CN101875697B - 新型抗egfr人源抗体tgm10的设计及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于计算机辅助设计新型抗EGFR人源抗体TGM10及其应用，该抗体可用于抑制表达EGFR的人肿瘤细胞生长。本发明基于EGFR蛋白胞外区与功能性抗体相互作用结构特征，通过计算机虚拟筛选、设计获得新型抗EGFR功能性人源抗体TGM10，应用PCR方法进行抗体基因全合成，将其构建至真核表达载体，并表达出能够特异性识别EGFR的9种TGM10抗体。抗体TGM10-1可以有效地杀伤EGFR阳性的肿瘤细胞，包括乳腺癌细胞系SKOV3、肝癌细胞系HepG2及肺癌细胞系A549。
Description
技术领域
本发明涉及新型抗体及其用途。基于EGFR与功能性抗体相互作用空间结构，利用计算机辅助合理评价EGFR蛋白与功能性抗体作用动态模式及功能性抗体特异性识别EGFR胞外区功能域的表位结构特征、理化性质，通过虚拟筛选与辅助分子设计相结合合理设计、获得新型抗EGFR人源抗体TGM10。应用分子生物学技术进行基因全合成和蛋白表达，并通过免疫学实验以及细胞生物学实验对新抗体的功能进行评价。
背景技术
表皮生长因子受体(EGFR)是细胞信号传导和细胞分化的重要分子之一[N.Prenzel，O.M.Fischer，S.Streit，S.Hart，A.Ullrich，The epidermalgrouth factor receptor family as a central element for cellular signaltransduction and diversification.Endocrine-related cancer 8(2001)11-31]。EGFR在多种类型的人类实体瘤中过表达，包括肺癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌、脑癌、膀胱癌、头颈部肿瘤、卵巢癌、胃癌、前列腺癌以及肝癌等[D.C.Moditahedi H，The receptor for EGF and its ligands：Expression，prognosticvalue and target for therapy in cancer.Int J Oncol(1994)277-296]。
人EGFR基因位于第7号染色体p13～q22区，全长200kb，由28个外显子组成，编码1186个氨基酸，形成的EGFR单链糖蛋白分子量约170kDa。EGFR胞外区(ECD)N-端621个氨基酸残基为配体结合区，由I、II、III、IV四个亚区(或相应称为L1、S1/CR1、L2、S2/CR2亚区)构成。I和III区富含亮氨酸；II和IV区富含半胱氨酸，全部50个半胱氨酸残基参与形成25个分子内二硫键。另外胞外区存在12个潜在的N-糖苷键连接的糖基化位点，其中I、II区各有2个，III、IV区各有4个。研究表明，EGFR的糖基化作用与其参与结合配体及自身同型二聚化有关。EGFR跨膜(TM)区由23个氨基酸残基构成的疏水区，为单链α螺旋。EGFR胞内区共542个氨基酸残基，由近膜区(JM)、酪氨酸激酶(TK)区、C-末端区三个亚区构成。近膜区的前13个氨基酸(645～657)是介导胞内二聚化作用所必需。自身磷酸化位点位于C-末端，其中Tyr1068、1148、1173为主要位点，Tyr992、1086为次要位点，与信号传递密切相关。EGFR的过度表达或异常激活，常常引起细胞恶性转化，从而与肿瘤的发生、发展为恶性以及肿瘤手术预后等密切相关。
目前用于EGFR靶向性治疗肿瘤的药物主要分为两类：EGFR单克隆抗体和小分子化合物酪氨酸激酶拮抗剂。酪氨酸激酶拮抗剂主要为小分子喹啉类化合物，能够竞争性抑制ATP与EGFR胞内酪氨酸激酶结构域的结合，进而影响酪氨酸残基磷酸化，抑制EGFR下游的信号转导。EGFR单克隆抗体是与内源性配体竞争结合EGFR，通过抑制酪氨酸激酶的激活、促进EGFR内化等作用产生抗肿瘤效应，包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)等。下面介绍一下3种已经上市的抗EGFR单克隆抗体，与其他化疗药相比，这些抗体作用特异性强，副作用小，在临床上取得了较好的疗效。
Cetuximab(Erbitux)是2004年2月FDA批准上市的抗EGFR人/鼠嵌合单克隆抗体。Erbitux由鼠抗EGFR抗体的Fv区与人IGg1重链和κ轻链恒定区构成，分子量约为152kD。Erbitux与放疗结合用于治疗局部区域性早期头颈部鳞状细胞癌，与伊立替康合用治疗EGFR阳性、伊立替康化疗无效的转移性结直肠癌。Erbitux特异性地与肿瘤细胞膜表面EGFR结合，竞争性抑制EGF和TGF-α等配体与EGFR的结合。虽然Erbitux在体内抗肿瘤效应的机制并不明确，但体外分析和动物体内试验表明，Erbitux与EGFR结合阻断磷酸化和与受体相关激酶的激活，从而抑制细胞生长，诱导凋亡，减少基质金属蛋白酶和血管上皮生长因子的产生[Ciardiello F，TortoraG.A novel approach in the treatment of cancer：targeting the epidermal growthfactor receptor.Clin Cancer Res，2001；7：2958-2970]。Erbitux还可以使细胞膜表面的EGFR内化，表达量下调[Kim ES，Khuri FR，Herbst RS，et al.Epidermal growth factor receptor biology.Cur Opin Oncol，2001；13：506-513]；增强肿瘤细胞对伊立替康等化疗药物和放疗的敏感性，抗肿瘤效果比单独化疗或放疗有所增强[Baselga J，Trigo JM，Bourhis J，et al.Phase IImulticenter study of the antiepidermal growth factor receptor monoclonalantibody cetuximab in combination with platinum based chemotherapy inpatients with platinum refractory metastatic and/or recurrent squamous cellcarcinoma of the head and neck.J Clin Oncol，2005；23：5568-5577]。
Panitumumab(VEXTIBIX)是一种由XenoMouse技术生产的完全人源IgG2抗EGFR单克隆抗体，无鼠源性[Yang XD，Jia XC，Corvalan JR，et al.Development of ABX EGF，a fully human anti EGF receptor monoclonalantibody for cancer therapy.Crit Rev Oncol Hematol，2001；38：17-23]。Panitumumab于2006年9月被FDA批准上市，与氟嘧啶、奥沙利铂和伊立替康合用或在化疗后用于治疗EGFR阳性的转移性直结肠癌。与其他抗EGFR抗体一样，panitumumab的作用机制也是通过阻断EGF和TGF-α与肿瘤细胞上EGFR的结合，诱导EGFR的内化，进而消除EGFR介导的细胞效应。在动物体内试验中，与其他抗EGFR抗体和治疗方法相比，只给予panitumumab的动物在8个月后大部分都未出现肿瘤复发[Ciardiello F，Caputo R，Bianco R，et al.Antitumor effect and potentiation of cytotoxic drugsactivity in human cancer cells by ZD 1839(Iressa)，an epidermal growth factorreceptor selective tyrosine kinase inhibitor.Clin Cancer Res，2000；6：2053-2063]。有研究表明，无论是高表达或低表达EGFR的肿瘤，panitumumab都能够有抑制其生长。皮疹通常是临床应用panitumumab最常见的不良反应，皮疹的发生率与panitumumab的剂量有关[Foon KA，Yang XD，Weiner LM，et al.Preclinical and clinical evaluations of ABX EGF，a fullyhuman anti epidermal growth factor receptor antibody.Int J Radiat Oncol BiolPhys，2004；58：984-990]。患者中还出现轻微的虚弱、腹泻、恶心等症状，但与剂量无关。与人鼠嵌合单抗cetuximab和其他EGFR靶向小分子药物不同的是，即使在高剂量2.5mg/(kg·wk)，完全人源的panitumumab没有出现过敏性不良反应和人抗人抗体。
Nimotuzomab(泰欣生)通用名为重组人源抗人表皮生长因子受体单克隆抗体，2006年4月获SFDA批准，是我国第一个人源单克隆抗体药物，与放疗联合用于治疗EGFR阳性的III/IV鼻咽癌。Nimotuzomab属于IgG1亚型，分子量为150kD，是通过基因工程技术将鼠单克隆抗体(ioregf/r3)的互补决定区移植到人抗体骨架构成的抗EGFR单克隆抗体[Crombet T，Osorio M，Cruz T，et al.Use of the humanized antiepidermal growth factorreceptor monoclonal antibody hr3in combination with radiotherapy in thetreatment of locally advanced head and neck cancer patients.J Clin Oncol，2004；22：1646-1654]。Nimotuzomab具有与EGFR结合的高亲和力(Kd＝10-9mol/L)，体内外实验证明nimotuzomab有抗细胞增殖和抗血管生成作用，并且能够促进细胞调亡，阻滞细胞周期停留在G1/S期[CrombetRamos T，Rak J，Perez R，et al.Antiproliferative，antiangiogenic andproapoptotic activity of hR3：A humanized anti EGFR antibody.Int J Cancer，2002；101：567-575]。用99mTc标记研究的nimotuzomab其在人体内的分布时发现，nimotuzomab在肝脏、心、肾、膀胱和脾有蓄积，其中肝脏的蓄积最显著。除肾、膀胱和胃肠道外，各个器官对nimotuzomab的摄取量随着时间的延长而降低，这是因为肾、膀胱和胃肠道是nimotuzomab的排泄器官。肿瘤对nimotuzomab的清除小于其他正常组织对nimotuzomab的清除，而肿瘤对nimotuzomab的摄取量相对于其他器官较恒定[Crombet T，TorresL，Neninger E.et al.Pharmacological evaluation of humanized anti epidermalgrowth factor receptor，monoclonal antibody hr3，in patients with advancedepithelial derived cancer.J Immunother，2003；26：139-148]，这说明nimotuzomab对肿瘤的靶向性强，在肿瘤部位能达到高浓度产生抑制肿瘤的效应。一项nimotuzomab与化疗联合应用的I/II期临床研究评价了nimotuzomab的安全性和临床疗效。24位患者16.7％有完全反应，20.8％病情稳定。所有患者的生存时间的平均值和中位数分别为16.76和14.77个月。值得一提的是nimotuzomab对儿童和青少年神经胶质瘤也有一定疗效，而且没有严重的毒副作用[Bode U，Buchen S，et al.Results ofa phase II trial ofhR3 monoclonal antibody(nimotuzumab)in the treatment of resistant orrelapsed high grade gliomas in children and adolescents.J Clin Oncol，2006；24(18S)：1522]。I/II期临床研究中nimotuzomab的一般副作用为轻中度发烧、低血压、振颤、肌肉酸痛和头痛。和临床其他抗EGFR抗体不同的是，应用nimotuzomab很少出现皮疹、皮炎等皮肤毒性。
Cetuximab、panitumumab和nimotuzomab这3种抗EGFR单克隆抗体具有靶向性强、毒副作用相对较小的特点。这些单克隆抗体与放化疗结合在临床上用于治疗EGFR阳性肿瘤已经取得了一定的疗效，为肿瘤患者带来了新的曙光。目前在我国抗EGFR单克隆抗体的临床应用还不够广泛，费用也相对较高。抗EGFR单克隆抗体未能单独用于肿瘤的治疗，还需要与放疗或化疗联合应用；而且在临床用于治疗肿瘤的类型也较少，这些在一定程度上限制了抗EGFR单克隆抗体在临床上的使用。
本发明即基于上面的研究背景，利用EGFR特殊的结构特征、EGFR胞外区与功能性抗体Erbitux相互作用空间构象及特定结构域特征，通过计算机虚拟筛选及分子设计方案设计新型抗EGFR人源抗体TGM10，并通过免疫学实验以及细胞生物学实验对其功能进行验证。
发明内容
本发明基于计算机辅助分子设计，并通过分子生物学全合成方法获得了一种新型抗EGFR人源抗体TGM10。
本发明公开的抗EGFR抗体TGM10是基于EGFR结构域、EGFR与功能性抗体相互作用空间构象以及理化特征利用计算机辅助设计获得的新型人源抗体。
本发明公开了一种新型抗EGFR人源抗体的基因序列，其特征在于具有如序列表所述的序列。所述EGFR人源抗体TGM10的重链可变区基因序列选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3之一；轻链可变区的基因序列选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6之一。
本发明公开了一种载体，包含EGFR人源抗体TGM10的重链可变区基因序列选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3之一，轻链可变区的基因序列为SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6之一。
本发明公开的抗体TGM10的一个特征是所述抗体能特异性识别靶抗原EGFR，抗体TGM10在免疫印迹实验中能够与目的蛋白发生特异性结合，表明所述9种抗体均可以应用于与抗原EGFR相关的诊断试剂的生产过程中。
本发明公开了EGFR人源抗体TGM10-1可以与表达靶抗原阳性细胞表面EGFR特异性结合；同时公开了TGM10-1可以应用于不当增殖相关疾病的药物的生产，所述抗体TGM10-1可以有效地抑制以及杀伤EGFR阳性的肿瘤细胞。
本发明公开的抗体的一个特征是所述抗体TGM10-1的细胞生物学功能良好，且明显优于对照抗体Erbitux。
所述抗体TGM10-1具有明显抑制细胞pAKT磷酸化水平的作用，TGM10-1对EGFR阳性的乳腺癌细胞系SKOV3、肝癌细胞系HepG2及肺癌细胞系A549的AKT磷酸化水平有明显的抑制，其抑制活性高于对照抗体Erbitux。
所述抗体TGM10-1可以大大降低了肿瘤细胞迁移能力。TGM10-1可以有效抑制SKVO3，HepG2以及A549等肿瘤细胞的迁移，其效果明显优于对照抗体Erbitux。
所述抗体TGM10-1能特异性地抑制EGFR阳性的SKVO3，HepG2以及A549增殖，其抑制能力高于对照抗体Erbitux。
所述抗体TGM10-1可以特异性介导ADCC功能，杀伤EGFR阳性的SKVO3，HepG2以及A549三种靶细胞，并且抗体TGM10-1的杀伤活性较对照Erbitux有显著的提高。
本发明公开了新型抗EGFR人源抗体TGM10的制备方法。
具体实施过程如下：
1)利用计算机辅助分子设计获得的人源抗EGFR抗体；
2)利用全合成PCR技术合成抗EGFR抗体基因；
3)抗体的表达及鉴定；
4)抗EGFR抗体生物学活性鉴定。
下面参照上述步骤详细描述抗EGFR人源抗体的设计及制备过程。设计及制备本发明抗体的方法仅仅是说明相关方法，并非是限制性的；也可以采用其他已知的方法，或者采用修改的方法。
1)利用计算机辅助分子设计获得的人源抗EGFR抗体
根据EGFR胞外区结构域功能表位的特征，利用计算机虚拟筛选及计算机辅助分子设计方法设计拮抗EGFR功能的短肽(长度为10～15)，并将获得的一系列功能短肽作为抗体可变区的CDR区储备；借助源自TrEMBL、SwissProt、Kabat、IMGT等蛋白质数据库提供的抗体序列构建的人源抗体序列信息数据库；通过同源模建、力学优化技术将人源抗体序列信息数据库中人源抗体可变区框架与前面储备的CDR进行合理拼接构建合理的抗体可变区。
2)利用全合成PCR技术合成抗EGFR抗体基因；
根据获得的抗体序列，选择在哺乳动物细胞中常用的密码子进行反向翻译，获得相应的抗体基因。利用基因全合成PCR技术，设计相应的引物，通过重叠PCR的方法获得全长基因；克隆入克隆载体，进行序列测定。
5)抗体的表达及鉴定
a)抗体的表达：将抗体基因构建至真核表达载体中，通过脂质体转染、电转等方法瞬时转染真核表达细胞，培养足够长时候后收获上清，其中含有表达的目的抗体。
b)双夹心酶联免疫吸附实验(ELISA)：以合适的抗体包被后作为捕获抗体，经过封闭后，加入待测样品以及标准样品进行捕获反应；随后利用合适的酶标二抗进行显色反应，测定样品中目的蛋白的含量。
c)SDS-PAGE：依据目的蛋白的大小配制合适浓度的聚丙烯酰胺凝胶，根据实验需要制备还原电泳样品或非还原电泳样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白；经过考马斯亮蓝染色后，确定目的蛋白分子量。
6)抗EGFR抗体生物学活性鉴定
a)AKT磷酸化水平测定：将EGFR阳性细胞培养在培养皿，加入不同浓度的抗体后培养24小时，以人IgG作为对照。收集细胞，M2缓冲液(20mMTris、250mM NaCl、3mM EDTA、3mM EGTA、0.5％NP40，pH7.6)裂解，4℃，12000rpm离心15min；取裂解上清进行Western Blotting实验，检测AKT和磷酸化AKT的水平。
b)流式细胞分析：收集目的细胞；缓冲液(PBS+2％胎牛血清)洗涤后，加入一抗，4℃反应30mins；缓冲液洗涤2次，加入相应的二抗，4℃避光反应30mins，缓冲液洗涤2次后重悬在鞘液中直接进行流式细胞分析或者以1％的多聚甲醛固定，4℃避光保存。
c)抑制生长实验：以EGFR阳性细胞作为靶细胞，加入不同浓度的抗体作用于靶细胞，设立阴性对照、阳性对照及实验组；作用24h后，以MTT法测定抗体对靶细胞生长抑制活性。
d)划痕实验：将EGFR阳性细胞培养在培养皿或平板上，待细胞融合后用细胞刮在中央区域画一条线，这条线内的细胞被机械力去除掉了，然后将细胞继续培养，观察细胞向无细胞的划痕区域迁移的情况，来判断细胞的迁移能力。设置阴性对照、阳性对照以及实验组。实验结束后去除上清，生理盐水洗涤，甲醇固定30min；流水轻轻洗涤，加入姬姆萨染液染色30min；倒置显微镜拍照。
e)抗体依赖的细胞毒试验(ADCC)：标记EGFR阳性细胞作为靶细胞，用淋巴细胞分离液从外周血中分离出外周血单个核细胞作为效应细胞；根据相应比例混合后，加入不等量的抗体，于圆底96孔培养板上进行杀伤实验，设立实验孔、靶细胞自发释放孔、最大释放孔及背景孔；37℃孵育2h。利用多功能酶标仪进行检测，计算杀伤率。
附图说明
图1真核表达获得的TGM10抗体SDS-PAGE。随机配对组合计算机辅助设计获得的抗体轻重链可变区基因进行真核表达，获得的9个抗体分子量均为155KDa；1～9表示9个抗体，M表示分子量标准品。
图2TGM10抗体特异性被羊抗人IgG识别。随机配对组合计算机辅助设计获得的抗体轻重链可变区基因获得的9个抗体均可被羊抗人IgG识别；1～9表示9个抗体；IgG表示人IgG，和Erbitux一起作为阳性对照。
图3TGM10抗体特异性识别靶抗原。以EGFR阳性细胞裂解液进行WesternBlottig检测，随机配对组合计算机辅助设计获得的抗体轻重链可变区基因获得的9个抗体均可识别分子量为185KDa的靶抗原；1～9表示9个抗体，Erbitux作为阳性对照。
图4抗体降低EGFR阳性细胞SKOV3、HepG2及A549种AKT磷酸化水平。其中1表示人IgG作为control对照；2表示Erbitux 10μg/mL；3表示Erbitux 50μg/mL；4表示TGM10-110μg/mL；5表示TGM10-150μg/mL.
图5抗体抑制EGFR阳性细胞SKOV3、HepG2及A549迁移能力。10μg/mL的抗体TGM10-1或Erbitux作用三种细胞后，进行细胞划痕实验。
图6抗体体外抑制EGFR阳性细胞增殖。A：抗体抑制SKOV3细胞增殖，B；抗体抑制HepG2细胞增殖，C：抗体抑制A549细胞增殖。
图7抗体体外介导ADCC效应杀伤EGFR阳性细胞。A：抗体介导ADCC效应杀伤SKOV3细胞，B；抗体介导ADCC效应杀伤HepG2细胞，C：抗体介导ADCC效应杀伤A549细胞。
实施例一、计算机辅助分子设计获得的人源抗EGFR抗体
一、材料：
InsightII 2005程序包(MSI分子模拟，San Diego)，该程序包包括：
Homology同源模建；
Discover力学优化；
Discover_3常温动力学模拟；
Docking分子对接；
Delphi表观静电势能分析。
Ludi分子设计程序(1995)；
IBM图形工作站；
PDB 2008数据库(网络www.rcsb.org下载)；
SwissProt数据库(2008，网络下载)；
Kabat数据库(2001，网络下载)；
IMGT数据库(2008，网络下载)。
二、方法结果：
利用确定的EGFR胞外区功能表位的结构特征，通过Ludi程序经片段生长方法设计能够识别该特征表位的短肽序列；利用从头搭建与二级结构预测连用模拟拮抗短肽的空间构象。
借助源自网络数据库PDB、SwissProt、TrEMBL、Kabat、IMGT获得的抗体序列信息构成的人源抗体可变区框架结构数据库，与上述拮抗短肽合理组合拼接构成新型人源抗体可变区。利用设计的抗体可变区序列经同源模建技术搭建其空间构象。
利用分子对接方法构建抗体可变区与抗原EGFR相互作用的复合物结构。在考虑溶剂效应的前提下，通过常温动力学模拟获得抗体与抗原相互作用的复合物模型，通过相互作用能确定能够作用于抗原EGFR的抗体可变区结构。进一步优化获得的新型人源抗体可变区氨基酸序列，最终获得3条靶向EGFR的重链氨基酸序列(SEQ_ID NO：1、SEQ_ID NO：2、SEQ_ID NO：3)以及3条轻链可变区氨基酸序列(SEQ_ID NO：4、SEQ_ID NO：5和SEQ_ID NO：6)。
实施例二、抗EGFR人源抗体TGM10的表达和鉴定
一、材料：
引物设计软件为biosun软件，引物由上海英骏生物技术有限公司合成；Pyrobest DNA polymerase为TAKARA公司产品；dNTP为TAKARA公司产品；pGEM-T Easy vector system为Invitrogen公司产品；T4DNA连接酶为NEB公司产品；基因测序由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成；抗体真核表达载体pTGS-FRT-DHFR由本公司构建并申请国家专利(专利授权号：ZL200510064335.0)；脂质体、MTT为Invitrogen公司产品，羊抗人IgG、及辣根酶标记的羊抗人IgG及人IgG为本公司制备；内切酶为NEB公司产品；其他试剂为市购产品。
二、方法结果
1.EGFR抗体基因的合成
根据计算机模拟获得的抗体基因序列，包括重链可变区的基因序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3，轻链可变区的基因序列SEQID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。选择在哺乳动物细胞中使用频率较高的密码子，将计算机设计筛选获得的抗体轻重链可变区氨基酸序列反向翻译，获得抗体的可变区核苷酸序列；根据基因全合成的原理，利用计算机辅助设计软件，设计引物，考虑引物的二级结构、GC含量等相关参数；采用重叠PCR技术全合成抗体轻重可变区基因。
2.抗体的表达
2.1抗体真核表达载体的构建
选择本公司获得的含有人IgG1抗体恒定区基因的表达载体pTGS-FRT-DHFR(专利授权号：ZL200510064335.0)作为本发明抗体的表达载体。将本实施例步骤1所述获得的3个抗体轻链可变区基因、3个重链可变区基因进行随机配对组合，克隆入pTGS-FRT-DHFR载体中。经过转化等分子生物学常用技术，共获得9个抗体的真核表达载体。
2.2抗体表达
将获得的真核表达载体，通过脂质体介导的方法瞬时转染至CHO细胞，48h后收获上清，通过双夹心ELISA法以及SDS-PAGE等实验分析目的抗体的表达情况。
利用羊抗人IgG以及辣根酶标记的羊抗人IgG进行双夹心ELISA法检测上清中抗体的含量，以未转染上清作为阴性对照，人IgG纯品作为标准品。实验结果显示，将计算机辅助设计获得的抗体轻重链可变区基因随机配对组合表达，收获的上清中具有目的蛋白表达。以非还原的形式进行SDS-PAGE实验，结果显示表达的目的蛋白约为155KDa，符合抗体的分子量(图1)；以辣根酶标记的羊抗人IgG进行Western Blotting检测，表达获得的目的蛋白可以被羊抗人IgG特异性识别，具有人IgG抗体特征(图2)；提示获得的抗体序列经过反向翻译得到的基因在真核细胞中可成功表达，表达获得的蛋白为抗体分子，具有典型的IgG抗体特征。
2.3抗体鉴定
收集EGFR阳性的细胞SKOV3，M2缓冲液裂解细胞后取裂解液进行Western Blotting实验，将计算机辅助设计获得的抗体轻重链可变区基因随机配对组合表达获得的9个抗体作为检测抗体，以辣根酶标记的羊抗人IgG进行检测。实验结果显示，各抗体均可特异性识别靶蛋白，其分子量约为185KDa(图3)，提示，获得的抗体TGM10可以特异性识别靶抗原EGFR。
实施例三、抗EGFR抗体TGM10-1的功能性试验
以重链可变区基因为SEQ ID NO：2，轻链可变区基因为SEQ ID NO：6的EGFR人源抗体TGM10-1为例，进一步验证抗体的生物学功能。
一、材料
乳腺癌细胞系SKVO3，肝癌细胞系HepG2以及肺癌细胞系A549购自ATCC；DELFIA EuTDA细胞毒作用试剂盒为PE公司产品；其他相关试剂参看实施例二。
二、方法结果
1)流式细胞分析TGM10-1与细胞表面EGFR的结合
以EGFR阳性乳腺癌细胞系SKVO3，肝癌细胞系HepG2以及肺癌细胞系A549三种细胞作为靶细胞，检测不同浓度的TGM10-1抗体结合细胞表面EGFR抗原的能力；以Erbitux抗体作为阳性对照。结果显示TGM10-1能特异性识别靶细胞，并且其结合阳性率与对照抗体Erbitux相似(表1)，提示抗体TGM10-1的识别活性与对照抗体Erbitux一致。
表1FACS检测TGM10-1与细胞表面EGFR的结合活性
2)TGM10-1抑制AKT磷酸化水平
将EGFR阳性乳腺癌细胞系SKVO3，肝癌细胞系HepG2以及肺癌细胞系A549三种细胞接种6孔板，加入梯度稀释(10ug/ml、50ug/ml)的Erbitux或TGM10-1作用24h后收集细胞，以M2缓冲液裂解，取上清进行WesternBlotting实验。检测AKT、pAKT、GAPDH表达水平。实验结果表明，GAPDH含量一致时，不同抗体作用后细胞内AKT表达水平相近，而pAKT表达水平呈明显变化；不同浓度的Erbitux或TGM10-1均能有效降低细胞内AKT的磷酸化水平；并且TGM10-1对SKOV3、HepG2及A549三种细胞系pAKT磷酸化水平的抑制作用均优于对照抗体Erbitux，其中在50μg/ml的条件下尤为明显(图4)。
3)细胞划痕定性实验检测TGM10-1的功能
以EGFR阳性乳腺癌细胞系SKVO3，肝癌细胞系HepG2以及肺癌细胞系A549进行细胞划痕实验，设置TGM10-1实验组、Erbitux对照组以及人IgG对照组，浓度为10μg/mL。结果表明，抗体TGM10-1可明显降低了三种肿瘤细胞迁移能力，并且TGM10-1作用三种细胞系后形成的划痕面积显著大于Erbitux作用后形成的划痕面积；提示TGM10-1的抑制效果明显优于Erbitux(图5)。
4)抑制生长实验
以EGFR阳性乳腺癌细胞系SKVO3，肝癌细胞系HepG2以及肺癌细胞系A549三种细胞作为靶细胞，加入不同浓度的抗体作用于靶细胞，设立阴性对照、阳性对照及实验组；以MTT法测定抗体对靶细胞生长抑制活性。结果表明，抗体TGM10-1明显抑制三种细胞的增殖，其抑制活性呈抗体浓度依赖；并且在各浓度下，TGM10-1对三种细胞的抑制活性均优于Erbitux；提示相同浓度下，TGM10-1对EGFR阳性细胞的抑制增殖活性较Erbitux显著提高(图6，A：抗体抑制SKOV3细胞增殖，B；抗体抑制HepG2细胞增殖，C：抗体抑制A549细胞增殖)。
6)抗体依赖的细胞毒试验(ADCC)
以PE公司的DELFIA EuTDA细胞毒作用试剂盒进行ADCC实验，标记EGFR阳性乳腺癌细胞系SKVO3，肝癌细胞系HepG2以及肺癌细胞系A549作为靶细胞，用淋巴细胞分离液从外周血中分离出外周血单个核细胞作为效应细胞；根据相应比例混合后，加入不等量的抗体，于圆底96孔培养板上进行杀伤实验，设立实验孔、靶细胞自发释放孔、最大释放孔及背景孔；37℃孵育2h。利用多功能酶标仪进行检测，计算杀伤率。结果表明，抗体TGM10-1可以有效介导ADCC活性杀伤三种细胞，其活性呈抗体浓度依赖；并且相同浓度下，TGM10-1对三种细胞的杀伤率均高于Erbitux，提示TGM10-1介导ADCC功能杀伤把细胞的活性显著高于Erbitux(图7，A：抗体介导ADCC效应杀伤SKOV3细胞，B；抗体介导ADCC效应杀伤HepG2细胞，C：抗体介导ADCC效应杀伤A549细胞)。
<110>北京天广实生物技术股份有限公司
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<210>1
<211>357
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>
<400>1
caggtgcagc tgaagcagag cggccccggc ctggtgcagc ccagccagag cctgagcatc 60
acctgcaccg tgagcggctt cagcctgacc aactacggcg tgcactgggt gcgccagagc 120
cccggcaagg gcctggagtg gctgggcgtg atctggagcg gcggcaacac cgattacaac 180
acccccttca ccagccgcct gagcatcaac aaggataaca gcaagagcca ggtgttcttc 240
aagatgaaca gcctgcagag caacgatacc gccatctact actgcgcccg cgccctgacc 300
tactacgatt acgagttcgc ctactggggc cagggcaccc tggtcaccgt gagcagc 357
<210>2
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<212>DNA
<213>人工序列
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gaggtgcagc tgcaggagag cggcggcgag ctggtgaagc ccggcgccag cctgagcctg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggca tccactgggt gcgccagcgc 120
cccggcaagg gcctggagtg gatcggcgcc atctggagcg gcggcgccac cgactacaac 180
gagcccttca agagccgctt caccatcacc cgcgacaaca gcagcagcac cgcctacctg 240
cagctcaaca gcctgaccag cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg cggcgccacc 300
tactacgagt acgagttcgc ctactggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcagc 357
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<212>DNA
<213>人工序列
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ggcaccaagc tcgagatcaa g 321
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ggcaccaagc tcgagatcaa g 321
Claims (5)
1.一种抗EGFR抗体TGM10，包括重链可变区、轻链可变区以及其他区域，其特征在于，所述重链可变区由序列SEQ ID NO：2编码，所述轻链可变区由序列SEQ ID NO：6编码。
2.一种载体，包含权利要求1所述抗体可变区编码基因。
3.一种宿主细胞，包含权利要求2所述的载体。
4.权利要求1所述抗体在制备肿瘤诊断或治疗药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤为EGFR过表达肿瘤。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肺癌、乳腺癌或肝癌。
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