que os referidos domínios variáveis e o referido ligante têm uma das seguintes configurações na direção do N-terminal a C-terminal: a) VHligante-VL ou b) VL-ligante-VH. Em uma forma de realização preferida, o fragmento scFv tem a configuração VH-ligante-VL.

[0154] Em uma forma de realização preferida, o domínio extracelular do receptor de ligação ao antígeno compreende uma porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc que compreende a mutação P329G, em que o fragmento scFv compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

[0155] Em uma forma de realização particular alternativa, o domínio Fc mutado compreende as mutações I253A, H310A e H435A (“AAA”). As mutações AAA reduzem a ligação ao receptor Fc neonatal (FcRn). Por conseguinte, o domínio Fc mutado que compreende as mutações AAA se liga a FcRn com afinidade reduzida ou abolida em comparação com o domínio Fc não mutado.

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[0156] Por conseguinte, em uma forma de realização, o domínio extracelular do receptor de ligação ao antígeno compreende uma porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc que compreende as mutações I253A, H310A e H435A, em que a porção de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende pelo menos um de:

(a) uma sequência de aminoácidos de SYGMS (SEQ ID NO: 53) da região determinante de complementaridade (CDR H) 1 da cadeia pesada;

(b) uma sequência de aminoácidos de SSGGSY (SEQ ID NO: 54) da CDR H2; e (c) uma sequência de aminoácidos de LGMITTGYAMDY (SEQ ID NO: 55) da CDR H3.

[0157] Em uma forma de realização, o domínio extracelular do receptor de ligação ao antígeno compreende uma porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc que compreende as mutações I253A, H310A e H435A, em que a porção de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo pelo menos um de:

(d) uma sequência de aminoácidos de RSSQTIVHSTGHTYLE (SEQ ID NO: 56) da cadeia leve (CDR L)1;

(e) uma sequência de aminoácidos de KVSNRFS (SEQ ID NO:

57) da CDR L2; e (f) uma sequência de aminoácidos de FQGSHVPYT (SEQ ID NO:

58) da CDR L3.

[0158] Em uma forma de realização, o domínio extracelular do receptor de ligação ao antígeno compreende uma porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc que compreende as mutações I253A, H310A e H435A, em que a porção de ligação ao antígeno

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69/293 compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 e SEQ ID NO: 55 e pelo menos uma CDR de cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 e SEQ ID NO: 58.

[0159] Em uma forma de realização, o domínio extracelular do receptor de ligação ao antígeno compreende uma porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc que compreende a mutação P329G, em que a porção de ligação ao antígeno compreende a região determinante de complementaridade (CDRs) da cadeia pesada de SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 e SEQ ID NO: 55 e as CDRs da cadeia leve de SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 e SEQ ID NO: 58.

[0160] Em uma forma de realização preferencial, o domínio extracelular do receptor de ligação ao antígeno compreende uma porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc que compreende as mutações I253A, H310A e H435A, em que a porção de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende:

(b) uma sequência de aminoácidos de SSGGSY (SEQ ID NO: 54) da CDR H2;

(c) uma sequência de aminoácidos de LGMITTGYAMDY (SEQ ID NO: 55) da CDR H3; e uma região variável da cadeia leve que compreende:

(d) uma sequência de aminoácidos de RSSQTIVHSTGHTYLE

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70/293 (SEQ ID NO: 56) da cadeia leve (CDR L) 1;

(e) uma sequência de aminoácidos de KVSNRFS (SEQ ID NO:

57) da CDR L2; e (f) uma sequência de aminoácidos de FQGSHVPYT (SEQ ID NO:

58) da CDR L3.

[0161] Em uma forma de realização, o domínio extracelular do receptor de ligação ao antígeno compreende uma porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc que compreende as mutações I253A, H310A e H435A, em que a porção de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 e uma região variável da cadeia leve (VL) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 62.

[0162] Em uma forma de realização, o domínio extracelular do receptor de ligação ao antígeno compreende uma porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc que compreende as mutações I253A, H310A e H435A, em que a porção de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 e uma região variável da cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62.

[0163] Em uma forma de realização, a pelo menos uma porção de ligação ao antígeno é um fragmento scFv, Fab, crossFab ou scFab. Em uma forma de realização, o domínio extracelular do receptor de ligação ao antígeno compreende uma porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc que compreende as mutações I253A, H310A e H435A, em que a pelo menos uma porção de ligação ao antígeno é um

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71/293 fragmento Fab. Em uma forma de realização específica, o domínio extracelular do receptor de ligação ao antígeno compreende uma porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc que compreende as mutações I253A, H310A e H435A, em que o fragmento Fab compreende uma cadeia pesada de SEQ ID NO: 64 e um cadeia leve de SEQ ID NO: 65.

[0164] Em uma forma de realização, o domínio extracelular do receptor de ligação ao antígeno compreende uma porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc que compreende as mutações I253A, H310A e H435A, em que a pelo menos uma porção de ligação ao antígeno é um fragmento scFv. Em uma forma de realização específica, o domínio extracelular do receptor de ligação ao antígeno compreende uma porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc que compreende as mutações I253A, H310A e H435A, em que o fragmento scFv compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60.

[0165] Em outras formas de realização de acordo com a invenção, a porção de ligação ao antígeno compreendida no domínio extracelular é um fragmento Fab de cadeia única ou scFab.

[0166] Os fragmentos Fab e scFab são estabilizados através da ligação dissulfeto natural entre o domínio CL e o domínio CH1. As porções de ligação ao antígeno que compreendem um domínio variável da cadeia pesada (VH) e um domínio variável da cadeia leve (VL), tais como os fragmentos Fab, crossFab, scFv e scFab, conforme descrito aqui, podem ser ainda mais estabilizadas através da introdução de pontes dissulfeto inter-cadeia entre o domínio VH e o VL. Por conseguinte, em uma forma de realização, o(s) fragmento(s) Fab, o(s) fragmento(s) crossFab, o(s) fragmento(s) scFv e/ ou o(s) fragmento(s) scFab compreendidos nos receptores de ligação ao antígeno de acordo com a invenção podem ser ainda mais estabilizados por geração de

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72/293 ligações dissulfeto inter-cadeia via inserção de resíduos de cisteína (por exemplo, posição 44 na cadeia pesada variável e posição 100 na cadeia leve variável de acordo com a numeração de Kabat). Tais porções de ligação ao antígeno estabilizadas são referidas pelo termo “ds” nos exemplos e Figuras anexados.

Domínio Transmembrana de Ancoragem

[0167] No contexto da presente invenção, o domínio transmembrana de ancoragem dos receptores de ligação ao antígeno da presente invenção pode ser caracterizado por não ter um sítio de divagem para proteases de mamíferos. No contexto da presente invenção, proteases referem-se a enzimas proteolíticas que são capazes de hidrolisar a sequência de aminoácidos de um domínio transmembrana que compreende um sítio de divagem para a protease. O termo proteases inclui endopeptidases e exopeptidases. No contexto da presente invenção, qualquer domínio transmembrana de ancoragem de uma proteína transmembrana, conforme estabelecido entre outros pela nomenclatura CD, pode ser usado para gerar os receptores de ligação ao antígeno da invenção, que ativam células T, preferencialmente células T CD8+, mediante ligação a um domínio Fc mutado como aqui definido.

[0168] Por conseguinte, no contexto da presente invenção, o domínio transmembrana de ancoragem pode compreender parte de um domínio transmembrana de murino/ camundongo ou preferencialmente de um humano. Um exemplo para esse domínio transmembrana de ancoragem é um domínio transmembrana de CD28, por exemplo, tendo a sequência de aminoácidos como mostrada aqui na SEQ ID NO: 11 (como codificada pela sequência de DNA mostrada na SEQ ID NO: 24). No contexto da presente invenção, o domínio transmembrana do receptor de ligação ao antígeno da presente invenção pode compreender/ consistir em uma sequência de

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73/293 aminoácidos como mostrada na SEQ ID NO: 11 (conforme codificado pela sequência de DNA mostrada na SEQ ID NO: 24).

[0169] Em uma forma de realização ilustrativa da presente invenção, como prova de conceito, é fornecido um receptor de ligação ao antígeno que compreende uma porção de ligação ao antígeno compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 (como codificado pela sequência de DNA mostrada na SEQ ID NO: 22), e uma parte de fragmento/ polipeptídeo de CD28 (o número de Entrada Uniprot de CD28 humano é P10747 (com o número de versão 173 e a versão 1 da sequência)) como mostrado aqui como SEQ ID NO: 71 (como codificado pela sequência de DNA mostrada na SEQ ID NO: 70). Alternativamente, qualquer proteína possuindo um domínio transmembrana, como fornecido, entre outros, pela nomenclatura CD, pode ser usada como um domínio transmembrana de ancoragem da proteína receptora de ligação ao antígeno da invenção. Como descrito acima, o receptor de ligação ao antígeno aqui fornecido pode compreender o domínio transmembrana de ancoragem de CD28 que está localizado nos aminoácidos 153 a 179, 154 a 179, 155 a 179, 156 a 179, 157 a 179, 158 a 179, 159 a 179,

160 a 179, 161 a 179, 162 a 179, 163 a 179, 164 a 179, 165 a 179, 166 a179,

167 a 179, 168 a 179, 169 a 179, 170 a 179, 171 a 179, 172 a 179, 173 a179,

174 a 179, 175 a 179, 176 a 179, 177 a 179 ou 178 a 179 da proteínaCD28 humana completa, como mostrado na SEQ ID NO: 71 (conforme codificado pelo cDNA mostrado em SEQ ID NO: 70). Por conseguinte, no contexto da presente invenção, o domínio transmembrana de ancoragem pode compreender ou consistir em uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 11 (como codificado pela sequência de DNA mostrada na SEQ ID NO: 24).

[0170] Em uma forma de realização, é fornecido um receptor de ligação ao antígeno que compreende um domínio transmembrana de

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74/293 ancoragem e um domínio extracelular compreendendo um fragmento Fab capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc que compreende as mutações I253A, H310A e H435A, em que o receptor de ligação ao antígeno compreende:

(a) uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64 fundida no C-terminal ao N-terminal do domínio transmembrana de ancoragem de SEQ ID NO: 11, opcionalmente através do ligante peptídico de SEQ ID NO: 17; e (b) uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65.

[0171] Em uma forma de realização, é fornecido um receptor de ligação ao antígeno que compreende um domínio transmembrana de ancoragem e um domínio extracelular compreendendo um fragmento Fab capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc que compreende a mutação P329G, em que o receptor de ligação ao antígeno compreende:

(a) uma cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 40 e SEQ ID NO: 49 fundida no C-terminal ao N-terminal do domínio transmembrana de ancoragem de SEQ ID NO: 11, opcionalmente através do ligante peptídico de SEQ ID NO: 17; e (b) uma cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 41 e SEQ ID NO: 50.

[0172] Em uma forma de realização, é fornecido um receptor de ligação ao antígeno que compreende um domínio transmembrana de ancoragem e um domínio extracelular compreendendo um fragmento Fab capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc que compreende a mutação P329G, em que o receptor de ligação ao antígeno compreende:

(a) uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 fundida no C-terminal ao N-terminal do

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75/293 domínio transmembrana de ancoragem de SEQ ID NO: 11, opcionalmente através do ligante peptídico de SEQ ID NO: 17; e (b) uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41.

[0173] Em uma forma de realização preferida, é fornecido um receptor de ligação ao antígeno que compreende um domínio transmembrana de ancoragem e um domínio extracelular compreendendo um fragmento Fab capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc que compreende a mutação P329G, em que o receptor de ligação ao antígeno compreende:

(a) uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 fundida no C-terminal ao N-terminal do domínio transmembrana de ancoragem de SEQ ID NO: 11, opcionalmente através do ligante peptídico de SEQ ID NO: 17; e (b) uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.

[0174] Em uma forma de realização, é fornecido um receptor de ligação ao antígeno que compreende um domínio transmembrana de ancoragem e um domínio extracelular compreendendo um fragmento scFv capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc que compreende as mutações I253A, H310A e H435A, mas não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado, em que o receptor de ligação ao antígeno compreende o aminoácido de SEQ ID NO: 60 fundido no C-terminal ao N-terminal do domínio transmembrana de ancoragem de SEQ ID NO: 11, opcionalmente através do ligante peptídico de SEQ ID NO: 17.

[0175] Em uma forma de realização, é fornecido um receptor de ligação ao antígeno que compreende um domínio transmembrana de ancoragem e um domínio extracelular compreendendo um fragmento scFv capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc que compreende a

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76/293 mutação P329G, mas que não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado, em que o receptor de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 34 fundida no C-terminal ao N-terminal do domínio transmembrana de ancoragem de SEQ ID NO: 11, opcionalmente através do ligante peptídico de SEQ ID NO: 17.

[0176] Em uma forma de realização preferida, é fornecido um receptor de ligação ao antígeno que compreende um domínio transmembrana de ancoragem e um domínio extracelular compreendendo um fragmento scFv capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc que compreende a mutação P329G, mas que não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado, em que o receptor de ligação ao antígeno compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 fundida no Cterminal ao N-terminal do domínio transmembrana de ancoragem de SEQ ID NO: 11, opcionalmente através de um ligante peptídico de SEQ ID NO: 17.

[0177] Em uma forma de realização, é fornecido um receptor de ligação ao antígeno que compreende um domínio transmembrana de ancoragem e um domínio extracelular compreendendo um fragmento scFab capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc que compreende a mutação P329G, mas que não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado, em que o fragmento scFv compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 fundida no C-terminal ao N-terminal do domínio transmembrana de ancoragem de SEQ ID NO: 11, opcionalmente através de um ligante peptídico de SEQ ID NO: 17.

Domínio de Sinalização de Estímulo (SSD) e Domínio de Sinalização de CoEstímulo (CSD)

[0178] De preferência, o receptor de ligação ao antígeno da presente invenção compreende pelo menos um domínio de sinalização de

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77/293 estímulo e/ ou pelo menos um domínio de sinalização de co-estímulo. Por conseguinte, o receptor de ligação ao antígeno aqui fornecido compreende, preferencialmente, um domínio de sinalização de estímulo, que fornece a ativação de células T. O receptor de ligação ao antígeno aqui fornecido pode compreender um domínio de sinalização de estímulo que é uma parte de fragmento/ polipeptídeo de CD3z de murino/ camundongo ou humano (a Entrada UniProt de CD3z humano é P20963 (número de versão 177 com número de sequência 2; a Entrada UniProt de CD3z de murino/ camundongo é P24161 (número de acesso citável primário) ou Q9D3G3 (número de acesso citável secundário) com o número de versão 143 e o número de sequência 1)), FCGR3A (a entrada UniProt do FCGR3A humano é P08637 (número de versão 178 com número de sequência 2)) ou NKG2D (a entrada UniProt do NKG2D humano é P26718 (número de versão 151 com número de sequência 1); a entrada UniProt do NKG2D de murino/ camundongo é 054709 (número de versão 132 com número de sequência 2)).

[0179] Assim, o domínio de sinalização de estímulo que está compreendido no receptor de ligação ao antígeno aqui fornecido pode ser uma parte de fragmento/ polipeptídeo do comprimento total de CD3z, FCGR3A ou NKG2D. As sequências de aminoácidos do comprimento total de murino/ camundongo de CD3z ou NKG2D são mostradas aqui como SEQ ID NOs: 96 (CD3z), 100 (FCGR3A) ou 104 (NKG2D) (murino/ camundongo conforme codificado pelas sequências de DNA mostradas em SEQ ID NOs: 97 (CD3z), 101 (FCGR3A) ou 105 (NKG2D) As sequências de aminoácidos dos CD3z, FCGR3A ou NKG2D de comprimento total humano são mostradas aqui como SEQ ID NOs: 94 (CD3z), 98 (FCGR3A) ou 102 (NKG2D) (humano como codificado pelas sequências de DNA mostradas nas SEQ ID NOs: 95 (CD3z), 99 (FCGR3A) ou 103 (NKG2D)).O receptor de ligação ao antígeno da presente invenção pode compreender fragmentos de CD3z, FCGR3A ou NKG2D como

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78/293 domínio de estímulo, desde que esteja compreendido pelo menos um domínio de sinalização. Em particular, qualquer parte/ fragmento de CD3z, FCGR3A ou NKG2D é adequado como domínio de estímulo, desde que esteja compreendido pelo menos um motivo de sinalização.

[0180] No entanto, mais preferencialmente, o receptor de ligação ao antígeno da presente invenção compreende polipeptídeos que são derivados de origem humana. Assim, mais preferencialmente, o receptor de ligação ao antígeno aqui fornecido compreende as sequências de aminoácidos como mostradas aqui como SEQ ID NOs: 94 (CD3z), 98 (FCGR3A) ou 102 (NKG2D) (humano conforme codificado pelas sequências de DNA mostradas na SEQ ID NOs: 95 (CD3z), 99 (FCGR3A) ou 103 (NKG2D)). Por exemplo, a parte de fragmento/ polipeptídeo de CD3z humano que pode estar compreendida no receptor de ligação ao antígeno da presente invenção pode compreender ou consistir na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 13 (conforme codificada pela sequência de DNA mostrada em SEQ ID NO: 26). Por conseguinte, em uma forma de realização, o receptor de ligação ao antígeno compreende a sequência como mostrada na SEQ ID NO: 13 ou uma sequência que possui até 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 substituições, deleções ou inserções em comparação com a SEQ ID NO: 13 e que é caracterizado por ter uma atividade de sinalização de estímulo. Configurações específicas de receptores de ligação ao antígeno que compreendem um domínio de sinalização de estímulo (SSD) são fornecidas aqui abaixo e nos Exemplos e Figuras. A atividade de sinalização de estímulo pode ser determinada, por exemplo, pela liberação aprimorada de citocinas, como medida por ELISA (IL2, IFNy, TNFa), atividade proliferativa aumentada (medida por números celulares aumentados) ou atividade lítica aumentada, como medida por ensaios de liberação de LDH.

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[0181] Além disso, o receptor de ligação ao antígeno aqui fornecido compreende, preferencialmente, pelo menos um domínio de sinalização de co-estímulo que fornece atividade adicional à célula T. O receptor de ligação ao antígeno aqui fornecido pode compreender um domínio de sinalização de co-estímulo que é uma parte de fragmento/ polipeptídeo de CD28 de murino/ camundongo ou humano (a Entrada UniProt de CD28 humano é P10747 (número de versão 173 com número de sequência 1); a entrada UniProt de CD28 de murino/ camundongo é P31041 (número de versão 134 com número de sequência 2)), CD137 (a entrada UniProt de CD137 humano é Q07011 (número de versão 145 com número de sequência 1); a entrada UniProt de CD137 de murino/ camundongo é P20334 (número de versão 139 com número de sequência 1)), 0X40 (a entrada UniProt do 0X40 humano é P23510 (número de versão 138 com número de sequência 1); a entrada UniProt do 0X40 de murino/ camundongo é P43488 (número de versão 119 com número de sequência 1)), ICOS (a entrada UniProt do ICOS humano é Q9Y6W8 (número de versão 126 com número de sequência 1)); a entrada UniProt do ICOS de murino/ camundongo é Q9WV40 (número de acesso citável primário) ou Q9JL17 (número de acesso citável secundário) com o número de versão 102 e a versão de sequência 2)), CD27 (a entrada UniProt de CD27 humano é P26842 (número de versão 160 com o número de sequência 2); a Entrada Uniprot de CD27 de murídeo/ camundongo é P41272 (número de versão 137 com versão de sequência 1)), 4-1-BB (a Entrada UniProt do 4-1-BB de murino/ camundongo é P20334 (número de versão 140 com versão de sequência 1); a entrada UniProt do 4-1-BB humano é Q07011 (número de versão 146 com versão sequencial)), DAP10 (a entrada UniProt do DAP10 humano é Q9UBJ5 (número de versão 25 com número de sequência 1); a entrada UniProt do DAP10 de murino/ camundongo é Q9QUJ0 (número de acesso citável primário) ou Q9R1E7 (número de acesso citável secundário)

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80/293 com o número de versão 101 e o número de sequência 1)) ou DAP12 (a entrada UniProt do DAP12 humano é 043914 (número de versão 146 e o número de sequência 1); a entrada UniProt do DAP12 de murino/ camundongo é 0054885 (número de acesso citável primário) ou Q9R1E7 (número de acesso citável secundário) com o número de versão 123 e o número de sequência 1). Em certas formas de realização da presente invenção, o receptor de ligação ao antígeno da presente invenção pode compreender um ou mais, isto é, 1,2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dos domínios de sinalização de co-estímulo aqui definidos. Por conseguinte, no contexto da presente invenção, o receptor de ligação ao antígeno da presente invenção pode compreender uma parte de fragmento/ polipeptídeo de um de um CD28 de murino/ camundongo ou, de preferência, de humano, como primeiro domínio de sinalização de co-estímulo e o segundo domínio de sinalização de co-estímulo é selecionado a partir do grupo que consiste em CD27, CD28, CD137, 0X40, ICOS, DAP10 e DAP12 de murino/ camundongo ou, preferencialmente, de humano, ou fragmentos dos mesmos. De preferência, o receptor de ligação ao antígeno da presente invenção compreende um domínio de sinalização de co-estímulo que é derivado de uma origem humana. Assim, mais preferencialmente, o(s) domínio(s) de sinalização de co-estímulo que está(ão) compreendido(s) no receptor de ligação ao antígeno da presente invenção pode(m) compreender ou consistir na sequência de aminoácidos conforme mostrada na SEQ ID NO: 12 (como codificado pela sequência de DNA mostrada na SEQ ID NO: 25).

[0182] Assim, o domínio de sinalização de co-estímulo que pode estar opcionalmente compreendido no receptor de ligação ao antígeno aqui fornecido é uma parte de fragmento/ polipeptídeo de CD27, CD28, CD137, 0X40, ICOS, DAP10 e DAP12 completo. As sequências de aminoácidos dos CD27, CD28, CD137, 0X40, ICOS, CD27, DAP10 ou DAP12 de murino/ camundongo completos são mostradas aqui como SEQ ID NOs: 69 (CD27), 73

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81/293 (CD28), 77 (CD137), 81 (0X40), 85 (ICOS), 89 (DAP10) ou 93 (DAP12) (murino/ camundongo como codificado pelas sequências de DNA mostradas nas SEQ ID NOs: 68 (CD27), 72 (CD28), 76 (CD137), 80 (0X40), 84 (ICOS), 88 (DAP10) ou 92 (DAP12)). No entanto, como as sequências humanas são as mais preferidas no contexto da presente invenção, o domínio de sinalização de co-estímulo que pode estar opcionalmente compreendido na proteína do receptor de ligação ao antígeno fornecida aqui é uma parte de fragmento/ polipeptídeo de CD27, CD28, CD137, 0X40, ICOS, DAP10 ou DAP12 completo humano. As sequências de aminoácidos dos CD27, CD28, CD137, 0X40, ICOS, DAP10 ou DAP12 completos humano são mostradas aqui como SEQ ID NOs: 67 (CD27), 71 (CD28), 75 (CD137), 79 (0X40), 83 (ICOS), 87 (DAP10) ou 91 (DAP12) (humano, conforme codificado pelas sequências de DNA mostradas nas SEQ ID NOs: 66 (CD27), 70 (CD28), 74 (CD137), 78 (0X40), 82 (ICOS), 86 (DAP10) ou 90 (DAP12)).

[0183] Em uma forma de realização preferida, o receptor de ligação ao antígeno compreende CD28 ou um fragmento da mesma como domínio de sinalização de co-estímulo. O receptor de ligação ao antígeno aqui fornecido pode compreender um fragmento de CD28 como domínio de sinalização de co-estímulo, desde que pelo menos um domínio de sinalização de CD28 esteja compreendido. Em particular, qualquer parte/ fragmento de CD28 é adequado para o receptor de ligação ao antígeno da invenção desde que pelo menos um dos motivos de sinalização de CD28 esteja compreendido. Por exemplo, o polipeptídeo CD28 que está compreendido na proteína de receptor de ligação ao antígeno da presente invenção pode compreender ou consistir na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 12 (como codificada pela sequência de DNA mostrada na SEQ ID NO: 25). Na presente invenção, o domínio intracelular de CD28, que funciona como um domínio de sinalização de co-estímulo, pode compreender uma sequência derivada do

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82/293 domínio intracelular do polipeptídeo CD28 com a(s) sequência(s) YMNM (SEQ ID NO: 106) e/ou PYAP (SEQ ID NO: 107). De preferência, o receptor de ligação ao antígeno da presente invenção compreende polipeptídeos que são derivados de origem humana. Por exemplo, a parte do fragmento/ polipeptídeo da CD28 humana que pode estar compreendida no receptor de ligação ao antígeno da presente invenção pode compreender ou consistir na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 12 (conforme codificada pela sequência de DNA mostrada em SEQ ID NO: 25). Por conseguinte, no contexto da presente invenção, o receptor de ligação ao antígeno compreende a sequência como mostrada na SEQ ID NO: 12 ou uma sequência que possui até 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substituições, deleções ou inserções em comparação com a SEQ ID NO: 12 e que é caracterizada por ter uma atividade de sinalização de co-estímulo. Configurações específicas de receptores de ligação ao antígeno que compreendem um domínio de sinalização de co-estímulo (CSD) são fornecidas aqui abaixo e nos Exemplos e Figuras. A atividade de sinalização de co-estímulo pode ser determinada, por exemplo, pela liberação aprimorada de citocinas, como medida por ELISA (IL-2, IFNy, TNFa), atividade proliferativa aumentada (como medida por números celulares aumentados) ou atividade lítica aumentada, como medida por ensaios de liberação de LDH.

[0184] Como mencionado acima, em uma forma de realização da presente invenção, o domínio de sinalização de co-estímulo do receptor de ligação ao antígeno pode ser derivado do gene CD28 humano (número de entrada Uni Prot: P10747 (número de acesso com a versão de entrada: 173 e versão 1 da sequência)) e fornece atividade CD28, definida como produção de citocinas, proliferação e atividade lítica da célula transduzida aqui descrita, como uma célula T transduzida. A atividade CD28 pode ser medida pela liberação de citocinas por ELISA ou citometria de fluxo de citocinas, como interferon-gama (IFN-γ) ou interleucina 2 (IL-2), proliferação de células T

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83/293 medidas, por exemplo, por medição ki67, quantificação celular por citometria de fluxo ou atividade lítica, avaliada pela medição da impedância em tempo real da célula alvo (usando, por exemplo, um instrumento de ICELLligence, como descrito, por exemplo, em Thakur et al., Biosens Bioeletron. 35(1) (2012), 503506; Krutzik etal.., Methods Mol Biol. 699 (2011), 179-202; Ekkens et al., Infect Immun. 75(5) (2007), 2291-2296; Ge et al., Proc Natl Acad Sci US A. 99(5). (2002), 2983-2988; Düwell etal., Cell Death Differ. 21(12) (2014), 1825-1837, Erratum in: Cell Death Differ. 21(12) (2014), 161). Os domínios de sinalização de co-estímulo PYAP (AA 208 a 211 de SEQ ID NO: 107 e YMNM (AA 191 a 194 de SEQ ID NO: 106) são benéficos para a função do polipeptídeo CD28 e os efeitos funcionais enumerados acima. A sequência de aminoácidos do domínio YMNM é mostrada na SEQ ID NO: 106; a sequência de aminoácidos do domínio PYAP é mostrada na SEQ ID NO: 107. Por conseguinte, no receptor de ligação ao antígeno da presente invenção, o polipeptídeo CD28 compreende, preferencialmente, uma sequência derivada do domínio intracelular de um polipeptídeo CD28 tendo as sequências YMNM (SEQ ID NO: 106) e/ ou PYAP (SEQ ID NO: 107). No contexto da presente invenção, um domínio intracelular de um polipeptídeo CD28 tendo as sequências YMNM (SEQ ID NO: 106) e/ ou PYAP (SEQ ID NO: 107) caracterizado por uma atividade CD28, definida como produção, proliferação de citocina atividade lítica de uma célula transduzida aqui descrita, como por exemplo uma célula T transduzida. Por conseguinte, no contexto da presente invenção, o domínio de sinalização de co-estímulo dos receptores de ligação ao antígeno da presente invenção possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 (humana) (como codificada pela sequência de DNA mostrada na SEQ ID NO: 25). No entanto, no receptor de ligação ao antígeno da presente invenção, um ou ambos os domínios podem ser mutados para FMNM (SEQ ID NO: 108) e/ ou AYAA (SEQ ID NO: 109), respectivamente. Qualquer uma dessas mutações

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84/293 reduz a capacidade de uma célula transduzida que compreende o receptor de ligação ao antígeno de liberar citocinas sem afetar sua capacidade de proliferar e pode ser vantajosamente usada para prolongar a viabilidade e, portanto, o potencial terapêutico das células transduzidas. Ou, em outras palavras, essa mutação não funcional aumenta, de preferência, a persistência das células que são transduzidas com o receptor de ligação ao antígeno aqui fornecido in vivo. Estes motivos de sinalização podem, no entanto, estar presentes em qualquer local dentro do domínio intracelular do receptor de ligação ao antígeno aqui fornecido.

Ligante e Peptídeos de Sinal

[0185] Além disso, o receptor de ligação ao antígeno aqui fornecido pode compreender pelo menos um ligante (ou “espaçador”). Um ligante é geralmente um peptídeo com um comprimento de até 20 aminoácidos. Por conseguinte, no contexto da presente invenção, o ligante pode ter um comprimento de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 aminoácidos. Por exemplo, o receptor de ligação ao antígeno aqui fornecido pode compreender um ligante entre o domínio extracelular compreendendo pelo menos uma porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado, o domínio transmembrana de ancoragem, o domínio de sinalização de co-estímulo e/ou o domínio de sinalização de estímulo. Tais ligantes têm a vantagem de aumentar a probabilidade de que os diferentes polipeptídeos do receptor de ligação ao antígeno (ou seja, o domínio extracelular compreendendo pelo menos uma porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado, o domínio transmembrana de ancoragem, o domínio de sinalização de co-estímulo e/ou domínio de sinalização de estímulo) dobrem independentemente e se comportem conforme o esperado. Assim, no contexto da presente invenção, o domínio extracelular que compreende pelo menos uma

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85/293 porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado, o domínio transmembrana de ancoragem que não possui um sítio de divagem para proteases de mamíferos, o domínio de sinalização de coestímulo e o domínio de sinalização de estímulo podem estar compreendidos em um polipeptídeo multifuncional de cadeia única. Um construto de fusão de cadeia única, por exemplo, pode consistir em (a) polipeptídeo(s) que compreende(m) domínio(s) extracelular(es) compreendendo pelo menos uma porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado, domínio(s) transmembrana de ancoragem, domínio(s) de sinalização de co-estímulo e/ou domínio(s) de sinalização de estímulo. Em formas de realização alternativas, o receptor de ligação ao antígeno compreende uma porção de ligação ao antígeno que não é um construto de fusão de cadeia única, isto é, a porção de ligação ao antígeno é um fragmento Fab ou um crossFab. Em tais formas de realização, o receptor de ligação ao antígeno não é um construto de fusão de cadeia única que compreende apenas uma cadeia de polipeptídeo. De preferência, esses construtos compreenderão um polipeptídeo de fusão de cadeia pesada de cadeia única combinado com uma cadeia leve de imunoglobulina, como descrito aqui, por exemplo, o polipeptídeo de fusão de cadeia pesada compreende cadeia(s) pesada(s) de imunoglobulina, domínio(s) transmembrana de ancoragem, domínio(s) de sinalização de co-estímulo e/ou domínio(s) de sinalização de estímulo e é combinado com cadeia(s) leve(s) de imunoglobulina. Por conseguinte, a porção de ligação ao antígeno, o domínio transmembrana de ancoragem, o domínio de sinalização de co-estímulo e o domínio de sinalização de estímulo podem ser conectados por um ou mais ligantes peptídicos idênticos ou diferentes, como aqui descrito. Por exemplo, no receptor de ligação ao antígeno aqui fornecido, o ligante entre o domínio extracelular que compreende pelo menos uma porção de ligação ao antígeno

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86/293 capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado e o domínio transmembrana de ancoragem pode compreender ou consistir na sequência de aminoácidos, como mostrado na SEQ ID NO: 17. Por conseguinte, o domínio transmembrana de ancoragem, o domínio de sinalização de co-estímulo e/ ou o domínio de estímulo podem ser conectados um ao outro por ligantes peptídicos ou, alternativamente, por fusão direta dos domínios.

[0186] Em algumas formas de realização de acordo com a invenção, a porção de ligação ao antígeno compreendida no domínio extracelular é um fragmento variável de cadeia única (scFv) que é uma proteína de fusão das regiões variáveis das cadeias pesada (VH) e leve (VL) de um anticorpo, conectado com um ligante peptídico curto de dez a cerca de 25 aminoácidos. O ligante geralmente é rico em glicina para flexibilidade, bem como serina ou treonina para solubilidade, e pode conectar o N-terminal do VH ao C-terminal do VL ou vice-versa. Por exemplo, no receptor de ligação ao antígeno aqui fornecido, o ligante pode ter a sequência de aminoácidos como mostrada na SEQ ID NO: 16. A porção de ligação ao antígeno scFv, como aqui descrita, retém a especificidade do anticorpo original, apesar da remoção das regiões constantes e da introdução do ligante. Os anticorpos scFv são, por exemplo, descritos em Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96).

[0187] Em algumas formas de realização de acordo com a invenção, a porção de ligação ao antígeno compreendida no domínio extracelular é um fragmento Fab de cadeia única ou scFab que é um polipeptídeo que consiste em um domínio variável da cadeia pesada (VH), um domínio constante 1 (CH1) do anticorpo, um domínio variável da cadeia leve (VL) do anticorpo, um domínio constante da cadeia leve (CL) do anticorpo e um ligante, em que os referidos domínios de anticorpo e o referido ligante têm uma das seguintes ordens na direção do N-terminal ao C-terminal: a) VH-CH1ligante-VL-CL, b) VL-CL-ligante-VH-CH1, c) VH-CL-ligante-VL-CH1 ou d) VL

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CH1-ligante-VH-CL; e em que o referido ligante é um polipeptídeo de pelo menos 30 aminoácidos, preferencialmente entre 32 e 50 aminoácidos. Os referidos fragmentos Fab de cadeia única são estabilizados através da ligação dissulfeto natural entre o domínio CL e o domínio CH1.

[0188] Em algumas formas de realização de acordo com a invenção, a porção de ligação ao antígeno compreendida no domínio extracelular é um fragmento Fab de cadeia única cruzada que é um polipeptídeo que consiste em um domínio variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo, um domínio constante 1 (CH1) do anticorpo, um domínio variável da cadeia leve (VL) do anticorpo, um domínio constante da cadeia leve (CL) do anticorpo e um ligante, em que os referidos domínios de anticorpo e o referido ligante têm uma das seguintes ordens na direção do N-terminal ao C-terminal: a) VH-CL-ligante-VL-CH1 eb) VL-CH1-ligante-VH-CL; em que VH e VL formam juntos um sítio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a um antígeno e em que o referido ligante é um polipeptídeo de pelo menos 30 aminoácidos.

[0189] O receptor de ligação ao antígeno aqui fornecido ou suas partes pode compreender um peptídeo de sinal. Esse peptídeo de sinal trará a proteína para a superfície da membrana da célula T. Por exemplo, no receptor de ligação ao antígeno aqui fornecido, o peptídeo de sinal pode ter a sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 110 (como codificado pela sequência de DNA mostrada na SEQ ID NO: 111).

Receptores de Ligação ao Antígeno de Ativação de Células T capazes de se Ligarem Especificamente a Domínios Fc Mutados

[0190] Os componentes dos receptores de ligação ao antígeno, como aqui descritos, podem ser fundidos entre si em uma variedade de configurações para gerar receptores de ligação ao antígeno de ativação de células T.

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[0191] Em algumas formas de realização, o receptor de ligação ao antígeno compreende um domínio extracelular composto por um domínio variável da cadeia pesada (VH) e um domínio variável da cadeia leve (VL) conectado a um domínio transmembrana de ancoragem. Em algumas formas de realização, o domínio VH é fundido no C-terminal ao N-terminal do domínio VL, opcionalmente através de um ligante peptídico. Em outras formas de realização, o receptor de ligação ao antígeno compreende ainda um domínio de sinalização de estímulo e/ ou um domínio de sinalização de co-estímulo. Em uma forma de realização específica, o receptor de ligação ao antígeno consiste essencialmente em um domínio VH e um domínio VL, um domínio transmembrana de ancoragem e, opcionalmente, um domínio de sinalização de estímulo conectado por um ou mais ligantes peptídicos, em que o domínio VH é fundido no C-terminal ao N-terminal do domínio VL, e o domínio VL é fundido no C-terminal ao N-terminal do domínio transmembrana de ancoragem, em que o domínio transmembrana de ancoragem é fundido no C-terminal ao N-terminal do domínio de sinalização de estímulo. Opcionalmente, o receptor de ligação ao antígeno compreende ainda um domínio de sinalização de co-estímulo. Em uma dessas formas de realização específicas, o receptor de ligação ao antígeno consiste essencialmente em um domínio VH e um domínio VL, um domínio transmembrana de ancoragem, um domínio de sinalização de estímulo e um domínio de sinalização de co-estímulo conectado por um ou mais ligantes peptídicos, em que o domínio VH é fundido no C-terminal ao N-terminal do domínio VL, e o domínio VL é fundido no C-terminal ao N-terminal do domínio transmembrana de ancoragem, em que o domínio transmembrana de ancoragem é fundido no C-terminal ao N-terminal do domínio de sinalização de estímulo, em que o domínio de sinalização de estímulo é fundido no C-terminal ao N-terminal do domínio de sinalização de co-estímulo. Em uma forma de realização alternativa, o domínio de sinalização de co-estímulo é conectado ao

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89/293 domínio transmembrana de ancoragem em vez do domínio de sinalização de estímulo. Em uma forma de realização preferida, o receptor de ligação ao antígeno consiste essencialmente em um domínio VH e um domínio VL, um domínio transmembrana de ancoragem, um domínio de sinalização de coestímulo e um domínio de sinalização de estímulo conectado por um ou mais ligantes peptídicos, em que o domínio VH é fundido no C-terminal ao Nterminal do domínio VL, e o domínio VL é fundido no C-terminal ao N-terminal do domínio transmembrana de ancoragem, em que o domínio transmembrana de ancoragem é fundido no C-terminal ao N-terminal do domínio de sinalização de co-estímulo, em que o domínio de sinalização de co-estímulo é fundido no C-terminal ao N-terminal do domínio de sinalização de estímulo.

[0192] Em formas de realização preferidas, uma das porções de ligação é um fragmento Fab ou um fragmento crossFab. Em uma forma de realização preferida, a porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal da cadeia pesada de Fab ou crossFab ao N-terminal do domínio transmembrana de ancoragem, opcionalmente através de um ligante peptídico. Em uma forma de realização alternativa, a porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal da cadeia leve de Fab ou crossFab ao N-terminal do domínio transmembrana de ancoragem, opcionalmente através de um ligante peptídico. Em outras formas de realização, o receptor de ligação ao antígeno compreende ainda um domínio de sinalização de estímulo e/ ou um domínio de sinalização de co-estímulo. Em uma forma de realização específica, o receptor de ligação ao antígeno consiste essencialmente em um fragmento Fab ou crossFab, um domínio transmembrana de ancoragem e, opcionalmente, um domínio de sinalização de estímulo conectado por um ou mais ligantes peptídicos, em que o fragmento Fab ou crossFab é fundido no C- terminal da cadeia pesada ou leve ao N-terminal do domínio transmembrana de ancoragem, em que o domínio transmembrana de ancoragem é fundido no C

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90/293 terminal ao N-terminal do domínio de sinalização de estímulo. De preferência, ο receptor de ligação ao antígeno compreende ainda um domínio de sinalização de co-estímulo. Em uma dessas formas de realização, o receptor de ligação ao antígeno consiste essencialmente em um fragmento Fab ou crossFab, um domínio transmembrana de ancoragem, um domínio de sinalização de estímulo e um domínio de sinalização de co-estímulo conectado por um ou mais ligantes peptídicos, em que o fragmento Fab ou crossFab é fundido no C-terminal da cadeia pesada ou leve ao N-terminal do domínio transmembrana de ancoragem, em que o domínio de sinalização de estímulo é fundido no Cterminal ao N-terminal do domínio de sinalização de co-estímulo. Em uma forma de realização preferida, o domínio de sinalização de co-estímulo está conectado ao domínio transmembrana de ancoragem em vez do domínio de sinalização de estímulo. Em uma forma de realização mais preferida, o receptor de ligação ao antígeno consiste essencialmente em um fragmento Fab ou crossFab, um domínio transmembrana de ancoragem, um domínio de sinalização de co-estímulo e um domínio de sinalização de estímulo, em que o fragmento Fab ou crossFab é fundido no C-terminal da cadeia pesada ao Nterminal do domínio transmembrana de ancoragem através de um ligante peptídico, em que o domínio transmembrana de ancoragem é fundido no Cterminal ao N-terminal do domínio de sinalização de co-estímulo, em que o domínio de sinalização de co-estímulo é fundido no C-terminal ao N-terminal do domínio de sinalização de estímulo.

[0193] A porção de ligação ao antígeno, o domínio transmembrana de ancoragem e os domínios de sinalização de estímulo e/ ou de co-estímulo podem ser fundidos um ao outro diretamente ou através de um ou mais ligantes peptídicos, compreendendo um ou mais aminoácidos, tipicamente cerca de 2-20 aminoácidos. Os ligantes peptídicos são conhecidos na técnica e são aqui descritos. Os ligantes peptídicos não imunogênicos

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91/293 adequados incluem, por exemplo, ligantes peptídicos (G4S)n, (SG4)n, (G4S)_n ou G4(SG4)n, em que “n” é geralmente um número entre 1 e 10, tipicamente entre 2 e 4. Um ligante peptídico preferido para conectar a porção de ligação ao antígeno e a porção transmembrana de ancoragem é GGGGS (G4S) de acordo com a SEQ ID NO 17. Um ligante peptídico exemplificativo adequado para conectar a cadeia pesada variável (VH) e a cadeia leve variável (VL) é GGGSGGGSGGGSGGGS (G4S)4 de acordo com a SEQ ID NO 16.

[0194] Além disso, os ligantes podem compreender (uma porção de) uma região de dobradiça de imunoglobulina. Particularmente quando uma porção de ligação ao antígeno é fundida ao N-terminal de um domínio transmembrana de ancoragem, pode ser fundida através de uma região de dobradiça de imunoglobulina ou de uma porção da mesma, com ou sem um ligante peptídico adicional.

[0195] Como aqui descrito, os receptores de ligação ao antígeno da presente invenção compreendem um domínio extracelular que compreende pelo menos uma porção de ligação ao antígeno. Um receptor de ligação ao antígeno com uma única porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um antígeno da célula alvo é útil e preferido, particularmente nos casos em que é necessária alta expressão do receptor de ligação ao antígeno. Nesses casos, a presença de mais de uma porção de ligação ao antígeno específica para 0 antígeno da célula alvo pode limitar a eficiência da expressão do receptor de ligação ao antígeno. Em outros casos, no entanto, será vantajoso ter um receptor de ligação ao antígeno que compreende duas ou mais porções de ligação ao antígeno específicas para um antígeno da célula alvo, por exemplo, para otimizar 0 direcionamento para 0 sítio alvo ou para permitir a reticulação de antígenos da célula alvo.

[0196] Em uma forma de realização particular, 0 receptor de ligação ao antígeno compreende uma porção de ligação ao antígeno capaz de

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92/293 se ligar especificamente a um domínio Fc mutado, em particular um domínio Fc de lgG1, que compreende a mutação P329G. Em uma forma de realização, a porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado, mas que não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado é um scFv, um Fab ou um crossFab.

[0197] Em uma forma de realização, a porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal do fragmento scFv ou no C-terminal da cadeia pesada de Fab ou crossFab ao N-terminal de um domínio transmembrana de ancoragem, opcionalmente através de um ligante peptídico. Em uma forma de realização, o ligante peptídico compreende a sequência de aminoácidos GGGGS (SEQ ID NO: 16). Em uma forma de realização, o domínio transmembrana de ancoragem é um domínio transmembrana selecionado a partir do grupo que consiste no domínio transmembrana de CD8, CD3z, FCGR3A, NKG2D, CD27, CD28, CD137, 0X40, ICOS, DAP10 ou DAP12 ou um fragmento do mesmo. Em uma forma de realização preferida, o domínio transmembrana de ancoragem é o domínio transmembrana de CD28 ou um fragmento do mesmo. Em uma forma de realização particular, o domínio transmembrana de ancoragem compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO: 11). Em uma forma de realização, o receptor de ligação ao antígeno compreende ainda um domínio de sinalização de co-estímulo (CSD). Em uma forma de realização, o domínio transmembrana de ancoragem do receptor de ligação ao antígeno é fundido no C-terminal ao N-terminal de um domínio de sinalização de coestímulo. Em uma forma de realização, o domínio de sinalização de coestímulo é selecionado individualmente a partir do grupo que consiste no domínio intracelular de CD27, CD28, CD137, 0X40, ICOS, DAP10 e DAP12, ou fragmentos dos mesmos, conforme descrito anteriormente. Em uma forma de realização preferida, o domínio de sinalização de co-estímulo é o domínio

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93/293 intracelular de CD28 ou um fragmento do mesmo. Em uma forma de realização particular, o domínio de sinalização de co-estímulo compreende ou consiste na sequência RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 12). Em uma forma de realização, o receptor de ligação ao antígeno compreende ainda um domínio de sinalização de estímulo. Em uma forma de realização, o domínio de sinalização de co-estímulo do receptor de ligação ao antígeno é fundido no C-terminal ao N-terminal do domínio de sinalização de estímulo. Em uma forma de realização, o pelo menos um domínio de sinalização de estímulo é selecionado individualmente a partir do grupo que consiste no domínio intracelular de CD3z, FCGR3A e NKG2D, ou fragmentos do mesmo. Em uma forma de realização preferida, o domínio de sinalização de co-estímulo é o domínio intracelular de CD3z ou um fragmento do mesmo. Em uma forma de realização específica, o domínio de sinalização de co-estímulo compreende ou consiste na sequência: RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPR RKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTY DALHMQALPPR (SEQ ID NO:13).

[0198] Em uma forma de realização, o receptor de ligação ao antígeno é fundido a uma proteína repórter, particularmente a GFP ou seus análogos aprimorados. Em uma forma de realização, o receptor de ligação ao antígeno é fundido no C-terminal ao N-terminal de eGFP (proteína fluorescente verde aprimorada), opcionalmente através de um ligante peptídico, como descrito aqui. Em uma forma de realização preferida, o ligante peptídico é GEGRGSLLTCGDVEENPGP (T2A) de acordo com a SEQ ID NO: 18.

[0199] Em uma forma de realização específica, o receptor de ligação ao antígeno compreende um domínio transmembrana de ancoragem e um domínio extracelular que compreende pelo menos uma porção de ligação ao antígeno, em que a pelo menos uma porção de ligação ao antígeno é um

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94/293 fragmento scFv capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado, mas que não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado, em que o domínio Fc mutado compreende a mutação P329G. A mutação P329G reduz a ligação do receptor Fcy. Em uma forma de realização, o receptor de ligação ao antígeno da invenção compreende um domínio transmembrana de ancoragem (ATD), um domínio de sinalização de coestímulo (CSD) e um domínio de sinalização de estímulo (SSD). Em uma dessas formas de realização, o receptor de ligação ao antígeno tem a configuração scFv-ATD-CSD-SSD. Em uma forma de realização preferida, o receptor de ligação ao antígeno tem a configuração scFv-G4S-ATD-CSD-SSD, em que G4S é um ligante que compreende a sequência GGGGS de SEQ ID NO: 17. Opcionalmente, uma proteína repórter pode ser adicionada ao Cterminal do receptor de ligação ao antígeno, opcionalmente através de um ligante peptídico.

[0200] Em uma forma de realização específica, a porção de ligação ao antígeno é um fragmento scFv capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado que compreende a mutação P329G, em que a porção de ligação ao antígeno compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3 e pelo menos uma CDR da cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6.

[0201] Em uma forma de realização preferida, a porção de ligação ao antígeno é um scFv capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado que compreende a mutação P329G, em que a porção de ligação ao antígeno compreende a sequência de aminoácidos RYWMN (SEQ ID NO: 1) da região determinante de complementaridade (CDR H) 1; a sequência de aminoácidos EITPDSSTINYTPSLKD (SEQ ID NO: 2) da CDR H2, a sequência

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95/293 de aminoácidos PYDYGAWFAS (SEQ ID NO: 3) da CDR H3, a sequência de aminoácidos RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 4) da região determinante de complementaridade da cadeia leve (CDR L) 1, a sequência de aminoácidos GTNKRAP (SEQ ID NO: 5) da CDR L2 e a sequência de aminoácidos ALWYSNHWV (SEQ ID NO: 6) da CDR L3.

[0202] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece urn receptor de ligação ao antígeno, que compreende, em ordem, do N-terminal ao C-terminal:

(i) uma porção de ligação ao antígeno que é um fragmento scFv capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado que compreende a mutação P329G, em que o fragmento scFv compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) que compreende a região determinante de complementaridade (CDR) 1 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 1, a CDR 2 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 2, a CDR 3 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 3 e uma região variável da cadeia leve (VH) que compreende a CDR 1 da cadeia leve de SEQ ID NO: 4, a CDR 2 da cadeia leve de SEQ ID NO: 5 e a CDR 3 da cadeia leve de SEQ ID NO: 6;

(ii) um ligante peptídico, em particular o ligante peptídico de SEQ ID NO: 17;

(iii) um domínio transmembrana de ancoragem, em particular o domínio transmembrana de ancoragem de SEQ ID NO: 11;

(iii) um domínio de sinalização de co-estímulo, em particular o domínio de sinalização de co-estímulo de SEQ ID NO: 12; e (iv) um domínio de sinalização de estímulo, em particular o domínio de sinalização de estímulo de SEQ ID NO: 13.

[0203] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um receptor de ligação ao antígeno que compreende, em ordem, do N-terminal ao C-terminal:

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96/293 (i) uma porção de ligação ao antígeno que é uma molécula de scFv capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado que compreende a mutação P329G, em que o scFv compreende um domínio variável da cadeia pesada (VH) selecionado a partir de SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 32 e o domínio variável da cadeia leve (VL) selecionado a partir de SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 33;

[0204] Em uma forma de realização preferida, a presente invenção fornece um receptor de ligação ao antígeno que compreende, em ordem, do Nterminal ao C-terminal:

(i) uma porção de ligação ao antígeno que é uma molécula de scFv capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado que compreende a mutação P329G, em que o scFv compreende o domínio variável da cadeia pesada (VH) SEQ ID NO: 8 e o domínio variável da cadeia leve (VL) SEQ ID NO: 9;

(iii) um domínio de sinalização de co-estímulo, em particular o domínio de sinalização de co-estímulo de SEQ ID NO: 12; e

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97/293 (iv) um domínio de sinalização de estímulo, em particular o domínio de sinalização de estímulo de SEQ ID NO: 13.

[0205] Em uma forma de realização preferida, a presente invenção fornece um receptor de ligação ao antígeno que compreende, em ordem, do Nterminal ao C-terminal:

(i) uma porção de ligação ao antígeno que é uma molécula de scFv capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado que compreende a mutação P329G, em que o scFv compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 34;

[0206] Em uma forma de realização específica, a porção de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado que compreende a mutação P329G, em que o receptor de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31.

[0207] Em uma forma de realização preferida, a porção de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado que compreende a mutação P329G, em que o receptor de ligação ao antígeno compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31.

[0208] Em uma forma de realização preferida, a porção de ligação

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98/293 ao antígeno é um fragmento Fab. Em uma forma de realização, a porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal da cadeia pesada de Fab ao Nterminal de um domínio transmembrana de ancoragem. Em uma forma de realização, o domínio transmembrana de ancoragem é um domínio transmembrana selecionado a partir do grupo que consiste no domínio transmembrana de CD8, CD3z, FCGR3A, NKG2D, CD27, CD28, CD137, 0X40, ICOS, DAP10 ou DAP12 ou um fragmento do mesmo. Em uma forma de realização preferida, o domínio transmembrana de ancoragem é o domínio transmembrana de CD28 ou um fragmento do mesmo. Em uma forma de realização particular, o domínio transmembrana de ancoragem é FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO: 11). Em uma forma de realização, o receptor de ligação ao antígeno compreende ainda um domínio de sinalização de co-estímulo (CSD). Em uma forma de realização, o domínio transmembrana de ancoragem do receptor de ligação ao antígeno é fundido no C-terminal ao N-terminal de um domínio de sinalização de co-estímulo. Em uma forma de realização, o domínio de sinalização de co-estímulo é selecionado individualmente a partir do grupo que consiste no domínio intracelular de CD27, CD28, CD137, 0X40, ICOS, DAP10 e DAP12, ou fragmentos dos mesmos, como descrito aqui anteriormente. Em uma forma de realização preferida, o domínio de sinalização de co-estímulo é o domínio intracelular de CD28 ou um fragmento do mesmo. Em uma forma de realização particular, o domínio de sinalização de co-estímulo compreende ou consiste na sequência: RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 12). Em uma forma de realização, o receptor de ligação ao antígeno compreende ainda um domínio de sinalização de estímulo. Em uma forma de realização, o domínio de sinalização de co-estímulo do receptor de ligação ao antígeno é fundido no C-terminal ao N-terminal do domínio de sinalização de estímulo. Em uma forma de realização, o pelo menos um

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99/293 domínio de sinalização de estímulo é selecionado individualmente a partir do grupo que consiste no domínio intracelular de CD3z, FCGR3A e NKG2D, ou fragmentos do mesmo. Em uma forma de realização preferida, o domínio de sinalização de co-estímulo é o domínio intracelular de CD3z ou um fragmento do mesmo. Em uma forma de realização específica, o domínio de sinalização de co-estímulo compreende ou consiste na sequência: RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPR RKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTY DALHMQALPPR (SEQ ID NO:13).

[0209] Em uma forma de realização, o receptor de ligação ao antígeno é fundido a uma proteína repórter, particularmente a GFP ou seus análogos aprimorados. Em uma forma de realização, o receptor de ligação ao antígeno é fundido no C-terminal ao N-terminal do eGFP (proteína fluorescente verde aprimorada), opcionalmente através de um ligante peptídico, como descrito aqui. Em uma forma de realização preferida, o ligante peptídico é GEGRGSLLTCGDVEENPGP (T2A) de SEQ ID NO: 18.

[0210] Em uma forma de realização específica, o receptor de ligação ao antígeno compreende um domínio transmembrana de ancoragem e um domínio extracelular que compreende pelo menos uma porção de ligação ao antígeno, em que a pelo menos uma porção de ligação ao antígeno é um fragmento Fab capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado, mas que não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado, em que o domínio Fc mutado compreende a mutação P329G, em que a mutação P329G reduz a ligação ao receptor Fcy. Em uma forma de realização, o receptor de ligação ao antígeno da invenção compreende um domínio transmembrana de ancoragem (ATD), um domínio de sinalização de co-estímulo (CSD) e um domínio de sinalização de estímulo (SSD). Em uma dessas formas de realização, o receptor de ligação ao antígeno tem a

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100/293 configuração Fab-ATD-CSD-SSD. Em uma forma de realização preferida, ο receptor de ligação ao antígeno tem a configuração Fab-G4S-ATD-CSD-SSD, em que G4S é um ligante que compreende a sequência GGGGS de SEQ ID NO: 17. Opcionalmente, uma proteína repórter pode ser adicionada ao Cterminal do receptor de ligação ao antígeno, opcionalmente através de um ligante peptídico.

[0211] Em uma forma de realização específica, a porção de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado que compreende a mutação P329G, em que a porção de ligação ao antígeno é um fragmento Fab que compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3 e pelo menos uma CDR de cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6.

[0212] Em uma forma de realização preferida, a porção de ligação ao antígeno é um fragmento Fab capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado que compreende a mutação P329G, em que a porção de ligação ao antígeno compreende a sequência de aminoácidos RYWMN (SEQ ID NO: 1) da região determinante de complementaridade (CDR H) 1, a sequência de aminoácidos EITPDSSTINYTPSLKD (SEQ ID NO: 2) da CDR H2, a sequência de aminoácidos PYDYGAWFAS (SEQ ID NO: 3) da CDR H3, a sequência de aminoácidos RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 4) da região determinante de complementaridade da cadeia leve (CDR L) 1, a sequência de aminoácidos GTNKRAP (SEQ ID NO: 5) da CDR L2 e a sequência de aminoácidos ALWYSNHWV (SEQ ID NO: 6) da CDR L3.

[0213] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um receptor de ligação ao antígeno que compreende, em ordem, do N-terminal ao C-terminal:

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101/293 (i) uma porção de ligação ao antígeno que é uma molécula de Fab capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado que compreende a mutação P329G, que compreende a região determinante de complementaridade (CDR) 1 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 1, a CDR 2 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 2, a CDR 3 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 3, a CDR 1 da cadeia leve de SEQ ID NO: 4, a CDR 2 da cadeia leve de SEQ ID NO: 5 e a CDR 3 da cadeia leve da SEQ ID NO: 6;

[0214] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um receptor de ligação ao antígeno que compreende:

a) um polipeptídeo de fusão de cadeia pesada que compreende, em ordem, do N-terminal ao C-terminal:

(i) uma cadeia pesada que compreende a região determinante de complementaridade (CDR) 1 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 1, a CDR 2 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 2, a CDR 3 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 3;

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102/293 (iv) um domínio de sinalização de estímulo, em particular o domínio de sinalização de estímulo de SEQ ID NO: 13 e

b) uma cadeia leve que compreende a CDR 1 da cadeia leve de SEQ ID NO: 4, a CDR 2 da cadeia leve de SEQ ID NO: 5 e a CDR 3 da cadeia leve de SEQ ID NO: 6.

[0215] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um receptor de ligação ao antígeno que compreende:

(i) o domínio variável da cadeia pesada (VH) SEQ ID NO: 8;

(iii) um domínio de sinalização de co-estímulo, em particular o domínio de sinalização de co-estímulo de SEQ ID NO: 12; e (iv) um domínio de sinalização de estímulo, em particular o domínio de sinalização de estímulo de SEQ ID NO: 13 e

b) o domínio variável da cadeia leve (VL) SEQ ID NO: 9.

[0216] Em uma forma de realização, a porção de ligação ao antígeno é um fragmento Fab que compreende uma cadeia pesada que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 ou SEQ ID NO: 49 e uma cadeia leve que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 ou SEQ ID NO: 50. Em uma forma de realização preferida, a porção de ligação ao antígeno é um fragmento Fab que compreende uma cadeia pesada compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 e uma cadeia leve compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

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103/293

41.

[0217] Em uma forma de realização específica, a porção de ligação ao antígeno é um fragmento Fab capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado que compreende a mutação P329G, em que o receptor de ligação ao antígeno compreende um polipeptídeo de fusão de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 48 e um polipeptídeo de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 41 e SEQ ID NO: 50.

[0218] Em uma forma de realização preferida, a porção de ligação ao antígeno é um fragmento Fab capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado que compreende a mutação P329G, em que o receptor de ligação ao antígeno compreende um polipeptídeo de fusão de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 e um polipeptídeo de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41.

[0219] Em uma forma de realização alternativa, o receptor de ligação ao antígeno compreende uma porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado, em particular um domínio Fc de lgG1, que compreende as mutações I253A, H310A e H435A (“AAA”). Em uma forma de realização, a porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado, mas que não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado é um scFv, um Fab ou um crossFab.

[0220] Em uma forma de realização, a porção de ligação ao

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104/293 antígeno é fundida no C-terminal do fragmento scFv ou no C-terminal da cadeia pesada de Fab ou crossFab ao N-terminal de um domínio transmembrana de ancoragem, opcionalmente através de um ligante peptídico. Em uma forma de realização, o ligante peptídico compreende a sequência de aminoácidos GGGGS (SEQ ID NO: 16). Em uma forma de realização, o domínio transmembrana de ancoragem é um domínio transmembrana selecionado a partir do grupo que consiste no domínio transmembrana de CD8, CD3z, FCGR3A, NKG2D, CD27, CD28, CD137, 0X40, ICOS, DAP10 ou DAP12 ou um fragmento do mesmo. Em uma forma de realização preferida, o domínio transmembrana de ancoragem é o domínio transmembrana de CD28 ou um fragmento do mesmo. Em uma forma de realização particular, o domínio transmembrana de ancoragem compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO: 11). Em uma forma de realização, o receptor de ligação ao antígeno compreende ainda um domínio de sinalização de co-estímulo (CSD). Em uma forma de realização, o domínio transmembrana de ancoragem do receptor de ligação ao antígeno é fundido no C-terminal ao N-terminal de um domínio de sinalização de coestímulo. Em uma forma de realização, o domínio de sinalização de coestímulo é selecionado individualmente a partir do grupo que consiste no domínio intracelular de CD27, CD28, CD137, 0X40, ICOS, DAP10 e DAP12, ou fragmentos dos mesmos, conforme descrito anteriormente. Em uma forma de realização preferida, o domínio de sinalização de co-estímulo é o domínio intracelular de CD28 ou um fragmento do mesmo. Em uma forma de realização particular, o domínio de sinalização de co-estímulo compreende ou consiste na sequência: RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 12). Em uma forma de realização, o receptor de ligação ao antígeno compreende ainda um domínio de sinalização de estímulo. Em uma forma de realização, o domínio de sinalização de co-estímulo do receptor de

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105/293 ligação ao antígeno é fundido no C-terminal ao N-terminal do domínio de sinalização de estímulo. Em uma forma de realização, o pelo menos um domínio de sinalização de estímulo é selecionado individualmente a partir do grupo que consiste no domínio intracelular de CD3z, FCGR3A e NKG2D, ou seus fragmentos. Em uma forma de realização preferida, o domínio de sinalização de co-estímulo é o domínio intracelular de CD3z ou um fragmento do mesmo. Em uma forma de realização específica, o domínio de sinalização de co-estímulo compreende ou consiste na sequência: RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPR RKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTY DALHMQALPPR (SEQ ID NO:13).

[0221] Em uma forma de realização, o receptor de ligação ao antígeno é fundido a uma proteína repórter, particularmente a GFP ou seus análogos aprimorados. Em uma forma de realização, o receptor de ligação ao antígeno é fundido no C-terminal ao N-terminal do eGFP (proteína fluorescente verde aprimorada), opcionalmente através de um ligante peptídico, como descrito aqui. Em uma forma de realização preferida, o ligante peptídico é GEGRGSLLTCGDVEENPGP (T2A) de acordo com a SEQ ID NO: 18.

[0222] Em uma forma de realização específica, o receptor de ligação ao antígeno compreende um domínio transmembrana de ancoragem e um domínio extracelular que compreende pelo menos uma porção de ligação ao antígeno, em que a pelo menos uma porção de ligação ao antígeno é um fragmento scFv capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado, mas que não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado, em que o domínio Fc mutado compreende as mutações I253A, H310A e H435A. As mutações I253A, H310A e H435A reduzem a ligação ao receptor FcRn. Em uma forma de realização, o receptor de ligação ao antígeno da invenção compreende um domínio transmembrana de ancoragem (ATD), um

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106/293 domínio de sinalização de co-estímulo (CSD) e um domínio de sinalização de estímulo (SSD). Em uma dessas formas de realização, o receptor de ligação ao antígeno tem a configuração scFv-ATD-CSD-SSD. Em uma forma de realização preferida, o receptor de ligação ao antígeno tem a configuração scFv-G4S-ATD-CSD-SSD, em que G4S é um ligante que compreende a sequência GGGGS de SEQ ID NO: 17. Opcionalmente, uma proteína repórter pode ser adicionada ao C-terminal do receptor de ligação ao antígeno, opcionalmente através de um ligante peptídico.

[0223] Em uma forma de realização específica, a porção de ligação ao antígeno é um fragmento de scFv capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado que compreende as mutações I253A, H310A e H435A, em que a porção de ligação ao antígeno compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 e SEQ ID NO: 55 e pelo menos uma CDR de cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58.

[0224] Em uma forma de realização preferida, a porção de ligação ao antígeno é um scFv capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado que compreende as mutações I253A, H310A e H435A, em que a porção de ligação ao antígeno compreende a sequência de aminoácidos SYGMS (SEQ ID NO: 53) da região determinante de complementaridade (CDR H) 1, a sequência de aminoácidos SSGGSY (SEQ ID NO: 54) da CDR H2, a sequência de aminoácidos LGMITTGYAMDY (SEQ ID NO: 55) da CDR H3, a sequência de aminoácidos RSSQTIVHSTGHTYLE (SEQ ID NO: 56) da região determinante de complementaridade (CDR L) 1 da cadeia leve, a sequência de aminoácidos KVSNRFS (SEQ ID NO: 57) da CDR L2 e a sequência de aminoácidos FQGSHVPYT (SEQ ID NO: 58) da CDR L3.

[0225] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece

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107/293 um receptor de ligação ao antígeno, que compreende, em ordem, do N-terminal ao C-terminal:

(i) uma porção de ligação ao antígeno que é um fragmento scFv capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado que compreende as mutações I253A, H310A e H435A, em que o fragmento scFv compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) que compreende a região determinante de complementaridade (CDR) 1 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 53, a CDR 2 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 54, a CDR 3 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 55 e uma região variável da cadeia leve (VH) que compreende a CDR 1 da cadeia leve de SEQ ID NO: 56, a CDR 2 da cadeia leve de SEQ ID NO: 57 e a CDR 3 da cadeia leve de SEQ ID NO: 58;

[0226] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um receptor de ligação ao antígeno que compreende, em ordem, do N-terminal ao C-terminal:

(i) uma porção de ligação ao antígeno que é uma molécula de scFv capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado que compreende as mutações I253A, H310A e H435A, em que o scFv compreende o domínio variável da cadeia pesada (VH) de SEQ ID NO: 61 e o domínio variável da cadeia leve (VL) de SEQ ID NO: 62;

(ii) um ligante peptídico, em particular o ligante peptídico de SEQ

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108/293

ID NO: 17;

(iii) um domínio de sinalização de co-estimulo, em particular o domínio de sinalização de co-estimulo de SEQ ID NO: 12; e (iv) um domínio de sinalização de estímulo, em particular o domínio de sinalização de estímulo de SEQ ID NO: 13.

[0227] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece urn receptor de ligação ao antígeno que compreende, em ordem, do N-terminal ao C-terminal:

(i) uma porção de ligação ao antígeno que é uma molécula de scFv capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado que compreende as mutações I253A, H310A e H435A, em que o scFv compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60;

[0228] Em uma forma de realização específica, a porção de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado que compreende as mutações I253A, H310A e H435A, em que o receptor de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59.

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109/293

[0229] Em uma forma de realização preferida, a porção de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado que compreende as mutações I253A, H310A e H435A, em que o receptor de ligação ao antígeno compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 595.

[0230] Em uma forma de realização preferida, a porção de ligação ao antígeno é um fragmento Fab. Em uma forma de realização, a porção de ligação ao antígeno é fundida no C-terminal da cadeia pesada de Fab ao Nterminal de um domínio transmembrana de ancoragem. Em uma forma de realização, o domínio transmembrana de ancoragem é um domínio transmembrana selecionado a partir do grupo que consiste no domínio transmembrana de CD8, CD3z, FCGR3A, NKG2D, CD27, CD28, CD137, 0X40, ICOS, DAP10 ou DAP12 ou um fragmento do mesmo. Em uma forma de realização preferida, o domínio transmembrana de ancoragem é o domínio transmembrana de CD28 ou um fragmento do mesmo. Em uma forma de realização particular, o domínio transmembrana de ancoragem é FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO: 11). Em uma forma de realização, o receptor de ligação ao antígeno compreende ainda um domínio de sinalização de co-estímulo (CSD). Em uma forma de realização, o domínio transmembrana de ancoragem do receptor de ligação ao antígeno é fundido no C-terminal ao N-terminal de um domínio de sinalização de co-estímulo. Em uma forma de realização, o domínio de sinalização de co-estímulo é selecionado individualmente a partir do grupo que consiste no domínio intracelular de CD27, CD28, CD137, 0X40, ICOS, DAP10 e DAP12, ou fragmentos dos mesmos, como descrito aqui anteriormente. Em uma forma de realização preferida, o domínio de sinalização de co-estímulo é o domínio intracelular de CD28 ou um fragmento do mesmo. Em uma forma de realização particular, o domínio de sinalização de co-estímulo compreende ou consiste na

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110/293 sequência RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 12). Em uma forma de realização, o receptor de ligação ao antígeno compreende ainda um domínio de sinalização de estímulo. Em uma forma de realização, o domínio de sinalização de co-estímulo do receptor de ligação ao antígeno é fundido no C-terminal ao N-terminal do domínio de sinalização de estímulo. Em uma forma de realização, o pelo menos um domínio de sinalização de estímulo é selecionado individualmente a partir do grupo que consiste no domínio intracelular de CD3z, FCGR3A e NKG2D, ou fragmentos dos mesmos. Em uma forma de realização preferida, o domínio de sinalização de co-estímulo é o domínio intracelular de CD3z ou um fragmento do mesmo. Em uma forma de realização específica, o domínio de sinalização de co-estímulo compreende ou consiste na sequência: RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPR RKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTY DALHMQALPPR (SEQ ID NO:13).

[0231] Em uma forma de realização, o receptor de ligação ao antígeno é fundido a uma proteína repórter, particularmente a GFP ou seus análogos aprimorados. Em uma forma de realização, o receptor de ligação ao antígeno é fundido no C-terminal ao N-terminal do eGFP (proteína fluorescente verde aprimorada), opcionalmente através de um ligante peptídico, como descrito aqui. Em uma forma de realização preferida, o ligante peptídico é GEGRGSLLTCGDVEENPGP (T2A) de SEQ ID NO: 18.

[0232] Em uma forma de realização específica, o receptor de ligação ao antígeno compreende um domínio transmembrana de ancoragem e um domínio extracelular que compreende pelo menos uma porção de ligação ao antígeno, em que a pelo menos uma porção de ligação ao antígeno é um fragmento Fab capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado, mas que não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não

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111/293 mutado, em que o domínio Fc mutado compreende as mutações I253A, H310A e H435A, em que as mutações I253A, H310A e H435A reduzem a ligação ao receptor FcRn. Em uma forma de realização, o receptor de ligação ao antígeno da invenção compreende um domínio transmembrana de ancoragem (ATD), um domínio de sinalização de co-estímulo (CSD) e um domínio de sinalização de estímulo (SSD). Em uma dessas formas de realização, o receptor de ligação ao antígeno tem a configuração Fab-ATD-CSD-SSD. Em uma forma de realização preferida, o receptor de ligação ao antígeno tem a configuração FabG4S-ATD-CSD-SSD, em que G4S é um ligante que compreende a sequência GGGGS de SEQ ID NO: 17. Opcionalmente, uma proteína repórter pode ser adicionada ao C-terminal do receptor de ligação ao antígeno, opcionalmente através de um ligante peptídico.

[0233] Em uma forma de realização específica, a porção de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado que compreende as mutações I253A, H310A e H435A, em que a porção de ligação ao antígeno é um fragmento Fab que compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 e SEQ ID NO: 55 e pelo menos uma CDR de cadeia leve selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58.

[0234] Em uma forma de realização preferida, a porção de ligação ao antígeno é um fragmento Fab capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado que compreende as mutações I253A, H310A e H435A, em que a porção de ligação ao antígeno compreende a sequência de aminoácidos SYGMS (SEQ ID NO: 53) da região determinante de complementaridade (CDR H) 1, a sequência de aminoácidos SSGGSY (SEQ ID NO: 54) da CDR H2, a sequência de aminoácidos LGMITTGYAMDY (SEQ ID NO: 55) da CDR H3, a sequência de aminoácidos RSSQTIVHSTGHTYLE (SEQ ID NO: 56) da região

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112/293 determinante de complementaridade (CDR L) 1 da cadeia leve, a sequência de aminoácidos KVSNRFS (SEQ ID NO: 57) da CDR L2 e a sequência de aminoácidos FQGSHVPYT (SEQ ID NO: 58) da CDR L3.

[0235] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um receptor de ligação ao antígeno que compreende, em ordem, do N-terminal ao C-terminal:

(i) uma porção de ligação ao antígeno que é uma molécula de Fab capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado que compreende as mutações I253A, H310A e H435A, que compreende a região determinante de complementaridade (CDR) 1 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 53, a CDR 2 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 54, a CDR 3 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 55, a CDR 1 da cadeia leve de SEQ ID NO: 56, a CDR 2 da cadeia leve de SEQ ID NO: 57 e a CDR 3 da cadeia leve de SEQ ID NO: 58;

[0236] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um receptor de ligação ao antígeno que compreende:

(i) uma cadeia pesada que compreende a região determinante de complementaridade (CDR) 1 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 53, a CDR 2 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 54, a CDR 3 da cadeia pesada de SEQ ID NO:

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113/293

55;

b) uma cadeia leve que compreende a CDR 1 da cadeia leve de SEQ ID NO: 56, a CDR 2 da cadeia leve de SEQ ID NO: 57 e a CDR 3 da cadeia leve de SEQ ID NO: 58.

[0237] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um receptor de ligação ao antígeno que compreende:

(i) o domínio variável da cadeia pesada (VH) SEQ ID NO: 61;

b) o domínio variável da cadeia leve (VL) SEQ ID NO: 62.

[0238] Em uma forma de realização específica, a porção de ligação ao antígeno é um fragmento Fab que compreende uma cadeia pesada

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114/293 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64 e uma cadeia leve compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65.

[0239] Em uma forma de realização específica, a porção de ligação ao antígeno é um fragmento Fab capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado que compreende as mutações I253A, H310A e H435A, em que o receptor de ligação ao antígeno compreende um polipeptídeo de fusão de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que está em pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63 e um polipeptídeo de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65.

[0240] Em uma forma de realização preferida, a porção de ligação ao antígeno é um fragmento Fab capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado que compreende as mutações I253A, H310A e H435A, em que o receptor de ligação ao antígeno compreende um polipeptídeo de fusão de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63 e um polipeptídeo de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65.

[0241] Em certas formas de realização alternativas, o receptor de ligação ao antígeno da invenção, o polipeptídeo de cadeia leve de Fab e o polipeptídeo de fusão da cadeia pesada de Fab são fundidos um ao outro, opcionalmente através de um ligante peptídico. A fusão das cadeias pesada e leve de Fab pode melhorar o emparelhamento das cadeias pesada e leve de Fab, e também reduz o número de plasmídeos necessários para a expressão de alguns dos receptores de ligação ao antígeno da invenção. Uma estratégia alternativa para reduzir o número de plasmídeos necessários para a expressão

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115/293 do receptor de ligação ao antígeno é o uso de um lado interno da entrada ribossômica para permitir a expressão de construtos de cadeia pesada e leve a partir do mesmo plasmídeo, como ilustrado, por exemplo, na Figura 2.

[0242] Em certas formas de realização, o receptor de ligação ao antígeno compreende um polipeptídeo em que a região variável da cadeia leve de Fab da porção de ligação ao antígeno compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante da cadeia pesada de Fab da porção de ligação ao antígeno (isto é, a porção de ligação ao antígeno compreende um cadeia pesada de crossFab, em que a região variável da cadeia pesada é substituída por uma região variável da cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com o domínio transmembrana de ancoragem (VL(i)-CH1(i)-ATD). Em algumas formas de realização, o receptor de ligação ao antígeno compreende ainda um polipeptídeo em que a região variável da cadeia pesada de Fab da primeira porção de ligação ao antígeno compartilha uma ligação peptídica carboxiterminal com a região constante da cadeia leve de Fab da primeira porção de ligação ao antígeno (VH(i)-CL(i)). Em certas formas de realização, os polipeptídeos estão ligados covalentemente, por exemplo, por uma ligação dissulfeto. Em formas de realização alternativas, o receptor de ligação ao antígeno compreende um polipeptídeo em que a região variável da cadeia pesada de Fab da porção de ligação ao antígeno compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante da cadeia leve de Fab da porção de ligação ao antígeno (ou seja, a porção de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada de crossFab, em que a região constante da cadeia pesada é substituída por uma região constante da cadeia leve), que por sua vez compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com um domínio transmembrana de ancoragem (VH(i)-CL(i)-ATD). Em algumas formas de realização, o receptor de ligação ao antígeno compreende ainda um

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116/293 polipeptídeo em que a região variável da cadeia leve de Fab da porção de ligação ao antígeno compartilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com a região constante da cadeia pesada de Fab da porção de ligação ao antígeno (VL(i)-CH1 (η). Em certas formas de realização, os polipeptídeos estão ligados covalentemente, por exemplo, por uma ligação dissulfeto.

[0243] De acordo com qualquer uma das formas de realização acima, os componentes do receptor de ligação ao antígeno (por exemplo, VH e VL, porção de ligação ao antígeno, domínio transmembrana de ancoragem, domínio de sinalização de co-estímulo, domínio de sinalização de estímulo) podem ser fundidos diretamente ou através de vários ligantes, particularmente ligantes peptídicos que compreendem um ou mais aminoácidos, tipicamente cerca de 2-20 aminoácidos, que são descritos aqui ou são conhecidos na técnica. Os ligantes peptídicos não imunogênicos adequados incluem, por exemplo, ligantes peptídicos (G4S)n, (SG4)n, (G4S)_n ou G4(SG4)n, em que n é geralmente um número entre 1 e 10, preferencialmente entre 1 e 4.

Exemplos de Receptores de Ligação ao Antígeno de Ativação de Células T

[0244] Como mostrado de forma ilustrativa nos Exemplos anexos e na Figura 1A, como prova do conceito da presente invenção, o receptor de ligação ao antígeno “Anti-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD pETR17096” (SEQ ID NO: 7) foi construído, o qual compreende uma porção de ligação ao antígeno scFv estabilizada que se liga a/ é dirigida contra/ interage com ou em um anticorpo que compreende a mutação P329G no domínio Fc. O construto compreende ainda o domínio transmembrana de CD28, um fragmento de CD28 como domínio de sinalização de co-estímulo e um fragmento de CD3z como domínio de sinalização de estímulo. As sequências (aminoácido e cDNA) da molécula de ligação ao anticorpo “Anti-P329G-dsscFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD pETR17096” são mostradas nas Tabelas 2 e 3.

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[0245] Além disso, como ilustrado na Figura 1B, como uma prova adicional do conceito da presente invenção, o receptor de ligação ao antígeno “Anti-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD pETR17100” (SEQ ID NOs: 39, 41) foi construído, o qual compreende uma porção de ligação ao antígeno de Fab estabilizada que se liga a/ é dirigida contra/ interage com ou em um anticorpo que compreende as mutações P329G no domínio Fc. O construto compreende ainda o domínio transmembrana de CD28, um fragmento de CD28 como domínio de sinalização de co-estímulo e um fragmento de CD3z como domínio de sinalização de estímulo. As sequências (aminoácido e DNA) do receptor de ligação ao antígeno “Anti-P329G-ds-FabCD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD pETR17100” são mostradas nas Tabelas 4 e 5.

[0246] Como uma prova adicional do conceito da presente invenção, o receptor de ligação ao antígeno “Anti-P329G-Fab-CD28ATDCD28CSD-CD3zSSD pETR17594” (SEQ ID NOs: 48, 50) foi construído, o qual compreende uma porção de ligação ao antígeno de Fab que se liga a/ é dirigida contra/ interage com ou em um anticorpo que compreende as mutações P329G no domínio Fc. O construto compreende ainda o domínio transmembrana de CD28, um fragmento de CD28 como domínio de sinalização de co-estímulo e um fragmento de CD3z como domínio de sinalização de estímulo. As sequências (aminoácido e DNA) do receptor de ligação ao antígeno “Anti-P329G-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD pETR17594” são mostradas nas Tabelas 6 e 7.

[0247] Como prova adicional do conceito da presente invenção, o receptor de ligação ao antígeno “Anti-AAA scFv” (SEQ ID NO: 59) foi construído, o qual compreende uma porção de ligação ao antígeno de scFv que se liga a/ é dirigida contra/ interage com ou em um anticorpo que compreende as mutações I253A, H310A e H435A no domínio Fc. O construto

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118/293 compreende ainda o domínio transmembrana de CD28, um fragmento de CD28 como domínio de sinalização de co-estímulo e um fragmento de CD3z como domínio de sinalização de estímulo. As sequências (aminoácido e cDNA) da molécula de ligação ao anticorpo “Anti-AAA scFv” são mostradas abaixo nas Tabelas 8 e 9.

[0248] Como prova adicional do conceito da presente invenção, o receptor de ligação ao antígeno “Anti-AAA Fab” (SEQ ID NOs: 63, 65) foi construído, o qual compreende uma porção de ligação ao antígeno de Fab que se liga a/ é dirigida contra/ interage com ou em um anticorpo que compreende as mutações I253A, H310A e H435A no domínio Fc. O construto compreende ainda o domínio transmembrana de CD28, um fragmento de CD28 como domínio de sinalização de co-estímulo e um fragmento de CD3z como domínio de sinalização de estímulo. As sequências (aminoácido e cDNA) da molécula de ligação ao anticorpo “Anti-AAA scFv” são mostradas abaixo nas Tabelas 10 e 11.

[0249] A invenção também fornece molécula(s) de ácido nucleico que codifica(m) receptores de ligação ao antígeno da invenção, como aqui descrito. Também estão abrangidos pela presente invenção molécula(s) de ácido nucleico que codifica(m) os receptores de ligação ao antígeno da presente invenção e kits que compreendem molécula(s) de ácido nucleico de acordo com a invenção, como descrito aqui mais adiante.

Kits

[0250] Um aspecto adicional da presente invenção são kits que compreendem ou consistem em um ácido nucleico que codifica um receptor de ligação ao antígeno da invenção e/ ou células, preferencialmente células T transduzidas com receptores de ligação ao antígeno da invenção e, opcionalmente, anticorpo/ anticorpos compreendendo um domínio Fc mutado, em que o receptor de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente

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119/293 ao domínio Fc mutado.

[0251] Por conseguinte, é fornecido um kit que compreende:

(A) uma célula T transduzida capaz de expressar um receptor de ligação ao antígeno da invenção; e (B) um anticorpo que compreende um domínio Fc mutado;

[0252] Além disso, é fornecido um kit que compreende:

(A) um polinucleotídeo isolado e/ ou um vetor que codifica um receptor de ligação ao antígeno da invenção; e (B) um anticorpo que compreende um domínio Fc mutado;

[0253] No contexto da presente invenção, os kits da presente invenção podem compreender células T transduzidas, polinucleotídeos isolados e/ ou vetores e um ou mais anticorpos compreendendo um domínio Fc mutado. Em formas de realização particulares, o anticorpo é um anticorpo terapêutico, por exemplo, um anticorpo específico de tumor. Os antígenos específicos de tumor são conhecidos na técnica e aqui descritos. No contexto da presente invenção, o anticorpo é administrado antes, simultaneamente ou após a administração de células T transduzidas que expressam um receptor de ligação ao antígeno da invenção. Os kits de acordo com a presente invenção compreendem células T transduzidas ou polinucleotídeos/ vetores para gerar células T transduzidas. Neste contexto, as células T transduzidas são células T universais, uma vez que não são específicas para um determinado tumor, mas podem ser direcionadas a qualquer tumor, dependendo do anticorpo

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120/293 terapêutico que compreende o domínio Fc mutado. Aqui são fornecidos exemplos de anticorpos que compreendem um domínio Fc mutado, no entanto, qualquer anticorpo que compreende um domínio Fc mutado, como descrito aqui pode ser incluído nos kits aqui fornecidos. Em formas de realização particulares, o domínio Fc mutado dos anticorpos exibe afinidade de ligação reduzida a um receptor Fc e/ ou função efetora reduzida, em comparação com um domínio Fc de lgG1 nativo. Em uma dessas formas de realização, o domínio Fc mutado (ou o anticorpo que compreende o referido domínio Fc mutado) exibe menos de 50%, preferencialmente menos de 20%, mais preferencialmente menos de 10% e mais preferencialmente menos de 5% da afinidade de ligação a um receptor Fc, em comparação com um domínio Fc de lgG1 nativo (ou um anticorpo que compreende um domínio Fc de IgG 1 nativo) e/ou menos de 50%, preferencialmente menos de 20%, mais preferencialmente menos de 10% e mais preferencialmente menos de 5% da função efetora, em comparação com um domínio Fc de lgG1 nativo (ou um anticorpo que compreende um domínio Fc de lgG1 nativo). Em uma forma de realização, o domínio Fc mutado (ou o anticorpo que compreende o referido domínio Fc mutado) não se liga substancialmente a um receptor Fc e/ ou induz a função efetora. Em uma forma de realização particular, o receptor Fc é um receptor Fey. Em uma forma de realização, o receptor Fc é um receptor Fc humano. Em uma forma de realização, o receptor Fc é um receptor Fc de ativação. Em uma forma de realização específica, o receptor Fc é um receptor Fcy humano de ativação, mais especificamente FcyRllla, FcyRI ou FcyRlla humano, mais especificamente FcyRllla humano. Em uma forma de realização, a função efetora é uma ou mais selecionadas a partir do grupo de CDC, ADCC, ADCP e secreção de citocina. Em uma forma de realização específica, a função efetora é ADCC. Em uma forma de realização, o domínio Fc mutado exibe afinidade de ligação substancialmente alterada ao receptor Fc neonatal (FcRn), em

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121/293 comparação com um domínio Fc de IgG 1 nativo. Em uma forma de realização, o anticorpo que compreende o domínio Fc mutado exibe menos de 20%, particularmente menos de 10%, mais particularmente menos de 5% da afinidade de ligação a um receptor Fc em comparação com um anticorpo que compreende um domínio Fc não projetado. Em uma forma de realização particular, o receptor Fc é um receptor Fey. Em algumas formas de realização, o receptor Fc é um receptor Fc humano. Em algumas formas de realização, o receptor Fc é um receptor Fc de ativação. Em uma forma de realização específica, o receptor Fc é um receptor Fcy humano de ativação, mais especificamente FcyRllla, FcyRI ou FcyRlla humano, mais especificamente FcyRllla humano. De preferência, a ligação a cada um desses receptores é reduzida. Em algumas formas de realização, a afinidade de ligação a um componente do complemento, especificamente a afinidade de ligação a C1q, também é reduzida.

[0254] Em certas formas de realização, o domínio Fc do anticorpo é mutado para ter função efetora reduzida, em comparação com um domínio Fc não mutado. A função efetora reduzida pode incluir, mas não se limita a, uma ou mais das seguintes: citotoxicidade dependente de complemento reduzida (CDC), citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos reduzida (ADCC), fagocitose celular dependente de anticorpo reduzida (ADCP), secreção de citocinas reduzida, captação reduzida de antígeno mediada por complexos imunes por células apresentadoras de antígeno, ligação reduzida a células NK, ligação reduzida a macrófagos, ligação reduzida a monócitos, ligação reduzida a células polimorfonucleares, redução da sinalização direta induzindo apoptose, reticulação reduzida de anticorpos ligados ao alvo, maturação reduzida de células dendríticas ou iniciação reduzida de células T. Em uma forma de realização, a função efetora reduzida é um ou mais selecionadas a partir do grupo de CDC reduzida, ADCC reduzida, ADCP

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122/293 reduzida e secreção reduzida de citocinas. Em uma forma de realização particular, a função efetora reduzida é ADCC reduzida. Em uma forma de realização, a ADCC reduzida é inferior a 20% da ADCC induzida por um domínio Fc não projetado (ou um anticorpo que compreende um domínio Fc não projetado).

[0255] Em uma forma de realização, a mutação de aminoácido que reduz a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor Fc e/ ou função efetora é uma substituição de aminoácido. Em uma forma de realização, o domínio Fc compreende uma substituição de aminoácido em uma posição selecionada a partir do grupo de E233, L234, L235, N297, P331 e P329. Em uma forma de realização mais específica, o domínio Fc compreende uma substituição de aminoácido em uma posição selecionada a partir do grupo de L234, L235 e P329. Em algumas formas de realização, o domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos L234A e L235A. Em uma dessas formas de realização, o domínio Fc é um domínio Fc de IgGi, particularmente um domínio Fc de IgGi humana. Em uma forma de realização, o domínio Fc compreende uma substituição de aminoácido na posição P329. Em uma forma de realização mais específica, a substituição de aminoácido é P329A ou P329G, particularmente P329G. Em uma forma de realização, o domínio Fc compreende uma substituição de aminoácido na posição P329 e uma substituição adicional de aminoácidos em uma posição selecionada a partir de E233, L234, L235, N297 e P331. Em uma forma de realização mais específica, a substituição adicional de aminoácidos é E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D ou P331S. Em formas de realização particulares, o domínio Fc compreende substituições de aminoácidos nas posições P329, L234 e L235. Em uma forma de realização, o domínio Fc compreende as mutações de aminoácidos L234A, L235A e P329G (“P329G LALA”). Em uma dessas formas de realização, o domínio Fc é um domínio Fc de IgGi, particularmente um

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123/293 domínio Fc de IgGi humana. A combinação “P329G LALA” de substituições de aminoácidos abole quase completamente a ligação do receptor Fcy (assim como o complemento) de um domínio Fc de IgGi humana, conforme descrito na publicação PCT no. WO 2012/130831, aqui incorporado por referência na sua totalidade. O documento WO 2012/130831 também descreve métodos para preparar esses domínios Fc mutantes e métodos para determinar suas propriedades, tais como ligação ao receptor Fc ou funções efetoras.

[0256] Em uma forma de realização específica, o domínio Fc exibindo afinidade de ligação reduzida a um receptor Fc e/ ou função efetora reduzida, em comparação com um domínio Fc de IgGi nativo, é um domínio Fc de IgGi humana que compreende as mutações de aminoácidos L234A, L235A e opcionalmente P329G, ou um domínio Fc de lgG4 humano que compreende as mutações de aminoácidos S228P, L235E e opcionalmente P329G.

[0257] Em certas formas de realização, a N-glicosilação do domínio Fc foi eliminada. Em uma dessas formas de realização, o domínio Fc compreende uma mutação de aminoácido na posição N297, particularmente uma mutação de aminoácido substituindo asparagina por alanina (N297A) ou ácido aspártico (N297D).

[0258] Além dos domínios Fc descritos acima e na publicação PCT no. WO 2012/130831, domínios Fc com ligação ao receptor Fc e/ ou função efetora reduzida também incluem aqueles com mutação de um ou mais resíduos do domínio Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 (Patente US 6.737.056). Esses mutantes Fc incluem mutantes Fc com mutações em duas ou mais posições de aminoácidos 265, 269, 270, 297 e 327, incluindo o chamado mutante Fc “DANA” com mutação dos resíduos 265 e 297 para alanina (Patente US 7.332.581).

[0259] Os domínios Fc mutantes podem ser preparados por deleção, substituição, inserção ou modificação de aminoácidos usando

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124/293 métodos genéticos ou químicos bem conhecidos na técnica. Os métodos genéticos podem incluir mutagênese sítio-específica da sequência de DNA codificante, PCR, síntese gênica e similares. As alterações nucleotídicas corretas podem ser verificadas, por exemplo, por sequenciamento.

[0260] A ligação aos receptores Fc pode ser facilmente determinada, por exemplo, por ELISA ou por Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR), utilizando instrumentação padrão, tais como um instrumento BIAcore (GE Healthcare), e receptores Fc, tal como pode ser obtido por expressão recombinante. Alternativamente, a afinidade de ligação de domínios Fc ou moléculas de ligação a antígenos biespecíficos de ativação de células que compreendem um domínio Fc para receptores Fc pode ser avaliada usando linhagens celulares conhecidas por expressar receptores Fc específicos, tais como células NK humanas que expressam o receptor ΡογΙΙIa.

[0261] A função efetora de um domínio Fc, ou um anticorpo que compreende um domínio Fc, pode ser medida por métodos conhecidos na técnica. Outros exemplos de ensaios in vitro para avaliar a atividade ADCC de uma molécula de interesse são descritos na Patente U.S. 5,500,362; Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sei USA 83, 7059-7063 (1986) e Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sei USA 82, 1499-1502 (1985); Patente U.S. 5,821,337; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987). Como alternativa, métodos de ensaios não radioativos podem ser empregados (ver, por exemplo, ensaio de citotoxicidade não radioativa ACTI™ para citometria de fluxo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); e ensaio de citotoxicidade não radioativa CytoTox 96® (Promega, Madison, Wl)). As células efetoras úteis para esses ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células Natural Killer (NK). Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como o divulgado em Clynes et al., Proc Natl Acad Sei USA

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95, 652-656 (1998).

[0262] Em algumas formas de realização, a ligação do domínio Fc a um componente do complemento, especificamente a C1q, é reduzida. Por conseguinte, em algumas formas de realização em que o domínio Fc é projetado para ter uma função efetora reduzida, a referida função efetora reduzida inclui CDC reduzida. Os ensaios de ligação a C1q podem ser realizados para determinar se o anticorpo é capaz de se ligar a C1q e, portanto, possui atividade CDC. Ver, por exemplo, ELISA de ligação a C1q e C3c nos documentos WO 2006/029879 e WO 2005/100402. Para avaliar a ativação do complemento, um ensaio CDC pode ser realizado (ver, por exemplo, GazzanoSantoro et al., J. Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003); e Cragg e Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)).

[0263] Em uma forma de realização, a afinidade de ligação ao receptor Fc neonatal (FcRn) é reduzida. Em formas de realização particulares, um domínio Fc mutado de acordo com a invenção exibe afinidade de ligação reduzida ao receptor FcRn, em comparação com um domínio Fc de IgGi nativo. Em uma dessas formas de realização, o domínio FC(ou o anticorpo que compreende o referido domínio Fc) exibe menos de 50%, preferencialmente menos de 20%, mais preferencialmente menos de 10% e mais preferencialmente menos de 5% da afinidade de ligação ao receptor Fc neonatal, em comparação com um domínio Fc de IgGi nativo (ou um anticorpo que compreende um domínio Fc de IgGi nativo) e/ ou menos de 50%, preferencialmente menos de 20%, mais preferencialmente menos de 10% e mais preferencialmente menos de 5% da função efetora, em comparação com um domínio Fc de IgGi nativo (ou um anticorpo que compreende um domínio Fc de IgGi nativo). Em uma forma de realização, o domínio Fc mutado (ou o anticorpo que compreende o referido domínio Fc mutado) não se liga substancialmente ao receptor Fc neonatal. Em uma forma de realização

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126/293 particular, o receptor Fc é um receptor FcRn. Em uma forma de realização, o receptor Fc é um receptor FcRn humano. Em formas de realização particulares, o domínio Fc compreende substituições de aminoácidos nas posições I253, H310 e H435. Em formas de realização mais particulares, o domínio Fc compreende as mutações de aminoácidos I253A, H310A e H435A (“AAA”). Em uma dessas formas de realização, o domínio Fc é um domínio Fc de IgGi, particularmente um domínio Fc de IgGi humana. A combinação “AAA” de substituições de aminoácidos abole quase completamente a ligação ao receptor FcRn de um domínio Fc da IgGi humana.

[0264] Em uma forma de realização específica, o anticorpo que compreende a região Fc mutada é capaz de se ligar especificamente a CD20 e compreende a sequência da cadeia pesada de SEQ ID NO: 112 e a sequência da cadeia leve de SEQ ID NO: 113. Em uma forma de realização, o anticorpo que compreende a região Fc mutada é capaz de se ligar especificamente a FAP e compreende a sequência da cadeia pesada de SEQ ID NO: 114 e a sequência da cadeia leve de SEQ ID NO: 115. Em uma forma de realização, o anticorpo que compreende a região Fc mutada é capaz de se ligar especificamente a CEA e compreende a sequência da cadeia pesada de SEQ ID NO: 116 e a sequência da cadeia leve de SEQ ID NO: 117, a sequência da cadeia pesada de SEQ ID NO: 118 e a sequência da cadeia leve de SEQ ID NO: 119, a sequência da cadeia pesada de SEQ ID NO: 120 e a sequência da cadeia leve de SEQ ID NO: 121 ou a sequência da cadeia pesada de SEQ ID NO: 122 e a sequência da cadeia leve de SEQ ID NO: 123. Em outras formas de realização, o anticorpo compreendendo a região Fc mutada é capaz de se ligar especificamente à tenascina (TNC) e compreende a sequência da cadeia pesada de SEQ ID NO: 124 e a sequência da cadeia leve de SEQ ID NO: 125.

[0265] Em uma outra forma de realização, o anticorpo que compreende a região Fc mutada é um anticorpo biespecífico, por exemplo, um

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127/293 anticorpo biespecífico de ativação de células T. Em uma dessas formas de realização, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira porção de ligação capaz de se ligar especificamente a um alvo de ativação de células T, em particular CD3, e uma segunda porção de ligação capaz de se ligar especificamente a um antígeno tumoral, como aqui descrito.

[0266] Em uma forma de realização, o anticorpo compreendendo a região Fc mutada é biespecífico e capaz de se ligar especificamente a Her2, em que o anticorpo biespecífico compreende uma primeira sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 126, uma primeira sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 127, uma segunda sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 128 e uma segunda sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 129.

[0267] Em uma forma de realização ilustrativa da presente invenção, como prova de conceito, é fornecido um kit que compreende uma sequência de aminoácidos conforme mostrado na SEQ ID NO: 7 (“Anti-P329Gds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD” (como codificado pela sequência de DNA mostrada na SEQ ID NO: 19)) combinada com o anticorpo que compreende uma cadeia pesada de SEQ ID NO: 112 e uma cadeia leve de SEQ ID NO: 113. Como alternativa, o kit pode compreender uma sequência de aminoácidos conforme mostrado na SEQ ID NO: 31 (“Anti-P329G-scFvCD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD” (conforme codificada pela sequência de DNA mostrada na SEQ ID NO: 35)) combinada com o anticorpo que compreende uma cadeia pesada de SEQ ID NO: 112 e uma cadeia leve de SEQ ID NO: 113. Além disso, no contexto da presente invenção, o kit pode compreender uma sequência de aminoácidos conforme mostrado na SEQ ID NO: 39 (“AntiP329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD” (conforme codificada pela sequência de DNA mostrada em SEQ ID NO: 44)) combinada com o anticorpo que compreende uma cadeia pesada de SEQ ID NO: 112 e uma cadeia leve de SEQ ID NO: 113. Como alternativa, o kit pode compreender uma sequência de

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128/293 aminoácidos conforme mostrada na SEQ ID NO: 48 (“Anti-P329G-FabCD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD” (conforme codificada pela sequência de DNA mostrada na SEQ ID NO: 51)) combinada com um anticorpo que compreende uma cadeia pesada de SEQ ID NO: 112 e uma cadeia leve de SEQ ID NO: 113. Como alternativa, o kit pode compreender uma sequência de aminoácidos conforme mostrada na SEQ ID NO: 59 (“Anti-AAA-scFv-CD28ATD-CD28CSDCD3zSSD”) combinada com um anticorpo que compreende uma cadeia pesada de SEQ ID NO: 112 e uma cadeia leve de SEQ ID NO: 113. Além disso, no contexto da presente invenção, o kit pode compreender uma sequência de aminoácidos, como mostrada na SEQ ID NO: 63 (“Anti-AAA-Fab-CD28ATDCD28CSD-CD3zSSD”) combinada com um anticorpo que compreende uma cadeia pesada de SEQ ID NO: 112 e uma cadeia leve de SEQ ID NO: 113. Além disso, no contexto da presente invenção, o kit pode compreender pelo menos uma molécula de anticorpo que compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NO: 112 e SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114 e SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116 e SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118 e SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120 e SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122 e SEQ ID NO: 123 e SEQ ID NO: 124 e SEQ ID NO: 125. Além disso, no contexto da presente invenção, o kit pode compreender uma molécula de anticorpo biespecífico, em particular um anticorpo biespecífico que compreende uma primeira cadeia pesada de SEQ ID NO: 128, uma primeira cadeia leve de SEQ ID NO: 129, uma segunda cadeia pesada de SEQ ID NO: 130 e uma segunda cadeia leve de SEQ ID NO: 131.

[0268] Além disso, partes do kit da invenção podem ser embaladas individualmente em frascos ou garrafas ou em combinação em recipientes ou unidades com vários recipientes. Além disso, o kit da presente invenção pode compreender um sistema de incubação de células em saco (fechado) em que as células do paciente, preferencialmente as células T,

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129/293 conforme descrito neste documento, podem ser transduzidas com um receptor(es) de ligação ao antígeno da invenção e incubadas sob GMP (boas práticas de fabricação, conforme descrito nas diretrizes de boas práticas de fabricação publicadas pela Comissão Européia em http://ec.europa.eu/health/documents/eudralex/index_en.htm). Além disso, o kit da presente invenção compreende um sistema de incubação de células em saco (fechado) em que as células T de pacientes isoladas/ obtidas podem ser transduzidas com um receptor(es) de ligação ao antígeno da invenção e incubadas sob GMP. Além disso, no contexto da presente invenção, o kit também pode compreender um vetor que codifica o(s) receptor(es) de ligação ao antígeno, como aqui descrito. O kit da presente invenção pode ser vantajosamente utilizado, entre outras coisas, para a realização do método da invenção e pode ser empregado em uma variedade de aplicações aqui referidas, por exemplo, como ferramentas de pesquisa ou ferramentas médicas. A fabricação dos kits segue, de preferência, procedimentos padrão que são conhecidos pelo técnico no assunto.

[0269] Neste contexto, as células derivadas do paciente, preferencialmente células T, podem ser transduzidas com um receptor de ligação ao antígeno da invenção capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado, como aqui descrito, utilizando o kit como descrito acima. O domínio extracelular que compreende uma porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado não ocorre naturalmente em ou sobre as células T. Por conseguinte, as células derivadas do paciente transduzidas com os kits da invenção adquirirão a capacidade de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo terapêutico e se tornarão capazes de induzir a eliminação/ lise das células alvo via interação com um anticorpo terapêutico que compreende o domínio Fc mutado, em que o anticorpo terapêutico é capaz

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130/293 de se ligar a um antígeno tumor-específico que ocorre naturalmente (que é expresso endogenamente) na superfície de uma célula tumoral. A ligação do domínio extracelular do receptor de ligação ao antígeno, como aqui descrito, ativa essa célula Tea coloca em contato físico com a célula tumoral através do anticorpo terapêutico que compreende o domínio Fc mutado. As células T não transduzidas ou endógenas (por exemplo, células T CD8+) são incapazes de se ligar ao domínio Fc mutado do anticorpo terapêutico que compreende o domínio Fc mutado. As células T transduzidas que expressam o receptor de ligação ao antígeno que compreende o domínio extracelular capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado permanecem inalteradas por um anticorpo terapêutico que não compreende as mutações no domínio Fc como aqui descrito. Por conseguinte, as células T que expressam a molécula de receptor de ligação ao antígeno da invenção têm a capacidade de lisar as células alvo na presença de um anticorpo que compreende as mutações no domínio Fc como descrito aqui, in vivo e/ ou in vitro. As células alvo correspondentes compreendem células que expressam uma molécula de superfície, isto é, um antígeno tumor-específico que ocorre naturalmente na superfície de uma célula tumoral, que é reconhecido por pelo menos um, de preferência dois, domínios de ligação do anticorpo terapêutico, como aqui descrito. Tais moléculas de superfície são caracterizadas aqui abaixo.

[0270] A lise da célula alvo pode ser detectada por métodos conhecidos na técnica. Por conseguinte, esses métodos compreendem, entre outros, ensaios fisiológicos in vitro. Tais ensaios fisiológicos podem monitorar a morte celular, por exemplo, pela perda da integridade da membrana celular (por exemplo, ensaio de iodeto de propídio à base de FACS, ensaio de influxo de azul de tripano, ensaios fotométricos de liberação de enzimas (LDH), ensaio radiométrico de liberação de 51 Cr, ensaios fluorométricos de liberação de európio e liberação de CalceinAM). Ensaios adicionais compreendem o

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131/293 monitoramento da viabilidade celular, por exemplo, por ensaios fotométricos MTT, XTT, WST-1 e alamarBIue, ensaio radiométrico de incorporação de 3HThd, ensaio clonogênico que mede a atividade da divisão celular e ensaio fluorométrico Rhodamine123 que mede o gradiente transmembranar mitocondrial. Além disso, a apoptose pode ser monitorada, por exemplo, pelo ensaio de exposição à fosfatidilserina à base de FACS, teste TUNEL baseado em ELISA, ensaio de atividade da caspase (fotométrico, fluorométrico ou baseado em ELISA) ou analisando a morfologia celular alterada (contração, sangramento da membrana).

Células T Transduzidas Capazes de Expressar Receptores de Ligação a Antígeno da Invenção

[0271] Um outro aspecto da presente invenção são células T transduzidas capazes de expressar um receptor de ligação ao antígeno da presente invenção. Os receptores de ligação ao antígeno, como aqui descritos, referem-se a moléculas que naturalmente não estão compreendidas na e/ ou sobre a superfície das células T e que não são (endogenamente) expressas em ou sobre as células T normais (não transduzidas). Assim, o receptor de ligação ao antígeno da invenção em e/ou sobre as células T é artificialmente introduzido nas células T. No contexto da presente invenção, as referidas células T, preferencialmente células T CD8+, podem ser isoladas/ obtidas a partir de um indivíduo a ser tratado como aqui definido. Por conseguinte, os receptores de ligação ao antígeno, como aqui descritos, que são introduzidos artificialmente e subsequentemente apresentados em e/ou sobre a superfície das referidas células T compreendem domínios que compreendem uma ou mais porções de ligação ao antígeno acessíveis (in vitro ou in vivo) a imunoglobulinas (derivados de Ig), preferencialmente anticorpos, em particular ao domínio Fc dos anticorpos. No contexto da presente invenção, essas moléculas introduzidas artificialmente são apresentadas em e/ou sobre a

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132/293 superfície das referidas células T após a transdução (retroviral ou lentiviral), conforme descrito abaixo. Por conseguinte, após a transdução, as células T, de acordo com a invenção, podem ser ativadas por imunoglobulinas, preferencialmente anticorpos (terapêuticos) que compreendem mutações específicas no domínio Fc, como aqui descrito.

[0272] A invenção também se refere a células T transduzidas que expressam um receptor de ligação ao antígeno codificado por uma molécula(s) de ácido nucleico que codifica(m) o receptor de ligação ao antígeno da presente invenção. Por conseguinte, no contexto da presente invenção, a célula transduzida pode compreender uma molécula de ácido nucleico que codifica o receptor de ligação ao antígeno da presente invenção ou um vetor da presente invenção que expressa um receptor de ligação ao antígeno da presente invenção.

[0273] No contexto da presente invenção, o termo “célula T transduzida” refere-se a uma célula T geneticamente modificada (isto é, uma célula T em que uma molécula de ácido nucleico foi introduzida deliberadamente). A célula T transduzida aqui fornecida pode compreender o vetor da presente invenção. De preferência, a célula T transduzida aqui fornecida compreende a molécula de ácido nucleico que codifica o receptor de ligação ao antígeno da presente invenção e/ ou o vetor da presente invenção. A célula T transduzida da invenção pode ser uma célula T que expressa transitoriamente ou estavelmente o DNA exógeno (isto é, a molécula de ácido nucleico que foi introduzida na célula T). Em particular, a molécula de ácido nucleico que codifica o receptor de ligação ao antígeno da presente invenção pode ser integrada de maneira estável no genoma da célula T usando uma transdução retroviral ou lentiviral. Ao utilizar a transfecção de mRNA, a molécula de ácido nucleico que codifica o receptor de ligação ao antígeno da presente invenção pode ser expressa transitoriamente. De preferência, a célula

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T transduzida aqui fornecida foi geneticamente modificada através da introdução de uma molécula de ácido nucleico na célula T por meio de um vetor viral (por exemplo, um vetor retroviral ou um vetor lentiviral). Por conseguinte, a expressão dos receptores de ligação ao antígeno pode ser constitutiva e o domínio extracelular do receptor de ligação ao antígeno pode ser detectável na superfície celular. Este domínio extracelular do receptor de ligação ao antígeno pode compreender o domínio extracelular completo de um receptor de ligação ao antígeno como aqui definido, mas também partes do mesmo. O tamanho mínimo necessário é o sítio de ligação ao antígeno da porção de ligação ao antígeno no receptor de ligação ao antígeno.

[0274] A expressão também pode ser condicional ou induzível no caso em que o receptor de ligação ao antígeno é introduzido nas células T sob o controle de um promotor induzível ou repressível. Exemplos para tais promotores induzíveis ou repressíveis podem ser um sistema transcricional contendo o promotor do gene de álcool desidrogenase I (alcA) e a proteína transativadora AlcR. Diferentes formulações agrícolas à base de álcool são usadas para controlar a expressão de um gene de interesse ligado ao promotor alcA. Além disso, os sistemas promotores responsivos à tetraciclina podem funcionar para ativar ou reprimir o sistema de expressão gênica na presença de tetraciclina. Alguns dos elementos dos sistemas incluem uma proteína repressora de tetraciclina (TetR), uma sequência do operador de tetraciclina (tetO) e uma proteína de fusão do transativador de tetraciclina (tTA), que é a fusão da sequência de ativação do TetR e da proteína 16 do vírus herpes simplex (VP16). Além disso, podem ser utilizados promotores responsivos a esteróides, promotores relacionados a proteínas relacionadas a patogênese (PR) or regulados por metais.

[0275] A expressão pode ser constitutiva ou constitucional, dependendo do sistema utilizado. Os receptores de ligação ao antígeno da

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134/293 presente invenção podem ser expressos na superfície da célula T transduzida aqui fornecida. A porção extracelular do receptor de ligação ao antígeno (ou seja, o domínio extracelular do receptor de ligação ao antígeno) pode ser detectada na superfície celular, enquanto a porção intracelular (ou seja, o(s) domínio(s) de sinalização de co-estímulo e o domínio de sinalização de estímulo) não é detectável na superfície celular. A detecção do domínio extracelular do receptor de ligação ao antígeno pode ser realizada usando um anticorpo que se liga especificamente a esse domínio extracelular ou pelo domínio Fc mutado ao qual o domínio extracelular é capaz de se ligar. O domínio extracelular pode ser detectado usando esses anticorpos ou domínios Fc por citometria de fluxo ou microscopia.

[0276] As células transduzidas da presente invenção podem ser qualquer célula imune. Estas incluem, mas não estão limitadas a células B, células T, células Natural Killer (NK), células T Natural Killer (NK), células T γδ, células linfóides inatas, macrófagos, monócitos, células dendríticas ou neutrófilos. Preferencialmente, a referida célula imune seria um linfócito, preferencialmente células NK ou T. As referidas células T incluem células T CD4 e células T CD8. O desencadeamento do receptor de ligação ao antígeno da presente invenção na superfície do leucócito tornará a célula citotóxica contra uma célula alvo em conjunto com um anticorpo terapêutico que compreende um domínio Fc mutado, independentemente da linhagem da qual a célula se originou. A citotoxicidade ocorrerá independentemente do domínio de sinalização de estímulo ou domínio de sinalização de estímulo escolhido para o receptor de ligação ao antígeno e não depende do suprimento exógeno de citocinas adicionais. Por conseguinte, a célula transduzida da presente invenção pode ser, por exemplo, uma célula T CD4+, uma célula T CD8+, uma célula T γδ, uma célula T Natural Killer (NK), uma célula Natural Killer (NK), uma célula de linfócitos infiltrantes de tumor (TIL), uma célula mielóide ou uma

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135/293 célula-tronco mesenquimal. Preferencialmente, a célula transduzida aqui fornecida é uma célula T (por exemplo, uma célula T autóloga), mais preferencialmente, a célula transduzida é uma célula T CD8+. Por conseguinte, no contexto da presente invenção, a célula transduzida é uma célula T CD8+. Além disso, no contexto da presente invenção, a célula transduzida é uma célula T autóloga. Por conseguinte, no contexto da presente invenção, a célula transduzida é preferencialmente uma célula T CD8+ autóloga. Além do uso de células autólogas (por exemplo, células T) isoladas do sujeito, a presente invenção também compreende o uso de células alogeneicas. Por conseguinte, no contexto da presente invenção, a célula transduzida também pode ser uma célula alogeneica, tal como uma célula T CD8+ alogeneica. O uso de células alogeneicas baseia-se no fato de que as células, de preferência as células T, podem reconhecer um epítopo específico de antígeno apresentado por células apresentadoras de antígenos exógenos (APC), desde que a APC expresse a molécula de MHC, classe I ou classe II, à qual a população de células de resposta específica, isto é, a população de células T é restrita, juntamente com o epítopo do antígeno reconhecido pelas células T. Assim, o termo alogeneico refere-se a células de um indivíduo/ sujeito não relacionado que vem de um doador não relacionado que é antígeno leucocitário humano (HLA) compatível com o indivíduo/ sujeito que será tratado por, por exemplo, a célula transduzida que expressa o receptor de ligação ao antígeno aqui descrito. Células autólogas referem-se a células que são isoladas/ obtidas como descrito aqui acima a partir do sujeito a ser tratado com a célula transduzida aqui descrita.

[0277] A célula transduzida da invenção pode ser co-transduzida com outras moléculas de ácido nucleico, por exemplo, com uma molécula de ácido nucleico que codifica um receptor de células T.

[0278] A presente invenção também se refere a um método para a produção de uma célula T transduzida que expressa um receptor de ligação ao

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136/293 antígeno da invenção, compreendendo as etapas de transduzir uma célula T com um vetor da presente invenção, cultivar a célula T transduzida em condições que permitem a expressão do receptor de ligação ao antígeno na ou sobre a referida célula transduzida e recuperar a referida célula T transduzida.

[0279] No contexto da presente invenção, a célula transduzida da presente invenção é preferencialmente produzida pelo seguinte processo: células (por exemplo, células T, preferencialmente células T CD8+) são isoladas/ obtidas a partir de um sujeito (preferencialmente um paciente humano). Os métodos para isolar/ obter células (por exemplo, células T, preferencialmente células T CD8+) a partir de pacientes ou de doadores são bem conhecidos na técnica e no contexto da presente invenção as células (por exemplo, células T, preferencialmente células T CD8+) de pacientes ou de doadores podem ser isoladas por coleta de sangue ou remoção da medula óssea. Depois de isolar/ obter células como uma amostra do paciente, as células (por exemplo, células T) são separadas dos outros ingredientes da amostra. São conhecidos vários métodos para separar células (por exemplo, células T) da amostra e incluem, sem serem limitativos, por exemplo leucaférese para obter células a partir da amostra de sangue periférico de um paciente ou de um doador, isolar/ obter células usando um aparelho FACSort, escolher células vivas ou mortas de amostras frescas de biópsia que portam células vivas manualmente ou usando um micromanipulador (ver, por exemplo, Dudley, lmmunother.26 (2003), 332-342; Robbins, Clin. Oncol. 29 (201 1), 917924 ou Leisegang, J. Mol. Med. 86 (2008), 573-58). As células T isoladas/ obtidas, de preferência células T CD8+, são subsequentemente cultivadas e expandidas, por exemplo, usando um anticorpo anti-CD3, usando anticorpos monoclonais anti-CD3 e anti-CD28 e/ ou usando um anticorpo anti-CD3, um anticorpo anti-CD28 e interleucina-2 (IL-2) (ver, por exemplo, Dudley, Immunother. 26 (2003), 332-342 ou Dudley, Clin. Oncol. 26 (2008), 5233-5239).

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[0280] Em uma etapa subsequente, as células (por exemplo, células T) são artificialmente/ geneticamente modificadas/ transduzidas por métodos conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Lemoine, J Gene Med 6 (2004), 374-386). Os métodos para a transdução de células (por exemplo, células T) são conhecidos na técnica e incluem, sem limitação, um caso em que o ácido nucleico ou um ácido nucleico recombinante é transduzido, por exemplo, um método de eletroporação, método de fosfato de cálcio, método de lipídio catiônico ou método de lipossomas. O ácido nucleico a ser transduzido pode ser transduzido convencionalmente e de forma altamente eficiente, usando um reagente de transfecção disponível comercialmente, por exemplo, Lipofectamine (fabricado por Invitrogen, n^s de catálogo: 11668027). No caso em que um vetor é usado, o vetor pode ser transduzido da mesma maneira que o ácido nucleico acima mencionado, desde que o vetor seja um vetor plasmídico (isto é, um vetor que não seja um vetor viral). No contexto da presente invenção, os métodos para a transdução de células (por exemplo, células T) incluem a transdução de células T retrovirais ou lentivirais, vetores não virais (por exemplo, vetor de minicírculo sleeping beauty), bem como a transfecção de mRNA. “Transfecção de mRNA” refere-se a um método bem conhecido dos técnicos no assunto para expressar transitoriamente uma proteína de interesse, como no presente caso, o receptor de ligação ao antígeno da presente invenção, em uma célula a ser transduzida. Em resumo, as células podem ser eletroporadas com o mRNA que codifica o receptor de ligação ao antígeno da presente invenção usando um sistema de eletroporação (tal como, por exemplo, Gene Pulser, Bio-Rad) e posteriormente cultivado pelo protocolo de cultura de células padrão (por exemplo, célula T), conforme descrito acima (ver Zhao et ai., Mol Ther. 13(1) (2006), 151-159.) A célula transduzida da invenção é uma célula T, mais preferencialmente uma célula T CD8+, e é gerada por transdução de célula T lentiviral ou mais

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138/293 preferencialmente retroviral.

[0281] Neste contexto, vetores retrovirais adequados para a transdução de células T são conhecidos na técnica como SAMEN CMV/SRa (Clay et al., J. Immunol. 163 (1999), 507-513), LZRS-id3-IHRES (Heemskerk et al., J. Exp. Med. 186 (1997), 1597-1602), FeLV (Neil et al., Nature 308 (1984), 814-820), SAX (Kantoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 65636567), pDOL (Desiderio, J. Exp. Med. 167 (1988), 372-388), N2 (Kasid et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 473-477), LNL6 (Tiberghien et al., Blood 84 (1994), 1333-1341), pZipNEO (Chen et al., J. Immunol. 153 (1994), 36303638), LASN (Mullen et al., Hum. Gene Ther. 7 (1996), 1123-1129), pGIXsNa (Taylor et al., J. Exp. Med. 184 (1996), 2031-2036), LCNX (Sun et al., Hum. Gene Ther. 8 (1997), 1041-1048), SFG (Gallardo et al., Blood 90 (1997) e LXSN (Sun etal., Hum. Gene Ther. 8 (1997), 1041-1048), SFG (Gallardo etal., Blood 90 (1997), 952-957), HMB-Hb-Hu (Vieillard etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 11595-11600), pMV7 (Cochlovius et al., Cancer Immunol. Immunother. 46 (1998), 61-66), pSTITCH (Weitjens et al., Gene Ther 5 (1998), 1195-1203), pLZR (Yang et al., Hum. Gene Ther. 10 (1999), 123-132) pBAG (Wu et al., Hum. Gene Ther. 10 (1999), 977-982), rKat.43.267bn (Gilham et al., J. Immunother. 25 (2002), 139-151), pLGSN (Engels etal., Hum. Gene Ther. 14 (2003), 1155-1168), pMP71 (Engels etal., Hum. Gene Ther. 14 (2003), 11551168), pGCSAM (Morgan etal., J. Immunol. 171 (2003), 3287-3295), pMSGV (Zhao et al., J. Immunol. 174 (2005), 4415-4423) ou pMX (de Witte et al., J. Immunol. 181 (2008) 5128-5136). No contexto da presente invenção, vetor lentiviral adequado para a transdução de células (por exemplo, células T) é, por exemplo, vetor lentiviral PL-SIN (Hotta et a!., Nat Methods. 6(5) (2009), 370376), p156RRL-sinPPT-CMV-GFP-PRE/Nhel (Campeau etal., PLoS One 4(8) (2009), e6529), pCMVR8.74 (Catálogo da Addgene n^s 22036), FUGW (Lois et a!., Science 295(5556) (2002), 868-872, pLVX-EF1 (Catálogo da Addgene n^s

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64368), pLVE (Brunger et al., Proc Natl Acad Sci USA 111(9) (2014), E798806), pCDH1 -MCS1-EF1 (Hu etal., Mol Cancer Res. 7(11) (2009), 1756-1770), pSLIK (Wang etal., Nat Cell Biol. 16(4) (2014), 345-356), pLJM1 (Solomon et al., Nat Genet. 45(12) (2013), 1428-30), pLX302 (Kang etal., Sci Signal. 6(287) (2013), rs13), pHR-IG (Xie et al., J. Cereb Blood Flow Metab. 33(12) (2013), 1875-85), pRRLSIN (Catálogo da Addgene n^s 62053), pLS (Miyoshi et al., J Virol. 72(10) (1998), 8150-8157), pLL3.7 (Lazebnik etal., J. Biol Chem. 283(7) (2008), 11078-82), FRIG (Raissi etal., Mol Cell Neurosci. 57 (2013), 23-32), pWPT (Ritz-Laser etal., Diabetologia. 46(6) (2003), 810-821), pBOB (Marr et al., J. Mol Neurosci. 22(1-2) (2004), 5-11) ou pLEX (Catálogo da Addgene n^s27976).

[0282] A célula T transduzida/ células T da presente invenção é/são, de preferência, cultivadas sob condições controladas, fora do seu ambiente natural. Em particular, o termo “cultura” significa que as células (por exemplo, a(s) célula(s) transduzida(s) da invenção) que são derivadas de eucariotos multicelulares (de preferência de um paciente humano) são cultivadas in vitro. Cultivar células é uma técnica de laboratório para manter as células vivas separadas da sua fonte original de tecido. Aqui, a célula transduzida da presente invenção é cultivada sob condições que permitem a expressão do receptor de ligação ao antígeno da presente invenção nas ou sobre as referidas células transduzidas. As condições que permitem a expressão ou um transgene (ou seja, do receptor de ligação ao antígeno da presente invenção) são comumente conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 agonísticos e a adição de citocinas como a interleucina 2 (IL-2), interleucina 7 (IL-7), interleucina 12 (IL-12) e/ ou interleucina 15 (IL-15). Após a expressão do receptor de ligação ao antígeno da presente invenção na célula transduzida em cultura (por exemplo, uma T CD8+), a célula transduzida é recuperada (isto é, re-extraída) da cultura (isto é,

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140/293 do meio de cultura).

[0283] Por conseguinte, também está abrangido pela invenção uma célula transduzida, preferencialmente uma célula T, em particular uma T CD8+ que expressa um receptor de ligação ao antígeno codificado por uma molécula de ácido nucleico da invenção que pode ser obtida pelo método da presente invenção.

Moléculas de Ácido Nucleico

[0284] Um outro aspecto da presente invenção refere-se a ácidos nucleicos e vetores que codificam um ou vários receptores de ligação ao antígeno da presente invenção. Exemplos de moléculas de ácido nucleico que codificam os receptores de ligação ao antígeno da presente invenção são mostrados nas SEQ ID NOs: 19, 30, 35, 38, 44, 47, 51 e 52. As moléculas de ácido nucleico da invenção podem estar sob o controle de sequências reguladoras. Por exemplo, podem ser empregues promotores, melhoradores de transcrição e/ ou sequências que permitem a expressão induzida do receptor de ligação ao antígeno da invenção. No contexto da presente invenção, as moléculas de ácido nucleico são expressas sob o controle de promotor constitutivo ou induzível. Promotores adequados são, por exemplo, o promotor CMV (Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611), o promotor UBC (Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611), PGK (Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611), o promotor EF1A (Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611), o promotor CAGG (Qin et al., PLoS One 5(5)) (2010), e10611), o promotor SV40 (Qin etal., PLoS One 5(5) (2010), e10611), o promotor COPIA (Qin etal., PLoS One 5(5) (2010), e10611), o promotor ACT5C (Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611), o promotor TRE (Qin et al., PLoS One. 5(5) (2010), e10611), o promotor Oct3/4 (Chang et al., Molecular Therapy 9 (2004), S367-S367 (doi: 10.1016/j.ymthe.2004.06.904)) ou o promotor Nanog (Wu et al., Cell Res. 15(5) (2005), 317-24). A presente invenção, portanto, também se refere a um

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141/293 vetor(es) que compreende(m) a(s) molécula(s) de ácido nucleico descrita(s) na presente invenção. Aqui, o termo vetor refere-se a uma molécula de ácido nucleico circular ou linear que pode replicar-se autonomamente em uma célula hospedeira (isto é, em uma célula transduzida) na qual foi introduzida. Muitos vetores adequados são conhecidos dos técnicos em biologia molecular, cuja escolha depende da função desejada e inclui plasmídeos, cosmídeos, vírus, bacteriófagos e outros vetores usados convencionalmente em engenharia genética. Os métodos que são bem conhecidos dos técnicos no assunto podem ser utilizados para construir vários plasmídeos e vetores; ver, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et al. (loc cit.) e Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates e Wiley Interscience, N.Y. (1989), (1994). Alternativamente, os polinucleotideos e vetores da invenção podem ser reconstituídos em lipossomos para entrega às células alvo. Como discutido em mais detalhes abaixo, um vetor de clonagem foi usado para isolar sequências individuais de DNA. Sequências relevantes podem ser transferidas para vetores de expressão onde a expressão de um polipeptídeo específico é necessária. Os vetores de clonagem típicos incluem pBluescript SK, pGEM, pUC9, pBR322, pGA18 e pGBT9. Os vetores de expressão típicos incluem pTRE, pCAL-n-EK, pESP-1, pOP13CAT.

[0285] A invenção também se refere a um vetor(es) que compreende(m) molécula(s) de ácido nucleico que é(são) uma sequência reguladora operacionalmente ligada à(s) dita(s) molécula(s) de ácido nucleico que codifica(m) um receptor de ligação ao antígeno, conforme aqui definido. No contexto da presente invenção, o vetor pode ser policistrônico. Tais sequências reguladoras (elementos de controle) são conhecidas do técnico no assunto e podem incluir um promotor, um cassete de emenda, um códon de iniciação da tradução, um sítio de tradução e inserção para introduzir uma inserção no(s) vetor(es). No contexto da presente invenção, a(s) dita(s) molécula(s) de ácido

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142/293 nucleico é(são) operacionalmente ligada(s) às referidas sequências de controle de expressão, permitindo a expressão em células eucarióticas ou procarióticas. Está previsto que o(s) referido(s) vetor(es) seja(m) vetor(es) de expressão compreendendo a(s) molécula(s) de ácido nucleico que codifica(m) o receptor de ligação ao antígeno, conforme aqui definido. Operacionalmente ligado refere-se a uma justaposição em que os componentes descritos estão em uma relação que lhes permite funcionar da maneira pretendida. Uma sequência de controle operacionalmente ligada a uma sequência de codificação é ligada de tal maneira que a expressão da sequência de codificação é alcançada sob condições compatíveis com as sequências de controle. No caso de a sequência de controle ser um promotor, é óbvio para um técnico no assunto que o ácido nucleico de fita dupla é preferencialmente utilizado.

[0286] No contexto da presente invenção, o(s) vetor(es) recitado(s) é(são) um vetor(es) de expressão. Um vetor de expressão é um construto que pode ser usado para transformar uma célula selecionada e fornece a expressão de uma sequência de codificação na célula selecionada. Um vetor(es) de expressão pode, por exemplo, ser vetor(es) de clonagem, vetor(es) binário(s) ou vetor(es) de integração. A expressão compreende a transcrição da molécula de ácido nucleico, de preferência em um mRNA traduzível. Os elementos reguladores que garantem a expressão em células procarióticas e/ou eucarióticas são bem conhecidos dos técnicos no assunto. No caso de células eucarióticas, elas compreendem normalmente promotores que garantem o início da transcrição e opcionalmente sinais poli-A que garantem o término da transcrição e estabilização do transcrito. Possíveis elementos reguladores que permitem a expressão em células hospedeiras procarióticas compreendem, por exemplo, o promotor PL, lac, trp ou tac em E. coli, e exemplos de elementos reguladores que permitem a expressão em células hospedeiras eucarióticas são o promotor AOX1 ou GAL1 em levedura

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143/293 ou o promotor de CMV, SV40, RSV (vírus do sarcoma de Rous), intensificador de CMV, intensificador de SV40 ou um íntron globina em células de mamíferos e outras células animais.

[0287] Além de elementos que são responsáveis pela iniciação da transcrição, esses elementos reguladores também podem compreender sinais de terminação de transcrição, tal como o sítio SV40-poli-A ou o sítio tk-poli-A, a jusante do polinucleotídeo. Além disso, dependendo do sistema de expressão usado, as sequências líderes que codificam peptídeos de sinal capazes de direcionar o polipeptídeo para um compartimento celular ou secretá-lo no meio podem ser adicionadas à sequência de codificação da sequência de ácido nucleico recitada e são bem conhecidas na técnica; ver também, por exemplo, exemplos anexados.

[0288] A(s) sequência(s) líder(es) é(são) montada(s) em fase apropriada com sequências de tradução, iniciação e terminação e, de preferência, uma sequência líder capaz de direcionar a secreção da proteína traduzida, ou uma porção dela, para o espaço periplásmico ou meio extracelular. Opcionalmente, a sequência heteróloga pode codificar um receptor de ligação ao antígeno, incluindo um peptídeo de identificação do Nterminal que confere as características desejadas, por exemplo, estabilização ou purificação simplificada do produto recombinante expresso; ver supra. Nesse contexto, os vetores de expressão adequados são conhecidos na técnica, tais como o vetor de expressão de cDNA de Okayama-Berg pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNAI, pcDNA3 (ln-vitrogene), pEF-DHFR, pEF-ADA ou pEF-neo (Raum et al., Cancer Immunol Immunother 50 (2001), 141-150) ou pSPORTI (GIBCO BRL).

[0289] No contexto da presente invenção, as sequências de controle de expressão serão sistemas promotores eucarióticos em vetores capazes de transformar ou transfectar células eucarióticas, mas também

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144/293 podem ser usadas sequências de controle para células procarióticas. Uma vez incorporado o vetor na célula apropriada, a célula é mantida em condições adequadas para expressão de alto nível das sequências nucleotídicas e conforme desejado. Elementos reguladores adicionais podem incluir aprimoradores transcricionais e traducionais. Vantajosamente, os vetores da invenção acima descritos compreendem um marcador selecionável e/ ou pontuável. Os genes marcadores selecionáveis úteis para a seleção de células transformadas e, por exemplo, tecidos vegetais e plantas são bem conhecidos dos técnicos no assunto e compreendem, por exemplo, resistência ao antimetabólito como base de seleção para dhfr, que confere resistência ao metotrexato (Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13 (1994), 143-149), npt, que confere resistência aos aminoglicosídeos neomicina, canamicina e paromicina (Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983), 987-995) e higro, que confere resistência à higromicina (Marsh, Gene 32 (1984), 481-485). Genes selecionáveis adicionais foram descritos, ou seja, trpB, que permite que as células utilizem indol em vez de triptofano; hisD, que permite que as células utilizem histinol em vez de histidina (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85 (1988), 8047); isomerase de manose-6-fosfato que permite que as células utilizem manose (WO 94/20627) e ODC (ornitina descarboxilase) que confere resistência ao inibidor da ornitina descarboxilase, 2-(difluorometil)-DL-ornitina, DFMO (McConlogue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.) ou desaminase de Aspergillus terreus que confere resistência a Blasticidin S (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995), 2336-2338).

[0290] Marcadores pontuáveis úteis também são conhecidos dos técnicos no assunto e estão disponíveis comercialmente. Vantajosamente, o referido marcador é um gene que codifica luciferase (Giacomin, PI. Sci. 116 (1996), 59-72; Scikantha, J. Bact. 178 (1996), 121), proteína fluorescente verde

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145/293 (Gerdes, FEBS Lett. 389 (1996), 44-47) ou β-glucuronidase (Jefferson, EMBO J. 6 (1987), 3901-3907). Esta forma de realização é particularmente útil para a triagem simples e rápida de células, tecidos e organismos contendo um vetor recitado.

[0291] Como descrito acima, a(s) molécula(s) de ácido nucleico recitada(s) pode(m) ser usada(s) sozinha(s) ou como parte do(s) vetor(es) para expressar os receptores de ligação ao antígeno da invenção em células, para, por exemplo, terapia adotiva de células T, mas também para fins de terapia gênica. As moléculas de ácido nucleico ou o(s) vetor(es) contendo a(s) sequência(s) de DNA que codifica(m) qualquer um dos receptores de ligação ao antígeno aqui descritos são introduzidos nas células que, por sua vez, produzem o polipeptídeo de interesse. A terapia gênica, baseada na introdução de genes terapêuticos nas células por técnicas ex vivo ou in vivo, é uma das aplicações mais importantes da transferência de genes. Os vetores, métodos ou sistemas de entrega de genes adequados para métodos ou sistemas de entrega de genes para terapia gênica in vitro ou in vivo são descritos na literatura e são conhecidos pelo técnico no assunto; ver, por exemplo, Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813; Verma, Nature 389 (1994), 239; Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Onodera, Blood 91 (1998), 30-36; Verma, Gene Ther. 5 (1998), 692-699; Nabel, Ann. N.Y. Acad. Sci. 811 (1997), 289-292; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243-51; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; WO 94/29469; WO 97/00957; US 5.580.859; US 5.589.466; ou Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640. A(s) molécula(s) de ácido nucleico e vetor(es) citados podem ser projetados para introdução direta ou para introdução via lipossomas ou vetores virais (por exemplo, adenoviral, retroviral) na célula. No contexto da presente invenção, a referida célula é uma célula T,

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146/293 tal como células T CD8+, células T CD4+, células T CD3+, células T γδ ou células T natural killer (NK), preferencialmente células T CD8+.

[0292] De acordo com o acima exposto, a presente invenção refere-se a métodos para derivar vetores, particularmente plasmídeos, cosmídeos e bacteriófagos usados convencionalmente em engenharia genética que compreendem uma molécula de ácido nucleico que codifica a sequência polipeptídica de um receptor de ligação ao antígeno aqui definido. No contexto da presente invenção, o referido vetor é um vetor de expressão e/ ou um vetor de transferência ou direcionamento de genes. Os vetores de expressão derivados de vírus como retrovirus, vírus vaccinia, vírus adeno-associado, vírus herpes ou papiloma vírus bovino, podem ser utilizados para a distribuição dos polinucleotídeos ou vetores recitados nas populações de células alvo.

[0293] Os métodos que são bem conhecidos dos técnicos no assunto podem ser utilizados para construir o(s) vetor(es) recombinante(s); ver, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et al. (loc cit.), Ausubel (1989, loc cit.) ou outros livros-texto padrão. Alternativamente, as moléculas de ácido nucleico e vetores recitados podem ser reconstituídos em lipossomas para entrega às células alvo. Os vetores contendo as moléculas de ácido nucleico da invenção podem ser transferidos para a célula hospedeira por métodos bem conhecidos, que variam dependendo do tipo de hospedeiro celular. Por exemplo, a transfecção de cloreto de cálcio é comumente utilizada para células procarióticas, enquanto o tratamento de fosfato de cálcio ou eletroporação pode ser usado para outros hospedeiros celulares; ver Sambrook, supra. O vetor recitado pode, entre outros, ser o pEF-DHFR, pEF-ADA ou pEF-neo. Os vetores pEF-DHFR, pEF-ADA e pEF-neo foram descritos na técnica, por exemplo, em Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92 (1995), 7021-7025 e Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001), 141 -150.

[0294] A invenção também fornece uma célula T transformada ou

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147/293 transfectada com um vetor como aqui descrito. A referida célula T pode ser produzida introduzindo pelo menos um dos vetores descritos acima ou pelo menos uma das moléculas de ácido nucleico descritas acima na célula T ou em sua célula precursora. A presença do referido pelo menos um vetor ou pelo menos uma molécula de ácido nucleico na célula T pode mediar a expressão de um gene que codifica o receptor de ligação ao antígeno descrito acima compreendendo um domínio extracelular que compreende uma porção de ligação ao antígeno capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado. O vetor da presente invenção pode ser policistrônico.

[0295] A(s) molécula(s) de ácido nucleico ou vetor(es) descrito(s) que é(são) introduzido(s) na célula T ou em sua célula precursora pode(m) integrar-se ao genoma da célula ou pode(m) ser mantido(s) extracromossomicamente.

Antígenos Específicos de Tumor

[0296] Como mencionado acima, o(s) domínio(s) (derivado de Ig) do anticorpo aqui descrito compreendendo um domínio Fc mutado pode compreender um sítio de interação do antígeno com especificidade para uma molécula de superfície celular, isto é, um antígeno tumor-específico que ocorre naturalmente na superfície de uma célula tumoral. No contexto da presente invenção, esses anticorpos trarão células T transduzidas, como aqui descrito, compreendendo o receptor de ligação ao antígeno da invenção em contato físico com uma célula tumoral, em que a célula T transduzida se torna ativada. A ativação de células T transduzidas da presente invenção pode resultar em lise da célula tumoral, como aqui descrito.

[0297] Exemplos de marcadores tumorais que ocorrem naturalmente na superfície das células tumorais são apresentados abaixo e compreendem, mas não estão limitados a, FAP (proteína de ativação de fibroblastos), CEA (antígeno carcinoembrionário), p95 (p95HER2), BCMA

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148/293 (antígeno de maturação de células B), EpCAM (molécula de adesão celular epitelial), MSLN (mesotelina), MCSP (proteoglicano sulfato de condroitina de melanoma), HER-1 (fator de crescimento epidérmico humano 1), HER-2 (fator de crescimento epidérmico humano 2), HER-3 (fator de crescimento epidérmico humano 3), CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, CD52Flt3, receptor de folato 1 (FOLR1), antígeno de superfície celular de trofoblasto humano 2 (Trop-2) antígeno de câncer 12-5 (CA-12-5), antígeno leucocitário humano - relacionado ao antígeno D (HLA-DR), MUC-1 (mucina-1), antígeno A33, PSMA (antígeno de membrana específico da próstata), tirosina quinase 3 do tipo FMS (FLT-3), PSMA (antígeno de membrana específico da próstata), PSCA (antígeno de células-tronco da próstata), receptor de transferrina, TNC (tenascina), anidrase carbônica IX (CA-IX) e/ ou peptídeos ligados a uma molécula do complexo principal de histocompatibilidade humano (MHC).

[0298] Por conseguinte, no contexto da presente invenção, o receptor de ligação ao antígeno, conforme descrito aqui, liga-se ao domínio Fc mutado de um anticorpo, isto é, um anticorpo terapêutico capaz de se ligar especificamente a um antígeno/ marcador que ocorre naturalmente na superfície das células tumorais selecionadas do grupo que consiste em FAP (proteína de ativação de fibroblastos), CEA (antígeno carcinoembrionário), p95 (p95HER2), BCMA (antígeno de maturação de células B), EpCAM (molécula de adesão celular epitelial), MSLN (mesotelina), MCSP (proteoglicano sulfato de condroitina de melanoma), HER-1 (fator de crescimento epidérmico humano 1), HER-2 (fator de crescimento epidérmico humano 2), HER-3 (fator de crescimento epidérmico humano 3), CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, CD52Flt3, receptor de folato 1 (FOLR1), antígeno de superfície celular de trofoblasto humano 2 (Trop-2) antígeno de câncer 12-5 (CA-12-5), antígeno leucocitário humano - relacionado ao antígeno D (HLA-DR), MUC-1 (mucina-1), antígeno A33, PSMA (antígeno de membrana específico da próstata), tirosina

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149/293 quinase 3 do tipo FMS (FLT-3), PSMA (antígeno de membrana específico da próstata), PSCA (antígeno de células-tronco da próstata), receptor de transferrina, TNC (tenascina), anidrase carbônica IX (CA-IX) e/ ou peptideos ligados a uma molécula do complexo principal de histocompatibilidade humano (MHC).

[0299] A(s) sequência(s) dos membros (humanos) do antígeno A33, BCMA (antígeno de maturação de células B), antígeno de câncer 12-5 (CA-12-5), anidrase carbônica IX (CA-IX), CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, CEA (antígeno carcinoembrionário), EpCAM (molécula de adesão celular epitelial), FAP (proteína de ativação de fibroblastos), tirosina quinase 3 do tipo FMS (FLT-3), receptor de folato 1 (FOLR1), HER-1 (fator de crescimento epidérmico humano 1), HER-2 (fator de crescimento epidérmico humano 2), HER-3 (fator de crescimento epidérmico humano 3), antígeno leucocitário humano - relacionado ao antígeno D (HLA-DR), MSLN (mesotelina), MCSP (proteoglicano sulfato de condroitina de melanoma), MUC-1 (mucina-1), PSMA (antígeno de membrana específico da próstata), PSMA (antígeno de membrana específico da próstata), PSCA (antígeno de células-tronco da próstata), p95 (p95HER2), receptor de transferrina, TNC (tenascina), antígeno de superfície celular de trofoblasto humano 2 (Trop-2) estão disponíveis no banco de dados UniProtKB/Swiss-Prot e podem ser recuperadas a partir de http://www.uniprot.org/uniprot/?query=reviewed%3Ayes. Estas sequências (proteínas) também se referem a sequências modificadas anotadas. A presente invenção também fornece técnicas e métodos em que são usadas sequências homólogas e também variantes alélicas genéticas e similares das sequências concisas aqui fornecidas. De preferência, são utilizadas tais variantes e similares das sequências concisas aqui. De preferência, essas variantes são variantes genéticas. O técnico no assunto pode deduzir facilmente a região de codificação relevante dessas sequências (proteínas) nessas entradas do banco

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150/293 de dados, que também pode incluir a entrada de DNA genômico, bem como de mRNA/ cDNA. A(s) sequência(s) da FAP (humana) (proteína de ativação de fibroblastos) pode(m) ser obtida(s) a partir da entrada Q12884 do banco de dados Swiss-Prot (versão de entrada 168, versão de sequência 5); a(s) sequência(s) do CEA (humano) (antígeno carcinoembrionário) pode(m) ser obtida(s) a partir da entrada P06731 do banco de dados Swiss-Prot (versão de entrada 171, versão de sequência 3); a(s) sequência(s) da EpCAM (molécula de adesão celular epitelial) (humana) pode(m) ser obtida(s) a partir da entrada P16422 do banco de dados Swiss-Prot (versão de entrada 117, versão de sequência 2); a(s) sequência(s) da MSLN (humana) (mesotelina) pode(m) ser obtida(s) a partir no número de entrada UniProt Q13421 (número de versão 132; versão da sequência 2); a(s) sequência(s) da tirosina quinase 3 do tipo FMS (FLT-3) (humana) pode(m) ser obtida(s) a partir da entrada P36888 do banco de dados Swiss-Prot (número de acesso citável primário) ou Q13414 (número de acesso secundário) com o número de versão 165 e a versão da sequência 2; as sequências de MCSP (humano) (proteoglicano sulfato de condroitina de melanoma) podem ser obtidas a partir do número de entrada UniProt Q6UVK1 (número de versão 118; versão de sequência 2); a(s) sequência(s) do receptor de folato 1 (humano) (FOLR1) pode(m) ser obtida(s) a partir do número de entrada UniProt P15328 (número de acesso citável primário) ou Q53EW2 (número de acesso secundário) com o número de versão 153 e a versão de sequência 3; a(s) sequência(s) do antígeno de superfície celular de trofoblasto (humano) 2 (Trop-2) pode(m) ser obtida(s) a partir do número de entrada UniProt P09758 (número de acesso citável primário) ou Q15658 (número de acesso secundário) com o número de versão 172 e o versão de sequência 3; a(s) sequência(s) do PSCA (humano) (antígeno de células-tronco da próstata) pode(m) ser obtida(s) a partir do número de entrada UniProt 043653 (número de acesso citável primário) ou Q6UW92 (número de

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151/293 acesso secundário) com o número de versão 134 e a versão da sequência 1; a(s) sequência(s) do HER-1 (humano) (receptor do fator de crescimento epidérmico) pode(m) ser obtida(s) a partir da entrada P00533 do banco de dados Swiss-Prot (versão de entrada 177, versão de sequência 2); a(s) sequência(s) do HER-2 (humano) (receptor tirosina-proteína quinase erbB-2) pode(m) ser obtida(s) a partir da entrada P04626 do banco de dados SwissProt (versão de entrada 161, versão de sequência 1); a(s) sequência(s) do HER-3 (humano) (receptor tirosina-proteína quinase erbB-3) pode(m) ser obtida(s) a partir da entrada P21860 do banco de dados Swiss-Prot (versão de entrada 140, versão de sequência 1); a(s) sequência(s) do CD20 (humano) (antígeno de linfócito B CD20) pode(m) ser obtida(s) a partir da entrada P11836 do banco de dados Swiss-Prot (versão de entrada 117, versão de sequência 1); a(s) sequência(s) do CD22 (humano) (antígeno de linfócito B CD22) pode(m) ser obtida(s) a partir da entrada P20273 do banco de dados Swiss-Prot (versão de entrada 135, versão de sequência 2); a(s) sequência(s) do CD33 (humano) (antígeno de linfócito B CD33) pode(m) ser obtida(s) a partir da entrada P20138 do banco de dados Swiss-Prot (versão de entrada 129, versão de sequência 2); a(s) sequência(s) do CA-12-5 (humano) (Mucina 16) pode(m) ser obtida(s) a partir da entrada Q8WXI7 do banco de dados Swiss-Prot (versão de entrada 66, versão de sequência 2); a(s) sequência(s) do HLA-DR (humano) pode(m) ser obtida(s) a partir da entrada Q29900 do banco de dados Swiss-Prot (versão de entrada 59, versão de sequência 1); a(s) sequência(s) da MUC-1 (humana) (Mucina-1) pode(m) ser obtida(s) a partir da entrada P15941 do banco de dados Swiss-Prot (versão de entrada 135, versão de sequência 3); a(s) sequência(s) do A33 (humano) (antígeno A33 da superfície celular) pode(m) ser obtida(s) a partir da entrada Q99795 do banco de dados Swiss-Prot (versão de entrada 104, versão de sequência 1); a(s) sequência(s) do PSMA (humano) (Glutamato carboxipeptidase 2) pode(m) ser obtida(s) a partir da entrada

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Q04609 do banco de dados Swiss-Prot (versão de entrada 133, versão de sequência 1), a(s) sequência(s) do receptor de transferrina (humano) pode(m) ser obtida(s) a partir das entradas do banco de dados Swiss-Prot Q9UP52 (versão de entrada 99, versão de sequência 1) e P02786 (versão de entrada 152, versão de sequência 2); a sequência da TNC (humana) (tenascina) pode ser obtida a partir da entrada P24821 do banco de dados Swiss-Prot (versão de entrada 141, versão de sequência 3); ou a(s) sequência(s) da CA-IX (humana) (anidrase carbônica IX) pode(m) ser obtida(s) a partir da entrada Q16790 do banco de dados Swiss-Prot (versão de entrada 115, versão de sequência 2).

Uso Terapêutico e Métodos de Tratamento

[0300] As moléculas ou construtos (isto é, receptores de ligação ao antígeno, células T transduzidas e kits) aqui fornecidos são particularmente úteis em contextos médicos, em particular para o tratamento de uma doença maligna. Por exemplo, um tumor pode ser tratado com uma célula T transduzida expressando um receptor de ligação ao antígeno da presente invenção em conjunto com um anticorpo terapêutico específico para a célula tumoral e que compreende um domínio Fc mutado. Por conseguinte, em certas formas de realização, o receptor de ligação ao antígeno, a célula T transduzida ou o kit são utilizados no tratamento de uma doença maligna, em particular em que a doença maligna é selecionada a partir de câncer de origem epitelial, endotelial ou mesotelial e câncer de sangue.

[0301] A especificidade do tumor do tratamento é fornecida pelo anticorpo terapêutico que compreende um domínio Fc mutado, em que o anticorpo é administrado antes, simultaneamente ou após a administração de célula T transduzida que expressa um receptor de ligação ao antígeno da invenção. Neste contexto, as células T transduzidas são células T universais, uma vez que não são específicas para um dado tumor, mas podem ser direcionadas a qualquer tumor, dependendo do anticorpo terapêutico que

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153/293 compreende o domínio Fc mutado usado de acordo com a invenção.

[0302] Neste contexto, a doença maligna pode ser um câncer/ carcinoma de origem epitelial, endotelial ou mesotelial ou um câncer de sangue. No contexto da presente invenção, o câncer/ carcinoma é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer gastrointestinal, câncer de pâncreas, câncer colangiocelular, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pele, câncer de boca, câncer gástrico, câncer cervical, Linfoma de células T e B, leucemia mielóide, câncer de ovário, leucemia, leucemia linfática, carcinoma nasofaríngeo, câncer de cólon, câncer de próstata, câncer de células renais, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pele (melanoma), câncer do trato geniturinário, por exemplo, câncer de testículo, câncer de ovário, câncer endotelial, câncer de colo do útero e câncer de rim, câncer do dueto biliar, câncer de esôfago, câncer das glândulas salivares e câncer da glândula tireóide ou outras doenças tumorais, como tumores hematológicos, gliomas, sarcomas ou osteossarcomas.

[0303] Por exemplo, doenças tumorais e/ ou linfomas podem ser tratados com um construto específico direcionado contra essas indicações médicas. A indicação para uma célula T transduzida da presente invenção combinada com um anticorpo terapêutico que compreende um domínio Fc mutado é dada pela especificidade do anticorpo terapêutico para um antígeno tumoral. Por exemplo, câncer gastrointestinal, câncer pancreático, câncer colangiocelular, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pele e/ ou câncer de boca pode ser tratado com um anticorpo que compreende um domínio Fc mutado, em que o anticorpo é direcionado contra EpCAM (humano) (como o antígeno tumor-específico que ocorre naturalmente na superfície de uma célula tumoral).

[0304] O câncer gastrointestinal, câncer pancreático, câncer colangiocelular, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de ovário, câncer

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154/293 de pele e/ ou câncer de boca pode ser tratado com uma célula T transduzida da presente invenção administrada antes, simultaneamente ou após a administração de um anticorpo terapêutico que compreende um domínio Fc mutado em que o anticorpo é direcionado contra HER1, preferencialmente HER1 humano. Além disso, câncer gastrointestinal, câncer pancreático, câncer colangiocelular, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pele, glioblastoma e/ ou câncer de boca podem ser tratados com uma célula T transduzida da presente invenção administrada antes, simultaneamente ou após a administração de um anticorpo terapêutico que compreende um domínio Fc mutado em que o anticorpo é direcionado contra MCSP, preferencialmente MCSP humano. O câncer gastrointestinal, câncer pancreático, câncer colangiocelular, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pele, glioblastoma e/ ou câncer de boca pode ser tratado com uma célula T transduzida da presente invenção administrada antes, simultaneamente ou após a administração de um anticorpo terapêutico que compreende um domínio Fc mutado em que o anticorpo é direcionado contra FOLR1, preferencialmente FOLR1 humano. O câncer gastrointestinal, câncer pancreático, câncer colangiocelular, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pele, glioblastoma e/ ou câncer de boca pode ser tratado com uma célula T transduzida da presente invenção administrada antes, simultaneamente ou após a administração de um anticorpo terapêutico que compreende um domínio Fc mutado em que o anticorpo é direcionado contra Trop-2, preferencialmente Trop-2 humano. O câncer gastrointestinal, câncer pancreático, câncer colangiocelular, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pele, glioblastoma e/ ou câncer de boca pode ser tratado com uma célula T transduzida da presente invenção administrada antes, simultaneamente ou após a administração de um anticorpo terapêutico que compreende um domínio Fc mutado em que o anticorpo é

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155/293 direcionado contra PSCA, preferencialmente PSCA humano. O câncer gastrointestinal, câncer pancreático, câncer colangiocelular, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pele, glioblastoma e/ ou câncer de boca pode ser tratado com uma célula T transduzida da presente invenção administrada antes, simultaneamente ou após a administração de um anticorpo terapêutico que compreende um domínio Fc mutado em que o anticorpo é direcionado contra EGFRvIII, preferencialmente EGFRvIII humano. O câncer gastrointestinal, câncer pancreático, câncer colangiocelular, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pele, glioblastoma e/ ou câncer de boca pode ser tratado com uma célula T transduzida da presente invenção administrada antes, simultaneamente ou após a administração de um anticorpo terapêutico que compreende um domínio Fc mutado em que o anticorpo é direcionado contra MSLN, preferencialmente MSLN humano. O câncer gástrico, câncer de mama e/ ou câncer cervical podem ser tratados com uma célula T transduzida da presente invenção administrada antes, simultaneamente ou após a administração de um anticorpo terapêutico que compreende um domínio Fc mutado, em que o anticorpo é direcionado contra HER2, preferencialmente HER2 humano. O câncer gástrico e/ ou câncer de pulmão pode ser tratado com uma célula T transduzida da presente invenção administrada antes, simultaneamente ou após a administração de um anticorpo terapêutico que compreende um domínio Fc mutado, em que o anticorpo é direcionado contra HER3, preferencialmente HER3 humano. O linfoma de células B e/ ou linfoma de células T pode ser tratado com uma célula T transduzida da presente invenção administrada antes, simultaneamente ou após a administração de um anticorpo terapêutico que compreende um domínio Fc mutado em que o anticorpo é direcionado contra CD20, preferencialmente CD20 humano. O linfoma de células B e/ ou linfoma de células T pode ser tratado com uma célula T transduzida da presente invenção

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156/293 administrada antes, simultaneamente ou após a administração de um anticorpo terapêutico que compreende um domínio Fc mutado, em que o anticorpo é direcionado contra CD22, preferencialmente CD22 humano. A leucemia mielóide pode ser tratada com uma célula T transduzida da presente invenção administrada antes, simultaneamente ou após a administração de um anticorpo terapêutico que compreende um domínio Fc mutado em que o anticorpo é direcionado contra CD33, preferencialmente CD33 humano. O câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer de mama e/ ou câncer gastrointestinal podem ser tratados com uma célula T transduzida da presente invenção administrada antes, simultaneamente ou após a administração de um anticorpo terapêutico que compreende um domínio Fc mutado, em que o anticorpo é direcionado contra CA12-5, preferencialmente CA12-5 humano. O câncer gastrointestinal, leucemia e/ ou carcinoma nasofaríngeo podem ser tratados com uma célula T transduzida da presente invenção administrada antes, simultaneamente ou após a administração de um anticorpo terapêutico que compreende um domínio Fc mutado, em que o anticorpo é direcionado contra HLA-DR, preferencialmente HLA-DR humano. O câncer de cólon, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pulmão e/ ou câncer de pâncreas pode ser tratado com uma célula T transduzida da presente invenção administrada antes, simultaneamente ou após a administração de um anticorpo terapêutico que compreende um domínio Fc mutado em que o anticorpo é direcionado contra MUC-1, preferencialmente MUC-1 humano. O câncer de cólon pode ser tratado com uma célula T transduzida da presente invenção administrada antes, simultaneamente ou após a administração de um anticorpo terapêutico que compreende um domínio Fc mutado em que o anticorpo é direcionado contra A33, preferencialmente A33 humano. O câncer de próstata pode ser tratado com uma célula T transduzida da presente invenção administrada antes, simultaneamente ou após a administração de um anticorpo terapêutico que

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157/293 compreende um domínio Fc mutado, em que o anticorpo é direcionado contra PSMA, preferencialmente PSMA humano. O câncer gastrointestinal, câncer pancreático, câncer colangiocelular, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pele e/ ou câncer de boca pode ser tratado com uma célula T transduzida da presente invenção administrada antes, simultaneamente ou após a administração de um anticorpo terapêutico que compreende um domínio Fc mutado em que o anticorpo é direcionado contra o receptor de transferrina, preferencialmente o receptor de transferrina humano. O câncer de pâncreas, câncer de pulmão e/ ou câncer de mama podem ser tratados com uma célula T transduzida da presente invenção administrada antes, simultaneamente ou após a administração de um anticorpo terapêutico que compreende um domínio Fc mutado, em que o anticorpo é direcionado contra o receptor de transferrina, preferencialmente o receptor de transferrina humano. O câncer renal pode ser tratado com uma célula T transduzida da presente invenção administrada antes, simultaneamente ou após a administração de um anticorpo terapêutico que compreende um domínio Fc mutado em que o anticorpo é direcionado contra CA-IX, preferencialmente CAIX humano.

[0305] Por conseguinte, a invenção também se refere a um método para o tratamento de uma doença, uma doença maligna, tal como câncer de origem epitelial, endotelial ou mesotelial e/ ou câncer de sangue. No contexto da presente invenção, o referido sujeito é um humano.

[0306] No contexto da presente invenção, um método particular para o tratamento de uma doença compreende as etapas de:

(a) isolar células T, de preferência células T CD8+, a partir de um indivíduo;

(b) transduzir as referidas células T isoladas, preferencialmente células T CD8+, com um receptor de ligação ao antígeno como aqui descrito; e

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158/293 (c) administrar as células T transduzidas, preferencialmente células T CD8+, ao referido indivíduo.

[0307] No contexto da presente invenção, as referidas células T transduzidas, preferencialmente células T CD8+, e/ ou anticorpo/ anticorpos terapêuticos são co-administrados ao referido indivíduo por infusão intravenosa.

[0308] Além disso, no contexto da presente invenção, a presente invenção fornece um método para o tratamento de uma doença que compreende as etapas de:

(b) transduzir as referidas células T isoladas, preferencialmente células T CD8+, com um receptor de ligação ao antígeno como aqui descrito;

(c) opcionalmente, co-transduzir as referidas células T isoladas, preferencialmente células T CD8+, com um receptor de células T;

(d) expandir as células T, preferencialmente células T CD8+, por anticorpos anti-CD3 e anti-CD28; e (e) administrar as células T transduzidas, preferencialmente células T CD8+, ao referido indivíduo.

[0309] A etapa (d) acima mencionada (referindo-se à etapa de expansão das células T, como TIL, por anticorpos anti-CD3 e/ ou anti-CD28) também pode ser realizada na presença de citocinas (estimulantes), tais como a interleucina-2 e/ ou interleucina-15 (IL-15). No contexto da presente invenção, a etapa (d) acima mencionada (referente à etapa de expansão das células T, como a TIL, por anticorpos anti-CD3 e/ ou anti-CD28) também pode ser realizada na presença de interleucina-12 (IL-12), interleucina-7 (IL-7) e/ ou interleucina-21 (IL-21).

[0310] O método para o tratamento, além disso, compreende a

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159/293 administração do anticorpo utilizado de acordo com a presente invenção. O referido anticorpo pode ser administrado antes, simultaneamente ou após a administração das células T transduzidas. No contexto da presente invenção, a administração das células T transduzidas será realizada por infusão intravenosa. No contexto da presente invenção, as células T transduzidas são isoladas/ obtidas do indivíduo a ser tratado.

Composições

[0311] Além disso, a invenção fornece composições (medicamentos) que compreendem uma molécula(s) de anticorpo com um domínio(s) Fc mutado, uma célula(s) T transduzida que compreende um receptor de ligação ao antígeno da invenção, uma molécula(s) de ácido nucleico e um vetor(es) que codificam os receptores de ligação ao antígeno de acordo com a invenção e/ ou kits que compreendem uma ou mais das referidas composições. No contexto da presente invenção, a composição é uma composição farmacêutica que compreende ainda, opcionalmente, formulações adequadas de veículo, estabilizadores e/ ou excipientes. Por conseguinte, no contexto da presente invenção, é fornecida uma composição farmacêutica (medicamento) que compreende uma molécula de anticorpo compreendendo um domínio Fc mutado, como aqui definido, que deve ser administrado em combinação com uma célula T transduzida que compreende um receptor de ligação ao antígeno, como aqui descrito e/ ou uma composição que compreende a referida célula T transduzida, em que a referida molécula de anticorpo deve ser administrada antes, simultaneamente ou após a administração de células T transduzidas que compreendem um receptor de ligação ao antígeno da invenção.

[0312] De acordo com esta invenção, o termo “composição farmacêutica” refere-se a uma composição para administração a um paciente, preferencialmente um paciente humano. Além disso, no contexto da presente

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160/293 invenção, o paciente sofre de uma doença, em que a referida doença é uma doença maligna, especialmente cânceres/ carcinomas de origem epitelial, endotelial ou mesotelial ou um câncer de sangue. No contexto da presente invenção, os cânceres/ carcinomas são selecionados a partir do grupo que consiste em câncer gastrointestinal, câncer pancreático, câncer colangiocelular, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pele, câncer de boca, câncer gástrico, câncer cervical, Linfoma de células T e B, leucemia mielóide, câncer de ovário, leucemia, leucemia linfática, carcinoma nasofaríngeo, câncer de cólon, câncer de próstata, câncer de células renais, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pele (melanoma), câncer do trato geniturinário, por exemplo, câncer de testículo, câncer endotelial, câncer de colo do útero e câncer de rim, câncer do dueto biliar, câncer de esôfago, câncer das glândulas salivares e câncer da glândula tireóide ou outras doenças tumorais, como tumores hematológicos, gliomas, sarcomas ou osteossarcomas.

[0313] Em uma forma de realização preferida, a composição farmacêutica/ medicamento compreende um anticorpo e/ ou uma célula T transduzida como aqui definido para administração parenteral, transdérmica, intraluminal, intra-arterial, intravenosa, intratecal ou por injeção direta no tecido ou tumor. No contexto da presente invenção, a composição/ medicamento compreende um anticorpo que compreende um domínio Fc mutado como aqui definido que deve ser administrado antes, simultaneamente ou após a administração de células T transduzidas que compreendem um receptor de ligação ao antígeno, conforme aqui definido. No contexto da presente invenção, a composição farmacêutica/ medicamento que compreende um anticorpo como definido neste documento deve ser administrado em combinação com uma composição/ medicamento que compreende uma célula T transduzida compreendendo um receptor de ligação ao antígeno como aqui definido, em

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161/293 que a referida célula T foi obtida a partir de um sujeito a ser tratado.

[0314] O uso do termo “em combinação” não restringe a ordem na qual os componentes do regime de tratamento devem ser administrados ao sujeito. Por conseguinte, a composição farmacêutica/ medicamento aqui descrito abrange a administração de um anticorpo, como aqui definido, antes, simultaneamente ou após a administração de células T transduzidas compreendendo um receptor de ligação ao antígeno da presente invenção. “Em combinação”, como usado neste documento, também não restringe o tempo entre a administração de um anticorpo como aqui definido antes e as células T transduzidas compreendendo um receptor de ligação ao antígeno, conforme aqui definido. Assim, quando os dois componentes não são administrados simultaneamente/ concomitantemente, as administrações podem ser separadas por 1 minuto, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas ou 72 horas ou por qualquer diferencial de tempo adequado prontamente determinado por um técnico no assunto e/ ou aqui descrito.

[0315] No contexto da presente invenção, o termo “em combinação” também abrange a situação em que o anticorpo, como aqui definido, e as células T transduzidas que compreendem um receptor de ligação ao antígeno de acordo com a invenção são pré-incubados junto antes da administração ao sujeito. Assim, os dois componentes podem ser préincubados antes da administração, por exemplo, por 1 minuto, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos ou 1 hora ou por qualquer tempo adequado prontamente determinado por um técnico no assunto. A invenção, em outra forma de realização preferida, refere-se a um regime de tratamento, no qual o anticorpo como aqui definido e as células T transduzidas que compreendem um receptor de ligação ao antígeno como aqui definido, devem ser administrados simultaneamente/ concomitantemente. No contexto da

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162/293 presente invenção, o anticorpo como aqui definido pode ser administrado após a administração das células T transduzidas que compreendem um receptor de ligação ao antígeno.

[0316] Além disso, “em combinação”, conforme usado neste documento, não restringe os regimes de tratamento divulgados à administração de um anticorpo conforme definido aqui e células T transduzidas, preferencialmente células T CD8+, compreendendo um receptor de ligação ao antígeno da invenção em sequência imediata (isto é, o administração de um dos dois componentes, seguida (após um certo intervalo de tempo) pela administração do outro, sem a administração e/ ou prática de qualquer outro protocolo de tratamento entre eles. Portanto, os regimes de tratamento atuais também abrangem a administração separada de uma molécula de anticorpo como aqui definida e células T transduzidas, preferencialmente células T CD8+, compreendendo um receptor de ligação ao antígeno de acordo com a invenção, em que as administrações são separadas por um ou mais protocolos de tratamento necessários e/ ou adequados para o tratamento ou prevenção da doença ou um sintoma da mesma. Exemplos de tais protocolos de tratamento de intervenção incluem, entre outros, administração de medicação para dor; administração de quimioterápicos, manuseio cirúrgico da doença ou um sintoma da mesma. Por conseguinte, os regimes de tratamento como aqui divulgados abrangem a administração de um anticorpo como aqui definido e células T transduzidas, preferencialmente células T CD8+ que compreendem um receptor de ligação ao antígeno como aqui definido juntamente com nenhum, um ou mais de um protocolo de tratamento adequado para o tratamento ou prevenção de uma doença, ou um sintoma da mesma, como aqui descrito ou como conhecido na técnica.

[0317] É particularmente considerado que a(s) referida(s) composição(ões) farmacêutica(s)/ medicamento(s) devem ser administrados a

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163/293 um paciente por infusão ou injeção. No contexto da presente invenção, as células T transduzidas que compreendem um receptor de ligação ao antígeno, como descrito aqui, devem ser administradas a um paciente por infusão ou injeção. A administração das composições/ medicamentos adequados pode ser realizada de diferentes maneiras, administração intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular, tópica ou intradérmica.

[0318] A composição farmacêutica/ medicamento da presente invenção pode ainda compreender um veículo farmaceuticamente aceitável. Exemplos de veículos farmacêuticos adequados são bem conhecidos na técnica e incluem soluções salinas tamponadas com fosfato, água, emulsões, como emulsões óleo/ água, vários tipos de agentes umectantes, soluções estéreis, etc. Composições que compreendem esses veículos podem ser formuladas por métodos convencionais bem conhecidos. Estas composições farmacêuticas podem ser administradas ao sujeito em uma dose adequada. O regime de dosagem será determinado pelo médico responsável e por fatores clínicos. Como é bem conhecido no campo médico, as dosagens para qualquer paciente dependem de muitos fatores, incluindo o tamanho do paciente, a área de superfície corporal, a idade, o composto específico a ser administrado, o sexo, o tempo e a via de administração, a saúde geral e outros medicamentos sendo administrados simultaneamente. Geralmente, o regime como uma administração regular da composição farmacêutica deve estar na faixa de 1 pg a 5 g de unidades por dia. No entanto, uma dosagem mais preferida para infusão contínua pode estar na faixa de 0,01 pg a 2 mg, preferencialmente 0,01 pg a 1 mg, mais preferencialmente 0,01 pg a 100 pg, ainda mais preferencialmente 0,01 pg a 50 pg e mais preferencialmente de 0,01 pg a 10 pg de unidades por quilograma de peso corporal por hora. Dosagens particularmente preferidas são aqui descritas abaixo. O progresso pode ser monitorado por avaliação periódica. As dosagens variam, mas uma dosagem

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164/293 preferida para administração intravenosa de DNA é de aproximadamente 10⁶ a 10¹² cópias da molécula de DNA.

[0319] As composições da invenção podem ser administradas local ou sistematicamente. A administração será geralmente parenteral, por exemplo, por via intravenosa; células T transduzidas também podem ser administradas direcionadas para o sítio alvo, por exemplo, por cateter para um local em uma artéria. As preparações para administração parenteral incluem soluções, suspensões e emulsões aquosas ou não aquosas estéreis. Exemplos de solventes não aquosos são propilenoglicol, polietilenoglicol, óleos vegetais, tais como óleo de oliva e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etila. Os veículos aquosos incluem água, soluções alcoólicas/ aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo solução salina e meios tamponados. Os veículos parenterais incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, Ringer com lactato ou óleos fixos. Os veículos intravenosos incluem reabastecimentos de fluidos e nutrientes, reabastecedores de eletrólitos (tais como os baseados na dextrose de Ringer) e similares. Conservantes e outros aditivos também podem estar presentes, como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes e gases inertes e similares. Além disso, a composição farmacêutica da presente invenção pode compreender veículos proteináceos, como, por exemplo, albumina sérica ou imunoglobulina, preferencialmente de origem humana. Está previsto que a composição farmacêutica da invenção pode compreender, além dos construtos de anticorpos proteináceos ou moléculas de ácido nucleico ou vetores que codificam as mesmas (como descrito nesta invenção) e/ ou células, outros agentes biologicamente ativos, dependendo do uso pretendido da composição farmacêutica. Esses agentes podem ser fármacos que atuam no sistema gastrointestinal, fármacos que atuam como citostáticos, fármacos que previnem a hiperuricemia, fármacos que inibem reações imunológicas (por exemplo,

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165/293 corticosteróides), fármacos que atuam no sistema circulatório e/ ou agentes tais como moléculas de co-estímulo de células T ou citocinas conhecidos na técnica.

[0320] Possível indicação para administração da(s) composição(ões)/ medicamento(s) da invenção são doenças malignas, tais como câncer de origem epitelial, endotelial ou mesotelial e câncer de sangue, especialmente cânceres/ carcinomas epiteliais, tais como câncer de mama, câncer de cólon, câncer de próstata, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pele (melanoma), câncer do trato geniturinário, por exemplo, câncer de ovário, câncer de testículo, câncer endotelial, câncer de colo do útero e câncer renal, câncer de pulmão, câncer gástrico, câncer do dueto biliar, câncer de esôfago, câncer das glândulas salivares e câncer da glândula tireóide ou outras doenças tumorais, como tumores hematológicos, gliomas, sarcomas ou osteossarcomas.

[0321] A invenção prevê ainda os protocolos de co-administração com outros compostos, por exemplo, moléculas capazes de fornecer um sinal de ativação para células efetoras imunes, para proliferação celular ou para estimulação celular. A referida molécula pode ser, por exemplo, um sinal de ativação primária adicional para células T (por exemplo, uma molécula de coestímulo adicional: moléculas da família B7, OX40L, 4.1 BBL, CD40L, antiCTLA-4, anti-PD-1) ou uma outra interleucina de citocinas (por exemplo, IL-2).

[0322] A composição da invenção, como descrita acima, também pode ser uma composição de diagnóstico que compreende ainda, opcionalmente, meios e métodos para detecção.

[0323] Por conseguinte, nas formas de realização preferidas, são fornecidos o kit, os receptores de ligação ao antígeno ou a célula T transduzida, como aqui descrito, para uso como um medicamento. No contexto da presente invenção, é fornecido o receptor de ligação ao antígeno de acordo

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166/293 com a invenção para uso como um medicamento, em que um ou mais anticorpos que compreendem um domínio Fc mutado, conforme descrito neste documento, devem ser administrados antes, simultaneamente ou após a administração de células T transduzidas, preferencialmente células T CD8+ que compreendem e/ ou expressam um receptor de ligação ao antígeno, como aqui definido, e em que as referidas células T, preferencialmente células T CD8+, foram obtidas a partir de um sujeito a ser tratado. O referido medicamento pode ser utilizado em um método de tratamento de doenças malignas, especialmente canceres/ carcinomas de origem epitelial, endotelial ou mesotelial ou do sangue. No contexto da presente invenção, o câncer/ carcinoma é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer gastrointestinal, câncer de pâncreas, câncer colangiocelular, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pele, câncer de boca, câncer gástrico, câncer cervical, Linfoma de células T e B, leucemia mielóide, câncer de ovário, leucemia, leucemia linfática, carcinoma nasofaríngeo, câncer de cólon, câncer de próstata, câncer de células renais, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pele (melanoma), câncer do trato geniturinário, por exemplo, câncer de testículo, câncer de ovário, câncer endotelial, câncer de colo do útero e câncer de rim, câncer do dueto biliar, câncer de esôfago, câncer das glândulas salivares e câncer da glândula tireóide ou outras doenças tumorais, como tumores hematológicos, gliomas, sarcomas ou osteossarcomas.

[0324] Além disso, no contexto da presente invenção, o anticorpo como aqui descrito compreendendo um domínio Fc mutado se liga a um antígeno tumor-específico que ocorre naturalmente na superfície de uma célula tumoral, em que a referida molécula de anticorpo deve ser administrada antes, simultaneamente ou após e administração de células T transduzidas, preferencialmente células T CD8+, a partir do referido sujeito compreendendo

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167/293 um receptor de ligação ao antígeno como aqui definido. No contexto da presente invenção, o câncer/ carcinoma é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer gastrointestinal, câncer de pâncreas, câncer colangiocelular, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pele, câncer de boca, câncer gástrico, câncer cervical, Linfoma de células T e B, leucemia mielóide, câncer de ovário, leucemia, leucemia linfática, carcinoma nasofaríngeo, câncer de cólon, câncer de próstata, câncer de células renais, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pele (melanoma), câncer do trato geniturinário, por exemplo, câncer de testículo, câncer de ovário, câncer endotelial, câncer de colo do útero e câncer de rim, câncer do dueto biliar, câncer de esôfago, câncer das glândulas salivares e câncer da glândula tireóide ou outras doenças tumorais, como tumores hematológicos, gliomas, sarcomas ou osteossarcomas.

[0325] Além disso, de acordo com a invenção, uma molécula ou construto (isto é, uma molécula de anticorpo aqui descrita) que compreende um ou dois domínios de ligação direcionados a/ se ligando a/ interagindo com um antígeno tumoral, preferencialmente um antígeno tumoral humano (como o antígeno tumor-específico que ocorre naturalmente na superfície de uma célula tumoral) e que compreende um domínio Fc mutado, em que os domínios extracelulares aqui definidos do receptor de ligação ao antígeno da presente invenção são direcionados a/ se ligam a/ interagem com o domínio Fc mutado, são fornecidos para o tratamento de câncer gastrointestinal, câncer pancreático, câncer colangiocelular, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pele e/ ou câncer de boca. Assim, no contexto da presente invenção, é fornecida uma molécula de anticorpo que compreende dois domínios de ligação direcionados a/ se ligando a/ interagindo com um antígeno tumoral, preferencialmente um antígeno tumoral humano, e que compreende um domínio Fc mutado, em que os domínios extracelulares aqui

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168/293 definidos do receptor de ligação ao antígeno são direcionados a/ se ligam a/ interagem com o domínio Fc mutado, para uso no tratamento câncer de origem epitelial, endotelial ou mesotelial e câncer de sangue.

[0326] Em uma forma de realização, é fornecido (i) um anticorpo, que compreende dois domínios de ligação direcionados a/ se ligando a/ interagindo com um antígeno tumoral, preferencialmente um antígeno tumoral humano e um domínio Fc mutado; e (ii) o receptor de ligação ao antígeno de acordo com a invenção direcionado a/ se ligando a/ interagindo com o domínio Fc mutado, para uso no tratamento de câncer gastrointestinal, câncer pancreático, câncer colangiocelular, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de ovário, pele câncer e/ ou câncer de boca.

[0327] Em uma forma de realização, é fornecido (i) um anticorpo que compreende um ou dois domínios de ligação contra HER1, preferencialmente HER1 humano, e um domínio Fc mutado, e (ii) o receptor de ligação ao antígeno, de acordo com a invenção, direcionado a/ se ligando a/ interagindo com o domínio Fc mutado, para uso no tratamento de câncer gastrointestinal, câncer de pâncreas, câncer colangiocelular, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pele e/ ou câncer de boca.

[0328] Em uma forma de realização, é fornecido (i) um anticorpo que compreende um ou dois domínios de ligação contra HER2, preferencialmente HER2 humano, e um domínio Fc mutado, e (ii) o receptor de ligação ao antígeno, de acordo com a invenção, direcionado a/ se ligando a/ interagindo com o domínio Fc mutado, para uso no tratamento de câncer gástrico, câncer de mama e/ ou câncer cervical.

[0329] Em uma forma de realização, é fornecido (i) um anticorpo que compreende um ou dois domínios de ligação contra HER3, preferencialmente HER3 humano, e um domínio Fc mutado, e (ii) o receptor de ligação ao antígeno, de acordo com a invenção, direcionado a/ se ligando a/

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169/293 interagindo com o domínio Fc mutado, para uso no tratamento de câncer gástrico e/ ou câncer de pulmão.

[0330] Em uma forma de realização, é fornecido (i) um anticorpo que compreende um ou dois domínios de ligação contra CEA, preferencialmente CEA humano, e um domínio Fc mutado, e (ii) o receptor de ligação ao antígeno, de acordo com a invenção, direcionado a/ se ligando a/ interagindo com o domínio Fc mutado, para uso no tratamento de câncer de origem epitelial, endotelial ou mesotelial e câncer de sangue.

[0331] Em uma forma de realização, é fornecido (i) um anticorpo que compreende um ou dois domínios de ligação contra p95, preferencialmente p95 humano, e um domínio Fc mutado, e (ii) o receptor de ligação ao antígeno, de acordo com a invenção, direcionado a/ se ligando a/ interagindo com o domínio Fc mutado, para uso no tratamento de câncer de origem epitelial, endotelial ou mesotelial e câncer de sangue.

[0332] Em uma forma de realização, é fornecido (i) um anticorpo que compreende um ou dois domínios de ligação contra BCMA, preferencialmente BCMA humano, e um domínio Fc mutado, e (ii) o receptor de ligação ao antígeno, de acordo com a invenção, direcionado a/ se ligando a/ interagindo com o domínio Fc mutado, para uso no tratamento de câncer de origem epitelial, endotelial ou mesotelial e câncer de sangue.

[0333] Em uma forma de realização, é fornecido (i) um anticorpo que compreende um ou dois domínios de ligação contra MSLN, preferencialmente MSLN humano, e um domínio Fc mutado, e (ii) o receptor de ligação ao antígeno, de acordo com a invenção, direcionado a/ se ligando a/ interagindo com o domínio Fc mutado, para uso no tratamento de câncer de origem epitelial, endotelial ou mesotelial e câncer de sangue.

[0334] Em uma forma de realização, é fornecido (i) um anticorpo que compreende um ou dois domínios de ligação contra MCSP,

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170/293 preferencialmente MCSP humano, e um domínio Fc mutado, e (ii) o receptor de ligação ao antígeno, de acordo com a invenção, direcionado a/ se ligando a/ interagindo com o domínio Fc mutado, para uso no tratamento de câncer de origem epitelial, endotelial ou mesotelial e câncer de sangue.

[0335] Em uma forma de realização, é fornecido (i) um anticorpo que compreende um ou dois domínios de ligação contra CD19, preferencialmente CD19 humano, e um domínio Fc mutado, e (ii) o receptor de ligação ao antígeno, de acordo com a invenção, direcionado a/ se ligando a/ interagindo com o domínio Fc mutado, para uso no tratamento de câncer de origem epitelial, endotelial ou mesotelial e câncer de sangue.

[0336] Em uma forma de realização, é fornecido (i) um anticorpo que compreende um ou dois domínios de ligação contra CD20, preferencialmente CD20 humano, e um domínio Fc mutado, e (ii) o receptor de ligação ao antígeno, de acordo com a invenção, direcionado a/ se ligando a/ interagindo com o domínio Fc mutado, para uso no tratamento de linfoma de células B e/ ou linfoma de células T.

[0337] Em uma forma de realização, é fornecido (i) um anticorpo que compreende um ou dois domínios de ligação contra CD22, preferencialmente CD22 humano, e um domínio Fc mutado, e (ii) o receptor de ligação ao antígeno, de acordo com a invenção, direcionado a/ se ligando a/ interagindo com o domínio Fc mutado, para uso no tratamento de linfoma de células B e/ ou linfoma de células T.

[0338] Em uma forma de realização, é fornecido (i) um anticorpo que compreende um ou dois domínios de ligação contra CD38, preferencialmente CD38 humano, e um domínio Fc mutado, e (ii) o receptor de ligação ao antígeno, de acordo com a invenção, direcionado a/ se ligando a/ interagindo com o domínio Fc mutado, para uso no tratamento de câncer de origem epitelial, endotelial ou mesotelial e câncer de sangue.

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171/293

[0339] Em uma forma de realização, é fornecido (i) um anticorpo que compreende um ou dois domínios de ligação contra CD52Flt3, preferencialmente CD52Flt3 humano, e um domínio Fc mutado; e (ii) o receptor de ligação ao antígeno, de acordo com a invenção, direcionado a/ se ligando a/ interagindo com o domínio Fc mutado, para uso no tratamento de câncer de origem epitelial, endotelial ou mesotelial e câncer de sangue.

[0340] Em uma forma de realização, é fornecido (i) um anticorpo que compreende um ou dois domínios de ligação contra FolR1, preferencialmente FolR1 humano, e um domínio Fc mutado; e (ii) o receptor de ligação ao antígeno, de acordo com a invenção, direcionado a/ se ligando a/ interagindo com o domínio Fc mutado, para uso no tratamento de câncer de origem epitelial, endotelial ou mesotelial e câncer de sangue.

[0341] Em uma forma de realização, é fornecido (i) um anticorpo que compreende um ou dois domínios de ligação contra Trop-2, preferencialmente Trop-2 humano, e um domínio Fc mutado; e (ii) o receptor de ligação ao antígeno, de acordo com a invenção, direcionado a/ se ligando a/ interagindo com o domínio Fc mutado, para uso no tratamento de câncer gastrointestinal, câncer pancreático, câncer colangiocelular, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de ovário, pele câncer, glioblastoma e/ ou câncer de boca.

[0342] Em uma forma de realização, é fornecido (i) um anticorpo que compreende um ou dois domínios de ligação contra CA-12-5, preferencialmente CA-12-5 humano, e um domínio Fc mutado; e (ii) o receptor de ligação ao antígeno, de acordo com a invenção, direcionado a/ se ligando a/ interagindo com o domínio Fc mutado, para uso no tratamento de câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer de mama e/ ou câncer gastrointestinal.

[0343] Em uma forma de realização, é fornecido (i) um anticorpo que compreende um ou dois domínios de ligação contra HLA-DR,

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172/293 preferencialmente HLA-DR humano, e um domínio Fc mutado; e (ii) o receptor de ligação ao antígeno, de acordo com a invenção, direcionado a/ se ligando a/ interagindo com o domínio Fc mutado, para uso no tratamento de câncer gastrointestinal, leucemia e/ ou carcinoma nasofaríngeo.

[0344] Em uma forma de realização, é fornecido (i) um anticorpo que compreende um ou dois domínios de ligação contra MUC-1, preferencialmente MUC-1 humano, e um domínio Fc mutado; e (ii) o receptor de ligação ao antígeno, de acordo com a invenção, direcionado a/ se ligando a/ interagindo com o domínio Fc mutado, para uso no tratamento de câncer de cólon, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pulmão e/ ou câncer de pâncreas.

[0345] Em uma forma de realização, é fornecido (i) uma molécula de anticorpo que compreende um ou dois domínios de ligação contra A33, preferencialmente A33 humano, e um domínio Fc mutado; e (ii) o receptor de ligação ao antígeno, de acordo com a invenção, direcionado a/ se ligando a/ interagindo com o domínio Fc mutado, para uso no tratamento de câncer de cólon.

[0346] Em uma forma de realização, é fornecido (i) um anticorpo que compreende um ou dois domínios de ligação contra PSMA, preferencialmente PSMA humano, e um domínio Fc mutado; e (ii) o receptor de ligação ao antígeno, de acordo com a invenção, direcionado a/ se ligando a/ interagindo com o domínio Fc mutado, para uso no tratamento de câncer de próstata.

[0347] Em uma forma de realização, é fornecido (i) uma molécula de anticorpo que compreende um ou dois domínios de ligação contra PSCA, preferencialmente PSCA humano, e um domínio Fc mutado; e (ii) o receptor de ligação ao antígeno, de acordo com a invenção, direcionado a/ se ligando a/ interagindo com o domínio Fc mutado, para uso no tratamento de câncer de

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173/293 origem epitelial, endotelial ou mesotelial e câncer de sangue.

[0348] Em uma forma de realização, é fornecido (i) uma molécula de anticorpo que compreende um ou dois domínios de ligação contra o receptor de transferrina, preferencialmente o receptor de transferrina humano, e um domínio Fc mutado; e (ii) o receptor de ligação ao antígeno, de acordo com a invenção, direcionado a/ se ligando a/ interagindo com o domínio Fc mutado, para uso no tratamento de câncer de origem epitelial, endotelial ou mesotelial e câncer de sangue.

[0349] Em uma forma de realização, é fornecido (i) um anticorpo que compreende um ou dois domínios de ligação contra tenascina, preferencialmente tenascina humana, e um domínio Fc mutado; e (ii) o receptor de ligação ao antígeno, de acordo com a invenção, direcionado a/ se ligando a/ interagindo com o domínio Fc mutado, para uso no tratamento de câncer de origem epitelial, endotelial ou mesotelial e câncer de sangue.

[0350] Em uma forma de realização, é fornecido (i) uma molécula de anticorpo que compreende um ou dois domínios de ligação contra CA-IX, preferencialmente XA-IX humano, e um domínio Fc mutado; e (ii) o receptor de ligação ao antígeno, de acordo com a invenção, direcionado a/ se ligando a/ interagindo com o domínio Fc mutado, para uso no tratamento de câncer renal.

Formas de Realização Exemplificativas

[0351] 1. Um receptor de ligação ao antígeno compreendendo um domínio transmembrana de ancoragem e um domínio extracelular que compreende uma porção de ligação ao antígeno, em que a porção de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a um domínio de fragmento cristalizável (Fc) mutado, mas não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado, em que o domínio Fc mutado compreende pelo menos uma substituição de aminoácido em comparação com o domínio Fc parental não mutado.

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174/293

[0352] 2. O receptor de ligação ao antígeno da forma de realização 1, em que a ligação do receptor Fc do domínio Fc mutado é reduzida em comparação com a ligação do receptor Fc do domínio Fc parental não mutado, particularmente em que o receptor Fc é um receptor Fcy ou receptor Fc neonatal (FcRn).

[0353] 3. O receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das formas de realização 1 ou 2, em que a ligação do receptor Fc é medida por Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR) a 25 °C.

[0354] 4. O receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das formas de realização 1 a 3, em que a porção de ligação ao antígeno é um scFv, um Fab, crossFab ou um scFab.

[0355] 5. O receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das formas de realização 1 a 4, em que o domínio transmembrana de ancoragem é um domínio transmembrana selecionado a partir do grupo que consiste no domínio transmembrana CD8, CD3z, FCGR3A, NKG2D, CD27, CD28, CD137, 0X40, ICOS, DAP10 ou DAP12 ou um fragmento do mesmo.

[0356] 6. O receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das formas de realização 1 a 5, em que o domínio transmembrana de ancoragem é o domínio transmembrana de CD28, em particular em que o domínio transmembrana de ancoragem compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.

[0357] 7. O receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das formas de realização 1 a 6 compreende ainda pelo menos um domínio de sinalização de estímulo e/ ou pelo menos um domínio de sinalização de coestímulo.

[0358] 8. O receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das formas de realização 1 a 7, em que o pelo menos um domínio de sinalização de estímulo é selecionado individualmente a partir do grupo que consiste no

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175/293 domínio intracelular de CD3z, de FCGR3A e de NKG2D, ou fragmentos dos mesmos.

[0359] 9. O receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das formas de realização 1 a 8, em que o pelo menos um domínio de sinalização de estímulo é o domínio intracelular de CD3z ou um fragmento do mesmo, em particular em que o pelo menos um domínio de sinalização de estímulo compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.

[0360] 10. O receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das formas de realização 1 a 9, em que o pelo menos um domínio de sinalização de co-estímulo é selecionado individualmente a partir do grupo que consiste no domínio intracelular de CD27, de CD28, de CD137, de 0X40, de ICOS, de DAP10 e de DAP12, ou fragmentos dos mesmos.

[0361] 11.0 receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das formas de realização 1 a 10, em que o pelo menos um domínio de sinalização de co-estímulo é o domínio intracelular de CD28 ou um fragmento do mesmo, em particular, em que o pelo menos um domínio de sinalização de co-estímulo compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.

[0362] 12. O receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das formas de realização 1 a 11, em que o receptor de ligação ao antígeno compreende um domínio de sinalização de estímulo compreendendo o domínio intracelular de CD3z, ou um fragmento do mesmo, e em que o receptor de ligação ao antígeno compreende um domínio de sinalização de co-estímulo compreendendo o domínio intracelular de CD28, ou um fragmento do mesmo.

[0363] 13. O receptor de ligação ao antígeno da forma de realização 12, em que o domínio de sinalização de estímulo compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 e o domínio de sinalização de co-estímulo compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.

[0364] 14. O receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das

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176/293 formas de realização 1 a 13, em que o domínio extracelular está conectado ao domínio transmembrana de ancoragem, opcionalmente através de um ligante peptídico.

[0365] 15. O receptor de ligação ao antígeno da forma de realização 14, em que o ligante peptídico compreende a sequência de aminoácidos GGGGS (SEQ ID NO: 17).

[0366] 16. O receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das formas de realização 1 a 15, em que o domínio transmembrana de ancoragem está conectado a um domínio de co-sinalização ou a um domínio de sinalização, opcionalmente através de um ligante peptídico.

[0367] 17. O receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das formas de realização 1 a 16, em que os domínios de sinalização e/ ou cosinalização estão conectados, opcionalmente através de pelo menos um ligante peptídico.

[0368] 18. O receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das formas de realização 1 a 17, em que a porção de ligação ao antígeno é um fragmento scFv, em que o fragmento scFv está conectado no C-terminal ao Nterminal do domínio transmembrana de ancoragem, opcionalmente através de um ligante peptídico.

[0369] 19. O receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das formas de realização 1 a 17, em que a porção de ligação ao antígeno é um fragmento Fab ou um fragmento crossFab, em que o fragmento Fab ou crossFab está conectado no C-terminal da cadeia pesada ao N- terminal do domínio transmembrana de ancoragem, opcionalmente através de um ligante peptídico.

[0370] 20. O receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das formas de realização 7 a 19, em que o receptor de ligação ao antígeno compreende um domínio de co-sinalização, em que o domínio de co

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177/293 sinalização está conectado no N-terminal ao C-terminal do domínio transmembrana de ancoragem.

[0371] 21. O receptor de ligação ao antígeno da forma de realização 20, em que o receptor de ligação ao antígeno compreende adicionalmente um domínio de sinalização de estímulo, em que o domínio de sinalização de estímulo está conectado no N-terminal ao C-terminal do domínio de sinalização de co-estímulo.

[0372] 22. O receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das formas de realização 1 a 21, em que o domínio Fc parental não mutado é um domínio Fc de lgG1 ou lgG4, particularmente um domínio Fc de lgG1 humana.

[0373] 23. O receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das formas de realização 1 a 22, em que o domínio Fc mutado compreende pelo menos uma mutação de aminoácido em uma posição selecionada a partir do grupo que consiste em L234, L235, I253, H310, P331, P329 e H435, de acordo com a numeração EU, em particular em que a mutação de aminoácido é L234A, L235A, I253A, N297A, H310A, P329G e/ou H435A.

[0374] 24. O receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das formas de realização 1 a 23, em que o domínio Fc mutante compreende uma substituição de aminoácido em uma posição selecionada a partir do grupo que consiste no resíduo 117, 118, 136, 180, 193, 212, 214 e 318 de Fc de lgG1 humana (SEQ ID NO: 130), em particular em que a mutação de aminoácido é L117A, L118A, 1136A, N180A, H193A, P212G, P214G e/ ou H318A.

[0375] 25. O receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das formas de realização 1 a 24, em que o domínio Fc mutado compreende pelo menos uma mutação de aminoácido em uma posição selecionada a partir do grupo que consiste em L234, L235 e P329 de acordo com a numeração EU, em particular as mutações de aminoácido L234A, L235A e P329G (“PGLALA”).

[0376] 26. O receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das

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178/293 formas de realização 1 a 25, em que o domínio Fc mutado compreende a mutação de aminoácido P329G de acordo com a numeração EU, em que a ligação do receptor Fey do domínio Fc mutado é reduzida em comparação com a ligação do receptor Fey de o domínio Fc parental não mutado, em particular em que o receptor Fey é FcyRllla e/ ou FcyRlla humano.

[0377] 27. O receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das formas de realização 1 a 26, em que o domínio Fc mutante compreende uma substituição de aminoácido na posição 212 de Fc de lgG1 humana (SEQ ID NO: 130), em particular em que a mutação dos aminoácidos é P212G.

[0378] 28. O receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das formas de realização 1 a 24, em que o domínio Fc mutado compreende pelo menos uma mutação de aminoácido em uma posição selecionada a partir do grupo que consiste em I253, H310 e H435 de acordo com a numeração EU, em particular as mutações de aminoácido I253A, H310A e H435A (“AAA”), em que a ligação de FcRn do domínio Fc mutado é reduzida em comparação com a ligação de FcRn do domínio Fc parental não mutado.

[0379] 29. O receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das formas de realização 1 a 24 ou 28, em que o domínio Fc mutante compreende uma substituição de aminoácido nas posições 136, 193 e 318 de Fc de lgG1 humana (SEQ ID NO: 130), em particular em que a mutação de aminoácido é 1136A, H193A e H318A (“AAA”).

[0380] 30. O receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das formas de realização 1 a 27, em que a pelo menos uma porção de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado que compreende a mutação P329G, mas não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado, em que a porção de ligação ao antígeno compreende:

(i) uma região variável da cadeia pesada (VH) que compreende:

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179/293 (a) a sequência de aminoácidos RYWMN (SEQ ID NO: 1) da região determinante de complementaridade (CDR H) 1 da cadeia pesada;

(e) a sequência de aminoácidos GTNKRAP (SEQ ID NO: 5) da CDR L2; e (f) a sequência de aminoácidos ALWYSNHWV (SEQ ID NO: 6) da CDR L3.

[0381 ] 31. O receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das formas de realização 1 a 27 ou 30, em que a pelo menos uma porção de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado que compreende a mutação P329G, mas não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado, em que a porção de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 32 e uma região variável da cadeia leve (VL) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 33.

[0382] 32. O receptor de ligação ao antígeno das formas de

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180/293 realização 1 a 27, 30 ou 31, em que a pelo menos uma porção de ligação ao antígeno compreende a região variável da cadeia pesada (VH) de SEQ ID NO: 8 e a região variável da cadeia leve (VL) de SEQ ID NO: 9.

[0383] 33. O receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das formas de realização 1 a 27 ou 30 a 32, em que a pelo menos uma porção de ligação ao antígeno é um scFv capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado que compreende a mutação P329G, mas não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado, em que o receptor de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 31.

[0384] 34. O receptor de ligação ao antígeno da forma de realização 33, compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.

[0385] 35. O receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das formas de realização 1 a 27 ou 30 a 32, em que a pelo menos uma porção de ligação ao antígeno é um fragmento Fab capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado que compreende a mutação P329G, mas que não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado, em que o receptor de ligação ao antígeno compreende:

a) um polipeptídeo de fusão de cadeia pesada que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO:48;e

b) um polipeptídeo de cadeia leve que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NO: 41 e SEQ ID NO: 50.

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[0386] 36. O receptor de ligação ao antígeno da forma de realização 35, compreendendo:

a) o polipeptídeo de fusão de cadeia pesada de SEQ ID NO: 39; e

b) o polipeptídeo de cadeia leve de SEQ ID NO: 41.

[0387] 37. O receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das formas de realização 1 a 24 ou 28 a 29, em que a pelo menos uma porção de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado que compreende as mutações I253A, H310A e H435A (“AAA”), mas não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado, em que a porção de ligação ao antígeno compreende:

(i) uma região variável da cadeia pesada (VH) que compreende:

55) da CDR H3; e (ii) uma região variável da cadeia leve (VL) que compreende:

(d) a sequência de aminoácidos RSSQTIVHSTGHTYLE (SEQ ID NO: 56) da região determinante de complementaridade (CDR L) 1 da cadeia leve;

[0388] 38. O receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das formas de realização 1 a 24, 28, 29 ou 37, em que a pelo menos uma porção de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc

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182/293 mutado que compreende as mutações I253A, H310A e H435A (“AAA”), mas não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado, em que a porção de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 e uma região variável da cadeia leve (VL) que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62.

[0389] 39. O receptor de ligação ao antígeno das formas de realização 1 a 24, 28, 29 ou 37 a 38, em que a pelo menos uma porção de ligação ao antígeno compreende:

a) a região variável da cadeia pesada (VH) de SEQ ID NO: 61; e

b) a região variável da cadeia leve (VL) de SEQ ID NO: 62.

[0390] 40. O receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das formas de realização 1 a 24, 28, 29 ou 37 a 39, em que a pelo menos uma porção de ligação ao antígeno é um scFv capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado que compreende as mutações I253A, H310A e H435A (“AAA”), mas não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado, em que o receptor de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59.

[0391] 41. O receptor de ligação ao antígeno da forma de realização 40, que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

59.

[0392] 42. O receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das formas de realização 1 a 27 ou 30 a 32, em que a pelo menos uma porção de ligação ao antígeno é um fragmento Fab capaz de se ligar especificamente a

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183/293 um domínio Fc mutado que compreende a mutação P329G, mas que não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado, em que o receptor de ligação ao antígeno compreende:

[0393] 43. O receptor de ligação ao antígeno da forma de realização 42, compreendendo:

a) o polipeptídeo de fusão de cadeia pesada de SEQ ID NO: 39; e

b) o polipeptídeo de cadeia leve de SEQ ID NO: 41.

[0394] 44. Um polinucleotídeo isolado que codifica o receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das formas de realização 1 a 43.

[0395] 45. Um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo de fusão de cadeia pesada ou um polipeptídeo de cadeia leve do receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das formas de realização 1 a 32, 35 a 39 e 42 a 43.

[0396] 46. Uma composição que codifica o receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das formas de realização 1 a 32, 35 a 39 e 42 a 43, que compreende um primeiro polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo de fusão de cadeia pesada e um segundo polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo de cadeia leve.

[0397] 47. Um polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo de qualquer uma das formas de realização 44 ou 45 ou pela composição da forma de realização 46.

[0398] 48. Um vetor, particularmente um vetor de expressão, que

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184/293 compreende o polinucleotídeo da forma de realização 44 ou os polinucleotídeos da forma de realização 45.

[0399] 49. Uma célula T transduzida que compreende o polinucleotídeo da forma de realização 44, a composição da forma de realização 46 ou o vetor da forma de realização 48.

[0400] 50. Uma célula T transduzida capaz de expressar o receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das formas de realização 1 a 43.

[0401] 51. A célula T transduzida de qualquer uma das formas de realização 49 ou 50, em que a célula T transduzida é co-transduzida com um receptor de célula T (TCR) capaz de se ligar especificamente a um antígeno alvo.

[0402] 52. Um kit compreendendo:

(A) uma célula T transduzida capaz de expressar o receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das formas de realização 1 a 43; e (B) um anticorpo que compreende um domínio Fc mutado;

[0403] 53. Um kit compreendendo:

(A) um polinucleotídeo isolado que codifica o receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das formas de realização 1 a 43; e (B) um anticorpo que compreende um domínio Fc mutado;

[0404] 54. Um kit compreendendo:

(A) a composição da forma de realização 46 ou o vetor da forma

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185/293 de realização 48 que codifica o receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das formas de realização 1 a 43; e (B) um anticorpo que compreende um domínio Fc mutado;

[0405] 55. O kit de qualquer uma das formas de realização 52 a

54, em que o domínio Fc parental não mutado é um domínio Fc de lgG1 ou lgG4, particularmente um domínio Fc de IgG 1 humana.

[0406] 56. O kit de qualquer uma das formas de realização 52 a

55, em que a ligação do receptor Fc do domínio Fc mutado é reduzida em comparação com a ligação do receptor Fc do domínio Fc parental não mutado, particularmente em que o receptor Fc é um receptor Fcy ou receptor Fc neonatal (FcRn).

[0407] 57. O kit da forma de realização 56, em que a ligação do receptor Fc é medida por Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR) a 25 °C.

[0408] 58. O kit de qualquer uma das formas de realização 52 a

57, em que o domínio Fc mutado compreende pelo menos uma mutação de aminoácido em uma posição selecionada a partir do grupo que consiste em L234, L235, I253, H310, P331, P329 e H435 de acordo com a numeração EU, em particular em que a mutação de aminoácido é L234A, L235A, I253A, N297A, H310A, P329G e/ou H435A.

[0409] 59. O kit de qualquer uma das formas de realização 52 a

58, em que o domínio Fc mutado compreende pelo menos uma mutação de aminoácido em uma posição selecionada a partir do grupo que consiste em L234, L235 e P329 de acordo com a numeração EU, em particular as mutações de aminoácidos L234A, L235A e P329G (“PGLALA”).

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[0410] 60. O kit de qualquer uma das formas de realização 52 a

59, em que o domínio Fc mutado compreende a mutação de aminoácido P329G de acordo com a numeração EU.

[0411] 61. O kit de qualquer uma das formas de realização 52 a

60, em que o domínio Fc mutado compreende pelo menos uma mutação de aminoácido em uma posição selecionada a partir do grupo que consiste em I253, H310 e H435 de acordo com a numeração EU, em particular as mutações de aminoácidos I253A, H310A e H435A (“AAA”).

[0412] 62. O kit de qualquer uma das formas de realização 52 a

61, em que o anticorpo que compreende o domínio Fc mutado é capaz de se ligar especificamente a um antígeno na superfície de uma célula tumoral, em particular em que o antígeno é selecionado a partir do grupo que consiste em FAP, CEA, p95, BCMA, EpCAM, MSLN, MCSP, HER-1, HER-2, HER-3, CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, CD52Flt3, FOLR1, Trop-2, CA-12-5, HLA-DR, MUC-1 (mucina), antígeno A33, PSMA, PSCA, receptor de transferrina, TNC (tenascina) e CA-IX e/ ou a um peptídeo ligado a uma molécula do complexo principal de histocompatibilidade humano (MHC).

[0413] 63. O kit de qualquer uma das formas de realização 52 a

62, em que o anticorpo que compreende o domínio Fc mutado é capaz de se ligar especificamente a um antígeno selecionado a partir do grupo que consiste em proteína de ativação de fibroblastos (FAP), antígeno carcinoembrionário (CEA), mesotelina (MSLN), CD20, receptor de folato 1 (FOLR1) e tenascina (TNC).

[0414] 64. O kit de qualquer uma das formas de realização 52 a 63 para uso como um medicamento.

[0415] 65. O receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das formas de realização 1 a 43 ou a célula T transduzida de qualquer uma das formas de realização 49 a 51 para uso como um medicamento, em que uma

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187/293 célula T transduzida que expressa o receptor de ligação ao antígeno é administrada antes, simultaneamente ou após a administração de um anticorpo que compreende um domínio Fc mutado, em que o receptor de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc mutado, mas não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado.

[0416] 66. O kit de qualquer uma das formas de realização 52 a 63, para uso no tratamento de uma doença, em particular para uso no tratamento de uma doença maligna.

[0417] 67. O receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das formas de realização 1 a 43 ou a célula T transduzida de qualquer uma das formas de realização 49 a 51 para uso no tratamento de uma doença maligna, em que o tratamento compreende a administração de uma célula T transduzida que expressa o receptor de ligação ao antígeno antes, simultaneamente ou após a administração de um anticorpo que compreende um domínio Fc mutado, em que o receptor de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc mutado, mas não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado.

[0418] 68. O receptor de ligação ao antígeno, a célula T transduzida ou o kit para uso de acordo com a forma de realização 66 ou 67, em que a referida doença maligna é selecionada a partir de câncer de origem epitelial, endotelial ou mesotelial e câncer de sangue.

[0419] 69. O receptor de ligação ao antígeno, a célula T transduzida ou o kit para uso de acordo com as formas de realização 66 a 68, em que o anticorpo que compreende o domínio Fc mutado é capaz de se ligar especificamente a um antígeno na superfície das células tumorais, em particular em que o antígeno é selecionado a partir do grupo que consiste em FAP, CEA, p95, BCMA, EpCAM, MSLN, MCSP, HER-1, HER-2, HER-3, CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, CD52Flt3, FOLR1, Trop- 2, CA-12-5, HLA-DR,

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MUC-1 (mucina), antígeno A33, PSMA, PSCA, receptor de transferrina, TNC (tenascina) e CA-IX e/ ou a um peptídeo ligado a uma molécula do complexo principal de histocompatibilidade humano (MHC).

[0420] 70. O receptor de ligação ao antígeno, a célula T transduzida ou o kit para uso de acordo com as formas de realização 66 a 69, em que o anticorpo que compreende o domínio Fc mutado é capaz de se ligar especificamente a um antígeno selecionado a partir do grupo que consiste na proteína de ativação de fibroblastos (FAP), antígeno carcinoembrionário (CEA), mesotelina (MSLN), CD20, receptor de folato 1 (FOLR1) e tenascina (TNC).

[0421] 71. O receptor de ligação ao antígeno, a célula T transduzida ou o kit para uso de acordo com qualquer uma das formas de realização 66 a 70, em que a célula T transduzida é derivada de uma célula isolada do sujeito a ser tratado.

[0422] 72. O receptor de ligação ao antígeno, a célula T transduzida ou o kit para uso de acordo com qualquer uma das formas de realização 66 a 70, em que a célula T transduzida não é derivada de uma célula isolada do indivíduo a ser tratado.

[0423] 73. Um método de tratamento de uma doença em um sujeito, compreendendo administrar ao sujeito uma célula T transduzida capaz de expressar o receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das formas de realização 1 a 43 e administrar antes, simultaneamente ou após a administração da célula T transduzida, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo que compreende um domínio Fc mutado, em que o receptor de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc mutado, mas não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado.

[0424] 74. O método da forma de realização 73, compreendendo adicionalmente isolar uma célula T do sujeito e gerar a célula T transduzida

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189/293 através da transdução da célula T isolada com o polinucleotideo da forma de realização 44, a composição da forma de realização ou o vetor da forma de realização 48.

[0425] 75. O método da forma de realização 74, em que a célula T é transduzida com um construto de vetor retroviral ou lentiviral ou com um construto de vetor não viral.

[0426] 76. O método da forma de realização 75, em que o construto de vetor não viral é um vetor de minicirculo sleeping beauty.

[0427] 77. O método de qualquer uma das formas de realização 73 a 76, em que a célula T transduzida é administrada ao sujeito por infusão intravenosa.

[0428] 78. O método de qualquer uma das formas de realização 73 a 77, em que a célula T transduzida é colocada em contato com anticorpos anti-CD3 e/ ou anti-CD28 antes da administração ao sujeito.

[0429] 79. O método de qualquer uma das formas de realização 73 a 78, em que a célula T transduzida é colocada em contato com pelo menos uma citocina antes da administração ao sujeito, preferencialmente com interleucina-2 (IL-2), interleucina-7 (IL-7), interleucina-15 (IL-15) e/ ou interleucina-21, ou variantes dos mesmos.

[0430] 80. O método de qualquer uma das formas de realização 73 a 79, em que a doença é uma doença maligna.

[0431] 81. O método de qualquer uma das formas de realização 73 a 79, em que a doença é selecionada a partir de câncer de origem epitelial, endotelial ou mesotelial e câncer de sangue.

[0432]82. Método para induzir a lise de uma célula alvo, compreendendo colocada em contato a célula alvo com uma célula T transduzida capaz de expressar o receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das formas de realização 1 a 43 na presença de um anticorpo que

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190/293 compreende um domínio Fc mutado em que o receptor de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc mutado, mas não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado.

[0433]83. O método da forma de realização 82, em que a célula alvo é uma célula cancerígena.

[0434]84. O método de qualquer uma das formas de realização 82 ou 83, em que a célula alvo expressa um antígeno selecionado a partir do grupo que consiste em FAP, CEA, p95, BCMA, EpCAM, MSLN, MCSP, HER-1, HER-2, HER- 3, CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, CD52Flt3, FOLR1, Trop-2, CA-12-5, HLA-DR, MUC-1 (mucina), antígeno A33, PSMA, PSCA, receptor de transferrina, TNC (tenascina) e CA-IX.

[0435]85. O método de qualquer uma das formas de realização 82 a 84, em que a célula alvo expressa um antígeno selecionado a partir do grupo que consiste em proteína de ativação de fibroblastos (FAP), antígeno carcinoembrionário (CEA), mesotelina (MSLN), CD20, receptor de folato 1 (FOLR1) e tenascina (TNC).

[0436]86. Uso do receptor de ligação ao antígeno de qualquer uma das formas de realização 1 a 43, dos polinucleotídeos de qualquer uma das formas de realização 44 e 45 ou da célula T transduzida de qualquer uma das formas de realização 49 a 51 para a fabricação de um medicamento.

[0437]87. O uso da forma de realização 86, em que o medicamento é para o tratamento de uma doença maligna.

[0438]88. O uso da forma de realização 86, em que o medicamento é para o tratamento de uma doença.

[0439]89. O uso da forma de realização 87, caracterizada pela referida doença maligna ser selecionada a partir de câncer de origem epitelial, endotelial ou mesotelial e câncer de sangue.

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[0440]90. O uso da forma de realização 88, caracterizada pela referida doença ser selecionada a partir de câncer de origem epitelial, endotelial ou mesotelial e câncer de sangue.

[0441] Estas e outras formas de realização são relevadas e englobadas pela descrição e exemplos da presente invenção. Literatura adicional referente a qualquer um dos anticorpos, métodos, usos e compostos a serem empregados de acordo com a presente invenção pode ser recuperada a partir de bibliotecas e bancos de dados públicos, utilizando, por exemplo, dispositivos eletrônicos. Por exemplo, o banco de dados público “Medline”, disponível na Internet, pode ser utilizado, por exemplo, em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. Outros bancos de dados e endereços, tais como http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, http://www.infobiogen.fr/, http://www.fmi.ch/biology/research_tools.html, http: //www.tigr.org/, são do conhecimento dos técnicos no assunto e também podem ser obtidos usando, por exemplo, http://www.lycos.com.

Exemplos

[0442]A seguir estão exemplos de métodos e composições da invenção. Entende-se que várias outras formas de realização podem ser realizadas, dada a descrição geral fornecida acima.

TÉCNICAS DE DNA RECOMBINANTE

[0443] Foram utilizados métodos padrão para manipular o DNA, como descrito em Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor, Nova Iorque, 1989. Os reagentes biológicos moleculares foram utilizados de acordo com as instruções do fabricante. Informações gerais sobre as sequências nucleotídicas das cadeias leve e pesada de imunoglobulina humana são fornecidas em: Kabat, E.A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5- ed., Publicação NIH n^s 91-3242.

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Sequenciamento de DNA

[0444] As sequências de DNA foram determinadas por sequenciamento de fita dupla.

Síntese Gênica

[0445] Os segmentos de genes desejados foram gerados por PCR usando modelos apropriados ou foram sintetizados por Geneart AG (Regensburg, Alemanha) a partir de oligonucleotídeos sintéticos e produtos de PCR por síntese gênica automatizada. Os segmentos de genes flanqueados por sítios de divagem de endonucleases de restrição singulares foram clonados em vetores de clonagem/ sequenciamento padrão. O DNA do plasmídeo foi purificado a partir de bactérias transformadas e a concentração foi determinada por espectroscopia de UV. A sequência de DNA dos fragmentos de genes subclonados foi confirmada por sequenciamento de DNA. Os segmentos gênicos foram projetados com sítios de restrição adequados para permitir a subclonagem nos respectivos vetores de expressão. Todos os construtos foram projetados com uma sequência de DNA de extremidade 5' que codifica para um peptídeo líder que tem como alvo proteínas para secreção em células eucarióticas.

Purificação de Proteínas

[0446] As proteínas foram purificadas a partir de sobrenadantes filtrados de cultura de células, referindo-se a protocolos padrão. Em resumo, os anticorpos foram aplicados a uma coluna de Proteína A Sepharose (GE Healthcare) e lavados com PBS. A eluição dos anticorpos foi alcançada a pH 2,8, seguida por neutralização imediata da amostra. A proteína agregada foi separada dos anticorpos monoméricos por cromatografia de exclusão por tamanho (Superdex 200, GE Healthcare) em PBS ou em Histidina 20 mM, NaCI 150 mM, pH 6,0. As frações de anticorpos monoméricos foram reunidas, concentradas (se necessário) utilizando, por exemplo, um concentrador

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193/293 centrífugo MILLIPORE Amicon Ultra (30 MWCO), congeladas e armazenadas a -20 °C ou -80 °C. Parte das amostras foi fornecida para análises de proteínas subsequentes e caracterização analítica, por exemplo, por SDS-PAGE e cromatografia de exclusão por tamanho (SEC).

SDS-PAGE

[0447] O sistema de gel NuPAGE® Pre-Cast (Invitrogen) foi usado de acordo com as instruções do fabricante. Em particular, 10% ou 4-12% de géis pré-moldados NuPAGE® Novex® Bis-TRIS (pH 6,4) e um tampão de corrida NuPAGE® MES (géis reduzidos, com aditivo de tampão de corrida antioxidante NuPAGE®) ou MOPS (géis não reduzidos) foi usado.

Cromatografia Analítica de Exclusão por Tamanho

[0448] A cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) para a determinação da agregação e do estado oligomérico dos anticorpos foi realizada por cromatografia de HPLC. Resumidamente, os anticorpos purificados de proteína A foram aplicados a uma coluna Tosoh TSKgel G3000SW em NaCI 300 mM, KH2PO4/ K2HPO4 50 mM, pH 7,5 em um sistema HPLC 1100 da Agilent ou a uma coluna Superdex 200 (GE Healthcare) em 2 x PBS em um Sistema HPLC Dionex. A proteína eluída foi quantificada por absorbância de UV e integração de áreas de pico. O Padrão de Filtração BioRad Gel 151-1901 serviu como padrão.

Produção de Anticorpos

[0449] As mutações Pro329Gly, Leu234Ala e Leu235Ala foram introduzidas na região constante para anular a ligação aos receptores gama Fc de acordo com 0 método descrito na Publicação de Pedido de Patente Internacional n^s WO 2012/130831 A1. Consequentemente, as mutações I253A, H310A e H435A (“AAA”) foram introduzidas na região constante para anular a ligação ao FcRn. Os respectivos anticorpos foram produzidos co-transfectando células HEK293-EBNA com os vetores de expressão de mamíferos usando

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194/293 polietilenimina. As células foram transfectadas com os correspondentes vetores de expressão para cadeias pesadas e leves na proporção de 1:1.

Transdução Lentiviral de Células T Jurkat NFAT

[0450] Para produzir vetores lentivirais, as sequências de DNA respectivas para a montagem correta do receptor de ligação ao antígeno foram clonadas em quadro em um vetor de polinucleotídeo lentiviral sob um promotor precoce imediato (CMV) do citomegalovírus humano constitutivamente ativo. O vetor retroviral continha um elemento regulador pós-transcricional do vírus da hepatite de marmota (WPRE), um elemento do trato de polipurina central (cPPT), uma origem de replicação de pUC e um gene que codifica para resistência a antibióticos, facilitando a propagação e seleção em bactérias.

[0451] Para produzir partículas funcionais de vírus, a transfecção à base de Lipofectamine LTX™ foi realizada usando células Hek293T confluentes de 60 a 70% (ATCC CRL3216) e vetores contendo CAR, além de vetores de transferência pCMV-VSV-G: pRSV-REV: pCgpV na proporção de 3:1:1:1. Após 48 horas o sobrenadante foi coletado, centrifugado por 5 minutos a 250 g para remover os resíduos celulares e filtrado através de filtro de polietersulfona de 0,45 ou 0,22 pm. Partículas de vírus concentradas (Lenti-xConcentrator, Takara) foram usadas para transduzir células Jurkat NFAT (Signosis). As células transduzidas positivas foram classificadas como conjuntos ou clones únicos usando o classificador FACSARIA (BD Bioscience). Após expansão celular para densidade apropriada, as células Jurkat NFAT T foram usadas para experimentos.

Exemplo 1

[0452] É descrito aqui um ensaio de células T Jurkat NFAT repórter usando células tumorais SUDHDL4 que expressam CD20 como células alvo e um conjunto classificado de células T Jurkat NFAT expressando Anti-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD (Figura 6A) ou um

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195/293 conjunto de células T Jurkat NFAT expressando anti-P329G-ds-scFvCD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD (Figura 6B) como células alvo. Utilizou-se como IgG, GA101 IgG com mutação P329G LALA, que por um lado reconhece o antígeno tumoral e, por outro lado, é reconhecido pelas células T Jurkat NFAT transduzidas. Como controle positivo, uma placa de 96 poços (Cellstar Greiner-bio-one, CAT n^s 655185) foi revestida com 10 pg/ml de anticorpo CD3 (da Biolegend®) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 4 °C de um dia para outro ou durante pelo menos 1 hora a 37 °C. Os poços revestidos com CD3 foram lavados duas vezes com PBS, após a etapa final de lavagem, o PBS foi completamente removido. As células efetoras ou células do tipo selvagem Jurkat NFAT foram contadas e verificadas quanto à sua viabilidade usando Cedex HiRes. O número de células foi ajustado para 1x10⁶ células viáveis/ ml. Portanto, uma alíquota apropriada da suspensão de células foi transformada em péletes a 21 Og por 5 minutos à temperatura ambiente (RT) e ressuspensa em RPMI-160 fresco + FCS a 10% + Glutamax a 1% (meio de crescimento). As células alvo que expressam o antígeno de interesse também foram contadas e verificadas quanto à sua viabilidade. O número de células foi ajustado, análogo como descrito para as células efetoras, para 1x10⁶ células viáveis/ ml em meio de crescimento. As células alvo e as células efetoras foram plaqueadas na proporção E: T de 5: 1 ou 1: 1 (110.000 células por poço no total) em triplicatas em uma placa de cultura de suspensão de 96 poços (Greiner-bio one). Como etapa seguinte, uma diluição em série de GA101 com mutação P329G LALA, visando o antígeno de interesse, foi preparada em meio de crescimento usando uma placa de poço de 2 ml de profundidade (Axygen®). Para obter concentrações finais variando de 1 pg/ ml a 0,0001 pg/ ml em um volume final de 200 pl por poço, pipetou-se uma alíquota de 50 pl das diferentes diluições para os respectivos poços. A placa de 96 poços foi centrifugada por 2 minutos a 190 g e à temperatura ambiente. Selada com

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Parafilm®, a placa foi incubada a 37 °C e 5% de CO2 em uma atmosfera de umidade. Após 20 horas de incubação, 0 conteúdo de cada poço foi misturado pipetando para cima e para baixo 10 vezes, usando uma pipeta multicanal. Transferiu-se 100 μΙ de suspensão de células para uma nova placa de 96 poços de fundo claro e plano branca (Greiner-bio-one) e adicionou-se 100 μΙ de ensaio ONE-GIo™ Luciferase (Promega). Após 15 minutos de incubação no escuro em um agitador rotativo a 300 rpm e à temperatura ambiente, a luminescência foi medida usando 0 leitor de placas Tecan® SparkWM, 1 s/ poço como tempo de detecção.

[0453] Após 0 co-cultivo de células alvo e efetoras na proporção de 5: 1 (pontos) ou 1: 1 (quadrados) por 20 horas, os gráficos mostram uma ativação dependente de dose de células T Jurkat NFAT que expressam AntiP329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD, bem como células T Jurkat NFAT que expressam Anti-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD quando GA101 IgG com mutação P329G LALA foi usada como anticorpo (Figuras 6 A e B, representadas em preto). Se a GA101 IgG sem mutação P329G LALA (Figuras 6 A e B, representadas em cinza) foi usada, não foi detectável a ativação das células T Jurkat NFAT transduzidas. Cada ponto representa 0 valor médio das duplicatas biológicas, cada uma realizada como duplicata técnica. Todos os valores são representados como linha de base corrigida. O desvio padrão é indicado por barras de erro.

Exemplo 2

[0454] É descrito aqui um ensaio de células T Jurkat NFAT repórter usando células tumorais SUDHDL4 (Figura 7C e 7D) ou WSUDLCL2 (Figura 7A e 7B) que expressam CD20 como células alvo e células Jurkat NFAT de clone único que expressam Anti-P329G-ds-Fab-CD28ATDCD28CSD-CD3zSSD como células alvo. Utilizou-se GA101 IgG com mutação P329G LALA como IgG, que por um lado reconhece 0 antígeno tumoral e, por

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197/293 outro lado, é reconhecido pelas células T Jurkat NFAT. As células efetoras ou células do tipo selvagem Jurkat NFAT foram contadas e verificadas quanto à sua viabilidade usando Cedex HiRes. O número de células foi ajustado para 1x10⁶ células viáveis/ ml. Portanto, uma alíquota apropriada da suspensão de células foi transformada em péletes a 21 Og por 5 minutos à temperatura ambiente (RT) e ressuspensa em RPMI-160 fresco + FCS a 10% + Glutamax a 1% (meio de crescimento). As células alvo que expressam o antígeno de interesse também foram contadas e verificadas quanto à sua viabilidade. O número de células foi ajustado, análogo como descrito para as células efetoras, para 1x10⁶ células viáveis/ ml em meio de crescimento. As células alvo e as células efetoras foram plaqueadas na proporção E: T de 10: 1, 5: 1 ou 1: 1 (110.000 células por poço no total) em triplicatas em uma placa de cultura de suspensão de 96 poços (Greiner-bio one). Como etapa seguinte, uma diluição em série de GA101 com mutação P329G LALA, visando o antígeno de interesse, foi preparada em meio de crescimento usando uma placa de poço de 2 ml de profundidade (Axygen®). Para obter concentrações finais variando de 1 pg/ ml a 0,0001 pg/ ml em um volume final de 200 pl por poço, pipetou-se uma alíquota de 50 pl das diferentes diluições para os respectivos poços. A placa de 96 poços foi centrifugada por 2 min a 190 g e à temperatura ambiente. Selada com Parafilm®, a placa foi incubada a 37 °C e 5% de CO2 em uma atmosfera de umidade. Após 20 horas de incubação, 0 conteúdo de cada poço foi misturado pipetando para cima e para baixo 10 vezes, usando uma pipeta multicanal. Transferiu-se 100 pl de suspensão de células para uma nova placa de 96 poços de fundo claro e plano branca (Greiner-bio-one) e adicionou-se 100 pl de ensaio ONE-GIo™ Luciferase (Promega). Após 15 minutos de incubação no escuro em um agitador rotativo a 300 rpm e à temperatura ambiente, a luminescência foi medida usando 0 leitor de placas Tecan® SparkWM, 1 s/ poço como tempo de detecção.

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[0455] Após o co-cultivo de células alvo e efetoras na proporção de 10: 1 (pontos), 5: 1 (quadrados) ou 1:1 (triângulos) por 20 horas, os gráficos mostram uma GA101 IgG com ativação dependente de dose de P329G LALA de células T Jurkat NFAT que expressam Anti-P329G-ds-Fab-CD28ATDCD28CSD-CD3zSSD (Figura 7A-D, representadas em preto). Se a GA101 IgG sem a mutação P329G LALA (Figura 7A-D, representada em cinza) foi usada, então apenas uma pequena ativação das células T Jurkat NFAT transduzidas foi detectada na concentração mais alta de 1 pg/ ml de anticorpo. Cada ponto representa o valor médio da duplicata técnica. Todos os valores são representados como linha de base corrigida. O desvio padrão é indicado por barras de erro.

Exemplo 3

[0456] É aqui descrito um ensaio de células T Jurkat NFAT repórter realizado utilizando células tumorais NIH/3T3-huFAP cl 19 que expressam FAP aderentes como células alvo. Como células efetoras, um conjunto classificado de células T Jurkat NFAT que expressam Anti-P329G-dsFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD (Figura 8A) ou células T Jurkat NFAT que expressam Anti-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD (Figura 8C) foi utilizado. Utilizou-se FAP 4B9 IgG com mutação P329G LALA como IgG, que por um lado reconhece o antígeno tumoral e, por outro lado, é reconhecido pelas células T Jurkat NFAT. A IgG DP47/vk3 que porta a mutação P329G LALA foi incluída como controle de isotipo. Como controle positivo, poços de uma placa de 96 poços (Greiner-bio-one, CAT-655185) foram revestidos com 10 pg/ ml de anticorpo CD3 (da Biolegend®) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por pelo menos 1 hora a 37 °C. Os poços revestidos com CD3 foram lavados duas vezes com PBS, após a etapa final de lavagem, o PBS foi completamente removido. As células alvo NIH/3T3-huFAP cl 19 aderentes foram lavadas uma vez com PBS e destacadas usando tripsina. As

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199/293 células destacadas foram ressuspensas em DMEM + 4,5 g de LD-Glicose + LGlutamina + HEPES 25 mM + FCS a 10% e Glutamax a 1%. As células efetoras ou células T Jurkat NFAT do tipo selvagem foram contadas e verificadas quanto à sua viabilidade usando Cedex HiRes. O número de células foi ajustado para 1x10⁶ células viáveis/ ml. Portanto, uma alíquota apropriada da suspensão de células foi transformada em péletes a 21 Og por 5 minutos à temperatura ambiente (RT) e ressuspensa em RPMI-160 fresco + FCS a 10% + Glutamax a 1% (meio de crescimento). As células alvo que expressam o antígeno de interesse também foram contadas e verificadas quanto à sua viabilidade. O número de células foi ajustado, análogo como descrito para as células efetoras, para 1x10⁶ células viáveis/ ml em meio de crescimento. As células alvo e células efetoras foram plaqueadas na proporção E: T de 5: 1 (110.000 células por poço no total) em triplicatas em uma placa de cultura de suspensão de 96 poços (Greiner-bio one). Como etapa seguinte, uma diluição em série de um anticorpo com mutação P329G LALA, visando o antígeno de interesse, foi preparada em meio de crescimento usando uma placa de poço de 2 ml de profundidade (Axygen®). Para obter concentrações finais variando de 1 pg/ ml a 0,0001 pg/ ml em um volume final de 200 pl por poço, pipetou-se uma alíquota de 50 pl das diferentes diluições para os respectivos poços. A placa de 96 poços foi centrifugada por 2 minutos a 190 g e à temperatura ambiente. Selada com Parafilm®, a placa foi incubada a 37 °C e 5% de CO2 em uma atmosfera de umidade. Após 20 horas de incubação, 0 conteúdo de cada poço foi misturado pipetando para cima e para baixo 10 vezes, usando uma pipeta multicanal. Transferiu-se 100 pl de suspensão de células para uma nova placa de 96 poços de fundo claro e plano branca (Greiner-bio-one) e adicionou-se 100 pl de ensaio ONE-GIo™ Luciferase (Promega). Após 15 minutos de incubação no escuro em um agitador rotativo a 300 rpm e à temperatura ambiente, a luminescência foi medida usando 0 leitor de placas Tecan®

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200/293

SparkWM, 1 s/ poço como tempo de detecção.

[0457] As Figuras 8 B e 8 D representam dados de células T Jurkat NFAT que expressam Anti-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSDCD3zSSD (Figura 8 D) ou células T Jurkat NFAT que expressam Anti-P329Gds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD (Figura 8 B) ambas co-cultivadas com células alvo e 1 pg/ ml de anticorpo FAP 4B9 em comparação com diferentes condições de controle.

[0458] Após a incubação com 1 pg/ ml de FAP 4B9 P329G LALA, as células T Jurkat NFAT (Figura 8 B e 8 D, triângulo preto), bem como apenas as células alvo (Figura 8 B e 8 D, triângulo preto de cabeça para baixo) não mostram nenhum sinal de luminescência detectável.

[0459] As células T Jurkat NFAT também não mostram sinal de luminescência após o co-cultivo com células alvo e 1 pg/ ml de anticorpo FAP 4B9 (Figura 8 B e Figura 8 D losango preto). Enquanto a ativação dependente de CD3 de células Jurkat NFAT co-cultivada com células alvo e 1 pg/ ml de anticorpo FAP 4B9 prova sua funcionalidade através de um sinal de luminescência detectável (pontos brancos).

[0460] A ativação dependente de CD3 de células T Jurkat NFAT que expressam Anti-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD (Figura 8 B, quadrados brancos) e a ativação de células T Jurkat NFAT que expressam Anti-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD (Figura 8 D representada em quadrados brancos) co-cultivadas com células alvo e 1 pg/ ml de anticorpo FAP 4B9 mostra os sinais de luminescência mais altos de todos, uma vez que combina a ativação mediada por CAR com a ativação mediada por CD3. O sinal de luminescência mediada por CD3 também é visível quando os CARs são incubados com células alvo e 1 pg/ ml de anticorpo DP47/vk3 (Figura 8 B e Figura 8 D, triângulos brancos de cabeça para baixo). Cada ponto representa o valor médio das triplicatas técnicas. Todos os valores são representados como

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201/293 linha de base corrigida. O desvio padrão é indicado por barras de erro.

Exemplo 4

[0461 ]É aqui descrito um ensaio de células T Jurkat NFAT repórter usando células tumorais MKN45 que expressam CEA aderentes como células alvo. Como células efetoras, um conjunto classificado de células T Jurkat NFAT que expressam Anti-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSDCD3zSSD (Figura 9 A) ou de células T Jurkat NFAT que expressam AntiP329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD (Figura 9 C) foi utilizado. Utilizaram-se CEA A5B7 IgG ou CEA T84 LCHA IgG, ambas com mutação P329G LALA. Ainda, a IgG DP47/vk3 que porta a mutação P329G LALA foi incluída como controle de isotipo.

[0462] Como controle positivo, poços de uma placa de 96 poços (Greiner-bio-one, CAT-655185) foram revestidos com 10 pg/ ml de anticorpo CD3 (da Biolegend®) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 1 hora a 37 °C. Os poços revestidos com CD3 foram lavados duas vezes com PBS, após a etapa final de lavagem, o PBS foi completamente removido.

[0463] As células alvo MKN45 aderentes foram lavadas uma vez com PBS e destacadas usando tripsina. As células destacadas foram ressuspensas em DMEM + 4,5 g de LD-Glicose + L-Glutamina + HEPES 25 mM + FCS a 10% e Glutamax a 1%.

[0464] As células efetoras ou células T Jurkat NFAT do tipo selvagem foram contadas e verificadas quanto à sua viabilidade usando Cedex HiRes. O número de células foi ajustado para 1x10⁶ células viáveis/ ml. Portanto, uma alíquota apropriada da suspensão de células foi transformada em péletes a 21 Og por 5 minutos à temperatura ambiente (RT) e ressuspensa em RPMI-160 fresco + FCS a 10% + Glutamax a 1% (meio de crescimento).

[0465] As células alvo que expressam o antígeno de interesse também foram contadas e verificadas quanto à sua viabilidade. O número de

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202/293 células foi ajustado, análogo como descrito para as células efetoras, para 1x10⁶células viáveis/ ml em RPM 1-1640 + FCS a 10% + Glutamax a 1%.

[0466] As células alvo e células efetoras foram plaqueadas na proporção E: T de 5: 1 (110.000 células por poço no total) em triplicatas em uma placa de cultura de suspensão de 96 poços (Greiner-bio one).

[0467] Como etapa seguinte, uma diluição em série de um anticorpo com mutação P329G LALA, visando o antígeno de interesse, foi preparada em meio de crescimento usando uma placa de poço de 2 ml de profundidade (Axygen®). Para obter concentrações finais variando de 1 pg/ ml a 0,0001 pg/ ml em um volume final de 200 pl por poço, pipetou-se uma alíquota de 50 pl das diferentes diluições para os respectivos poços. A placa de 96 poços foi centrifugada por 2 minutos a 190 g e à temperatura ambiente. Selada com Parafilm®, a placa foi incubada a 37 °C e 5% de CO2 em uma atmosfera de umidade.

[0468] Após 20 horas de incubação, 0 conteúdo de cada poço foi misturado pipetando para cima e para baixo 10 vezes, usando uma pipeta multicanal. Transferiu-se 100 pl de suspensão de células para uma nova placa de 96 poços de fundo claro e plano branca (Greiner-bio-one) e adicionou-se 100 pl de ensaio ONE-GIo™ Luciferase (Promega). Após 15 minutos de incubação no escuro em um agitador rotativo a 300 rpm e à temperatura ambiente, a luminescência foi medida usando 0 leitor de placas Tecan® SparkWM, 1 s/ poço como tempo de detecção.

[0469] Após 0 co-cultivo de células alvo e efetoras na proporção de 5: 1 (Figura 9 A e C, pontos) por 20 horas, os gráficos mostram uma ativação dependente de dose das células T Jurkat NFAT que expressam AntiP329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD, bem como das células T Jurkat NFAT que expressam Anti-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSDCD3zSSD, quando CEA A5B7 com mutação P329G LALA foi usada como

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203/293 anticorpo (Figura 9 A e C, pontos cinzas). O uso de CEA T84 LCHA com mutação P329G LALA mostrou apenas para células T Jurkat NFAT que expressam Anti-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD uma ativação dependente da dose (Figura 9 A, pontos pretos). Enquanto que, ao usar o anticorpo com mutação P329G LALA, a ativação das células T Jurkat NFAT que expressam Anti-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD foi detectável apenas na concentração mais alta de 1 pg/ ml de anticorpo.

[0470] Se o anticorpo controle DP47/vk3 IgG com mutação P329G LALA (Figura 9 A e C, triângulos pretos) foi usado, nenhuma ativação de células T Jurkat NFAT Anti-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD ou células T Jurkat NFAT que expressam Anti-P329G-ds-Fab-CD28ATDCD28CSD-CD3zSSD foi detectável. Cada ponto representa o valor médio das triplicatas técnicas. O desvio padrão é indicado por barras de erro.

[0471] As Figuras 9 B e 9 D representam dados de células T Jurkat NFAT que expressam Anti-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSDCD3zSSD (Figura 9 B) ou células T Jurkat NFAT que expressam Anti-P329Gds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD (Figura 9 D), ambas co-cultivadas com células alvo e 1 pg/ ml de anticorpo CEA T8 LCHA P329G LALA ou CEA A5B7 P329G LALA em comparação com diferentes condições de controle.

[0472] Após a incubação com 1 pg/ ml de CEA T8 LCHA P329G LALA, as células T Jurkat NFAT CAR sozinhas (Figura 9 B e 9 D, losango preto), bem como as células alvo sozinhas (Figura 9 B e 9 D, círculo branco) não mostram nenhum sinal de luminescência detectável.

[0473] As células T Jurkat NFAT também não mostram um sinal de luminescência detectável após o co-cultivo com células alvo e 1 pg/ ml de IgG (Figura 9 B e Figura 9 D, quadrado branco e losango branco). Enquanto a ativação dependente de CD3 de células T Jurkat NFAT co-cultivadas com células alvo e 1 pg/ ml de IgG prova sua funcionalidade através de um sinal de

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204/293 luminescênciadetectável (Figura 9 B e D, cruz cinza).

[0474] A ativação dependente de CD3 de células T Jurkat NFAT Anti-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD (Figura 9 B, estrela preta e estrela cinza) e a ativação de células T Jurkat NFAT que expressam AntiP329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD (Figura 9 D, estrela preta e estrela cinza) co-cultivadas com células alvo e 1 pg/ ml de IgG mostram os sinais de luminescência mais altos de todos, uma vez que a ativação mediada por CAR e a ativação mediada por CD3 são combinadas. O sinal de luminescência mediado por CD3 também é visível quando os CARs são incubados com células alvo e 1 pg/ ml de anticorpo DP47/vk3 (Figura 9 B e Figura 9 D, sinal de adição cinza). Cada ponto representa o valor médio das triplicatas técnicas. O desvio padrão é indicado por barras de erro.

Exemplo 5

[0475] É aqui descrito um ensaio de células T Jurkat NFAT repórter usando células tumorais MKN45 que expressam CEA aderentes como células alvo. Como células efetoras, um conjunto classificado de células T Jurkat NFAT que expressam Anti-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSDCD3zSSD (Figura 10 C) ou células T Jurkat NFAT que expressam Anti-P329Gds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD (Figura 10 A) foi utilizado. Foram utilizadas a IgG CH1A1A 98 99 ou CEA hMN14, ambas com mutação P329G LALA. Ainda, a IgG DP47/vk3 que porta a mutação P329G LALA foi incluída como controle de isotipo.

[0476] Como controle positivo, poços de uma placa de 96 poços (Greiner-bio-one, CAT-655185) foram revestidos com 10 pg/ ml de anticorpo CD3 (da Biolegend®) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 1 hora a 37 °C. Os poços revestidos com CD3 foram lavados duas vezes com PBS, após a etapa final de lavagem, o PBS foi completamente removido.

[0477] As células alvo MKN45 aderentes foram lavadas uma vez

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205/293 com PBS e destacadas usando tripsina. As células destacadas foram ressuspensas em DMEM + 4,5 g de LD-Glicose + L-Glutamina + HEPES 25 mM + FCS a 10% e Glutamax a 1%.

[0478] As células efetoras ou células Jurkat NFAT do tipo selvagem foram contadas e verificadas quanto à sua viabilidade usando Cedex HiRes. O número de células foi ajustado para 1x10⁶ células viáveis/ ml. Portanto, uma alíquota apropriada da suspensão de células foi transformada em péletes a 21 Og por 5 minutos à temperatura ambiente (RT) e ressuspensa em RPMI-160 fresco + FCS a 10% + Glutamax a 1% (meio de crescimento).

[0479] As células alvo que expressam o antígeno de interesse também foram contadas e verificadas quanto à sua viabilidade. O número de células foi ajustado, análogo como descrito para as células efetoras, para 1x10⁶células viáveis/ ml em RPMI-1640 + FCS a 10% + Glutamax a 1%.

[0480] As células alvo e células efetoras foram plaqueadas na proporção E: T de 5: 1 (110.000 células por poço no total) em triplicatas em uma placa de cultura de suspensão de 96 poços (Greiner-bio one).

[0481] Como etapa seguinte, uma diluição em série de um anticorpo com mutação P329G LALA, visando o antígeno de interesse, foi preparada em meio de crescimento usando uma placa de poço de 2 ml de profundidade (Axygen®). Para obter concentrações finais variando de 1 pg/ ml a 0,0001 pg/ ml em um volume final de 200 pl por poço, pipetou-se uma alíquota de 50 pl das diferentes diluições para os respectivos poços. A placa de 96 poços foi centrifugada por 2 minutos a 190 g e à temperatura ambiente. Selada com Parafilm®, a placa foi incubada a 37 °C e 5% de CO2 em uma atmosfera de umidade.

[0482] Após 20 horas de incubação, 0 conteúdo de cada poço foi misturado pipetando para cima e para baixo 10 vezes, usando uma pipeta multicanal. Transferiu-se 100 pl de suspensão de células para uma nova placa

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206/293 de 96 poços de fundo claro e plano branca (Greiner-bio-one) e adicionou-se 100 μΙ de ensaio ONE-GIo™ Luciferase (Promega). Após 15 minutos de incubação no escuro em um agitador rotativo a 300 rpm e à temperatura ambiente, a luminescência foi medida usando o leitor de placas Tecan® SparkWM, 1 s/ poço como tempo de detecção.

[0483] Após 20 horas, o co-cultivo de células alvo e células T Jurkat NFAT que expressam Anti-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSDCD3zSSD na proporção de 5: 1 (Figura 10 A, pontos pretos e cinzas), nenhuma ativação é detectável quando o anticorpo CEA hMN14 ou o anticorpo CH1A1A 98 99 foi usado (Figura 9 A e B, pontos cinzas). As células T Jurkat NFAT que expressam anti-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD mostram pouca ativação a 0,1 e 1 pg/ ml de ambos os anticorpos CEA hMN14 ou CH1A1A 98 99 (Figura 10 C pontos pretos e cinzas).

[0484] Se o anticorpo controle DP47/vk3 IgG com mutação P329G LALA (Figura 10 A e C, triângulos pretos) foi usado, nem a ativação de células T Jurkat NFAT que expressam Anti-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSDCD3zSSD nem a de células T Jurkat NFAT que expressam anti-P329G-ds-FabCD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD foi detectável. Cada ponto representa o valor médio das triplicates técnicas. Todos os valores são representados como linha de base corrigida. O desvio padrão é indicado por barras de erro.

[0485] As Figuras 10 B e 10 D representam dados de células T Jurkat NFAT que expressam Anti-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSDCD3zSSD (Figura D) ou de células T NFAT que expressam Anti-P329G-dsscFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD (Figura 9D), ambas co-cultivados com células alvo e 1 pg/ ml de anticorpo CEA hMN14 ou anticorpo CH1A1A 98 99 em comparação com diferentes condições de controle.

[0486] Todos os experimentos de controle realizados não mostram nenhum sinal de luminescência detectável, exceto aqueles em que o CD3 foi

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207/293 usado como estímulo de ativação. Cada ponto representa o valor médio das triplicates técnicas. O desvio padrão é indicado por barras de erro.

Exemplo 6

[0487] É aqui descrito um ensaio de células T Jurkat NFAT repórter utilizando células tumorais CT26TNC cl 19 que expressam TNC aderentes como células alvo. Como células efetoras, um conjunto classificado de células T Jurkat NFAT que expressam Anti-P329G-ds-Fab-CD28ATDCD28CSD-CD3zSSD (Figura 11 C) ou de células T Jurkat NFAT que expressam Anti-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD (Figura 11 A) foi utilizado. TNCA2B10 com mutação P329G LALA foi usado como IgG. Ainda, a IgG DP47/vk3 que porta a mutação P329G LALA foi incluída como controle de isotipo.

[0488] Como controle positivo, poços de uma placa de 96 poços (Greiner-bio-one, CAT-655185) foram revestidos com 10 pg/ ml de anticorpo CD3 (da Biolegend®) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 1 hora a 37 °C. Os poços revestidos com CD3 foram lavados duas vezes com PBS, após a etapa final de lavagem, o PBS foi completamente removido.

[0489] As células alvo CT26TNC cl 19 aderentes foram lavadas uma vez com PBS e destacadas usando tripsina. As células destacadas foram ressuspensas em RPMI-1630 + FCS a 10% e Glutamax a 1% + 15 pg/ ml de Puromicina.

[0490] As células efetoras ou células T Jurkat NFAT do tipo selvagem foram contadas e verificadas quanto à sua viabilidade usando Cedex HiRes. O número de células foi ajustado para 1x10⁶ células viáveis/ ml. Portanto, uma alíquota apropriada da suspensão de células foi transformada em péletes a 21 Og por 5 minutos à temperatura ambiente (RT) e ressuspensa em RPMI-160 fresco + FCS a 10% + Glutamax a 1% (meio de crescimento).

[0491] As células alvo que expressam o antígeno de interesse

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208/293 também foram contadas e verificadas quanto à sua viabilidade. O número de células foi ajustado, análogo como descrito para as células efetoras, para 1x10⁶células viáveis/ ml em RPMI-1640 + FCS a 10% + Glutamax a 1%.

[0492] As células alvo e células efetoras foram plaqueadas na proporção E: T de 5: 1 (110.000 células por poço no total) em triplicatas em uma placa de cultura de suspensão de 96 poços (Greiner-bio one).

[0493] Como etapa seguinte, uma diluição em série de um anticorpo com mutação P329G LALA, visando o antígeno de interesse, foi preparada em meio de crescimento usando uma placa de poço de 2 ml de profundidade (Axygen®). Para obter concentrações finais variando de 1 pg/ ml a 0,0001 pg/ ml em um volume final de 200 pl por poço, pipetou-se uma alíquota de 50 pl das diferentes diluições para os respectivos poços. A placa de 96 poços foi centrifugada por 2 minutos a 190 g e à temperatura ambiente. Selada com Parafilm®, a placa foi incubada a 37 °C e 5% de CO2 em uma atmosfera de umidade.

[0494] Após 20 horas de incubação, 0 conteúdo de cada poço foi misturado pipetando para cima e para baixo 10 vezes, usando uma pipeta multicanal. Transferiu-se 100 pl de suspensão de células para uma nova placa de 96 poços de fundo claro e plano branca (Greiner-bio-one) e adicionou-se 100 pl de ensaio ONE-GIo™ Luciferase (Promega). Após 15 minutos de incubação no escuro em um agitador rotativo a 300 rpm e à temperatura ambiente, a luminescência foi medida usando 0 leitor de placas Tecan® SparkWM, 1 s/ poço como tempo de detecção.

[0495] Após 0 co-cultivo de células alvo e efetoras na proporção de 5: 1 (Figura 11 A e C, pontos pretos) por 20 horas, os gráficos mostram uma ativação dependente de dose das células T Jurkat NFAT que expressam AntiP329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD, bem como das células T Jurkat NFAT que expressam Anti-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD

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CD3zSSD, quando TNC A2B10 com mutação P329G LALA foi usado como anticorpo. Se o anticorpo de controle DP47/vk3 IgG com mutação P329G LALA (Figura 11 A e C, pontos pretos) foi usado, nem a ativação de células T Jurkat NFAT que expressam Anti-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD nem de células T Jurkat NFAT que expressam Anti-P329G-ds-Fab-CD28ATDCD28CSD-CD3zSSD foram detectáveis. Cada ponto representa o valor médio das triplicatas técnicas. Todos os valores são representados como linha de base corrigida. O desvio padrão é indicado por barras de erro.

[0496] As Figuras 11 B e 11 D representam dados de células T Jurkat NFAT que expressam Anti-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSDCD3zSSD (Figura 11 D) ou células T Jurkat NFAT que expressam Anti-P329Gds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD (Figura 11 B), ambas co-cultivadas com células alvo e 1 pg/ ml de TNC A2B10 em comparação com diferentes condições de controle.

[0497] As células T Jurkat NFAT não mostram qualquer sinal de luminescência detectável após o co-cultivo com células alvo e 1 pg/ ml de IgG (Figura 11 B e Figura 11 D, triângulo branco). Enquanto a ativação dependente de CD3 das células Jurkat NFAT co-cultivadas com células alvo e 1 pg/ ml de IgG prova sua funcionalidade através de um sinal de luminescência detectável (Figura 11 B e Figura 11 D, quadrado branco).

[0498] Ativação dependente de CD3 de células T Jurkat NFAT que expressam Anti-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD (Figura 11 B, círculo branco) e ativação de células T Jurkat NFAT que expressam AntiP329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD (Figura 11 D, círculo branco) co-cultivadas com células alvo e 1 pg/ ml de IgG mostram os sinais de luminescência mais altos de todos, uma vez que a ativação mediada por CAR e a ativação mediada por CD3 são combinadas. O sinal de luminescência mediado por CD3 também é visível quando os CARs são incubados com

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210/293 células alvo e 1 pg/ ml de anticorpo DP47/vk3 (Figura 11 B e Figura 11 D, losango preto). Cada ponto representa o valor médio das triplicates técnicas. O desvio padrão é indicado por barras de erro.

Exemplo 7

[0499] É aqui descrito um ensaio de células T Jurkat NFAT repórter utilizando células tumorais CT26TNC cl 19 que expressam TNC aderentes como células alvo. Como células efetoras, um conjunto classificado de células T Jurkat NFAT que expressam Anti-P329G-Fab-CD28ATDCD28CSD-CD3zSSD (Figura 12 A) foi usado. TNCA2B10 com mutação P329G LALA foi usado como IgG. Ainda, a IgG DP47/vk3 que porta a mutação P329G LALA foi incluída como controle de isotipo.

[0500] Como controle positivo, poços de uma placa de 96 poços (Greiner-bio-one, CAT-655185) foram revestidos com 10 pg/ ml de anticorpo CD3 (da Biolegend®) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 1 hora a 37 °C. Os poços revestidos com CD3 foram lavados duas vezes com PBS, após a etapa final de lavagem, o PBS foi completamente removido.

[0501] As células alvo CT26TNC cl 19 aderentes foram lavadas uma vez com PBS e destacadas usando tripsina. As células destacadas foram ressuspensas em RPMI-1630 + FCS a 10% e Glutamax a 1% + 15 pg/ ml de Puromicina.

[0502] As células efetoras ou células Jurkat NFAT do tipo selvagem foram contadas e verificadas quanto à sua viabilidade usando Cedex HiRes. O número de células foi ajustado para 1x10⁶ células viáveis/ ml. Portanto, uma alíquota apropriada da suspensão de células foi transformada em péletes a 21 Og por 5 minutos à temperatura ambiente (RT) e ressuspensa em RPMI-160 fresco + FCS a 10% + Glutamax a 1% (meio de crescimento).

[0503] As células alvo que expressam o antígeno de interesse também foram contadas e verificadas quanto à sua viabilidade. O número de

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211/293 células foi ajustado, análogo como descrito para as células efetoras, para 1x10⁶células viáveis/ ml em RPMI-1640 + FCS a 10% + Glutamax a 1%.

[0504] As células alvo e células efetoras foram plaqueadas na proporção E: T de 5: 1 (110.000 células por poço no total) em triplicates em uma placa de cultura de suspensão de 96 poços (Greiner-bio one).

[0505] Como etapa seguinte, uma diluição em série de um anticorpo com mutação P329G LALA, visando o antígeno de interesse, foi preparada em meio de crescimento usando uma placa de poço de 2 ml de profundidade (Axygen®). Para obter concentrações finais variando de 1 pg/ ml a 0,0001 pg/ ml em um volume final de 200 pl por poço, pipetou-se uma alíquota de 50 pl das diferentes diluições para os respectivos poços. A placa de 96 poços foi centrifugada por 2 minutos a 190 g e à temperatura ambiente. Selada com Parafilm®, a placa foi incubada a 37 °C e 5% de CO2 em uma atmosfera de umidade.

[0506] Após 20 horas de incubação, 0 conteúdo de cada poço foi misturado pipetando para cima e para baixo 10 vezes, usando uma pipeta multicanal. Transferiu-se 100 pl de suspensão de células para uma nova placa de 96 poços de fundo claro e plano branca (Greiner-bio-one) e adicionou-se 100 pl de ensaio ONE-GIo™ Luciferase (Promega). Após 15 minutos de incubação no escuro em um agitador rotativo a 300 rpm e à temperatura ambiente, a luminescência foi medida usando 0 leitor de placas Tecan® SparkWM, 1 s/ poço como tempo de detecção.

[0507] Após 0 co-cultivo de células alvo e efetoras em uma proporção de 5: 1 (Figura 12 A, pontos pretos) por 20 horas, os gráficos mostram uma ativação dependente de dose das células T Jurkat NFAT que expressam Anti-P329G-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD começando com 0,01 pg/ ml de TNC A2B10 com mutação P329G LALA. Se 0 anticorpo de controle DP47/vk3 IgG com mutação P329G LALA (Figura 12 A e C, pontos

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212/293 cinzas) foi usado, nenhuma ativação de células T Jurkat NFAT que expressam Anti-P329G-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD foi detectável. Cada ponto representa o valor médio das triplicatas técnicas. Todos os valores são representados como linha de base corrigida. O desvio padrão é indicado por barras de erro.

[0508] A Figura 12 B representa dados de células T Jurkat NFAT T que expressam Anti-P329G-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD cocultivadas com células alvo e 1 pg/ ml de anticorpo TNC A2B10 em comparação com diferentes condições de controle.

[0509] Células T Jurkat NFAT que expressam anti-P329G-FabCD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD incubadas com células alvo, mas sem anticorpo (Figura 12 B, quadrado preto), bem como células Jurkat NFAT incubadas com células alvo e 1 pg/ ml de anticorpo TNC A2B10 (Figura 12 B, pontos brancos) não mostram sinal de luminescência detectável. Enquanto as células Jurkat NFAT co-cultivadas com células alvo e 1 pg/ ml de TNC A2B10 plaqueadas em poços revestidos com CD3, mostram um sinal claro de luminescência.

[0510] Ainda, as células T Jurkat NFAT que expressam Fab antiP329G-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD, incubadas com células alvo e 1 pg/ ml de TNC A2B10 ou 1 pg/ ml de anticorpo DP47/vk3, em poços revestidos com CD3, mostram um sinal de alta luminescência. Cada ponto representa o valor médio das triplicatas técnicas. O desvio padrão é indicado por barras de erro.

Exemplo 8

[0511]É descrito aqui um ensaio de células T Jurkat NFAT repórter usando células tumorais SUDHDL4 que expressam CD20 como células alvo e um conjunto de células Jurkat NFAT que expressam anti-P329Gds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD (Figura 13A) ou anti-P329G-ds-FabCD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD (Figura 13B) como células efetoras. A GA101

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IgG com P329G LALA, uma mutação D265A P329G, uma mutação LALA apenas ou nenhuma mutação, foi usada como IgG que, por um lado, reconhece o antígeno tumoral e, por outro lado, é reconhecida pelas células T Jurkat NFAT. As células efetoras foram contadas e verificadas quanto à sua viabilidade usando Cedex HiRes. O número de células foi ajustado para 1x10⁶células viáveis/ ml. Uma alíquota apropriada da suspensão de células foi transformada em péletes a 210 g por 5 minutos à temperatura ambiente (RT) e ressuspensa em RPMI-160 fresco + FCS a 10% + Glutamax a 1%. As células alvo que expressam o antígeno de interesse também foram contadas e verificadas quanto à sua viabilidade. O número de células foi ajustado, análogo como descrito para as células efetoras, para 1x10⁶ células viáveis/ ml em meio de crescimento. As células alvo e as células efetoras foram plaqueadas na proporção E: T de 5: 1 (110.000 células por poço no total) em triplicatas em uma placa de cultura de suspensão de 96 poços (Greiner-bio one). Como etapa seguinte, uma diluição em série dos diferentes anticorpos, visando o antígeno de interesse, foi preparada em meio de crescimento usando uma placa de poço de 2 ml de profundidade (Axygen®). Para obter concentrações finais variando de 1 pg/ ml a 0,0001 pg/ ml em um volume final de 200 pl por poço, pipetou-se uma alíquota de 50 pl das diferentes diluições para os respectivos poços. A placa de 96 poços foi centrifugada por 2 minutos a 190 g e à temperatura ambiente. Selada com Parafilm®, a placa foi incubada a 37 °C e 5% de CO2 em uma atmosfera de umidade. Após 20 horas de incubação, 0 conteúdo de cada poço foi misturado pipetando para cima e para baixo 10 vezes, usando uma pipeta multicanal. Transferiu-se 100 pl de suspensão de células para uma nova placa de 96 poços de fundo claro e plano branca (Greiner-bio-one) e adicionou-se 100 pl de ensaio ONE-GIo™ Luciferase (Promega). Após 15 minutos de incubação no escuro em um agitador rotativo a 300 rpm e à temperatura ambiente, a luminescência foi medida usando 0 leitor de placas

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Tecan® SparkWM, 1 s/ poço como tempo de detecção. Os gráficos mostram uma ativação dependente de dose das células alvo somente quando os anticorpos são usados que portam uma mutação P329G ou a mutação P329G e LALA, mas não a mutação LALA isoladamente. Além disso, nenhuma ativação das células efetoras é detectável se o anticorpo do tipo selvagem GA101 for usado.

Exemplo 9

[0512] É descrito aqui um ensaio de células T Jurkat NFAT repórter usando células tumorais SUDHDL4 que expressam CD20 como células alvo e um conjunto de células Jurkat NFAT que expressam anti-P329Gds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD (Figura 14A) ou anti-P329G-ds-FabCD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD (Figura 14B) como células efetoras. A GA101 IgG com P329G LALA, uma mutação P329G sozinha, uma mutação LALA apenas ou nenhuma mutação, foi usada como IgG que, por um lado, reconhece o antígeno tumoral e, por outro lado, é reconhecida pelas células T Jurkat NFAT. As células efetoras foram contadas e verificadas quanto à sua viabilidade usando Cedex HiRes. O número de células foi ajustado para 1x10⁶células viáveis/ ml. Uma alíquota apropriada da suspensão de células foi transformada em péletes a 210 g por 5 minutos à temperatura ambiente (RT) e ressuspensa em RPMI-160 fresco + FCS a 10% + Glutamax a 1%. As células alvo que expressam o antígeno de interesse também foram contadas e verificadas quanto à sua viabilidade. O número de células foi ajustado, análogo como descrito para as células efetoras, para 1x10⁶ células viáveis/ ml em meio de crescimento. As células alvo e as células efetoras foram plaqueadas na proporção E: T de 5: 1 (110.000 células por poço no total) em triplicatas em uma placa de 384 poços. Como etapa seguinte, uma diluição em série dos diferentes anticorpos, visando o antígeno de interesse, foi preparada em meio de crescimento usando uma placa de 96 poços. Para obter concentrações

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215/293 finais variando de 1 pg/ ml a 10 pg/ ml em um volume final de 30 pl por poço, pipetou-se uma alíquota de 10 pl das diferentes diluições nos respectivos poços. A placa de 384 poços foi centrifugada por 2 minutos a 190 g e à temperatura ambiente. Selada com Parafilm®, a placa foi incubada a 37 °C e 5% de CO2 em uma atmosfera de umidade. Após 20 horas de incubação, foram adicionados 6 pl do ensaio ONE-GIo™ Luciferase (Promega) e a leitura foi realizada imediatamente usando um leitor de placas Tecan® SparkWM, 1 s/ poço como tempo de detecção. Os gráficos mostram uma ativação dependente de dose das células alvo apenas quando os anticorpos são usados que portam uma mutação P329G ou a mutação P329G e LALA, mas não a mutação LALA isoladamente. Além disso, nenhuma ativação das células efetoras é detectável se 0 anticorpo do tipo selvagem GA101 for usado.

Sequências Exemplificativas

Tabela 2: Sequências de Aminoácidos Anti-P329G-ds-scFv:

Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
Anti-P329G CDR H1 Kabat	RYWMN	1
Anti-P329G CDR H2 Kabat	EITPDSSTINYTPSLKD	2
Anti-P329G CDR H3 Kabat	PYDYGAWFAS	3
Anti-P329G CDR L1 Kabat	RSSTGAVTTSNYAN	4
Anti-P329G CDR L2 Kabat	GTNKRAP	5
Anti-P329G CDR	ALWYSNHWV	6

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Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
L3 Kabat
pETR17096 de fusão AntiP329G-ds-scFv- CD28ATD- CD28CSD- CD3zSSD	EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFS RYWMNWVRQAPGKCLEWIGEITPDSSTINYT PSLKDKFIISRDNAKNTLYLQMIKVRSEDTALY YCVRPYDYGAWFASWGQGTLVTVSAGGGG SGGGGSGGGGSGGGGSQAVVTQESALTTS PGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPD HLFTGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLIGDKAAL TITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGCGTKL TVLGGGGSFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFII FWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHY QPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQG QNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMG GKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGM KGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHM QALPPR	7
Anti-P329G-ds VH	EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFS RYWMNWVRQAPGKCLEWIGEITPDSSTINYT PSLKDKFIISRDNAKNTLYLQMIKVRSEDTALY YCVRPYDYGAWFASWGQGTLVTVSA	8
Anti-P329G-ds VL	QAVVTQESALTTS PG ETVTLTCRSSTG AVTT SNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNKRAPGVP ARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALW YSNHWVFGCGTKLTVL	9
Anti-P329G-ds-	EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFS	10

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Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
scFv	RYWMNWVRQAPGKCLEWIGEITPDSSTINYT PSLKDKFIISRDNAKNTLYLQMIKVRSEDTALY YCVRPYDYGAWFASWGQGTLVTVSAGGGG SGGGGSGGGGSGGGGSQAVVTQESALTTS PGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPD HLFTGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLIGDKAAL TITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGCGTKL TVL
CD28ATD	FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV	11
CD28CSD	RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPY APPRDFAAYRS	12
CD3zSSD	RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRRE EYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLY NELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGL YQGLSTATKDTYDALHMQALPPR	13
CD28ATD- CD28CSD- CD3zSSD	FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRS RLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRD FAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNEL NLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKN PQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRG KGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR	14
eGFP	VSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSG EGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTT LTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYV QERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIEL	15

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Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
	KGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADK QKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPI GDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHM VLLEFVTAAGITLGMDELYK
Ligante (G4S)4	GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS	16
Ligante G4S	GGGGS	17
Ligante T2A	GEGRGSLLTCGDVEENPGP	18

Tabela 3: Sequências de DNA anti-P329G-ds-scFv:

Construto	Sequência de DNA	SEQ ID NO
pETR17096 de fusão Anti-P329G-dsscFv-CD28ATD- CD28CSD- CD3zSSD	ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTG GTAGCAACAGCTACCGGTGTGCATTCCGA GGTGAAGCTGCTGGAGAGCGGCGGCGGC CTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAAGCT GAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCGACTTCA GCAGGTACTGGATGAACTGGGTGAGGCAG GCCCCCGGCAAGTGTCTGGAGTGGATCGG CGAGATCACCCCCGACAGCAGCACCATCA ACTACACCCCCAGCCTGAAGGACAAGTTCA TCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACACC CTGTACCTGCAGATGATCAAGGTGAGGAG CGAGGACACCGCCCTGTACTACTGCGTGA GGCCCTACGACTACGGCGCCTGGTTCGCC AGCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGT GAGCGCCGGAGGGGGCGGAAGTGGTGGC	19

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Construto	Sequência de DNA	SEQ ID NO
	GGGGGAAGCGGCGGGGGTGGCAGCGGAG GGGGCGGATCTCAGGCCGTGGTGACCCA GGAGAGCGCCCTGACCACCAGCCCCGGC GAGACCGTGACCCTGACCTGCAGGAGCAG CACCGGCGCCGTGACCACCAGCAACTACG CCAACTGGGTGCAGGAGAAGCCCGACCAC CTGTTCACCGGCCTGATCGGCGGCACCAA CAAGAGGGCCCCCGGCGTGCCCGCCAGG TTCAGCGGCAGCCTGATCGGCGACAAGGC CGCCCTGACCATCACCGGCGCCCAGACCG AGGACGAGGCCATCTACTTCTGCGCCCTG TGGTACAGCAACCACTGGGTGTTCGGCTG TGGCACCAAGCTGACCGTGCTGGGAGGGG GCGGATCCTTCTGGGTGCTGGTGGTGGTG GGCGGCGTGCTGGCCTGCTACAGCCTGCT GGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTCTGGGT GAGGAGCAAGAGGAGCAGGCTGCTGCACA GCGACTACATGAACATGACCCCCAGGAGG CCCGGCCCCACCAGGAAGCACTACCAGCC CTACGCCCCCCCCAGGGACTTCGCCGCCT ACAGGAGCAGGGTGAAGTTCAGCAGGAGC GCCGACGCCCCCGCCTACCAGCAGGGCC AGAACCAGCTGTATAACGAGCTGAACCTG GGCAGGAGGGAGGAGTACGACGTGCTGG ACAAGAGGAGGGGCAGGGACCCCGAGAT GGGCGGCAAGCCCAGGAGGAAGAACCCC

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Construto	Sequência de DNA	SEQ ID NO
	CAGGAGGGCCTGTATAACGAGCTGCAGAA GGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGA TCGGCATGAAGGGCGAGAGGAGGAGGGG CAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCC TGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGAC GCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAG G
Anti-P329G-ds VH	GAGGTGAAGCTGCTGGAGAGCGGCGGCG GCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAA GCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCGACT TCAGCAGGTACTGGATGAACTGGGTGAGG CAGGCCCCCGGCAAGTGTCTGGAGTGGAT CGGCGAGATCACCCCCGACAGCAGCACCA TCAACTACACCCCCAGCCTGAAGGACAAGT TCATCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAAC ACCCTGTACCTGCAGATGATCAAGGTGAG GAGCGAGGACACCGCCCTGTACTACTGCG TGAGGCCCTACGACTACGGCGCCTGGTTC GCCAGCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGA CCGTGAGCGCC	20
Anti-P329G-ds VL	CAGGCCGTGGTGACCCAGGAGAGCGCCCT GACCACCAGCCCCGGCGAGACCGTGACCC TGACCTGCAGGAGCAGCACCGGCGCCGTG ACCACCAGCAACTACGCCAACTGGGTGCA GGAGAAGCCCGACCACCTGTTCACCGGCC TGATCGGCGGCACCAACAAGAGGGCCCCC	21

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Construto	Sequência de DNA	SEQ ID NO
	GGCGTGCCCGCCAGGTTCAGCGGCAGCCT GATCGGCGACAAGGCCGCCCTGACCATCA CCGGCGCCCAGACCGAGGACGAGGCCAT CTACTTCTGCGCCCTGTGGTACAGCAACCA CTGGGTGTTCGGCTGTGGCACCAAGCTGA CCGTGCTG
Anti-P329G-dsscFv	ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTG GTAGCAACAGCTACCGGTGTGCATTCCGA GGTGAAGCTGCTGGAGAGCGGCGGCGGC CTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAAGCT GAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCGACTTCA GCAGGTACTGGATGAACTGGGTGAGGCAG GCCCCCGGCAAGTGTCTGGAGTGGATCGG CGAGATCACCCCCGACAGCAGCACCATCA ACTACACCCCCAGCCTGAAGGACAAGTTCA TCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACACC CTGTACCTGCAGATGATCAAGGTGAGGAG CGAGGACACCGCCCTGTACTACTGCGTGA GGCCCTACGACTACGGCGCCTGGTTCGCC AGCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGT GAGCGCCGGAGGGGGCGGAAGTGGTGGC GGGGGAAGCGGCGGGGGTGGCAGCGGAG GGGGCGGATCTCAGGCCGTGGTGACCCA GGAGAGCGCCCTGACCACCAGCCCCGGC GAGACCGTGACCCTGACCTGCAGGAGCAG CACCGGCGCCGTGACCACCAGCAACTACG	22

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Construto	Sequência de DNA	SEQ ID NO
	CCAACTGGGTGCAGGAGAAGCCCGACCAC CTGTTCACCGGCCTGATCGGCGGCACCAA CAAGAGGGCCCCCGGCGTGCCCGCCAGG TTCAGCGGCAGCCTGATCGGCGACAAGGC CGCCCTGACCATCACCGGCGCCCAGACCG AGGACGAGGCCATCTACTTCTGCGCCCTG TGGTACAGCAACCACTGGGTGTTCGGCTG TGGCACCAAGCTGACCGTGC
IRES EV71, lado interno da entrada ribossômica	CCCGAAGTAACTTAGAAGCTGTAAATCAAC GATCAATAGCAGGTGTGGCACACCAGTCAT ACCTTGATCAAGCACTTCTGTTTCCCCGGA CTGAGTATCAATAGGCTGCTCGCGCGGCT GAAGGAGAAAACGTTCGTTACCCGACCAA CTACTTCGAGAAGCTTAGTACCACCATGAA CGAGGCAGGGTGTTTCGCTCAGCACAACC CCAGTGTAGATCAGGCTGATGAGTCACTG CAACCCCCATGGGCGACCATGGCAGTGGC TGCGTTGGCGGCCTGCCCATGGAGAAATC CATGGGACGCTCTAATTCTGACATGGTGTG AAGTGCCTATTGAGCTAACTGGTAGTCCTC CGGCCCCTGATTGCGGCTAATCCTAACTG CGGAGCACATGCTCACAAACCAGTGGGTG GTGTGTCGTAACGGGCAACTCTGCAGCGG AACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCCT TTTATTCCTATATTGGCTGCTTATGGTGACA ATCAAAAAGTTGTTACCATATAGCTATTGGA	23

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223/293

Construto	Sequência de DNA	SEQ ID NO
	TTGGCCATCCGGTGTGCAACAGGGCAACT GTTTACCTATTTATTGGTTTTGTACCATTAT CACTGAAGTCTGTGATCACTCTCAAATTCA TTTTGACCCTCAACACAATCAAAC
CD28ATD	TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGT CCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGT GGCCTTTATTA1 1 1 1CTGGGTG	24
CD28CSD	AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAG TGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCC CCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCC TATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTAT CGCTCC	25
CD3zSSD	AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGC CCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGC TCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAG AGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGT GGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGC CGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTG TACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCG GAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGG CGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGAT GGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCAC CAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGC AGGCCCTGCCCCCTCGC	26
CD28ATD-	TTCTGGGTGCTGGTGGTGGTGGGCGGCGT	27

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 440/852

224/293

Construto	Sequência de DNA	SEQ ID NO
CD28CSD- CD3zSSD	GCTGGCCTGCTACAGCCTGCTGGTGACCG TGGCCTTCATCATCTTCTGGGTGAGGAGCA AGAGGAGCAGGCTGCTGCACAGCGACTAC ATGAACATGACCCCCAGGAGGCCCGGCCC CACCAGGAAGCACTACCAGCCCTACGCCC CCCCCAGGGACTTCGCCGCCTACAGGAGC AGGGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGC CCCCGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGC TGTATAACGAGCTGAACCTGGGCAGGAGG GAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGGAG GGGCAGGGACCCCGAGATGGGCGGCAAG CCCAGGAGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCT GTATAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGG CCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAG GGCGAGAGGAGGAGGGGCAAGGGCCACG ACGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCC ACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACAT GCAGGCCCTGCCCCCCAGG
Elemento T2A	TCCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAAC ATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCC CTAGG	28
eGFP	GTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGG GGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACG GCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTG TCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCT ACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCA	29

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 441/852

225/293

Construto	Sequência de DNA	SEQ ID NO
	CCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCC ACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGT GCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACA TGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCA TGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACC ATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAG ACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGA CACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGG GCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATC CTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAA CAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAA GCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCA AGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGC GTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAA CACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGC TGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAG TCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAA GCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCG TGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATG GACGAGCTGTACAAGTGA
pETR17096 de fusão AntiP329G-ds-scFv- CD28ATD- CD28CSDCD3zSSD-eGFP	ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTG GTAGCAACAGCTACCGGTGTGCATTCCGA GGTGAAGCTGCTGGAGAGCGGCGGCGGC CTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAAGCT GAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCGACTTCA GCAGGTACTGGATGAACTGGGTGAGGCAG	30

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 442/852

226/293

Construto	Sequência de DNA	SEQ ID NO
	GCCCCCGGCAAGTGTCTGGAGTGGATCGG CGAGATCACCCCCGACAGCAGCACCATCA ACTACACCCCCAGCCTGAAGGACAAGTTCA TCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACACC CTGTACCTGCAGATGATCAAGGTGAGGAG CGAGGACACCGCCCTGTACTACTGCGTGA GGCCCTACGACTACGGCGCCTGGTTCGCC AGCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGT GAGCGCCGGAGGGGGCGGAAGTGGTGGC GGGGGAAGCGGCGGGGGTGGCAGCGGAG GGGGCGGATCTCAGGCCGTGGTGACCCA GGAGAGCGCCCTGACCACCAGCCCCGGC GAGACCGTGACCCTGACCTGCAGGAGCAG CACCGGCGCCGTGACCACCAGCAACTACG CCAACTGGGTGCAGGAGAAGCCCGACCAC CTGTTCACCGGCCTGATCGGCGGCACCAA CAAGAGGGCCCCCGGCGTGCCCGCCAGG TTCAGCGGCAGCCTGATCGGCGACAAGGC CGCCCTGACCATCACCGGCGCCCAGACCG AGGACGAGGCCATCTACTTCTGCGCCCTG TGGTACAGCAACCACTGGGTGTTCGGCTG TGGCACCAAGCTGACCGTGCTGGGAGGGG GCGGATCCTTCTGGGTGCTGGTGGTGGTG GGCGGCGTGCTGGCCTGCTACAGCCTGCT GGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTCTGGGT GAGGAGCAAGAGGAGCAGGCTGCTGCACA

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 443/852

227/293

Construto	Sequência de DNA	SEQ ID NO
	GCGACTACATGAACATGACCCCCAGGAGG CCCGGCCCCACCAGGAAGCACTACCAGCC CTACGCCCCCCCCAGGGACTTCGCCGCCT ACAGGAGCAGGGTGAAGTTCAGCAGGAGC GCCGACGCCCCCGCCTACCAGCAGGGCC AGAACCAGCTGTATAACGAGCTGAACCTG GGCAGGAGGGAGGAGTACGACGTGCTGG ACAAGAGGAGGGGCAGGGACCCCGAGAT GGGCGGCAAGCCCAGGAGGAAGAACCCC CAGGAGGGCCTGTATAACGAGCTGCAGAA GGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGA TCGGCATGAAGGGCGAGAGGAGGAGGGG CAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCC TGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGAC GCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAG GTCCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAA CATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGC CCTAGGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTT CACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGC TGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTC AGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATG CCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTC ATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCC CTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCT ACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCC GACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAG

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 444/852

228/293

Construto	Sequência de DNA	SEQ ID NO
	TCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGA GCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCA ACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTC GAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGA GCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACG GCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTAC AACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATG GCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGT GAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGA CGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACC AGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCC GTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAG CACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCA ACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTG GAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCT CGGCATGGACGAGCTGTACAAGTGA

Tabela 4: Sequências de Aminoácidos Anti-P329G-scFv:

Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
Anti-P329G CDR H1 Kabat	ver Tabela 2	1
Anti-P329G CDR H2 Kabat	ver Tabela 2	2
Anti-P329G CDR H3 Kabat	ver Tabela 2	3

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 445/852

229/293

Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
Anti-P329G CDR	ver Tabela 2	4
L1 Kabat
Anti-P329G CDR	ver Tabela 2	5
L2 Kabat
Anti-P329G CDR	ver Tabela 2	6
L3 Kabat
Fusão Anti-	EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFS	31
P329G-scFv-	RYWMNWVRQAPGKGLEWIGEITPDSSTINYT
CD28ATD-	PSLKDKFIISRDNAKNTLYLQMIKVRSEDTALY
CD28CSD-	YCVRPYDYGAWFASWGQGTLVTVSAGGGG
CD3zSSD	SGGGGSGGGGSGGGGSQAVVTQESALTTS PGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPD HLFTGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLIGDKAAL TITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKL TVLGGGGSFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFII FWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHY QPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQG QNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMG GKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGM KGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHM QALPPR
Anti-P329G VH	EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFS RYWMNWVRQAPGKGLEWIGEITPDSSTINYT PSLKDKFIISRDNAKNTLYLQMIKVRSEDTALY YCVRPYDYGAWFASWGQGTLVTVSA	32

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 446/852

230/293

Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
Anti-P329G VL	QAVVTQESALTTS PG ETVTLTCRSSTG AVTT SNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNKRAPGVP ARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALW YSNHWVFGGGTKLTVL	33
Anti-P329G-scFv	EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFS RYWMNWVRQAPGKGLEWIGEITPDSSTINYT PSLKDKFIISRDNAKNTLYLQMIKVRSEDTALY YCVRPYDYGAWFASWGQGTLVTVSAGGGG SGGGGSGGGGSGGGGSQAVVTQESALTTS PGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPD HLFTGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLIGDKAAL TITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKL TVL	34
CD28ATD	ver Tabela 2	11
CD28CSD	ver Tabela 2	12
CD3zSSD	ver Tabela 2	13
CD28ATD- CD28CDS- CD3zSSD	ver Tabela 2	14
eGFP	ver Tabela 2	15
Ligante (G4S)4	ver Tabela 2	16
Ligante G4S	ver Tabela 2	17
Ligante T2A	ver Tabela 2	18

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 447/852

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Tabela 5: Sequências de DNA anti-P329G-scFv:

Construto	Sequência de DNA	SEQ ID NO
Fusão AntiP329G-scFv- CD28ATD- CD28CSD- CD3zSSD	ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTG GTAGCAACAGCTACCGGTGTGCATTCCGA GGTGAAGCTGCTGGAGAGCGGCGGCGGC CTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAAGCT GAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCGACTTCA GCAGGTACTGGATGAACTGGGTGAGGCAG GCCCCCGGCAAGGGTCTGGAGTGGATCG GCGAGATCACCCCCGACAGCAGCACCATC AACTACACCCCCAGCCTGAAGGACAAGTTC ATCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACAC CCTGTACCTGCAGATGATCAAGGTGAGGA GCGAGGACACCGCCCTGTACTACTGCGTG AGGCCCTACGACTACGGCGCCTGGTTCGC CAGCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACC GTGAGCGCCGGAGGGGGCGGAAGTGGTG GCGGGGGAAGCGGCGGGGGTGGCAGCG GAGGGGGCGGATCTCAGGCCGTGGTGAC CCAGGAGAGCGCCCTGACCACCAGCCCCG GCGAGACCGTGACCCTGACCTGCAGGAGC AGCACCGGCGCCGTGACCACCAGCAACTA CGCCAACTGGGTGCAGGAGAAGCCCGACC ACCTGTTCACCGGCCTGATCGGCGGCACC AACAAGAGGGCCCCCGGCGTGCCCGCCA GGTTCAGCGGCAGCCTGATCGGCGACAAG GCCGCCCTGACCATCACCGGCGCCCAGAC	35

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 448/852

232/293

Construto	Sequência de DNA	SEQ ID NO
	CGAGGACGAGGCCATCTACTTCTGCGCCC TGTGGTACAGCAACCACTGGGTGTTCGGC GGTGGCACCAAGCTGACCGTGCTGGGAGG GGGCGGATCCTTCTGGGTGCTGGTGGTGG TGGGCGGCGTGCTGGCCTGCTACAGCCTG CTGGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTCTGG GTGAGGAGCAAGAGGAGCAGGCTGCTGCA CAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGGA GGCCCGGCCCCACCAGGAAGCACTACCAG CCCTACGCCCCCCCCAGGGACTTCGCCGC CTACAGGAGCAGGGTGAAGTTCAGCAGGA GCGCCGACGCCCCCGCCTACCAGCAGGG CCAGAACCAGCTGTATAACGAGCTGAACCT GGGCAGGAGGGAGGAGTACGACGTGCTG GACAAGAGGAGGGGCAGGGACCCCGAGA TGGGCGGCAAGCCCAGGAGGAAGAACCC CCAGGAGGGCCTGTATAACGAGCTGCAGA AGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAG ATCGGCATGAAGGGCGAGAGGAGGAGGG GCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGG CCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACG ACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCC AGG
Anti-P329G VH	GAGGTGAAGCTGCTGGAGAGCGGCGGCG GCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAA GCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCGACT	36

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 449/852

233/293

Construto	Sequência de DNA	SEQ ID NO
	TCAGCAGGTACTGGATGAACTGGGTGAGG CAGGCCCCCGGCAAGGGTCTGGAGTGGAT CGGCGAGATCACCCCCGACAGCAGCACCA TCAACTACACCCCCAGCCTGAAGGACAAGT TCATCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAAC ACCCTGTACCTGCAGATGATCAAGGTGAG GAGCGAGGACACCGCCCTGTACTACTGCG TGAGGCCCTACGACTACGGCGCCTGGTTC GCCAGCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGA CCGTGAGCGCC
Anti-P329G VL	CAGGCCGTGGTGACCCAGGAGAGCGCCCT GACCACCAGCCCCGGCGAGACCGTGACCC TGACCTGCAGGAGCAGCACCGGCGCCGTG ACCACCAGCAACTACGCCAACTGGGTGCA GGAGAAGCCCGACCACCTGTTCACCGGCC TGATCGGCGGCACCAACAAGAGGGCCCCC GGCGTGCCCGCCAGGTTCAGCGGCAGCCT GATCGGCGACAAGGCCGCCCTGACCATCA CCGGCGCCCAGACCGAGGACGAGGCCAT CTACTTCTGCGCCCTGTGGTACAGCAACCA CTGGGTGTTCGGCGGTGGCACCAAGCTGA CCGTGCTG	37
CD28ATD	ver Tabela 3	24
CD28CSD	ver Tabela 3	25
CD3zSSD	ver Tabela 3	26

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 450/852

234/293

Construto	Sequência de DNA	SEQ ID NO
CD28ATD- CD28CSD- CD3zSSD	ver Tabela 3	27
Elemento T2A	ver Tabela 3	28
eGFP	ver Tabela 3	29
Fusão AntiP329G-scFv- CD28ATD- CD28CSD- CD3zSSDeGFP	ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTG GTAGCAACAGCTACCGGTGTGCATTCCGA GGTGAAGCTGCTGGAGAGCGGCGGCGGC CTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAAGCT GAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCGACTTCA GCAGGTACTGGATGAACTGGGTGAGGCAG GCCCCCGGCAAGGGTCTGGAGTGGATCG GCGAGATCACCCCCGACAGCAGCACCATC AACTACACCCCCAGCCTGAAGGACAAGTTC ATCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACAC CCTGTACCTGCAGATGATCAAGGTGAGGA GCGAGGACACCGCCCTGTACTACTGCGTG AGGCCCTACGACTACGGCGCCTGGTTCGC CAGCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACC GTGAGCGCCGGAGGGGGCGGAAGTGGTG GCGGGGGAAGCGGCGGGGGTGGCAGCG GAGGGGGCGGATCTCAGGCCGTGGTGAC CCAGGAGAGCGCCCTGACCACCAGCCCCG GCGAGACCGTGACCCTGACCTGCAGGAGC AGCACCGGCGCCGTGACCACCAGCAACTA	38

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 451/852

235/293

Construto	Sequência de DNA	SEQ ID NO
	CGCCAACTGGGTGCAGGAGAAGCCCGACC ACCTGTTCACCGGCCTGATCGGCGGCACC AACAAGAGGGCCCCCGGCGTGCCCGCCA GGTTCAGCGGCAGCCTGATCGGCGACAAG GCCGCCCTGACCATCACCGGCGCCCAGAC CGAGGACGAGGCCATCTACTTCTGCGCCC TGTGGTACAGCAACCACTGGGTGTTCGGC GGTGGCACCAAGCTGACCGTGCTGGGAGG GGGCGGATCCTTCTGGGTGCTGGTGGTGG TGGGCGGCGTGCTGGCCTGCTACAGCCTG CTGGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTCTGG GTGAGGAGCAAGAGGAGCAGGCTGCTGCA CAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGGA GGCCCGGCCCCACCAGGAAGCACTACCAG CCCTACGCCCCCCCCAGGGACTTCGCCGC CTACAGGAGCAGGGTGAAGTTCAGCAGGA GCGCCGACGCCCCCGCCTACCAGCAGGG CCAGAACCAGCTGTATAACGAGCTGAACCT GGGCAGGAGGGAGGAGTACGACGTGCTG GACAAGAGGAGGGGCAGGGACCCCGAGA TGGGCGGCAAGCCCAGGAGGAAGAACCC CCAGGAGGGCCTGTATAACGAGCTGCAGA AGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAG ATCGGCATGAAGGGCGAGAGGAGGAGGG GCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGG CCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACG

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 452/852

236/293

Construto	Sequência de DNA	SEQ ID NO
	ACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCC AGGTCCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTTCT AACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCG GCCCTAGGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCT GTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCG AGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAG TTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCG ATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAG TTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGT GCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGA CCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTAC CCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTC AAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCA GGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACG GCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAG TTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCAT CGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGG ACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAG TACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATC ATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAA GGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGA GGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACT ACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGC CCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCT GAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACC CCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTG

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 453/852

237/293

Construto	Sequência de DNA	SEQ ID NO
	CTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCAC TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTGA

Tabela 6: Sequências de Aminoácidos Anti-P329G-ds- Fab

Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
Anti-P329G CDR H1 Kabat	ver Tabela 2	1
Anti-P329G CDR H2 Kabat	ver Tabela 2	2
Anti-P329G CDR H3 Kabat	ver Tabela 2	3
Anti-P329G CDR L1 Kabat	ver Tabela 2	4
Anti-P329G CDR L2 Kabat	ver Tabela 2	5
Anti-P329G CDR L3 Kabat	ver Tabela 2	6
pETR17100 de	EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFS	39
fusão Anti-	RYWMNWVRQAPGKCLEWIGEITPDSSTINYT
P329G-ds-Fab-	PSLKDKFIISRDNAKNTLYLQMIKVRSEDTALY
cadeia pesada-	YCVRPYDYGAWFASWGQGTLVTVSAASTKG
CD28ATD-	PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP
CD28CSD-	VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS
CD3zSSD	VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSCGGGGSFWVLVVVGGVLACYSLLVTV

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 454/852

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Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
	AFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTR KHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAY QQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDP EMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYS EIGMKGERRRGKGHDG LYQG LSTATKDTYD ALHMQALPPR
Cadeia pesada	EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFS	40
de Anti-P329G-	RYWMNWVRQAPGKCLEWIGEITPDSSTINYT
ds-Fab	PSLKDKFIISRDNAKNTLYLQMIKVRSEDTALY YCVRPYDYGAWFASWGQGTLVTVSAASTKG PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSC
Cadeia leve de	QAVVTQESALTTS PG ETVTLTCRSSTG AVTT	41
Anti-P329G-ds-	SNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNKRAPGVP
Fab	ARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALW YSNHWVFGCGTKLTVLRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE C
Anti-P329G-ds VL	ver Tabela 2	9
CL	RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF	42

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 455/852

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Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
	YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC
Anti-P329G-ds VH	ver Tabela 2	8
CH1	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSC	43
CD28ATD- CD28CSD- CD3zSSD	ver Tabela 2	14

Tabela 7: Sequências de DNA anti-P329G-ds-Fab:

Construto	Sequência de DNA	SEQ ID NO
pETR17100 de	ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTG	44
fusão Anti-	GTAGCAACAGCTACGGGTGTGCATTCCCA
P329G-ds-Fab-	GGCCGTGGTGACCCAGGAGAGCGCCCTG
cadeia pesada-	ACCACCAGCCCCGGCGAGACCGTGACCCT
CD28ATD-	GACCTGCAGGAGCAGCACCGGCGCCGTG
CD28CSD-	ACCACCAGCAACTACGCCAACTGGGTGCA
CD3zSSD	GGAGAAGCCCGACCACCTGTTCACCGGCC TGATCGGCGGCACCAACAAGAGGGCCCCC GGCGTGCCCGCCAGGTTCAGCGGCAGCCT GATCGGCGACAAGGCCGCCCTGACCATCA

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240/293

Construto	Sequência de DNA	SEQ ID NO
	CCGGCGCCCAGACCGAGGACGAGGCCAT CTACTTCTGCGCCCTGTGGTACAGCAACCA CTGGGTGTTCGGCTGTGGCACCAAGCTGA CCGTGCTGCGTACGGTGGCTGCACCATCT GTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAG TTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGC CTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCC AAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCT CCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCA CAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTAC AGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAA AGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGC CTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCT CGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGA GAGTGTTAGGAATTCCCCGAAGTAACTTAG AAGCTGTAAATCAACGATCAATAGCAGGTG TGGCACACCAGTCATACCTTGATCAAGCAC TTCTGTTTCCCCGGACTGAGTATCAATAGG CTGCTCGCGCGGCTGAAGGAGAAAACGTT CGTTACCCGACCAACTACTTCGAGAAGCTT AGTACCACCATGAACGAGGCAGGGTGTTT CGCTCAGCACAACCCCAGTGTAGATCAGG CTGATGAGTCACTGCAACCCCCATGGGCG ACCATGGCAGTGGCTGCGTTGGCGGCCTG CCCATGGAGAAATCCATGGGACGCTCTAAT TCTGACATGGTGTGAAGTGCCTATTGAGCT

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 457/852

241/293

Construto	Sequência de DNA	SEQ ID NO
	AACTGGTAGTCCTCCGGCCCCTGATTGCG GCTAATCCTAACTGCGGAGCACATGCTCAC AAACCAGTGGGTGGTGTGTCGTAACGGGC AACTCTGCAGCGGAACCGACTACTTTGGGT GTCCGTGTTTCCTTTTATTCCTATATTGGCT GCTTATGGTGACAATCAAAAAGTTGTTACC ATATAGCTATTGGATTGGCCATCCGGTGTG CAACAGGGCAACTGTTTACCTATTTATTGG TTTTGTACCATTATCACTGAAGTCTGTGATC ACTCTCAAATTCATTTTGACCCTCAACACAA TCAAACGCCACCATGGGATGGAGCTGTAT CATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACCGG TGTGCACTCCGAGGTGAAGCTGCTGGAGA GCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGG CAGCCTGAAGCTGAGCTGCGCCGCCAGCG GCTTCGACTTCAGCAGGTACTGGATGAACT GGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGTGTCT GGAGTGGATCGGCGAGATCACCCCCGACA GCAGCACCATCAACTACACCCCCAGCCTG AAGGACAAGTTCATCATCAGCAGGGACAAC GCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGATC AAGGTGAGGAGCGAGGACACCGCCCTGTA CTACTGCGTGAGGCCCTACGACTACGGCG CCTGGTTCGCCAGCTGGGGCCAGGGCACC CTGGTGACCGTGAGCGCCGCTAGCACCAA GGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCCA

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 458/852

242/293

Construto	Sequência de DNA	SEQ ID NO
	GCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGC CGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACT TCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAAC AGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACAC CTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGTTCTGGCC TGTATAGCCTGAGCAGCGTGGTCACCGTG CCTTCTAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTA CATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCA ACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCC AAGAGCTGCGGAGGGGGCGGATCCTTCTG GGTGCTGGTGGTGGTGGGCGGCGTGCTG GCCTGCTACAGCCTGCTGGTGACCGTGGC CTTCATCATCTTCTGGGTGAGGAGCAAGAG GAGCAGGCTGCTGCACAGCGACTACATGA ACATGACCCCCAGGAGGCCCGGCCCCACC AGGAAGCACTACCAGCCCTACGCCCCCCC CAGGGACTTCGCCGCCTACAGGAGCAGGG TGAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGCCCCC GCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTA TAACGAGCTGAACCTGGGCAGGAGGGAGG AGTACGACGTGCTGGACAAGAGGAGGGGC AGGGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCA GGAGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTAT AACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGA GGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCG AGAGGAGGAGGGGCAAGGGCCACGACGG

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 459/852

243/293

Construto	Sequência de DNA	SEQ ID NO
	CCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCA AGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAG GCCCTGCCCCCCAGG
Anti-P329G-ds	ver Tabela 3	21
VL
CL	CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC TTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCT GGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAAT AACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAG TGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGG TAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGG ACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGC AGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTA CGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAG TCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTC ACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTA G	45
Anti-P329G-ds	ver Tabela 3	20
VH
CH1	GCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCC CCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCG GCGGCACAGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTC AAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGT GTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCG GCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAG	46

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244/293

Construto	Sequência de DNA	SEQ ID NO
	AGTTCTGGCCTGTATAGCCTGAGCAGCGT GGTCACCGTGCCTTCTAGCAGCCTGGGCA CCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACA AGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAG GTGGAGCCCAAGAGCTGC
CD28ATD- CD28CSD- CD3zSSD	ver Tabela 3	27
pETR17100 de	ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTG	47
fusão Anti-	GTAGCAACAGCTACGGGTGTGCATTCCCA
P329G-ds-Fab-	GGCCGTGGTGACCCAGGAGAGCGCCCTG
cadeia pesada-	ACCACCAGCCCCGGCGAGACCGTGACCCT
CD28ATD-	GACCTGCAGGAGCAGCACCGGCGCCGTG
CD28CSD-	ACCACCAGCAACTACGCCAACTGGGTGCA
CD3ZSSD-	GGAGAAGCCCGACCACCTGTTCACCGGCC
eGFP	TGATCGGCGGCACCAACAAGAGGGCCCCC GGCGTGCCCGCCAGGTTCAGCGGCAGCCT GATCGGCGACAAGGCCGCCCTGACCATCA CCGGCGCCCAGACCGAGGACGAGGCCAT CTACTTCTGCGCCCTGTGGTACAGCAACCA CTGGGTGTTCGGCTGTGGCACCAAGCTGA CCGTGCTGCGTACGGTGGCTGCACCATCT GTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAG TTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGC CTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCC AAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCT

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 461/852

245/293

Construto	Sequência de DNA	SEQ ID NO
	CCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCA CAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTAC AGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAA AGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGC CTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCT CGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGA GAGTGTTAGGAATTCCCCGAAGTAACTTAG AAGCTGTAAATCAACGATCAATAGCAGGTG TGGCACACCAGTCATACCTTGATCAAGCAC TTCTGTTTCCCCGGACTGAGTATCAATAGG CTGCTCGCGCGGCTGAAGGAGAAAACGTT CGTTACCCGACCAACTACTTCGAGAAGCTT AGTACCACCATGAACGAGGCAGGGTGTTT CGCTCAGCACAACCCCAGTGTAGATCAGG CTGATGAGTCACTGCAACCCCCATGGGCG ACCATGGCAGTGGCTGCGTTGGCGGCCTG CCCATGGAGAAATCCATGGGACGCTCTAAT TCTGACATGGTGTGAAGTGCCTATTGAGCT AACTGGTAGTCCTCCGGCCCCTGATTGCG GCTAATCCTAACTGCGGAGCACATGCTCAC AAACCAGTGGGTGGTGTGTCGTAACGGGC AACTCTGCAGCGGAACCGACTACTTTGGGT GTCCGTGTTTCC1 1 1 1ATTCCTATATTGGCT GCTTATGGTGACAATCAAAAAGTTGTTACC ATATAGCTATTGGATTGGCCATCCGGTGTG CAACAGGGCAACTGTTTACCTATTTATTGG

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 462/852

246/293

Construto	Sequência de DNA	SEQ ID NO
	TTTTGTACCATTATCACTGAAGTCTGTGATC ACTCTCAAATTCATTTTGACCCTCAACACAA TCAAACGCCACCATGGGATGGAGCTGTAT CATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACCGG TGTGCACTCCGAGGTGAAGCTGCTGGAGA GCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGG CAGCCTGAAGCTGAGCTGCGCCGCCAGCG GCTTCGACTTCAGCAGGTACTGGATGAACT GGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGTGTCT GGAGTGGATCGGCGAGATCACCCCCGACA GCAGCACCATCAACTACACCCCCAGCCTG AAGGACAAGTTCATCATCAGCAGGGACAAC GCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGATC AAGGTGAGGAGCGAGGACACCGCCCTGTA CTACTGCGTGAGGCCCTACGACTACGGCG CCTGGTTCGCCAGCTGGGGCCAGGGCACC CTGGTGACCGTGAGCGCCGCTAGCACCAA GGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCCA GCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGC CGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACT TCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAAC AGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACAC CTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGTTCTGGCC TGTATAGCCTGAGCAGCGTGGTCACCGTG CCTTCTAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTA CATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCA

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 463/852

247/293

Construto	Sequência de DNA	SEQ ID NO
	ACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCC AAGAGCTGCGGAGGGGGCGGATCCTTCTG GGTGCTGGTGGTGGTGGGCGGCGTGCTG GCCTGCTACAGCCTGCTGGTGACCGTGGC CTTCATCATCTTCTGGGTGAGGAGCAAGAG GAGCAGGCTGCTGCACAGCGACTACATGA ACATGACCCCCAGGAGGCCCGGCCCCACC AGGAAGCACTACCAGCCCTACGCCCCCCC CAGGGACTTCGCCGCCTACAGGAGCAGGG TGAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGCCCCC GCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTA TAACGAGCTGAACCTGGGCAGGAGGGAGG AGTACGACGTGCTGGACAAGAGGAGGGGC AGGGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCA GGAGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTAT AACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGA GGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCG AGAGGAGGAGGGGCAAGGGCCACGACGG CCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCA AGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAG GCCCTGCCCCCCAGGTCCGGAGAGGGCA GAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTG GAGGAGAATCCCGGCCCTAGGGTGAGCAA GGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTG CCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGT AAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCG

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 464/852

248/293

Construto	Sequência de DNA	SEQ ID NO
	AGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAA GCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCG GCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTC GTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTG CTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGC AGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCC GAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTT CTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCC GCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACC CTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCAT CGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGG GGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGC CACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAG AAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATC CGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCA GCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCC CCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCC GACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGC CCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCG ATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACC GCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGA GCTGTACAAGTGA

Tabela 8: Sequências de aminoácidos Anti-P329G-Fab:

Construto

Sequência de aminoácidos

SEQ ID NO

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249/293

Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
Anti-P329G CDR H1 Kabat	ver Tabela 2	1
Anti-P329G CDR H2 Kabat	ver Tabela 2	2
Anti-P329G CDR H3 Kabat	ver Tabela 2	3
Anti-P329G CDR L1 Kabat	ver Tabela 2	4
Anti-P329G CDR L2 Kabat	ver Tabela 2	5
Anti-P329G CDR L3 Kabat	ver Tabela 2	6
pETR17594 de	EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFS	48
fusão Anti-	RYWMNWVRQAPGKGLEWIGEITPDSSTINYT
P329G-Fab-	PSLKDKFIISRDNAKNTLYLQMIKVRSEDTALY
cadeia pesada-	YCVRPYDYGAWFASWGQGTLVTVSAASTKG
CD28ATD-	PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP
CD28CSD-	VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS
CD3zSSD	VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSCGGGGSFWVLVVVGGVLACYSLLVTV AFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTR KHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAY QQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDP EMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYS EIGMKGERRRGKGHDG LYQG LSTATKDTYD

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 466/852

250/293

Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
	ALHMQALPPR
Cadeia pesada de Anti-P329GFab	EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFS RYWMNWVRQAPGKGLEWIGEITPDSSTINYT PSLKDKFIISRDNAKNTLYLQMIKVRSEDTALY YCVRPYDYGAWFASWGQGTLVTVSAASTKG PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSC	49
Cadeia leve de Anti-P329G-Fab	QAVVTQESALTTS PG ETVTLTCRSSTG AVTT SNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNKRAPGVP ARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALW YSNHWVFGGGTKLTVLRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE C	50
Anti-P329G VL	ver Tabela 4	33
CL	ver Tabela 6	42
Anti-P329G VH	ver Tabela 4	32
CH1	ver Tabela 6	43
CD28ATD- CD28CSD- CD3zSSD	ver Tabela 2	14

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 467/852

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Tabela 9: Sequências de DNA anti-P329G-Fab:

Construto	Sequência de DNA	SEQ ID NO
pETR17594 de fusão AntiP329G-Fabcadeia pesadaCD28ATDCD28CSDCD3zSSD	ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTG GTAGCAACAGCTACGGGTGTGCATTCCCA GGCCGTGGTGACCCAGGAGAGCGCCCTG ACCACCAGCCCCGGCGAGACCGTGACCCT GACCTGCAGGAGCAGCACCGGCGCCGTG ACCACCAGCAACTACGCCAACTGGGTGCA GGAGAAGCCCGACCACCTGTTCACCGGCC TGATCGGCGGCACCAACAAGAGGGCCCCC GGCGTGCCCGCCAGGTTCAGCGGCAGCCT GATCGGCGACAAGGCCGCCCTGACCATCA CCGGCGCCCAGACCGAGGACGAGGCCAT CTACTTCTGCGCCCTGTGGTACAGCAACCA CTGGGTGTTCGGCGGTGGCACCAAGCTGA CCGTGCTGCGTACGGTGGCTGCACCATCT GTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAG TTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGC CTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCC AAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCT CCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCA CAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTAC AGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAA AGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGC CTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCT CGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGA GAGTGTTAGGAATTCCCCGAAGTAACTTAG	51

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 468/852

252/293

Construto	Sequência de DNA	SEQ ID NO
	AAGCTGTAAATCAACGATCAATAGCAGGTG TGGCACACCAGTCATACCTTGATCAAGCAC TTCTGTTTCCCCGGACTGAGTATCAATAGG CTGCTCGCGCGGCTGAAGGAGAAAACGTT CGTTACCCGACCAACTACTTCGAGAAGCTT AGTACCACCATGAACGAGGCAGGGTGTTT CGCTCAGCACAACCCCAGTGTAGATCAGG CTGATGAGTCACTGCAACCCCCATGGGCG ACCATGGCAGTGGCTGCGTTGGCGGCCTG CCCATGGAGAAATCCATGGGACGCTCTAAT TCTGACATGGTGTGAAGTGCCTATTGAGCT AACTGGTAGTCCTCCGGCCCCTGATTGCG GCTAATCCTAACTGCGGAGCACATGCTCAC AAACCAGTGGGTGGTGTGTCGTAACGGGC AACTCTGCAGCGGAACCGACTACTTTGGGT GTCCGTGTTTCC1 1 1 1ATTCCTATATTGGCT GCTTATGGTGACAATCAAAAAGTTGTTACC ATATAGCTATTGGATTGGCCATCCGGTGTG CAACAGGGCAACTGTTTACCTATTTATTGG TTTTGTACCATTATCACTGAAGTCTGTGATC ACTCTCAAATTCATTTTGACCCTCAACACAA TCAAACGCCACCATGGGATGGAGCTGTAT CATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACCGG TGTGCACTCCGAGGTGAAGCTGCTGGAGA GCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGG CAGCCTGAAGCTGAGCTGCGCCGCCAGCG

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Construto	Sequência de DNA	SEQ ID NO
	GCTTCGACTTCAGCAGGTACTGGATGAACT GGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGTCT GGAGTGGATCGGCGAGATCACCCCCGACA GCAGCACCATCAACTACACCCCCAGCCTG AAGGACAAGTTCATCATCAGCAGGGACAAC GCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGATC AAGGTGAGGAGCGAGGACACCGCCCTGTA CTACTGCGTGAGGCCCTACGACTACGGCG CCTGGTTCGCCAGCTGGGGCCAGGGCACC CTGGTGACCGTGAGCGCCGCTAGCACCAA GGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCCA GCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGC CGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACT TCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAAC AGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACAC CTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGTTCTGGCC TGTATAGCCTGAGCAGCGTGGTCACCGTG CCTTCTAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTA CATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCA ACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCC AAGAGCTGCGGAGGGGGCGGATCCTTCTG GGTGCTGGTGGTGGTGGGCGGCGTGCTG GCCTGCTACAGCCTGCTGGTGACCGTGGC CTTCATCATCTTCTGGGTGAGGAGCAAGAG GAGCAGGCTGCTGCACAGCGACTACATGA ACATGACCCCCAGGAGGCCCGGCCCCACC

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 470/852

254/293

Construto	Sequência de DNA	SEQ ID NO
	AGGAAGCACTACCAGCCCTACGCCCCCCC CAGGGACTTCGCCGCCTACAGGAGCAGGG TGAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGCCCCC GCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTA TAACGAGCTGAACCTGGGCAGGAGGGAGG AGTACGACGTGCTGGACAAGAGGAGGGGC AGGGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCA GGAGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTAT AACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGA GGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCG AGAGGAGGAGGGGCAAGGGCCACGACGG CCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCA AGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAG GCCCTGCCCCCCAGG
Anti-P329G VL	ver Tabela 5	37
CL	ver Tabela 7	45
Anti-P329G VH	ver Tabela 5	36
CH1	ver Tabela 7	46
CD28ATD- CD28CSD- CD3zSSD	ver Tabela 3	27
pETR17594 de	ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTG	52
fusão Anti-	GTAGCAACAGCTACGGGTGTGCATTCCCA
P329G-Fab-	GGCCGTGGTGACCCAGGAGAGCGCCCTG
cadeia pesada-	ACCACCAGCCCCGGCGAGACCGTGACCCT

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Construto	Sequência de DNA	SEQ ID NO
CD28ATD- CD28CSD- CD3zSSD-eGFP	GACCTGCAGGAGCAGCACCGGCGCCGTG ACCACCAGCAACTACGCCAACTGGGTGCA GGAGAAGCCCGACCACCTGTTCACCGGCC TGATCGGCGGCACCAACAAGAGGGCCCCC GGCGTGCCCGCCAGGTTCAGCGGCAGCCT GATCGGCGACAAGGCCGCCCTGACCATCA CCGGCGCCCAGACCGAGGACGAGGCCAT CTACTTCTGCGCCCTGTGGTACAGCAACCA CTGGGTGTTCGGCGGTGGCACCAAGCTGA CCGTGCTGCGTACGGTGGCTGCACCATCT GTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAG TTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGC CTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCC AAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCT CCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCA CAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTAC AGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAA AGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGC CTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCT CGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGA GAGTGTTAGGAATTCCCCGAAGTAACTTAG AAGCTGTAAATCAACGATCAATAGCAGGTG TGGCACACCAGTCATACCTTGATCAAGCAC TTCTGTTTCCCCGGACTGAGTATCAATAGG CTGCTCGCGCGGCTGAAGGAGAAAACGTT CGTTACCCGACCAACTACTTCGAGAAGCTT

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256/293

Construto	Sequência de DNA	SEQ ID NO
	AGTACCACCATGAACGAGGCAGGGTGTTT CGCTCAGCACAACCCCAGTGTAGATCAGG CTGATGAGTCACTGCAACCCCCATGGGCG ACCATGGCAGTGGCTGCGTTGGCGGCCTG CCCATGGAGAAATCCATGGGACGCTCTAAT TCTGACATGGTGTGAAGTGCCTATTGAGCT AACTGGTAGTCCTCCGGCCCCTGATTGCG GCTAATCCTAACTGCGGAGCACATGCTCAC AAACCAGTGGGTGGTGTGTCGTAACGGGC AACTCTGCAGCGGAACCGACTACTTTGGGT GTCCGTGTTTCC1 1 1 1ATTCCTATATTGGCT GCTTATGGTGACAATCAAAAAGTTGTTACC ATATAGCTATTGGATTGGCCATCCGGTGTG CAACAGGGCAACTGTTTACCTATTTATTGG TTTTGTACCATTATCACTGAAGTCTGTGATC ACTCTCAAATTCATTTTGACCCTCAACACAA TCAAACGCCACCATGGGATGGAGCTGTAT CATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACCGG TGTGCACTCCGAGGTGAAGCTGCTGGAGA GCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGG CAGCCTGAAGCTGAGCTGCGCCGCCAGCG GCTTCGACTTCAGCAGGTACTGGATGAACT GGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGTCT GGAGTGGATCGGCGAGATCACCCCCGACA GCAGCACCATCAACTACACCCCCAGCCTG AAGGACAAGTTCATCATCAGCAGGGACAAC

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Construto	Sequência de DNA	SEQ ID NO
	GCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGATC AAGGTGAGGAGCGAGGACACCGCCCTGTA CTACTGCGTGAGGCCCTACGACTACGGCG CCTGGTTCGCCAGCTGGGGCCAGGGCACC CTGGTGACCGTGAGCGCCGCTAGCACCAA GGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCCA GCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGC CGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACT TCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAAC AGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACAC CTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGTTCTGGCC TGTATAGCCTGAGCAGCGTGGTCACCGTG CCTTCTAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTA CATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCA ACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCC AAGAGCTGCGGAGGGGGCGGATCCTTCTG GGTGCTGGTGGTGGTGGGCGGCGTGCTG GCCTGCTACAGCCTGCTGGTGACCGTGGC CTTCATCATCTTCTGGGTGAGGAGCAAGAG GAGCAGGCTGCTGCACAGCGACTACATGA ACATGACCCCCAGGAGGCCCGGCCCCACC AGGAAGCACTACCAGCCCTACGCCCCCCC CAGGGACTTCGCCGCCTACAGGAGCAGGG TGAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGCCCCC GCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTA TAACGAGCTGAACCTGGGCAGGAGGGAGG

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Construto	Sequência de DNA	SEQ ID NO
	AGTACGACGTGCTGGACAAGAGGAGGGGC AGGGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCA GGAGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTAT AACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGA GGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCG AGAGGAGGAGGGGCAAGGGCCACGACGG CCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCA AGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAG GCCCTGCCCCCCAGGTCCGGAGAGGGCA GAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTG GAGGAGAATCCCGGCCCTAGGGTGAGCAA GGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTG CCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGT AAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCG AGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAA GCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCG GCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTC GTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTG CTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGC AGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCC GAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTT CTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCC GCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACC CTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCAT CGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGG GGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGC

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Construto	Sequência de DNA	SEQ ID NO
	CACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAG AAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATC CGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCA GCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCC CCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCC GACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGC CCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCG ATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACC GCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGA GCTGTACAAGTGA

Tabela 10: Sequências de aminoácidos anti-AAA-scFv

Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
Anti-AAA CDR H1 Kabat	SYGMS	53
Anti-AAA CDR H2 Kabat	SSGGSY	54
Anti-AAA CDR H3 Kabat	LGMITTGYAMDY	55
Anti-AAA CDR L1 Kabat	RSSQTIVHSTGHTYLE	56
Anti-AAA CDR L2 Kabat	KVSNRFS	57
Anti-AAA CDR L3 Kabat	FQGSHVPYT	58

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Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
Fusão Anti-AAAscFv-CD28ATDCD28CSDCD3zSSD	MNFGLSLVFLALILKGVQCEVQLVESGGDLV KPGGSLKLSCAASGFTFSSYGMSWVRQTPD KRLEWVATISSGGSYIYYPDSVKGRFTISRDN AKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARLGMITTG YAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGG GGSGGGGSDVLMTQTPLSLPVSLGDQASIS CRSSQTIVHSTGHTYLEWFLQKPGQSPKLLIY KVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEA EDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKGGG GSFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSK RSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPP RDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYN ELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRK NPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRR GKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR	59
Anti-AAA-scFv	MNFGLSLVFLALILKGVQCEVQLVESGGDLV KPGGSLKLSCAASGFTFSSYGMSWVRQTPD KRLEWVATISSGGSYIYYPDSVKGRFTISRDN AKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARLGMITTG YAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGG GGSGGGGSDVLMTQTPLSLPVSLGDQASIS CRSSQTIVHSTGHTYLEWFLQKPGQSPKLLIY KVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEA EDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIK	60
Anti-AAA VH	MNFGLSLVFLALILKGVQCEVQLVESGGDLV KPGGSLKLSCAASGFTFSSYGMSWVRQTPD	61

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Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
	KRLEWVATISSGGSYIYYPDSVKGRFTISRDN AKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARLGMITTG YAMDYWGQGTSVTVSS
Anti-AAA VL	DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQTIVHS TGHTYLEWFLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGV PDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCF QGSHVPYTFGGGTKLEIK	62

Tabela 11: Sequências de Aminoácidos anti-AAA-Fab

Construto	Sequência de proteínas	SEQ ID NO
Anti-AAA CDR H1 Kabat	ver Tabela 10	53
Anti-AAA CDR H2 Kabat	ver Tabela 10	54
Anti-AAA CDR H3 Kabat	ver Tabela 10	55
Anti-AAA CDR L1 Kabat	ver Tabela 10	56
Anti-AAA CDR L2 Kabat	ver Tabela 10	57
Anti-AAA CDR L3 Kabat	ver Tabela 10	58
Fusão Anti-AAA-	MNFGLSLVFLALILKGVQCEVQLVESGGDLV	63
Fab-cadeia	KPGGSLKLSCAASGFTFSSYGMSWVRQTPD
pesada-	KRLEWVATISSGGSYIYYPDSVKGRFTISRDN

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 478/852

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Construto	Sequência de proteínas	SEQ ID NO
CD28ATD- CD28CSD- CD3zSSD	AKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARLGMITTG YAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPS SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGGG GSFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSK RSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPP RDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYN ELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRK NPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRR GKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
Cadeia pesada de Anti-AAA-Fab	MNFGLSLVFLALILKGVQCEVQLVESGGDLV KPGGSLKLSCAASGFTFSSYGMSWVRQTPD KRLEWVATISSGGSYIYYPDSVKGRFTISRDN AKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARLGMITTG YAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPS SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC	64
Cadeia leve de Anti-AAA-Fab	DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQTIVHS TGHTYLEWFLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGV PDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCF QGSHVPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPS DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG	65

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 479/852

263/293

Construto	Sequência de proteínas	SEQ ID NO
	EC
Anti-AAA VL	ver Tabela 10	62
CL	ver Tabela 6	42
Anti-AAA VH	ver Tabela 10	61
CH1	ver Tabela 6	43

Tabela 12

Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
CD27 humano	ATGGCGCGCCCGCATCCGTGGTGGCTGTG CGTGCTGGGCACCCTGGTGGGCCTGAGC GCGACCCCGGCGCCGAAAAGCTGCCCGG AACGCCATTATTGGGCGCAGGGCAAACTG TGCTGCCAGATGTGCGAACCGGGCACCTT TCTGGTGAAAGATTGCGATCAGCATCGCAA AGCGGCGCAGTGCGATCCGTGCATTCCGG GCGTGAGCTTTAGCCCGGATCATCATACCC GCCCGCATTGCGAAAGCTGCCGCCATTGC AACAGCGGCCTGCTGGTGCGCAACTGCAC CATTACCGCGAACGCGGAATGCGCGTGCC GCAACGGCTGGCAGTGCCGCGATAAAGAA TGCACCGAATGCGATCCGCTGCCGAACCC GAGCCTGACCGCGCGCAGCAGCCAGGCG CTGAGCCCGCATCCGCAGCCGACCCATCT GCCGTATGTGAGCGAAATGCTGGAAGCGC GCACCGCGGGCCATATGCAGACCCTGGCG	66

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 480/852

264/293

Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
	GA 1 1 1 1CGCCAGCTGCCGGCGCGCACCCT GAGCACCCATTGGCCGCCGCAGCGCAGCC TGTGCAGCAGCGA1 1 1 1ATTCGCATTCTGG TGAT1 1 1 1AGCGGCATGTTTCTGGTGTTTAC CCTGGCGGGCGCGCTGTTTCTGCATCAGC GCCGCAAATATCGCAGCAACAAAGGCGAA AGCCCGGTGGAACCGGCGGAACCGTGCC ATTATAGCTGCCCGCGCGAAGAAGAAGGC AGCACCATTCCGATTCAGGAAGATTATCGC AAACCGGAACCGGCGTGCAGCCCG
CD27 humano	MARPHPWWLCVLGTLVGLSATPAPKSCPER HYWAQGKLCCQMCEPGTFLVKDCDQHRKA AQCDPCIPGVSFSPDHHTRPHCESCRHCNS GLLVRNCTITANAECACRNGWQCRDKECTE CDPLPNPSLTARSSQALSPHPQPTHLPYVSE MLEARTAGHMQTLADFRQLPARTLSTHWPP QRSLCSSDFIRILVIFSGMFLVFTLAGALFLHQ RRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGS TIPIQEDYRKPEPACSP	67
CD27 murino	ATGGCGTGGCCGCCGCCGTATTGGCTGTG CATGCTGGGCACCCTGGTGGGCCTGAGCG CGACCCTGGCGCCGAACAGCTGCCCGGAT AAACATTATTGGACCGGCGGCGGCCTGTG CTGCCGCATGTGCGAACCGGGCACCTTTT TTGTGAAAGATTGCGAACAGGATCGCACC GCGGCGCAGTGCGATCCGTGCATTCCGGG	68

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 481/852

265/293

Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
	CACCAGCTTTAGCCCGGATTATCATACCCG CCCGCATTGCGAAAGCTGCCGCCATTGCA ACAGCGGCTTTCTGATTCGCAACTGCACCG TGACCGCGAACGCGGAATGCAGCTGCAGC AAAAACTGGCAGTGCCGCGATCAGGAATG CACCGAATGCGATCCGCCGCTGAACCCGG CGCTGACCCGCCAGCCGAGCGAAACCCCG AGCCCGCAGCCGCCGCCGACCCATCTGCC GCATGGCACCGAAAAACCGAGCTGGCCGC TGCATCGCCAGCTGCCGAACAGCACCGTG TATAGCCAGCGCAGCAGCCATCGCCCGCT GTGCAGCAGCGATTGCATTCGCAT1 1 1 1GT GACCTTTAGCAGCATGTTTCTGATTTTTGTG CTGGGCGCGATTCTGTTTTTTCATCAGCGC CGCAACCATGGCCCGAACGAAGATCGCCA GGCGGTGCCGGAAGAACCGTGCCCGTATA GCTGCCCGCGCGAAGAAGAAGGCAGCGC GATTCCGATTCAGGAAGATTATCGCAAACC GGAACCGGCGTTTTATCCG
CD27 murino	MAWPPPYWLCMLGTLVGLSATLAPNSCPDK HYWTGGGLCCRMCEPGTFFVKDCEQDRTA AQCDPCIPGTSFSPDYHTRPHCESCRHCNS GFLIRNCTVTANAECSCSKNWQCRDQECTE CDPPLNPALTRQPSETPSPQPPPTHLPHGTE KPSWPLHRQLPNSTVYSQRSSHRPLCSSDCI RIFVTFSSMFLIFVLGAILFFHQRRNHGPNED	69

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 482/852

266/293

Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
	RQAVPEEPCPYSCPREEEGSAIPIQEDYRKP EPAFYP
CD28 humano	ATGCTGCGCCTGCTGCTGGCGCTGAACCT GTTTCCGAGCATTCAGGTGACCGGCAACA AAATTCTGGTGAAACAGAGCCCGATGCTG GTGGCGTATGATAACGCGGTGAACCTGAG CTGCAAATATAGCTATAACCTGTTTAGCCG CGAATTTCGCGCGAGCCTGCATAAAGGCC TGGATAGCGCGGTGGAAGTGTGCGTGGTG TATGGCAACTATAGCCAGCAGCTGCAGGT GTATAGCAAAACCGGCTTTAACTGCGATGG CAAACTGGGCAACGAAAGCGTGACCTTTTA TCTGCAGAACCTGTATGTGAACCAGACCGA TATTTAT1 1 1 1GCAAAATTGAAGTGATGTAT CCGCCGCCGTATCTGGATAACGAAAAAAG CAACGGCACCATTATTCATGTGAAAGGCAA ACATCTGTGCCCGAGCCCGCTGTTTCCGG GCCCGAGCAAACCG 1 1 1 1GGGTGCTGGTG GTGGTGGGCGGCGTGCTGGCGTGCTATAG CCTGCTGGTGACCGTGGCGTTTATTATTTT TTGGGTGCGCAGCAAACGCAGCCGCCTGC TGCATAGCGATTATATGAACATGACCCCGC GCCGCCCGGGCCCGACCCGCAAACATTAT CAGCCGTATGCGCCGCCGCGCGATTTTGC GGCGTATCGCAGC	70
CD28 humano	MLRLLLALNLFPSIQVTGNKILVKQSPMLVAY	71

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 483/852

267/293

Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
	DNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAV EVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNE SVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDN EKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLV VVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHS DYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYR S
CD28 murino	ATGACCCTGCGCCTGCTGTTTCTGGCGCT GAACTTT1 1 1AGCGTGCAGGTGACCGAAAA CAAAATTCTGGTGAAACAGAGCCCGCTGCT GGTGGTGGATAGCAACGAAGTGAGCCTGA GCTGCCGCTATAGCTATAACCTGCTGGCG AAAGAATTTCGCGCGAGCCTGTATAAAGGC GTGAACAGCGATGTGGAAGTGTGCGTGGG CAACGGCAACTTTACCTATCAGCCGCAGTT TCGCAGCAACGCGGAATTTAACTGCGATG GCGA1 1 1 1GATAACGAAACCGTGACCTTTC GCCTGTGGAACCTGCATGTGAACCATACC GATATTTATTTTTGCAAAATTGAATTTATGTA TCCGCCGCCGTATCTGGATAACGAACGCA GCAACGGCACCATTATTCATATTAAAGAAA AACATCTGTGCCATACCCAGAGCAGCCCG AAACTG 1 1 1 1GGGCGCTGGTGGTGGTGGC GGGCGTGCTGTTTTGCTATGGCCTGCTGG TGACCGTGGCGCTGTGCGTGATTTGGACC AACAGCCGCCGCAACCGCCTGCTGCAGAG	72

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 484/852

268/293

Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
	CGATTATATGAACATGACCCCGCGCCGCC CGGGCCTGACCCGCAAACCGTATCAGCCG TATGCGCCGGCGCGCGATTTTGCGGCGTA TCGCCCG
CD28 murino	MTLRLLFLALNFFSVQVTENKILVKQSPLLVV DSNEVSLSCRYSYNLLAKEFRASLYKGVNSD VEVCVGNGNFTYQPQFRSNAEFNCDGDFDN ETVTFRLWNLHVNHTDIYFCKIEFMYPPPYLD NERSNGTIIHIKEKHLCHTQSSPKLFWALVVV AGVLFCYGLLVTVALCVIWTNSRRNRLLQSD YMNMTPRRPGLTRKPYQPYAPARDFAAYRP	73
CD137 humano	ATGGGAAACAGCTGTTACAACATAGTAGCC ACTCTGTTGCTGGTCCTCAACTTTGAGAGG ACAAGATCATTGCAGGATCCTTGTAGTAAC TGCCCAGCTGGTACATTCTGTGATAATAAC AGGAATCAGATTTGCAGTCCCTGTCCTCCA AATAGTTTCTCCAGCGCAGGTGGACAAAG GACCTGTGACATATGCAGGCAGTGTAAAG GTG I I I ICAGGACCAGGAAGGAGTGTTCCT CCACCAGCAATGCAGAGTGTGACTGCACT CCAGGGTTTCACTGCCTGGGGGCAGGATG CAGCATGTGTGAACAGGATTGTAAACAAGG TCAAGAACTGACAAAAAAAGGTTGTAAAGA CTGTTGCTTTGGGACATTTAACGATCAGAA ACGTGGCATCTGTCGACCCTGGACAAACT GTTCTTTGGATGGAAAGTCTGTGCTTGTGA	74

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 485/852

269/293

Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
	ATGGGACGAAGGAGAGGGACGTGGTCTGT GGACCATCTCCAGCCGACCTCTCTCCGGG AGCATCCTCTGTGACCCCGCCTGCCCCTG CGAGAGAGCCAGGACACTCTCCGCAGATC ATCTCCTTCTTTCTTGCGCTGACGTCGACT GCGTTGCTCTTCCTGCTGTTCTTCCTCACG CTCCGTTTCTCTGTTGTTAAACGGGGCAGA AAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCAT TTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGG AAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAG AAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGTGA
CD137 humano	MGNSCYNIVATLLLVLNFERTRSLQDPCSNC PAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRT CDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPG FHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGCKDC CFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNG TKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAPARE PGHSPQIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVK RGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRF PEEEEGGCEL	75
CD137 murino	ATGGGCAACAACTGCTATAACGTGGTGGT GATTGTGCTGCTGCTGGTGGGCTGCGAAA AAGTGGGCGCGGTGCAGAACAGCTGCGAT AACTGCCAGCCGGGCACCTTTTGCCGCAA ATATAACCCGGTGTGCAAAAGCTGCCCGC CGAGCACCTTTAGCAGCATTGGCGGCCAG	76

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 486/852

270/293

Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
	CCGAACTGCAACAI I IGCCGCGTGTGCGC GGGCTATTTTCGCTTTAAAAAAI I I IGCAGC AGCACCCATAACGCGGAATGCGAATGCATT GAAGGCTTTCATTGCCTGGGCCCGCAGTG CACCCGCTGCGAAAAAGATTGCCGCCCGG GCCAGGAACTGACCAAACAGGGCTGCAAA ACCTGCAGCCTGGGCACCTTTAACGATCA GAACGGCACCGGCGTGTGCCGCCCGTGG ACCAACTGCAGCCTGGATGGCCGCAGCGT GCTGAAAACCGGCACCACCGAAAAAGATG TGGTGTGCGGCCCGCCGGTGGTGAGCTTT AGCCCGAGCACCACCATTAGCGTGACCCC GGAAGGCGGCCCGGGCGGCCATAGCCTG CAGGTGCTGACCCTGTTTCTGGCGCTGAC CAGCGCGCTGCTGCTGGCGCTGATTTTTAT TACCCTGCTGTTTAGCGTGCTGAAATGGAT TCGCAAAAAATTTCCGCATAI I I ITAAACAG CCGTTTAAAAAAACCACCGGCGCGGCGCA GGAAGAAGATGCGTGCAGCTGCCGCTGCC CGCAGGAAGAAGAAGGCGGCGGCGGCGG CTATGAACTG
CD137 murino	MGNNCYNVVVIVLLLVGCEKVGAVQNSCDN CQPGTFCRKYNPVCKSCPPSTFSSIGGQPN CNICRVCAGYFRFKKFCSSTHNAECECIEGF HCLGPQCTRCEKDCRPGQELTKQGCKTCSL GTFNDQNGTGVCRPWTNCSLDGRSVLKTGT	77

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 487/852

271/293

Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
	TEKDVVCGPPVVSFSPSTTISVTPEGGPGGH SLQVLTLFLALTSALLLALIFITLLFSVLKWIRK KFPHIFKQPFKKTTGAAQEEDACSCRCPQEE EGGGGGYEL
0X40 humano	ATGTGCGTGGGCGCGCGCCGCCTGGGCC GCGGCCCGTGCGCGGCGCTGCTGCTGCT GGGCCTGGGCCTGAGCACCGTGACCGGC CTGCATTGCGTGGGCGATACCTATCCGAG CAACGATCGCTGCTGCCATGAATGCCGCC CGGGCAACGGCATGGTGAGCCGCTGCAG CCGCAGCCAGAACACCGTGTGCCGCCCGT GCGGCCCGGGCTTTTATAACGATGTGGTG AGCAGCAAACCGTGCAAACCGTGCACCTG GTGCAACCTGCGCAGCGGCAGCGAACGCA AACAGCTGTGCACCGCGACCCAGGATACC GTGTGCCGCTGCCGCGCGGGCACCCAGC CGCTGGATAGCTATAAACCGGGCGTGGAT TGCGCGCCGTGCCCGCCGGGCCA1 1 1 1 AG CCCGGGCGATAACCAGGCGTGCAAACCGT GGACCAACTGCACCCTGGCGGGCAAACAT ACCCTGCAGCCGGCGAGCAACAGCAGCGA TGCGATTTGCGAAGATCGCGATCCGCCGG CGACCCAGCCGCAGGAAACCCAGGGCCC GCCGGCGCGCCCGATTACCGTGCAGCCGA CCGAAGCGTGGCCGCGCACCAGCCAGGG CCCGAGCACCCGCCCGGTGGAAGTGCCG	78

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 488/852

272/293

Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
	GGCGGCCGCGCGGTGGCGGCGATTCTGG GCCTGGGCCTGGTGCTGGGCCTGCTGGG CCCGCTGGCGATTCTGCTGGCGCTGTATC TGCTGCGCCGCGATCAGCGCCTGCCGCCG GATGCGCATAAACCGCCGGGCGGCGGCA GCTTTCGCACCCCGATTCAGGAAGAACAG GCGGATGCGCATAGCACCCTGGCGAAAAT T
0X40 humano	MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHC VGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQ NTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLR SGSERKQLCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYK PGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLA GKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQ GPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVP GGRAVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRD QRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTL AKI	79
0X40 murino	ATGTATGTGTGGGTGCAGCAGCCGACCGC GCTGCTGCTGCTGGCGCTGACCCTGGGCG TGACCGCGCGCCGCCTGAACTGCGTGAAA CATACCTATCCGAGCGGCCATAAATGCTGC CGCGAATGCCAGCCGGGCCATGGCATGGT GAGCCGCTGCGATCATACCCGCGATACCC TGTGCCATCCGTGCGAAACCGGC1 1 1 1 ATA ACGAAGCGGTGAACTATGATACCTGCAAAC	80

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 489/852

273/293

Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
	AGTGCACCCAGTGCAACCATCGCAGCGGC AGCGAACTGAAACAGAACTGCACCCCGAC CCAGGATACCGTGTGCCGCTGCCGCCCGG GCACCCAGCCGCGCCAGGATAGCGGCTAT AAACTGGGCGTGGATTGCGTGCCGTGCCC GCCGGGCCATTTTAGCCCGGGCAACAACC AGGCGTGCAAACCGTGGACCAACTGCACC CTGAGCGGCAAACAGACCCGCCATCCGGC GAGCGATAGCCTGGATGCGGTGTGCGAAG ATCGCAGCCTGCTGGCGACCCTGCTGTGG GAAACCCAGCGCCCGACCTTTCGCCCGAC CACCGTGCAGAGCACCACCGTGTGGCCGC GCACCAGCGAACTGCCGAGCCCGCCGACC CTGGTGACCCCGGAAGGCCCGGCGTTTGC GGTGCTGCTGGGCCTGGGCCTGGGCCTG CTGGCGCCGCTGACCGTGCTGCTGGCGCT GTATCTGCTGCGCAAAGCGTGGCGCCTGC CGAACACCCCGAAACCGTGCTGGGGCAAC AGCTTTCGCACCCCGATTCAGGAAGAACAT ACCGATGCGCATTTTACCCTGGCGAAAATT
0X40 murino	MYVWVQQPTALLLLALTLGVTARRLNCVKHT YPSGHKCCRECQPGHGMVSRCDHTRDTLC HPCETGFYNEAVNYDTCKQCTQCNHRSGSE LKQNCTPTQDTVCRCRPGTQPRQDSGYKLG VDCVPCPPGHFSPGNNQACKPWTNCTLSGK QTRHPASDSLDAVCEDRSLLATLLWETQRPT	81

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 490/852

274/293

Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
	FRPTTVQSTTVWPRTSELPSPPTLVTPEGPA FAVLLGLGLGLLAPLTVLLALYLLRKAWRLPN TPKPCWGNSFRTPIQEEHTDAHFTLAKI
ICOS humano	ATGAAAAGCGGCCTGTGGTAT1 1 1 1 1 1CTG TTTTGCCTGCGCATTAAAGTGCTGACCGGC GAAATTAACGGCAGCGCGAACTATGAAATG TTTAT1 1 1 1CATAACGGCGGCGTGCAGATT CTGTGCAAATATCCGGATATTGTGCAGCAG TTTAAAATGCAGCTGCTGAAAGGCGGCCA GATTCTGTGCGATCTGACCAAAACCAAAGG CAGCGGCAACACCGTGAGCATTAAAAGCC TGAAATTTTGCCATAGCCAGCTGAGCAACA ACAGCGTGAGC1 1 1 1 1TCTGTATAACCTGG ATCATAGCCATGCGAACTATTAT1 1 1 1GCAA CCTGAGCATT1 1 1GATCCGCCGCCGTTTAA AGTGACCCTGACCGGCGGCTATCTGCATA TTTATGAAAGCCAGCTGTGCTGCCAGCTGA AATTTTGGCTGCCGATTGGCTGCGCGGCG TTTGTGGTGGTGTGCATTCTGGGCTGCATT CTGATTTGCTGGCTGACCAAAAAAAAATAT AGCAGCAGCGTGCATGATCCGAACGGCGA ATATATGTTTATGCGCGCGGTGAACACCGC GAAAAAAAGCCGCCTGACCGATGTGACCC TG	82
ICOS humano	MKSGLWYFFLFCLRIKVLTGEINGSANYEMFI FHNGGVQILCKYPDIVQQFKMQLLKGGQILC	83

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 491/852

275/293

Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
	DLTKTKGSGNTVSIKSLKFCHSQLSNNSVSFF LYNLDHSHANYYFCNLSIFDPPPFKVTLTGGY LHIYESQLCCQLKFWLPIGCAAFVVVCILGCIL ICWLTKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAK KSRLTDVTL
ICOS murino	ATGAAACCGTAT1 1 1 1GCCGCGTGTTTGTG TTTTGCTTTCTGATTCGCCTGCTGACCGGC GAAATTAACGGCAGCGCGGATCATCGCAT GTTTAGCTTTCATAACGGCGGCGTGCAGAT TAGCTGCAAATATCCGGAAACCGTGCAGCA GCTGAAAATGCGCCTGTTTCGCGAACGCG AAGTGCTGTGCGAACTGACCAAAACCAAAG GCAGCGGCAACGCGGTGAGCATTAAAAAC CCGATGCTGTGCCTGTATCATCTGAGCAAC AACAGCGTGAGCT1 1 1 1 1CTGAACAACCCG GATAGCAGCCAGGGCAGCTATTA1 1 1 1TGC AGCCTGAGCATTTTTGATCCGCCGCCGTTT CAGGAACGCAACCTGAGCGGCGGCTATCT GCATATTTATGAAAGCCAGCTGTGCTGCCA GCTGAAACTGTGGCTGCCGGTGGGCTGCG CGGCGTTTGTGGTGGTGCTGCTGTTTGGC TGCATTCTGATTATTTGGTTTAGCAAAAAAA AATATGGCAGCAGCGTGCATGATCCGAAC AGCGAATATATGTTTATGGCGGCGGTGAAC ACCAACAAAAAAAGCCGCCTGGCGGGCGT GACCAGC	84

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 492/852

276/293

Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
ICOS murino	MKPYFCRVFVFCFLIRLLTGEINGSADHRMFS FHNGGVQISCKYPETVQQLKMRLFREREVLC ELTKTKGSGNAVSIKNPMLCLYHLSNNSVSF FLNNPDSSQGSYYFCSLSIFDPPPFQERNLS GGYLHIYESQLCCQLKLWLPVGCAAFVVVLL FGCILIIWFSKKKYGSSVHDPNSEYMFMAAV NTNKKSRLAGVTS	85
DAP10 humano	ATGATTCATCTGGGCCATATTCTGTTTCTG CTGCTGCTGCCGGTGGCGGCGGCGCAGA CCACCCCGGGCGAACGCAGCAGCCTGCC GGCGTTTTATCCGGGCACCAGCGGCAGCT GCAGCGGCTGCGGCAGCCTGAGCCTGCC GCTGCTGGCGGGCCTGGTGGCGGCGGAT GCGGTGGCGAGCCTGCTGATTGTGGGCGC GGTGTTTCTGTGCGCGCGCCCGCGCCGCA GCCCGGCGCAGGAAGATGGCAAAGTGTAT ATTAACATGCCGGGCCGCGGC	86
DAP10 humano	MIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYP GTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIV GAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRG	87
DAP10 murino	ATGGATCCGCCGGGCTATCTGCTGTTTCTG CTGCTGCTGCCGGTGGCGGCGAGCCAGA CCAGCGCGGGCAGCTGCAGCGGCTGCGG CACCCTGAGCCTGCCGCTGCTGGCGGGCC TGGTGGCGGCGGATGCGGTGATGAGCCTG	88

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 493/852

277/293

Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
	CTGATTGTGGGCGTGGTGTTTGTGTGCATG CGCCCGCATGGCCGCCCGGCGCAGGAAG ATGGCCGCGTGTATATTAACATGCCGGGC CGCGGC
DAP10 murino	MDPPGYLLFLLLLPVAASQTSAGSCSGCGTL SLPLLAGLVAADAVMSLLIVGVVFVCMRPHG RPAQEDGRVYINMPGRG	89
DAP12 humano	ATGGGGGGACTTGAACCCTGCAGCAGGCT CCTGCTCCTGCCTCTCCTGCTGGCTGTAAG TGGTCTCCGTCCTGTCCAGGCCCAGGCCC AGAGCGATTGCAGTTGCTCTACGGTGAGC CCGGGCGTGCTGGCAGGGATCGTGATGG GAGACCTGGTGCTGACAGTGCTCATTGCC CTGGCCGTGTACTTCCTGGGCCGGCTGGT CCCTCGGGGGCGAGGGGCTGCGGAGGCA GCGACCCGGAAACAGCGTATCACTGAGAC CGAGTCGCCTTATCAGGAGCTCCAGGGTC AGAGGTCGGATGTCTACAGCGACCTCAAC ACACAGAGGCCGTATTACAAATGA	90
DAP12 humano	MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSGLRPVQAQAQS DCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYF LGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQEL QGQRSDVYSDLNTQRPYYK	91
DAP12 murino	ATGGGGGCTCTGGAGCCCTCCTGGTGCCT TCTGTTCCTTCCTGTCCTCCTGACTGTGGG	92

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 494/852

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Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
	AGGATTAAGTCCCGTACAGGCCCAGAGTG ACACTTTCCCAAGATGCGACTGTTCTTCCG TGAGCCCTGGTGTACTGGCTGGGATTGTT CTGGGTGACTTGGTGTTGACTCTGCTGATT GCCCTGGCTGTGTACTCTCTGGGCCGCCT GGTCTCCCGAGGTCAAGGGACAGCGGAAG GGACCCGGAAACAACACATTGCTGAGACT GAGTCGCCTTATCAGGAGCTTCAGGGTCA GAGACCAGAAGTATACAGTGACCTCAACAC ACAGAGGCAATATTACAGATGA
DAP12 murino	MGALEPSWCLLFLPVLLTVGGLSPVQAQSDT FPRCDCSSVSPGVLAGIVLGDLVLTLLIALAV YSLGRLVSRGQGTAEGTRKQHIAETESPYQE LQGQRPEVYSDLNTQRQYYR	93
CD3z humano	MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLC YLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQ QGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPE MGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYS EIGMKGERRRGKGHDG LYQG LSTATKDTYD ALHMQALPPR	94
CD3z humano	ATGAAGTGGAAGGCGCTTTTCACCGCGGC CATCCTGCAGGCACAGTTGCCGATTACAGA GGCACAGAGCTTTGGCCTGCTGGATCCCA AACTCTGCTACCTGCTGGATGGAATCCTCT TCATCTATGGTGTCATTCTCACTGCCTTGTT	95

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 495/852

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Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
	CCTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAG AGCCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAAC CAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGA AGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAG ACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGA AAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGG CCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGAT GGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGA AAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCA CGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAG CCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCAC ATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA
CD3z murino	MKWKVSVLACILHVRFPGAEAQSFGLLDPKL CYLLDGILFIYGVIITALYLRAKFSRSAETAANL QDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPE MGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYS EIGTKGERRRGKGHDG LYQG LSTATKDTYD ALHMQTLAPR	96
CD3z murino	ATGAAGTGGAAAGTGTCTGTTCTCGCCTGC ATCCTCCACGTGCGGTTCCCAGGAGCAGA GGCACAGAGCTTTGGTCTGCTGGATCCCA AACTCTGCTACTTGCTAGATGGAATCCTCT TCATCTACGGAGTCATCATCACAGCCCTGT ACCTGAGAGCAAAATTCAGCAGGAGTGCA GAGACTGCTGCCAACCTGCAGGACCCCAA CCAGCTCTACAATGAGCTCAATCTAGGGCG	97

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 496/852

280/293

Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
	AAGAGAGGAATATGACGTCTTGGAGAAGAA GCGGGCTCGGGATCCAGAGATGGGAGGC AAACAGCAGAGGAGGAGGAACCCCCAGGA AGGCGTATACAATGCACTGCAGAAAGACAA GATGGCAGAAGCCTACAGTGAGATCGGCA CAAAAGGCGAGAGGCGGAGAGGCAAGGG GCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGCA CTGCCACCAAGGACACCTATGATGCCCTG CATATGCAGACCCTGGCCCCTCGCTAA
FCGR3A humano	MWQLLLPTALLLLVSAGMRTEDLPKAVVFLE PQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWF HNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNL STLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPI HLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHN SDFYIPKATLKDSGSYFCRGLFGSKNVSSET VNITITQGLAVSTISSFFPPGYQVSFCLVMVLL FAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRK DPQDK	98
FCGR3A humano	ATGTGGCAGCTGCTGCTGCCGACCGCGCT GCTGCTGCTGGTGAGCGCGGGCATGCGCA CCGAAGATCTGCCGAAAGCGGTGGTGTTT CTGGAACCGCAGTGGTATCGCGTGCTGGA AAAAGATAGCGTGACCCTGAAATGCCAGG GCGCGTATAGCCCGGAAGATAACAGCACC CAGTGGTTTCATAACGAAAGCCTGATTAGC AGCCAGGCGAGCAGCTA1 1 1 1ATTGATGCG	99

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 497/852

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Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
	GCGACCGTGGATGATAGCGGCGAATATCG CTGCCAGACCAACCTGAGCACCCTGAGCG ATCCGGTGCAGCTGGAAGTGCATATTGGC TGGCTGCTGCTGCAGGCGCCGCGCTGGGT GTTTAAAGAAGAAGATCCGATTCATCTGCG CTGCCATAGCTGGAAAAACACCGCGCTGC ATAAAGTGACCTATCTGCAGAACGGCAAAG GCCGCAAATATTTTCATCATAACAGCGATTT TTATATTCCGAAAGCGACCCTGAAAGATAG CGGCAGCTATTTTTGCCGCGGCCTGTTTG GCAGCAAAAACGTGAGCAGCGAAACCGTG AACATTACCATTACCCAGGGCCTGGCGGT GAGCACCATTAGCAGC1 1 1 1 1 1CCGCCGGG CTATCAGGTGAGC1 1 1TGCCTGGTGATGGT GCTGCTGTTTGCGGTGGATACCGGCCTGT A1 1 1 1AGCGTGAAAACCAACATTCGCAGCA GCACCCGCGATTGGAAAGATCATAAATTTA AATGGCGCAAAGATCCGCAGGATAAA
FCGR3A murino	MFQNAHSGSQWLLPPLTILLLFAFADRQSAA LPKAVVKLDPPWIQVLKEDMVTLMCEGTHNP GNSSTQWFHNGRSIRSQVQASYTFKATVND SGEYRCQMEQTRLSDPVDLGVISDWLLLQTP QRVFLEGETITLRCHSWRNKLLNRISFFHNEK SVRYHHYKSNFSIPKANHSHSGDYYCKGSLG STQHQSKPVTITVQDPATTSSISLVWYHTAFS LVMCLLFAVDTGLYFYVRRNLQTPREYWRKS	100

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 498/852

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Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
	LSIRKHQAPQDK
FCGR3A murino	ATGTTTCAGAATGCACACTCTGGAAGCCAA TGGCTACTTCCACCACTGACAATTCTGCTG CTGTTTGCTTTTGCAGACAGGCAGAGTGCA GCTCTTCCGAAGGCTGTGGTGAAACTGGA CCCCCCATGGATCCAGGTGCTCAAGGAAG ACATGGTGACACTGATGTGCGAAGGGACC CACAACCCTGGGAACTCTTCTACCCAGTGG TTCCACAACGGGAGGTCCATCCGGAGCCA GGTCCAAGCCAGTTACACGTTTAAGGCCAC AGTCAATGACAGTGGAGAATATCGGTGTCA AATGGAGCAGACCCGCCTCAGCGACCCTG TAGATCTGGGAGTGATTTCTGACTGGCTGC TGCTCCAGACCCCTCAGCGGGTGTTTCTG GAAGGGGAAACCATCACGCTAAGGTGCCA TAGCTGGAGGAACAAACTACTGAACAGGAT CTCATTCTTCCATAATGAAAAATCCGTGAG GTATCATCACTACAAAAGTAATTTCTCTATC CCAAAAGCCAACCACAGTCACAGTGGGGA CTACTACTGCAAAGGAAGTCTAGGAAGTAC ACAGCACCAGTCCAAGCCTGTCACCATCAC TGTCCAAGATCCAGCAACTACATCCTCCAT CTCTCTAGTCTGGTACCACACTGCTTTCTC CCTAGTGATGTGCCTCCTGTTTGCAGTGGA CACGGGCCTTTATTTCTACGTACGGAGAAA TCTTCAAACCCCGAGGGAGTACTGGAGGA	101

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 499/852

283/293

Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
	AGTCCCTGTCAATCAGAAAGCACCAGGCTC CTCAAGACAAGTGA
NKG2D humano	MGWIRGRRSRHSWEMSEFHNYNLDLKKSDF STRWQKQRCPVVKSKCRENASPFFFCCFIAV AMGIRFIIMVAIWSAVFLNSLFNQEVQIPLTES YCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQ ASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHW MGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQK GDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV	102
NKG2D humano	ATGGGCTGGATTCGCGGCCGCCGCAGCC GCCATAGCTGGGAAATGAGCGAATTTCATA ACTATAACCTGGATCTGAAAAAAAGCGATT TTAGCACCCGCTGGCAGAAACAGCGCTGC CCGGTGGTGAAAAGCAAATGCCGCGAAAA CGCGAGCCCGTT1 1 1 1 1TTTGCTGCTTTATT GCGGTGGCGATGGGCATTCGCTTTATTATT ATGGTGGCGATTTGGAGCGCGGTGTTTCT GAACAGCCTGTTTAACCAGGAAGTGCAGAT TCCGCTGACCGAAAGCTATTGCGGCCCGT GCCCGAAAAACTGGATTTGCTATAAAAACA ACTGCTATCAGT1 1 1 1 1GATGAAAGCAAAAA CTGGTATGAAAGCCAGGCGAGCTGCATGA GCCAGAACGCGAGCCTGCTGAAAGTGTAT AGCAAAGAAGATCAGGATCTGCTGAAACTG GTGAAAAGCTATCATTGGATGGGCCTGGT GCATATTCCGACCAACGGCAGCTGGCAGT	103

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 500/852

284/293

Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
	GGGAAGATGGCAGCATTCTGAGCCCGAAC CTGCTGACCATTATTGAAATGCAGAAAGGC GATTGCGCGCTGTATGCGAGCAGCTTTAAA GGCTATATTGAAAACTGCAGCACCCCGAAC ACCTATATTTGCATGCAGCGCACCGTG
NKG2D murino	MALIRDRKSHHSEMSKCHNYDLKPAKWDTS QEQQKQRLALTTSQPGENGIIRGRYPIEKLKI SPMFVVRVLAIALAIRFTLNTLMWLAIFKETFQ PVLCNKEVPVSSREGYCGPCPNNWICHRNN CYQFFNEEKTWNQSQASCLSQNSSLLKIYSK EEQDFLKLVKSYHWMGLVQIPANGSWQWE DGSSLSYNQLTLVEIPKGSCAVYGSSFKAYT EDCANLNTYICMKRAV	104
NKG2D murino	ATGGCGCTGATTCGCGATCGCAAAAGCCA TCATAGCGAAATGAGCAAATGCCATAACTA TGATCTGAAACCGGCGAAATGGGATACCA GCCAGGAACAGCAGAAACAGCGCCTGGCG CTGACCACCAGCCAGCCGGGCGAAAACGG CATTATTCGCGGCCGCTATCCGATTGAAAA ACTGAAAATTAGCCCGATGTTTGTGGTGCG CGTGCTGGCGATTGCGCTGGCGATTCGCT TTACCCTGAACACCCTGATGTGGCTGGCG A1 1 1 1TAAAGAAACCTTTCAGCCGGTGCTG TGCAACAAAGAAGTGCCGGTGAGCAGCCG CGAAGGCTATTGCGGCCCGTGCCCGAACA ACTGGATTTGCCATCGCAACAACTGCTATC	105

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 501/852

285/293

Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
	AGTTI I I IAACGAAGAAAAAACCTGGAACC AGAGCCAGGCGAGCTGCCTGAGCCAGAAC AGCAGCCTGCTGAAAATTTATAGCAAAGAA GAACAGGATTTTCTGAAACTGGTGAAAAGC TATCATTGGATGGGCCTGGTGCAGATTCCG GCGAACGGCAGCTGGCAGTGGGAAGATG GCAGCAGCCTGAGCTATAACCAGCTGACC CTGGTGGAAATTCCGAAAGGCAGCTGCGC GGTGTATGGCAGCAGCTTTAAAGCGTATAC CGAAGATTGCGCGAACCTGAACACCTATAT TTGCATGAAACGCGCGGTG
CD28 YMNM	YMNM	106
CD28 PYAP	PYAP	107
CD28 FMNM	FMNM	108
CD28 AYAA	AYAA	109
Peptídeo de sinal	ATMGWSCIILFLVATATGVHS	110
Sequência de DNA de peptídeo de sinal	ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTG GTAGCAACAGCTACCGGTGTGCACTCC	111
Cadeia pesada de Anti-CD20 (GA101)	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFS YSWINWVRQAPGQGLEWMGRIFPGDGDTD YNGKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED TAVYYCARNVFDGYWLVYWGQGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY	112

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 502/852

286/293

Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
	SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKV DKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Cadeia leve de Anti-CD20 (GA101)	DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHS NGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLVSGV PDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCA QNLELPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPS DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG EC	113
Cadeia pesada de Anti-FAP(4B9) PGLALA	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDT AVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN	114

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287/293

Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
	WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK
Cadeia leve de Anti-FAP(4B9)	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSS YLAWYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGIPDRF SGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIM LPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC	115
Cadeia pesada de Anti-CEA (A5B7) PGLALA	EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTVS SYWMHWVRQAPGKGLEWVGFIRNKANGGT TEYAASVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCARDRGLRFYFDYWGQGTTVTVS SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSN TKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT	116

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 504/852

288/293

Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
	TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Cadeia leve de Anti-CEA (A5B7)	QAVLTQPASLSASPGASASLTCTLRRGINVG AYSIYWYQQKPGSPPQYLLRYKSDSDKQQG SGVSSRFSASKDASANAGILLISGLQSEDEAD YYCMIWHSGASAVFGGGTKLTVLRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTK SFNRGEC	117
Cadeia pesada de Anti-CEA (T84.66LCHA) PGLALA	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIK DTYMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPANGNSK YVPKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	118

Petição 870190096380, de 26/09/2019, pág. 505/852

289/293

Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
Cadeia leve de	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRAGESVDIF	119
Anti-CEA	GVGFLHWYQQKPGQAPRLLIYRASNRATGIP
(T84.66LCHA)	ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQ TNEDPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE C
Cadeia pesada	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT	120
de Anti-CEA	EFGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEAT
(CH1A1A98/992F	YVEEFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDD
1) PGLALA	TAVYYCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTV SSASTKG PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSN TKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGA PIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQ VSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Cadeia leve de	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASAAVGT	121
Anti-CEA	YVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRKRGVPSRF
(CH1A1A98/992F	SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYYT

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290/293

Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
1)	YPLFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQ LKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD YEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Cadeia pesada de Anti-CEA (hMN14) PGLALA	EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCSASGFDFT TYWMSWVRQAPGKGLEWIGEIHPDSSTINYA PSLKDRFTISRDNAKNTLFLQMDSLRPEDTG VYFCASLYFGFPWFAYWGQGTPVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFP EPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK KVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK	122
Cadeia leve de Anti-CEA (hMN14)	DIQLTQS PSSLSAS VG D RVTITCKASQD VGTS VAWYQQKPGKAPKLLIYWTSTRHTGVPSRF SGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYSLY RSFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKS GTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSG NSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC	123

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291/293

Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
Cadeia pesada de Anti-TNC (2B10) PGLALA	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFS SYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYA QKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTA VYYCARLYGYAYYGAFDYWGQGTTVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKV DKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIE KTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVS LSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	124
Cadeia leve de Anti-TNC (2B10)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRN DLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSR FSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQNGL QPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC	125
Cadeia pesada 1 de Anti-HER2 (PER) PG LALA	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF I F I DYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSI YNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAE DTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSS	126

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292/293

Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Cadeia leve 1 de Anti-HER2 (PER)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIG VAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFS GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYP YTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKS GTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSG NSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC	127
Cadeia pesada 2 de Anti-HER2 (PER) PG LALA	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF I F I DYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSI YNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAE DTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSV	128

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293/293

Construto	Sequência de aminoácidos	SEQ ID NO
	FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Cadeia leve 2 de Anti-HER2 (PER)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIG VAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFS GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYP YTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKS GTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSG NSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC	129
lgG1 Fc humana	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	130

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Claims

Reivindicações

1. RECEPTOR DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO, caracterizado por compreender um domínio transmembrana de ancoragem e um domínio extracelular que compreende uma porção de ligação ao antígeno, em que a porção de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente a um domínio de fragmento cristalizável (Fc) mutado, mas não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado, em que o domínio Fc mutado compreende pelo menos uma substituição de aminoácido em comparação com o domínio Fc parental não mutado.
2. RECEPTOR DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela ligação do receptor Fc do domínio Fc mutado ser reduzida em comparação com a ligação do receptor Fc do domínio Fc parental não mutado, particularmente em que o receptor Fc é um receptor Fcy ou receptor Fc neonatal (FcRn).
3. RECEPTOR DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pela porção de ligação ao antígeno ser um scFv, um Fab, um crossFab ou um scFab.
4. RECEPTOR DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo domínio transmembrana de ancoragem ser um domínio transmembrana selecionado a partir do grupo que consiste no domínio transmembrana CD8, CD3z, FCGR3A, NKG2D, CD27, CD28, CD137, 0X40, ICOS, DAP10 ou DAP12 ou um fragmento dos mesmos, em particular em que o domínio transmembrana de ancoragem é o domínio transmembrana de CD28 ou um fragmento do mesmo.
5. RECEPTOR DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por compreender ainda pelo menos um domínio de sinalização de estímulo e/ ou pelo menos um domínio de sinalização de co-estímulo.

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6. RECEPTOR DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por dito pelo menos um domínio de sinalização de estímulo ser selecionado individualmente a partir do grupo que consiste no domínio intracelular de CD3z, de FCGR3A e de NKG2D, ou fragmentos dos mesmos, em particular em que o pelo menos um domínio de sinalização de estímulo é o domínio intracelular de CD3z ou um fragmento do mesmo.
7. RECEPTOR DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por dito pelo menos um domínio de sinalização de co-estímulo ser selecionado individualmente a partir do grupo que consiste no domínio intracelular de CD27, de CD28, de CD137, de 0X40, de ICOS, de DAP10 e de DAP12, ou fragmentos dos mesmos, em particular em que o pelo menos um domínio de sinalização de co-estímulo é o domínio intracelular CD28 ou um fragmento do mesmo.
8. RECEPTOR DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo receptor de ligação ao antígeno compreender um domínio de sinalização de estímulo que compreende o domínio intracelular de CD28, ou um fragmento do mesmo, e em que o receptor de ligação ao antígeno compreende um domínio de sinalização de co-estímulo que compreende o domínio intracelular de CD3z, ou um fragmento do mesmo.
9. RECEPTOR DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pela porção de ligação ao antígeno ser um fragmento scFv, em que o fragmento scFv está conectado ao C-terminal ao N-terminal do domínio transmembrana de ancoragem, opcionalmente através de um ligante peptídico.
10. RECEPTOR DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pela porção de ligação ao

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3/8 antígeno ser um fragmento Fab ou um crossFab, em que o fragmento Fab ou crossFab está conectado no C-terminal da cadeia pesada ao N-terminal do domínio transmembrana de ancoragem, opcionalmente através de um ligante peptídico.
11. RECEPTOR DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo domínio Fc mutado compreender pelo menos uma mutação de aminoácido em uma posição selecionada a partir do grupo que consiste em L234, L235, I253, H310, P331, P329 e H435, de acordo com a numeração EU, em particular em que a mutação de aminoácido é L234A, L235A, I253A, N297A, H310A, P329G e/ ou H435A.
12. RECEPTOR DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo domínio Fc mutado compreender a mutação de aminoácido P329G de acordo com a numeração EU, em que a ligação ao receptor Fcy do domínio Fc mutado é reduzida em comparação com a ligação ao receptor Fcy do domínio Fc parental não mutado.
13. RECEPTOR DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo domínio Fc mutado compreender pelo menos uma mutação de aminoácido em uma posição selecionada a partir do grupo que consiste em I253, H310 e H435 de acordo com a numeração EU, em particular as mutações de aminoácido I253A, H310A e H435A (“AAA”), em que a ligação de FcRn do domínio Fc mutado é reduzida em comparação com a ligação de FcRn do domínio Fc parental não mutado.
14. RECEPTOR DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado por dita pelo menos uma porção de ligação ao antígeno ser capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado que compreende a mutação P329G, mas não ser capaz de

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4/8 se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado, em que a porção de ligação ao antígeno compreende:

(i) uma região variável da cadeia pesada (VH) que compreende:

(a) a sequência de aminoácidos RYWMN (SEQ ID NO: 1) da região determinante de complementaridade (CDR H) 1 da cadeia pesada;

(b) a sequência de aminoácidos EITPDSSTINYTPSLKD (SEQ ID NO: 2) da CDR H2; e (c) a sequência de aminoácidos PYDYGAWFAS (SEQ ID NO: 3) da CDR H3; e (ii) uma região variável da cadeia leve (VL) que compreende:

(d) a sequência de aminoácidos RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 4) da região determinante de complementaridade (CDR L) 1 da cadeia leve;

(e) a sequência de aminoácidos GTNKRAP (SEQ ID NO: 5) da CDR L2; e (f) a sequência de aminoácidos ALWYSNHWV (SEQ ID NO: 6) da CDR L3.
15. RECEPTOR DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11 e 13, caracterizado por dita pelo menos uma porção de ligação ao antígeno ser capaz de se ligar especificamente a um domínio Fc mutado que compreende as mutações I253A, H310A e H435A (“AAA”), mas não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado, em que a porção de ligação ao antígeno compreende:

(i) uma região variável da cadeia pesada (VH) que compreende:

(a) a sequência de aminoácidos SYGMS (SEQ ID NO: 53) da região determinante de complementaridade (CDR H) 1 da cadeia pesada;

(b) a sequência de aminoácidos SSGGSY (SEQ ID NO: 54) da

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CDR H2; e (c) a sequência de aminoácidos LGMITTGYAMDY (SEQ ID NO:

55) da CDR H3; e (ii) uma região variável da cadeia leve (VL) que compreende:

(d) a sequência de aminoácidos RSSQTIVHSTGHTYLE (SEQ ID NO: 56) da região determinante de complementaridade (CDR L) 1 da cadeia leve;

(e) a sequência de aminoácidos KVSNRFS (SEQ ID NO: 57) da CDR L2; e (f) a sequência de aminoácidos FQGSHVPYT (SEQ ID NO: 58) da CDR L3.
16. CÉLULA T TRANSDUZIDA, caracterizada por ser capaz de expressar o receptor de ligação ao antígeno, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15.
17. POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, caracterizado por codificar o receptor de ligação ao antígeno, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15.
18. VETOR, particularmente um vetor de expressão, caracterizado por compreender o polinucleotídeo conforme definido na reivindicação 17.
19. CÉLULA T TRANSDUZIDA, caracterizada por ser capaz de expressar o receptor de ligação ao antígeno, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15.
20. KIT, caracterizado por compreender:

(A) uma célula T transduzida capaz de expressar o receptor de ligação ao antígeno, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15; e (B) um anticorpo que compreende um domínio Fc mutado;

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6/8 em que o receptor de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc mutado, mas não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado.
21. KIT, caracterizado por compreender:

(A) um polinucleotídeo isolado que codifica o receptor de ligação ao antígeno, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15; e (B) um anticorpo que compreende um domínio Fc mutado;

em que o receptor de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc mutado, mas não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado.
22. KIT, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a

21, caracterizado pelo anticorpo que compreende o domínio Fc mutado ser capaz de se ligar especificamente a um antígeno selecionado a partir do grupo que consiste em proteína de ativação de fibroblastos (FAP), antígeno carcinoembrionário (CEA), mesotelina (MSLN), CD20, receptor de folato 1 (FOLR1) e tenascina (TNC).
23. KIT, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a

22, caracterizado por ser para uso como um medicamento.
24. KIT, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a

22, caracterizado por ser para uso no tratamento de uma doença, em particular para uso no tratamento de uma doença maligna.
25. RECEPTOR DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, ou célula T transduzida, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por ser para uso como um medicamento, em que uma célula T transduzida que expressa o receptor de ligação ao antígeno é administrada antes, simultaneamente ou após a administração de um anticorpo que compreende um domínio Fc mutado em que o receptor de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc mutado,

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7/8 mas não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado.
26. RECEPTOR DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, ou célula T transduzida, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por ser para uso no tratamento de uma doença maligna, em que o tratamento compreende a administração de uma célula T transduzida que expressa o receptor de ligação ao antígeno antes, simultaneamente ou após a administração de um anticorpo que compreende um domínio Fc mutado em que o receptor de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc mutado, mas não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado.
27. MÉTODO PARA TRATAR UMA DOENÇA em um sujeito, caracterizado por compreender administrar ao sujeito de uma célula T transduzida capaz de expressar o receptor de ligação ao antígeno , conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, e administrar antes, simultaneamente ou após a administração da célula T transduzida, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo que compreende um domínio Fc mutado, em que o receptor de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc mutado, mas não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado.
28. MÉTODO PARA INDUZIR A LISE DE UMA CÉLULA ALVO, caracterizado por compreender colocar a célula alvo em contato com uma célula T transduzida capaz de expressar o receptor de ligação ao antígeno, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, na presença de um anticorpo que compreende um domínio Fc mutado em que o receptor de ligação ao antígeno é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc mutado, mas não é capaz de se ligar especificamente ao domínio Fc parental não mutado.

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29. USO DO RECEPTOR DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, do polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 17, ou da célula T transduzida, conforme definida na reivindicação 19, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença maligna.
30. RECEPTOR DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO, caracterizado por ser substancialmente como descrito anteriormente com referência a qualquer um dos exemplos ou a qualquer um dos desenhos anexos.