CN1712533A

CN1712533A - 一种极端嗜盐古菌质粒及其衍生质粒载体

Info

Publication number: CN1712533A
Application number: CN 200410049751
Authority: CN
Inventors: 向华; 孙超岷
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2004-06-25
Filing date: 2004-06-25
Publication date: 2005-12-28
Anticipated expiration: 2024-06-25
Also published as: CN100422333C

Abstract

本发明公开了一种极端嗜盐古菌质粒及其衍生质粒。本发明所提供的极端嗜盐古菌质粒，名称为pSCM201，来源于极端嗜盐古菌AS7094，它具有序列表中序列3的核苷酸序列。pSCM201的衍生质粒包括pSCM204，pSCM206。本发明的极端嗜盐古菌质粒及其衍生质粒将在极端嗜盐古菌的研究和开发中发挥重要作用。

Description

一种极端嗜盐古菌质粒及其衍生质粒载体

技术领域

本发明涉及一种极端嗜盐古菌质粒及其衍生质粒载体。

背景技术

古菌多生长于极端自然环境，被认为是与细菌和真核生物并列的、生命的第三种形式。研究表明，古菌在遗传信息的传递方面(如DNA复制、转录、翻译等)与真核生物相似；而在中央代谢(如产能)方面则与细菌接近。因此，研究古菌不仅对于阐明生命运动的基本规律、揭示生命起源和物种进化等方面的奥秘具有重大意义，而且有助于了解较为复杂的真核生物的一些重要生物学过程。从发展生物技术的角度看，极端环境古菌所产生的极端酶比普通酶更能耐受严酷条件(如高温、酸碱、有机溶剂等)，因而在许多领域具有良好的应用前景。

极端嗜盐古菌(Extremely Halophilic Archaea)的最适生长环境含有2-5M NaCl，是主要的极端嗜盐环境微生物。极端嗜盐古菌在系统进化树中位于古细菌的一个分支Euryarchaeta(广古菌)的顶端，形成一个相对独立的群体(Proc Natl Acad Sci USA1996，93(17)：9188-9193)，与嗜热古菌和产甲烷古菌相比，嗜盐古菌是最容易培养的一个类群。极端嗜盐古菌种类繁多，包括Halobacterium，Halococcus，Haloarcula，Haloferax，Halorubrum，Halobaculum，Halogeome tricum，Haloterrigrna，Halorhabdus，Natrialba，Natronobacterium，Natronococcus，Natronomonas，Natrinema，Natronorubrum，Haloalcalophilium等16个属。其中Halobacterium，Haloferax等为中性极端嗜盐古菌，Natronobacterium，Natronococcus等为极端嗜盐嗜碱古菌。极端嗜盐古菌极具开发前景，如在这类微生物中有大量可供开发的极端酶类，生物活性因子，可降解塑料的前体物质，具有研制生物计算机芯片潜力的细菌视紫红质等。

极端嗜盐古菌的研究和开发需要相应的遗传操作系统，但是目前其遗传操作系统还相当匮乏，中性极端嗜盐古菌中已构建的几个系统(J Bacteriol 1990，172：756-761；J Biol Chem 1992，267：5829-5843)只能用于有限的几个属，这在很大程度上限制了这类重要微生物的理论研究和基因工程开发。因此研发极端嗜盐古菌的新株型的新的遗传操作系统意义重大。极端微生物遗传操作系统不仅是研究极端环境微生物遗传学，以及表达极端酶类和极端微生物生物活性因子的首选系统，而且该系统还具有其它重要特色。极端嗜盐微生物遗传操作系统的构建将为该类极端微生物资源的深度开发，如生物纳米材料紫膜的生物改性，生物可降解塑料前体物PHA的遗传工程等，提供首选的工具系统。

质粒系统是微生物生物遗传操作系统的主要形式。对微生物进行成功的基因转化必须满足以下条件：1)用于转化的基因(DNA)必须能通过诸如电转化，无机离子处理，原生质体融合等物理或化学方法导入该生物体内。2)进入生物体内的外源基因(DNA)必须能被复制(自主复制或者作为宿主基因组的一部分进行复制)。在实际操作中，可通过从欲被转化的宿主中分离其野生型质粒，然后通过基因重组构建复制型质粒载体，外源DNA被克隆到上述质粒载体后就可很好地实现随质粒复制的目的。3)应用一种或几种选择标记，使转化体能从非转化细胞群中被选择出来。

发明内容

本发明的目的是提供一种极端嗜盐古菌质粒。

本发明所提供的极端嗜盐古菌质粒，名称为pSCM201，来源于极端嗜盐古菌AS7094，具有序列表中序列3的核苷酸序列。

经测定，极端嗜盐古菌AS7094的16S rDNA(序列1)与盐盒菌属(Haloarcula sp.)16S rDNA有98％的同源性，其cR序列(序列2)与盐盒菌属(Haloarcula sp.)cR序列具有99％的同源性，可以肯定AS7094为盐盒菌属(Haloarcula sp.)。

序列表中序列3由3463个核苷酸组成。其中，序列3中的自5′端第90-1289位碱基为一个开放阅读框架Orf1，Orf1编码具有序列表中序列4的氨基酸残基序列的反式作用因子Orf1；序列3中的自5′端第1291-1698位碱基为第二个开放阅读框架Orf2，Orf2编码具有序列表中序列5的氨基酸残基序列的反式作用因子Orf2；序列3中的自5′端第1771-2409位碱基为第三个开放阅读框架Orf3，Orf3编码具有序列表中序列6的氨基酸残基序列的反式作用因子Orf3。序列3中的自5′端第1699-1770位碱基，2410-89位碱基，均为质粒的顺式作用元件。

序列表中的序列4是由399个氨基酸残基组成的蛋白质，序列表中的序列5是由135个氨基酸残基组成的蛋白质，序列表中的序列6是由212个氨基酸残基组成的蛋白质。

pSCM201为双链DNA质粒，拓扑学形状是环状，可用来转化嗜盐古菌。极端嗜盐古菌AS7094可在完全培养基上生长，菌落呈圆形，边缘整齐，37℃生长7-10天菌落为红色。

质粒pSCM201的物理图谱如图1所示，其包括的常见限制性内切酶位点有ClaI，Hind III，Nco I等酶切位点各一个，两个Sal I酶切位点。其中，序列3中的自5′端第1-6位碱基为Hind III酶切位点；序列3中的自5′端第656-661位碱基为Cla I酶切位点；序列3的自5′端第3224-3229位碱基为NcoI酶切位点；序列3中的自5′端第1642-1647位碱基和序列1中的白5′端第2221-2226位碱基为两个SalI酶切位点。质粒pSCM201不含Apa I，BamH I，Bgl II，EcoR I，EcoR V，Kpn I，NdeI，Pvu II，Sac II，Sma I，Sph I，Xba I等常见内切酶位点，因此这些内切酶位点可作为pSCM201的衍生载体的多克隆位点。

基于本发明质粒pSCM201构建的表达载体，如pSCM204和pSCM206也属于本发明保护范围。

由于质粒pSCM201能够在嗜盐古菌中自主复制，在保证其提供的复制所需的元件完整的前提下，向其中引入性质明确的其它功能DNA片段，即可构成可转化极端嗜盐古菌的重组载体或衍生质粒载体。

在质粒pSCM201的非编码区引入大肠杆菌质粒复制子及适于在大肠杆菌中筛选的抗性标记基因，在此基础上引入在极端古菌中有效的抗性选择基因，即可构成E.coli-Halobacteria穿梭克隆载体，方便在大肠杆菌中进行基因操作及在极端嗜盐古菌中进行遗传分析和应用研究。如在质粒pSCM201的自5′端第2614至2703位碱基之间引入大肠杆菌质粒复制子ColE1 ori及适于在大肠杆菌中筛选的抗性标记基因Amp^R及多克隆位点，在多克隆位点EcoRI和KpnI之间引入在极端古菌中有效的抗性选择基因Mev^R，即可构成E.coli-Halobacteria穿梭克隆载体pSCM204(其物理图谱如图2所示)。

pSCM204含有来自pSCM201完整的在极端嗜盐古菌中复制所需的复制原点，即通过PCR获得的DNA序列pSCM201 ori；含有在大肠杆菌中复制所需的复制原点，即大肠杆菌质粒复制子ColE1 ori；并含有在大肠杆菌及在极端嗜盐古菌中筛选转化子的抗性选择标记基因Amp^R和Mev^R，以及用于外源基因插入的克隆位点如Kpn I，Pst I，NdeI等。pSCM204是一个有效的E.coli-Halobacteria穿梭克隆载体，可转化大肠杆菌和极端嗜盐古菌，并在其中克隆表达外源基因。对pSCM204在宿主Haloarcula.hispanica中的稳定性实验表明，该穿梭载体在无抗性选择压力存在的条件下生长200代，质粒载体的保持率仍超过98％。pSCM204的高度稳定性为其进一步构建表达载体表达极端嗜盐古菌中有用蛋白质提供了可靠的保障。

在pSCM201的其中两个开放开放阅读框(Orf2、Orf3)内部设计引物将整个质粒扩增出来，然后按pSCM204的构建策略构建相应的克隆载体，用来研究Orf2、Orf3是否是pSCM201复制所必需的。例如采用PCR方法在Orf2的内部设计了一对引物将整个质粒扩增出来然后直接连到pUCm-T载体上，再加上Mev^R构建成pSCM206(其物理图谱如图3所示)，该质粒可以从某些方面研究Orf2的功能。

以穿梭克隆载体(如pSCM204)为基础，在其多克隆位点引入适当的启动子，同时可在启动子下游引入目的基因，转化相应的宿主菌(如Haloarcula.hispanica)，以合适的条件加以诱导得到足够量的目的蛋白。如以pSCM201为基础构建表达载体研究目前在嗜盐古菌中最具应用潜力的紫膜蛋白，也是一个极具吸引力的研究方向。因此，基于pSCM201构建而成各种表达载体均在本专利保护之列。

由本发明的极端嗜盐古菌质粒及其衍生质粒载体转化所得到的微生物也属于本发明的保护范围。

本发明的极端嗜盐古菌质粒及其衍生质粒载体为极端嗜盐古菌的研究和开发提供了工具系统，将在极端嗜盐古菌的研究和开发中发挥重要作用。

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

附图说明

图1为质粒pSCM201的物理图谱

图2为重组载体pSCM204的物理图谱

图3为重组载体pSCM206的物理图谱

具体实施方式

实施例1、获得质粒pSCM201的方法

对67株极端嗜盐古菌进行质粒普查，结果表明在AS7094菌株中含有一小质粒，命名为pSCM201。将pSCM201提取后作酶切实验，发现其含有两个单酶切位点，即HindIII、NcoI。将pSCM201用HindIII酶切后连到作同样酶切的pBluescriptII SK-；NcoI酶切后连到作同样酶切的pUCm-T载体复制形式上进行测序。测序结果表明，质粒pSCM201具有序列表中序列3的核苷酸序列，其中，序列3中的自5′端第90-1289位碱基为一个开放阅读框架Orf1，Orf1编码具有序列表中序列4的氨基酸残基序列的质粒复制所需的反式作用因子；序列3中的自5′端第1291-1698位碱基为第二个开放阅读框架Orf2，Orf2编码具有序列表中序列5的氨基酸残基序列的质粒复制所需的反式作用因子；序列3中的自5′端第1771-2409位碱基为第三个开放阅读框架Orf3，Orf3编码具有序列表中序列6的氨基酸残基序列的质粒复制所需的反式作用因子；序列3中的自5′端第1699-1770位碱基、2410-89位碱基均为顺式作用元件。该质粒还包括各一个Cla I酶切位点(序列1中的自5′端第656-661位碱基)，HindIII(序列1中的自5′端第1-6位碱基)酶切位点，Nco I酶切位点(序列1中的自5′端第3224-3229位碱基)；两个SalI酶切位点(序列1中的自5′端第1642-1647位碱基和序列1中的自5′端第2221-2226位碱基)。

实施例2、以质粒pSCM201为基础的重组载体pSCM204的构建

以pSCM201为模板，以orf4F：CTAGATCTTGCCACCCCTATGACAGC和orf4R：GCCTCGAGTGTGCTATCTGATTCCTT为引物在以下反应体系和循环程序下进行PCR扩增。其中，反应体系：10×PCR buffer 2.5μl，2.5mM dNTP 2μl，2.5mM Mg²⁺ 1.5μl，orf4F(10μM)1μl，orf4R(10μM)1μl，pSCM201 1μl，Taq酶(5U/μl)0.3μl，ddH₂O15.7μl。以上所用PCR反应试剂均购自华美公司。循环程序：94℃3min；94℃1min，57℃1min，72℃3.5min，30个循环；72℃7min。将得到的PCR产物和pUcm-T载体(购自上海生工生物工程公司)直接连接，同时将极端嗜盐菌来源的莫维诺林(mevinolin)抗性基因(Mev^R，J Biol Chem 1992，267：5829-5834)引入连有pSCM201PCR产物的pUcm-T载体的复制形式的多克隆位点区域作为在极端嗜盐古菌中的抗性选择标记基因，得到应用型的E.coli-Halobacteria穿梭克隆载体pSCM204(如图2所示)。Mev^R抗性基因来源于极端嗜盐古菌种比较常用的一个穿梭克隆载体pUBP2(ProcNatl Acad Sci USA 1990，87：6772-6776)。引入方法如下：用EcoRI和KpnI对pUBP2和连有pSCM201 PCR产物的pUcm-T载体的复制形式进行双酶切，然后回收pUBP2酶切产物中Mev^R抗性基因，与双酶切后的连有pSCM201 PCR产物的pUcm-T载体的复制形式进行连接，转化大肠杆菌JM109。将构建好的pSCM204转化与AS7094亲缘关系较近的Haloarcula.hispanica(微生物所菌种保藏中心)，转化采用原生质体转化方法(J.Bacteriol 1987，169：1341-1344)。将得到的转化子转接后提取质粒，测序结果表明转化子的序列是正确的。通过回转大肠杆菌JM109及用回转大肠杆菌JM109所得到的质粒重新转化Haloarcula.hispanica，均能够得到阳性克隆。对pSCM204在Haloarcula.hispanica的稳定性实验表明，该穿梭载体能够在无抗性选择压力存在的条件下存在超过200代而不丢失。稳定性实验方法如下：将在含有莫维诺林(5μg/ml)的液体AS-168培养基(每升中含有5.0g酸水解酪素(Difco)，5.0g酵母抽提物(Difco)，1.0g谷氨酸钠，3.0g柠檬酸钠，200g NaCl，20g MgSO₄.7H₂O，2.0g KCl，0.36g FeCl₂.4H₂O，0.36mg MnCl₂.4H₂O，pH7.2-7.4)中长至对数末期的Haioarcula.hispanica接种至不含莫维诺林的液体AS-168培养基中连续传代培养，每2天转接一次，以每天10代的速率计算，共转接10次。每次将得到的菌体稀释，分别涂布不含和含有莫维诺林(5μg/ml)的固体AS-168培养基，统计得到的菌落数，将含有莫维诺林的固体培养基得到的菌落数除以不含莫维诺林的固体培养基得到的菌落数即可得到pSCM204在Haloarcula.hispanica中的存在率，结果表明pSCM204在不含莫维诺林的培养基中生长200代存在率仍然达到98％，说明该克隆载体是非常稳定的，这位以后基于此构建各种穿梭表达载体奠定了基础。

实施例3、pSCM206的构建及其应用

为了研究Orf2的功能，构建了载体pSCM206(其物理图谱如图4所示)，其具体构建方法如下：采用PCR方法在Orf1的内部设计了一对引物将整个质粒扩增出来然后直接连到pUCm-T载体上，再连上Mev^R构建成pSCM206。PCR引物为orf135dF：TGCCCGCTGTCTGATTCG和orf135dR：CCAGACGGAACCACCATC在以下反应体系和循环程序下进行PCR扩增。反应体系：10×PCR buffer 2.5μl；2.5mM dNTP 2μl；2.5mM Mg²⁺ 1.5μl；orf135dF(10μM)1μl；orf135dR(10μM)1μl；pSCM2011μl；Taq酶(5U/μl)0.3μl；ddH₂O 15.7μl。以上所用PCR反应试剂均购自华美公司。循环程序：94℃3min；94℃1min，54℃1min，72℃3.5min，30个循环；72℃7min。连Mev^R方法同实施例2。将pSCM206采用原生质体转化方法(J.Bacteriol1987，169：1341-1344)转化Haloarcula.hispanica，虽然得到了转化子，但在无莫维诺林选择的条件下，pSCM206远不如pSCM204稳定，表明Orf2对pSCM201的复制虽然不是必需的，但可能在质粒的分配过程中起重要作用。

序列表

<160>6

<210>1

<211>1474

<212>DNA

<213>盐盒菌属(Haloarcula sp.)

<400>1

attccggttg atcctgccgg aggccattgc catcggagtc cgatttagcc atgctagtcg 60

cacgagttca gactcgtggc atatagctca gtaacacgtg gccaaactac cctacagacc 120

gcgataacct cgggaaactg aggccaatag cggatataac tctcaggctg gagtgccgag 180

agttagaaac gttccggcgc tgtaggatgt ggctgcggcc gattaggtag atggtggggt 240

aacggcccac catgccgata atcggtacgg gttgtgagag caagaacccg gagacggtat 300

ctgagacaag ataccgggcc ctacggggcg cagcaggcgc gaaaccttta cactgcacga 360

cagtgcgata gggggactcc gagtgcgagg gcatatagcc ctcgcttttc tgtaccgtaa 420

ggtggtacag gaacaaggac tgggcaagac cggtgccagc cgccgcggta ataccggcag 480

tccaagtgat ggccgatatt attgggccta aagcgtccgt agcttgctgt gtaagtccat 540

tgggaaatcg accagctcaa ctggtcggcg tccggtggaa actacacagc ttggggccga 600

gagactcaac gggtacgtcc ggggtaggag tgaaatcctg taatcctgga cggaccacca 660

atggggaaac cacgttgaga gaccggaccc gacagtgagg gacgaaagcc agggtctcga 720

accggattag atacccgggt agtcctggct gtaaacaatg ctcgctaggt atgtcacgcg 780

ccatgagcac gtgatgtgcc gtagtgaaga cgataagcga gccgcctggg aagtacgtcc 840

gcaaggatga aacttaaagg aattggcggg ggagcaccac aaccggagga gcccgcggtt 900

tcattggact caacgccgga catctcaccg gtcccgacag tagtaatgac ggtcagcttg 960

acgactttac ttcgacgcta ctgagaggag gtgcatggcc gccgtcagct cgtaccgtga 1020

ggcgtcctgt taagtcaggc aacgagcgag acccacactt ctagttgcca gcaacacccc 1080

tgcggtggtt gggtacacta ggaggactgc cattgctaaa atggaggaag gaatgggcaa 1140

cggtaggtca gtatgccccg aatggaccgg gcaacacgcg ggctacaatg gctctgacag 1200

tgggatgcaa cgccgagagg cggagctaat ctccaaacgg agtcgtagtt cggattgcgg 1260

gctgaaaccc gcccgcatga agctggattc ggtagtaatc gcgtgtcaga agcgcgcggt 1320

gaatacgtcc ctgctccttg cacacaccgc ccgtcaaagc acccgagtgg ggtccggatg 1380

aggccgtcat gcgacggtcg aatctgggct ccgcaagggg gcttaagtcg taacaaggta 1440

gccgtagagg aatctgcggc tggatcacct ccta 1474

<210>2

<211>753

<212>DNA

<213>盐盒菌属(Haloarcula sp.)

<400>2

atgccagaac cagggagtga agcgatatgg ctgtggttag gtacagcggg catgttcctc 60

ggcatgctct acttcatcgc gcgcggctgg ggtgagaccg acagtaggcg tcaaaagttc 120

tacatcgcga caatactcat cacggcaatc gcgttcgtga attacctcgc gatggcgctt 180

ggcttcgggt tgacgatcgt cgagttcgcc ggcgaggagc accccatcta ctgggcccga 240

tacagtgact ggttgttcac gacgccgtta ctgttgtacg acctcgggtt gcttgccggg 300

gcagatcgta acactatcac ctcgctcgtc agcctcgacg tgctgatgat cgggaccggg 360

ctggtcgcga cgctgagcgc aggaagcggc gtgctgtcgg ccggtgcgga acggctggtc 420

tggtggggca tcagtaccgc cttcctgctg gtcctgctgt acttcctgtt cagctcgctg 480

tccggtcggg tcgcagactt gcccagtgac acgcgtagca ccttcaagac gctacgaaac 540

ctcgtgaccg tcgtatggtt ggtgtacccg gtgtggtggc tcatcgggac cgaggggatc 600

ggcctcgtcg ggatcggtat cgagacggcc ggcttcatgg tcatcgacct gaccgccaag 660

gtcggcttcg gtatcatcct gctccggagc cacggcgtgc tcgacggcgc ggccgagacg 720

accggaactg gcgcaacgcc tgcagacgac taa 753

<210>3

<211>3463

<212>DNA

<213>盐盒菌属(Haloarcuia sp.)

<400>3

aagcttctga gtttcggggg gttcggctgt tgcccccagt tttcacgggg tagaggctgt 60

gagaacctac tgtactgggg gtgtaataaa tgaccccccc ggaaaccacc ccagttacgc 120

cggaactgga ccgggagaag gttcggcccg aagcacccac tacgttctac gatggggacg 180

tacagatacc cggttatggg acgccaccgg aacggtgccg cgccctgtcg ccagtgggct 240

tctgcgaggc gggccacacg atactcgggc ggtcgtcgtg tggcacccgg tactgtcccg 300

atcactggcg cgactggtgc gaggacgcgg tggtcagcgc ggtcgcgcga ctcgccgctt 360

atcggcacgc ggttgacgga gcggagaagc gactaagcca catcgtagcc tcaccaccgc 420

aggaccggag ctactcgaag cgggcgatgt gggagacgcg gagcgaagcc tacgacgtgc 480

tggaagatgc gggtgtccgt ggcggggtgt cggtgacgca cccgtaccgg accaacgagc 540

ggggtgatat gctgtttgag acggctgttg agtccggtga gattcctgag gaaaccgggc 600

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aactgacggc ggcgatatgg tcgcggattc agatagaggc agagaaggcg gttaaggaga 960

cgggagaaag cggcgaggag gaggcgatag caggaccggc ggagtgtcca gaagacggtt 1020

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cgctctcaac ggcgctgatg ggtgaatagg ctattcgtcg agggcgctgc tgaagtcggg 1320

tgtttcaccc ggtgcgtaat cccggtgaag catttccccg tagccgtcga gagtgtggtc 1380

aagacggccg tatagagcca actggtatcg gtaggtgtcg cggtattcaa cagggtcgcc 1440

ctcgaagttc cagcggggcc gtgatggtgg ttccgtctgg aacatcagtg catcgagtag 1500

gcgggcgatc tcgttcggct cgaagatgtc ggcgttgttg atttcgggac tcgcagcgaa 1560

ctcgatgagt tcctgaagtg ccatccgtgc ccgctgtctg attcgggact tcgcgttgta 1620

tcgggactgg ccggtcagtt cgtcgacacc gttcagtaca tcgcggcggg agtcggtcag 1680

gaagatattt tctaccatca gtctaaccga gtacctgagt atctatcaag ttttcccatg 1740

aaaaactgat tagcatggct gttcacagat atggtacaca tggcgaccac agagaacagc 1800

ggcggagtta gggcatggga ttcagcgaag caattcgctg ttgaccggct gaaagaggaa 1860

accgaatcgc ttagtccgag cgctctggcg gaggaatacg gctgctctgg cgaccacatg 1920

cgccactgcc ttgcggacct cgcgaaagag gaactggtag agcgcatagg acacggcgaa 1980

tatacggccg gagaacaggc cggagaacag gttctccaac acgaagacca cacagactca 2040

cgtgatgagg acagcccgga ggacacggag gacacgggca atataggccc ttctgtggat 2100

gggccagccc ggtcggagga ccccgataca acgggtggaa gcccggtaga gattgaggag 2160

gacgagcggg ccgaggtgga gctgtccgag agcgacgagg aggacggcga cggcgagcgc 2220

gtcgacgtag atcgagacgg cgacggtggc cgctcggtgg gcgtctacat catcgctggg 2280

accgtcctgt tggtgctggc cgcgctgtgg ctctcgatac aggaccagtc cgatgagacg 2340

cccgagcagc ccggtcagga tgaggaggaa gaggaggcag ttgacccgga tgtgtggggt 2400

gcggagtgat gcaggaccca gaaccagaga acattacggg aacaaaacag gtagttcacc 2460

gggttgagca taacattcac tgggggtacg tggccggtgg tgtcgggctg ctggctgttg 2520

ccttcgtact ctacaaactg ctcgatttag acggcgaaga cgatgaaaac gacatgtcta 2580

gtgtaacgtg acaggtttta tgttcccccg ctcgaaggaa tcagatagca cagaaagtcc 2640

gtacacgact ctcacgagtc gggaaacgga tggggagaat ggaactcccc atcactgtgc 2700

tgccacacct atgacagcaa gcaagcctac cccaccgagt ggggagagtg tttcggacga 2760

gtcggcacag tacagaaact tcagtgagga tttactatac tacgccctac agcgctctgc 2820

cgagcgttta gagggtgaga tgtgggaaac ggtcagtcag gcgtctaacg gtatcctgag 2880

ccgtgagcag taccagcgga caatcgaggc gttctacgat ttcggggacg tattggagtt 2940

tgtggaccgc tacacccacg agaagcagca agtagccagt gatgattcaa tcaatcaatc 3000

agcggcgggt actaacaccg agcctgctga aggagggtgt agtaactcag acacgtgaac 3060

gaagtgacgg agaagggccg tcaccccaga acggcttggc cggcacgttc tgtactcagc 3120

ccttctcact ccggcgacaa aggctttcgg cctgaatcga cccggctggt ttatcgctgt 3180

tcgttcgtcg agatcggcgt cgaggagctg gtcgagcgat gacccatggc taccgttgcg 3240

gcctctccct gcggttgcgg tggcaccagc gtcccgagcg gcgcgagaac acccgtctcg 3300

gagcgagcgg agcgagcgag aatacggcgt ttcttggagc gccgggaggg ttcccgttac 3360

ccacctgagc aaccggcgaa ctgatgccag tctaccccgc agtacaggac cctgcctact 3420

acgccccttc gcggggtcaa tacggccaga atcgggcagt aga 3463

<210>4

<211>399

<212>PRT

<213>盐盒菌属(Haloarcula sp.)

<400>4

Met Thr Pro Pro Glu Thr Thr Pro Val Thr Pro Glu Leu Asp Arg Glu

1 5 10 15

Lys Val Arg Pro Glu Ala Pro Thr Thr Phe Tyr Asp Gly Asp Val Gln

20 25 30

Ile Pro Gly Tyr Gly Thr Pro Pro Glu Arg Cys Arg Ala Leu Ser Pro

35 40 45

Val Gly Phe Cys Glu Ala Gly His Thr Ile Leu Gly Arg Ser Ser Cys

50 55 60

Gly Thr Arg Tyr Cys Pro Asp His Trp Arg Asp Trp Cys Glu Asp Ala

65 70 75 80

Val Val Ser Ala Val Ala Arg Leu Ala Ala Tyr Arg His Ala Val Asp

85 90 95

Gly Ala Glu Lys Arg Leu Ser His Ile Val Ala Ser Pro Pro Gln Asp

100 105 110

Arg Ser Tyr Ser Lys Arg Ala Met Trp Glu Thr Arg Ser Glu Ala Thr

115 120 125

Thr Cys Trp Lys Met Arg Val Ser Val Ala Gly Cys Arg Val Thr His

130 135 140

Pro Tyr Arg Thr Asn Glu Arg Gly Asp Met Leu Phe Glu Thr Ala Val

145 150 155 160

Glu Ser Gly Glu Ile Pro Glu Glu Thr Gly Arg Trp Ala Phe Leu Arg

165 170 175

Glu Val Ser Glu Asp Trp Glu Asp Phe Thr Arg Tyr Ile Asp Ala Ser

180 185 190

Pro His Tyr His Thr Ile Ala Ala Ala Pro Ser Val Glu Pro Gly Asp

195 200 205

Ala Pro Asp Asp Trp Val Val Glu Arg Ile Arg Thr Leu Lys Pro Phe

210 215 220

Tyr Phe Arg Asp Thr Glu Ala Tyr Arg Ala Met Val Ala Pro Val Tyr

225 230 235 240

Tyr Thr Leu Thr His Gly Ala Val Glu Asp Ala Lys His Thr Leu Thr

245 250 255

Tyr Phe Gly Asp Val His Pro Ala Ser Phe Asp Pro Glu Glu Glu Leu

260 265 270

Thr Ala Ala Ile Trp Ser Arg Ile Gln Ile Glu Ala Glu Lys Ala Val

275 280 285

Lys Glu Thr Gly Glu Ser Gly Glu Glu Glu Ala Ile Ala Gly Pro Ala

290 295 300

Glu Cys Pro Glu Asp Gly Cys Glu Ala Ala Thr Val Asp Val Tyr Tyr

305 310 315 320

Leu Ala Glu Tyr Met Asp Asp Glu Glu Trp Val Thr Ser Val Lys Cys

325 330 335

Gly Val Gly Gly Arg Glu Lys Trp Leu Arg Leu Lys Gly Val Leu Leu

340 345 350

Trp Trp Asp Glu Gly Gly Asp Arg Pro Pro Pro Ser Val Gln Gly Asn

355 360 365

Glu Lys Lys Leu Arg Asn Trp Leu Glu Met Lys Gly Glu Ser Val Thr

370 375 380

Pro Arg Lys Gln Gln Val Ser Leu Ser Thr Ala Leu Met Gly Glu

385 390 395

<210>5

<211>135

<212>PRT

<213>盐盒菌属(Haloarcula sp.)

<400>5

Met Val Glu Asn Ile Phe Leu Thr Asp Ser Arg Arg Asp Val Leu Asn

1 5 10 15

Gly Val Asp Glu Leu Thr Gly Gln Ser Arg Tyr Asn Ala Lys Ser Arg

20 25 30

Ile Arg Gln Arg Ala Arg Met Ala Leu Gln Glu Leu Ile Glu Phe Ala

35 40 45

Ala Ser Pro Glu Ile Asn Asn Ala Asp Ile Phe Glu Pro Asn Glu Ile

50 55 60

Ala Arg Leu Leu Asp Ala Leu Met Phe Gln Thr Glu Pro Pro Ser Arg

65 70 75 80

Pro Arg Trp Asn Phe Glu Gly Asp Pro Val Glu Tyr Arg Asp Thr Tyr

85 90 95

Arg Tyr Gln Leu Ala Leu Tyr Gly Arg Leu Asp His Thr Leu Asp Gly

100 105 110

Tyr Gly Glu Met Leu His Arg Asp Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Pro Asp

115 120 125

Phe Ser Ser Ala Leu Asp Glu

130 135

<210>6

<211>212

<212>PRT

<213>盐盒菌属(Haloarcula sp.)

<400>6

Met Val His Met Ala Thr Thr Glu Asn Ser Gly Gly Val Arg Ala Trp

1 5 10 15

Asp Ser Ala Lys Gln Phe Ala Val Asp Arg Leu Lys Glu Glu Thr Glu

20 25 30

Ser Leu Ser Pro Ser Ala Leu Ala Glu Glu Tyr Gly Cys Ser Gly Asp

35 40 45

His Met Arg His Cys Leu Ala Asp Leu Ala Lys Glu Glu Leu Val Glu

50 55 60

Arg Ile Gly His Gly Glu Tyr Thr Ala Gly Glu Gln Ala Gly Glu Gln

65 70 75 80

Val Leu Gln His Glu Asp His Thr Asp Ser Arg Asp Glu Asp Ser Pro

85 90 95

Glu Asp Thr Glu Asp Thr Gly Asn Ile Gly Pro Ser Val Asp Gly Pro

100 105 110

Ala Arg Ser Glu Asp Pro Asp Thr Thr Gly Gly Ser Pro Val Glu Ile

115 120 125

Glu Glu Asp Glu Arg Ala Glu Val Glu Leu Ser Glu Ser Asp Glu Glu

130 135 140

Asp Gly Asp Gly Glu Arg Val Asp Val Asp Arg Asp Gly Asp Gly Gly

145 150 155 160

Arg Ser Val Gly Val Tyr Ile Ile Ala Gly Thr Val Leu Leu Val Leu

165 170 175

Ala Ala Leu Trp Leu Ser Ile Gln Asp Gln Ser Asp Glu Thr Pro Glu

180 185 190

Gln Pro Gly Gln Asp Glu Glu Glu Glu Glu Ala Val Asp Pro Asp Val

195 200 205

Trp Gly Ala Glu

210

Claims

1、一种极端嗜盐古菌质粒，它具有序列表中序列3的核苷酸序列。

2、根据权利要求1所述的质粒，其特征在于：所述序列3中的自5′端第90-1289位碱基编码具有序列表中序列4的氨基酸残基序列的反式作用因子；序列3中的自5′端第1291-1698位碱基编码具有序列表中序列5的氨基酸残基序列的反式作用因子；序列3中的自5′端第1771-2409位碱基编码具有序列表中序列6的氨基酸残基序列的反式作用因子；序列3中的自5′端第1699-1770位碱基，2410-89位碱基，均为顺式作用元件。

3、基于权利要求1所述极端嗜盐古菌质粒构建的表达载体。

4、根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于：所述载体为pSCM204。

5、根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于：所述载体为pSCM206。

6、由权利要求1-5所述质粒转化得到的微生物。