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KR20160107299A - 최종 당화 산물의 수용체(ｒａｇｅ)에 대한 항체 및 이의 용도 - Google Patents

최종 당화 산물의 수용체(ｒａｇｅ)에 대한 항체 및 이의 용도 Download PDF

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KR20160107299A
KR20160107299A KR1020167021949A KR20167021949A KR20160107299A KR 20160107299 A KR20160107299 A KR 20160107299A KR 1020167021949 A KR1020167021949 A KR 1020167021949A KR 20167021949 A KR20167021949 A KR 20167021949A KR 20160107299 A KR20160107299 A KR 20160107299A
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KR1020167021949A
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지졔 구
충-밍 셰
전 우
엔리코 엘. 디지아마리노
펑 뤄
제라드 비. 폭스
존 이. 할란
마르틴 슈미트
랄프 뢰베르트
라인홀트 뮐러
울리히 에베르트
폴커 님리히
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아비에 도이치란트 게엠베하 운트 콤파니 카게
애브비 인코포레이티드
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Publication date
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Abstract

본 발명은 RAGE 단백질에 결합하는 분리된 항체, 특히, 모노클로날 항체, 특히, CDR 이식된 사람화된 항체에 관한 것이다. 구체적으로, 이들 항체는 RAGE가 이의 다양한 리간드에 결합하는 것을 억제하는 능력을 갖는다. 본원에 기재된 항체 또는 이의 일부는 RAGE의 병리생리학적 리간드, 예를 들어, 잘못 폴딩된 단백질(예를 들어, 아밀로이드 β 및 최종 당화 산물)에 의해 유도되거나 이들에 의해 특징지워지는 질환 또는 장애를 치료하는데 유용하다.

Description

최종 당화 산물의 수용체(ＲＡＧＥ)에 대한 항체 및 이의 용도{Antibodies to receptor of advanced glycation end products (RAGE) and uses thereof}
본원은 알츠하이머 질환(AD), 중추신경계 세포 퇴행, 손상된 학습 및 기억, 아밀로이드 β의 비정상적인 수송 및 최종 당화 산물의 수용체(RAGE)와 관련된 기타 신경염증 병태의 치료 및 진단에 사용될 수 있는 항체, 특히 모노클로날 항체 및 특히, 이의 CDR 이식된 사람화된 버전에 관한 것이다. 특히 본 발명은 RAGE와 결합하는 항체 및 이의 단편에 관한 것이다.
알츠하이머 질환(AD)은 노인 치매에 대한 가장 흔한 원인이고 65세 이상의 노인 집단에서 약 10%의 발병율을 나타낸다. 노령화와 함께 질환 가능성은 증가한다. 전세계적으로, 약 1500만명의 사람들이 당해 질환을 앓고 있고 추가로 수명 연장이 향후 몇십년에 걸쳐 당해 질환을 앓는 사람의 수를 3배 이상 증가시킬 것으로 예상된다. 상기 관점에서, AD를 신중하고 즉각적으로 치료할 필요가 있다. 당해 치료와 함께 병든 환자들은 당해 치료 없이는 가능하지 않는 것 이상으로 수년동안 기능적이고 활동적인 생활을 유지할 수 있다. 따라서, 보호관리인 및 환자들에게 있어서 당해 치료를 위해서는 재정적인 문제 뿐만 아니라 "생활의 질"과 관련된 문제가 있다.
분자적 관점에서 AD는 비정상적으로 응집된 단백질의 퇴적을 특징으로 한다. 세포외 아밀로이드 플라크의 경우에, 이들 퇴적물은 주로 아밀로이드-β-펩타이드 필라멘트(Aβ)로 이루어지고 세포내 신경섬유 엉킴(NFT)의 경우에 주로 타우(tau) 단백질로 이루어진다. AD는 또한 RAGE의 증가된 신경원 발현을 특징으로 한다. RAGE는 Aβ에 대한 시그널-전달 세포 표면 수용체로서 기능하는 면역글로불린 계열의 다중 리간드 수용체이다.
마우스내 Aβ40 봉입체가 여러 그룹에서 뇌 혈관의 혈관 수축을 유도하고 뇌혈류(CBF)를 감소시키는 것으로 나타난다. AD를 앓는 환자는 또한 뇌혈류가 감소된다. 유전자전이된 동물이 플라크 형성을 유발하는 질환을 유도하는 단백질 아밀로이드 전구체 단백질(APP)을 과발현하는 AD의 마우스 모델에서, RAGE는 질환 진행에서 병원성 인자로서 연관되어 있다(문헌참조: Deane et al. Nature Medicine 9(7) pp 907-913, 2003; Arancio et al. EMBOJ, 1-10, 2004).
RAGE는 Aβ-펩타이드에 결합하는 것으로 나타났다. 당해 상호작용의 억제는 유전자전이 동물 모델에서 Aβ의 축적을 억제하고 따라서 RAGE가 AD에 관여하는 것으로 사료된다. sRAGE (가용성 RAGE) 및 항-RAGE 항체를 사용한 치료는 플라크 수를 감소시키는 것으로 나타났다(문헌참조: Deane et al, 2003). 항체에 의한 RAGE와 아밀로이드의 상호작용 차단은 AD 환자에 대한 치료가 될 수 있지만, 동물 혈청으로부터 생성된 기존의 폴리클로날 항체는 사람에 대한 만성 치료를 위해 적합하지 않다.
RAGE와 Aβ의 상호작용은 WO 2006/077101 A1에 기재되어 있고, 당해 문헌은 RAGE의 C 말단 도메인의 일부, 주로 C1-도메인을 나타내는 펩타이드와 Aβ가 RAGE에 결합하는 것에 대한 경쟁 뿐만 아니라 v-도메인이 결핍된 RAGE의 경쟁을 기재하고 있다. RAGE의 v-도메인과 항-RAGE 항체의 상호작용은 WO2007109749(A2)에 기재되어 있고 당해 문헌은 또한 상이한 리간드(S100b, HMGB1 (고 이동성 그룹 박스 1 단백질), 아밀로이드 aβ)의 결합이 당해 도메인에 결합함을 통해 RAGE에 결합함을 기재하고 있다.
WO 2008/137552 A2는 RAGE의 상이한 도메인에 결합하는 특정 모노클로날 항-RAGE 항체를 기재하고 있다. 당해 항체 대부분은 사람 RAGE와, HMGB1 및 CpG DNA의 복합체의 상호작용을 억제한다.
WO 2006/077101는 RAGE의 AGER-RME 및 AGER-CDP로 지정된 펩타이드의 동정, 기능 및 용도에 관한 것이다. 당해 펩타이드는 특히 항-RAGE 항체와 같이 RAGE 결합 리간드를 동정하고 제조하기 위해 적용될 수 있다. 본 발명은 RAGE의 C-도메인에 결합하는 신규 모노클로날 항체 및 RAGE내 C1 및 C2-도메인에 대한 모노클로날 항체와 Aβ의 특이적 상호작용 및 결합 경쟁을 기재하고 있다.
본 발명은 RAGE에 특이적으로 결합하는 결합 분자, 특히 항체를 제공한다. 본 발명의 대표적인 항-RAGE 항체는 하기에 보다 상세하게 특정된 바와 같이, 서열번호 1, 5, 9, 13, 17, 및 21에 나타낸 항체 가변 영역 아미노산 서열 또는 이의 개별 CDR 또는 관련 CDR 서열 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명은 RAGE에 특이적으로 결합하는 결합 분자, 특히 항체를 제공한다. 본 발명의 대표적인 항-RAGE 항체는 하기에 보다 상세하게 특정된 바와 같이, 서열번호 1, 5, 9, 13, 17, 및 21에 나타낸 항체 가변 영역 아미노산 서열 또는 이의 개별 CDR 또는 관련 CDR 서열 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
특이적으로, 본 발명은 RAGE에 결합하는 모노클로날 항체, 보다 구체적으로 RAGE의 C-도메인에 결합하는 모노클로날 항체를 제공한다.
본 발명은 서열번호 5, 13 및 21 중 어느 하나와 90% 이상 동일하거나 당해 서열에 포함된 항체의 RAGE 결합 단편인 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하고 RAGE에 특이적으로 결합하는 항-RAGE 항체를 포함한다.
또한 서열번호 1, 9 및 17 중 어느 하나와 90% 이상 동일하거나 당해 서열 내 포함된 항체의 RAGE-결합 단편인 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고 RAGE에 특이적으로 결합하는 항-RAGE 항체가 포함된다.
본 발명의 특정 양태는 RAGE의 C-도메인에 결합할 수 있고 Aβ-글로불로머의 결합을 차단할 수 있는 여러 모노클로날 항체에 의해 대표된다. 보다 구체적으로 본 발명은 RAGE의 C-2 도메인에 결합하고, 폴리클로날 항체를 생성하기 위해 사용되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드에 결합하지 않고, 마우스내 뇌 혈관에 대한 Aβ 1-40의 생체내 효과를 중화시킬 수 있는 모노클로날 항체 11E6을 기재하고 있다.
본 발명의 항-RAGE 항체는 RAGE의 C-도메인에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다.
본 발명의 항-RAGE 항체는 키메라 항체, CDR 이식된 또는 사람화된 항체, 단일쇄 항체, 융합 단백질 및 사람 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 상기된 바와 같은 항-RAGE 항체 또는 RAGE 결합 단편을 포함한다.
다양한 양태에서, 본 발명의 항체는 재조합 항체 또는 모노클로날 항체이다. 본 발명의 특정 중화 항체는 본원에서 mAb7F9, mAb11E6, 및 mAb4E5로서 언급되고 이의 기능성 항체 단편, 및 mAb7F9, mAb11E6, 및 mAb4E5와 동일한 성질, 예를 들어, 낮은 해리 동력학과 함께 RAGE와의 고친화성 결합 및 높은 중화 능력을 갖는 다른 항체 및 기능성 항체 단편이 본 발명의 일부로서 간주된다. 그러나 본 발명의 사람 항체는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있는 사람 배선 면역글로불린 면역원성 RAGE 폴리펩타이드 또는 이의 단편에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 당해 결합 친화성은 경쟁적 ELISA, c RIA, BIAcore 또는 KinExA 기술에 의해 측정될 수 있다. 또한 당해 해리 속도는 BIAcore 또는 KinExA 기술에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화성 및 해리 속도는 예를 들어, BIAcore를 사용하는 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된다.
본 발명의 모노클로날 항체 중 하나인 mAb7F9 항체는 서열번호 1의 서열, 및 각각 서열번호 1의 잔기 31번 내지 35번, 50번 내지 68번 및 101번 내지 108번인 서열번호 2, 3 및 4의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH 영역)을 포함하는 서열과 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 본 발명의 mAb7F9 항체는 서열번호 5의 서열 및 각각 서열번호 5의 잔기 24번 내지 34번, 50번 내지 56번 및 89번 내지 97번인 서열번호 6, 7 및 8의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL 영역)을 포함하는 서열과 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
본 발명의 또 다른 모노클로날 항체인 mAb11E6 항체는 서열번호 9의 서열; 및 각각 서열번호 9의 31번 내지 35번, 50번 내지 66번 및 99번 내지 109번 잔기인 서열번호 10. 11 및 12의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH 영역)을 포함하는 서열과 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 본 발명의 mAb11E6 항체는 서열번호 13의 서열; 및 각각 서열번호 13의 잔기 24번 내지 34번, 50번 내지 56번 및 89번 내지 97번 잔기인 서열번호 14, 15 및 16의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL 영역)을 포함하는 서열과 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. mAb11E6은 RAGE의 C-2 도메인과 결합하지만 폴리클로날 항체를 생성시키는데 사용되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드에는 결합하지 않고 마우스 내 뇌 혈관에 대한 Aβ1-40의 생체내 효과를 중화시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 모노클로날 항체인 mAb4E5 항체는 서열번호 17의 서열; 및 각각 서열번호 17의 잔기 31번 내지 35번, 50번 내지 66번 및 99번 내지 109번인 서열번호 18, 19 및 20의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH 영역)을 포함하는 서열과 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 본 발명의 mAb4E5 항체는 서열번호 21의 서열; 및 각각 서열번호 21의 잔기 24번 내지 34번, 50번 내지 56번, 89번 내지 97번인 서열번호 22, 23 및 24를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL 영역)을 포함하는 서열과 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
또한, 본 발명의 RAGE와 상호작용하는 분리된 모노클로날 항체는 당화된 결합 단백질일 수 있고 이때, 당해 항체 또는 이의 항원 결합부는 하나 이상의 탄수화물 잔기를 포함하는 것으로 의도된다. 초기 생체내 단백질 생산은 해독후 변형으로 공지된 추가의 프로세싱을 받을 수 있다. 특히, 당(글리코실) 잔기는 글리코실화로서 공지된 과정으로 효소적으로 첨가될 수 있다. 공유적으로 결합된 올리고사카라이드 측쇄를 함유하는 수득한 단백질은 글리코실화된 단백질 또는 당단백질로서 공지되어 있다. 단백질 글리코실화는 단백질이 발현되는 숙주 세포뿐만 아니라 목적하는 단백질의 아미노산 서열에 의존한다. 상이한 유기체는 상이한 글리코실화 효소(예를 들어, 글리코실트랜스퍼라제 및 글리코시다제)를 생성할 수 있고 가용한 상이한 기질(예를 들어, 뉴클레오타이드 당)을 갖는다. 당해 인자로 인해, 단백질 글리코실화 패턴 및 글리코실 잔기의 조성은 특정 단백질이 발현되는 숙주 시스템에 따라 상이할 수 있다. 본 발명에 유용한 글리코실 잔기는 글루코스, 갈락토스, 만노스, 푸코스, n-아세틸글루코사민 및 시알산을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역과 같은 중쇄 불변 영역을 포함한다. 추가로, 당해 항체는 카파 경쇄 불변 영역 또는 람다 경쇄 불변 영역인 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 특히, 당해 항체는 카파 경쇄 불변 영역을 포함한다. 또는, 당해 항체 부분은 예를 들어, Fab 단편 또는 단일쇄 Fv 단편일 수 있다. Fc 부분에서 아미노산 잔기의 대체는 항체 이펙터 기능을 변화시키고 이는 문헌(참조: Winter, et al. 미국 특허 제5,648,260호; 제5,624,821호)에 공지되어 있다. 항체의 Fc 부분은 여러 중요한 이펙터 기능, 예를 들어, 사이토킨 유도, ADCC, 식세포작용, 보체 의존성 세포독성(CDC) 및 항체 및 항원-항체 복합체의 반감기/제거 비율을 매개한다. 몇몇 경우에 이들 이펙터 기능은 치료학적 항체를 위해 요구될 수 있지만 다른 경우에는 치료 목적에 따라 불필요하거나 심지어 해로울 수 있다. 특정 사람 IgG 이소형(isotype), 특히 IgG1 및 IgG3은 각각 Fcγ Rs 및 보체 C1q에 결합함을 통해 ADCC 및 CDC를 매개한다. 신생기 Fc 수용체(FcRn)는 항체의 순환 반감기를 결정하는 중요한 성분이다. 또 다른 양태에서 하나 이상의 아미노산 잔기는 항체의 불변 영역, 예를 들어, 항체의 Fc 영역에서 대체되어 항체의 이펙터 기능이 변화된다.
도 1a-1c는 재조합 사람 RAGE에 대한 재조합 및 하이브리도마-유래 항-사람 RAGE 모노클로날 항체 7F9, 11E6, 및 4E5의 ELISA 결합을 보여준다.
도 2는 도트 블롯 결합에 의한 모노클로날 항체 7F9, 11E6, 및 4E5의 특징 분석을 보여준다.
도 3a - 3c는 sRAGE - Aβ-글로불로머-모노클로날 항체 경쟁을 보여주는 HTRF 분석 결과를 보여준다.
도 4는 HTRF sRAGE - Aβ-글로불로머 결합을 보여준다.
도 5는 Aβ-글로불로머의 sRAGE-Fc 및 RAGE v-도메인으로의 결합을 보여준다.
도 6a - 6c는 상이한 RAGE 단편에 대한 본 발명의 모노클로날 항체의 ELISA 결합 실험을 보여준다.
도 7a - 7c는 상이한 RAGE 단편에 대한 본 발명의 모노클로날 항체의 ELISA 결합 단편을 보여준다.
도 8a - 8f는 Aβ1-40의 상이한 용량에 의해 유도된 뇌혈류의 변화를 보여준다.
도 9a - 9c는 뇌혈류에서 Aβ1-40-유도된 변화에서의 11E6의 효과를 보여준다.
도 10은 상이한 용량의 11E6 또는 대조군 항체로 처리된 노화된 Tg2576 마우스에서 관찰되는 뇌혈류의 변화를 보여준다.
도 11은 항체 11E6가 Aβ 유도된 다이나민 절단으로부터 해마 뉴런을 보호함을 보여준다. 상부 패널: 단일 실험으로부터 반복되는 실험 조건을 나타내는 샘플을 보여주고 처리 농도(μM)는 상기 지적되어 있다. Aβ의 첨가 없이 세포는 대부분 온전한(약 100 kDa) 다이나민 I 시그널 (제1 막대)을 보여주고 이는 5μM Aβ(제2 막대)로 처리된 세포에서 감소하여 약 90kDa 절단 생성물로 복귀한다. 항체 11E6 처리(제3 막대)는 절단을 방지하는 반면, Ig1 대조군 항체(제4 막대)는 현저한 보호 효과를 나타내지 않는다. 하부 패널: 3개의 독립적인 실험의 다이나민 시그널의 정량화(OμM Aβ 처리로의 정상화 후 % 다이나민 +/- SEM으로서 표현됨)는 11E6의 통계학적으로 유의적인 보호 효과를 밝혔다(일원배치 ANOVA, Kruskal Wallis 시험 후 Dunns 시험; *는 p<0.05를 나타낸다)
도 12는 랫트 해마 슬라이스 배양물에서 시냅스 전달의 글로불로머-유도된 강한 억제에 대한 11E6 (A) 또는 대조군 항체(B)의 영향을 보여준다. 0.1 μM 11E6는 글로불로머 유도된 결손을 완전히 역전시켰다(참조 (A)).
도 13은 Tg2576 마우스에서 아밀로이드 플라크 침적물에 대해 항체 11E6을 사용한 12주 처리의 효과를 보여준다. 11E6 또는 IgG1 대조군 항체 처리(그룹당 n=19) 후 항 Aβ 항체 6G1로 표지화시켜 검출되는 바와 같은 플라크(A, B)로 덮여진 면적 및 플라크 개수(C,D)를 보여준다. 11E6을 사용한 처리는 신피질에서 다수의 침적물에 의해 덮여진 면적 및 이의 개수를 각각 24.5% (A) 및 26.8% (C) 감소시켰다. 통계학적 분석은 강한 경향(괄호안의 별표, p<0.06; Mann-Whitney U-시험)을 나타냈다. 당해 감소는 전두 피질에서 통계학적으로 유의적이고(별표, p<0.05; Mann-Whitney U-시험), 여기서, 침적물 영역은 11E6 처리 후 23.5%(B) 감소하였고 이들의 개수는 26.8% (D) 감소하였다.
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서열번호 4: mAb VH 7F9 CDR-H3의 아미노산 서열
서열번호 5: mAb VL 7F9의 아미노산 서열
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서열번호 7: mAb VL 7F9 CDR-L2의 아미노산 서열
서열번호 8: mAb VL 7F9 CDR-L3의 아미노산 서열
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서열번호 11: mAb VH 11E6 CDR-H2의 아미노산 서열
서열번호 12: mAb VH 11E6 CDR-H3의 아미노산 서열
서열번호 13: mAb VL 11E6의 아미노산 서열
서열번호 14: mAb VL 11E6 CDR-L1의 아미노산 서열
서열번호 15: mAb VL 11E6 CDR-L2의 아미노산 서열
서열번호 16: mAb VL 11E6 CDR-L3의 아미노산 서열
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서열번호 18: mAb VH 4E5 CDR-H1의 아미노산 서열
서열번호 19: mAb VH 4E5 CDR-H2의 아미노산 서열
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서열번호 24: mAb VL 4E5 CDR-L3의 아미노산 서열
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서열번호 32: 6His-(Thr)-[RAGE (130-336)]를 암호화하는 작제물 #6(굵게 표시)의 완전한 플라스미드 뉴클레오타이드 서열
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서열번호 34: 암호화된 아미노산 서열 RAGE 단백질 # 1
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서열번호 37: 암호화된 아미노산 서열 RAGE 단백질 # 4
서열번호 38: 암호화된 아미노산 서열 RAGE 단백질 # 5
서열번호 39: 암호화된 아미노산 서열 RAGE 단백질 # 6
서열번호 40: 암호화된 아미노산 서열 RAGE 단백질 # 7
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서열번호 46: 프레임워크 아미노산 서열 VH7-4.1/JH6 FR4 및 VH1-2/JH6 FR4
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서열번호 57: CDR-이식된 아미노산 서열 VH 11E6.2-GL
서열번호 58: CDR-이식된 아미노산 서열 VL 11E6.1-GL
서열번호 59: CDR-이식된 아미노산 서열 VL 11E6.2-GL
서열번호 60: hRAGE의 아미노산 서열
서열번호 61: husRAGE 단편의 아미노산 서열
서열번호 62: 사람화된 항체 서열 VH h11E6.1
서열번호 63: 사람화된 항체 서열 VL h11E6.1
서열번호 64: 사람화된 항체 서열 VL h11E6.2
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서열번호 66: 사람화된 항체 서열 VL h11E6.4
서열번호 67: 사람화된 항체 서열 VH h11E6.5
서열번호 68: 사람화된 항체 서열 VH h11E6.9
서열번호 69: 사람화된 항체 서열 VH h11E6.16
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1. 일반 정의
본원에서 달리 정의되지 않는 경우, 본 발명과 관련하여 사용된 과학적 및 기술적 용어들은 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 용어의 의미 및 범위는 명확하여야 하지만; 어떤 잠재적인 불명료함이라도 있는 경우에는 본 명세서에 제시된 정의가 어떤 사전적 또는 외부적 정의보다 더 선행한다. 또한, 문맥상 다른 식으로 요구되지 않는 한, 단수형 용어는 복수형을 포함하는 것이고, 복수형 용어는 단수형을 포함하는 것이다. 본 출원에서, "또는"의 사용은 다른 식으로 언급되지 않는 한, "및/또는"을 의미한다. 더구나, 용어 "포함하는"뿐만 아니라 "포함한다" 및 "포함된"과 같은 다른 형태의 사용은 제한적인 것이 아니다. 또한, "요소" 또는 "구성성분"과 같은 용어는 구체적으로 언급되지 않는 한, 하나의 유니트를 포함하는 요소 및 구성성분 및 하나 이상의 서브유니트를 포함하는 요소 및 구성성분 둘 다를 포함한다.
일반적으로, 본 명세서에 기술된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 하이브리드화와 관련하여 사용된 명명법 및 이의 기술은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고, 통상적으로 사용되는 것이다. 본 발명의 방법 및 기술은 일반적으로, 다른 식으로 나타내지 않는 한, 본 기술분야에서 잘 알려진 통상적인 방법에 따라 본 명세서 전체에 걸쳐 인용되고 거론된 다양한 일반적 및 더욱 특정한 문헌에 기술된 바와 같이 수행된다. 효소반응 및 정제기술은 제조자의 시방서에 따라, 본 기술분야에서 통상적으로 수행되는 바와 같이, 또는 본 명세서에 기술된 바와 같이 수행된다. 본 명세서에 기술된 분석 화학, 합성 유기화학 및 의학 및 약제학적 화학과 관련하여 사용된 명명법 및 이의 실험실 절차 및 기술은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고, 통상적으로 사용되는 것이다. 화학적 합성, 화학적 분석, 약제학적 제제, 제형화 및 전달, 및 환자의 치료를 위해서는 표준 기술이 사용된다.
본 발명은 보다 용이하게 이해되도록 선택된 용어는 하기에 정의된다.
본 명세서에 사용된 "폴리펩타이드"란 용어는 아미노산의 임의의 중합체 쇄를 의미한다. "펩타이드" 및 "단백질"이란 용어는 폴리펩타이드란 용어와 호환 사용되며, 역시 아미노산의 중합체 쇄를 의미한다. "폴리펩타이드"란 용어는 천연 또는 합성 단백질, 단백질 단편 및 단백질 서열의 폴리펩타이드 유사체를 포괄한다. 폴리펩타이드는 단량체성 또는 중합체성일 수 있다.
"분리된 단백질" 또는 "분리된 폴리펩타이드"란 용어는 유도 기원 또는 근원으로 인해 자연 상태에서 동반하는 천연 성분과 관련되어 있지 않고; 동종 유래의 다른 단백질이 실질적으로 없으며; 다른 종의 세포에 의해 발현되고; 또는 천연에 존재하지 않는 단백질 또는 폴리펩타이드이다. 따라서, 천연 세포와 다른 세포계에서 합성되거나 화학 합성된 폴리펩타이드는 천연 구성성분으로부터 "분리된" 것일 것이다. 또한, 단백질은 당업계에 공지된 단백질 정제 기술을 이용해 분리에 의해 천연 성분이 실질적으로 제거된 것일 수 있다.
본 명세서에 사용된 "회수하는"이란 용어는 폴리펩타이드와 같은 화학 종을, 당업계에 공지된 단백질 정제 기술의 사용과 같은 분리에 의해 자연 관련 구성성분이 실질적으로 없게 하는 과정을 의미한다.
용어, "최종 당화 산물의 수용체(RAGE)"는 무엇보다 가용성 Aβ 펩타이드, S100b, 및 HMGB1 (또한 암포테린으로서 공지됨)와 결합하는 면역글로불린 계에서 다중 리간드 수용체를 나타낸다. RAGE는 이들 리간드에 응답하여 병리-생리학적 관련 세포 변화를 매개한다. RAGE 및 사람 APP를 과발현하는 유전자전이 동물은 공간 학습 및 기억에서 조기 비정상을 나타내고 이는 RAGE가 알츠하이머형 병리학에서 Aβ-유도된 신경원 교란에 대한 보조인자임을 나타내고 RAGE가 세포 기능부전을 개선시키기 위한 잠재적인 표직임을 시사한다.
RAGE의 구조는 밝혀지지 않았다. 다른 단백질과의 상동성은 RAGE가 여러 도메인을 갖는 모델을 유도한다. 이들 도메인은 면역글로불린과 유사하게 지칭된다: (i) N 말단에서 V-형 도메인: 면역글로불린에서 이와 균등한 도메인은 항원과 결합하고 이들 단백질내 유일한 결합 영역을 나타낸다. RAGE에서, 당해 도메인은 S100과 같은 몇몇 리간드와 결합한다(문헌참조: Ostendorp et al. EMBOJ. 26,3875,2007; Leclerc et al. JBC 282,31317,2007). RAGE에서 v-형 도메인에 결합하는 모노클로날 항체는 상이한 리간드 S100b, HMGB1, 및 아밀로이드 β (문헌참조: WO2007109749(A2))의 결합과 경쟁하고 이것은 이들 리간드가 또한 당해 동일한 도메인을 통해 RAGE에 결합함을 의미한다. (ii) 제1 C2-형 도메인: RAGE내 2개의 도메인은 면역글로불린의 C2 도메인과 상동성을 갖고; 이들 도메인중 하나는 C1으로 지칭된다(또한 문헌(참조: Ostendorp et al. BBRC 2006)에 의해 사용되는 명명법). 당해 도메인에 결합하는 몇몇 리간드는 예를 들어, S100A12(또한 ENRAGE 또는 칼그라눌린 C로 지칭됨)으로 기재되었고 이는 Kd = 90 nM의 친화성으로 결합한다(문헌참조: Hofmann et al. Cell 97, 889, 1999; Xie et al. JBC, 282, 4218, 2007). Aβ는 당해 도메인에 대해 S100A12와 경쟁하고, 이는 Aβ가 또한 C1-도메인에 결합함을 시사한다. (iii) 제2 C2-형 도메인: 당해 도메인은 C2로 지칭된다(또한 문헌(참조: Ostendorp et al. BBRC 2006)에 의해 사용됨). RAGE 리간드 S100A6은 C2 도메인과 결합하고 C2 도메인 기원의 펩타이드에 대해 생성된 항체는 당해 결합을 위해 S100A6과 경쟁하는 것으로 나타났고; 당해 항체는 SH-SY5Y에서 감소된 시그널 전달을 유도한다 (문헌참조: Leclerc et al. JBC 282,31317,2007).
"RAGE 도메인"은 당업계에 제공된 상이한 정의에 준하게 정의될 수 있다:
문헌[참조: Xie et al. 2007, J. Biol. Chem., Vol. 282:4218-4231]에 따라 h RAGE 도메인에 대한 하기의 정의를 적용한다:
- V 도메인(서열번호 60의 아미노산 24-129),
- C1 도메인(서열번호 60의 아미노산 130-234),
- C2 도메인 (서열번호 60의 아미노산 235-336).
문헌[참조: Hudson et al, The FASEB Journal. 2008;22:1572-1580]에 의한 보다 최근의 정의에 따라, hRAGE (서열번호 60에 따른 404개 아미노산 잔기)는 하기로 구성된 세포외 영역(서열번호 60의 아미노산 1-342)을 갖는다:
- 시그널 펩타이드(서열번호 60의 아미노산 1-22)에 이어서 3개의 면역글로불린형 도메인(다음 도메인을 포함함),
- Ig-형 V-형 도메인 (서열번호 60의 아미노산 23-116) 및
- 2개의 Ig-형 C2-형 1/2 도메인 (서열번호 60의 아미노산 124-221; 또한 C1 도메인으로 지정되고; 서열번호 60의 아미노산 227-317; 또한 C2 도메인으로 지정됨);
- 단일 막관통 도메인(서열번호 60의 아미노산 343-363), 및
- 짧은 세포질 테일 (서열번호 60의 아미노산 364-404).
고도의 동일성 관점에서, 특히, 도메인 V, C1 및 C2의 정의와 관련하여, 달리 언급되지 않는 경우, 각각의 정의는 본 발명의 결합 단백질의 결합 특성을 정의하기 위해 적용될 수 있다.
상기 나타낸 바와 같이, RAGE는 상이한 도메인을 통해 상이한 리간드와 결합할 수 있다. 다른 리간드와의 경쟁 실험의 결과는 Aβ가 C1-도메인에 결합함을 나타내는 것으로 보인다(문헌참조: Hofmann et al. Cell 97, 889, 1999 또는 Xie et al. JBC, 282, 4218, 2007). RAGE 리간드의 비제한적인 예로서 다음이 언급될 수 있다:
- 최종 당화 산물(AGE), (Baynes J. W., 1991, Diabetes. 1991, 40:405-412; Ahmed K.A., 2007, J Clin Biochem Nutr. 41 (2):97-105);
- S100/칼그라눌린 계열의 구성원(예를 들어, 칼그라눌린 C (또한 ENRAGE 및 S100A12로서 공지됨), S100Al, S100A4, S100A11, S100A13, S100B, 및 S100P);
- 예를 들어, Aβ 1-40 펩타이드로서 아밀로이드-β-펩타이드 (Aβ);
- 예를 들어, Aβ1-42, Aβ12-42, Aβ20-42 글로불로머로서 아밀로이드-β 글로불로머(문헌참조: Barghorn et al, Globular amyloid B peptide 1-42 oligomer - a homogenous and stable neuropathological protein in Alzheimer's disease; Journal of Neurochemistry. 95(3):834-847, November 2005; WO2007/062852; WO2008/150949; 이 모든 문헌은 참조로서 인용됨);
- 백혈구 인테그린 (예를 들어, Mac-1)
본원에 사용된 바와 같은 용어 "RAGE"는 사람 RAGE로 언급되고 이는 "hRAGE" 또는 "huRAGE"로 표시된다. 달리 언급되지 않는 경우 용어 "RAGE"는 또한 사람 종과는 상이한 종(예를 들어, 마우스 또는 래트와 같은 설치류)으로부터 분리되거나 수득된 RAGE 분자; 또는 소 RAGE 분자를 포함한다.
당해 용어"sRAGE"는 RAGE의 외부 세포 도메인으로부터 유래하는 가용성 형태의 RAGE를 언급한다. 예를 들어, 사람 RAGE로부터 유래된 sRAGE 분자(또한 husRAGE로서 표시됨)는 사람 RAGE(서열번호 60 참조)의 아미노산 잔기 1 내지 331번(서열번호 61 참조)를 포함한다.
본 명세서에 사용된 "생물학적 활성"은 본 명세서에 정의된 바와 같은 RAGE의 모든 고유의 생물학적 성질을 의미한다.
항체, 단백질 또는 펩타이드와 제2 화학 종 간의 상호작용과 관련하여 본 명세서에 사용된 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"이란 용어는 이 상호작용이 화학 종 상의 특정 구조(예: 이하에 정의되는 "항원 결정인자" 또는 "에피토프")의 존재에 의존적임을 의미하고; 예컨대 항체는 일반적으로 단백질이 아닌 단백질의 특정 구조를 인식하여 여기에 결합한다. 항체가 에피토프 "A"에 특이적이면, 표지화된 "A"와 항체를 함유하는 반응물에서 에피토프 A(또는 유리의 표지 미부착된 A) 함유 분자의 존재는 항체에 결합된 표지화된 A의 양을 감소시킬 것이다.
본 명세서에 사용된 "항체"란 용어는 광범하게는 4개의 폴리펩타이드 쇄, 즉 2개의 중쇄(H)와 2개의 경쇄(L), 또는 이의 임의의 기능성 단편, 돌연변이체, 변형체 또는 유도체를 포함하고, Ig 분자의 필수적인 에피토프 결합 특징을 보유하는 임의의 면역글로불린(Ig) 분자를 의미한다. 상기 항체의 돌연변이체, 변형체 또는 유도체 형태는 당업계에 공지되어 있다. 이의 구체예는 이하에 논의되지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 항체는 분자와 특이적으로 반응하여 항체에 분자를 결합시킬 수 있다면 분자에 "결합할 수 있는"이라고 한다.
본 명세서에 사용된 "모노클로날 항체"는 여러 항체의 혼합물을 함유하는 "폴리클로날" 항체 제조물과 대조적으로, 공통 중쇄 및 공통 경쇄 아미노산 서열을 공유하는 항체 분자의 제조물을 의미하는 것이다. 모노클로날 항체는 파지, 세균, 효모 또는 리보솜 디스플레이와 같은 몇몇 신기술뿐만 아니라 하이브리도마-유래의 항체(예: 표준 쾰러 및 밀스타인(Kohler and Milstein) 하이브리도마 방법론((1975) Nature 256: 495-497)로 예시되는 고전 방법으로 생산할 수 있다.
전체 길이 항체에서, 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(HCVR 또는 VH로 약칭) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(LCVR 또는 VL로 약칭) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 다시 상보성 결정 영역(CDR)이라 불리는 초가변성 영역과 이 영역 사이에 산재해 있는 프레임워크 영역(FR)이라 불리는 더 보존적인 영역으로 세분될 수 있다. 각 VH 및 VL은 3개의 CDR과 4개의 FR로 이루어져 있고 이들은 N-말단에서 C-말단까지 하기의 순서로 배열되어 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 면역글로불린 분자는 임의의 종류(예: IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 항체의 "항원결합부" 또는 "항원결합 단편"(단순히 "항체부" 또는 "항체 단편")은 항원(예: RAGE)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 의미한다. 항체의 항원결합 기능은 전체 길이 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다는 것은 밝혀져 있다. 이러한 항체의 구체예는 추가로 2종 이상의 다른 항원에 특이적으로 결합하는 이특이성(bispecific), 이원 특이성(dual specific) 또는 다특이성(multi-specific) 형태일 수 있다. 항체의 "항원결합부"란 용어에 포함되는 결합 단편의 예로는 (i) Fab 단편, 즉, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 즉, 디설파이드 브릿지를 통해 힌지 영역에서 서로 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (v) 단일 가변 도메인을 포함하는 dAb 단편(Ward ed al., (1989) Nature 341:544-546, Winter et al., PCT 공개번호 WO 90/05144 A1, 본원에 참고인용됨); 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인, 즉, VL 및 VH가 별도의 유전자에 의해 암호화될지라도 이들은 재조합 방법을 이용해 합성 링커로 결합시킴으로써 VL 영역과 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성한 단일 단백질로 제조할 수 있다(단일쇄 Fv (ScFv)로서 공지됨; Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 참조). 또한, 이러한 단일쇄 항체는 항체의 "항원결합부"란 용어에 포함되는 것으로 생각한다. 디아바디(diabody)와 같은 단일쇄 항체의 다른 형태도 또한 여기에 포함된다. 디아바디는 2가, 이특이적 항체로, 여기서 VH 및 VL 도메인은 단일 폴리펩타이드 쇄에서 발현되지만, 동일 쇄 상의 두 도메인 간에 쌍을 형성할 정도로 매우 짧은 링커를 사용하여, 도메인들이 다른 쇄의 상보성 도메인과 쌍을 이루게 하고 2개의 항원 결합 부위를 생성한다(참조: 예를 들어, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123). 이러한 항체 결합부는 당업계에 공지되어 있다(Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag, New York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5).
본 명세서에 사용된 "항체 작제물"이란 용어는 링커 폴리펩타이드 또는 면역글로불린 불변 도메인에 연결된 본 발명의 하나 이상의 항원결합부를 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. 링커 폴리펩타이드는 펩타이드 결합에 의해 연합된 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하며 하나 이상의 항원결합부를 연결하는데 사용된다. 이러한 링커 폴리펩타이드는 당업계에 공지되어 있다(예: Holliger, P., et al.(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al.(1994) Structure 2:1121-1123). 면역글로불린 불변 도메인은 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인을 의미한다. 사람 IgG 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있고 표 1에 나타낸다.
Figure pat00001
추가로, 본 발명의 항체 또는 이의 항원결합부는 당해 항체 또는 항체부와 하나 이상의 추가의 단백질 또는 펩타이드와의 공유 또는 비공유 연합에 의해 형성된 대형 면역부착 분자의 일부일 수 있다. 당해 면역부착 분자의 예로는 사량체 scFv 분자를 제조하기 위한 스트렙타비딘 코어 영역의 이용(Kipriyanov, S. M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) 및 2가 및 비오틴 부착된 scFv 분자를 제조하기 위한 시스테인 잔기, 마커 펩타이드 및 C-말단 폴리히스티딘 태그의 이용(Kipriyanov, S.M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058)을 포함한다. 항체부, 예컨대 Fab 및 F(ab')2 단편은 종래 기술, 예컨대 각각 전체 항체의 파파인 또는 펩신 분해를 이용하여 전체 항체로부터 제조할 수 있다. 또한, 항체, 항체부 및 면역부착 분자는 본 명세서에 기술된 바와 같은 표준 재조합 DNA 기술을 이용해 수득할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "분리된 항체"는 다른 항원 특이성을 가진 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 언급하려고 한다(예: 사람 RAGE에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 사람 RAGE 외에 다른 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다). 하지만, 사람 RAGE에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 다른 종 유래의 RAGE 분자와 같은 다른 항원에 대해 교차반응성을 나타낼 수 있다. 또한, 분리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없는 것일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "사람 항체"는 가변 및 불변 영역이 사람 배선의 면역글로불린 서열로부터 유래하는 가변 및 불변 영역을 보유하는 항체를 포함하려 한다. 본 발명의 사람 항체는 예를 들어 CDR에 및 특히 CDR3에 사람 배선 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이 유발 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 함유할 수 있다. 하지만, 본 명세서에 사용된 "사람 항체"란 용어는 마우스와 같은 다른 포유동물 종의 배선에서 유래된 CDR 서열이 사람 프레임워크 서열 위에 이식된 항체를 포함하려는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 "재조합 사람 항체"란 용어는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 모든 사람 항체, 예컨대 숙주 세포에 형질감염된 재조합 발현 벡터를 이용해 발현된 항체(이하 상세히 설명됨), 재조합, 조합적 사람 항체 라이브러리로부터 분리된 항체(Hoogenboom H.R., (1997) TIB Tech. 15:62-70; Azzazy H., and Highsmith W.E.,(2002) Clin. Biochem. 35: 425-445; Gavilondo J.V., and Larrick J.W.(2002) BioTechniques 29: 128-145; Hoogenboom H., and Chames P.(2000) Immunology Today 21: 371-378), 사람 면역글로불린 유전자를 위해 형질전환된 동물 (예를 들어, 마우스)로부터 분리된 항체 [참조: Taylor, L.D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295; Kellermann S-A., and Green L.L.(2002) Current Opinion in Biotechnology 13: 594-597; Little M. et al.(2000) Immunology Today 21: 364-370)], 또는 사람 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열에 스플라이싱하는 것을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 항체를 포함하고자 한다. 상기 재조합 사람 항체는 사람 배선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는다. 하지만, 특정 양태에서, 상기 재조합 사람 항체는 시험관내 돌연변이유발법으로 처리되고(또는 사람 Ig 서열에 유전자전이 동물이 사용되면, 생체내 체세포 돌연변이유발법), 이에 따라 재조합 항체의 VH 영역과 VL 영역의 아미노산 서열은 사람 배선 VH 및 VL 서열에서 유래되고 이와 관련이 있지만 생체내 사람 항체 배선 레퍼토리에는 자연적으로 존재하지 않는 서열이다.
용어 "키메라 항체"는 하나의 종 기원의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역에 대한 서열 및 또 다른 종 기원의 불변 영역 서열을 포함하는 항체를 언급하고, 예를 들어, 쥐 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 사람 불변 영역에 연결된 항체가 있다. 이러한 키메라 항체는 재조합 분자생물학 기술을 통해 생산되거나 또는 함께 물리적으로 접합시킬 수 있다.
용어 "CDR-이식된 항체"는 하나의 종 기원의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만 여기서, VH 및/또는 VL의 CDR 영역의 하나 이상의 서열이 또 다른 종의 CDR 서열로 대체된 항체를 의미하고, 예를 들어, 쥐의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖지만 여기서 쥐 CDR(예를 들어, CDR3) 하나 이상이 사람 CDR 서열로 대체된 항체가 있다.
용어 "카벳(Kabat) 넘버링", "카벳 정의" 및 "카벳 표지화"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 당업계에서 인지되는 당해 용해는 항체 또는 이의 항원결합부의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에서 기타 아미노산 잔기보다 더 가변성(즉, 초가변성)인 아미노산 잔기를 넘버링하는 시스템을 의미한다(참조: Kabat er al. (1971) Ann. NY Acad, Sci. 190:382-391 및 Kabat, E. A., et al.(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH 공개번호 91-3242). 중쇄 가변 영역에 대해, 초가변 영역은 CDR1에서 아미노산 31번 내지 35번의 범위이고 CDR2에 대해서는 아미노산 50번 내지 65번의 범위이고 CDR3에 대해서는 아미노산 95번 내지 102번의 범위이다. 경쇄 가변 영역에 대해, 초가변 영역은 CDR1에 대해 아미노산 24번 내지 34번의 범위이고, CDR2에 대해서는 아미노산 50번 내지 56번의 범위이고 CDR3에 대해서는 아미노산 89번 내지 97번의 범위이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "수용체" 및 "수용체 항체"는 하나 이상의 프레임워크 영역의 아미노산 서열 중 적어도 50, 55, 60, 65, 70, 75 또는 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 100%를 제공하거나 이를 암호화하는 항체 또는 핵산 서열을 의미한다. 몇몇 양태에서, 용어 "수용체"는 불변 영역(들)을 제공하거나 암호화하는 항체 아미노산 또는 핵산 서열을 언급한다. 또 다른 양태에서, 용어 "수용체"는 하나 이상의 프레임워크 영역 및 불변 영역(들)을 제공하거나 암호화하는 항체 아미노산 또는 핵산 서열을 언급한다. 특정 양태에서, 용어 "수용체"는 하나 이상의 프레임워크 영역의 아미노산 서열의 적어도 50, 55, 60, 65, 70, 75 또는 80%, 특히, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 100%를 제공하거나 암호화하는 사람 항체 아미노산 또는 핵산 서열을 언급한다. 당해 양태에 따라, 수용체는 사람 항체의 하나 이상의 특정 위치에 존재하지 않는 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 10개 이상의 아미노산 잔기를 함유할 수 있다. 수용체 프레임워크 영역 및/또는 수용체 불변 영역(들)은 예를 들어, 배선 항체 유전자, 성숙 항체 유전자, 기능성 항체(예를 들어, 당업계에 널리 공지된 항체, 개발중인 항체 또는 시판중인 항체)로부터 유래하거나 수득된 것일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "CDR"은 항체 가변 서열내의 상보성 결정 영역을 언급한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 각각에 대해서 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 지정된 3개의 CDR이 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "CDR 세트"는 항원과 결합할 수 있는 단일 가변 영역에 존재하는 3개 CDR의 그룹을 의미한다. 이들 CDR의 정확한 경계는 상이한 시스템에 따라 다르게 정의되었다. 카벳(Kabat)에 의해 기술된 시스템(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) 및 (1991))은 항체의 임의의 가변 영역에 적용될 수 있는 명확한 잔기 넘버링 시스템을 제공하고 3개의 CDR을 한정하는 정확한 잔기 경계선을 제공한다. 이들 CDR은 카벳 CDR로서 언급될 수 있다. 문헌[Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) 및 Chothia et al., Nature 342:877-883 (1989)]에서는 카벳 CDR 내에서 특정 하위부분(subportion)이 거의 동일한 펩타이드 프레임워크 형태를 취하고 있다고 밝혔지만 아미노산 서열에 있어서 상당한 다양성이 있다. 이들 하위부분은 L1, L2 및 L3 또는 H1, H2 및 H3으로서 지정되었고, 여기서, "L" 및 "H"는 각각 경쇄 및 중쇄 영역을 지칭한다. 이들 영역은 카벳 CDR과 중복하는 경계선을 갖는 초티아(Chothia) CDR로서 지칭될 수 있다. 카벳 CDR과 중복하는 CDR을 한정하는 또 다른 경계선은 문헌[참조: Padlan, FASEB J. 9:133-139 (1995) 및 MacCallum, J Mol Biol 262(5):732-45 (1996)]에 기재되었다. 또 다른 CDR 경계선 정의가 엄격히 상기 시스템 중 하나를 따르지는 않지만 카벳 CDR과 중복할 것이고 이들은 특정 잔기 또는 잔기 그룹 또는 심지어 전체 CDR이 항원 결합에 상당한 영향을 주지 않는다는 예측 또는 실험적 발견 측면에서 단축되거나 연장될 수 있다. 본원에 사용된 방법은 임의의 당해 시스템에 따라 한정된 CDR을 사용할 수 있지만 바람직한 양태는 카벳 또는 초티아 한정된 CDR이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "표준(canonical)" 잔기는 둘다 본원에 참조로서 인용되는 문헌[참조: Chothia et al. (J. Mol. Biol. 196:901-907 (1987); Chothia et al., J. Mol. Biol. 227:799 (1992)]에 의해 정의된 바와 같은 특정 표준 CDR 구조를 한정하는 CDR 또는 프레임워크에서의 잔기를 언급한다. 초티아 등에 따르면, 많은 항체의 CDR의 중요한 부분은 거의 동일한 펩타이드 프레임워크 형태를 갖지만 아미노산 잔기 수준에서는 큰 다양성이 있다. 각각의 표준 구조는 주로 루프를 형성하는 아미노산 잔기의 연속 절편에 대한 특정 세트의 펩타이드 프레임워크 비틀림 각을 특정한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "공여체" 및 "공여 항체"는 하나 이상의 CDR을 제공하는 항체를 언급한다. 특정 양태에서, 공여 항체는 프레임워크 영역이 수득되거나 유래된 항체와는 상이한 종 기원의 항체이다. 사람화된 항체와 관련하여, 용어 "공여 항체"는 하나 이상의 CDR을 제공하는 비사람 항체를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프레임워크" 또는 "프레임워크 서열"은 가변 영역에서 CDR을 제외한 나머지 서열을 의미한다. CDR 서열의 정확한 정의가 상이한 시스템을 사용하여 결정할 수 있기 때문에 프레임워크 서열의 의미는 상응하게 다르게 해석된다. 6개의 CDR(경쇄의 CDR-L1 , -L2, 및 -L3 및 중쇄의 CDR-H1, -H2, 및 -H3)은 또한 경쇄 및 중쇄 상에서 프레임워크 영역을 각각의 쇄상에서 4개의 하위영역(FR1, FR2, FR3 및 FR4)으로 나누고, 여기서 CDR1은 FR1과 FR2 사이에 위치하고 CDR2는 FR2와 FR3 사이에 위치하고, CDR3은 FR3과 FR4 사이에 위치한다. FR1, FR2, FR3 또는 FR4로서 특정 하위영역을 특정하는 것 없이, 기타 영역에 의해 언급되는 프레임워크 영역은 단일의 천연적으로 존재하는 면역글로불린 쇄내에서 조합된 FR들을 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같이, FR은 4개의 하위영역 중 하나를 나타내고 FR들은 프레임워크 영역을 구성하는 4개의 하위영역 중 2개 이상을 나타낸다.
사람 중쇄 및 경쇄 수용체 서열은 당업계에 공지되어 있다. 본 발명의 한 양태에서, 사람 중쇄 및 경쇄 수용체 서열은 표 2와 표 3에 기술된 서열 중에서 선택된다. 이 표들에는 사람 프레임워크 서열 FR1 내지 FR4의 여러 조합이 기술된다.
Figure pat00002
Figure pat00003
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "배선 항체 유전자" 또는 "유전자 단편"은 특정 면역글로불린의 발현을 위해 유전자 재배열 및 돌연변이를 유도하는 성숙 과정이 진행되지 않은 비림프구 세포에 의해 암호화된 면역글로불린 서열을 의미한다(참조: 예를 들어, Shapiro et al., Crit. Rev. Immunol. 22(3): 183-200 (2002); Marchalonis et al., Adv Exp Med Biol. 484:13-30 (2001)). 본 발명의 다양한 양태에 의해 제공된 장점 중 하나는 배선 항체 유전자가 성숙한 항체 유전자보다 종에 속하는 개체들에 특징적인 필수 아미노산 서열 구조를 보존할 가능성이 높고, 이에 따라서 당해 종에 치료요법적으로 사용되는 경우 이종 근원으로서 인지될 가능성이 적다는 인식에 기초를 둔다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "주요" 잔기는 항체, 특히 사람화된 항체의 결합 특이성 및/또는 친화성에 대해 보다 영향을 미치는 가변 영역내 특정 잔기를 의미한다. 주요 잔기는 하기의 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: CDR에 인접한 잔기, 잠재적 글리코실화 부위(N- 또는 O-글리코실화 부위일 수 있는), 희귀 잔기, 항원과 상호작용할 수 있는 잔기, CDR과 상호작용할 수 있는 잔기, 표준 잔기, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역간의 접촉 잔기, 버니어(Vernier) 구역내 잔기 및 가변 중쇄 CDR1의 초티아 정의와 제1 중쇄 프레임워크의 카벳 정의 사이에 중첩하는 영역내 잔기.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "사람화된 항체"는 일반적으로 비-사람 종(예: 마우스) 유래의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만, 이 VH 및/또는 VL 서열 중 적어도 일부가 더욱 "사람 같은", 즉 사람 배선 가변 서열과 더욱 유사한 서열이 되도록 변경된 항체를 의미한다. 사람화된 항체의 한 종류는 CDR-이식된 항체로, 여기서 사람 CDR 서열은 비-사람 VH 및 VL 서열에 도입되어 대응하는 비-사람 CDR 서열을 교체한다.
구체적으로, 본 명세서에 사용된 "사람화된 항체"란 용어는 목적하는 항원과 면역특이적으로 결합하고 실질적으로 사람 항체의 아미노산 서열을 갖는 프레임워크(FR) 영역 및 실질적으로 비-사람 항체의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 변형체, 유도체, 유사체 또는 이의 단편을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, CDR과 관련하여 사용된 용어 "실질적으로"는 비-사람 항체 CDR의 아미노산 서열과 50, 55, 60, 65, 70, 75 또는 80% 이상, 특히 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR을 의미한다. 사람화된 항체는 모든 CDR 영역 또는 실질적으로 모든 CDR 영역이 비-사람 면역글로불린(즉, 공여 항체)의 서열에 상응하고 모든 프레임워크 영역 또는 실질적으로 모든 프레임워크 영역이 사람 면역글로불린 컨센서스 서열 영역인 실질적으로 하나 이상 및 전형적으로 2개의 가변 도메인(Fab, Fab', F(ab')2, FabC, Fv) 모두를 포함한다. 특히, 사람화된 항체는 또한 전형적으로 사람 면역글로불린의 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부(Fc)와 같은 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부(Fc)를 포함한다. 몇몇 양태에서, 사람화된 항체는 적어도 중쇄의 가변 도메인 뿐만 아니라 경쇄 둘다를 포함한다. 항체는 또한 중쇄의 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 CH4 영역을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 사람화된 항체는 단지 사람화된 경쇄를 포함한다. 몇몇 양태에서, 사람화된 항체는 단지 사람화된 중쇄를 포함한다. 특정 양태에서, 사람화된 항체는 단지 경쇄 및/또는 사람화된 중쇄의 사람화된 가변 도메인을 포함한다.
사람화된 항체는 IgY, IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 비롯한 임의의 클래스의 면역글로불린 및 임의의 이소타입, 예컨대 제한없이, IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 중에서 선택될 수 있다. 사람화된 항체는 1 이상의 클래스 또는 이소타입 유래의 서열을 포함할 수 있고, 특정 불변 도메인은 당업계에 공지된 기술을 이용하여 원하는 작용인자 기능을 최적화하도록 선택할 수 있다.
사람화된 항체의 프레임워크 및 CDR 영역은 모 서열에 정확하게 상응할 필요는 없고, 예를 들어 공여 항체 CDR 또는 컨센서스 프레임워크는 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환, 삽입 및/또는 결실에 의해 돌연변이되어 당해 부위에서 CDR 또는 프레임워크 잔기가 공여 항체 또는 컨센서스 프레임워크에 상응하지 않게 될 수 있다. 특정 양태에서, 당해 돌연변이는 광범위하지 않다. 통상적으로, 사람화된 항체 잔기의 50, 55, 60, 65, 70, 75 또는 80% 이상, 특히 85% 이상, 보다 특히 90% 이상, 및 특히 95% 이상이 모 FR 및 CDR 서열 잔기에 상응할 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "컨센서스 프레임워크"는 컨센서스 면역글로불린 서열에서 프레임워크 영역을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "컨센서스 면역글로불린 서열"은 관련 면역글로불린 서열 계열에서 가장 흔하게 나타나는 아미노산(또는 뉴클레오타이드)로부터 형성된 서열을 의미한다(참조: Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987). 면역글로불린 계열에서, 컨센서스 서열내에 각각의 위치는 당해 계열내 당해 위치에서 가장 흔하게 나타나는 아미노산이 차지한다. 2개의 아미노산이 종종 균등하게 나타나는 경우, 어느 하나가 컨센서스 서열에 포함될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "버니어" 영역은 문헌[Foote and Winter (1992, J. Mol. Biol. 224:487-499, 본원에 참조로서 인용됨]에 기재된 바와 같이 CDR 구조를 조정하고 항원에 대한 일치(fit)를 세부 조정할 수 있는 프레임워크 잔기의 서브세트를 언급한다. 버니어 구역 잔기는 CDR을 지탱하는 층을 형성하고 CDR의 구조 및 항체의 친화성에 영향을 줄 수 있다.
본 명세서에 사용된 RAGE 리간드 중 하나에 대한 RAGE의 "결합 억제"란 용어는 리간드 결합 활성의 부분적인(예컨대, 약 1 내지 10% 이상, 특히 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상) 또는 완전한 감소를 포괄한다. 이러한 "결합 억제"는 당업계에서 이용가능한 임의의 적당한 방법, 바람직하게는 HTRF 기반의 결합 분석과 같은 본 명세서에 예시된 바와 같은 임의의 방법으로 측정할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "중화성"이란 용어는 결합 단백질이 표적 단백질에 특이적으로 결합할 때 표적 단백질의 생물학적 활성의 중화를 의미한다. 중화성은 표적에 상기 결합 단백질이 여러 방식으로 결합한 결과일 수 있다. 예를 들어, 중화성은 표적 분자에 대한 수용체 결합에 영향을 미치지 않는 표적 영역에 결합 단백질이 결합함으로써 나타날 수 있다. 대안적으로, 결합 단백질의 결합은 표적에 대한 수용체 결합을 차단시킬 수 있고, 이러한 차단은 결과적으로 표적 단백질 활성을 중화시킨다. 이러한 각각의 여러 기전이 본 발명에 따라 나타날 수 있다.
특히, 중화성 결합 단백질은 RAGE에 결합하여 RAGE의 생물학적 활성을 중화시키는 중화성 항체이다. 특히, 중화성 결합 단백질은 RAGE에 결합하고 RAGE의 생물학적 활성을 적어도 약 1 내지 10%, 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85% 이상으로 감소시킨다. 중화성 결합 단백질에 의한 RAGE의 생물학적 활성의 중화는 당업계에 널리 공지되어 있고/있거나 실험부, 특히 실시예 5, 6, 10 및 16 내지 19에 예시되어 있는 RAGE 생물학적 활성의 하나 이상의 지시기를 측정함에 의해 평가할 수 있다. 예를 들어, RAGE의 중화는 하기 실시예 5 및 6에서 측정된 바와 같이 Aβ-글로불로머로의 RAGE의 결합을 중화시킨다.
동물 모델에서 생체내 측정된 "뇌혈 용량의 가용성 Aβ1-40 펩타이드 유도된 감소의 억제"는 비처리된 대조군과 비교하는 경우 또는 특히 음성 모노클로날 또는 폴리클로날 면역글로불린 이소형 대조군과 비교하는 경우 적어도 약 1 내지 10%, 적어도 약 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85% 이상의 부분적 또는 완전한 억제를 언급한다.
사람 APP를 과발현하는 동물 모델에서 생체내 "뇌혈 용량의 개선"은 비처리된 대조군과 비교하는 경우 또는 특히 음성 모노클로날 또는 폴리클로날 면역글로불린 이소형 대조군과 비교하는 경우, 통계학적으로 유의적인 CBV의 개선을 언급한다.
사람 APP를 과발현하는 동물 모델에서 생체내 측정된 바와 같이 "아밀로이드 플라크 수 및/또는 아밀로이드 플라크 면적의 감소"는 비처리된 대조군과 비교하는 경우 또는 특히 음성 모노클로날 또는 폴리클로날 면역글로불린 이소형 대조군과 비교하는 경우 적어도 약 1 내지 10%, 적어도 약 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85% 이상의 부분적 또는 완전한 감소를 언급한다.
시험관내 해마 뉴런의 응집된 Aβ1-40 펩타이드 유도된 다이나민 절단의 억제는 비처리된 대조군과 비교하는 경우 또는 특히 음성 모노클로날 또는 폴리클로날 면역글로불린 이소형 대조군과 비교하는 경우 적어도 약 1 내지 10%, 적어도 약 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85% 이상의 부분적 또는 완전한 억제를 언급한다.
시험관내 "시냅스 전달의 Aβ1-42 글로불로머 유도된 감소의 역전"은 비처리된 대조군과 비교하는 경우 또는 특히 음성 모노클로날 또는 폴리클로날 면역글로불린 이소형 대조군과 비교하는 경우 적어도 약 1 내지 10%, 적어도 약 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85% 이상의 부분적 또는 완전한 감소를 언급한다.
본원에 사용된 바와 같이 "중화성 모노클로날 항체"는 특이적 항원에 결합 즉시 당해 항원에 대한 천연 리간드와 경쟁하여 이와 결합할 수 있는 항체 분자의 제조물을 언급한다. 본 원의 특정 양태에서, 본 발명의 중화성 항체는 이의 리간드 중 하나 이상 특히 Aβ-펩타이드, Aβ-글로불로머, S100b 및 암포테린으로부터 선택되는 리간드에 결합하는 것에 대해 RAGE와 경쟁할 수 있고 RAGE 생물학적 활성 또는 기능을 차단할 수 있다.
당해 용어 "활성"은 항원에 대한 항체, 예를 들어, RAGE 항원과 결합하는 항-RAGE 항체의 결합 특이성/친화성 및/또는 항체, 예를 들어, RAGE에 결합하여 RAGE의 생물학적 활성을 중화시킬 수 있는 항-RAGE 항체의 중화성 효능과 같은 활성을 포함한다.
RAGE의 "생물학적 기능" 또는 "활성"은 Aβ에 대한 시그널 전달 세포 표면 수용체 또는 세포내로 또는 세포를 가로질러 단백질의 수송을 매개하는 수용체의 활성으로서 기술될 수 있다.
용어 "에피토프" 또는 "항원 결정인자"는 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 폴리펩타이드 결정인자를 포함한다. 특정 양태에서, 에피토프 결정인자는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 설포닐과 같은 분자의 화학적 활성 표면 배합을 포함하고, 특정 양태에서, 특이적 3차원 구조 특징 및/또는 특이적 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 항체에 의해 결합되는 항원 영역이다. 특정 양태에서, 항체는 이것이 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물에서 이의 표적 항원을 우선적으로 인지하는 경우 항원에 특이적으로 결합하는 것이라 한다.
본 명세서에 사용된 "표면 플라스몬 공명"이란 용어는 예컨대 BIAcore 시스템(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ)을 이용하여 바이오센서 매트릭스 내의 단백질 농도의 변경을 검출하여 실시간 생물특이성 상호작용을 분석할 수 있게 하는 광학적 현상을 의미한다. 추가 설명에는 문헌[Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51: 19-26; Jonsson, U. et al.(1991) Biotechniques 11: 620-627; Johnsson, B., et al.(1995) J.Mol.Recognit. 8: 125-131; 및 Johnnson, B., et al.(1991) Anal. Biochem. 198: 268-277]을 참조한다.
본 명세서에 사용된 용어 "kon"은 당업계에 공지된 바와 같이 항체/항원 복합체를 형성하기 위해 항원에 항체가 결합하는 온 속도 상수(on rate constant)를 의미하고자 한다.
본 명세서에 사용된 용어 "koff"는 당업계에 공지된 바와 같이 항체/항원 복합체로부터 항체가 해리하는 오프 속도 상수(off rate constant)를 의미하고자 한다.
본 명세서에 사용된 "kd"란 용어는 당업계에 공지된 바와 같이 특정 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 의미하고자 한다.
본 명세서에 사용된 "표지화된 결합 단백질"이란 용어는 결합 단백질을 확인할 수 있도록 혼입된 표지를 보유한 단백질을 의미한다. 표지는 검출가능한 마커, 예컨대 마킹된 아비딘(예: 광학 또는 비색 방법에 의해 검출할 수 있는 형광 마커 또는 효소 활성을 함유하는 스트렙타비딘)에 의해 검출될 수 있는 비오티닐 잔기의 폴리펩타이드에 대한 부착 또는 방사선표지된 아미노산의 혼입이 바람직하다. 폴리펩타이드용 표지의 예로는 다음을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다: 방사성동위원소 또는 방사성핵종(예: 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho 또는 153Sm); 형광 표지(예: FITC, 로다민, 란타나이드 인광물질), 효소 표지(예: 양고추냉이 퍼옥시다제, 루시퍼라제, 알칼리성 포스파타제); 화학발광 마커; 비오티닐 기; 2차 리포터(예: 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체의 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그)에 의해 인식되는 소정의 폴리펩타이드 에피토프; 및 자성 제제, 예컨대 가돌리늄 킬레이트.
"항체 접합체"란 용어는 치료제 또는 세포독성제와 같은 제2 화학 잔기에 화학적으로 결합된 항체와 같은 결합 단백질을 의미한다. 여기에 사용된 "제제"란 용어는 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 생물학적 거대분자 또는 생물학적 물질로부터 제조된 추출물을 의미한다. 특히, 치료제 또는 세포독성제는 백일해 독소, 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미토잔트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 퓨로마이신 및 이의 유사체 또는 동족체를 포함하는 것이 바람직하고, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 "결정" 및 "결정화된"이란 용어는 결정 형태로 존재하는 항체 또는 이의 항원결합부를 의미한다. 결정은 고체 상태인 물질의 한 형태로, 무정형 고체 상태 또는 액정 상태와 같은 다른 형태와 상이하다. 결정은 원자, 이온, 분자(예: 항체와 같은 단백질) 또는 분자 어셈블리(예: 항원/항체 복합체)의 규칙적이고 반복적인 3차원 배열로 구성된다. 이러한 3차원 배열은 당해 분야에 잘 알려진 특정 수학적 관계에 따라 배열된다. 결정에서 반복되는 기본 단위 또는 빌딩 블록은 비대칭 단위라 불린다. 주어진 명백한 결정학적 대칭에 일치하는 배열에서 비대칭 단위의 반복은 결정의 "단위 셀"을 제공한다. 3차원 전부에서 규칙적인 해독에 의해 단위 셀의 반복은 결정을 제공한다[Giege, R. and Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2nd ea., pp. 20 1-16, Oxford University Press, New York, New York(1999)].
본원에서 언급되는 바와 같은 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 2종 이상의 뉴클레오타이드, 즉 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시뉴클레오타이드 또는 어느 한 종류의 뉴클레오타이드의 변형된 형태의 중합체 형태를 의미한다. 이 용어는 일본쇄 및 이본쇄 형태의 DNA를 포함하지만 특히 이본쇄 DNA이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "분리된 폴리뉴클레오타이드"는 그 기원으로 인해, "분리된 폴리뉴클레오타이드"가 자연에서 함께 발견되는 폴리뉴클레오타이드 일부 또는 전부와 결합되어 있지 않거나; 자연에서 결합되지 않은 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 결합되어 있거나; 또는 더 긴 서열의 일부로서 자연에서 발생되지 않는 폴리뉴클레오타이드(예: 게놈, cDNA 또는 합성 기원이거나 이의 일부 조합의 폴리뉴클레오타이드)를 의미할 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 이것이 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미하려는 것이다. 한가지 유형의 벡터는 추가의 DNA 절편이 연결될 수 있는 환형 이본쇄 DNA를 의미하는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이고 여기서, 추가의 DNA 절편은 바이러스 게놈에 연결될수 있다. 특정 벡터는 이들이 도입된 숙주 세포에서 자가 복제할 수 있다(예를 들어, 세균 복제 오리진을 갖는 세균 벡터 및 에피좀 포유동물 벡터). 기타 벡터(예를 들어, 비-에피좀 포유동물 벡터)는 숙주 세포로의 도입시 숙주 세포의 게놈내로 통합될 수 있고 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 특정 벡터는 이들이 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 단순히 "발현 벡터")라 한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에 사용하는 발현 벡터는 흔히 플라스미드 형태이다. 본원 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 가장 흔하게 사용되는 벡터 형태이기 때문에 상호교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 기타 형태의 발현 벡터, 예를 들어, 동등한 기능을 제공하는 바이러스 벡터(예를 들어, 복제 결손형 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스)를 포함하고자 한다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 기재된 구성성분들이 이들의 의도된 방식으로 기능하도록 하는 관계에 있는 배치 상태를 언급한다. 암호화 서열에 "작동가능하게 연결된" 조절 서열은 암호화 서열이 조절 서열과 상용성인 조건 하에서 발현이 달성될 수 있도록 연결되어 있다. "작동가능하게 연결된" 서열은 당해의 유전자와 인접성인 발현 조절 서열 및 당해 유전자를 조절하기 위해 원거리에서 또는 트랜스로 작용하는 발현 조절 서열을 모두 포함한다. 본 명세서에 사용된 "발현 조절 서열"이란 용어는 이들이 연결된 암호화 서열의 발현 및 프로세싱에 영향을 미치는데 필수적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 발현 조절 서열은 적당한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 효과적인 RNA 프로세싱 시그널, 예컨대 스플라이싱 및 폴리아데닐화 시그널; 세포질 mRNA를 안정시키는 서열; 해독 효율을 증강시키는 서열(즉, 코작(Kozak) 컨센서스 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 필요하면 단백질 배출을 증진시키는 서열을 포함한다. 이러한 조절 서열의 본성은 숙주 유기체에 따라 달라지고; 원핵생물에서, 이러한 조절 서열은 일반적으로 프로모터, 리보솜 결합 부위 및 전사 종결 서열을 포함하고; 진핵생물에서 이러한 조절 서열은 일반적으로 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. "조절 서열"이란 용어는 그 존재가 발현 및 프로세싱에 필수적인 성분을 포함하려는 것으로, 존재가 유익한 추가 구성성분, 예컨대 리더 서열 및 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다.
본원에 정의된 바와 같은 "형질전환"은 외인성 DNA가 숙주 세포로 진입되는 임의의 과정을 의미한다. 형질전환은 당업계에 널리 공지된 다양한 방법을 사용하여 천연 또는 인공 조건하에 수행할 수 있다. 형질전환은 외래 핵산 서열을 원핵 또는 진핵 숙주 세포로 삽입하기 위한 임의의 공지된 방법에 의존할 수 있다. 당해 방법은 형질전환되는 숙주 세포를 기초로 선별되고 바이러스 감염, 전기천공, 리포펙션(lipofection) 및 입자 포격을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 당해 "형질전환된" 세포는 삽입된 DNA가 자가 복제 플라스미드로서 또는 숙주 염색체의 일부로서 복제할 수 있는 안정하게 형질전환된 세포를 포함한다. 이들은 또한 제된 시간 동안 삽입된 DNA 또는 RNA를 일시적으로 발현하는 세포를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "재조합 숙주 세포"(또는 단순히 "숙주 세포")는 외인성 DNA가 도입된 세포를 의미하고자 한다. 이러한 용어는 특정 피검체 세포뿐만 아니라 당해 세포의 자손을 의미하려는 것으로 이해해야만 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 후속 세대에서 특정 변형이 일어날 수 있기 때문에 당해 자손은 사실 모세포와 동일할 수는 없지만 여전히 본원에 사용된 바와 같은 용어 "숙주 세포"의 범위 내에 포함된다. 특히 숙주 세포는 임의의 생명체로부터 선택되는 원핵생물 및 진핵생물의 세포를 포함한다. 특정 진핵생물 세포는 원생생물, 진균류, 식물 및 동물 세포를 포함한다. 특히 숙주 세포는 원핵생물 세포주 이.콜라이(E. coli); 포유동물 세포주 CHO, HEK 293 및 COS; 곤충 세포주 Sf9; 및 진균 세포 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
표준 기술은 재조합 DNA, 올리고뉴클레오타이드 합성 및 조직 배양 및 형질전환(예를 들어, 전기천공, 리포펙션)에 사용될 수 있다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조업자의 지침에 따라 또는 당업계에서 일반적으로 수행되는 바와 같이 또는 본원에 기술된 바와 같이 수행할 수 있다. 이전의 기술 및 과정은 일반적으로 당업계에 널리 공지된 통상적인 방법에 따라 및 본원 명세서에 전반에 걸쳐 인용되고 논의된 다양한 일반적 보다 구체적인 참조문헌에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다. 임의의 목적을 위해 본원에 참조로서 인용되는 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]을 참조한다.
당업계에 공지된 바와 같고 본원에 사용된 바와 같이 "유전자전이 유기체"는 유전자전이를 포함하는 세포를 갖는 유기체를 언급하고, 여기서, 유기체(또는 유기체의 선조)에 도입된 유전자전이는 유기체에서 천연적으로 발현되지 않는 폴리펩타이드를 발현한다. "유전자전이"는 유전자전이 유기체가 발생하는 세포의 게놈으로 안정하게 작동가능하게 통합되어 돌연변이 유기체의 하나 이상의 세포 종류 또는 조직에서 암호화된 유전자 생성물의 발현을 유도하는 DNA 작제물이다.
"조절한다(regulate)" 및 "조절한다(modulate)"란 용어는 호환 사용되고, 본 명세서에 사용되듯이 당해 분자의 활성(예: RAGE의 생물학적 활성)을 변화 또는 변경시키는 것을 의미하는 것이다. 조절은 당해 분자의 특정 활성 또는 기능의 크기를 증가 또는 감소시키는 것일 수 있다. 분자의 활성 또는 기능의 예로는 결합 특성, 효소 활성, 세포 수용체 활성화 및 시그널 전달을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.
이에 대응하게, 본 명세서에 사용된 "조절인자"란 용어는 당해 분자의 활성 또는 기능(예: RAGE의 생물학적 활성)을 변화 또는 변경시킬 수 있는 화합물이다. 예를 들어, 조절인자는 조절인자의 부재 하에 관찰되는 활성 또는 기능의 크기와 비교했을 때 분자의 특정 활성 또는 기능의 크기를 증가 또는 감소시킬 수 있다.
본 명세서에 사용된 "작용물질"이란 용어는 당해 분자와 접촉했을 때 작용물질의 부재 하에 관찰되는 활성 또는 기능의 크기에 비해 분자의 특정 활성 또는 기능의 크기를 증가시키는 조절인자를 의미한다. 당해의 특정 작용물질은 RAGE 폴리펩타이드 또는 RAGE에 결합하는 폴리펩타이드, 핵산, 탄수화물 또는 임의의 다른 분자를 포함할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 "길항제"란 용어는 당해 분자와 접촉했을 때 길항제의 부재 하에 관찰되는 활성 또는 기능의 크기에 비해 분자의 특정 활성 또는 기능의 크기를 감소시키는 조절인자를 의미한다. 길항제의 예로는 단백질, 펩타이드, 항체, 펩티바디(peptibody), 탄수화물 또는 작은 유기 분자를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 펩티바디는 예컨대 WO 01/83525에 기술되어 있다.
당해의 특정 길항제는 RAGE의 생물학적 또는 면역학적 활성을 차단하거나 조절하는 것을 포함한다. RAGE의 길항제는 RAGE에 결합하는 단백질, 핵산, 탄수화물 또는 임의의 다른 분자, 예컨대 RAGE 분자와 상호작용하는 모노클로날 항체를 포함할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. RAGE와의 상호작용은 다른 리간드/세포막 성분의 결합 및 중화를 초래할 수 있고, 다중 질병에 대해 작용하는 첨가제 또는 상승제로 유용할 수 있음이 주목되어야 한다.
본 명세서에 사용된 "유효량"이란 용어는 장애 또는 이의 하나 이상의 증상의 중증도 및/또는 기간을 감소시키거나 호전시키기에 충분하거나, 장애의 진행을 방지하거나, 장애의 퇴화를 유발하거나, 장애와 관련이 있는 하나 이상의 증상의 재발, 발달, 개시 또는 진행을 방지하거나, 장애를 검출하거나, 또는 다른 치료(예: 예방제 또는 치료제)의 예방 또는 치료 효과(들)를 증진 또는 향상시키기에 충분한 치료의 양을 의미한다.
본 명세서에 사용된 "시료"란 용어는 광범위한 의미로 사용된다. 본 명세서에 사용된 "생물학적 시료"는 임의의 양의 생물 또는 예전 생물 유래의 물질을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 생물에는 사람, 마우스, 래트, 원숭이, 개, 토끼 및 다른 동물을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 물질에는 혈액, 혈청, 소변, 활액, 세포, 기관, 조직, 골수, 림프절 및 비장을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.
2. 특이적 양태
본 발명의 특이적 양태는 하기에 열거되어 있다:
1. 1 x 10-7 M 이하의 KD 및 1 x 10-2s-1 이하의 Koff 속도 상수(이 둘다는 표면 플라스몬 공명에 의해 결정됨)로 사람 RAGE로부터 해리하는 분리된 결합 단백질.
2. i) 표준 시험관내 분석, 예를 들어, 실험부, 특히 실시예 4 및 5 및 본원에 인용된 참조문헌에 기재된 바와 같은 HTRF 분석에서 결정되는 바와 같이, 사람 RAGE에 결합하고, RAGE의 리간드 중 하나 이상의 결합하는 RAGE의 능력을 조절, 특히 억제하는 양태 1의 결합 단백질,
ii) RAGE 매개된 생물학적 활성을 억제할 수 있는 양태 1의 결합 단백질.
iii) 하기의 생물학적 활성 중 하나 이상을 갖는 결합 단백질, 특히 이전의 양태에 따른 결합 단백질:
a. 예를 들어, 실험부, 특히 실시예 10 및 본원에 인용된 문헌에서 보다 상세하게 기재된 바와 같이 C57BL/6 암컷 마우스와 같은 동물 모델에서 생체내 뇌혈류 용량(CBV)의 가용성 Aβ1-40 펩타이드 유도된 감소의 억제;
b. 예를 들어, 실험부, 특히 실시예 16 및 본원에 인용된 문헌에서 보다 상세하게 기재된 바와 같이 유전자전이된 Tg2576 마우스 모델과 같이 사람 APP를 과발현하는 동물 모델에서 생체내 뇌혈류 용량의 개선;
c. 예를 들어, 실험부, 특히 실시예 19 및 본원에 인용된 문헌에서 보다 상세하게 기재된 바와 같이 유전자전이된 Tg2576 마우스 모델과 같이 사람 APP를 과발현하는 동물 모델에서 생체내 아밀로이드 플라크 수 및/또는 아밀로이드 플라크 면적의 감소;
d. 예를 들어, 실험부, 특히 실시예 17 및 본원에 인용된 문헌에서 보다 상세하게 기재된 바와 같이 배아 랫트로부터 수득된 해마 뉴런과 같은 시험관내 해마 뉴런의 응집된 Aβ1-40 펩타이드 유도된 다이나민의 억제;
e. 예를 들어, 실험부, 특히 실시예 18 및 본원에 인용된 문헌에서 보다 상세하게 기재된 바와 같이 해마 슬라이스 배양물에서 결정된, 시험관내 시냅스 전달의 Aβ1-42 글로불로머 유도된 감소의 역전.
3. 리간드가 Aβ 펩타이드, Aβ-글로불로머, S100b 및 암포테린으로부터 선택된 양태 1 또는 2의 결합 단백질.
4. 중화 결합 단백질인 이전의 양태 중 어느 하나의 결합 단백질.
5. 사람 RAGE로의 Aβ 글로불로머의 결합을 차단, 특히 억제할 수 있는 이전의 양태 중 어느 하나의 결합 단백질.
6. 상기 Aβ 글로불로머가 Aβ1-42인 이전의 양태 중 어느 하나의 결합 단백질.
7. 상기 결합 단백질이 사람 RAGE의 C1- 및/또는 C2-도메인의 적어도 하나의 아미노산 잔기, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개 아미노산 잔기와 상호작용하는 이전의 양태 중 어느 하나의 결합 단백질.
8. 사람화된 항체인 이전의 양태 중 어느 하나에 따른 결합 단백질.
9. 항원 결합 도메인을 포함하는 결합 단백질로서, 상기 결합 단백질이 사람 RAGE 분자의 에피토프에 결합할 수 있고, 상기 항원 결합 도메인이 서열번호 4, 12 및 20로 이루어진 아미노산 서열의 CDR-H3 그룹; 및 상기 서열 중 어느 하나와 50% 이상, 예를 들어, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 변형된 CDR 아미노산 서열; 서열번호 8, 16 및 24로 이루어진 아미노산 서열의 CDR-L3 그룹; 및 당해 서열 중 어느 하나와 50% 이상, 예를 들어, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 변형된 CDR 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 CDR을 포함하는, 이전의 양태 중 어느 하나에 따른 결합 단백질.
10. 항원 결합 도메인을 포함하는 결합 단백질로서, 당해 결합 단백질이 사람 RAGE 분자의 에피토프에 결합할 수 있고, 당해 항원 결합 도메인이 서열번호 4, 12 및 20으로 이루어진 아미노산 서열의 CDR-H3 그룹; 및 당해 서열 중 하나와 50% 이상, 예를 들어, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95 % 이상의 서열 동일성을 갖는 변형된 CDR 아미노산 서열; 서열번호 8, 16 및 24로 이루어진 아미노산 서열의 CDR-L3 그룹; 및 당해 서열 중 하나와 50% 이상, 예를 들어, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95 %의 서열 동일성을 갖는 변형된 CDR 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 CDR을 포함하는, 결합 단백질.
11. 서열번호 2, 10 및 18로 이루어진 CDR-H1 그룹으로부터 선택되거나; 서열번호 3, 11 및 19로 이루어진 CDR-H2 그룹으로부터 선택되거나; 서열번호 6, 14 및 22로 이루어진 CDR-L1 그룹으로부터 선택되거나; 서열번호 7, 15 및 23으로 이루어진 CDR-L2 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열; 및 당해 서열 중 하나와 50% 이상, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95 % 이상의 서열 동일성을 갖는 변형된 CDR 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 CDR을 추가로 포함하는, 이전의 양태 중 어느 하나에 따른 결합 단백질.
12. 하나 이상의 CDR이 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 이전의 양태 중 어느 하나에 따른 결합 단백질:
Figure pat00004
13. 하기로 이루어진 가변 도메인 CDR 세트, 또는 3개 CDR 중 하나 이상이 모 서열과 50% 이상, 예를 들어, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95 % 이상의 서열 동일성을 갖는 변형된 CDR 아미노산 서열인 가변 도메인 세트로부터 선택되는 3개 이상의 CDR을 포함하는, 양태 12에 따른 결합 단백질.
Figure pat00005
14. 2개 이상의 가변 도메인 CDR 세트를 포함하는, 양태 13에 따른 결합 단백질.
15. 2개 이상의 가변 도메인 CDR 세트가 VH 7F9 세트 및 VL 7F9 세트; VH 4E5 세트 및 VL 4E5 및 VH 11E6 세트 및 VL 11E6 세트로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 양태 14에 따른 결합 단백질.
16. 사람 수용체 프레임워크를 추가로 포함하는, 이전의 양태 중 어느 하나에 따른 결합 단백질.
17. 사람 수용체 프레임워크가 서열번호 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 및 55로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는, 양태 16에 따른 결합 단백질.
18. 서열번호 56 및 57로부터 선택되는 하나 이상의 중쇄 가변 도메인 및/또는 서열번호 58 및 59로부터 선택되는 하나 이상의 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 이전의 양태 중 어느 하나의 결합 단백질.
19. 상기 결합 단백질이 2개의 가변 도메인을 포함하고, 상기 2개의 가변 도메인이,
서열번호 56 및 58; 56 및 59;
서열번호 57 및 58; 57 및 59
로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는, 양태 18의 결합 단백질.
20. 상기 사람 수용체 프레임워크가, 주요 잔기에서 하나 이상의 프레임워크 영역 아미노산 대체를 포함하고, 상기 주요 잔기가 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 양태 16 내지 19 중 어느 하나에 따른 결합 단백질:
CDR에 인접한 잔기;
글리코실화 부위 잔기;
희귀 잔기;
RAGE 에피토프와 상호작용할 수 있는 잔기;
CDR과 상호작용할 수 있는 잔기;
정준 잔기;
중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 사이의 접촉 잔기;
버니어 지대내 잔기;
파라-글루타메이트를 형성할 수 있는 N-말단 잔기; 및
초티아-한정된 가변 중쇄 CDR1 및 카바트-한정된 제1 중쇄 프레임워크간에 중첩하는 영역내 잔기.
21. 상기 주요 잔기가 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 양태 20에 따른 결합 단백질:
(중쇄 서열 위치): 1, 2, 68, 70, 72, 76, 85, 89, 95
(경쇄 서열 위치): 11, 13, 43, 49, 58, 70, 87.
22. 컨센서스 사람 가변 도메인인 이전의 양태 중 어느 하나의 결합 단백질.
23. 상기 사람 수용체 프레임워크가 하나 이상의 프레임워크 영역 아미노산 대체, 예를 들어, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개 대체를 포함하고 프레임워크의 아미노산 서열이 당해 사람 수용체 프레임워크의 서열과 65% 이상 동일하고 당해 사람 수용체 프레임워크과 동일한 70개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 양태 16 내지 22 중 어느 하나의 결합 단백질.
24. 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 (프레임워크 돌연변이된) 가변 도메인을 포함하는, 이전의 양태 중 어느 하나의 결합 단백질:
(중쇄 서열) 서열번호 62, 67, 68 및 69;
(경쇄 서열) 서열번호 63, 64, 65 및 66.
25. 상기 결합 단백질이 2개의 가변 도메인을 포함하고, 상기 2개의 가변 도메인이 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 양태 24의 결합 단백질:
서열번호 62 및 63 ; 62 및 64 ; 62 및 65 ; 62 및 66;
서열번호 67 및 63 ; 67 및 64 ; 67 및 65 ; 67 및 66;
서열번호 68 및 63 ; 68 및 64 ; 68 및 65 ; 68 및 66;
26. RAGE 분자로부터 선택된 표적과 결합할 수 있는 이전의 양태 중 어느 하나의 결합 단백질.
27. 사람 RAGE와 결합할 수 있는 이전의 양태 중 어느 하나의 결합 단백질.
28. 마우스 및 랫트 RAGE와 결합하는 추가의 기능적 특성 중 하나 이상을 갖는 결합 단백질.
29. RAGE 분자로부터 선택된 표적의 생물학적 기능을 조절, 특히 중화시킬 수 있는, 이전의 양태 중 어느 하나의 결합 단백질.
30. 하나 이상의 리간드에 결합하는 RAGE의 능력을 조절, 특히 억제하는, 양태 29의 결합 단백질.
31. 사람 RAGE의 Aβ 펩타이드, Aβ-글로불로머, S100b 및 암포테린으로의 결합의 상호작용 중 하나 이상을 조절, 특히 억제하는, 양태 30의 결합 단백질.
32. 예를 들어, 원발성 뉴런에서 다이나민의 Aβ-유도된 절단, 해마 슬라이스에서 글로불로머 유도된 시냅스 결손, CBV에서 Aβ 유도된 감소와 같은 RAGE 생물학적 활성을 중화시킬 수 있는 이전의 양태 중 어느 하나의 결합 단백질.
33. RAGE 분자가 RAGE 또는 sRAGE와 같은 RAGE 단편인 양태 32의 결합 단백질.
34. RAGE가 사람, 랫트 및 마우스로부터 선택되는, 양태 33의 결합 단백질.
35. 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같이, 적어도 약 102M-1s-1; 적어도 약 103M-1s-1; 적어도 약 104M-1s-1; 적어도 약 105M-1s-1; 적어도 약 106M-1s-1, 및 적어도 약 107M-1s- 1 로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 표적에 대한 온 속도 상수(Kon)를 갖는, 이전의 양태 중 어느 하나의 결합 단백질.
36. 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같이, 최대 약 10-2s-1; 최대 약 10-3s-1; 최대 약 10-4s-1; 최대 약 10-5s-1; 및 최대 약 10-6s -1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 표적에 대해 오프 속도 상수(Koff)를 갖는, 이전의 양태 중 어느 하나의 결합 단백질.
37. 최대 약 10-7 M; 최대 약 10-8 M; 최대 약 10-9 M; 최대 약 10-10 M; 최대 약 10-11 M; 최대 약 10-12 M; 및 최대 10-13 M로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 표적에 대해 해리 상수(KD)를 갖는, 이전의 양태 중 어느 하나의 결합 단백질.
38. 링커 폴리펩타이드 또는 면역글로불린 불변 도메인을 추가로 포함하는, 이전의 양태 중 어느 하나에 기재된 결합 단백질을 포함하는 항체 작제물.
39. 상기 결합 단백질이 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 양태 38에 따른 항체 작제물:
면역글로불린 분자,
모노클로날 항체,
키메라 항체,
CDR-이식된 항체,
사람화된 항체,
Fab,
Fab',
F(ab')2,
Fv,
디설파이드 연결된 Fv,
scFv,
단일 도메인 항체,
디아바디,
다특이적 항체,
이원 특이적 항체,
이원 가변 도메인 면역글로불린, 및
이특이적 항체.
40. 상기 결합 단백질이 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄 면역글로불린 불변 도메인을 포함하는, 양태 38 및 39 중 어느 하나에 따른 항체 작제물;
사람 IgM 불변 도메인,
사람 IgG1 불변 도메인,
사람 IgG2 불변 도메인,
사람 IgG3 불변 도메인,
사람 IgG4 불변 도메인,
사람 IgE 불변 도메인,
사람 IgD 불변 도메인,
사람 IgA1 불변 도메인,
사람 IgA2 불변 도메인,
사람 IgY 불변 도메인 및
상응하는 돌연변이된 도메인.
41. 서열번호 25, 41, 42, 및 26으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 불변 도메인을 포함하는, 양태 38 내지 40 중 어느 하나에 따른 항체.
42. 면역부착 분자, 이미지화제, 치료학적 제제 및 세포독성제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 제제를 추가로 포함하는, 양태 38 내지 41 중 어느 하나에 기재된 항체 작제물을 포함하는 항체 접합체.
43. 제제가 방사선 표지, 효소, 혈광 표지, 발광 표지, 생발광 표지, 자기 표지 및 비오틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 이미지화제인 양태 42에 따른 항체 접합체.
44. 이미지화제가 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho, 및 153Sm으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 방사선 표지인 양태 43에 따른 항체 접합체.
45. 제제가 항대사물, 알킬화제, 항생제, 성장 인자, 사이토킨, 항-혈관형성제, 항-세포분열 제제, 안트라사이클린, 독소 및 아폽토시스 제제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 치료학적 제제 또는 세포독성 제제인 양태 42에 따른 항체 접합체.
46. 상기 결합 단백질이 사람 글리코실화 패턴을 갖는 양태 38 내지 41 중 어느 하나에 따른 항체 작제물.
47. 상기 결합 단백질이 사람 글리코실화 패턴을 갖는 양태 42 내지 45 중 어느 하나에 따른 항체 접합체.
48. 결정으로서 존재하는 양태 1 내지 37 중 어느 하나에 따른 결합 단백질.
49. 결정으로서 존재하는 양태 38 내지 41 중 어느 하나에 따른 항체 작제물.
50. 항체 작제물이 결정으로서 존재하는 양태 42 내지 45 중 어느 하나에 따른 항체 접합체.
51. 상기 결정이 담체 부재 약제학적 조절 방출 결정인 양태 48에 따른 결합 단백질.
52. 상기 결정이 담체 부재 약제학적 조절된 방출 결정인 양태 49에 따른 항체 작제물.
53. 상기 결정이 담체 부재 약제학적 조절된 방출 결정인 양태 50에 따른 항체 접합체.
54. 상기 결합 단백질의 가용성 대응물보다 높은 생체내 반감기를 갖는 양태 48에 따른 결합 단백질.
55. 상기 항체 작제물의 가용성 대응물보다 높은 생체내 반감기를 갖는 양태 49에 따른 항체 작제물.
56. 상기 항체 접합체의 가용성 대응물보다 높은 생체내 반감기를 갖는 양태 50에 따른 항체 접합체.
57. 생물학적 활성을 보유하는 양태 48에 따른 결합 단백질.
58. 생물학적 활성을 보유하는 양태 49에 따른 항체 작제물.
59. 생물학적 활성을 보유하는 양태 50에 따른 항체 접합체.
60. 양태 1 내지 37 중 어느 하나의 결합 단백질 아미노산 서열을 암호화하는 분리된 핵산.
61. 양태 38 내지 41 중 어느 하나의 항체 작제물 아미노산 서열을 암호화하는 분리된 핵산.
62. 양태 42 내지 45 중 어느 하나의 항체 접합체 아미노산 서열을 암호화하는 분리된 핵산.
63. 양태 60 내지 62 중 어느 하나에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
64. pcDNA, pTT, pTT3, pEFBOS, pBV, pJV, pHybE, 및 pBJ로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 양태 6의 벡터.
65. 양태 63 및 64의 어느 하나에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
66. 원핵세포인 양태 65에 따른 숙주 세포.
67. 이.콜라이인 양태 66에 따른 숙주 세포.
68. 진핵세포인 양태 67에 따른 숙주 세포.
69. 상기 진핵 세포가 원생생물 세포, 동물 세포, 식물 세포 및 진균류 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 양태 68에 따른 숙주 세포.
70. 상기 진핵 세포가 포유동물 세포, 조류 세포 및 곤충 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 동물 세포인 양태 69에 따른 숙주 세포.
71. HEK 세포, CHO 세포, COS 세포 및 효모 세포로부터 선택되는 양태 69에 따른 숙주 세포.
72. 효모 세포가 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)인 양태 71에 따른 숙주 세포.
73. 곤충 Sf9 세포인 양태 70에 따른 숙주 세포.
74. 양태 65 내지 73 중 어느 하나의 숙주 세포를, RAGE와 결합할 수 있는 결합 단백질을 제조하기에 충분한 조건하에서 배양 배지에서 배양시킴을 포함하는, RAGE와 결합할 수 있는 단백질을 제조하는 방법.
75. 양태 74의 방법에 따라 제조된 단백질.
76. (a) 양태 48 내지 50 중 어느 하나에 따른 결정화된 생성물 단백질 및 성분을 포함하는 제형 및
(b) 하나 이상의 중합체 담체
를 포함하는, 결합 단백질의 방출용 조성물.
77. 상기 중합체 담체가 폴리(아크릴산), 폴리(시아노아크릴레이트), 폴리(아미노산), 폴리(안하이드라이드), 폴리 (뎁시펩타이드), 폴리(에스테르), 폴리(락트산), 폴리 (락틱-코-글리콜산) 또는 PLGA, 폴리(b-하이드록시부티레이트), 폴리 (카프롤락톤), 폴리(디옥사논); 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(하이드록시프로필)메타크릴아미드, 폴리[(유기) 포스파젠], 폴리 (오르토 에스테르), 폴리 (비닐 알코올), 폴리 (비닐피롤리돈), 말레산 무수물- 알킬 비닐 에테르 공중합체, 플루론산 폴리올, 알부민, 알기네이트, 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체, 콜라겐, 피브린, 겔라틴, 하이알루론산, 올리고사카라이드, 글리카미노글리칸, 황화 폴리사카라이드, 이의 블렌드 및 공중합체로 이루어진 그룹 중 하나 이상으로부터 선택된 중합체인 양태 76에 따른 조성물.
78. 상기 성분이 알부민, 슈크로스, 트레할로스, 락티톨, 겔라틴, 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 그룹으로부터 선택된 양태 76에 따른 조성물.
79. 양태 77 및 78의 어느 하나에 따른 유효량의 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물을 치료하기 위한 방법.
80. 양태 1 내지 59 중 어느 하나의 생성물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
81. 상기 약제학적으로 허용되는 담체가 상기 결합 단백질의 흡착 또는 분배를 증가시키기 위해 유용한 보조제로서 작용하는, 양태 80의 약제학적 조성물.
82. 상기 보조제가 하이알루로니다제인 양태 81의 약제학적 조성물.
83. RAGE 활성이 치명적인 장애를 치료하기 위한 하나 이상의 추가의 치료학적 제제를 추가로 포함하는 양태 82의 약제학적 조성물.
84. 상기 추가의 제제가 치료학적 제제, 이미지화제, 세포독성제, 혈관형성 억제제; 키나제 억제제; 공동 자극 분자 차단제; 접착 분자 차단제; 항-사이토킨 항체 또는 이의 기능성 단편; 메토트렉세이트; 사이클로스포린; 라파마이신; FK506; 검출가능한 표지 또는 리포터; TNF 길항제; 항류마티스제; 근육 이완제, 진정제, 비스테로이드 소염제(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근육 차단제, 항미생물제, 항건선제, 코르티코스테로이드, 동화성 스테로이드, 에리트로포이에틴, 면역화, 면역글로불린, 면역 억제제, 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 방사선약제, 항우울제, 항정신제, 자극제, 천식 약물, 베타 효능제, 흡입 스테로이드, 에피네프린 또는 유사체, 사이토킨, 및 사이토킨 길항제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 양태 83의 약제학적 조성물. 추가의 예는 디메본, 항-Aβ-항체, 베타-세크레타제 억제제, 타우-조절제, 인식 증진제, 예를 들어, 5-HT6 길항제, 콜레스테리나제 억제제(예를 들어, 탁트린, 도네페질, 리바스티그민 또는 갈란타민), 부분 NMDA 수용체 차단제(예를 들어, 메만틴), 글리코사미노글리캔 모사체(예를 들어, 알체메드), 감마 세크레타제의 억제제 또는 알로스테릭 조절제(예를 들어, R- 플루르비프로펜), 황체 호르몬 차단 고나도트로핀 방출 호르몬 효능제(예를 들어, 류프로렐린), 세로티닌 5-HT1A 수용체 길항제, 켈라틴제, 뉴런 선택적 L형 칼슘 채널 차단제, 면역조절제, 아밀로이드 섬유합성(fibrillogenesis) 억제제 또는 아밀로이드 단백질 침적 억제제(예를 들어, M266), 다른 항체(예를 들어, 바피뉴주마브), 5-HT1a 수용체 길항제, PDE4 억제제, 히스타민 효능제, 최종 당화 산물에 대한 수용체 단백질, PARP 자극제, 세로토닌 6 수용체 길항제, 5-HT4 수용체 효능제, 사람 스테로이드, 뉴런 대사를 증진시키는 글루코스 흡수 자극제, 선택적 CB1 길항제, 벤조디아제핀 수용체에서 부분 효능제, 아밀로이드 베타 생산 길항제 또는 억제제, 아밀로이드 베타 침적 억제제, NNR 알파-7 부분적 길항제, 치료학적 표적 PDE4, RNA 해독 억제제, 무스카린 효능제, 신경 성장 인자 수용체 효능제, NGF 수용체 효능제 및 유전자 치료 조절제로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 약제학적 조성물.
85. 사람 RAGE를 양태 1 내지 59 중 어느 하나의 생성물과 접촉시켜 사람 RAGE 활성을 감소시킴을 포함하는 사람 RAGE 활성을 감소시키기 위한 방법.
86. 양태 1 내지 59 중 어느 하나의 생성물을 필요로 하는 피검체에서 당해 생성물을 투여하는 단계를 포함하는, 당해 피검체에서 Aβ 펩타이드, 글로불로머, S100b 및 암포테린으로부터 선택되는 하나 이상의 리간드에 결합하는 hRAGE를 감소키는 방법.
87. 양태 1 내지 59 중 어느 하나의 생성물 단독으로 또는 다른 치료학적 제제와 함께 투여하는 단계를 포함하는, RAGE 활성과 관련된 장애에 대해 피검체를 치료하는 방법.
88. 양태 1 내지 59 중 어느 하나의 생성물 단독 또는 다른 치료학적 제제와 함께 투여함을 포함하는, RAGE 활성이 해로운 장애를 앓는 피검체에서 RAGE 활성을 감소시키는 방법.
89. 양태 88에 있어서, 장애가 근위축성측색경화증, 상완신경총손상, 외상성 뇌 손상을 포함하는 뇌 손상, 뇌성 마비, 프리드리히 아탁시아(Friedrich's Ataxia), 길랑 바레(Guillain Barre), 백질이영양증, 다발성 경화증, 포스트 폴리오, 이분 척추증(Spina Bifida), 척추 손상, 척수 근위축증, 척추 종양, 뇌졸중, 횡단성 척수염, 치매, 노인성 치매, 경증 인지 손상, 알츠하이머 관련 치매, 헌팅톤 무도병, 지연성 운동장애, 운동과다증, 조증, 모부스 파킨슨병(Morbus Parkinson), 스틸-리챠드 증후군, 다운 증후군, 중증근무력증, 신경 외상, 혈관 아밀로이드증, 아밀로이드증을 갖는 I형 뇌출혈, 뇌염, 프리드리히 아탁시아, 급성 혼돈 장애, 근위축성측색경화증, 녹내장, 알츠하이머 질환, 당뇨성 신증, 패혈증, 류마티스 관절염 및 관련 염증성 질환; 당뇨병 및 이로 인한 합병증(예를 들어, 당뇨망막병증, 신증, 혈관 합병증); 죽상경화 합병증, 폐 섬유증, 암, 특히 흑색종 및 기타 아밀로이드증을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 신경학적 질환을 포함하는, 방법.
90. 양태 1 내지 51 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 결합 단백질의 분리된 CDR.
91. 최종 당화 산물의 수용체(RAGE) 단백질의 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 상호작용하는 분리된 결합 단백질.
92. 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 양태 91의 분리된 결합 단백질.
93. VH 및 VL 도메인을 포함하는, 양태 92에 따른 모노클로날 항체 또는 항원 결합 단편.
94. RAGE의 리간드에 결합하는 RAGE의 능력을 감소시키는 양태 92에 따른 모노클로날 항체.
95. Aβ 펩타이드, 글로불로머, S100b 및 암포테린을 포함하는 양태 94에 따른 리간드.
96. RAGE에 대한 Aβ 글로불로머의 결합을 차단시킬 수 있는 양태 92에 따른 모노클로날 항체.
97. 양태 92에 있어서, 다음을 포함하는 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편: 서열번호 1, 서열번호 9, 및 서열번호 17로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 서열번호 5, 서열번호 13, 및 서열번호 21로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역; 아미노산 서열 서열번호 25를 갖는 사람 면역글로불린 감마 1 중쇄 불변 영역; 및 아미노산 서열 서열번호 26을 갖는 사람 면역글로불린 카파 경쇄 불변 영역.
98. 항원 결합 도메인이 서열번호 2, 3, 4, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 18, 19, 및 20으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 양태 93의 모노클로날 항체.
99. VH 도메인이 서열번호 1, 서열번호 9 및 서열번호 17로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 양태 93에 따른 모노클로날 항체.
100. VH 도메인이 서열번호 2, 3, 4, 10, 11, 12, 18, 19, 및 20으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 CDR 영역을 포함하는 양태 99에 따른 모노클로날 항체.
101. VH 도메인이 서열번호 2, 3, 4; 서열번호 10, 11, 12; 서열번호 18, 19, 및 20의 세트로부터 선택된 3개 이상의 CDR 영역을 포함하는 양태 100에 따른 모노클로날 항체.
102. VL 도메인이 서열번호 5, 서열번호 13, 및 서열번호 21로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 양태 93에 따른 모노클로날 항체.
103. VL 도메인이 서열번호 6, 7, 8, 14, 15, 16, 22, 23, 및 24로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 CDR 영역을 포함하는 양태 102에 따른 모노클로날 항체.
104. VL 도메인이 서열번호 6, 7, 8; 서열번호 14, 15, 16; 서열번호 22, 23, 및 24의 세트로부터 선택된 3개 이상의 CDR 영역을 포함하는 양태 103에 따른 모노클로날 항체.
105. 마우스 항체, 사람화된 항체, 완전히 사람 항체, 키메라 항체, 사람화된 항체의 항원 결합 단편 또는 키메라 항체의 항원 결합 단편인 양태 92의 항체 또는 항원 결합 단편.
106. Fab 단편, a Fab' 단편, F(ab')2 단편 및 Fv 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항원 결합 단편인 양태 92의 항체 또는 항원 결합 단편.
107. 양태 96에 따른 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생성하는 하이브리도마 세포주.
108. 하이브리도마가 마우스, 사람, 랫트, 양, 돼지, 소, 염소 및 말 하이브리도마로 이루어진 그룹으로부터 선택된 양태 107의 하이브리도마 세포주.
109. RAGE 단백질의 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주.
110. 마우스 및 사람 하이브리도마로 이루어진 그룹으로부터 선택된 양태 107의 하이브리도마 세포주.
111. 랫트, 양, 돼지, 소, 염소 및 말 하이브리도마로부터 선택된 양태 107의 하이브리도마 세포주.
112. 벡터가 pcDNA; pTT; pTT3; pEFBOS; pBV; pJV; 및 pBJ로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 양태 97의 임의의 아미노산 서열을 암호화하는 분리된 핵산을 포함하는 분리된 핵산을 포함하는 벡터.
113. 숙주 세포가 원생생물, 동물세포, 식물 세포 및 진균류 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 양태 112에 따른 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
114. 동물 세포가 HEK293, CHO 및 COS를 포함하는 그룹으로부터 선택된 포유동물 세포인 양태 113의 숙주 세포.
115. 결합 단백질을 생산하기에 충분한 조건하에서 숙주 세포를 배양 배지내에서 배양하고 배양 배지를 수거하고 생성된 분리된 결합 단백질을 정제함을 포함하는, 양태 91에 따른 분리된 결합 단백질을 제조하는 방법.
116. 양태 99 또는 102에 따른 모노클로날 항체 또는 항원 결합부 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
117. RAGE내 C2-도메인과 결합하는 양태 99 또는 102의 모노클로날 항체를 투여함을 포함하는 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
118. 양태 117에 있어서, 장애가 근위축성측색경화증, 상완신경총손상, 외상성 뇌 손상을 포함하는 뇌 손상, 뇌성 마비, 프리드리히 아탁시아(Friedrich's Ataxia), 길랑 바레(Guillain Barre), 백질이영양증, 다발성 경화증, 포스트 폴리오, 이분 척추증(Spina Bifida), 척추 손상, 척수 근위축증, 골수 종양, 뇌졸중, 횡단성 척수염, 치매, 노인성 치매, 경증 인지 손상, 알츠하이머 관련 치매, 헌팅톤 무도병, 지연성 운동장애, 운동과다증, 조증, 모부스 파킨슨병(Morbus Parkinson), 스틸-리챠드 증후군, 다운 증후군, 중증근무력증, 신경 외상, 혈관 아밀로이드증, 아밀로이드증을 갖는 I형 뇌출혈, 뇌염, 프리드리히 아탁시아, 급성 혼돈 장애, 근위축성측색경화증, 녹내장, 알츠하이머 질환, 당뇨성 신증, 패혈증, 류마티스 관절염 및 관련 염증성 질환을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 신경학적 질환을 포함하는 방법.
119. 서열번호 56 및 57로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 VH 영역을 포함하는 양태 105의 항체.
120. 서열번호 58 및 59로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 VL 영역을 포함하는 양태 105의 항체.
121. VH 또는 VL 서열에서 1 내지 10개의 돌연변이에 의해 추가로 변형된 양태 119 또는 120의 항체.
122. 돌연변이가 프레임워크 복귀 돌연변이 및 버니어 및 VH/VL 접면 잔기의 돌연변이로부터 선택된 양태 121의 항체.
123. RAGE의 HMGB1-CpG DNA 복합체로의 결합을 억제하는 이전의 양태 중 어느 하나의 항체 또는 결합 단백질 또는 RAGE의 HMGB1-CpG DNA 복합체로의 결합을 억제하지 않는 이전의 양태의 하나의 항체 또는 결합 단백질.
3. 항- hRAGE 항체의 생산
3.1 개요
본 출원의 항체는 적당한 숙주(예: 척추동물, 예컨대 사람, 마우스, 래트, 양, 염소, 돼지, 소, 말, 파충류, 어류, 양서류, 및 조류, 파충류 및 어류의 알)의 면역화로 생산할 수 있다. 본 출원의 항체를 생산하기 위해, 본 발명의 면역원성 RAGE 폴리펩타이드 또는 이의 단편으로 숙주를 면역화한다. "면역화"란 용어는 면역 레퍼토리가 자연의 유전자 미변형 유기체에 존재하는 것인지 또는 돌연변이 유기체, 예컨대 합성 사람 면역 레퍼토리를 디스플레이하도록 변형된 유기체에 존재하는지에 관계없이 항원을 면역 레퍼토리에 제공하는 과정을 의미한다. 이와 유사하게, "면역원성 제조물"은 항원의 면역원성을 증진시키는 애주번트 또는 다른 첨가제를 함유하는 항원의 제형이다.
동물의 면역화는 당업계에 공지된 임의의 방법으로 수행할 수 있다[예컨대, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990 참조]. 비-사람 동물, 예컨대 마우스, 래트, 양, 염소, 돼지, 소 및 말을 면역화하는 방법은 당업계에 공지되어 있다[예컨대, Harlow and Lane 및 미국 특허 5,994,619 참조]. 특정 양태에서, RAGE 항원은 면역 반응을 자극하기 위해 애주번트와 함께 투여한다. 이러한 애주번트로는 완전 또는 불완전 프로인트 애주번트, RIBI(뮤라밀 디펩타이드) 또는 ISCOM(면역자극 복합체)을 포함한다. 이러한 애주번트는 폴리펩타이드를 국소 침적물 중에 격리시켜 빠른 분산으로부터 보호하거나, 또는 대식세포에 화학주성인 인자 및 면역계의 다른 성분을 분비하도록 숙주를 자극하는 물질을 함유할 수 있다. 특히, 폴리펩타이드가 투여되고 있다면, 면역화 스케줄은 수 주 동안 전개되는 폴리펩타이드의 2회 이상의 투여를 수반할 것이다.
동물 숙주는 완전 세포 또는 붕괴 세포의 세포막과 관련된 항원으로 면역화되고, 본 출원의 항체는 본 발명의 면역원성 폴리펩타이드에 결합하는 것으로 확인하는 것이 고찰된다. 동물 숙주를 항원으로 면역화한 후, 항체는 그 동물로부터 수득할 수 있다. 항체-함유 혈청은 동물로부터 채혈하거나 희생시켜 수득한다. 혈청은 동물로부터 수득한 대로 사용할 수 있고, 이 혈청으로부터 면역글로불린 분획을 수득할 수도 있으며, 또는 혈청으로부터 항체를 정제할 수도 있다. 이러한 방식으로 수득한 혈청 또는 면역글로불린은 폴리클로날이어서, 불균일한 어레이의 성질을 보유한다.
3.2 하이브리도마 기술을 이용한 항- RAGE 모노클로날 항체
모노클로날 항체는 당업계에 공지된 다양한 기술, 예컨대 하이브리도마의 이용, 재조합체 및 파지 디스플레이 기술, 또는 이의 조합 등으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 당업계에 공지되고 예컨대 문헌[Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed., 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier, N.Y., 1981)(이 문헌들은 전문이 참고인용됨)]에 교시된 것을 비롯한 하이브리도마 기술을 이용해 생산할 수 있다. 본 명세서에 사용된 "모노클로날 항체"란 용어는 하이브리도마 기술을 통해 생산에 제한되지 않는다. "모노클로날 항체"란 용어는 이것이 생산되는 방법이 아닌, 단일 클론, 예컨대 임의의 진핵생물, 원핵생물 또는 파지 클론에서 유래되는 항체를 의미한다.
하이브리도마 기술을 이용하여 특정 항체를 생산 및 선별하는 방법은 통상적이고 당업계에 공지되어 있다. 한 양태에서, 본 발명은 모노클로날 항체를 생산하는 방법뿐만 아니라, 본 발명의 항체를 분비하는 하이브리도마 세포를 배양하는 단계를 포함하되, 여기서 하이브리도마가 바람직하게는 본 발명의 항원으로 면역화된 마우스로부터 분리된 비장세포를 골수종 세포와 융합시킨 뒤, 융합으로부터 수득되는 하이브리도마를 본 발명의 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 항체를 분비하는 하이브리도마 클론에 대해 선별함으로써 생산되는 하이브리도마인 상기 방법에 의해 생산되는 항체를 제공한다. 간략히 말하면, 마우스는 RAGE 항원으로 면역화할 수 있다. 특정 양태에서, RAGE 항원은 면역 반응을 자극하는 애주번트와 함께 투여한다. 이러한 애주번트로는 완전 또는 불완전 프로인트 애주번트, RIBI(뮤라밀 디펩타이드) 또는 ISCOM(면역자극 복합체)을 포함한다. 이러한 애주번트는 폴리펩타이드를 국소 침적물 중에 격리시켜 빠른 분산으로부터 보호하거나, 또는 대식세포에 화학주성인 인자 및 면역계의 다른 성분을 분비하도록 숙주를 자극하는 물질을 함유할 수 있다. 특히, 폴리펩타이드가 투여되고 있다면, 면역화 스케줄은 수주 동안 전개되는 폴리펩타이드의 2회 이상의 투여를 수반할 것이다.
면역 반응이 검출되면, 예컨대 항원 RAGE에 특이적인 항체가 마우스 혈청에서 검출되면, 마우스 비장을 수확하여 비장세포를 분리했다. 그 다음, 비장세포를 공지의 기술에 따라 임의의 적당한 골수종 세포, 예컨대 ATCC에서 입수가능한 세포주 SP20 유래의 세포 등에 융합시킨다. 하이브리도마를 선택하고 한계희석법으로 클로닝한다. 그 다음, 하이브리도마 클론을 RAGE에 결합할 수 있는 항체를 분비하는 세포에 대해 당업계에 공지된 방법으로 분석한다. 일반적으로 다량의 항체를 함유하는 복수액은 양성 하이브리도마 클론으로 마우스를 면역화하여 수득할 수 있다.
다른 양태에서, 항체-생산성 불멸화된 하이브리도마는 면역화된 동물로부터 제조할 수 있다. 면역화 후, 동물을 희생시키고 비장계 B 세포를 당업계에 공지된 바와 같이 불멸화된 골수종 세포에 융합시킨다[예컨대, Harlow and Lane, 상기 문헌 참조]. 특정 양태에 따르면, 골수종 세포는 면역글로불린 폴리펩타이드를 분비하지 않는다(비분비성 세포주). 융합 및 항생제 선택 후, 하이브리도마는 RAGE 또는 이의 일부, 또는 RAGE를 발현하는 세포를 이용하여 선별한다. 특정 양태에서, 초기 선별은 효소-결합된 면역분석법(ELISA) 또는 방사능면역분석법(RIA), 특히 ELISA를 이용하여 수행한다. ELISA 선별의 한 예는 참고인용된 WO 00/37504에 제공되어 있다.
항-RAGE 항체 생산 하이브리도마는 선발하여 클로닝한 뒤, 바람직한 특성, 예컨대 왕성한 하이브리도마 성장, 높은 항체 생산 및 바람직한 항체 특성(이하에 논의됨) 등에 대해 선별한다. 하이브리도마는 동계 동물, 면역계가 없는 동물, 예컨대 누드 마우스의 생체내에서 또는 시험관내 세포 배양물에서 배양 및 증폭될 수 있다. 하이브리도마를 선택, 클로닝 및 증폭시키는 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
특정 양태에서, 하이브리도마는 전술한 바와 같은 마우스 하이브리도마이다. 다른 바람직한 양태에서, 하이브리도마는 비-사람, 마우스외 종, 예컨대 래트, 양, 돼지, 염소, 소 또는 말에서 생산된다. 다른 양태에서, 하이브리도마는 사람 하이브리도마로, 사람의 비분비성 골수종을 항-RAGE 항체를 발현하는 사람 세포와 융합시킨 것이다.
특정 에피토프를 인식하는 항체 단편은 공지의 기술로 생산할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 Fab 및 F(ab')2 단편은 파파인(Fab 단편 생산) 또는 펩신(Fab'2 단편 생산)과 같은 효소를 이용한 면역글로불린 분자의 단백분해 절단에 의해 생산될 수 있다. F(ab')2 단편은 가변 영역, 경쇄 불변 영역 및 중쇄의 CH1 도메인을 함유한다.
3.3 SLAM 을 이용한 항- RAGE 모노클로날 항체
본 발명의 다른 관점에서, 재조합 항체는 미국 특허 5,627,052, PCT 공개번호 WO 92/02551 및 문헌[Babcock, J.S. et al.(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7843-7848]에 기술된 바와 같이, 선택 림프구 항체 방법(SLAM)과 같은 당업계에서 언급된 절차를 이용하여 분리된 단일 림프구로부터 수득한다. 이 방법에서, 당해 항체를 분비하는 단일 세포, 예컨대 전술한 면역화된 동물 중 어느 하나로부터 유래된 림프구는 항원-특이적 용혈 플라크 분석법을 이용하여 선별하고, 이 분석법에서 항원 RAGE, RAGE의 서브유닛 또는 이의 단편은 비오틴과 같은 링커를 이용해 양 적혈구 세포에 커플링되고 RAGE에 대해 특이성이 있는 항체를 분비하는 단일 세포를 확인하는데 사용된다. 당해 항체 분비성 세포의 확인 후, 이 세포로부터 역전사효소-PCR에 의해 중쇄 및 경쇄 가변 영역 cDNA를 획득하고, 이러한 가변 영역을 적당한 면역글로불린 불변 영역(예: 사람 불변 영역)의 환경에서, 포유동물 숙주 세포, 예컨대 COS 또는 CHO 세포에서 발현시킬 수 있다. 생체내 선택된 하이브리도마로부터 유래된, 증폭된 면역글로불린 서열로 형질감염된 숙주 세포는 그 다음 형질감염된 세포를 패닝(panning)하여 RAGE에 대한 항체를 발현하는 세포를 분리하는 처리 등에 의해 시험관내에서 추가 분석 및 선택을 받을 수 있다. 증폭된 면역글로불린 서열은 다시 시험관내에서, 예컨대 PCT 공개번호 WO 97/29131 및 PCT 공개번호 WO 00/56772에 기술된 바와 같은 시험관내 친화성 성숙 방법 등으로 조작될 수 있다.
3.4 유전자전이 동물을 이용한 항- RAGE 모노클로날 항체
본 발명의 다른 양태에서, 항체는 사람 면역글로불린 유전자좌의 일부 또는 전부를 포함하는 비-사람 동물을 RAGE 항원으로 면역화시켜 생산한다. 특정 양태에서, 비-사람 동물은 마우스 항체 생산 결손성이고 사람 면역글로불린 유전자좌의 큰 단편을 포함하는 유전자조작된 마우스 균주인 제노마우스(XENOMOUSE) 유전자전이 마우스이다. 예컨대, 문헌[Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994) 및 미국 특허 5,916,771, 5,939,598, 5,985,615, 5,998,209, 6,075,181, 6,091,001, 6,114,598 및 6,130,364]을 참조한다. 또한, WO 91/10741(1991.7.25 공개), WO 94/02602(1994.2.3 공개), WO 96/34096 및 WO 96/33735(둘 다 1996.10.31 공개), WO 98/16654(1998.4.23 공개), WO 98/24893(1998.6.11 공개), WO 98/50433(1998.11.12 공개), WO 99/45031(1999.9.10 공개), WO 99/53049(1999.10.21 공개), WO 00/09560(2000.2.24 공개) 및 WO 00/037504(2000.6.29 공개)도 참조한다. 제노마우스 돌연변이 마우스는 성인계 사람의 완전 사람 항체 레퍼토리를 생산하고, 항원-특이적 사람 Mab를 생성한다. 제노마우스 돌연변이 마우스는 사람 중쇄 유전자좌와 x 경쇄 유전자좌로 이루어진 메가염기 크기의 배선 형태 YAC 단편의 도입을 통해 사람 항체 레퍼토리의 약 80%를 함유한다[Mendez et al., Nature Genetics 15: 145-156(1997), Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188: 483-495(1998), 모든 개시내용이 참고 인용됨].
3.5 재조합 항체 라이브러리를 이용한 항- RAGE 모노클로날 항체
또한, 본 발명의 항체 제조에는 원하는 항체 라이브러리를 선별하여 결합 특이성을 가진 항체를 확인하는 시험관내 방법이 사용될 수 있다. 이러한 재조합 항체 라이브러리의 선별 방법은 당업계에 공지되어 있고, 문헌[예컨대 Ladner et al . 미국 특허 5,223,409; Kang et al . PCT 공개번호 WO 92/18619; Dower et al . PCT 공개번호 WO 91/17271; Winter et al . PCT 공개번호 WO 92/20791; Markland et al . PCT 공개번호 WO 92/15679; Breitling et al . PCT 공개번호 WO 93/01288; McCafferty et al . PCT 공개번호 WO 92/01047; Garrard et al . PCT 공개번호 WO 92/09690; Fuchs et al . (1991) Bio / Technology 9:1370-1372; Hay et al . (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al . (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty et al ., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths et al . (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al . (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al . (1991) Nature 352:624-628; Gram et al . (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio / Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al . (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; 및 Barbas et al . (1991) PNAS 88:7978-7982, US 특허출원 공개 20030186374, 및 PCT 공개번호 WO 97/29131(각 내용은 본 발명에 참고인용됨)]에 기술된 방법을 포함한다.
재조합 항체 라이브러리는 RAGE 또는 RAGE의 일부로 면역화된 피검체로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 재조합 항체 라이브러리는 순수 피검체, 즉 RAGE로 면역화되지 않은 피검체 유래, 예를 들어 사람 RAGE로 면역화된 적이 없는 사람 피검체 유래의 사람 항체 라이브러리일 수 있다. 본 발명의 항체는 사람 RAGE를 함유하는 펩타이드로 재조합 항체 라이브러리를 선별하여 RAGE를 인식하는 항체를 선택한다. 이러한 선별과 선택을 수행하는 방법은 이전 문단의 참고문헌에 기술된 것처럼 당업계에 공지되어 있다. hRAGE에 대해 특별한 결합 친화성을 가진 본 발명의 항체, 예컨대 특정 koff 속도 상수로 사람 RAGE로부터 해리하는 항체를 선택하기 위해, 당업계에 공지된 방법인 표면 플라스몬 공명을 이용하여 원하는 koff 속도 상수를 가진 항체를 선택할 수 있다. hRAGE에 대한 특별한 중화 활성을 가진 본 발명의 항체를 선택하기 위해, 예컨대 hRAGE 활성의 억제를 평가하는 당업계에 공지된 특별한 IC50 표준 방법 등을 사용할 수 있다.
한 관점에서, 본 발명은 사람 RAGE에 결합하는 분리된 항체 또는 이의 항원결합부에 관한 것이다. 특히, 항체는 중화 항체이다. 다양한 양태에서, 항체는 재조합 항체 또는 모노클로날 항체이다.
예를 들어, 본 발명의 항체는 당업계에 공지된 다양한 파지 디스플레이 방법으로도 생성할 수 있다. 파지 디스플레이 방법에서 기능성 항체 도메인은 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 운반하는 파지 입자의 표면에서 디스플레이된다. 특히, 이러한 파지는 레퍼토리 또는 조합 항체 라이브러리(예: 사람 또는 쥐)로부터 발현된 항원-결합 도메인을 디스플레이하는데 이용될 수 있다. 당해 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 발현하는 파지는 항원, 예컨대 표지화된 항원 또는 고상 표면이나 비드에 결합되거나 포획된 항원을 이용하여 선택하거나 확인할 수 있다. 이러한 방법에 사용된 파지는 일반적으로 Fab, Fv 또는 디설파이드 안정화된 Fv 항체 도메인이 파지 유전자 III 또는 유전자 VIII 단백질 중 어느 하나에 재조합 융합되어 있는, 파지로부터 발현된 fd 및 M13 결합 도메인을 포함하는 사상(filamentous) 파지이다. 본 발명의 항체를 제조하는데 사용될 수 있는 파지 디스플레이 방법의 예는 문헌[Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57:191-280 (1994); PCT 출원번호 PCT/GB91/01134; PCT 공개번호 WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; 및 미국 ㅌ특허번호 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780, 225; 5,658,727; 5,733,743 및 5,969,108; 각 문헌은 전문이 참고인용됨]에 개시된 것을 포함한다.
상기 문헌들에 기술된 바와 같이, 파지 선택 후, 파지 유래의 항체 암호화 영역을 분리하여 사람 항체를 포함하는 전체 항체 또는 임의의 다른 바람직한 항원 결합 단편을 생성하는데 사용하고, 이하에 상세히 기술되는 바와 같은 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 세균을 비롯한 임의의 바람직한 숙주에서 발현시킬 수 있다. 예를 들어, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편을 재조합 생산하는 기술은 당업계에 공지된 방법, 예컨대 문헌[PCT 공개번호 WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12(6):864-869 (1992); 및 Sawai et al., AJRI 34:26-34 (1995); 및 Better et al., Science 240:1041-1043 (1988) (이 문헌들은 전문이 참고인용된다)]에 개시된 방법을 이용할 수 있다. 단일쇄 Fv 및 항체를 생산하는데 사용될 수 있는 기술의 예는 미국 특허 4,946,778 및 5,258,498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); 및 Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988)에 기술된 것을 포함한다.
파지 디스플레이에 의해 재조합 항체 라이브러리를 선별하는 방법의 대안으로, 대형 조합 라이브러리를 선별하는 당업계에 공지된 여타 방법을 이용하여 본 발명의 이원 특이성 항체를 확인할 수 있다. 대체 발현계의 한 종류는 문헌[PCT 공개번호 WO 98/31700(Szostak 및 Roberts), 및 Roberts, R.W. and Szostak, J.W. (1997) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 94:12297-12302]에 기술된 바와 같이 재조합 항체 라이브러리가 RNA-단백질 융합체로 발현되는 것이다. 이러한 계에서, 공유 융합체는 펩타이드계 수용체 항생제인 퓨로마이신을 3' 말단에서 운반하는 합성 mRNA의 시험관내 해독에 의해 암호화되는 펩타이드 또는 단백질과 mRNA 사이의 융합체로 생성된다. 따라서, 특정 mRNA는 복합 mRNA 혼합물(예: 조합 라이브러리)로부터 항체와 같은 암호화된 펩타이드 또는 단백질, 또는 이의 일부의 성질, 예컨대 이원 특이성 항원에 대한 항체 또는 이의 일부의 결합 등에 기초하여 농축시킬 수 있다. 이러한 라이브러리의 선별로부터 회수된 항체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 전술한 바와 같은 재조합 수단(예: 포유동물 숙주 세포)에 의해 발현될 수 있고, 더욱이 본래 선택된 서열(들)에 돌연변이가 도입된 mRNA-펩타이드 융합체의 추가 선별, 또는 전술한 바와 같은 재조합 항체의 시험관내 친화성 성숙의 다른 방법 등에 의해 추가 친화성 성숙으로 처리될 수 있다.
다른 시도로, 본 발명의 항체는 또한 당업계에 공지된 효모 디스플레이 방법을 이용해 생성할 수 있다. 효모 디스플레이 방법에서, 효모 세포 벽에 항체 도메인을 테더링(tethering)하고 효모 표면에서 디스플레이하기 위해 유전자 방법을 이용한다. 특히, 이러한 효모는 레퍼토리 또는 조합 항체 라이브러리(예: 사람 또는 쥐)로부터 발현된 항원-결합 도메인을 디스플레이하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 항체를 제조하는데 이용될 수 있는 효모 디스플레이 방법의 예는 본원에 참고인용된 미국 특허 6,699,658(Wittrup, et al.)에 개시된 방법을 포함한다.
4. 본 발명의 특정 재조합 RAGE 항체의 생산
본 발명의 항체는 당업계에 공지된 많은 기술 중 임의의 기술로 생산할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 발현 벡터(들)가 표준 기술에 의해 숙주 세포에 형질감염된, 숙주 세포로부터의 발현이 있다. "형질감염"이란 용어의 다양한 형태는 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에 외인성 DNA를 도입시키는데 흔히 사용되는 광범한 기술, 예컨대 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포괄하고자 한다. 본 발명의 항체는 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포 중 어느 하나에서 발현하는 것이 가능하지만, 진핵생물 세포(특히 포유동물 세포)가 원핵생물 세포보다 적절히 폴딩된 면역학적 활성 항체를 어셈블리하고 분비할 가능성이 크기 때문에 진핵생물 세포에서의 항체 발현이 바람직하고, 특히 포유동물 숙주 세포에서의 항체 발현이 가장 바람직하다.
이러한 본 발명의 재조합 항체를 발현시키기 위한 특정 포유동물 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO 세포)[예컨대, 문헌(R.J. Kaufman and P.A. Sharp (1982) Mol. Biol . 159:601-621)에 기술된 바와 같이, DHFR 선택성 마커와 함께 사용된 문헌(Urlaub and Chasin, (1980) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 77:4216-4220)에 기술된 dhfr- CHO 세포 포함), NS0 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 항체 유전자를 발현하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포에 도입되면, 이 숙주 세포를 이 숙주 세포에서 항체를 발현하기에 충분한 시간 동안, 또는 더욱 바람직하게는 숙주 세포가 증식된 배양 배지로 항체를 분비하기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양하여 항체를 생산한다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 이용해 배양 배지로부터 회수할 수 있다.
또한, 숙주 세포는 Fab 단편 또는 scFv 분자와 같은 기능성 항체 단편을 생산하는데 이용할 수 있다. 이러한 절차 상의 변화는 본 발명의 범위 내인 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 본 발명의 항체의 경쇄 및/또는 중쇄 중 어느 하나의 기능성 단편을 암호화하는 DNA로 숙주 세포를 형질감염시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 당해 항원에 결합하는데 필요하지 않은 경쇄 및 중쇄 중 어느 하나 또는 둘 모두를 암호화하는 DNA의 일부 또는 전부를 제거하기 위해 재조합 DNA 기술을 이용할 수도 있다. 이러한 절두형 DNA 분자로부터 발현된 분자도 본 발명의 항체에 포함된다. 또한, 본 발명의 항체를 표준 화학적 가교 방법에 의해 제2 항체에 가교결합하여, 하나의 중쇄와 하나의 경쇄가 본 발명의 항체이고 다른 중쇄 및 경쇄가 당해 항원 외의 다른 항원에 특이적인 이기능성 항체를 생산할 수도 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원결합부의 특정 재조합 발현계에서, 항체 중쇄 및 항체 경쇄를 모두 암호화하는 재조합 발현 벡터는 인산칼슘-매개의 형질감염에 의해 dhfr- CHO 세포 내로 도입된다. 재조합 발현 벡터 내에서, 항체 중쇄 및 경쇄 유전자는 각각 CMV 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 인자에 작동가능하게 연결되어 유전자의 높은 전사 수준을 유도한다. 또한, 재조합 발현 벡터는 메토트렉세이트 선택/증폭을 이용하여 상기 벡터로 형질감염된 CHO 세포의 선택을 가능하게 하는 DHFR 유전자를 운반한다. 선택된 형질감염 숙주 세포는 항체 중쇄 및 경쇄의 발현을 허용하도록 배양하고 이 배양 배지로부터 완전한 항체를 회수한다. 재조합 발현 벡터를 제조하고 숙주 세포를 형질감염시키며, 형질감염체를 선택하고, 숙주 세포를 배양하고 배양 배지로부터 항체를 회수하기 위해 표준 분자생물학 기술을 이용한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 재조합 항체가 합성될 때까지 적당한 배양 배지에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하여 본 발명의 재조합 항체를 합성하는 방법을 제공한다. 이 방법은 추가로 배양 배지로부터 재조합 항체를 분리하는 단계를 포함한다.
4.1 항 RAGE 항체
표 4는 본 발명의 바람직한 항-hRAGE 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열 목록이다.
Figure pat00006
Figure pat00007
상기 분리된 항-RAGE 항체 CDR 서열은 본 발명에 따라 분리된 RAGE 결합 단백질의 신규 패밀리를 구축한다. hRAGE에 관하여 특정 RAGE 결합 및/또는 중화 활성을 가진 본 발명의 CDR을 생성하고 선택하기 위해, 본 발명의 결합 단백질을 생성하고 이 결합 단백질의 RAGE 결합 및/또는 중화 특성을 평가하는 당업계에 공지된 표준 방법을 이용할 수 있고, 그 예로는 본 명세서에 상세하게 기술된 것을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.
4.2 항 RAGE 키메라 항체
키메라 항체는 항체의 여러 부분이 다른 동물 종에서 유래한 분자로, 예컨대 쥐 모노클로날 항체 유래의 가변 영역과 사람 면역글로불린 불변 영역을 보유하는 항체가 있다. 키메라 항체를 생산하는 방법은 당업계에 공지되어 있다[Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202; 미국특허 5,807,715; 4,816,567; 및 4,816,397, 모두 전문이 참고인용됨]. 또한, 적당한 항원 특이성이 있는 마우스 항체 분자 유래의 유전자를 적당한 생물학적 활성의 사람 항체 분자 유래의 유전자와 함께 스플라이싱하여 "키메라 항체"를 생산하기 위해 개발된 기술(Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454, 전문이 참고인용됨)이 사용될 수 있다.
한 양태에서, 본 발명의 키메라 항체는 본 명세서에 기술된 쥐 모노클로날 항 사람 RAGE 항체의 중쇄 불변 영역을 사람 IgG1 불변 영역으로 교체하여 생산한다.
4.3 항 RAGE CDR 이식된 항체
본 발명의 CDR-이식된 항체는 VH 및/또는 VL의 CDR 영역 중 하나 이상이 본 발명의 쥐 항체와 같은 비-사람 CDR 서열로 교체된, 사람 항체 유래의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 임의의 사람 항체 유래의 프레임워크 서열은 CDR 이식용 주형으로 작용할 수 있다. 하지만, 이러한 프레임워크 위에 직쇄 교체는 종종 항원에 대한 결합 친화성의 일부 상실을 초래하기도 한다. 사람 항체가 원조 쥐 항체에 대해 상동성이 클수록 사람 프레임워크와 쥐 CDR의 조합으로 인해 친화성을 감소시킬 수 있는 CDR의 비틀림이 초래될 가능성은 더 적다. 따라서, CDR로부터 떨어진 쥐 가변 프레임워크를 교체하기 위해 선택한 사람 가변 프레임워크는 쥐 항체 가변 영역 프레임워크와 적어도 65%의 서열 동일성인 것이 바람직하다. CDR로부터 떨어진 사람 및 쥐 가변 영역은 적어도 70%의 서열 동일성인 것이 더욱 바람직하다. CDR로부터 떨어진 사람 및 쥐 가변 영역은 서열 동일성이 75% 이상인 것이 더 더욱 바람직하다. CDR로부터 떨어진 사람 및 쥐 가변 영역은 서열 동일성이 적어도 80%인 것이 가장 바람직하다. CDR 이식된 항체를 생산하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(Jones et al., Nature 321: 522-525(1986); 미국 특허 5,225,539).
특정 양태에서, 본 발명은 표 5에 기술된 바와 같은 VH 및/또는 VL 쇄를 보유한 CDR 이식된 항체를 제공한다.
Figure pat00008
mAb 11E6 유래의 CDR 서열은 진하게 표시했다. 특정 프레임워크 서열(FR1 내지 FR4)에는 해당 서열번호를 표시하여 참조된다(표 2 및 3 참조).
4.4 항 RAGE 사람화된 항체
사람화된 항체는 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)이 비-사람 종 유래이고 프레임워크 영역은 사람 면역글로불린 분자 유래인, 원하는 항원에 결합하는 비-사람 종의 항체 유래의 항체 분자이다. 공지된 사람 Ig 서열은 다음 웹사이트들과 문헌에 개시되어 있다 [예컨대, www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez-/query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; www.public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html; www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html; www.whfreeman.com/immunology/CH- 05/kuby05.htm; www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/m- ikeimages.html; www.antibodyresource.com/; mcb.harvard.edu/BioLinks/Immuno- logy.html.www.immunologylink.com/; pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.- html; www.biotech.ufl.edu/.about.hcl/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html- ; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; www.m.ehime-u.acjp/.about.yasuhito-/Elisa.html; www.biodesign.com/table.asp; www.icnet.uk/axp/facs/davies/lin-ks.html; www.biotech.ufl.edu/.about.fccl/protocol.html; www.isac-net.org/sites_geo.html; aximtl.imt.uni-marburg.de/.about.rek/AEP- Start.html; baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html; www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/pu- blic/INTRO.html; www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html; imgt.cnusc.fr:8104/; www.biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html; antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; www.unizh.ch/.about.honegger/AHOsem- inar/Slide01.html; www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/; www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/h- umanisation/TAHHP.html; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.cryst.bioc.cam.ac.uk/.abo- ut.fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html; www.jerini.de/frroducts.htm; www.patents.ibm.com/ibm.html. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983), 각각 본 발명에 참고인용됨]. 이와 같이 입수된 서열들은 면역원성을 감소시키거나, 또는 결합성, 친화성, 온-속도 (on-rate), 오프-속도 (off-rate), 화합성, 특이성, 반감기 또는 당업계에 공지된 바와 같은 임의의 다른 적당한 특성을 감소, 증진 또는 변성시키는데 사용할 수 있다.
사람 프레임워크 영역에 존재하는 프레임워크 잔기는 항원 결합을 변경, 특히 증진시키기 위해 CDR 공여 항체 유래의 대응 잔기로 치환될 수 있다. 이러한 프레임워크 치환은 당업계에 공지된 방법, 예컨대 항원 결합에 중요한 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 CDR과 프레임워크 잔기의 상호작용의 모델링 및 특정 위치들에 존재하는 이상 프레임워크 잔기을 확인하기 위한 서열 비교를 통해 확인한다(예컨대, Queen et al., 미국 특허 5,585,089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988), 전문이 참고인용됨). 3차원 면역글로불린 모델은 흔히 이용가능하고 당업자에게 익숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체형태 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램도 이용가능하다. 이러한 디스플레이의 조사는 후보 면역글로불린 서열의 기능에 잔기들의 가능한 역할을 분석할 수 있게 하고, 즉 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 가능하게 한다. 이러한 방식으로, 원하는 항체 특성, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 친화성 증가가 달성되도록 컨센서스 및 입수 서열들로부터 FR 잔기를 선택 및 조합할 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 영향을 미치는데 직접적으로 가장 실질적으로 관여한다. 항체는 다음 문헌들에 기술된 바와 같은 당업계에 공지된 다양한 기술을 이용하여 사람화될 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다: Jones et al., Nature 321:522 (1986); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993), Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al. , PNAS 91:969-973 (1994); PCT 공개번호 WO 91/09967, PCT/: US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/14424, WO90/14430, EP 229246, EP 592,106; EP 519,596, EP 239,400, 미국 특허번호 5,565,332, 5,723,323, 5,976,862, 5,824,514, 5,817,483, 5814476, 5763192, 5723323, 5,766886, 5,714,352, 6,204,023, 6,180,370, 5,693,762, 5,530,101, 5,585,089, 5,225,539; 4,816,567 [각각 전문이 참고인용됨, 여기에 인용된 참고문헌도 포함].
5. 본 발명의 항체의 추가 양태
5.1 융합 항체 및 면역어드헤신( immunoadhesin )
본 발명은 또한 본 발명의 RAGE 항체 전부 또는 일부와 여기에 연결된 다른 폴리펩타이드를 포함하는 융합 항체 또는 면역어드헤신이 제조될 수 있음을 예시한다. 일부 양태에서, 상기 폴리펩타이드에는 RAGE 항체의 가변 영역만이 연결된다. 다른 양태에서, 본 발명의 RAGE 항체의 VH 도메인은 제1 폴리펩타이드에 연결되고, 항체의 VL 도메인은 VH 도메인과 VL 도메인이 서로 상호작용하여 항체 결합 부위를 형성하게 하는 방식으로 제1 폴리펩타이드와 연합하는 제2 폴리펩타이드에 연결된다. 다른 양태에서, VH 도메인은 VH 도메인과 VL 도메인이 서로 상호작용할 수 있게 하는 링커에 의해 VL 도메인으로부터 분리되어 있다(이하, 단일쇄 항체 참조). VH-링커-VL 항체는 그 다음 당해의 폴리펩타이드에 연결된다. 융합 항체는 RAGE를 발현하는 세포 또는 조직으로 폴리펩타이드를 유도하는데 유용하다. 당해의 폴리펩타이드는 치료제, 예컨대 독소이거나, 또는 진단제, 예컨대 양고추냉이 퍼옥시다제와 같이 쉽게 가시화될 수 있는 효소일 수 있다. 또한, 융합 항체는 2개(또는 그 이상)의 단일쇄 항체가 서로 연결되어 생성될 수 있다. 이것은 단일 폴리펩타이드 쇄 위에 2가 또는 다가 항체를 생성하고자 하는 경우, 또는 이특이성 항체를 생성하고자 하는 경우에 유용하다.
하나의 양태는 본 발명의 항체 또는 항체부가 다른 기능성 분자(예: 다른 펩타이드 또는 단백질)에 연결되거나 유도체화된 표지화된 결합 단백질을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 표지화된 결합 단백질은 본 발명의 항체 또는 항체부를 (화학적 결합, 유전자 융합, 비공유 결합 등에 의해) 하나 이상의 다른 분자 실체, 예컨대 핵산, 다른 항체(예: 이특이성 항체 또는 디아바디), 검출가능한 제제, 세포독성제, 약제 및/또는 다른 분자(예: 스트렙타비딘 코어 영역 또는 폴리히스티딘 태그)의 연합을 매개할 수 있는 단백질 또는 펩타이드 등에 기능적으로 연결시켜 유도할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체부가 유도체화될 수 있는 유용한 검출성 제제는 형광 화합물을 포함한다. 형광 검출성 제제의 예로는 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 5-디메틸아민-1-나프탈렌설포닐 클로라이드, 피코에리트린 등을 포함한다. 또한, 항체는 검출성 효소, 예컨대 알칼리성 포스파타제, 양고추냉이 퍼옥시다제, 글루코스 옥시다제 등으로 유도체화될 수 있다. 항체가 검출성 효소로 유도체화되면, 효소가 이용하여 검출성 반응 산물을 생산하는 추가 시약을 첨가하여 검출한다. 예를 들어, 검출성 제제인 양고추냉이 퍼옥시다제가 존재하면, 과산화수소 및 디아미노벤지딘의 첨가는 검출가능한 유색 반응 산물을 야기한다. 또한, 항체는 핵산, 비오틴으로 유도체화될 수 있고 아비딘 또는 스트렙타비딘 결합의 간접 측정을 통해 검출할 수 있다.
5.2 단일쇄 항체
본 발명은 본 발명의 면역원성 RAGE에 결합하는 단일쇄 항체(scFv)를 포함한다. scFv를 생산하기 위해, VH- 및 VL-암호화 DNA를 가요성 링커를 암호화하는 DNA, 예컨대 아미노산 서열(Gly4-Ser)을 암호화하는 DNA에 작동가능하게 연결시켜, 가요성 링커에 의해 VL 및 VH 영역이 연합된, 인접한 단일쇄 단백질로 VH 서열과 VL 서열을 발현시킬 수 있다(예컨대, Bird et al. (1988) Science 242:423-42 6; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; McCafferty et al., 30 Nature (1990) 34 8: 552-554 참조). 단일쇄 항체는 단일 VH 및 VL만이 사용되면 일가, 2개의 VH와 VL이 사용되면 2가, 2개 이상의 VH와 VL이 사용되면 다가일 수 있다. 링커를 통해 커플링된 2개의 상기 scFv 단편은 "디아바디"라 불리며, 이 역시 본 발명에 포함된다.
5.3 이특이성 항체
본 발명은 또한 하나의 특이성이 본 발명의 면역원성 RAGE 폴리펩타이드에 대한 것인, 이특이성 항체 또는 이의 항원결합부를 포함한다. 예를 들어, 이특이성 항체는 특이적으로 하나의 결합 도메인을 통해 본 발명의 면역원성 RAGE 폴리펩타이드에 결합하고 제2 결합 도메인을 통해 제2 분자에 결합하는 항체로 생성될 수 있다. 또한, 하나보다 많은 VH와 VL을 함유하는 단일쇄 항체는 본 발명의 면역원성 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하고 신경돌기 돌출 및 성장의 억제 및 미엘린 매개 성장 원추 붕괴의 약화와 관련이 있는 다른 분자에 결합하는 항체로 생성될 수 있다. 이러한 이특이성 항체는 예컨대 문헌[Fanger et al. Immunol Methods 4: 72-81 (1994) 및 Wright and Harris, 20 (상기 문헌 설명 참조)]에 공지된 기술을 이용하여 생성할 수 있다.
일부 양태에서, 이특이적 항체는 본 발명의 항체 유래의 가변 영역을 하나 이상 사용하여 제조한다. 다른 양태에서, 이특이성 항체는 상기 항체 유래의 CDR 영역을 하나 이상 사용하여 제조한다.
5.4 유도체화되고 표지화된 항체
본 발명의 항체 또는 이의 항원결합 단편은 유도체화되거나 다른 분자(예: 다른 펩타이드 또는 단백질)에 연결될 수 있다. 일반적으로, 항체 또는 항원결합 단편은 유도체화 또는 표지화에 의해 본 발명의 면역원성 폴리펩타이드에 대한 결합이 역영향을 받지 않을 정도로 유도체화된다.
예를 들어, 본 발명의 항체 또는 항체부는 하나 이상의 다른 분자 실체, 예컨대 다른 항체(예: 이특이성 항체 또는 디아바디), 검출 시약, 세포독성제, 약제 및/또는 다른 분자(스트렙타비딘 코어 영역 또는 폴리히스티딘 태그)와 항체 또는 항원결합 단편의 연합을 매개할 수 있는 단백질 또는 펩타이드에 기능적으로 연결(화학적 커플링, 유전자 융합, 비공유 연합 등)될 수 있다. 또한, 항체 또는 이의 항원결합부는 하나 이상의 다른 또는 여러 단백질 또는 펩타이드와 항체 또는 항체부의 공유 또는 비공유 연합에 의해 형성된, 더 큰 면역부착 분자의 일부일 수 있다. 이러한 면역부착 분자의 예는 4량체 scFv 분자를 제조하기 위한 스트렙타비딘 코어 영역의 이용(Kipriyanov et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) 및 2가의 비오틴화된 scFv 분자를 제조하기 위한 시스테인 잔기, 마커 펩타이드 및 C-말단 폴리히스티딘 태그의 이용(Kipriyanov et al. (1994) Molecular Immunology 31:1047-1058)을 포함한다. 항체부, 예컨대 Fab 및 F(ab')2 단편은 전체 항체를 파파인 또는 펩신으로 각각 분해하는 등의 통상의 기술을 이용해 완전 항체로부터 제조할 수 있다. 또한, 항체, 항체부 및 면역부착 분자는 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 수득할 수 있다.
유도체화된 항체는 2 이상의 항체(동일 종류 또는 다른 종류의 항체, 예컨대 이특이성 항체를 생성하는 것)를 가교결합시켜 생산할 수 있다. 적당한 가교제로는 2가지 상이한 반응성 기가 적당한 스페이서(예: m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스테르)에 의해 분리된 이종이작용기성 또는 동종이작용기성(예: 디석신이미딜 수베레이트)인 가교제를 포함한다. 이러한 링커들은 피어스 케미컬 컴패니(Pierce Chemical Company, Rockford, III)에서 입수할 수 있다.
또한, 유도체화된 항체는 표지화된 항체일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 항체부를 유도체화할 수 있는 검출 제제는 형광 화합물, 예컨대 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 5-디메틸아민-1-나프탈렌설포닐 클로라이드, 피코에리트린, 란타나이드 인광물질 등이다. 항체는 또한 검출에 유용한 효소, 예컨대 양고추냉이 퍼옥시다제, 갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼리성 포스파타제, 글루코오스옥시다제 등으로 표지화될 수 있다. 검출성 효소로 표지화된 양태에서, 항체는 효소가 이용하여 검출성 반응 산물을 생산하는 추가 시약을 첨가하여 검출한다. 예를 들어, 과산화수소 및 디아미노벤지딘과 양고추냉이 퍼옥시다제이다. 또한, 항체는 비오틴으로 표지화될 수 있고, 아비딘 또는 스트렙타비딘 결합의 간접 측정을 통해 검출할 수 있다. 또한, 항체는 제2 리포터(예: 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체의 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프: 태그)에 의해 인식되는 소정의 폴리펩타이드 에피토프로 표지화될 수 있다. RAGE 항체 또는 이의 항원 단편은 방사선표지된 아미노산으로 표지화될 수 있다. 방사선표지는 진단용 및 치료용으로 사용될 수 있다. 방사선표지된 RAGE 항체는 예컨대 피검체 중의 RAGE 수용체 수준을 측정하기 위해 진단용으로 사용할 수 있다. 또한, 방사선표지된 RAGE 항체는 척수 손상을 치료하기 위해 치료용으로 사용할 수 있다.
폴리펩타이드용 표지의 예로는 다음을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다: 방사성동위원소 또는 방사성핵종(예: 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho 또는 153Sm). RAGE 항체 또는 이의 항원 단편은 또한 화학 기, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 메틸 또는 에틸 기 또는 탄수화물 기로 유도체화될 수 있다. 이러한 기들은 항체의 생물학적 특성을 향상시키는데, 예컨대 혈청 반감기 증가 또는 조직 결합을 증가시키는데 유용할 수 있다. 또한, 폴리펩타이드용 표지는 PCR로 검출하거나 유전자 발현을 증진시키기 위한 DNA와 같은 핵산, 또는 RAGE-보유 세포 또는 조직에서 유전자 발현을 억제하는 siRNA를 포함할 수 있다.
RAGE 항체의 클래스 및 서브클래스는 당업계에 공지된 임의의 방법으로 측정할 수 있다. 일반적으로, 항체의 클래스 및 서브클래스는 항체의 특정 클래스 및 서브클래스에 특이적인 항체를 이용하여 결정할 수 있다. 이러한 항체는 시중에서 입수가능하다. 클래스 및 서브클래스는 ELISA, 웨스턴 블롯 및 다른 기술을 통해 결정할 수 있다. 대안적으로, 클래스 및 서브클래스는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 도메인 전부 또는 일부를 서열분석하는 단계, 이 아미노산 서열과 공지된 각종 클래스 및 서브클래스의 면역글로불린의 아미노산 서열과 비교하는 단계, 및 항체의 클래스 및 서브클래스를 결정하는 단계를 통해 결정할 수 있다.
5.5 이원 가변 도메인 면역글로불린
본 명세서에 사용된 이원 가변 도메인(DVD) 결합 단백질 또는 면역글로불린은 2개 이상의 항원 결합 부위를 함유하는 결합 단백질이고 4가 또는 다가 결합 단백질, 예컨대 2가 및 4가인 단백질이다. 본 명세서에 사용된 "다가 결합 단백질"이란 용어는 2개 이상의 항원 결합 부위를 함유하는 결합 단백질을 의미한다. 다가 결합 단백질은 항원결합부위가 2개 이상이도록 유전자조작되는 것이 바람직하고, 일반적으로 자연발생의 항체가 아니다. "다특이성 결합 단백질"이란 용어는 2개 이상의 관련 또는 무관련 표적에 결합할 수 있는 결합 단백질을 의미한다. 이러한 DVD는 하나의 항원에 결합할 수 있는 단일특이성 또는 2개 이상의 항원에 결합할 수 있는 다특이성일 수 있다. 2개의 중쇄 DVD 폴리펩타이드와 2개의 경쇄 DVD 폴리펩타이드를 함유하는 DVD 결합 단백질은 DVD Ig이라 부른다. DVD Ig의 절반은 각각 중쇄 DVD 폴리펩타이드, 경쇄 DVD 폴리펩타이드 및 2개의 항원결합부위를 포함한다. 각 결합 부위는 항원결합 부위마다 항원 결합에 관여하는 CDR이 총 6개인 중쇄 가변 도메인과 경쇄 가변 도메인을 포함한다. DVD 결합 단백질 및 DVD 결합 단백질의 제조방법은 참고인용된 미국 특허출원번호 11/507,050에 개시되어 있다. 본 발명은 RAGE에 결합할 수 있는 결합 단백질을 함유하는 DVD 결합 단백질을 포함하고자 한다. 특히, DVD 결합 단백질은 RAGE와 제2 표적에 결합할 수 있다. 제2 표적은 항 염증성 MAB 활성(IL-1, IL-6, IL-8, IL-11, IL-12,IL-17, IL-18, IL-23, TNF 알파/베타, IFN-베타, 감마, LIF, OSM, CNTF, PF-4, 혈소판 염기성 단백질(PBP), NAP-2, 베타-TG, MIP-1, MCP2/3, RANTES, 림포탁틴, 수송-중재 단백질(인슐린 수용체, 트랜스페린 수용체, 트롬빈 수용체, 렙틴 수용체, LDL 수용체), 또는 다른 신경재생 MAB(NgR, Lingo, p75, CSPG (예: NG-2, 뉴로칸(neurocan), 브레비칸(brevican), 버시칸(versican), 어그리칸(aggrecan)), 히알루론산, mAG, 테나신(tenascin), NI-35, NI-250, IMP, 퍼레칸(perlecan), 뉴로칸(neurocan), 포스파칸(phosphacan), nogo-A, OMGP, Sema4D, Sema 3A, 에프린 B3, 에프린 A2, 에프린 A5, MAG, EphA4, 플렉신 B1, TROY, wnts, ryk rec., BMP-2, BMP-4, BMP-7), 신경보호 MAB 활성(EGF, EGFR, Sema 3), 항-아밀로이드 베타 MAB(예: m266, 3D6 (바피뉴주마브(bapineuzumab)), 항-글로불로머 MAB 7C6), CNS 위치한 수용체 및 트랜스포터(세로토닌 수용체, 도파민 수용체, DAT, Asc-1, GlyT1)로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
5.6 이원 특이성 항체
또한, 본 출원은 "이원 특이성 항체" 기술을 설명한다. 이원 특이성 항체는 작용물질, 길항제 또는 이 둘의 다른 조합으로 작용할 수 있다. 이원 특이성 항체는 VH 쇄는 제1 항원에 결합하고 VL 쇄는 다른 항원에 결합하는 항체로, WO 2008082651에 예시되어 있다.
5.7 결정화된 항체
본 발명의 다른 양태는 결정화된 결합 단백질을 제공한다. 본 명세서에 사용된 "결정화된"이란 용어는 결정 형태로 존재하는 항체 또는 이의 항원결합부를 의미한다. 결정은 고체 상태인 물질의 한 형태로, 무정형 고체 상태 또는 액정 상태와 같은 다른 형태와 상이하다. 결정은 원자, 이온, 분자(예: 항체와 같은 단백질) 또는 분자 어셈블리(예: 항원/항체 복합체)의 규칙적이고 반복적인 3차원 배열로 구성된다. 이러한 3차원 배열은 당해 분야에 잘 알려진 특정 수학적 관계에 따라 배열된다. 결정에서 반복되는 기본 단위 또는 빌딩 블록은 비대칭 단위라 불린다. 주어진 명백한 결정학적 대칭에 일치하는 배열에서 비대칭 단위의 반복은 결정의 "단위 셀"을 제공한다. 3차원 전부에서 규칙적인 해독에 의해 단위 셀의 반복은 결정을 제공한다[Giege, R. and Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2nd ea., pp. 20 1-16, Oxford University Press, New York, New York(1999)].
특히, 본 출원은 본 명세서에 개시된 바와 같은 완전 RAGE 항체 및 이의 단편의 결정, 그리고 이러한 결정을 함유하는 제형 및 조성물을 기술한다. 한 양태에서, 결정화된 결합 단백질은 결합 단백질의 가용성 대응물보다 생체내 반감기가 더 길다. 다른 양태에서, 결합 단백질은 결정화 후 생물학적 활성을 유지한다.
본 발명의 결정화된 결합 단백질은 참고인용된 WO 02072636에 개시된 바와 같이 당업계에 공지된 방법에 따라 생산할 수 있다.
5.8 글리코실화된 항체
본 발명의 다른 양태는 항체 또는 이의 항원결합부가 하나 이상의 탄수화물 잔기를 함유하는 글리코실화된 결합 단백질을 제공한다. 초기 생체내 단백질 생산은 해독후 변형으로 알려진 추가 프로세싱을 받을 수 있다. 구체적으로, 당(글리코실) 잔기는 글리코실화로 알려진 과정인 효소적 첨가될 수 있다. 수득되는 공유 결합된 올리고사카라이드 측쇄를 보유하는 단백질은 글리코실화된 단백질 또는 당단백질로 알려져 있다. 항체는 Fc 도메인은 물론 가변 도메인에 하나 이상의 탄수화물 잔기를 보유하는 당단백질이다. Fc 도메인 내의 탄수화물 잔기는 Fc 도메인의 효과기 기능에 중요한 영향을 미치고 항체의 항원 결합 또는 반감기에 최소 영향을 미친다(R. Jefferis, Biotechnol. Prog. 21(2005), pp. 11-16). 이에 반해, 가변 도메인의 글리코실화는 항체의 항원 결합 활성에 영향을 미칠 수 있다. 가변 도메인의 글리코실화는 아마도 입체 방해로 인해 항체 결합 친화성에 좋지 않은 영향을 미칠 수 있고(Co, M.S., et al., Mol. Immunol. (1993) 30: 1361-1367), 또는 항원에 대한 친화성을 증가시킬 수 있다(Wallick, S.C., et al., Exp. Med. (1988) 168:1099-1109; Wright, A., et al., EMBO J. (1991) 10:2717 2723).
본 발명의 한 관점은 결합 단백질의 O-결합 또는 N-결합 글리코실화 부위가 돌연변이된, 글리코실화 부위 돌연변이체의 생성에 관한 것이다. 당업자는 이러한 돌연변이체를 공지된 표준 기술로 생성할 수 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 생물학적 활성은 유지하지만 결합 활성은 증가 또는 감소한 글리코실화 부위 돌연변이체이다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항체 또는 항원결합부의 글리코실화는 변형된다. 예를 들어, 비글리코실화된 항체가 제조될 수 있다(즉, 글리코실화 결실 항체). 글리코실화는 예를 들어 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시키도록 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어 항체 서열 내의 하나 이상의 글리코실화 부위를 변경시켜 실행할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역의 글리코실화 부위를 제거하여 그 부위의 글리코실화를 제거하는 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 이러한 비글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시킬 수 있다. 이러한 시도는 각 전문이 참고인용된 PCR 공개번호 WO 2003 016466 A2, 및 미국 특허 5,714,350 및 6,350,861에 더 상세하게 기술되어 있다.
또한, 또는 대안적으로, 본 발명의 변형 항체는 글리코실화 종류가 변경된 항체, 예컨대 감소량의 푸코실 잔기를 보유하는 저푸코실화된 항체 또는 양분형 GlcNAc 구조가 증가된 항체로 제조될 수 있다. 이와 같은 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증되었다. 이러한 탄수화물 변형은 예컨대 변경된 글리코실화 기전을 가진 숙주 세포에서 항체를 발현시키는 방법 등으로 실행할 수 있다. 글리코실화 기전이 변경된 세포는 당업계에 기술되어 있고 본 발명의 재조합 항체를 발현하기 위해 숙주 세포로 사용되어, 글리코실화가 변경된 항체를 생산할 수 있다. 예컨대 문헌[Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1, 및 유럽특허 EP 1,176,195; PCT 공보 WO 03/035835; WO 99/54342 80]을 참조한다(각 문헌은 전문이 참고인용된다).
단백질 글리코실화는 당해 단백질의 아미노산 서열 및 단백질이 발현되는 숙주 세포에 의존적이다. 다른 유기체는 다른 글리코실화 효소(예: 글리코실트랜스퍼라제 및 글리코시다제)를 생산할 수 있고 이용할 수 있는 기질(뉴클레오타이드 당)이 다르다. 이러한 요인으로 인해, 단백질 글리코실화 패턴 및 글리코실 잔기의 조성은 특정 단백질이 발현되는 숙주계에 따라 달라질 수 있다. 본 발명에 유용한 글리코실 잔기는 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스, 푸코오스, n-아세틸글루코사민 및 시알산을 포함할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 특히, 글리코실화된 결합 단백질은 글리코실화 패턴이 사람이도록 글리코실 잔기를 포함한다.
당업자에게는 다른 단백질 글리코실화가 다른 단백질 특성을 초래할 수 있는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 효모와 같은 미생물 숙주에서 생산되고 효모 내인성 경로를 이용하여 글리코실화된 치료 단백질의 효능은, CHO 세포주와 같은 포유동물 세포에서 발현된 동일 단백질의 효능에 비해 감소될 수 있다. 이러한 당단백질은 사람 중에서 면역원성일 수 있고, 투여 후 생체내에서 감소된 반감기를 나타낼 수 있다. 사람 및 다른 동물 중의 특정 수용체는 특정 글리코실 잔기를 인식하여 혈류로부터 그 단백질의 신속한 제거를 촉진할 수 있다. 다른 부작용으로는 단백질 폴딩, 가용성, 프로테아제에 대한 민감성, 트래피킹(trafficking), 수송, 구획화, 분비, 다른 단백질 또는 인자들에 의한 인식, 항원성 또는 알러지유발성의 변화를 포함할 수 있다. 따라서, 당업자는 특정한 글리코실화 패턴과 조성의 치료 단백질, 예컨대 사람 세포에서 또는 의도한 피검 동물의 종-특이적 세포에서 생산된 것과 동일하거나 적어도 유사한 글리코실화 조성 및 패턴의 치료 단백질을 선호할 수 있다.
숙주 세포의 단백질과 다른 글리코실화 단백질의 발현은 이종의 글리코실화 효소를 발현하는 숙주 세포를 유전자 변형시켜 달성할 수 있다. 당업계에 공지된 기술을 사용하여 당업자는 사람 단백질 글리코실화를 나타내는 항체 또는 이의 항원결합부를 생성할 수 있다. 예를 들어, 효모 균주는 비자연 발생의 글리코실화 효소를 발현하도록 유전자 변형되었고, 이러한 효모 균주에서 생산된 글리코실화된 단백질(당단백질)은 동물 세포, 특히 사람 세포에서와 동일한 단백질 글리코실화를 나타낸다(미국 특허 출원 2004 0018590 및 2002 0137134, 및 PCT 공개번호 WO 2005100584 A2).
또한, 당업자라면 다양한 글리코실화 효소를 발현하도록 유전자조작된 숙주 세포의 라이브러리를 사용하여, 이 라이브러리의 구성 숙주 세포가 글리코실화 변형 패턴을 가진 당해의 단백질을 생산하도록 함으로써 당해의 단백질을 발현시킬 수 있음을 이해하고 있을 것이다. 당업자는 그 다음 특별한 새로운 글리코실화 패턴을 가진 당해의 단백질을 선택하고 분리할 수 있다. 특히, 특별히 선택된 새로운 글리코실화 패턴을 가진 단백질은 증진 또는 변경된 생물학적 성질을 나타낸다.
5.9 항- 이디오타입 항체
결합 단백질 외에, 본 발명은 또한 이러한 본 발명의 결합 단백질에 특이적인 항-이디오타입(항-Id) 항체에 관한 것이다. 항-Id 항체는 다른 항체의 항원결합 영역과 일반적으로 연합된 독특한 결정인자를 인식하는 항체이다. 항-Id는 동물을 결합 단백질 또는 이의 CDR 함유 영역으로 면역화시켜 제조할 수 있다. 면역화된 동물은 면역화 항체의 이디오타입 결정인자를 인식하고 이에 반응하여 항-Id 항체를 생산할 것이다. 또한, 항-Id 항체는 "면역원"으로 사용되어 또 다른 동물에서 면역반응을 유도하여 소위 항-항-Id 항체를 생산할 수 있다.
6. 항체의 용도
사람 RAGE에 결합하는 능력이 주어지면, 본 발명의 중화 항체 또는 이의 일부는 통상적인 면역분석법, 예컨대 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA), 방사능면역분석법(RIA), 또는 조직 면역조직화학을 이용하여 사람 RAGE(예: 혈청 또는 혈장과 같은 생물학적 시료에서)를 검출하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 생물학적 시료를 본 발명의 항체 또는 항체부와 접촉시키는 단계 및 사람 RAGE에 결합된 항체(또는 항체부) 또는 미결합된 항체(또는 항체부)를 검출하여 생물학적 시료 중의 사람 RAGE를 검출하는 단계를 포함하여, 생물학적 시료 중의 사람 RAGE를 검출하는 방법을 제공한다. 항체는 결합 또는 미결합 항체의 검출을 용이하게 하기 위해 검출가능한 물질로 직접 또는 간접적으로 표지화될 수 있다. 검출가능한 적당한 물질로는 다양한 효소, 보결분자단, 형광 물질, 발광 물질 및 방사능활성 물질을 포함한다. 적당한 효소의 예로는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제를 포함하며; 적당한 보결분자단 복합체의 예로는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴이 있고; 적당한 형광 물질의 예로는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하고; 발광 물질의 예로는 루미놀을 포함하고; 적당한 방사능활성 물질의 예로는 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho, 153Sm을 포함한다.
본 발명의 항체 및 항체부는 시험관내 및 생체내에서 사람 RAGE 활성을 중화시킬 수 있다. 따라서, 이러한 본 발명의 항체 및 항체부를 사용하여 이의 리간드에 대한 RAGE의 결합을 억제함에 따라서 산출되는 활성을 중화시킬 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 피검체에서, 유리하게는 RAGE 산출 활성이 유해한 질병 또는 장애를 앓고 있는 피검체로부터 RAGE 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 본 발명의 모노클로날 항체의 이용을 통해, Aβ-글로불로머와 같은 이의 리간드 중 하나 이상에 대한 RAGE 결합을 방해하여, 상기 질환 또는 장애를 앓고 있는 피검체에서 RAGE 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 항체, 특히 본 명세서에 개시된 사람화된 항체는 치료 목적으로 사람 피검체에게 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 수의용으로 또는 사람 질환의 동물 모델로서 항체가 결합할 수 있는 RAGE를 발현하는 비-사람 포유동물에게 투여할 수 있다. 이와 관련하여, 이러한 동물 모델은 본 발명의 항체의 치료 효능을 평가하는데 유용할 수 있다(예컨대 투약량 및 투여 시간 과정의 검사).
본 명세서에 사용된 바와 같이, "RAGE 활성이 유해한 장애"란 용어는 이 장애를 앓고 있는 피검체에서 RAGE의 존재 또는 이로부터 산출되는 활성이 이 장애의 병태생리에 책임이 있거나 장애의 악화에 기여하는 요인인 것으로 밝혀졌거나 또는 의심되는 질환 및 여타 장애를 포함하고자 한다. 따라서, RAGE 활성이 유해한 장애는 RAGE 활성의 감소가 이 장애의 증상 및/또는 진행을 경감시키는 것으로 생각되는 장애이다. 본 발명의 항체로 치료될 수 있는 장애의 비제한적 예는 이하 본 발명의 항체의 약제학적 조성물에 관한 섹션에서 논하는 장애를 포함한다.
RAGE는 근위축성측색경화증, 상완신경총손상, 외상성 뇌 손상을 포함하는 뇌 손상, 뇌성 마비, 프리드리히 아탁시아(Friedrich's Ataxia), 길랑 바레(Guillain Barre), 백질이영양증, 다발성 경화증, 포스트 폴리오, 이분 척추증(Spina Bifida), 척추 손상, 척수 근위축증, 척추 종양, 뇌졸중, 횡단성 척수염, 치매, 노인성 치매, 경증 인지 손상, 알츠하이머 관련 치매, 헌팅톤 무도병, 지연성 운동장애, 운동과다증, 조증, 모부스 파킨슨병(Morbus Parkinson), 스틸-리챠드 증후군, 다운 증후군, 중증근무력증, 신경 외상, 혈관 아밀로이드증, 아밀로이드증을 갖는 I형 뇌 출혈, 뇌염, 프리드리히 아탁시아, 급성 혼돈 장애, 근위축성측색경화증, 녹내장, 알츠하이머 질환, 당뇨성 신증, 패혈증, 류마티스 관절염 및 관련 염증성 질환; 당뇨병 및 이로 인한 합병증(예를 들어, 당뇨망막병증, 신증, 혈관 합병증); 죽상경화 합병증, 폐 섬유증, 암, 특히 흑색종 및 기타 아밀로이드증을 포함하는 그룹으로부터 선택된 신경학적 질환이 관여하는 다양한 질환과 연관된 병리학에서 중요한 역할을 하는 것으로 인지되고 있다 (예를 들어, 하기 문헌을 참조한다: 아밀로이드증, 암, 관절염, 크론 질환, 만성 및 급성 염증 질환: Schmidt AM et al: J Clin Invest. 2001 Oct;108(7):949-55.; 심혈관 질환, 당뇨, 당뇨 합병증: Yan SD et al: Eur J Clin Invest. 1997 Mar;27(3): 179-81; 프리온 관련 질환: Sasaki N et al: Neurosci Lett. 2002 Jun 28;326(2): 117-20; 혈관염, 신증, 망막증 및 신경병증: Thornalley PJ.:Int Rev Neurobiol. 2002;50:37-57; 알츠하이머 질환: Weldon DT et al: Geriatrics. 1997 Sep;52 Suppl 2:S13-6; Yan SD et al: Biochim Biophys Acta. 2000 Jul 26;1502(1): 145-57; 류마티스 관절염, 골관절염: Drinda S et al:. Rheumatol Int. 2004 Mar 26; 장질환: Foell D et al:Gut. 2003 Jun;52(6):847-53; 다발성 경화증: Yan SS et al:Nat Med. 2003 Mar;9(3):287-93; 건선: Foell D et al: Rheumatology (Oxford). 2003 Nov;42(1l): 1383-9 : 낭창: Tanji N et al:J Am Soc Nephrol. 2000 Sep;11(9): 1656-66; 일반 자가면역 질환, 패혈증: Liliensiek B et al:J Clin Invest. 2004 Jun;113(11): 1641-50; 죽상동맥경화증 및 협착증: Schmidt AM et al: Circ Res. 1999 Mar 19;84(5):489-97).
또한 이전에 논의된 바와 같이, 상기된 파트너 중 임의의 하나간에 DVD 면역글로불린 또는 이원 특이적 항체가 사용될 수 있다. 상기된 바와 같은 당해 항체 제제는 당해 질환의 치료를 위해 유용할 수 있다.
본 발명의 항체는 또한 세포내 표적 단백질의 표적화를 포함하도록 막관통 전달을 허용하는 펩타이드와 조합될 수 있다. 당해 펩타이드 서열은 tat, 안테나페디아, 폴리-arg, 몇몇 항미생물 펩타이드를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 당해 펩타이드는 세포막 및 상피 및 내피 막을 포함하고 뇌혈 장벽, 장 점막, 뇌막 등을 포함하는 막을 통한 전달을 허용할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체부는 또한 RAGE 활성이 이전의 문단에서 논의된 바와 같이 관여하는 질환의 치료에 유용한 하나 이상의 추가의 소분자 치료제와 함께 투여될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는 단독으로 또는 추가의 제제, 예를 들어, 치료제와 함께 사용될 수 있고 당해 추가의 제제는 의도된 목적에 따라 당업자에 의해 선택된다. 예를 들어, 추가의 제제는 본 발명의 항체에 의해 치료되는 질환 또는 병태를 치료하기 위해 유용한 것으로 당업계에 인지된 치료제일 수 있다. 또한 추가의 제제는 치료학적 조성물에 이로운 성질을 부여하는 제제, 예를 들어, 조성물의 점도에 영향을 주는 제제일 수 있다.
7. 약제학적 조성물
또한, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 항원결합부 및 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 장애 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방, 치료, 관리 또는 호전시키는데 및/또는 연구하는데 사용된다. 특정 양태에서, 조성물은 본 발명의 하나 이상의 항체를 포함한다. 다른 양태에서, 약제학적 조성물은 본 발명의 하나 이상의 항체와 RAGE 활성이 유해한 장애를 치료하기 위한 본 발명의 항체 외에 다른 하나 이상의 예방제 또는 치료제를 포함한다. 특히, 예방제 또는 치료제는 장애 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방, 치료, 관리 또는 호전시키는데 유용한 것으로 공지되거나, 사용되어 왔거나, 또는 현재 사용되고 있다. 이러한 양태에 따르면, 조성물은 추가로 담체, 희석제 또는 부형제를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 및 항체부는 피검체에게 투여하기에 적합한 약제학적 조성물에 혼입될 수 있다. 일반적으로, 약제학적 조성물은 본 발명의 항체 또는 항체부와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 명세서에 사용된 "약제학적으로 허용되는 담체"는 생리학적으로 융화성인 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항세균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수지연제 등을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예로는 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 중 하나 이상, 뿐만 아니라 이의 배합물을 포함한다. 많은 경우에 등장제, 예컨대 당, 다가알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 조성물에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 약제학적으로 허용되는 담체는 추가로 항체 또는 항체부의 효과 또는 저장수명을 증가시키는 습윤화제 또는 유화제, 보존제 또는 완충액과 같은 보조 물질을 소량으로 포함할 수 있다.
다양한 전달 시스템이 알려져 있으며, 본 발명의 하나 이상의 항체 또는 본 발명의 하나 이상의 항체와 장애 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방, 관리, 치료 또는 호전시키는데 유용한 예방제 또는 치료제의 배합물을 투여하는데 사용될 수 있으며, 그 예로는 리포좀으로의 캡슐화, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 항체 또는 항체 단편을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체-매개의 세포내이입(예컨대, Wu and Wu, J.Biol.Chem. 262: 4429-4432(1987)), 레트로바이러스 또는 다른 벡터의 일부로서 핵산의 작제 등이 있다. 본 발명의 예방제 또는 치료제를 투여하는 방법은 비경구 투여(예: 피내, 근육내, 복강내, 정맥내 및 피하), 경막외 투여, 종양내 투여 및 점막 투여(예: 비내 및 구강 경로)를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, 폐 투여는, 에컨대 흡입기 또는 분무기의 사용, 및 에어로졸화제를 이용한 제형을 이용할 수 있다. 그 예는 본원에 전문이 참고인용되는 문헌[미국 특허 6,019,968, 5,985,320, 5,985,309, 5,934,272, 5,874,064, 5,855,913, 5,290,540, 및 4,880,078; 및 PCT 공개번호 WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, 및 WO 99/66903]을 참고한다. 한 양태에서, 본 발명의 항체, 병용 요법 또는 본 발명의 조성물은 Alkermes AIR® 폐 약물 전달 기술(Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.)로 투여한다. 특정 양태에서, 본 발명의 예방제 또는 치료제는 근육내, 정맥내, 종양내, 구강, 비내, 폐 또는 피하로 투여된다. 예방제 또는 치료제는 통상적인 임의의 경로, 예컨대 주입 또는 일시 주사로, 상피 또는 점막피부 내층(예: 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국소 투여일 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명의 예방제 또는 치료제는 치료를 요하는 부위에 국소적으로 투여하는 것이 바람직할 것이며; 이는 예컨대 국소 주입, 주사, 또는 다른 이식체에 의해 달성될 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니며, 상기 이식체는 다공성 또는 비다공성 물질로, 막 및 매트릭스, 예컨대 시알라스틱(sialastic) 막, 중합체, 섬유성 매트릭스(예: Tisseel®) 또는 콜라겐 매트릭스를 포함한다. 한 양태에서, 본 발명의 하나 이상의 항체 길항제의 유효량은 장애 또는 이의 증상을 예방, 치료, 관리 및/또는 호전시키기 위해 피검체의 환부에 국소적으로 투여한다. 다른 양태에서, 본 발명의 하나 이상의 항체의 유효량은 장애 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방, 치료, 관리 및/또는 호전시키기 위해 피검체에게 본 발명의 항체 외에 다른 하나 이상의 치료제(예: 하나 이상의 예방제 또는 치료제)의 유효량과 함께 환부에 국소적으로 투여한다.
다른 양태에서, 예방제 또는 치료제는 제어 방출 또는 지속 방출 시스템으로 전달할 수 있다. 한 양태에서는 조절 또는 지속 방출을 달성하기 위해 펌프를 사용할 수 있다(예: Langer, 상기 문헌설명 참조; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). 다른 양태에서는 중합체 물질이 본 발명의 치료제의 조절 또는 지속 방출을 달성하기 위해 사용될 수 있다(예컨대, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; 또한 Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1:105); 미국 특허 5,679,377; 미국 특허 5,916,597; 미국 특허 5,912,015; 미국 특허 5,989,463; 미국 특허 5,128,326; PCT 공개번호 WO 99/15154; 및 PCT 공개번호 WO 99/20253 참조). 지속 방출 제형에 사용되는 중합체의 예로는 폴리(2-하이드록시 에틸 메타크릴레이트), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(아크릴산), 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트), 폴리(메타크릴산), 폴리글리콜라이드(PLG), 폴리안하이드라이드, 폴리(N-비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알콜), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리락타이드(PLA), 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)(PLGA) 및 폴리오르토에스테르가 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 바람직한 양태에서, 지속 방출 제형에 사용된 중합체는 불활성이고 침출성 불순물이 없으며, 보관시 안정하고, 멸균성이고 생체분해성이다. 다른 양태에서, 조절 또는 지속 방출 시스템은 예방 또는 치료 표적 부근에 처리되어, 전신 용량의 일부만을 필요로 할 수 있다(예컨대, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, 상기 문헌 참조, vol. 2, pp. 115-138 (1984)).
제어 방출 시스템은 문헌(Langer, 1990, Science 249:1527-1533)에서 논하고 있다. 당업자에게 공지된 임의의 기술은 본 발명의 하나 이상의 치료제를 함유하는 지속 방출 제형을 생산하는데 사용할 수 있다. 예컨대, 미국 특허 4,526,938, PCT 공개번호 WO 91/05548, PCT 공개번호 WO 96/20698, Ning et al., 1996, "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel," Radiotherapy &Oncology 39:179-189, Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long- Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science &Technology 50:372-397, Cleek et al., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854, 및 Lam et al., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760 (각 문헌은 전문이 참고인용되었다)을 참고한다.
본 발명의 조성물이 예방제 또는 치료제를 암호화하는 핵산인 특정 양태에서, 핵산은 이를 적당한 핵산 발현 벡터의 일부로서 작제하고, 레트로바이러스 벡터를 이용하거나(미국 특허 4,980,286 참조), 또는 직접 주사, 또는 마이크로입자 포격(예: 유전자 총; Biolistic, Dupont)의 이용 또는 지질이나 세포-표면 수용체 또는 형질감염제로의 코팅, 또는 핵에 유입되는 것으로 알려진 호메오박스-유사 펩타이드에 결합시켜 투여(예: Joliot et al., 1991 Proc. Natl. Acad. Scis. USA 88: 1864-1868)하는 등에 의해 세포내가 되도록 투여함으로써, 생체내 투여하여 암호화된 예방제 또는 치료제의 발현을 촉진할 수 있다. 대안적으로, 핵산은 새포내 도입한 뒤, 상동 재조합에 의한 발현을 위해 숙주 세포 DNA 내로 혼입시킬 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 의도한 투여 경로에 화합성이 되도록 제형화한다. 투여 경로의 예로는 비경구, 예컨대 정맥내, 피내, 피하, 구강, 비내(예: 흡입), 경피(예: 국소), 경점막 및 직장 투여를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 특정 양태에서, 조성물은 통상의 절차에 따라 사람에게 정맥내, 피하, 근육내, 구강, 비내 또는 표면 투여하기 위해 조정된 약제학적 조성물로 제형화한다. 일반적으로, 정맥내 투여용 조성물은 멸균 등장 수성 완충액 중의 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 추가로 용해제 및 주사 부위에 통증을 경감시키기 위한 리그노캄과 같은 국소 마취제를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물이 국소 투여되어야 한다면, 조성물은 연고, 크림, 경피 패치, 로션, 젤, 샴푸, 스프레이, 에어로졸, 용액, 유탁액 또는 다른 당업자에게 공지된 형태로 제형화될 수 있다[예컨대, Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995) 참조]. 분무할 수 없는 표면 투약 형태에는 표면 투여에 융화성인 하나 이상의 부형제 또는 담체를 함유하고 동적 점도가 바람직하게는 물보다 큰 점성 내지 반고체 또는 고체 형태가 일반적으로 사용된다. 적당한 제형으로는, 용액, 현탁액, 유탁액, 크림, 연고, 분말, 도찰제(liniment), 고약 등이 있으나, 이에 국한되지 않으며, 이는 필요하다면 멸균되거나 삼투압과 같은 각종 성질에 영향을 미치는 보조제(예: 보존제, 안정제, 함습제, 완충액 또는 염)와 혼합된다. 다른 적당한 표면 투약 형태로는 활성 성분이, 특히 고체 또는 액체 불활성 담체와 함께 가압 휘발성 물질(예: 기체 분사제, 예컨대 프레온)과의 혼합물로 또는 압축병에 포장된 분무가능한 에어로졸 제제를 포함한다. 보습제 또는 습윤제도 필요하다면 약제학적 조성물 및 투약 형태에 첨가될 수 있다. 이러한 추가 성분의 예는 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 방법이 조성물의 비내 투여를 포함한다면, 이 조성물은 에어로졸 형태, 스프레이, 미스트 또는 점적제 형태로 제형화될 수 있다. 특히, 본 발명에 따라 사용되는 예방제 또는 치료제는 압축 팩이나 분무기로부터 적당한 분사제(예: 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적당한 기체)를 이용하여 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달될 수 있다. 가압 에어로졸인 경우, 투약 단위는 계측량을 전달하는 밸브를 제공하여 측정할 수 있다. 흡입기 또는 취입기에 사용되는 캡슐 및 카트리지(예컨대 젤라틴으로 구성됨)는 화합물의 분말 혼합물 및 락토스 또는 전분과 같은 적당한 분말 베이스를 함유하도록 제형화할 수 있다.
본 발명의 방법이 경구 투여를 포함한다면, 조성물은 정제, 캡슐, 카셰, 젤캡, 용액, 현탁액 등의 형태로 경구 투여용으로 제형화될 수 있다. 정제 또는 캡슐은 약제학적으로 허용되는 부형제, 예컨대 결합제(예: 예비젤라틴화된 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로스); 충진제(예: 락토오스, 미세결정형 셀룰로오스 또는 제2 인산칼슘); 윤활제(예: 마그네슘 스테아레이트, 탈크 또는 실리카); 붕해제(예: 감자 전분 또는 나트륨 전분 글리콜레이트); 또는 함습제(예: 나트륨 라우릴 설페이트)를 이용하여 통상의 수단으로 제조할 수 있다. 정제는 당업계에 공지된 방법으로 코팅할 수 있다. 경구 투여용 액체 제제는 용액, 시럽 또는 현탁액 형태일 수 있으나, 이에 국한되지 않고, 또는 사용 전에 물이나 다른 적당한 비히클로 구성하는데 사용되는 건조 산물로 제공될 수도 있다. 이러한 액체 제제는 현탁제(예: 소르비톨 시럽, 셀룰로오스 유도체 또는 수소화된 식용 지방); 유화제(예: 레시틴 또는 아카시아); 비수성 비히클(예: 아몬드유, 유성 에스테르, 에틸 알콜 또는 분별화된 식물성유); 및 보존제(예: 메틸 또는 프로필 p-하이드록시벤조에이트 또는 소르브산)와 같은 약제학적으로 허용되는 첨가제를 이용하여 통상의 수단으로 제조할 수 있다. 이 제제는 또한 완충액 염, 향미제, 착색제 및 감미제를 적당한 경우 함유할 수 있다. 경구 투여용 제제는 예방제 또는 치료제(들)의 서방형, 제어 방출형 또는 지속 방출형으로 적당히 제형화할 수 있다.
본 발명의 방법은 에어로졸화 제제와 함께 제형화된 조성물의 폐 투여, 예컨대 흡입기 또는 분무기에 의한 폐 투여를 포함할 수 있다. 예컨대, 미국 특허 6,019, 968, 5,985,320, 5,985,309, 5,934,272, 5,874,064, 5,855,913, 5,290,540, 및 4,880,078; 및 PCT 공개번호 WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 및 WO 99/66903(각 문헌은 전문이 참고인용된다)을 참고한다. 특정 양태에서, 본 발명의 항체, 병용 요법 및/또는 본 발명의 조성물은 Alkermes AIR® 폐 약물 전달 기술(Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.)을 이용해 투여한다.
본 발명의 방법은 주사(예: 일시 주사 또는 연속 주입)에 의한 비경구 투여용으로 제형화한 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 주사용 제형은 보존제가 첨가되어 단위 투약 형태(예: 앰플 또는 다용량 용기)로 제공될 수 있다. 이 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중에 현탁액, 용액 또는 유탁액과 같은 형태를 취할 수 있고, 현탁화제, 안정제 및/또는 분산제와 같은 제형화용 제제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 사용 전에 적당한 비히클(예: 멸균 발열원제거 물)로 구성되는 분말 형태일 수 있다. 본 발명의 방법은 추가로 데포(depot) 제제로 제형화된 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 이러한 장기 작용성 제형은 이식(예: 피하 또는 근육내) 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어 조성물은 적당한 중합체 또는 소수성 물질(예: 허용성 오일 중의 유탁액으로서) 또는 이온교환수지를 이용하여 제형화하거나, 난용성 유도체(예: 난용성 염)로 제형화될 수 있다.
본 발명의 방법은 중성 형태 또는 염 형태로 제형화된 조성물의 투여를 포함한다. 약제학적으로 허용되는 염은 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등에서 유래된 음이온과 같은 음이온으로 형성된 염 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화제2철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등에서 유래된 양이온과 같은 양이온으로 형성된 염을 포함한다.
일반적으로, 조성물의 성분들은 별도로 공급되거나 함께 혼합되어 단위 투약 형태, 예컨대 활성 제제의 양을 표시한 앰플이나 사셋과 같은 밀봉 용기 중의 무수 농축물 또는 건조 동결 분말로 공급된다. 투여 방식이 주입이라면, 조성물은 멸균 약제학적 등급 수 또는 식염수를 함유하는 주입 병에 분배될 수 있다. 투여 방식이 주사라면, 투여 전에 성분들을 혼합할 수 있도록 주사용 멸균수 또는 식염수 앰플을 구비할 수 있다.
특히, 본 발명은 본 발명의 약제학적 조성물 또는 하나 이상의 예방제 또는 치료제를 제제의 양을 표시한 앰플 또는 사셋과 같은 밀봉 용기에 포장하여 제공한다. 한 양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물 또는 하나 이상의 예방제 또는 치료제는 건조 멸균, 동결건조된 분말 또는 무수 농축물로서 밀봉 용기에 담아 공급되며, 피검체에게 투여하기에 적당한 농도로 복원(예: 물이나 식염수를 이용하여)될 수 있다. 특히, 본 발명의 약제학적 조성물 또는 하나 이상의 예방제 또는 치료제는 적어도 5mg, 더욱 특히 적어도 10mg, 적어도 15mg, 적어도 25mg, 적어도 35mg, 적어도 45mg, 적어도 50mg, 적어도 75mg, 또는 적어도 100mg의 단위 투약량으로 밀봉 용기에 건조 멸균 동결건조된 분말로서 공급된다. 본 발명의 동결건조된 예방제 또는 치료제 또는 약제학적 조성물은 원 용기에 2℃ 내지 8℃ 사이에서 보관될 수 있고, 본 발명의 예방제 또는 치료제, 또는 약제학적 조성물은 복원된 후 1주 내에, 특히 5일 내에, 72시간 내에, 48시간 내에, 24시간 내에, 12시간 내에, 6시간 내에, 5시간 내에, 3시간 내에 또는 1시간 내에 투여되어야 한다. 대안적 양태에서, 본 발명의 하나 이상의 예방제 또는 치료제 또는 약제학적 조성물은 제제의 양과 농도를 표시한 밀봉 용기에 액체 형태로 공급된다. 특히, 투여 조성물의 액체 형태는 적어도 0.25mg/ml, 더욱 특히 적어도 0.5mg/ml, 적어도 1mg/ml, 적어도 2.5mg/ml, 적어도 5mg/ml, 적어도 8mg/ml, 적어도 10mg/ml, 적어도 15mg/ml, 적어도 25mg/ml, 적어도 50mg/ml, 적어도 75mg/ml 또는 적어도 100mg/ml로 밀봉 용기에 공급된다. 액체 형태는 원 용기에 2℃ 내지 8℃ 사이에서 보관되어야 한다.
본 발명의 항체 및 항체부는 비경구 투여에 적합한 약제학적 조성물에 혼입될 수 있다. 특히, 이 항체 또는 항체부는 0.1 내지 250mg/ml 항체를 함유하는 주사가능 용액으로 제조될 것이다. 주사가능 용액은 플린트 또는 호박색 바이엘, 앰플 또는 예비충진된 주사기에 액체 또는 동결건조된 투약 형태로 구성될 수 있다. 완충액은 L-히스티딘(1-50mM), 경우에 따라 5-10mM, pH 5.0 내지 7.0(최적으로는 pH 6.0)일 수 있다. 다른 적당한 완충액은 석신산나트륨, 시트르산나트륨, 인산나트륨 또는 인산칼륨을 포함하나, 이에 국한되지는 않는다. 염화나트륨은 0-300mM(최적으로는 150mM, 액체 투약 형태에서) 농도로 용액의 독성을 개질시키기 위해 사용될 수 있다. 동결방지제는 동결건조 투약 형태에 포함될 수 있고, 주로 0-10% 수크로오스(최적은 0.5-1.0%)를 포함한다. 다른 적당한 동결방지제로는 트레할로스 및 락토오스를 포함한다. 충전제는 동결건조 투약 형태에 포함될 수 있고, 주로 1-10% 만니톨(최적은 2-4%)이다. 안정제는 액체 및 동결건조 투약 형태 모두에 사용될 수 있고, 주로 1-50mM L-메티오닌(최적은 5-10mM)이다. 다른 적당한 충전제는 글리신, 아르기닌을 포함하고, 0-0.05% 폴리소르베이트-80(최적은 0.005-0.01%)으로 포함될 수 있다. 추가 계면활성제는 폴리소르베이트 20 및 BRIJ 계면활성제를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 비경구 투여용 주사가능 용액으로 제조된 본 발명의 항체 및 항체부를 포함하는 약제학적 조성물은 또한 애주번트로 유용한 제제, 예컨대 치료 단백질(예: 항체)의 흡수 또는 분산을 증가시키는데 사용되는 제제를 포함할 수 있다. 특히 유용한 애주번트는 히알루로니다제, 예컨대 Hylenex®(재조합 사람 히알루로니다제)이다. 주사가능 용액에 히알루로니다제의 첨가는 비경구 투여 후, 특히 피하 투여 후 사람의 생체이용율을 향상시킨다. 또한, 주사 부위 용량을 증대(즉, 1ml 이상)시키고, 통증과 불안을 감소시키며, 주사 부위 반응의 발생빈도를 최소화할 수 있다(참고인용된 WO 2004078140, US2006104968 참조).
본 발명의 조성물은 다양한 형태일 수 있다. 그 예로는 액체, 반고체 및 고체 투약 형태, 예를 들어 액체 용액(예: 주사가능 및 주입가능 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 환제, 분말, 리포좀 및 좌약을 포함한다. 바람직한 형태는 의도한 투여 방식 및 치료 적용에 따라 달라진다. 일반적으로 바람직한 조성물은 주사가능 용액 또는 주입가능 용액의 형태, 예컨대 다른 항체로 사람을 수동 면역화하는데 사용되는 것과 유사한 조성물 형태이다. 특정 투여 방식은 비경구(예: 정맥내, 피하, 복강내, 근육내) 방식이다. 특정 양태에서, 항체는 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여한다. 다른 특정 양태에서, 항체는 근육내 또는 피하 주사로 투여한다.
치료 조성물은 일반적으로 제조 및 보관 조건 하에 멸균성이고 안정해야 한다. 조성물은 용액, 마이크로유탁액, 분산액, 리포좀이나 또는 고농도 약물에 적합한 다른 정렬된 구조로 제형화할 수 있다. 멸균 주사가능 용액은 필요한 양의 활성 화합물(즉, 항체 또는 항체부)을 필요하다면 위에서 열거한 성분 중 하나 또는 여러 성분과 함께 적당한 용매에 혼입시킨 뒤, 여과 멸균하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질과 위에서 열거한 다른 필요 성분을 함유하는 멸균 비히클에 활성 화합물을 혼입시켜 제조한다. 멸균 주사가능 용액을 제조하기 위한 멸균 동결건조 분말의 경우, 특정 제조방법은 사전 멸균여과된 용액으로부터 활성성분 + 임의의 바람직한 추가 성분의 분말을 생산하는 진공 건조 및 분무 건조이다. 용액의 적당한 유동성은 예컨대 레시틴과 같은 코팅을 이용하고, 분산액의 경우에는 필요한 입자 크기를 유지시키고, 계면활성제를 사용하여 유지시킬 수 있다. 주사가능 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예컨대 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 첨가하여 유도할 수 있다.
본 발명의 항체 및 항체부는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 투여할 수 있지만, 많은 치료 용도에서 특정 투여 경로/방식은 피하 주사, 정맥내 주사 또는 주입이다. 당업자라면 이해할 수 있듯이, 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 달라질 것이다. 특정 양태에서, 활성 화합물은 화합물이 빠르게 방출하지 않게 하는 담체로 제조될 수 있고, 그 예로는 제어 방출 제형, 구체적으로 이식체, 경피 패치 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템이 있다. 생체분해성, 생체융화성 중합체가 사용될 수 있고, 그 예로는 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 있다. 이러한 제형을 제조하는 다수의 방법은 특허되어 있거나 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 예컨대, 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참고한다.
특정 양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체부는 예를 들어 불활성 희석제 또는 동화성 식용 담체를 이용하여 경구 투여할 수 있다. 화합물(및 필요한 경우 다른 성분)은 또한 경질 또는 연질 외피의 젤라틴 캡슐에 봉입되거나 정제로 압축되거나 또는 피검체의 식이에 직접 첨가될 수 있다. 경구 치료 투여 시, 화합물은 부형제와 혼합되고 섭취 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 비경구 투여 외에 다른 방식으로 본 발명의 화합물을 투여하기 위해, 화합물은 불활성화 방지 물질로 코팅하거나 불활성화 방지 물질과 함께 공동투여하는 것이 필요할 수 있다.
또한, 보충 활성 화합물을 조성물에 첨가할 수도 있다. 특정 양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체부는 RAGE 활성이 유해한 장애를 치료하는데 유용한 하나 이상의 추가 치료제와 함께 공동제형화되고/되거나 공동투여되기도 한다. 예를 들어, 본 발명의 항-RAGE 항체 또는 항체부는 다른 표적에 결합하는 하나 이상의 추가 항체(예: 사이토킨에 결합하거나 세포 표면 분자에 결합하는 항체)와 공동제형화 및/또는 공동투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 하나 이상의 항체는 전술한 치료제 중 2종 이상과 함께 사용될 수 있다. 이러한 병용 요법은 투여되는 치료제의 투약량을 낮추기 위해 이용할 수 있어, 다양한 단독요법과 관련이 있는 가능한 독성 또는 합병증을 피할 수 있어 유리하다.
특정 양태에서, RAGE에 대한 항체 또는 이의 단편은 당업계에 공지된 반감기 확장 비히클에 연결된다. 이러한 비히클로는 Fc 도메인, 폴리에틸렌글리콜 및 덱스트란이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 비히클은 문헌[예컨대, 미국 특허출원 일련번호 09/428,082 및 PCT 공개번호 WO 99/25044(모든 목적에서 참고인용됨)]에 기술되어 있다.
특정 양태에서, 본 발명의 항체 또는 본 발명의 다른 예방제 또는 치료제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열은 유전자 요법으로 장애 또는 이의 하나 이상의 증상을 치료, 예방, 관리 또는 호전시키기 위해 투여한다. 유전자 요법은 발현된 또는 발현성 핵산을 피검체에게 투여하여 수행하는 치료법을 의미한다. 이러한 양태의 본 발명에서, 핵산은 예방 또는 치료 효과를 매개하는 본 발명의 암호화된 항체 또는 예방제 또는 치료제를 생산한다.
당업계에서 이용가능한 유전자 요법에 대한 모든 방법이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 유전자 요법에 대해 일반적인 검토를 하기 위해서는, 문헌[Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, Science 260:926- 932 (1993); 및 Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; May, 1993, TIBTECH 11(5):155-215]을 참조한다. 사용될 수 있는 재조합 DNA 기술에 대한 당업계에 공지된 방법은 문헌[Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, NY (1993); 및 Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)]에 기술되어 있다. 유전자 요법의 다양한 방법에 대한 상세한 설명은 참고인용된 US 2005 0042664 A1에 개시되어 있다.
RAGE는 본원에서 상기 정의된 바와 같은 다양한 질환과 연관된 병리학에서 중추 역할을 한다. 아밀로이드 Aβ-펩타이드의 동물로의 주입은 세동맥에서 염증 반응과 같은 반응을 유도하고 뇌혈류를 감소시킨다. 이들 효과는 RAGE에 대한 항체에 의해 방지될 수 있다[문헌참조: Rhodin, J. et al. World Congress for Microcirculation, submitted Papers, 7th, Sydney, Australia, Aug. 19-22, 2001, 543-547; Deane et al. Nature med. 2003]. RAGE는 AD 환자 및 사람 APP 유전자가 과발현되는 유전자전이 마우스에서 상향조절된다(문헌참조: Deane et al. Nature med. 2003). 사람 APP 유전자가 발현되고 RAGE가 과발현되는 이중-유전자전이 마우스를 사용하여 정상적인 RAGE 유전자의 과발현이 학습 손상을 유발하고 플라크를 증가시키는 반면 우성-음성 시그널 전달된 결손 RAGE 변이체의 과발현은 학습을 개선시키고 플라크 수준을 저하시켰음을 밝혔다(문헌참조: Arancio et al. 2004 EMBO J. 2004). 1형 및 2형 당뇨병 둘다의 동물 모델에서의 실험은 리간드-RAGE 축의 길항작용이 당뇨병에서 혈관 세포 및 염증 세포 교란의 발생 및 진행을 억제함을 밝힌다. 예를 들어, RAGE 녹아웃 마우스 및 항-RAGE 항체를 사용하여 예를 들어, 동물 모델에서 당뇨병성 신증이 개선됨이 밝혀졌다[문헌참조: Ravichandran R. et al CANADIAN JOURNAL OF DIABETES. 2006;30(4):422, Myint Khin et al. Diabetes (2006), 55(9), 2510; De-Vriese et al. Journal of the American Society of Nephrology 2003, 14/8, 2109, Jensen et al. Renal effects of a neutralising RAGE-antibody in long-term streptozotocin-diabetic mice. The Journal of endocrinology, 2006, 188, 493]. 비만 2형 당뇨병 마우스에서 중화 RAGE 항체의 양성 장기 신장 효과는 문헌[참조: Flyvbjerg et al (Diabetes, 2004, 53, 1, p. 166-72)]에 의해 밝혀졌다. RAGE 녹아웃 마우스의 사용은 패혈증에 RAGE가 관여함을 보여주었다(문헌참조: Birgit Liliensiek et al. J Clin Invest. 2004 June 1; 113(11): 1641-1650; Receptor for advanced glycation end products (RAGE) regulates sepsis but not the adaptive immune response). 항-RAGE IgG로부터 유래된 차단 F(ab)2 단편은 MOG 또는 MBP 유도된 EAE에서 염증 반응을 감소시킨다(문헌참조: Yan, S. S., et al. 2003. Nat. Med. 9:287-293). 암에서 RAGE의 관여는 문헌(참조: Abe-R et al. Journal of Investigative Dermatology, 2004, 122/2 (461-467)에 의해 밝혀졌다. 종양 보유 마우스에서, 생존율은 연장되었고 자발적 폐 전이는 항-RAGE 중화 항체를 사용한 치료에 의해 억제되었다.
본 발명의 항체 또는 항체부를 사용하여 이러한 질병을 겪고 있는 사람을 치료할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원결합부는 단독으로 또는 추가 제제, 예컨대 치료제와 함께 사용될 수 있는 이해되어야 하고, 상기 추가 제제는 당업자라면 의도된 목적에 맞게 선택할 수 있다. 예를 들어, 추가 제제는 본 발명의 항체로 치료되는 질환 또는 상태를 치료하는데 유용한 것으로 당업계에 인식되어 있는 치료제일 수 있다. 또한, 추가 제제는 치료 조성물에 유익한 속성을 부여하는 제제, 예컨대 조성물의 점도에 영향을 미치는 제제일 수 있다.
또한, 본 발명에 포함되어야 하는 배합물은 의도된 목적에 유용한 배합물인 것으로 이해되어야 한다. 앞에 제시한 제제들은 목적에 따라 예시적인 것이며 제한하려는 것이 아니다. 본 발명의 일부인 배합물은 본 발명의 항체와 앞의 목록 중에서 선택되는 적어도 하나의 추가 제제일 수 있다. 또한, 배합물은 형성된 조성물이 의도한 기능을 수행할 수 있을 정도의 배합이면 하나보다 많은 추가 제제, 예컨대 2종 또는 3종의 추가 제제를 포함할 수도 있다.
본 발명의 항체 또는 항체부와 병용될 수 있는 다발성 경화증 치료제의 비제한적 예로는, 코르티코스테로이드(corticosteroid); 프레드니솔론(prednisolone); 메틸프레드니솔론(methylprednisolone); 아자티오프린(azathioprine); 사이클로포스파미드(cyclophosphamide); 사이클로스포린(cyclosporine); 메토트렉세이트(methotrexate); 4-아미노피리딘; 티자니딘(tizanidine); 인터페론-β1a(Avonex; Biogen); 인터페론-β1b(Betaseron; Chiron/Berlex); 인터페론 α-n3) (Interferon Sciences/Fujimoto), 인터페론-α (Alfa Wassermann/J&J), 인터페론 β1A-IF (Serono/Inhale Therapeutics), 페그인터페론 α 2b (Enzon/Schering-Plough), 코폴리머 1 (Cop-1; Copaxone; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.); 고압 산소; 정맥내 면역글로불린; 클라드리빈; 다른 사람 사이토킨 또는 성장 인자에 대한 항체 또는 그에 대한 길항제 및 수용체, 예컨대 TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-23, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF, 및 PDGF를 포함한다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원결합부는 세포표면분자에 대한 항체, 예컨대 CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 또는 이들의 리간드와 병용될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원결합부는 제제, 예컨대 메토트렉세이트, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 미코페놀레이트 모페틸, 레플루노마이드, NSAID, 예컨대 이부프로펜, 코르티코스테로이드, 예컨대 프레드니솔론, 포스포디에스테라제 억제제, 아데노신 작용물질, 항트롬빈제, 보체 억제제, 아드레날린성 제제, 염증촉진성 사이토킨, 예컨대 TNFα 또는 IL-1에 의한 시그널링을 방해하는 제제(예: IRAK, NIK, IKK, p38 또는 MAP 키나제 억제제), IL-1β 변환 효소 억제제, TACE 억제제, T-세포 시그널링 억제제, 예컨대 키나제 억제제, 메탈로프로테이나제 억제제, 설파살라진, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린, 안지오텐신 변환 효소 억제제, 가용성 사이토킨 수용체 및 이의 유도체(예: 가용성 p55 또는 p75 TNF 수용체, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R) 및 항염증성 사이토킨(예: IL-4, IL-10, IL-13 및 TGFβ)과 병용할 수 있다.
항체 또는 이의 항원결합부와 병용할 수 있는 다발성 경화증의 바람직한 치료제로는 예컨대 인터페론-β, 예컨대 IFNβ1a 및 IFNβ1b; 코팍손, 코르티코스테로이드, 카스파제 억제제, 예컨대 카스파제-1 억제제, IL-1 억제제, TNF 억제제 및 CD40 리간드 및 CD80에 대한 항체가 포함된다.
특히, 본 발명의 결합 단백질 및 항체를 사용하여 아밀로이드증, 예를 들어, 알츠하이머 질환 및 다운 증후군을 치료할 수 있다. 본 발명의 결합 단백질 및 항체를 단독으로 또는 상기 질환중 하나를 치료하는데 적합한 하나 이상의 추가의 제제와 함께 사용될 수 있는 것으로 이해되어야만 한다. 상기 하나 이상의 추가 제제는 이의 의도된 목적을 위해 당업자가 선택할 수 있다. 예를 들어, 당해 추가의 제제는 치료제, 예를 들어 콜레스테리나제 억제제 (예를 들어, 타크트린, 도네페질, 리바스티그민 또는 갈란타민), 부분 NMDA 수용체 차단제 (예를 들어, 메만틴), 글리코사미노글리칸 모사체(예를 들어, 알체메드), 감마 세크레타제의 억제제 또는 알로스테릭 조절제(예를 들어, R-플루르비프로펜), 황체 호르몬 차단 고나도트로핀 방출 호르몬 효능제(예를 들어, 류프로렐린), 세로티닌 5-HT1A 수용체 길항제, 켈라틴제, 뉴런 선택적 L-형 칼슘 채널 차단제, 면역조절제, 아밀로이드 섬유생성 억제제 또는 아밀로이드 단백질 침적 억제제(예를 들어, M266), 또 다른 항체(예를 들어, 바피뉴주마브), 5-HT1A 수용체 길항제, PDE4 억제제, 히스타민 효능제, 최종 당화 산물에 대한 수용체 단백질, PARP 자극제, 세로토닌 6 수용체 길항제, 5-HT4 수용체 효능제, 사람 스테로이드, 신경세포 대사를 증진시키는 글루코스 흡수 자극제, 선택적 CB1 길항제, 벤조디아제핀 수용체에서 부분 효능제, 아밀로이드 베타 생성 길항제 또는 억제제, 아밀로이드 베타 침적 억제제, NNR 알파-7 부분 길항제, 치료학적 표적화 PDE4, RNA 해독 억제제, 무스카린 효능제, 신경 성장 인자 수용체 효능제, NGF 수용체 효능제 및 유전자 치료 조절제(즉, 본 발명의 항체 또는 결합 단백질에 의해 치료되는 질환 또는 병태를 치료하는데 유용한 것으로서 현재 인정되고 있는 제제들 또는 향후 인정될 제제일 수 있다). 추가의 제제는 또한 치료학적 조성물에 이로운 성질을 부여하는 제제, 예를 들어, 조성물의 점도에 영향을 주는 제제일 수 있다.
또한, 본 발명의 항체 또는 이의 항원결합부는 알레투주마브, 드로나비놀, 유니메드, 대클리주마브, 미토잔트론, 잘리프로덴 염산염, 팜프리딘, 글라티라머 아세테이트, 나탈리주마브, 신나비돌, a-이뮤노킨 NNSO3, ABR-215062, AnergiX.MS, 케모킨 수용체 길항제, BBR-2778, 칼라구알린, CPI-1189, LEM(리포좀 캡슐화된 미토잔트론), THC.CBD(카나비노이드 작용물질) MBP-8298, 메소프람(PDE4 억제제), MNA-715, 항-IL-6 수용체 항체, 뉴로박스, 피르페니돈 알로트랩 1258(RDP-1258), sTNF-R1, 탈람파넬, 테리플루노미드, TGF-베타2, 티플리모티드, VLA-4 길항제(예컨대, TR-14035, VLA4 Ultrahaler, Antegran-ELAN/Biogen), 인터페론 감마 길항제, IL-4 작용물질과 병용할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명의 항체 또는 항체부의 "치료학적 유효량" 또는 "예방학적 유효량"을 포함할 수 있다. "치료학적 유효량"은 원하는 치료 결과를 달성하는데 필요한 투약량에서 필요한 시간 기간 동안의 효과적인 양을 의미한다. 항체 또는 항체부의 치료학적 유효량은 당업자에 의해 결정될 수 있고, 질병 상태, 연령, 성별 및 개체의 체중, 및 개체에서 항체 또는 항체부가 원하는 반응을 유인하는 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 치료학적 유효량은 또한 치료학적 유익 효과가 항체 또는 항체부의 임의의 독성 또는 유해 효과를 능가하는 것이다. "예방학적 유효량"은 원하는 예방 효과를 달성하는데 효과적인 양, 투약량 및 필요한 시간 동안을 의미한다. 일반적으로, 예방 용량은 질병 전이나 초기에 피검체에게 사용되기 때문에, 예방학적 유효량은 치료학적 유효량보다 적을 것이다.
투약 계획은 원하는 최적 반응(예: 치료학적 또는 예방학적 반응)을 제공하도록 조정할 수 있다. 예를 들어, 단일 일시 투여할 수도 있고, 여러 분할 용량은 경시적으로 투여할 수도 있으며, 또는 치료 상황의 위급에 따라 제시된 바와 같이 비례적으로 감소 또는 증가시킬 수도 있다. 특히 투여 용이 및 투약량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 투약 단위 형태로 제형화하는 것이 유리하다. 본 명세서에 사용된 투약 단위 형태는 치료할 포유동물 피검체에게 단위 투약량으로서 적합한 물리적 분리 단위를 의미한다; 각 단위는 필요한 약제학적 담체와 연계하여 원하는 치료 효과를 생산하는 것으로 계산된 소정량의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 투약 단위 형태의 세부사항은 (a) 활성 화합물 고유의 특징 및 달성해야 하는 특별한 치료 또는 예방 효과, 및 (b) 개체의 민감성을 치료하기 위한 상기 활성 화합물을 배합하는 기술에 고유한 한계에 의해 조정되고 직접 좌우된다.
본 발명의 항체 또는 항체부의 치료학적 또는 예방학적 유효량에 대한 예시적인, 비제한적 범위는 0.1-20 mg/kg, 더욱 특히 1-10 mg/kg이다. 투약량 값은 경감되어야 하는 상태의 종류 및 중증도에 따라 달라질 수 있다는 것을 유념해야 한다. 또한, 임의의 특정 피검체에서 구체적인 투약 계획은 개체의 필요와 조성물을 투여하거나 투여를 감독하는 사람의 전문적인 판단에 따라 경시적으로 조정되어야 하고 본 명세서에 제시된 투약량 범위는 단지 예시적인 것으로, 청구하는 조성물의 범위 또는 실행을 제한하려는 것이 아니라는 것이 이해되어야 한다.
당업자에게는 본 명세서에 기술한 본 발명의 방법의 다른 적당한 변형 및 수정이 명백하며, 본 발명의 범위 또는 본 명세서에 개시된 양태를 벗어나지 않고 적당한 등가물을 이용하여 제조할 수 있다는 것을 잘 알고 있을 것이다. 이제 본 발명을 상세하게 설명했지만, 이하 예시적 목적으로 포함되는, 본 발명을 제한하려는 것이 아닌 다음 실시예를 참조로 하면 더 분명하게 이해될 것이다.
실험 부분
실시예 1: 바람직한 항- huRAGE 항체
1.1 하이브리도마 및 항체의 제조
4 내지 6주령의 Balb/c 및 A/J 마우스를 면역화시키고 사람 RAGE로 피하내 부스팅하였다. 동물에게 3주 마다 주사하는데 1차로 완전 프로인트 보조제 중의 30 μg을 주사하기 시작하여 불완전 프로인트 보조제 중의 30 μg의 부스트를 주사하였다. 융합을 위해 선택된 마우스에 융합 4일 전에 식염수 중의 10 μg hRAGE를 정맥내 주사하였다. 면역화된 동물 기원의 비장을 제거하고 단일 세포 현탁액을 제조하였다. SP2/0 골수종 세포를 배양물로부터 수거하고 세척하였다. 비장 세포 및 종양 세포를 5:1의 비로 혼합하고 표준 기술을 사용하여 50% PEG 3000으로 융합시켰다(문헌참조: Kohler and Milstein, 1975). 융합 세포를 선택 배지에서 웰당 2.5 x 105 비장 세포의 밀도로 96웰 플레이트에 분주하였다. 7 내지 10일 동안 37℃에서 융합체를 배양하였다. 육안으로 콜로니가 관찰되는 경우 상청액을 제거하고 hRAGE ELISA에서 시험하였다.
목적하는 특성을 갖는 mAb를 생성하는 하이브리도마를 제한 희석 방법에 의해 서브클로닝하였다. 서브클론을 함유하는 상청액을 hRAGE에 결합하는 것에 대해 ELISA로 분석하였다. mAb의 중쇄 및 경쇄 서브클래스는 Zymed EIA Isotyping 키트를 사용하여 결정하였다.
1.2. 각각의 쥐 항-사람 RAGE mAb 에 대한 가변 영역의 아미노산 서열의 결정.
각각의 아미노산 서열 결정을 위해, 대략 10 x 106 하이브리도마 세포를 원심분리기로 분리하고 트리졸(Gibco BRL/Invitrogen, CA.)을 사용하여 제조업자의 지시에 따라 프로세싱하여 총 RNA를 분리하였다. 총 RNA를 제조업자의 지침에 따라 슈퍼스크립트 제1쇄 합성 시스템(Invitrogen, CA)을 사용하여 제1 쇄 DNA 합성에 적용하였다. 올리고(dT)를 사용하여 제1 쇄 합성을 프라이밍하여 폴리(A)+ RNA에 대해 선택하였다. 이어서 제1쇄 cDNA 생성물을 쥐 면역글로불린 가변 영역의 증폭용으로 디자인된 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시켰다(Ig-Primer Sets, Novagen, WI). PCR 생성물을 아가로스 겔상에서 분리하고 절개하고 정제한 다음 TOPO 클로닝 키트를 사용하여 pCR2.1-TOPO 벡터(Invitrogen, CA)에 서브클로닝하고 TOP10 화학적 컴피턴트 이.콜라이(Invitrogen, CA)에 형질전환시켰다. 콜로니 PCR을 형질전환체에 대해 수행하여 삽입체를 함유하는 클론을 동정하였다. 플라스미드 DNA를 QIAprep Miniprep 키트(Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 삽입체를 함유하는 클론으로부터 분리하였다. 플라스미드내 삽입체를 2개의 쇄에 대해 M13 정방향 및 M13 역방향 프라이머(Fermentas Life Sciences, Hanover MD)를 사용하여 서열분석함으로써 가변 중쇄 또는 가변 경쇄 DNA 서열을 결정하였다. 3개의 모노클로날 항체 7F9, 11E6 및 4E5의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열 및 이들의 3개의 가변 중쇄 CDR 및 3개의 가변 경쇄 CDR을 상기 표 4에 나타낸다.
1.3. 재조합 항 사람 RAGE 항체의 작제 및 발현
쥐 항-사람 RAGE 모노클로날 항체 7F9, 11E6 및 4E5의 중쇄 불변 영역을 암호화하는 DNA를 세균에서 상동 재조합에 의해 사람 IgG1 불변 영역을 암호화하는 cDNA 단편으로 대체하였다. 이들 항체 각각의 경쇄 불변 영역은 사람 카파 불변 영역으로 대체하였다(상기 표 1). 전장 키메라 항체를 pBOS 또는 pTT3 발현 플라스미드로 연결된 키메라 중쇄 및 경쇄 cDNA의 동시형질감염에 의해 COS 세포 또는 293 세포에서 일시적으로 발현시켰다(문헌참조: Mizushima and Nagata, Nucleic Acids Research 1990, Vol 18, pg 5322). 재조합 키메라 항체를 함유하는 세포 상청액을 단백질 A 세파로스 크로마토그래피로 정제하고 결합된 항체를 산 완충액의 첨가로 용출시켰다. 항체를 중화시키고 PBS로 투석하였다.
1.4. 재조합 항-사람 RAGE mAb 및 하이브리도마 유래된 항-사람 RAGE mAb 의 ELISA 결합.
정제된 키메라 항-사람 RAGE 모노클로날 항체는 경쟁 ELISA에서 사람 RAGE에 결합하는 이들의 능력에 대해 시험하였다. 재조합 키메라 항-사람 RAGE 모노클로날 항체 또는 하이브리도마 유래 항-사람 RAGE 모노클로날 항체를 PBST + 10% Superblock (Pierce Biotech, Rockford, IL) 중에 희석시키고 320 μg/mL 내지 0.0156 μg /mL (7F9 및 11E6) 및 160 μg /mL 내지 0.0078 μg /mL (4E5) 범위에 이르는 다양한 농도로 2x 스톡으로 구성하였다. 비오티닐화된 하이브리도마 유래 항-사람 RAGE 모노클로날 항체(7F9-비오틴, 1lE6-비오틴 및 4E5-비오틴)를 PBST+10% Superblock 중의 8 μg /mL로 제조하였다. 각각의 재조합 키메라 항-사람 RAGE 모노클로날 항체 또는 하이브리도마 유래 항-사람 RAGE 모노클로날 항체 및 각각의 상응하는 비오티닐화된 하이브리도마 유래된 항-RAGE mAb의 동등한 용적(50 μL)를 혼합하였다. 50 μL의 당해 혼합물을 이어서 2 μg/mL의 재조합 사람 RAGE로 사전에 피복된 ELISA 플레이트에 첨가하고 실온에서 1.5시간 동안 항온처리하였다. 웰을 PBS+ 0.05% Tween-20으로 3회 세척하였다. 스트렙타비딘 HRP (1 mg/mL)를 PBST + 10% Superblock 중에서 1:16000으로 희석시키고; 50 L/웰을 첨가하고 당해 플레이트를 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 PBS+ 0.05% Tween-20으로 3회 세척하였다. 50 μL의 TMB 용액(Sigma, St Louis, MO)을 각각의 웰에 첨가하고 실온에서 10분 동안 항온처리하였다. 당해 반응을 1N 황산을 첨가하여 종료시켰다. 플레이트를 450nm에서 분광측정으로 판독하였다. 결과를 도 1A, 1B 및 1C에 나타내었다.
실시예 2: 재조합 사람 sRAGE ( husRAGE )의 제조
재조합 husRAGE 단백질 293/6.1 sRAGE His 6을 HEK293 세포 (ATCC CRL- 1573)에서 발현시키고 정제하였다. 안정한 발현을 위해 사용되는 발현 벡터는 "pcDNA3 (-) 6.1 C HIS A"이었다.
분자 생물학적 표준 기술은 문헌[참조: Sambrook and Russel (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2001)]에 따라 사용하였다. 사람 림프구(PBL)로부터 총 RNA를 Superscript RT-PCR 시스템 (Invitrogen, Carlsbad USA)을 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. 올리고뉴클레오타이드 프라이머 RAGE-SE : CCG AAT TCC GGA AGC AGG ATG GCA GCC G (서열번호 81) 및 RAGE-AS: CCC TCG AGC CCC TCA AGG CCC TCA GTA CTA CT (서열번호 82)를 사용하여, RAGE cDNA를 상기 수득된 cDNA로부터 증폭시켜 참조 서열 NM-001136에 기재된 바와 같은 RAGE cDNA를 수득하였다. PCR-단편을 아가로스 겔상에서 전개시키고 정제하고 QIAquick 겔 추출 키트(Qiagen GmbH, Germany)를 사용하여 추출하였다. 이후에 cDNA를 제한 엔도뉴클레아제 EcoR1 및 XhoI를 사용하여 절단하였다. 수득한 단편을 겔 정제하고 XhoI/EcoR1으로 미리 절단시킨 벡터 pcDNA3(Invitrogen, USA)에 연결하였다. 이.콜라이 XL-I 블루 세포(Invitrogen, USA)내로 형질전환시킨 후 양성 재조합 클론을 동정하였다. 당해 클론의 서열을 입증하고 pcDNA3/RAGE 2.6 플라스미드 DNA를 플라스미드 소형 키트(Qiagen, Germany)를 사용하여 분리하였다. RAGE, husRAGE의 세포외 부분에 대한 암호화 영역을 PCR 및 프라이머 N-SE A: AGT AAC GGC CGC CAG TGT GCT GGA ATT CGG A (서열번호 83) 및 C-SE B: CCG GTA CCA CCT GCA GTT GGC CCC TCC TCG CC (서열번호 84)를 사용하여 pcDNA3/RAGE 2.6로부터 증폭시켰다. 수득한 PCR 생성물을 제한 엔도뉴클레오아제 EcoR1 및 Kpn1으로 절단시키고 상기된 바와 같이 겔 정제하고 EcoR1/Kpn1으로 미리 절단시킨 "pcDNA3.1(-) Myc HIS" (Invitrogen, USA)에 연결하였다. 수득한 플라스미드 "pcDNA 3 (-) 6.1 C HIS A"를 제조업자의 지시에 따라 Superfect (Qiagen, Germany)를 사용하여 HEK293 세포내로 형질감염시켰다. 내성 세포의 선별은 MEM 배지 (#M4528, Sigma, Germany) + 10% FCS, 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린/스트렙타비딘 (Invitrogen, USA) 중의 800 μg/ml G418를 사용하여 수행하였다. 세포 현탁액의 연속 희석을 통한 단일 세포의 클로닝은 RAGE 특이적 항체 (Santa Cruz; # sc5563)를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 확인된 바와 같이 세포 배양 배지로 husRAGE를 분비하는 클론 "293/6.1 sRAGE His 6"을 동정하게 하였다. 충분한 양의 husRAGE 단백질의 발현 및 정제를 위해 당해 클론을 세포 공장(Nunc, Germany)에서 혈청 함유 세포 배양 배지(상기 참조) 중에 성장시켰다. 이어서 세포를 무혈청 배지 Pro293a-CDM (#12-764Q, BioWhittaker, Belgiun)로 전환시키고 37℃에서 3일 동안 배양하였다. 80리터의 세포 부재 배지를 수거하고 Hemoflow F-Series High-Flux 칼럼 (Fresenisus Medical Care AG, Germany)을 사용하여 1400 ml의 용적으로 농축시켰다.
단백질 정제는 킬레이션을 위한 고정화 금속 이온 친화성 크로마토그래피 (IMAC)(Diarect AG (Freiburg, Germany)) 및 세파로스 FF(Amersham-Bioscience, Sweden)를 사용하여 수행하였다. 칼럼의 평형화 및 세포 상청액으로부터 매트릭스로의 hexa-His 함유 단백질의 결합은 제조업자의 지침에 따라 수행하였다. 단백질의 용출은 증가하는 이미다졸 농도를 사용한 농도 구배 단계를 사용하여 수행하였다. 용출된 분획을 웨스턴 블롯 및 항 HIS 항체를 사용하여 hexa-His를 함유하는 단백질에 대해 분석하였다. 정제된 husRAGE는 250-500 mM 이미다졸에서 특이적으로 용출되었다. 양성 분획을 합하고 농축시키고 PBS (2 x 4시간, 1 x 16시간)에 대해 3회 투석하였다.
사람 RAGE의 처음 101개 아미노산이 소실된 N-말단 축소된 버전의 husRAGE (102-331-sRAGE-HIS)를 husRAGE 단백질에 대해 상기된 분자 생물학에서의 표준 기술에 의해 제조하였다. 당해 단백질은 husRAGE(1-331)를 위해 사용된 것과 동일한 기본 과정에 의해 제조하였다. 상기된 플라스미드(pcDNA3/RAGE 2.6) 및 2개의 프라이머(CGA AGC TTG ATG AAC AGG AAT GGA AAG GAG ACC AAG (서열번호 85) 및 TCC TCG AGC ACC TGC AGT TGG CCC CTC CTC GCC T (서열번호 86))를 사용하여 husRAGE에 대해 보다 축소된 버전의 DNA를 PCR로 증폭시켰다. 아가로스 겔 및 단편의 용출 후 수득한 순수 단편을 제한 엔도뉴클레아제 HindIII 및 XhoI로 절단시키고 아가로스 겔 및 용출을 사용하여 다시 정제하였다. 당해 단편을 제한 엔도뉴클레아제 HindIII 및 XhoI로 미리 절단시킨 psecTAG 2A (Invitrogen, USA)에 연결하였다. 이.콜라이 "TOP10 One Shot" 세포 (Invitrogen, USA)내로 형질전환시킨 후 양성 클론을 집어내고 플라스미드 DNA를 분리하였다. 발현 벡터내 DNA를 Freestyle 발현 시스템(Invitrogen, USA)을 사용하여 HEK293 F 세포내로 형질감염시켰다. 96시간의 발현 후, 세포 부재 상청액을 Ni-NTA Superflow 비드 (Quiagen, Germany)를 사용하는 정제를 위해 사용하였다. 평형화 및 결합은 제조업자의 지침에 따라 수행하였다. 결합된 단백질은 완충액(PBS, 160 mM NaCl, 150 mM 이미다졸, pH8.0) 중에서 용출시켰다. 단백질 함유 분획을 합하고 TBS (Tris-완충 식염수; pH 7,4)에 대해 4℃에서 밤새 투석하였다. 정제된 husRAGE (102-331) 농도는 분광측정으로 측정하였다.
사람 RAGE의 아미노산 130번 이후의 아미노산이 소실된 C-말단 축소된 버전의 husRAGE-융합 단백질(1-130-sRAGE-Fc)을 husRAGE 단백질에 대해 상기된 바와 같은 분자 생물학에서의 표준 기술에 의해 제조하였다. 상기된 플라스미드(pcDNA3/RAGE 2.6) 및 2개의 프라이머(GCACCATGGCAGCCGGAACAGCAGTTG (서열번호 87) 및 GAGTCTCGAGGCAGAATCTACAATTTCTG (서열번호 88))를 사용하여 보다 축소된 버전의, husRAGE에 대한 DNA를 PCR로 증폭시켰다. 단편의 아가로스 겔 및 용출 후 수득한 순수한 단편을 제한 엔도뉴클레아제 NcoI 및 XhoI로 절단시키고 아가로스 겔 및 용출을 사용하여 다시 정제하였다. 당해 단편을 이어서 제한 엔도뉴클레아제 NcoI 및 XhoI로 미리 절단시킨 플라스미드 pENTR4에 연결하였다. 연결 혼합물을 이.콜라이 "TOP10 One Shot" 세포(Invitrogen, USA)내로 형질전환시켜 pENTR4-RAGE 1-130을 생성하였다. 양성 클론을 집어내고 플라스미드 DNA를 분리하였다. 부위 특이적 재조합 및 게이트웨이 클로닝 시스템(gateway cloning system) (Invitrogen, Carlsbad, USA; attL x attR)을 클론 pENTR4 hRAGE 1-130의 DNA 및 벡터 pcDNA3.1(+)Zeo hIgG 람다 hc 257-Stop과 함께 사용하여 "TOP10 One Shot" 세포(Invitrogen, USA)내로의 형질전환 및 정제 후 husRAGE-1-130-Fc를 암호화하는 플라스미드(pEXP hRAGE 1-130/hIgG lambda hc 257-Stop로 불리우는 플라스미드)를 작제하였다(하기 참조). Freestyle 발현 시스템 및 293F 세포를 사용하는 당해 플라스미드의 발현(실시예 2.1) 및 단백질 G 비드를 사용하는 세포 상청액으로부터 수득한 단백질의 정제(실시예 2.2)로 95 % 초과의 순도를 갖는 단백질을 수득하였다.
실시예 3: pcDNA3 .1(+)Zeo hIgG lambda hc 257- Stop 의 작제
2개 올리고뉴클레오타이드 프라이머 (gtacgatatcgagggacgaatggatccaccgtgcccagcacc (서열번호 91); ctagtctagatcatttacccggagacagggag (서열번호 92))를 사용하여 PCR(폴리머라제 연쇄 반응)에서 EasyA 폴리머라제를 사용하는 사람 태반 cDNA 라이브러리 (Clontech # HL5014a)로부터 hIgG 람다 중쇄에 대한 DNA 서열을 증폭시켰다. 수득한 DNA를 겔 정제하고(상기된 바와 같이), 제조업자의 지침에 따라 pcDNA3.1 V5-His TOPO Vektor (pcDNA3.1/V5/His TOPO TA 발현 키트 Invitrogen #K4800-01)내로 클로닝시키고 상기된 바와 같이 이.콜라이 TOP10 세포내로 형질전환시켰다. 양성 클론을 동정하고 수득한 플라스미드 DNA(명칭: pcDNA3.1(V5His) FC/hIgG lambda hc Nr.2/7)는 PCR 및 올리고뉴클레오타이드 프라이머(gtacgatatcgagggacgaatggatccaccgtgcccagcacc (서열번호 93); ctagtctagatcatttacccggagacagggag (서열번호 94))를 사용하여 정제하였다. DNA의 hIgG lambda hc 부분을 증폭시키고, EcoRV/XbaI로 절단시키고 EcoRV/XbaI로 미리 절단된 pcDNA3.1(+)Zeo 벡터 DNA로 연결시키고 이.콜라이 TOP10 세포내로 형질전환시켰다. 수득한 플라스미드를 다음과 같이 명명하고: pcDNA3.1(+)Zeo hIgG lambda hc 257-Stop 면역글로불린 IgG 중쇄의 C-말단 부분 프레임에 N-말단 융합된 단백질을 발현시키기 위한 추가의 연구를 위해 사용하였다.
3.1. 형질감염 및 HEK293F 세포에서 단백질의 발현
Free Style 293 발현 배지에서 2 내지 3일 동안 배양물에서 성장시킨 HEK 293F 세포를 400g에서 원심분리시키고 상청액을 버렸다. 세포 펠릿을 배지에 재현탁시키고 28ml의 새로운 배지에서 3 x 107 세포로 조정하고 125ml의 삼각 플라스크로 옮기고 형질감염 혼합물이 설정될때까지 150rpm의 회전 진탕기상에서 37℃, 8% CO2에서 배양기에서 배양하였다.
293fectin-DNA 복합체와의 형질감염 혼합물을 다음과 같이 설정하였다:
(i) 30 μg의 DNA를 Opti-MEM I로 희석시켜 총 1000 μl 용적이 되게 하고(대조군 1000 μl의 Opti-MEM I) 혼합하였다.
(ii) 35 μl의 293fectin (Invitrogen #12347-019; 1mL)을 Opti-MEM I으로 희석시켜 총 용적이 1000 μl이 되게 하고, 혼합하고 실온에서 5분 동안 항온처리하였다.
(i) 및 (ii)로부터의 DNA 혼합물 및 239fectin-용액을 새로운 튜브로 옮기고 약하게 혼합하고 25분 동안 실온에서 항온처리한 후 삼각플라스크 중의 세포에 첨가하였다.
세포를 150rpm에서 회전 진탕기상에서 37℃, 8% CO2에서 나타낸 시간 동안 당해 형질감염 혼합물로 항온처리하였다. 세포 상청액을 10분 동안 400g에서 원심분리하여 수거하였다.
3.2. 단백질 G- 세파로스를 사용한 RAGE - Fc 융합 단백질의 정제
세포 상청액 기원의 단백질을 비드에 커플링시키기 위해, 비드(단백질 G-세파로스 4 Fast Flow (Amersham Bioscience))를 PBS 중에 현탁시키고 13,500rpm에서 원심분리하고 상청액을 버려 3회 세척하였다. 비드를 실온에서 회전기상에서 1 내지 2시간 동안 커플링시키기 위해 각각의 세포 상청액(ml 비드당 300ml의 세포 상청액)과 항온처리하였다. 당해 비드를 PBS로 3회 세척하고 4℃에서 12시간 또는 밤새동안 세포 상청액으로 항온처리하였다. 항온처리 후 비드를 상기된 바와 같은 PBS로 3회 세척하였다. 결합된 단백질은 200 μl 14OmM NaCl + 0.1M 글라이신을 비드 펠릿에 첨가하고 회전기상에서 30분 동안 항온처리함에 의해 용출시켰다. 원심분리 후 2M Tris를 첨가하여 pH를 7.1 내지 pH 7.4로 조정함에 의해 당해 상청액을 즉시 중화시켰다. 비드 펠릿을 버린다. 수득된 프로브를 PBS에 대해 투석하고 -20℃에서 분액으로 동결 저장하였다. RAGE의 완전한 세포외 엑토도메인을 함유하는 RAGE-Fc 융합 단백질을 R&D 시스템(no. 1145-RG; 재조합 사람 RAGE/Fc Chimera)으로부터 수득하였다.
3.3. 비-변성 형태의 RAGE 의 펩타이드 또는 단편에 대한 항체의 도트 블롯 결합.
도트 블롯을 사용하여 비변성 형태의 RAGE의 펩타이드 또는 단편으로의 항체의 결합을 평가하였다. 사용된 단백질은 sRAGE-단백질(1-331 sRAGE-HIS) 또는 N-말단 축소된 버전 (102-331-sRAGE-HIS)이다. 펩타이드를 주문하여 유리 카복실 말단을 함유하는 표준 방법(Fmoc/tBu-화학을 사용하는 AMS 222 합성기상의 고형상 펩타이드 합성)에 따라 Biotrend에 의해 합성하였다. 펩타이드는 HPLC-정제하고 각각의 펩타이드의 순도 분석은 RP-HPLC를 사용하여 수행하였다. 모든 펩타이드는 80% 초과의 순도를 가졌다. 펩타이드의 실체를 질량 분광분석기로 확인하였다.
사용된 펩타이드는 사람 RAGE 단백질의 세포외 영역에 걸쳐있는 30량체였다. 대부분의 펩타이드의 순 전하(net charge)는 유사하였다.
Figure pat00009
1xPBS 중의 1 μl의 용적에서 상이한 양의 단백질/펩타이드(30 ng, 10 ng, 3 ng, 1 ng, 0.3 ng, 0.1 ng, 0.03 ng, 및 0.01 ng)로 이루어진 도트를 Hybond-ECL 니트로셀룰로스 막(Amersham, RPN68D)상에 2중으로 점적하였다. 막을 건조시키고 웨스턴 차단 시약 (Roche, no. 1921673)과 함께 실온에서 1시간 동안 막을 진탕시킴에 의해 비특이적 결합을 차단하였다. 차단 시약을 버리고 막을 7.14 nM의 농도에서 항체와 항온처리하였다(실온에서 1시간 진탕). 모노클로날 항체는 ML37-7F9, ML37-11E6, ML37-4E5 및 R&D 시스템으로부터 시판되는 항체(예를 들어, AF1145)이다. 블롯을 1 x PBS로 4회(각각 실온에서 진탕과 함께 5분 항온처리) 세척하였다. 이어서 블롯을 웨스턴 차단 시약 (Roche, no. 192173) 중에서 1:2000로 희석된 염소 항 마우스 IgG AP 2차 항체(Sigma no. A-7434)로 항온처리하였다. 1시간 동안의 항온처리는 이전과 같다(진탕, 실온). 필터를 1xPBS 중에서 4회(각각 5분) 세척하였다. 시그널은 제조업자의 지침에 따라 NBT/BCIP 기질 용액(Roche, no. 1697471)과 함께 발색시켰다. 발색은 이중 증류수로 10분 후 중지되었다. 도 2 참조.
husRAGE가 본 발명의 모든 3개의 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체 AF1145(제조원 R&D)에 의해 도트 블롯에서 검출되었지만 본 발명의 모노클로날 항체에 의해 어떠한 펩타이드도 검출되지 않았다. 그러나, 폴리클로날 항체는 여러 펩타이드를 검출하였다. 문헌[참조: Ostendorp et al. (EMBOJ. 26,3875,2007)]에 의해 기재된 바와 같이 폴리클로날 항체를 제조하기 위해 사용되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 9는 시판되는 폴리클로날 항체에 의해 명백하게 검출되었다. 이들 결과는 본 발명의 모노클로날 항체가 현재 가용성인 항체와는 상이한 에피토프를 분명하게 인지함을 나타낸다.
추가로, 결합의 특징 분석은 이.콜라이에서 발현된 사람 sRAGE의 RAGE 돌연변이 분석에 의해 수행하였다. 모노클로날 항체 11E6 및 4E5는 C2 도메인 주변 영역에 결합하는데, 이는 결합이 아미노산 235번 내지 336번이 없는 결실 돌연변이체에서 상실되기 때문이고, 결합은 아미노산 235번 내지 336번으로 이루어진 돌연변이 RAGE 단백질에서 명백하다.
실시예 4: HTRF 기술을 사용한, Aβ1-42- 글로불로머와 husRAGE 기원의 단백질간의 상호작용.
당해 분석은 제조원(CIS Bio International (Bagnols, France))으로부터 가용한 HTRF(균질의 시간 분리된 형광) 기술을 기초로 한다.
HTRF 공여체- 및 수용체 성분, 항-6HIS-유로피움크립테이트(CIS Bio 카탈로그 번호: 61HISKLA; 500 웰/13μg) 및 스트렙타비딘 XL - 665 (CIS Bio 카탈로그 번호: 611SAXLA, 500 웰/250μg)을 각각 250 μl의 이중 증류수에 용해시켰다. 이들 스톡 용액을 PBS, 0.1% BSA, pH 7.4에서 100배 희석하여 최종 농도가 3.7 nM 항6His-크립테이트 및 60.6 nM 스트렙타비딘 XL-665인 작업 용액을 수득하였다. 10 μM, 5 μM, 2.5 μM, 1.25 μM, 0.625 μM, 312.5 nM 및 156.25 nM의 비오티닐화된 Aβ-글로불로머(Aβ-글로불로머를 제조하기 위해 사용되는 Aβ1-42 펩타이드의 5분의 1은 비오티틸-아밀로이드 β-단백질(1-42)(Bachem no. H-5642)이다)의 용액을 문헌[참조: Barghorn et al. (J. Neuro chemistry, vol. 95, no 3, pp. 834-847, 2005 및 WO/2007/062852; 국제출원번호 PCT/EP2006/011530)]에 따라 제조하고; 사용되는 글로불로머 농도는 글로불로머의 제조를 위해 사용되는 Aβ1-42 단량체의 농도를 기준으로 계산하였다. 10 μM, 5 μM, 2.5 μM, 1.25 μM, 0.625 μM, 0.312 μM 및 0.156 μM의 비오티닐화된 Aβ-글로불로머의 용액을 동일 완충액(PBS, 0.1% BSA, pH 7.4)에서 제조하였다. 4 μl의 이들 용액 또는 4 μl의 완충액을 4 μl의 1 μM 재조합 husRAGE 단백질과 혼합하고 당해 용액을 실온에서 1시간 동안 항온처리함에 이어서 각각 4 μl의 용액(3.7 nM 항 6His-크립테이트 및 60.6 nM 스트렙타비딘 XL-665)을 첨가한다.
당해 분석물은 4℃에서 2시간 동안 항온처리하였다. 4 μl의 2M KF 스톡 용액을 첨가한 후 HTRF 시그널을 BMG Pherastar 형광 장치(BMG Labtech GmbH, Germany)에서 HTRF 모드로 측정하였다. 항체 및 배경 결과 없이 단지 항6HIS-크립테이트 - 또는 스트렙타비딘 XL - 용액을 사용하는 최대 시그널 곡선을 사용하였다. % DeltaF 값은 GraphPad Prism 4 (GraphPad Software, San Diego, USA)를 사용하여 제조업자 CisBio의 지침에 따라 계산하였다.
실시예 5: HTRF 기술을 사용한, 항체에 의한 husRAGE 로의 Aβ1-42- 글로불로머 결합의 억제
상기된 바와 같은 기본 프로토콜은 거의 변형시키지 않고 사용하였다. HTRF 공여체- 및 수용체-성분은 항-6HIS-유로피움크립테이트에 대해 10.25nM로 스트렙타비딘 XL-655에 대한 151.5 nM로 PBS, pH 7.4, 0.1% BSA 중에서 40배 희석시켰다.
정제된 모노클로날 항체(MAB)를 husRAGE에 대해 사용하거나 대조군 항체로서 대조군 면역글로불린(마우스 IgG1 및 마우스 IgG2a; no. M-5284 rsp. No. M-5409; Sigma, Germany)에 대해 사용한다.
당해 분석은 384웰 플레이트에서 총 20㎕의 용적으로 수행하였다. 각각의 분석 포인트에 대해: 4 μl의 1 μM husRAGE을 2 μM, 1 μM, 0.5 μM, 0.25 μM, 0.125 μM, 62.5 nM, 31.25 nM, 15.62 nM, 7.81 nM 및 3.9 nM의 농도에서, 실온에서 1시간 동안 4 μl의 시험 항체 또는 IgG 대조군 항체로 항온처리하였다. 배경을 위한 대조군은 husRAGE 및 항체 없이 수행하였다. 최대 시그널은 항체 없이 수득하였다. 후속적으로, 4 μl의 800 nM 비오티닐화된 Aβ-글로불로머를 첨가하고 또한 항-6HIS-유로피움크립테이트에 대해 2 μl의 10.25 nM 및 스트렙타비딘 XL-665에 대해 151.5 nM를 첨가하였다. 용적의 차이는 결합 완충액(1xPBS pH 7.4; 0.1% BSA)을 첨가함에 의해 조정하였다. 당해 분석은 추가 시간 동안 항온처리하였다. 4 μl의 2M KF 스톡 용액의 첨가 후, HTRF 시그널을 BMG Pherastar 형광 장치(BMG Labtech GmbH, Germany)에서 HTRF 모드로 측정하였다. 항체 및 배경 결과 없이 단지 항6HIS-크립테이트 - 또는 스트렙타비딘 XL- 용액을 사용하는 최대 시그널 곡선을 사용하였다. %Delta F 값은 GraphPad Prism 4 (GraphPad Software, San Diego, USA)를 사용하여 제조업자 CisBio의 지침에 따라 계산하였다. 결과는 도 3A, 3B 및 3C에 나타낸다. 도면에 나타낸 농도는 20 μl 분석 용적 중의 단백질의 최종 농도이다.
도 4에 나타낸 바와 같이, RAGE의 모든 3개의 도메인을 발현하는 husRAGE는 아밀로이드 Aβ-글로불로머에 결합하였다. v-도메인 (RAGE102-331) 대부분이 부재하는 사람 sRAGE로 이루어진 RAGE 돌연변이 단백질은 보다 높은 친화성으로 아밀로이드 Aβ-글로불로머에 결합하고 이는 Aβ-글로불로머에 결합하기 위해 사람 RAGE내의 도메인이 C-말단내에 있음을 나타낸다.
실시예 6: ALPHA 스크린 분석 기술을 사용한 RAGE 단백질에의 Aβ- 글로불로머의 결합
당해 분석은 20 μl의 용적으로 분석 완충액(25 mM HEPES, 100 mM NaCl pH 7.4 및 0.1% BSA)에서 수행하였다. 사용되는 공여체 비드는 피복된 스트렙타비딘(Perkin Elmer; 6760002S)이었고 수용체 비드는 단백질 A ALPHALISA (Perkin Elmer; CUSM64133000EA)이고, 각각의 비드 4 μl는 196 μl 의 분석 완충액으로 예비 희석시켰다.
384-웰 Proxi-Plate (Perkin Elmer, no. 6006280) 공여체 비드를 사용하여, 4㎕의 예비 희석된 공여체 비드 및 6㎕의 200nM 용액의 비오티닐화된-aβ-글로불로머를 사용하는 비오틴-aβ-글로불로머(상기 참조)로 로딩하였다.
수용체 비드는 4 μl의 예비 희석된 수용체 비드 및 6μl의 상이하게 희석된 RAGE-Fc 융합 단백질(예를 들어, 100 μg/ml로 개시함)을 사용하는 상이한 양의 RAGE-Fc 융합 단백질로 로딩하였다.
로딩(단백질의 비드에의 결합)은 30분 동안 실온에서 암실에서 수행하였다.
Aβ-글로불로머의 RAGE에의 결합은 암실에서 추가로 180분 동안 예비 로딩된 공여체 및 수용체 비드 제제에 의해 개시하였다. 시그널은 1초의 시간 지연과 함께 ALPHA-Quest 장치(Perkin Elmer)로 측정하였다. 추가의 분석은 GraphPadPrism 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 상이한 실험에서 동일한 기술을 사용하여, 모든 3개의 도메인으로 이루어진 RAGE-Fc에의 Aβ-글로불로머의 결합은 단지 v-도메인(huRAGE의 아미노산 1번 내지 130번)으로 이루어진 RAGE-Fc 돌연변이 단백질에의 Aβ-글로불로머의 결합에 대해 비교되었다. 도 5에 나타낸 바와 같이 가용성 RAGE의 3개의 도메인으로의 아밀로이드 Aβ-글로불로머의 결합은 강하고 RAGE의 v-도메인으로의 아밀로이드 Aβ-글로불로머의 결합은 무시할만하였다. RAGE로의 Aβ-글로불로머의 결합은 C-말단 영역에서 일어나기 때문에, 당해 도메인에 바람직하게 결합하는 항체는 당해 결합과 경쟁할 것으로 예상되었다.
실시예 7: 이. 콜라이 RAGE 단편의 작제 , 발현 및 정제
7.1. 작제물의 제조
표 6에 열거된 이.콜라이 RAGE 작제물을 다음과 같이 제조하였다. 작제물 1은 pET29의 유사 부위로 서브클로닝하기 위해 사용되는 NdeI 및 XhoI 제한 부위를 도입시키는 정방향 프라이머(atgctacatatgaaaaagacagctatcgcgatt gcagtggcactggctggtttcgctaccgtagcgcaggccgctcaaaacatcacagcc (서열번호 89)) 및 역방향 프라이머(atgctactcgagtcagtggtggtgg tggtggtgagttcccagccctgatcctcccacagagcctgcagttggcccctcc (서열번호 90))를 사용하여 주형 플라스미드 pcDNA 3(-) 6.1 C HIS A로부터 PCR 증폭에 의해 제조하였다. 나머지 작제물(#2 - #7, 표 6)을 주형으로서 작제물 1을 사용하여 작제하였다. RAGE 아미노산 잔기 24-129, 24-234, 24-336, 130-234, 130-336 및 235-336을 암호화하는 서열은 작제물 1으로부터 PCR 증폭시켰다. 수득한 DNA 단편은 1.0% 아가로스 겔상에 전개시키고 당해 DNA를 제조원(Qiagen)의 QIAquick Gel 추출 키트를 사용하여 정제하였다. 당해 DNA 단편을 NdeI 및 XhoI로 분해시키고 유사하게 분해된 pET28a에 연결하였다. 당해 연결 혼합물을 Max Efficiency DH5α 컴피턴트 세포내로 형질전환시키고 50 mg/L 카나마이신을 함유하는 LB 한천 플레이트상으로 도말하였다. 37℃에서 밤새 항온처리한 후 각각의 클론에 대한 3개의 콜로니를 50mg/L 카나마이신을 함유하는 3ml의 LB 브로쓰로 접종하고 37℃에서 밤새 진탕시켰다. 당해 DNA는 제조원(Qiagen)의 QIAprep Spin Miniprep 키트를 사용하여 분리하고 당해 삽입체를 T7 프로모터 및 T7 터미네이터 특이적 프라이머를 사용하여 서열분석하였다. 작제물 #1 - #7을 암호화하는 플라스미드의 DNA 서열은 서열번호 27 내지 33으로 나타내고 상응하는 해독된 영역은 서열번호 34 내지 40으로 나타낸다.
Figure pat00010
이.콜라이 균주 BL21(DE3)를 작제물 #1 플라스미드 DNA로 형질전환시키고 카나마이신(50mg/L)을 함유하는 LB 플레이트상에 도말하고 37℃에서 밤새 항온처리하였다. 다음 날, 각각 카나마이신(50mg/L)을 갖는 1L의 Terrific 브로쓰를 함유하는 14개 fernbach 플라스크에 CFU로 접종하고 37℃에서 배양기에서 진탕(180rpm)시킨다. 배양물이 0.47의 OD600nm에 도달하는 경우, 플라스크를 30℃ 배양기(여전히 180rpm으로 진탕시킴)로 옮기고 발현은 0.4 mM IPTG를 첨가하여 유도하였다. 세포를 원심분리(15,900g, 8분, 40℃)로 유도한지 4시간 후 수거하고 이어서 세포 페이스트를 정제때까지 -80℃에서 동결시켰다.
먼저, 약 20g의 세포 펠릿을 해동시키고 이를 180ml의 용해 완충액[50 mM Tris pH 7.6, 300 mM NaCl, 10% 글리세롤, 0.1% Triton X-100, 0.5 mM MgCl2, 20 mM 이미다졸, 1X Roche EDTA-부재 프로테아제 억제제, 20 U/ml DNase I] 중에 현탁시킨 후 RAGE 작제물 1을 정제한다. 세포를, 현탁액을 3℃에서 Avestin Emulsiflex 미세 유동화기를 통해 3회 연속 통과시킴으로써 용해시켰다. 이어서 세정된 용해물을 2ml/분으로 5ml의 HiTrap IMAC-칼럼 (GE Healthcare, 17-5255-01)상으로 로딩하였다. 이어서 당해 칼럼을 10CV의 세척 완충액[50 mM Tris pH 7.6, 300 mM NaCl, 10% 글리세롤, 20 mM 이미다졸]을 사용하여 세척하였다. 세척 단계 후, RAGE를 용출 완충액 [50 mM Tris pH 7.6, 300 mM NaCl, 10% 글리세롤, 500 mM 이미다졸]을 사용하여 구배 용출시켰다. RAGE를 함유하는 분획을 모으고 이어서 5OmM Tris pH 7.6, 2OmM NaCl, 10% 글리세롤에 대해 투석시켰다. 정제된 물질의 질량-분광 분석으로 OmpA-리더가 제거되었고 정제된 물질이 예상된 바와 같이 RAGE의 잔기 23번 (즉, 서열 A-Q-N-...)으로 시작함을 확인하였다.
작제물 #2- #7을 암호화하는 플라스미드는 별도로 이.콜라이 균주 BL21(DE3)내로 형질전환시키고, 카나마이신(50mg/L)을 함유하는 LB 플레이트상에 도말하고 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음날에, 1L의 밤새 발현 즉석 TB 배지 (Novagen)에 콜로니를 접종하고 30℃에서 19시간 동안 진탕시켰다. 당해 세포를 원심분리(15,900 x g, 10분, 40℃)하여 펠릿화하고 이어서 -8O℃에서 동결시켰다. 당해 펠릿(각각 5-6 그람)을 해동시키고 50ml의 용해 완충액[50 mM Tris, pH 8, 300 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 10% 글리세롤, 0.2 mg/ml 라이소자임, 1 ml의 프로테아제 억제제 칵테일 세트 III (Calbiochem), 2OU/ml의 벤조나제, 5 mM의 B-머캅토에탄올] 중에 재현탁시켰다. 용해물을 2분 동안 Vibra 세포 초음파기상에 초음파처리하고 이어서 30분 동안 20K x g에서 원심분리하였다. Econo-Pac 10개 칼럼(제조원: Bio-Rad)에 2 ml 베드 용적의 ProBond 니켈 수지로 충전시키고 용해 완충액으로 평형화시켰다. 세정된 용해물을 3회 연속으로 칼럼을 통과시킴에 이어서 3 x 10 칼럼 용적(총 60ml)의 세척 완충액[2 X PBS, 20 mM 이미다졸, 10% 글리세롤, 5 mM B-머캅토에탄올]으로 세척하였다. 당해 단백질을 5 x 1 칼럼 용적(총 10 ml)의 용출 완충액 [2 X PBS, 500 mM 이미다졸, 10% 글리세롤, 5 mM B-머캅토에탄올]으로 칼럼으로부터 용출시켰다. 당해 용출된 물질을, Bio-Rad Econo-Pac 10DG 칼럼을 사용하여 PBS, 10% 글리세롤, 및 1 mM DTT로 이전시켰다.
7.2. 항- RAGE 모노클로날 항체 11 E6 , 4 E5 및 7F9의 발현
하이브리도마 세포 증식을 위해 사용되는 배지는 10% 매우 낮은 IgG 태아 소 혈청(Invitrogen - 카탈로그 #16250-078)을 함유하는 BD 세포 MAb Quantum Yield 배지(Becton Dickenson - 카탈로그 # 220511)로 이루어졌다. 간략히 설명하면, RAGE 모노클로날 항체 11E6을 발현하는 쥐 하이브리도마 세포주의 다중 300 ml 종자 배양물을 밀도가 1.0 x 106 세포/ml에 도달할때까지 배양기 (65 rpm, 8% CO2, 37℃)에서 2L의 롤러병에서의 진탕으로 증식시켰다. 이어서 세포를 25L Wave BioReactor에서 밀도 0.06 x 106 세포/mL로 20L의 배지로 씨딩하고 작동 세팅은 분당 14 락(rock)/분이고 락 각도는 6°이고, 온도는 37℃이고 8% CO2는 0.15Lpm의 살포율이다. 2일 후, 배양물은 24L의 최종용적으로 배지를 첨가하여 증식시키고 0.43 x 106 세포/ml의 새로운 세포 밀도를 수득한다. 당해 배양물을 완전한 용적으로 증식시킨지 12일 후 수거하였다. 세포를 연속 원심분리(Carr ViaFuge, 6000 rpm, 1.7 Lpm)에 의해 제거하였다. 5 mM NaN3 (1 M NaN3 스톡 기원 - Hampton Research)을 세정된 배지에 첨가한 후, 즉시 당해 물질을 정제 공정에 사용하였다.
하이브리도마 세포 증식을 위해 사용되는 배지는 10% 매우 낮은 IgG 태아 소 혈청(Invitrogen - 카탈로그 #16250-078)을 함유하는 BD 세포 MAb Quantum Yield 배지(Becton Dickenson - 카탈로그 # 220511)로 이루어졌다. 간략히 설명하면, RAGE 모노클로날 항체 4E5를 발현하는 쥐 하이브리도마 세포주의 다중 300 ml 종자 배양물을 밀도가 1.0 x 106 세포/ml에 도달할때까지 배양기 (65 rpm, 8% CO2, 37℃)에서 2L의 롤러병에서의 진탕으로 증식시켰다. 이어서 세포를 25L Wave BioReactor에서 밀도 0.12 x 106 세포/mL로 5L의 배지로 씨딩하고 작동 세팅은 분당 12 락/분이고 락 각도는 6°이고, 온도는 37℃이고 8% CO2는 0.15Lpm의 살포율이다. 4일 후, 배양물은 24L의 최종용적으로 배지를 첨가하여 증식시키고 0.24 x 106 세포/ml의 새로운 세포 밀도를 수득한다. 락-속도를 14락/분으로 증가시켰다. 당해 배양물을 완전한 용적으로 증식시킨지 12일 후 수거하였다. 세포를 연속 원심분리(Carr ViaFuge, 6000 rpm, 1.7 Lpm)에 의해 제거하였다. 5 mM NaN3 (1 M NaN3 스톡 기원 - Hampton Research)을 세정된 배지에 첨가한 후, 즉시 당해 물질을 정제 공정에 사용하였다.
하이브리도마 세포 증식을 위해 사용되는 배지는 10% 매우 낮은 IgG 태아 소 혈청(Invitrogen - 카탈로그 #16250-078)을 함유하는 BD 세포 MAb Quantum Yield 배지(Becton Dickenson - 카탈로그 # 220511)로 이루어졌다. 간략히 설명하면, RAGE 모노클로날 항체 7F9를 발현하는 쥐 하이브리도마 세포주의 다중 300 ml 종자 배양물을 밀도가 1.0 x 106 세포/ml에 도달할때까지 배양기 (65 rpm, 8% CO2, 37℃)에서 2L의 롤러병에서의 진탕으로 증식시켰다. 이어서 세포를 25L Wave BioReactor에서 밀도 0.05 x 106 세포/mL로 10L의 배지로 씨딩하고 작동 세팅은 분당 12 락/분이고 락 각도는 6°이고, 온도는 37℃이고 8% CO2는 0.15Lpm의 살포율이다. 4일 후, 배양물은 25L의 최종용적으로 배지를 첨가하여 증식시키고 0.25 x 106 세포/ml의 새로운 세포 밀도를 수득한다. 락-속도를 14락/분으로 증가시켰다. 당해 배양물을 완전한 용적으로 증식시킨지 10일 후 수거하였다. 세포를 연속 원심분리(Carr ViaFuge, 6000 rpm, 1.7 Lpm)에 의해 제거하였다. 5 mM NaN3 (1 M NaN3 스톡 기원 - Hampton Research)을 세정된 배지에 첨가한 후, 즉시 당해 물질을 정제 공정에 사용하였다.
7.3. 항 RAGE 모노클로날 항체 11 E6 , 4 E5 및 7F9의 정제
세정된 하이브리도마 배지에 글라이신 및 NaCl을 각각 최종 농도가 3M 및 1.5M이 되도록 첨가하였다. pH를 NaOH를 사용하여 8.0으로 조정하엿다. 물질을 5 μm Pall Capsule #120 막 필터를 사용하여 여과하고 200 mL BioSepra 단백질 A 칼럼상으로 로딩하였다. 단백질 용액을 11 CV의 세척 완충액(20 mM 인산나트륨 pH 8.0, 1mM 아지드화나트륨)으로 세척하고 50mM의 글라이신(pH 3.0)의 농도 구배 단계를 사용하여 용출시켰다. 100mL 크기의 분획을 수거하고 단백질 농도를 A280nm를 측정함에 의해 측정하였다. 모든 칼럼 프로세싱 단계는 4℃에서 수행하였다. 모은 물질을 4℃에서 밤새 20L의 10 mM Tris pH 8.0에 대해 투석하였다. 추가로 10ml/분의 유속 모드의 SartoBind Q 강염기 음이온 교환제 Singlesep 소형 카트릿지(Sartorius)를 사용하여 크로마토그래피 세정을 달성하였다. 당해 항체는 칼럼에 결합하지 않고 하나의 풀로서 수거한다. 당해 단계 후, 당해 물질을 Amicon 교반된 가압 셀(5000 MWCO 막, 75 psi, 40℃)를 사용하여 5mg/ml로 농축시켰다. 최종적으로, 당해 항체는 2OL의 PBS 완충액(10 mM 포스페이트, 0.138 M NaCl, 0.0027 M KCl, pH 7.4)에 대해 2회 투석하였고 각각의 사이클은 4℃에서 24시간 동안이다.
7.4. ELISA 결합 실험:
항원(정제된 작제물 #1-7 단백질)을 피복 완충액[100 mM NaHCO3, pH 8.2]으로 lμg/ml까지 희석시키고 100 μl의 수득한 용액을 이어서 96웰 Nunc 면역 플레이트(Maxi-Sorb 표면, 평저, 카탈로그 # 439454)로 분주하였다. 당해 플레이트를 밀봉 필름으로 밀봉시키고 4℃에서 밤새 배양시켰다. 다음 날, 당해 플레이트 웰을 각각 150 μL PBST 완충액 [Sigma PBS + 0.05% Tween 20]으로 3회 세척하였다. 이어서 300ul의 차단 완충액(PBST 중의 3% NFDM)을 각각의 웰에 첨가하였다. 당해 플레이트를 실온에서 2시간 동안 항온처리하고 100rpm에서 진탕시켰다. 항온처리 단계 후, 각각의 웰을 다시 150 uL PBST로 3회 세척하였다. 시험될 100 ul의 상응하는 항체(즉, 7F9, 11E6, 및 4E5)를 PBST/0.5% BSA으로 구성되는 다양한 희석으로 첨가하였다. 이어서 당해 플레이트를 밀봉 필름으로 밀봉시키고 실온에서 2시간 동안 항온처리하고 100rpm에서 진탕시켰다. 이어서 항체 용액을 웰로부터 인출하고 각각의 웰을 다시 200ul PBST로 3회 세척하였다. 이어서 각각의 웰에, 접합된 2차 항체[Donkey 항-마우스 HRPO 접합체, Jackson Immuno Research, 카탈로그 #715-035-150]의 1:5000 희석액(PBST/1% NFDM 중) 200㎕를 첨가하였다. 당해 플레이트를 덮고 실온에서 100rpm에서 진탕시키면서 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 당해 항온처리 후, 당해 용액을 웰로부터 제거하고 각각의 웰을 200ul PBST로 3회 세척하였다. 각각의 웰에 100μL의 HRPO 기질[3,3',5',5'-테트라메틸벤지딘 액체 기질 (TMB), ELISA에 대해 과민감성, Sigma Catalog #T4444] 용액을 첨가하고 당해 플레이트를 10분 동안 실온에서 항온처리하였다. 최종적으로 50 μL의 2M H2SO4를 각각의 웰에 첨가하여 반응을 종료시키고 각각의 웰의 A540nm를 미세역가 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다.
이들 결합 실험의 결과는 도 6a, 6b, 6c, 도 7a, 7b, 및 7c에 나타낸다. 도 6a, 6b, 및 6c는 RAGE 잔기 24-234가 RAGE 모노클로날 항체 11E6, 4E5 또는 7F9의 결합에 관여하지 않음을 보여준다. 역으로, 도 7a, 7b, 및 7c에 나타낸 바와 같이, RAGE 잔기 235-336은 RAGE 모노클로날 항체 11E6 및 4E5의 결합을 위해 충분하였다. RAGE mAb 7F9는 이들 (이.콜라이 발현된) RAGE 단편 중 어느 하나에 대한 어떠한 결합도 보여주지 않았다.
실시예 8: 에피토프 맵핑
8.1. 11 E6 , 4 E5 및 7F9 항체의 고정화
대략적으로 20 mg의 CNBr-활성화된 세파로스 고속 흐름 수지를 칭량하여 35 μm 프리트(frit)를 장착한 3개의 컴팩트 반응 칼럼으로 충전하였다. 당해 수지가 200 μL의 1 mM HCl 중에서 팽윤하도록 방치한 후 200 μL의 1 mM HCl로 3회 세척하였다. 후속적으로 당해 수지를 500mM 염화나트륨을 함유하는 200 μL의 100 mM 중탄산나트륨 완충액(pH 8.3)(완충액 A)으로 3회 세정하였다. 완료되면, 당해 용액을 칼럼으로부터 분출시켜 단지 박층의 완충액이 각각의 수지상에 잔류하도록 하였다. 대략 5.5nmol의 항체를 수지에 고정화시키고 이는 235 μL의 7F9 (3.4 mg/mL), 500 μL의 11E6 (1.6 mg/mL), 및 200 μL의 4E5 (3.75 mg/mL)의 첨가를 필요로 하였다. 7F9 및 4E5 항체 고정화를 위해, 200 μL의 완충액 A를 또한 포함시켰다. 컴팩트 반응 칼럼을 밀봉시키고 실온에서 4시간 동안 뒤집어서 혼합시킨다. 완료되면, 컴팩트 반응 칼럼을 개봉시키고 200 μL의 완충액 A의 3회 첨가와 함께 분출시켜 비결합된 항체를 제거하였다. 분출 후, 100 mM Tris-HCl (pH 8) 및 500 mM 염화나트륨을 함유하는 200 μL의 완충액(완충액 B)을 각각의 칼럼에 첨가하였다. 당해 칼럼을 재밀봉시키고 실온에서 뒤집어서 혼합시켜 수지상에서 비결합되어 있지만 활성화된 부위를 차단시킨다. 2시간 후, 당해 칼럼을 개봉하고 먼저 500mM 염화나트륨을 함유하는 200 μL의 100 mM 나트륨 아세테이트 완충액 (pH 4)(완충액 C)으로 분출시키고 이어서 200 μL의 완충액 B로 분출시켰다. 당해 과정을 추가로 2회 반복하여 비결합된 항체를 완전히 제거하여 수지상의 잔류 접착 부위를 완전히 차단시킨다. 당해 수지를 이어서 항원 커플링 전에 100mM 염화나트륨을 함유하는 200 μL의 100 mM 중탄산나트륨 완충액(pH 8.3)(완충액 D)으로 4회 세척하였다.
8.2. 이. 콜라이 및 BacMam -발현된 sRAGE 항원의 단백질용해 절단
75 μL의 이.콜라이 발현된 항원을 11E6 및 4E5 수지에 첨가하고 125 μL의 BacMam-발현된 항원을 11E6, 4E5 및 7E9 수지에 첨가하여 sRAGE 항원이 항체 칼럼에 결합하도록 하였다. 당해 칼럼을 밀봉시키고 당해 샘플을 실온에서 2시간 동안 뒤집으면서 혼합하였다. 이 시간 후, 당해 칼럼을 개봉하고 200 μL의 완충액 D로 4회 첨가와 함께 분출시켰다. 세정을 통한 분출 후, 당해 수지를 200 μL의 완충액 D 및 프로테아제로 재현탁시키고 트립신, 엔도프로테이나제 Glu-C 또는 키모트립신 0.1mg/ml 용액으로서 제조하였다. 프로테아제의 양을 실험간에 다양하게 하여 분해를 약화시키지만 중량을 기준으로 프로테아제보다 200 내지 400배 과량의 항원의 범위에 이른다. 12시간 동안 뒤집으면서 혼합하여 실온에서 단백질용해가 일어나도록 하였다. 이 시간 후, 당해 칼럼을 개봉하고 단백질 용해 용액을 이를 통해 분출하고 추가의 분석을 위해 저장하였다. 이원 분해에 적용된 샘플을 위해 다음 단계 전에 수지를 200 μL의 완충액 D 및 제2 프로테아제 중에 재현탁시켰다. 제2 프로테아제에서 처리되지 않은 샘플에 대해, 당해 칼럼을 완충액 D에서 2회 개별 200 μL 세척에 적용하고 이어서 완충액 A에서의 200 μL 세척에 이어서 완충액 D에서의 최종 200 μL 세척에 적용하였다. 각각의 세척을 후기 분석을 위해 별도로 유지시켰다. 에피토프 함유 펩타이드를 2% 포름산 중에 3회 개별 200 μL 세척으로 칼럼으로부터 용출시켰다. 각각의 용출 샘플을 후기 분석을 위해 별도로 유지시켰다.
8.3. 에피토프 함유 펩타이드의 질량 분광 측정 분석
당해 샘플을 Bruker Apex QE 7T FT-ICR(Fourier-Transform Ion Cyclotron Resonance) 질량 분광측정기 및 Applied Biosystems Q-STAR Pulsar I 질량 분광측정기 둘다를 사용하여 분석하였다. FT-ICR 질량 분광측정 분석을 위해, 8 μL의 에피토프 절단 샘플을 Agilent series 1100 모세관 HPLC에 의해 Jupiter C4 역상 칼럼(0.5 x 150 mm, 5μ 입자 크기, 300 Å 공극 크기) 상에 주입하였다. 당해 샘플을 0.1% 포름산과 함께 90% 물 (용매 A) / 0.1% 포름산과 함께 10% 아세토니트릴(용매 B) 중에서 5μL/분 유속으로 5분 동안 세척하여 탈염시켰다. 당해 펩타이드를 이동상 조성을 5% 용매 A / 95% 용매 B로 변화시킴에 의해 질량 분광 측정기로 용출시켰다. 반복 질량 분광측정을 위해 직접 주입을 필요로 하는 샘플을 98% 물, 1% 아세토니트릴 및 1% 포름산 중에 평형화시킨 단백질 Microtrap (Michrom) 상으로 주입시켰다. 당해 샘플을 300 μL의 60% 아세토니트릴, 40% 물 및 0.1% 포름산 중에서 용출되기 전에 평형화 용매 1ml로 세척하였다. 당해 용출물을 직접 2 μL/분으로 FT-ICR 질량 분광측정기로 주입하였다. Q-STAR Pulsar 질량 분광측정을 위해, 5-30 μL의 샘플을 Agilent series 1100 HPLC에 의해 단백질 Microtrap(Michrom) 상에 주입하였다. 당해 샘플을 5% 용매 A / 95% 용매 B 중에 질량 분광측정기로 결합된 펩타이드를 용출시키기 전에 1분 동안 95% 용매 A / 5% 용매 B 중에서 세척하였다.
11E6 항체에 결합된 이.콜라이 발현된 sRAGE의 단백질분해 절단 및 에피토프 함유 펩타이드의 용출은 12,204.5 Da의 질량을 갖는 펩타이드의 존재를 밝혔다. 질량 선택 및 10+ 전하 상태의 충돌로 활성화된 분해는 잔기 Val229-His346 (당해 His 잔기는 Hexa-His-태그의 sRAGE 단백질로의 첨가로 인한 것이다)에 상응하는 당해 펩타이드의 실체를 확인시켜 주었다. 트립신에 이어서 키모트립신 단백질분해를 사용하는 추가의 에피토프 맵핑은 C-말단 헥사히스티딘 태그를 절단시켜서 에피토프가 잔기 Val229-His341 (이러한 His 잔기는 Hexa-His-태그의 sRAGE 단백질로 첨가로 인한 것이다)로 정련됨을 밝힌다. 당해 에피토프의 추가의 정련은 단백질분해를 사용하여 수득될 수 있다. 4E5 항체에 결합된 이.콜라이 발현된 sRAGE의 유사하게 수행된 단백질분해 절단은 11E6 항체 에피토프에 대해 관찰되는 것과 동일한 12,204.5 Da의 펩타이드를 밝혔다. 상응하게, 11E6 또는 4E5 항체에 결합된 BacMam-발현된 sRAGE의 절단은 질량이 10,671.9 Da 및 10,614.0 Da인 펩타이드를 함유하는 2개의 주요 에피토프를 밝혔다. 이들 펩타이드는 각각 잔기 Val229-Gly331 및 Val229-Ala330을 가로지르는 BacMam 발현된 작제물의 C-말단과 일치한다.
7F9 항체에 결합된 BacMam-발현된 sRAGE의 단백질분해 절단 및 에피토프 함유 펩타이드의 용출은 여러 중첩 펩타이드를 나타내는 다중 종을 밝혔다. 질량 스펙트럼의 탈회선은 질량 12,079.6 Da, 12,372.9 Da, 13,477.3 Da 및 24,132.3 Da의 펩타이드를 밝혔다. 이들 질량은 각각 잔기 Asn105-Arg216, Asn105-Arg218, Asn105-Arg228 및 Asn105-Gly331이고, 이는 잔기 Asn105-Arg216을 가로지르는 최소 에피토프임을 시사한다.
이들 결과는 항체 11E6 및 4E5가 이.콜라이 및 BacMam-발현된 sRAGE 둘다의 C 말단상에 에피토프를 보유하고 항체 7F9이 BacMam 발현된 sRAGE의 중앙 도메인상에 에피토프를 인지함을 지적한다.
실시예 9: Biacore 및 표면 플라스몬 공명 측정
본 발명의 3개의 모노클로날 항체, 즉 7F9, 11E6 및 4E5의 친화성은 Biacore 및 표면 플라스몬 공명 측정을 사용하여 측정하였다.
9.1. 항 RAGE 결합 동력학적 측정을 위한 재료 및 방법:
Biacore 2000 장치를 사용하여 마우스 항-RAGE mAb 결합 동력학을 측정하였다. mAb 친화성 분석을 위한 분석 형식은 고정화된 항-Fc 항체를 통한 Fc계 포획이었다. 표준 아민 커플링 프로토콜을 사용하여 1급 아민을 통해 Fc 특이적 IgG를 CM5 센서칩(Biacore)의 카복시-메틸(CM) 덱스트란 표면에 고정화시켰다. 마우스 항-RAGE mAb의 연구를 위해, 항-마우스 Fc (Biacore, 항-마우스, BR-1005-14)를 고정화된 포획 시약으로서 사용하였다. Biacore 2000상에서 시판되는 자동화된 프로토콜을 사용하여 센서칩의 모든 4개 플로우셀에서 8000-10000RU의 포획 시약을 고정화시켰다. 간략히 설명하면, CM-덱스트란 표면은 새롭게 제조된 1:1 5OmM N-하이드록시석신이미드(NHS):200mM 3-(N,N-디메틸아미노)프로필-N-에틸카보디이미드(EDC)에 의해 활성화시켰다. 이어서 항-Fc IgG 포획 시약(10mM 나트륨 아세테이트중 20ug/ml, pH4.5)을 표면에 적용하고 이어서 표면을 탈활성화시키고 1M 에탄올아민(pH 8.5)으로 잔류 반응 부위를 차단시킨다.
사용된 전개 완충액은 마우스 항-RAGE mAb에 대해 HBS-EP+ [1OmM HEPES, pH 7.4, 15OmM NaCl, 3mM EDTA, 0.05% P20 계면활성제 (Biacore)]이었다. 각각의 실험 사이클은 하기의 단계로 이루어져 있다: 1) 항-RAGE mAb를 플로우셀 2, 3 또는 4에서 50 내지 200RU(항원에 의존하여)의 수준으로 포획시켰다. 모든 측정은 어떠한 포획된 항-RAGE mAb도 갖지 않는 플로우셀 1에 대해 참조되었다. 2) 항원은 60ul/분에서 180ul를 모든 4개의 플로우셀을 통해 주사하였다. 항원 주사 후, 분해를 60ul/분에서 600초 동안 모니터링하였다. 3) 항-Fc 포획 표면은 낮은 pH 글라이신으로 재생시켰다. 동력학적 측정을 위해, RAGE 주사는 단지 무작위화된 2중의 완충액 중에서 2OnM에서 0.31nM으로의 2배 희석 시리즈이었다.
9.2. 평가 및 결과
데이터는 Biacore 평가 소프트웨어를 사용하여 프로세싱하였다. 간략히 설명하면, 당해 데이터는 처음에는 표준 셀로부터 시그널을 공제하고 2번째는 완충액만의 주사로부터의 시그널을 공제하여 2중 참조하였다. 이어서 RAGE 주사 시리즈로부터 2중 참조된 데이터는 질량 전달 항을 포함하는 1:1(Langmuir) 결합 모델에 광범위하게 적합되어 결합 동력학 속도 상수, ka 및 kd, 및 친화성 KD을 결정하였다.
표 7은 4E5가 마우스 RAGE (Mu-RAGE)에 결합하지 않았음을 보여준다. 11E6 및 4E5는 RAGE에 결합하기 위해 서로 교차 경쟁한다. 7F9는 글리코실화 부재 이.콜라이에서 제조된 RAGE에 결합하지 않는다.
표 7은 또한 본 발명의 3개의 항체가 단백질 분해로부터 사람 sRAGE의 보호 및 질량 분광측정기를 사용한 보호된 펩타이드의 동정을 사용한 에피토프 맵핑을 통해, 사람 RAGE에 결합되는 본 발명의 3개의 항체에 대한 특이적 에피토프를 보여준다. mAb 7F9는 C1 (Asn105 - Pro215)에 결합하고; mAb 4E5는 C2 (이.콜라이 RAGE내 Val229 - Thr340; 포유동물 세포에서 제조된 husRAGE내 Val229 - Gly331)에 결합하고, 11E6은 C2(이.콜라이 RAGE내 Val238 - Arg314; 포유동물 세포에서 제조된 husRAGE내 Val229 - Gly331)에 결합했다.
Figure pat00011
실시예 10: C57BL /6 암컷 마우스에서 생체내 뇌혈 용적( CBV ) 연구
10.1. 동물
C57BL/6 암컷 마우스(4 내지 6월령; Taconic, Germantown, New York, USA) 를 12시간 광 및 12시간 차광의 조건하에서 조용한 방에 삽입된 표준 멸균 목재 칩상에서 유지시키고(06:00에 광) 음식과 물에는 자유롭게 접근할 수 있게 한다. 총 33마리의 마우스를 fMRI-CBV 연구에 사용하였다. 모든 연구는 승인되었고 Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care에 의해 인정된 시설에서 National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals 지침에 따라 Abbott institutional Animal Care and Use Committee에 의해 세밀하게 모니터링되었다.
10.2. 가용성 Aβ 펩타이드 제제
Aβ1-40 (>99% 순수)을 제조원(Abbott Laboratories)에서 합성하였다. 간략히 설명하면 이.콜라이 BL21(DE3)를 1mM IPTG로 유도하고 18L 발효기 작동에서 3시간 동안 41℃에서 발현시켰다. 185 gm의 세포 페이스트를 수거하였다. 당해 펩타이드가 봉입체로서 발현되었다. 세포를 0.1% Triton X100을 함유하는 0.1M Tris 완충액에서 용해시켰다. 이어서 펠릿을 50mM Tris 완충액으로 3회 세척하고 물로 1회 세척하였다. 세척액을 버리고 최종 펠릿을 물에 재현탁시키고 동결건조시켰다. 동결건조된 펠릿을 50OmL의 DMSO로 추출하고 물 중의 0.2% 암모니아를 사용하여 1L로 희석시켰다. 이러한 1L 샘플을 0.1% 암모니아를 함유하는 19L의 10% 에탄올에 대해 투석시켰다. 희석을 실온에서 총 5시간 동안 물 중의 단지 0.1% 암모니아를 사용하여 계속하였다. 1.4L의 샘플을 0.1% 암모니아를 사용하여 2L로 희석시키고 물 중의 0.1% 암모니아로 평형화된 2.5 X 25cm PLRP-S HPLC 칼럼(Polymer Labs, Amherst, MA)에 적용하였다. 0.1% 암모니아를 함유하는 아세토니트릴로 용출시켰다. Aβ1-40을 200분 동안 10 내지 30%B로 농도 구배 동안에 용출시켰다. 모은 물질을 동결건조시켰다. MALDI 분석을 사용하여 물질의 실체 및 순도를 확인하였다. 당해 물질을 N15 표지된 AβMet-1-40으로서 정제하였다. 소량의 메티오닌 설폭사이드는 샘플중에 +16 매쓰 유닛으로 존재하였다. 138 mg을 당해 1회 진행중에 펩타이드의 암모늄 염으로서 정제하였다. 역 서열, Aβ40-1 (>99% 순수)를 제조원(Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA))으로부터 구입하였다. Aβ 펩타이드(0.01 또는 0.1 mg)을 모든 fMRI-CBV 실험 직전에 새로운 포스페이트 완충 식염수(0.1ml; PBS) 중에 별도로 용해시켰다. 초기 연구를 위해, 마우스를 무작위로 5개 처리 그룹으로 할당하였다: PBS 대조군, Aβ1-40 (0.01 또는 0.1 mg/마우스) 또는 Aβ40-1 (0.01 또는 0.1 mg/마우스)(각 그룹에는 5마리의 동물이 있다).
10.3. 항체 제조
음성 IgG 대조군 항체 및 항-RAGE 항체인 11E6 (둘다 >99% 순수)는 제조원(Abbott Laboratories)에서 합성하였다.
10.4. fMRI 를 사용한 CBV 측정
모든 fMRI 실험을 20G/cm 자기장 구배 삽입체를 사용한 7.0 T/21 cm 수평 자석 상에서 수행하였다(문헌참조: Biospec Bruker, Billerica, MA). 처음에 동물을 메디토미딘(1 mg/kg, i.p.; Pfizer Animal Health, Exton, Pennsylvania, USA)+케타민(75 mg/kg, i.p.; Fort Dodge Animal Health, Iowa, USA)을 사용하여 마취시킴에 이어서 전달하기 위한 코일 및 수용하기 위한 표면 코일 공간을 함유하는 이원-코일의 작은 동물 압죄기(Insight Neuroimaging Systems, LLC, Worcester, MA)에 놓았다. 호흡율 및 파동형태를 전력 변환기를 통해 모니터링하였다. 직장 온도를 모니터링하고 피드백 조절된 순환 물 패드를 통해 37 ± 1℃로 유지시켰다. 모든 이미지화를 광 단계 동안에 수행하였다. 코일 대 코일 전자기 상호작용을 활성적으로 탈커플링시켰다. 해부 이미지는 신속한 스핀 에코 신속 획득 이완 증진된 (RARE) 펄스 서열을 사용하여 획득하고 이때, TR = 3 s, 유효 TE = 100 ms, 매트릭스 = 256 x 256, FOV = 2.56 cm x 2.56 cm, 9개의 1.0-mm 슬라이스 및 4개의 평균이다. 구배 에코 단일-샷 에코-평판 이미지화(EPI)는 fMRI- CBV 이미지 획득을 위해 사용하였고 이때, TR = 2 s, TE = 13 ms, 매트릭스 = 64 x 64, FOV = 2.56 cm x 2.56 cm이고 평판내 분리는 = 400 μm x 400 μm이다. 10 mg Fe/kg 초소형 초자성 산화철 (USPIO) 조영제(SH U555C, Schering AG, Germany)를 18분 이미지 획득으로 정맥내 2분 투여하였다. 가용성 Aβ 및 PBS는 시린지 펌프(1분 동안 0.1ml/분)를 사용한 조영제 6분 후 꼬리 정맥을 통해 투여하고 CBV의 변화는 후속 10분 기간 동안 검출하였다. 대조군 IgG1 항체 또는 11E6를 이들의 홈 케이지내 마우스에게 이미지화 연구 개시 3시간 전에 ip 투여하였다.
10.5. fMRI 데이터 분석
데이터 분석은 Analysis of Functional NeuroImages (AFNI) 소프트웨어 팩키지 (Cox R W, Comput Biomed Res 29:162-173, 1996)를 사용하여 수행하였다. 시간 의존적 상대적 CBV 변화 rCBV(t)를 동정하기 위해 하기 관계를 기초로 시간 경과 미처리 데이터로부터 계산하였다(Mandeville et al, 1999).
Figure pat00012
여기서, s(t)는 Aβ 또는 PBS 주입 후 시그널 강도이고, So(t)는 Aβ 또는 PBS 주입 전 기본 시그널이고 Spre는 조영제 투여 전 평균 시그널 강도이다. 시간-경과 rCBV 변화는 혈액으로부터 조영제의 제거를 차지하는 선형 함수로 최소제곱화하였다(Cox, 1996).
후속적으로, 모든 마우스에서 각각의 복셀에 대한 약물의 동력학을 반영하는 rCBV 시그널을 비선형 미분 대수 모델에 피팅하였고(수학식 2)(Luo et al, 2004) 여기서 t0은 반응의 시간 지연이고, k는 곱셈 계수이고 α1는 제거율이고 α2는 흡수율이다.
Figure pat00013
파라미터 to, k, α1 및 α2에 피팅된 초기 값은 공지된 Aβ 동력학을 기준으로 각각 0-45 초, -500-500, 0-0.15, 및 0.15-0.5이다(문헌참조: Shiiki et al., J Neurosci 24:9632-9637, 2004). to, k, α1 및 α2에 대한 최종 값은 자동적으로 모델 피팅의 최대 유의성을 기초로 AFNI를 사용하여 결정하였다. 활성화된 rCBV 복셀을 이어서 본페로니 보정 후 p < 0.05에서 결정하였다.
도 8에 나타낸 결과는 Aβ1-40이 용량 의존적 및 지역 특이적 방식으로 CBV를 감소시켰음을 나타낸다(0.01 mg 도 8a 및 0.1 mg 도 8b). 감소된 CBV의 정도는 마우스가 Aβ1-40의 저용량(도 8a)과 비교하여 고용량(도 8b)를 사용하여 치료되는 경우 상당히 컸지만 유사한 뇌 영역(예를 들어, 전두엽 피질, 미상핵, 시상하부, 해마)은 영향을 받았다. Aβ1-40의 용량 의존적 효과와는 대조적으로, 역 펩타이드, Aβ40- 1는 동일 용량, (0.01 mg 도 8c 및 0.1 mg 도 8d)에서 시험되는 경우 CBV에 유의적인 영향을 주지 못하였고 관찰된 CBV에서 임의의 감소 정도는 PBS 처리된 대조군 그룹(PBS, 도 8e)과 상당한 차이가 없었다. 12분 시간 경과 동안에, 여러 뇌 영역을 가로지르는 환부 복셀에 대해 10 내지 20% 범위에 이르는 Aβ1-40에 의해 유도된 CBV에서 감소 정도는 꾸준히 투여 후 5분 이내에 최대에 도달하였고 지속적인 연구 동안에 우울한 채로 남아있었고(대표적인 데이터는 도 8f에서 해마에 대해 나타냄) 2개 용량의 Aβ1-40에 대해 유사하였다. 이들 데이터는 침입성 레이저 도플러 유동측정 기술(나타내지 않음)을 사용하는 추가의 연구와 일치한다.
fMRI를 사용하는 CBV에 대한 11E6의 효과를 시험하기 위해, 대조군 IgG1 항체의 투여전 효과를 먼저 평가하였다. 예상된 바와 같이, 이미지화 개시 3시간 전에 IgG1 항체의 사전 투여는 Aβ1-40 (0.01 mg 도 9a)를 사용한 시험공격 (challenge)의 효과를 차단하지 않았다. 대조적으로, 이미지화 개시 3시간 전에 주어진 0.1 mg/마우스 용량의 11E6는 Aβ1-40(0.1 mg 도 9b)를 사용한 시험공격에 의해 정상적으로 유발되는 CBV에서의 감소를 완전히 차단하였다. 유사하게, CBV 정도의 감소는 또한 항-RAGE 항체 11E6을 사용한 전처리에 의해 소멸되었지만 대조군 항체(도 9c)에 의해서는 소멸되지 않았다. 이들 데이터는 알츠하이머 질환과 관련된 동물 모델에서 항체, 11E6의 생체내 기능성 활성을 입증한다.
실시예 11: CDR -이식된 항체의 작제
당업계에 널리 공지된 표준 방법을 적용함에 의해, 모노클로날 항체 11E6의 VH 및 VL 쇄의 CDR 서열(상기 표 4 참조)을 상이한 사람 중쇄 및 경쇄 수용체 서열에 이식시켰다. 본 발명의 모노클로날 항체 11E6의 VH 및 VL 서열과 서열 VH 및 VL의 정렬을 기준으로 하기의 공지된 사람 서열을 선택한다:
a) 중쇄 수용체 서열을 작제하기 위한 연결 서열 hJH6 뿐만 아니라 VH7-4.1 및 VH1-2(상기 표 2에 따름);
b) 경쇄 수용체 서열을 작제하기 위한 hJK2 뿐만 아니라 1-12/L5 및 3-15/L2(상기 표 3에 따름).
11E6의 상응하는 VH 및 VL CDR을 당해 수용체 서열에 이식시킴에 의해 하기의 CDR 이식된 사람화된 변형된 VH 및 VL 서열을 제조하였다(또한 표 5 참조): VH 11E6.1-GL, VH 11E6.2-GL, VL 11E6.1-GL 및 VL 11E6.2-GL.
실시예 12: CDR 이식된 항체에서 프레임워크 복귀 돌연변이의 작제
사람화된 항체 프레임워크 돌연변이를 생성시키기 위해, 돌연변이를, 당업계에 널리 공지된 방법을 사용하는 가변 도메인 및/또는 돌연변이 프라이머 및 PCR의 새로운 합성을 사용하는 CDR 이식된 항체로 도입하였다. 복귀 돌연변이 및 다른 돌연변이의 상이한 조합으로 하기와 같이 각각의 CDR-이식체를 작제한다.
중쇄 VH 11E6.1-GL에 대해, 하기의 버니어 및 VH/VL 접면 잔기 중 하나 이상을 다음과 같이 복귀 돌연변이시켰다: V2 -> I, 및/또는 Y95 -> F.
중쇄 VH 11E6.2GL에 대해 하기의 버니어 및 VH/VL 접면 잔기 중 하나 이상을 다음과 같이 복귀 돌연변이시켰다: V2 -> I, V68 -> F, M70 -> F, R72 -> L, Y95 -> F.
경쇄 VL 11E6.1-GL에 대해 하기의 버니어 및 VH/VL 접면 잔기 중 하나 이상을 다음과 같이 복귀 돌연변이시켰다: A43 -> S, Y49 -> F, Y87 -> F.
경쇄 VL 11E6.2-GL에 대해 하기의 버니어 및 VH/VL 접면 잔기 중 하나 이상을 다음과 같이 복귀 돌연변이시켰다: A43 -> S, Y49 -> F, I58 -> V, Y87 -> F.
추가의 돌연변이는 다음을 포함한다:
중쇄
VH 11E6.1-GL에 대해, Q1 -> E, 및
VH 11E6.2-GL에 대해, Q1 -> E, I76 -> T, R85 -> S, D89 -> E;
경쇄
VL 11E6.1-GL에 대해, V11 -> L, 및
VL 11E6.2-GL에 대해, V13 -> L, E70 -> D.
실시예 13: 재조합 사람화된 항 RAGE 항체의 작제 및 발현
프레임워크 복귀 돌연변이를 함유하는 중쇄 및 경쇄를 보유하는 pHybE 발현 벡터를 293-6E로 동시 형질감염시켜 일시적으로 전장 사람화된 항체를 제조하였다. 돌연변이는 실시예 11에 따라 제조된 바와 같이 가변 도메인의 새로운 합성 및/또는 돌연변이 프라이머 및 PCR 및 당업계에 널리 공지된 방법을 사용함에 의해 CDR 이식된 항체 서열에 도입하였다. 사람화된 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 표 8에 기재되어 있다.
Figure pat00014
Figure pat00015
Figure pat00016
구체적으로 중쇄에 대해:
VH h11E6.1, VH h11E6.2, VH h11E6.3, 및 VH h11E6.4는 Q1 -> E 돌연변이를 갖는 VH 11E6.1-GL을 함유한다.
VH h11E6.5, VH h11E6.6, VH h11E6.7 및 VH h11E6.8은 Q1 -> E 돌연변이 및 하기의 버니어 및 VH/VL 접면 잔기 복귀 돌연변이: V2 -> I 및 Y95 -> F를 갖는 VH 11E6.1-GL을 함유한다.
VH h11E6.9, VH h11E6.10, VH h11E6.11, 및 VH h11E6.12는 Q1 -> E, I76 -> T, R85 -> S, 및 D89 -> E 돌연변이를 갖는 VH11E6.2-GL을 함유한다.
VH h1lE6.13, VH h11E6.14, VH h11E6.15, 및 VH h11E6.16은 Q1 -> E, I76 -> T, R85 -> S, D89 -> E 돌연변이 및 하기의 버니어 및 VH/VL 접면 잔기 복귀 돌연변이: V2 -> I, V68 -> F, M70 -> F, R72 -> L, 및 Y95 -> F를 갖는 VH 11E6.2-GL을 함유한다.
경쇄에 대해:
VL h11E6.1, VL h11E6.5, VL h11E6.9, 및 VL h11E6.13은 V11 -> L 돌연변이를 갖는 VL 11E6.1-GL을 함유한다.
VL h11E6.2, VL h11E6.6, VL h11E6.10, 및 VL h11E6.14는 V11 -> L 돌연변이 및 하기의 버니어 및 VH/VL 접면 잔기 복귀 돌연변이: A43 -> S, Y49 -> F, 및 Y87 -> F를 갖는 VL 11E6.1-GL을 함유한다.
VL h11E6.3, VL h11E6.7, VL h11E6.11, 및 VL h11E6.15는 V13 -> L 및 E70 -> D 돌연변이를 갖는 VL 11E6.2-GL을 함유한다.
VL h11E6.4, VL h11E6.8, VL h11E6.12, 및 VL h11E6.16은 V13 -> L 및 E70 -> D 돌연변이 및 하기의 버니어 및 VH/VL 접면 잔기 복귀 돌연변이: A43 -> S, Y49 -> F, I58 -> V, 및 V87 -> F를 갖는 VL 11E6.2-GL를 함유한다.
실시예 14: 경쟁 ELISA 를 사용한 사람화된 11 E6 항체의 특성 분석
ELISA 플레이트 (Costar 3369)를 0.2M 탄산나트륨-중탄산나트륨 완충액, pH 9.4 중에서 50 μl/웰의 2μg/ml hRAGE (1-331)을 사용하여 4℃에서 밤새 피복시키고, 세척 완충액(0.1% Tween 20을 함유하는 PBS)으로 세척하고, PBS 중에 2% 탈지 분유의 200 μl/웰을 사용하여 실온에서 1시간 동안 차단시켰다. 세척 완충액으로 세척한 후, 50ul/웰의 ELISA 완충액 중에서 81 μg/ml의 최종 농도 및 연속으로 3배 희석된 부분에 개시하여 비오티닐화된 m11E6 (0.3 μg/ml 최종 농도) 및 비표지된 경쟁인자 시험 항체의 혼합물을 2중으로 첨가하였다. 1시간 동안 실온에서 플레이트를 항온처리하고 세척 완충액으로 세척한 후, 결합된 항체를 ELISA 완충액 중에서 HRP-접합된 스트렙타비딘(Fitzgerald)의 1:10,000 희석의 10ul/웰을 사용하여 검출하였다. 실온에서 1시간 동안 항온처리하고 세척 완충액으로 세척한 후, 100 μl/웰의 TMB 완충액(Zymed)을 첨가하여 발색시켰다. 실온에서 15분 동안 항온처리한 후, 50ul/웰의 1N 염산을 첨가하여 종료시켰다. 흡광도는 490 nm에서 판독하였다. 표 9는 컴퓨터 소프트웨어 GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA)을 사용하여 수득된 사람화된 11E6 항체의 IC50 값을 보여준다.
Figure pat00017
실시예 15: 항 RAGE mAb 와 RAGE 의 상호작용에 대한 결합 상수의 측정
Biacore 2000 및 Biacore T100 장치를 사용하여 항-RAGE mAb 결합 동력학을 측정하였다. mAb 친화성 분석을 위한 분석 포맷은 고정화된 항-Fc 항체를 통한 Fc계 포획이다. 표준 아민 커플링 프로토콜을 사용하여 1급 아민을 통해 CM5 센서칩(Biacore)의 카복시-메틸(CM) 덱스트란 표면에 고정화시켰다. 마우스 항-RAGE mAb의 연구를 위해, 항-마우스 Fc (Biacore, 항-마우스, BR-1005-14)는 고정화된 포획 시약으로서 사용하고 사람화된 항-RAGE mAb의 연구를 위해, 항-사람 Fc (Pierce 31125)를 고정화된 포획 시약으로서 사용하였다. Biacore 2000 및 Biacore T100으로 시판되는 자동화된 프로토콜을 사용하여 센서칩의 모든 4개 플로우셀에서 8000-10000 RU의 포획 시약을 고정화시켰다. 간략히 설명하면, CM-덱스트란 표면은 새롭게 제조된 1:1 5OmM N-하이드록시석신이미드(NHS):200mM 3-(N,N-디메틸아미노)프로필-N-에틸카보디이미드(EDC)에 의해 활성화시켰다. 이어서 항-Fc IgG 포획 시약(10mM 나트륨 아세테이트 중 20ug/ml, pH4.5)을 표면에 적용하고 이어서 표면을 탈활성화시키고 1M 에탄올아민(pH 8.5)로 잔류 반응 부위를 차단시킨다.
사용된 전개 완충액은 사람화된 항체에 대해 PBS-P [1 X PBS(Sigma P3813) pH 7.4, 0.005% P20 계면활성제 (Biacore)]이었다. 각각의 실험 사이클은 하기의 단계로 이루어져 있다: 1) 항-RAGE mAb를 플로우셀 2, 3 또는 4에서 50 내지 200 RU(항원에 따라)의 수준으로 포획시켰다. 모든 측정은 어떠한 포획된 항-RAGE mAb도 갖지 않는 플로우셀 1에 대해 참조되었다. 2) 항원은 80ul/분에서 240ul를 모든 4개의 플로우셀을 통해 주사하였다. 항원 주사 후, 분해를 80ul/분에서 600초 동안 모니터링하였다. 3) 항-Fc 포획 표면은 낮은 pH 글라이신으로 재생시켰다. 동력학적 측정을 위해, 항원 주사는 단지 무작위화된 2중으로 완충액 및 3OnM에서 0.12nM(sRAGE[RAGE(1-331)]으로의 3배 희석 시리즈이었다.
데이터는 Biacore 평가 소프트웨어 또는 Scrubber 2.0 소프트웨어(BioLogic Software)를 사용하여 프로세싱하였다. 간략히 설명하면, 당해 데이터는 처음에 표준 셀로부터 시그널을 공제하고 2번째는 완충액만의 주사로부터의 시그널을 공제하여 2중으로 참조되었다. 이어서 RAGE 주사 시리즈로부터 2중 참조된 데이터는 질량 전달 항을 포함하는 1:1(Langmuir) 결합 모델에 광범위하게 적합되어 결합 동력학 속도 상수, k a 및 k d , 및 친화성 K D (ka = kon; kd = koff)를 측정하였다.
Figure pat00018
KD 값은 모든 3개의 mAb에 대해 2자리 pM이고 이들의 결합 동력학에 관하여 3개의 mAb간에는 유의적인 구분이 없는 것처럼 보인다. 현재 실험에서, 본래의 마우스 11E6 mAb는 당해 항원(사람 sRAGE 1-331, V#400)으로 평가하였고 또한 2자리 pM MD이었다.
본래의 마우스 11E6 mAb는 이전에 29OpM인 것으로 보고되었다. 그러나 당해 초기 실험은 상이한 완충 시스템(Biacore 완충액 HBS- EP+: 1OmM HEPES, pH 7.4, 15OmM NaCl, 3mM EDTA, 0.05%P20)을 사용하였다. 완충액 선택은 물론 동력학에 영향을 미칠 수 있다.
실시예 16: 노화된 Tg2576 마우스에서 생체내 뇌혈류 용적 ( CBV ) 연구
16.1. 동물
알츠하이머 질환의 Tg2576 마우스 모델(Hsiao et al.,1996)은 햄스터 프리온 단백질(PrP) 프로모터의 조절하게 고수준의 APP (APPK670N,M671L)의 스웨덴 돌연변이를 발현한다. 당해 돌연변이가 분비된 Ab42 및 Ab40에서 동시적 증가를 유발하는 것으로 익히 확립되었다. Tg2576 마우스가 노령화됨에 따라, 플라크는 알츠하이머 질환에서 나타나는 것들과 유사한 것으로 나타난다. 추가로, Tg2576 마우스는 Y 미로, T 미로, 및 Morris 수중 미로 시험[참조: Hsiao et al. (1996) Correlative memory deficits, Ab elevation, and amyloid plaques in transgenic mice. Science 274:99-102]에 의해 분석된 바와 같이 연령 의존성 행동 결핍을 나타낸다.
16.2 항체 제조
음성 IgG 대조군 항체 및 항-RAGE 항체인 11E6 (둘다 >99% 순수)을 제조원(Abbott Laboratories)에서 합성하였다.
16.3. fMRI 를 사용한 CBV 측정
fMRI-CBV 실험을 20G/cm 자기장 구배 삽입체(Biospec Bruker, Billerica, MA)를 사용한 7.0 T/21 cm 수평 자석 상에서 수행하였다. 노화된 Tg2576 마우스(19 내지 20월령)을 메디토미딘(1 mg/kg, i.p.; Pfizer Animal Health, Exton, Pennsylvania, USA)+케타민(75 mg/kg, i.p.; Fort Dodge Animal Health, Iowa, USA)을 사용하여 마취시킴에 이어서 전달하기 위한 코일 및 수용하기 위한 표면 코일 공간을 함유하는 이원-코일의 작은 동물 압죄기(Insight Neuroimaging Systems, LLC, Worcester, MA)에 놓았다. 호흡율 및 파동형태를 전력 변환기를 통해 연속적으로 모니터링하였다. 직장 온도를 모니터링하고 피드백 조절된 순환 물 패드를 통해 37 ± 1℃로 유지시켰다. 모든 이미지화를 광 단계동안에 수행하였다. 코일 대 코일 전자기 상호작용을 활성적으로 탈커플링시켰다. 해부 이미지는 신속한 스핀 에코 신속 획득 이완 증진된 (RARE) 펄스 서열을 사용하여 획득하고 이때, TR = 3 s, 유효 TE = 100 ms, 매트릭스 = 256 x 256, FOV = 2.56 cm x 2.56 cm, 9개의 1.0-mm 슬라이스 및 4개의 평균이다. 구배 에코 단일-샷 에코-평판 이미지화(EPI)는 fMRI-CBV 이미지 획득을 위해 사용하였고 이때, TR = 2 s, TE = 13 ms, 매트릭스 = 64 x 64, FOV = 2.56 cm x 2.56 cm이고 평판내 분리는 = 400 μm x 400 μm이다. 10 mg의 Fe/kg 초소형 초자성 산화철 (USPIO) 조영제(SH U555C, Schering AG, Germany)를 18분 이미지 획득으로 정맥내 2분 투여하였다. 마우스 11E6 또는 비특이적 마우스 IgG1(대조군 항체)는 시린지 펌프(1분 동안 0.1ml/분)를 사용한 조영제 6분 후 꼬리 정맥을 통해 투여하고 CBV의 변화는 후속 10분 기간 동안 검출하였다.
16.4. fMRI 데이터 분석
데이터 분석은 Analysis of Functional NeuroImages (AFNI) 소프트웨어 팩키지 (Cox, 1996)를 사용하여 수행하였다. 시간 의존적 상대적 CBV 변화 rCBV(t)를 동정하기 위해 수학식 1의 관계를 기초로 하는 시간 경과 미처리 데이터로부터 계산하였다(Mandeville et al, 1999).
[수학식 1]
Figure pat00019
여기서, s(t)는 Aβ 또는 PBS 주입 후 시그널 강도이고, So(t)는 Aβ 또는 PBS 주입 전 기본 시그널이고 Spre는 조영제 투여 전 평균 시그널 강도이다. 시간-경과 rCBV 변화는 혈액으로부터 조영제의 제거를 설명하는 선형 함수로 최소제곱화하였다(Cox, 1996).
후속적으로, 모든 마우스에서 각각의 복셀에 대한 약물의 동력학을 반영하는 rCBV 시그널을 비선형 미분 대수 모델에 피팅하였고(수학식 2)(Luo et al, 2004) 여기서 t 0 은 반응의 시간 지연이고, k는 곱셈 계수이고 α1는 제거율이고 α2는 흡수율이다.
[수학식 2]
Figure pat00020
t 0 , k, α1 및 α2에 대한 최종 값은 자동적으로 모델 피팅의 최대 유의성을 기초로 AFNI를 사용하여 측정하였다. 활성화된 rCBV 복셀을 이어서 본페로니 보정 후 p < 0.05에서 측정하였다. CBV 증가와 함께 전뇌 활성화된 복셀을 기록하였다. 비전환된 데이터는 ANOVA 가정과 일치하지 않기 때문에 Box-Cox 전환을 사용하여 적절한 정규성 및 변량 동질성을 보장한다. 11E6 효과는 fMRI-CBV 모델에서 19월령의 TG2576 마우스에서 IgG1에 대해 통계학적으로 유의적이다(p<0.05).
결과는 첨부된 도 10에 나타낸다. 본 발명의 데이터는, RAGE내 다양한 에피토프를 표적화하는 폴리클로날 항-RAGE 항체가 APP 유전자전이 마우스에서 뇌혈 관류를 증가시킴을 보여주는 딘(Deane)(Deane et al, 2003)에 의한 결과를 확대시킨다. 본 발명의 데이터는 처음으로 RAGE내 C2 도메인을 표적화하는 모노클로날 항체 11E6가 APP 유전자전이 마우스에서 뇌혈 관류를 증가시킴을 보여준다. 당해 효과는 RAGE로의 고수준의 Aβ의 경쟁 결합에 의해 매개되는 것으로 추정된다. 고수준의 Aβ는 사람 APP의 과발현으로 인해 뇌 및 혈장에 존재한다. 따라서, 11E6을 사용한 AD 환자의 치료는 잠재적으로 신경 기능을 개선시키는, 당해 환자내 뇌 관류를 증가시킬 수 있다. 동시에 환자의 치료는 잠재적으로 치료 동안에 뇌 혈류 추적에 의해 모니터될 수 있다.
실시예 17: 항체 11 E6 에 의한 Aβ 유도된 다이나민 절단으로부터 해마 뉴런의 보호
17.1. 해마 뉴런의 배양
랫트 해마 뉴런은 문헌[참조: Goslin and Banker. (1991) Rat Hippocampal Neurons in Low-Density Culture. In: Banker G and Goslin K (ed). Culturing Nerve Cells, MIT Press, Cambridge]에 따라 약간 변형시켜 제조하였다. 간략히 설명하면, 19일령의 배아 랫트의 해마를 절개하고 뇌막으로부터 제거하였다. 해마 뉴런은 조직을 트립신 처리하고(0,1% 트립신 / 17-20분 / 37℃) 이어서 화염 광택 파스퇴르 피펫으로 연마하여 수득하였다. 해마 뉴런은 0.5 내지 3ml의 무혈청 배양 배지(신경기본 배지, B27 보충물, 2mM L-글루타민;1% 페니실린-스트렙토마이신; Invitrogen, Karlsruhe, Germany)를 사용하여 폴리-D-라이신 피복된 6웰 또는 24웰 플레이트(Biocoat™ plate; BD Biosciences, Heidelberg, Germany)로 0.2-1.0 x 105 세포의 밀도로 분주하였다. 세포를 적어도 21일 동안 37℃, 5% CO2에서 배양하고 배지의 3분의 1을 1주일에 1회 교환하였다.
17.2. Aβ 유도된 다이나민 절단
Aβ는 문헌[참조: Kelly, B. L., and Ferreira, A. (2006; J Biol Chem 281(38), 28079-28089; Kelly, B. L., Vassar, R., and Ferreira, A. (2005) J Biol Chem 280(36), 31746-31753)]에 따라 약간 변형시켜 응집시켰다. 간략히 설명하면, Aβ1-40 (American Peptide, Sunnyvale, Ca)을 무혈청 배양 배지에 0.1mg/ml로 용해시키고 4일 동안 37℃에서 항온처리하였다. 항-RAGE 모노클로날 항체 11E6, KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin (Megathura crenulata, Abbott))에 대해 지시된 IgG1 이소형 모노클로날 항체 또는 PBS를 최종 용적 225μl-1ml에서 일정한 교반하에 25℃에서 1시간 동안 응집된 Aβ와 항온처리하였다. 당해 혼합물을 배양 배지에 첨가하여 각각 5μM Aβ (단량체로서 계산됨) 및 2μM 항체의 최종 농도를 수득한다. 모든 처리는 3중으로 수행하고 Aβ 또는 항체가 첨가되지 않은 웰을 추가의 대조군으로서 포함시켰다. 추가로 24시간 동안 세포를 배양하고 웨스턴 블롯으로 프로세싱하기 전에 광학 현미경으로 간단히 조사하였다. Aβ를 사용한 처리는 항온처리 기간 동안에 명백한 뉴런 사멸을 유도하지 않았다.
17.3. 웨스턴 블롯 , 다이나민 절단의 정량화, 및 통계학적 분석
배양 배지를 제거하고 세포를 PBS로 1회 세척하였다. 세포를, 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일(Roche, Mannheim, Germany)을 함유하는 냉 완충액(5OmM Tris-HCl pH 7.5 ; 15OmM NaCl ; 1% NP-40 ; 1% Triton X-100 ; 2mM EDTA)을 첨가하여 용해시켰다. 세포를 박리시키고 파쇄물을 5분 동안 4℃에서 13000g에서 원심분리시켰다. 상청액을 제거하고 총 단백질 농도를 상업용 키트 (Bio-Rad, Munchen, Germany)를 사용하는 브래드포드 방법에 의해 측정하였다. 단백질을 로딩 완충액 (Bio-Rad, Munchen, Germany)으로 1ug/ul까지 희석시키고 5분 동안 비등시켰다. 25 μg의 각각의 샘플을 4-20% SDS-PAGE (Invitrogen, Karlsruhe, Germany)상에서 전개시키고 iBlot 시스템(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)을 사용하여 니트로셀룰로스 막상으로 이전시켰다. 또는, 세포를 직접 96웰 플레이트상에서 용해시키고 로딩 완충액으로 희석하고 1/4 내지 1/5의 단백질을 SDS-PAGE상에 로딩하였다. 막을 1 x 차단 시약 (Roche, Mannheim, Germany)을 사용하여 1 내지 2시간 동안 실온에서 차단시키고 이어서 4℃에서 밤새 다이나민 I에 대한 1차 항체와 항온치리하였다(PA-1-660; 1:1000 희석; 친화성 BioReagents, Golden, Co). 후속적으로 서양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 2차 항체(염소 항-토끼 IgG, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)를 1시간 동안 실온에서 블롯에 적용하고 증진된 화학발광 (SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate; Pierce, Rockford, Il)을 사용하여 검출하였다. 면역블롯 시그널은 VersaDoc 시스템 (Bio-Rad, Munchen, Germany)로 가시화하고 온전한 다이나민 I(약 100kDa)는 Quantity One 소프트웨어 (Bio-Rad, Munchen, Germany)를 사용하여 정량하였다 . 정상화를 위해, 블롯을 37℃에서 30분 동안 박리시키고(Restore Western Blot Stripping Buffer; Pierce, Rockford, Il), PBS 중에서 세척하고 βIII 튜불린(TuJ-I, 1:1000 희석, Abcam, Cambridge, MA)에 대해 지시된 1차 항체 및 2차 항체(당나귀 항-마우스 IgG, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)로 재프로빙하였다. Aβ로 처리되지 않은 세포의 정상화된 다이나민 I 발현의 평균을 100%로 설정하였다. 3개의 별도의 실험의 % 데이터는 일원배치 ANOVA (Kruskal-Wallis 시험)에 이어서 듄(Dunn) 시험 (GraphPad Prism™; GraphPad Software, San Diego, Ca)에 의해 통계학적 유의성에 대해 분석하였다.
17.4. 항- RAGE 항체 11 E6 는 해마 뉴런을 Aβ 유도된 다이나민 절단으로부터 보호한다.
응집된 Aβ1-40은 최근에 해마 뉴런에서 시냅스 마커 단백질 다이나민 I의 절단을 유도하는 것으로 나타났다(문헌참조: Kelly et al, 2005; Kelly & Ferreira, 2006). 완전히 공개된 결과에 따라, 본 발명자는 응집된 Aβ와 24시간 동안 해마 뉴런의 항온처리 후 온전한(약 100kDa)의 다이나민 I의 현저한 감소 및 동시에 약 90kDa 절단 생성물의 증가를 관찰했다(도 11, 상부 패널). 항-RAGE 항체 11E6와 Aβ의 예비 항온처리는 약 70%까지 절단을 차단하였다. 대조적으로, RAGE-비관련 쥐 IgG1 이소형 대조군 항체는 어떠한 보호도 제공하지 못하였다(도 11, 상부 패널). 3중 샘플의 밀도측정 스캐닝, 대조군 단백질(βIII 튜불린) 양으로의 정상화 및 3개의 독립적인 실험의 분석은 관찰된 보호 효과의 통계학적 유의성을 밝혔다(도 11, 하부 패널; 일원배치 ANOVA; p<0,05).
실시예 18: 시냅스 전달의 글로불로머 유도된 억제에 대한 항체 11 E6 의 효 과
18.1. 시험 A
유기형 해마 슬라이스 배양물은 문헌[참조: Stoppini et al (Journal of Neuroscience Methods, 37, Issue 2, April 1991, Pages 173-182 "A simple method for organotypic cultures of nervous tissue" L. Stoppinia, P. -A. Buchsa and D. Muller)]의 변형된 프로토콜에서 제조하였고 3일 동안 고칼륨 배지에서 이후 34℃/5% CO2에서 액체/기체 접면에서 보충된 신경기본 A 배지에서 배양하였다.
랫트 해마 슬라이스 배양물은 9일령 Wistar 랫트로부터 제조하고 시험관내에서 15일 내지 16일째에 사용하였다. 슬라이스 배양물을,
- 1 μM 1-42 글로불로머,
- 0.1 μM 11E6 (RAGE mAb ML 39-11E6 정제 #4194, 샘플 #6116) + 1 μM 1-42 글로불로머
- 대조군(글로불로머 한외여과물 + SDS) 중 어느 하나와 함께 밤새 배양하였다.
동시 배양 그룹에서, 당해 항체를 글로불로머 2시간 전에 슬라이스 배양 배지에 적용하였다. 인공 뇌척수액으로 연속 관류하에 접면 기록 챔버에서 기록을 수행하였다. 자기 여기 시냅스후 전위를 상이한 전압 강도에서 2상 펄스로 샤퍼 콜래트럴(Schaffer collateral)의 자극 후 CA1 영역으로부터 기록하였다. 샤퍼 콜래트럴은 0.5M 이극성 텅스텐 전극(WPI; Saraosta USA)을 사용하는 2상 펄스(0.1ms/상)로 자극시키고, fEPSP 진폭을 aCSF (0.7-1.1 Megaohm, GC150F-15, Harvard Apparatus, Hugstetten, Germany)로 채워진 유리 전극으로 기록하였다. 전력 CED 1401 (Cambridge Electronic Design Ltd., Cambridge, UK)을 사용하여 시그널을 디지털화하고 Signal 2.14 (Cambridge Electronic Design Ltd., Cambridge, UK)을 사용하여 분석하였다.
당해 결과는 도 12a에 나타낸다. 글로불로머 적용은 시냅스 전달을 강하게 억제하였다. 0.1 μM 11E6의 동시 적용은 글로불로머 유도된 결손을 완전히 역전시켰다. 따라서, 11E6는 시냅스 전달에서 글로불로머 유도된 결손을 역전시킬 수 있다.
18.2. 시험 B
랫트 해마 슬라이스 배양물을 9일령 Wistar 랫트로부터 제조하고 시험관내에서 16일 내지 18일째 사용하였다. 슬라이스 배양물을,
- 1 μM 1-42 글로불로머
- 0.1 μM IgG1 mAb H35C206 (KLH) + 1 μM 1-42 글로불로머
- 대조군 (SDS) 중 어느 하나와 밤새 항온처리하였다.
상이한 강도에서 샤퍼 콜래트럴의 자극 후 CA1으로부터 기록을 수행하였다(인공 뇌척수액 중에서).
당해 결과는 도 12b에 나타낸다. 글로불로머 적용은 시냅스 전달을 강하게 억제하였다. IgG1의 동시 적용은 글로불로머 유도된 결손을 역전시키지 못하였다. 따라서, IgG 대조군 항체는 0.1μM에서 시냅스 전달에서 글로불로머 유도된 결손을 역전시키지 못한다.
실시예 19: Tg2576 마우스의 전두엽 피질에서 아밀로이드 플라크에 대한 항체 11E6의 효과의 원위치 분석.
이들 실험을 위해 14.5월령 Tg2576 마우스(Hsiao et al., 1996, Science; 274(5284), 99-102)를 사용하였다. 당해 마우스는 소위 스웨덴 돌연변이(K670N/M671L)을 갖는 사람 APP를 과발현하고 약 11월령에서 뇌 유조직에서 β 아밀로이드 침적물을 형성하였다. 12월령에서 시작하여 마우스에 500 μg 11E6 (n=19) i.p. (복강내) 또는 IgG1 대조군 항체(n=19)를 12주 동안 1주 1회 주사하였다. 마지막 주사 후, 동물을 깊히 마취시키고 경심적으로 0.1 M 포스페이트 완충 식염수(PBS)를 관류시켜 혈액을 플러싱(flushing)하였다. 이어서 뇌를 두개골로부터 제거하고 종축으로 분할하였다. 뇌의 하나의 대뇌반구를 급속 동결시키고 다른 하나는 4% 파라포름알데하이드내로 함침시켜 고정화시켰다. 함침 고정화된 대뇌반구를 PBS 중 30% 슈크로스에 적셔 동결보호시키고 동결 마이크로톰상에 탑재하였다. 전체 전뇌를 40 μm 섹션으로 절단하고 PBS 중에서 수거하고 후속 염색 과정을 위해 Superfrost® Plus 유리 슬라이드(Menzel Glaeser, Braunschweig, Germany)상에 탑재하였다. 아밀로이드 플라크를 함유하는 Aβ의 염색은 하기의 프로토콜에 따라 자동 염색 장치(Ventana Discovery®, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)에서 단량체 Aβ(Barghorn et al., 2005, J. Neurochem.)에 대해 생성된 마우스 모노클로날 항체 6G1을 사용하여 수행하였다:
- 유리 슬라이드상의 섹션을 완전히 공기 건조시키고 Ventana 기계로 옮긴다
- 세척 및 차단 단계를 포함하는 발색성 디아미노 벤지딘(DAB) 과정을 위해 Ventana에 의해 제공된 자동 프로토콜을 사용하고 DAB MapTM 키트를 사용한 염색을 사용하였고 실험자는 항원 복구 및 1차 및 2차 면역조직화학을 당해 자동화 프로토콜에 포함시켰다:
- 항원 복구는 45분 동안 95℃에서 컨디셔너 #2(시트라트계 완충액, pH 6.0)의 존재하에 수득하였다
- 3시간 동안 37℃에서 항체 희석제(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) 중에서 6G1(1:500)과의 항온처리
- 37℃에서 30분 동안 비오티닐화된 2차 항체 당나귀 항-마우스 IgG(1:500; Jackson ImmunoResearch, Newmarket, UK)와의 항온처리
- 자동화 염색의 마무리 후, 슬라이드를 정상의 물로 세척하고 등급화된 에탄올 중에서 탈수시키고, XTRA-Solve® (J.T. Baker, Griesheim, Germany)에서 세정하고, UltraKitt® (J.T. Baker, Griesheim, Germany)로 커버슬립하였다
플라크 염색은 ImagePro 5.0 이미지 분석 시스템을 사용하여 신피질의 3개의 조직학적 절편에서 정량하였다. 실험자는 분석하에 마우스의 처리에 대해 알지 못하고 하기의 파라미터를 측정하였다: 신피질의 면적, 6G1 양성 염색으로 덮여진 면적 및 염색된 플라크의 개수. 이들 파라미터는 가변적이고 정상적으로 분포되지 않는다. 따라서, 플라크 로드의 감소는 통계학적으로 단측 Mann-Whitney U-시험에 의해 평가하였다. Tg2576 마우스에서 Aβ 침적 염색의 결과는 도 13에 나타낸다.
갈색 DAB 침적물의 평가는 항-RAGE 항체가 신피질에서 아밀로이드 플라크의 수 및 면적을 각각 24.5% 및 26.8% 감소시켰음을 보여주었다(p<0.1). 플라크 수 및 면적의 감소는 전두엽 신피질에서 가장 명백하였다 (p<0.05).
본원에 인용된 문헌은 참조로서 인용된다.
<110> Abbott GmbH & Co. KG Abbott Laboratories <120> Antibodies to receptor of advanced glycation end products (RAGE) and uses thereof <130> M/49231-PCT <150> US 61/051,863 <151> 2008-05-09 <150> US 61/093,416 <151> 2008-09-01 <160> 94 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH 7F9 <400> 1 Glu Glu Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Leu Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Ile Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Tyr Tyr Ser Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Gly Ser 65 70 75 80 Val Ser Leu Gln Met Asp Asn Leu Thr Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95 Phe Cys Ala Arg Asn Ala Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH 7F9 CDR-H1 <400> 2 Asn Tyr Trp Met Asp 1 5 <210> 3 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH 7F9 CDR-H2 <400> 3 Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Tyr Tyr Ser Thr His Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH 7F9 CDR-H3 <400> 4 Asn Ala Tyr Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 <210> 5 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL 7F9 <400> 5 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ala Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Asp Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL 7F9 CDR-L1 <400> 6 Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser Val Ala 1 5 10 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL 7F9 CDR-L2 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Glu Ser Ile Tyr Ser Glu Glu Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH 11E6 CDR-H3 <400> 12 Ser Arg Met Val Thr Ala Tyr Gly Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 13 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mAb VL 11E6 <400> 13 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Phe Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Leu Ser Asn Met Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Val Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mAb VL 11E6 CDR-L1 <400> 14 Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mAb VL 11E6 CDR-L2 <400> 15 Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mAb VL 11E6 CDR-L3 <400> 16 Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 17 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mAb VH 4E5 <400> 17 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn His Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Ile Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Ala Gly Thr Ala Arg Ala Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 18 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mAb VH 4E5 CDR-H1 <400> 18 Asn Tyr Leu Ile Glu 1 5 <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mAb VH 4E5 CDR-H2 <400> 19 Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr 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5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mAb VL 4E5 CDR-L3 <400> 24 Leu Gln Tyr Ala Ser Phe Pro Phe Thr 1 5 <210> 25 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 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Pro Arg Val 1 5 10 15 Trp Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln Leu Val Val Glu 20 25 30 <210> 78 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide 8 <400> 78 Val Val Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr 1 5 10 15 Leu Thr Cys Glu Val Pro Ala Gln Pro Ser Pro Gln Ile His 20 25 30 <210> 79 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide 9 <400> 79 Gln Ile His Trp Met Lys Asp Gly Val Pro Leu Pro Leu Pro Pro Ser 1 5 10 15 Pro Val Leu Ile Leu Pro Glu Ile Gly Pro Gln Asp Gln Gly 20 25 30 <210> 80 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide 10 <400> 80 Asp Gln Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr His Ser Ser His Gly Pro 1 5 10 15 Gln Glu Ser Arg Ala Val Ser Ile Ser Ile Ile Glu Pro Gly 20 25 30 <210> 81 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PCR Primer <400> 81 Cys Cys Gly Ala Ala Thr Thr Cys Cys Gly Gly Ala Ala Gly Cys Ala 1 5 10 15 Gly Gly Ala Thr Gly Gly Cys Ala Gly Cys Cys Gly 20 25 <210> 82 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PCR Primer <400> 82 Cys Cys Cys Thr Cys Gly Ala Gly Cys Cys Cys Cys Thr Cys Ala Ala 1 5 10 15 Gly Gly Cys Cys Cys Thr Cys Ala Gly Thr Ala Cys Thr Ala Cys Thr 20 25 30 <210> 83 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR Primer <400> 83 agtaacggcc gccagtgtgc tggaattcgg a 31 <210> 84 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PCR Primer <400> 84 Cys Cys Gly Gly Thr Ala Cys Cys Ala Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly 1 5 10 15 Thr Thr Gly Gly Cys Cys Cys Cys Thr Cys Cys Thr Cys Gly Cys Cys 20 25 30 <210> 85 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR Primer <400> 85 cgaagcttga tgaacaggaa tggaaaggag accaag 36 <210> 86 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR Primer <400> 86 tcctcgagca cctgcagttg gcccctcctc gcct 34 <210> 87 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR Primer <400> 87 gcaccatggc agccggaaca gcagttg 27 <210> 88 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR Primer <400> 88 gagtctcgag gcagaatcta caatttctg 29 <210> 89 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR Primer <400> 89 atgctacata tgaaaaagac agctatcgcg attgcagtgg cactggctgg tttcgctacc 60 gtagcgcagg ccgctcaaaa catcacagcc 90 <210> 90 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR Primer <400> 90 atgctactcg agtcagtggt ggtggtggtg gtgagttccc agccctgatc ctcccacaga 60 gcctgcagtt ggcccctcc 79 <210> 91 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR Primer <400> 91 gtacgatatc gagggacgaa tggatccacc gtgcccagca cc 42 <210> 92 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR Primer <400> 92 ctagtctaga tcatttaccc ggagacaggg ag 32 <210> 93 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR Primer <400> 93 gtacgatatc gagggacgaa tggatccacc gtgcccagca cc 42 <210> 94 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR Primer <400> 94 ctagtctaga tcatttaccc ggagacaggg ag 32

Claims (4)

  1. 사람 최종 당화 산물의 수용체 (RAGE)에 특이적으로 결합하는 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 단편으로서, 상기 항체가 사람 RAGE의 C2 도메인 내의 에피토프에 결합할 수 있으나 사람 RAGE의 V 도메인 또는 C1 도메인 내의 에피토프에 대한 결합 활성을 갖지 않는, 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 분리된 모노클로날 항체가 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 76, 서열번호 77, 서열번호 78, 서열번호 79 및 서열번호 80으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 에피토프에 대해 결합 활성을 갖지 않는, 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 단편.
  3. 제1항에 있어서, 상기 분리된 모노클로날 항체가 서열번호 79의 서열에 대한 결합 활성을 갖지 않는, 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 단편.
  4. 제1항에 있어서, 상기 C2 도메인 내의 에피토프가 사람 RAGE (서열번호 60)의 아미노산 잔기 235-336, 227-317, 229-341, 229-331 및 229-330으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인, 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 단편.
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