CN102268424A

CN102268424A - 一种与PHBV的3-HV单体合成相关的β-酮硫解酶及其编码基因与应用

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Publication number: CN102268424A
Application number: CN201010195738XA
Authority: CN
Inventors: 向华; 冯博; 韩静
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2010-06-01
Filing date: 2010-06-01
Publication date: 2011-12-07
Anticipated expiration: 2030-06-01
Also published as: CN102268424B

Abstract

本发明提供一种极端嗜盐古菌中与可生物降解材料PHBV的3-HV单体合成相关的β-酮硫解酶的研究与应用，本发明提供的蛋白是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与PHBV和/或3-HV合成相关的由1)衍生的蛋白质。本发明实验证明，将与聚羟基丁酸羟基戊酸酯和/或3-羟基脂肪酸合成相关的蛋白的编码基因导入宿主菌中可以产生合成PHBV的3-HV单体摩尔百分比大于所述宿主菌产生3-HV。

Description

一种与PHBV的3-HV单体合成相关的β-酮硫解酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种极端嗜盐古菌中与可降解材料PHBV的3-HV单体合成相关的β-酮硫解酶的研究与应用。

背景技术

许多原核生物包括细菌和某些极端嗜盐古菌，在碳源过量，氮、磷、硫、氧等元素限制的培养条件下，胞内可以积累聚羟基脂肪酸酯(PHA)。PHA是一类由3-羟基脂肪酸(3HA)组成的生物聚酯，主要作为碳源、能源及还原力的贮藏性物质。PHA具有与传统的石油化工塑料如聚乙烯、聚丙烯相类似的物化性质，并且它具有可完全生物降解和利用可再生资源合成的特点，被认为是一种环境友好型的“生物可降解塑料”，可以从一定程度上缓解石油塑料引起的“白色污染”问题。PHA目前已知的应用领域包括可生物降解包装材料，手术缝合线、药物释放载体、聚合物支架等医用材料以及其手性单体在药物合成过程中的应用等。

在各种PHA中，由于生产成本的限制，目前只有PHB(聚羟基丁酸酯)与PHBV(聚羟基丁酸羟基戊酸酯)在细菌中实现了半商业化的生产。PHB是PHA家族中最简单、研究最透彻的成员。尽管其性质类似于热塑性塑料，但是PHB具有易碎、热稳定性不高、可塑性和机械性能较差等缺点，因而限制了它的广泛应用。与PHB相比，PHBV由于3-羟基戊酸(3-HV)单体的掺入，其性能有了很大的改进，因此具有更加广泛的应用前景。但是，用细菌来生产PHBV需要添加昂贵的丙酸、戊酸等相关底物来提供3-HV单体，而且高浓度的相关底物会抑制菌体的生长。与细菌相比，极端嗜盐古菌作为PHA的生产菌株可以在很大程度上降低其生产成本，可以在不添加有机酸等相关碳源的情况下合成PHBV，并且所合成的PHBV在性能上要优于细菌来源的PHBV。

细菌中，上述两种短链PHA的生物合成是通过β-酮硫解酶(PhaA)，β-酮酯酰-CoA还原酶(PhaB)和PHA合酶(PhaC)所催化。β-酮硫解酶与β-酮酯酰-CoA还原酶负责提供PHA合成的前体3-HB-CoA和3-HV-CoA。目前，国际上对极端嗜盐古菌PHA的研究还主要集中在发酵工艺的优化方面，而对此类微生物中PHA合成相关基因的研究相对较少，在公开报道中未见嗜古盐菌PHA合成相关的β-酮硫解酶(PhaA)的报道，更无类似于细菌中对这些相关基因通过基因工程技术进行改造，寻求性能更加优良的PHA以及实现PHA的低成本生产的报道。因此，极端嗜盐古菌中β-酮硫解酶基因的发现、及其在极端嗜盐古菌中的遗传工程技术的改造，对于极端嗜盐古菌PHA的生物工程开发具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种与PHBV的3-HV单体合成相关的β-酮硫解酶及其编码基因。

本发明提供的蛋白质，名称为PhaAl，来源于极端嗜盐古菌(Haloferax sp.)XH1001CGMCC No.3822，蛋白质：

1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与聚羟基丁酸羟基戊酸酯(PHBV)合成和/或3-羟基脂肪酸(3-HV)合成相关的由1)衍生的蛋白质。

上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

其中，序列表中序列1由383位氨基酸残基组成。

上述蛋白的编码基因(phaA1)也属于本发明的保护范围。

所述编码基因为如下1)、2)、3)或4)的所示的基因：

1)序列表中序列2自5’末端第955-2106位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2自5’末端第791-2119位核苷酸所示的DNA分子；

3)在严格条件下可以与1)或2)限定的DNA分子杂交且与聚羟基丁酸羟基戊酸酯合成和/或3-羟基脂肪酸合成相关蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)限定的DNA序列至少具有90％同源性，且编码与聚羟基丁酸羟基戊酸酯合成和/或3-羟基脂肪酸合成相关蛋白的DNA分子。

所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。

其中，序列表中序列2是由2995个脱氧核苷酸组成，开放阅读框为自5′末端第955-2106位核苷酸序列，自5′末端第2104-2106位核苷酸序列为phaA1的终止密码子，编码具有序列表中序列1的氨基酸残基序列；自5′末端第914-954位核苷酸序列为所述编码基因的启动子区域，其中第924-931位核苷酸序列为启动子核心序列。

含有上述基因的重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围；含有上述编码基因的菌也属于本发明保护的范围，所述菌优选为极端嗜盐古菌(Haloferaxsp.)XH1001 CGMCC No.3822。

本发明的极端嗜盐古菌(Haloferax sp.)XH1001 CGMCC No.3822于2010年5月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)。

所述重组载体为在载体pWL102的多克隆位点插入所述编码基因得到的重组载体。

所述重组菌是将所述编码基因导入宿主菌得到的重组菌。

所述宿主菌为极端嗜盐古菌，优选为极端嗜盐古菌(Haloarcula hispanica)或极端嗜盐古菌(Haloferax mediterranei)，尤其优选为极端嗜盐古菌(Haloarcula hispanica)CGMCC No.1.2049。

本发明的另一个目的是提供一种与PHBV的3-HV单体合成相关的β-酮硫解酶的应用。

本发明提供的应用为所述蛋白在合成聚羟基丁酸羟基戊酸酯和/或3-羟基脂肪酸中的应用，或所述编码基因在合成聚羟基丁酸羟基戊酸酯和/或3-羟基脂肪酸中的应用。

制备聚羟基丁酸羟基戊酸酯的方法也是本发明保护的范围，具体为发酵所述重组菌，得到聚羟基丁酸羟基戊酸酯，所述聚羟基丁酸羟基戊酸酯中3-羟基脂肪酸的摩尔百分比高于发酵所述宿主菌得到的聚羟基丁酸羟基戊酸酯中3-羟基脂肪酸的的摩尔百分比。

所述发酵的方法为：1)将所述重组菌接种于AS-168培养基，在37℃培养至对数生长期，得到对数期菌株；每升AS-168培养基按如下方法配制：将5.0g酸水解酪素，5.0g酵母提取物，1.0g谷氨酸钠，3.0g柠檬酸钠，200g NaCl，20g MgSO₄·7H₂O，2.0g KCl，0.36g FeSO₄·4H₂O和0.36mg MnCl₂·4H₂O溶于水中，用水补足体积；所述AS-168培养基的pH值为7.2；

2)再将所述对数期菌株接种到MG培养基，在37℃培养3天，得到聚羟基丁酸羟基戊酸酯；每升所述MG培养基按如下方法配制：将200g NaCl，20g MgSO₄·7H₂O，2.0g KCl，1g谷氨酸钠，37.5mg KH₂PO₄，50mg FeSO₄·7H₂O，0.36mg MnCl₂·4H₂O，1g酵母提取物和20g葡萄糖溶于水中，用水补足体积；所述MG培养基的pH值为7.2。

本发明实验证明，将与聚羟基丁酸羟基戊酸酯和/或3-羟基脂肪酸合成相关的蛋白的编码基因导入宿主菌中可以产生合成PHBV的3-HV单体，且产生3-HV的摩尔百分比大于所述宿主菌产生3-HV。同时实验中的突变株(Haloferax sp.)ΔphaA1可以作为一株宿主菌来验证来自于其他极端嗜盐古菌的phaA1基因的功能，为将来在极端嗜盐古菌领域筛选能够高效提供3HV的β-酮硫解酶提供平台。

附图说明

图1为phaA1基因RT-PCR的琼脂糖电泳图

图2为整合载体pUBPDA的构建示意图

图3为PCR验证缺失phaA1基因的突变菌Haloferax sp.ΔphaA1的琼脂糖电泳图

图4为菌株积累聚羟基脂肪酸酯(PHA)的气相色谱检测结果

图5为异源表达phaA1积累聚羟基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)的气相色谱检测结果

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、β-酮硫解酶及其编码基因的获得

从天津海水盐场的盐池底泥中分离菌株，分离采用的培养基为AS-168培养基(每升含有：5.0g酸水解酪素(casamino acids)，5.0g酵母提取物(yeast extract)，1.0g谷氨酸钠(sodium glutamate)，3.0g柠檬酸钠，200g NaCl，20g MgSO₄·7H₂O，2.0g KCl，0.36g FeSO₄·4H₂O和0.36mg MnCl₂·4 H₂O，pH 7.2)。分离获得一极端嗜盐古菌菌株XH1001。该菌株在AS-168琼脂糖平板(AS-168+1.2％琼脂糖)上生长可形成微红色菌落。菌落不透明、边缘光滑。该菌革兰氏染色阴性，电镜观察细胞通常宽1至2μm，长2至3μm。进行理化实验发现，XH1001最适生长NaCl浓度是20％～25％，在10％的NaCl浓度仍可以生长；生长pH范围为5.2～8.0；好氧；能利用葡萄糖、淀粉、氨基酸等合成大量的PHBV。经过分子验证实验发现，该菌的16S rDNA基因(序列3)与HaloferaxmediterraneiATCC33500的16S rDNA(GenBankNo.D11107)同源性在99％以上，因此命名为Haloferax sp.XH1001.

将Haloferax sp.XH1001于2010年5月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.3822。

通过对极端嗜盐古菌(Haloferax sp.)XH1001 CGMCC No.3822基因组进行鸟枪法测序，获得一β-酮硫解酶基因，将该基因命名为PhaA1，其核苷酸序列为序列表中序列2的自5′末端第955-2106位核苷酸序列，编码蛋白为PhaA1，该蛋白的氨基酸序列为序列1所示。

实施例2、phaA1的功能鉴定

一、发酵培养基中基因phaA1的转录情况

1、发酵培养基中Haloferax sp.XH1001 CGMCC No.3822菌体总RNA的提取

1)将Haloferax sp.XH1001 CGMCC No.3822在AS-168培养基(每升含有：5.0g酸水解酪素(casamino acids)，5.0g酵母提取物(yeast extract)，1.0g谷氨酸钠(sodiumglutamate)，3.0g柠檬酸钠，200g NaCl，20g MgSO₄·7H₂O，2.0g KCl，0.36g FeSO₄·4H₂O和0.36mg MnCl₂·4H₂O，其余为水，pH 7.2)中37℃培养3-4天，使其进入对数生长期。

2)按5％的接种量，将(Haloferax sp.)XH1001 CGMCC No.3822接种在MG(每升含有：200g NaCl，20g MgSO₄·7H₂O，2.0g KCl，1g谷氨酸钠(sodium glutamate)，37.5mg KH₂PO₄，50mg FeSO₄·7H₂O，0.36mg MnCl₂·4H₂O，1g酵母提取物(yeastextract)，20g葡萄糖(glucose)，pH 7.2)培养基中37℃继续培养2天，使其进入对数生长中期，用高压灭菌两次的EP管收集3-5mL菌体，12,000rpm，室温离心1min，弃上清，离心甩一次，用移液枪吸尽上清。

3)用每个EP管中加入1ml TRIzol试剂(invitrigen)将提取上述收集菌体中的总RNA，并将总RNA溶解于20-30μL DEPC水中。

2、RNA浓度与纯度的测定

取上述获得的1.5μL RNA溶液加入到300μL TE溶液中，用BECKMAN DU800测定其浓度，对照为300μL TE加入1.5μL DEPC水。测得OD260/280为2.05，说明RNA的纯度符合下一步的实验要求。测得RNA的浓度为5.6μg/μL。

3、将RNA用DNase消化

将提取的总RNA 15μg用RNase-free RQ1DNase(Promega)处理，50μL体系(DNase buffer 5μL，DNase 5μL，15μg RNA，DEPC水补足至50μL)，37℃反应4-5小时。

4、RT-PCR

根据phaA1的核苷酸序列，设计了一对RT-PCR引物phaARTF/phaARTR，引物序列如下：

phaARTF：5′CGCCGTTCCTGTGATTCT3′

phaARTR：5′GCCCCCGCAAGTGTAGAC3′

以DNase消化后的RNA为模板，利用OneStep RT-PCR试剂盒(Qiagen公司)，根据说明书上的步骤进行RT-PCR。程序分为两步：第一步，利用RT-PCR后引物phaARTR，以总RNA为模板，将目的RNA反转录成cDNA；第二步，利用RT-PCR引物phaARTF/phaARTR，以第一步中反转录成的cDNA为模板，进行PCR。在第二步中，要用Dnase消化后的总RNA作阴性对照，用极端嗜盐古菌(Haloferax sp.)XH1001CGMCC No.3822的DNA作阳性对照。结果如图1所示：图1中泳道1为RT-PCR条带；泳道2为DNA为模板的阳性对照；泳道3为Dnase消化后的总RNA为模板的阴性对照；泳道M为100bp marker。从图1中可以看出，泳道1的条带与阳性对照(泳道2)的条带一致，证明：phaA1基因在发酵培养基中转录。

二、基因phaA1的功能

(一)、通过构建缺失基因phaA1的突变菌株Haloferax sp.ΔphaA1来验证

1、敲除phaA1基因的同源重组整合质粒pUBPDA的构建

pUBPDA的构建过程如图2所示，具体步骤如下：

1)用于敲除phaA1的同源重组双交换臂的扩增

根据phaA1的核苷酸序列，设计了两对双交换臂的扩增引物N1/N2和C1/C2：

N1：5′ATCAAGCTTTGCCACCGACCCAATACG 3′(带下划线的序列为HindIII识别位点)

N2：5′ATAGGATCCCGCCGAAGGTGGGGAAGG 3′(带下划线的序列为BamHI识别位点)

C1：5′ATAGGATCCCCGGGAAGGTCGTTACGT 3′(带下划线的序列为BamHI识别位点)

C2：5′ATAGGTACCCGGTGACGGCATAGAGAT 3′(带下划线的序列为KpnI识别位点)

以由实施例1获得的DNA为模板，用引物对N1/N2扩增破坏phaA1的双交换左臂(pha-L)，PCR扩增程序为：94℃3min预变性；然后94℃30s、54℃30s、72℃40s进行30个循环；72℃再延伸7min；扩增体系为：25μL；扩增得到796bp的片段，经测序表明该片段具有序列表中序列2的自5′端第1-796位核苷酸序列，即为敲除phaA1的左臂(pha-L)；

以由实施例1获得的DNA为模板，用引物对C1/C2扩增敲除phaA1的双交换右臂(pha-R)，PCR扩增程序为：94℃3min预变性；然后94℃30s、54℃30s、72℃40s进行30个循环；72℃再延伸7min；扩增体系为：25μL；扩增得到781bp的片段，经测序表明该片段具有序列表中序列2的自5′端第2215-2995位核苷酸序列，即为敲除phaA1的右臂(pha-R)。

琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物pha-L和pha-R。

2)敲除phaA1的整合载体pUBPDA的构建

用限制性内切酶BamHI和KpnI分别双酶切载体pUBP(Han，J.，Lu，Q.，Zhou，L.，Zhou，J.，Xiang，H.2007.Molecular characterization of the phaEC_Hm genes，required forbiosynthesis of poly(3-hydroxybutyrate)in the extremely halophilic archaeon Haloarculamarismortui.Appl Environ Microbiol，73(19)，6058-65.，公众可从中国科学院微生物研究所获得)和PCR产物pha-R，连接酶切后的载体和PCR片段，然后用CaCl₂化学法将连接产物转化至大肠杆菌JM109，在含有氨苄青霉素的抗性平板上进行筛选，将获得的阳性克隆进行测序；结果表明片段pha-R(其核苷酸序列为序列表中序列2的自5′末端第2215-2995位核苷酸序列)已经正确插入载体pUBP的BamHI和KpnI位点间，将其命名为重组载体pUBP-R。

右臂成功连入后，再用HindIII和BamHI分别双酶切连有右臂的pUBP重组载体pUBP-R和PCR产物pha-L，连接酶切后的载体和PCR片段，然后用CaCl₂化学法将连接产物转化至大肠杆菌JM109，在含有氨苄青霉素的抗性平板上进行筛选，将获得的阳性克隆进行测序；结果表明片段pha-L(其核苷酸序列为序列表中序列2的自5′末端第1-796位核苷酸序列)已经正确插入载体pUBP-R的BamHI和HindIII位点间，得到含有pha-L和pha-R完整的双交换整合载体，并将其命名为pUBPDA。

2、phaA1缺失突变株Haloferax sp.)ΔphaA1的构建

通过pUBPDA的双交换臂与极端嗜盐古菌(Haloferax sp.)XH1001 CGMCCNo.3822基因组中的phaA1进行同源重组，敲除Haloferax sp.XH1001 CGMCC No.3822基因组中的phaA1，具体步骤如下所述：

1)整合载体pUBPDA转化Haloferax sp.XH1001 CGMCC No.3822

采用PEG介导的方法(按照文献Cline，S.W.，W.L.Lam，R.L.Charlebois，L.C.Schalkwyk，and W.F.Doolittle.1989.Transformation methods for halophilic archaebacteria.Can J Microbiol 35：148-52.所述的方法)将pUBPDA转化极端嗜盐古菌(Haloferaxsp.)XH1001 CGMCC No.3822，转化后在含有5mg/L莫维诺林的AS-168(每升含有：5.0g酸水解酪素(casamino acids)，5.0g酵母提取物(yeast extract)，1.0g谷氨酸钠(sodium glutamate)，3.0g柠檬酸钠，200g NaCl，20g MgSO₄·7H₂O，2.0g KCl，0.36g FeSO₄·4H₂O和0.36mg MnCl₂·4H₂O，12g琼脂，pH 7.2)固体平板上筛选转化子。

2)筛选基因phaA1的单交换菌株

在步骤1)得到的转化子中，进行PCR验证：抽取总DNA，以N1和C2作为引物反应，反应体系为：1×PCR缓冲液，dNTPs 0.2μM，Mg²⁺1.5μL(终浓度1.5μM)，N1和C2各1μL(终浓度0.4nM)，Taq DNA聚合酶1μl(3U)；反应条件为先94℃3min预变性；然后94℃45s、54℃45s、72℃150s进行30个循环；72℃再延伸7min。结果如图3所示，泳道1为极端嗜盐古菌(Haloferax sp.)XH1001 CGMCCNo.3822阴性对照；泳道2和泳道3为极端嗜盐古菌(Halofepax sp.)XH1001 CGMCCNo.3822的重组菌，泳道4为pUBPDA质粒阳性对照。从图中看出，阴性对照的的PCR产物大小2995bp，阳性对照的PCR产物大小1577bp，泳道2的PCR产物大小分别为2995bp和1577bp，说明对应的菌株为发生phaA1单交换的极端嗜盐古菌(Haloferaxsp.)XH1001 CGMCC No.3822菌株。

3)同源重组双交换后缺失phaA1的突变株(Haloferax sp.ΔphaA1)的筛选

将步骤2)筛选到的phaA1单交的极端嗜盐古菌(Haloferax sp.)XH1001 CGMCCNo.3822菌株在不含莫维诺林的液体AS-168培养基中传代培养80代，重复转接培养4次后将传代培养的培养液倍比稀释10⁹，在固体AS-168培养基平板上涂布均匀，培养一周左右得到单克隆，挑取单克隆同时在AS-168固体平板上及含5mg/L莫维诺林的AS-168的固体培养基上划线。待菌生长一周后，挑取在抗性平板上不生长但在非抗性平板上生长的单菌落，抽提其基因组DNA作为模板，同样以N1和C2作为引物进行PCR验证，反应体系和条件与筛选单交换菌株相同。PCR结果如图3所示，其中泳道3所示重组菌的PCR产物大小为1577bp，说明对应的菌株为发生双交换导致phaA1缺失的极端嗜盐古菌(Haloferax sp.)XH1001 CGMCC No.3822菌株，将其命名为Haloferax sp.ΔphaA1。

3、phaA1缺失突变株Haloferax sp.ΔphaA1积累PHA种类的检测

检测Haloferax sp.ΔphaA1在积累PHA的培养基中所积累PHA的变化，用野生菌Haloferax sp.XH1001 CGMCC No.3822作为阳性对照。具体操作如下所示：

1)将上述获得的Haloferax sp.ΔphaA1在AS-168培养基中37℃培养3-4天，使其进入对数生长期。

2)按5％的接种量，将Haloferax sp.ΔphaA1接种在MG培养基中37℃继续培养3天，然后离心收集菌体。

3)将收集的菌体冰干，然后称取约75mg冰干的菌体，将其置于酯化管中，再向其中加入2mL酯化液(3％体积的浓硫酸溶于甲醇中，含1g/L苯甲酸作为内标)和2mL氯仿，混匀后将其置于100℃的烤箱中酯化4小时。酯化后加入1mL蒸馏水，混匀，待有机相和水相分层后，取1μL下层有机相用气相色谱进行检测。

实验设3次重复。检测结果如图4A和4B所示(图中显示3-HB和3-HV单体峰即表明可产生PHBV)，其中A为极端嗜盐古菌(Haloferax sp.)XH1001 CGMCC No.3822野生菌积累的聚羟基丁酸戊酸共聚酯结果；B为缺失phaA1基因的突变菌Haloferax sp.ΔphaA1的结果。结果表明，未经任何处理的Haloferax sp.XH1001 CGMCC No.3822野生菌株在MG培养基中积累的PHA种类为PHBV(图4A)，而Haloferax sp.ΔphaA1在相同的培养条件下由于缺失了基因phaA1，合成的PHA种类变为PHB(图4B)。证明本发明的phaA1蛋白及其编码基因与3-HV合成相关。

(二)、将phaA1基因回转Haloferax sp.ΔphaA1突变菌后验证phaA1基因的功能

将基因phaA1导入突变株Haloferax sp.ΔphaA1，以验证phaA1基因的功能，具体操作如下：

1、构建重组载体pWL102-A

根据Haloferax sp.XH1001的基因组序列设计引物

HmeF1：5′ATAGGATCCCCAGCTTCCAGGGTCATT 3′(带下划线的序列为BamHI识别位点)

HmeR1：5′ATCGGTACCTCGGCGAAGATGATAGTT 3′(带下划线的序列为KpnI识别位点)

以Haloferax sp.XH1001 CGMCC No.3822的基因组DNA为模板，用引物HmeF1和HmeR1进行PCR扩增。PCR反应条件为：94℃3min预变性；然后94℃30s、54℃30s、72℃70s进行30个循环；72℃再延伸7min；扩增体系为：25μL；扩增得到1329bp的片段，回收PCR产物，然后用BamHI/KpnI切割；并用相同的内切酶切割穿梭载体pWL 102(Lam，W.L.，and W.F.Doolittle.1989.Shuttle vectors for thearchaebacterium Halobacterium volcanii.Proc Natl Acad Sci USA 86：5478-82，公众可从中国科学院微生物研究所获得)。连接酶切后的载体和片段，并将连接产物用CaCl₂化学法转化大肠杆菌JM109，在含有氨苄青霉素的抗性平板上进行筛选，筛选获得阳性克隆，对阳性克隆进行测序，测序结果表明，载体pWL102的BamHI和KpnI位点间插入的序列具有序列表中序列2自5′末端第791-2119位核苷酸序列，将该重组载体命名为pWL102-A，且序列2自5′末端第791-2119位核苷酸序列包括phaA1的开放阅读框(序列2自5′末端第955-2106位核苷酸序列)。

2、构建重组菌ΔphaA1/A

将步骤1获得的pWL102-A通过PEG介导的方法转化至步骤一中获得的突变菌Haloferax sp.ΔphaA1中，并在含有5mg/L莫维诺林的AS-168固体平板上筛选阳性转化子，再对阳性转化子进行提取质粒及酶切和测序验证，证明获得了已经导入重组载体pWL102-A的阳性转化子，将含有pWL102-A的重组极端嗜盐古菌(Haloferax sp.)ΔphaA1命名为ΔphaA1/A。

采用同样的方法将空载体pWL102导入重组极端嗜盐古菌(Haloferax sp.)ΔphaA1中获得重组菌ΔphaA1/pWL102。

3、发酵重组菌ΔphaA1/A以检测其积累PHA的种类

将其得到的ΔphaA1/A工程菌按照步骤一3中所述的方法进行发酵，再按照步骤一3所述的方法进行酯化反应(经过甲酯化处理后)，然后用气相色谱检测ΔphaA1/A工程菌所积累PHA的种类。以极端嗜盐古菌(Haloferax sp.)XH1001 CGMCC No.3822野生菌和重组菌ΔphaA1/pWL102为对照。

实验设3次重复，检验结果与图4C所示，将图4A与4B一起对照比较，A为极端嗜盐古菌(Haloferax sp.)XH1001 CGMCC No.3822野生菌积累的聚羟基丁酸戊酸共聚酯结果(或重组菌ΔphaA1/pWL102积累的聚羟基丁酸戊酸共聚酯结果，二者结果相同)；B为缺失phaA1基因的突变菌Haloferax sp.ΔphaA1的结果；C为导入phaA1基因的菌Haloferax sp.ΔphaA1/A的结果；D为聚羟基丁酸戊酸共聚酯标样(图中显示3-HB和3-HV单体峰即表明可产生PHBV)。气相色谱检测的各样品经过甲醇高温处理生成羟基脂肪酸甲酯，4.85min的出峰位置对应1ng苯甲酸的甲酯化产物(内标)。

从图中可以看出，phaA1基因和其本身启动子(第914-954位核苷酸序列)导入Haloferax sp.ΔphaA1后获得的重组菌ΔphaA1/A能够产生3-HV组分，表明phaA1基因及其本身启动子的导入使得原来丧失3-HV组分合成能力的菌株重新获得了PHBV的积累能力；对比图4A与图4C，可以看出3-HV组分的摩尔比与野生菌Haloferax sp.XH1001 CGMCC No.3822相当。

证明Haloferax sp.中phaA1编码的蛋白具有β-酮硫解酶的功能。同时表明，突变株Haloferax sp.ΔphaA1可以作为一株宿主菌来验证来自于其他极端嗜盐古菌的phaA1基因的功能，为将来在极端嗜盐古菌领域筛选能够高效提供3-HV的β-酮硫解酶提供平台。

实施例3、phaA1基因应用

将实施例2步骤二构建的重组质粒pWL102-A通过PEG介导的方法(Can JMicrobiol.35：148-52.)转化至未经任何处理的野生型菌株Haloarcula hispanica CGMCCNo.1.2049(购自CGMCC，菌株编号为CGMCC No.1.2049)中，将获得的重组菌命名为Haloarcula hispanica/pWL 102-A。

按实施例2所述方法进行发酵与分析。采用同样的方法将空载体pWL102导入Haloarcula hispanica CGMCC No.1.2049得到的重组菌(命名为Haloarculahispanica/pWL102)进行发酵与分析，作为对照。未经任何处理的野生型菌株Haloarculahispanica CGMCC No.1.2049也作为对照。

实验设3次重复，结果取平均值。实验结果如图5中A为Haloarculahispanica/pWL102产生的聚羟基丁酸戊酸共聚酯结果(或野生型菌株Haloarculahispanica CGMCC No.1.2049产生的聚羟基丁酸戊酸共聚酯结果，二者结果相同)；B为Haloarcula hispanica/pWL102-A产生的聚羟基丁酸戊酸共聚酯结果；C为聚羟基丁酸戊酸共聚酯标样(图中显示3-HB和3-HV单体峰即表明可产生PHBV)。从图中看出，野生型菌株Haloarcula hispanica CGMCC No.1.2049、Haloarcula hispanica/pWL102和Haloarcula hispanica/pWL102-A产生PHBV的总量没有明显变化，但是Haloarculahispanica/pWL102产生PHBV中3-HV摩尔百分比为3.6左右，转入重组质粒pWL102-A的菌株Haloarcula hispanica/pWL102-A产生PHBV中3-HV摩尔百分比为9.7左右。转入重组质粒pWL102-A的菌株产生的PHBV中3-HV摩尔百分比比转入空载体pWL102的菌株提高了1.7倍。说明异源表达phaA1基因，可以大幅度提高Haloarculahispanica CGMCC No.1.2049菌产生3-HV组分的能力。

序列表

<110>中国科学院微生物研究所

<120>一种与PHBV的3-HV单体合成相关的β-酮硫解酶及其编码基因与应用

<130>CGGNARB102357

<160>3

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>383

<212>PRT

<213>极端嗜盐古菌(Haloferax sp)

<400>1

Met Glu Val Ala Val Ile Gly Ser Ser Met Thr Lys Phe Gly Gln Arg

1 5 10 15

Ser Ala Trp Ile Arg Glu Leu Leu Ser Glu Ala Gly Gln Ala Cys Leu

20 25 30

Glu Asp Ala Gly Val Ala Pro Ala Ser Val Asp His Leu Tyr Val Ser

35 40 45

Asn Met Ala Ser Gly Glu Phe Glu Gly Gln Thr Gly Val Met Asn Ala

50 55 60

Leu Ala His Asp Leu Gly Val Ile Pro Ala Tyr Thr Gln Arg Ile Asp

65 70 75 80

Gln Thr Ser Ser Ser Gly Gly Ala Gly Ile Tyr Glu Ala Trp Gln Ser

85 90 95

Ile Ala Ser Gly Val Ser Glu Met Thr Leu Leu Val Gly Gly Glu Lys

100 105 110

Met Thr His Lys Thr Thr Gly Glu Ser Thr Asp Ile Ile Ala Ser Cys

115 120 125

Thr His Pro Glu Glu Tyr Lys His Gly Val Thr Leu Pro Ser Phe Ala

130 135 140

Gly Met Thr Ala Arg Asn Tyr Leu Glu Arg Phe Asp Ala Pro Arg Glu

145 150 155 160

Ser Leu Ala Arg Val Ala Val Lys Asn His Arg Asn Gly Val Asp Asn

165 170 175

Pro Lys Ala Gln Phe Gln Lys Glu Ile Asp Ile Glu Thr Ala Leu Glu

180 185 190

Ser Pro Ile Ile Ala Asp Pro Leu Arg Leu Tyr Asp Phe Cys Pro Ile

195 200 205

Thr Asp Gly Ser Ala Ala Met Met Phe Thr Thr Glu Glu Arg Ala Gln

210 215 220

Glu Ile Thr Asp Glu Tyr Ala Ile Val Ser Gly Val Gly Gly Ala Thr

225 230 235 240

Asp Thr His Val Val His Glu Arg Asp Asp Pro Thr Val Met Gly Gly

245 250 255

Val Val Glu Ser Ser Lys Gln Ala Tyr Glu Met Ala Gly Val Gly Pro

260 265 270

Asp Asp Leu Asp Val Ala Glu Leu His Asp Met Phe Thr Ile Leu Glu

275 280 285

Phe Leu Gln Leu Glu Gly Ile Gly Val Ala Asp His Gly Ala Ala Trp

290 295 300

Glu Leu Ala Met Asp Gly Val Thr Ala Lys Asp Gly Gly Leu Pro Ile

305 310 315 320

Asn Thr Ser Gly Gly Leu Lys Ser Lys Gly His Pro Leu Gly Ala Ser

325 330 335

Gly Val Ala Gln Gly Val Glu Ile Tyr Glu Gln Leu Val Gly Glu Ala

340 345 350

Gly Pro Arg Gln Val Glu Ala Asp Thr Ala Leu Ala Cys Asn Val Gly

355 360 365

Gly Phe Gly Asn Cys Val Ile Thr Thr Ile Met Glu Ala Ala Lys

370 375 380

<210>2

<211>2995

<212>DNA

<213>极端嗜盐古菌(Haloferax sp.)

<400>2

tgccaccgac ccaatacgga ccagacacac gaatccgttc caatacctgg ttcacggttc 60

gatttttacg aactcacgct ggcgacaaaa cagtacgtcc cttttgcgtc tccaccgaga 120

gagactatcg ttcaaattgg accggagtaa ggaattcgtg gtcgtcgtcg aacggcacgt 180

agttatcatc gttcgatacg ccttcgtcga aacacccgtg gacagacagc agtggtcagt 240

caccgtccaa ttcaaacgga cgttcgagca cgtacctgtt ttccgggtgg ggttcgtcgc 300

cgattatcgt ctcacgttca tcggcgtgtt cgaacccgaa tcgttcgtag aacgcgttgc 360

cgggcttgtt ctctacgagg accatcgcgt tgatccgttc gatgccctgt tcggcgaggc 420

cagcacacgt ctgttcgagc aactcacgtc caacgttttc tcgccggtgt tcggggtgaa 480

cgtaaatccg gaggatgtat ccctcccctt cggtgttgtt ccaagtcgcg tgtgcgaaac 540

cgatgactgt gtcctcgcgt tcagcaacga gaatccgcgc ctgactcttg tggagttccg 600

ctacaatctg ctcaggagtg taccagtcgg tgaccgcctc ttcggccgtt tcgcgggtca 660

gaatctccgg atagtcggtt ttccaggact gttgtgctat ctgaaggatg gcgtcggtat 720

cgtcttcggt cgcagtccgg ataggcatgt atgaccatag cactggcatc ccgatagtcc 780

ttccccacct tcggcgaaga tgatagttcc gtcttcggca ccgagacagg gtacacgagc 840

cagcaactca tagctgaggc gtgagatgct gggtatatat ctccacccat ggccctatct 900

aacaaattat cctcaaccaa catgataata tgacacctgt gagaagtttc gagtatggaa 960

gtcgcagtga ttggctcatc gatgaccaag ttcggtcagc ggagtgcctg gatccgtgag 1020

ttgctctcag aagcaggcca agcatgtctc gaggatgcgg gcgtcgcccc cgcaagtgta 1080

gaccatctgt acgtctcgaa tatggccagt ggcgagttcg aaggccagac gggggtgatg 1140

aacgcactgg cccatgatct cggagtgata ccggcctaca cccagcgaat cgaccagacc 1200

tcttcgtccg gtggggcggg aatctacgag gcgtggcagt cgattgcctc aggagtcagc 1260

gagatgacgc tgttggtcgg tggcgagaag atgacccaca agaccacggg cgagtcaacc 1320

gatatcatcg cctcctgtac ccacccagag gagtacaaac acggcgtgac gctgccgtca 1380

ttcgccggga tgacggcccg gaactacctc gaacggttcg acgcaccgcg ggagtcgctg 1440

gcccgggtcg cggtcaagaa tcacaggaac ggcgtcgaca acccgaaagc gcagttccag 1500

aaagagatcg acatcgagac ggctctggag tcaccaatca tcgctgatcc gctccggttg 1560

tacgacttct gtcctatcac ggacgggagc gcggcgatga tgtttacgac cgaagaacgg 1620

gcgcaagaga tcaccgacga gtatgccatc gtctctggcg tcggcggcgc aacggacaca 1680

cacgtcgtcc acgaacgtga tgacccaacc gtgatgggcg gcgtcgtcga atcgagtaag 1740

caagcctacg agatggccgg cgtcggaccc gatgatctcg atgtggcaga acttcacgac 1800

atgttcacaa tccttgaatt cctccaactg gagggcatcg gtgttgcgga ccacggtgcc 1860

gcgtgggaac tggcgatgga cggcgtcact gcaaaagacg gcggcctccc gatcaacacc 1920

tccgggggac tcaagtcgaa aggccacccg ctgggggcga gcggcgttgc acagggcgtc 1980

gagatatacg aacagctcgt cggtgaggct ggtccgcgac aagtcgaagc cgacactgca 2040

ctggcctgta acgtcggcgg ctttggaaat tgtgtcatca ctaccatcat ggaggctgca 2100

aaatgaccct ggaagctggc aagtgtccta acgggcacgt ctcgtatccc acgcaccctc 2160

gttgtcggaa atgtggtgaa ccgcaaacgg agacgctcga cctctcggac cggaccggga 2220

aggtcgttac gtggactcac tccacggcga ccccgccggg cgtccgccag ccgaacacga 2280

tggcaatcgt cgagttcgaa gtagacggcc aggccgtccg cgcgctcggg caggtaacca 2340

ccgacgacat cgagaccggt gatgtggtcg aaccggtgta tgtcgaagaa ctacgcgacc 2400

cagaagttgg gatcaaagcc cccgaaagtc agtcctggga cggctatcgc tgggaccctg 2460

tgtagtatta ggggtccggt gtagcgactc actcgtgtcg tcttttttac cacatgtcgc 2520

cttgccagac ccaaatcgtt tgacgatagc gtgcgattag ttatcatggt tgacgcacgc 2580

gaataccacg agcagacgaa acattctccg gaacgcgtcc gcgccgacac gttctcactc 2640

gatttcgaga acaagccgcg accgtacaag gtgtacgagg ggctgtcaca gatctcgctc 2700

gaagagttgc gatactcagc cgacgaaccg gcactgtctg cgattactac cccgccaccc 2760

gaatcacgtg tggatgttgg ttcgccatcg aacggtgtcg gttcgtcatc gaacggtgtc 2820

ggttcgtcat cggtcgatac ccagtcgccg tcagtcgaca cccagacact ccaaacgctc 2880

tgccactatg cgacgggtgt aactaagacg ctgaaaatcc gcggcaggca aacgcgtttt 2940

cgggccgctt cctgtacggg gaaactctat cacatcgatc tctatgccgt caccg 2995

<210>3

<211>1473

<212>DNA

<213>极端嗜盐古菌(Haloferax sp)

<400>3

attccggttg atcctgccgg aggtcattgc tattggggtc cgatttagcc atgctagttg 60

cacgagttca cactcgtggc gaaaagctca gtaacacgtg gccaaactac cctacagaga 120

acgataacct cgggaaactg aggctaatag ttcatacggg agtcatgctt gaatgccgac 180

tccccgaaac gctccggcgc tgtaggatgt ggctgcggcc gattaggtag acggtggggt 240

aacggcccac cgtgccaata atcggtacgg gttgtgagag caagaacccg gagacggaat 300

ctgagacaag attccgggcc ctacggggcg cagcaggcgc gaaaccttta cactgcacgc 360

aagtgcgata aggggacccc aagtgcgagg gcatatagtc ctcgcttttc tcgactgtaa 420

ggcggtcgag gaataagagc tgggcaagac cggtgccagc cgccgcggta ataccggcag 480

ctcaagtgat gaccgatatt attgggccta aagcgtccgt agccggccat gaaggttcat 540

cgggaaatcc gccagctcaa ctggcgggcg tccggtgaaa accacatggc ttgggaccgg 600

aaggctcgag gggtacgtct ggggtaggag tgaaatcctg taatcctgga cggaccaccg 660

atggcgaaag cacctcgaga agacggatcc gacggtgagg gacgaaagct agggtctcga 720

accggattag atacccgggt agtcctagct gtaaacgatg ctcgctaggt gtggcacagg 780

ctacgagcct gtgctgtgcc gtagggaagc cgtgaagcga gccgcctggg aagtacgtcc 840

gcaaggatga aacttaaagg aattggcggg ggagcactac aaccggagga gcctgcggtt 900

taattggact caacgccgga catctcacca gctccgacta cagtaatgac ggtcaggttg 960

atgaccttac cacgacgctg tagagaggag gtgcatggcc gccgtcagct cgtaccgtga 1020

ggcgtcctgt taagtcaggc aacgagcgag acccgcactt ctaattgcca gcaacagttt 1080

cgactggttg ggtacattag aaggactgcc gctgctaaag cggaggaagg aacgggcaac 1140

ggtaggtcag tatgccccga atgagctggg ctacacgcgg gctacaatgg tcaagacaat 1200

gggttgctat ctcgaaagag aacgctaatc tcctaaactt gatcgtagtt cggattgagg 1260

actgaaactc gtcctcatga agctggattc ggtagtaatc gcatttcaca agagtgcggt 1320

gaatacgtcc ctgctccttg cacacaccgc ccgtcaaagc acccgagtga ggtccggatg 1380

aggccaccac acggtggtcg aatctgggct tcgcaagggg gcttaagtcg taacaaggta 1440

gccgtagggg aatctgcggc tggatcacct cct 1473

Claims

1.一种蛋白质，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与聚羟基丁酸羟基戊酸酯合成和/或3-羟基脂肪酸合成相关的由1)衍生的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求1或2所述编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下1)、2)、3)或4)的所示的基因：

1)序列表中序列2自5’末端第955-2106位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2自5’末端第791-2119位核苷酸所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且与聚羟基丁酸羟基戊酸酯的合成和/或3-羟基脂肪酸的合成相关的DNA分子；

4)与1)或2)限定的DNA序列至少具有90％同源性且编码与聚羟基丁酸羟基戊酸酯合成和/或3-羟基脂肪酸合成相关蛋白的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、转基因细胞系和重组菌；含有权利要求2或3所述编码基因的菌。

5.根据权利要求4所述的重组载体或重组菌，其特征在于：所述重组载体为在载体pWL102的多克隆位点插入权利要求2或3所述编码基因得到的重组载体；所述重组菌为将权利要求2或3所述编码基因导入宿主菌得到的重组菌。

6.根据权利要求4所述的菌，其特征在于：所述含有权利要求2或3所述编码基因的菌为极端嗜盐古菌(Haloferax sp.)XH1001 CGMCC No.3822。

7.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所宿主菌为极端嗜盐古菌，优选为极端嗜盐古菌(Haloarcula hispanica)或极端嗜盐古菌(Haloferax mediterranei)，尤其优选为极端嗜盐古菌(Haloarcula hispanica)CGMCC No.1.2049。

8.权利要求1所述蛋白在合成聚羟基丁酸羟基戊酸酯和/或3-羟基戊酸中的应用，或权利要求2或3所述编码基因在合成聚羟基丁酸羟基戊酸酯和/或3-羟基戊酸中的应用。

9.一种制备聚羟基丁酸羟基戊酸酯的方法，发酵权利要求4或7所述重组菌，得到聚羟基丁酸羟基戊酸酯，所述聚羟基丁酸羟基戊酸酯中3-羟基脂肪酸的摩尔百分比高于发酵所述宿主菌得到的聚羟基丁酸羟基戊酸酯中3-羟基脂肪酸的的摩尔百分比。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述发酵的方法为：1)将所述重组菌接种于AS-168培养基，在37℃培养至对数生长期，得到对数期菌株；每升AS-168培养基按如下方法配制：将5.0g酸水解酪素，5.0g酵母提取物，1.0g谷氨酸钠，3.0g柠檬酸钠，200g NaCl，20g MgSO₄·7H₂O，2.0g KCl，0.36g FeSO₄·4H₂O和0.36mg MnCl₂·4H₂O溶于水中，用水补足体积；所述AS-168培养基的pH值为7.2；