DE19937719A1

DE19937719A1 - Genetische Elemente eines Bakteriophagen von Natrialba magadii

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Publication number: DE19937719A1
Application number: DE1999137719
Authority: DE
Inventors: Angela Witte; Ulrike Baranyi; Rainhard Klein
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-08-10
Filing date: 1999-08-10
Publication date: 2001-02-22

Abstract

Gesamtgenom-Nukleotidsequenz des Bakteriophagen WCh1 von Natrialba magadii, dessen Replikationsstartbereich und für Bakteriophagenproteine kodierende Gene sowie deren Expressionsregulationselemente.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft genetische Elemente des Genoms des ersten aus der Gruppe der haloalkalophilen Archaea isolierten Bakteriophagen ϕCh1, die Identifizierung von Phagenproteine kodierenden Genen dieses Phagengenoms einschließlich deren Expressionsregulations elementen, sowie die Expression einzelner Gene, insbesondere der Gene der Strukturproteine der Bakteriophagenhülle (Capsidproteine).

Bakteriophagen sind Viren, die Prokaryonten infizieren. Eine besondere Gruppe innerhalb der Prokaryonten bilden die haloalkalophilen Archaebakterien oder Archaea. Diese Organismen sind angepaßt an hohe Salzkonzentrationen und hohe pH-Werte. Die Proteine dieser Organismen tolerieren gleichfalls hohe Salz- und pH-Werte. Aus diesem Grunde sind insbesondere Proteine der extrem haloalkalophilen Archaea für technische Anwendungen interessant (Rodriguez-Valera, F. (1992) Biotechnological potential of halobacteria. Biochem Soc Symp 58: 135-147; Ventosa A. und Nieto J. J. (1995) Biotechnological applications and potentialities of halophilic microorganisms. World of Microbiology and Biotechnology. 1185- 1194.)

Bakteriophagengenome enthalten Replikationsursprungs-Sequenzen und sind als autonom replizierende Einheiten für Herstellung von Vektoren von Interesse. Oft stehen Bakteriophagengene unter der Kontrolle induzierbarer Promotoren, die ebenfalls für die Herstellung von Vektoren verwendet werden können. Die Strukturproteine der Bakteriophagen-Hülle (Capsidproteine) können in rekombinanter Form als Fusionen mit heterologen Polypeptiden, z. B. Antigenen, Epitopen oder Enzymen exprimiert oder als Strukturelemente eingesetzt werden.

Organismen aus der Gruppe der Archaea liefern eine große Anzahl tech nologisch interessanter Enzyme und Proteine. Bisher sind nur drei Gesamtgenome von Bakteriophagen, die Archaea infizieren, veröffentlicht. Es handelt sich um SSV1 aus Sulfolobus shibatae (Palm, P., Schleper, C., Grampp, B., Yeats, S., McWilliam, P., Reiter, W.-D. und Zillig W. (1991) Complete nucleotide sequence of the virus SSV 1 of the archaebacterium Sulfolobus shibatae. Virology 1285: 242-250.), His1 aus Haloarcula hispanica (Bath, C. und Dyall-Smith, M. L. (1998) His1, an archaeal virus of the Fuselloviridae family that infects Haloarcula hispanica. J. Virol. 72: 9392-9395.) und ψM2 aus Methanobacterium sp. (Pfister, P., Wasserfallen, A., Stettler, R. und Leisinger, T. (1998) Molecular analysis of Methanobacterium phage psiM2. Mol. Microbiol. 30: 233-244). Ein weiterer gut untersuchter Phage ist ϕH aus Halobacterium salinarium (Stolt, P. und Zillig, W. (1993) In vivo and in vitro analysis of transcription of the L region from the Halobacterium salinarium phage ϕH: Definition of a repressor enhancing gene. Virology 195: 649-658). Weiterhin ist die Existenz eines als ϕCh1 bezeichneten Bakteriophagen aus Natrialba magadii bekannt (Witte, A., Baranyi, U., Klein, R., Sulzner, M., Luo, C., Wanner, G., Krüger, D. und Lubitz, W. (1997) Characterization of Natronobacterium magadii phage ϕCh1, a unique archaeal phage containing DNA and RNA. Molecular Microbiology 23: 603-616). Das Genom dieses Phagen wurde jedoch bisher noch nicht sequenziert.

Zur homologen Expression von Proteinen in hato- oder haloalkalophilen Archaea wurden mehrere Plasmide offenbart. Keines der bisher bekannten Plasmide erlaubt jedoch die kontrollierte Induktion der Genexpression in ihren Wirten. Die bisherigen Expressionssysteme in Archaea sind deshalb nur begrenzt einsetzbar.

Es besteht daher ein Befürfnis zur Bereitstellung eines Vektors, der die kontrollierte Expression von Proteinen in Archaea, insbesondere in haloalkalophilen Archaea ermöglicht.

Eine der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand somit darin, über die Sequenzierung des Gesamtgenoms eines Bakteriophagen, der haloalkalophile Archaea infiziert, sowohl den Replikationsursprung als auch für Proteine kodierende offene Leserahmen auf dem Phagengenom zu identifizieren.

Eine weitere der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand darin, über die Untersuchung der Expression der Phagengene Zugang zu Expressionsregulationselementen zu finden, die zur Entwicklung induzierbarer Expressionssysteme verwendet werden können.

Eine erste der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wurde durch die Charakterisierung und Sequenzierung des Genoms des Bakteriophagen ϕCH1 gelöst. Die Sequenz des 58498 bp langen Genoms ist in SEQ ID NO. 1 (Nukleotide 1-48.300) und SEQ ID NO. 2 (Nukleotide 48.301- 58.498) dargestellt. Durch Analyse des Bakteriophagen-Genoms konnten insgesamt 86 für Proteine kodierende Gene (Offene Leserahmen, "ORFs") identifiziert werden, wobei als Startkodons AUG und GUG zugelassen wurden. Eine Übersicht über die Gene des Bakteriophagen ϕCh1 liefert Tabelle 1.

5'-seitig der für Proteine kodierenden ORFs befinden sich die für die Genexpression verantwortlichen Regulationselemente des Phagengenoms. Vorzugsweise liegen diese Expressionsregulationselemente, die Promotor-, Operator- und Enhancersequenzen enthalten können, im Bereich von -1 bis 500, besonders bevorzugt im Bereich von -1 bis 400 und am meisten bevorzugt im Bereich von -1 bis 200 bezüglich des jeweiligen Translationsstarts.

Der Replikationsursprung des Bakteriophagen befindet sich im Bereich der Nukleotide 28.000 bis 42.000, wo mehrere, für die Replikation des Phagengenoms essentielle Gene lokalisiert sind.

In N. magadii L11 liegt ϕCh1 in Form eines Prophagen im Bakteriengenom integriert vor. Im Laufe einer Langzeitkultivierung von N. magadii L11 wurde ein Stamm erhalten, der nicht mehr spontan lysiert und als N. magadii L13 bezeichnet wurde. Der Stamm N. magadii L13 hat den Prophagen verloren, kann aber nach Infektion mit ϕCh1 diesen Phagen replizieren und ist daher als Wirtszelle zur Einführung heterologer Nukleinsäuren oder/und zur Expression heterologer Polypeptide geeignet.

Der Stamm L13 wurde am 02.08.1999 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland unter der Hinterlegungsnummer DSM 12971 gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrages hinterlegt.

Nach Transfektion des Stammes L13 mit dem Phagen ϕCh1 wurde eine als ϕCh1-1 bezeichnete Phagenvariante aus einem Einzelplaque isoliert. ϕCh1-1 zeigt gegenüber ϕCh1 ein deutlich verändertes Lyseverhalten insoweit, als die Lyse gegenüber mit ϕCh1 infizierten L13-Zellen weit früher erfolgt.

Ein Gegenstand der Erfindung ist eine isolierte Nukleinsäure erhältlich aus dem Bakteriophagen ϕCh1 umfassend

a) mindestens einen offenen Leserahmen (ORF) ausgewählt aus den in Tabelle 1 gezeigten, aus dem Gesamtgenom des Bakteriophagen ϕCh1 von Natrialba magadii hergeleiteten ORFs und/oder
b) mindestens ein Expressionsregulationselement für einen solchen ORF und/oder
c) den Replikationsursprung des Bakteriophagen ϕCh1,

wobei die Nukleotidsequenz des Gesamtgenoms des Bakteriophagen ϕCh1 aus den in SEQ ID NO. 1 und SEQ ID NO. 2 gezeigten Nukleotidsequenzen erhältlich ist.

Falls die Nukleinsäure einen ORF enthält, kann die Nukleotidsequenz des ORF neben einer in SEQ ID NO. 1/2 angegebenen Sequenz ausgewählt werden aus

a) einer Sequenz, die einer ORF-Sequenz gemäß SEQ ID NO. 1 und 2 im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entspricht und
b) einer Sequenz, die mit einer ORF-Sequenz gemäß SEQ ID NO. 1 und 2 oder einer Sequenz gemäß a) unter stringenten Bedingungen hybridisiert.

Falls die Nukleinsäure ein Expressionsregulationselement enthält, kann die Sequenz des Expressionsregulationselements neben einer in SEQ ID NO. 1 und 2 angegebenen Sequenz ausgewählt werden aus einer Sequenz, die mit einem Expressionsregulationselement gemäß SEQ ID NO. 1 und 2 unter stringenten Bedingungen hybridisiert und in der Lage ist, eine Genexpression in N. magadii oder/und verwandten Organismen zu bewirken.

Falls die Nukleinsäure den Replikationsursprung enthält, kann dessen Sequenz neben der in SEQ ID NO. 1 und 2 gezeigten Sequenz ausgewählt werden aus einer Sequenz, die damit unter stringenten Bedingungen hybridisiert und in der Lage ist, eine Replikation in N. magadii oder/und verwandten Organismen zu bewirken.

Der Replikationsursprung eignet sich zur Herstellung eines rekombinanten Vektors, der sich in Natrialba magadii und/oder einer anderen Archaea- Spezies replizieren kann. Wird der Replikationsstartbereich der vorliegenden Erfindung mit einem weiteren, nicht im Genom des Phagen ϕCh1 enthaltenen, heterologen Replikationsursprung des Standes der Technik in einem rekombinanten Vektor kombiniert, so werden nützliche Shuttle- Vektoren erhalten, die sich zusätzlich in einem weiten Wirtsbereich in Pro- und Eukaryonten replizieren können.

Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Nukleinsäure, die aus einer in SEQ ID NO. 1 und 2 angegebenen Sequenz ausgewählt wird und die in operativer Verknüpfung mit einer heterologen Nukleotidsequenz vorzugsweise in einem rekombinanten Vektor vorliegt.

Ein solcher Vektor kann

a) eine von der Nukleotidsequenz des Bakteriophagen ϕCh1 gemäß SEQ ID NO. 1 und 2 abgeleitete, proteinkodierende Nukleinsäure operativ mit einem Expressionsregulationselement gemäß SEQ ID NO. 1 und 2 verknüpft und/oder
b) eine proteinkodierende Nukleinsäure nach (a) operativ mit einem heterologen Expressionsregulationselement verknüpft und/oder
c) eine heterologe, proteinkodierende Nukleinsäure operativ mit einem Expressionsregulationselement nach (a) verknüpft enthalten.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Proteine der Bakteriophagen hülle (Capsidproteine), insbesondere die Proteine gpA, gpH, gpE und gp42,6 (siehe Tabelle 2 in Beispiel 3) und weiterhin die Capsidproteine gp34,7, gp34,3 und gp42,1. Der Phagenpartikel von ϕCh1 setzt sich aus vier Hauptproteinen und einer Reihe von Nebenproteinen zusammen. Die Größe der Proteine variiert zwischen 15 und 80 kDa. Sie weisen niedrige isoelektrische Punkte auf (s. Tabelle 2) was als Charakteristikum halophiler Proteine angesehen wird. Die biochemische Charakterisierung bestimmter Capsidproteine und die Isolierung der zugehörigen sowie der benachbarten Gene wird in Beispiel 3 ausführlich beschrieben.

Die erfindungsgemäßen Phagenstrukturproteine können auch in rekombinanter Form als Träger Fusionen mit heterologen Peptid- und/oder Polypeptidsequenzen, z. B. Epitopen, Antigenen und/oder Enzymen verwendet. Sie können weiterhin als Strukturelemente, z. B. als Self- Assembly-Strukturen für Nanoengineering eingesetzt werden.

Darüber hinaus betrifft die Erfindung auch andere Phagenproteine, z. B. DNA-Methyltransferasen (MTasen) und DNA-bindende Proteine, z. B. Repressoren. Diese Proteine können in nativer Form, in Form von Muteinen (erzeugt durch Aminosäuresubstitutionen, -deletionen und/oder -additionen) oder als Fusionen mit heterologen Aminosäuresequenzen vorliegen. DNA- MTasen können in die Gruppen der C-MTasen und der N-MTasen eingeteilt werden (Cheng, X. (1995) Structure and function of DNA methyltransferases. Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 24: 293-318). Die C-MTasen führen zur Bildung von C⁵-Methylcytosin, während die N-MTasen entweder N⁴-Methyladenin (N⁴-MTasen) oder N⁶-Methyladenin (N⁵-MTasen) erzeugen. Durch Computeranalyse des Bakteriophagengenoms konnte als ORF Nr. 81 ein Gen identifiziert werden, das für eine Adenin-N⁶- Methyltransferase (M.ϕCH1-I) kodiert (dam-ähnlich). Die Ergebnisse der Untersuchung dieser MTase werden in Beispiel 5 beschrieben.

ORF Nr. 67 kodiert für ein Protein, das zur C⁵-MTase aus Haemophilus influenzae (Genbank Nr. X85374) hohe Ähnlichkeit zeigt, und ORF Nr. 72 kodiert für ein Protein, das hohe Ähnlichkeit zur N⁶-MTase des Halobakterien-Phagen ϕH (Genbank Nr. X80162) aufweist.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ORF Nr. 49, der für einen Bakteriophagen-Repressor kodiert. Die Ergebnisse der Untersuchungen des Repressors sind in Beispiel 6 beschrieben. Die Kenntnis des Repressors ist für die Entwicklung rekombinanter Vektoren und/oder Shuttle-Vektoren nützlich.

Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind die Genprodukte von ORF Nr. 50 (Ähnlichkeit zu TLX3 des Halobakterien- Phagen ϕH), ORF Nr. 1 und Nr. 50 (Ähnlichkeit zu einem hypothetischen Protein und zu repH des Halobakterien-Plasmids pHV2) sowie ORF Nr. 8 (Ähnlichkeit zum Protein pp des Methanobakterien-Phagen ψM2).

Auch alle anderen in Tabelle 1 aufgeführten ORFs werden von der vorliegenden Erfindung erfasst.

Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Phagenvariante ϕCh1-1. Sie zeigt stromaufwärts des rep-Gens eine Sequenzduplikation von 223 bp, die möglicherweise die Ursache für ihr verändertes Lyse-Verhalten darstellt.

Neben ϕCh1-1 konnten weitere Phagenvarianten charakterisiert werden, die sich von ϕCH1 z. B. durch Mutationen im Bereich des Rekombinase-Gens unterscheiden. Die einzelnen Varianten unterscheiden sich in der Anzahl und Orientierung der flankierenden repetitiven Sequenzen. Die beiden das Rekombinase-Gen flankierenden Bereiche aus direkten Sequenz wiederholungen können gegeneinander ausgetauscht sein. Die Orientierung des Rekombinase-Gens in Bezug auf das restliche Genom bleibt dabei unverändert. Diese Varianten und auch andere Varianten von ϕCH1, insbesondere rekombinante Varianten mit heterologen DNA-Insertionen werden von der vorliegenden Erfindung erfaßt.

Vorzugsweise weist die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz des Bakteriophagen

a) eine der in SEQ ID NO. 1 und/oder SEQ ID NO. 2 gezeigten Nukleotidsequenzen oder
b) eine zu den Sequenzen aus a) mindestens 70% homologe Nukleotidsequenz auf.

Die in SEQ ID NO. 3 gezeigte Nukleotidsequenz (rep-Gen, ORF Nr. 49) kodiert für den vollständigen Bakteriophagen-Repressor (SEQ ID NO. 4).

Die in SEQ ID NO. 5 gezeigte Nukleotidsequenz (dam-ähnliche-N⁶-MTase- Gen, ORF Nr. 81) kodiert für die vollständige N⁵-Methyltransferase des Bakteriophagen (SEQ ID NO. 6).

Die in SEQ ID NO. 7 gezeigte Nukleotidsequenz (ORFs Nr. 22 und 23) kodiert für die Bakteriophagenproteine cp67 (SEQ ID NO. 8) und H (SEQ ID NO. 9).

Die in SEQ ID NO. 10 gezeigte Nukleotidsequenz (ORF Nr. 15) kodiert für das Bakteriophagenprotein E (SEQ ID NO. 11).

Die in SEQ ID NO. 12 gezeigte Nukleotidsequenz (ORF Nr. 10) kodiert für das Capsidprotein gp34,7 (SEQ ID NO. 13).

Die in SEQ 1D NO. 14 gezeigte Nukleotidsequenz (ORF Nr. 11) kodiert für das Capsidprotein gp34,3 (SEQ ID NO. 15).

Die in SEQ ID NO. 16 gezeigte Nukleotidsequenz (ORF Nr. 13) kodiert für das Capsidprotein gp42,1 (SEQ ID NO. 17).

Neben den in den SEQ ID NO. 1, 2, 3, 5, 7, 10, 12, 14 und 16 gezeigten Nukleotidsequenzen und diesen Sequenzen im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Nukleotidsequenzen umfasst die vorliegende Erfindung auch solche Sequenzen, die damit unter stringenten Bedingungen hybridisieren. Der Begriff "Hybridisierung" gemäß vorliegender Erfindung wird wie bei Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press (1989), 1.101 bis 1.104) verwendet. Demnach spricht man von einer Hybridisierung unter stringenten Bedingungen, wenn nach Waschen für eine Stunde mit 1 × SSC und 0,1% SDS bei 55°C, vorzugsweise bei 62°C und besonders bevorzugt bei 68°C, insbesondere für eine Stunde in 0,2 × SSC und 0,1% SDS bei 55°C, vorzugsweise bei 62°C und besonders bevorzugt bei 68°C noch ein positives Hybridisierungssignal beobachtet wird. Eine unter derartigen Waschbedingungen mit einer in SEQ ID NO. 1-3, 5, 7, 10, 12, 14 und/oder 16 gezeigten Nukleotidsequenzen oder einer damit im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Nukleotidsequenz hybridisierende Sequenz wird von der vorliegenden Erfindung umfasst.

Darüber hinaus umfasst die vorliegende Erfindung auch Nukleotidsequenzen, die auf Nukleotidebene eine Homologie von mindestens 70% zu den in SEQ ID NO. 1-3, 5, 7, 10, 12, 14 und/oder 16 dargestellten Nukleotidsequenzen aufweisen und Aminosäuresequenzen, die auf Aminosäureebene eine Homologie von mindestens 80% zu den in SEQ ID NO. 4, 6, 8, 9, 11, 13, 15 und/oder 17 dargestellten Aminosäuresequenzen aufweisen.

Unter Homologie ist ein Ausmaß für die Ähnlichkeit von Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen zur verstehen, die der gemäß dem Programm BLAST und dessen Unterprogrammen und den Ausführungen des NCBI/NIH (www.ncbi.nlm.nih.gov) errechneten Größe der Identität (Identity) entspricht.

Die Erfindung erfasst außerdem isolierte Polypeptide, die von einer der Nukleinsäuresequenzen aus SEQ ID NO. 1-3, 5, 7, 10, 12, 14 und/oder 16 kodiert werden. Die erfindungsgemäßen Polypeptide können mit mindestens einer heterologen Peptid- und/oder Polypeptidsequenz fusioniert sein, wie z. B. einem Polypeptidabschnitt der Beta-Galactosidase.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können in einem Vektor vorliegen. Dieser Vektor kann ein beliebiger prokaryontischer oder eukaryontischer Vektor sein, auf dem sich die Nukleotidsequenz vorzugsweise unter Kontrolle eines Expressionssignals (Promotor, Operator, Enhancer etc.) befindet. Beispiele für prokaryontische Vektoren sind chromosomale Vektoren wie etwa Bakteriophagen (z. B. Bakteriophage λ) und extrachromosomale Vektoren wie etwa Plasmide, wobei zirkuläre Plasmidvektoren besonders bevorzugt sind. Geeignete prokaryontische Vektoren sind z. B. bei Sambrook et al., supra, Kap. 1 bis 4, beschrieben.

Andererseits kann die Nukleinsäure auch in einem eukaryontischen Vektor vorliegen, z. B. in einem Hefevektor oder einem für höhere Zellen geeigneten Vektor (z. B. einem Plasmidvektor, viralem Vektor oder Pflanzenvektor). Derartige Vektoren sind beispielsweise bei Sambrook et al., supra, Kap. 16, beschrieben.

Desweiteren kann die Nukleinsäure in einem Shuttle-Vektor vorliegen, wobei ein solcher Vektor z. B. den Replikationsursprung des Bakteriophagen ϕCh1 und zusätzlich mindestens einen weiteren Replikationsursprung aufweist, wodurch eine Replikation sowohl z. B. in Natrialba magadii als auch in Organismen aus den Gruppen der Eukaryonten und/oder der Prokaryonten möglich ist. Solche Vektoren können z. B. zirkuläre Plasmide oder Bakteriophagen sein.

Die Nukleinsäure kann weiterhin in einem Sicherheitsvektor vorliegen, der Suizidgene (z. B. prokaryontische Suizidgene wie das E-Gen des Phagen ϕX174 oder Archaea-Suizidgene) unter Kontrolle eines regulierbaren Promotors enthält. Archaea-Suizidgene werden bevorzugt aus Genen von Archaea-Phagen ausgewählt.

Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung des Phagen als Gentransfervektor, wobei der unter Hochsalzbedingungen stabile Phage zum Zielort transportiert wird, dort gegebenenfalls an einen Rezeptor bindet, und anschließend durch Verringerung der Salzkonzentration zerfällt, wobei die DNA freigesetzt wird und am Zielort ihre Wirkung (z. B. durch Endozytose in einen Makrophagen) entfalten kann.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Zelle von Natrialba magadii, die frei ist vom Prophagen des Bakteriophagen ϕCh1 und mit ϕCh1 infiziert werden kann.

Eine Zelle gemäß der vorliegenden Erfindung ist also bevorzugt eine Natrialba magadii-Zelle, die frei ist vom Prophagen des Bakteriophagen ϕCh1, wie z. B. der Natrialba magadii Stamm L13 (DSM 12971). Eine weitere erfindungsgemäße Zelle umfasst einen Vektor mit mindestens einem Replikationsursprung oder/und einer proteinkodierenden Nukleinsäure des Bakteriophagen ϕCh1.

Die Erfindung erfasst außerdem Phagenvarianten, die im Vergleich zum Bakteriophagen ϕCh1 ein verändertes Lyseverhalten aufweisen, wie z. B. die Phagenvariante ϕCh1-1.

In noch einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Charakterisierung der Expression und der entsprechenden Expressionsregulationselemente verschiedener Gene von ϕCh1, die in Beispiel 6 weiter ausgeführt werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von rekombinanten halophilen Archaea, bevorzugt Natrialba magadii, als rekombinante Wirtszellen zur Herstellung von Proteinen oder anderen Polymeren, z. B. Poly-Hydroxy-Buttersäure (PHB) Polymeren. Die Gewinnung der Polymere erfolgt vorzugsweise dadurch, daß die Wirtszellen durch Verringerung der Salzkonzentration lysiert und die Polymere in das wäßrige Medium freigesetzt werden (siehe z. B. Beispiel 7). Eine derartige wässrige Freisetzung ist für PHB aus Eubakterien im US-Patent 5,149,644 beschrieben.

Weiterhin soll die Erfindung durch die nachfolgenden Figuren und Beispiele erläutert werden. Es zeigen:

Fig. 1 Teil A die Wachstumskurve von N. magadii L11 (⚫) und den Phagentiter (○) und Fig. 1 Teil B die Wachstumskurve von N. magadii L13 (⚫), wobei der Zeitpunkt der Infektion mit ϕCh1 durch den langen Pfeil angegeben ist und kurze Pfeile die Zeitpunkte der Entnahme von RNA und Protein-Proben angeben

Fig. 2 das Ergebnis der Detektion der mRNAs der Gene E, cp67 und H durch Reverse Transkription-(RT)-PCR bei der Lyse von N. magadii L11- Zellen

Fig. 3 das Ergebnis der Detektion der mRNAs der Gene E, cp67 und H durch RT-PCR bei Infektion von N. magadii L13-Zellen

Fig. 4 das Ergebnis der Detektion der mRNA des N⁶-Methyltransferasegens (dam) durch RT-PCR bei der Lyse von N. magadii L11-Zellen

Fig. 5 das Ergebnis der Detektion der mRNA des N⁶-Methyltransferasegens (dam) durch RT-PCR bei Infektion von N. magadii L13-Zellen

Fig. 6 das Ergebnis der Detektion der mRNA des Repressor-Gens (rep) durch RT-PCR bei der Lyse von N. magadii L11-Zellen

Fig. 7 das Ergebnis der Detektion der mRNA des Repressor-Gens (rep) durch RT-PCR bei Infektion von N. magadii L13-Zellen

Fig. 8 eine physikalische Karte des Repressorgens und seiner Umgebung aus ϕCh1 und der Variante ϕCh1-1.

Beispiele Beispiel 1 Wachstum und Lyse von Natrialba magadii L11 und L13

N. magadii wurde bei 37°C in Vollmedium (8,8 g/l Casaminosäuren, 11,7 g/l Hefeextrakt, 4 M NaCl, 1 mM MgSO₄, 0,02 µM FeSO₄, 36 mM Na₂CO₃, 31,5 mM KCl, 3 mM Na₃Citrat) angezogen. Phagentiter wurden bestimmt durch Ausplattieren entsprechender Verdünnungen auf Topagar gemäß Adams (1959).

Fig. 1A zeigt das Wachstum von N. magadii L11 (⚫); Phagentiter (○). Fig. 1B zeigt das Wachstum von N. magadii L13 (⚫), die Infektion mit ϕCh1 ist durch den langen Pfeil angegeben. Kurze Pfeile in den Fig. 1a und 1b geben die Zeitpunkte der Entnahme von RNA und Protein-Proben an.

Beispiel 2 Isolierung des Bakteriophagen ϕCh1 und Sequenzierung des Genoms

Aus dem Kulturüberstand von N. magadii L11 wurde durch Zufügen von Polyethylenglycol (PEG) 6.000 auf eine Konzentration von 10% und anschließende Inkubation bei Raumtemperatur aus dem PEG-Präzipitat, durch Reinigung über einen Cäsiumchlorid-Stufengradienten durch Ultrazentrifugation der Bakteriophage ϕCh1 als das für die spontane Lyse verantwortliche Agens isoliert. Das PEG-Präzipitat wurde hierbei gesammelt, in Puffer A (4 M NaCl, 36 mM Na₂CO₃, 31,5 mM KCl) resuspendiert und in einem Cäsiumchlorid-Stufengradienten (Endkonzentrationen an CsCl 4 M, 2,7 M und 0,6 M) für 20 h bei 114.000 xg in einem SW40 Ti-Rotor (Beckmann) konzentriert. Der Bakteriophage bildete eine Bande zwischen der ersten und der zweiten Schicht. Gesammelte Phagenpartikel wurden zwei weitere Male konzentriert und gegen Puffer A dialysiert. Aus gereinigten Phagen-Partikeln wurden Nukleinsäuren isoliert, indem die Phagen in einem Verhältnis von 1 : 5 in Wasser verdünnt wurden und mit einem Chloroform/Isoamylalkohol/Phenol-Gemisch extrahiert wurden. Nach der Präzipitation mit 2,5 Volumina Ethanol wurden die Nukleinsäuren durch Zentrifugation (30.000 xg für 30 min) gesammelt, getrocknet und in einem passenden Puffer resuspendiert. Die DNA des Bakteriophagen wurde durch Restriktionsspaltung mit verschiedenen Enzymen in Form von 200 bis 5.800 Basenpaaren (bp) langen, einander überlappenden, DNA-Fragmenten in den Vektor pKSII + kloniert. Die Fragmente wurden mittels Vektor-spezifischer Primer sequenziert. Ein Teil der Fragmente wurde subkloniert, um auch die internen Bereiche sequenzieren zu können. Bereiche, die nicht klonierbar waren, wurden über PCR amplifiziert und dann direkt sequenziert. Wenn kein PCR-Produkt erhalten werden konnte, wurden die entsprechenden Abschnitte der genomischen DNA des Bakteriophagen direkt sequenziert.

Beispiel 3 Biochemische Charakterisierung von Capsidproteinen und Isolierung der zugehörigen und benachbarten Gene

Zur biochemischen Charakterisierung wurden gereinigte Phagenpartikel mit 10%iger Trichloressigsäure präzipitiert und auf 11%igen SDS- Polyacrylamidgelen getrennt. Die Proteine wurden auf eine PVDF-Membran transferiert, mit Coomassie Brilliant Blau gefärbt und entsprechende Banden ausgeschnitten. Unter Verwendung von Standard Edman-Abbautechniken wurden Proteine vom N-Terminus her sequenziert. Dabei stellte sich heraus, daß zwei der Proteine einen identischen N-Terminus besitzen (gpA, 80 kDa und gpH, 28 kDa). Von den Aminosäuresequenzen wurden degenerierte Oligonukleotide abgeleitet und diese in Southernhybridisierungen zur Identifizierung jener DNA-Fragmente, die die entsprechenden Gene codieren, eingesetzt. Diese Fragmente wurden kloniert und sequenziert. Sequenzanalysen ergaben, daß eines der Strukturproteine (gpE; 55 kDa; ORF Nr. 15) Ähnlichkeit zu einem Strukturprotein eines anderen Archaea- Phagen, ϕH, aufweist (Protein hp32). Durch Sequenzierung der umliegenden Bereiche der identifizierten Gene konnten zwei weitere potentielle Strukturprotein-Gene ausfindig gemacht werden. Einer der beiden offenen Leserahmen (ORF Nr. 8) weist Ähnlichkeit zu Portalproteinen verschiedener anderer Bakteriophagen auf. Portalproteine sind ebenfalls Strukturproteine, die für die Verpackung der DNA in die Capside der Phagen verantwortlich sind. Der zweite offene Leserahmen (ORF Nr. 22) zeigte Ähnlichkeit zu einem weiteren ϕH Strukturprotein, hp67. Die den Proteinen gpA und gpH gemeinsame N-terminale Aminosäuresequenz findet sich nur im ORF Nr. 23, woraus folgt, daß gpA und gpH von einem gemeinsamen Gen codiert werden. Die Tatsache, daß sowohl gpA mit 80 kDa als auch gpH mit 28 kDa weit größer sind als die mittels Computeranalyse errechnete Größe des Polypeptids des ORF Nr. 23 (14 kDa), läßt folgern, daß gpA und gpH Multimere ein und desselben Proteins sind. Solche Multimere wurden bei verschiedenen bakteriellen Phagen gefunden (Popa et al., 1991; Hatful & Sarkis, 1993). Diese Capsidprotein-Multimere können auch kovalent miteinander verbunden sein (Popa et al., 1991).

Tabelle 2

Biochemisch charakterisierte Caosidproteine des Phagen ϕCh1 und ihre zugehörigen Gene sowie benachbarte Gene

Die entsprechenden Gene wurden in E.coli kloniert und exprimiert, wodurch rekombinante Formen von Protein E und Protein H erhalten werden konnten.

Auch die von den ORFs 10, 11 und 13 kodierten Proteine gp34,7, gp34,3 und gp42,1 wurden mittlerweile experimentell als Capsidproteine identifiziert.

Beispiel 4 Charakterisierung der Adenin-N⁶-Methyltransferase des Bakteriophagen

Durch Computeranalyse des Bakteriophagengenoms konnte als ORF Nr. 81 ein Gen identifiziert werden, das für eine Adenin-N⁶-Methyltransferase (M.ϕCH1-I) kodiert (dam-ähnlich). Das Enzym gehört zu der Gruppe der D21-N⁶-Adenin-Methyltransferasen, die durch das konservierte Motiv DPPY vor dem FxGxG-Motiv ausgezeichnet sind. Die Transkriptionsanalyse weist das Methylasegen als ein "spätes" Gen des Bakteriophagen aus. Das Gen der Methylase M.ϕCh1-I wurde in den Vektor pQE-32 kloniert und in E.coli exprimiert. Dabei zeigte sich überraschenderweise, daß die auf diese Weise erhaltene, rekombinante Bakteriophagen-Methyltransferase in E.coli aktiv ist und dort DNA methyliert.

Tabelle 3 zeigt die Modifikationsanalyse durch Restriktionsspaltung von aus N. magadii L13 nach Infektion isolierter ϕCh1-DNA. Im Vergleich zu ϕCh1- DNA, die aus Bakteriophagenpartikeln nach Lyse von L11 isoliert worden waren, ist der Methylierungsgrad der DNA von etwa 40% auf nur noch 5% gesunken.

Tabelle 3

Modifikationsanalyse von ϕCh1-DNA, isoliert aus L13 nach Infektion, durch Restriktionsspaltung

Beispiel 5 Charakterisierung des Phagen-Repressors

Das Gen des Bakteriophagen-Repressors wurde in das Plasmid pBluescript II KS + kloniert und in E.coli in rekombinanter Form exprimiert. Mit Hilfe des Lysegens E des Bakteriophagen ϕX174 konnte nachgewiesen werden, daß der rekombinante ϕCh1-Repressor in der Lage ist, in E.coli an den λpL- Promotor in spezifischer Weise zu binden. Dies ist ein überraschender Befund, da die meisten bisher untersuchten Proteine aus halophilen Archaea bei niedrigen Salzkonzentrationen, wie sie auch im Cytoplasma von E.coli herrschen, inaktiv oder instabil sind.

Beispiel 6 Untersuchungen zur Genexpression

Bei der Untersuchung der Regulation der Expression einzelner Gene im Infektionszyklus zeigten sich generelle Unterschiede zwischen dem lysogenen Stamm L11 und dem mit ϕCh1 infizierten Stamm L13. Die Expression der Gene für Strukturproteine im Stamm L11 (gpE, pgA/H und orf42,6) erfolgte erst in einer sehr späten Phase des Infektionszyklus, kurz vor dem Beginn der Lyse der Zellen. ϕCh1-Gene für Strukturproteine fallen somit in die Klasse der "späten Gene". Dies steht in Übereinstimmung mit vielen Strukturprotein-Genen anderer Phagen, die ebenfalls erst in einer späten Phase exprimiert werden. Bei der Infektion des Stammes L13 mit ϕCh1 erfolgt die Expression der "späten Gene" schon zu einem viel früheren Zeitpunkt. Nach 4 bis 5 Stunden können erste mRNAs für Strukturproteine nachgewiesen werden, deren Menge dann im Laufe des Infektionszyklus kontinuierlich ansteigt. Dies deutet darauf hin, daß es nach Infektion mit ϕCh1 nicht, wie im Stamm L11, zur Ausbildung einer lysogenen Phase kommt, sondern direkt der lytische Weg eingeschlagen wird. Die Ergebnisse werden auch durch Western Blot-Analysen in denen ϕCh1-Strukturproteine mittels Antikörpern detektiert werden, erhalten.

In dieser Weise wird auch das die N⁶-Adenin Methyltransferase (MTase) kodierende Gen exprimiert. Deshalb liegt nur ein Teil der in die Phagenpartikel verpackten DNA in methylierter Form vor. Durch die späte Expression der MTase können nicht mehr alle der in Phagenpartikel zu verpackenden DNA Stränge modifiziert werden. In der Folge entstehen Phagenpartikel, von denen ein Teil methylierte DNA enthält und ein anderer Teil nicht methylierte DNA.

Ein anderes Expressionsverhalten wurde für das den potentiellen Phagenrepressor kodierende Gen (rep) festgestellt, es wird schon von Beginn an exprimiert. In L11-Zellen ist gegen Ende des Zyklus ein leichter Anstieg der Konzentration an rep-mRNAs erkennbar - jedoch nicht vergleichbar mit dem Expressionsmuster der für die Strukturproteine und die MTase kodierenden Gene. Dieser leichte Anstieg ist mit dem Beginn der Replikation des Phagengenoms erklärbar. Die erhöhte Kopienzahl der Phagen-DNA gegen Ende des Infektionszyklus hätte bei gleichbleibender Regulation der rep-Expression eine höhere Anzahl rep-spezifischer mRNAs zur Folge. Rep wird somit konstitutiv exprimiert. In infizierten Zellen konnte wie bei den übrigen untersuchten Genen ein kontinuierlicher Anstieg der Expression während des Infektionszyklus nachgewiesen werden, der wiederum mit dem Anstieg der Kopienzahl der Phagen-DNA erklärbar ist.

a) Untersuchungen zur Expression der Capsidgene

In Fig. 2 ist das Ergebnis einer gelelektrophoretischen Analyse mit 0,8%igen Agarosegelen, auf denen Produkte einer RT-PCR mit RNA-Proben, die zu den mit Pfeilen in Fig. 1A gekennzeichneten Zeitpunkten aus entsprechenden N. magadii L11-Zellen entnommen wurden, aufgetragen wurden. Von jeder Probe wurden 5 ng Gesamt RNA zur Durchführung der Reversen Transkription-PCR eingesetzt. Das als Sonde verwendete PCR- Produkt wurde als positive Kontrolle verwendet (Spur 1 in Fig. 2 und 3). Als Negativkontrolle wurden in Spur 2 der Fig. 2 und 3 Proben von nichtinfizierten N. magadii L13 Zellen verwendet. In Spur 1 wurde ein von einem Gen E-tragenden Plasmid mit geeigneten Primern erzeugtes PCR- Produkt als Positivkontrolle (+) aufgetragen, Spur 2 (-) dient als Negativkontrolle und in Spur 3 wurden Proben aus nichtinfizierten N. magadii L13-Zellen (L13) aufgetragen. In Spalte A wurden ab Spur 4 RNA- Proben ohne vorherige Reverse Transkription aufgetragen. Das Ergebniss einer RT-PCR mit 16S rRNA-Primern ist in Spalte E zur Überprüfung der Konstanz der eingesetzten RNA-Probenmenge gezeigt.

Der Lysebeginn bei N. magadii L11 korreliert mit einer Zunahme der mRNAs der Gene E, cp67 und H ab der in der 72. Stunde genommenen Probe. Fig. 3 zeigt die entsprechende Analyse für die Infektion von N. magadii L13 mit fCh1. Spur 4 zeigt die Verhältnisse zum Zeitpunkt der Infektion (ad). Im Gegensatz zu dem in Fig. 2 gezeigten Ergebnis werden die mRNAs der Gene E, cp67 und H bereits einige Stunden vor der Lyse detektiert. Das Lyseverhalten des Phagen ist hier ein ganz anderes als bei der Lyse von N. magadii L11.

Die eingesetzten Primerpaare für die jeweiligen Gene können aus Tabelle 4 entnommen werden. Das Primerpaar CD-2 und CD-4 für die positive Kontrolle sowie das Primerpaar Nb16F und Nb16R für die 16S rRNA wurden entprechend für die in den Fig. 4 bis 7 dargestellten Ergebnisse eingesetzt und werden deshalb in Tabellen 4 und 6 nicht mehr wiederholt.

Tabelle 4

Wie in SEQ ID No. 10 angegeben, wird Protein E außerdem am N-Terminus zwischen Lysin-16 und Asparagin-17 posttranslational prozessiert.

b) Untersuchungen zur Expression des Gens für die N⁶-Methyltransferase

Entsprechend dem für Fig. 2 in Beispiel 2 ausgeführten Vorgehen wurde die Expression des N⁶-Methyltransferasegens in N. magadii L11 und L13 untersucht. In Fig. 4 ist die Korrelation der Zunahme der Expression des N⁶-Methyltransferasegens in N. magadii L11 zu sehen. Fig. 5 zeigt das entsprechende Ergebnis für L13 nach Infektion mit ϕCh1. Die Transkription setzt sehr viel früher ein als bei L11, ist aber bedeutend schwächer. Die Analysebedingungen entsprechen den oben für die Fig. 2 und 3 beschriebenen. Als Primerpaare für die RT-PCR wurden die in Tabelle 5 gezeigten Oligonukleotide verwendet.

Tabelle 5

c) Expressionsanalyse des Repressorgens

In den Fig. 6 und 7 sind die Ergebnisse der Expressionsanalyse des Repressorgens für N. magadii L11 und L13 (nach Infektion nach ϕCh1) gezeigt. Die für die RT-PCR eingesetzten Primerpaare ergeben sich aus Tabelle 6 gezeigt. Das Vorgehen entsprach dem für Fig. 2 in Beispiel 2.

In Fig. 8 ist eine physikalische Karte der Repressorgene von ϕCh1 und der Variante ϕCh1-1 gezeigt. Bei ϕCh1-1 findet sich am 3'-Ende des Repressorgens eine Duplikation von 223 bp Länge.

Tabelle 6

Beispiel 7 Verwendung von rekombinanten halophilen Archaea als rekombinante Wirtszellen zur Herstellung von Polymeren

Rekombinante halophile Archaea, wie z. B. Natrialba magadii, können als rekombinante Wirtszellen zur Herstellung von Proteinen oder anderen Polymeren, z. B. PHB Polymeren, verwendet werden. Hierzu werden die Archaeazellen bei hohen Salzkonzentrationen, z. B. 1,5 bis 4 M NaCl gezüchtet, wobei unter diesen Bedingungen das gewünschte Produkt hergestellt wird. Durch Verringerung der Salzkonzentration, z. B. auf unter 1,5 M, vorzugsweise auf unter 1 M, wird ein Zerfall der Zellen hervorgerufen, was zu einer wässrigen Freisetzung des gewünschten Produkts führt.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Isolierte Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß sie

a) mindestens einen offenen Leserahmen (ORF) ausgewählt aus den in Tabelle 1 gezeigten, aus dem Genom des Bakteriophagen ϕCh1 von Natrialba magadii hergeleiteten ORFs und/oder
b) mindestens ein Expressionsregulationselement für einen solchen ORF und/oder
c) den Replikationsursprung des Bakteriophagen ϕCh1 enthält,

wobei die Nukleotidsequenz des Genoms des Bakteriophagen ϕCh1 aus den in SEQ ID NO. 1 und SEQ ID NO. 2 gezeigten Nukleotidsequenzen erhältlich ist.

2. Nukleinsäure nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen ORF enthält, wobei die Nukleotidsequenz des ORF ausgewählt ist aus

3. Nukleinsäure nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Expressionsregulationselement enthält, wobei die Nukleotidsequenz des Expressionsregulationselements ausgewählt ist aus einer Sequenz, die mit einem Expressionsregulationselement gemäß SEQ ID NO. 1 und 2 unter stringenten Bedingungen hybridisiert.

4. Nukleinsäure nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Replikationsursprung enthält, wobei die Nukleotidsequenz des Replikationsursprungs ausgewählt ist aus einer Sequenz, die mit einem Replikationsursprung gemäß SEQ ID NO. 1 und 2 unter stringenten Bedingungen hybridisiert.

5. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie in operativer Verknüpfung mit einer heterologen Nukleotidsequenz vorliegt.

6. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie ausgewählt ist aus

a) einer für den Repressor des Bakteriophagen ϕCh1 kodierenden und in SEQ ID NO. 3 gezeigten Nukleotidsequenz,
b) einer Sequenz, die der Sequenz gemäß SEQ ID NO. 3 im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entspricht und
c) einer Sequenz, die mit einer Sequenz gemäß (a) und/oder (b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert.

7. Nukleinsäure nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie für eine mindestens 80% homologe Aminosäuresequenz zu der in SEQ ID NO. 4 gezeigten Aminosäuresequenz kodiert.

8. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie ausgewählt ist aus

a) einer für die N⁶-Methyltransferase des Bakteriophagen ϕCh1 kodierenden und in SEQ ID NO. 5 gezeigten Nukleotidsequenz,
b) einer Sequenz, die der Sequenz gemäß SEQ ID NO. 5 im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entspricht und
c) einer Sequenz, die mit einer Sequenz gemäß (a) und/oder (b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert.

9. Nukleinsäure nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie für eine mindestens 80% homologe Aminosäuresequenz zu der in SEQ ID NO. 6 gezeigten Aminosäuresequenz kodiert.

10. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie ausgewählt ist aus

a) einer für die Bakteriophagenproteine cp67 und/oder H des Bakteriophagen ϕCh1 kodierenden und zumindest einen kodierenden Abschnitt der in SEQ ID NO. 7 gezeigten Nukleotidsequenz,
b) einer Sequenz, die der Sequenz gemäß SEQ ID NO. 7 im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entspricht und
c) einer Sequenz, die mit einer Sequenz gemäß (a) oder/und (b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert.

11. Nukleinsäure nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie für eine mindestens 80% homologe Aminosäuresequenz zu der in SEQ ID NO. 8 gezeigten Aminosäuresequenz kodiert.

12. Nukleinsäure nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie für eine mindestens 80% homologe Aminosäuresequenz zu der in SEQ ID NO. 9 gezeigten Aminosäuresequenz kodiert.

13. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie ausgewählt ist aus

a) einer für das Protein E des Bakteriophagen ϕCh1 kodierenden und in SEQ ID NO. 10 gezeigten Nukleotidsequenz,
b) einer Sequenz, die der Sequenz gemäß SEQ ID NO. 10 im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entspricht und
c) einer Sequenz, die mit einer Sequenz gemäß (a) und/oder (b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert.

14. Nukleinsäure nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß sie für eine mindestens 80% homologe Aminosäuresequenz zu der in SEQ ID NO. 11 gezeigten Aminosäuresequenz kodiert.

15. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie ausgewählt ist aus

a) einer für das Capsidprotein gp34, 7 des Bakteriophagen ϕCh1 kodierenden und in SEQ ID NO. 12 gezeigten Nukleotidsequenz,
b) einer Sequenz, die der Sequenz gemäß SEQ ID NO. 12 im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entspricht und
c) einer Sequenz, die mit einer Sequenz gemäß (a) und/oder (b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert.

16. Nukleinsäure nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß sie für eine mindestens 80% homologe Aminosäuresequenz zu der in SEQ ID NO. 13 gezeigten Aminosäuresequenz kodiert.

17. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie ausgewählt ist aus

a) einer für das Capsidprotein gp34,3 des Bakteriophagen ϕCh1 kodierenden und in SEQ ID NO. 14 gezeigten Nukleotidsequenz,
b) einer Sequenz, die der Sequenz gemäß SEQ ID NO. 14 im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entspricht und
c) einer Sequenz, die mit einer Sequenz gemäß (a) und/oder (b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert.

18. Nukleinsäure nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß sie für eine mindestens 80% homologe Aminosäuresequenz zu der in SEQ ID NO. 15 gezeigten Aminosäuresequenz kodiert.

19. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie ausgewählt ist aus

a) einer für das Capsidprotein gp42,1 des Bakteriophagen ϕCh1 kodierenden und in SEQ ID NO. 16 gezeigten Nukleotidsequenz,
b) einer Sequenz, die der Sequenz gemäß SEQ ID NO. 16 im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entspricht und
c) einer Sequenz, die mit einer Sequenz gemäß (a) und/oder (b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert.

20. Nukleinsäure nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß sie für eine mindestens 80% homologe Aminosäuresequenz zu der in SEQ ID NO. 17 gezeigten Aminosäuresequenz kodiert.

21. Rekombinanter Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens eine Kopie einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 20 enthält.

22. Vektor nach Anspruch 21 dadurch gekennzeichnet, daß er

a) eine von der Nukleotidsequenz des Bakteriophagen ϕCh1 gemäß Anspruch 2 abgeleitete, proteinkodierende Nukleinsäure operativ mit einem Expressionsregulationselement gemäß Anspruch 3 verknüpft oder/und
b) eine proteinkodierende Nukleinsäure gemäß Anspruch 2 operativ mit einem heterologen Expressionsregulationselement verknüpft oder/und
c) eine heterologe, proteinkodierende Nukleinsäure operativ mit einem Expressionsregulationselement gemäß Anspruch 2 verknüpft enthält.

23. Rekombinanter Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er den Replikationsursprung des Bakteriophagen ϕCh1 umfaßt.

24. Vektor nach einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß er zur Transformation von Mikroorganismen aus der Gruppe der Archaea (Archaebakterien) geeignet ist.

25. Vektor nach einem der Ansprüche 21 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß er zur Transformation von Natrialba magadii geeignet ist.

26. Vektor nach einem der Ansprüche 21 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß er

a) mindestens einen weiteren Replikationsursprung umfasst, der im Genom des Bakteriophagen ϕCh1 nicht enthalten ist und
b) ein Shuttle-Vektor ist.

27. Vektor nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Prokaryonten/Archaea-Shuttle-Vektor und/oder ein Eukaryonten/Archaea-Shuttle-Vektor ist.

28. Vektor nach einem der Ansprüche 21 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Sicherheitsvektor ist, der mindestens ein Suizidgen unter Kontrolle eines regulierbaren Promotors enthält.

29. Vektor nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß das Suizidgen ausgewählt ist aus einem

a) prokaryontischen Suizidgen und/oder einem
b) Archaea-Suizidgen.

30. Vektor nach Anspruch 29 dadurch gekennzeichnet, daß das prokaryontische Suizidgen das E-Gen des Bakteriophagen ϕX174 oder ein lytisch aktives Fragment davon ist.

31. Vektor nach Anspruch 29 dadurch gekennzeichnet, daß das Archaea-Suizidgen ein Lysegen von Archaea-Phagen oder ein lytisch aktives Fragment davon ist.

32. Vektor nach einem der Ansprüche 21 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß er ein zirkuläres Plasmid oder ein Bakteriophage ist.

33. Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einem Vektor nach einem der Ansprüche 21 bis 32 transformiert ist.

34. Zelle nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Natrialba magadii-Zelle ist.

35. Zelle nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine von Natrialba magadii verschiedene Zelle ist.

36. Isoliertes Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es von einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 5-20 kodiert ist.

37. Polypeptid nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß es mit mindestens einer heterologen Peptid- und/oder Polypeptidsequenz fusioniert ist.

38. Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Natrialba magadii-Zelle ist, die frei ist vom Prophagen des Bakteriophagen ϕCh1.

39. Natrialba magadii Stamm L13 (DSM 12971)

40. Phagenvariante, die im Vergleich zu ϕCh1 unterschiedliches Lyseverhalten aufweist und deren genomische Nukleotidsequenz mindestens 70% Homologie zur Nukleotidsequenz des Genoms von ϕCh1 gemäß SEQ ID NO. 1 und 2 aufweist.

41. Verwendung des Bakteriophagen ϕCh1 als Gentransfervektor dadurch gekennzeichnet, daß ein zu transferierendes Gen enthaltender Phage unter Hochsalzbedingungen zu einem Zielort transportiert wird, dort gegebenenfalls an einen Rezeptor bindet, und anschließend durch Verringerung der Salzkonzentration lysiert wird, wobei die DNA freigesetzt wird.

42. Verwendung von halophilen Archaea als Wirtszellen zur Herstellung von Proteinen oder anderen Polymeren, dadurch gekennzeichnet, daß rekombinante Archaeazellen unter Kultivierungsbedingungen, bei denen das gewünschte Produkt gebildet wird, und bei hohen Salzkonzentrationen gezüchtet werden, und durch Verringerung der Salzkonzentration eine Lyse der Zellen hervorgerufen wird, was zu einer wässrigen Freisetzung des gewünschten Produkts führt.

43. Verwendung nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß die rekombinanten halophilen Archaeazellen Natrialba magadii- Zellen sind.

44. Verwendung nach Anspruch 42 oder 43, dadurch gekennzeichnet, daß die Salzkonzentration zur Lyse der Zellen auf unter 1,5 M verringert wird.

45. Verwendung nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, daß die Salzkonzentration zur Lyse der Zellen auf unter 1 M verringert wird.