KR102651043B1

KR102651043B1 - 지질-외피보유 바이러스의 불활성화를 위한 환경 친화적 세제

Info

Publication number: KR102651043B1
Application number: KR1020207015211A
Authority: KR
Inventors: 쟝-밥티스트 파르세트; 요한나 킨더만; 비요른 틸레; 토마스 알 크레일
Original assignee: 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤
Priority date: 2017-10-30
Filing date: 2018-10-30
Publication date: 2024-03-22
Anticipated expiration: 2038-10-30
Also published as: SG11202003793WA; MX2020004151A; US20210032567A1; ES2991988T3; RU2020117357A; RU2020117357A3; AU2018357917A1; EP3704178A1; JP2021501163A; KR20200071127A; CA3080656A1; BR112020008414A2; EP3704178B1; AU2018357917B2; WO2019086463A1; US12258540B2; JP7432506B2; CN111511800B; CN111511800A; CO2020006181A2

Abstract

본 발명은 환경 친화적 세제를 사용하여 지질-외피보유 바이러스를 불활성화시키는 방법, 및 환경 친화적 세제를 사용하여 생물제약 약물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 환경 친화적 세제를 제공한다.

Description

지질-외피보유 바이러스의 불활성화를 위한 환경 친화적 세제

생물제약 약물의 사용은 개체 건강에 영향을 미치는 많은 질환, 질병 또는 상태를 치료하는 방법으로서 중요성이 계속 증가하고 있다. 생물제약 약물은 전형적으로, 포유동물 세포주와 같은 숙주 세포에서의 재조합 생산을 통해, 또는 생물학적 유체로부터의 정제에 의해 수득된다. 그러나, 이러한 생물제약 생산 공정에서, 바이러스 오염은 상당한 문제를 제기한다. 바이러스 오염은 동물-유래의 생성물의 사용을 통해, 또는 정제되는 생물학적 유체에 의해 생물제약 생산 공정으로 도입될 수 있다. 박테리아 오염과 달리, 바이러스 오염은 검출하기가 어렵다. 그러나, 바이러스 오염이 간과되고 감염성 바이러스가 생물제약 약물의 제형 내로 혼입되는 경우에는 환자에게 상당한 건강상 위험이 제기된다. 따라서, 생물제약 생산에서 바이러스 불활성화는 대단히 중요하다.

많은 생물제약 생산 공정에서, 바이러스 불활성화를 위해 세제가 사용된다. 종종, 이들 세제는 소위 용매/세제 (S/D) 처리에서 용매와 배합된다. 상품의 S/D 처리를 위해 세제 트리톤(Triton) X-100이 다년간 사용되어 왔다.

그러나, 최근의 생태적 연구를 통해, 트리톤 X-100 및 그의 분해 생성물이 잠재적으로 수중 유기체 내의 내분비 교란물질로서 거동하여, 환경적 영향 관점에서 문제를 일으킬 수 있음이 제기되었다 (문헌 ["ECHA Support document for identification of 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenol, ethoxylated as substances of very high concern because, due to their degradation to a substance of very high concern (4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenol) with endocrine disrupting properties, they cause probable serious effects to the environment which give rise to an equivalent level of concern to those of CMRs and PBTs/vPvBs", adopted on 12 December 2012] 참조). 결과적으로, 바이러스 불활성화를 위한 대안적인 환경 친화적 세제가 요구된다.

본 발명은 하기 기재된 실시양태를 제공함으로써 상기 기재된 요구를 충족시키고 관련 기술분야에서의 상기 언급된 문제를 해결한다:

트리톤-X100의 독성 활성은, 해양 생물 유기체의 특정 내분비 수용체에 도킹하는 능력을 갖는 페놀 모이어티로부터 기인한다. 일관성 있게, 내분비 교란물질 활성에 대한 인실리코 예측에 기반하여, 본 발명에 따른 비-페놀성 폴리옥시에틸렌 에테르 세제 중 어느 것도 내분비 교란물질로서 활성이라는 증거를 발견하지 못했다.

본 발명자들은 놀랍게도, 환경 친화적 비-페놀성 폴리옥시에틸렌 에테르 세제 예컨대 트리톤 X-100 환원형, 트리톤 N-101 환원형, 및 브리즈(Brij) C10은 S/D 처리에서 지질-외피보유 바이러스를 효율적으로 불활성화시킴을 발견하였다. 본 발명자들은 또한, S/D 및 단일-세제 처리에서 지질-외피보유 바이러스를 효율적으로 불활성화시키는 환경 친화적 비-페놀성 폴리옥시에틸렌 에테르 세제를 합성하였다. 따라서, 본 발명자들은, 본 발명의 지질-외피보유 바이러스를 불활성화시키는 방법에서 환경 친화적 비-페놀성 폴리옥시에틸렌 에테르 세제가 사용될 수 있음을 발견하였다.

따라서, 본 발명은, 하기 기재된 바람직한 실시양태를 제공함으로써 지질-외피보유 바이러스를 불활성화시키기 위한 개선된 수단 뿐만 아니라 환경 친화적 비-페놀성 폴리옥시에틸렌 에테르 세제를 제공한다:

1. 하기 화학식 (VIII)의 화합물:

여기서

R은 2 내지 12개의 탄소 원자의 선형 쇄 및 상기 선형 쇄 상의 치환기로서 1개 이상의 메틸 기를 갖는 탄화수소 기를 나타내고,

m은 1 내지 4의 정수를 나타내고,

A는 폴리옥시에틸렌 잔기를 나타냄.

2. 항목 1에 있어서, A가 4 내지 16개의 옥시에틸렌 단위, 바람직하게는 9 또는 10개의 옥시에틸렌 단위를 포함하는 폴리옥시에틸렌 잔기를 나타내는 것인 화합물.

3. 항목 1 또는 2에 있어서, m이 1인 화합물.

4. 항목 1 내지 3 중 어느 한 항목에 있어서, R이 2 내지 6개의 탄소 원자의 선형 쇄 및 상기 선형 쇄 상의 치환기로서 1개 이상의 메틸 기를 갖는 탄화수소 기를 나타내는 것인 화합물.

5. 항목 1 내지 4 중 어느 한 항목에 있어서, R이 2 내지 6개의 탄소 원자의 선형 쇄 및 상기 선형 쇄 상의 치환기로서 2 내지 4개의 메틸 기를 갖는 탄화수소 기를 나타내는 것인 화합물.

6. 항목 1 내지 5 중 어느 한 항목에 있어서, R이 4개의 탄소 원자의 선형 쇄 및 상기 선형 쇄 상의 치환기로서 4개의 메틸 기를 갖는 탄화수소 기를 나타내는 것인 화합물.

7. 항목 1 내지 6 중 어느 한 항목에 있어서, R이 2,4,4-트리메틸-펜트-2-일 기를 나타내는 것인 화합물.

8. 항목 1에 있어서, 화학식 (VIII)의 화합물이 하기 화합물인 화합물:

여기서 m 및 z는 하기 군으로부터 독립적으로 선택된 정수임:

m = 1 내지 4

z = 1 내지 5.

9. 항목 8에 있어서, m이 1인 화합물.

10. 항목 1에 있어서, 화학식 (VIII)의 화합물이 하기 화합물인 화합물:

여기서 n은 4 내지 16의 정수이고, 바람직하게는 여기서 n은 9 또는 10임.

11. 항목 1 내지 10 중 어느 한 항목에 있어서, 하기 구조 화학식을 갖는 29-[4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페닐]-3,6,9,12,15,18,21,24,27-노나옥사노나코산-1-올이 제외되는 것인 화합물:

12. 하기 단계를 포함하는, 지질 외피를 갖는 바이러스를 불활성화시키는 방법으로서:

a) 세제를 액체에 첨가하여 상기 세제와 상기 액체의 혼합물을 제조하는 단계; 및

b) 상기 혼합물을 인큐베이션하여 상기 바이러스를 불활성화시키는 단계;

여기서 상기 세제는 폴리옥시에틸렌 에테르이고, 여기서 상기 세제는 비-페놀성 세제인

방법.

13. 항목 12에 있어서, 상기 세제가 환경 친화적인 것인 방법.

14. 항목 12 또는 13에 있어서, 상기 세제가 비-이온성 세제인 방법.

15. 항목 12 내지 14 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 세제가 항목 1 내지 11 중 어느 한 항목의 화합물인 방법.

16. 항목 12 내지 14 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 세제가 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르인 방법.

17. 항목 16에 있어서, 상기 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르가 폴리옥시에틸렌 시클로알킬 에테르인 방법.

18. 항목 17에 있어서, 상기 폴리옥시에틸렌 시클로알킬 에테르의 시클로알킬 모이어티가 알킬-치환된 시클로알킬 모이어티인 방법.

19. 항목 18에 있어서, 상기 알킬-치환된 시클로알킬 모이어티가 분지형-알킬-치환된 시클로알킬 모이어티인 방법.

20. 항목 17 내지 19 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 폴리옥시에틸렌 시클로알킬 에테르가 폴리옥시에틸렌 시클로헥실 에테르인 방법.

21. 항목 17 내지 20 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 폴리옥시에틸렌 시클로알킬 에테르가 헤테로시클릭 폴리옥시에틸렌 시클로알킬 에테르가 아닌 것인 방법.

22. 항목 12 내지 14 및 16 내지 21 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 세제가 하기 화학식 (I)에 따른 구조를 갖는 것인 방법:

여기서 x, y 및 z는 하기 군으로부터 독립적으로 선택된 정수임:

x = 0 내지 5

y = 0 내지 5

z = 0 내지 20.

23. 항목 22에 있어서, 상기 세제가 하기 화학식 (II)에 따른 구조를 갖는 것인 방법:

24. 항목 23에 있어서, 상기 세제가 하기 화학식 (III)에 따른 구조를 갖는 것인 방법:

여기서 n은 4 내지 16의 정수임.

25. 항목 24에 있어서, n이 9 또는 10인 방법.

26. 항목 22에 있어서, 상기 세제가 하기 화학식 (IV)에 따른 구조를 갖는 것인 방법:

27. 항목 26에 있어서, 상기 세제가 하기 화학식 (V)에 따른 구조를 갖는 것인 방법:

여기서 n은 4 내지 16의 정수임.

28. 항목 27에 있어서, n이 9 또는 10인 방법.

29. 항목 12 내지 14 및 16 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 세제가 선형 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르인 방법.

30. 항목 29에 있어서, 상기 세제가 선형 폴리옥시에틸렌 헥사데실 에테르인 방법.

31. 항목 30에 있어서, 상기 세제가 하기 화학식 (VI)에 따른 구조를 갖는 것인 방법:

여기서 x는 15임.

32. 항목 31에 있어서, 상기 세제가 하기 화학식 (VII)에 따른 구조를 갖는 것인 방법:

여기서 x는 15이고, 여기서 n은 5 내지 15의 정수임.

33. 항목 32에 있어서, n이 10인 방법.

34. 항목 12 내지 33 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 세제가 상기 바이러스의 불활성화에 적합한 것인 방법.

35. 항목 12 내지 34 중 어느 한 항목에 있어서, 단계 a)에서, 어떠한 유기 용매도 상기 액체에 첨가하지 않는 것인 방법.

36. 항목 12 내지 34 중 어느 한 항목에 있어서, 단계 a)가 용매를 상기 액체에 첨가하는 것을 추가로 포함하고, 단계 a)에서, 상기 세제 및 상기 용매를 상기 액체에 첨가함으로써 상기 바이러스의 불활성화를 위한 용매/세제 혼합물을 제조하는 것인 방법.

37. 항목 36에 있어서, 상기 용매가 유기 용매인 방법.

38. 항목 36 또는 37에 있어서, 상기 용매가 트리-n-부틸 포스페이트인 방법.

39. 항목 12 내지 38 중 어느 한 항목에 있어서, 단계 a)에서, 상기 세제 이외의 어떠한 추가 세제도 첨가하지 않는 것인 방법.

40. 항목 12 내지 38 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 세제 이외의 어떠한 추가 세제도 첨가하지 않는 것인 방법.

41. 항목 12 내지 38 중 어느 한 항목에 있어서, 단계 a)가 추가 세제를 상기 액체에 첨가하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.

42. 항목 41에 있어서, 상기 추가 세제가 폴리소르베이트 80인 방법.

43. 항목 12 내지 42 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 액체가 생물학적 의약품을 포함하는 것인 방법.

44. 항목 12 내지 43 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 액체가 생물제약 약물을 포함하는 것인 방법.

45. 항목 44에 있어서, 상기 생물제약 약물이 바이러스성 백신이 아닌 것인 방법.

46. 항목 44 또는 45 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 생물제약 약물이 혈액 인자, 이뮤노글로불린 예컨대 모노클로날 항체, 대체 효소, 백신, 유전자 요법 벡터, 성장 인자 또는 성장 인자 수용체인 방법.

47. 항목 44 내지 46 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 생물제약 약물이 치료 단백질인 방법.

48. 항목 44 내지 47 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 생물제약 약물이 혈액 인자이며, 여기서 상기 혈액 인자는 인자 I (피브리노겐), 인자 II (프로트롬빈), 조직 인자, 인자 V, 인자 VII 또는 VIIa, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 XI, 인자 XII, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 (VWF), 프리칼리크레인, 고분자량 키니노겐 (HMWK), 피브로넥틴, 항트롬빈 III, 헤파린 보조인자 II, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 플라스미노겐, 알파 2-항플라스민, 조직 플라스미노겐 활성인자 (tPA), 우로키나제, 플라스미노겐 활성인자 억제제-1 (PAI1), 또는 플라스미노겐 활성인자 억제제-2 (PAI2)인 방법.

49. 항목 44 내지 48 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 생물제약 약물이 인자 VIII, 바람직하게는 재조합 인간 인자 VIII인 방법.

50. 항목 44 내지 47 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 생물제약 약물이 이뮤노글로불린이며, 여기서 상기 이뮤노글로불린은 인간 혈장 또는 모노클로날 항체로부터의 이뮤노글로불린인 방법.

51. 항목 12 내지 50 중 어느 한 항목에 있어서, 단계 a) 전에 또는 단계 a)와 단계 b) 사이에, 방법이 상기 액체 또는 혼합물을 심층 필터로 여과하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.

52. 항목 12 내지 51 중 어느 한 항목에 있어서, 단계 b)에서, 상기 혼합물을 적어도 1시간 동안 인큐베이션하는 것인 방법.

53. 항목 12 내지 52 중 어느 한 항목에 있어서, 단계 b)에서, 상기 혼합물을 0℃ 내지 10℃의 온도에서 인큐베이션하거나, 또는 상기 혼합물을 16℃ 내지 25℃의 온도에서 인큐베이션하는 것인 방법.

54. 항목 44 내지 53 중 어느 한 항목에 있어서, 단계 b) 후에, 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:

c) 상기 생물제약 약물을 정제하는 단계.

55. 항목 54에 있어서, 상기 정제가 상기 세제로부터 상기 생물제약 약물을 분리하는 것을 포함하는 것인 방법.

56. 항목 54 또는 55에 있어서, 상기 정제가 상기 추가 세제로부터 상기 생물제약 약물을 분리하는 것을 포함하는 것인 방법.

57. 항목 54 내지 56 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 생물제약 약물에 대한 상기 정제가 상기 생물제약 약물을 적어도 1종의 크로마토그래피 정제에 의해 정제하는 것을 포함하는 것인 방법.

58. 항목 54 내지 57 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 적어도 1종의 크로마토그래피 정제가 음이온 교환 크로마토그래피 및/또는 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 것인 방법.

59. 생물제약 약물을 제조하는 방법으로서, 항목 44 내지 58 중 어느 한 항목에 따른 방법을 포함하며, 여기서 상기 생물제약 약물은 상기 항목 44 내지 58 중 어느 한 항목에 정의된 바와 같은 것인 방법.

60. 항목 59에 있어서, 항목 44 내지 58 중 어느 한 항목의 방법 후에, 상기 생물제약 약물을 포함하는 제약 제형을 제조하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

61. 지질 외피를 갖는 바이러스의 불활성화를 위한 방법에서의 항목 12 내지 34 중 어느 한 항목에 정의된 바와 같은 세제의 용도.

62. 항목 61에 있어서, 상기 세제 이외의 어떠한 추가 세제도 사용되지 않는 것인 용도.

63. 항목 61 또는 62에 있어서, 어떠한 유기 용매도 사용되지 않는 것인 용도.

64. 항목 61에 있어서, 상기 바이러스의 상기 불활성화를 위한 상기 방법이 용매/세제 처리를 사용하는 방법이며, 상기 용매/세제 처리는 항목 12 내지 34 중 어느 한 항목에 정의된 바와 같은 상기 세제의 사용을 포함하는 것인 용도.

65. 항목 61 내지 64 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 바이러스 불활성화가 항목 44 내지 50 중 어느 한 항목에 정의된 바와 같은 생물제약 약물을 포함하는 액체 중의 바이러스의 불활성화인 방법.

66. 항목 12 내지 34 중 어느 한 항목에 정의된 바와 같은 세제를 포함하는 조성물.

67. 항목 12 내지 34 중 어느 한 항목에 정의된 바와 같은 세제.

68. 항목 66에 있어서, 항목 44 내지 50 중 어느 한 항목에 정의된 바와 같은 생물제약 약물을 추가로 포함하는 조성물.

69. 항목 66 또는 68에 있어서, 조성물이 어떠한 유기 용매도 포함하지 않는 것인 조성물.

70. 항목 66 또는 68에 있어서, 항목 37 또는 38에 정의된 바와 같은 유기 용매를 추가로 포함하는 조성물.

71. 항목 66 및 68 내지 70 중 어느 한 항목에 있어서, 조성물이 상기 세제 이외의 어떠한 추가 세제도 포함하지 않는 것인 조성물.

72. 항목 66 및 68 내지 70 중 어느 한 항목에 있어서, 항목 41 또는 42에 정의된 바와 같은 추가 세제를 추가로 포함하는 조성물.

73. 항목 67의 세제 또는 이전 항목들 중 어느 한 항목의 조성물을 포함하고, 항목 57 또는 58에 정의된 바와 같은 크로마토그래피 정제를 위한 크로마토그래피 수지를 추가로 포함하는, 바이러스 불활성화를 위한 키트.

74. 항목 73에 있어서, 심층 필터를 추가로 포함하는 키트.

75. 하기 화학식 (VIII)의 화합물을 합성하는 방법으로서,

여기서

m은 1 내지 4의 정수를 나타내고,

A는 폴리옥시에틸렌 잔기를 나타냄,

여기서 방법은 하기 단계를 포함하는 것인 방법:

A) 하기 화학식 (IX) (여기서 R은 상기 정의된 바와 같음)의 페놀을 하기 화학식 (X) (여기서 R 및 m은 상기 정의된 바와 같음)의 알콜로 전환시키는 단계; 및

(B) 화학식 (X)의 알콜을 상기 정의된 바와 같은 화학식 (VIII)의 폴리옥시에틸렌 에테르로 전환시키는 단계.

76. 하기 화학식 (VIII)의 화합물을 합성하는 방법으로서,

여기서

m은 1 내지 4의 정수를 나타내고,

A는 폴리옥시에틸렌 잔기를 나타냄,

여기서 방법은 하기 단계를 포함하는 것인 방법:

(1) 톨루엔을 반응시켜 하기 화학식 (XI) (여기서 R은 상기 정의된 바와 같음)의 치환된 톨루엔을 수득하는 단계;

(2) 화학식 (XI)의 치환된 톨루엔을 하기 화학식 (XII) (여기서 R 및 m은 상기 정의된 바와 같고, X는 히드록실 기, 브로민 원자, 아이오딘 원자 및 염소 원자를 포함하는 군으로부터 선택됨)의 화합물로 전환시키는 단계; 및

(3) 화학식 (XII)의 화합물을 상기 정의된 바와 같은 화학식 (VIII)의 폴리옥시에틸렌 에테르로 전환시키는 단계.

77. 하기 화학식 (VIIIa)의 화합물을 합성하는 방법으로서,

여기서

A는 폴리옥시에틸렌 잔기를 나타냄,

여기서 방법은 하기 단계를 포함하는 것인 방법:

(I) 벤질 알콜을 하기 화학식 (XIII) (여기서 R은 상기 정의된 바와 같음)의 화합물로 전환시키는 단계; 및

(II) 화학식 (XIII)의 화합물을 상기 정의된 바와 같은 화학식 (VIIIa)의 폴리옥시에틸렌 에테르로 전환시키는 단계.

78. 항목 75 내지 77 중 어느 한 항목에 있어서, A가 4 내지 16개의 옥시에틸렌 단위를 포함하는 폴리옥시에틸렌 잔기를 나타내는 것인 방법.

79. 항목 78에 있어서, A가 8 내지 10개의 옥시에틸렌 단위를 포함하는 폴리옥시에틸렌 잔기를 나타내는 것인 방법.

80. 항목 78에 있어서, A가 9 또는 10개의 옥시에틸렌 단위를 포함하는 폴리옥시에틸렌 잔기를 나타내는 것인 방법.

81. 항목 75, 76 및 78 내지 80 중 어느 한 항목에 있어서, m이 1인 방법.

82. 항목 75 내지 81 중 어느 한 항목에 있어서, R이 2 내지 6개의 탄소 원자의 선형 쇄 및 상기 선형 쇄 상의 치환기로서 1개 이상의 메틸 기를 갖는 탄화수소 기를 나타내는 것인 방법.

83. 항목 75 내지 82 중 어느 한 항목에 있어서, R이 2 내지 6개의 탄소 원자의 선형 쇄 및 상기 선형 쇄 상의 치환기로서 2 내지 4개의 메틸 기를 갖는 탄화수소 기를 나타내는 것인 방법.

84. 항목 75 내지 83 중 어느 한 항목에 있어서, R이 4개의 탄소 원자의 선형 쇄 및 상기 선형 쇄 상의 치환기로서 4개의 메틸 기를 갖는 탄화수소 기를 나타내는 것인 방법.

85. 항목 75 내지 84 중 어느 한 항목에 있어서, R이 2,4,4-트리메틸-펜트-2-일 기를 나타내는 것인 방법.

86. 항목 75 내지 77 중 어느 한 항목에 있어서, 화학식 (VIII)의 화합물이 하기 화합물인 방법:

m = 1 내지 4

z = 1 내지 5.

87. 항목 86에 있어서, m이 1인 방법.

88. 항목 75 내지 77 중 어느 한 항목에 있어서, 화학식 (VIII)의 화합물이 하기 화합물인 방법:

89. 항목 76 및 78 내지 88 중 어느 한 항목에 있어서, 단계 (2)에서의 전환이 AIBN (아조비스(이소부티로니트릴)을 라디칼 개시제로서 사용하는 라디칼 반응인 방법.

90. 항목 76 및 78 내지 89 중 어느 한 항목에 있어서, X가 브로민 원자인 방법.

91. 항목 76 및 78 내지 90 중 어느 한 항목에 있어서, 단계 (2)에서의 전환이 N-브로모숙신이미드 (NBS)를 시약으로서 사용하는 것인 방법.

92. 항목 76 및 78 내지 91 중 어느 한 항목에 있어서, 단계 (3)에서의 전환이 TBME (메틸-tert-부틸에테르)를 용매로서 사용하는 것인 방법.

93. 항목 76 및 78 내지 92 중 어느 한 항목에 있어서, 단계 (3)에서의 전환이 적어도 2시간 동안, 바람직하게는 주위 온도에서 실시되는 것인 방법.

94. 항목 76 및 78 내지 93 중 어느 한 항목에 있어서, 단계 (3)에서의 전환이 5시간 이하 동안, 바람직하게는 주위 온도에서 실시되는 것인 방법.

95. 항목 76 및 78 내지 94 중 어느 한 항목에 있어서, 단계 (3)에서의 전환이 3시간 동안, 바람직하게는 주위 온도에서 실시되는 것인 방법.

96. 항목 75 내지 95 중 어느 한 항목에 있어서, 방법이 적어도 100 g, 적어도 1 kg, 적어도 10 kg, 적어도 100 kg 또는 적어도 1000 kg의 상기 화학식 (VIII)의 화합물을 산출하는 규모로 수행되는 것인 방법.

도 1: 17℃ ± 1℃에서 IVIG-함유 액체에 대한 S/D 처리 시 저 농도의 트리톤 X-100 환원형 또는 트리톤 N-101 환원형의 바이러스 불활성화 효율. 3-성분 혼합물을 사용하여 최종 농도 0.04% - 0.06%의 트리톤 X-100 환원형 또는 트리톤 N-101 환원형, 0.01% - 0.02%의 폴리소르베이트 80, 0.01% - 0.02%의 TnBP를 얻었다 (동일한 농도의 트리톤 X-100과의 병렬 비교). 시간 경과에 따른 바이러스 불활성화는 HIV를 사용한 2회의 실행 (각각 A 및 B)에 대한 바이러스 감소 인자 (RF)로 나타낸다. 트리톤 X-100 환원형 ("TX-100 red.") 또는 트리톤 N-101 환원형 ("TN-101 red.")을 사용한 S/D 처리의 바이러스 불활성화를 트리톤 X-100 ("TX-100")을 사용한 S/D 처리의 바이러스 불활성화와 비교하였다.
도 2: 17℃ ± 1℃에서 IVIG-함유 액체에 대한 S/D 처리 시 저 농도의 트리톤 X-100 환원형 또는 트리톤 N-101 환원형의 바이러스 불활성화 효율. 3-성분 혼합물을 사용하여 최종 농도 0.04% - 0.06%의 트리톤 X-100 환원형 또는 트리톤 N-101 환원형, 0.01% - 0.02%의 폴리소르베이트 80, 0.01% - 0.02%의 TnBP를 얻었다 (동일한 농도의 트리톤 X-100과의 병렬 비교). 시간 경과에 따른 바이러스 불활성화를 PRV를 사용한 2회의 실행 (각각 A 및 B)에 대한 바이러스 감소 인자 (RF)로 나타낸다. 트리톤 X-100 환원형 ("TX-100 red.") 또는 트리톤 N-101 환원형 ("TN-101 red.")을 사용한 S/D 처리의 바이러스 불활성화를 트리톤 X-100 ("TX-100")을 사용한 S/D 처리의 바이러스 불활성화와 비교하였다.
도 3: 17℃ ± 1℃에서 IVIG-함유 액체에 대한 S/D 처리 시 저 농도의 브리즈 C10의 바이러스 불활성화 효율. 3-성분 혼합물을 사용하여 최종 농도 0.04% - 0.06%의 브리즈 C10, 0.01% - 0.02%의 폴리소르베이트 80, 0.01% - 0.02%의 TnBP를 얻었다 (동일한 농도의 트리톤 X-100과의 병렬 비교). 시간 경과에 따른 바이러스 불활성화를 HIV를 사용한 2회의 실행 (각각 A 및 B)에 대한 바이러스 감소 인자 (RF)로 나타낸다. 브리즈 C10을 사용한 S/D 처리의 바이러스 불활성화를 트리톤 X-100 ("TX-100")을 사용한 S/D 처리의 바이러스 불활성화와 비교하였다.
도 4: 17℃ ± 1℃에서 IVIG-함유 액체에 대한 S/D 처리 시 저 농도의 브리즈 C10의 바이러스 불활성화 효율. 3-성분 혼합물을 사용하여 최종 농도 0.04% - 0.06%의 브리즈 C10, 0.01% - 0.02%의 폴리소르베이트 80, 0.01% - 0.02%의 TnBP를 얻었다 (동일한 농도의 트리톤 X-100과의 병렬 비교). 시간 경과에 따른 바이러스 불활성화를 PRV를 사용한 2회의 실행 (각각 A 및 B)에 대한 바이러스 감소 인자 (RF)로 나타낸다. 브리즈 C10을 사용한 S/D 처리의 바이러스 불활성화를 트리톤 X-100 ("TX-100")을 사용한 S/D 처리의 바이러스 불활성화와 비교하였다.
도 5: 17℃ ± 1℃에서 IVIG-함유 액체에 대한 S/D 처리 시 저 농도의 브리즈 C10의 바이러스 불활성화 효율. 3-성분 혼합물을 사용하여 최종 농도 0.04% - 0.06%의 브리즈 C10, 0.01% - 0.02%의 폴리소르베이트 80, 0.01% - 0.02%의 TnBP를 얻었다 (동일한 농도의 트리톤 X-100과의 병렬 비교). 시간 경과에 따른 바이러스 불활성화를 BVDV를 사용한 2회의 실행 (각각 A 및 B)에 대한 바이러스 감소 인자 (RF)로 나타낸다. 브리즈 C10을 사용한 S/D 처리의 바이러스 불활성화를 트리톤 X-100 ("TX-100")을 사용한 S/D 처리의 바이러스 불활성화와 비교하였다.
도 6: 1℃ ± 1℃에서 인간 혈청 알부민 (HSA)-함유 액체에 대한 S/D 처리 시 저 농도의 브리즈 C10의 바이러스 불활성화 효율. 3-성분 혼합물을 사용하여 최종 농도 0.08% - 0.1%의 브리즈 C10, 0.02% - 0.03%의 폴리소르베이트 80, 0.02% - 0.03%의 TnBP를 얻었다 (동일한 농도의 트리톤 X-100과의 병렬 비교). 시간 경과에 따른 바이러스 불활성화를 X-MuLV를 사용한 2회의 실행 (각각 A 및 B)에 대한 바이러스 감소 인자 (RF)로 나타낸다. 브리즈 C10을 사용한 S/D 처리의 바이러스 불활성화를 트리톤 X-100 ("TX-100")을 사용한 S/D 처리의 바이러스 불활성화와 비교하였다.
도 7: 1℃ ± 1℃에서 HSA-함유 액체에 대한 S/D 처리 시 저 농도의 브리즈 C10의 바이러스 불활성화 효율. 3-성분 혼합물을 사용하여 최종 농도 0.08% - 0.1%의 브리즈 C10, 0.02% - 0.03%의 폴리소르베이트 80, 0.02% - 0.03%의 TnBP를 얻었다 (트리톤 X-100에 대한 기존 데이타와 비교). 시간 경과에 따른 바이러스 불활성화를 BVDV를 사용한 2회의 실행 (각각 A 및 B)에 대한 바이러스 감소 인자 (RF)로 나타낸다. 브리즈 C10을 사용한 S/D 처리의 바이러스 불활성화를 트리톤 X-100 ("TX-100")을 사용한 S/D 처리의 바이러스 불활성화와 비교하였다.
도 8: 19℃ ± 1℃에서 HSA-함유 액체에 대한 S/D 처리 시 저 농도의 브리즈 C10의 바이러스 불활성화 효율. 3-성분 혼합물을 사용하여 최종 농도 0.08% - 0.1%의 브리즈 C10, 0.02% - 0.03%의 폴리소르베이트 80, 0.02% - 0.03%의 TnBP를 얻었다 (동일한 농도의 트리톤 X-100과의 병렬 비교). 시간 경과에 따른 바이러스 불활성화를 X-MuLV를 사용한 2회의 실행 (각각 A 및 B)에 대한 바이러스 감소 인자 (RF)로 나타낸다. 브리즈 C10을 사용한 S/D 처리의 바이러스 불활성화를 트리톤 X-100 ("TX-100")을 사용한 S/D 처리의 바이러스 불활성화와 비교하였다.
도 9: 17℃ ± 1℃에서 IVIG-함유 액체에 대한 S/D 처리 시 저 농도의 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트의 바이러스 불활성화 효율. 3-성분 혼합물을 사용하여 최종 농도 0.04% - 0.06%의 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트, 0.01% - 0.02%의 폴리소르베이트 80, 0.01% - 0.02%의 TnBP를 얻었다 (동일한 농도의 트리톤 X-100과의 병렬 비교). 시간 경과에 따른 바이러스 불활성화를 PRV를 사용한 2회의 실행 (각각 A 및 B)에 대한 바이러스 감소 인자 (RF)로 나타낸다. 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트를 사용한 S/D 처리의 바이러스 불활성화를 트리톤 X-100 ("TX-100")을 사용한 S/D 처리의 바이러스 불활성화와 비교하였다. (A)에서, 양쪽 세제는 동일한 불활성화 속도를 보임을 참고하기 바란다. 채워진 부호는 잔류 감염성을 갖는 값들을 나타내고, 채워지지 않은 부호는 검출 한계 미만의 감소 인자를 나타낸다.
도 10: 1℃ ± 1℃에서 인간 혈청 알부민 (HSA)-함유 액체에 대한 S/D 처리 시 저 농도의 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트의 바이러스 불활성화 효율. 3-성분 혼합물을 사용하여 최종 농도 0.08% - 0.1%의 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트, 0.02% - 0.03%의 폴리소르베이트 80, 0.02% - 0.03%의 TnBP를 얻었다 (동일한 농도의 트리톤 X-100과의 병렬 비교). 시간 경과에 따른 바이러스 불활성화를 X-MuLV를 사용한 2회의 실행 (각각 A 및 B)에 대한 바이러스 감소 인자 (RF)로 나타낸다. 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트를 사용한 S/D 처리의 바이러스 불활성화를 트리톤 X-100 ("TX-100")을 사용한 S/D 처리의 바이러스 불활성화와 비교하였다. 채워진 부호는 잔류 감염성을 갖는 값들을 나타내고, 채워지지 않은 부호는 검출 한계 미만의 감소 인자를 나타낸다.
도 11: 19℃ ± 1℃에서 HSA-함유 액체에 대한 S/D 처리 시 저 농도의 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트의 바이러스 불활성화 효율. 3-성분 혼합물을 사용하여 최종 농도 0.08% - 0.1%의 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트, 0.02% - 0.03%의 폴리소르베이트 80, 0.02% - 0.03%의 TnBP를 얻었다 (동일한 농도의 트리톤 X-100과의 병렬 비교). 시간 경과에 따른 바이러스 불활성화를 X-MuLV를 사용한 2회의 실행 (각각 A 및 B)에 대한 바이러스 감소 인자 (RF)로 나타낸다. 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트를 사용한 S/D 처리의 바이러스 불활성화를 트리톤 X-100 ("TX-100")을 사용한 S/D 처리의 바이러스 불활성화와 비교하였다. 채워진 부호는 잔류 감염성을 갖는 값들을 나타내고, 채워지지 않은 부호는 검출 한계 미만의 감소 인자를 나타낸다.
도 12: (A) 14℃ ± 1℃에서 HSA-함유 버퍼에 대한 세제 처리 시 저 농도의 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트 또는 트리톤 X-100 환원형 또는 브리즈 C10의 바이러스 불활성화 효율. 단일-세제 처리를 사용하여 최종 농도 0.09% - 0.11%의 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트 또는 트리톤 X-100 환원형 또는 브리즈 C10을 얻었다 (동일한 농도의 트리톤 X-100과의 병렬 비교). 시간 경과에 따른 바이러스 불활성화를 BVDV를 사용한 2회의 실행에 대한 평균 바이러스 감소 인자 (RF)로 나타낸다. 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트 또는 트리톤 X-100 환원형 ("TX-100 red.") 또는 브리즈 C10을 사용한 단일-세제 처리의 바이러스 불활성화를 트리톤 X-100 ("TX-100")을 사용한 단일-세제 처리의 바이러스 불활성화와 비교하였다. 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트 및 트리톤 X-100 환원형은 트리톤 X-100과 동일한 불활성화 속도를 보임을 참고하기 바란다. 채워진 부호는 잔류 감염성을 갖는 값들을 나타내고, 채워지지 않은 부호는 검출 한계 미만의 감소 인자를 나타낸다. (B) 14℃ ± 1℃에서 HSA-함유 버퍼에 대한 세제 처리 시 저 농도의 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트 또는 트리톤 X-100 환원형의 바이러스 불활성화 효율. 단일-세제 처리를 사용하여 최종 농도 0.02% - 0.04%의 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트 또는 트리톤 X-100 환원형을 얻었다 (동일한 농도의 트리톤 X-100과의 병렬 비교). 시간 경과에 따른 바이러스 불활성화를 BVDV를 사용한 2회의 실행에 대한 평균 바이러스 감소 인자 (RF)로 나타낸다. 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트 또는 트리톤 X-100 환원형 ("TX-100 red.")을 사용한 단일-세제 처리의 바이러스 불활성화를 트리톤 X-100 ("TX-100")을 사용한 단일-세제 처리의 바이러스 불활성화와 비교하였다. 채워진 부호는 잔류 감염성을 갖는 값들을 나타내고, 채워지지 않은 부호는 검출 한계 미만의 감소 인자를 나타낸다.
도 13: (A) 17℃ ± 1℃에서 IVIG-함유 액체에 대한 세제 처리 시 저 농도의 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트 또는 트리톤 X-100 환원형의 바이러스 불활성화 효율. 단일-세제 처리를 사용하여 최종 농도 0.09% - 0.11%의 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트 또는 트리톤 X-100 환원형을 얻었다 (동일한 농도의 트리톤 X-100과의 병렬 비교). 시간 경과에 따른 바이러스 불활성화를 BVDV를 사용한 2회의 실행에 대한 평균 바이러스 감소 인자 (RF)로 나타낸다. 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트 또는 트리톤 X-100 환원형 ("TX-100 red.")을 사용한 단일-세제 처리의 바이러스 불활성화를 트리톤 X-100 ("TX-100")을 사용한 단일-세제 처리의 바이러스 불활성화와 비교하였다. 채워진 부호는 잔류 감염성을 갖는 값들을 나타내고, 채워지지 않은 부호는 검출 한계 미만의 감소 인자를 나타낸다. (B) 17℃ ± 1℃에서 IVIG-함유 액체에 대한 세제 처리 시 저 농도의 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트 또는 트리톤 X-100 환원형의 바이러스 불활성화 효율. 단일-세제 처리를 사용하여 최종 농도 0.02% - 0.04%의 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트 또는 트리톤 X-100 환원형을 얻었다 (동일한 농도의 트리톤 X-100과의 병렬 비교). 시간 경과에 따른 바이러스 불활성화를 BVDV를 사용한 2회의 실행에 대한 평균 바이러스 감소 인자 (RF)로 나타낸다. 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트 또는 트리톤 X-100 환원형 ("TX-100 red.")을 사용한 단일-세제 처리의 바이러스 불활성화를 트리톤 X-100 ("TX-100")을 사용한 단일-세제 처리의 바이러스 불활성화와 비교하였다. 채워진 부호는 잔류 감염성을 갖는 값들을 나타내고, 채워지지 않은 부호는 검출 한계 미만의 감소 인자를 나타낸다.
도 14: 23℃ ± 1℃에서 인자 VIII-함유 액체에 대한 세제 처리 시 저 농도의 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트 또는 트리톤 X-100 환원형의 바이러스 불활성화 효율. 단일-세제 처리를 사용하여 최종 농도 0.09% - 0.11%의 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트 또는 트리톤 X-100 환원형을 얻었다 (동일한 농도의 트리톤 X-100과의 병렬 비교). 시간 경과에 따른 바이러스 불활성화를 BVDV를 사용한 2회의 실행에 대한 평균 바이러스 감소 인자 (RF)로 나타낸다. 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트 또는 트리톤 X-100 환원형 ("TX-100 red.")을 사용한 단일-세제 처리의 바이러스 불활성화를 트리톤 X-100 ("TX-100")을 사용한 단일-세제 처리의 바이러스 불활성화와 비교하였다. 채워진 부호는 잔류 감염성을 갖는 값들을 나타내고, 채워지지 않은 부호는 검출 한계 미만의 감소 인자를 나타낸다.

하기에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명에서 사용된 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 그의 보편적 의미에 따라 이해될 수 있다.

본원에 인용된 모든 공보물, 특허 및 특허출원은 모든 목적 상 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

정의

용어 "지질 외피를 갖는 바이러스", "지질-외피보유 바이러스" 및 "외피보유 바이러스"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 의미를 갖는다. 예를 들어, 지질-외피보유 바이러스는 헤르페스비리다에(Herpesviridae) 예컨대 가성광견병 바이러스 (PRV), 단순 포진 바이러스, 바리셀라-조스테르 바이러스, 시토메갈로바이러스 또는 엡스타인-바르 바이러스; 헤파드나비리다에(Hepadnaviridae) 예컨대 B형 간염 바이러스; 토가비리다에(Togaviridae) 예컨대 신드비스 바이러스, 루벨라 바이러스 또는 알파바이러스; 아레나비리다에(Arenaviridae) 예컨대 림프구 맥락수막염 바이러스; 플라비비리다에(Flaviviridae) 예컨대 웨스트나일(West Nile) 바이러스, 소 바이러스성 설사 바이러스 (BVDV), 뎅기 바이러스, C형 간염 바이러스 또는 황열병 바이러스; 오르토믹소비리다에(Orthomyxoviridae) 예컨대 인플루엔자 바이러스 A, 인플루엔자 바이러스 B, 인플루엔자 바이러스 C, 이사바이러스 또는 토고토바이러스; 파라믹소비리다에(Paramyxoviridae) 예컨대 센다이 바이러스, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 우역 바이러스 또는 개 디스템퍼 바이러스; 분야비리다에(Bunyaviridae) 예컨대 캘리포니아 뇌염 바이러스 또는 한타바이러스; 랍도비리다에(Rhabdoviridae) 예컨대 수포성 구내염 바이러스 또는 광견병 바이러스; 필로비리다에(Filoviridae) 예컨대 에볼라 바이러스 또는 마르부르그 바이러스; 코로나비리다에(Coronaviridae) 예컨대 코로나 바이러스 또는 심각한 급성 호흡기 증후군 (SARS) 코로나바이러스; 보르나비리다에(Bornaviridae) 예컨대 보르나 질환 바이러스; 또는 아르테리비리다에(Arteriviridae) 예컨대 아르테리바이러스 또는 말 동맥염 바이러스; 레트로비리다에(Retroviridae) 예컨대 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 인간 T-림프친화 바이러스 1 (HTLV-1) 또는 친이종 뮤린 백혈병 바이러스 (X-MuLV); 폭스비리다에(Poxviridae) 예컨대 백시니아 바이러스 또는 오르토폭스바이러스 바리올래 (바이올라바이러스)일 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "지질 외피를 갖는 바이러스를 불활성화시키는"이란, 지질-외피보유 바이러스의 세포 감염 능력을 방해하는 것을 지칭한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 지질-외피보유 바이러스의 세포 감염 능력 (즉, 지질-외피보유 바이러스의 감염성)은 전형적으로 액체 중의 감염성 바이러스 입자의 수를 결정함으로써 평가된다. 따라서, 본원에서 사용되는 용어 "지질 외피를 갖는 바이러스를 불활성화시키는" 또는 "지질-외피보유 바이러스를 불활성화시키는"이란, 용액 중의 감염성 바이러스 입자의 수를 감소시키는 것을 지칭한다.

본원에서 용어 "Log10 감소 값" 또는 "LRV"는 용어 "바이러스 감소 인자", "감소 인자", "RF" 또는 "R"과 상호교환가능하게 사용된다. 한 실시양태에서, "Log10 감소 값" 또는 "LRV"는 액체 중의 감염성 바이러스 입자의 감소에 대한 척도로서 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "Log10 감소 값" 또는 "LRV"는 바이러스 불활성화 전의 감염성 바이러스 입자 대 바이러스 불활성화 후의 감염성 바이러스 입자의 비의 로그 (밑수 10)로서 정의된다. LRV 값은 소정 유형의 바이러스에 대해 특이적이다. 0 초과의 임의의 Log10 감소 값 (LRV)이 생물제약 생산 방법 및 공정과 같은 방법 및 공정의 안전성을 개선하는데 유익함은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백하다. 본 발명에 따른 방법에 의해 달성되는 Log10 감소 값 (LRV)은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이 결정된다. 예를 들어, LRV는 액체에 대해 본 발명에 따른 바이러스 불활성화를 위한 방법을 수행한 전후에 액체 중의 감염성 바이러스 입자의 수를 결정함으로써 결정될 수 있다.

통상의 기술자라면 액체 중의 감염성 바이러스 입자를 측정하기 위한 수많은 방법을 알고 있을 것이다. 예를 들어, 그리고 제한 없이, 액체 중의 감염성 바이러스 입자 농도는 바람직하게는 플라크 검정 또는 TCID₅₀ 검정에 의해, 보다 바람직하게는 TCID₅₀ 검정에 의해 측정될 수 있다. 본원에서 사용되는 "TCID₅₀ 검정"이란 조직 배양 감염 용량 검정을 지칭한다. TCID₅₀ 검정은 종점 희석 시험이며, 여기서 TCID₅₀ 값은 접종된 세포 배양물의 50%에서 세포 사멸 또는 병리학적 변화를 유도하는데 필요한 바이러스 농도를 나타낸다.

본원에서 사용되는 용어 "계면활성제"란, 2종의 액체 간의 또는 액체와 고체 간의 표면 장력을 낮추는 화합물을 지칭한다. 계면활성제는 세제, 습윤제, 유화제, 발포제 및 분산제로서 작용할 수 있다.

본 발명과 관련하여, 제1- 및 제2-언급 용매, 세제 및/또는 액체와 관련하여 "에 첨가하는", "에 첨가한다" 또는 "에 첨가된"과 같은 용어는 제1-언급 용매, 세제 및/또는 액체를 제2-언급 용매, 세제 및/또는 액체에 첨가하는 경우를 포괄한다. 그러나, 이들 용어는 또한, 제2-언급 용매, 세제 및/또는 액체를 제1-언급 용매, 세제 및/또는 액체에 첨가하는 경우를 포괄하도록 의도된다. 따라서, "에 첨가하는", "에 첨가한다" 또는 "에 첨가된"과 같은 용어는, 제1-언급 용매, 세제 및/또는 액체를 제2-언급 용매, 세제 및/또는 액체에 첨가하는지의 여부 또는 그 반대의 경우를 명시하도록 의도되지 않는다.

관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있는 바와 같이, 용어 "세제"는 관련 기술분야에 공지된 그의 일반적 의미에 따라 사용되며, 특히 지질 막을 투과화시킬 수 있는 계면활성제를 포함한다. 예를 들어, 세제 트리톤 X-100 및 데옥시콜레이트는 단백질의 소수성 세그먼트에 결합함으로써 양친매성 막 단백질을 가용화시키는 것으로 제시된 바 있다 (문헌 [Simons et al., 1973] 참조). 세제는 그의 전하에 따라 3개의 폭넓은 군으로 분류된다. 음이온성 세제는 음이온성 (즉, 음으로 하전된) 친수성 기를 포함한다. 예시적 음이온성 세제는 테트라데실트리메틸암모늄 브로마이드, 도데실트리메틸암모늄 브로마이드, 나트륨 라우레트 술페이트, 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 세트리미드 및 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드이다. 양이온성 세제는 양이온성 (즉, 양으로 하전된) 친수성 기를 포함한다. 예시적 양이온성 세제는 벤즈알코늄 클로라이드, 세틸 트리메틸암모늄 브로마이드 (CTAB), 세틸피리디늄 클로라이드 (CPC) 및 벤제토늄 클로라이드 (BZT)이다. 본원에서 사용되는 용어 "비-이온성 세제"란, 양전하 또는 음전하를 갖지 않는 세제를 지칭한다. 예시적 비-이온성 세제는 소르비탄 에스테르 (소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노팔미테이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 소르비탄 트리스테아레이트, 소르비탄 모노올레에이트, 소르비탄 트리올레에이트), 폴리소르베이트 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트 (폴리소르베이트 20), 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노팔미테이트, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 트리스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 트리올레에이트, 폴리옥시에틸렌(20)-소르비탄-모노올레에이트 (트윈(Tween) 80/폴리소르베이트 80)), 폴록사머 (폴록사머 407, 폴록사머 188) 및 크레모포르이다. 본 발명에 따른 세제는 바람직한 실시양태에 명시된 바와 같으며, 트리톤 N-101 환원형, 트리톤 X-100 환원형 및 브리즈 C10을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "비-페놀성"은 용어 "페놀-무함유"와 상호교환가능하게 사용된다. 본 발명에서 사용된 바와 같은 비-페놀성 세제란, 어떠한 페놀 관능기도 함유하지 않는 세제를 지칭한다. 용어 "방향족"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 의미를 갖는다. 본 발명에서 사용된 바와 같은 방향족이 아닌 세제란, 어떠한 방향족 고리도 함유하지 않는 세제를 지칭한다.

본원에서 사용되는 용어 "환경 친화적"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 의미를 갖는다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 세제와 관련하여, 용어 "환경 친화적"이란, 세제가 내분비 교란물질로서 거동하지 않음을 가리킨다. 내분비 교란물질은, 내분비계의 기능(들)을 변경시키고 결과적으로 무손상 유기체 또는 그의 자손, 또는 (하위)집단에서 건강상 불리한 영향을 야기하는 외인성 물질이다. 통상의 기술자라면 내분비 교란물질을 확인하기 위한 다양한 방법을 알고 있을 것이다. 내분비 교란물질 및 그의 평가에 대한 추가 정보는, 예를 들어, 모든 목적 상 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 ["ECHA Support document for identification of 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenol, ethoxylated as substances of very high concern because, due to their degradation to a substance of very high concern (4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenol) with endocrine disrupting properties, they cause probable serious effects to the environment which give rise to an equivalent level of concern to those of CMRs and PBTs/vPvBs", adopted on 12 December 2012]; 또는 모든 목적 상 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [brochure "Global Assessment of the Sate-of-the-Science of Endocrine Disruptors" (WHO/PCS/EDC/02.2), published by the International Programme on Chemical Safety of the World Health Organisation]에서 찾아볼 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "용매"는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 의미를 갖는다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 유기 용매가 본 발명의 방법에서 사용된다. 특히 유용한 유기 용매는, 지질-외피보유 바이러스의 지단백질 외피와 세제 간의 접촉을 촉진하는 환경을 생성한다. 이와 같이 바람직하게는, 그러한 접촉을 촉진하는 유기 용매 예컨대 제한 없이 에테르, 알콜, 알킬포스페이트 예컨대 디알킬포스페이트 또는 트리알킬포스페이트, 또는 이들의 임의의 조합이 본 발명의 방법에서 사용된다.

본원에 개시된 방법에서 유용한 에테르 용매는 화학식 R1-O-R2 (여기서, R1 및 R2는 독립적으로, 산소 또는 황 원자를 함유할 수 있는 C1-C18 알킬 또는 C1-C18 알케닐, 바람직하게는 C1-C18 알킬 또는 C1-C18 알케닐임)를 갖는 것들을 포함한다. 에테르의 비제한적 예는 디메틸 에테르, 디에틸 에테르, 에틸 프로필 에테르, 메틸-부틸 에테르, 메틸 이소프로필 에테르 및 메틸 이소부틸 에테르를 포함한다. 본원에 개시된 방법에서 유용한 알콜 용매는, C1-C8 알킬 기 또는 C1-C8 알케닐 기를 갖는 것들을 포함한다. 알콜의 비제한적 예는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, 이소부탄올, n-펜탄올 및 이소펜탄올을 포함한다. 본원에 개시된 방법에서 유용한 알킬포스페이트 용매는, 산소 또는 황 원자를 함유할 수 있는 C1-C18 알킬 기 또는 C1-C18 알케닐 기를 갖는 것들을 포함한다. 알킬포스페이트의 비제한적 예는 디알킬포스페이트 예컨대 디-(n-부틸)포스페이트, 디-(t-부틸)포스페이트, 디-(n-헥실)포스페이트, 디-(2-에틸헥실)포스페이트, 디-(n-데실)포스페이트, 또는 에틸 디-(n-부틸) 포스페이트; 및 트리알킬포스페이트 예컨대 트리-(n-부틸)포스페이트, 트리-(t-부틸)포스페이트, 트리-(n-헥실)포스페이트, 트리-(2-에틸헥실)포스페이트, 또는 트리-(n-데실)포스페이트를 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "생물학적 의약품"은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 그의 활성 물질이 생물학적 물질 (예를 들어, 포유동물 세포 또는 미생물에 의해 생성된 생물학적 물질)인 제품을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 본 발명의 방법에서 사용된 생물학적 의약품은 최종 제조품으로 제한되지는 않으나, 바람직하게는 또한 제조 공정의 임의의 단계의 중간 제품을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "생물제약 약물"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 의미를 갖는다. 생물제약 약물은, 인간 혈장으로부터 수득된 생물제약 약물과 같은 다른 공급원으로부터의 생물제약 약물 및 재조합 생물제약 약물 둘 다를 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "심층 필터"는 관련 기술분야에 공지된 의미를 갖는다. 특히, 이러한 필터 (예를 들어, 구배-밀도 심층 필터)는 필터 재료의 심부 내에서 여과를 달성한다. 보편적 등급의 이러한 필터는, 유동 채널들의 복잡한 구불구불한 미로를 형성하도록 결합된 (또는 달리 고정된) 섬유들의 랜덤 매트릭스를 포함하는 것들이다. 이들 필터에서의 입자 분리는 일반적으로, 섬유 매트릭스에의 흡착 또는 그에 의한 포획으로부터 초래된다. 세포 배양 브로스 및 기타 공급원료의 바이오프로세싱을 위한 가장 흔하게 사용되는 심층 필터 매체는 셀룰로스 섬유, 필터 보조제 예컨대 DE, 및 양으로 하전된 수지 결합제이다. 심층 필터 매체는, 절대 필터와 달리, 다공성 매체 전반에 걸쳐 입자를 보유하여, 기공 크기보다 더 큰 입자 및 더 작은 입자 둘 다의 체류를 허용한다. 입자 체류는 소수성, 이온성 및 기타 상호작용을 통한 흡착 및 크기 배제 둘 다를 포함하는 것으로 생각된다.

본원에서 사용되는 용어 "생물제약 약물을 정제하는"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 의미를 가지며, 본 발명의 혼합물에 포함될 수 있는 기타 물질로부터 생물제약 약물을 분리하는 것을 지칭한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 용어 "생물제약 약물을 정제하는"이란, 본 발명의 세제로부터 생물제약 약물을 분리하는 것을 지칭한다.

용어 "크로마토그래피"는 관련 기술분야에 공지된 그의 의미에 따라 사용된다. 이는 혼합물에 존재하는 다른 분자들로부터 관심 분석물질 (예를 들어, 생물제약 약물과 같은 표적 분자)을 분리하는 임의의 크로마토그래피 기술을 포함한다. 통상, 관심 분석물질은, 혼합물의 개별 분자들이 결합 및 용리 공정에서, 또는 이동상의 영향 하에 고정 매체를 통해 이동하는 속도의 차이의 결과로서 다른 분자들로부터 분리된다.

용어 "크로마토그래피 수지" 및 "크로마토그래피 매체"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 혼합물에 존재하는 다른 분자들로부터 관심 분석물질 (예를 들어, 생물제약 약물과 같은 표적 분자)을 분리하는 임의의 종류의 상 (예를 들어, 고체상)을 지칭한다. 통상, 관심 분석물질은, 혼합물의 개별 분자들이 결합 및 용리 공정에서, 또는 이동상의 영향 하에 고체 고정상을 통해 이동하는 속도의 차이의 결과로서 다른 분자들로부터 분리된다. 다양한 유형의 크로마토그래피 매체의 예는, 예를 들어, 양이온 교환 수지, 양이온 교환 막, 친화 수지, 음이온 교환 수지, 음이온 교환 막, 소수성 상호작용 수지 및 이온 교환 모노리스를 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "제약 제형"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 의미를 가지며, 환자에게 투여하기에 적합한 임의의 제형을 지칭한다. 제약 제형은 관련 기술분야에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 제형에 존재하는 임의의 생물제약 약물에 있어서, 통상의 기술자라면 버퍼, 안정화제, 계면활성제, 항산화제, 킬레이트화제 및/또는 보존제 등을 포함한 바람직한 추가 성분을 선택 및 첨가할 수 있을 것이다.

본원에서 사용되는 용어 "용매/세제 혼합물"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 의미를 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용된 용매/세제 혼합물은 물 이외의 적어도 1종의 용매, 및 적어도 1종의 세제를 함유한다. 본 발명에 따라 사용된 용매는 바람직하게는 유기 용매이고, 가장 바람직하게는 트리-n-부틸 포스페이트이다. 혼합물 중에 함유된 상이한 용매 및/또는 세제의 수는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 용매/세제 혼합물은 트리-n-부틸 포스페이트, 폴리소르베이트 80, 및 본 발명에 따른 폴리옥시에틸렌 에테르 세제로 구성될 수 있다.

용어 "사이에"는, 본 발명에서 수치 범위를 나타내는데 사용된 경우, 각 범위의 나타낸 하한값 및 상한값을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 온도가 0℃와 10℃ 사이에 있는 것으로 나타낸 경우, 이는 0℃ 및 10℃의 온도를 포함한다. 유사하게, 변수 x가 예를 들어 4와 16 사이의 정수인 것으로 나타낸 경우, 이는 정수 4 및 16을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "1시간"은 정확히 60분으로 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "1시간"은 60분 ± 5분, 바람직하게는 60분 ± 2분과 관련된 것으로 이해되어야 한다.

실시양태

본 발명에 따른 지질 외피를 갖는 바이러스를 불활성화시키는 방법은 세제를 액체에 첨가하여 상기 세제와 상기 액체의 혼합물을 제조하는 단계; 및 상기 혼합물을 인큐베이션하여 상기 바이러스를 불활성화시키는 단계를 포함한다. 상기 기재된 바와 같이, 본원에서 사용되는 용어 "지질 외피를 갖는 바이러스를 불활성화시키는"이란, 용액 중의 감염성 바이러스 입자의 농도를 감소시키는 것을 지칭한다. 본 발명에 따른 지질 외피를 갖는 바이러스를 불활성화시키는 방법에서, 방법이 적어도 1종의 바이러스에 대해 적어도 1 Log10 감소 값 (LRV), 또는 적어도 1종의 바이러스에 대해 적어도 2 Log10 감소 값 (LRV), 또는 적어도 1종의 바이러스에 대해 적어도 3 Log10 감소 값 (LRV), 또는 적어도 1종의 바이러스에 대해 적어도 4 Log10 감소 값 (LRV), 또는 적어도 1종의 바이러스에 대해 적어도 5 Log10 감소 값 (LRV), 또는 적어도 1종의 바이러스에 대해 적어도 6 Log10 감소 값 (LRV), 또는 적어도 1종의 바이러스에 대해 적어도 7 Log10 감소 값 (LRV), 또는 적어도 1종의 바이러스에 대해 적어도 8 Log10 감소 값 (LRV), 가장 바람직하게는 적어도 1종의 바이러스에 대해 적어도 4 Log10 감소 값 (LRV)을 달성하는 것이 바람직하다. 물론, 적어도 1종의 바이러스에 대해 임의의 Log10 감소 값 (LRV)이 유익하다는 것은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백하며, 이는 예를 들어 생물제약 생산 공정의 안전성을 개선시키기 때문이다. 본 발명에 따라 언급된 LRV는 외피보유 바이러스의 LRV이다.

본 발명의 방법은 일반적으로 지질-외피보유 바이러스의 불활성화를 위한 것이지만, 본 발명에 따른 세제는 또한, 예를 들어 비-외피보유 바이러스가 그의 복제 사이클 동안 일부 단계에서 지질 외피를 획득하는 경우, 그러한 비-외피보유 바이러스를 불활성화시킬 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 용어 "지질 외피를 갖는 바이러스를 불활성화시키는"은, 본 발명의 방법에서, 지질 외피를 갖는 바이러스에 추가로 비-외피보유 바이러스가 또한 불활성화될 수 있는 가능성을 배제하도록 의도되지 않는다.

본 발명에 따른 지질 외피를 갖는 바이러스를 불활성화시키는 방법에서는, 세제를 액체에 첨가하여 상기 세제와 상기 액체의 혼합물을 제조하고, 상기 혼합물을 인큐베이션하여 상기 바이러스를 불활성화시킨다. 본 발명의 방법의 상기 액체는 임의의 종류의 액체 또는 여러 액체의 혼합물 예컨대 용액, 현탁액, 또는 여러 현탁액 및/또는 용액의 혼합물일 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 또한 이에 제한되지는 않고, 본 발명에 따른 상기 액체는 혈액일 수 있거나 혈액 또는 혈액 분획물을 함유할 수 있고, 또는 혈장일 수 있거나 혈장 또는 혈장 분획물을 함유할 수 있고, 또는 혈청일 수 있거나 혈청 또는 혈청 분획물을 함유할 수 있고, 또는 세포 배양 배지일 수 있거나 세포 배양 배지를 함유할 수 있고, 또는 버퍼일 수 있거나 버퍼를 함유할 수 있다. 액체는 또한, 공정 중간체 (예를 들어, 생물제약 약물의 제조 시 공정 중간체)일 수 있다.

본 발명에 따른 액체는 지질 외피를 갖는 바이러스를 함유할 수 있거나, 또는 지질 외피를 갖는 바이러스를 함유하는 것으로 생각될 수 있다 (예를 들어, 액체가 혈액이거나 혈액 또는 혈액 분획물을 함유하고, 또는 혈장이거나 혈장 또는 혈장 분획물을 함유하고, 또는 혈청이거나 혈청 또는 혈청 분획물을 함유하는 경우, 또는 세포 배양 시 생성된 생물제약 약물을 함유하는 경우). 본 발명의 모든 다른 실시양태에 따른 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 상기 액체는 지질 외피를 갖는 바이러스를 함유한다. 본 발명에 따른 상기 액체 중의 지질 외피를 갖는 상기 바이러스의 기원은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 바이러스는, 본 발명에 따른 액체를 제조하는데 사용될 수 있는 인간 혈액으로부터, 또는 본 발명에 따른 액체를 제조하는데 사용될 수 있는 인간 혈장으로부터, 또는 본 발명에 따른 액체를 제조하는데 사용될 수 있는 인간 혈청으로부터, 또는 본 발명에 따른 액체를 제조하는데 사용될 수 있는 세포 배양 배지로부터 유래될 수 있다. 특히, 바이러스가 본 발명에 따른 액체를 제조하는데 사용되는 세포 배양 배지로부터 유래되는 경우, 바이러스는 소 혈청 알부민과 같은 상기 세포 배양 배지의 동물-유래의 성분으로부터 유래될 수 있다.

본 발명에 따른 지질 외피를 갖는 바이러스를 불활성화시키는 방법에서는, 세제를 액체에 첨가하여 상기 세제와 상기 액체의 혼합물을 제조한다. 상기 세제는 폴리옥시에틸렌 에테르이다.

폴리옥시에틸렌 에테르는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 하기 화학식 A에 따른 구조를 갖는다:

여기서 n은 1 이상임.

관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명한 바와 같이, 폴리옥시프로필렌 에테르는 본 발명에 따른 폴리옥시에틸렌 에테르와 매우 유사한 특성을 가질 수 있다. 따라서, 본 발명의 모든 다른 실시양태에 따라, 예를 들어 본 발명의 지질 외피를 갖는 바이러스를 불활성화시키는 방법에서, 폴리옥시에틸렌 에테르는 폴리옥시프로필렌 에테르로 대체될 수 있다.

폴리옥시프로필렌 에테르는 또한 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 하기 화학식 B에 따른 구조를 갖는다:

여기서 n은 1 이상임.

본원에 언급된 바와 같이, 본 발명에 따른 "폴리옥시에틸렌 에테르"는 바람직하게는 관련 기술분야에서의 그의 보편적 의미에 따른 폴리옥시에틸렌 에테르이다. 대안적으로, 본 발명에 따른 폴리옥시에틸렌 에테르는 또한 폴리옥시에테르일 수 있으며, 이 경우 폴리옥시에테르 분자의 총 수의 일부, 바람직하게는 대부분은 폴리옥시에틸렌 에테르 분자이지만, 폴리옥시에테르 분자의 총 수의 또 다른 일부, 바람직하게는 소수는 옥시에틸렌 및 옥시프로필렌 단위를 포함하는 혼합 중합체, 및/또는 옥시프로필렌 단위를 포함하는 중합체이다. 이 경우에, 용어 "폴리옥시에테르 분자의 총 수의 대부분은 폴리옥시에틸렌 에테르 분자이다"란, 폴리옥시에테르 분자의 총 수의 적어도 50%가 폴리옥시에틸렌 에테르 분자임을 의미한다. 바람직하게는, 폴리옥시에테르 분자의 총 수의 적어도 60%는 폴리옥시에틸렌 에테르 분자이다. 보다 바람직하게는, 폴리옥시에테르 분자의 총 수의 적어도 70%는 폴리옥시에틸렌 에테르 분자이다. 더욱 더 바람직하게는, 폴리옥시에테르 분자의 총 수의 적어도 80%는 폴리옥시에틸렌 에테르 분자이다. 더욱 더 바람직하게는, 폴리옥시에테르 분자의 총 수의 적어도 90%는 폴리옥시에틸렌 에테르 분자이다. 가장 바람직하게는, 폴리옥시에테르 분자의 총 수의 적어도 95%는 폴리옥시에틸렌 에테르 분자이다. 또한 대안적으로, 본 발명에 따른 폴리옥시에틸렌 에테르는 또한, 다량 (예를 들어, 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%)의 옥시에틸렌 단위 및 미량의 옥시프로필렌 단위를 포함하는 혼합 폴리옥시에테르일 수 있다.

본 발명의 방법에 따라 사용되는 세제는 비-페놀성이다. 본 발명의 모든 다른 실시양태에 따른 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법에 따라 사용되는 세제는 방향족이 아니다.

본 발명에 따른 폴리옥시에틸렌 에테르 세제는 에톡실화 반응에 의해 합성될 수 있다. 에톡실화는, 알콜 에톡실레이트 (폴리옥시에틸렌 에테르라고도 알려짐)를 생성하기 위해 알콜 (대안적으로 아민이 사용될 수 있음)에 대해 수행되는 산업적 공정이다. 반응은 에틸렌 옥시드를 촉매로서의 역할을 하는 염기 (예컨대 수산화칼륨, KOH)와 함께 고온 (예를 들어, 약 180℃)에서 고압 (예를 들어, 1-2 bar의 압력) 하에 알콜에 통과시킴으로써 진행된다. 공정은 매우 발열성이다.

반응은 광범위한 다분산도의 반복 단위 길이를 갖는 생성물의 형성으로 이어진다 (상기 식에서 n의 값이 평균 중합체 길이임).

실험실 규모에서, 폴리옥시에틸렌 에테르 세제는, 먼저 알콜의 히드록실 기로부터 양호한 이탈기 (예컨대, Cl, Br, I, OMs 또는 OTf)를 형성한 다음, 이 기질을 모노 탈양성자화된 폴리에틸렌글리콜과 반응시킴으로써 생성될 수 있다. 대안적으로, 양호한 이탈기 (예컨대, Cl, Br, I, OMs 또는 OTf)는, 탈양성자화된 알콜과 제2 단계에서 반응시키는 폴리에틸렌글리콜 쇄 상에 붙일 수 있다.

폴리옥시에틸렌 에테르의 합성을 위한 예시적 방법은 예를 들어 미국 특허 번호 1,970,578 및 문헌 [Di Serio et al. (2005)]에 상세히 기재되어 있으며, 이들은 모든 목적 상 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

TX-100, 트리톤 N-101 환원형, 트리톤 X-100 환원형, 및 브리즈 C10이 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르일 때 (= 에톡실화 반응이 에틸렌 옥시드 기체로 수행됨), 프로필렌 옥시드를 사용하여 산업적 규모로 유사한 반응을 수행하는 것 (=프로폭실화)이 또한 가능하다. 유일한 차이는 PEG 쇄 내의 메틸 기 치환일 것이다:

에톡실화 및 프로폭실화는 또한 동일한 공정에서 조합될 수 있으며, 옥시에틸렌 및 옥시프로필렌 단위를 포함하는 혼합 중합체 폴리옥시에테르와 같은 혼합 생성물로 이어질 수 있다.

트리톤-X100의 독성 활성은, 해양 생물 유기체의 특정 내분비 수용체에 도킹하는 능력을 갖는 페놀 모이어티로부터 기인한다. 방향족 고리와 PEG 쇄 사이에 메틸렌 기를 삽입함으로써, 새로운 구조에 트리톤-X100의 페놀 관능기가 더 이상 존재하지 않는다. 또한, PEG 쇄가 환경으로 방출된 후 분해되면, 발현된 벤질 알콜은 상응하는 벤조산으로 용이하게 산화될 것이다. 이 대사물질은 페놀 유도체와 완전히 상이한 극성 및 기하 구조를 가지며, 이는 내분비 수용체에서 어떠한 억제도 방지할 것이다.

상기 고려사항에 기반하여, 본 발명자들은 비-페놀성 폴리옥시에틸렌 에테르를 합성하였고, 그의 항바이러스 활성을 시험하였다 (실시예 4 내지 10 참조). 따라서, 본 발명은 또한, 하기 화학식 (VIII)의 비-페놀성 폴리옥시에틸렌 에테르를 제공한다:

화학식 (VIII)에서 R은 2 내지 12개의 탄소 원자의 선형 쇄 및 상기 선형 쇄 상의 치환기로서 1개 이상의 메틸 기를 갖는 탄화수소 기를 나타내고, m은 1 내지 4의 정수를 나타내고, A는 폴리옥시에틸렌 잔기를 나타내며, 단, 임의로 하기 구조 화학식을 갖는 29-[4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페닐]-3,6,9,12,15,18,21,24,27-노나옥사노나코산-1-올은 제외된다.

화학식 (VIII)에서 R은 2 내지 12개, 바람직하게는 2 내지 8개, 보다 바람직하게는 2 내지 6개, 가장 바람직하게는 4개의 탄소 원자의 선형 쇄 및 상기 선형 쇄 상의 치환기(들)로서 1개 이상, 바람직하게는 2 내지 6개, 가장 바람직하게는 4개의 메틸 기(들)를 갖는 탄화수소 기를 나타낸다.

바람직하게는 R은 2 내지 12개, 바람직하게는 2 내지 8개, 보다 바람직하게는 2 내지 6개, 가장 바람직하게는 4개의 탄소 원자의 선형 쇄 및 상기 선형 쇄 상의 치환기(들)로서 2개의 메틸 기(들)를 갖는 탄화수소 기; 2 내지 12개, 바람직하게는 2 내지 8개, 보다 바람직하게는 2 내지 6개, 가장 바람직하게는 4개의 탄소 원자의 선형 쇄 및 상기 선형 쇄 상의 치환기(들)로서 4개의 메틸 기(들)를 갖는 탄화수소 기; 또는 2 내지 12개, 바람직하게는 2 내지 8개, 보다 바람직하게는 2 내지 6개, 가장 바람직하게는 4개의 탄소 원자의 선형 쇄 및 상기 선형 쇄 상의 치환기(들)로서 6개의 메틸 기(들)를 갖는 탄화수소 기를 나타낸다.

가장 바람직하게는 R은 2,4,4-트리메틸-펜트-2-일 기를 나타낸다.

화학식 (VIII)에서, m은 1 내지 4의 정수, 바람직하게는 1 내지 2의 정수, 가장 바람직하게는 1의 정수를 나타낸다.

화학식 (VIII)에서, A는 폴리옥시에틸렌 잔기, 바람직하게는 2-20개의 옥시에틸렌 단위를 포함하는 폴리옥시에틸렌 잔기, 보다 바람직하게는 4 내지 16개의 옥시에틸렌 단위를 포함하는 폴리옥시에틸렌 잔기, 더욱 더 바람직하게는 8 내지 12개의 옥시에틸렌 단위를 포함하는 폴리옥시에틸렌 잔기, 가장 바람직하게는 9 또는 10개의 옥시에틸렌 단위를 포함하는 폴리옥시에틸렌 잔기를 나타낸다.

화학식 (VIII)의 화합물의 바람직한 실시양태는, R이 2 내지 6개의 탄소 원자의 선형 쇄 및 상기 선형 쇄 상의 치환기로서 2 내지 4개의 메틸 기를 갖는 탄화수소 기를 나타내고; m이 1 내지 2의 정수를 나타내고; A가 8 내지 12개의 옥시에틸렌 단위를 포함하는 폴리옥시에틸렌 잔기를 나타내는 화합물이다.

화학식 (VIII)의 화합물의 또 다른 바람직한 실시양태는, R이 2 내지 6개의 탄소 원자의 선형 쇄 및 상기 선형 쇄 상의 치환기로서 2 내지 4개의 메틸 기를 갖는 탄화수소 기를 나타내고; m이 1의 정수를 나타내고; A가 8 내지 12개의 옥시에틸렌 단위를 포함하는 폴리옥시에틸렌 잔기를 나타내는 화합물이다.

화학식 (VIII)의 화합물의 구체적인 바람직한 실시양태는 하기 화합물이다:

m = 1 내지 4, 바람직하게는 여기서 m은 1이고;

z = 1 내지 5.

화학식 (VIII)의 화합물의 또 다른 구체적인 바람직한 실시양태는 하기 화합물이다:

화학식 (VIII)의 화합물은 문헌 [Vogel's Textbook of Practical Organic Chemistry (5th Edition, 1989, A.I. Vogel, A.R. Tatchell, B.S. Furnis, A.J. Hannaford, P.W.G. Smith)]에 기재된 것들과 같은 보편적으로 공지된 합성 방법에 의해 합성될 수 있다. 예를 들어, 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트는, 화학식 (VIII)의 기 R에 상응하는 치환기를 포함하는 페놀을 상응하는 벤조산 또는 호모벤조산으로 전환시키고, 산 기를 알콜 기로 환원시키고, 알콜을 반응시켜 폴리에틸렌 글리콜 에테르 (폴리옥시에틸렌 에테르; POE 에테르라고도 공지됨)를 형성시킴으로써 제조될 수 있다. 여기서, 에틸렌 옥시드 또는 적합한 폴리에틸렌 글리콜은 폴리에틸렌 글리콜 에테르 관능기를 도입하기 위한 기초로서의 기능을 할 수 있다 (반응식 1; 개별 변환을 수행하기에 효과적인 실험 절차의 대표예는 예를 들어 문헌 [Bioorganic & Medicinal Chemistry, 16(9), 4883-4907, 2008]; [Journal of Medicinal Chemistry, 48(10), 3586-3604, 2005]; [Journal of Physical Chemistry B, 107(31), 7896-7902, 2003]; [Journal of Nanoparticle Research, 15(11), 2025/1-2025/12, 12 pp., 2013]; 및 [PCT Int. Appl., 2005016240, 24 Feb 2005]에서 찾아볼 수 있음).

대안적으로, 화학식 (VIII)의 화합물은, 톨루엔의 알킬화에 이어, 벤질 메틸 기의 관능화 및 추가 반응에 의한 폴리에틸렌 글리콜 에테르 형성을 통해 접근할 수 있다 (반응식 2; 개별 변환을 수행하기에 효과적인 실험 절차의 대표예는 예를 들어 문헌 [Russian Journal of Applied Chemistry, 82(6), 1029-1032, 2009]; [Journal of Organic Chemistry, 79(1), 223-229, 2014]; 및 [Chemistry - A European Journal, 23(60), 15133-15142, 2017]에서 찾아볼 수 있음). 폴리에틸렌 글리콜 에테르 관능기의 도입에 적합한 중간체를 수득하기 위한 벤질 알콜의 직접 알킬화가 또한 구상된다 (반응식 3; 상응하는 변환을 위한 실험 절차의 대표예는 예를 들어 문헌 [Russian Journal of Organic Chemistry, 51(11), 1545-1550, 2015]에서 찾아볼 수 있음).

화학식 (VIII)에 따른 구조를 갖는 상기 폴리옥시에틸렌 에테르는 본 발명에 따른 지질 외피를 갖는 바이러스를 불활성화시키는 방법에서 사용될 수 있다.

상기 기재된 바와 같이 그리고 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명한 바와 같이, 폴리옥시에틸렌 에테르의 합성은 통상, 광범위한 다분산도의 폴리옥시에틸렌 반복 단위 길이를 갖는 생성물을 산출한다. 따라서, 폴리옥시에틸렌 반복 단위의 수가 본 발명의 폴리옥시에틸렌 에테르에 대해 나타낸 경우, 이 수는 평균 폴리옥시에틸렌 반복 단위 길이를 지칭한다. 평균 폴리옥시에틸렌 반복 단위 길이란, 샘플의 모든 폴리옥시에틸렌 에테르 분자의 폴리옥시에틸렌 반복 단위의 평균 수를 지칭한다. 예를 들어, 본 발명의 지질 외피를 갖는 바이러스를 불활성화시키는 방법의 한 실시양태에서, 세제를 액체에 첨가하여 상기 세제와 상기 액체의 혼합물을 제조하며, 여기서 상기 세제는 하기 화학식 (III)에 따른 구조를 갖는 폴리옥시에틸렌 에테르일 수 있다:

여기서 n은 10임.

본 발명의 지질 외피를 갖는 바이러스를 불활성화시키는 방법의 상기 실시양태에서, 상기 화학식 (III) 내의 n = 10은, 본 발명에 따른 액체에 첨가되는 모든 폴리옥시에틸렌 에테르 분자의 폴리옥시에틸렌 반복 단위의 평균 수일 것이다.

본 발명에 따른 지질 외피를 갖는 바이러스를 불활성화시키는 방법에서 사용된 폴리옥시에틸렌 에테르 세제는 폴리옥시에틸렌 반복 단위의 평균 수가 2 내지 100개, 2 내지 50개, 2 내지 20개, 또는 4 내지 16개, 또는 9 또는 10개이다. 바람직하게는, 폴리옥시에틸렌 반복 단위의 평균 수는 4 내지 16개, 보다 바람직하게는 9 또는 10개, 가장 바람직하게는 10개이다.

관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명한 바와 같이, 본 발명에 따른 폴리옥시에틸렌/폴리옥시프로필렌 에테르 세제에서, 폴리옥시에틸렌/폴리옥시프로필렌 모이어티의 말단 히드록실 기에 메틸 기가 부착될 수 있다 (즉, 말단 히드록실 기가 블로킹될 수 있음). 말단 히드록실 기의 이러한 블로킹은 합성을 용이하게 할 수 있다. 이는 상기 반응식 1 또는 반응식 2에 따라 제조된 화합물과 같이 에톡실화 또는 프로폭실화를 통해 제조되지 않은 화합물에 특히 유용하다. 메틸-블로킹된 폴리옥시에틸렌/폴리옥시프로필렌 모이어티를 갖는 구조는 통상, 하기 예시적 구조로 예시된 바와 같은 mPEG 유도체라 지칭된다:

관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명한 바와 같이 또한, 폴리옥시프로필렌 에테르의 합성은 통상, 광범위한 다분산도의 폴리옥시프로필렌 반복 단위 길이를 갖는 생성물을 산출한다. 따라서, 폴리옥시프로필렌 반복 단위의 수가 본 발명에 따른 폴리옥시프로필렌 에테르에 대해 나타낸 경우, 이 수는 평균 폴리옥시프로필렌 반복 단위 길이를 지칭한다. 상기 폴리옥시에틸렌 에테르에 대해 기재된 바와 같이, 평균 폴리옥시프로필렌 반복 단위 길이란, 샘플의 모든 폴리옥시프로필렌 에테르 분자의 폴리옥시프로필렌 반복 단위의 평균 수를 지칭한다.

본 발명에 따라 사용된 폴리옥시프로필렌 에테르 세제는 폴리옥시프로필렌 반복 단위의 평균 수가 2 내지 100개, 2 내지 50개, 2 내지 20개, 또는 5 내지 15개, 또는 9 또는 10개이다. 바람직하게는, 폴리옥시프로필렌 반복 단위의 평균 수는 5 내지 15개, 보다 바람직하게는 9 또는 10개, 가장 바람직하게는 10개이다.

본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 지질 외피를 갖는 바이러스를 불활성화시키는 방법에서 사용된 폴리옥시에틸렌 에테르는 하기 화학식 (II)에 따른 구조를 갖는다:

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 화학식 (II)로 나타낸 화합물은 상업적으로 입수가능한 트리톤 X-100 환원형 (CAS No. 92046-34-9)이다.

본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 지질 외피를 갖는 바이러스를 불활성화시키는 방법에서 사용된 폴리옥시에틸렌 에테르는 하기 화학식 (IV)에 따른 구조를 갖는다:

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 화학식 (IV)로 나타낸 화합물은 상업적으로 입수가능한 트리톤 N-101 환원형 (CAS No. 123359-41-1)이다.

본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 지질 외피를 갖는 바이러스를 불활성화시키는 방법에서 사용된 폴리옥시에틸렌 에테르는 하기 화학식 (VI)에 따른 구조를 갖는다:

여기서 x는 15임.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 화학식 (VI)으로 나타낸 화합물은 상업적으로 입수가능한 브리즈 C10 (CAS No. 9004-95-9)이다.

본 발명의 모든 다른 실시양태에 따라, 본 발명의 지질 외피를 갖는 바이러스를 불활성화시키는 방법에서, 폴리옥시에틸렌 에테르는 또한 모노옥시에틸렌 에테르로 대체될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 모노옥시에틸렌 에테르는 하기 화학식 C에 따른 구조를 갖는다:

x = 0 내지 5

y = 0 내지 5

z = 0 내지 20.

바람직하게는, 상기 모노옥시에틸렌 에테르는 하기 화학식 D에 따른 구조:

또는 하기 화학식 E에 따른 구조를 갖는다:

본 발명의 모든 다른 실시양태에 따라, 본 발명은 또한, 본 발명에 의해 제공된 폴리옥시에틸렌 에테르에 상응하는 모노옥시에틸렌 에테르를 제공한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 모노옥시에틸렌 에테르는 하기 화학식 F에 따른 구조를 갖는다:

여기서 R은 2 내지 12개의 탄소 원자의 선형 쇄 및 상기 선형 쇄 상의 치환기로서 1개 이상의 메틸 기를 갖는 탄화수소 기를 나타내고; m은 1 내지 4의 정수를 나타내고; A는 폴리옥시에틸렌 잔기를 나타냄.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 화학식 F의 모노옥시에틸렌 에테르는 하기 화합물이다:

화학식 F에 따른 구조를 갖는 상기 모노옥시에틸렌 에테르는, 본 발명에 따른 지질 외피를 갖는 바이러스를 불활성화시키는 방법에서 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 지질 외피를 갖는 바이러스를 불활성화시키는 방법에서, 세제를 액체에 첨가하여 상기 세제와 상기 액체의 혼합물을 제조한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 폴리옥시에틸렌 에테르 세제를 액체에 첨가하여, 최종 농도 약 0.03% (w/w) 내지 10% (w/w), 바람직하게는 약 0.05% (w/w) 내지 10% (w/w), 보다 바람직하게는 0.1% (w/w) 내지 10% (w/w), 더욱 더 바람직하게는 약 0.5% (w/w) 내지 5% (w/w), 가장 바람직하게는 약 0.5% (w/w) 내지 2% (w/w)의, 액체 중의 폴리옥시에틸렌 에테르 세제를 산출한다.

본 발명의 지질 외피를 갖는 바이러스를 불활성화시키는 방법의 바람직한 실시양태에서는, 방법에서 사용된 폴리옥시에틸렌 에테르가 지질 외피를 갖는 상기 바이러스의 불활성화에 적합하다. 불활성화란, 본원에서 사용되는 바와 같이, 지질-외피보유 바이러스의 세포 감염 능력을 교란시키는 것을 지칭한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명한 바와 같이, 지질-외피보유 바이러스의 세포 감염 능력 (즉, 지질-외피보유 바이러스의 감염성)은 전형적으로, 용액 중의 감염성 바이러스 입자의 수를 결정함으로써 평가된다. 용액 중의 감염성 바이러스 입자의 수를 결정하기 위한 예시적 방법은 본원에 기재되어 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 지질 외피를 갖는 바이러스를 불활성화시키는 방법에서는, 세제 및 용매를 액체에 첨가하는 단계가 상기 바이러스의 불활성화를 위한 용매/세제 혼합물을 제조하는 방식으로 수행된다. 바람직하게는 상기 용매는 유기 용매이고, 더욱 더 바람직하게는 상기 용매는 트리-n-부틸 포스페이트이다. 세제의 농도, 및 용매의 유형 및 농도는, 예를 들면, 액체에 존재하는 잠재적 바이러스, 요망되는 LRV, 액체에 존재할 수 있는 생물제약 약물의 특성, 및 액체에 존재할 수 있는 생물제약 약물의 제조 공정의 특징 (예를 들어, 불활성화가 수행될 온도)을 고려하여 통상의 기술자에 의해 적절히 선택될 수 있는 것으로 이해된다. 전형적으로, 본 발명에 따른 인큐베이션 동안 유기 용매 및 단일 세제의 최종 농도는 약 0.01% (w/w) 내지 약 5% (w/w)의 유기 용매 및 약 0.05% (w/w) 내지 약 10% (w/w)의 세제, 바람직하게는 약 0.1% (w/w) 내지 약 5% (w/w)의 유기 용매 및 약 0.1% (w/w) 내지 약 10% (w/w)의 세제, 보다 바람직하게는 약 0.1% (w/w) 내지 약 1% (w/w)의 유기 용매 및 약 0.5% (w/w) 내지 약 5% (w/w)의 세제, 가장 바람직하게는 약 0.1% (w/w) 내지 약 0.5% (w/w)의 유기 용매 및 약 0.5% (w/w) 내지 약 2% (w/w)의 세제이다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 지질 외피를 갖는 바이러스를 불활성화시키는 방법에서는, 세제 (및 임의로 또한 용매)를 액체에 첨가하는 단계가 추가 세제를 액체에 첨가하는 방식으로 수행된다. 바람직하게는, 상기 추가 세제는 폴리옥시에틸렌 (80) 소르비탄 모노올레에이트 (예를 들어, 폴리소르베이트 80 또는 트윈 80이라고도 공지됨)이다. 바람직하게는 상기 용매는 유기 용매이고, 더욱 더 바람직하게는 상기 용매는 트리-n-부틸 포스페이트이다. 본 발명에 따른 세제의 농도, 추가 세제의 유형 및 농도 뿐만 아니라 용매의 유형 및 농도는, 예를 들면, 액체에 존재하는 잠재적 바이러스, 요망되는 LRV, 액체에 존재할 수 있는 생물제약 약물의 특성, 및 액체에 존재할 수 있는 생물제약 약물의 제조 공정의 특징 (예를 들어, 불활성화가 수행될 온도)을 고려하여 통상의 기술자에 의해 적절히 선택될 수 있는 것으로 이해된다. 전형적으로, 유기 용매의 최종 농도는 약 0.01% (w/w) 내지 약 5% (w/w)이고, 본 발명에 따른 세제의 최종 농도는 약 0.05% (w/w) 내지 약 10% (w/w)이고, 추가 세제의 최종 농도는 약 0.01% (w/w) 내지 약 5% (w/w)이다. 바람직하게는, 유기 용매의 최종 농도는 약 0.1% (w/w) 내지 약 5% (w/w)이고, 본 발명에 따른 세제의 최종 농도는 약 0.1% (w/w) 내지 약 10% (w/w)이고, 추가 세제의 최종 농도는 약 0.1% (w/w) 내지 약 5% (w/w)이다. 보다 바람직하게는, 유기 용매의 최종 농도는 약 0.1% (w/w) 내지 약 1% (w/w)이고, 본 발명에 따른 세제의 최종 농도는 약 0.5% (w/w) 내지 약 5% (w/w)이고, 추가 세제의 최종 농도는 약 0.1% (w/w) 내지 약 1% (w/w)이다. 가장 바람직하게는, 유기 용매의 최종 농도는 약 0.1% (w/w) 내지 약 0.5% (w/w)이고, 본 발명에 따른 세제의 최종 농도는 약 0.5% (w/w) 내지 약 2% (w/w)이고, 추가 세제의 최종 농도는 약 0.1% (w/w) 내지 약 0.5% (w/w)이다.

본 발명에 따른 또 다른 실시양태에서는, 1종의 세제만이 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 방법의 한 실시양태에서는, 단계 a)에서, 본 발명의 세제 이외의 어떠한 추가 세제도 첨가하지 않는다. 본 발명의 방법의 또 다른 실시양태에서는, 방법에서, 본 발명의 세제 이외의 어떠한 추가 세제도 첨가하지 않는다. 본 발명에 따른 또 다른 실시양태에서는, 지질 외피를 갖는 바이러스의 불활성화를 위한 방법에서 본 발명의 세제를 사용 시에, 본 발명의 세제 이외의 어떠한 추가 세제도 사용하지 않는다. 이들 실시양태의 하나의 이점은, 단일 세제는 후속 (방법) 단계에서 보다 용이하게 제거될 수 있다는 것이다. 예를 들어, 단일 세제는, 전형적으로 2종의 세제 및 1종의 용매 (특히, 유기 용매)를 포함하는 표준 용매/세제 (S/D) 처리에서 사용되는 3성분과 비교해서 보다 용이하게 제거될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 세제를 포함하는 조성물은, 상기 세제 이외의 어떠한 추가 세제도 포함하지 않는다.

본 발명에 따른 또 다른 실시양태에서는, 어떠한 유기 용매도 사용하지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 방법의 한 실시양태에서는, 단계 a)에서 어떠한 유기 용매도 첨가하지 않는다. 본 발명에 따른 또 다른 실시양태에서는, 지질 외피를 갖는 바이러스의 불활성화를 위한 방법에서 본 발명의 세제를 사용 시에 어떠한 유기 용매도 사용하지 않는다. 본 발명에 따른 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 세제를 포함하는 조성물은 어떠한 유기 용매도 포함하지 않는다.

상기 요약된 바와 같이, 본 발명에 따른 지질 외피를 갖는 바이러스를 불활성화시키는 방법은, 환자 안전을 보장하기 위해 최종 생성물에서 활성 (즉, 감염성) 바이러스가 없어야 하는 생물제약 생산 공정에서 특히 유용하다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 지질 외피를 갖는 바이러스를 불활성화시키는 방법에서는, 세제를 생물학적 의약품 또는 생물제약 약물, 바람직하게는 생물제약 약물을 포함하는 액체에 첨가한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 생물제약 약물은 바이러스성 백신이 아니다. 본 발명에 따른 생물제약 약물은 특별히 제한되지 않는다. 그것들은 인간 혈장으로부터 수득된 생물제약 약물과 같은 다른 공급원으로부터의 생물제약 약물 및 재조합 생물제약 약물 둘 다를 포함한다. 본 발명에 따른 생물제약 약물은, 제한 없이, 혈액 인자, 이뮤노글로불린, 대체 효소, 백신, 유전자 요법 벡터, 성장 인자 및 그의 수용체를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 생물제약 약물은 치료 단백질이다. 바람직한 혈액 인자는 인자 I (피브리노겐), 인자 II (프로트롬빈), 조직 인자, 인자 V, 인자 VII 및 인자 VIIa, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 XI, 인자 XII, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 (VWF), 프리칼리크레인, 고분자량 키니노겐 (HMWK), 피브로넥틴, 항트롬빈 III, 헤파린 보조인자 II, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 플라스미노겐, 알파 2-항플라스민, 조직 플라스미노겐 활성인자 (tPA), 우로키나제, 플라스미노겐 활성인자 억제제-1 (PAI1), 및 플라스미노겐 활성인자 억제제-2 (PAI2)를 포함한다. 인자 VIII이 특히 바람직한 혈액 인자이고, 재조합 인자 VIII이 더욱 더 바람직하다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 혈액 인자는 기능성 폴리펩티드 변이체, 및 혈액 인자를 코딩하거나 상기와 같은 기능성 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 의도된다. 바람직한 이뮤노글로불린은 인간 혈장 유래의 이뮤노글로불린, 모노클로날 항체 및 재조합 항체를 포함한다. 본 발명에 따른 생물제약 약물은 바람직하게는 각 인간 또는 재조합 인간 단백질 또는 이들의 기능성 변이체이다.

상기 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 생물제약 약물은 또한 유전자 요법 벡터 예컨대 바이러스성 유전자 요법 벡터일 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명한 바와 같이, 본 발명의 지질 외피를 갖는 바이러스를 불활성화시키는 방법은 일반적으로 비-외피보유 바이러스는 불활성화시키지 않는다. 따라서, 바람직한 실시양태에서는, 본 발명에 따른 생물제약 약물이 바이러스성 유전자 요법 벡터인 경우, 이러한 바이러스성 유전자 요법 벡터가 비-외피보유 바이러스에 기반한다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 바이러스성 유전자 요법 벡터는 아데노-관련 바이러스 (AAV)에 기반한다.

본 발명의 모든 다른 실시양태에 따라, 본 발명의 지질 외피를 갖는 바이러스를 불활성화시키는 방법은, 상기 혼합물을 인큐베이션시켜 상기 바이러스를 불활성화시키는 단계 후에, 상기 생물제약 약물을 정제하는 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 정제는, 상기 세제(들)로부터 상기 생물제약 약물을 분리하는 것을 포함한다. 통상의 기술자라면 세제(들)로부터 생물제약 약물을 분리하기 위한 다양한 방법을 알고 있을 것이다. 이러한 방법은, 생물제약 약물의 특성, 이를 수득하는 공급원 (예를 들어, 재조합적으로, 또는 인간 혈장과 같은 기타 공급원으로부터), 및 요망되는 생물제약 적용 (예를 들어, 피하 또는 정맥내 투여할지의 여부 등)을 고려하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, 생물제약 약물은 크로마토그래피, 예컨대 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 세제(들)로부터 분리될 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 세제(들)로부터의 상기 정제는 1종 초과의 크로마토그래피 정제를 포함한다.

본 발명의 모든 다른 실시양태에 따라, 본 발명의 지질 외피를 갖는 바이러스를 불활성화시키는 방법은, 상기 혼합물을 바람직하게는 심층 필터로 여과하는 단계를 포함할 수 있다. 이와 같은 여과 단계는, 세제를 액체에 첨가하여 상기 세제와 상기 액체의 혼합물을 제조하는 단계 전에 수행될 수 있다. 대안적으로, 이와 같은 여과 단계는, 세제를 액체에 첨가하여 상기 세제와 상기 액체의 혼합물을 제조하는 단계와 상기 혼합물을 인큐베이션하여 상기 바이러스를 불활성화시키는 단계 사이에 수행될 수 있다.

본 발명의 모든 다른 실시양태에 따른 또 다른 실시양태에서는, 지질 외피를 갖는 바이러스를 불활성화시키는 방법에서, 상기 혼합물을 인큐베이션하여 상기 바이러스를 불활성화시키는 단계가 상기 혼합물을 적어도 10분 동안, 적어도 30분 동안, 적어도 1시간 동안, 적어도 2시간 동안, 적어도 4시간 동안, 적어도 12시간 동안 또는 적어도 24시간 동안 인큐베이션하는 방식으로 수행될 수 있다.

본 발명의 모든 다른 실시양태에 따른 또 다른 실시양태에서는, 상기 혼합물을 인큐베이션하여 상기 바이러스를 불활성화시키는 단계에서, 상기 혼합물을 저온, 예컨대 0℃ 내지 15℃, 0℃ 내지 10℃, 0℃ 내지 8℃, 0℃ 내지 6℃, 0℃ 내지 4℃, 또는 0℃ 내지 2℃, 바람직하게는 0℃ 내지 10℃의 온도에서 인큐베이션한다. 본 발명의 모든 다른 실시양태에 따른 대안적 실시양태에서는, 상기 혼합물을 인큐베이션하여 상기 바이러스를 불활성화시키는 단계에서, 상기 혼합물을 실온에서 또는 그 근처에서, 예컨대 16℃ 내지 25℃, 18℃ 내지 24℃, 또는 20℃ 내지 23℃의 온도에서 인큐베이션한다.

본 발명의 방법의 단계들이 수행되는 방식은 특별히 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 특히, 방법 단계들은 회분식으로 수행될 수 있다. 대안적으로, 방법 단계들은 또한 반연속식 또는 연속식으로 수행될 수 있다.

상기 요약된 바와 같이, 본 발명에 따른 지질 외피를 갖는 바이러스를 불활성화시키는 방법은 생물제약 생산 공정에서 특히 유용하다. 따라서, 본 발명은 또한, 본 발명 및 그의 임의의 실시양태에 따른 지질 외피를 갖는 바이러스를 불활성화시키는 방법의 방법 단계들을 포함하는, 생물제약 약물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 생물제약 약물을 제조하는 방법은, 상기 생물제약 약물을 포함하는 제약 제형을 제조하는 단계를 포함하며, 이는 본 발명에 따른 지질 외피를 갖는 바이러스를 불활성화시키는 방법의 단계들에 후속하여 수행된다. 이러한 제약 제형은 제약 제형의 제조를 위한 공지된 표준에 따라 제조될 수 있다. 예를 들면 제형은, 예를 들어 제약학상 허용되는 성분 예컨대 담체, 부형제 또는 안정화제를 사용함으로써 적절히 투여 및 저장될 수 있는 방식으로 제조될 수 있다. 이러한 제약학상 허용되는 성분은, 환자에게 제약 제형을 투여할 때 사용된 양에서는 독성이 없다.

본 발명자들은 놀랍게도, 본 발명에 따른 폴리옥시에틸렌 에테르 세제가 지질 외피를 갖는 바이러스의 불활성화에 특히 유용함을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 또한, 지질 외피를 갖는 바이러스의 불활성화를 위한 임의의 방법에서의, 본 발명에 따른 개시된 폴리옥시에틸렌 에테르 세제의 용도에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 바이러스의 상기 불활성화를 위한 상기 방법은 용매/세제 처리를 사용하는 방법이며, 상기 용매/세제 처리는 본 발명의 상기 세제를 사용하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 바이러스 불활성화는 생물제약 약물을 포함하는 액체 중의 바이러스의 불활성화이다.

본 발명자들은 놀랍게도, 본 발명에 따른 비-페놀성 폴리옥시에틸렌 에테르 세제가 지질 외피를 갖는 바이러스의 불활성화에 특히 유용함을 발견하였기 때문에, 본 발명은 또한, 본 발명에 따른 폴리옥시에틸렌 에테르 세제, 및 본 발명에 따른 폴리옥시에틸렌 에테르 세제를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 폴리옥시에틸렌 에테르 세제를 포함하는 조성물은 생물제약 약물 및/또는 유기 용매 및/또는 추가 세제를 부가적으로 포함한다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 폴리옥시에틸렌 에테르 세제 또는 본 발명에 따른 폴리옥시에틸렌 에테르 세제를 포함하는 조성물을 포함하고 크로마토그래피 정제를 위한 크로마토그래피 수지를 추가로 포함하는, 바이러스 불활성화를 위한 키트를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 키트는 심층 필터를 추가로 포함한다.

본 발명은 비-페놀성 폴리옥시에틸렌 에테르를 제공한다. 상기 기재된 바와 같이, 이들 폴리옥시에틸렌 에테르는 본 발명에 따른 지질 외피를 갖는 바이러스를 불활성화시키는 방법에서 사용될 수 있다. 그러나, 다양한 다른 목적을 위해, 예를 들어 트리톤 X-100이 보편적으로 사용되는 것들에 대해 또한 이들 비-페놀성 폴리옥시에틸렌 에테르 뿐만 아니라 본 발명에 따른 모든 다른 비-페놀성 폴리옥시에틸렌 에테르가 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 비-페놀성 폴리옥시에틸렌 에테르는 실험실에서 사용될 수 있다. 실험실에서 그것들은, 예를 들어, 세포를 용해시켜 단백질 또는 소기관을 추출하기 위해, 또는 생세포의 막을 투과화하기 위해; 또는 비-고정된 (또는 약하게 고정된) 진핵 세포 막을 투과화하기 위해; 또는 천연 상태의 막 단백질을 CHAPS와 같은 쯔비터이온성 세제와 함께 가용화시키기 위해; 또는 DNA 추출 시 용해 버퍼의 일부로서 (통상, 알칼리성 용해 버퍼 중의 5% 용액으로); 또는 면역염색 동안 수용액의 표면 장력을 감소시키기 위해 (통상, TBS 또는 PBS 버퍼 중의 0.1-0.5%의 농도에서); 또는 미생물학에서 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans)의 콜로니 확장을 제한하기 위해; 또는 동물-유래의 조직을 탈세포화하기 위해; 또는 겔 내에서의 단백질의 재생 전 SDS-PAGE 겔로부터 SDS를 제거하기 위해 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 비-페놀성 폴리옥시에틸렌 에테르는 전자산업에서, 예를 들어, 일부 절차 및 작동을 개선시키고 그의 속도를 높이기 위한 슬랫용 습윤제로서 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 비-페놀성 폴리옥시에틸렌 에테르는 의료 용도를 가질 수 있다 (예를 들어, 살정제 노녹시놀(Nonoxinol) 9의 대체물로서, 또는 제약 부형제로서, 또는 인플루엔자 백신 (플루존(Fluzone)) 내 성분으로서 사용될 수 있음). 추가의 실시양태에서, 본 발명에 따른 비-페놀성 폴리옥시에틸렌 에테르는 강력 공산품에서부터 온화한 세제까지의 범위의 여러 유형의 세정 화합물에서 사용될 수 있거나; 증류수 및 이소프로필 알콜과 함께 홈메이드 비닐 레코드 세정 유체 내 성분으로서 사용될 수 있거나; 다이아몬드 블레이드의 세정 동안에 사용될 수 있거나; 유화 중합을 위한 제형에서 사용될 수 있거나; 타이어에서 사용될 수 있거나; 세탁제 및 세정제에서 사용될 수 있거나; 산업에서 아교 또는 중합체의 생산을 위한 출발 화학물질로서 사용될 수 있거나; 가정용 또는 산업용 클리너에서, 페인트 또는 코팅에서, 펄프 또는 종이에서, 유전 상에서, 텍스타일에서, 농약에서, 금속가공 유체에서 사용될 수 있거나; 연질 복합 재료를 위한 탄소 재료의 분산을 위해 사용될 수 있거나; 또는 금속의 도금 시에 사용될 수 있다.

하기에서, 본 발명을 이에 제한되고자 하는 의도 없이 실시예로 예시할 것이다.

실시예

상기 요약된 바와 같이, 최근의 생태적 연구는 생물제약 생산 공정에서 트리톤 X-100의 사용과 관련하여 환경적 우려를 제기해 왔다. 구조적 고려사항에 기반하여, 본 발명자들은 후보 세제들이 부정적인 환경적 영향과 연관 없는 트리톤 X-100의 유용한 대안임을 확인하였다. 특히, 본 발명자들은 놀랍게도, 폴리옥시에틸렌 에테르가 생물제약 생산 동안 용매/세제 (S/D) 처리에 의한 지질-외피보유 바이러스의 불활성화에 있어서 트리톤 X-100의 적합한 대안임을 확인하였다. 하기 실험에서, S/D 처리를 위한 예시적 후보 세제들의 적합성은 정맥내 이뮤노글로불린 (IVIG)- 및 인간 혈청 알부민 (HSA)-함유 액체에 대해 시험하였다. 부가적으로, 하기 실험에서 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트를 합성하였고, S/D 처리 뿐만 아니라 단일-세제 처리에 있어서 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트 및 기타 폴리옥시에틸렌 에테르의 적합성을 다양한 시험 항목에 대해 시험하였다.

실시예 1: 정맥내 이뮤노글로불린을 포함하는 액체 중의 트리톤 X-100 환원형 또는 트리톤 N-101 환원형을 사용한 HIV 및 PRV 불활성화

정맥내 이뮤노글로불린 (IVIG)을 포함하는 액체 중의 지질-외피보유 바이러스 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 및 가성광견병 바이러스 (PRV)를 불활성화시키기 위한 S/D 처리에 있어서 트리톤 X-100 환원형 또는 트리톤 N-101 환원형의 적합성을 시험하고, 트리톤 X-100과 비교하였다. 이를 위해, IVIG를 포함하는 액체에 바이러스를 첨가하였다. 이어서, IVIG를 포함하는 바이러스-함유 액체를, 저 농도의 트리톤 X-100 환원형, 트리톤 N-101 환원형 또는 트리톤 X-100을 포함하는 S/D 혼합물과 함께 다양한 시간 동안 인큐베이션하고, 바이러스의 잔류 감염성을 결정하였다. 트리톤 X-100 환원형, 트리톤 N-101 환원형 및 트리톤 X-100은 바이러스 불활성화 속도, 즉, 시간 경과에 따른 바이러스 불활성화의 효율 (RF로 나타냄)을 평가하기 위해 저 농도로 사용되었다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명한 바와 같이, 생물제약 생산과 같은 상업적 생산 공정에서는 트리톤 X-100 환원형 또는 트리톤 N-101 환원형을 포함한 본 발명의 세제가 유의하게 더 높은 농도로 사용될 수 있으며, 이는 바이러스 불활성화 속도를 가속화할 것이며 또한 달성 LRV를 증가시킬 것으로 예상된다.

재료

IVIG를 포함하는 액체

IVIG를 포함하는 액체 (IVIG-함유 액체)를 드라이아이스 상에서 냉동시켰고, 수집일 이후 1년 내 사용할 때까지 ≤ -60℃에서 저장하였다.

바이러스

가성광견병 바이러스 (PRV; 헤르페스비리다에 과; 외피보유; dsDNA; Ø = 120 - 200 nm)를 큰 외피보유 DNA 바이러스의 모델로서 사용하였다.

인간 면역결핍 바이러스 (HIV; 레트로비리다에 과; 외피보유; ssRNA; Ø = 80 - 100 nm)를 HIV-2와 같은 다른 지질-외피보유 RNA (리보핵산) 바이러스의 모델, 및 해당 표적 바이러스로서 사용하였다.

표 1: 실험에서 사용된 바이러스 스톡

바이러스 스톡을 사용 전 특징분석하였다. 이 특징분석은, 적어도 10회의 독립적인 적정과 양성 대조군으로서의 사용 허용 바이러스 역가 범위의 사양에 의한 바이러스 역가의 결정, 바이러스 스톡 단백질 함량의 결정, 바이러스 아이덴티티와 다른 바이러스 및 미코플라스마에 의한 오염에 대한 PCR 시험, 및 큰 바이러스 응집체의 통과를 허용하지 않는 필터로 바이러스 응집에 대한 시험을 포함하였다. 유의한 응집 없이 PCR 아이덴티티/오염 시험을 통과하는 바이러스 스톡 (즉, 바이러스 스톡과 여과된 스톡 간의 감염성 역가의 차이가 1.0 log보다 더 작음)만을 사용하였다.

트리톤 X-100 환원형 또는 트리톤 N-101 환원형 시약 믹스

S/D 성분 폴리소르베이트 80 (PS80, 크릴렛(Crillet) 4 HP, 트윈 80) 및 트리-n-부틸-포스페이트 (TnBP)를 각 세제 (즉, 트리톤 X-100, 트리톤 X-100 환원형 또는 트리톤 N-101 환원형)와 하기 비 (표 2 내지 표 4 참조)로 배합하였다:

표 2: 트리톤 X-100 S/D 시약 믹스에 대한 성분들의 양

표 3: 트리톤 X-100 환원형 S/D 시약 믹스에 대한 성분들의 양

표 4: 트리톤 N-101 환원형 S/D 시약 믹스에 대한 성분들의 양

각각의 혼합물을 적어도 15분 동안 교반하였다. S/D 시약 믹스를 1년 이내에 사용을 위해 실온에서 저장하였다. 사용 전 각 S/D 시약 믹스를 균질성이 보장되도록 다시 적어도 15분 동안 교반하였다.

방법

S/D 처리의 바이러스 불활성화 용량 및 강건성을 바이러스 불활성화에 불리한 조건 하에 (즉, 짧은 인큐베이션 시간으로 비교적 저온에서) 평가하였다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명한 바와 같이, 생물제약 생산과 같은 상업적 생산 공정에서는 더 긴 인큐베이션 시간 및 더 높은 온도가 사용될 수 있으며, 이는 바이러스 불활성화 속도를 가속화할 것이며 또한 달성 LRV를 증가시킬 수 있다. 추가로, 상기에 이미 언급된 바와 같이, 저 농도의 S/D 성분들이 사용될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명한 바와 같이, 생물제약 생산과 같은 상업적 생산 공정에서는 더 높은 농도의 S/D 성분들이 사용될 수 있으며, 이는 바이러스 불활성화 속도를 가속화할 것이며 또한 달성 LRV를 증가시킬 수 있다.

단백질 농도는 S/D 처리 동안 바이러스 불활성화에 대해 유의한 영향을 미치지 않기 때문에 (또한 문헌 [Dichtelmueller et al., 2009] 참조), 단백질 함량에 관련된 강건성은 조사하지 않았다.

IVIG-함유 액체를 해동시키고, 모든 추가의 단계는 생물안전 등급 II 캐비넷에서 실시하였다. IVIG-함유 액체는, 인큐베이션을 위해 저온유지장치에 연결된 이중벽 용기를 사용하여 +17℃ ± 1℃의 온도에서 교반 하에 인큐베이션하였다. 이어서, IVIG-함유 액체를, 0.9 bar (한도: 0.5 bar - 1.5 bar)의 표적 압력에서 가압 질소를 사용하여 사르토리우스(Sartorius) (SM16249) 스테인레스강 필터 홀더에 연결된 25 cm²의 유효 필터 면적을 갖는 0.2 μm의 심층 필터 (제타 플러스(Zeta Plus)® VR06, 쿠노(Cuno)/3M 또는 등가물)를 통해 여과시켰다. 컨디셔닝을 위해, 필터 재료를 액체의 여과 전 55 l/m²의 하이플로 슈퍼셀(Hyflo Supercel) 현탁액 (1 L당 5.0 g ± 0.05 g의 하이플로 슈퍼셀; 3 M NaCl을 사용하여 3.5 mS/cm (명시 범위: 2.5 - 6.0 mS/cm)로 전도도 조절됨)으로 예비코팅하였다 (≤ 0.5 bar의 압력에서). 여과 동안 필터 홀더를 냉각시키고, 여액을 저온유지장치에 연결된 이중벽 용기를 사용하여 ≤ 18℃의 표적 온도에서 수집하였다. 여액용 용기를 냉각시켰다. 필터가 막히는 경우, 잔류 액체에 대한 여과를 계속하기 위해 새로운 사전-컨디셔닝된 필터를 사용하였다. 여과 후, 온도 (표적: ≤18℃) 및 부피를 측정하였다.

IVIG-함유 액체의 부피를 측정한 후, 이를 교반 하에 저온 (+2℃ 내지 +8℃) 희석 버퍼 (표적 전도도가 3.5 mS/cm (범위: 2.5 mS/cm - 6.0 mS/cm)인 NaCl 용액)를 사용하여 28.9 AU_280-320/cm (범위: 14.5 - 72.3 AU_280-320/cm)의 계산치 표적 흡광도로 조절하였다. 이후의 1:31 바이러스 스파이크를 고려하여, 이는 여과 후 S/D 시약과 함께 인큐베이션에 대해 28 AU_280-320/cm (범위: 14 - 70 AU_280-320/cm)의 계산치 표적 흡광도 값을 초래하였다.

여과 및 단백질 조절된 IVIG-함유 액체를 다시, 교반 하에, 저온유지장치에 연결된 이중벽 용기를 사용하여 +17℃ ± 1℃로 조절하였다. 이 온도 범위는 여과된 IVIG-함유 액체를 S/D 시약과 함께 인큐베이션하는 것이 완료될 때까지 교반 하에 유지시켰고, 연속적으로 기록하였다. 무부하 중량이 결정된 스크류-캡 플라스크로 옮겨진 결정된 부피의 여과된 IVIG-함유 액체를 바이러스로 1:31의 비로 스파이킹하였다 (예를 들어, IVIG를 포함하는 액체 30 mL를 바이러스 스톡 용액 1 mL로 스파이킹함). 스파이킹된 IVIG-함유 액체를 17℃ ± 1℃에서 계속 교반 하에 추가로 인큐베이션하였다. 스파이킹 후 1 - 2분 이내에, 바이러스 적정을 위한 샘플 (0.5 mL의 스파이크 대조군 SC 및 2 mL의 홀드 대조군 HC)을 취하였다.

인출 후, 홀드 대조군 (HC)을, S/D 시약의 첨가 후에 스파이킹된 공정 재료와 동일한 온도, 즉, +17℃ ± 1℃로 유지시켰다 (즉, S/D 처리가 완료될 때까지 IVIG-함유 액체가 있는 용기와 동일한 냉각 순환으로 저장하였음). 냉각 액체의 온도를 홀드 대조군 샘플의 삽입 전에 결정하였고, 또한 홀드 대조군이 S/D 처리 후 적정을 위해 제거되기 직전에 다시 결정하였다.

S/D 시약 믹스의 첨가량을 계산하기 위해, 스파이킹된 IVIG-함유 액체의 중량을 결정하였다. 칭량된 재료는, 필요한 경우, 교반 하에 +17℃ ± 1℃로 재조절되었다. 각 S/D 시약 믹스를 IVIG-함유 액체에 첨가하여 최종 농도 0.05%의 각 폴리옥시에틸렌 에테르 세제를 얻었다. S/D 시약 믹스를 교반 하에 시린지를 사용하여 1분 이내에 첨가하였고, S/D 시약 믹스의 실제 첨가량을 시린지의 역-칭량에 의해 결정하였다. 스파이킹된 IVIG-함유 액체를 계속 교반 하에 +17℃ ± 1℃에서 59 ± 1분 동안 S/D 시약과 함께 추가로 인큐베이션하였다. 인큐베이션 동안, 1 - 2분, 10 ± 1분, 30 ± 1분 및 59 ± 1분 후에 바이러스 적정을 위한 샘플 1 mL를 취하였다. 샘플 인출 후 S/D 시약에 의한 바이러스의 추가 불활성화를 막기 위해, 샘플을 즉시 저온 (+2℃ 내지 +8℃) 세포 배양 배지로 1:20 희석하였다 (즉, 샘플 1 부피 플러스 세포 배양 배지 19 부피).

샘플을 적정하기 위해, 샘플의 순차적 0.5 log 희석물을 적절한 조직 배양 배지에서 제조하고, 각각의 희석물 100 μL를 각 지표 세포주로 시딩된 미량역가 플레이트의 각각의 8개의 웰에 첨가하였다. 세포를 36.0℃ (설정치)에서 7일 동안 인큐베이션한 후, 현미경으로 육안 점검에 의해 세포병변 효과를 평가하였다. 중간 조직 배양 감염 용량 (TCID₅₀)을 푸아송(Poisson) 분포에 따라 계산하였고, log₁₀[TCID₅₀/mL]로 나타내었다.

바이러스 클리어런스 용량의 계산을 하기 식에 따라 수행하였다:

여기서,

R = 바이러스 감소 인자

V₁ = 출발 재료의 부피 [mL]

T₁ = 출발 재료 중의 바이러스의 농도 [TCID₅₀/mL]

V₂ = 바이러스 불활성화 후 재료의 부피 [mL]

T₂ = 바이러스 불활성화 후 바이러스의 농도 [TCID₅₀/mL])

처리 전후에 각각의 스파이킹된 샘플의 부피 및 역가를 사용하여 R을 계산하였다. 바이러스가 검출되지 않으면, 검출 한계를 계산을 위한 바이러스 역가로서 간주하였다.

결과

IVIG-함유 액체의 S/D 처리를 트리톤 X-100 환원형과 PS80과 TnBP의 혼합물, 또는 트리톤 N-101 환원형과 PS80과 TnBP의 혼합물을 사용하여 수행한 경우, HIV는 10분 이내에 적어도 4의 바이러스 감소 인자 (RF)로 불활성화되었다 (도 1A). 반복 실험에서 유사한 결과가 수득되었다 (도 1B).

부가적인 실험에서, IVIG-함유 액체의 S/D 처리를 트리톤 X-100 환원형과 PS80과 TnBP의 혼합물, 또는 트리톤 N-101 환원형과 PS80과 TnBP의 혼합물을 사용하여 수행한 경우, PRV는 10분 이내에 약 4의 RF로 불활성화되었다 (도 2A). 반복 실험에서 유사한 결과가 수득되었다 (도 2B).

이들 실험으로부터, 생물제약 약물-함유 액체의 S/D 처리에 있어서 트리톤 X-100을 트리톤 X-100 환원형 또는 트리톤 N-101 환원형으로 교체하면, 저 농도의 세제로도 지질-외피보유 바이러스의 효율적인 불활성화가 초래되는 것으로 나타났다.

실시예 2: 정맥내 이뮤노글로불린을 포함하는 액체 중의 브리즈 C10을 사용한 HIV, PRV 및 BVDV 불활성화

재료 및 방법

실험은 상기 실시예 1에 대해 기재된 바와 같이 수행하였다. 그러나, S/D 처리에 있어서, 브리즈 C10을 포함하는 S/D 혼합물을 시험하였고, 트리톤 X-100을 포함하는 S/D 혼합물과 비교하였다. 트리톤 X-100을 포함하는 S/D 혼합물의 조성물은 상기 실시예 1에 대해 기재된 바와 같이 제조하였다. 브리즈 C10을 포함하는 S/D 혼합물의 조성물은 다음과 같이 제조하였다.

S/D 성분 폴리소르베이트 80 (PS80, 크릴렛 4 HP, 트윈 80) 및 트리-n-부틸-포스페이트 (TnBP)를 세제 브리즈 C10과 하기 비 (표 5 참조)로 배합하였다:

표 5: 브리즈 C10 S/D 시약 믹스에 대한 성분들의 양.

혼합물을 적어도 15분 동안 교반하였다. S/D 시약 믹스를 1년 이내에 사용을 위해 실온에서 저장하였다. 사용 전 S/D 시약 믹스를 균질성이 보장되도록 다시 적어도 15분 동안 교반하였다.

각 S/D 시약 믹스를 IVIG-함유 액체에 첨가하여 최종 농도 0.05%의 각 폴리옥시에틸렌 에테르 세제를 얻었다.

부가적으로, 또한 바이러스 BVDV의 불활성화를 시험하였다:

표 6: 실험에서 사용된 바이러스 스톡.

결과

IVIG-함유 액체의 S/D 처리를 브리즈 C10과 PS80과 TnBP의 혼합물을 사용하여 수행한 경우, HIV는 10분 이내에 4 초과의 바이러스 감소 인자 (RF)로 불활성화되었다 (도 3A). 반복 실험에서 유사한 결과가 수득되었다 (도 3B).

부가적인 실험에서, IVIG-함유 액체의 S/D 처리를 브리즈 C10과 PS80과 TnBP의 혼합물을 사용하여 수행한 경우, PRV는 10분 이내에 약 4의 RF로 불활성화되었다 (도 4A). 반복 실험에서 유사한 결과가 수득되었다 (도 4B).

부가적인 실험에서, IVIG-함유 액체의 S/D 처리를 브리즈 C10과 PS80과 TnBP의 혼합물을 사용하여 수행한 경우, BVDV는 10분 이내에 약 5의 RF로 불활성화되었다 (도 5A). 반복 실험에서 유사한 결과가 수득되었다 (도 5B).

이들 실험으로부터, 생물제약 약물-함유 액체의 S/D 처리에 있어서 트리톤 X-100을 브리즈 C10으로 교체하면, 저 농도의 세제로도 지질-외피보유 바이러스의 효율적인 불활성화가 초래되는 것으로 나타났다.

실시예 3: 인간 혈청 알부민을 포함하는 액체 중의 브리즈 C10을 사용한 X-MuLV 및 BVDV 불활성화 불활성화

생물제약 약물의 모델 단백질로서 인간 혈청 알부민 (HSA)을 포함하는 액체 중의 지질-외피보유 바이러스 친이종 뮤린 백혈병 바이러스 (X-MuLV) 및 소 바이러스성 설사 바이러스 (BVDV)를 불활성화시키기 위한 S/D 처리에 있어서 브리즈 C10의 적합성을 시험하였고, 트리톤 X-100과 비교하였다. 이를 위해, HSA를 포함하는 액체에 바이러스를 첨가하였다. 이어서, HSA를 포함하는 바이러스-함유 액체를, 저 농도의 브리즈 C10을 포함하는 S/D 혼합물과 함께 다양한 시간 동안 인큐베이션하고, 바이러스의 잔류 감염성을 결정하였다. 브리즈 C10은 바이러스 비활성 속도, 즉, 시간 경과에 따른 바이러스 불활성화의 효율 (RF로 나타냄)을 평가할 수 있도록 저 농도로 사용되었다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명한 바와 같이, 생물제약 생산과 같은 상업적 생산 공정에서는 브리즈 C10이 유의하게 더 높은 농도로 사용될 수 있으며, 이는 바이러스 불활성화 속도를 가속화할 것이며 또한 달성 RF를 증가시킬 수 있다.

재료

HSA를 포함하는 액체

인간 혈청 알부민 (HSA)-함유 액체를 생물제약 약물-함유 액체의 모델로서 사용하였다.

바이러스

친이종 뮤린 백혈병 바이러스 (X-MuLV; 레트로비리다에 과; 외피보유 ssRNA 바이러스; Ø = 80 - 110 nm)를 내인성 레트로바이러스 입자 및 외피보유 RNA 바이러스의 모델로서 사용하였다. 부가적으로, BVDV를 사용하였다.

표 7: 실험에서 사용된 바이러스 스톡.

브리즈 C10 시약 믹스

S/D 성분 폴리소르베이트 80 (PS80, 크릴렛 4 HP, 트윈 80) 및 트리-n-부틸-포스페이트 (TnBP)를 각 세제 (즉, 트리톤 X-100 또는 브리즈 C10)와 하기 비 (표 8 내지 표 9 참조)로 배합하였다:

표 8: 트리톤 X-100 S/D 시약 믹스에 대한 성분들의 양

표 9: 브리즈 C10 S/D 시약 믹스에 대한 성분들의 양

방법

S/D 처리의 바이러스 불활성화 용량 및 강건성을 바이러스 불활성화에 불리한 조건 하에 (즉, 짧은 인큐베이션 시간으로 비교적 저온에서) 평가하였다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명한 바와 같이, 생물제약 생산과 같은 상업적 생산 공정에서는 더 긴 인큐베이션 시간 및 더 높은 온도가 사용될 수 있으며, 이는 바이러스 불활성화 속도를 가속화할 것이며 또한 달성 LRV를 증가시킬 수 있다. 추가로, 상기에 이미 언급된 바와 같이, 저 농도의 S/D 성분들이 사용될 수 있었다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명한 바와 같이, 생물제약 생산과 같은 상업적 생산 공정에서는 더 높은 농도의 S/D 성분들이 사용될 수 있으며, 이는 바이러스 불활성화 속도를 가속화할 것이며 또한 달성 LRV를 증가시킬 수 있다.

모든 하기 단계는 생물안전 등급 II 캐비넷에서 실시하였다. 출발 재료는, 인큐베이션을 위해 저온유지장치에 연결된 이중벽 용기를 사용하여 +1℃ ± 1℃의 온도에서 교반 하에 인큐베이션하였다. 이어서, HSA-함유 액체를 0.2 μm의 PVDF 막 시린지 필터 (친수성 PVDF 필터, 밀리팩(Millipak) 60 또는 등가물)를 통해 여과시켰다. 여과 후, 온도 및 부피를 측정하였다.

여과된 HSA-함유 액체를 다시, 교반 하에, 저온유지장치에 연결된 이중벽 용기를 사용하여 +1℃ ± 1℃로 조절하였다. 이 온도 범위는 여과된 HSA-함유 액체를 S/D 시약과 함께 인큐베이션하는 것이 완료될 때까지 교반 하에 유지시켰고, 연속적으로 기록하였다. 무부하 중량이 결정된 스크류-캡 플라스크로 옮겨진 결정된 부피의 여과된 HSA-함유 액체를 1:31의 비로 스파이킹하였다 (예를 들어, HSA-함유 액체 48 mL를 바이러스 스톡 용액 1.6 mL로 스파이킹함). 스파이킹된 HSA-함유 액체를 1℃ ± 1℃에서 계속 교반 하에 추가로 인큐베이션하였다. 스파이킹 후 1 - 2분 이내에, 바이러스 적정을 위한 샘플 (0.5 mL의 스파이크 대조군 SC 및 2 mL의 홀드 대조군 HC)을 취하였다.

인출 후, 홀드 대조군 (HC)을 S/D 시약의 첨가 후에 스파이킹된 HSA-함유 액체와 동일한 온도, 즉, +1℃ ± 1℃로 유지시켰다 (즉, S/D 처리가 완료될 때까지 HSA-함유 액체가 있는 용기와 동일한 냉각 순환으로 저장하였음). 냉각 액체의 온도를 홀드 대조군 샘플의 삽입 전에 결정하였고, 또한 홀드 대조군이 S/D 처리 후 적정을 위해 제거되기 직전에 다시 결정하였다.

S/D 시약 믹스의 첨가량을 계산하기 위해, 스파이킹된 HSA-함유 액체의 중량을 결정하였다. 칭량된 재료는, 필요한 경우, 교반 하에 +1℃ ± 1℃로 재조절되었다. 각 S/D 시약 믹스를 HSA-함유 액체에 첨가하여 최종 농도 0.08% 내지 0.1% (w/w)의 각 폴리옥시에틸렌 에테르 세제를 얻었다. S/D 시약 믹스를 교반 하에 시린지를 사용하여 1분 이내에 첨가하였고, S/D 시약 믹스의 실제 첨가량을 시린지의 역-칭량에 의해 결정하였다. 스파이킹된 HSA-함유 액체를 계속 교반 하에 +1℃ ± 1℃에서 59 ± 1분 동안 S/D 시약과 함께 추가로 인큐베이션하였다. 인큐베이션 동안, 1 - 2분, 10 ± 1분, 30 ± 1분 및 59 ± 1분 후에 바이러스 적정을 위한 샘플 1 mL를 취하였다. 샘플 인출 후 S/D 시약에 의한 바이러스의 추가 불활성화를 막기 위해, 샘플을 즉시 저온 (+2℃ 내지 +8℃) 세포 배양 배지로 1:20 희석하였다 (즉, 샘플 1 부피 플러스 세포 배양 배지 19 부피).

샘플의 적정 및 바이러스 클리어런스 용량의 계산을 상기 실시예 1에 대해 기재된 바와 같이 수행하였다.

결과

HSA-함유 액체의 S/D 처리를 1℃ ± 1℃에서 브리즈 C10과 PS80과 TnBP의 혼합물을 사용하여 수행한 경우, X-MuLV는 60분 이내에 2 초과의 바이러스 감소 인자 (RF)로 불활성화되었다 (도 6A). 반복 실험에서 유사한 결과가 수득되었다 (도 6B).

부가적인 실험에서, HSA-함유 액체의 S/D 처리를 1℃ ± 1℃에서 브리즈 C10과 PS80과 TnBP의 혼합물을 사용하여 수행한 경우, BVDV는 10분 이내에 약 4의 바이러스 감소 인자 (RF)로 불활성화되었다 (도 7A). 반복 실험에서 유사한 결과가 수득되었다 (도 7B).

부가적인 실험들은 정확히 본 실시예의 재료 및 방법 부분에 기재된 바와 같이 수행하며, 단, HSA-함유 액체의 S/D 처리를 1℃ ± 1℃ 대신에 19℃ ± 1℃에서 수행하였다. HSA-함유 액체의 S/D 처리를 19℃ ± 1℃에서 브리즈 C10과 PS80과 TnBP의 혼합물 (브리즈 C10)을 사용하여 수행한 경우, X-MuLV는 10분 이내에 3 초과의 바이러스 감소 인자 (RF)로 불활성화되었다 (도 8A). 반복 실험에서 유사한 결과가 수득되었다 (도 8B).

이들 실험으로부터, 생물제약 약물-함유 액체의 S/D 처리에 있어서 트리톤 X-100을 브리즈 C10으로 교체하면, 실온에서 또는 그 부근에서 그리고 1℃ ± 1℃ 정도로 낮은 온도에서 저 농도의 세제로도 지질-외피보유 바이러스의 효율적인 불활성화가 초래되는 것으로 나타났다.

실시예 4: 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트 I의 합성 (방법 1)

중간체 III의 합성:

페놀 II (170,3 g, 800 mmol)를 내부 온도계 및 교반 바가 구비된 2 L의 3구 플라스크에 넣었다. 플라스크에 무수 CH₂Cl₂ (1000 mL)를 첨가하고, 교반을 시작하였다. 출발 재료의 용해 후 용액을 0℃로 냉각시켰다. 완전 용해 후 NEt₃ (225 mL, 1.6 mol)을 10분 이내에 첨가하였다. CH₂Cl₂ (180 mL) 중의 Tf₂O (256 g, 907 mmol) 용액을 0℃에서 120분에 걸쳐 반응 혼합물에 첨가하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 수성 포화 NaHCO₃ 용액 (400 mL)을 첨가하고, 반응 혼합물을 추출하였다. 유기 상을 물 (2 x 400 mL) 및 염수 (500 mL)로 반복적으로 세척하였다. 이어서, 유기 상을 진공에서 농축시켰다. 톨루엔 (300 mL)을 잔류물에 첨가하고, 조 생성물을 농축시켜 조 흑색 액체 314 g을 얻었다. 이 잔류물을 SiO₂ 플러그의 상단에 충전하고, 석유 에테르/EtOAc (0 내지 2%)로 용리시켰다. 순수한 분획물의 농축에 의해 투명한 무색 오일 269.5 g (수율: 99.6%)을 얻었다. R_f = 0.74 (석유 에테르/EtOAc 5%).

중간체 IV의 합성:

트리플레이트 III (269 g, 795 mmol)을 무수 및 탈기된 DMF (1.3 L)에 용해시키고, Zn(CN)₂ (95.3 g, 795 mmol) 및 Pd(PPh₃)₄ (25 g, 21.5 mmol)를 순차적으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 3시간 동안 80℃로 가온한 후, 진공 하에 DMF를 제거하였다. 톨루엔 (300 mL)을 잔류물에 첨가하고, 조 생성물을 농축시켜 흑색 잔류물 432 g을 얻었다. 이 조 생성물을 SiO₂ 플러그의 상단에 충전하고, 석유 에테르/EtOAc (0 내지 10%)로 용리시켰다. 순수한 분획물의 농축에 의해 투명한 무색 오일 128.1 g (수율: 74.8%)을 얻었다. R_f = 0.23 (석유 에테르/EtOAc 2%).

중간체 V의 합성:

니트릴 IV (127.6 g, 592.5 mmol)를 MeOH (500 mL)에 용해시키고, 4 M NaOH 수용액 (750 mL)을 첨가하고, 혼합물을 환류시키고, 이 온도 (80℃)를 밤새 유지시켰다. 가온된 혼합물에 추가의 10 M NaOH 수용액 (150 mL)을 첨가하고, 용액을 20시간 동안 더 가열하였다. 주위 온도로 냉각시킨 후, 반응 용기의 내용물을 큰 비이커로 옮기고, 얼음조에서 냉각시켰다. 4 M HCl 수용액 (1.1 L)을 30분 이내에 첨가하였고, 이 시점에 pH는 pH 종이에 의해 나타난 바와 같이 산성이었으며, 백색 고체가 침전되었다. 침전물을 여과하였고, 물 (500 mL)로 헹궜다. 습윤 케이크를 2 L 플라스크로 옮기고, 진공 하에 3일 동안 건조시켜 백색 분말 127.5 g (수율: 91.9%)을 얻었다. R_f = 0.42 (석유 에테르/EtOAc 2:1).

중간체 VI의 합성:

카르복실산 V (127 g, 542 mmol)를 건조시킨 mTHF (1.2 L)에 현탁시키고, -10℃로 냉각시켰다. THF 중의 LiAlH₄의 용액(1 M, 575 mL, 575 mmol)을 60분에 걸쳐 첨가한 다음, 반응물을 주위 온도로 서서히 가온하고, 밤새 추가로 교반하였다. 반응 용기의 내용물을 큰 비이커로 옮기고, 과량의 하이드라이드를 얼음 (15 g)으로 조심스럽게 켄칭하였다. 3 M HCl 수용액 (500 mL)을 20분 이내에 첨가하였고, 이 시점에 pH는 pH 종이에 의해 나타난 바와 같이 산성이었다. EtOAc (300 mL)를 조 혼합물에 첨가하였고, 2개의 상을 격렬히 교반하였다. 수성 상을 EtOAc (300 mL 및 500 mL)로 2회 역추출하였다. 합한 유기 상을 포화 NaHCO₃ 수용액 (300 mL), 물 (300 mL) 및 염수 (500 mL)로 연속적으로 세척하였다. 이어서, 유기 상을 진공에서 농축시켰다. 톨루엔 (300 mL)을 잔류물에 첨가하고, 조 생성물을 농축시켜 투명 노르스름한 오일 123.3 g을 얻었다. 이 잔류물을 SiO₂ 플러그의 상단에 충전하고, 석유 에테르/EtOAc (0 내지 15%)로 용리시켰다. 순수한 분획물의 농축에 의해 무정형 백색 고체 85.3 g (수율: 71.4%)을 얻었다. R_f = 0.37 (석유 에테르/EtOAc 4:1).

중간체 VII의 합성:

벤질 알콜 VI (84.8 g, 385 mmol)을 무수 CH₂Cl₂ (1 L)에 용해시키고, 얼음/물 조에서 냉각시켰다. NEt₃ (110 mL, 770 mmol)을 첨가한 후, 무수 CH₂Cl₂ (25 mL) 중의 MsCl의 용액 (45 mL, 577 mmol)을 60분에 걸쳐 서서히 첨가하였다. 반응물을 주위 온도로 서서히 가온하고, 밤새 추가로 교반하였다. 포화 NaHCO₃ 수용액 (420 mL)을 첨가하고, 반응 혼합물을 격렬히 교반하였다. 유기 상을 물 (2 x 500 mL) 및 염수 (300 mL)로 반복적으로 세척하였다. 이어서, 유기 상을 진공에서 농축시켰다. 톨루엔 (200 mL) 및 CH₂Cl₂ (100 mL)를 잔류물에 첨가하고, 조 생성물을 농축시켜 오렌지색 반고체 90 g (수율: 78.4%)을 얻었다. R_f = 0.71 (석유 에테르/EtOAc 4:1).

I의 합성:

PEG400 (360 g, 900 mmol)을 무수 THF (1 L)에 용해시키고, tBuOK (90 g, 802 mmol)를 주위 온도에서 15분에 걸쳐 나누어 첨가하고, 혼합물을 주위 온도에서 60분 교반하고, 얼음조에서 냉각시켰다. 그 동안에, 메실레이트 VII (89.5 g, 300 mmol)을 THF (300 mL)에 현탁시키고, 우윳빛 오렌지색 용액을 냉각시킨 탈양성자화된 PEG400 용액에 20분에 걸쳐 첨가하였다. 반응물을 주위 온도로 서서히 가온하고, 밤새 추가로 교반하였다. 1 M HCl 수용액 (820 mL)을 얼음 (500 g)과 함께 첨가하였다. 진공 하에 THF를 제거하고, EtOAc (1 L)를 첨가하였다. 상들을 교반하고, 유기 상을 물 (2 x 500 mL)로 연속적으로 세척하였다. 각각의 수성 상을 EtOAc (300 mL)로 역추출하였다. 합한 유기 상을 물 (500 ml)로 세척하고, 진공에서 농축시켰다. 톨루엔 (250 mL)을 잔류물에 첨가하고, 조 생성물을 농축시켜 투명 노르스름한 오일 125.2 g을 얻었다. 이 잔류물을 SiO₂ 플러그의 상단에 충전하고, CH₂Cl₂/MeOH (0 내지 8%)로 용리시켰다. 순수한 분획물의 농축에 의해 담갈색 투명 오일 107.5 g (수율: 59.5%)을 얻었다. R_f = 0.37-0.22 (CH₂Cl₂/MeOH 20:1). MS (ESI): m/z =[M+H]⁺= 573.5, 617.5 (100%), 661.6; [M+Ac]^-= 631.4, 675.4 (100%), 719.5. ¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃): δ = 7.33 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.23 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 4.52 (s, 2H), 3.72-3.58 (m, 33H), 2.54 (br s, 1H), 1.72 (s, 2H), 1.34 (s, 6H), 0.70 (s, 9H). ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl₃): δ = 149.7, 135.1, 127.4 (2C), 126.2 (2C), 73.2, 72.6, 70.7 (m), 70.5, 69.4, 61.9, 57.0, 38.6, 32.5, 31.9 (3C), 31.6 (2C).

실시예 5a: 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트 I의 합성 (방법 2)

톨루엔 (35 mL, 328 mmol) 및 진한 H₂SO₄ (10 mL)를 둥근 바닥 플라스크에서 0℃로 냉각시켰다. 톨루엔 (27 mL, 256 mmol)과 디이소부틸렌의 혼합물 (3:1의 2,4,4-트리메틸-1-펜텐 + 2,4,4-트리메틸-2-펜텐 혼합물로서, 10 mL, 64 mmol)을 반응 혼합물에 2시간에 걸쳐 서서히 첨가하였다. 반응물을 0℃에서 2시간 동안 추가로 교반하였다. 물 (100 mL)을 첨가하였다. 상 분리 후 유기 상을 포화 NaHCO₃ 수용액 (100 mL)으로 세척하고, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 농축시켜 투명한 무색 오일 14 g을 얻었다. 오일을 100 mL의 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 단경로 증류 장치 (1·10^-1 mbar) 상에서 증류시켰다. 62 내지 70℃에서 증류된 분획물 (8.1 g, 수율 61.9%)을 수집하였다. R_f = 0.65 (석유 에테르 40-60 100%).

p-치환된 톨루엔 X (500 mg, 2.45 mmol)를 아세토니트릴 (ACN) (5 mL)에 용해시켰다. N-브로모숙신이미드 (NBS) (460 mg, 2.57 mmol)를 첨가하였고, 용해 후, 25 mL의 듀란(Duran) 둥근 바닥 플라스크를 할로겐 램프 (300 W)로부터 15 cm 거리에 놓았다. 60분의 조사 후 (반응 온도 = 45℃), 용매를 제거하였다. 석유 에테르 40-60 (25 mL)을 첨가하였고, 고체가 침전되었다. 액체 상을 물 (2 x 20 mL)로 세척하고, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 농축시켜 노르스름한 조 오일 540 mg (수율: 77.9%)을 얻었다. R_f = 0.43 (석유 에테르 40-60 100%).

PEG400 (2.25 g, 5.61 mmol)을 주위 온도에서 무수 THF (5 mL)에 용해시켰다. tBuOK (420 mg, 3.74 mmol)를 1분에 걸쳐 나누어 첨가하고, 혼합물을 90분 교반한 다음, 얼음/물 조에서 0℃로 냉각시켰다. 그 동안에, 벤질 브로마이드 중간체 XI (530 mg, 1.87 mmol)을 THF (2 mL)에 현탁시키고, 용액을 냉각시킨 탈양성자화된 PEG400 용액에 첨가하였다. 반응물을 주위 온도로 서서히 가온하고, 밤새 추가로 교반하였다. HCl (1 M, 20 mL)을 EtOAc (50 mL) 및 물 (20 mL)과 함께 반응 혼합물에 첨가하였다. 용액을 분별 깔때기로 옮기고, 격렬히 추출하였다. 상 분리 후 유기 상을 물 (5 x 15 mL)로 연속적으로 세척하고, 최종적으로 MgSO₄ 상에서 건조시켜 조 오일 잔류물 0.8 g을 얻었다. 이 잔류물을 SiO₂ 칼럼의 상단에 충전하고, CH₂Cl₂/MeOH (0 내지 8%)로 용리시켰다. 순수한 분획물의 농축에 의해 투명 노르스름한 오일 588 mg (수율: 52.2%)을 얻었다. R_f = 0.37-0.22 (CH₂Cl₂/MeOH 20:1).

실시예 5b: 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트 I (방법 2 변이체)의 합성

단계 1:

본 단계는 다음과 같이 수행하였다:

톨루엔 (750 mL, 7.04 mol) 및 진한 H₂SO₄ (20 mL, 0.375 mol)을 둥근 바닥 플라스크에서 0℃로 냉각시켰다. 톨루엔 (250 mL, 2.35 mol)과 디이소부틸렌의 혼합물 (3:1의 2,4,4-트리메틸-1-펜텐 + 2,4,4-트리메틸-2-펜텐 혼합물로서, 200 mL, 1.28 mol)을 반응 혼합물에 90분에 걸쳐 서서히 첨가하였다. 반응물을 0℃에서 추가로 교반하고, 밤새 주위 온도로 가온하였다. 얼음 (400 g)을 첨가하고, 혼합물을 분별 깔때기로 옮겼다. 상 분리 후 유기 상을 포화 NaHCO₃ 수용액 (300 mL) 및 물 (2 x 250 mL)로 연속적으로 세척하였다. 유기 상을 농축시켜 투명한 무색 오일 199.1 g을 얻었다. 오일을 500 mL의 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 단경로 증류 장치 (20 mbar) 상에서 증류시켰다. 138℃ 내지 161℃에서 증류된 분획물을 수집하였다 (134.1 g, 수율 51.4%). R_f = 0.65 (석유 에테르 40-60 100%). ¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃): δ = 7.28 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.10 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 2.34 (s, 3H), 1.75 (s, 2H), 1.38 (s, 6H), 0.75 (s, 9H). ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl₃): δ = 147.3, 134.7, 128.6 (2C), 126.1 (2C), 57.1, 38.4, 32.5, 31.9 (3C), 31.7 (2C), 21.0.

대안적으로, 본 단계를 다음과 같이 수행하였다:

톨루엔 (400 mL, 3.83 mol) 및 노나플루오로-1-부탄술폰산 (4 mL, 24 mmol)을 둥근 바닥 플라스크에서 주위 온도에서 교반하였다. 톨루엔 (200 mL, 1.92 mol)과 디이소부틸렌의 혼합물 (3:1의 2,4,4-트리메틸-1-펜텐 + 2,4,4-트리메틸-2-펜텐 혼합물로서, 100 mL, 0.64 mol)을 반응 혼합물에 60분에 걸쳐 서서히 첨가하였다. 반응물을 주위 온도에서 밤새 추가로 교반하였다. 포화 NaHCO₃ 수용액 (200 mL)을 첨가하고, 혼합물을 20분 동안 교반하였다. 혼합물을 분별 깔때기로 옮기고, 수성 상은 버렸다. 유기 상을 물 (3 x 300 mL)로 연속적으로 세척하였다. 유기 상을 농축시켜 투명한 무색 오일 132.5 g을 얻었다. 오일을 500 mL의 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 단경로 증류 장치 (26-16 mbar) 상에서 증류시켰다. 115℃ 내지 135℃에서 증류된 분획물을 수집하였다 (80.5 g, 수율 62%). R_f = 0.65 (석유 에테르 40-60 100%). ¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃): δ = 7.28 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.10 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 2.34 (s, 3H), 1.75 (s, 2H), 1.38 (s, 6H), 0.75 (s, 9H). ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl₃): δ = 147.3, 134.7, 128.6 (2C), 126.1 (2C), 57.1, 38.4, 32.5, 31.9 (3C), 31.7 (2C), 21.0.

단계 2:

본 단계는 다음과 같이 수행하였다:

p-치환된 톨루엔 X (63.6 g, 311 mmol)를 아세토니트릴 (ACN) (650 mL)에 용해시켰다. N-브로모숙신이미드 (NBS) (58.2 g, 327 mmol)를 첨가하였고, 용해 후, 교반 (350 rpm)하면서 2 L의 듀란 둥근 바닥 플라스크를 할로겐 램프 (300 W)로부터 5-25 cm 거리에 놓았다. 6시간의 조사 후 (반응 온도 = 최대 46℃), 용매를 진공 하에 제거하였다. 석유 에테르 40-60 (450 mL)를 첨가하였고, 진한 고체가 침전되었다. 액체 상을 농축시켜 암갈색 잔류물 (75 g)를 얻었다. 이 잔류물을 SiO₂ 플러그의 상단에 충전하고, 석유 에테르 40-60 (100%)으로 용리시켰다. 순수한 분획물의 농축에 의해 오렌지색 투명 오일 43.8 g (수율: 49.7%)을 얻었다. R_f = 0.43 (석유 에테르 40-60 100%). ¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃): δ = 7.34 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.30 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.50 (s, 2H), 1.74 (s, 2H), 1.36 (s, 6H), 0.72 (s, 9H). ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl₃): δ = 150.9, 134.8, 128.6 (2C), 126.7 (2C), 57.0, 38.7, 33.9, 32.5, 31.9 (3C), 31.6 (2C).

대안적으로, 본 단계를 다음과 같이 수행하였다:

p-치환된 톨루엔 X (85.2 g, 417 mmol)를 트리플루오로톨루엔 (830 mL)에 용해시켰다. 기타 용매 예컨대 에스테르 또는 알칸 (EtOAc 및 헥산)이 또한 이용가능하다. 교반 (450 rpm)하면서 AIBN (아조비스(이소부티로니트릴)) (3.4 g, 21 mmol)과 함께 N-브로모숙신이미드 (NBS) (74.2 g, 417 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 5시간 동안 80℃로 가열하였다. 진공 하에 용매를 제거하였다. 석유 에테르 40-60 (350 mL)을 첨가하였고, 백색 고체가 침전되었다. 액체 상을 농축시켜 투명한 오렌지색 잔류물 (108 g)를 얻었다. 이 잔류물을 SiO₂ 플러그의 상단에 충전하고, 석유 에테르 40-60 (100%)으로 용리시켰다. 순수한 분획물의 농축에 의해 투명한 거의 무색의 오일 64.1 g (수율: 54.3%)을 얻었으며, 이는 결정화되어, 고순도의 생성물을 가리키는 무색 침상체를 형성하였다. R_f = 0.43 (석유 에테르 40-60 100%). ¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃): δ = 7.34 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.30 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.50 (s, 2H), 1.74 (s, 2H), 1.36 (s, 6H), 0.72 (s, 9H). ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl₃): δ = 150.9, 134.8, 128.6 (2C), 126.7 (2C), 57.0, 38.7, 33.9, 32.5, 31.9 (3C), 31.6 (2C). 라디칼 개시제로서 AIBN (아조비스(이소부티로니트릴))의 사용은 본 반응 단계에서 수득되는 생성물의 고순도에 기여하는 것으로 예상된다.

단계 3:

본 단계는 다음과 같이 수행하였다:

PEG400 (184.1 g, 460 mmol)을 주위 온도에서 무수 THF (550 mL)에 용해시켰다. tBuOK (27.2 g, 245 mmol)를 15분에 걸쳐 나누어 첨가하고, 혼합물을 90분 교반하였다. 그 동안에, 벤질 브로마이드 중간체 XI (43.5 g, 153 mmol)을 THF (300 mL)에 현탁시키고, 용액을 냉각시킨 탈양성자화된 PEG400 용액에 첨가하였다. 반응물을 주위 온도에서 밤새 교반하였다. HCl (1 M, 270 mL)을 반응 혼합물에 첨가하였다. 휘발물질을 제거하고, EtOAc (600 mL)를 첨가하였다. 용액을 분별 깔때기로 옮기고, 격렬히 추출하였다. 상 분리 후 수성 상을 EtOAc (300 mL)로 추가로 추출하였다. 합한 유기 상을 물/염수 (1:1, 3 x 300 mL)로 연속적으로 세척하고, 최종적으로 농축시켜 오렌지색 조 오일 잔류물 90.4 g을 얻었다. 이 잔류물을 SiO₂ 칼럼의 상단에 충전하고, CH₂Cl₂/MeOH (0 내지 8%)로 용리시켰다. 순수한 분획물의 농축에 의해 투명한 담갈색 오일 82.2 g (수율: 89.0%)을 얻었다. R_f = 0.37-0.22 (CH₂Cl₂/MeOH 20:1). MS (ESI): m/z =[M+H]⁺= 573.5, 617.5 (100%), 661.6; [M+Ac]^-= 631.4, 675.4 (100%), 719.5. ¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃): δ = 7.33 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.23 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 4.52 (s, 2H), 3.72-3.58 (m, 33H), 2.54 (br s, 1H), 1.72 (s, 2H), 1.34 (s, 6H), 0.70 (s, 9H). ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl₃): δ = 149.7, 135.1, 127.4 (2C), 126.2 (2C), 73.2, 72.6, 70.7 (m), 70.5, 69.4, 61.9, 57.0, 38.6, 32.5, 31.9 (3C), 31.6 (2C).

대안적으로, 본 단계를 다음과 같이 수행하였다:

PEG400 (475 g, 1.19 mol)을 주위 온도에서 TBME (메틸-tert-부틸에테르) (1.0 L)에 용해시켰다. tBuOK (43.2 g, 385 mmol)를 20분에 걸쳐 나누어 첨가하고, 혼합물을 90분 교반하였다. 그 동안에, 벤질 브로마이드 중간체 XI (84 g, 297 mmol)을 TBME (250 mL)에 현탁시키고, 용액을 주위 온도에서 탈양성자화된 PEG400 용액에 첨가하였다. 반응물을 주위 온도에서 3시간 교반하였다. 얼음 (200 g) 및 HCl (1 M, 400 mL)을 반응 혼합물에 첨가하였다. 용액을 분별 깔때기로 옮기고, EtOAc (1 L) 및 물 (500 mL)을 첨가하고, 격렬히 추출하였다. 상 분리 후 유기 상을 물/염수 (1:1, 3 x 500 mL)로 연속적으로 세척하고, 최종적으로 농축시켜 오렌지색 조 오일 잔류물 165 g을 얻었다. 이 잔류물을 SiO₂ 칼럼의 상단에 충전하고, CH₂Cl₂/MeOH (0 내지 10%)로 용리시켰다. 순수한 분획물의 농축에 의해 투명한 담갈색 오일 151.7 g (수율: 84.9%)을 얻었다. R_f = 0.37-0.22 (CH₂Cl₂/MeOH 20:1). MS (ESI): m/z =[M+H]⁺= 573.5, 617.5 (100%), 661.6; [M+Ac]^-= 631.4, 675.4 (100%), 719.5. ¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃): δ = 7.33 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.23 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 4.52 (s, 2H), 3.72-3.58 (m, 33H), 2.54 (br s, 1H), 1.72 (s, 2H), 1.34 (s, 6H), 0.70 (s, 9H). ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl₃): δ = 149.7, 135.1, 127.4 (2C), 126.2 (2C), 73.2, 72.6, 70.7 (m), 70.5, 69.4, 61.9, 57.0, 38.6, 32.5, 31.9 (3C), 31.6 (2C). 용매로서 TBME (메틸-tert-부틸에테르)의 사용, 3시간의 적당한 반응 시간 (반응 부산물을 최소화할 것으로 예상됨), 보다 큰 제조 규모, 및 출발 재료 (즉, 벤질 브로마이드 중간체 XI)의 순도는 모두 본 반응 단계에서 관찰된 고수율에 기여하는 것으로 예상된다.

실시예 6: 정맥내 이뮤노글로불린을 포함하는 액체 중의 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트를 사용한 PRV 불활성화

재료 및 방법

실험은 상기 실시예 1에 대해 기재된 바와 같이 수행하였다. 그러나, S/D 처리에 있어서, 실시예 5a에서 생성된 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트를 포함하는 S/D 혼합물을 시험하였고, 트리톤 X-100을 포함하는 S/D 혼합물과 비교하였다. 트리톤 X-100을 포함하는 S/D 혼합물의 조성물은 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트를 포함하는 S/D 혼합물의 조성물은 다음과 같이 제조하였다.

S/D 성분 폴리소르베이트 80 (PS80, 크릴렛 4 HP, 트윈 80) 및 트리-n-부틸-포스페이트 (TnBP)를 실시예 5a에서 생성된 세제 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트와 하기 비 (표 10 참조)로 배합하였다:

표 10: 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트 ("4-TOBAPE"로 약칭됨) S/D 시약 믹스에 대한 성분들의 양

각 S/D 시약 믹스를 IVIG-함유 액체에 첨가하여 최종 농도 0.05% w/w의 각 폴리옥시에틸렌 에테르 세제를 얻었다.

바이러스 PRV의 불활성화만을 시험하였다.

결과

IVIG-함유 액체의 S/D 처리를 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트와 PS80과 TnBP의 혼합물을 사용하여 수행한 경우, PRV는 1-2분 이내에 약 4의 바이러스 감소 인자 (RF)로 불활성화되었다 (도 9A). 반복 실험에서 유사한 결과가 수득되었다 (도 9B).

이들 실험으로부터, 생물제약 약물-함유 액체의 S/D 처리에 있어서 트리톤 X-100을 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트로 교체하면, 저 농도의 세제로도 지질-외피보유 바이러스의 효율적인 불활성화가 초래되는 것으로 나타났다.

실시예 7: 인간 혈청 알부민을 포함하는 액체 중의 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트를 사용한 X-MuLV 불활성화

재료 및 방법

실험은 상기 실시예 3에 대해 기재된 바와 같이 수행하였다. 그러나, S/D 처리에 있어서, 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트 포함하는 S/D 혼합물을 시험하였고, 트리톤 X-100을 포함하는 S/D 혼합물과 비교하였다. 트리톤 X-100을 포함하는 S/D 혼합물의 조성물은 상기 실시예 3에서 기재된 바와 같이 제조하였다. 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트를 포함하는 S/D 혼합물의 조성물은 다음과 같이 제조하였다.

S/D 성분 폴리소르베이트 80 (PS80, 크릴렛 4 HP, 트윈 80) 및 트리-n-부틸-포스페이트 (TnBP)를 세제 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트와 하기 비 (표 11 참조)로 배합하였다:

표 11: 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트 ("4-TOBAPE"로 약칭됨) S/D 시약 믹스에 대한 성분들의 양

각 S/D 시약 믹스를 HSA-함유 액체에 첨가하여 최종 농도 0.1%의 각 폴리옥시에틸렌 에테르 세제를 얻었다.

바이러스 X-MuLV의 불활성화만을 시험하였다.

결과

HSA-함유 액체의 S/D 처리를 1℃ ± 1℃에서 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트와 PS80과 TnBP의 혼합물을 사용하여 수행한 경우, X-MuLV는 10분 이내에 2 초과의 바이러스 감소 인자 (RF)로 불활성화되었다 (도 10A). 반복 실험에서 유사한 결과가 수득되었다 (도 10B).

부가적인 실험들은 정확히 본 실시예의 재료 및 방법 부분에 기재된 바와 같이 수행하며, 단, HSA-함유 액체의 S/D 처리를 1℃ ± 1℃ 대신에 19℃ ± 1℃에서 수행하였다. HSA-함유 액체의 S/D 처리를 19℃ ± 1℃에서 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트와 PS80과 TnBP의 혼합물을 사용하여 수행한 경우, X-MuLV는 10분 이내에 2 초과의 바이러스 감소 인자 (RF)로 불활성화되었고 (도 11A), 30분 이내에 약 4의 RF로 불활성화되었다. 반복 실험에서 유사한 결과가 수득되었다 (도 11B).

이들 실험으로부터, 생물제약 약물-함유 액체의 S/D 처리에 있어서 트리톤 X-100을 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트로 교체하면, 실온에서 또는 그 부근에서 그리고 1℃ ± 1℃ 정도로 낮은 온도에서 저 농도의 세제로도 지질-외피보유 바이러스의 효율적인 불활성화가 초래되는 것으로 나타났다.

실시예 8: HSA-함유 버퍼 중의 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트, 트리톤 X-100 환원형 또는 브리즈 C10을 사용한 BVDV 불활성화

치료 항체의 모델 단백질로서 인간 혈청 알부민 (HSA)을 함유하는 버퍼 중의 지질-외피보유 바이러스 소 바이러스성 설사 바이러스 (BVDV)를 불활성화시키기 위한 단일-세제 처리에 있어서 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트, 트리톤 X-100 환원형 또는 브리즈 C10의 적합성을 시험하고, 트리톤 X-100과 비교하였다. 이를 위해, HSA-함유 버퍼에 저 농도의 각 세제를 첨가한 다음, 혼합물을 바이러스로 스파이킹하였다. 다양한 시간 동안 인큐베이션 후 바이러스의 잔류 감염성을 결정하였다. 각 세제는 바이러스 불활성화 속도, 즉, 시간 경과에 따른 바이러스 불활성화의 효율 (RF로 나타냄)을 평가할 수 있도록 저 농도로 사용되었다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명한 바와 같이, 생물제약 생산과 같은 상업적 생산 공정에서는 본 발명의 세제가 유의하게 더 높은 농도로 사용될 수 있으며, 이는 바이러스 불활성화 속도를 가속화할 것이며 또한 달성 RF를 증가시킬 수 있다.

재료

HSA-함유 버퍼

인간 혈청 알부민 (HSA)을 함유하는 버퍼를 치료 항체의 모델로서 사용하였다.

바이러스

표 12: 실험에서 사용된 바이러스 스톡.

세제

사용 전 각 세제, 또는 그의 1:10 희석물 (즉, 각 세제 1 g ± 2% 플러스 증류수9 g ± 2%)을 균질성이 보장되도록 적어도 15분 동안 교반하였다.

방법

단일-세제 처리의 바이러스 불활성화 용량 및 강건성을 바이러스 불활성화에 불리한 조건 하에 (즉, 짧은 인큐베이션 시간으로 비교적 저온에서) 평가하였다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명한 바와 같이, 생물제약 생산과 같은 상업적 생산 공정에서는 더 긴 인큐베이션 시간 및 더 높은 온도가 사용될 수 있으며, 이는 바이러스 불활성화 속도를 가속화할 것이며 또한 달성 LRV를 증가시킬 수 있다. 추가로, 상기에 이미 언급된 바와 같이, 저 농도의 각 세제가 사용되었다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명한 바와 같이, 생물제약 생산과 같은 상업적 생산 공정에서는 더 높은 농도의 각 세제가 사용될 수 있으며, 이는 바이러스 불활성화 속도를 가속화할 것이며 또한 달성 LRV를 증가시킬 수 있다.

단백질 농도는 바이러스 불활성화에 대해 유의한 영향을 미치지 않기 때문에 (또한 문헌 [Dichtelmueller et al., 2009] 참조), 단백질 함량에 관련된 강건성은 조사하지 않았다.

모든 하기 단계는 생물안전 등급 II 캐비넷에서 실시하였다. 출발 재료는, 인큐베이션을 위해 저온유지장치에 연결된 이중벽 용기를 사용하여 +14℃ ± 1℃의 온도에서 교반 하에 인큐베이션하였다.

HSA-함유 버퍼를, 무부하 중량이 결정된 스크류-캡 플라스크로 옮겼다. 단일 세제의 첨가량의 계산을 위해 HSA-함유 버퍼의 중량 (밀폐형 플라스크 내의)을 결정하였다. HSA-함유 버퍼 g당 세제의 필요량 ([mg]), 또는 그의 1:10 희석물의 각 양을 첨가하여 하기 최종 농도의 각 세제를 산출하였다: 0.1% ± 0.01% (w/w) 또는 0.03% ± 0.01% (w/w). 세제를 교반 하에 시린지를 사용하여 1분 이내에 첨가하였고, 실제 첨가량을 시린지의 역-칭량에 의해 결정하였다. HSA-함유 버퍼를 적어도 10분 동안 완전한 세제 첨가 후 추가로 교반하였다. 세제와 혼합된 HSA-함유 버퍼를 0.2 μm의 수포르(Supor) 시린지 막 필터 (또는 등가물)를 통해 여과시키고, 여액을 저온유지장치에 연결된 이중벽 용기를 사용하여 14℃ ± 1℃의 표적 온도에서 수집하였다. 여액용 용기를 냉각시켰다. 필터가 막히는 경우, HSA-함유 버퍼에 대한 여과를 계속하기 위해 새로운 필터를 사용하였다. 여과 후, 온도 (표적: 14℃ ± 1℃) 및 부피를 측정하였다.

각 세제를 갖는 여과된 HSA-함유 버퍼를, 교반 하에, 저온유지장치에 연결된 이중벽 용기를 사용하여 14℃ ± 1℃로 조절하였다. 이 온도 범위는 세제와 함께 HSA-함유 버퍼를 인큐베이션하는 것이 완료될 때까지 교반 하에 유지시켰고, 연속적으로 기록하였다. 세제를 갖는 HSA-함유 버퍼의 결정된 부피를 1:31의 비로 스파이킹하였다 (예를 들어, HSA-함유 버퍼 48 mL를 바이러스 스톡 용액 1.6 ml로 스파이킹함). 스파이킹된 HSA-함유 버퍼를 14℃ ± 1℃에서 59 ± 1분 동안 계속 교반 하에 추가로 인큐베이션하였다. 인큐베이션 동안, 1 - 2분, 5 ± 1분, 29 ± 1분 및 59 ± 1분에, 바이러스 적정을 위한 샘플을 취하였다. 샘플 인출 후 세제에 의한 바이러스의 추가 불활성화를 막기 위해, 샘플을 즉시 각 저온 (+2℃ 내지 +8℃) 세포 배양 배지로 1:20 희석하였다 (즉, 샘플 1 부피 플러스 세포 배양 배지 19 부피).

스파이크- 및 홀드 대조군을 동일한 날짜에 수행하였다: HSA-함유 버퍼는 상기 기재된 바와 같이 여과하였으나, 세제의 사전 첨가는 없었다. 이어서, 여액을 상기 기재된 바와 같이 교반 하에 14℃ ± 1℃로 조절하였다. HSA-함유 버퍼를 1:31의 비로 스파이킹하였고, 상기 기재된 바와 같이 14℃ ± 1℃에서 59 ± 1분 동안 추가로 인큐베이션하였다. 스파이킹 후 1 - 2분 이내에, 바이러스 적정을 위한 샘플 (스파이크 대조군)을 취하였다. 59 ± 1분 동안 인큐베이션 후, 바이러스 적정을 위한 샘플 (즉, 홀드 대조군 샘플)을 취하였다 (HC).

결과

HSA-함유 버퍼의 단일-세제 처리를 14℃ ± 1℃에서 0.1% ± 0.01%의 트리톤 X-100, 브리즈 C10, 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트 또는 트리톤 X-100 환원형을 사용하여 수행한 경우, BVDV는 5분 이내에 약 5의 바이러스 감소 인자 (RF)로 불활성화되었다 (도 12A). HSA-함유 버퍼의 단일-세제 처리를 14℃ ± 1℃에서 0.03% ± 0.01%의 트리톤 X-100, 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트 또는 트리톤 X-100 환원형을 사용하여 수행한 경우, BVDV는 5분 이내에 3 초과 및 29분 이내에 4 초과의 바이러스 감소 인자 (RF)로 불활성화되었다 (도 12B).

이들 실험으로부터, 트리톤 X-100, 브리즈 C10, 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트 또는 트리톤 X-100 환원형을 사용하여 생물제약 약물-함유 액체를 단일-세제 처리하면 저 농도의 세제로도 지질-외피보유 바이러스의 효율적인 불활성화가 초래되는 것으로 밝혀졌다.

실시예 9: IVIG-함유 액체 중의 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트 또는 트리톤 X-100 환원형을 사용한 BVDV 불활성화

정맥내 이뮤노글로불린 (IVIG)을 포함하는 액체 중의 지질-외피보유 바이러스 소 바이러스성 설사 바이러스 (BVDV)를 불활성화시키기 위한 단일-세제 처리에 있어서 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트 또는 트리톤 X-100 환원형의 적합성을 시험하고, 트리톤 X-100과 비교하였다. 이를 위해, IVIG를 포함하는 액체에 바이러스를 첨가하였다. 이어서, IVIG를 포함하는 바이러스-함유 액체를 저 농도의 트리톤 X-100 환원형, 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트 또는 트리톤 X-100과 함께 다양한 시간 동안 인큐베이션하고, 바이러스의 잔류 감염성을 결정하였다. 트리톤 X-100 환원형, 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트 및 트리톤 X-100은 바이러스 불활성화 속도, 즉, 시간 경과에 따른 바이러스 불활성화의 효율 (RF로 나타냄)을 평가하도록 저 농도로 사용되었다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명한 바와 같이, 생물제약 생산과 같은 상업적 생산 공정에서는 트리톤 X-100 환원형 또는 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트를 포함한 본 발명의 세제가 유의하게 더 높은 농도로 사용될 수 있으며, 이는 바이러스 불활성화 속도를 가속화할 것이며 또한 달성 LRV를 증가시는 것으로 예상된다.

재료

IVIG를 포함하는 액체

IVIG를 포함하는 액체 (IVIG-함유 액체)를 드라이아이스 상에서 냉동시키고, 수집일 이후 1년 내에 사용할 때까지 ≤ -60℃에서 저장하였다.

바이러스

표 13: 실험에서 사용된 바이러스 스톡.

세제

방법

단일-세제 처리의 바이러스 불활성화 용량 및 강건성을 바이러스 불활성화에 불리한 조건 하에 (즉, 짧은 인큐베이션 시간으로 비교적 저온에서) 평가하였다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명한 바와 같이, 생물제약 생산과 같은 상업적 생산 공정에서는 더 긴 인큐베이션 시간 및 더 높은 온도가 사용될 수 있으며, 이는 바이러스 불활성화 속도를 가속화할 것이며 또한 달성 LRV를 증가시킬 수 있다. 추가로, 상기에 이미 언급된 바와 같이, 저 농도의 각 세제가 사용될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명한 바와 같이, 생물제약 생산과 같은 상업적 생산 공정에서는 더 높은 농도의 각 세제가 사용될 수 있으며, 이는 바이러스 불활성화 속도를 가속화할 것이며 또한 달성 LRV를 증가시킬 수 있다.

IVIG-함유 액체를 해동시키고, 모든 추가의 단계는 생물안전 등급 II 캐비넷에서 실시하였다. IVIG-함유 액체를 인큐베이션을 위해 저온유지장치에 연결된 이중벽 용기를 사용하여 +17℃ ± 1℃의 온도에서 교반 하에 인큐베이션하였다. 이어서, IVIG-함유 액체를, 0.9 bar (한도: 0.5 bar - 1.5 bar)의 표적 압력에서 가압 질소를 사용하여 사르토리우스 (SM16249) 스테인레스강 필터 홀더에 연결된 25 cm²의 유효 필터 면적을 갖는 0.2 μm의 심층 필터 (쿠노 VR06 또는 등가물)를 통해 여과시켰다. 컨디셔닝을 위해, 필터 재료를 액체의 여과 전 55 L/m²의 하이플로 슈퍼셀 현탁액 (1 L당 5.0 g ± 0.05 g의 하이플로 슈퍼셀; 3 M NaCl을 사용하여 3.5 mS/cm (명시 범위: 2.5 - 6.0 mS/cm)로 전도도 조절됨)으로 예비코팅하였다 (≤ 0.5 bar의 압력에서). 여과 동안 필터 홀더를 냉각시키고, 여액을 저온유지장치에 연결된 이중벽 용기를 사용하여 +17℃ ± 1℃의 표적 온도에서 수집하였다. 여액용 용기를 냉각시켰다. 필터가 막히는 경우, 잔류 액체에 대한 여과를 계속하기 위해 새로운 사전-컨디셔닝된 필터를 사용하였다. 여과 후 부피를 측정하였다.

IVIG-함유 액체의 부피를 측정한 후, 이를 교반 하에 저온 (+2℃ 내지 +8℃) 희석 버퍼 (3.5 mS/cm (범위: 2.5 mS/cm - 6.0 mS/cm)의 표적 전도도를 갖는 NaCl 용액)를 사용하여 28.9 AU_280-320/cm (범위: 14.5 - 72.3 AU_280-320/cm)의 계산치 표적 흡광도로 조절하였다. 이후의 1:31 바이러스 스파이크를 고려하여, 이는 여과 후 세제와 함께 인큐베이션에 대해 28 AU_280-320/cm (범위: 14 - 70 AU_280-320/cm)의 계산치 표적 흡광도 값을 초래하였다.

여과 및 단백질 조절된 IVIG-함유 액체를 다시, 교반 하에, 저온유지장치에 연결된 이중벽 용기를 사용하여 +17℃ ± 1℃로 조절하였다. 이 온도 범위는 세제와 함께 여과된 IVIG-함유 액체를 인큐베이션하는 것이 완료될 때까지 교반 하에 유지시켰고, 연속적으로 기록하였다. 무부하 중량이 결정된 스크류-캡 플라스크로 옮겨진 여과된 IVIG-함유 액체의 결정된 부피를 1:31 비의 바이러스로 스파이킹하였다 (예를 들어, IVIG-함유 액체 30 mL를 바이러스 스톡 용액 1 mL로 스파이킹함). 스파이킹된 IVIG-함유 액체를 17℃ ± 1℃에서 계속 교반 하에 추가로 인큐베이션하였다. 스파이킹 후 1 - 2분 이내에, 바이러스 적정을 위한 샘플 (스파이크 대조군 SC 및 홀드 대조군 HC)을 취하였다.

인출 후, 홀드 대조군 (HC)을 세제의 첨가 후에 스파이킹된 IVIG-함유 액체와 동일한 온도, 즉, +17℃ ± 1℃로 유지시켰다 (즉, 세제 처리가 완료될 때까지 IVIG-함유 액체가 있는 용기와 동일한 냉각 순환으로 저장하였음). 냉각 액체의 온도를 홀드 대조군 샘플의 삽입 전에 결정하였고, 또한 홀드 대조군이 세제 처리 후 적정을 위해 제거되기 직전에 다시 결정하였다.

세제의 첨가량을 계산하기 위해 스파이킹된 IVIG-함유 액체의 중량을 결정하였다. 칭량된 재료는, 필요한 경우, 교반 하에 +17℃ ± 1℃로 재조절되었다. IVIG-함유 액체 g당 세제의 필요량 ([mg]) 또는 그의 1:10 희석물의 각 양을 첨가하여 하기 최종 농도의 각 세제를 산출하였다: 0.1% ± 0.01% (w/w) 또는 0.03% ± 0.01% (w/w). 세제를 교반 하에 시린지를 사용하여 1분 이내에 첨가하였고, 세제의 실제 첨가량을 시린지의 역-칭량에 의해 결정하였다. 스파이킹된 IVIG-함유 액체를 계속 교반 하에 +17℃ ± 1℃에서 59 ± 1분 동안 각 세제와 함께 추가로 인큐베이션하였다. 인큐베이션 동안, 1 - 2분, 10 ± 1분, 30 ± 1분 및 59 ± 1분 후에 바이러스 적정을 위한 샘플 1 mL를 취하였다. 샘플 인출 후 S/D 시약에 의한 바이러스의 추가 불활성화를 막기 위해, 샘플을 즉시 저온 (+2℃ 내지 +8℃) 세포 배양 배지로 1:20 희석하였다 (즉, 샘플 1 부피 플러스 세포 배양 배지 19 부피).

결과

IVIG-함유 액체의 단일-세제 처리를 17℃ ± 1℃에서 0.1% ± 0.01%의 트리톤 X-100, 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트 또는 트리톤 X-100 환원형을 사용하여 수행한 경우, BVDV는 10분 이내에 약 5의 바이러스 감소 인자 (RF)로 불활성화되었다 (도 13A). IVIG-함유 액체의 단일-세제 처리를 17℃ ± 1℃에서 0.03% ± 0.01%의 트리톤 X-100, 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트 또는 트리톤 X-100 환원형을 사용하여 수행한 경우, BVDV는 10분 이내에 3 초과 및 30분 이내에 4 초과의 바이러스 감소 인자 (RF)로 불활성화되었다 (도 13B).

이들 실험으로부터, 트리톤 X-100, 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트 또는 트리톤 X-100 환원형을 사용하여 생물제약 약물-함유 액체를 단일-세제 처리하면 저 농도의 세제로도 지질-외피보유 바이러스의 효율적인 불활성화가 초래되는 것으로 확인되었다.

실시예 10: FVIII-함유 액체 중의 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트 또는 트리톤 X-100 환원형을 사용한 BVDV 불활성화

혈장-유래의 인자 VIII (pdFVIII)을 포함하는 액체 중의 지질-외피보유 바이러스 소 바이러스성 설사 바이러스 (BVDV)를 불활성화시키기 위한 단일-세제 처리에 있어서 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트 또는 트리톤 X-100 환원형의 적합성을 시험하고, 트리톤 X-100과 비교하였다. 이를 위해, pdFVIII을 포함하는 액체에 바이러스를 첨가하였다. 이어서, pdFVIII을 포함하는 바이러스-함유 액체를 저 농도의 트리톤 X-100 환원형, 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트 또는 트리톤 X-100과 함께 다양한 시간 동안 인큐베이션하고, 바이러스의 잔류 감염성을 결정하였다. 트리톤 X-100 환원형, 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트 및 트리톤 X-100은 바이러스 불활성화 속도, 즉, 시간 경과에 따른 바이러스 불활성화의 효율 (RF로 나타냄)을 평가하도록 저 농도로 사용되었다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명한 바와 같이, 생물제약 생산과 같은 상업적 생산 공정에서는 트리톤 X-100 환원형 또는 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트를 포함한 본 발명의 세제가 유의하게 더 높은 농도로 사용될 수 있으며, 이는 바이러스 불활성화 속도를 가속화할 것이며 또한 달성 LRV를 증가시킬 것으로 예상된다.

재료

pdFVIII을 포함하는 액체

pdFVIII을 포함하는 액체 (pdFVIII-함유 액체)를 드라이아이스 상에서 냉동시키고, 수집일 이후 1년 내에 사용할 때까지 ≤ -60℃에서 저장하였다.

바이러스

표 14: 실험에서 사용된 바이러스 스톡.

세제

방법

단일-세제 처리의 바이러스 불활성화 용량 및 강건성을 바이러스 불활성화에 불리한 조건 하에 (즉, 짧은 인큐베이션 시간으로) 평가하였다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명한 바와 같이, 생물제약 생산과 같은 상업적 생산 공정에서는 더 긴 인큐베이션 시간이 사용될 수 있으며, 이는 바이러스 불활성화 속도를 가속화할 것이며 또한 달성 LRV를 증가시킬 수 있다. 추가로, 상기에 이미 언급된 바와 같이, 저 농도의 각 세제가 사용될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명한 바와 같이, 생물제약 생산과 같은 상업적 생산 공정에서는 더 높은 농도의 각 세제가 사용될 수 있으며, 이는 바이러스 불활성화 속도를 가속화할 것이며 또한 달성 LRV를 증가시킬 수 있다.

pdFVIII-함유 액체를 해동시키고, 모든 추가의 단계는 생물안전 등급 II 캐비넷에서 실시하였다. 가능한 조대한 응집체를 제거하기 위해, pdFVIII-함유 액체를 0.45 μm의 막 필터 (예를 들어, 사르토리우스 사르토스케일 사르토브란(Sartorius SartoScale Sartobran) 또는 등가물)를 통해 여과시켰다. pdFVIII-함유 액체를, 무부하 중량이 결정된 스크류-캡 플라스크로 옮기고, 교반 하에, 저온유지장치에 연결된 이중벽 용기를 사용하여 +23℃ ± 1℃의 표적 온도로 조절하였다. pdFVIII-함유 액체의 결정된 부피를 1:31의 비로 스파이킹하였다 (예를 들어, pdFVIII-함유 액체 48 mL를 바이러스 스톡 용액 1.6 mL로 스파이킹하였음). 후속적으로, 각각의 바이러스 적정을 위한 샘플 (스파이크 대조군, SC) 및 홀드 대조군 (HC)을 취하였다.

홀드 대조군을 세제의 첨가 후에 스파이킹된 pdFVIII-함유 액체와 동일한 온도, 즉, +23℃ ± 1℃로 유지시켰다 (즉, 세제 처리가 완료될 때까지 pdFVIII-함유 액체가 있는 용기와 동일한 냉각 순환으로 저장하였음). 냉각 액체의 온도를 홀드 대조군 샘플의 삽입 전에 결정하였고, 또한 홀드 대조군이 세제 처리 후 적정을 위해 제거되기 직전에 다시 결정하였다.

세제의 첨가량을 계산하기 위해 스파이킹된 pdFVIII-함유 액체의 중량을 결정하였다. 칭량된 재료를, 교반 하에, 저온유지장치에 연결된 이중벽 용기를 사용하여 +23℃ ± 1℃로 조절하였다. 이 온도 범위는 스파이킹된 pdFVIII-함유 액체를 세제와 함께 인큐베이션하는 것이 완료될 때까지 교반 하에 유지시켰고, 연속적으로 기록하였다. pdFVIII-함유 액체 g당 세제의 필요량 ([mg]), 또는 그의 1:10 희석물의 각 양을 첨가하여 최종 세제 농도 0.1% ± 0.01% (w/w)를 산출하였다. 세제를 교반 하에 시린지를 사용하여 1분 이내에 첨가하였고, 세제의 실제 첨가량을 시린지의 역-칭량에 의해 결정하였다. 세제의 첨가가 완료된 후, 스파이킹된 pdFVIII-함유 액체를 +23℃ ± 1℃에서 59 ± 1분 동안 계속 교반 하에 추가로 인큐베이션하였다. 인큐베이션 동안, 1 - 2분, 5 ± 1분, 30 ± 1분 및 59 ± 1분 후에, 바이러스 적정을 위한 샘플 1 mL를 취하였다. 샘플 인출 후 세제에 의한 바이러스의 추가 불활성화를 막기 위해, 샘플을 즉시 각 저온 (+2 내지 +8℃) 세포 배양 배지로 1:20 희석하였다 (즉, 샘플 1 부피 플러스 세포 배양 배지 19 부피).

결과

pdFVIII-함유 액체의 단일-세제 처리를 23℃ ± 1℃에서 0.1% ± 0.01%의 트리톤 X-100, 4-tert-옥틸벤질 알콜 폴리에톡실레이트 또는 트리톤 X-100 환원형을 사용하여 수행한 경우, BVDV는 5분 이내에 약 5의 바이러스 감소 인자 (RF)로 불활성화되었다 (도 14).

실시예 11: 독성 시험

인실리코 데이타에 기반하여, 본 발명에 따른 세제들 중 어느 것도 내분비 교란물질로서 활성인 것으로 밝혀지지 않았다.

본 발명의 방법, 공정 및 생성물은, 예를 들어 산업적 제조 공정에서 지질-외피보유 바이러스의 환경 친화적 불활성화에 상업적으로 유용하다. 예를 들어, 본 발명은 생물제약의 산업적 생산에서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 산업적으로 적용가능하다.

Claims

하기 구조식으로 표시되는 화합물:

여기서 m은 1이고, z는 하기 군으로부터 선택된 정수임:
z = 1 내지 5.
제1항에 있어서, 하기 화합물인 화합물:

여기서 n은 4 내지 16의 정수이거나, 또는 여기서 n은 9 또는 10임.
지질 외피를 갖는 바이러스를 불활성화시키는 방법으로서,
a) 세제를 액체에 첨가하여 상기 세제와 상기 액체의 혼합물을 제조하는 단계; 및
b) 상기 혼합물을 인큐베이션하여 상기 바이러스를 불활성화시키는 단계
를 포함하고,
여기서 상기 세제는 제1항의 화합물인 방법.
제3항에 있어서, 상기 세제가 환경 친화적인 것인 방법.
제3항에 있어서, 단계 a)가 용매를 상기 액체에 첨가하는 것을 추가로 포함하며, 단계 a)에서, 상기 세제 및 상기 용매를 상기 액체에 첨가함으로써 상기 바이러스의 불활성화를 위한 용매/세제 혼합물을 제조하는 것인 방법.
제5항에 있어서, 상기 용매가 유기 용매이고, 상기 용매가 임의로 트리-n-부틸 포스페이트인 방법.
제3항에 있어서, 상기 액체가 생물학적 의약품 및/또는 생물제약 약물을 포함하는 것인 방법.
제7항에 있어서, 상기 생물제약 약물이
(a) 혈액 인자, 이뮤노글로불린 예컨대 모노클로날 항체, 대체 효소, 백신, 유전자 요법 벡터, 성장 인자 또는 성장 인자 수용체이고/거나;
(b) 치료 단백질인
방법.
제8항에 있어서, 상기 생물제약 약물이 혈액 인자이고, 여기서 상기 혈액 인자가 인자 I (피브리노겐), 인자 II (프로트롬빈), 조직 인자, 인자 V, 인자 VII 또는 VIIa, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 XI, 인자 XII, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 (VWF), 프리칼리크레인, 고분자량 키니노겐 (HMWK), 피브로넥틴, 항트롬빈 III, 헤파린 보조인자 II, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 플라스미노겐, 알파 2-항플라스민, 조직 플라스미노겐 활성인자 (tPA), 우로키나제, 플라스미노겐 활성인자 억제제-1 (PAI1), 또는 플라스미노겐 활성인자 억제제-2 (PAI2)인 방법.
제9항에 있어서, 상기 생물제약 약물이 인자 VIII 또는 재조합 인간 인자 VIII인 방법.
제3항에 있어서,
(a) 단계 a) 전에 또는 단계 a)와 단계 b) 사이에, 상기 액체 또는 혼합물을 심층 필터로 여과하는 단계를 추가로 포함하고/거나;
(b) 단계 b)가 하기 조건 (i) 내지 (iii) 중 어느 하나를 만족시키는 것인 방법:
(i) 상기 혼합물을 적어도 1시간 동안 인큐베이션하는 것;
(ii) 상기 혼합물을 0℃ 내지 10℃의 온도에서 인큐베이션하거나, 또는 상기 혼합물을 16℃ 내지 25℃의 온도에서 인큐베이션하는 것; 또는
(iii) 상기 혼합물을 0℃ 내지 10℃의 온도 또는 16℃ 내지 25℃의 온도에서 적어도 1시간 동안 인큐베이션하는 것.
제7항에 있어서, 단계 b) 후에, 하기 단계:
c) 상기 생물제약 약물을 정제하는 단계
를 추가로 포함하며; 여기서:
(i) 상기 정제는 상기 세제로부터 상기 생물제약 약물을 분리하는 것을 포함하는 것; 및/또는
(ii) 상기 생물제약 약물에 대한 상기 정제는 상기 생물제약 약물을 적어도 1종의 크로마토그래피 정제에 의해 정제하는 것을 포함하고, 상기 적어도 1종의 크로마토그래피 정제는 임의로 음이온 교환 크로마토그래피 및/또는 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 것인
방법.
제7항에 따른 지질 외피를 갖는 바이러스를 불활성화시키는 방법을 포함하는, 생물제약 약물을 포함하는 제약 제형을 제조하는 방법으로서, 여기서 상기 생물제약 약물은 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같고, 상기 지질 외피를 갖는 바이러스를 불활성화시키는 방법 후에, 상기 생물제약 약물을 포함하는 상기 제약 제형을 제조하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
세제를 포함하는 조성물로서, 여기서 세제는 제1항 또는 제2항의 화합물인 조성물.
제14항에 있어서, 유기 용매를 추가로 포함하며, 여기서 상기 용매가 임의로 트리-n-부틸 포스페이트인 조성물.
하기 화학식 (VIII)의 화합물을 합성하는 방법으로서,

여기서 화학식 (VIII)의 화합물은 하기 화합물이고, R 및 A는 하기 식에 표시된 바와 같고,

여기서 m은 1이고, z는 하기 군으로부터 선택된 정수이고:
z = 1 내지 5
여기서 방법은 하기 단계:
(A) 하기 화학식 (IX) (여기서 R은 상기 정의된 바와 같음)의 페놀을 하기 화학식 (X) (여기서 R 및 m은 상기 정의된 바와 같음)의 알콜로 전환시키는 단계; 및

(B) 화학식 (X)의 알콜을 상기 정의된 바와 같은 화학식 (VIII)의 폴리옥시에틸렌 에테르로 전환시키는 단계
를 포함하는 방법.
하기 화학식 (VIII)의 화합물을 합성하는 방법으로서,

여기서 화학식 (VIII)의 화합물은 하기 화합물이고, R 및 A는 하기 식에 표시된 바와 같고,

여기서 m은 1이고, z는 하기 군으로부터 선택된 정수이고:
z = 1 내지 5
여기서 방법은 하기 단계:
(1) 톨루엔을 반응시켜 하기 화학식 (XI) (여기서 R은 상기 정의된 바와 같음)의 치환된 톨루엔을 수득하는 단계;

(2) 화학식 (XI)의 치환된 톨루엔을 하기 화학식 (XII) (여기서 R 및 m은 상기 정의된 바와 같고, X는 히드록실 기, 브로민 원자, 아이오딘 원자 및 염소 원자를 포함하는 군으로부터 선택됨)의 화합물로 전환시키는 단계; 및

(3) 화학식 (XII)의 화합물을 상기 정의된 바와 같은 화학식 (VIII)의 폴리옥시에틸렌 에테르로 전환시키는 단계
를 포함하는 방법.
하기 화학식 (VIII)의 화합물을 합성하는 방법으로서,

여기서 화학식 (VIII)의 화합물은 하기 화합물이고, R 및 A는 하기 식에 표시된 바와 같고,

여기서 m은 1이고, z는 하기 군으로부터 선택된 정수이고:
z = 1 내지 5
여기서 방법은 하기 단계:
(I) 벤질 알콜을 하기 화학식 (XIII) (여기서 R은 상기 정의된 바와 같음)의 화합물로 전환시키는 단계; 및

(II) 화학식 (XIII)의 화합물을 상기 정의된 바와 같은 화학식 (VIII)의 폴리옥시에틸렌 에테르로 전환시키는 단계
를 포함하는 방법.
제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 (VIII)의 화합물이 하기 화합물인 방법:

여기서 n은 4 내지 16의 정수이거나, 또는 여기서 n은 9 또는 10임.
제17항에 있어서,
(i) 단계 (2)에서의 전환이 AIBN (아조비스(이소부티로니트릴))을 라디칼 개시제로서 사용하는 라디칼 반응이고/거나;
(ii) X가 브로민 원자인
방법.
제17항에 있어서,
(a) 단계 (2)에서의 전환이 N-브로모숙신이미드 (NBS)를 시약으로서 사용하는 것;
(b) 단계 (3)에서의 전환이 TBME (메틸-tert-부틸에테르)를 용매로서 사용하는 것; 및/또는
(c) 단계 (3)에서의 전환이 적어도 2시간 동안, 5시간 이하 동안, 또는 3시간 동안 실시되고, 여기서 단계 (3)에서의 전환이 주위 온도에서 실시될 수 있는 것인
방법.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제