CN101029082A - 一种人源化抗egfr单克隆抗体的重组制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种人源化抗EGFR单克隆抗体的重组制备方法，该单克隆抗体可用于抑制表达EGFR的人体肿瘤细胞的生长，其原理为该单克隆抗体与高表达EGFR的肿瘤细胞表面的EGFR结合，以阻止肿瘤细胞增殖所需要的EGF与细胞表面的EGFR结合而产生作用。
Description
技术领域：
本发明涉及一种人源化单克隆抗体的重组制备方法，特别涉及一种利用基因重组技术制备人源化抗EGFR单克隆抗体的生物活性多肽的方法，该单克隆抗体可用于抑制表达EGFR的人体肿瘤细胞的生长，其原理为该单克隆抗体与高表达EGFR的肿瘤细胞表面的EGFR结合，以阻止肿瘤细胞增殖所需要的EGF与细胞表面的EGFR结合而产生作用。
背景技术：
表皮细胞有丝分裂的第一步就是EGF与细胞表面的膜型糖蛋白EGF受体结合而产生的激活作用。(Carpenter，et al.，Epidermal Growth Factor，Annual Review Biochem.，Vol.48，193-216(1979))。
目前已经发现若干类肿瘤细胞高表达EGFR，比如膀胱癌细胞、乳腺癌细胞等表达出比正常细胞高得多的EGF受体。目前已经将EGFR的表达量作为乳腺癌患者预后状况的标志，高表达EGFR的患者往往预后比较差。因此，高表达EGFR已经被学术界认为是多种肿瘤细胞产生的诱发因素。
EGFR是酪氨酸激酶受体家族ErbB的一员。EGFR在肿瘤细胞中介导作用于新细胞质产生的多个系统的信号传递。肿瘤细胞过度表达EGFR预示可以开发EGFR的拮抗剂作为人类肿瘤治疗药物。
HXE225为特异针对EGFR1胞外区的人源化单克隆抗体，用于治疗过度表达EGFR1的人类肿瘤。
本专利提供了一种利用杂交瘤细胞和高密度悬浮培养高效表达人源化抗EGFR单克隆抗体HXE225的制备方法。本专利所提供了一种大规模工业化生产人源化抗EGFR单克隆抗体HXE225的方法，同时建立一种大规模制备不同单克隆抗体的技术平台。
发明内容：
本发明提供一种制备人源化抗EGFR单克隆抗体HXE225的方法，该方法包括以下步骤：
a.人工合成HXE225重链可变区氨基酸编码区相对应的基因；
b.人工合成HXE225轻链可变区氨基酸编码区相对应的基因；
c.步骤a得到的基因插入载体pCMV2的HindIII-NheI位点，pCMV2含CMV启动子和人免疫球蛋白γ1恒定区编码基因；连接好的质粒DNA转化E.coli XL-1，经过筛选和DNA序列测定确证克隆正确，重组质粒命名为pCMV-ch225-HC；
d.步骤b得到的基因插入载体pGSK的HindIII-BsiW1位点，pGSK载体含CMV启动子和人免疫球蛋白κ链恒定区以及谷氨酸合成酶编码基因；连接好的质粒DNA转化E.coli XL-1，经过筛选和DNA序列测定确证克隆正确，重组质粒命名为pGS-ch225-LC；
e.将pCMV-ch225-HC质粒DNA经BglII-BamH1双酶切分离出含CMV启动子和人免疫球蛋白γ1恒定区编码基因片段；所得片段插入pGS-ch225-LC的BamH1位点，转化E.coli XL-1，经PCR和DNA策序确证克隆正确，构建成功pGS-ch225-LH。
f.pGS-ch225-LH重组质粒通过电穿孔法转染鼠杂交骨髓瘤细胞NSO，用选择培养基在96孔板筛选阳性细胞克隆；
g.用ELISA法筛选高表达的细胞克隆；
h.表达单克隆抗体HXE225的NSO细胞亚克隆；
i.所筛选的高表达细胞株的驯化和大规模悬浮培养；
j.纯化单克隆抗体HXE225及活性测定；
其中a、b所述人工合成人角质细胞生长因子氨基酸编码区相对应的基因是现有技术，可以通过现有技术获得，如人工合成的方法。
步骤c、d中所述pCMV2、pGSK可以通过分子生物学技术构建或购买商业化表达载体。
本发明优选的HXE225重链可变区氨基酸编码区相对应的基因的编码DNA序列见序列表1和3。
本发明优选的HXE225轻链可变区氨基酸编码区相对应的基因的编码DNA序列见序列表1和3。
本发明的制备方法，其特征在于，其中所述悬浮培养是将合格的重组HXE225的工程细胞株接种到细胞培养罐中培养。
所述悬浮培养的特征在于所用的培养基为无血清蛋白化学成分培养基，培养基可以购买商业培养基(如Gibco的CD-Hybridoma medium或JRH的无血清培养基)或由生产厂家按照细胞培养的原理进行配制。
本发明的制备方法，其中所述提取层析纯化步骤(1)包括离心收集上清液；(2)离心上清液通过超滤将上清液浓缩；(3)将浓缩后的上清液上ProteinA亲和层析、SP-Sepharose FF、Q-Sepharose FF，获得95％以上纯度的HXE225。
本发明是根据HXE225一级结构的轻链可变区、重链可变区氨基酸编码序列(该序列可按照遗传密码的通用性、简并性和遗传密码使用的偏好性原则进行改变)，人工合成轻链DNA全序列。本发明的主要特点在于，分别将该编码基因片段克隆入适宜表达载体，(优选的如：pCMV2、pGSK，可以从市场上买到或自行构建)中构建形成重组质粒，然后将重组质粒转染适宜的细胞株，优选的如：NSO、CHO(可以从市场上买到)，经筛选得到的具有高表达能力的工程细胞株。该工程细胞株经过悬浮培养，所表达的融合蛋白经过适宜的步骤分离纯化后获得高纯度的HXE225。经过N-末端氨基酸序列测定、质谱分子量测定、等电点测定、肽图分析以及生物活性检测等分析，结果表明我们所表达的HXE225与理论完全一致。
本发明使用的分子克隆方法的基本原理，以及操作步骤中所使用的原料，溶剂，工具属于现有技术领域，如DNA的合成方法，酶切位点的选择等，本发明使用的表达载体，宿主菌等都为商业化载体或菌种。
以上方法的具体操作步骤可以见本发明的实施例。
本发明的优点主要表现在于高效表达HXE225，每升培养液可获得400mg的HXE225纯品。
附图说明：
图1 pCMV2质粒图谱和多克隆位点及序列
图2 pGSK质粒图谱和多克隆位点及序列
图3重组质粒的构建示意图
图3-1Construction of pCMV-HXE225 HC
图3-2Construction of pGS-HXE225 LC
图3-3Construction of pGS-HXE225 L-H
图3-4HXE225 expression vector
图4 HXE225纯化过程电泳图谱
序列1人源化抗EGFR单克隆抗体HXE225的轻链可变区DNA序列
序列2人源化抗EGFR单克隆抗体HXE225的轻链可变区氨基酸序列
序列3人源化抗EGFR单克隆抗体HXE225的轻链DNA序列
序列4人源化抗EGFR单克隆抗体HXE225的轻链氨基酸序列
序列5人源化抗EGFR单克隆抗体HXE225的重链可变区DNA序列
序列6人源化抗EGFR单克隆抗体HXE225的重链可变区氨基酸序列
序列7人源化抗EGFR单克隆抗体HXE225的重链DNA序列
序列8人源化抗EGFR单克隆抗体HXE225的重链氨基酸序列
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1 工程细胞株的构建及筛选
1.表达载体
选用表达载体如pCMV2、pGSK作为表达载体，pCMV2含CMV启动子和人免疫球蛋白γ1恒定区编码基因；(见图1)。
表达载体pGSK含CMV启动子和人免疫球蛋白κ链恒定区以及谷氨酸合成酶编码基因。(见图2)
2、基因的设计和合成：根据HXE225的一级结构编码序列，合成HXE225的轻链和重链可变区的编码DNA序列。见序列表1、2、3、4。
3.HXE225轻链可变区基因插入载体pCMV2的HindIII-NheI位点，pCMV2含CMV启动子和人免疫球蛋白γ1恒定区编码基因；连接好的质粒DNA转化E.coli XL-1，经过筛选和DNA序列测定确证克隆正确，重组质粒命名为pCMV-ch225-HC；
HXE225重链可变区基因插入载体pGSK的HindIII-BsiW1位点，pGSK载体含CMV启动子和人免疫球蛋白κ链恒定区以及谷氨酸合成酶编码基因；连接好的质粒DNA转化E.coli XL-1，经过筛选和DNA序列测定确证克隆正确，重组质粒命名为pGS-ch225-LC；
将pCMV-ch225-HC质粒DNA经BglII-BamH1双酶切分离出含CMV启动子和人免疫球蛋白γ1恒定区编码基因片段；所得片段插入pGS-ch225-LC的BamH1位点，转化E.coli XL-1，经PCR和DNA策序确证克隆正确，构建成功pGS-ch225-LH。构建图谱见图3
4.将构建成功的重组质粒pGS-ch225-LH转染NSO细胞，筛选高表达的工程细胞株，并对所筛选的细胞株进行亚克隆，获得的最终细胞株命名为NSO225。
实施例2 悬浮培养
1.将贴壁培养的种子细胞液，接种到细胞培养罐，培养基为CD-Hybridoma media或其它适宜培养基中)中培养，期间流加浓缩培养液如氨基酸或葡萄糖等；细胞浓度达到2×106/ml，14000g离心30min收集上清液，弃沉淀。
2.收集的上清用截留分子量为50000D的超滤膜进行超滤浓缩。
3.经过浓缩的上清夜上Protein A进行亲和层析，层析平衡缓冲液为20mM PB，pH7.0，上样后经过平衡缓冲液洗脱未结合蛋白，用100mM柠檬酸钠缓冲液，pH3.0洗脱得到初纯的HXE225；
4.初纯的HXE225调整pH到5，上用20mM PB pH5.0缓冲液平衡的SP-Sepharose FF进行离子交换层析，上样后用20mM PB pH5.0缓冲液洗脱到基线，用20mM PB pH7.0，600mM NaCl洗脱样品；
5.SP-离子交换层析所得样品超滤后将缓冲液换为20mM PB pH8.0，上样后用20mM PBpH8.0缓冲液洗脱到基线，然后用20mM PB pH8.0，500mM NaCl洗脱样品。
| OD | Ertibus | 0.2143 | 0.224 | 0.2237 | 0.2043 | 0.1917 | 0.13 | 0.0487 | 0.0117 | 0.0063 | 0.005 |
| OD | Ch225 | 0.2097 | 0.2177 | 0.2247 | 0.214 | 0.1367 | 0.1463 | 0.0837 | 0.0377 | 0.0067 | 0.0057 |
| ％ of initial | Ertibus | 100 | 104.5 | 104.4 | 95.3 | 89.5 | 60.7 | 22.7 | 5.5 | 2.9 | 2.3 |
| ％ of initial | Ch225 | 100 | 103.8 | 107.2 | 102.1 | 65.2 | 69.8 | 39.9 | 18 | 3.2 | 2.7 |
| lg(％ of initial) | Ertibus | 2 | 2.0191 | 2.0187 | 1.9791 | 1.9518 | 1.7832 | 1.356 | 0.7404 | 0.4624 | 0.3617 |
| lg(％ of initial) | Ch225 | 2 | 2.0162 | 2.0162 | 2.009 | 1.8142 | 1.8439 | 1.601 | 1.2553 | 0.5051 | 0.4314 |
| Concentration(M/L) | 0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1 | 1.2 | 1.4 | 1.6 | 1.8 | |
| OD | Ertibus | 0.2143 | 0.224 | 0.2237 | 0.2043 | 0.1917 | 0.13 | 0.0487 | 0.0117 | 0.0063 | 0.005 |
| OD | Ch225 | 0.2097 | 0.2177 | 0.2247 | 0.214 | 0.1367 | 0.1463 | 0.0837 | 0.0377 | 0.0067 | 0.0057 |
| ％ of initial | Ertibus | 100 | 104.5 | 104.4 | 95.3 | 89.5 | 60.7 | 22.7 | 5.5 | 2.9 | 2.3 |
| ％ of initial | Ch225 | 100 | 103.8 | 107.2 | 102.1 | 65.2 | 69.8 | 39.9 | 18 | 3.2 | 2.7 |
| lg(％ of initial) | Ertibus | 2 | 2.0191 | 2.0187 | 1.9791 | 1.9518 | 1.7832 | 1.356 | 0.7404 | 0.4624 | 0.3617 |
| lg(％ of initial) | Ch225 | 2 | 2.0162 | 2.0162 | 2.009 | 1.8142 | 1.8439 | 1.601 | 1.2553 | 0.5051 | 0.4314 |
| Concentration(M/L) | 0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1 | 1.2 | 1.4 | 1.6 | 1.8 | |
实施例3 ELISA测定表达量
将ELISA测定板用100ul碳酸盐缓冲液(0.01M Na2CO3，0.035M NaHCO3，pH9.6)稀释的抗人IgG的单克隆抗体在4℃孵育过夜，然后用含0.1％Tween-20的PBS冲洗三遍；从96孔板移取100ul细胞培养上清夜到测定孔中，室温孵育60分钟，然后用含0.1％Tween-20的PBS冲洗三遍，然后加入偶联有horseradish peroxidase的抗人IgG Fc片段的单克隆抗体；室温孵育60分钟，然后用含0.1％ Tween-20的PBS冲洗三遍，显色反应后测定OD405。
实施例4 Ertibux与HXE225抗体相对亲和力测定方法
1.细胞A431以2×104/孔接种96孔板，37℃过夜。PBS洗三次。
2.丙酮/乙醇1∶1固定10min。PBS洗二次。
3.加10ug/ml，每孔100ul一抗，37℃，2h，PBST洗三次。分别加入0.1MPB，PH6.0配制的NH4SCN每孔100ul从0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8M/L，每稀释度2-3/孔。室温15min，PBST洗三次。
4.加二抗(mouse anti HIgG Fc-HRP)加底物，显色测定。
Concen.(M/L) Ertibus Ch225
0 2 2
0.2 2.0191 2.0162
0.4 2.0187 2.0162
0.6 1.9791 2.009
0.8 1.9518 1.8142
1 1.7832 1.8439
1.2 1.356 1.601
1.4 0.7404 1.2553
1.6 0.4624 0.5051
1.8 0.3617 0.4314
2 0.1139 0.3802
结果：Ch225 1.5M/L，Ertibux 1.4M/L
实施例5 HXE225抗体流式细胞测定
流式细胞测定(FCM)方法：将A431细胞复苏培养在10％NBS DMEM培养基中，待细胞长起传代到一定数目时，消化细胞制备细胞悬液，计数。取5×106个细胞用预冷的PBS洗2次，1000转离心5分钟。加入3ml2％的溶入PBS的BSA，置4℃30分钟。1000转离心5分钟，用预冷的PBS洗2次，每次加洗液2ml。1000转离心5分钟，加样品20ug，置4℃反应1小时，用预冷的PBS洗2次。加FITC标记的二抗2ul，置4℃30分钟，用预冷的PBS洗2次，1000转离心5分钟，加400ulPBS，FCM检测。
序列表
序列1 人源化抗EGFR单克隆抗体HXE225的轻链可变区DNA序列(1-66编码信号肽)
ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCTTGCTAATCAGTGCCTCAGTTGCAATGTCC 60
AGAGGAGACATCCAGCTGACCCAGTCTCCAGTCATCCTGTCTGTGAGTCCAGGAGAAAGA 120
GTCAGTTTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATTGGCACAAACATACACTGGTATCAGCAA 180
AGAACAAATGGTTCTCCAAGGCTTCTCATAAAGTATGCTTCTGAGTCTATCTCTGGGATC 240
CCTTCCAGGTTTAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACTCTTAGCATCAACAGTGTG 300
GAGTCTGAAGATATTGCAGATTATTATTGTCAACAAAATAATAACTGGCCAACCACGTTC 360
GGTGCTGGGACCAAGCTGGAGATCAAA 380
序列2
人源化抗EGFR单克隆抗体HXE225的轻链可变区氨基酸序列(1-22为信号肽序列)
5 10 15
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala
20 25 30
Ser Val Ala Met Ser Arg Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro
35 40 45
Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys
50 55 60
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln
65 70 75
Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu
80 85 90
Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
95 100 105
Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile
110 115 120
Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr Phe
125
Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
序列3 人源化抗EGFR单克隆抗体HXE225的轻链DNA序列
ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCTTGCTAATCAGTGCCTCAGTTGCAATGTCC 60
AGAGGAGACATCCAGCTGACCCAGTCTCCAGTCATCCTGTCTGTGAGTCCAGGAGAAAGA 120
GTCAGTTTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATTGGCACAAACATACACTGGTATCAGCAA 180
AGAACAAATGGTTCTCCAAGGCTTCTCATAAAGTATGCTTCTGAGTCTATCTCTGGGATC 240
CCTTCCAGGTTTAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACTCTTAGCATCAACAGTGTG 300
GAGTCTGAAGATATTGCAGATTATTATTGTCAACAAAATAATAACTGGCCAACCACGTTC 360
GGTGCTGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTC 420
CCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAAC 480
TTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAAC 540
TCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACC 600
CTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCAT 660
CAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA 710
序列4 人源化抗EGFR单克隆抗体HXE225的轻链氨基酸序列
5 10 15
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala
20 25 30
Ser Val Ala Met Ser Arg Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro
35 40 45
Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys
50 55 60
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln
65 70 75
Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu
80 85 90
Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
95 100 105
Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile
110 115 120
Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Ash Asn Trp Pro Thr Thr Phe
125 130 135
Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
140 145 150
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
155 160 165
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
170 175 180
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
185 190 195
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
200 205 210
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
215 220 225
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
230 235
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys ***
序列5
人源化抗EGFR单克隆抗体HXE225的重链可变区DNA序列(1-57编码信号肽)
ATGGACTTTGGGCTCAGCTTCATTTTCCTTGCCCTTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTCAG 60
GTACAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTAGTGCAGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACC 120
TGCACAGTCTCTGGTTTCTCATTAACTAACTATGGTGTACACTGGGTTCGCCAGTCTCCA 180
GGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTGATATGGAGTGGTGGAAACACAGACTATAATACA 240
CCTTTCACATCCAGACTGAGCATCAACAAGGACAATTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTTAAA 300
ATGAACAGTCTGCAATCTAATGACACAGCCATATATTACTGTGCCAGAGCCCTCACCTAC 360
TATGATTACGAGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTTTCCTCT 410
序列6
人源化抗EGFR单克隆抗体HXE225的重链可变区氨基酸序列(1-19为信号肽序列)
5 10 15
Met Asp Phe Gly Leu Ser Phe Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys
20 25 30
Gly Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu
35 40 45
Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly
50 55 60
Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro
65 70 75
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn
80 85 90
Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys
95 100 105
Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln
110 115 120
Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr
125 130 135
Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
138
Val Ser Ser
序列7 人源化抗EGFR单克隆抗体HXE225的重链DNA序列
ATGGACTTTGGGCTCAGCTTCATTTTCCTTGCCCTTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTCAG 60
GTACAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTAGTGCAGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACC 120
TGCACAGTCTCTGGTTTCTCATTAACTAACTATGGTGTACACTGGGTTCGCCAGTCTCCA 180
GGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTGATATGGAGTGGTGGAAACACAGACTATAATACA 240
CCTTTCACATCCAGACTGAGCATCAACAAGGACAATTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTTAAA 300
ATGAACAGTCTGCAATCTAATGACACAGCCATATATTACTGTGCCAGAGCCCTCACCTAC 360
TATGATTACGAGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTTTCCTCTGCTAGC 420
ACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACA 480
GCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAAC 540
TCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTC 600
TACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATC 660
TGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGCAGAGCCCAAATCT 720
TGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCA 780
GTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTC 840
ACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTG 900
GACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACG 960
TACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTAC 1020
AAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCC 1080
AAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCTCGGGATGAGCTGACC 1140
AAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTG 1200
GAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGAC 1260
TCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAG 1320
GGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAG 1380
AGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAATGA 1400
序列8 人源化抗EGFR单克隆抗体HXE225的重链氨基酸序列
5 10 15
Met Asp Phe Gly Leu Ser Phe Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys
20 25 30
Gly Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu
35 40 45
Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly
50 55 60
Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro
65 70 75
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn
80 85 90
Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys
95 100 105
Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln
110 115 120
Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr
125 130 135
Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
140 145 150
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
155 160 165
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
170 175 180
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
185 190 195
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
200 205 210
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
215 220 225
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
230 235 240
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser
245 250 255
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
260 265 270
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
275 280 285
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
290 295 300
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
305 310 315
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
320 325 330
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
335 340 345
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
350 355 360
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
365 370 375
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
380 385 390
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
395 400 405
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
410 415 420
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
425 430 435
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
440 445 450
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
455 460 465
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
468
Pro Gly Lys***
Claims (10)
1.一种重组制备人源化抗EGFR单克隆抗体HXE225的方法；其特征在于，将人工合成的编码HXE225单克隆抗体轻链可变区、重链可边区的基因片段克隆到适宜的表达载体构建重组质粒，将重组质粒转染宿主细胞构建表达HXE225单克隆抗体的工程细胞株。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述重链可变区、轻链可边区的基因优选但不限于序列1、2所标示序列。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述的表达载体优选但不限于pGSK。
4.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述细胞株优选但不限于NSO细胞株。
5.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述方法为分步构建轻链和重链的完整编码DNA序列。
6.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述重链构建为将合成的轻链可变区编码DNA序列插入pCMV2中，与其上的轻链恒定区构成完整重链编码序列HXE225-HC，所形成的质粒称为pCMV-ch225-HC。
7.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述轻链构建为将合成的轻链可变区编码DNA序列插入pGSK中，与其上的轻链恒定区构成完整重链编码序列HXE225-LC，所形成的质粒称为pGS-ch225-LC。
8.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述重组质粒为将权利要求7所述的HXE225-HC及其上游的CMV启动子用限制性内切酶切割、分离纯化后插入权利要求8所述的pGS-ch225-LC的合适位点构建成功pGS-ch225-LH。
9.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述pGS-ch225-LH转染NSO细胞构建表达HXE225单克隆抗体的工程细胞株。
10.权利要求2所述轻链、重链可变区DNA序列优选但不限于序列1、5所述。
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Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101875697A (zh) * | 2010-04-15 | 2010-11-03 | 北京天广实生物技术股份有限公司 | 新型抗egfr人源抗体tgm10的设计及其应用 |
| CN102153648A (zh) * | 2011-01-27 | 2011-08-17 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 一种抗egfr人源化抗体l4-h3及其编码基因与应用 |
| CN102153647A (zh) * | 2011-01-27 | 2011-08-17 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 一种抗egfr人源化抗体l3-h3及其编码基因与应用 |
| CN102153649A (zh) * | 2011-01-27 | 2011-08-17 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 一种抗egfr人源化抗体l1-h3及其编码基因与应用 |
| CN102167743A (zh) * | 2010-02-25 | 2011-08-31 | 百迈博药业有限公司 | 一种全人源抗egfr单克隆抗体、其制备方法及用途 |
| CN101875696B (zh) * | 2009-11-11 | 2012-02-08 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 一种抗体及其制备方法与应用 |
| WO2014075576A1 (zh) * | 2012-11-16 | 2014-05-22 | 上海赛伦生物技术有限公司 | 人源抗人表皮生长因子受体抗体及其编码基因与应用 |
| CN105601743A (zh) * | 2016-02-01 | 2016-05-25 | 苏州普罗达生物科技有限公司 | 一种抗vegfr2的单链抗体及其应用 |
| CN111875704A (zh) * | 2020-06-23 | 2020-11-03 | 白先宏 | 一种egfr抗体及其应用 |
| WO2024213106A1 (zh) * | 2023-04-13 | 2024-10-17 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 特异性结合egfr和muc1的抗原结合分子、其药物偶联物及其医药用途 |
-
2006
- 2006-03-03 CN CN 200610057985 patent/CN101029082A/zh active Pending
Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101875696B (zh) * | 2009-11-11 | 2012-02-08 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 一种抗体及其制备方法与应用 |
| CN102167743B (zh) * | 2010-02-25 | 2014-05-14 | 上海百迈博制药有限公司 | 一种全人源抗egfr单克隆抗体、其制备方法及用途 |
| CN102167743A (zh) * | 2010-02-25 | 2011-08-31 | 百迈博药业有限公司 | 一种全人源抗egfr单克隆抗体、其制备方法及用途 |
| CN101875697B (zh) * | 2010-04-15 | 2014-04-30 | 北京天广实生物技术股份有限公司 | 新型抗egfr人源抗体tgm10的设计及其应用 |
| CN101875697A (zh) * | 2010-04-15 | 2010-11-03 | 北京天广实生物技术股份有限公司 | 新型抗egfr人源抗体tgm10的设计及其应用 |
| CN102153647B (zh) * | 2011-01-27 | 2012-07-04 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 一种抗egfr人源化抗体l3-h3及其编码基因与应用 |
| CN102153649A (zh) * | 2011-01-27 | 2011-08-17 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 一种抗egfr人源化抗体l1-h3及其编码基因与应用 |
| CN102153647A (zh) * | 2011-01-27 | 2011-08-17 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 一种抗egfr人源化抗体l3-h3及其编码基因与应用 |
| CN102153648A (zh) * | 2011-01-27 | 2011-08-17 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 一种抗egfr人源化抗体l4-h3及其编码基因与应用 |
| WO2014075576A1 (zh) * | 2012-11-16 | 2014-05-22 | 上海赛伦生物技术有限公司 | 人源抗人表皮生长因子受体抗体及其编码基因与应用 |
| US9840561B2 (en) | 2012-11-16 | 2017-12-12 | Shanghai Saiyuan Bio-Technology Co., Ltd. | Human anti-human epidermal growth factor receptor antibody and encoding gene and application thereof |
| CN105601743A (zh) * | 2016-02-01 | 2016-05-25 | 苏州普罗达生物科技有限公司 | 一种抗vegfr2的单链抗体及其应用 |
| CN111875704A (zh) * | 2020-06-23 | 2020-11-03 | 白先宏 | 一种egfr抗体及其应用 |
| CN111875704B (zh) * | 2020-06-23 | 2024-01-12 | 白先宏 | 一种egfr抗体及其应用 |
| WO2024213106A1 (zh) * | 2023-04-13 | 2024-10-17 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 特异性结合egfr和muc1的抗原结合分子、其药物偶联物及其医药用途 |
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