CN102676414B - 一种基于西班牙盐盒菌和pyrF基因的遗传操作系统及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于西班牙盐盒菌和pyrF基因的遗传操作系统及其应用。该遗传操作系统包括重组嗜盐古菌和重组质粒载体；重组嗜盐古菌按照包括如下步骤的方法制备得到：使含有SEQ ID NO：1所示蛋白的编码基因的出发嗜盐古菌中的SEQ ID NO：1所示蛋白的编码基因的功能丧失，得到的重组菌为所述重组嗜盐古菌；重组质粒载体中至少含有如下元件：在大肠杆菌中复制所需的复制原点、用于筛选大肠杆菌转化子的抗性选择标记基因的表达盒、SEQ ID NO：1所示蛋白的编码基因的表达盒、供外源基因插入的多克隆位点。该遗传操作系统可作为一个高效的基因敲除系统，可以对Haloarcula hispanica进行广泛的基因功能研究和代谢途径阐明。实验证明，用本发明系统进行遗传转化获得阳性重组子的频率大大提高。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于西班牙盐盒菌和pyrF基因的遗传操作系统及其应用。
背景技术
1977年，美国人Woese发现了地球上的第三种生命形式-古菌，才导致了生命三域学说的提出，即认为生命是由古菌域(Archaea)、细菌域(Bacteria)和真核生物域(Eucarya)所组成。古菌域包括泉古菌门(Crenarchaeota)、广古菌门(Euryarchaeota)、初古菌门(Korarchaeota)和纳古菌门(Nanoarchaeota)。
古菌在遗传信息的传递方面(如DNA复制、转录、翻译等)与真核生物相似；而在中心代谢(如产能)方面则与细菌接近。因此，研究古菌不仅对于阐明生命运动的基本规律、揭示生命起源和物种进化等方面具有重大意义，而且有助于了解更为复杂的真核生物中的一些重要生物学过程。从生物技术的角度看，通常生长在极端环境条件下的古菌所产生的极端酶比普通酶更能耐受严酷条件(如高温、酸碱、有机溶剂等)，因而古菌在许多领域具有良好的应用前景。
极端嗜盐古菌在系统进化树中位于古菌域的一个分支-广古菌门，它能生长在含有约2-5M NaCl的近饱和盐浓度(如晒盐场、盐湖和死海等)的环境中，且具有古菌的特质，极端嗜盐古菌日益引起生物学家的关注。另外，极端嗜盐古菌极具开发前景，如在这类微生物中存在大量可供开发的极端酶类、生物活性物质、可生物降解的塑料PHA和可作为纳米生物材料用于构造生物分子器件的紫膜等。近年虽然在分子遗传学方面有些进展，比如Polyethylene glycol(PEG，聚乙二醇)介导的极端嗜盐古菌原生质体转化方法的建立、基因敲除，基因互补和定点突变等技术在极端嗜盐古菌中的应用，但仅局限在某些种属中，不具有普遍适用性，从而限制了对其他菌株的深入研究。另外，一般用于极端嗜盐古菌抗性选择的主要是新生霉素、茴香霉素、莫维诺林和硫链丝菌素等，但这些抗性选择标记基因多来源于菌体自身基因突变后克隆得到的，应用于整合质粒载体系统转化后，易发生与菌体相应的内源基因发生高频同源重组，导致假阳性转化子的产生。且这些抗生素的选择压力较弱，常常得不到转化子。这种情况，极大地阻碍了对嗜盐古菌的深入系统的理论研究和基因工程开发。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种重组嗜盐古菌。
本发明所提供的重组嗜盐古菌，按照包括如下步骤的方法制备得到：使含有SEQ IDNO：1所示蛋白的编码基因的出发嗜盐古菌中的SEQ ID NO：1所示蛋白的编码基因的功能丧失，得到的重组菌为所述重组嗜盐古菌。
上述任一所述重组嗜盐古菌中，所述含有SEQ ID NO：1所示蛋白的编码基因的出发嗜盐古菌为西班牙盐盒菌(Haloarcula hispanica)。
上述任一所述重组嗜盐古菌中，所述西班牙盐盒菌(Haloarcula hispanica)为保藏编号为CGMCC1.2049的西班牙盐盒菌(Haloarcula hispanica)。
上述任一所述重组嗜盐古菌中，所述使含有SEQ ID NO：1所示蛋白的编码基因的出发嗜盐古菌中的SEQ ID NO：1所示蛋白的编码基因的功能丧失为敲除所述出发嗜盐古菌中的SEQ ID NO：1所示蛋白的编码基因；
上述任一所述重组嗜盐古菌中，所述敲除是通过同源重组实现的；
上述任一所述重组嗜盐古菌中，所述同源重组通过如下同源重组载体实现：所述同源重组载体按照包括如下步骤的方法构建：将SEQ ID NO：2中第1-585位核苷酸所示DNA沿着从PstI至BamHI的方向插在载体pUBP的PstI和BamHI位点间，得到的重组载体记作中间重组载体；将SEQ ID NO：2中第1395-1942位核苷酸所示DNA沿着从BamHI至KpnI的方向插在载体pUBP的BamHI和KpnI位点间，得到的重组载体即为所述同源重组载体；
上述任一所述重组嗜盐古菌中，所述SEQ ID NO：1所示蛋白的编码基因为如下1)或2)或3)或4)所示：
1)其核苷酸序列是SEQ ID NO：2中自5′末端第597-1430位核苷酸所示DNA分子；
2)其核苷酸序列是SEQ ID NO：2中自5′末端第477-1430位核苷酸所示DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
4)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。
本发明的另一个目的是提供一种试剂盒。
本发明所提供的试剂盒，包括上述任一所述的重组嗜盐古菌和如下重组质粒载体；所述重组质粒载体中至少含有供外源基因插入的多克隆位点和如下其它三个元件：在大肠杆菌中复制所需的复制原点、用于筛选大肠杆菌转化子的抗性选择标记基因的表达盒、SEQ ID NO：1所示蛋白的编码基因的表达盒、供外源基因插入的多克隆位点；
所述供外源基因插入的多克隆位点不与所述其它三个元件重叠。
上述试剂盒中的重组质粒载体中既含有大肠杆菌质粒复制子(即在大肠杆菌中复制所需的复制原点)又含有用于筛选大肠杆菌转化子的抗性选择标记基因的表达盒，方便在大肠杆菌中进行基因操作及在嗜盐古菌中进行遗传操作。
上述任一所述试剂盒中，所述重组质粒载体优选如下：所述重组质粒载体中的各个元件之间的排列顺序没有要求，但各个元件之间不相互重叠。
上述任一所述试剂盒中，所述重组质粒载体按照包括如下步骤的方法制备得到：将SEQ ID NO：2中第477-1430位核苷酸所示基因插在载体pUBP的多克隆位点间，得到的重组载体即为所述重组质粒载体。
上述任一所述试剂盒中，所述重组载体具体按照包括如下步骤的方法制备得到：将SEQ ID NO：2中第477-1430位核苷酸所示基因沿着从EcoRI至KpnI的方向插在载体pUBP的EcoRI和KpnI位点间，得到的重组载体即为所述重组质粒载体。该质粒的物理图谱如图1所示，其多克隆位点包括的限制性内切酶酶切位点有SphI，PstI，BamHI，KpnI和EcoRI等酶切位点各一个，两个HindIII酶切位点。这些内切酶识别位点可以方便的进行外源片段的克隆及其衍生载体的构建。
上述任一所述试剂盒中，所述试剂盒中包括筛选培养基I和/或筛选培养基II；
每1升所述筛选培养基I由酸水解酪素、谷氨酸钠、柠檬酸钠、NaCl、MgSO4·7H2O、KCl、FeSO4·7H2O、MnCl2·4H2O、尿嘧啶、5-FOA和水组成，其中各组分在所述筛选培养基I中的浓度为：酸水解酪素5.0g/L、谷氨酸钠1.0g/L、柠檬酸钠3.0g/L、NaCl200g/L、MgSO4·7H2O 20g/L、KCl 2.0g/L、FeSO4·7H2O 0.36g/L、MnCl2·4H2O 0.36mg/L、尿嘧啶50mg/L、5-FOA 150mg/L；所述筛选培养基I的pH值为7.1-7.2；(此为筛选双交换菌株的培养基)
每1升所述筛选培养基II由酸水解酪素、谷氨酸钠、柠檬酸钠、NaCl、MgSO4·7H2O、KCl、FeSO4·7H2O、MnCl2·4H2O和水组成，其中各组分在所述筛选培养基II中的浓度为：酸水解酪素5.0g/L、谷氨酸钠1.0g/L、柠檬酸钠3.0g/L、NaCl 200g/L、MgSO4·7H2O20g/L、KCl 2.0g/L、FeSO4·7H2O 0.36g/L、MnCl2·4H2O 0.36mg/L；所述筛选培养基II的pH值为7.1-7.2。(此为筛选单交换菌株的培养基)
上述任一所述试剂盒在如下1)或2)或3)中的应用也属于本发明的保护范围：
1)敲除上述任一所述重组嗜盐古菌的基因组中目的基因；
2)在上述任一所述重组嗜盐古菌中过表达外源基因；
3)研究菌(Haloarcula hispanica)的基因组中待测基因的功能。
本发明的另一个目的是提供一种蛋白及其编码基因。
本发明所提供的蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：
a)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)将SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有乳清酸核苷-5′-单磷酸脱羧酶活性的由a)衍生的蛋白质。
本发明所提供的蛋白的编码基因为如下1)或2)或3)或4)所示：
1)其核苷酸序列是SEQ ID NO：2中自5′末端第597-1430位核苷酸所示DNA分子；
2)其核苷酸序列是SEQ ID NO：2中自5′末端第477-1430位核苷酸所示DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
4)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。
含有上述任一所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系、重组病毒或表达盒也属于本发明的保护范围；
SEQ ID NO：1所示蛋白的编码基因在基因工程中作为选择标记的应用也属于本发明的保护范围。
所述基因工程是与含有SEQ ID NO：1所示蛋白的编码基因的极端嗜盐古菌相关的基因工程。
所述SEQ ID NO：1所示蛋白的编码基因为如下1)或2)或3)或4)所示：
1)其核苷酸序列是SEQ ID NO：2中自5′末端第597-1430位核苷酸所示DNA分子；
2)其核苷酸序列是SEQ ID NO：2中自5′末端第477-1430位核苷酸所示DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
4)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。
本发明的遗传操作系统，包含2个组分，一部分为整合质粒载体pHAR，另一部分为Har.hispanicaΔpyrF尿嘧啶营养缺陷型宿主菌。该遗传操作系统可作为一个高效的基因敲除系统，可以对Har.hispanica进行广泛的基因功能研究和代谢途径阐明。实验证明，用本发明系统进行遗传转化获得阳性重组子的频率大大提高。本发明丰富了嗜盐古菌中的选择标记基因，增加选择的压力，易于阳性转化子的筛选，利于对嗜盐古菌展开系统的大规模的功能基因组学分析，并从中发现嗜盐古菌这个群体中共性和个性的遗传代谢、进化生态、物种起源等的机理。本发明为极端嗜盐古菌的研究和开发提供了重要工具，将在极端嗜盐古菌的研究和开发中发挥重要作用。
附图说明
图1为整合质粒载体pHAR构建过程示意图
图2为PyrF蛋白氨基酸序列与Halobacterium salinarum Ura3蛋白(NCBI编号AF187997)多序列比对示意图
图3为pyrF基因RT-PCR的琼脂糖凝胶电泳图谱
图4为利用pHAR整合质粒载体敲除目的基因原理示意图
图5为pyrF基因上下游结构图与Har.hispanicaΔpyrF突变体PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图及Southern blot验证结果
图6为crtB基因上下游结构图与Har.hispanicaΔpyrFΔcrtB突变体PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图及Southern blot验证结果
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
西班牙盐盒菌(Haloarcula hispanica)CGMCC 1.2049购自中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)。
pUCm-T载体购自Beyotime，产品目录号为D2006。
载体pUBP在文献“Han，J.，Q.Lu，et al.(2007).″Molecular characterization of thephaEC(Hm)，genes，required for biosynthesis of poly(3-hydroxybutyrate)in the extremelyhalophilic Archaeon Haloarcula marismortui″Applied and Environmental Microbiology 73(19)：6058-6065.”中公开过，公众可从中国科学院微生物研究所获得。
实施例1、乳清酸核苷-5′-单磷酸脱羧酶PyrF及其编码基因的获得
对西班牙盐盒菌(Haloarcula hispanica)CGMCC 1.2049进行基因组测序，研究其结构，结果该基因组中有一个orf被注释为pyrF。设计一对引物P1/P2进行PCR扩增pyrF编码基因及其启动子序列，引物序列如下：
P1：5′TATGAATTCGAGCGGGCTTCTACCTGC3′(EcoRI)
P2：5′GGCGGTACCTTAGCGGAACTGATTCAG3′(KpnI)
以西班牙盐盒菌(Haloarcula hispanica)CGMCC 1.2049的基因组为模板，用引物对P1和P2为上下游引物进行PCR扩增，得到954bp长度的PCR产物。
上述PCR扩增程序为：94℃3min预变性；然后94℃30s、57℃30s、72℃60s进行30个循环；72℃再延伸7min。扩增体系为25μl。
将PCR扩增产物片段连接到pUCm-T载体上进行测序，测序结果表明在pUCm-T载体中插入的基因序列如SEQ ID NO：2中自5′端第477-1430位核苷酸所示，其中SEQID NO：2第477-596位核苷酸为基因PyrF的启动子区域，第597-1430位核苷酸为基因PyrF的编码框，第567-573位核苷酸序列为启动子核心序列；基因PyrF编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示(记作PyrF蛋白)。表明引物对P1/P2扩增得到了954bp的序列，正确。
实施例2、pyrF基因功能鉴定
每升AS-168培养基按照如下方法制备：将5.0g酸水解酪素(casamino acids)，5.0g酵母提取物(yeast extract)，1.0g谷氨酸钠(sodium glutamate)，3.0g柠檬酸钠，200g NaCl，20g MgSO4·7H2O，2.0g KCl，0.36g FeSO4·7H2O和0.36mg MnCl2·4H2O溶于蒸馏水中，用蒸馏水定容至1升，pH 7.1-7.2。
酸水解酪素购自Bacto Difco，产品目录号为223120。酵母提取物购自OXOID，产品目录号为LP0021。
1.RT-PCR检测Har.hispanica CGMCC 1.2049中pyrF基因的转录情况。
1)培养条件：挑取Har.hispanica CGMCC 1.2049单菌落于AS-168培养基37℃摇床，200rpm，培养4天。
2)RNA提取：取灭菌的1.5ml EP管收集1.5ml菌液，4℃，12000rpm，离心1min，用移液枪吸尽上清。加入1ml TRIzol试剂(invitrogen)裂解菌体，有机溶剂抽提去除细胞碎片、脂类和蛋白，得到总RNA，溶解于20-30μl DEPC水中。取1.5μl RNA溶液加入到300μl TE溶液中，用Beckman DU800测定其浓度，对照为300μl TE加入1.5μl DEPC水。测得OD260/280为2.02，说明RNA的纯度符合下一步的实验要求。计算得到RNA的浓度为6.28μg/μl。取总RNA 15μg用RNase-free RQ1 DNase(Promega)处理，50μL体系(DNase buffer 5μl，DNase 5μl，15μg RNA，DEPC水补足至50μl)，37℃反应4-5h；70℃，10min失活DNase，以此作为RT模板。
3)RT-PCR检测：
根据pyrF的核苷酸序列，设计一对RT-PCR引物pyrFRTF/pyrFRTR，引物序列如下：
pyrFRTF：5′AGTTCAACCGCCGCATCAT3′
pyrFRTR：5′GGAGAAACGGCTCCAACGAG3′
以DNase消化后的RNA为模板，利用OneStep RT-PCR试剂盒(Qiagen公司)，根据说明书步骤进行RT-PCR。程序分为两步：第一步，利用RT-PCR后引物pyrFRTR，以总RNA为模板，将目的RNA反转录成cDNA；第二步，利用引物对pyrFRTF/pyrFRTR，以上步的cDNA为模板，进行PCR。以未经Dnase消化的总RNA作阴性对照。结果如图3所示：泳道1为RT-PCR条带279bp；泳道2为未经Dnase消化的总RNA模板阴性对照；泳道M为100bp DNAladdermarker。从图3可以看出pyrF基因是活跃转录的。另外，通过检索基因组注释，发现该基因在基因组中仅有一个拷贝，有利于后续基因的敲除、互补和营养缺陷型菌株的获得。
2.敲除pyrF基因，以获得尿嘧啶营养缺陷型宿主
1)敲除pyrF基因的同源重组整合质粒载体pUBPΔpyrF的构建
<1>用于敲除pyrF的同源重组双交换臂的PCR扩增
根据SEQ ID NO：2中pyrF基因编码序列及其上下游核苷酸序列，设计了两对双交换臂的扩增引物pyrFF1/pyrFR1和pyrFF2/pyrFR2：
pyrFF1：5′ATACTGCAGCGACTCGGCTCGGCAATA3′(PstI)
pyrFR1：5′AATGGATCCCGGCTGGCAGCGATACAA3′(BamHI)
pyrFF2：5′GCGGGATCCAAACAGCTCAAACAGCGACTG3′(BamHI)
pyrFR2：5′GCTGGTACCCCAGCATTCCGAGTATCCA3′(KpnI)
以Har.hispanica CGMCC 1.2049的基因组DNA为模板，用引物对pyrFF1/pyrFR1扩增破坏pyrF的双交换左臂585bp，如图5A所示。PCR扩增程序为：94℃3min预变性；94℃30s、57℃30s、72℃40s进行30个循环；72℃延伸7min。扩增体系为25μl。将PCR扩增产物片段连接到pUCm-T载体上进行测序，测序结果表明引物对pyrFF1/pyrFR1扩增得到了585bp的序列，具有SEQ ID NO：2的自5′端第1-585位核苷酸序列；
以Har.hispanica CGMCC 1.2049的基因组DNA为模板，用引物对pyrFF2/pyrFR2扩增敲除pyrF的双交换右臂548bp，如图5A所示。PCR扩增程序为：94℃3min预变性；94℃30s、57℃30s、72℃40s进行30个循环；72℃延伸7min。扩增体系为25μl。将PCR扩增产物片段连接到pUCm-T载体上进行测序，测序结果表明引物对pyrFF2/pyrFR2扩增得到了548bp的序列，具有SEQ ID NO：2的自5′端第1395-1941位核苷酸序列。
<2>敲除pyrF的整合质粒载体pUBPΔpyrF的构建
将经限制性内切酶PstI和BamHI双酶切的载体pUBP和PCR产物左臂585bp，T4 DNA ligase 16℃连接过夜，然后热激转化法将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态，在含有氨苄青霉素抗性的平板上进行筛选，将获得的阳性克隆进行测序；测序结果表明片段585bp(其核苷酸序列为序列表中序列2的自5′末端第1-585位核苷酸序列)已经正确插入载体pUBP的PstI和BamHI位点间(沿着从PstI至BamHI的方向)，将其命名为重组载体pUBP585。
将经BamHI和KpnI双酶切的重组载体pUBP585和PCR产物右臂548bp，连接酶T4 DNA ligase 16℃连接过夜，然后热激转化法将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态，在含有氨苄青霉素抗性的平板上进行筛选，将获得的阳性克隆进行测序；结果表明片段548bp(其核苷酸序列为序列表中序列2的自5′末端第1395-1942位核苷酸序列)已经正确插入载体pUBP585的BamHI和KpnI位点间(沿着从BamHI至KpnI的方向)，得到含有左臂585bp和右臂548bp的双交换整合质粒载体，并将其命名为pUBPΔpyrF。该质粒中左臂585bp和右臂548bp连在一起构成的片段记作ΔpyrF。
2)构建pyrF缺失营养缺陷型突变株Har.hispanicaΔpyrF
利用pUBPΔpyrF的双交换臂与Har.hispanica基因组中的pyrF进行同源重组，敲除pyrF基因，具体步骤如下所述：
<1>整合质粒载体pUBPΔpyrF转化Har.hispanica
采用文献(Cline，S.W.，W.L.Lam，et al.(1989).″Transformation methods forhalophilic archaebacteria.″Can J Microbiol 35(1)：148-152.)所述PEG介导的转化方法，将pUBPΔpyrF转化Har.hispanica CGMCC 1.2049，转化后在含有5mg/L莫维诺林的AS-168(AS-168培养基+5mg/L莫维诺林)固体平板上筛选转化子，能在含有5mg/L莫维诺林的AS-168上生长的克隆即为成功转入pUBPΔpyrF的重组菌。
<2>筛选和验证pUBPΔpyrF发生整合的单交换菌株
对步骤<1>得到的转化子分别进行PCR验证：抽取总DNA，以引物对pyrFF1/pyrFR2进行PCR反应，PCR扩增程序为：94℃3min预变性；94℃30s、57℃30s、72℃60s进行30个循环；72℃延伸7min。扩增体系为25μl。产生1942bp和1133bp条带的菌为目的单交换菌株。
单交换筛选原理：发生单交换时，pUBPΔpyrF质粒整合入Har.hispanica基因组同源区域，在单交换菌株中存在一个拷贝的完整的pyrF基因和一个拷贝的ΔpyrF，以引物对pyrFF1/pyrFR2进行PCR扩增，以完整的pyrF基因为模板，扩增得到1942bp，以ΔpyrF为模板，扩增得到1133bp，因此，以单交换菌株的基因组为模板可扩增出大小分别为1942bp和1133bp的两条带。
PCR鉴定结果如图5B所示：泳道1为单交换菌；泳道3为pUBPΔpyrF质粒阳性对照；泳道4为Har.hispanica CGMCC 1.2049野生型阴性对照。从图中看出，阴性对照的的PCR产物大小1942bp，阳性对照的PCR产物大小1133bp，泳道1的PCR产物大小分别为1942bp和1133bp，说明对应的菌株为pUBPΔpyrF质粒发生单交换整合入Har.hispanica基因组同源区域的重组菌株。以其基因组为模板可扩增出大小分别为1942bp和1133bp的两条带，表明得到正确的发生单交换整合的Har.hispanica重组菌株。
<3>双交换菌株Har.hispanicaΔpyrF的筛选
将步骤<2>筛选到的pyrF单交换菌株在不含莫维诺林的液体AS-168培养基中传代培养50代，重复转接培养4次后将传代培养的培养液稀释107涂布固体AS-168培养基平板，培养一周左右。挑取单克隆同时在AS-168固体平板上及含5mg/L莫维诺林的AS-168的固体培养基上划线。一周后，挑取在抗性平板(含5mg/L莫维诺林的AS-168的固体培养基)上不生长但在非抗性平板(AS-168固体平板)上生长的单菌落，即为目的双交换菌株，记作重组菌Har.hispanicaΔpyrF。
PCR验证：抽提重组菌Har.hispanicaΔpyrF的基因组DNA作为模板，同样以引物对pyrFF1/pyrFR2进行PCR验证，反应体系和条件与筛选单交换菌株相同。扩增只得到1133bp一条带的菌株为目的双交换菌株。
Southern blot验证：参照DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I(Roche)说明书进行，先提取重组菌Har.hispanicaΔpyrF的基因组DNA及对照菌株Har.hispanica野生型的基因组DNA，用限制性内切酶PstI进行消化，消化后的产物用于杂交(图5A)。Southern blot中使用的探针为上述pyrF的双交换右臂585bp片段，并用地高辛标记。杂交得到2473bp条带的菌株为双交换菌株，杂交得到3282bp条带的菌株为Har.hispanica野生型菌株。
PCR鉴定结果如图5B所示：泳道2为双交换菌株。泳道2中显示PCR产物大小为1133bp，说明对应的菌株为发生双交换导致pyrF基因缺失的Har.hispanica。Southernblot鉴定结果，见图5C。泳道1为野生型，泳道2为双交换菌株。Southern blot结果显示双交换菌株仅含有2473bp小片段，野生型对照菌株含有3282bp大片段，表明得到的目的双交换菌株正确。
整合质粒载体pUBPΔpyrF中的SEQ ID NO：2中第1-585位核苷酸所示DNA和SEQ ID NO：2中第1395-1942位核苷酸所示DNA与Har.hispanica中的完整基因pyrF发生同源重组，使缺失突变株Har.hispanicaΔpyrF中缺失了基因pyrF中的SEQ IDNO：2中第586-1394位核苷酸。
<4>Har.hispanicaΔpyrF对5-氟乳清酸(5-FOA)抗性检测
每升AS-168SY培养基按照如下方法制备：将5.0g酸水解酪素，1.0g谷氨酸钠，3.0g柠檬酸钠，200g NaCl，20g MgSO4·7H2O，2.0g KCl，0.36g FeSO4·7H2O和0.36mg MnCl2·4H2O溶于蒸馏水，用蒸馏水容至1升，得到的混合物即为AS-168SY培养基，用10M NaOH手动调节pH 7.1-7.2。
将Har.hispanicaΔpyrF和Har.hispanica CGMCC 1.2049野生型分别划线于添加终浓度为50μg/ml尿嘧啶(Uracil)和终浓度为150μg/ml 5-氟乳清酸(5-Fluorooroticacid，5-FOA)的AS-168SY培养基，于37℃培养，一周后观察菌的生长情况。结果Har.hispanicaΔpyrF突变体获得了5-FOA抗性，为尿嘧啶营养缺陷型菌株，而野生型菌株受到抑制，不能长出单菌落，为尿嘧啶原养型。这是因为，Har.hispanica CGMCC 1.2049体内存在从头合成尿嘧啶核苷酸的途径，因而能以5-FOA(5-fluoroorotic acid)为底物代谢产生对细胞有毒性的5-氟尿嘧啶(5-FU，5-fluorouracil)，因此野生型菌株在含有5-FOA的培养基中不能存活；而基因pyrF(Orotidine 5′-phosphate decarboxylase)正是尿嘧啶核苷酸合成途径最后一步的关键酶，Har.hispanicaΔpyrF中缺失了pyrF基因，失去了尿嘧啶核苷酸合成能力，并失去了催化5-FOA产生细胞毒性化合物5-FU能力，因而Har.hispanicaΔpyrF能在有5-FOA的培养基上生长，并且培养基中需要含有尿嘧啶。
pUBP这个质粒不具备在Har.hispanica CGMCC 1.2049中复制的复制子，因而不能单独转，只能在克隆入同源片段后靠同源重组才能整合进基因组。
上述实验只是提供了一个间接证据，证明该基因pyrF确实在尿嘧啶核苷酸合成途径中起作用，而图2的蛋白多序列比对结果显示，PyrF蛋白序列与已报道的Hbt.Salinarum中的Ura3有69％的序列相似性，可以证明该基因确实编码乳清苷-5′-单磷酸脱羧酶。
pyrF基因功能的阐明，有助于后续敲除和表达载体的构建，可以作为一个十分有效地选择标记基因应用于其他遗传操作系统。
实施例3、构建基于pyrF基因的整合质粒载体pHAR
将实施例1中pUCm-PyrF(含pyrF全长且含自身启动子)用限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切并切胶回收目的基因pyrF片段；将载体pUBP用限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切，回收载体大片段，将载体大片段与目的基因pyrF片段用T4 DNA ligase16℃连接过夜，构建过程如图1所示。然后热激转化法将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态，在含有氨苄青霉素抗性的平板上进行筛选，将获得的阳性克隆快抽检测，并提质粒进行测序，结果在载体pUBP的EcoRI和KpnI位点间沿着从EcoRI至KpnI的方向插入了SEQ ID NO：2中第477-1430位核苷酸所示基因，表明构建的重组载体正确，将阳性重组载体记作pHAR。
载体pHAR中含有如下四个元件：在大肠杆菌中复制所需的复制原点，即大肠杆菌质粒复制子E.coii ori；用于筛选大肠杆菌转化子的抗性选择标记基因AmpR(氨苄青霉素抗性基因)的表达盒；乳清苷-5′-单磷酸脱羧酶的编码基因pyrF的表达盒；供外源基因插入的多克隆位点。上述四个元件均不相互重叠，各个元件之间的排列顺序没有特别要求。
该载体pHAR的物理图谱如图1所示，其多克隆位点包括的限制性内切酶酶切位点有SphI，PstI，BamHI，KpnI和EcoRI等酶切位点各一个，两个HindIII酶切位点；这些内切酶识别位点可以方便的进行外源片段的克隆及其衍生载体的构建。多克隆位点在基因pyrF的表达盒的上游，不与大肠杆菌中复制所需的复制原点、抗性选择标记基因AmpR(氨苄青霉素抗性基因)的表达盒和乳清苷-5′-单磷酸脱羧酶的编码基因pyrF的表达盒重叠。
载体pHAR中，既含有大肠杆菌质粒复制子(即在大肠杆菌中复制所需的复制原点)又含有用于筛选大肠杆菌转化子的抗性选择标记基因的表达盒)，方便在大肠杆菌中进行基因操作及在嗜盐古菌中进行遗传操作。
载体pHAR中不具备在Har.hispanica CGMCC 1.2049中复制的复制子，但可以在克隆入同源片段后靠同源重组整合入Har.hispanica的基因组。
该载体中pyrF基因可以赋予Har.hispanicaΔpyrF尿嘧啶核苷酸从头合成能力，因而能在尿嘧啶营养缺陷型培养基AS-168SY上生长，因而达到正向选择转化子的目的。
至此，整合质粒载体pHAR结合实施例2中敲除得到的Har.hispanicaΔpyrF尿嘧啶营养缺陷型宿主菌组成了一个高效的基因敲除系统，可以对Har.hispanica进行广泛的基因功能研究和代谢途径阐明。
Har.hispanicaΔpyrF和载体pHAR组成遗传操作系统的原理：Har.hispanica内存在从头合成尿嘧啶核苷酸的途径，因而能以5-FOA(5-fluoroorotic acid)为底物代谢产生对细胞有毒性的5-氟尿嘧啶(5-FU，5-fluorouracil)。而pyrF(Orotidine 5′-phosphate decarboxylase)正是尿嘧啶核苷酸合成途径最后一步的关键酶，该基因缺失突变后的菌将失去尿嘧啶核苷酸合成能力和失去催化5-FOA产生细胞毒性化合物5-FU能力，从而Har.hispanicaΔpyrF能在含有5-FOA的培养基上生长，野生型却不能。将含有外源基因的待整合质粒载体pHAR转化Har.hispanicaΔpyrF后，首先质粒载体pHAR与Har.hispanicaΔpyrF发生单交换，然后再发生双交换，最后实现目的基因的敲除。
实施例4、系统的应用-敲除八氢番茄红素合成酶crtB基因
利用Har.hispanicaΔpyrF和pHARΔcrtB敲除Har.hispanicaΔpyrF中的crtB基因，具体步骤如下：
1、敲除crtB的整合质粒载体pHARΔcrtB的构建
1)用于敲除crtB的同源重组双交换臂的PCR扩增
根据SEQ ID NO：3中crtB基因编码序列及其上下游核苷酸序列，设计了两对双交换臂的扩增引物crtBF1/crtBR1和crtBF2/crtBR2：
crtBF1：5′ATTGGTACCAAGCGTGGTCGAGCAGGTCC3′(KpnI)
crtBR1：5′TTAGGATCCCGTCGCGCACTTGTCGGCAG3′(BamHI)
crtBF2：5′AATGGATCCCAGCCACGCACCGGGTATCG3′(BamHI)
crtBR2：5′ATACTGCAGCGCCGACGGTCCGCCACTCC3′(PstI)
以Har.hispanica CGMCC 1.2049的DNA为模板，用引物对crtBF1/crtBR1扩增破坏crtB的双交换左臂517bp，如图6A所示。PCR扩增程序为：94℃3min预变性；94℃30s、57℃30s、72℃30s进行30个循环；72℃延伸7min。扩增体系为25μl。将PCR扩增产物片段连接到pUCm-T载体上进行测序，测序结果表明引物对crtBF1/crtBR1扩增得到了504bp的序列，具有SEQ ID NO：3的自5′端第1-517位核苷酸序列；
以Har.hispanica CGMCC 1.2049的DNA为模板，用引物对crtBF2/crtBR2扩增敲除crtB的双交换右臂528bp，如图6A所示。PCR扩增程序为：94℃3min预变性；94℃30s、57℃30s、72℃30s进行30个循环；72℃延伸7min。扩增体系为25μl。将PCR扩增产物片段连接到pUCm-T载体上进行测序，测序结果表明引物对crtBF2/crtBR2扩增得到了562bp的序列，具有SEQ ID NO：3的自5′端第1524-2085位核苷酸序列。
2)敲除crtB的整合质粒载体pHARΔcrtB的构建
将经限制性内切酶KpnI和BamHI双酶切的载体pHAR和PCR产物左臂517bp，T4DNA ligase 16℃连接过夜，然后热激转化法将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态，在含有氨苄青霉素抗性的平板上进行筛选，将获得的阳性克隆进行测序；测序结果表明片段517bp(其核苷酸序列为序列表中序列3的自5′末端第1-517位核苷酸序列)已经正确插入载体pHAR的KpnI和BamHI位点间(沿着从KpnI和BamHI的方向)，将其命名为重组载体pHAR517。
将经BamHI和PstI双酶切的重组载体pHAR517和PCR产物右臂562bp，连接酶T4 DNA ligase 16℃连接过夜，然后热激转化法将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态，在含有氨苄青霉素抗性的平板上进行筛选，将获得的阳性克隆进行测序；结果表明片段528bp(其核苷酸序列为序列表中序列3的自5′末端第1524-2085位核苷酸序列)已经正确插入载体pHAR517的BamHI和PstI位点间(沿着从BamHI至PstI的方向)，得到含有左臂517bp和右臂562bp的双交换整合质粒载体，并将其命名为pHARΔcrtB。左臂517bp和右臂562bp一起构成重组片段，记作ΔcrtB。
2、敲除Har.hispanicaΔpyrF中的crtB
利用pHARΔcrtB的双交换臂与Har.hispanicaΔpyrF基因组中的crtB进行同源重组以敲除crtB基因(原理示意图见图4)，构建crtB缺失突变株Har.hispanicaΔpyrFΔcrtB，具体步骤如下：
1)单交换菌株的构建、筛选及验证方法
采用文献(Cline，S.W.，W.L.Lam，et al.(1989).″Transformation methods forhalophilic archaebacteria.″Can J Microbiol 35(1)：148-152.)所述PEG介导的转化方法，将pHARΔcrtB转化Har.hispanicaΔpyrF，转化后涂布筛选培养基II固体平板，在该固体平板上能正常生长的菌为发生单交换的菌。
每1升所述筛选培养基II由酸水解酪素、谷氨酸钠、柠檬酸钠、NaCl、MgSO4·7H2O、KCl、FeSO4·7H2O、MnCl2·4H2O和水组成，其中各组分在所述筛选培养基II中的浓度为：酸水解酪素5.0g/L、谷氨酸钠1.0g/L、柠檬酸钠3.0g/L、NaCl 200g/L、MgSO4·7H2O20g/L、KCl 2.0g/L、FeSO4·7H2O 0.36g/L、MnCl2·4H2O 0.36mg/L；所述筛选培养基II的pH值为7.1。(此为筛选单交换菌株的培养基)
单交换菌株验证：进行PCR验证：抽取单交换菌株的总DNA，以引物对crtBF1/crtBR2进行PCR反应，PCR扩增程序为：94℃3min预变性；94℃30s、57℃30s、72℃60s进行30个循环；72℃延伸7min。扩增体系为25μl。以发生单交换的菌的基因组为模板，扩增出大小分别为1032bp和2061bp的两条带的为目的单交换菌株。
单交换筛选的原理：因为发生crtB单交换时，载体pHARΔcrtB通过双交换左臂或双交换右臂全部整合到Har.hispanicaΔpyrF的基因组上。一方面，为了区分单交换菌株与未转化的Har.hispanicaΔpyrF，筛选培养基II中不含有尿嘧啶；单交换菌株中含有了pyrF基因，菌自身便可以合成尿嘧啶，因此单交换菌在不含有尿嘧啶的AS-168SY固体平板便能生长；而未转化的Har.hispanicaΔpyrFΔpyrF中不含有pyrF基因，不能自身合成尿嘧啶，不能在不含有尿嘧啶的固体平板上生长。另一方面，crtBF1/crtBR2扩增出大小分别为1079bp和2085bp的两条带的菌为目的单交换菌株；发生单交换的菌中含有一个拷贝的完整的crtB基因，还含有另一个拷贝的ΔcrtB，以发生单交换的菌的基因组为模板用引物crtBF1/crtBR2进行PCR扩增，可扩增出大小分别为1079bp和2085bp的两条带，1079bp是对ΔcrtB的扩增结果，2085bp是对完整的crtB基因的扩增结果。
2)双交换菌株的构建、筛选及验证方法
将步骤1)筛选到的crtB单交换菌株在液体AS-168SY(添加终浓度50μg/ml Uracil)培养基中传代培养50代，将传代培养的培养液稀释107涂布于筛选培养基I的平板，37℃培养一周左右。挑取单克隆划线于筛选培养基I的平板，能在筛选培养基I的平板上生长的菌落为发生双交换的菌，记作Har.hispanicaΔpyrFΔcrtB。
每1升所述筛选培养基I由酸水解酪素、谷氨酸钠、柠檬酸钠、NaCl、MgSO4·7H2O、KCl、FeSO4·7H2O、MnCl2·4H2O、尿嘧啶、5-FOA和水组成，其中各组分在所述筛选培养基I中的浓度为：酸水解酪素5.0g/L、谷氨酸钠1.0g/L、柠檬酸钠3.0g/L、NaCl200g/L、MgSO4·7H2O 20g/L、KCl 2.0g/L、FeSO4·7H2O 0.36g/L、MnCl2·4H2O 0.36mg/L、尿嘧啶50mg/L、5-FOA 150mg/L；所述筛选培养基I的pH值为7.1-7.2；
双交换菌株验证：
PCR验证：以Har.hispanicaΔpyrFΔcrtB的基因组DNA作为模板，以引物对crtBF1/crtBR2进行PCR扩增，反应体系和条件与单交换菌株验证相同。扩增结果为1079bp条带的应为目的双交换菌株。
Southern blot验证：方法参照DIG-High Prime DNA Labeling and Detection StarterKit I(Roche)说明书进行，具体为：先提取Har.hispanicaΔpyrFΔcrtB的基因组DNA及对照菌Har.hispanicaΔpyrF的基因组DNA，用限制性内切酶PstI/KpnI进行消化，消化后的产物用于杂交(图6A)。Southern blot中使用的探针为上述crtB的双交换右臂517p片段，并用地高辛标记。杂交结果为2473bp条带的为目的双交换菌株，杂交结果为3282bp条带的为对照菌Har.hispanicaΔpyrF，该条带由图6A所示的PstI/KpnI双酶切位点之间的片段产生。
双交换菌株筛选验证原理：发生双交换后，单交换菌中的完整的crtB基因被替换，质粒pHARΔcrtB从单交换菌的基因组中脱离，因此双交换菌株中只含有一个拷贝的ΔcrtB且不再含有完整的crtB基因和pyrF基因。一方面，筛选培养基I需含有尿嘧啶和5-FOA；因为双交换菌中不含有pyrF基因，自身不能合成尿嘧啶，且不能以5-FOA为底物代谢产生细胞毒性物质5-氟尿嘧啶，因此能在含有5-FOA的培养基中生长；而单交换菌株中含有pyrF基因，能以5-FOA为底物代谢产生细胞毒性物质5-氟尿嘧啶，因此不能在含有5-FOA的培养基中生长；所以筛选培养基I中需含有尿嘧啶和5-FOA。另一方面，用引物crtBF1/crtBR2对双交换菌株基因组进行扩增时，只得到一条得到1079bp的条带的菌为目的双交换菌株；因为双交换菌株中含有ΔcrtB，当用引物crtBF1/crtBR2对双交换菌株基因组进行扩增时，其实是对ΔcrtB的扩增结果，因此只得到一条得到1079bp的条带。整合质粒载体pHARΔcrtB中的SEQ ID NO：3中第1-517位核苷酸所示DNA和SEQ ID NO：3中第1524-2085位核苷酸所示DNA与Har.hispanicaΔpyrF中的完整基因crtB发生同源重组，使缺失突变株Har.hispanicaΔpyrFΔcrtB中缺失了基因crtB中的SEQ ID NO：3中第518-1523位核苷酸。
3)单交换菌株与双交换菌株验证
PCR鉴定结果如图6B所示：泳道1为单交换菌株扩增结果，泳道2为双交换菌株扩增结果，泳道3为pHARΔcrtB质粒阳性对照，泳道4为Har.hispanicaΔpyrF阴性对照。从图中看出，阴性对照的PCR产物大小2085bp，阳性对照的PCR产物大小1079bp，泳道1的PCR产物大小分别为1079bp和2085bp，说明单交换菌株鉴定正确，单交换菌株为pHARΔcrtB质粒发生单交换整合入Har.hispanicaΔpyrF基因组同源区域的重组菌株。泳道2的PCR产物大小为1079bp，说明双交换菌株鉴定正确。
Southern blot鉴定结果，见图6C。泳道1为单交换菌株杂交结果，泳道2为双交换菌株杂交结果。泳道1的杂交条带为3282bp bp，泳道2的杂交条带为2473bp；对照菌株Har.hispanicaΔpyrF得到3282bp大片段。表明得到的单交换菌株和双交换菌株均正确。
实施例5、效果验证
实验组：将pHARΔcrtB转化Har.hispanicaΔpyrF，筛选单交换菌株，得到的发生单交换的重组菌为目的重组子。转化方法及筛选方法与实施例4中所述一致。具体实验条件及结果如表1所示。
对照组：将pUBPΔpyrF转化西班牙盐盒菌(Haloarcula hispanica)CGMCC 1.2049，筛选单交换菌株，得到的发生单交换的重组菌为目的重组子。转化方法及筛选方法与实施例2中所述一致。具体实验条件及结果如表1所示。
以上实验均设3次重复，结果取平均值±标准差。
重组率计算公式：重组率＝每板重组子数/转化所用质粒量。
表1
实验结果表明，实验组的阳性重组率明显高于对照组，是对照组的3.9倍，说明实验组与对照组相比阳性转化子的产生率要低1-2个数量级，实验组所用系统更容易得到真正的阳性转化子。且实验组整个实验过程耗时缩短了一半，提高了工作效率。
Claims (11)
1.一种试剂盒，包括如下重组嗜盐古菌和如下重组质粒载体；所述重组质粒载体中至少含有供外源基因插入的多克隆位点和如下其它四个元件：在大肠杆菌中复制所需的复制原点、用于筛选大肠杆菌转化子的抗性选择标记基因的表达盒、SEQ ID NO:1所示蛋白的编码基因的表达盒、供外源基因插入的多克隆位点；
所述供外源基因插入的多克隆位点不与所述其它四个元件重叠；
所述重组质粒载体按照包括如下步骤的方法制备得到：将SEQ ID NO：2中第477-1430位核苷酸所示基因插在载体pUBP的多克隆位点间，得到的重组载体即为所述重组质粒载体；
所述重组嗜盐古菌，按照包括如下步骤的方法制备得到：使含有SEQ ID NO:1所示蛋白的编码基因的出发嗜盐古菌中的SEQ ID NO:1所示蛋白的编码基因的功能丧失，得到的重组菌为所述重组嗜盐古菌；
所述含有SEQ ID NO:1所示蛋白的编码基因的出发嗜盐古菌为西班牙盐盒菌（Haloarcula hispanica）；
所述使含有SEQ ID NO:1所示蛋白的编码基因的出发嗜盐古菌中的SEQ ID NO:1所示蛋白的编码基因的功能丧失为敲除所述出发嗜盐古菌中的SEQ ID NO:1所示蛋白的编码基因；
所述敲除是通过同源重组实现的；
所述同源重组通过如下同源重组载体实现：所述同源重组载体按照包括如下步骤的方法构建：将SEQ ID NO：2中第1-585位核苷酸所示DNA沿着从PstI至BamHI的方向插在载体pUBP的PstI和BamHI位点间，得到的重组载体记作中间重组载体；将SEQ ID NO：2中第1395-1942位核苷酸所示DNA沿着从BamHI至KpnI的方向插在载体pUBP的BamHI和KpnI位点间，得到的重组载体即为所述同源重组载体；
所述SEQ ID NO:1所示蛋白的编码基因，其核苷酸序列是SEQ ID NO：2中自5′末端第597-1430位核苷酸所示DNA分子。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括筛选培养基Ⅰ和/或筛选培养基Ⅱ；
每1升所述筛选培养基Ⅰ由酸水解酪素、谷氨酸钠、柠檬酸钠、NaCl、MgSO4·7H2O、KCl、FeSO4·7H2O、MnCl2·4H2O、尿嘧啶、5-FOA和水组成，其中各组分在所述筛选培养基Ⅰ中的浓度为：酸水解酪素5.0g/L、谷氨酸钠1.0g/L、柠檬酸钠3.0g/L、NaCl200g/L、MgSO4·7H2O20g/L、KCl2.0g/L、FeSO4·7H2O0.36g/L、MnCl2·4H2O0.36mg/L、尿嘧啶50mg/L、5-FOA150mg/L；所述筛选培养基Ⅰ的pH值为7.1-7.2；
每1升所述筛选培养基Ⅱ由酸水解酪素、谷氨酸钠、柠檬酸钠、NaCl、MgSO4·7H2O、KCl、FeSO4·7H2O、MnCl2·4H2O和水组成，其中各组分在所述筛选培养基Ⅱ中的浓度为：酸水解酪素5.0g/L、谷氨酸钠1.0g/L、柠檬酸钠3.0g/L、NaCl200g/L、MgSO4·7H2O20g/L、KCl2.0g/L、FeSO4·7H2O0.36g/L、MnCl2·4H2O0.36mg/L；所述筛选培养基Ⅱ的pH值为7.1-7.2。
3.权利要求1或2所述试剂盒在敲除权利要求1或2所述试剂盒中所述重组嗜盐古菌的基因组中目的基因中的应用。
4.一种蛋白，是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
5.权利要求4所述蛋白的编码基因；其核苷酸序列是SEQ ID NO：2中自5′末端第597-1430位核苷酸所示DNA分子。
6.含有权利要求5所述编码基因的重组载体。
7.含有权利要求5所述编码基因的重组菌。
8.含有权利要求5所述编码基因的转基因细胞系。
9.含有权利要求5所述编码基因的重组病毒。
10.含有权利要求5所述编码基因的表达盒。
11.SEQ ID NO:1所示蛋白的编码基因在基因工程中作为选择标记的应用。
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2011
- 2011-03-08 CN CN201110054379.0A patent/CN102676414B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1712533A (zh) * | 2004-06-25 | 2005-12-28 | 中国科学院微生物研究所 | 一种极端嗜盐古菌质粒及其衍生质粒载体 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| GenbankDatabase.Accession：YP_136142.1.《GenbankDatabase》.2004,Accession：YP_136142.1. * |
| 刘海龙等.极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica PHA 代谢调控的功能基因组学研究.《2010年第四届全国微生物遗传学学术研讨会论文摘要集》.2010,第35页. |
| 极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica PHA 代谢调控的功能基因组学研究;刘海龙等;《2010年第四届全国微生物遗传学学术研讨会论文摘要集》;20100918;第35页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102676414A (zh) | 2012-09-19 |
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