CN100347302C

CN100347302C - 尼可霉素生物合成调控基因及其编码蛋白与表达工程菌

Info

Publication number: CN100347302C
Application number: CNB2004100584112A
Authority: CN
Inventors: 谭华荣; 刘钢
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2004-08-11
Filing date: 2004-08-11
Publication date: 2007-11-07
Anticipated expiration: 2024-08-11
Also published as: CN1733921A

Abstract

本发明公开了尼可霉素生物合成途径特异性调控基因及其编码蛋白与应用。本发明的基因，是下列核苷酸序列之一：1)序列表中的SEQ ID №：1；2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸。所编码的蛋白质是氨基酸序列如SEQ ID №：2所示的蛋白质，或者是将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。构建含有该基因多拷贝的工程菌能有效提高菌株尼可霉素的产量，对尼可霉素的生产应用具有重要意义。

Description

尼可霉素生物合成调控基因及其编码蛋白与表达工程菌

技术领域

本发明涉及抗生素生物合成调控基因及其编码蛋白与应用，特别是涉及尼可霉素生物合成途径特异性调控基因及其编码蛋白与表达该基因的工程菌，以及该基因和工程菌在尼可霉素生产中的应用。

背景技术

尼可霉素属于核苷肽类抗生素，是酰基和糖基核苷类中的一种，与几丁质合成酶的天然底物UDP-N-乙酰葡萄糖胺结构类似，是该酶的强竞争性抑制剂。由于几丁质是真菌细胞壁和昆虫及其它无脊椎动物外骨骼的重要组成成分，因此，尼可霉素通过竞争性抑制几丁质的合成来有效抑制真菌、昆虫和螨虫，而对哺乳动物、蜜蜂和植物无毒或者毒性极低并且在自然界中易降解，是一种较理想的农用抗生素。田间试验证明尼可霉素对很多植物病害，如小麦白粉病、黄瓜菌核病、番茄叶霉病、烟草红斑病、苹果轮斑病等都有很好的防治作用。同时，研究表明尼可霉素能有效抑制人体深部感染真菌——白色念珠菌(Candida albicans)，尼可霉素Z作为口服药物对球孢子菌病和芽生菌病有明显的疗效。目前，越来越多的人面临着由于自身免疫病(如艾滋病患者、器官移植病人和接受化疗的癌症患者)而引起的危及生命的真菌感染，因此，作为抗真菌药物尼可霉素有巨大的应用和开发潜力。

研究表明，抗生素的生物合成涉及一系列复杂的生化反应，与此相关的基因成簇排列，它们的表达受到多水平多层次的调控。通常抗生素生物合成的调控主要在三个水平进行：(1)途径特异性调控；(2)与抗生素和形态分化都相关的多效调控；(3)全局性调控。途径特异性调控基因(Antibiotic-Specific Regulatory Genes)只特异性地调控某种抗生素的生物合成，这些调控基因一般与抗生素生物合成基因成簇存在，调控它们的转录。大多数抗生素生物合成基因簇都包含途径特异性调控基因，有的是一个，有的是两个或更多。天然产生尼可霉素的链霉菌目前已知的有唐德链霉菌(S.tendae)和圈卷产色链霉菌(S.ansochromogenes)。德国吐比根大学Bormann实验室曾以唐德链霉菌为研究材料进行尼可霉素相关工作的；而中国科学院微生物研究所谭华荣博士实验室以圈卷产色链霉菌为材料进行了有关其尼可霉素生物合成的分子生物学研究。虽然对尼可霉素的生物合成有了初步的研究，但对它的调控机制的研究至今仍属空白。

发明内容

本发明的目的是提供一种尼可霉素生物合成途径特异性调控基因及其编码蛋白。

本发明所提供的尼可霉素生物合成调控基因，来源于圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)，命名为sanG，是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；

3)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

4)在高严谨度条件下能够与序列表中的SEQ ID №：1杂交的序列。

所述的高严谨度条件是指在68℃，0.1X SSC(含有0.1％SDS)中15分钟洗脱两次的严格洗脱条件。

序列表中的SEQ ID №：1的DNA序列长度为5073bp，含有一个完整的开放阅读框(ORP)，大小为3186-bp，起始密码子为该序列5’端第1767位开始的ATG，终止密码子为该序列5’端第4952位结束的TGA。

由该sanG基因编码的调控蛋白SanG，是具有序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列的蛋白质或将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。

序列表中的SEQ ID №：2是由1061个氨基酸残基组成的蛋白质。

本发明的另一个目的是提供sanG基因以及表达该基因的工程菌在尼可霉素生产中的应用。

含有本发明基因的表达载体及工程菌均属于本发明的保护范围，利用现有分子生物学的方法可以得到含有sanG基因多拷贝的表达载体，如重组质粒pKC1139::sanG；以及利用表达载体通过转化得到工程菌，如圈卷产色链霉菌(Streptomycesansochromogenes)NK2，该菌株已于2004年07月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC № 1181。

本发明首次从圈卷产色链霉菌中克隆到了尼可霉素生物合成途径特异性调控基因sanG，并对其进行了序列测定及分析。分析结果表明，该基因所编码的产物与多种抗生素生物合成调控蛋白(SARPs)具有一定的同源性，但它所编码的蛋白(含1061个氨基酸残基)要比一般的抗生素生物合成调控蛋白(含200-400个氨基酸残基)大很多，是一类新的抗生素调控蛋白。通过基因功能研究表明，sanG破坏株失去了尼可霉素的产生能力，而重新引入一个拷贝的sanG基因可以使尼可霉素重新产生，表明该基因是一个正调控基因。同时本发明发明人在圈卷产色链霉菌野生株中导入多个拷贝的sanG基因，构建得到了一株尼可霉素高产工程菌，可以使尼可霉素产量提高2-3倍。本发明基因的研究、开发和应用对尼可霉素的生产应用具有极其重要的意义。

附图说明

图1为sanG基因高表达载体pKC1139::sanG的构建图；

图2为工程菌株尼可霉素的活性检测照片；

图3为工程菌株尼可霉素的生产曲线；

图4为工程菌株尼可霉素的HPLC分析谱图；

图5为质粒pUC119::kmr的物理谱图；

图6为质粒pGL001的物理谱图。

具体实施方式

实施例1、sanG基因的克隆及序列分析

1、克隆探针的制备

利用XhoI-BamHI酶切质粒pZH1300(Li，W.，and Tan，H.Structure and functionof sanV：a gene involved in nikkomycin biosynthesis of Streptomycesansochromogenes.Curr.Microbiol.2003.46(6)：403-407.)，按常规方法进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后用DEAE膜法回收1.7kb的DNA片段(该片段含有部分sanV基因)；将所回收得到的DNA片段按常规方法进行非放射性地高辛标记，作为基因克隆的探针，该探针的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID №：3。

2、构建部分基因组文库

接种圈卷产色链霉菌7100(谭华荣，吴畏，田宇清等。圈卷产色链霉菌分化及其特性研究。微生物学报，1994，34：398-402)孢子悬液于YEME液体培养基中，摇床培养48小时，离心收集菌体，并用常规方法提取得到圈卷产色链霉菌总DNA(Kieser，T.，Bibb，M.J.，Buttner，M.J.，Chater，K.F.，and Hopwood，D.A.(2000)PracticalStreptomyces Genetics.Norwich：The John lnnes Foundation.)。

用不同的限制性内切酶酶切圈卷产色链霉菌总DNA，进行琼脂糖凝胶电泳，然后用上述克隆探针进行Southern杂交，其中XhoI酶切产物得到一条7.5kb的信号带。用XhoI大量酶切圈卷产色链霉菌总DNA，进行琼脂糖凝胶电泳，回收大小在7.5kb左右的DNA片段，取部分回收的DNA片段再次进行Southern杂交，结果表明所回收的DNA中含有目的DNA。

将回收的DNA与XhoI酶切的pBluescriptII载体(购自Stratagene公司，美国)按常规方法进行连接，然后采用电转化法转化E.coli DH5a，构建成部分基因组文库。

3、sanV基因下游7.5kb DNA片段的克隆

以步骤1所得到的1.7kb的XhoI-BamHI DNA片段为探针(序列表中的SEQ ID №：3)，采用菌落杂交方法对圈卷产色链霉菌7100的部分基因文库进行筛选，其中1个重组质粒得到阳性信号，命名为pGL001。该载体酶切结果表明，其中含有包括部分sanV基因在内的7.5kb的XhoI DNA片段。

4、sanG基因的序列分析

按常规的DNA测序方法对7.5kb DNA片段进行序列测定，其不包括部分sanV基因在内的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID №：1，长度为5073bp。用FramePlot软件对该序列进行分析，结果表明整个核苷酸序列中G+C％约为72.2％，具有典型的链霉菌密码子使用特征，其中含有一个完整的开放阅读框(ORP)，大小为3186-bp，起始密码子为该序列5’端第1767位开始的ATG，终止密码子为该序列5’端第4952位结束的TGA，将其命名为sanG。

sanG编码一个由1061个氨基酸残基组成的蛋白质(SanG)，其氨基酸残基序列为序列表中的SEQ ID №：2。在NCBI的蛋白质序列数据库中进行同源性比较，结果表明蛋白SanG与链霉菌的抗生素生物合成调控蛋白(SARPs)有较高的同源性，但该蛋白(含1061个氨基酸残基)要比一般的抗生素生物合成调控蛋白(含200-400个氨基酸残基)大很多，在其氨基端还存在有一个典型的螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix，HTH)DNA结合域(从N端的第99位Arg到第258位Leu)，为一类新型的抗生素调控蛋白。

实施例2、sanG基因的功能研究

1、构建用于基因破坏的重组质粒pGLD020

用XhoI酶切质粒pGL001，回收7.5-kb大小的DNA片段，亚克隆到删除了BamHI位点的pUC19的salI位点上，构建得到重组质粒pGLD021。用BamHI酶切pGLD021，然后用Klenow补平末端，回收该6-kb大小的片段；同时用BamHI和EcoRI双酶切重组质粒pUC119::kmr(该质粒的物理谱图如图5)，经Klenow补平末端，回收约1.0-kb的卡那霉素抗性基因片段；连接以上两个DNA片段，将连接产物转化E.coli DH5α，从转化子中提取质粒，酶切验证后得到正确的重组质粒pGLD022。进一步用HindIII和EcoRI双酶切pGLD022，回收4.4-kb的DNA片段并克隆到pKC1139(Kieser，T.，Bibb，M.J.，Buttner，M.J.，Chater，K.F.，and Hopwood，D.A.(2000)PracticalStreptomyces Genetics.Norwich：The John lnnes Foundation.)的多克隆位点上，构建得到用于基因破坏的重组质粒pGLD020。以上酶切、回收、克隆、转化等操作均按照常规的分子生物学实验方法进行。

2、构建sanG阻断突变株

首先将质粒pGLD020转入到E.coli ET12567中，培养、提取获得非甲基化的DNA，然后用该DNA转化圈卷产色链霉菌7100的原生质体，随机挑选其中6个转化子转接至含有安普霉素(Apramycin)的YEME中富集菌体，经质粒提取、酶切验证，证明所得转化子都是正确的。将其中一个转化子转接至含有安普霉素的基本培养基平板上，28℃培养7天后，制备孢子悬液。经适当稀释后，以每个平皿10⁴个孢子的浓度涂布在含有卡那霉素的基本培养基平板上，于42℃高温培养。pKC1139具有温度敏感型复制起点，在高于34℃条件下不能正常复制。因此，以pKC1139为基础构建的载体pGLD020在42℃时不能自主复制，只有当sanG基因及其侧翼序列与圈卷产色链霉菌7100染色体发生了同源重组时——单交换或双交换的菌株才能在含有卡那霉素的基本培养基上生长。若发生了双交换，则kmr替换sanG基因，此时菌落表现为Km^rAm^s；若发生了单交换，则整个pGLD020插入到染色体上，此时菌落表现为Km^rAm^r。将长出的菌落分别影印在含Apramycin和含Kanamycin的MM平板上，那些在含Kanamycin的MM平板上生长，而在含Apramycin的MM平板上不生长的菌落即染色体上的同源基因可能发生了双交换。将随机筛选的6株突变株接种在没有任何选择压力的基本培养基上，在28℃下培养，传5代后重新转接至分别含有卡那霉素和安普霉素的基本培养基上，结果仍然表现为Km^rAm^s，说明通过双交换得到的这些sanG缺失突变株在遗传上是稳定的。

3、阻断突变株的Southern blotting杂交验证

将上述6株遗传上稳定的阻断突变株接种于YEME培养基中，28℃，250rpm振荡培养30小时后分别提取总DNA，用XhoI酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，回收7.5kb的DNA片段，然后将DNA片段进行地高辛标记。

以地高辛标记的7.5kb的DNA片段为探针进行Southern blot杂交，发生双交换的突变株的总DNA所呈现的阳性信号带应该比野生型菌株的小3.2kb左右，理论推测大小分别为4.3-kb和7.5-kb。杂交结果证明，突变株的杂交信号带与理论上计算的分子量大小一致，说明所得到的突变株都是正确的。

4、尼可霉素生物检测和HPLC分析

将Southern blotting杂交验证正确的阻断突变株和野生型菌株分别接种在YEME培养基中，在30℃培养36h后，以1％的接种量在SP培养基中进行二次发酵，在不同培养时间分别取样，检测菌体湿重和上清中尼可霉素的粗略含量。将上清液经过直径0.25μm的微孔滤膜过滤后，按常规方法进行HPLC分析，表明上清中没有尼可霉素，而在各个时间点所测菌体湿重与野生型菌株几乎没有差异。结果表明，sanG缺失突变株不再产生尼可霉素，说明sanG基因是尼可霉素生物合成所必需的。

5、sanG缺失突变株的互补分析

为了排除sanG缺失突变株的表型是由于染色体上其它基因位点突变所造成的这种可能性，进行了突变株的遗传互补实验。用BamHI酶切质粒pGL001，回收3.3-kb的DNA片段，与pSET152连接(Bierman，M.，Logan，R.，O’Brien，K.，Seno，E.T.，Rao，R.N.，and Schoner，B.E.Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA fromEscherichia coli to Streptomyces spp.Gene.1992.116：43-49)，然后用Bg1II和EcoRI双酶切，回收其中的大片段；用BglII和EcoRI双酶切pGL001，回收4.1kb的DNA片段，将两段DNA片段连接，构建成含有完整sanG基因及其上游启动子的重组质粒pSET152::sanG。

将pSET152::sanG转入E.coli ET12567/pUZ8002，培养、提取得到去除限制修饰的pSET152::sanG，然后转入缺失突变株之中，以安普霉素为筛选标记筛选转化子。随机筛选6株转化子在SP培养基中发酵，然后进行尼可霉素生物活性检测，结果表明sanG基因互补后的突变株恢复了尼可霉素的产生能力，从另一方面说明sanG基因是尼可霉素生物合成所必需的。

实施例3、尼可霉素高产工程菌株的构建

1、sanG基因高拷贝重组质粒pKC1139::sanG的构建

构建sanG基因高表达载体pKC1139::sanG的过程如图1所示。用XhoI酶切质粒pGL001(该质粒的物理谱图如图6)，回收7.5-kb的DNA片段，该DNA片段含有完整sanG基因及其启动子序列，将该片段插入载体质粒pUC19的SalI位点，将获得的质粒用HindIII和EcoRI进行双酶切，回收7.5-kb的HindIII-EcoRI片段；将所得的DNA片段插入到可以在E.coli和链霉菌中穿梭的多拷贝质粒pKC1139的多克隆位点，构建得到sanG基因高拷贝重组质粒pKC1139::sanG。

2、转化、筛选尼可霉素高产工程菌株

将pKC1139::sanG转入E.coli ET12567/pUZ8002，培养、提取得到去除限制修饰的pKC1139::sanG，然后将pKC1139::sanG转入野生型菌株圈卷产色链霉菌7100中，以安普霉素为筛选标记筛选转化子，得到尼可霉素工程菌。

从中筛选3株工程菌在SP培养基中发酵，然后进行尼可霉素生物活性检测，并与野生型菌株7100进行比较，结果如图2所示，图中B、C、D为工程菌，7100为圈卷产色链霉菌7100，7100/pKC1139为含有空载体pKC1139的对照菌株。结果表明，3株工程菌尼可霉素的产生能力都高于野生型菌株7100。

用HPLC检测工程菌尼可霉素的产量，并以圈卷产色链霉菌7100为对照，结果如图3、图4所示，图3中B、C、D为工程菌，7100为圈卷产色链霉菌7100，7100/pKC1139为含有空载体pKC1139的对照菌株；图4A为工程菌圈卷产色链霉菌(Streptomycesansochromogenes)NK2 CGMCC №1181培养物HPLC图谱，B为圈卷产色链霉菌7100培养物HPLC图谱(HPLC谱图中X峰为尼可霉素X组分，Z峰为尼可霉素Z组分)。结果表明，工程菌的尼可霉素产量显著提高，为野生株的2-3倍。

序列表

<160>3

<210>1

<211>5073

<212>DNA

<213>圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)

<400>1

ggatcctttg cctccccgac ggcacctgat cgagcgggtg ccgtgcgtgc ggctgcgggt 60

cacgcgtccg gttcggctcc ggtcatcagg gcgagcaggg gtgtaagggg cgtggtcgtc 120

gatcatggtg gtgtagaagc cgtcgtcgtc cgcttccacc tcggcggcgc gggagaacgt 180

cacctgttcg tgcgaggcga gcgcggcttc ggtgtcgccg gggtgcgtgg cgagggcgcg 240

gccgagtccg gcgccgtccg gcatggccgg gttggcgccc ttgccgttcg gtgcccgcag 300

gcgggcggcg tccccgagca gcgtcacccc ggccacgcga cgcctcaccg cctaccgtgc 360

acgaactcgc cagggccggc cgggccggct tttacgcctg caacgctccc gaagggcagt 420

cggacctccg aaaccgacaa tatccacatt tgttctgttt tgttcttcct ggtgcgtcaa 480

cctcatcccg aatggccagg tcgcggatac atggagccac tttaagtcac ctggctcatt 540

cgcgttcgcc cagctcagga gaatgctcga tacactgatt ccggcgaggc ataccagcct 600

cagaaaagca ggggcatcgc gaacaccatg aacgcaaaca tgtccgagcg gaatggaaac 660

atcagccgac tcaccacagc cgacccgacc gtccgtgccg cagaccgcac ccatttcccc 720

cctcccaccc ccgaggggaa gaggacacgc aaggcaacca cgacacaaca ggaacccagg 780

ccgtccgggc cctccgtacc cgcccagaac caggccgccg caccggacgc caccttcacg 840

accgcgcccg tccccctctc acgcggcaca gcagtccgga tacgacctcg cggggcccgg 900

caagcccggc cggccgggac gcgctccgag accgtgacga aaggcgaccc ctggggaggg 960

tgggctgtgc gccagcggca cagggctgag gcgaccgctc tcaggcaggc agcgaggtca 1020

ctggctgaat accaggcgct ggcaagaaga ggcactcgac tatcaggcga gacggcgtaa 1080

tggccggcag ccgcaggggc cgctggggcc tccttgtcgc gatgcggttc ggcgtcggca 1140

atggctggta ttggctgtgc tcgggtgcgg acgttgacac gttaatcgtt tccggcaatt 1200

ccgatttggc caatcggcgt ttgcgagccg ggttgccgcc gctccaggcg gcagtagacg 1260

gcctttcggc catttcagct catgagctga tcgagcggct cgtcgcccat ggccgcgttc 1320

ggatcaccca cgctgatgat gacgaggtcg cggagtcccg gcgcgtcgtc gaccacgcga 1380

aacggcacgg cctgagacca gcgggcaagc gcattgagaa agttccgtac ggcgggtcgg 1440

ggctggagct cgtcataggg ggttgttccg gtcgccgcgg gccggccgga agcagaaccg 1500

ggcggcccgg gtgttccgcg agcccgggct ccgcgcgcat caggccgttc ctgccctccg 1560

cgcccgccgg tccctccggc cggcacagcc gcgcccctcc tgaacgcggg accggacgag 1620

cgggcacggc cagctcactg gccggtatcg aaatcgccgt gtcatggcgt gttcagtgcg 1680

tcacttgatc ggcaccgttt cagcacctgc cccgccctac gaccgaccgc ccgtcaagtg 1740

accgtcgaaa ggcaagaacc cccggcatgg cgtacacagc tcaagagcaa caaaccgcgt 1800

ccctgacaga tctgtcgttc gaggctttcg gtgtgatgac ggctcggcgc ggggccgagc 1860

aggtgcctct cggtccccca cggcaccggg ccgtgctggg actgctgctc atccggctgg 1920

gccaagtggt gcccgccgat cagctcatcg acgaattatg gggcgacagc ctccccagac 1980

gcccgcagcc accctgcaga acgtacctgt cccacctgcg gcgggtgctg acggggcggc 2040

acgggccgat cgccccgctg cgctaccagg cccccgggta cgtcctgacg gtggagccgg 2100

gcacgttcga cctgtcccgg ttcgagaccc tcgtctccca ggggcagcgc catgtgtccg 2160

acggccggct ccaggacgcc cgcgacgcgt tcgacaacgc gctgcggtta tggcgggcgg 2220

accccttcct ggacctcgcg gcctacaccc cgctcgcgga ggaggccgcc cgcctgagcc 2280

tcctgcggac caccgccgtc gcggcccaag ccgacacgct cctcacgctc ggcgaggcct 2340

gcgacgccgt cgcgctgctg cgccgcgagg tgtccctcca gcccatcgac gaacgcctgg 2400

tcggcagcct catgacgggc ctgtaccgcc tgggccggca ggccgaggcg ctccagctgt 2460

acgaccggac gcgcgcctac ctctccgagg agctcggggt cgccccggcc cgcgagctcc 2520

agcgcgtcca cctcgccctg ctgcgccacg aactcgacga ccagacgtcc gccccggccg 2580

ccgtcgaggt acgcgtccgg cccggcaccg tggccgagcg ggaggcggag gggcccgcgc 2640

cggcagacgg tccggaggcc gtccccgagg ccggacagcg gggtacggca ccggcggcct 2700

ggttcccctg ccgcggcgac gcccttgacg ctctgcggtc gtccatcacc ggcgccctgc 2760

gcggcagcgg gcacaccacc gccgtcgtcg gcgaggcggg cgtcggcaag accgaactgg 2820

tggcccgtgc cacggatcag acgcagccgc cgcaaccgca ggcggaggtc atccgtgtca 2880

actgccgcag cgacgagggg attcccgtcg gctgggtgtg gcagcaggtg ctgcgccggc 2940

tcgacatcct gttcggggag tccttcgacg acctgcgcaa gcagcgcgcc gaagggcatc 3000

cggtgacaac gctgtcggaa cccccctcgg accagatgga cttcctcgcc caggacgccc 3060

tgtgcgaagt gatcctccag tacgccgacg gcaggcccct cctgctcgtc ctcgaagaca 3120

gtgcaccggc ggaccgcctc acgctcgacg tgctggggct gttctgcagc cgcacgcagg 3180

ggcggcccgt cagcgtggtg atcacggtcc gcgaacccgg tctcggggcc gggcccgaga 3240

ccgacggccc gctcgtcgac ctcctggccg actcccgcac caaggtcgtg cacctggaca 3300

acctcaccga ggactacgtc cgggccgcgg tcacggccca ggcggggccc ggcgtcgaag 3360

cgtccgtcgt acgggcgctg tacgagcgca gcgccggcaa cccctatctc ctcgaccagt 3420

tgatcgccga cgccggcggg gcgcggcgcc tgcacgatcc ccgtgcggcc gatgtcgtcc 3480

gcgccgggat cccgacgggc gtccgcagca tgctgcgccg gcagttcgcc gggctgcccc 3540

cgcgcgtcct gcacctcctc cagtgctgcg ccgtgctcgg cggcgaggcg acgctggcct 3600

cgctgaccgc catgctggac gacgaaggcg ccggccacga cgtcctggaa gaggtcctgg 3660

cgaccgggct catgcacagc gaccgcgacg acccgcaccg gctcgtcttc cgctacggcc 3720

tcatccgcga cgtcctcctg gcggagctgc gccgccagga gcgggcggcc ctgcacgcgc 3780

gcgccgtcgg cgtgctcggt gcccgccacg gcgactcccc cgaggcgagc gagcagatcg 3840

ccgagcacgc ctggcaggcc gtgctggccc tgccggccga ggacgtgctg ccgcacctca 3900

gacgcgccgg cgaacaggcc gtcgtcgagg gcgactaccg gcgcgcgcag acctggttcg 3960

agcacgcgca caccttgctc tgcgccctgc cccgggacgg tggcgcgcca tcgaagcaga 4020

cgctggacct gcgcagcaag ctcctctaca cggcgagcat cacccgcggc tacaccaacc 4080

gggaaggtga aggccgaggc cgggcgcatc ccggaagctg tacgccgcca cgggcgggcc 4140

ggaccatcga gcagggtgcc ttgctgctgt ggcagttcgt ggccgaactg gtcaccgccc 4200

ggcacaccga gtgcgcccgg cacgcggagc agctgcgcgc tctcaccgag cggtccgacg 4260

ccccggaggt ccggttctac gagcggatcg cccgcggtct gctccagttg cccagcgatg 4320

ccgccgacgc gctcaccgcc ctgaccgagg cggtgcggat cgccgagaag ctgacccccg 4380

cacagcggga gcgcatgacg cgccgcgccc agcaggatcc gcggttcatg gccgcgaacc 4440

atcgcgtcct caccctgagg ctgctcggcg ccaccgacga ggcgcgggcg ctgtgcgagg 4500

agctgctggt agccaccggc ctggacggca cgccggtcga ccaggcgagc gcgtactact 4560

tccactccct gacagcggcc ctgggcgagg accccgacgg ggcggcggcc tccagcggcc 4620

ggggcctgga catcgcccgc gcccacgggc tgagccactg gaccgccatg ctccaggtgt 4680

gccggagctg ggcactccac cagagcggcg aggccgccgc actcgacagc ctggaatcgg 4740

ccgtcgccga gctgcgcgag cggcggctgc tcatccggct gccgctccac ctgggcctgc 4800

tggcccacgc ccagcacagc agcggggcgg ccgaagacgc cagacggacg ctgcggtcgt 4860

cgaccgcgga ggccagatcc cgcggggagt tggcctatgt gagccgcact ctgccgttca 4920

cccggctgtg tcccctgacg tccgcttcgt agcggccgga tcgtcggttc cttcgcctct 4980

cagccgggcg cgggcctggc cggcctcggg gtggccgagt ccgtcgaggg tccgcgccgc 5040

ctcccgccac agggcagggc ggcggggcgg tct 5073

<210>2

<211>1061

<212>PRT

<213>圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)

<400>2

Met Ala Tyr Thr Ala Gln Glu Gln Gln Thr Ala Ser Leu Thr Asp Leu

1 5 10 15

Ser Phe Glu Ala Phe Gly Val Met Thr Ala Arg Arg Gly Ala Glu Gln

20 25 30

Val Pro Leu Gly Pro Pro Arg His Arg Ala Val Leu Gly Leu Leu Leu

35 40 45

Ile Arg Leu Gly Gln Val Val Pro Ala Asp Gln Leu Ile Asp Glu Leu

50 55 60

Trp Gly Asp Ser Leu Pro Arg Arg Pro Gln Pro Pro Cys Arg Thr Tyr

65 70 75 80

Leu Ser His Leu Arg Arg Val Leu Thr Gly Arg His Gly Pro Ile Ala

85 90 95

Pro Leu Arg Tyr Gln Ala Pro Gly Tyr Val Leu Thr Val Glu Pro Gly

100 105 110

Thr Phe Asp Leu Ser Arg Phe Glu Thr Leu Val Ser Gln Gly Gln Arg

115 120 125

His Val Ser Asp Gly Arg Leu Gln Asp Ala Arg Asp Ala Phe Asp Asn

130 135 140

Ala Leu Arg Leu Trp Arg Ala Asp Pro Phe Leu Asp Leu Ala Ala Tyr

145 150 155 160

Thr Pro Leu Ala Glu Glu Ala Ala Arg Leu Ser Leu Leu Arg Thr Thr

165 170 175

Ala Val Ala Ala Gln Ala Asp Thr Leu Leu Thr Leu Gly Glu Ala Cys

180 185 190

Asp Ala Val Ala Leu Leu Arg Arg Glu Val Ser Leu Gln Pro Ile Asp

195 200 205

Glu Arg Leu Val Gly Ser Leu Met Thr Gly Leu Tyr Arg Leu Gly Arg

210 215 220

Gln Ala Glu Ala Leu Gln Leu Tyr Asp Arg Thr Arg Ala Tyr Leu Ser

225 230 235 240

Glu Glu Leu Gly Val Ala Pro Ala Arg Glu Leu Gln Arg Val His Leu

245 250 255

Ala Leu Leu Arg His Glu Leu Asp Asp Gln Thr Ser Ala Pro Ala Ala

260 265 270

Val Glu Val Arg Val Arg Pro Gly Thr Val Ala Glu Arg Glu Ala Glu

275 280 285

Gly Pro Ala Pro Ala Asp Gly Pro Glu Ala Val Pro Glu Ala Gly Gln

290 295 300

Arg Gly Thr Ala Pro Ala Ala Trp Phe Pro Cys Arg Gly Asp Ala Leu

305 310 315 320

Asp Ala Leu Arg Ser Ser Ile Thr Gly Ala Leu Arg Gly Ser Gly His

325 330 335

Thr Thr Ala Val Val Gly Glu Ala Gly Val Gly Lys Thr Glu Leu Val

340 345 350

Ala Arg Ala Thr Asp Gln Thr Gln Pro Pro Gln Pro Gln Ala Glu Val

355 360 365

Ile Arg Val Asn Cys Arg Ser Asp Glu Gly Ile Pro Val Gly Trp Val

370 375 380

Trp Gln Gln Val Leu Arg Arg Leu Asp Ile Leu Phe Gly Glu Ser Phe

385 390 395 400

Asp Asp Leu Arg Lys Gln Arg Ala Glu Gly His Pro Val Thr Thr Leu

405 410 415

Ser Glu Pro Pro Ser Asp Gln Met Asp Phe Leu Ala Gln Asp Ala Leu

420 425 430

Cys Glu Val Ile Leu Gln Tyr Ala Asp Gly Arg Pro Leu Leu Leu Val

435 440 445

Leu Glu Asp Ser Ala Pro Ala Asp Arg Leu Thr Leu Asp Val Leu Gly

450 455 460

Leu Phe Cys Ser Arg Thr Gln Gly Arg Pro Val Ser Val Val Ile Thr

465 470 475 480

Val Arg Glu Pro Gly Leu Gly Ala Gly Pro Glu Thr Asp Gly Pro Leu

485 490 495

Val Asp Leu Leu Ala Asp Ser Arg Thr Lys Val Val His Leu Asp Asn

500 505 510

Leu Thr Glu Asp Tyr Val Arg Ala Ala Val Thr Ala Gln Ala Gly Pro

515 520 525

Gly Val Glu Ala Ser Val Val Arg Ala Leu Tyr Glu Arg Ser Ala Gly

530 535 540

Asn Pro Tyr Leu Leu Asp Gln Leu Ile Ala Asp Ala Gly Gly Ala Arg

545 550 555 560

Arg Leu His Asp Pro Arg Ala Ala Asp Val Val Arg Ala Gly Ile Pro

565 570 575

Thr Gly Val Arg Ser Met Leu Arg Arg Gln Phe Ala Gly Leu Pro Pro

580 585 590

Arg Val Leu His Leu Leu Gln Cys Cys Ala Val Leu Gly Gly Glu Ala

595 600 605

Thr Leu Ala Ser Leu Thr Ala Met Leu Asp Asp Glu Gly Ala Gly His

610 615 620

Asp Val Leu Glu Glu Val Leu Ala Thr Gly Leu Met His Ser Asp Arg

625 630 635 640

Asp Asp Pro His Arg Leu Val Phe Arg Tyr Gly Leu Ile Arg Asp Val

645 650 655

Leu Leu Ala Glu Leu Arg Arg Gln Glu Arg Ala Ala Leu His Ala Arg

660 665 670

Ala Val Gly Val Leu Gly Ala Arg His Gly Asp Ser Pro Glu Ala Ser

675 680 685

Glu Gln Ile Ala Glu His Ala Trp Gln Ala Val Leu Ala Leu Pro Ala

690 695 700

Glu Asp Val Leu Pro His Leu Arg Arg Ala Gly Glu Gln Ala Val Val

705 710 715 720

Glu Gly Asp Tyr Arg Arg Ala Gln Thr Trp Phe Glu His Ala His Thr

725 730 735

Leu Leu Cys Ala Leu Pro Arg Asp Gly Gly Ala Pro Ser Lys Gln Thr

740 745 750

Leu Asp Leu Arg Ser Lys Leu Leu Tyr Thr Ala Ser Ile Thr Arg Gly

755 760 765

Tyr Thr Asn Arg Glu Gly Glu Gly Arg Gly Arg Ala His Pro Gly Ser

770 775 780

Cys Thr Pro Pro Arg Ala Gly Arg Thr Ile Glu Gln Gly Ala Leu Leu

785 790 795 800

Leu Trp Gln Phe Val Ala Glu Leu Val Thr Ala Arg His Thr Glu Cys

805 810 815

Ala Arg His Ala Glu Gln Leu Arg Ala Leu Thr Glu Arg Ser Asp Ala

820 825 830

Pro Glu Val Arg Phe Tyr Glu Arg Ile Ala Arg Gly Leu Leu Gln Leu

835 840 845

Pro Ser Asp Ala Ala Asp Ala Leu Thr Ala Leu Thr Glu Ala Val Arg

850 855 860

Ile Ala Glu Lys Leu Thr Pro Ala Gln Arg Glu Arg Met Thr Arg Arg

865 870 875 880

Ala Gln Gln Asp Pro Arg Phe Met Ala Ala Asn His Arg Val Leu Thr

885 890 895

Leu Arg Leu Leu Gly Ala Thr Asp Glu Ala Arg Ala Leu Cys Glu Glu

900 905 910

Leu Leu Val Ala Thr Gly Leu Asp Gly Thr Pro Val Asp Gln Ala Ser

915 920 925

Ala Tyr Tyr Phe His Ser Leu Thr Ala Ala Leu Gly Glu Asp Pro Asp

930 935 940

Gly Ala Ala Ala Ser Ser Gly Arg Gly Leu Asp Ile Ala Arg Ala His

945 950 955 960

Gly Leu Ser His Trp Thr Ala Met Leu Gln Val Cys Arg Ser Trp Ala

965 970 975

Leu His Gln Ser Gly Glu Ala Ala Ala Leu Asp Ser Leu Glu Ser Ala

980 985 990

Val Ala Glu Leu Arg Glu Arg Arg Leu Leu Ile Arg Leu Pro Leu His

995 1000 1005

Leu Gly Leu Leu Ala His Ala Gln His Ser Ser Gly Ala Ala Glu

1010 1015 1020

Asp Ala Arg Arg Thr Leu Arg Ser Ser Thr Ala Glu Ala Arg Ser

1025 1030 1035

Arg Gly Glu Leu Ala Tyr Val Ser Arg Thr Leu Pro Phe Thr Arg

1040 1045 1050

Leu Cys Pro Leu Thr Ser Ala Ser

1055 1060

<210>3

<211>1691

<212>DNA

<213>圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)

<400>3

ggatccgcgg ttcatggccg cgaaccatcg cgtcctcacc ctgaggctgc tcggcgccac 60

cgacgaggcg cgggcgctgt gcgaggagct gctggtagcc accggcctgg acggcacgcc 120

ggtcgaccag gcgagcgcgt actacttcca ctccctgaca gcggccctgg gcgaggaccc 180

cgacggggcg gcggcctcca gcggccgggg cctggacatc gcccgcgccc acgggctgag 240

ccactggacc gccatgctcc aggtgtgccg gagctgggca ctccaccaga gcggcgaggc 300

cgccgcactc gacagcctgg aatcggccgt cgccgagctg cgcgagcggc ggctgctcat 360

ccggctgccg ctccacctgg gcctgctggc ccacgcccag cacagcagcg gggcggccga 420

agacgccaga cggacgctgc ggtcgtcgac cgcggaggcc agatcccgcg gggagttggc 480

ctatgtgagc cgcactctgc cgttcacccg gctgtgtccc ctgacgtccg cttcgtagcg 540

gccggatcgt cggttccttc gcctctcagc cgggcgcggg cctggccggc ctcggggtgg 600

ccgagtccgt cgagggtccg cgccgcctcc cgccacaggg cagggcggcg gggcggtctc 660

cccgggactc gtgggtgtct cccatgtgat ggacccagcg ggtactgcgt gctcctccgg 720

ggcagcagcg gcaggaccgg gaagggtgtg ccgggcgccg gcatcaggtc ggcgccctca 780

cgcagggcgg ccaggtgttc gctgtcgacg gcggaaaaca gggggtgcac ccggattacc 840

gggggactcc ccgcgctgct tctccgcgcc ggagggagag ggcctgggcg tagagctcgg 900

cggcggcgca ccggcagggc ccccgggggc ggagcgggga gtcgggcttc agcggtttcc 960

gcaaggagcc gatgtggcgg tggacgacgt ccacggtgct gttcggcggg tcgccgtgcc 1020

acaggacgtc gacgatctgg ctcaggccga cggtctgtcc ggcgtgcaac ggcaacgccg 1080

gcaaggcgcg ctgcttcggt ggtccgaggg cgactcggcg cctgaccgcc acactgcgac 1140

cggccccagg accatggtgg tcctggtgtt cgtgatcttc ctcgccgtgc ggcccgtcaa 1200

cgagggtggc tggtccggga cgggtggtcg tagcgccgtt cgttgtaact gagcatgtcg 1260

atgaggcccc gggcggtgag ccgctgccgg ttccgggcca gatcgcgcgc ccggggaatc 1320

ggcacccctg cggggtcggc ccaggtgagc cggccacggt cgtcgatgcg ggcccggcag 1380

cggttcgcgt tgtcctggtg caggcagaac gggatgtcga ggtgtccgag ggcgaacgcg 1440

cgaacgagcg cctttccgac atcgctgccg agggtcagcg tgtgcgtgat gatcgcctgg 1500

gcctcctcgt agatcccgga gtccggaatt ccggccggtt cggccaccgc ctcccgctcg 1560

gccgcccacg cggcgcgttc gagggcgtcg acgttctccg tgatcgacgg gattctgctg 1620

gcctccaccg cggtcttgac gatcagccgc tcggtcccgg acctggcggc gagcctcgca 1680

ctctcctcga g 1691

Claims

1、一种尼可霉素生物合成调控基因，是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸。

2、根据权利要求1所述的基因，其特征在于：所述基因是序列表中的SEQ ID №：1。

3、尼可霉素生物合成调控蛋白，它是氨基酸序列如SEQ ID №：2所示的蛋白质，或者是将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。

4、根据权利要求3所述的蛋白，其特征在于：所述蛋白是氨基酸残基序列如SEQID №：2所示的蛋白质。

5、含有权利要求1所述基因的表达载体。

6、含有权利要求1所述基因的转基因工程菌。

7、根据权利要求6所述的工程菌，其特征在于：所述工程菌为圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)NK2 CGMCC № 1181。

8、权利要求1所述基因在尼可霉素生产中的应用。

9、圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)NK2 CGMCC №1181在尼可霉素生产中的应用。