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KR20050002906A - 콜라겐 생구조물 및 그 제조방법 및 용도 - Google Patents

콜라겐 생구조물 및 그 제조방법 및 용도 Download PDF

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KR20050002906A
KR20050002906A KR10-2004-7015383A KR20047015383A KR20050002906A KR 20050002906 A KR20050002906 A KR 20050002906A KR 20047015383 A KR20047015383 A KR 20047015383A KR 20050002906 A KR20050002906 A KR 20050002906A
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biostructures
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안트로제네시스 코포레이션
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Abstract

본 발명은 양막으로부터 생산된 본 명세서에서는 콜라겐 생구조물(biofabric)로 정의되는 콜라겐 막에 관한 것이다. 본 발명의 콜라겐 생구조물은 천연 비-처리된 양막의 구조적 형태, 즉 천연 3차 또는 4차 구조를 갖는다. 본 발명은 양막을 탈세포화(decellularize)하여 융모막 및 양막을 갖는 태반 막 바람직하게는 인간 태반 막으로부터 콜라겐 생구조물을 제조하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시예에서 상기 양막은 완전히 탈세포화된다. 본 발명의 콜라겐 생구조물은 예를 들어 혈관 재생, 혈관의 제조 및 대체, 건 및 인대 대체, 상처-드레싱, 외과적 이식, 안과적 사용, 봉합 및 다른 것들을 포함하는 의학 및 수술 분야에 다양한 용도를 갖는다. 본 생구조물의 잇점은 생역학적 강도, 유연성, 봉합성 및 특히 인간 태반으로부터 유래한 경우에 낮은 항원성에 부분적으로 기인한다.

Description

콜라겐 생구조물 및 그 제조방법 및 용도{COLLAGEN BIOFABRIC AND METHODS OF PREPARATION AND USE THEREFOR}
2.1 양막: 해부 및 조직학
태반 낭(sac)은 느슨한 결합조적에 의해 밀접하게 연결된 두 층으로 구성되어 있다. 그들은 양막 및 융모막 층들로 알려졌다(도1 참조). 양막 층은 가장 안쪽의 두층이고, 태아를 둘러싼 양수와 접촉하고 그들은 함께 양막 낭을 형성한다. 양막 층은 무혈성(avascular)이고 기저막 위에 있는 단층 원주상피세포에 의해 정렬(line)되어 있고 30에서 60 마이크론의 두께를 갖는다. 융모막은 낭의 가장 외부 층이고 심하게 세포화(cellularize)되어있다. 혈관 관계(tree)는 태반에서 기원하고 융모막 층을 통하여 태반막으로 확장한다. 융모막 층은 느스한 결합조직에 의해 양막 층으로부터 분리되고 결합되며, 그 두층은 120에서 180 마이크론이다. 태반 막들은 무코다당류들(mucopolysaccarides)괴 심하게 적재된 콜라겐 매트릭스를 가지고 그들은 태아가 자라기 위한 보호 낭으로 주로 작용하는 것으로 알려졌다. 그 막은 어미 순환에 존재하는 감염원 및 면역원에 대한 장벽을 유지하기도 한다. 태반들은 능동 및 수동 수송 모두를 갖는다. 가장 작은 분자와 단백질들은 그들을 통하여 자유롭게 통과할 수 있으나 IgM와 같은 큰 단백질들은 기저막을 통과할 수 없다.
95 % 에틸알콜 또는 조직 배양 배지와 50대 50 % 비율에 섞인 글리세롤에 태반 막들(동물 또는 인간으로부터 온)의 보존은 냉동 전에 양막의 보존을 위하여 활용되었다. 이 보존제들은 핵 농축(pyknotic)을 만드는 태반 조직의 생존을 제거하나 콜라겐 매트릭스 및 기저막들은 보존된다. 흥미롭게, 보존의 양 형태들은 또한 이식된 막들의 항원성을 제거하고 또한 잠재적인 독서원을 제거한다.보존은 종종 양막이 융모로부터 조심스레 분리된 후에 보존은 대체로 달성된다. 기저 막(basal lamina) 및 상피를 갖는 양막 쪽은 광택이 있고(shiny), 융모 반대편은 무디다(dull).
2.2 양막의 전 진료 적용(PREVIOUS CLINICAL APPLICATIONS OF AMNIOTIC MEMBRANES)
동물원성 감염증 병을 운반하거나 교차-종(cross-species) 거부를 일으키는 이종 조직들(다른 종으로부터 온 조직들)을 갖는 가능한 잠재적 문제들은 이들 조직들을 덜 바람직하게 만들었다. 동종 또는 같은 종의 다른 개인들로부터 이식들은 인간 이식 물질에 대한 바람직한 소스로 계속되었다.이식을 위한 인간의 기증자 조직들의 부족은 조직 이식을 위한 새로운 물질의 개발을 촉진해 온 커가는 문제이다. 아주 종종 생물학적 생(raw) 물질의 공급원은 부족하고 얻기 어렵고 매우 비싸다. 그러나, 인간의 양막으로부터 콜라겐 시트는 조직 이식 적용에 유용한 바람직한 생역학적 특성을 갖는다. 따라서 양막들은 동족 이식 물질에 대한 좋은 공급원이다.
양막 및 융모막을 포함하는 태반 막은 1910년 만큼 이른 시기에 문서화된 수술에 사용되었고 1979년에 Trelford와 Trelford-Sauder에 의하여 재검토 되었다(Trelford와 Trelford-Sauder,1979, Am. J. Obstet. Gynecol . 833 참조). 1910년에 Davis는 예를 들어 화상 및 궤양 피부에 대한 피부 이식 수술에 수술 재료로서 태아 막들의 사용을 처음 보고하였다(Davis 외, 1910, John Hopkins Med. J; 15 : 307 참조). 이 연구는 주로 동물들에게 있었고 인체 실험들은 기대에 어긋나게 판명 되었다. 그 후 외과수술에 양막들의 사용은 확장되었다(Stern 외, 1913, JAMA, 13: 973-4; Sabella 외, 1913 Med. Records NY, 83: 478-80; de Rotth 외, 1940 Arch. Opthalmol, 23: 522-5; Sorsby 외, 1946, Br. J.Opthamlol. 30: 337-45 참조). 그것은 현재 회상 피부, 피부 상처들 및 다리의 만성 궤양에 대한 생물학적 드레싱으로, 인공 질의 외과적 재건에서 부수적 조직으로 및 배꼽탈장을 보수하는데 사용된다(예를 들어 Trelford 및 Trelford-Sauder, 1979,134 Am.J. Obstet. Gynecol. 833; Colocho 외, 1974 Arch. Surg. 109: 370-3; Faulk 외. 1980, Lancet, 1156; Prasad 외, 1986, J. Trauma, 26: 945-6; Subrahmanyan 외, 1995,J. Plastic Surg. 48: 477-8; Gruss 외, 1978, J. Can. Med. Assoc. 118: 1237-46; Ward 외, 1984, Br.J. Plastic Surg. 37: 191-3; Dhall, 1984, J. Obstet. Gynaecol. 91: 279-82 참조). 그것은 또한 복부 머리 및 골반의 수술과정에서 조직 결합을 막는데 사용되어 왔다(Gharib 외, 1996, Pediatr. Surg. Int. 11: 96-9;Rennekampff 외, 1994, Invest. Surg. 7: 187-93). 1940 년대에, 몇몇 저자들은 여러가지 눈 표면 이상을 치료하는데 상기 양막의 유익한 역할을 발표하였다(예를 들어 de Rotth 외, 1940 Arch. Opthalmol, 23: 522-5; Sorsby 외, 1946, Br. J.Opthalmol. 30: 337-45;Lavery 외, 1946, Trans.Opthalmol. Soc. UK, 66: 668 참조).
이식 수술에서 용도를 위하여 양막의 조제 및 보존을 최적화하려는 상기 분야의 많은 시도들이 이전에 기재되었다(리뷰를 위해선 Dua 외, 1999, Br. J. Opthalmol. 83: 748-52 ("Dua") 참조). 양막들의 여러가지 조제는 융모막 층에서 양막층의 분리 또는 분리없는 식염수 및 항생물질 혼합물, 알콜 탈수에 의한 보존을 포함하였다. 그러나 Dua 및 상기에서 언급한 참고문헌들에 설명된 모든 방법들은 여전히 양막들의 조제 및 보존에서 개량에 의하여 발표될 필요가 있는 단점을 갖는다. 더 최근에는 각막 상피 결함을 보정하기 위한 조직 이식 수술과정에 적용하기 위하여 양막의 보존에 대한 해동에 의존하는 방법들이 공지되었다. 예를 들어미국 특허 번호 6,152, 142 및 6,326, 019 B1("Tseng")을 참조. 트셍(Tseng)은 기질에 올려지고 Dulbecco 변형 이글 배지 및 글리세롤의 혼합물에 보존하고 -80℃에 냉동된 양막이 공지되었다. 그것의 제조동안에 특정 시간에서 조직의 냉동 과정은 트셍 양막을 부서지게하고 심지어는 해동 및 활성화의 단계 후에 더 부서지게한다. 이 외에도 해동 및 활성화 단계는 양막의 취급을 위해 필요한 시간을 증가한다. 게다가 보존 및 제조에서 냉동 단계에 의한 트셍 양막의 부서짐때문에 구조적 지지대 또는 뒷받침(backing)이 저정 동안 트셍 양막의 구조적 보전을 위해 필요하다. 이것은 뒷받침으로부터 보존된 양막을 분리하는 어려움 즉 그것의 부서짐에 기인하여 원형대로 취급하고 분리하기 어려울 수 있는 증가된 어려움을 제공한다. 따라서 뒷받침으로부터 양막의 분리는 막의 파열의 가능성을 증진시키고, 수술 진행에 조제 시간의 증가를 이끄는 수술 과정을 수행하기 전에 냉동된 양막으로 활성화 용액을 흡수되게 하는 양막 활성화에 필요한 시간의 길이를 증가시킨다. 저장 및 선적(shipping)도 -80℃ 냉동에 의하여 복잡화된다. 결국 트셍의 막들은 일반적으로 탈세포화되지 않는다; 결과적으로 그렇게 제조된 양막들은 전형적으로 불투명하고 단일한 구조적 조성물을 가지고 있지 않다.
더 최근에 Yui 등의 미국 특허 번호 5,618, 312("312 특허")는 치밀층으로부터 콜라겐 시트의 제조를 설명하였다.비록 설명된 재료가 주로 콜라겐이지만 그것은 매우 약해서 의학적 사용, 예컨대 봉합(suturable)을 위하여 그것을 충분하게 강하게 만들기 위하여 가교(crosslinking)의 분리 단계를 필요로 하는 가공이 필요하다. '312 특허'에서 설명된 가교의 한 방법은 콜라겐의 자연 구조에 역 효과를주는 것으로 알려진 높은 열처리 바람직하게는 100에서 110℃를 채택한다. Yui외 미국 특허 번호 5,876, 451호는 태반으로부터 유도된 유사한 콜라겐 재료를 설명한다. 그러나, 이 재료는 제조과정에서 매트릭스 콤포넌트의 천연 구조의 파괴 및/또는 분열을 야기할 것 같은 탈세포화 단계의 일부로 프로테이즈로 처리된다. 따라서 개량된 구조적 특성을 가지고 의학적, 진단적 및 화장품에 이용되는 개량된 양막에 대한 것이 당업계에 필요하다. 본 발명은 천연 콜라겐 4차 구조를 유지하며 기존의 콜라겐 기초된 생구조물과는 다른 콜라겐을 포함하는 그러한 생구조물을 제공한다.결과적으로, 본 발명의 생구조물은 용이하게 제조되고, 용이하게 사용되며 의학적 및 수술적 목적에 충분한 강도를 가지며 상처 치료에 대한 뛰어난 기질을 제공한다.
본 발명은 양막으로부터 생산된 본 명세서에서는 콜라겐 생구조물(biofabric)로 정의되는 콜라겐 막에 관한 것이다. 본 발명의 콜라겐 생구조물은 천연 비-처리된 양막의 구조적 형태, 즉 천연 3차 또는 4차 구조를 갖는다. 본 발명은 양막을 탈세포화(decellularize)하여 융모막 및 양막을 갖는 태반 막 바람직하게는 인간 태반 막으로부터 콜라겐 생구조물을 제조하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시예에서 상기 양막은 완전히 탈세포화된다. 본 발명의 콜라겐 생구조물은 예를 들어 혈관 재생, 혈관의 제조 및 대체, 건 및 인대 대체, 상처-드레싱, 외과적 이식, 안과적 사용, 봉합 및 다른 것들을 포함하는 의학 및 수술 분야에 다양한 용도를 갖는다. 본 생구조물의 잇점은 생역학적 강도, 유연성, 봉합성 및 특히 인간 태반으로부터 유래한 경우에 낮은 항원성에 부분적으로 기인한다.
도1은 인간 태반의 융모막 및 양막이다.
도2의 A는 처리 전, B는 처리 후의 콜라겐 생구조물의 사진이다.
도3은 콜라겐 생구조물이다. 본 발명의 콜라겐 생구조물은 양각(emboss)형태를 갖는 단일한 반투명 표면을 갖는 것으로 예시된다.
도4는 메시 구조 및 그것의 건조된 생구조물 그림이다.
3. 발명의 요약
본 발명은 부분적으로 발명자들의 개량된 물리적 및 생물리적 특성들을 갖는 새로운 콜라겐 생구조물을 야기하는 태반 바람직하게는 인간 태반에서 온 콜라겐 생구조물의 제조에 대한 새로운 방법의 발견과 관련된다.바람직하게는 제조 방법은 양막의 최소 가공에 관련된다.그것의 가공되어진 방법에 기인한 선행기술에서 기재된 것과 다른 본 발명의 콜라겐 생구조물은 원래의 천연 3차 및 4차 구조를 갖는다. 본 발명은 또한 증가된 인장 강도, 봉합성 및 감소된 숙주 이식 거부를 야기하는 감소된 면역성의 우수한 특성을 갖는 태반 유래 양막 또는 생구조물을 제공한다. 본 발명은 또한 냉동 또는 저온보존없이 탈수된 시트로 보존할 수 있는 태반유래 양막 또는 생구조물을 제공한다.바람직하게는 태반 유래 양막은 인간 환자들에 사용하기위한 인간태반으로부터 유래한다. 그러나, 동일한 방법은 동물 환자들에 수의학적 사용을 위하여 여러가지 동물 종으로부터 태반들을 사용하여 채택될 수 있다.
본 발명은 태반 바람직하게는 인간 태반을 제공하고 서로서로로부터 융모막 층과 양막 층을 분리하고 양막을 탈세포화고 그 밑에 있는 세포외 매트릭스의 구조를 보존하는 것을 포함하는 콜라겐 생구조물을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명은 상기 탈세포화된 양막을 세척하고 건조하는 것을 더욱 포함한다. 이 방법은 상온에서 살균 저장 조건하에서 안정할 수 있는 탈수되고 탈세포화된 생구조물을 만들고, 그것은 차후에 재수화되고 대상에 이식된다.
특정 실시예에서 상기 태반은 제왕 절개 분만 또는 자연 분만을 겪은 인간 여성으로부터 온 것이고, 바람직한 실시예에서 상기 태반이 적어도 하나의 전염병에 대한 테스트를 한 공여자로부터 온 것인지를 결정하는데 사용되는 것으로 당업계에 알려진 혈청학적 및 세균학적 분석이 사용된다. 또 다른 실시예에서 상기 태반의 공급원은 공여자의 의학적 역사, 혈액형, 면역 데이터 및 유전자형 특성을 포함하여 알려졌다. 비록 태반은 어떤 포유류에서 올수 있지만 바람직하게는 상기 공여자는 인간 여성이다. 일 실시예에서 상기 태반은 융모막으로부터 양막을 분리하기 전에 당업계에 공지된 일반적인 방법을 사용하여 방혈된다.
본 발명에 따른 양막의 탈세포화는 상기 양막 예를 들어 상기 양막의 태아 측과 상기 양막의 어미 쪽으로부터 온 모든 가시적인 세포 물질 및 세포찌거기를제거하는 것을 포함한다. 양막의 탈세포화는 양막의 구조적 보전을 붕괴시키거나 생화학적 조성을 변화시켜서는 안된다. 따라서 본 발명에 따른 양막의 탈세포화는 양막의 제조의 어느 지점에서 냉동 또는 프로테이즈로 막을 접촉하는 것을 구성하지 않는다. 바람직하게는 상기 양막은 용액을 갖는 약한 세제 예를 들어 0.01-1.0% 데옥시코릭산(deoxycholic acid) 나트륨 염 모노하이드레이트, 비이온성 세제, 트리톤 X-100, 음이온성 세제 및 소디움 도데실 설페이트 또는 그것의 혼합물을 포함하는 용액을 사용하여 탈세포화한다.
일단 본 발명의 방법에 따라 양막이 탈세포화되면 상기 막은 세척되고 바람직하게는 진공하에서 낮은 열로 건조될 수 있다.
일 실시예에서 본 발명은 천연 3차 또는 4차 구조를 갖는 막이고, 탈수되고, 탈세포화되고 기질 없는 양막을 포함하는 콜라겐 생구조물을 제공한다. 다른 실시예에서 본 발명은 콜라겐, 에라스틴 및 피브로넥틴을 포함하는 탈세포화되고 기질 없는 양막을 포함하는 콜라겐 생구조물을 제공한다. 또 다른 실시예에서 상기 양막이 결코 프로테이즈와 접촉되지 않는 조건에서 탈수되고, 탈세포화되고 단일하고, 반투명하고 기질 없는 양막을 포함하는 콜라겐 생구조물을 제공한다.
일 실시예에서 콜라겐 생구조물은 하나 이상의 생분자들 예를 들어 항생물질, 호르몬, 성장 인자, 항-종양제, 항진균제, 항바이러스제, 통증 치료제, 항히스타민제, 항염증제, 항감염제, 상처 치유제, 상처 봉합체, 세포 유인제 및 스캐폴딩제 및 그 유사체를 포함하나 이에 한정되지 않는 치료제를 더욱 포함한다. 특정 실시예에서 상기 콜라겐 생구조물은 예를 들어 피브로브라스트 성장 인자, 상피 성장인자 등의 하나 이상의 성장 인자를 포함할 수 있다. 상기 생구조물은 또 특정 생화학적 과정의 특정 저해제 예를 들어 막 수용체 저해제, 카이네이즈 저해제, 성장 저해제, 항암제, 항생제 등과 같은 작은 유기 분자를 포함하나 이에 한정되지 아니하는 하나 이상의 작은 분자들을 포함할 수있다. 일 실시예에서 콜라겐 생구조물은 그것의 의도된 사용에 따라 수술에 대한 생산 또는 제조 동안에 한 생 분자를 포함한다.
일 실시예에서 본 발명은 본 발명의 생구조물의 적어도 두층들을 포함하는 래미네이트(laminate) 및 그 제조방법을 포함한다. 다른 실시예에서 본 발명은 시트, 화이버, 구, 튜브를 포함하나 이에 한정되지 아니하는 의도된 사용에 따른 복잡한 3차 스캐폴딩으로 그 래미네이트를 형성하는 것을 포함한다.
일 실시예에서 본 발명은 양막 및 융모막을 포함하는 태반을 제공하고; 융모막으로부터 양막을 분리하고; 양막을 탈세포화하는 것을 포함하는 양막 래미네이트 제조방법을 포함한다. 다른 실시예에서 본 발명은 적어도 한번 상기 탈세포화된 양막을 세척하고 양막 라미네이트를 형성하기 위하여 적어도 두 탈세포화된 양막을 서로 접촉하여 적층하고 탈세포화된 양막 래미네이트를 건조하는 단계를 더욱 포함한다. 대안적으로 다른 실시예에서 양막 래미네이트 제조방법은 본 발명의 방법에 따라 제조된 적어도 두 양막을 건조하고 양막 라미네이트를 형성하기 위하여 적어도 두 탈세포화된 양막을 서로 접촉하여 적층하는 것을 포함한다.
몇몇 실시예에서 본 발명의 방법에 따라 제조된 상기 양막층들은 양막 라미네이트를 형성하기 위하여 접착제 존재하에서 서로 접촉하여 위치할 수 있다. 본발명의 조성물 및 방법에 따라 사용된 접착제는 당업자에 공지된 생물학적 접착제 바람직하게는 생체들과 잘 교합하는 접착제 예를 들어 피브로넥틴, 피브린과 같은 천연 접착제, 합성 접착제를 포함하나 이에 한정되지 아니한다. 타 실시예에서 본 발명의 방법에 따라 제조된 상기 양막층들은 양막 라미네이트를 형성하기 위하여 서로 가교(cross-linking)된다. 당업자에게 공지된 가교제 및 방법은 본 발명의 범위에 포함되고 화학 가교, 펩타이드 가교, UV 가교, 방사선 가교, 피브로넥틴 가교, 피브리노겐 가교, 하이드로겔 가교를 포함하나 이에 한정되지 아니한다. 타 실시예에서 본 발명의 방법에 따라 제조된 양막 라미네이트은 접착제를 포함하지 않는다.
일 실시예에서 본 발명은 수술 이식으로서 콜라겐 생구조물을 포함한다. 특정 실시예에서 본 발명은 수술 자리에 직접 이식체를 위치하는 것을 포함하는 대상 바람직하게는 인간에서 수술 과정에서 수술 이식의 사용을 포함한다.
본 발명은 하나 이상의 하이드로 겔 조성물을 더욱 포함하는 콜라겐 생구조물, 양막 라미네이트 또는 3차 스캐폴딩을 포함한다. 상기 하이드로 겔 조성물은 폴리비닐 알콜, 폴리에틸렌 글라이콜, 히아루로닉산, 및 그것의 유도체 또는 아나로그로 를 포함하나 이에 한정되지 아니하는 폴리머를 포함할 수 있다.
일 실시예에서 본 발명의 콜라겐 생구조물, 양막 라미네이트, 3차 스캐폴딩, 또는 그것의 하이드로 겔 조성물은 단일하고 컨후루언트한 세포들인 줄기 세포, 분화된 성인세포, 전구세포 및 그 유사체 바람직하게는 인간의 세포로 더욱 군집시킬 수 있다.
본 발명은 특별하게 상업적인 규모의 생산에 한정되지 아니하는 높은 수준의 콜라겐 생구조물, 그것의 라미네이트, 그것의 3차 스캐폴딩 및 그것의 하이드로 겔 조성물의 생산방법을 제공한다. 본 발명은 진료적 시도 및 상업적 규모의 사용을 위한 대량의 양막을 생산하는 어려움을 해결하였다.
본 발명의 콜라겐 생구조물은 약물 운반; 조직 공학; 예를 들어 요실금의 보정과 같은 비뇨기 관련 용도; 눈 표면 이상의 치료와 같은 안과적 사용; 눈 수술 이식; 혈관 재생, 혈관의 신설 및 대체와 같은 혈관적 사용; 감소된 밸브를 세우는 의치(prosthetic) 장치와 같은 심장학적 사용; 예를 들어 손상된 신경 특히 두랄루민 대체 및 신경 교통 주위의 의치로서 잘려진 말초 신경의 재생과 같은 신경 관련 사용; 골 대체물로서 정형학적 치료와 같은 골 관련 사용; 상처(외부 및 내부), 급성 및 만성 상처, 선천적 상처 및 화상의 치료와 같은 피부과적 사용; 피부 결함, 노화된 피부, 주름들, 세선들, 피부 가늘어짐, 감소된 피부 탄력성, 거친 피부, 및 태양 손상 피부와 같은 피부 이상 치료; 상처 드레싱; 및 상처 감염의 치료에 적합하다.
특정한 실시예에서 본 발명은 예를 들어 대상의 질병화된 각막 표면 상에 수술 이식으로 생구조물을 위치하여 본 발명의 콜라겐 생구조물을 사용하는 것을 포함하는 대상에서 예를 들어 눈 표면 질병과 같은 눈 관련 질환 또는 이상을 치료 및/또는 예방하는 방법을 포함한다. 또 다른 실시예에서 본 발명은 본 발명의 생구조물을 사용하는 것을 포함하는 예를 들어 생구조물로 피부에 접촉하여 대상에서 피부 이상을 치료 및/또는 예방하는 방법을 포함한다. 또 다른 실시예에서 본 발명은 본 발명의 생구조물로 상처 및/또는 화상에 접촉하는 것을 포함하는 대상에서 상처 및/또는 화상을 치료 및/또는 예방하는 방법을 포함한다. 다른 실시예에서 본 발명은 임플란드로 본 발명의 콜라겐 생구조물을 사용하는 것을 포함하는 대상 바람직하게는 인간에서 요실금을 치료하는 방법을 포함한다.
다른 실시예에서 본 발명은 본 발명의 콜라겐 생구조물로 대상에 접촉하는 것을 포함하는 대상에 치료제를 운반하는 방법을 포함한다. 본 발명은 예를 들어 조직 공학에서 살아 있는 세포들로 본 발명의 콜라겐 생구조물 또는 래미네이트를 군집하는 것을 포함하는 대상에 세포들을 운반하는 방법을 포함한다.
본 발명은 수술 과정에 사용을 위하여 본 발명의 생구조물을 포함하는 수술 이식을 체공한다. 수술 이식은 대상 바람직하게는 인간의 내부 또는 외부에 적용할 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 포유류 바람직하게는 인간의 태반에서 유래한 콜라겐 막 또는 생구조물을 제공한다. 상기 콜라겐 생구조물은 최종 산물에 천연 콜라겐 구조 즉 천연 3차 및 4차 구조를 갖기 위하여 제조되었다. 콜라겐 생구조물외에 본 발명은 또한 콜라겐 생구조물을 제조하고, 의학적 세팅에 상기 생구조물을 사용하는 방법을 제공한다.
본 발명은 천연 3차 및 4차 구조를 갖는 탈수되고 탈세포화된 기질 없는 양막을 포함하는 콜라겐 생구조물을 제공한다. 일 실시예에서 콜라겐 에라스틴 및 피브로넥틴을 포함하는 탈세포화된 기질 없는 콜라겐 생구조물을 제공한다.
몇몇 실시예에서 본 발명은 본 발명의 콜라겐 생구조물을 포함하는 양막 래미네이트를 제공한다.본 발명의 방법에 따라 제조된 양막 래미네이트는 양막 래미네이트 형성하기 위하여 서로 접촉하여 위치하는 적어도 두 층의 콜라겐 생구조물을 포함한다. 다른 실시예들에서 본 발명은 본 발명의 콜라겐 생구조물을 포함하는 튜브 같은 3차 구조 스캐폴드를 제공한다.다른 실시예에서 본 발명은 본 발명의 콜라겐 생구조물, 그것의 래미네이트 또는 하이드로겔 조성물을 더욱 포함하는 그것의 3차 스캐폴드를 제공한다.
따라서 본 발명은 래미네이트, 3차 스캐폴드 및 하이드로겔 조성물을 포함하나 이에 한정되지 아니하는 콜라겐 생구조물의 여러 형태 및 형상을 제공한다. 본 발명은 본 발명의 조성물의 의학적 유용한 형태를 제공한다. 특정한 형태 또는 형상에 관계없이 본 발명의 조성물은 하나 이상의 생분자들 바람직하게는 치료제를 더욱 포함할 수 있다.본 발명의 조성물은 명세서에서 자세하게 기재된 것과 같은 의학 분야에서 여러 유용성을 갖는 생분자를 포함한다. 몇몇 실시예에서 본 발명은 세포들이 균일하고 컨후루언트하기 위해서 살아있는 세포들로 본 발명의 조성물을 군집시키는 것을 포함한다. 세포들로 군집화된 본 발명의 조성물은 예를 들어 조직 공학 목적을 위한 것과 같이 의료 및 치과 분야에 다양한 유용성을 갖는다.
본 발명은 또한 콜라겐 생구조물, 그것의 래미네이트 그것의 3차 스캐폴드 또는 하이드로겔 조성물을 제조하는 방법들에 관한 것이다. 특정한 실시예에서 본 발명은 융모막으로부터 양막을 분리하는 단계; 및 상기 양막이 효소 예를 들어 프로테이즈와 접촉하지 않기 위하여 양막을 탈세포화하는 단계를 포함하는 양막과 융모막을 갖는 태반으로부터 콜라겐 생구조물을 제조하는 방법을 제공한다. 다른 실시예에서 본 방법은 상기 탈세포화된 양막을 세척하고 건조하는 것을 더욱 포함한다. 또 다른 특정한 실시예에서, 본 발명은 융모막으로부터 양막을 분리하는 단계; 상기 양막을 탈세포화하는 단계; 및 양막 래미네이트(laminate)를 형성하기 위하여 적어도 두 상기 탈세포화된 양막을 서로 접촉하여 적층하는 단계를 포함하는 양막과 융모막을 갖는 태반으로부터 양막 래미네이트을 제조하는 방법을 제공한다.특정한 실시예에서 상기 탈세포화된 양막은 적층 전에 건조된다.또 다른 특정한 실시예에서 상기 탈세포화된 양막은 적어도 두 상기 탈세포화된 양막을 서로 접촉하여 적층된 후에 건조된다.
본 발명은 의료, 치과 및 수술 세팅에 본 발명의 콜라겐 생구조물, 그것의 래미네이트, 그것의 3차 스캐폴드 또는 그것의 하이드로겔 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 사실상, 본 발명의 조성물들은 당업계에 공지된 다른 생물질에 비하여 증가된 치료 및 진료적 유용성을 갖는다고 기대된다. 몇몇 실시예에서 본 발명은 본 발명의 조성물을 사용하여 대상에서 눈 관련 질병 또는 이상을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 특정한 실시예에서 본 발명은 대상의 질환있는 눈 표면에 상기 생구조물을 위치하는 것을 포함하는 대상에서 눈 관련 질병 또는 이상을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.
다른 실시예들에서 본 발명은 본 발명의 조성물을 사용하여 대상 바람직하게는 인간의 피부 질환을 치료료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 특정한 실시예에서 본 방법은 조성물을 대상의 피부에 접촉하는 것을 포함한다. 또 다른 특정한실시예에서, 본 조성물은 피부 질환의 자리인 대상의 피부 표면에 직접 위치된다.본 발명은 또한 상처 또는 화상의 위치에 본 발명의 조성물을 접촉하여 대상 바람직하게는 인간에서 상처 또는 화상을 치료하는 방법을 제공한다.
다른 실시예에서 본 발명은 눈 수술; 심혈관 수술; 치주 수술; 신경학상 수술; 치과 수술 및 정형외과 수술과 같은 수술 과정에 본 발명의 조성물(예를 들어 콜라겐 생구조물, 양막 래미네이트)을 사용하는 것을 제공한다.
본 발명은 대상 바람직하게는 인간에 생분자 바람직하게는 치료제를 전달하기 위하여 본 발명의 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.본 발명은 또한 대상 바람직하게는 인간에 본 발명의 조성물을 사용하여 세포들을 전달하는 방법을 제공하고 여기서 본 발명의 조성물은 세포들로 더 군집화되었다.
5.1 콜라겐 생구조물
본 발명은 본 명세서에서 콜라겐 생구조물로 정의되는 콜라겐 양막을 제공한다. 본 발명의 콜라겐 생구조물은 천연, 비처리된 양막의 구조적 형태 유지하는데, 즉 콜라겐, 에라스틴 및 가능하게는 피브로넥틴과 같이 그 조성물 내에 구조 단백질의 3차 및 4차 구조를 유지한다. 이처럼, 본 발명의 콜라겐 생구조물은 천연 또는 비처리된 양막과 같은 구조 단백질로 구성된다. 양막을 생산하는 종래의 방법은 프로테아제나 고열처리의 사용을 요구하는데, 그 결과로서 이러한 막들은 조성물 내에서 구조 단백질의 3차 및 4차구조를 유지하지 않는다.
특정 실시예에서, 본 발명은 탈수되고, 탈세포화되며, 기질이 없는(즉, 필터 뒷받침없는) 양막을 제공하는데, 그러한 양막은 천연 3차 및 4차 구조를 갖는다(도2A 및 B 참조). 본 발명의 탈수되고 탈세포화된 양막은 균일한, 즉 최소한 세포 물질이 없는 반투명한 생구조물로서, 탈세포화된 매트릭스의 좌선성 삼중 나선 알파 나선형 시트을 포함하고 도 3에 나타난 바와 같은 외관을 갖는다 (예를들면, Molecular Biology of the Cell, 1989, Alberts et al., ed., Garland Publishing Inc., New York, NY 참조; 본 명세서에서 본 인용문헌은 참고로서 그대로 포함된다.).
본 발명의 콜라겐 생구조물은 예를 들면 말, 소, 돼지나 협비류 원숭이와 같은 어떠한 포유류의 양막으로부터 얻어질 수 있는데, 가장 바람직한 것은 인간의 태반으로부터 얻어지는 것이다. 바람직한 실시예에서, 본 발명의 생구조물은 그 조성물내에 콜라겐 물질의 천연 3차 및 4차구조를 포함한다.
본 발명의 콜라겐 생구조물은 종래 기술분야에서 기술된 것과는 대조적으로 최소한으로 가공되는데, 즉, 본 발명의 콜라겐 생구조물은 예를 들면 약한 세제에서 탈세포화되는 것처럼 기껏해야 하나의 화학적 또는 생물학적 처리 또는 가공을 겪게되는 것이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "최소한으로 가공된"이라는 것은 콜라겐 생구조물의 제조 중에 어떠한 단계에서라도 본 발명의 양막이 효소 처리, 예를 들면 프로테아제 처리, 고열 처리, 거친 화학 처리, 강한 세제나 산에 노출이 없는 것을 의미한다. 양막의 프로테아제 처리는 탈세포화 단계의 부분으로서, 생구조물의 구조적 형태와 타협하는데, 예를 들면 콜라겐 물질의 3차 및/또는 4차 구조에 영향을 준다. 반면에, 본 발명의 생구조물의 제조에 있어서 양막의 최소 가공은 종래 기술분야에서의 것들에 비하여 향상된 기계적 강도를 갖는 결과물과 반투명성 결과물을 초래한다.
탈세포화되고 기질이 없는 본 발명의 콜라겐 생구조물은 피브로넥틴 및 에라스틴 뿐만 아니라 콜라겐(콜라겐 타입 I, IV 및 II를 포함하되 이에 한정되지는 않는다)을 포함한다. 본 명세서에서 기술된 방법에 따라 제조되므로, 이 조합은 본 발명의 생구조물의 향상된 기계적 강도에 부분적으로 원인이 된다. 최소 처리 및 가공의 결과로서, 본 발명의 콜라겐 생구조물은 천연 막의 조성물을 유지한다. 콜라겐은 척추동물의 주된 구조 물질이고, 주된 기계적 기능을 하는 조직에 존재한다. 콜라겐 분자는 정상 좌선성 수퍼나선(superhelix)을 형성하는 세가닥 로프에서처럼 서로 주위에 짝을 이룬 알파 사슬(각각 약 1000개의 아미노산의 길이)로 불리워지는 3개의 폴리펩타이드 사슬로 구성된다. 적어도 19개 타입의 콜라겐이 밝혀졌으며, 그들 모두 동일한 3차 구조를 포함한다. (예를 들면, Lee et al.,2001, International J.ofPharmaceutics, 221: 1-22 참조)
본 발명의 양막은 형태, 생역학적 및 구조적 특성이 종래 기술에 보고되고 발명자들에게 알려진 것들보다도 우수한데, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 부분적으로 양막과 인간 태반의 조절되고 풍부한 근원의 신규한 제조방법의 발견에 근거된다(5.2절 참조).
특히, 본 발명의 콜라겐 생구조물은 종래의 하나 또는 그 이상의 양막과 비교하여 다음과 같이 하나 또는 그 이상의 특징을 갖는다: 향상된 인장강도; 우수한 봉합성; 숙주-이식(host-graft) 거부반응의 감소를 초래하는 감소된 항원성; 냉동이나 저온보존 필요 없는 저장과 운송의 용이성; 사용 전에 취급과 재수화와 같은활성화 공정을 위한 최소한의 후조제(post-preparation) 요구; 및 구조적, 기능적 형태를 유지하면서 장기간 상온에서 저장될 수 있는 능력이다. 표 1은 종래 기술에 비하여 본 발명의 생구조물의 잇점을 정리한 것이다.
대안적인 실시예에서, 본 발명은 탈수되고, 탈세포화되고, 기질이 없는 융모막, 바람직하게는 인간 융모막을 포함하는 콜라겐 생구조물을 제공한다. 융모막을 포함하는 콜라겐 생구조물은 양막을 포함하는 본 발명의 콜라겐 생구조물과 유사한 특성을 갖을 것으로 기대된다. 본 발명은 모두 래미네이트, 3차 스캐폴드 및 하이드로겔 조성물을 포함하되 이에 한정되지는 않는 융모막을 포함하는 콜라겐 생구조물의 모든 의학적으로 유용한 형태를 제공한다.
본 발명의 생구조물 대 종래의 양막 제제
특징 본 발명의 콜라겐 생구조물 종래의 양막
혈청학적 측정 완전함: 항체선별(ATY); 알라닌 아미노 전이효소 선별(ALT); 간염 핵심항체(핵산 및 ELISA); B형간염 표면항원(핵산 및 ELISA); C형간염 바이러스항체(핵산 및 ELISA); HIV-1 및 HIV-2; HTLV-1 및 HTLV-2; 매독 테스트(RPR); CMV항체 테스트; C형간염 및 HIV 테스트(핵산테스트) 불완전함: CMV 테스트 없음.
저장 건조: 저열 진공으로 탈수; 냉동이나 냉장 필요 없음; 선반 보관 냉동: 배양 배지에 보관; 드라이 아이스 선적 및 냉동기/냉장기 필요
수술적 제조 수 분: 수분내 제조; 외과적 자리에서 직접 수화; 예를 들면 식염수 방울로 눈에서; 해동, 적시기 또는 린스 필요 없음. 길다: 장황한 제조/해동/적심시간이 요구됨; 반드시 필터 뒷받침(backing)을 제거해야 함
수술적 취급 간단: 건조 중 흔들어 줄 수 있고; 외과적 자리에 도포되고 난 다음 그 자리에서 수화됨. 장황함: 필터 페이퍼로부터 반드시 제거되어야 함; 외과수술 동안 둥글게 말리는 경향 있음(ball up); 외과적으로 가공하기 어려움
세포충실성 탈세포화: 최소한으로 경피세포가 없음; 최소한으로 세포 찌꺼기가 없음; 더 빨라진 재형성 사세포(dead cell)와 함께: 사세포가 존재; 임상적 증거가 긴 치료시간/높은 거부율을 나타낸다(일화적 증거)
기질 없음: 기질이 없음(예를 들면 필터 뒷받침) 있음: 니트로셀룰로오스/필터 페이퍼에 지지됨.
살균(선택적) 있음: 전자선 조사; 적어도 18kGy; 조직 안전성의 증가된 보증 없음: 항생제 및 글리세롤(유독성)을 포함하는 배지에 저장; 공식적인 최종적인 살균 없음
조직 투명도 반투명: 광학적으로 맑음 불투명: 우유빛 또는 탁한 외관
바람직한 실시예에서, 본 발명의 콜라겐 생구조물은 반투명, 즉 광학적으로 맑다. 다른 바람직한 실시예에서, 본 발명의 콜라겐 생구조물은 얇고 경량이다. 특정 실시예에서, 본 발명의 탈수된 콜라겐 생구조물은 0.3-0.6mg/cm2이다. 특정 실시예에서, 본 발명의 콜라겐 생구조물은 적어도 두께가 30 마이크론이다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 콜라겐 생구조물은 두께가 약 10 - 40 마이크론이다.
본 발명은 다양한 형태, 예를 들면 삽입, 차폐에서 본 발명의 콜라겐 생구조물의 용도를 포함한다. 일반적으로, 생구조물은 어떠한 의학적으로 유용한 형태로도 형성될 수 있다. 예를 들면, 콜라겐 생구조물은 그대로 사용을 위하여, 즉, 전체 태반으로부터 콜라겐 생구조물의 사용을 위하여 형성될 수 있다. 대안적으로, 콜라겐 생구조물은 띠, 패치 또는 롤로 절단되거나 또는 실로 짜여질 수 있다. 다른 실시예에서, 단일-두께 시트 또는 래미네이트로서 콜라겐 생구조물은 일정한 간격으로 잘릴 수 있고, 예를 들면 메쉬를 형성하기 위하여 확장될 수도 있다.
일부 실시예에서, 콜라겐 생구조물은 평평한데, 예를 들면 기울기나 굴곡이 없는 표면을 갖는다. 다른 실시예에서, 본 발명의 콜라겐 생구조물은 완전히 평평하지는 않고, 보조개가 생긴 표면을 갖는데, 예를 들면 표면이 침하 또는 함입된 것이다.
특정의 바람직한 실시예에서, 본 발명은 적어도 본 발명의 콜라겐 생구조물의 두 층을 포함하는 래미네이트를 포함한다. 층들은 물리적으로 함께 결합될 수 있는데, 예를 들면 접착제, 패스너의 사용으로, 또는 상기 층들을 융합시키기 위해서 생구조물의 일부분, 예를 들면 적어도 상기 층들 중 어느 하나의 주변을 열-스탬핑함으로써 될 수 있다. 생구조물은 "그레인"을 가지고 있기 때문에, 상기 생구조물은 다양한 방법으로 래미네이트될 수 있다. 하나의 실시예에서, 래미네이트의 모든 층들은 동일한 그레인 배치를 갖는다. 다른 실시예에서, 층들 중 적어도 하나는 적어도 다른 하나의 층의 그레인 배치에 대하여 90도 회전된(즉, 거의 수직인) 그레인 배치이다. 더욱 특정된 실시예에서, 상기 수직 층은 서로 인접한다. 또 다른 실시예에서, 상기 래미네이트는 적어도 3층의 콜라겐 생구조물을 포함하는데,전술한 적어도 3층의 각각의 그레인 구조는 두개의 나머지 층의 그레인 구조에 대해 약 60도 정도 회전되어 있다. 다른 실시예에서, 상기 래미네이트는 적어도 첫 번째 물질과 두 번째 물질을 포함하는데, 여기에서 전술한 첫 번째 물질은 본 발명의 콜라겐 생구조물이고, 전술한 두 번째 물질은 콜라겐 생구조물과 함께 래미네이트를 형성할 수 있는 어떠한 다른 성분이다. 특정 실시예에서, 전술한 두 번쩨 물질은 양막 이외의 막으로부터 형성된 시트 또는 막이다. 다른 특정 실시예에서, 전술한 두 번째 물질은 비천연 물질인데, 예를 들면 폴리락톤, 폴리아세테이크, 플라스틱 필름 등이다. 일부 실시예에서, 양막 래미네이트는 다층인데, 적어도 6, 적어도 8, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 80, 적어도 100, 적어도 1000개의 본 발명의 방법에 따라서 제조된 양막을 포함한다. 본 발명의 양막 래미네이트는 재한없는 층 수를 포함할 수 있다.
래미네이트는 래미네이트를 복잡한 3차 구조로 형성시키게 하는 증가된 구조적 경직성을 갖는다. 그러한 3차 구조는 시트, 튜브, 중심체를 포함할 수 있다.
콜라겐 생구조물은 또한 단일 시트 또는 래미네이트로서 다른 물질과 결합될 수 있다. 예를 들면, 생구조물은 연성 플라스틱 필름, 거즈, 플라스틱 시팅, 부목(stent), 밸브, 정형외과 장치, 붕대, 패치 등에 결합, 즉 묶일 수 있다.
콜라겐 생구조물은 생구조물의 콜라겐 매트릭스의 일부분이 아닌 하나 또는 그 이상의 화합물이나 성분들을 포함할 수 있다. 예를 들면, 콜라겐 생구조물은 생산 중 또는 외과수술 준비 중에 생분자가 포함될 수 있다. 그러한 생분자는 항생제(클린다마이신, 미노사이클린, 독시사이클린, 겐타마이신과 같은), 호르몬, 성장인자, 항종양제, 항진균제, 항바이러스제, 통증치료제, 항히스타민제, 항염증제, 은 (실버 니트레이트와 실버 설파디아진을 포함하되 이에 한정되지는 않는 은 염과 같은)을 포함하되 이에 한정되지는 않는 항감염제, 원소성 은(elemental silver), 항생제, 살균효소(bactericidal enzymes) (리소좀과 같은), 상처 치유제 (PDGF, TGF를 포함하되 이에 한정되지는 않는 시토킨; 티모신과 같은), 상처 치유제로서 히아루로닉산, 상처 봉합체 (트롬빈을 포함 또는 불포함하는 피브린과 같은), 세포 유인제 및 스캐폴딩제 (피브로넥틴과 같은) 등을 포함하는데, 이에 한정되는 것은 아니다. 특정 예에서, 콜라겐 생구조물은 적어도 하나의 성장 인자를 포함하는데, 예를 들면 섬유모세포 성장인자, 상피 성장인자 등이 있다. 생구조물은 또한 특별한 생화학적 과정의 특정 억제제, 예를 들면 막 수용체 억제제, 키나아제 억제제, 성장 억제제, 항암제, 항생제 등과 같은 작은 유기 분자를 포함할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 본 발명의 콜라겐 생구조물은 하이드로겔과 결합될 수 있다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에게 알려진 어떠한 하이드로겔 조성물이라도 본 발명 내에서 포함될 수 있는데, 예를 들면 다음 문헌에 개시된 하이드로겔 조성물 중 하나이다: Graham, 1998, Med. Device Technol.9 (1) : 18-22; Peppas et al., 2000, Eur. J. Pharm.Biopharm. 50 (1) : 27-46; Nguyen et al., 2002, Biomaterials, 23 (22): 4307-14; Henincl et al., 2002, Adv.Drug Deliv. Rev 54 (1) : 13-36; Skelhorne et al., 2002, Med. Device.Technol. 13 (9): 19-23; Schmedlen etal., 2002, Biomaterials 23: 4325-32; 상기 모든 문헌은 그대로 본 명세서에 참고문헌으로서 포함된다. 특정 실시예에서, 하이드로겔 조성물은 콜라겐 생구조물에 적용되는데, 다시 말하면 콜라겐 생구조물의 표면에 내려진다. 예를 들면, 하이드로겔 조성물은 콜라겐 생구조물 위에 뿌려지고, 생구조물의 표면상에 포화되고, 콜라겐 생구조물에 적셔지고, 콜라겐 생구조물과 담궈지거나 콜라겐 생구조물의 표면에 코팅되어질 수 있다.
본 발명의 방법과 조성물에 유용한 하이드로겔은 당업계에 알려진 어떠한 물과 상호작용하는 또는 수용성 고분자로부터 만들어질 수 있는데, 폴리비닐알콜(PVA), 폴리히드록시에틸 메타크릴레이트, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈, 히아루로닉 산, 덱스트린 또는 이들의 유도체와 유사물들을 포함하되 이에 한정되는 것은 아니다.
일부 실시예에서, 본 발명의 콜라겐 생구조물은 하이드로겔과의 결합 이전에 하나 또는 그 이상의 생분자를 더 포함한다. 다른 실시예에서, 하이드로겔 조성물은 본 발명의 콜라겐 생구조물과 결합하기 이전에 하나 또는 그 이상의 생분자를 더 포함한다. 그러한 생분자들은 항생제(클린다마이신, 미노사이클린, 독시사이클린, 겐타마이신과 같은), 호르몬, 성장인자, 항종양제, 항진균제, 항바이러스제, 통증치료제, 항히스타민제, 항염증제, 은 (실버 니트레이트와 실버 설파디아진을 포함하되 이에 한정되지는 않는 은 염과 같은)을 포함하되 이에 한정되지는 않는 항감염제, 원소성 은(elemental silver), 항생제, 살균효소(bactericidal enzymes) (리소좀과 같은), 상처 치유제 (PDGF, TGF를 포함하되 이에 한정되지는 않는 시토킨; 티모신과 같은), 상처 치유제로서 히아루로닉산, 상처 봉합체 (트롬빈을 포함 또는 불포함하는 피브린과 같은), 세포 유인제 및 스캐폴딩제 (피브로넥틴과 같은) 등을 포함하는데, 이에 한정되는 것은 아니다. 특정 예에서, 콜라겐 생구조물 또는 하이드로겔 조성물은 적어도 하나의 성장 인자를 포함할 수 있는데, 예를 들면 섬유모세포 성장인자, 상피 성장인자 등이 있다. 바람직하게, 생분자는 치료제이다.
일부 실시예에서, 하이드로겔 조성물은 본 발명의 생구조물을 포함하는 래미네이트와 결합된다.
하이드로겔/콜라겐 생구조물 조성물은 의학분야에서 이용되는데, 상처, 화상, 피부 컨디션(예를 들면 흉터의 치료)의 치료, 성형용(예를 들면 성형수술) 및 이식물로서의 어떠한 용도라도 포함되되 이에 한정되지는 않는다. 일부 실시예에서, 하이드로겔/ 콜라겐 생구조물 조성물은 대상물에 국소적으로, 즉 피부의 표면에 도포되는데, 예를 들면 상처의 치료를 위함이다. 다른 실시예에서, 하이드로겔/콜라겐 생구조물 조성물은 대상물의 내부에서 사용될 수 있는데, 예를 들면 이식물로서 신체 내에서 영구적 또는 반영구적 구조가 된다. 일부 실시예에서, 하이드로겔 조성물은 생분해되지 않도록 조제된다. 또 다른 실시예에서, 하이드로겔 조성물은 생분해되도록 조제된다. 특정 실시예에서, 하이드로겔 조성물은 수일 내에 분해되도록 조제된다. 다른 특정 실시예에서, 하이드로겔 조성물은 수 개월내에 분해되도록 조제된다.
일부 실시예에서, 본 발명의 콜라겐 생구조물은 세포들로 군집되는데, 세포들은 단일하고 컨후루언트하다. 본 발명의 생구조물을 군집시키는데 사용될 수 있는 세포들은 줄기세포, 바람직하게는 인간 줄기세포, 인간 분화된 성인세포, 분화전능성의 줄기세포(totipotent stem cells), 다능성 줄기세포(pluripotent stem cells), 다기능성(multipotent) 줄기세포, 조직 특이 줄기세포(tissue specifc stem cells), 배아성(embryonic like) 줄기세포, 수임 선조 세포(committed progenitor cells), 피브로블라스토이드(fibroblastoid) 세포를 포함하되 이에 한정되는 것은 아니다. 다른 실시예에서, 본 발명은 본 발명의 생구조물을 콘드로사이트, 간세포, 조혈세포, 췌장 선세포 조직세포(pancreatic parenchymal cells), 신경모세포 및 근육 선조 세포를 포함하되 이에 제한되지는 않는 선조 세포의 특정 계층으로 군집시키는 것을 포함한다.
5.2 콜라겐 생구조물의 제조과정
본 발명은 본 발명의 콜라겐 생구조물을 제조하는 방법을 제공한다.
특히, 본 발명은 양막과 융모막을 포함하는 태반을 제공하고; 융모막으로부터 양막을 분리하고; 양막을 탈세포화하는 것을 포함하는 콜라겐 생구조물을 제조하는 방법을 포함한다. 특정 실시예에서, 본 방법은 탈세포화된 양막을 세척하고 건조하는 것을 더 수반한다.
바람직하게, 상기 태반은 인간 대상물에서 사용하기 위하여 인간 태반으로부터 기인한 것이다. 일부 실시에에서, 본 발명은 인간 대상물에서 사용하기 위하여 동물 종으로부터 기인한 태반을 포함한다. 다른 실시예에서, 본 발명은 동물 대상물에서 수의학적 사용을 위하여 동물 종으로부터 기인한 태반을 포함한다.
바람직한 실시예에서, 본 발명의 방법에서 사용을 위한 태반은 신생아 분만 후에 가능한한 빨리 취해진 것이다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 태반은 정상적인 건강한 유아의 제왕절개 분만 후에 즉시 취해진 것이다. 제공된 태반은 무균 조건 하에서 수집된다. 일부 실시예에서, 태반은 어떤 추가적인 처리에 앞서 분만 시간으로부터 48시간동안 저장된다. 다른 실시예에서, 태반은 어떤 추가적인 처리에 앞서 분만 시간으로부터 5일까지 저장된다.
바람직하게, 태반, 탯줄 및 탯줄 혈액은 추가적인 처리를 위해서 분만 또는 출산실로부터 다른 장소, 예를 들면 실험실로 이동된다. 바람직하게, 태반은 살균 가방 또는 컨테이너와 같은 살균된 운송 장치로 수송되는데, 선택적으로는 단열된 것이다. 일부 실시예에서, 태반은 다음 처리가 있을 때까지 상온에 보관된다. 다른 실시예에서, 태반은 다음 처리가 있을 때까지 냉장되는데, 즉, 2 내지 8℃에서 보관된다. 또 다른 실시예에서, 태반은 다음 처리가 있을 때까지 살균 조건하에서 5일까지 보관된다. 가장 바람직한 실시예에서, 태반은 당업자에게 알려진 바와 같이 무균 조건 하에서 다루어지고 처리된다. 바람직하게는 상기 실험실은 HEPA 여과 시스템(청정실 분류법에 의한 정의에 따라, 클래스 1000을 갖추거나 또는 그보다 나은)을 갖춘 것이 바람직하다. 바람직한 실시예에서, HEPA 여과 시스템은 본 발명의 방법을 실시하기 위하여 실험실을 사용하기 전 적어도 1시간 작동시킨다.
특정 실시예에서, 태반은 방혈되는데, 즉, 출생 후 남아있는 탯줄 혈액을 완전히 빼낸다. 일부 실시예에서, 상기 태반은 70% 방혈, 80% 방혈, 90% 방혈, 95% 방혈, 99% 방혈된다.
본 발명은 HIV, HBV, HCV, HTLV, 매독, CMV 및 태반 조직을 오염시킨다고 알려진 다른 바이러스성 병원균들을 포함하되 이에 한정되지는 않는 전염병에 대해서당업자에게 알려진 표준 기법을 이용하여 출산 시간 전에 임신중인 모체를 선별하는 것을 포함한다. 바람직하게, 전염병에 대해서 선별하는데 사용되는 방법은 연방 의약국(Federal Drug Administration)에 의해 설명된 바와 같은 규정을 따른다. 임신중인 모체는 출산 한달 이내에, 바람직하게는 출산 두주 이내에, 보다 바람직하게는 출산 한주 이내에, 가장 바람직하게는 출산시에 선별될 수 있다(예를 들면, 진단 목적으로 혈액 샘플을 채취한다). 전술한 병원체들에 대해 음성 또는 비반응성인 모체의 공여자들로부터 수집된 조직만이 본 발명의 생구조물을 생산하는데 사용된다. 바람직하게, 태반 막의 공여자의 완전한 부계와 의학적 및 사회적 역사가 얻어지는데, 예를 들면 상세한 가족 역사를 포함한다.
공여자는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에게 알려진 표준 혈청학적 및 세균학적 테스트를 이용하여 선별된다. 병원체를 확인하는 어떠한 측정 또는 진단 테스트도 본 발명의 방법의 범위 내에 있으나, 바람직한 측정은 높은 처리량을 위한 용량과 높은 정확성이 결합된 것이다. 특정 실시예에서, 본 발명은 당업자에게 알려진 표준 기술을 이용하여 항원 및/또는 항체에 대해서 공여자를 선별하는 것을 포함한다. 항원과 항체의 제한없는 예는 항체 선별(ATY); 알라닌 아미노 전이 효소 선별(ALT) ; 간염 핵심 항체(핵산과 ELISA) ; B형 간염 표면 항원; C형 간염 바이러스 항체 ; HIV-1과 HIV-2; HTLV-1과 HTLV-2 ; 매독 테스트(RPR) ; CMV 항체 테스트 ; 및 C형 간염과 HIV 테스트를 포함한다. 사용된 측정은 당업자에가 알려진 바와 같이 핵산에 근거한 측정 또는 ELISA에 근거한 측정일 수 있다.
본 발명은 당업자에게 알려진 표준 기술을 이용하여 신생아의 탯줄로부터 혈액을 더 테스트하는 것을 포함한다 (예를 들면, Cotorruelo et al., 2002, Clin Lab. 48 (5-6): 271-81; Maine et al., 2001, Expert Rev. Mol.Diagn.,l(1) : 19-29; Nielsen etal., 1987, J. Clin. Microbiol. 25 (8):1406-10 참조; 상기 모든 문헌은 본 명세서에서 참고문헌으로서 그대로 포함된다.) 하나의 실시예에서, 신생아의 탯줄로부터 얻어진 혈액은 당업자에게 알려진 표준 기술을 사용하여 세균 병원체(그람 양성 및 그람 음성균을 포함하되 이에 한정되지는 않는)와 곰팡이에 대하여 테스트된다. 특정 실시예에서, 신생아의 탯줄 혈액의 혈액형과 혈액의 Rh 인자는 당업자에게 알려진 기술을 이용하여 결정된다. 다른 실시예에서, 특이한 CBC는 신생아의 탯줄에 기인하는 혈액으로부터 당업자에게 알려진 표준 방법을 이용하여 얻어진다. 또 다른 실시예에서, 호기성 세균 배양은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 알려진 표준 방법을 사용하여 신생아의 탯줄로부터 얻어지는 혈액으로부터 취해진다. 정상범위내의(예를 들면, 정상 레벨로부터 큰 이상이나 벗어남이 없는) CBC를 갖고, 혈청학 및 세균학에 대해서 음성으로 측정되고, 전염성 질병 및 오염에 대해 음성 또는 비반응성으로 측정되는 공여자들로부터 수집된 조직만이 본 발명의 생구조물을 생산하는데 사용된다.
본 발명의 콜라겐 생구조물을 제조하는 하나의 전형적인 방법은 다음의 단계들을 포함한다.
I 단계. 본 발명은 탯줄을 태반 원반으로부터 분리하기 위해서(선택적으로) 태반 막을 처리하고, 융모막으로부터 양막을 분리하는 것을 포함한다. 바람직한 실시예에서, 양막은 태반 막을 절단하기 전에 융모막으로부터 분리된다. 융모막으로부터 양막의 분리는 태반막의 가장자리로부터 출발하여 이루어지는 것이 바람직하다. 다른 바람직한 실시예에서, 양막은 비절개 박리를 이용하여, 예를 들면 장갑낀 손가락으로 융모막으로부터 분리된다. 융모막과 태반 원반으로부터 양악을 분리한 다음, 탯줄 밑동은 예를 들면 가위로 자르고 태반 원반으로부터 분리한다. 특정 실시예에서, 양막과 융모막의 분리가 조직을 찢지 않고는 할 수 없는 경우, 본 발명은 양막과 융모막을 태반 원반으로부터 하나의 조각으로 잘라낸 다음 그것을 벗겨내어 분리하는 것을 포함한다.
그 다음, 바람직하게 상기 양막은 살균 염수 용액에 보관된다. 일부 실시예에서, 살균 염수 용액은 완충되어 있다. 특정 바람직한 실시예에서, 양막을 보관하기 위한 상기 살균 염수 용액은 0.9% 살균 NaCl 용액이다. 바람직하게, 양막은 적어도 4℃에서 냉장 보관된다. 특정 실시예에서, 양막은 적어도 2℃, 적어도 6℃, 또는 8℃까지의 온도에서 냉장된다. 여기서, 양막은 냉장되고 살균 염수로 보호되어 유지되면 5일까지 저장될 수 있다. 바람직하게, 분리된 양막은 처리과정에서 다음 단계 이전에 분만시로부터 최대 72시간동안 냉장된다.
II 단계. 일단 양막이 융모막으로부터 분리되면, 본 발명은 양막을 탈세포화하는 것을 포함한다. 본 발명의 양막을 탈세포화하는 공정은 양막의 어떠한 냉동도 포함하지 않는다는 조건하에, 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에게 알려진 어떠한 탈세포화 공정도 본 발명의 방법에 포함된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 탈세포화는 본 발명의 양막으로부터 모든 세포물질과 세포 찌꺼기(예를 들면, 모든 가시적인 세포물질과 세포 찌꺼기)를 제거하는 것을 의미한다. 양막의 탈세포화는 실질적으로 양막의 콜라겐 매트릭스와 정상적으로 결합된 모든 세포가 제거되는 것을 확실하게 한다. 콜라겐 매트릭스와 결합된 "실질적으로 모든" 세포를 제거하는 본 발명의 양막의 탈세포화는 바람직하게는 적어도 90%의 세포를 제거하고, 보다 바람직하게는 적어도 95%의 세포를 제거하며, 가장 바람직하게는 적어도 99%의 세포를 제거한다. 본 발명의 방법에 따라 탈세포화된 양막은 균일하게 얇고, 즉, 10-40 마이크론의 두께이고, 매끄럽고(접촉에 의해 결정된 바와 같이), 외관이 깨끗하다.
바람직한 실시예에서, 본 발명의 양막의 탈세포화는 양막의 모체 측면으로부터 실질적으로 모든 세포 물질과 세포 찌꺼기를 제거한 다음, 양막의 태아 측면으로부터 모든 세포 물질과 세포 찌꺼기를 제거하는 것을 포함한다. 특정 실시예에서, 본 발명의 양막의 탈세포화는 살균 용액으로 세척함과 결합하여 물리적인 벗겨냄을 포함한다. 다른 특정 실시예에서, 양막의 물리적인 벗겨냄은 살균 세포 스크래퍼로 벗겨내는 것을 포함한다. 또 다른 특정 실시예에서, 탈세포화 중 양막을 세척하기 위한 살균 용액은 수용액, 생리학적 완충액을 포함하는 용액 또는 예를 들면 0.9% NaCl 용액과 같은 염수 용액이다.
양막의 탈세포화는 양막으로부터 천연 세포와 다른 항원체 및 세포 찌꺼기를 제거하는 것을 포함하며, 선택적으로, 새로운 면역학적 자리의 생성을 억제하기 위한 처리를 포함한다. 양막의 탈세포화에서, 역 면역반응을 유도할 수 있는 다른 세포 및 비세포 구조 또는 성분 뿐만 아니라 천연 생세포가 제거된다. 본 발명에 따라 행해지는 탈세포화 기술은 양막의 해부의 큰 붕괴를 초래해서는 안되며, 그것의구조적 조성물의 생역학적 특성을 바꾸어서는 안된다. 즉, 콜라겐, 에라스틴 및 가능하게는 피브로넥틴의 구조적 및 생화학적 형태가 탈세포화에 의해 영향받아서는 안된다. 특히, 양막의 거친 화학적 처리와 프로테아제 처리는 본 발명의 탈세포화 기술의 범위내가 아니다.
바람직하게, 양막의 탈세포화는 세제를 포함한 용액의 사용을 포함한다. 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있는 세제는 비이온성 세제, 트리톤 X-100, 음이온성 세제, 소디움 도데실 설페이트를 포함하는데, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 방법에서 세제는 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. pH 6 ~ 8이고 거품이 적은 어떠한 순한 음이온성 세제, 즉, 비자극성 세제는 본 발명의 방법에 따라서 사용될 수 있다. 특정 실시예에서, 0.01 - 1% 데옥시콜릭 산 나트륨 염 모노하이드레이트가 양막의 탈세포화에 사용된다. 비록 특별한 형태의 수단에 의해 결합되지 않아도, 본 발명의 방법에 따른 양막의 탈세포화는 세포막을 붕괴할 수 있고, 양막으로부터 세포 찌꺼기를 제거하는데 도움이 될 수 있다. 그러나, 양막 내에 어떠한 잔류 세제 레벨을 제거하기 위해서는 조치가 취해져야 하는데, 예를 들면 생세포와 양막의 나중의 재군집과의 간섭을 피하기 위해서이다.
본 발명의 생구조물의 제조에 있어서 프로테아제의 활성을 제한하는 것은 필수적이다. 금속 이온 킬레이터, 예를 들면 1,10-페난트롤린(phenanthroline) 및 에틸렌디아민테트라아세틱 애시드(EDTA)와 같은 첨가물은 많은 단백질 가수분해 효수들에게 바람직하지 않은 환경을 만든다. 콜라게나제와 같은 프로테아제에 대한 차선의 조건을 제공하는 것은 용해(lysis) 단계동안 콜라겐과 같은 양막 조성물을 분해로부터 보호하는 것에 도움이 될 수 있다. 프로테아제에 대한 차선 조건은 용액 내 칼슘 및 아연 이온의 양을 제거하거나 제한하는 저장 용해액(hypotonic lysis solution)을 조제함으로써 이루어질 수 있다. 많은 프로테아제는 칼슘 및 아연 이온의 존재하에 활성을 갖으며, 칼슘 및 아연 이온이 없는 환경에서는 그들의 활성을 많이 잃는다. 바람직하게, 저장 용해액은 pH, 칼슘 및 아연이온의 감소된 유효성, 금속 이온 킬레이터의 존재 및 콜라게나제에 대한 특정 단백질분해 억제제의 사용의 조건을 선택하여 제조될 것인데, 역 단백질 가수분해의 분해로부터 근원적인 양막을 보호하는 동안 용액이 천연 세포를 최적으로 용해할 것이다. 예를 들면, 저장 용해액은 칼슘 및 아연 이온을 포함하지 않고 EDTA와 같은 금속 이온 킬레이터를 포함하는 pH 5.5 ~ 8, 바람직하게는 pH 7 ~ 8인 물의 완충 용액을 포함할 수 있다. 추가적으로, 저장 용해액으로 양막을 처리하는 동안 온도와 시간 파라미터의 조절도 또한 프로테아제의 활성을 제한하기 위하여 채용될 수 있다.
또한, 양막의 탈세포화 처리는 새로운 면역학적 자리의 발생을 제한하는 것이 바람직하다. 콜라겐의 효소 분해는 증가된 면역원성을 초래한다고 여겨지므로, 본 발명은 세포 대사, 단백질 생성 및 세포분열을 억제하는데 효과적이고, 양막의 조성물의 단백질 분해를 최소화하여 양막의 기초 구조를 유지하는 효소, 예를 들면 뉴클레아제로 양막의 처리를 포함한다. 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있는 뉴클레아제의 예는 엑소뉴클레아제와 엔도뉴클레아제 모두를 포함하여 천연 세포 DNA와 RNA의 소화에서 효력이 있는 것들이다. 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있는 뉴클레아제의 제한없는 예는 예를 들면 DNAase I (SIGMA Chemical Company, St.Louis, Mo. ) 및 RNAase A (SIGMA Chemical Company, St. Louis, Mo. )와 같이 세포 활성을 억제하는 엑소뉴클레아제와, 예를 들면 EcoR I (SIGMA Chemical Company, St. Louis, Mo. ) 및 Hind Ill (SIGMA Chemical Company, St. Louis, Mo. )와 같이 세포 활성을 억제하는 엔도뉴클레아제를 포함한다. 선택된 뉴클레아제는, 예를 들어 마그네슘, 칼슘과 같은 이온을 포함하는 생리학적 완충용액에 적용되는 것이 바람직한데, 이것은 뉴클레아제의 활성에 최적이다. 바람직하게, 완충 용액의 이온 농도, 처리 온도 및 처리 길이는 원하는 레벨의 뉴클레아제 활성을 확실하게 하기 위한 전형적인 실험에 의해 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 선택된다. 바람직하게 완충액은 세포 내부로 뉴클레아제의 접근을 촉진하는 저장(hypotonic)인 것이다.
특정 실시예에서, 본 발명의 양막을 탈세포화하는 것은 다음의 단계들을 포함한다. 먼저, 양막을 깨끗한 살균 컨테이너로 옮기고, 선택적으로 살균수로 세척하고, 살균 거즈로 건조시킨다. 그런 다음, 양막은 모체 측면이 위로 향하게 하여 살균 트레이에 놓여진다. 살균 세포 스크래퍼(예를 들면, 32 cm, PE 블레이드, PS 핸들, NalgeNunc International)을 사용하여, 양막의 모체 측면으로부터 모든 가시적인 세포물질을 물리적으로 제거함으로써 양막을 부분적으로 탈세포화 시킨다. 필요하다면, 살균수는 세포 및 세포 찌꺼기를 제거하는 것을 도와주는데 사용된다. 양막의 모체 측면에서 부분적인 탈세포화가 완료된 다음, 양막은 태아 측면이 위로 올라오도록 돌려진다. 찢김을 방지하기 위해 양막에 최소의 압력을 가하여 세포 스크래퍼로 태아 측면 상의 모든 가시적인 세포 찌꺼기를 부드럽게 제거한다. 살균수는 세포 및 세포 찌꺼기를 제거하는 것을 도와주는데 사용될 수 있다.
하나의 실시예에서, 탈세포화된 양막은 다음 공정에 앞서 살균 생리액, 예를 들면 살균 0.9% NaCl 용액으로 채워진 살균 컨테이너에 놓여진다. 본 발명의 방법에 따라서, 양막의 다음 처리단계는 양막이 살균 생리액에 놓여진 후 2-3 시간 내에 시작되어야 한다. 특정 실시예에서, III단계는 II단계를 즉시 뒤따르는데, 양막은 살균 용액으로 채워진 컨테이너에 놓여질 필요는 없다.
양막은 보다 쉬운 세척을 위해 모양을 만들거나 세척되지 않는 부위를 제거하기 위하여, 예를 들면 살균 작은 칼을 이용하여 세척 과정 동안 절단될 수 있다.
III 단계. 탈세포화 후에, 양막은 세포외 가용성 단백질, 지질 및 프로테오글리칸(proteoglycan)과 같은 어떠한 세포외 찌꺼기 뿐만 아니라 세포 단백질, 세포 지질 및 세포 핵산을 포함할 수 있는 세포 찌꺼기를 확실하게 제거하기 위하여 세척된다. 비록 어떠한 메카니즘의 수단에 의해 결합되지 않아도, 이러한 세포 및 세포외 찌꺼기를 제거하는 것은 양막의 면역원성을 감소시킨다.
일단 본 발명의 양막이 탈세포화되면, 막은 양막의 양 면으로부터 모든 가시적인 세포 물질과 세포 찌꺼기를 완벽하게 효율적으로 제거하기 위하여 더 세척된다. 바람직하게 용액은 천연 조직 세포를 효과적으로 용해하기 위하여 조제된 수용성 저장 또는 낮은 이온 강도 용액이다. 그러한 수용성 저장 용액은 탈이온수 또는 수용성 저장 완충액이 될 수 있다. 바람직하게, 수용성 저장 완충액은 추가적으로 프로테아제의 활성을 위한 차선의 조건을 제공하는 첨가제를 포함하며, 예를 들면 콜라게나제인데, 이것은 세포 용해의 결과로서 방출될 수 있다.
바람직하게, 탈세포화를 도와주기 위해 양막은 세제에서, 예를 들면 흔들리는 판(rocking platform) 위에서 부드럽게 흔들어진다. 특정 실시예에서, 양막은 적어도 15분간, 적어도 20분간, 적어도 30분간 또는 120분까지 흔들어진다. 양막은, 세제 탈세포화 후에, 앞에서 설명한 바와 같이 다시 물리적으로 탈세포화될 수 있다; 물리적 및 세제 탈세포화 단계는 양막의 형태가 유지되는 한, 가시적인 세포 물질 및 세포 찌꺼기가 남아있지 않을 때까지 필요시 반복될 수 있다.
특정 실시예에서, 양막의 세척은 다음 단계를 포함한다: 탈세포화된 양막은 살균 컨테이너에 놓여지고, 그 다음 양막을 충분히 덮을 수 있는 양으로 탈세포화 용액을 채운다; 그런 다음, 양막과 탈세포화 용액이 담긴 컨테이너는 흔들리는 판 위에 놓여진다(예를 들면, Model 100, VWR Scientific Products Corp. , P. O. Box 640169, Pittsburgh, PA 15264-0169). 그 다음, 탈세포화 용액 내의 양막은 흔들리는 판 위에서 15 내지 120분동안 흔들어진다. 흔들림 단계 후, 양막은 컨테이너로부터 제거되고, 살균 용액, 예를 들면 0.9% NaCl 용액으로 채워진 깨끗한 살균 트레이에 놓여진다. 새로운 살균 세포 스크래퍼를 이용하여, 잔류 탈세포화 용액을 제거하고, 양막의 양 면으로부터 남아있는 어떠한 세포 물질을 제거한다. 이 단계는 모든 가시적인 잔류 세포 물질을 제거하기 위하여 필요한 횟수만큼 반복될 수 있다.
특정 실시예에서, 양막은 탈세포화 단계 이후에 즉시(즉, 30분 이내) 건조된다. 대안적으로, 다음 처리가 즉시 이루어지지 않은 경우, 양막은 냉장, 예를 들면 2-8℃의 온도에서, 건조 전에 28일까지 저장될 수 있다. 탈세포화된 양막이 3일 이상 28일 이하동안 저장되는 경우, 양막을 덮는 살균 용액은 주기적으로, 예를 들면 매 1-3일마다 교체해 주는 것이 바람직하다.
특정 실시예에서, 양막이 세척 후에 냉장되지 않은 경우, 양막은 제조의 IV단계를 진행하기 전에 적어도 3회 세척된다. 다른 실시예에서, 양막이 냉장되고 살균 용액이 한번 교체된 경우, 양막은 제조의 IV단계를 진행하기 전에 적어도 2회 세척된다. 또 다른 실시예에서, 양막은 냉장되고 살균 용액은 2회 이상 교체된 경우, 양막은 제조의 IV단계를 진행하기 전에 적어도 한번 세척된다.
특정 실시예에서, 탈세포화된 양막은 살균 조건하에 저장되고, 더 이상의 추가적인 공정, 예를 들면 건조와 같은 공정을 행하지 않는다. IV단계를 진행하기 전에, 모든 세균학적 및 혈청학적 시험에서 모든 테스트가 음성을 나타내는 것이 확실하도록 평가되어야 한다.
IV 단계. 본 발명의 방법의 마지막 단계는 콜라겐 생구조물을 생산하기 위하여 본 발명의 탈세포화된 양막을 건조하는 것을 포함한다. 콜라겐의 평평하고 건조한 시트를 만들기 위해서는 양막을 건조하는 어떠한 방법도 사용될 수 있다. 그러나, 양막은 진공하에서 건조되는 것이 바람직하다.
특정 실시예에서, 본 발명의 탈세포화된 양막을 건조하기 위한 전형적인 방법은 다음과 같은 단계를 포함한다:
건조를 위한 탈세포화된 양막의 어셈블리.탈세포화된 양막은 살균 용액으로부터 제거되고, 과잉의 유동액은 부드럽게 짜낸다. 그런 다음, 탈세포화된 양막은 태아 측면이 아래쪽으로 위치하도록 하여, 예를 들면 트레이 위에 평평하게 될 때까지 부드럽게 펼쳐진다. 그런 다음, 탈세포화된 양막은 태아 측면이 위쪽을 향하도록 뒤집고, 건조 프레임, 바람직하게는 플라스틱 메쉬 건조 프레임(예를 들면, Quick CountRPlastic Canvas, Uniek, Inc., Waunakee, WI) 위에 놓는다. 다른 실시예에서, 건조 프레임은 약 0.5센티미터의 오토클래버블(autoclavable) 스테인레스 스틸 메쉬일 수 있다. 가장 바람직한 실시예에서, 약 0.5센티미터의 양막은 건조 프레임의 가장자리와 겹쳐진다. 특정 실시예에서, 건조 프레임을 벗어나서 확장한 오버랩핑 양막은, 예를 들면 클램프나 지혈기를 이용하여 프레임의 상부와 겹쳐진다. 일단 양막이 건조 프레임에 위치하게 되면, 살균 거즈는 열 건조기(또는 겔 건조기)(예를 들면, Model 583, Bio-Rad Laboratories, 200 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547)의 건조 판 상에 위치되어, 플라스틱 메쉬 건조 프레임 위에 놓인 양막 보다 조금 더 큰 면적이 덮어지도록 한다. 바람직하게는, 거즈 층의 전체 두께는 한번 접힌 4X4 거즈의 두께를 넘지 않는다. 물질같은 건조 시트에 적합한 어떠한 열 건조 기기라도 사용될 수 있다. 건조 프레임은 건조 판 상에서 거즈의 상부에 위치되는데, 플라스틱 프레임의 경계가 거즈의 경계 이상으로 확장될 수 있게 바람직하게는 0.1 - 10cm, 더욱 바람직하게는 0.5-1.0cm가 되도록 한다. 가장 바람직한 실시예에서, 양막을 갖는 건조 프레임은 양막의 태아 측면이 위쪽을 향하게 하여 살균 거즈의 상부에 놓여진다. 일부 실시예에서, 다른 플라스틱 프레임 메쉬는 양막의 상부에 놓여진다. 메쉬프레임과 거기에서 건조된 막의 관찰은 도 4에 나타냈다. 다른 실시예에서, 얇은 플라스틱 시트(예를 들면, SW182, 투명 PVC,AEP Industries Inc., South Hackensack, NJ 07606) 또는 생체 상용적인 실리콘이 시트가 모든 경계를 벗어나서 잘 확장되도록 메쉬를 덮는 막의 상부에 위치한다. 이 실시예에서 두 번째 메쉬 프레임은 필요하지 않다.
대안적인 실시예에서, 양막은 티벡(Tybec) 물질의 하나 또는 그 이상의 살균 시트(예를 들면, 의료용 포장을 위한 티벡 한 시트장, DupontTyvekg, P. O. Box 80705, Wilmington, DE 19880-0705), 선택적으로, 막의 상부에 하나의 티벡 시트와 함께 놓여진다. 이러한 택일적 과정은 더 부드러운 버전의 생구조물(즉, 물질의 축을 따라서 수직을 이루는 특이한 섬유 압착 영역의 패턴 없이)을 생산할 것인데, 이것은 예를 들면 본 명세서에 기술된 바와 같이 세포의 팽창을 위한 매트릭스로서의 사용을 위함과 같은 특정의 적용에 대하여 이로울 수 있다.
양막 건조.바람직한 실시예에서, 본 발명은 진공 하에서 본 발명의 양막을 열 건조하는 것을 포함한다. 진공 하에서의 건조는 약 0 - 약60℃의 어떠한 온도에서라도 이루어질 수 있는 반면, 양막은 약 35℃에서 약 50℃ 사이에서 건조되는 것이 바람직하고, 약 50℃에서가 가장 바람직하다. 콜라겐이 일부 분해는 50℃를 넘는 온도에서 예상된다는 것을 인식해야 한다. 바람직하게는, 건조 온도는 연장된 탐침을 사용하여 교정된 디지털 온도계를 사용하여 맞춰지고 입증된다. 바람직하게는, 진공압력은 약 -22 인치Hg로 맞춰진다. 건조 단계는 양막의 콜라겐 매트릭스가, 예를 들면 수분 분석기에 의해 결정된 바와 같이 3-12% 미만의 수분을 함유할 때가지 계속된다. 이것을 달성하기 위해서, 양막은 ,예를 들면 약 60분동안, 탈수된 양막을 얻기 위해서 열-진공 건조될 수 있다. 일부 실시예에서, 양막은 약 30분에서 2시간동안, 바람직하게는 약 60분동안 건조된다. 비록 어떠한 메카니즘의 수단에 의해 결합되지 않아도, 진공 압력과 결합된 낮은 온도 세팅은 콜라겐을 변성시키지 않으면서 양막을 탈수 상태가 되도록 한다는 것이 인정된다.
본 발명에 따라서 건조 공정이 완결된 후, 양막은 진공 펌프를 가동하면서 약 2분간 냉장된다.
양막의 포장 및 저장.전술한 바와 같이 본 발명의 방법에 따라서 양막이 일단건조되면, 막은 부드럽게 건조 프레임으로부터 들어올려진다. 막을"들어올려짐"은 다음과 같은 단계를 포함할 수 있다:펌프를 계속 작동하면서, 플라스틱 필름은 양막을 아래로 잡아당기면서 코너부터 시작하여 부드럽게 양막으로부터 제거된다; 양막을 구비한 프레임은 건조 판으로부터 들여 올려져서 양막 면이 위로 가는 절단 보드에 놓여진다; 프레임의 가장자리고부터 1-2mm 떨어진 가장자리를 따라서 잘라내어 절개가 이루어진다; 그런 다음, 양막은 프레임으로부터 벗겨진다; 그리고 다음에 사용될 바에 의해 결정된 적절한 크기대로 절단된다. 바람직하게, 이 단계에서의 양막의 취급은 살균 장갑을 가지고 이루어진다.
양막은 살균 컨테이너, 예를 들면 필 파우치에 놓여지고 밀봉된다. 본 발명의 방법에 따라 만들어진 생구조물은 전술한 바와 같이 장기간 동안 상온에서 저장될 수 있다.
대안적인 실시예에서, 본 발명은 융모막을 포함하는 콜라겐 생구조물을 제조하는 방법을 제공한다. 전술한 방법은 융모막을 포함하는 생구조물을 제조하는 방법에 적용할 수 있을 것으로 기대된다. 특정 실시예에서, 본 발명은 양막과 융모막을 포함하는 태반을 제공하고; 융모막으로부터 양막을 분리하고; 융모막을 탈세포화 하는 것을 포함하는 콜라겐 생구조물을 제조하는 방법을 포함한다. 특정 실시예에서, 본 방법은 탈세포화된 융모막을 세척하고 건조하는 것을 더 수반한다.
5.2.1 3차 스캐폴드와 래미네이트를 제조하는 방법
본 발명은 본 발명의 콜라겐 생구조물을 포함하는 3차 스캐폴드, 3차 배열(configuration) 및 래미네이트를 제조하는 방법을 제공한다.
일부 실시예에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 방법을 이용하여, 양막과 융모막을 포함하는 태반, 바람직하게는 인간 태반을 제공하고, 융모막으로부터 양막을 분리하고; 본 명세서에 개시된 방법을 이용하여 양막을 탈세포화하고; 본 명세서에 개시된 방법을 이용하여 적어도 한번 탈세포화된 양막을 세척하고; 양막 래미네이트가 형성되도록 서로 접촉하여 탈세포화된 양막의 적어도 두개를 적층하고; 본 명세서에 개시된 방법을 이용하여 양막 래미네이트를 건조하는 것을 포함하는 양막 래미네이트를 제조하는 방법을 제공한다.
대안적으로, 다른 실시예에서, 양막 래미네이트를 제조하는 방법은 본 발명의 방법에 따라 제조된 양막 적어도 두개를 건조하고, 양막 래미네이트가 형성되도록 적어도 두개의 양막을 서로 접촉하여 적층하는 것을 포함한다.
일부 실시예에서, 본 발명의 방법에 따라 제조된 양막 층은 양막 래미네이트를 형성하기 위하여 접착제 존재하에 서로 접촉하게 놓여질 수 있다. 본 발명의 방법과 조성물에 따라 사용된 접착제는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 알려진 어떠한 생물학적 접착제일 수 있으며, 바람직하게는, 예를 들면 피브로넥틴, 피브린과 같은 천연 접착제, 합성 접착제를 포함하되 이에 한정되지는 않는 생물학적 상용성이 있는 접착제일 수 있다. 다른 실시예에서, 본 발명의 방법에 따라 제조된 양막 층은 양막 래미네이트를 형성하기 위하여 서로 가교결합된다. 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 알려진 어떠한 가교제나 방법도 본 발명의 범위 이내에서 사용될 수 있는데, 화학적 가교, 펩타이드 가교, UV 가교, 방사선 가교, 피브로넥틴 가교, 피브리노겐 가교, 하이드로겔 가교를 포함하되 이에 한정되지는 않는다. 다른 실시예에서, 본 발명의 방법에 따라 형성된 양막 래미네이트는 접착제를 포함하지 않는다.
5.3 콜라겐 생구조물의 저장 및 취급
본 발명은 상온(예를 들면 25℃)에서 탈수된 시트로서 본 발명의 콜라겐 생구조물을 저장하는 것을 포함한다. 특정 실시예에서, 본 발명의 콜라겐 생구조물은 적어도 10℃, 적어도 15℃, 적어도 20℃, 적어도 25℃, 또는 적어도 29℃의 온도에서 저장될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 콜라겐 생구조물은 냉장되지 않는다. 일부 실시예에서, 본 발명의 콜라겐 생구조물은 약 2 내지 8℃의 온도에서 냉장될 수 있다. 다른 실시예에서, 본 발명의 콜라겐 생구조물은 장기간동안 상기 확인된 어떠한 온도에서라도 저장될 수 있다. 가장 바람직한 실시예에서, 본 발명의 생구조물은 살균 및 비산화 조건하에서 저장된다. 본 발명의 방법에 따라 생성된 생구조물은 콜라겐 생구조물의 생화학적 또는 생물리적 성질의 어떠한 변화 없이, 생화학적 또는 구조적 형태의 변화없이(예를 들면, 분해없이) 어떠한 특정 온도에서 12개월 또는 그 이상 저장될 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 생성된 생구조물은 콜라겐 생구조물의 생화학적 또는 생물리적 성질의 어떠한 변화 없이, 생화학적 또는 구조적 형태의 변화없이(예를 들면, 분해없이) 수년동안 저장될 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 제조된 본 발명의 생구조물은 무기한적으로 지속될 것으로 기대된다. 생구조물은 장기간 저장에 적합한 어떤 컨테이너에서 저장될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 콜라겐 생구조물은 살균 이중 필-파우치 포장으로 저장된다.
본 발명은 그것의 건조 상태에서 본 발명의 콜라겐 생구조물의 취급을 포함한다. 특정 실시예에서, 콜라겐 생구조물은 사용전에, 예를 들면 외과적 이식 전에 정돈된다. 본 발명은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 정해진 바와 같이, 그 사용에 양립할 수 있는 본 발명의 생구조물의 어떠한 차원이라도 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명은 lx2cm; 2x3 cm; 4x4 cm, 5x5, 또는 6x8인 콜라겐 생구조물을 포함한다. 본 발명의 생구조물은 양막의 크기의 범위 내에서 필요한 어떠한 크기로도 절단될 수 있다.
본 발명의 콜라겐 생구조물의 표면 배치는 시각적으로 확인될 수 있다. 본 발명의 콜라겐 생구조물은 "격자(grid)" 패턴을 갖는데, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 모체 및 태아 표면의 시각적 확인이 가능하다. 특정 실시예에서, 콜라겐 생구조물의 표면 배치는 확대 하에서 확인된다. 콜라겐 생구조물의 태아 측면은 그것의 오목면, 즉 오목해진 격자 패턴에 의해 구별될 수 있다는 것이 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 평가될 것이다. 역으로, 모체 측면은볼록면, 즉 높아진 격자 패턴에 의하여 확인될 수 있다.
본 발명의 콜라겐 생구조물은 사용 전에 최소 제조 시간이 요구된다. 바람직한 실시예에서, 본 발명의 콜라겐 생구조물은 5분 또는 그 이하 이내, 10분 또는 그 이하 이내에, 15분 또는 그 이하 이내에 사용할 준비가 된다. 사용 전, 예를 들면 외과적 이식 전에 본 발명에 따른 콜라겐 조성물의 제조 시간은 탈수된 콜라겐 생구조물의 재수화에 의한 활성화를 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 콜라겐 생구조물은 외과수술 자리에 있는 동안 수화된다. 다른 실시예에서, 본 발명의 콜라겐 생구조물은 접시에서 살균 조건 하에서 수화된다. 본 발명은 살균 생리학적 완충액을 이용하여 본 발명의 콜라겐 생구조물의 수화를 포함한다. 특정 실시예에서, 본 발명은 살균 염수액, 예를 들면 살균 0.9% NaCl 용액으로 본 발명의 콜라겐 생구조물을 수화하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 살균 염수액은 완충되었다. 특정 실시예에서, 본 발명의 콜라겐 생구조물의 수화는 적어도 2분, 적어도 5분, 적어도 10분, 적어도 15분 또는 적어도 20분을 요구한다. 바람직한 실시예에서, 본 발명의 콜라겐 생구조물의 수화는 5분 이내에 완결된다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 본 발명의 콜라겐 생구조물의 수화는 10분 이내에 완결된다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 본 발명의 콜라겐 생구조물의 수화는 단지 10분 걸린다.
예를 들면, 외과적 이식으로서의 사용을 위하여 일단 수화된 본 발명의 콜라겐 생구조물은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자들에 의해 결정된 바와 같이 본 발명의 기술분야에서 양막에 관하여 향상된 봉합성을 갖는다. 본 발명의 콜라겐 생구조물은 본 발명이 속하는 기술분야에서의 양막처럼 쉽게 찢어지거나 쉽게 부서지지 않는다. 본 발명은 효과적으로 봉합될 수 있는 콜라겐 생구조물을 포함한다.
5.3.1 살균
본 발명의 생구조물의 살균은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 알려진 방법, 예를 들면 Gorham, D. Byrom(ed.), 1991, Biomaterials, Stockton Press, New York, 55-122을 이용하여 전자선 조사에 의해 이루어지는 것이 바람직하다. 적어도 99.9%의 세균이나 또는 다른 잠재적으로 오염을 일으키는 유기체들을 죽이는데 충분한 어떠한 방사선량이라도 본 발명의 범위내이다. 바람직한 실시예에서, 본 발명의 생구조물의 최종적인 살균을 얻기 위하여 적어도 18-25 kGy의 선량이 사용되었다. 그러나, 본 발명의 생구조물의 살균은 항생제나 글리세롤에서 저장을 포함하지 않는다.
5.4 본 발명의 콜라겐 생구조물을 사용하는 방법
본 발명의 콜라겐 생구조물은 부분적으로 본 발명이 속한 분야에서 사용되어온 전통적 막과 비교하여 생체역학적(biomechanical) 강도, 유연성, 봉합능력(suturability), 낮은 면역원성과 같은 물리적 성질들 때문에 의학 및 수술 영역에서 많은 유용성을 지닌다. 예를 들어, 본 발명의 콜라겐 생구조물은 예를 들어 GoretexTM와 같은 합성 비-재흡수 PTFE 막; 글리코라이드 및 락타이드 코폴리머로 제조된 합성 재흡수 막; PCT특허 제WO-88/08305호, 독일특허 제DE-2631909호, 미국특허 제5,837,278호에 개시된 막과 같은 본 발명이 속한 분야의 기존 막들에 비하여 가이드된 조직 재생성에 있어 촉진된 치료적 유용성을 가질 것으로 기대된다.
본 발명의 콜라겐 생구조물을 제조하는 방법은 생구조물의 3차 및 4차 구조의 보존을 보장하고, 따라서 의학 및 수술 영역에서 그것의 의도된 사용에 있어 생구조물을 이상적으로 만든다. 아래에서 상세히 설명되는 것처럼, 본 발명은 혈관 치유, 자궁 치유, 힘줄 대체, 각막 대체, 인공 피부, 치주질환의 치료, 및 상처 치유를 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 다양한 의학 및 치의학 적용에 있어 사용하기에 적당한 물리적 성질을 가진 콜라겐 생구조물을 제공한다. 그것의 의도된 사용에 따라, 본 발명은 요세관(tubular) 혈관을 형성하도록 모양 지어질 수 있는 막과 같은 2차원 막; 임플란트와 같은 3차원 스캐폴드, 또는 1차원 섬유(fiber)와 같은 콜라겐 생구조물의 사용을 포함한다.
5.4.1 본 발명의 콜라겐 생구조물을 사용하는 치료방법
5.4.1.1 피부상태의 치료방법
인간피부는 표피와 진피의 혼성 물질이다. 표피의 윗부분은 각질층이고, 이것은 피부의 가장 뻣뻣한 층이며 외부 환경에 의하여 가장 영향을 많이 받는 층이다. 각질층 아래가 표피의 내부부분이다. 표피 아래는 유두진피인데, 이것은 피부의 마이크로-릴리프(micro-relief)로 정의되는 다소 느슨한 연결조직으로 만들어져 있다. 유두진피 아래에 위치한 망상진피는 공간적으로 조직된 단단한 결합 조직이다. 망상진피는 또한 거친 주름과 관련된다. 진피 아래에 피하층이 있다.
피부의 주 기능은 보호, 배설, 분비, 흡수, 체온조절, 색소생성(pigmentogenesis), 축적, 체온조절, 지각 인식, 및 면역 과정의 조절을 포함한다. 이러한 기능은 노화 및 태양 과다 노출에 의한 피부 내 구조적 변화에 유해하게 영향을 받는다. 피부 노화와 관련된 생리적 변화는 예를 들어 Cerimele, D. et al., 1990, Br. J. Dermatol., 122 Suppl. 35, p. 13-20에 개시된 것과 같은 막 기능의 손상과 표피 세포의 감소된 회전율(turnover)을 포함한다. 그러나 본 발명이 속한 분야의 방법 및 조성물은 피부 탄력과 부드러움의 개선, 또는 주름의 제거와 같은 피부 상태를 개선하는데 있어 제한된 성공을 하였을 뿐이다.
본 발명의 콜라겐 생구조물은 의학적 용도뿐만 아니라 화장 용도로 사용될 수도 있다. 본 발명의 콜라겐 생구조물은 피부손상, 노화된 피부, 주름, 세선, 엷어짐(thinning), 감소된 피부탄력, 거친 피부, 선천적인 퇴행성 피부 상태, 콜라겐 VII 결핍, 및 태양 손상 피부를 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 피부 상태를 치료하는데 임상적이고 치료적인 유용성을 가진다. 몇몇 실시예에서, 본 발명의 콜라겐 생구조물은 여드름 흉터, 미간 고랑(glabellar furros), 절개 흉터, 또는 본 발명이 속한 분야에 알려진 어떠한 다른 부드러운 조직 결함과 같은 피부 상태를 위한 피하 이식물로써 사용될 수 있다. 본 발명의 콜라겐 생구조물은 피부 노화와 관련된 변화를 치료하는데 임상적이고 치료적인 유용성을 가진다. 몇몇 실시예에서, 본 발명의 콜라겐 생구조물은 피부주름, 및/또는 탄력성 및 부드러움과 같은 피부 상태를 개선하는데 유용성을 가진다. 본 발명의 콜라겐 생구조물은 이식물로써, 라미네이트(laminate)로써, 또는 피부 상태의 치료를 위한 3차원의 둘둘 말린 형태로써 사용될 수도 있다. 본 발명의 콜라겐 생구조물은 부분적으로 긴 지속 효과를 제공할 수 있는 그것의 안정성 때문에 예를 들어 미국특허 제5,972,999호; 제5,418,875호; 제5,332,579호, 제5,198,465호와 같은 피부 상태를 치료하기 위한, 본 발명이 속한 분야에 알려진 방법과 비교하여, 향상된 임상성 유용성을 가질 것으로 기대된다.
바람직한 실시예로, 본 발명의 콜라겐 생구조물은 피부 상태를 치료하기 위하여 본 발명이 속한 분야에 알려진 하나 이상의 치료제로 더 보충된다. 그러한 치료제의 예는 비타민, 미네랄, 카테킨-기초 제제, N-아세틸글루코사민, 및 글루코사민을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다 (Neldner, 1993, Amer. Acad. Derm. Annl. Mtg. Wash. DC.; Lubell 1996, Cosmetic Dermatol, 9 (7): 58-60; Swaine et al., 1995, J. Am. Board of Family Practice, 8 (3): 206-16; Shan et al., 1994, Kidney International, 46 (2): 388-95 참조; 상기 모든 문헌은 인용에 의하여 그 전체가 본 명세서에 포함된다).
본 발명의 콜라겐 생구조물은 피부 상태의 치료에 있어 유용한 (클린다마이신, 미노사이클린, 독시사이클린, 겐타마이신과 같은) 항생제, 호르몬, 성장 인자, 항-종양 치료제, 항-진균 치료제, 항-바이러스성 치료제, 통증 치료제, 항-히스타민제, 항-염증치료제, (질산은 및 은 설파디아진을 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 은염(silver salt)과 같은) 은을 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 항-감염제, 은 원소(elemental silver), 항생제, (라이소좀과 같은) 박테리아살균성 효소, (PDGF, TGF를 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 사이토카인; 티모신과 같은) 상처 치료제, 상처 치유제로서 히야루로닉 산, (트롬빈이 있는 또는 없는피브린과 같은) 상처 실란트, (피브로넥틴과 같은) 세포 부착성 및 스캐폴드성 시약 등을 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 일정 생체분자(biomolecule)를 함유할 수도 있다. 특정 실시예에서, 콜라겐 생구조물은 예를 들어, 섬유모세포 성장 인자, 표피 성장 인자 등과 같은 적어도 하나의 성장 인자를 함유할 수도 있다. 생구조물은 예를 들어 막 수용체 억제제, 키나제 억제제, 성장 억제제, 항암제, 항생제 등과 같은 작은 유기 분자 또한 함유할 수 있다.
5.4.1.2 상처 및 화상
본 발명의 콜라겐 생구조물은 딱딱한 및/또는 부드러운 조직 회복을 보강하기 위한, 예를 들어 미국특허 제3,157,524호; 제4,320,201호; 제3,800,792호; 제4,837,285호; 제5,116,620호에 개시된 것과 같이 본 발명이 속한 분야에 잘 알려진 다른 생체물질과 비교하여, 부분적으로 그것의 물리적 성질 때문에 촉진된 임상적 유용성을 가지리라 기대된다. 본 발명의 콜라겐 생구조물은 그것이 콜라겐의 자연적 4차 구조를 보유하고 있기 때문에 콜라겐 매트릭스의 간극(interstices) 내로 세포 이동을 통하여 향상된 조직 내-성장(tissue in-growth)을 제공한다. 본 발명의 콜라겐 생구조물은 세포가 콜라겐 매트릭스 내에 부착하고 성장하도록 하고, 그들의 자연적 거대분자(macromolecules)를 합성하도록 한다. 세포는 그로써 새로운 조직의 성장을 위한 새로운 매트릭스를 생성한다. 그러한 세포 발달은 섬유, 플리스(fleece) 및 가용성 콜라겐과 같은 다른 알려진 콜라겐의 형태에서는 관찰되지 않는다.
몇몇 실시예에서, 본 발명은 개체의 피부 위에 직접 즉, 상처부위 위 각질층 위에 직접 콜라겐 생구조물을 놓아 상처를 치유하는 것을 포함하고, 상처는 예를 들어 부착성 테입을 사용하여 덮어진다. 다른 실시예로, 본 발명은 예를 들어 피하 이식물과 같은 이식물로써 본 발명의 콜라겐 생구조물을 사용하여 상처를 치료하는 것을 포함한다.
본 발명은 본 발명의 콜라겐 생구조물에 조직 내 성장을 촉진할 수 있는 거대분자를 첨가하여 상처 치료 속도를 높이는 것을 포함한다. 그러한 거대분자는 히야루로닉 산, 피브로넥틴(fibronectin), 라미닌, 및 프로테오글리칸을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다 (예를 들어, Doillon et al. (1987) Biomaterials 8: 195-200; 및 Doillon and Silver (1986) Biomaterials 7: 3-8 참조).
본 발명은 또한 혈소판-유래 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자, 표피 성장 인자, 전환 성장 인자 베타, 혈관신생 인자, 항생제, 항진균제, 살정제(spermicidal agents), 호르몬, 효소, 효소 억제제를 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 약리학적으로 활성인 성분 및 위에서 설명된 어떠한 생체분자를 5.4.2.7장에서 설명된 것처럼 피부에 전달하기 위하여 본 발명의 콜라겐 생구조물 내에 함유하는 것을 포함한다. 바람직하게 약리학적으로 활성인 성분은 생리학적으로 효과적인 양만큼 제공된다.
몇몇 실시예에서, 콜라겐 생구조물은 상처 부위에 적용하기 전에 동종이형(allogenic) 줄기세포, 줄기세포, 및 자가 성인 세포를 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 살아있는 세포를 더 함유할 수 있다.
본 발명의 콜라겐 생구조물은 특히 외과적 또는 외상의(traumatic) 상처 파손에 의한 상처 감염과 같은 상처를 치료하는데 유용하다. 특정 실시예에서, 콜라겐 생구조물은 항생제, 항-미생물제, 및 항-박테리아제를 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 상처 감염의 치료에 유용한 성분을 치료학적으로 유효한 양만큼 함유한다. 본 발명의 콜라겐 생구조물은 예를 들어 인체 내 또는 외부 환경 기원의, 상처를 감염시킬 수 있는, 병원성 세균에 대한 알려진 레저보어인 미생물과 같은 본 발명이 속한 분야에 잘 알려진 어떠한 미생물로부터의 상처감염의 치료에 있어서 임상적 및 치료학적 유용성을 가진다. 상처 내 미생물의 성장이 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 감소 또는 억제될 수 있는 미생물의 비-한정적 예는S. aureus, St. epidermis,베타 해모라이틱(haemolytic)Streptococci, E. coli, Klebsiella및Pseudomonas종, 및 혐기성 박테리아로 깊은 외상성 상처의, 가스 괴저의 원인인Clostridium welchii또는tartium이 있다.
다른 실시예로, 본 발명의 콜라겐 생구조물은 표피 상처, 피부 상처, 만성 상처, 급성 상처, 외부 상처, 내부 상처(예를 들어 콜라겐 생구조물은 봉합선으로부터 혈액의 누출을 막기 위해, 및 신체가 봉합 물질에 부착하는 것을 막기 위해 수술 동안 아나스토스모시스(anastosmosis) 주위로 감싸질 수 있다), 선천적 상처(예를 들어 위축물집표피박리증)를 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 상처 치료를 위해 사용된다. 특히 콜라겐 생구조물은 압박 궤양(예를 들어 욕창 궤양)의 치료에 있어 향상된 유용성을 가진다. 압박 궤양은 주로 오랫동안 침대에 있어야 하는, 예를 들어 피부 손실로 고통 받는 사지마비환자 및 하반신마비환자와 같은환자에게 국소적 압력의 효과 때문에 발생한다. 결과적인 압박 상처는 진피 마손 및 표피와 피부 부속물의 손실을 나타낸다.
본 발명의 콜라겐 생구조물은 또한 1도 화상, 2도 화상(부분적 두께 화상), 3도 화상(총 두께 화상), 화상 상처의 감염, 절제 및 비절제(unexcised) 화상 상처의 감염, 이식 상처의 감염, 공여 부위의 감염, 전에 이식된 또는 치유된 화상 상처 또는 피부 이식 공여 부위로부터 표피의 손실, 및 화상 상처 농가진을 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 화상의 치료에 사용될 수 있다.
5.4.1.3 조직 공학(engineering)
본 발명은 예를 들어 표피 성장 및 분화를 위한 보충으로, 배양된 피부 세포의 운송을 위한 운반체로 본 발명의 콜라겐 생구조물을 사용하는 것을 포함한다. 일정 실시예에서, 조직 및/또는 오르가노이드(즉, 표면 모습 또는 구조에 있어 신체의 일정 기관 또는 선(gland)과 유사체) 형성용으로 생구조물에 세포를 거주시키기 위하여, 생구조물은 그러한 새로운 세포로 생구조물을 재거주시키는(repopulate) 과정 동안 생구조물에 세포의 부착을 촉진하는 세포 부착 인자로 처리될 수 있다. 일정 실시예에서, 세포 부착의 정도는 예를 들어 인간 또는 소태아 혈청과 같은 혈청으로 양막을 처리함으로써 증가한다. 다른 실시예에서, 세포 부착의 정도는 피브로넥틴으로 양막을 처리함으로써 증가한다.
본 발명의 콜라겐 생구조물은 예를 들어 질환이 있는 또는 손상된 조직을 재생성하거나 대체하기 위하여 가이드된 조직 재생성에서 사용될 수 있다. 본 발명은치료부위에 생구조물을 직접 이식하여 또는 인공기구(prosthetic device)의 형성으로 본 발명의 생구조물을 사용하는 것을 포함한다. 본 발명의 콜라겐 생구조물은 예를 들어 특히 경구 또는 치과 수술 등의 수술 후와 같은 일정 환경에서 특히 유용하다 (5.4.2.2장에서 좀더 자세히 설명함). 이러한 경우에 촉진된 상처 치유 및/또는 진피 대체는 바람직하다. 가이드된 조직 재생성에 있어 본 발명의 콜라겐 생구조물의 유용성은 부분적으로, 재생성이 요구되어지는 영역에 다른 조직의 내 성장을 막는 환경을 제공하는 능력 때문이다.
예를 들어, 붕괴 또는 질환 때문에 치근의 실질 부분이 제거된 경우에 제거된 뼈 조직을 대체하기 위하여 건강한 뼈 재생성이 일어나는 것이 바람직하다. 그러나 뼈의 제거로 남겨진 공간은 결합 조직으로 빠르게 채워지고, 결합 조직의 이러한 내 성장은 결과적으로 뼈 재생성을 막는다. 그러한 내 성장을 막기 위하여, 본 발명의 콜라겐 생구조물은 수술적으로 상처 공간의 주위에 삽입될 수 있다. 생구조물은 바람직하지 않은 세포 타입이 상처 공간으로 침입하는 것을 막거나 방해하고, 이것은 바람직한 세포가 공간 내에서 성장하도록 한다. 이것에 의하여 상처를 치유한다.
몇몇 실시예에서, 콜라겐 생구조물은 망막 표면 재건을 위한 이식물로써 예를 들어 스티븐 존슨 신드롬(Stevens Johnson syndrome)을 가진 환자, 2차적 화학적 화상이 있는 림블(limbal) 줄기세포 결핍을 가진 환자, 또는 화학적 및/또는 열적 화상을 가진 환자에 있어 유용하다. 본 발명의 콜라겐 생구조물은 예를 들어 상피화(epithelialization)를 촉진함으로써 임상적 유용성을 가지리라 기대된다. 본발명의 콜라겐 생구조물은 조직 공학에 있어 본 발명이 속한 분야에서 사용되어온 양막과 비교하여 뛰어난 임상적 유용성을 가질 것으로 기대된다. Gomes et al., 2003, Opthalmology, 119: 166-73; Ti et al., 2001, Opthalmology, 108: 1209-1217; Meller et al., 2000, Opthalmology, 107: 980-9; Gris et al., 2002 Opthalmology, 109: 508-12; Koizumi et al., 2000, Invest. Opthal. and Visual Science, 41: 2506-13; Pires et al., 1999, Arch. Opthalmol. 117: 1291-7; Tseng et al., 1998, Arch. Opthalmol. 116: 431:441; Heiligenhaus et al., 2001 Invest. Opthal. and Visual Science 42: 1969-74; Anderson et al. 2001,Br. J. Opthalmol. 85: 567-75 참조.
본 발명은 성인 조직 세포, 자가 세포, 및 줄기세포를 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 살아있는 세포를 콜라겐 생구조물에 거주시키는 것을 포함한다. 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 줄기세포는 토티포텐트(totipotent) 또는 플러리포텐트(pluripotent)하거나, 또는 조직 특이 세포로 분화될 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 줄기세포는 본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 표준 방법에 의하여 얻어질 수 있다. 바람직하게는, 줄기세포는 미국특허출원 제10/74,976호(2002년 2월 13일 출원)에 개시된 방법에 따라 모아진다. 전술한 인용문헌은 인용에 의하여 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 혈관, 심장 밸브, 간, 췌장, 및 인대를 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 생체공학적 조직 및 오르가노이드의 발달을 위하여 본 발명의 콜라겐 생구조물(예를 들어 3차원 스캐폴드)을 사용하는 것을 포함한다. 비록 일정 작용기전에 본 발명이 제한되도록 의도되는 것은 아니지만, 생체공학적 조직으로써 본 발명의 콜라겐 생구조물은 부분적으로 혈액 응고를 촉진하는 지혈 성질 때문이다. 본 발명의 콜라겐 생구조물은 특히 혈관 수술에서 혈관 인공삽입물 및 이식물로 유용하다. 본 발명의 콜라겐 생구조물은 예를 들어 봉합 라인으로부터 혈액의 누출을 막고 봉합 물질에 신체가 부착하는 것을 막기 위하여 혈관 수술 시술 동안에 혈관(또는 이식 혈관)의 연결 부위 위에 주위(circumferential) 커버링으로 사용할 수 있다.
5.4.2 수술 시술에서 콜라겐 생구조물을 사용하는 방법
본 발명은 외과적 이식물로 본 발명의 콜라겐 생구조물을 사용하는 것을 포함한다. 본 발명은 본 발명의 콜라겐 생구조물 또는 그것의 라미네이트를 포함하는 외과적 이식물을 포함한다. 본 발명은 또한 외과적 이식물을 준비하고 사용하는 방법을 포함한다.
몇몇 실시예에서, 본 발명은 외과적 시술에서 외과적인 이식물을 사용하는 방법을 포함하고, 외과적 이식물은 직접적으로 예를 들어 내면 부위, 또는 외면 부위인 개체의 외과수술 부위에 적용된다. 몇몇 실시예에서, 콜라겐 생구조물은 아래에서 자세히 설명되는 것처럼, 예를 들어 봉합 라인으로부터 혈액의 누출을 막고 봉합물질에 신체가 부착하는 것을 막기 위하여 외과 시술 동안 외과적 이식물로 사용된다. 다른 실시예에서, 외과적 이식물은 예를 들어 봉합 라인으로부터 장관액 및 담즙의 누출을 막고 봉합물질에 신체가 부착하는 것을 막기 위하여 위장관 수술동안 위장관의 연결 부위 위에 커버링으로 사용된다.
본 발명은 화상 또는 외과시술 피부 상처를 커버하기 위하여; 복부, 흉부 강(cavity) 및 심낭을 덮고 있는 장막 표면 위의 모든 내부 복막 수술 또는 다른 재건술 내 부착을 막기 위하여; 구강 및 비강, 호흡관, 위장관, 및 비뇨생식기관을 따라 있는 점막 표면을 재구성하기 위하여 이식물 또는 드레싱으로; 뇌 수술에 있어 뇌경질막 복원을 보충하기 위한 대체물로; 중추 및 말초 신경계 내 신경 재생성을 촉진하기 위한 대체물로; 및 관절 또는 힘줄 회복에서 부착을 방지하는 부드러운 조직 재건을 위하여 생구조물을 사용하는 것을 포함한다.
본 발명은 특정 의도 외과시술 용도에 따라 본 발명의 외과적 이식물에 하나 이상의 생체분자, 바람직하게는 치료 성분을 함유시키는 것을 포함한다. 그러한 생체분자는 (클린다마이신, 미노사이클린, 독시사이클린, 겐타마이신과 같은) 항생제, 호르몬, 성장 인자, 항-종양 치료제, 항-진균 치료제, 항-바이러스성 치료제, 통증 치료제, 항-히스타민제, 항-염증치료제, (질산은 및 은 설파디아진을 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 은염(silver salt)과 같은) 은을 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 항-감염제, 은 원소(elemental silver), 항생제, (라이소좀과 같은) 박테리아살균성 효소, (PDGF, TGF를 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 사이토카인; 티모신과 같은) 상처 치료제, 상처 치유제로서 히야루로닉 산, (트롬빈이 있는 또는 없는 피브린과 같은) 상처 실란트, (피브로넥틴과 같은) 세포 부착성 및 스캐폴드성 시약 등을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 특정 실시예에서, 콜라겐 생구조물은 적어도 하나 이상의 성장 인자, 예를 들어 섬유모세포 성장 인자, 표피 성장 인자 등과 같은 성장 인자를 함유할 수 있다. 생구조물은, 예를 들어 막 수용체 억제제, 키나제 억제제, 성장 억제제, 항암제, 항생제 등의, 특정 생화학 프로세스의 특이적 억제제와 같은 작은 유기 분자를 함유할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 외과적 이식물에 줄기세포, 토티포텐트 줄기세포, 플러리포텐트 줄기세포, 멀티포텐트 줄기세포, 조직 특이 줄기세포, 배아 유사 줄기세포, 수임 전구세포, 피브로블라스토이드(fibroblastoid) 세포를 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 살아있는 세포를 함유시키는 것을 포함한다. 다른 실시예에서, 본 발명은 본 발명의 외과적 이식물에 연골세포, 간세포, 조혈세포, 췌장실질세포, 신경세포, 및 근 전구세포를 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 특정 클래스의 전구세포를 함유시키는 것을 포함한다.
5.4.2.1 안과학(ophthalmology)
본 발명의 콜라겐 생구조물은 눈과 관련된 질환 또는 장애의 치료에 임상적이고 치료학적인 유용성을 가진다. 본 발명의 콜라겐 생구조물은 특히 각막 궤양/천공, 수포성 각막병증, 망막 유피낭/종양, 주요 익상편(pterygium), 저항성 표피 장애, 급성 및 만성 알칼리 화상, 열화상, 무홍채증, 아토피성 각막염, 원인불명의 림발(limbal) 줄기세포 결핍, 각막 판누스, 신생혈관증식, 류마티스성 각막 용해, 안구흉터 유사물집증, 누설 여과 기포, 노출된 Ahmed 밸브 튜브, 계속적 검구유착이 있는 세라티아 연조직염, 급성 및 만성 스티벤손 존슨 신드롬(StevensonJohnson syndrome)을 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 안구 표면 질환의 치료 및/또는 예방에 유용하다. 본 발명의 콜라겐 생구조물은 특히 궤양이 있는 저항성 표피 장애의 치료를 촉진; 상피화를 촉진; 상피 및 줄기세포의 성장을 촉진; 염증 및 통증의 감소; 혈관신생 및 흉터화의 억제; 상피 표현형의 회복에 있어 유용하고, 익상편(pterygia)의 "노출 공막(bare sclera)" 제거 동안 결막 자가이식물의 대안적 대체물로 유용하다.
본 발명은 징후인(symptomatic) 수포성 각막병증의 치료를 위해, 바람직하게는 인간에 있어, 더욱 바람직하게는 시력이 나쁜 인간에 있어 본 발명의 콜라겐 생구조물을 사용하는 이식을 포함한다. 본 발명의 콜라겐 생구조물은 징후인 수포성 각막병증, 특히 결막 플랩 구조의 치료를 위해 본 발명이 속한 분야에서 사용되는 다른 표준 절차와 비교하여 향상된 치료적 및 임상적 유용성을 가질 것으로 기대된다. 징후인 수포성 각막병증, 특히 결막 플랩 구조 내의 치료를 위해 본 발명이 속한 분야에서 사용되는 표준 절차에 비해 본 발명의 콜라겐 생구조물을 사용하는 이식의 이점은 예를 들어 통증의 감소, 수술의 편리함, 미용학적으로 좋은 외형, 및 눈꺼플처짐 및 림발 줄기세포 결핍과 같은 합병증의 감소를 포함한다. 본 발명의 콜라겐 생구조물은 궤양이 있는 각막 표피 상해의 치료를 촉진하기 위한 결막 플랩의 향상된 대안물; 심벨파론(symbelpharon) 용해의 결막 표면 재건을 위한 향상된 방법; 결막 또는 각막 표면의 종양, 병변, 또는 상흔 조직의 외과적 제거를 위한 향상된 방법; 결합 수포 누출에 의한 녹내장 수술을 위한 향상된 방법; 익상편(pterygia)의 "노출 공막(bare sclera)" 제거 동안 결막 자가이식물의 대안적으로향상된 대체물; 및 띠 각막병증의 재발 방지를 위한 향상된 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 안과영역의 외과적 이식물로 생구조물을 사용하는 것을 제공한다. 본 발명은 적용 대상에 부착될 때 그 대상에게 전달될 수 있는 하나 이상의 치료 성분을 더 함유하는 본 발명의 생구조물을 포함하는 이식 조제물을 포함한다. 본 발명의 생구조물을 사용하여 전달될 수 있는 치료적 성분의 예는 필로카핀, 에리스로마이신, 겐타미신, 반코마이신, 토브라마이신, 네틸마이신, 폴리믹신 B 설페이트, 트리메토프림, 암포테리신 B, 항-암제, 항생제, 사이클로스포린 등을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 콜라겐 생구조물은 또한 엑시머 레이저 사진굴절의/치료의(photerefractive/therapeutic) 각막절제술에 의해 야기된 각막혼탁을 줄이는데 유용하다.
안과 시술에서 사용하기 위한 본 발명의 콜라겐 생구조물은 인서트, 쉴드(shield), 입자(particle), 겔, 수성 주사, 스폰지, 필름을 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 다양한 구성으로 제공될 수 있다.
본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 안과 이식을 위한 통상의 외과적 기술은 본 발명 내에 포함된다.
안과영역 외과적 이식물로 본 발명의 콜라겐 생구조물을 사용하기 위한 예시적 프로토콜은 다음의 단계를 포함한다: 질병이 있는 각막 및/또는 결막 조직이 제거된다; 본 발명의 방법에 따라 제조된 외과적 이식물이 멸균 상태에서 제공되고, 각막 표피 또는 노출 공막을 덮기 위하여 free hand 테크닉에 의하여 손질된다. 봉합을 사용하여, 이식물은 노출 공막 및 결막의 접합부위에 연결된다; 기본 봉합이 행하여진다; 그 후 끊긴 봉합이 이식 표면 위에 긴장을 부여하기 위하여 사용된다; 그래서 이식물과 적용 대상의 공막 또는 각막 사이의 일정 영역은 피하여 진다. 이식물과 호스트의 연결부위에서, 공여 조직과 연결된 지점의 기초 라미나(lamina) 위로 호스트 표피가 슬라이딩하도록 하기 위하여 적용 대상 결막 아래로 이식물의 자유 모서리(free edge)가 있어야 한다. 그렇지 않다면 이식물은 적용 대상에 의해 배출된다.
5.4.2.2 치과(Dental)
본 발명의 콜라겐 생구조물은 예를 들어 치주 수술, 치주 조직의 재생성을 위한 가이드된 조직 재생성, 가이드된 뼈 재생성 및 치근 덮음과 같은 치과 분야에서 특히 유용하다. 본 발명은 양쪽 매치 치주 결함, 치아사이 내 뼈(intrabony) 결함(defect), 깊은 3-벽(wall) 내 뼈 결함, 2-벽 내 뼈 결함, 및 내 뼈 결함 2 및 3을 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 치주 내 뼈 결함의 재생성을 촉진하기 위하여 본 발명의 콜라겐 생구조물을 사용하는 것을 포함한다. 본 발명의 콜라겐 생구조물은 예를 들어 Quteish et al., 1992, J. Clin. Periodontol. 19 (7): 476-84; Chung et al., 1990, J. Periodontol. 61 (12): 732-6; Mattson et al., 1995, J. Periodontol. 66 (7): 635-45; Benque et al., 1997, J. Clin. Periodontol. 24 (8): 544-9; Mattson et al., 1999, J. Periodontol. 70 (5):510-7에 개시된 것과 같은 크로스-링크된 콜라겐 막을 사용하는 등의 본 발명이 속한 분야에 알려진 다른 기술과 비교하여 치주 내 뼈 결함의 치료에 있어 향상된 치료적 유용성 및 향상된 임상적 파라미터를 가질 것으로 기대된다. 본 발명의 콜라겐 생구조물을 사용하여 향상된 임상적 파마리미터의 예는 본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 플라크 및 잇몸 인덱스 스코어링, 더듬자검사 포켓 깊이, 더듬자검사 부착 깊이, 및 분기(furcation) 인발브먼트와 뼈 결함의 분류를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또한 양쪽 결함(bilateral defect), 쌍 버칼(buccal) 클래스 II 턱뼈(mandibular) 몰라 분기 결함(paired buccal Class II mandibular molar furcation defects), 및 양쪽 턱뼈 분기 결함(bilateral mandibular furcation defect)을 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 클래스 II 분기 결함을 치료하기 위하여 본 발명의 콜라겐 생구조물을 사용하는 것을 포함한다. 클래스 II 분기 결함을 치료하는데 있어서 본 발명의 콜라겐 생구조물의 유용성은 부분적으로 분기 결함 내 없어진 치주를 재생성하는 그것의 능력으로 설명될 수 있다. 본 발명의 콜라겐 생구조물은 Paul et al., 1992, Int. J. Periodontics Restorative Dent. 12: 123-31; Wang et al., 1994, J. Periodontol. 65: 1029-36; Blumenthal, 1993, J. Periodontol. 64: 925-33; Black et al., 1994, J. Periodontol. 54: 598-604; Yukna et al., 1995, J. Periodontol. 67: 650-7에 개시된 것과 같은 클래스 II 분기 결함을 치료하는데 있어 본 발명이 속한 분야에서 사용된 콜라겐 막과 비교하여 향상된 치료적 및 임상적 유용성을 가지리라 예상된다.
본 발명은 또한 치근(root) 덮음 시술에 있어 본 발명의 콜라겐 생구조물을사용하는 것을 포함한다. 치근 덮음(root coverage)에서 본 발명의 생구조물의 유용성은 부분적으로 가이드된 조직 재생성의 원리에 기초한 없어진, 손상된 또는 질병 있는 잇몸 조직을 대체하는 그것의 능력으로 설명될 수 있다. 본 발명의 생구조물은 여러 이유로 위에서 인용되었던 Shieh et al., 1997 J. Periodontol., 68: 770-8; Zahedi et al., 1998 J. Periodontol. 69: 975-81; Ozcan et al., 1997 J. Marmara Univ. Dent. Fa. 2: 588-98; Wang et al., 1997 J. Dent. Res. 78 (Spec Issue): 119 (Abstr. 106)에 개시된 것과 같은 치근 덮음에 전통적으로 사용되어온, 본 발명이 속한 분야의 콜라겐 막과 비교하여 향상된 임상적 유용성을 가질 것으로 기대된다.
본 발명은 또한 치주염 및 치은염(gingivitis)을 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 치주 질환을 가진 개체에게 콜라겐 생구조물을 사용하는 것을 포함한다. 본 발명의 생구조물은 또한 스케일링 및 치근 계획 시술(root planning procedures)에 있어 부속물(adjunct)로써 임상적 유용성을 가진다. 본 발명은 본 발명의 콜라겐 생구조물을 이용하여 치주 질환이 있는 개체를 치료하는 것을 포함한다. 본 발명의 콜라겐 생구조물을 사용하여 개체의 치주 질환을 치료하는 예시적 방법은 예를 들어 5mm 이상의 크기를 가진 하나 이상의 치주 포켓 내로 콜라겐 생구조물을 삽입하는 것을 포함하며, 이 경우 바람직하게 콜라겐 생구조물은 클로헥시딘 글루코네이트와 같은 항생제를 함유한다. 바람직하게 콜라겐 생구조물은 생분해된다.
치과학에서의 사용을 위한 본 발명의 콜라겐 생구조물은 치료되는 치과 장애의 타입에 따라 하나 이상의 생체분자를 함유할 수 있다. 치과 장애를 치료하는데 본 발명이 속한 분야에서 알려진 어떠한 생체분자도 본 발명의 방법 및 조성물에 포함된다. 특정 실시예에서, 감염과 관련된 치과 장애를 치료하기 위해 사용된 콜라겐 생구조물은 독시사이클린, 테트라사이클린, 클로헥시딘 글루코네이트, 및 미노사이클린을 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 하나 이상의 항생제를 함유할 수 있다.
5.4.2.3 신경병(neurology)
본 발명의 콜라겐 생구조물은 또한 손상된 신경을 회복하는데, 특히 심각한 말초 신경을 회복하는데, 및 신경외과 시술에 있어 유용하다. 본 발명은 예를 들어 경질(dural) 대체 및 말초 신경 회복에 있어 콜라겐 생구조물을 사용하는 것을 포함한다. 본 발명의 콜라겐 생구조물은 여러 이유로 위에서 언급된 예를 들어 Berger et al., 1970, Acta. Neurochir. 23: 141; Ducker et al., 1968, Mil. Med. 133: 298; 미국특허 제4,778,467호; 제4,883,618호; 제3,961,805호; 제5,354,305호와 같은 본 발명이 속한 분야에서 사용된 다른 방법들과 비교하여 경질 대체물로써 또는 신경 회복에 있어 향상된 임상적 유용성을 가진다.
몇몇 실시예에서, 본 발명의 콜라겐 생구조물은 신경 연결 주위에 인공삽입물로써 사용될 수 있다. 예를 들어 그것은 말초 신경 연결을 둘러싸기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 콜라겐 생구조물은 예를 들어 회복 영역을 가로질러 세로적(longitudinal) 결합 조직 뼈대의 형성을 촉진하고, 따라서 집(sheath) 세포 및 축삭(axonal) 재생성의 세로적 패턴을 높임으로써 특히 신경 회복에 유용하다.
말초 신경 회복은 일반적으로 네로라피(nerorrahpy, Jennings et al., 1955, Surgery: 206)로 알려진 시술에서 봉합을 사용하는 행해진다. 그러나 이러한 접근은 심각하게 손상된 신경을 봉합하는 방법이 어렵기 때문에 제한적 성공을 거두었다. 본 발명의 콜라겐 생구조물은 따라서 신경 회복에 있어 봉합 없는 방법의 대안을 제공하고, 그것에 의하여 예를 들어 신경 말단은 본 발명의 생구조물로 이루어진 관(tubular) 보철 장치 내로 에워싸인다. 따라서 심각한 말단을 재생성을 위하여 가까운 근접으로 가져온다.
5.4.2.4 비뇨기학(urology)
본 발명의 콜라겐 생구조물은 특히 요실금의 교정에 특히 유용하다. 요실금은 저장 동안 요도가 막혀지지 않아 발생한다. 그 원인은 외인적일 수 있는데, 예를 들어 요도 및 방광 목(neck)의 나쁜 해부학적 지지가 찔금증(incontinence)과 골반저부 재걸기(resuspension)에 대한 반응을 야기한다. 요도 실패는 택일적으로 내인성일 수 있다. 즉 나쁜 요도 기능(urethral function) 때문일 수 있다. 전통적으로, 요실금은 콜라겐, 지방, 실리콘과 같은 팽화 성분(bulking agent)를 사용하여 교정된다(review Lightner, 2002, Current Opinion in Urology, 12 (4): 333-8 참조). 본 발명의 콜라겐 생구조물은 본 발명이 속한 분야에 알려진 팽화 성분과 비교하여 향상된 유용성 즉 자제를 향상시키는 유용성을 가진다. 더욱이 본 발명의 콜라겐 생구조물은 예를 들어 감소된 국소 합병증, 감소된 요도관 감염, 비 주인반응(no host reaction), 믿을만한 내구성, 및 높은 안전성과 같은 향상된 치료적 유용성을 가진다.
요실금을 교정하는데 있어 본 발명의 콜라겐 생구조물의 유용성은 부분적으로 본 명세서에서 설명된 콜라겐 생구조물의 독특한 물리적 형태, 특히 그것의 비-면역원성 때문이다. 몇몇 실시예에서, 콜라겐 생구조물은 예를 들어 요도 임플란트와 같이 이식물로 사용된다. 비록 어떠한 특정 이론에 의해 본 발명이 한정되도록 의도된 것은 아니지만, 본 발명의 콜라겐 생구조물은 예를 들어 요도 폐쇄 압력 및 소변의 수동적 누출에 대한 저항성을 증가시킴으로써 향상된 치료적 유용성을 가질 수 있다.
5.4.2.5 정형외과학(orthopedics)
본 발명의 콜라겐 생구조물은 정형외과 수술 시술에 사용될 수 있다. 일정 실시예에서, 콜라겐 생구조물은 예를 들어 후천적 또는 선천적 결함과 같은 정형외과적 결함에 대하여 사용될 수 있다. 외상 또는 뼈 종양의 외과 소생(resurrection)에서 기인한 국소 결함의 재건은 정형외과 또는 턱얼굴 수술에 있어 중요한 문제이다. 전형적으로, 합성 뼈 대체물 또는 콜라겐 막이 부분적으로 그들의 뼈 유도(osteoinductive) 활성 때문에 사용되어 왔다(예를 들어 Rao et al., 1995, J. Biomater. Sci. Polymer Edn. 7 (7): 623-45 참조). 그러나 일반적 문제는 이식된 물질의 결과인 전신적 감염이다. 본 발명의 콜라겐 생구조물은, 그러나, 특히 정형외과 결함에서 사용된 뼈 대체물로써의 낮은 면역원성 때문에 본 발명이속한 분야에서 사용되는 물질에 비하여 유리하다. 몇몇 실시예에서, 콜라겐 생구조물은 힘줄, 인대 및 연골을 재건하기 위한 인공삽입물(prosthesis)로 사용될 수 있다. 다른 실시예에서, 본 발명의 콜라겐 생구조물은 뼈 대체물로써의 인공삽입물로 사용될 수 있다.
5.4.2.6 심장혈관 수술
본 발명의 콜라겐 생구조물은 예를 들어 큰 및 작은 혈관을 구성하기 위한 인공삽입물로써; 혈관의 선천적 기형 및 질병이 있는 밸브를 회복하기 위하여 심장혈관 외과 시술에서 사용될 수 있다.
본 발명의 콜라겐 생구조물은 특히 예를 들어 정맥 또는 동맥 이식과 같은 혈관 수술에서 이식물로써 유용성을 가진다. 혈관 수술에서 생구조물의 유용성은 부분적으로 그것의 비-독성, 비-면역원성; 안전성; 취급용이성; 항-트롬보제닉 특성; 혈관 벽의 최소 이식 구멍(minimal implantation porosity); 다양한 크기의 가능성; 물질의 재현성 때문이다. 몇몇 실시예에서, 본 발명의 생구조물은 밸브 대체물로 사용될 수 있다.
5.4.2.7 약물 전달
본 발명의 콜라겐 생구조물은 예를 들어 치료 성분과 같은 약물의 조절 전달을 위한 약물 전달 운반체로 사용될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 콜라겐 생구조물은 하나 이상의 치료성분을 개체, 바람직하게는 인간에게 전달한다. 본 발명의 범주내에 포함된 치료 성분은 단백질, 펩타이드, 폴리사카라이드, 폴리사카라이드 접합체(conjugate), 유전적 기초 백신, 생 약화 백신, 전체의 세포들이다. 본 발명의 방법에서 사용되는 약물의 비-한정적 예는 항생제, 항-암제, 항-박테리아제, 항-바이러스제; 백신; 마취제; 진통제; 항-천식제; 항-염증 치료제; 항-우울제; 항-관절염 치료제; 항-당뇨 치료제; 항-정신병제; 중추 신경게 자극제; 호르몬; 면역-억제제; 근 이완제; 플로스타그란딘이다.
콜라겐 생구조물은 개체, 특히 인간에게 하나 이상의 작은 분자의 조절 전달을 위한 전달 운반체로 사용될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 콜라겐 생구조물은 개체, 특히 인간에게 하나 이상의 작은 분자를 전달한다. 여기에서 사용된 것처럼, 용어 "작은 분자" 및 유사한 용어는 몰 당 약 10,000그람 보다 작은 분자량을 가진 펩타이드, 펩티도 유사체, 아미노산, 아미노산 유사체, 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 유사체, 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 유기 또는 무기 화합물(즉 이종유기 및 유기금속 화합물을 포함함), 몰 당 약 5,000그람 보다 작은 분자량을 가진 유기 또는 무기 화합물, 몰 당 약 1,000그람 보다 작은 분자량을 가진 유기 또는 무기 화합물, 몰 당 약 500그람 보다 작은 분자량을 가진 유기 또는 무기 화합물, 몰 당 약 100그람 보다 작은 분자량을 가진 유기 또는 무기 화합물 및 그러한 화합물의 염, 에스터, 및 다른 약학적으로 허용 가능한 형태를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 그러한 화합물의 염, 에스터, 및 다른 약학적으로 허용 가능한 형태 또한 포함된다.
일정 실시예에서, 약물 전달을 위한 운반체로서의 본 발명의 콜라겐 생구조물은 본 발명이 속한 분야에서 알려진 다른 약물 전달 시스템에 비하여 약물의 향상된 흡수; 개선된 약동학적 프로파일, 및 약물의 전신적 분포를 가져온다. 개선된 약물동태에 있어, 약물동력학적 프로파일의 개선은 예를 들어 최고 혈장 농도에 도달하는 시간(Tmax); 최고 혈장 농도의 크기(Cmax); 검출 가능한 혈액 또는 혈장 농도를 나타내는 시간(Tlag)과 같은 표준 약물동력학적 파라미터로 측정된다. 향상된 흡수에 있어, 약물의 흡수는 그러한 파라미터로 측정되는 것처럼 향상된다. 약물동력학적 파라미터의 평가는 본 발명이 속한 분야에서 통상적으로 수행된다.
6.1 콜라겐 생구조물을 만드는 방법
물질(Materials)
다음의 물질들이 콜라겐 생구조물의 제조에 사용된다.
물질/장치
* 전달 레코드의 카피(Copy of Delivery Record)
* 물질/가족 병력/동의서의 카피(Copy of Material/Family HealthHistory/Informed Consent)
* 소스 바코드 라벨(Source Bar Code Label) (공여자 ID 번호)
* 콜렉션 # (투입 물질에 배정되는 연속 숫자)
* 조직 프로세싱 레코더 (서류 ID #ANT-19F); 각 롯트 숫자의 프로세싱의 자세한 레코드가 유지됨.
* 인간 태반 (프로세싱의 시작 전 48 시간이 넘지 않은)
* 멸균 외과수술용 클램프/지혈제
* 멸균 가위
* 멸균 외과용 메스(Scalpel)
* 멸균 세포 스크래퍼(Nalgene NUNC Int. R0896)
* 멸균 거즈(비-멸균 PSS 4416, 멸균된)
* 멸균 린싱(rinsing) 스테인리스 스틸 트레이
* 소독된 프로세싱 스테인리스 스틸 트레이
* 소독된 플라스틱 주머니
* 멸균 0.9% NaCl 용액 (Baxter 2F7124)
* 멸균수 (Milli Q plus 09195 또는 Baxter 2F7113)
* 멸균 표본 저장용기 (VWR15704-014)
* 개인 보호 장비 (멸균 및 비-멸균 장갑을 포함)
* 인증된 클린 룸
* 미리 제조된 탈세포 용액 (D-cell); 0.01-1% 데옥시콜릭 산 소디움 일수화물
* 소독된 주머니
* 흔들리는 플랫폼 (VWR Model 100)
* 타이머 (VWR 21376890)
* 소독된 플라스틱 플레임 메쉬
* PVC 랩 필름
* 진공 펌프 (Schuco-Vac 5711-130)
* 겔 건조기 (즉 열 건조기; BioRad Model 583)
* 소독된 스테인리스 스틸 절단 보드
* 포장을 위한 파우치
* 멸균 스테인리스 시틸 자 (General Tools MFG. Co 1201)
* 추적 가능한 디지털 열측정기 (Model 61161-364, Control Company)
* Accu-Seal 자동 밀봉기 (Accu-Seal, Model630-1B6)
산모는 분만 시에 HIV, HBV, HCV, HTLV, 매독, CMV 및 모아지는 태반 조직을 오염시킬 수 있는 다른 바이러스, 및 다른 병원체와 같은 전염 가능한 질환이 조사되었다. 시험된 산모가 위에서 언급된 병원체에 대하여 음성 또는 비-반응성인 경우 공여자로부터 모아진 다른 조직들이 콜라겐 생구조물을 제조하기 위해 사용되었다.
정상적 출산 후에, 태반, 탯줄 및 탯줄 혈액은 자발적으로 수축하는 자궁으로부터 방출된다. 태반, 탯줄, 및 탯줄 혈액은 출생 후에 모아졌다. 그 물질들은 실험실로 운반되고, 실험실에서 그것들은 프로세싱의 적어도 1시간 전부터 가동된 HEPA 여과 시스템을 사용한 클린 룸 내 무균 상태에서 처리되었다. 그 물질을 다루는 모든 경우에 있어 장갑(멸균 또는 비-멸균 장갑을 적절히 사용)을 착용하였다. 조직 프로세싱 동안 생성된 양막/융모막의 모든 사용되지 않은 (폐기) 부분 및 오염된 용액은 가능한 빨리 처리되었다.
단계 I
멸균 필드는 멸균 Steri-Wrap 시트로 설치되었고, 프로세싱을 위한 다음의 기구와 액세서리가 그 위에 놓아졌다.
* 멸균 트레이 팩
* 멸균 세포 스크래퍼
* 멸균 외과용 메스
* 소독된 프로세싱 트레이
멸균 팩 ID #는 프로세싱 레코드에 기록되었다.
태반이 운반 용기로부터 분리되고 소독된 스테인리스 스틸 트레이에 놓여졌다. 외과용 클램프와 가위를 사용하여 탯줄이 태반 디스크로부터 약 2 인치가 되도록 잘랐다. 탯줄은 나중의 프로세싱을 위하여 분리된 멸균 용기에 놓여졌다. 용기는 조직 ID 바코드로 표지되었고; 존재하는 물질 및 보관 용액 (즉 매체의 타입)이확인되었다. 몇몇 케이스에서, 탯줄은 다른 프로젝트에서 요구되지 않는 경우 버려졌다.
태반 막의 모서리로부터 시작하여, 손가락으로 비절개박리하여 융모막으로부터 양막을 분리하였다. 이것은 막을 절단하기에 앞서 수행되었다.
양막을 융모막의 전체 표면 및 태반 디스크로부터 분리한 후에, 양막은 가위를 사용하여 탯줄 스텀프(stump) 주위로 잘려졌고 태반 디스크로부터 분리되었다. 몇몇 예에서, 양막과 융모막의 분리가 조직을 손상시키지 않고 가능하지 않다면 양막과 융모막은 태반 디스크로부터 하나의 조각으로 잘려지고, 그 후 따로 분리하며 벗겨졌다.
융모막은 분리된 표본 용기에 다른 프로젝트에서 사용하기 위하여 놓여졌다. 용기는 조직 ID 바코드로 표지되고, 존재하는 물질 및 보관 용액 (즉 매체의 타입)이 확인되고, 서명되고, 날짜가 기입되었다.
양막의 일정 조각이 태반 디스크에 아직 부착되어 있는 경우, 그것은 디스크로부터 벗겨지고 가위를 사용하여 탯줄 주위에서 잘려졌다. 태반은 다른 프로젝트에서 사용하기 위하여 운송 용기에 다시 놓여졌다.
적절한 데이터가 조직 프로세싱 레코더에 기록되었다.
양막은 멸균 0.9% NaCl 용액의 트레이에 보관되었다. 바람직하게는, 양막은 프로세스의 다음 단계에 앞서 전달시간으로부터 최대 72시간 동안 동결되어 저장된다.
단계 II
양막은 한번에 하나씩 표본 용기로부터 분리되고, 소독된 스테인리스 스틸 트레이에 놓여진다. 다른 조각들은 그들이 세척을 위해 준비될 때까지 멸균수로 채워진 분리된 멸균 스테인리스 스틸 트레이에 놓여진다. 프로세싱 트레이의 양막의 여분 조각은 제거되고 멸균수로 채워진 분리된 린싱 스테인리스 스틸 트레이에 놓여진다.
양막이 어머니 혈액 또는 태아 액/물질로 많이 오염된 경우 양막은 필요한 만큼 멸균수를 교환하여 멸균수로 헹구어졌다.
양막은 어머니쪽 부위가 위로 향하게 프로세싱 트레이에 놓여졌다. 멸균 세포 스크래퍼를 사용하여, 양막의 어머니쪽 부위로부터 세포성 물질과 육안으로 관찰되는 오염물질을 가능한 많이 주의깊게 제거하였다. (참조: 막이 찢어지는 것을 막기 위하여 이번 단계에서는 최소 압력이 적용되어야 한다) 멸균수가 세포 및 세포 파편의 제거를 돕기 위해 사용되었다. 양막은 분리된 멸균 스테인리스 스틸 린싱 트레이에서 멸균수를 사용하여 더 헹구어졌다.
양막을 뒤집어 태아쪽이 위로 향하게 하고, 프로세싱 트레이에 다시 놓고 멸균수로 헹구었다. 육안으로 보이는 세포성 물질 및 파편들을 세포 스크래퍼를 사용하여 부드럽게 제거하였다. (참조: 막이 찢어지는 것을 막기 위하여 이번 단계에서는 최소 압력이 적용되어야 한다) 멸균수가 세포 및 세포 파편의 제거를 돕기 위해 사용되었다.
양막은 분리된 멸균 린싱 트레이에서 세척 라운드(rounds) 사이에 멸균수로헹구어졌다. 모든 육안으로 보이는 세포 물질 및 파편들이 막의 양쪽부위에서 제거되지 않은 경우 대부분을 제거하기 위하여 필요한 만큼 많이 조직은 세척되었다. 멸균수는 헹굼 사이에 린싱 트레이에서 교환되었다.
프로세싱 트레이는 각각의 세척 라운드 후에 멸균수로 헹구어졌다.
양막의 모든 다른 조각들이 동일한 방법으로 조작되었고, 동일한 용기 내에 놓여졌다. 조직 ID 바코드가 첨부되고, 존재하는 물질 및 보관 용액 (즉 매체의 타입)이 확인되고, 서명 데이터가 첨부되었다.
적절한 정보 및 데이터가 조직 프로세싱 레코더에 기록되었다.
단계 III
양막은 린싱 트레이(또는 보관 용기)로부터 분리되었고, 여분의 용액은 손가락으로 부드럽게 짜서 제거하였고, 막은 멸균 표본 용기에 놓여졌다. 용기는 양막의 모든 부분이 덮여지도록 150ml 마크까지 D-세포 용액으로 채워졌고, 밀폐하였다.
용기는 흔들리는 플랫폼 위 주머니(bin) 내에 놓여졌다. 흔들리는 플랫폼은 켜지고, 막은 최소 15분 및 최대 120분 동안 #6 세팅으로 D-세포 용액 내에서 교반되었다.
새로운 멸균 필드가 단계 I에서와 동일한 방법으로 새로운 멸균 장치와 소독된 트레이를 이용하여 설치되었다. 멸균 팩 ID 숫자는 프로세싱 레코더에 기록되었다.
교반이 완료된 후에, 흔들리는 플랫폼은 꺼졌고, 막은 용기에서 꺼내었다.막은 새로운 멸균 스테인리스 스틸 프로세싱 트레이 내에 놓여졌다. 멸균 0.9% NaCl 용액이 트레이의 바닥을 덮기 위하여 첨가되었다.
새로운 멸균 세포 스크래퍼를 사용하여, 잔여 D-세포 및 세포성 물질(만약 존재한다면)이 조직의 양면으로부터 제거되었다. 이러한 단계는 양쪽 면의 전체 표면으로부터 육안으로 보이는 잔여 세포성 물질을 가능한 많이 제거하기 위하여 필요한 만큼 수회 반복되었다. 막은 세척 라운드 사이에 멸균 린싱 트레이 내에서 멸균 0.9% NaCl 용액으로 헹구어졌다. 멸균 0.9% NaCl 용액은 헹굼 사이에 린싱 트레이 내에서 교환되었다.
마지막 세척 라운드가 완결된 후에, 막은 멸균 0.9% NaCl 용액으로 헹구어졌고, 멸균 0.9% NaCl 용액으로 채워진 새로운 멸균 표본 용기 내에 놓여졌다.
양막의 모든 남은 조각이 완전히 동일한 방법으로 처리되었다.
모든 양막 조각이 처리되고 멸균 0.9% NaCl 용액의 용기 내에 놓여졌을 때, 용기는 #6 세팅으로 최소 5분 동안 교반되기 위하여 흔들리는 플랫폼 위 주머니 내에 놓여졌다. 교반이 완결된 후에, 막은 표본 용기에서 꺼내지고, 멸균 0.9% NaCl 용액이 용기 내에서 교환되고, 막은 다시 표본 용기 내에 놓여졌다.
표본 용기는 조직 ID 바코드와 격리 라벨로 표지되었다. 존재하는 물질 및 보존 용액 (즉 용액의 타입)은 확인되고, 서명되고 및 날짜가 기입되었다. 표본 용기는 깨끗한 짚(zip)-밀폐 용기 내에 놓여지고, 냉장고(2-8℃) 내에 놓았다.
모든 적절한 데이터는 조직 프로세싱 레코드 내에 기록되었다.
혈청검사 결과가 나왔을 때, 적절한 표지(혈청 음성 또는 단지 연구용도용)가 격리 라벨 위에 놓여졌고, 그러한 용기는 격리된 것들로부터 분리되었다.
단계 IV
단계 IV를 진행하기 전에, 조직 상태 검토(Tissue Status Review)가 모든 이용 가능한 시험 결과가 음성인지 확인하기 위하여 이루어졌다.
멸균 필드가 멸균 Steri-Wrap 시트를 사용하여 세팅되었고, 모든 멸균 및 소독된 장치와 액세서리가 단계 II 및 III와 동일한 방식으로 세팅되었다.
막은 냉장고에서 꺼내지고, 멸균 스테인리스 스틸 프로세싱 트레이 내에 놓여졌다. 멸균 0.9% NaCl 용액이 트레이의 바닥을 덮기 위하여 첨가되었다.
모든 육안으로 보이는 세포성 물질 및 파편(만약 있다면)이 새로운 멸균 세포 스프래퍼를 사용하여 부드럽게 제거되었다. (참조: 막이 찢어지는 것을 막기 위해 이 단계에서는 최소 압력이 적용되어야 한다) 멸균 0.9% NaCl 용액이 세포 및 파편의 제거를 돕기 위해 사용되었다.
막은 멸균 0.9% NaCl 용액으로 채워진 분리된 멸균 스테인리스 스틸 린싱 트레이 내에서 헹구어졌다. 멸균 0.9% NaCl 용액은 세척 라운드 사이에 교환되었다. 막은 새로운 멸균 표본 용기에 놓아졌고, 용기는 새로운 멸균 0.9% NaCl 용액으로 채워졌고, #6 세팅으로 최소 5분 동안 진탕하기 위하여 흔들리는 플랫폼 위에 놓아졌다.
앞 단계가 3회 반복되었고, 멸균 0.9% NaCl 용액이 각 진탕 사이에 교환되었다. 적절한 데이터가 조직 프로세싱 레코드에 기록되었다.
막은 표본 용기에서 한번에 한 조각씩 꺼내어졌고, 과량의 액은 손가락을 이용하여 부드럽게 짜서 제거하였고, 막은 멸균 프로세싱 트레이에 놓아졌다. 막은 평평해질 때까지 부드럽게 늘려졌다; 태아쪽 면이 아래로 향하도록 확실히 하였다.
프레임은 멸균 가위를 이용하여 소독된 플라스틱 시트를 잘라 준비되었다. 프레임의 크기는 막 세그먼트 보다 각 방향에 있어 약 0.5cm는 작아야 한다. 프레임은 멸균 0.9% NaCl 용액으로 채워진 린싱 트레이 내에서 헹구어졌다.
프레임은 가볍게 늘려진 막 표면 위에 놓여졌고, 그 위에 부드럽게 압력을 가하였다. 플라스틱 프레임의 부드러운 면이 조직을 향하도록 하는 것은 중요하다.
외과용 메스를 사용하여, 막은 프레임 모서리부터 약 0.5cm가 남도록 프레임 주위로 잘려졌다. 과량의 막은 표본 용기 내에 다시 놓여졌다.
프레임을 벗어나는 막 모서리는 클램프 또는 족집게를 사용하여 프레임의 모서리 위로 감싸졌고, 동일한 트레이 위에 놓아졌다.
막의 다른 조각은 동일한 방법으로 처리되었다. 건조되는 총 면적이 열 건조기 당 300cm2을 초과하지 않는 것이 중요하다. 막의 조각을 '프레임 아웃(framing out)'하는 동안, 비-프레임 조각은 용기 내 멸균 0.9% NaCl 용액 내에 있어야 한다.
드라이어의 건조 온도는 확장 프로브를 가진 캘리브레이트된 디지털 온도계를 사용하여 세팅되고, 확인되었다. 건조 온도는 50℃로 세팅되었다. 데이터는 조직 프로세싱 레코드에 기록되었다.
진공 펌프는 켜졌다.
멸균거즈는 열 건조기의 건조 플랫폼 위에 놓여졌고, 프레임된 막의 영역 보다 약간 넓은 영역을 덮었다. 거즈 층의 총 두께가 한번 접혀진 4x4 거즈의 두께를 초과하지 않는 것이 중요하다.
플라스틱 프레이밍(framing) 메쉬 한 시트가 거즈 위에 놓여졌다. 플라스틱 메쉬 모서리는 거즈 모서리보다 약 0.5-1.0cm 초과하여야 한다.
플레임된 막은 부드럽게 들어올려져 막 쪽이 위로 향하도록 열 건조기 플랫폼 위 플라스틱 메쉬의 위에 놓여졌다. 이것은 막의 최대 양(300cm2을 초과하지 않음)이 열 건조기 플랫폼 위에 놓여질 때까지 반복되었다. (참조: 양막의 태아쪽 면이 위로 향함)
PVC 랩 필름이 열 건조기의 전체 건조 플랫폼과 그의 다리를 덮을 정도로 크게 잘려졌다.
진공 펌프를 작동시키고, 열 건조기의 전체 건조 플랫폼을 부드럽게 플라스틱 필름으로 덮어, 양쪽 면 건조 플랫폼 모서리를 넘어 다리의 반만 남도록 하였다. 주의 깊게 필름을 막 및 플레임 시트에 대하여 단단히 끌고 (즉, 그것은 진공에 의하여 "빨아들어졌다(sucked in)") 조직 영역에 공기 누출 및 주름이 없었다. 리드(lid)는 그 후 밀폐되었다.
진공 펌프는 약-22 인치 Hg 진공으로 세팅되었다. 펌프 게이지는 건조 사이클의 2-3분 후에 기록되었다. 막은 약 60분 동안 열 진공 건조되었다. 건조 프로세스 내 약 15-30분, 멸균 거즈 층은 새로운 것으로 열 건조기 내에 놓여졌다. 거즈 층의 총 두께는 한번 접힌 4x4 거즈의 두께를 넘지 말아야 한다.
교환 후, 주의 깊게 플라스틱 필름이 막 및 플레임 시트에 대하여 단단히 잡아당겨졌고, 막 영역에는 공기 누출 및 주름이 없었다.
진공 밀봉의 완전성은 주기적으로 펌프 압력 모노미터를 체크하여 확인되었다. 건조 프로세스의 완결 후에, 열 건조기는 열려졌고 막은 펌프가 켜진 상태에서 약 2분 동안 식혀졌다.
새로운 멸균 필드가 멸균 Steri-wrap을 이용하여 세팅되었고, 소독된 스테인리스 스틸 커팅 보드(board)가 그 아래 놓여졌다. 이 시점에서 멸균 장갑이 사용되었다. 펌프를 계속 작동시킨 상태에서, 플라스틱 필름이 코너에서 시작하여 막 시트로부터 부드럽게 제거되었고 막 시트를 장갑 낀 손아래에 유지하였다. 프레임이 막과 함께 건조 플랫폼에서 들어올려졌고 막쪽이 위로 향하도록 소독된 스테인리스 스틸 커팅 보드의 위 멸균 필드 위에 놓여졌다. 외과용 메스를 사용하여, 막 시트를 프레임의 모서리부터 1-2mm 떨어지도록 모서리를 따라 칼 새김(incision)을 내며 잘랐다. 막은 장갑 (멸균 장갑) 낀 손으로 위치 지어졌다. 막 시트를 그것을 부드럽게 벗겨내어 프레임에서 분리하였고, 커팅 보드 위 멸균 필드 위에 놓았다.
외과용 메스 또는 날카로운 가위를 사용하여, 막 시트는 특정 크기의 세그먼트로 잘려졌다. 모든 조각은 잘려졌고, 포장 전에 멸균 필드 위에 안전하게 놓았다. 하나의 막 조각은 다른 한 손(비-멸균)으로 파우치를 잡고 있는 동안 다른 한 손(멸균)으로 이너(inner) 필-파우치(peel-pouch) 포장 내에 넣어졌다. '멸균' 손으로 파우치를 건드리지 않도록 주의하였다. 모든 조각이 이너 파우치 내로 넣어진 후, 그것들은 봉해졌다. 적절한 정보(예를 들어 파트 #, 롯트 # 등)가 있는 표지가 파우치의 바깥 지정된 위치에 첨부되었다. 모든 조각의 막이 동일한 방식으로 프로세스 되었다. 표지되고 밀봉된 필-파우치 포장은 그들이 멸균 시설 또는 분배자에게 운송되기 위해 준비될 때 까지 보관을 위하여 방수 집(zip)-락(lock) 가방에 넣어졌다. 모든 적절한 데이터가 조직 프로세싱 레코드에 기록되었다.
6.2 수화/봉합능력(suturability)에 대한 콜라겐 생구조물의 평가
본 발명의 생구조물의 외과 수술적 취급성, 수화 기간 및 봉합능력에 관하여 정성적 및 정량적 피드백을 얻기 위하여, 본 발명의 방법에 따라 제조된 양막 샘플이 4명의 경험 있고, 존경받는 눈표면 외과 의사들에게 평가를 위해 제공되어졌다. 샘플은 본 발명의 생구조물의 외과 수술적 취급 성질 및 봉합능력을 결정하기 위하여 돼지 눈 표본 위에 조직 이식을 수행함으로써 외과 의사들에 의해 평가되었다.
다음의 방법들이 각 외과 의사에 의해 사용될 수 있다.
(1) 돼지 눈의 사분역(quadrant) 하나에 알맞게 생구조물을 자른 후 건조한다.
(2) 잘려진 생구조물은 돼지 눈의 표면 위에 놓여진다.
(3) 생구조물은 멸균 생리식염수 용액으로 수화되고, 이식이 활성화되도록 된다. 즉 2, 5, 10 및 20분의 수화 기간동안 돼지 눈 위에서 재-수화된다.
(4) 생구조물은 여러 개의 9-0 비크릴(vicryl) 봉합 바이트(bite)로 돼지 눈의 표피에 봉합된다. 및
(5) 외과 의사는 수화된 양막의 조직 질(quality), 일치정도(consistency), 및 봉합능력에 대하여 정성적 평가를 한다.
균등물(Equivalents):
본 발명은 본 명세서에서 설명된 특정 실시예에 의하여 그 범위가 한정되는 것은 아니다. 실로, 설명된 것들에 더하여 본 발명의 다양한 변형은 전술한 설명 및 도면들로부터 본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다. 그러한 변형은 다음의 청구항의 범위 내에 있도록 의도된 것이다.
다양한 문헌, 특허 및 특허출원이 본 명세서에서 인용되었고, 그것의 개시들은 인용에 의하여 전체적으로 본 명세서에 포함된다.

Claims (76)

  1. (a) 융모막으로부터 양막을 분리하는 단계; 및
    (b) 상기 양막이 효소와 접촉하지 않기 위하여 양막을 탈세포화하는 단계를 포함하는 양막과 융모막을 갖는 태반으로부터 콜라겐 생구조물을 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서 상기 방법은 상기 탈세포화된 양막을 세척하고 건조하는 것을 더욱 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 태반은 인간 태반인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 태반은 제왕 절개 분만 또는 자연 분만을 겪은 인간 여성으로부터 온 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 방법은 상기 태반 막이 적어도 하나의 전염병에 대한 테스트를 한 공여자로부터 온 것인지를 결정하는 단계를 부가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 공여자는 인간 여성인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 태반은 출생 후 48시간 내에 공급된 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 방법은 (a)단계 후, (b)단계 전에 72시간까지 상기 양막을 저장하는 단계를 부가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 저장은 (a)단계에서 얻은 상기 양막을 5일까지 냉장하는 것을 포함하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 (b)단계에서 상기 양막의 탈세포화는 상기 양막으로부터 모든 가시적인 세포 물질 및 세포찌거기를 제거하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 (b)단계에서 상기 양막의 탈세포화는 상기 양막의 태아 측과 상기 양막의 어미 쪽으로부터온 모든 가시적인 세포 물질 및 세포찌거기를 제거하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 (b)단계에서 상기 양막의 탈세포화는 상기 막을 물리적으로 벗겨내는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 (b)단계에서 상기 양막의 탈세포화는 용액을 갖는 세제로 상기 양막을 탈세포화는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 용액을 갖는 세제는 0.01-1.0% 데옥시코릭산(deoxycholic acid) 나트륨 염 모노하이드레이트를 포함하는 용액인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 용액을 갖는 세제는 비이온성 세제, 트리톤 X-100, 음이온성 세제 및 소디움 도데실 설페이트 또는 그것의 혼합물로 구성된 군으로 부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제12항에 있어서, 상기 물리적 벗겨냄은 세포 스크래퍼를 가지고 벗겨내는 것을 포함하는 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 (b)단계에서 상기 양막의 탈세포화는 살균 용액에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제2항에 있어서, 상기 양막의 세척은 살균 용액에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제2항에 있어서, 상기 탈세포화된 양막의 건조는 약 35℃에서 약 50℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. (a) 융모막으로부터 양막을 분리하는 단계;
    (b) 상기 양막을 탈세포화하는 단계; 및
    (c) 양막 래미네이트(laminate)를 형성하기 위하여 적어도 두 상기 탈세포화된 양막을 서로 접촉하여 적층하는 단계를 포함하는 양막과 융모막을 갖는 태반으로부터 양막 래미네이트을 제조하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 방법은 (b)단계 후, (c)단계 전에 적어도 한번 상기 탈세포화된 양막을 세척하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제20항에 있어서, 상기 방법은 상기 탈세포화된 양막 래미네이트를 건조하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제20항에 있어서, 상기 방법은 상기 양막 래미네이트의 적어도 둘을 복잡한 3차 스캐폴드(scaffold)로 결합하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 양막은 천연 3차 또는 4차 구조를 가지며 탈수되고, 탈세포화되고 기질 없는 양막을 포함하는 콜라겐 생구조물.
  25. 콜라겐, 에라스틴 및 피브로넥틴을 포함하는 탈세포화되고 기질 없는 콜라겐 생구조물.
  26. 제1항의 방법에 의하여 제조된 콜라겐 생구조물.
  27. 제24항에 있어서, 상기 양막은 인간 양막인 것을 특징으로 하는 콜라겐 생구조물.
  28. 제24항에서 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생구조물은 약 10에서 40 마이크론의 두께를 갖는 것을 특징으로 하는 콜라겐 생구조물.
  29. 제24항에서 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생구조물은 하나 이상의 생분자들을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 콜라겐 생구조물.
  30. 제29항에 있어서, 상기 생분자는 항생물질, 호르몬, 성장 인자, 항-종양제, 항진균제, 항바이러스제, 통증 치료제, 항히스타민제, 항염증제, 항감염제, 상처 치유제, 상처 봉합체, 세포 유인제 및 스캐폴딩제로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 콜라겐 생구조물.
  31. 제29항에 있어서, 상기 생구조물은 하나 이상의 소분자들을 더욱 포함하는 콜라겐 생구조물.
  32. 제24항에서 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생구조물은 단일하고 컨후루언트한 세포들로 더욱 군집시키는 것을 특징으로 하는 콜라겐 생구조물.
  33. 제32항에 있어서, 상기 세포들은 인간 줄기세포 또는 인간 분화된 성인 세포들인 것을 특징으로 하는 콜라겐 생구조물.
  34. 제24항에서 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생구조물은 하나 이상의 치료제를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 콜라겐 생구조물.
  35. 제34항에 있어서, 상기 치료제는 호르몬, 펩타이드, 항생제, 항진균제 및 효소로 구성된 군으로부터 선택된 치료제인 것을 특징으로 하는 콜라겐 생구조물.
  36. 제24항에서 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생구조물은 하나 이상의 하이드로겔 조성물을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 콜라겐 생구조물.
  37. 제36항에 있어서, 상기 하이드로겔 조성물은 폴리비닐 알콜, 폴리에틸렌 글라이콜, 히아루로닉산, 덱스트란, 및 그것의 유도체 또는 아나로그로 구성된 군으로부터 선택된 폴리머를 포함하는 것을 특징으로 하는 콜라겐 생구조물.
  38. 제24항에서 제26항 중 어느 한 항의 콜라겐 생구조물을 포함하는 3차 스캐폴드.
  39. 제38항에 있어서, 상기 스캐폴드는 튜브인 것을 특징으로 하는 3차 스캐폴드.
  40. 제38항에 있어서, 상기 스캐폴드는 하나 이상의 하이드로겔 조성물을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 3차 스캐폴드.
  41. 제40항에 있어서, 상기 하이드로겔 조성물은 폴리비닐 알콜, 폴리에틸렌 글라이콜, 히아루로닉산, 덱스트란, 및 그것의 유도체 또는 아나로그로 구성된 군으로부터 선택된 폴리머를 포함하는 것을 특징으로 하는 3차 스캐폴드.
  42. 제20항의 방법에 의하여 제조된 양막 래미네이트.
  43. 제24항에서 제26항 중 어느 한 항의 콜라겐 생구조물의 적어도 두 층을 포함하는 양막 래미네이트.
  44. 제24항에서 제26항 중 어느 한 항의 콜라겐 생구조물을 포함하는 양막 래미네이트.
  45. 제42항에서 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 래비네이트는 하나 이상의 하이드로겔 조성물을 더욱 포함하는 양막 래미네이트.
  46. 제45항에 있어서, 상기 하이드로겔 조성물은 폴리비닐 알콜, 폴리에틸렌 글라이콜, 히아루로닉산, 덱스트란, 및 그것의 유도체 또는 아나로그로 구성된 군으로부터 선택된 폴리머를 포함하는 것을 특징으로 하는 양막 래미네이트.
  47. 제24항에서 제26항 중 어느 한 항의 콜라겐 생구조물을 포함하는 수술 이식.
  48. 대상의 수술 자리에 제47항의 외과적 수술 이식을 직접 적용하는 수술 과정에서 제47항의 외과적 이식을 사용하는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 수술(surgical) 자리는 눈, 피부, 복부의 장막 표면, 흉강의 장막 표면, 장 심장막, 구강의 점액질 표면, 비강의 점액질 표면, 호흡기관 표면, 위장관 표면 및 비뇨생식기관 표면으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제48항에 있어서, 상기 수술 이식은 대상의 몸의 내부 자리에 적용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제48항에 있어서, 상기 수술 이식은 대상의 몸의 외부 자리에 적용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제48항에 있어서, 상기 대상은 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 대상의 질환있는 눈 표면에 제24항에서 제26항 중 어느 한 항의 콜라겐 생구조물을 위치시키는 것을 포함하는 대상의 안과 질환의 치료 및/또는 예방 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 안과질환은 궤양(ulceration)/천공(perforation), 수포각막병증, 안 유피종(ocular dermoid)/종양, 주요한 익상편(pterygium), 지속적 각막 상피 결함, 급성 및 만성 알카리 화상들, 열 화상들, 홍체결여증(aniridia), 아토피성 각막염, 특발성(idiopathic) 윤부(limbal) 줄기 세포 결핍, 각막 판누스(pannus), 신혈관 신생, 류머티스성 각막 용해, 안 반흔성유천포창(cicatricial pemphigoid), 누수되는 여과 수포(bleb), 노출된 암드(Ahmed) 밸브 튜브, 차후 검구유착(symblepharon)을 갖는 세라시아(Serratia) 봉와직염, 급성 및 만성 스티븐슨 존슨(Johnson) 증후군으로 구성된 군으로부터 선택된 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 안과 수술, 심혈관 수술; 치주 수술; 신경학적 수술, 치과수술 및 정형외과 수술로 구성된 군으로부터 선택된 수술과정에서 제24항에서 제26항 중 어느 한 항의 콜라겐 생구조물을 사용하는 방법.
  56. 대상의 비뇨기적 실금의 치료에 제24항에서 제26항 중 어느 한 항의 콜라겐 생구조물을 사용하는 방법.
  57. 제24항에서 제26항 중 어느 한 항의 콜라겐 생구조물로 대상을 접촉하는 것을 포함하는 대상에 치료제를 운반하는 방법.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, 상기 대상은 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제57항에 있어서, 상기 치료제는 항생물질, 항암제, 항세균제, 항바이러스제, 백신, 마취제, 진통제, 항 천식제, 항염증제, 항우울제, 항당뇨제, 항정신제, 중추신경계 자극제, 호르몬, 면역 억제제, 근육 이완제 및 프로스타그란딘으로 구성된 군으로부터 선택된 치료제인 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 콜라겐 생구조물의 제조 시간에 콜라겐 생구조물의 수화를 포함하는 제24항에서 제26항 중 어느 한 항의 콜라겐 생구조물을 이용하는 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 생구조물의 수화는 살균된 식염수로 수화하는 것을 포함하는 방법.
  62. 제60항에 있어서, 상기 생구조물은 사용 전 적어도 2분간 수화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  63. 살아 있는 세포로 상기 래미네이트를 군집하는 것을 더욱 포함하는 양막 래미네이트를 사용하는 방법.
  64. 제63항에 있어서, 상기 살아 있는 세포는 성인 조직 세포 및 줄기 세포로 구성된 군으로부터 선택된 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 줄기 세포는 분화전능한(totipotent) 것을 특징으로 하는 방법.
  66. 제64항에 있어서, 상기 줄기 세포는 만능(pluripotent)인 것을 특징으로 하는 방법.
  67. 제64항에 있어서, 상기 줄기 세포는 조직 특이적인 것을 특징으로 하는 방법.
  68. 제24항에서 제26항 중 어느 한 항의 콜라겐 생구조물로 상기 피부 질환에 접촉하는 것을 포함하는 대상에서 피부 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 피부 질환은 피부 손상, 주름, 세선(fine line), 얇은 피부, 감소된 피부 신축성, 거친 피부, 여드름 흉터, 미간 후로스(glabellar furros), 절개 흉터, 연 조직 결함, 선천적 피부 질환, 퇴행성 피부 질환, 콜라겐 Ⅶ 결함 및 태양 손상된 피부로 구성된 군으로부터 선택된 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
  70. 제68항에 있어서, 상기 방법은 피부 질환의 치료를 위하여 대상에 하나 이상의 치료제를 투여하는 것을 더욱 포함하는 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 하나 이상의 치료제는 비타민, 미네랄, 카테킨 기초 조제물 및 글루코사민으로 구성된 군으로부터 선택된 방법.
  72. 제24항에서 제26항 중 어느 한 항의 콜라겐 생구조물로 상기 상처를 접촉하는 것을 포함하는 대상에서 상처를 치료하는 방법.
  73. 제72항에 있어서, 상기 상처는 표피 상처, 피부 상처, 압력(pressure) 궤양, 만성 상처, 급성상처, 외부 상처, 내부 상처, 선천적 상처, 화상 상처, 외과 상처 및 상처 감염으로 이루어진 군으로부터 선택된 상처인 것을 특징으로 하는 방법.
  74. 제24항에서 제26항 중 어느 한 항의 콜라겐 생구조물로 상기 화상을 접촉하는 것을 포함하는 대상에서 화상을 치료하는 방법.
  75. 제74항에 있어서, 상기 화상은 1도 화상, 2도 화상, 3도 화상, 감염된 화상 상처 및 화상 상처 농가진으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  76. 제68항, 제72항 또는 제74항에 있어서, 상기 대상은 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
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