CN1238381C

CN1238381C - 抗肿瘤表面抗原p185单抗嵌合抗体及其制备方法

Info

Publication number: CN1238381C
Application number: CN 200310106256
Authority: CN
Inventors: 刘兢; 程联胜
Original assignee: University of Science and Technology of China USTC
Current assignee: Hefei Vast Ke Maibo Bioisystech Co Ltd
Priority date: 2003-11-08
Filing date: 2003-11-08
Publication date: 2006-01-25
Anticipated expiration: 2023-11-08
Also published as: CN1613873A

Abstract

本发明针对肿瘤表面抗原p185的单链抗体-人scFv-Fc嵌合抗体及其制备方法，特征是采用表面表位包埋法免疫后制备的杂交瘤细胞株，以单链嵌合抗体基因的形式转染哺乳动物细胞CHO，采用pEE14作为重组抗体的载体，用它携带基因转染到GS低表达的哺乳动物细胞CHO中，将高表达重组抗体的CHO细胞株筛选出来；本发明的嵌合抗体分子仅由两条相同的重组单链组成，每条重组单链有一的抗原结合区，由重链和轻链可变区共价连接在一起，构成了识别抗原的单链抗体；由于去除了轻链恒定区和重链恒定区的CH1结构域，比完整抗体的分子量小了近三分之一，既更容易透过血管系屏障渗透进实体瘤的内部，又不像小的蛋白多肽药物那样容易很快被降解，从而能更好地发挥抑制肿瘤生长的作用。

Description

抗肿瘤表面抗原p185单抗嵌合抗体及其制备方法

技术领域：

本发明属于抗肿瘤表面抗原p185单链抗体-人抗体恒定区(scFv-Fc)嵌合抗体技术领域，特别是涉及单克隆抗体基因的克隆，抗体可变区基因重组及与人抗体恒定区基因连接构建成工程化抗体，以及将含有工程抗体的真核表达载体转化哺乳动物—中国仓鼠卵巢细胞株CHO，从而筛选出可用于制备嵌合抗体的细胞株的方法。

背景技术：

据美国《自然》杂志医学分刊(Nat Med，2003，9：129-134)报道，单克隆抗体技术已经被成功地用于构建针对某种特定抗原的杂交瘤，并在许多疾病的诊断和治疗上发挥了巨大作用。但是，由于目前所有单克隆抗体都是鼠源抗体，应用于人体时会产生人抗鼠抗体(HAMA)反应，所以不能直接用于人体内疾病治疗，要达到临床药物使用要求就必须对单克隆抗体进行人源化改造，以减少和消除鼠源蛋白的免疫原性。

p185是由癌基因neu/erbB-2/Her-2编码的一种重要的肿瘤细胞表面跨膜糖蛋白，中国发明专利CN1118568C中指出，按美国《科学》杂志(Science，1989，244：707-712)报道的免疫病理组织化学标准，有25-30％的乳腺癌和卵巢癌病人肿瘤组织的细胞出现p185过量表达或高表达，在前列腺、肺、胃、肝等十余种癌症中也一定比例的病人有p185蛋白高表达现象，该类病人肿瘤恶性程度高、预后差。

《美国国家科学学术进展》(Proc Natl Acad Sci USA，1986，83：9129-9133)报道了宾州大学医学院的格林(Greene I Mark)教授实验室发现针对鼠erbB-2/neu的单克隆抗体能抑制移植入裸鼠体内的neu转化NIH3T3细胞产生的肿瘤的生长，第一次提示了单抗对鼠p185高表达肿瘤有潜在的临床应用价值。美国《分子与细胞生物学》(Mol CellBiol，1989，9：1165-1172)报道，尤利奇(Ullrich A)等受到这一启示，制备了一株针对人erbB-2/HER-2的单克隆抗体mAb4D5，它能够特异性地抑制过表达erbB-2/HER2基因的人乳腺癌肿瘤细胞系的生长。《美国国家科学院院报》(Proc Natl Acad Sci USA，1992，89：4285-4289)报道，加州旧金山分校和基因技术(Genentech)公司为了消除鼠源单克隆抗体mAb4D5应用于人体时引起的人抗鼠反应(HAMA反应)，将鼠源单抗mAb4D5进行了人源化的改造，即将分子中的抗原结合区(loop区)移植到人抗体IgG1可变区的骨架FR上，经过改造的全人源化的mAb4D5抗体，命名为赫赛汀(Herceptin)，又名曲妥珠(Trastuzumab)。1998年9月，美国健康和人类服务部(HHS)在美国食品和药品管理局(FDA)的网站(http：//www.fda.gov/bbs/topics/NEWS/NEW00655.html)上发布了题为“新的单克隆抗体已被批准用于治疗进行性乳腺癌”的新闻，宣布Herceptin做为世界上第一个抗p185抗体药物已被批准面向市场公开销售。

目前用于单克隆抗体人源化改造的方法有很多：

其一，如Herceptin研制中所用的方法，见《美国国家科学院院报》(Proc Natl AcadSci USA，1992，89：4285-4289)，即以人抗体分子为基本分子骨架，经过基因操作，将欲改造的鼠抗体分子可变区中结合抗原的区域(即loop区)与人抗体分子的loop区部分交换，从而产生了全人源化的工程抗体。这种全人源化的抗体分子与鼠抗体分子一样，是完整的抗体分子，但仅保留了1/6的鼠源分子部分，其余部分用结构与之最接近的人抗体分子替换，其免疫原性降到了最低限。但是，这种改造涉及到鼠抗体分子中与抗原直接结合的可变区部分，往往会影响抗体与抗原的亲和力，为此，在人鼠抗体分子的loop区部分完成交换后，还要对分子的亲和力进行改造，方可获得具临床应用价值的工程抗体，因此手续十分繁杂；而且，全抗体分子有两条重链和两条轻链，只有将重链和轻链分别转染在哺乳动物细胞中才可能正确表达，因此需耗费很长时间和大量财力、物力，使获得的抗体药物价格十分昂贵。

其二，见《美国国家科学院院报》(Proc Natl Acad Sci USA，1984，81：6851-6855)和美国《自然》杂志生物技术分刊(Nature.Biotechnol，1998，16：535-539)报道的构建嵌合抗体的方法：即将鼠源抗体分子中识别抗原的重链和轻链可变区部分分别与人抗体分子中的重链和轻链恒定区部分通过基因技术连接起来，即在鼠源抗体的基础上将鼠抗体恒定区基因替换为人抗体恒定区基因，构建出既能识别靶抗原又可减少鼠源蛋白的免疫原性的嵌合抗体。该方法构建的嵌合抗体分子仍然是完整的抗体分子，它完全保留了鼠源抗体分子中识别抗原的可变区部分，因此其抗原结合部分的一级结构和空间结构仍然与鼠源抗体相同，同时它的恒定区换成了人抗体恒定区，因此它也像全人源化的工程抗体一样，拥有人抗体所有的免疫学杀伤效应。美国《血液》杂志(Blood，1999，94：88a)报道，由于这种嵌合抗体分子中保留了1/3的鼠源部分，其免疫原性降低了2/3，所以可以应用于人体治疗，但由于分子中还有1/3为鼠源性，用于长期临床治疗还可能发生HAMA反应。

其三，是制备抗体片段的衍生物，如：

1、美国《癌症研究》(Cancer Res，1992，52：6310-6317)报道了一种单链抗体衍生物—免疫毒素标记单链抗体分子，它是将针对p185的单链抗体(scFv)与一段截短了的细胞毒素Pseudomonas exotoxin A(ETA)融合，构建了免疫分子—毒素融合蛋白(scFv-ETA)即免疫毒素，随后美国《癌症研究》(Cancer Res，1998，58：2661-2666)报道，经免疫毒素处理后移植入小鼠体内的肿瘤细胞的生长数量和大小都明显减少，这种单链抗体只有全抗体分子的1/6，可用大肠杆菌系统表达，表达量比哺乳动物细胞要高的多。但不足的是，单链抗体及其衍生物只有一个抗原结合部位，即为单价，且因分子小，体内代谢速度快，所以其抗肿瘤的效率受到很大影响。

2、双价或双特异性抗体：据《英国癌症杂志》(Br J Cancer，1998，77：1405-1412)报道，阿丹木斯(Adams GP)等构建了一种双价抗体(diabody)，在p185高表达的肿瘤生成小鼠实验中证实了它比完整抗体分子更佳的体内体外靶向特性；美国《分子免疫学》(Mol Immunol，1999，3：433-445)报道，麦考尔(McCall AM)等构建了一种双特异性抗体，它具有既识别p185又识别人抗体恒定区Fc段受体的双特异识别性质。这类抗体是把两个识别不同抗原的单链抗体通过合适的一段基因连接起来，也是用大肠杆菌系统表达，形成的抗体比单链抗体分子大一倍，而且有两个抗原结合区，但在它们的制备过程中，要克隆两种抗体的可变区基因，这意味要先制备两种杂交瘤细胞株，表达时还要构建两种单链抗体的载体，增加了许多步骤，工作量和费用都大大提高。

其四，是构建其它新型嵌合抗体：美国《免疫学方法杂志》(J Immunol Methods，2001，251：123-135)报道了一种将鼠抗p185单链抗体scFv与人IgG1的Fc融合，构建成一种新型scFv-Fc嵌合抗体的方法，并在甲醇酵母中进行了表达，由于甲醇酵母的表达量与大肠杆菌表达系统相当，而糖基化功能比大肠杆菌表达系统要好的多，但与哺乳动物细胞的糖基化形式还是有较大差别，这很可能会影响到所表达的抗体的免疫原性，造成人体对此抗体的排斥效应，影响抗体药物的功能；另据《生物化学与生物物理学报》(2003，35：371-374)报道，北京军事医学科学院沈倍奋实验室也构建了单链抗体与人Fc片段的融合抗体分子并转染到哺乳动物细胞中，使用二氢叶酸还原酶(DHFR)筛选体系筛选出可高表达融合抗体分子的细胞株，并初步检测了它分泌的抗体的活性，但未见其构建方法及表达系统的详细阐述，也未见有任何相应的专利报道。

所以，目前拥有专利的针对p185的抗体类药物仅有美国Genentech公司的Herceptin一种，它是一个全人化完整结构的抗体分子。至于单链抗体与人Fc嵌合形式抗体则仅有一个实验室在甲醇酵母中进行表达研究的报道，关于此类分子至今未见有专利或任何文献公开。

中国《免疫学杂志》(2000.16：539-543)提出了一种采用表面表位包埋法(SEM)免疫后制备抗p185单克隆抗体杂交瘤细胞株的方法，用该方法制备的单抗对p185高表达的肿瘤细胞有良好的膜定位，且显示了对p185高表达细胞生长的特性性抑制效应，但尚未见任何有关用表面表位包埋法获得的单克隆抗体进行人源化改造的报导。

发明内容：

本发明的目的是提供一种针对肿瘤表面抗原p185的单链抗体-人scFv-Fc嵌合抗体及其制备方法。

本发明的抗肿瘤表面抗原p185单链抗体-人scFv-Fc嵌合抗体，分子中包括两个由单链抗体组成的两个抗原结合区和两条人抗体IgG1分子恒定区通过三对二硫键连接在一起的Fc片段；

其特征在于：

1)该嵌合抗体分子仅由两条相同的重组单链组成，每条重组单链有一个抗原结合区，它是由重链和轻链可变区共价连接在一起，构成识别抗原的单链抗体，命名为A21scFv；

2)该单链抗体A21scFv的氨基酸序列为：

V_L

D I V L T Q T P S S L P V S V G E K V T

M T C K S S Q T L L Y S N N Q K N Y L A

W Y Q Q K P G Q S P K L L I S W A F T R

K S G V P D R F T G S G S G T D F T L T

I G S V K A E D L A V Y Y C Q Q Y S N Y

Linker

P W T F G G G T K L E I K R G G G G S G

V_H

G G G S G G G G S G G G G S E V Q L Q Q

S G P E V V K T G A S V K I S C K A S G

Y S F T G Y F I N W V K K N S G K S P E

W I G H I S S S Y A T S T Y N Q K F K N

K A A F T V D T S S S T A F M Q L N S L

T S E D S A V Y Y C V R S G N Y E E Y A

M D Y W G Q G T S V T V S S

其中的黑体部分为重链和轻链的抗原结合区，下划线部分为重链和轻链可变区之间的连接区(linker)；

3)每条单链scFv片段与人抗体IgG1的Fc片段之间是共价连接构成了一条scFv-Fc嵌合单链，嵌合单链中scFv与Fc的连接区有一段称作绞链区(hinge)的肽段部分，含有三对共价的链间二硫键，即这个分子是由两条嵌合单链通过三对链间二硫键连接组成的同二聚体的嵌合抗体分子。

本发明的抗肿瘤表面抗原p185单链抗体-人scFv-Fc嵌合抗体的制备方法，包括利用反转录和聚合酶链反应(RT-PCR技术)，从可分泌抗体的杂交瘤细胞中分别扩增抗体的重链和轻链可变区基因，然后将重链和轻链可变区基因通过一段寡核苷酸(linker)连接起来构建成单链抗体(scFv)基因，将单链抗体基因与人免疫球蛋白IgG1的恒定区片段Fc的基因连接起来形成一条重组的单链抗体基因scFv-Fc，并克隆到含谷氨酰胺合成酶GS基因的pEE14载体质粒DNA中，再转染到哺乳动物细胞，通过不断增加培养细胞体系中甲硫氨酸硫氧化胺(methionine sulfoximine MSX)的浓度，筛选出能高表达抗肿瘤表面抗原p185单链抗体-人scFv-Fc嵌合抗体的细胞株；

其特征在于：

1)用来获得抗肿瘤表面抗原p185抗体基因的杂交瘤细胞株是采用表面表位包埋法(SEM)免疫后制备的杂交瘤细胞株，即：将表面高表达P185的T6-17细胞(转p185/erbB2基因的小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞)用BalB/C小鼠抗NIH3T3细胞的抗血清包埋后作为抗原细胞，免疫BalB/C小鼠数次，在免疫小鼠血清获得大于1∶10000漓度的特异性抗P185抗体浓度后，按常规杂交瘤细胞制备方法将免疫好的小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合，经选择性培养基培养、筛选，再经ELISA法筛选后，获得的可分泌特异性抗p185蛋白和特异性抑制肿瘤生长的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

2)重组的嵌合抗体是以单链嵌合抗体基因的形式转染哺乳动物细胞CHO，在细胞表达和加工过程中，两条单链之间通过三对二硫键形成了同二聚体形式的嵌合抗体分子，即转染的基因是单链而细胞表达出来的是两条单链共价连接的双链分子；

3)采用pEE14作为重组抗体的载体，这是一种含有谷氨酰胺合成酶(GS)基因的载体，用它携带基因转染到GS低表达的哺乳动物细胞CHO中，用GS筛选系统将高表达重组抗体的CHO细胞株筛选出来。

与现有抗体人化改造技术提供的抗体相比，本发明提供的抗体有如下优点和特异性：

首先，与具有完整抗体结构的全人化抗体如抗体药物Herceptin比，本嵌合抗体识别抗原的两个结构域不像完整抗体那样靠非共价键将重链和轻链可变区连接，而是用肽链将重链和轻链可变区连接起来形成，使重链和轻链可变区变为共价连接，从而大大加强了抗原识别区的稳定性；完整的抗体的分子量约15万道尔顿，这样大的分子药物较难渗入乳腺癌这样的实体瘤内部，影响了药物作用的发挥，据基因技术Genentech公司http：//www.gene.com/gene/products/information/pdf上公布的关于Herceptin施用情况的报导，Herceptin即使对Her2高表达肿瘤病人的治疗有效率也仅有14％，这可能就是与该抗体分子量大有关；而本发明产生的嵌合抗体由于去除了轻链恒定区和重链恒定区的CH1结构域，比完整抗体的分子量小了近三分之一，从药代动力学角度上说其分子量正好合适，既容易透过血管系屏障渗透进实体瘤的内部，又不像小的蛋白多肽药物那样容易很快被降解，从而能更好地发挥抑制肿瘤生长的作用；

与前面所述的“其二”的通常技术制备的一般嵌合抗体相比，本发明的抗体只有一般完整嵌合抗体分子量的2/3，正如上面所述，它更易透过血管系屏障渗透进实体瘤的内部，能更好地发挥抑制肿瘤生长的作用；

与前面所述的“其三”相比，本嵌合抗体不像单链抗体那样，只有一个抗原结合部位，也不像双价抗体那样，虽有两个抗原结合部位但没有抗体的恒定区，只能结合抗原却不能发挥抗体的效应器功能；本嵌合抗体以同二聚体形式存在、因而是有两个抗原结合部位的双价抗体，而且由于该嵌合抗体将鼠源单抗恒定区替换成了人抗体恒定区的Fc片段，使得在“其三”中所述的双价或双功能抗体分子中因不含抗体恒定区而失去的抗体的效应器功能(effector function)如补体介导的细胞毒性(CDCC)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)得到恢复，同时Fc可为人体内的Fc受体(FcR)所识别，从而大大减少了抗体的免疫原性，延长了它在体内的驻留时间(resident time)和用药周期；

本发明的抗体与前面所述的“其四”相比，由于采用的哺乳动物细胞CHO表达系统，在表达出来的抗体的糖基化形式上比用酵母系统更接近人类抗体分子的特性，药用更安全和有效。

本发明提供的抗体人源化改造技术与现有抗体改造技术相比有如下优点和特异性：

首先，与全人源化的抗体改造技术如Herceptin所采用的技术相比，有以下特点：

1)它不像全人源化抗体改造技术那样，需分别对轻链和重链进行基因重组改造，即要将鼠抗体轻链和重链可变区基因分别与人轻链和重链恒定区基因重组，先构建成轻链和重链两条嵌合单链，然后将轻链和重链两条嵌合单链可变区中鼠源性框架区进行进一步的人源化基因替换，然后将人源化改造后的轻链和重链两条嵌合单链分别转染到真核表达系统中表达，最后对表达的全抗体的轻链和重链两条嵌合单链分别进行亲和力的改造，以保证获得的全人源化抗体的亲和力与亲代抗体相一致，这样需耗费很长时间和大量财力、物力，使获得的抗体药物价格十分昂贵；而本发明是将鼠抗体轻链和重链可变区共价连接，形成了能结合抗原的单链抗体scFv，再与人Fc片段直接通过铰链区连接成单链嵌合抗体，然后只要对一条嵌合单链的基因改造、转染，所以无论在构建、表达或改造过程中均只需对一条链进行操作，减少了基因重组操作的工作量，大大节约了时间和费用；

2)与全人源化的完整抗体结构相比，虽然本发明方法中嵌合scFv-Fc抗体为单链形式，但是由于铰链区保留了三对半胱氨酸，所以在哺乳动物细胞内加工时可通过二硫键配对加工成为同二聚体形式的双价抗体，在简化基因重组操作的同时仍然可表达出与具有二价抗原结合特性、亲和力与完整结构的亲代抗体相一致的抗体；

其次，与前面所述的“其二”的通常制备嵌合抗体的技术相比，本发明方法不需将鼠源抗体的轻链和重链可变区与人抗体轻链和重链的恒定区基因分别重组，然后分别转染到真核表达系统表达，它只需对一条链进行操作就可形成具有二价抗原结合特性的嵌合抗体；

与前面所述的“其三”中制备双功能抗体相比，本发明方法不需要先制备两种杂交瘤细胞株，也不需要克隆两种抗体的可变区基因和构建两种单链抗体的载体，只需对一条链进行操作，其操作步骤比双价或双功能抗体的制备要简便的多；

最后，与以上所述的所有的表达系统相比，大肠杆菌系统为原核表达系统，无法像真核表达系统那样对表达的蛋白进行正确地后加工如糖基化作用，与“其四”所述的酵母表达系统(也是一种真核表达系统)相比，酵母的糖基化功能也无法与哺乳动物细胞表达系统相比；进一步比较在哺乳动物细胞的表达系统中，以往大部分哺乳动物细胞特别是CHO表达系统均采用的是二氢叶酸还原酶(DHFR)筛选体系，包括以上所述的“其一”“其二”以及“其四”中用的哺乳动物细胞表达系统均属此类，而本发明选择了谷氨酰胺合成酶(GS)筛选体系，该体系的优势在于往往只要一轮或者两轮扩增，一般约三个月时间，就能获得有效表达重组抗体的细胞株，而与之相比，使用DHFR系统则需要多轮的加压扩增过程，可能要耗费多达六个月的时间，才能获得类似GS系统的表达量；另外，GS系统通常只要更少的外源基因拷贝数就可以达到与DHFR系统相当的重组蛋白表达量，即一般GS系统筛选后的每个细胞有4-10个重组抗体基因拷贝，而DHFR系统则可多达几百个拷贝但却并不明显增加重组蛋白产量，正如美国《生物技术》(Bio/Technology，1993，11：887-893)报道的那样，GS系统积累最终产物的能力是DHFR系统的五倍，本发明筛选出的CHO细胞株就仅有2-4个重组抗体基因拷贝；还有，虽然林沙-瑞利公司(Lonza Press Release)1998年报导，(h ttp：//www.lonza.com/framer5.2.html.)他们已采用GS筛选体系进行了抗体的表达，但他们使用的哺乳动物细胞不是CHO而是NSO，而在抗体基因转染后，挑选阳性克隆的过程中，可贴壁生长的CHO细胞克隆的拣出要比悬浮生长的NSO细胞容易的多，本发明结合了GS筛选体系与CHO细胞表达体系的优点，使筛选过程更容易，表达效果更好。

附图说明：

图1为单链抗体构建流程图。

图2为筛选的三株A21单链抗体阳性菌株周质腔抽提物ELISA分析结果直方图。

图3为嵌合抗体瞬时表达质粒构建流程图。

图4为A21嵌合抗体基因结构示意图。

图5为亲和层析柱纯化后样品的电泳图。

图6为嵌合抗体抗原结合活性ELISA分析结果直方图。

图7为嵌合抗体与两种单抗的竞争性抑制反应曲线。

图8为嵌合抗体的免疫印迹实验结果示意图。

图9为嵌合抗体结构模式图。

图10-13为抗体分子抗原结合活性的细胞片免疫组化染色显微镜观察照片。

图14为MTT法测定A21嵌合抗体的生物学活性结果直方图。

图15-18为经嵌合抗体处理后的乳腺癌细胞显微镜观察照片。

具体实施方式：

实施例1、A21单链抗体(A21ScFv)的构建

单链抗体构建流程如图1所示：从杂交瘤细胞中抽提出总RNA；采用反转录(RT)和聚合酶链扩增反应(PCR)结合的方法，分别获得抗体轻链和重链可变区(VL和VH)的基因，并对克隆的基因序列进行测定；在序列测定的基础上，合成用于构建单链抗体的引物使扩增片段两端加上限制性内切酶位点；通过片段重叠延伸PCR即SOE-PCR方法将重链和轻链可变区通过一个连接肽linker连接起来，重组形成VL-linker-VH形式的单链抗体片段；然后，片段被双酶切回收并且与同样用双酶切处理的名为pCANTAB 5E的载体(phagemid)连接，构建成可表达重组单链抗体的表达质粒；将重组质粒转染大肠杆菌，通过活性检测筛选出单链抗体表达阳性的菌株。

具体实验步骤如下：

1.1杂交瘤细胞总RNA的提取：

1)培养足够数量(10×10⁶以上)的、用细胞表面表位包埋法制备的、可分泌特异性抗p185抗体的杂交瘤细胞A21(可参见《中国免疫学杂志》2000，10：539-546)，按上海维特洁公司生产的总RNA提取试剂盒所述的步骤，提取细胞的总RNA，最终反应产物100微升，取5-10微升，按通常使用的RNA电泳分析方法检测提取的RNA，其余置于-70℃备用。检测合格后进入下一步试验。

1.2反转录-聚合酶链扩增(RT-PCR)：

1.2.1引物设计

a.C端反转录(RT)引物设计：

本发明中的反转录引物的设计没有采用polyT引物，而是根据小鼠抗体恒定区5’端的保守的序列设计引物，这样可以保证能获得完整的可变区C端的cDNA序列。

反转录重链cDNA的引物Cγ设计为：5’GGGGCCAGTGGATAGAC 3’

反转录轻链cDNA的引物Cκ设计为：5’GTTGGTGCAGCATCAGC 3’

这两个反转录引物同时也作为下一步构建单链抗体时PCR扩增反应的C端引物使用。

b.N端简并引物(即不含有信号肽引物)的设计：

由于载体要求基因本身不含信号肽，为了适应这种载体，需设计N端不含信号肽的可变区PCR引物，而由于抗体可变区N端的多样性，在抗体基因序列未知的情况下，本方法设计了几种简并性引物，即：

VH：5’CCG GAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC 3’(下划线处为EcoRI位点)

VC：5’GGA GAATTCATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC 3’

VL：5’AGG GAGCTCGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA 3’(下划线处为SacI位点)

VLC：5’GGT GAGCTCGTTGGTGCAGCATCAGCCCG 3’(其中K＝G/T，M＝A/C，N＝A/T/G/C，R＝A/G，S＝C/G，W＝A/T，Y＝C/T)

T-pseu：5’AGTGTCAGTACATCTGGCTA 3’

其中VH、VC为重链引物，VL、VLC为轻链引物

1.2.2.反转录反应(RT反应物)：

以提取的总RNA为模板，采用1.2.1a中设计的C端反转录引物，按常规方法进行反转录反应，获得50微升产物cDNA，此即为用于抗体基因PCR扩增反应的模板cDNA。

1.2.3PCR扩增反应(注：重链和轻链除引物不同外，反应步骤均相同)

1)在PCR管中混合如下反应物：1微升反转录反应产物，5微升10×pfu Buffer，1微升pfu酶，重链或轻链N端和C端引物各1微升(25微摩尔浓度)，2mM dNTP，补水至50微升，混匀后用石蜡油封顶；

2)PCR仪上将反应程序设为：94℃5分钟变性后，94℃、55℃各1分钟、72℃2分钟进行30轮循环，然后72℃10分钟延伸；

3)取PCR反应物5微升走1％琼脂糖电泳，观察结果：如果重链没有扩增出来，则采用下列措施：换酶为Taq酶，退火温度降为45℃，进行第一轮PCR，如无明显带出现则取2.5微升第一轮PCR反应物进行同样条件的第二轮扩增；

4)回收目的DNA：取余下的所有PCR反应物在琼脂糖凝胶上电泳，观察结果，按海生工公司的凝胶回收试剂盒的方法进行切胶，回收目的DNA条带中的DNA；其中1-2微升继续5)所述的作序列分析，其余回收的DNA待5)的序列分析结果正确后，按1.3所述进行下一步实验。

5)将回收的1-2微升重链或轻链PCR扩增产物分别用其相应的限制性内切酶处理，获得的重链或轻链可变区基因分别与用同样限制性内切酶处理的pGEM-T载体或pBluescript载体DNA作常规的连接反应，将连接的产物转化感受态大肠杆菌Top10细胞，全部菌液铺氨卞青霉素平板，放入37℃过夜培养。随机挑选平板上独立生长的单菌落，转入3ml LB(含氨卞青霉素)培养基中振摇，依照常规分子生物学操作法抽提质粒，经酶切鉴定后，将含有重链或轻链可变区基因的阳性质粒送往上海生工公司测序。

1.3片段重叠延伸PCR(SOE-PCR)搭建单链抗体

根据以上序列测定结果，设计构建单链抗体的引物使扩增片段两端加上限制性内切酶位点；通过片段重叠延伸PCR即SOE-PCR方法将重链和轻链可变区通过一个连接肽linker连接起来，重组形成VL-linker-VH形式的单链抗体片段；

1.3.1引物：

根据以上序列测定结果，设计构建单链抗体的引物使扩增片段两端加上限制性内切酶位点，对进一步扩增A21重链和轻链以及加一段寡核苷酸序列分别设计的引物为：

V_L Back：5’AGCCGGCCGAYATTGTGMTSACCCAAACTCCA 3’

V_L For：5’GGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACC

ACCCCGTTTGATTTCCAGCCTGG 3’

V_H Back：5’GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCGAGGTCCAGCTGCA

GCAGTC 3’

V_H For：5’AGGATTC GCGGCCGCTGACGAGACGGTGACTGAGGT 3’

Sc Back：5’AAGGAA GGCCCAGCCGGCCGAYATTGTG 3’

Sc For：5’AGGATTC GCGGCCGCTG 3’(下划线处为SfiI和NotI位点，其中K＝G/T，M＝A/C，N＝A/T/G/C，R＝A/G，S＝C/G，W＝A/T，Y＝C/T)

(注：Back表示“上游”、For表示”下游”)

1.3.2将重链和轻链加上一段寡核苷酸linker的PCR反应

1)在PCR管中混合如下反应物：1微升模板DNA(即1.2中已克隆入质粒的抗体重链、轻链可变区基因)，5微升10×PCR Buffer，1微升Taq酶，Mg²⁺溶液3微升，上、下游(即Back和For)引物各1微升(25微摩尔浓度)，5微升dNTP，补水至50微升，混匀后用石蜡油封顶；

2)在PCR仪上将反应程序设为：94℃3分钟变性后，94℃、58℃、72℃各1分钟进行30轮循环，然后72℃10分钟延伸；

3)取PCR反应物5微升走1％琼脂糖电泳，观察结果，确定已形成了VL-linker和linker-VH形式的DNA片段，切胶法回收目的DNA条带中的DNA，用于下一步重链和轻链可变区基因连接PCR：

1.3.3.剪切重叠延伸PCR(Splice Overlaping Extend PCR即SOE-PCR)，即重链轻链可变区基因连接的PCR：

4)按以下配方加入各反应物：去离子水73微升，dNTP 10微升，10×pfu Buffer 10微升，上、下游引物各4微升，(注意引物10轮循环后才加入)，模板(上一步PCR所得的重链和轻链)各1微升，pfu酶1微升；

5)第一步反应条件如下：94℃3分钟变性，然后92℃1分钟、72℃3分钟进行10轮循环，之后加入引物(Sc Back、Sc For)；

6)第二步反应条件如下：92℃1分钟、66℃1分钟、72℃2分钟进行30轮循环，随后72℃延伸10分钟；

7)跑电泳，将预计为产物VL-linker-VH的单链抗体片段DNA通过切胶法回收。

1.4分泌型单链抗体的克隆：

使用噬菌体质粒(phagemid)pCANTAB 5E作为单链抗体克隆的载体，单链抗体可在分泌到细菌细胞的周质腔，便于抽提和纯化。具体实验步骤为：

1)对回收的单链抗体DNA片段采用SfiI、NotI双酶切，注意SfiI的酶切温度与NotI不同所以要分别去做，酶切产物切胶回收后与同样双酶切的pCANTAB 5E载体连接，转化大肠杆菌HB2151，通过氨卞青霉素(Amp)板筛选重组子。

2)单菌转入3ml 2×YT-AG(2×YT含100微克/ml氨卞青霉素和2％葡萄糖)中，30℃ 250rpm摇过夜；

3)将全部3ml过夜菌加入30ml 2×YT-AG，30℃ 250rpm摇1小时；

4)1500g离心20分钟，弃去上清；

5)重悬细胞于30ml 2×YT-AI(含1mM的IPTG)，30℃ 250rpm摇3小时；

6)1500g离心20分钟，弃去上清；

7)用0.3ml冰预冷1×TES(0.2MTris·HCl pH8.0，0.5mMEDTA，0.5M蔗糖)悬浮细胞，加0.45ml冰预冷0.2×TES混匀，冰上放30分钟，其间不时摇动；

8)12000g离心10分钟，上清为菌株周质腔抽提物，用于作表达蛋白即单链抗体的检测，将其转入一干净Ep管中，-20℃保存。

1.5酶联免疫分析(ELISA)法对可表达活性蛋白的菌落筛选：

a.T6-17(转p185基因的NIH3T3细胞，其表面高表达p185抗原)和NIH3T3细胞(表面不表达p185抗原)裂解液的制备：

1)T6-17、NIH3T3细胞传代至瓶中长满；

2)吸去上清，PBS洗去血清，对100ml培养瓶加入40微升PMSF、500微升细胞裂解液(50mMTris-HCl(pH7.5)，1％TritonX-100，150mMNaCl)，冰浴30分钟，其间不时摇匀之；

3)吹打瓶底，吸出裂解液至5ml离心管中，13000rpm 4℃离心10分钟；

4)吸上清，即为抗原裂解液，每管50微升分装，放于-70℃保存之。

b.ELISA实验：

1)将鼠源抗体A21作为标准抗体对照，取抗原裂解液倍比稀释多个浓度后100微升/每孔铺板(抗原稀释液为0.05MNaHCO3(pH9.0))，加100微升标准抗体，(0.1微克/ml)，做ELISA反应，摸索一个抗原抗体反应的最适抗原裂解液浓度；

2)取最适浓度抗原裂解液100微升/每孔铺板，4℃放置过夜；

3)取出板平衡至室温，TPBS(PBS加入Tween至0.05％)洗三次；

4)加入TPBS稀释的1％BSA，350微升/每孔，室温下封闭1小时；

5)TPBS洗三次，加入100微升/每孔的待测样品，室温振荡1小时或4℃过夜反应；

6)TPBS洗三次，加入封闭剂稀释的二抗100微升/每孔，室温下振荡反应1小时；

7)TPBS洗三次，按100微升/每孔加入浓度为1微克/微升的OPD底物(OPD Buffer配方：18g Na₂HPO₄，5g柠檬酸，加水至1升)，室温反应15-30分钟；

8)每孔加入100微升1M H₂SO₄终止反应，在ELISA仪上OD490nm测吸收值，上清显示与阳性抗原T6-17细胞裂解物有明显的颜色反应、而与阴性对照NIH3T3细胞裂解物无颜色反应的菌株即为阳性克隆菌株。

1.6单链抗体表达阳性菌株的筛选结果：

a.A21单链抗体表达阳性菌株的筛选结果

对将近100个不同的转染的大肠杆菌挑单菌落进行了诱导表达，然后又分别抽提周质腔分泌物，进行ELISA检测，有三株样品显示了明显的阳性反应，即这三株菌分泌的到周质腔的单链抗体具有特异结合p185抗原的活性。单独取这三株菌株，经常规方法IPTG诱导表达后，再提取周质腔分泌物，进行ELISA法测定，以OD490nm吸收值对样品编号作图，结果如图2，即筛选的三株A21单链抗体阳性菌株周质腔抽提物的酶联免疫分析(ELISA)结果直方图：编号1、2为第一号菌株，编号3、4为第二号菌，编号5、6为第三号菌；编号1、3、5样品用T6-17裂解液测试，编号2、4、6样品用NIH3T3裂解液测试。从图中可见，其中第二号株菌有最强的抗原结合反应，在100微克/ml抗原浓度时吸收峰达到0.75左右，取第二号菌株(命名为pChar)进行序列测定。

b.A21单链抗体的序列测定结果：将菌株pChar中的质粒抽提纯化后，进行了序列测定，获得的基因序列即为A21单链抗体的基因序列，即：

GACATTGTGCTGACCCAAACTCCATCCTCCCTACCTGTGTCAGTTGGAGAGAAGGTT

ACTATGACCTGCAAGTCCAGTCAGACCCTTTTATATAGTAACAATCAAAAGAACTAC

TTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATTTCCTGGGC

ATTCACTAGGAAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAG

ATTTCACTCTCACCATCGGCAGTGTGAAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTC

AGCAATATTCTAACTATCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAGGCTGGAAATCAAA

CGGGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTG

GTGGATCCGAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGGTAGTGAAGACTGGGGC

TTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGTTACTTCATAAAC

TGGGTCAAGAAGAACTCTGGAAAGAGCCCTGAGTGGATTGGACACATTAGTTCTTC

CTATGCTACCTCTACCTACAACCAGAAGTTTAAAAACAAGGCCGCATTTACTGTAGA

CACATCCTCCAGCACAGCCTTCATGCAGCTTAACAGCCTGACATCTGAGGACTCTG

CAGTCTATTATTGTGTTAGAAGTGGTAACTACGAAGAATATGCTATGGACTATTGGGG

TCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCGTCA

由该基因序列推导的A21单链抗体的氨基酸序列为：

V_L

D I V L T Q T P S S L P V S V G E K V T

M T C K S S Q T L L Y S N N Q K N Y L A

W Y Q Q K P G Q S P K L L I S W A F T R

K S G V P D R F T G S G S G T D F T L T

I G S V K A E D L A V Y Y C Q Q Y S N Y

Linker

P W T F G G G T K L E I K R G G G G S G

V_H

G G G S G G G G S G G G G S E V Q L Q Q

S G P E V V K T G A S V K I S C K A S G

Y S F T G Y F I N W V K K N S G K S P E

W I G H I S S S Y A T S T Y N Q K F K N

K A A F T V D T S S S T A F M Q L N S L

T S E D S A V Y Y C V R S G N Y E E Y A

M D Y W G Q G T S V T V S S

其中的黑体部分为重链和轻链的抗原结合区，下划线部分为重链和轻链可变区之间的连接区(linker)。

实施例2、scFv-Fc嵌合抗体分子的构建和表达：

本实施例所述抗肿瘤表面抗原p185单抗嵌合抗体scFv-Fc的构建，是将已经实验证明与p185抗原能特异结合的单链抗体scFv与人抗体IgG1(hu IgG1)的恒定区Fc通过基因操作连接，形成一条重组的单链的抗体融合基因，即嵌合抗体基因scFv-Fc，将基因先克隆到瞬时表达载体pSecTag并转染到瞬时表达细胞COS7中，测定瞬时表达的嵌合抗体蛋白，确定其具有与p185抗原特异结合的活性后，再将融合基因A21scFv-hu IgG1Fc即scFv-Fc基因克隆到含谷氨酰胺合成酶GS基因的pEE14载体质粒DNA中，然后转染哺乳动物细胞CHO，通过不断增加培养细胞体系中甲硫氨酸硫氧化胺(methioninesulfoximine MSX)的浓度，筛选出能高表达抗肿瘤表面抗原p185的单链抗体-人scFv-Fc嵌合抗体的细胞株。

具体实验步骤：

2.1A21嵌合抗体scFv-Fc分子的构建：

2.1.1.引物设计：

pEE14IgG1：5’GGG AAGCTTATGGAGACAGACACACTCCT 3’(下划线处为HindIII位点)

IgHinge B：5’GGG GCGGCCGCAGAGCCCAAATCTTGTGACAAA 3’(下划线处为NotI位点)

IgCH3F：5’GGG GAATTCTCATTTACCCGGAGACAG 3’(下划线处为EcoRI位点，斜体处为中止密码子)

2.1.2.scFv-Fc嵌合抗体基因的构建及克隆：

图3为嵌合抗体基因瞬时表达质粒构建流程图：从已证明可表达具有良好结合抗原活性单链抗体的菌株如实施例1中的pChar中提取质粒DNA，采用双酶SfiI和NotI酶切，从该表达质粒中将单链抗体基因scFv切出来；与此同时，用一对引物IgHinge B和IgCH3F从含有人抗体IgG1基因的质粒中扩增出人抗体Fc片段huIgG1Fc，并且用合适的的双酶切处理；然后，将双酶切的单链抗体scFv和Fc以及瞬时表达载体pSecTag进行三片段连接(linkage)，使前两者连接成为scFv-Fc形式的嵌合抗体分子基因，最后测序确定该基因的序列。由于载体上已经有自带信号肽序列，所以可将此重组质粒DNA转染COS-7细胞，然后检测转染细胞scFv-Fc基因的表达和活性。

基因构建和克隆过程涉及的所有PCR、酶切、连接、转化、测序等反应均在前面实施例1中已经阐述，在此不一一重复。

2.1.3A21嵌合抗体基因结构及序列：

图4给出了A21嵌合抗体基因结构示意图：它表示嵌合抗体基因是由A21单链抗体基因scFv和人抗体IgG1恒定区Fc(Fc即图中的CH2和CH3基因，又称huIgG1Fc片段)两部分组成，两段基因中间靠一段称为hinge的片段连接，它含有三个编码半胱氨酸的密码子序列，这使得scFv-Fc基因在真核细胞表达过程中，在两条嵌合抗体的单链之间可通过半胱氨酸两两配对，形成三对二硫键，从而保证最终表达产物是以同源二聚体形式存在。

该嵌合抗体基因(scFv-Fc)的全基因序列如下：

GACATTGTGCTGACCCAAACTCCATCCTCCCTACCTGTGTCAGTTGGAGAGAAGGTTACTATGAC

CTGCAAGTCCAGTCAGACCCTTTTATATAGTAACAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGC

AGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATTTCCTGGGCATTCACTAGGAAATCTGGGGTCCC

TGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCGGCAGTGTGAAGGCT

GAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTCTAACTATCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCAC

CAGGCTGGAAATCAAACGGGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTC

CGGTGGTGGTGGATCCGAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGGTAGTGAAGACTGGGGC

TTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGTTACTTCATAAACTGGGTCAA

GAAGAACTCTGGAAAGAGCCCTGAGTGGATTGGACACATTAGTTCTTCCTATGCTACCTCTACCT

ACAACCAGAAGTTTAAAAACAAGGCCGCATTTACTGTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTTCAT

GCAGCTTAACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTATTGTGTTAGAAGTGGTAACTACG

AAGAATATGCTATGGACTATTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCGTCA GCGGCCGCAGA

GCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGG

ACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAG

GTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTG

GACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTAC

CGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCA

AGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGC

CCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCA

GCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGG

GCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTC

TATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGA

TGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA

以上基因序列中有下划线的部分即为hinge片段的序列，黑体为编码半胱氨酸的密码子，在hinge片段之前为ScFv的基因，在其之后为Fc的基因。

2.2 A21嵌合抗体的COS-7细胞瞬时转染与表达：

具体步骤为：

1)在一个6孔细胞培养板内，培养COS-7细胞至40-60％密度；

2)在12×75mm灭菌管中制备如下溶液：

A：对每个转化孔，稀释1微克含scFv-Fc基因的瞬时表达重组pSecTag质粒DNA入100微升无血清培养基，

B：对每个转化孔，稀释5微升脂质体lipofectin入100微升无血清培养基，然后室温下放置45分钟；

3)合并A、B液，混匀之，室温放置15分钟；

4)用2ml无血清培养基洗涤6孔板中细胞一次；

5)对每孔加0.8ml无血清培养基入lipofectin-DNA复合物，混匀后倒入细胞内；

6)37℃ CO₂培养箱培养12-18小时后，用2ml正常血清培养基替换含DNA培养基，继续培养48-72小时；

7)吸取瞬时转染COS-7细胞上清，对分泌到上清的表达的嵌合抗体进行结合活性检测，检测方法放在下面的实施例3中说明，检测结果可表明表达的嵌合抗体结合抗原活性好，可以进入下一步稳定转染。

2.3A21嵌合抗体的CHO细胞稳定转染和筛选：

在上一步瞬时转染COS-7细胞、并证明转染细胞表达出的嵌合抗体分子scFv-Fc具有结合抗原活性的基础上，设计新的N端引物，从N端信号肽开始扩增，从而获得N端带有信号肽的scFv-Fc基因；将此重组基因双酶切，然后与同样双酶切的稳定表达载体pEE14进行连接，最终构建成真核稳定表达重组质粒scFv-Fc/pEE14，并转化哺乳动物CHO K1细胞(简称CHO细胞)，通过增加细胞培养基中甲硫氨酸硫氧化胺(methioninesulfoximine MSX)的浓度，筛选出能高表达scFv-Fc嵌合抗体的细胞株。

具体实验步骤如下：

1)转染的前一天，每孔2ml正常DMEM加血清，培养CHO K1细胞于6孔板中至60-70％密度；

2)转染前，在12×75mm灭菌管中制备如下溶液：

A；对每个转化孔，稀释1微克含scFv-Fc基因的重组稳定表达pEE14质粒DNA入100微升vv无血清培养基，

B：对每个转化孔，稀释5微升脂质体(LipofectAMINE 2000)入100微升无血清培养基，然后室温下放置5分钟；

3)合并A、B液，混匀之，室温放置20分钟，倒入细胞培养孔内，温和晃动混匀；

4)转染24小时后，用选择性培养基(不含谷氨酰胺的DMEM)加透析的小牛血清和终浓度至25微摩尔的MSX(methionine sulfoximine)，替换转染时用的培养基，继续培养之；

5)大约4-5天后换一次选择性培养基，这时大部分细胞死亡，继续培养到直至可见的细胞克隆出现，此过程一般需2-3周左右；

6)挑取单个细胞克隆，转移至96孔板中继续用选择性培养基培养，待细胞长满后取上清进行ELISA测定抗体的表达量(方法见2.5)，阳性克隆可以进一步加压(即提高MSX浓度)筛选；

7)对首轮96孔板中筛选获得的阳性克隆转到6孔板培养，先用不含MSX的选择性培养基培养24小时；

8)替换培养基为逐渐增加MSX浓度(终浓度100、250、500、1000微摩尔)的选择性培养基，又会有大部分细胞死亡，继续培养到直至可见的细胞克隆出现，每次克隆细胞均约生长2-3周；如前挑取可见克隆，测定上清表达量后进行下一轮加压筛选；

9)待MSX升至1mM浓度后，不再增加MSX浓度，对长出的克隆进行有限稀释法亚克隆，选择抗体产量最高的细胞株进行扩大化培养。

2.4CHO细胞稳定转染和筛选表达的结果：

经过5轮加压，不断挑取单克隆进行亚克隆和下一轮的筛选过程，最终细胞在高达1mM浓度的MSX中生长，此时检测抗体表达量，并筛选出了约30个高表达量的单克隆细胞株，它们的表达量在10-200微克/ml(累积表达量)不等，最高的达到200微克/ml。我们选取了三株表达量最高且稳定的细胞株，分别命名为Nu3、Oa4、Yg1，作为未来进行规模化扩大培养的种子株。

2.5捕获(capture)ELISA法测定抗体的表达量：

1)用PBS稀释羊抗人Fc多抗(Fizegiald公司产品)至10微克/ml，每孔100微升铺板，室温振荡3小时；

2)加入封闭剂(1％BSA溶于TPBS)350微升/孔，室温放置1小时；

3)TPBS洗三次，加入待测细胞表达上清100微升，室温振荡1小时，注意要将标准人IgG1(Sigma公司产)从0.1微克/ml倍比稀释作为标准含量对照；

4)TPBS洗三次，加入1∶8000稀释的HRP标记羊抗人Fc多抗(Pirece公司产品)100微升，室温振荡1小时；

5)TPBS洗三次，如前所述用OPD底物显色；

6)与标准人IgG对照相对比，找出所测样品对应的人IgG1含量，乘以2/3，即为所测的样品绝对含量。

2.6嵌合抗体的protein-G柱亲和纯化：

1)将稳定转染筛选出的细胞表达上清用0.22微米的滤膜过滤，以除去不溶性颗粒；

2)过滤液采用millipore超滤膜(截留分子量＞10kDa的蛋白)超滤之，浓缩度为10倍；

3)采用分子量3000型透析袋透析样品，用结合缓冲液Binding Buffer(20mMNa3PO4，pH7.0)为透析液；

4)准备好收集过柱样品的Ep管，每个Ep管内加入中和缓冲液(0.1M Tris-HCl，pH9.0)100微升；

5)用10倍柱体积Binding Buffer洗protein-G柱，流速1ml/分钟；

6)将样品过柱，流速同前；

7)用10倍柱体积Binding Buffer洗柱去除未结合蛋白；

8)用10倍柱体积洗脱缓冲液Elution Buffer(0.1M甘氨酸-HCl，pH2.7)洗脱结合的蛋白，用准备好的Ep收集管收集之，注意每管收集900微升洗脱样品；

9)用10倍柱体积Binding Buffer洗去protein-G柱内的Elution Buffer；将柱子保存在20％的乙醇中，4℃放置保存；

10)收集的样品取少量走SDS-PAGE电泳，观察纯化结果，其余全部放-20℃，用于生物活性测定。

2.7protein G亲和层析柱纯化结果：

图5给出了亲和层析柱纯化后样品的电泳图，图中Lane7：过柱后的表达上清；Lane8：过柱前的表达上清；Lane9：亲和柱洗脱样品；Lane10：巯基乙醇处理的亲和柱洗脱样品。

电泳结果表明，CHO细胞表达的上清样品经超滤和过亲和层析柱后，大量牛血清白蛋白被分离出去：过柱前的样品(Lane8)在50kDa处有大量牛血清白蛋白，与过柱后样品(Lane7)相比较，在105kDa处有一条清晰的条带，该条带在纯化的样品(Lane9)中被大量富集，且分子量大小与估算完全一致，另外，加巯基乙醇处理纯化的嵌合抗体，则在约55kDa处出现条带(Lane10)，说明纯化的样品被解链前是以同二聚体结构存在，被巯基乙醇解链成为两个单体，故可以断定，这就是我们表达的嵌合抗体。

实施例3、scFv-Fc嵌合抗体分子的活性鉴定

实验步骤：

3.1嵌合抗体抗原结合活性的ELISA鉴定实验：

该实验与实施例1的1.5中单链抗体的ELISA实验步骤基本相同，所不同的是将二抗变为羊抗人辣根过氧化酶(goat-anti-human HRP)二抗。

3.2嵌合抗体的抗原结合特性ELISA分析结果：

图6给出了嵌合抗体抗原结合活性ELISA分析结果直方图，图中a和b：含A21ScFv-Fc的pSectag重组载体转染COS-7的上清(a的包被抗原是T6-17细胞裂解物，b的包被抗原是NIH/3T3细胞裂解物)；c和d：单独pSectag载体(即不含A21 ScFv-Fc)转染COS-7的上清(c的包被抗原同a，d的包被抗原同b)。由该图结果可以很明显地看出：只有表达的嵌合抗体对含p185抗原的T6-17细胞裂解物有特异的免疫学结合活性，说明scFv-Fc结构能够很好的维持其亲代鼠源单抗A21对p185抗原的特异性抗原结合活性，这个分子设计和构建是成功的。

由于在真核COS-7细胞中能够成功的表达出具有免疫学活性的重组嵌合抗体分子，所以才确定在CHO细胞中建立稳定表达体系。在CHO细胞中表达出来的嵌合抗体经ELISA分析，结果也确与COS-7细胞中表达的结果基本相同。

3.3抗原结合竞争性抑制反应：

该实验是为了进一步验证表达的嵌合抗体是否能保持其亲代鼠源单抗A21相同的特异性抗原结合表位，具体实验步骤为：

1)用最适的抗原浓度包被ELISA，放置于4℃过夜；

2)TPBS洗三次，每孔350微升封闭剂(TPBS配制的1％BSA)封闭1小时；

3)TPBS洗三次，加入100微升连续10倍稀释的待测抗体和最佳浓度的被竞争抗体混合物，振荡反应过夜；

4)TPBS洗三次，加入针对待测抗体的HRP标记二抗100微升反应1小时；

5)再次洗涤后，用OPD如前所述显色，ELISA仪上490nm测吸收；

6)ELISA结果绘制成竞争抑制曲线。

3.4竞争性抑制反应实验结果：

图7为嵌合抗体与两种单抗的竞争性抑制反应曲线图：从竞争性抑制反应曲线上可以看出：鼠源单抗A21对A21嵌合抗体与p185的结合有竞争性抑制作用，随单抗的浓度不同抑制强度有所不同，呈现剂量依赖性趋势；与之对照，另一同样结合p185胞外区的鼠源单克隆抗体A18则对嵌合抗体与抗原的结合没有竞争性抑制反应，即使提高A18浓度，抑制率也未见增加，即A21嵌合抗体ScFv-Fc与鼠源单抗A21有相同的抗原结合表位。

3.5嵌合抗体的免疫印迹实验(western blot实验)：

方法与常规的免疫印迹实验方法基本相同，其中聚丙烯酰胺凝胶采用8％浓度，转膜后二抗为羊抗人HRP标记二抗。

3.6western blot实验鉴定结果：

图8为嵌合抗体的免疫印迹实验结果；图中Lane11：人IgG1对照；Lane 12：纯化后的嵌合抗体；Lane 13：巯基乙醇处理后的纯化抗体。

从western blot的结果可以明显看出，我们表达的嵌合抗体分子量大约在105kDa左右，和估算的相符，而人抗体对照为150kDa。由于用还原性试剂处理后分子量降为55kDa左右，约为嵌合抗体分子量的一半，所以我们可以得出结论，嵌合抗体是一个同二聚体的结构。其结构示意图如图9所示：两个scFv-Fc单体通过铰链区的三对二硫键被共价连接到一起，形成了与IgG1抗体类似的二价抗体结构。

3.7细胞免疫组化实验：

与常规的免疫组化分析方法基本相同。不同之处是用了两组细胞片：一组为T6-17(表面高表达p185，为阳性细胞)和NIH3T3(为阴性细胞)，另外一组为人乳腺癌细胞MCF7(阴性)和SKBR3(阳性)；此外，二抗采用羊抗人HRP标记的二抗。

3.8细胞免疫组化分析结果：

图10-13为嵌合抗体分子抗原结合活性的细胞免疫组化分析照片。图10为T6-17细胞与嵌合抗体反应后染色的结果；图11为NIH3T3细胞与嵌合抗体反应后染色的结果；图12为SKBR3细胞与嵌合抗体反应后染色的结果；图13为MCF7细胞与嵌合抗体反应后染色的结果。

如前所述，T6-17是表面高表达p185的细胞而NIH3T3细胞不是；SKBR3与MCF7细胞则均为人乳腺癌细胞，不同之处是前者表面高表达p185，后者则表达量很低。从这四种细胞的免疫组化照片结果上看，与嵌合抗体反应后，T6-17和SKBR3细胞的细胞膜上都有很明显的染色，而其胞质部分及NIH3T3和MCF7细胞基本上看不到染色，说明嵌合抗体分子是与细胞膜抗原特异结合的。

3.9MTT法测定嵌合抗体对肿瘤细胞生长抑制活性实验：

实验步骤：

1)胰酶消化SKBR3细胞后计数，用1640培养基稀释至2×10⁵个/ml；

2)每孔100微升将细胞加入96孔培养板中，37℃培养24小时；

3)每孔加入不同稀释度的待测嵌合抗体100微升，继续培养48小时；

4)每孔加MTT(用PBS培成5mg/ml)10微升，继续培养4小时；

5)小心吸去上清，每孔加入100微升DMSO，振荡混匀之，在ELISA仪上570nm处测吸收值；

6)按以下公式计算抗体的抑制率：[(不加抗体对照OD-加抗体样品OD)/(不加抗体对照OD-不加MTT样品OD)]×100％。

3.10MTT法测定实验结果：

图14为MTT法测定A21嵌合抗体的肿瘤细胞生长抑制活性结果直方图，(每个样品均不少于5个复孔)，SKBR3和MCF7均为每孔2×10⁴个细胞；其中A：SKBR3不加抗体；B：SKBR3加入抗体至6微克/ml；C/D/E：SKBR3加入抗体至0.7/0.07/0.007微克/ml；G：MCF7不加抗体；H：MCF7加入抗体至6/微克/ml：I/J/K：MCF7加入抗体至0.7/0.07/0.007微克/ml。

利用MTT法，测定不同浓度抗体对SKBR3和MCF7细胞生长抑制活性的作用结果显示：抗体特异性的对SKBR3细胞的生长有明显的影响，而对MCF7的生长则基本无作用。在浓度为0.7微克/ml时，抗体对SKBR3的抑制率为19％，与其鼠源母本单抗A21的结果21％基本相同。当降低抗体的浓度为0.07微克/ml时，抗体的抑制活性下降，到0.007微克/ml时，抗体的抑制活性基本上消失。

3.11长期培养法测嵌合抗体的细胞增殖抑制实验：

1)培养SKBR3和MCF7乳腺癌细胞至对数生长期，胰酶消化；

2)用2×RPMI 1640培养基悬浮细胞，调整细胞浓度为每毫升1×10⁵个，每孔取1ml加入6孔板中；

3)对照孔每孔加入1ml灭菌双蒸水，测试孔每孔加1ml双蒸水稀释的融合抗体(浓度为20微克/ml)，温和混匀之；

4)37℃ CO₂培养箱培养1星期，中间换一次液，每孔替换培养液成份均与被替换液相同；

5)一周后，取出培养皿，在光学显微镜下观察结果并拍摄照片。

3.12长期培养法测嵌合抗体的细胞增殖抑制实验结果：

图15-18为经嵌合抗体处理后的乳腺癌细胞显微镜下观察的照片图，其中图15为未加抗体培养生长的SKBR3细胞；图16为与抗体温育培养一周后的SKBR3细胞；图17为未加抗体培养生长的MCF7细胞；图18为与抗体温育培养一周后的MCF7细胞。

其中图15显示未经抗体处理的SKBR3细胞生长状态良好，细胞密度很高而且形态上看呈梭形；而图16是与抗体一起温育生长的细胞则形状十分不规则，细胞密度明显低于对照，且有大量细胞呈球状聚集成团。与此相对应，MCF7则受抗体的影响不大，图17和图18细胞形状均为米粒状，密度也基本相同。

Claims

1、一种抗肿瘤表面抗原p185单链抗体-人scFv-Fc嵌合抗体，分子中包括两个由单链抗体组成的两个抗原结合区和两条人抗体IgG1分子恒定区通过三对二硫键连接在一起的Fc片段；

其特征在于：

2)该单链抗体A21scFv的氨基酸序列为：

V_L

D I V L T Q T P S S L P V S V G E K V T

M T C K S S Q T L L Y S N N Q K N Y L A

W Y Q Q K P G Q S P K L L I S W A F T R

K S G V P D R F T G S G S G T D F T L T

I G S V K A E D L A V Y Y C Q Q Y S N Y

Linker

P W T F G G G T K L E I K R G G G G S G

V_H

G G G S G G G G S G G G G S E V Q L Q Q

S G P E V V K T G A S V K I S C K A S G

Y S F T G Y F I N W V K K N S G K S P E

W I G H I S S S Y A T S T Y N Q K F K N

K A A F T V D T S S S T A F M Q L N S L

T S E D S A V Y Y C V R S G N Y E E Y A

M D Y W G Q G T S V T V S S

其中的黑体部分为重链和轻链的抗原结合区，下划线部分为重链和轻链可变区之间的连接区；每条单链scFv片段与人抗体IgG1的Fc片段之间是通过肽键共价连接构成了一条scFv-Fc嵌合单链，嵌合单链中scFv与Fc的连接区有一段称作绞链区的肽段部分含有三对共价的链间二硫键；

即这个分子是由两条嵌合单链通过三对链间二硫键连接组成的同二聚体的嵌合抗体分子。

2、权利要求1所述抗肿瘤表面抗原p185单链抗体-人scFv-Fc嵌合抗体的制备方法，包括利用反转录和聚合酶链反应，从可分泌抗体的杂交瘤细胞中分别扩增抗体的重链和轻链可变区基因，然后将重链和轻链可变区基因通过一段寡核苷酸连接起来构建成单链抗体scFv基因，将单链抗体基因与人免疫球蛋白IgG1的恒定区片段Fc的基因连接起来形成一条重组的单链抗体基因scFv-Fc，并克隆到含谷氨酰胺合成酶GS基因的pEE14载体质粒DNA中，再转染到哺乳动物细胞，通过不断增加培养细胞体系中甲硫氨酸硫氧化胺的浓度，筛选出能高表达抗肿瘤表面抗原p185单链抗体-人scFv-Fc嵌合抗体的细胞株；

其特征在于：

1)用来获得抗肿瘤表面抗原p185抗体基因的杂交瘤细胞株是采用表面表位包埋法免疫后制备的杂交瘤细胞株，即：将表面高表达P185的T6-17细胞用BalB/C小鼠抗NIH3T3细胞的抗血清包埋后作为抗原细胞，免疫BalB/C小鼠数次，在免疫小鼠血清获得大于1∶10000滴度的特异性抗P185抗体浓度后，按常规杂交瘤细胞制备方法将免疫好的小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合，经选择性培养基培养、筛选，再经ELISA法筛选后，获得的可分泌特异性抗p185蛋白和特异性抑制肿瘤生长的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

3)采用pEE14作为重组抗体的载体，这是一种含有谷氨酰胺合成酶GS基因的载体，用它携带基因转染到GS低表达的哺乳动物细胞CHO中，用GS筛选系统将高表达重组抗体的CHO细胞株筛选出来。