JP2012507272A - 新規な方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、細胞培養により生産されるウイルス又はそのウイルス抗原に付随する宿主細胞核酸を分解するための方法であって、ｉ）エンドヌクレアーゼ、及びｉｉ）ＤＮＡアルキル化剤から選択される化合物を用いる少なくとも２つの核酸分解ステップを含む方法に関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、ウイルス又はウイルス抗原を生産する細胞培養に基づく方法、この方法により取得可能なウイルス又はウイルス抗原、及びそのようなウイルス又はウイルス抗原を含有するワクチンに関する。特に、本発明は、宿主細胞に由来する混入残留核酸の量及び／又はサイズを低減するための方法を提供する。本発明によると、宿主細胞核酸は、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）等のエンドヌクレアーゼにより、及び／又はβ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）等のＤＮＡアルキル化剤により、又はそれらの組合せにより実施される少なくとも２つの個別の分解ステップを実施することにより分解される。

ウイルスワクチンを製造するための卵に基づく従来の生産系の代替として、細胞培養に基づく技術を開発することは、卵に基づく従来の系に伴う欠点及び制約を克服するための最も迅速で最も有望な解決策である可能性が高い。ウイルスワクチンの商業生産では、典型的には、抗原供給源として大量のウイルスが必要とされる。しかしながら、卵に基づくプロセスは、卵の生物学的品質の変動の影響を受け易く、大量の好適な卵が入手可能でないことによる物流が問題となるため、柔軟性を欠いている。

細胞培養系は、ワクチン調製の、より単純で柔軟性があり一貫した好適な代替法と考えられており、ワクチン生産能力のスケールアップの可能性を向上させ、したがって必要に応じて、例えば自然の大流行脅威又はテロ攻撃に対応して、大量のウイルス調達を可能にする。

商業的量のウイルスは、種ウイルスを細胞培養系で複製することにより達成することができる。ウイルス複製、又はウイルス抗原の調製に好適な細胞培養系には、哺乳動物、トリ、又は昆虫細胞が含まれる。

しかしながら、細胞培養をワクチン生産に使用するには、ワクチン接種者が、混入完全細胞、細胞成分、及び／又は残留細胞ＤＮＡに曝されるというリスクが伴うことが、当技術分野で知られている。

細胞培養は、天然に存在する状態から改変されていない場合、複製能力に限界があり、したがって商業的ワクチンに必要な物質量を生産するには非実用的及び非効率的である。したがって、製造目的の場合、細胞を改変して「連続」又は「不死化」細胞系にして、それらが分裂することができる回数を増加させることが好ましい。これら改変の多くでは、細胞の癌化に関与する機序に類似した機序が使用される。そのため、したがって、宿主細胞ＤＮＡ等の、細胞培養プロセスに由来するあらゆる残留物質を、これらの系で製造されるワクチンの最終製剤から除去して、最終産物からあらゆる潜在的癌化物質を除去することが重要である。

したがって、ワクチン用の細胞培養に基づくウイルス又はウイルス抗原は、それらの抗原性及び免疫原性の特性を保ちつつ、それらの細胞の環境から適切に及び注意深く単離されなければならない。

規制当局により課されている、より厳密な要求を考慮すると、できるだけ低い残留ＤＮＡ含量のウイルス又はウイルス抗原を提供するだけでなく、生産プロセスの各ステップにおいて、細胞ＤＮＡのサイズ、分布、及び量を含む特性をモニターすることを可能にする方法を提供する必要性も依然として存在する。特に、１０ｎｇ未満の細胞残留ＤＮＡを含有し、該細胞残留ＤＮＡが３００塩基対を超過すべきでないウイルス又はウイルス抗原を含むワクチン用量を開発する必要性が存在する。

欧州特許第０８７０５０８号明細書では、ＤＮＡ分解剤としてＤＮＡ消化酵素の使用が開示されている。

国際公開第２００７／０５２１６３号パンフレットでは、ＤＮＡ分解剤としてβ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）の使用が開示されている。

欧州特許第０８７０５０８号明細書 国際公開第２００７／０５２１６３号パンフレット

本発明による方法は、高ウイルス収率、及びウイルス又はウイルス抗原免疫原性の保存を達成しつつ、高ＤＮＡ断片化及び低含有量の残留ＤＮＡを両方とも達成することを可能にする。

したがって、本発明の第１の態様では、細胞培養により生産されるウイルス又はそのウイルス抗原に付随する宿主細胞核酸を分解するための方法であって、ｉ）エンドヌクレアーゼ、及びｉｉ）ＤＮＡアルキル化剤から選択される化合物を用いる少なくとも２つの核酸分解ステップを含む方法が提供される。

本発明の第２の態様では、ウイルス又はそのウイルス抗原を細胞培養で生産するための方法であって、
（ａ）細胞培養培地中で培養された細胞集団を準備するステップと、
（ｂ）該細胞集団にウイルスを接種するステップと、
（ｃ）該ウイルスの複製が可能になるように該細胞集団を培養するステップと、
（ｄ）生産されたウイルスを収集して、それによりウイルス回収物を準備するステップと、
（ｅ）該ウイルスを単離するステップとを含み、
ｉ）エンドヌクレアーゼ、及びｉｉ）ＤＮＡアルキル化剤から選択される化合物を用いる少なくとも２つの宿主細胞核酸分解ステップを含む方法が提供される。

第３の態様では、本発明の方法により取得可能なウイルス又はそのウイルス抗原を含む組成物が提供される。

第４の態様では、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）アッセイで測定した際に１０ｎｇ未満、５ｎｇ未満、１ｎｇ未満、１００ｐｇ未満、又は１０ｐｇ未満の残留宿主細胞ＤＮＡ含量を有する、細胞培養産生ウイルス又はそのウイルス抗原を含む組成物が提供される。

第５の態様では、サザンブロットで測定した際に、サイズが５００塩基対未満、３００塩基対未満、２００塩基対未満、及び１００塩基対未満である残留宿主細胞ＤＮＡ含量を有する、細胞培養産生ウイルス又はそのウイルス抗原を含む組成物が提供される。

更なる態様では、好適な医薬担体と混合された本発明のウイルス又はそのウイルス抗原を含む免疫原性組成物が提供される。

また更なる態様では、本発明の方法を含む、ウイルスを生産するための細胞培養に基づく方法の実施中に、残留宿主細胞ＤＮＡをモニターし、残留細胞ＤＮＡの量及びサイズを両方とも測定することを可能にするための方法が提供される。

また更なる態様では、少なくとも以下のステップを含む、細胞培養で生産されたウイルス又はそのウイルス抗原を精製するための方法が提供される：
（ａ）スクロース勾配超遠心分離ステップであり、該スクロース勾配が、ウイルスを分割するように界面活性剤を含むステップ、及び
（ｂ）該スクロース勾配から収集された分割ウイルス貯留を、０．１％〜０．５％の非イオン性界面活性剤の存在下で１〜５日間インキュベートするステップ。

また更なる態様では、両性イオン界面活性剤の存在下で実施される少なくとも１つのサイズ排除クロマトグラフィーステップを含む、細胞培養で生産されたウイルス又はそのウイルス抗原を精製するための方法が提供される。

また更なる態様では、少なくとも以下のステップを含む、細胞培養で生産されたウイルス又はそのウイルス抗原を精製するための方法が提供される：
（ａ）１つのスクロース勾配超遠心分離ステップ、及び
（ｂ）１つのクロマトグラフィーステップ。

定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）によるＳＩＮＥ及びＬＩＮＥ配列の増幅の検証。図１Ａは、制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩで同時消化したＭＤＣＫ ＤＮＡで実施したＳＩＮＥ及びＬＩＮＥ増幅について確立された曲線を示す図である。図１Ｂは、ＳＩＮＥ及びＬＩＮＥ配列を増幅するために実施されたＱ−ＰＣＲ反応に由来する等量を負荷したアガロースゲルを示す図である。Ｃｔは、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄサイクルを表す。 定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）により、ＥＢ６６（登録商標）細胞の９９塩基対（ｂｐ）、１８５塩基対（ｂｐ）、及び２８０塩基対（ｂｐ）の配列を増幅するために使用されたプライマーを示す略図である。 ＭＤＣＫ細胞に接種しウイルスを感染させた後で細胞培養培地を収集することにより得られた細胞培養産生インフルエンザウイルス回収物中に存在する残留宿主細胞ＤＮＡのプロファイルである。ＤＮＡプロファイルの比較 − ＤＮＡ分解ステップ無し、対培養段階中に実施された１つのＤＮＡ分解ステップ。図３は、表示されているウイルス回収物、ＪＰ１１５、ＮＣＰ１１７、ＪＰ１２５、及びＮＣＰ１２７から調製されたＤＮＡ試料を負荷したアガロースゲルの紫外線下で撮影された画像を示す。Ｄは、ＤＮａｓｅを表し、Ｒは、ＲＮａｓｅを表す。 エンドヌクレアーゼを用いて及びＤＮＡアルキル化剤を用いて実施された２つのＤＮＡ分解ステップにかけた細胞培養産生インフルエンザウイルスの精製バルク中の残留ＭＤＣＫ ＤＮＡの特徴付け。図４Ａは、矢印で示されている試料ＪＰ１１５（レーン６）及びＪＰ１２５（レーン８）の精製バルクのＤＮＡ含有量を、サザンブロットにより分析した後で得られたオートラジオグラフィーを示す。レーン１０〜１５には、制限酵素Ｓａｕ３で消化された表示既知量のＭＤＣＫ対照ＤＮＡを負荷し、ＪＰ１１５及びＪＰ１２５のＤＮＡの半定量化はそれに基づいていた。図４Ｂは、試料ＮＣＰ１２４（レーン５、矢印で示されている）の精製バルクのＤＮＡ含量を、サザンブロットにより分析した後で得られたオートラジオグラフィーを示す。レーン７〜１２には、制限酵素Ｓａｕ３で消化された表示既知量のＭＤＣＫ対照ＤＮＡを負荷し、ＮＣＰ１２４のＤＮＡの半定量化はそれに基づいていた。 ＭＤＣＫ細胞で生産され、エンドヌクレアーゼを用いて及びＤＮＡアルキル化剤を用いて実施された複数のＤＮＡ分解ステップにかけられたインフルエンザウイルス抗原の、未感作マウスモデルにおける免疫原性。図５Ａは、試料ＮＣＰ１２４由来の製剤により誘導されたＨＩ抗体反応を示す。図５Ｂは、試料ＮＣＰ１２４由来の製剤により誘導された中和抗体反応を示す。 ＭＤＣＫ細胞で生産され、エンドヌクレアーゼを用いて及びＤＮＡアルキル化剤を用いて実施された複数のＤＮＡ分解ステップにかけられたインフルエンザウイルス抗原の、初回刺激マウスモデルにおける免疫原性。図６Ａは、試料ＮＣＰ１２４由来の製剤により誘導されたＨＩ抗体反応を示す。図６Ｂは、試料ＮＣＰ１２４由来の製剤により誘導された中和抗体反応を示す。

本発明は、ウイルス又はウイルス抗原を生産するための細胞培養に基づく方法を提供する。この方法は、精製されたウイルス又はウイルス抗原に付随したままの残留宿主細胞核酸、特にＤＮＡのサイズ及び量を両方とも制限することを意図している。特に、本発明は、ＤＮＡ分解の改良された方法及び分解されたＤＮＡのより良好な除去を提供する。本発明によると、本方法では、少なくとも２つの宿主細胞核酸分解ステップが、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）等のエンドヌクレアーゼ、及び／又はＢＰＬ（β−プロピオラクトン）等のＤＮＡアルキル化剤、又はそれらの組合せを使用して実施される。この方法は、ある範囲の細胞培養産生ウイルス又はウイルス抗原を処理するために使用することができる。

本発明の方法は、アデノウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、オルトミクソウイルス、パポバウイルス、パラミクソウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、レオウイルス、及びレトロウイルスを含むがそれらに限定されない広範囲のウイルスであり、ワクチンの標的である任意のウイルスに適している。特に、本発明の方法は、ミクソウイルス等のエンベロープウイルスに好適である。１つの実施形態では、本発明の方法により生産されるウイルスは、オルトミクソウイルスのファミリーに属しており、特にインフルエンザウイルスである。

ウイルス又はウイルス抗原は、インフルエンザウイルス等のオルトミクソウイルスに由来していてもよい。オルトミクソウイルス抗原は、赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックスタンパク質（Ｍ１）、膜タンパク質（Ｍ２）、１つ又は複数のトランスクリプターゼ（ＰＢ１、ＰＢ２、及びＰＡ）を含む１つ又は複数のウイルスタンパク質から選択されてもよい。特に好適な抗原には、インフルエンザ亜型の抗原特異性を決定する２つの表面糖タンパク質であるＨＡ及びＮＡが含まれる。

インフルエンザウイルスは、ヒトインフルエンザウイルス、トリインフルエンザウイルス、ウマインフルエンザウイルス、ブタ（例えば、豚）インフルエンザウイルス、ネコインフルエンザウイルスからなる群から選択される。より具体的には、インフルエンザウイルスは、Ａ、Ｂ、及びＣ株から、好ましくはＡ株及びＢ株から選択される。

インフルエンザウイルス又はその抗原は、大流行間期（例年の又は季節性の）インフルエンザ株に由来してもよい。あるいは、インフルエンザウイルス又はその抗原は、大流行発生を引き起こす能力を有する株に由来してもよい（つまり、現在流行している株の赤血球凝集素と比較して新しい赤血球凝集素を有するインフルエンザ株、又はトリ対象体において病原性であり、ヒト集団中で水平伝染する可能性を有するインフルエンザ株、又はヒトに病原性であるインフルエンザ株）。特定の季節、及びワクチンに含まれている抗原の性質に応じて、インフルエンザウイルス又はその抗原は、以下の赤血球凝集素亜型、すなわちＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、又はＨ１６のうち１つ又は複数に由来してもよい。好ましくは、インフルエンザウイルス又はその抗原は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、又はＨ９亜型に由来する。

本発明による方法で使用される細胞は、基本的には、細胞培養で培養することができ、ウイルス複製を支援することができる任意の所望の細胞タイプの細胞であり得る。それらは、接着して増殖する細胞であってもよく、又は懸濁状態で増殖する細胞であってもよい。それらは、初代細胞であってもよく、又は連続細胞系であってもよい。遺伝学的に安定した細胞系が好ましい。

哺乳動物細胞、例えばヒト、ハムスター、ウシ、サル、又はイヌ細胞が、特に好適である。

多数の哺乳動物細胞系が当技術分野で公知であり、それらには、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨＥＫ細胞、ヒト胚腎臓細胞（２９３細胞）、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、ベロ細胞、及びＭＤＣＫ細胞が含まれる。

好適なサル細胞は、例えば、ベロ細胞系における腎臓細胞等のアフリカミドリザル細胞である。好適なイヌ細胞は、例えば、ＭＤＣＫ細胞系における腎臓細胞である。

インフルエンザウイルスを増殖させるのに好適な哺乳動物細胞系には、ＭＤＣＫ細胞、ベロ細胞、又はＰＥＲ．Ｃ６細胞が含まれる。これら細胞系は全て、例えば、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から広く入手可能である。

特定の実施形態によると、本発明の方法では、ＭＤＣＫ細胞が使用される。元のＭＤＣＫ細胞系は、ＣＣＬ−３４としてＡＴＣＣから入手可能であるが、懸濁状態での増殖に適したＭＤＣＫ細胞等、この細胞系の誘導体も使用することができる（国際公開第１９９７／３７０００号パンフレット）。

あるいは、本発明で使用するための細胞系は、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、又はキジ等のトリ起源に由来していてもよい。トリ細胞系は、胚、ヒヨコ、及び成体を含む様々な発生段階に由来してもよい。特に、細胞系は、胚線維芽細胞、生殖細胞等の胚細胞、又はニューロン、脳、網膜、腎臓、肝臓、心臓、筋肉を含む個々の器官、又は胚外組織及び胚を保護する膜に由来してもよい。ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）を使用してもよい。トリ細胞系の例には、トリ胚性幹細胞（国際公開第０１／８５９３８号パンフレット）及びアヒル網膜細胞（国際公開第０５／０４２７２８号パンフレット）が含まれる。特に、アヒル胚性幹細胞に由来するＥＢ６６（登録商標）細胞系が、本発明で企図される（国際公開第２００８／１２９０５８号パンフレット）。他の好適なトリ胚性幹細胞には、ニワトリ胚性幹細胞、ＥＢ４５、ＥＢ１４、及びＥＢ１４−０７４に由来するＥＢｘ細胞系が含まれる（国際公開第２００６／１０８８４６号パンフレット）。このＥＢｘ細胞系には、その樹立が天然的にもたらされ、いかなる遺伝的、化学的、又はウイルス性の修飾も必要としなかった、遺伝学的に安定した細胞系であるという利点がある。これらトリ細胞は、インフルエンザウイルスを増殖させるのに特に好適である。

特定の実施形態によると、本発明の方法では、ＥＢ６６（登録商標）細胞が使用される。

細胞培養条件（温度、細胞密度、ｐＨ値等）は、使用される細胞の適合性に応じて非常に広い範囲にわたって変動し、特定のウイルスの詳細な増殖条件の要求に適応させることができる。細胞培養は、当技術分野において広範に文書化されているため、適切な培養条件を決定することは、当業者の能力内にある（例えば、Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson編 (1973)、及びR.I. Freshney, Culture of animal cells: A manual of basic technique, 第4版(Wiley-Liss Inc., 2000, ISBN 0-471-34889-9)を参照。

特定の実施形態では、本発明に記載の方法で使用される宿主細胞は、無血清及び／又は無タンパク質培地中で培養される。「無血清培地」（ＳＦＭ）は、細胞生存及び細胞増殖を可能にする血清添加を必要としない使用準備済の細胞培養培地を意味する。この培地は、必ずしも化学的に定義されていなくともよく、種々の由来、例えば植物由来の水解物を含有していてもよい。そのような無血清培地には、ウイルス、マイコプラズマ、又は未知の伝染性因子による汚染を排除することができるという利点がある。「無タンパク質」とは、タンパク質、増殖因子、他のタンパク質添加物、及び非血清タンパク質が除外されていても細胞増殖が生じる培養を意味するが、随意に、ウイルス増殖に必要な場合があるトリプシン又は他のプロテアーゼ等のタンパク質を含んでいてもよいことが理解されている。そのような培養で自然に増殖する細胞は、それら自体にタンパク質を含有している。

無血清培地は、多数の供給業者、例えばＶＰ ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社 カタログ番号１１６８１−０２０）、Ｏｐｔｉ−Ｐｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社 カタログ番号１２３０９−０１９）、又はＥＸ−ＣＥＬＬ（ＪＨＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）から商業的に入手可能である。

細胞は、種々の方法で増殖させることができ、例えば懸濁状態で増殖させてもよく、又はマイクロキャリア上での増殖のように表面に接着させて増殖させてもよく、又はそれらの組合せであってもよい。培養は、培養皿、フラスコ、ローラーボトル、又はバッチ、流加バッチ、灌流システム等の半連続型若しくは連続型システムを使用するバイオリアクターで実施することができる。典型的には、細胞は、主細胞バンクバイアル又は作業用細胞バンクバイアルから、種々のサイズのフラスコ又はローラーボトルを介して、最終的にはバイオリアクターへとスケールアップされる。１つの実施形態では、本発明の方法により使用される細胞は、撹拌バイオリアクター内の無血清培地中のマイクロキャリアビーズ上で培養され、培養培地は灌流により提供される。

代替的な実施形態では、細胞は、バッチ法で懸濁状態で培養される。

ウイルスによる感染に先立って、細胞は、約３７℃、より好適には３６．５℃で、６．７〜７．８の範囲のｐＨ、好適には約６．８〜７．５、より好適には約７．２のｐＨで培養される。

本発明の方法によると、細胞培養に基づくウイルス生産は、一般的に、生産しようとするウイルス株を培養細胞に接種するステップと、ウイルス複製を可能とするために感染細胞を所望の期間培養するステップとを含む。

大量の細胞産生ウイルスを生産するためには、細胞が高密度に達した時に、所望のウイルス株を細胞に接種することが好ましい。通常、細胞密度が、少なくとも約１．５×１０^６細胞／ｍｌ、好適には約３×１０^６細胞／ｍｌ、より好適には約５×１０^６細胞／ｍｌ、又は更により好適には７×１０^６細胞／ｍｌ、あるいはさらにそれ以上接種を実施する。最大のウイルス生産を得るための最適な細胞密度は、ウイルス増殖に使用される細胞タイプにより異なる場合がある。

接種は、約１０^−１〜１０^−７のＭＯＩ（感染多重度）、好適には約１０^−２〜１０^−６、及びより好適には約１０^−５のＭＯＩで実施される。

ウイルス感染の温度及びｐＨ条件は、異なる場合がある。温度は、ウイルスタイプに応じて、３２℃〜３９℃の範囲であってもよい。インフルエンザウイルスを生産する場合は、細胞培養感染は、生産される株に応じて異なる場合がある。インフルエンザウイルス感染は、好適には、３２℃〜３５℃の範囲の温度で、好適には３３℃で実施される。１つの実施形態では、ウイルス感染は３３℃で行う。代替的な実施形態では、ウイルス感染は３５℃で行う。ウイルス株に応じて、プロテアーゼ、典型的にはトリプシンを細胞培養に添加して、ウイルス複製を可能にすることができる。プロテアーゼは、任意の好適な培養段階で添加することができる。トリプシン（Tryspin）は、好ましくは非動物由来であり、つまりプロテアーゼは、動物供給源から精製されていない。トリプシンは、好適には、細菌、酵母等の微生物中で又は植物中で組換え的に生産される。組換えトリプシンの好適な例は、トウモロコシ中で産生された組換えトリプシンであるＴｒｙｐｚｅａｎ（Ｐｒｏｄｉｇｅｎ社製、１０１ ゲートウエイ ブルーバード スイート１００ カレッジステイション テキサス州 ７７８４５。メーカーコード：ＴＲＹ）、又は真菌中で発現されたトリプシン様酵素であるＴｒｐＬＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）（国際公開第２００４／０２０６１２号パンフレット）である。

感染すると、細胞は、受動溶解とも呼ばれる宿主細胞の自然溶解により、新しく形成されたウイルス粒子を培養培地に放出することができる。したがって、１つの実施形態では、細胞ベースのウイルス回収物は、細胞培養培地又は上清を収集することにより、ウイルス接種後の任意の時間に提供することができる。特定の実施形態では、細胞培養培地は灌流により収集される。ウイルス接種後の異なる時点で細胞由来ウイルスを回収し、必要に応じてその異なる回収物を貯留することが所望の場合、この回収方法は特に好適である。

あるいは、ウイルス感染後に、細胞ベースのウイルスは、能動溶解とも呼ばれる、宿主細胞を溶解するための外的因子を使用することにより回収することができる。しかしながら、前述のものとは対照的に、能動的な細胞溶解は細胞培養を直ちに終了させるため、そのような回収方法は、細胞ベースのウイルス回収物を単一の時点で収集することを必要とする。

能動的細胞溶解に使用することができる方法は公知である。この点で有用な方法は、例えば、凍結融解、固体剪断、高浸透圧及び／又は低浸透圧溶解、液体剪断、高圧放出、界面活性剤による溶解、又はそれらの任意の組合せである。

１つの実施形態によると、細胞ベースのウイルス回収物は、細胞培養培地又は上清を収集すること、接種された細胞を溶解すること、又はその両方により、ウイルス接種後の任意の時間に提供することができる。

回収する前に、細胞感染を２〜１０日間継続することができる。特定の実施形態によると、接種後３、４、及び５日目の培養液上清を、更なる下流プロセス（ウイルス単離）のために回収及び貯留する。別の実施形態によると、細胞培養上清は、接種後５日目から収集される。細胞産生ウイルスを回収するのに最適な時間は、通常、感染のピークを決定することに基づく。例えば、ＣＰＥ（細胞変性効果）は、細胞球状化、配位喪失（disorientation）、膨潤又は収縮、死滅、表面からの剥離を含む、ウイルス接種後に宿主細胞に生じる形態学的変化をモニターすることにより測定される。特定のウイルス抗原の検出は、ウエスタンブロット分析等のタンパク質検出の標準技術によりモニターすることもできる。その後、所望の検出レベルの達成時に、回収物を収集することができる。インフルエンザウイルスの特定の場合では、ＨＡの含有量は、当業者によく知られている技術であるＳＲＤアッセイにより、細胞にウイルスを接種した後の任意の時間にモニターすることができる（Wood, JM, et al. (1977). J. Biol. Standard. 5, 237-247）。加えて、ＳＲＤアッセイは、最適化されたウイルス収率を得るのに必要とされる、最適な細胞密度範囲を決定するために使用することもできる。

本発明では、細胞培養に基づくウイルス又はウイルス抗原を生産する際に、宿主細胞核酸を分解するための少なくとも２つのステップでの処理が使用される。核酸分解化合物は、エンドヌクレアーゼであってもよく、ＤＮＡアルキル化剤であってもよく、又はその両方であってもよい。例えば、第１の処理をエンドヌクレアーゼにより実施し、その後第２の処理をＤＮＡアルキル化剤により実施してもよく、その逆でもよい。したがって、１つの実施形態では、少なくとも１つのエンドヌクレアーゼステップ及び少なくとも１つのＤＮＡアルキル化ステップが、任意の順序で順次実施される。あるいは、本発明による方法では、各々のステップがエンドヌクレアーゼにより実施されるか又は各々のステップがＤＮＡアルキル化剤により実施される２つの別個の核酸分解ステップを実施してもよい。核酸分解の第１のステップ及び第２のステップは、本発明による方法の任意の時点で実施することができる。それらは、連続した様式、つまり前のステップの直後に次のステップという様式で実施することができる。あるいは、２つの核酸分解ステップは、本発明による方法中で行う他のステップにより隔てられていてもよい。

本発明は、２つの宿主細胞核酸分解ステップに限定されておらず、別の実施形態では、各追加的ステップがエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡアルキル化剤により実施され、任意の順序で任意の時間に実施される、２つを超える核酸分解ステップも企図される。

１つの実施形態によると、少なくとも１つの宿主細胞核酸分解ステップは、生産されたウイルスを回収する前、つまりウイルス単離段階ではなく細胞培養段階中に実施される。本発明の状況では、細胞培養段階及びウイルス単離段階は、ウイルス回収ステップにより隔てられている。細胞培養段階は、ウイルス回収ステップ前のあらゆるステップを包含すると理解されるべきであり、ウイルス単離段階は、前記回収段階後のあらゆるステップを包含すると理解されるべきである。細胞培養段階は、具体的には、（ａ）培養下の細胞集団を提供するステップと、（ｂ）該細胞集団にウイルスを接種するステップと、（ｃ）該ウイルスの複製が可能になるように該細胞集団を培養するステップとを含む。ウイルス単離段階は、ウイルス回収物に含まれるウイルスの精製を目的とする任意のステップ、つまり宿主細胞核酸を含む宿主細胞混入物質の除去を目的とする任意のステップであると理解されるべきである。

１つの実施形態では、少なくとも２つの核酸分解ステップは、エンドヌクレアーゼを用いて実施される。特定の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、細胞培養段階中及びウイルス単離段階中に添加される。別の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、感染細胞の細胞培養上清を収集した後に得られるウイルス回収物、及びウイルス単離段階中に得られるウイルス回収物の両方に添加される。

代替的な実施形態では、少なくとも１つの核酸分解ステップは、エンドヌクレアーゼを用いて実施され、少なくとも１つの核酸分解ステップは、アルキル化剤を用いて実施される。特定の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、細胞培養段階中に添加され、ＤＮＡアルキル化剤は、ウイルス単離段階中に添加される。別の実施形態では、エンドヌクレアーゼ及びＤＮＡアルキル化剤の両方が、ウイルス単離段階中に添加される。

宿主細胞核酸分解は、細胞培養段階中に実施される場合、好適には、エンドヌクレアーゼを細胞培養に添加することにより実施される。エンドヌクレアーゼは、ウイルスによる細胞の接種と同時又はウイルス接種後の任意の適切な時点を含む、細胞培養段階の任意の好適なステップにおいて添加することができる。細胞培養段階におけるそのような初期添加により、特に、核酸が細胞から培養培地に放出されるとすぐ、すなわちエンドヌクレアーゼによる核酸認識を妨害することになる細胞残渣との複合体又は凝集体が発生する可能性が生じる前に、核酸分解を標的とすることが可能になる。細胞培養にエンドヌクレアーゼを添加することによる別の結果は、エンドヌクレアーゼ作用を、ウイルス接種ステップのような通常はプログラム化された細胞培養ステップと全く同じ条件及び同じ時点で行うことができ、したがって、最終産物の安定性に影響を及ぼしプロセスを遅延させる場合がある、特定の温度でのインキュベーションも、追加的なインキュベーション期間も設定する必要がないことである。エンドヌクレアーゼを添加する方法は、使用される培養の方法に応じて変わる場合がある。細胞がバイオリアクターで培養される場合、エンドヌクレアーゼは、細胞培養を含有するバイオリアクターに直接添加することができる。あるいは、細胞培養培地を提供するために灌流システムが使用される場合、エンドヌクレアーゼは、灌流培地に添加することができる。

１つの実施形態では、本発明の方法による細胞培養段階中に少なくとも１つのＤＮＡ分解ステップを実施することにより、ウイルス単離段階に移行する前に、定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）により測定して、３００塩基対長のＤＮＡ断片の量が、ＤＮＡ分解が全く実施されない場合と比較して、５０％を超えて、特に６０％を超えて、その中でも特に７０％を超えて、及び８０％をさえ超えて低減されることが可能となる。

特定の実施形態では、本発明の方法は、感染細胞の細胞培養上清を収集することにより得られるウイルス回収物を提供し、該ウイルス回収物中では、定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）により測定して、３００塩基対長のＤＮＡ断片の量が、ＤＮＡ分解ステップを実施せずに得られたウイルス回収物と比較して、５０％を超えて、特に６０％を超えて、その中でも特に７０％を超えて、及び８０％をさえ超えて低減される。

別の実施形態では、本発明の方法による細胞培養段階中に少なくとも１つのＤＮＡ分解ステップを実施することにより、ウイルス単離段階に移行する前に、定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）により測定して、６０塩基対長のＤＮＡ断片の量が、ＤＮＡ分解を全く実施しない場合と比較して、３０％を超えて、特に４０％を超えて、その中でも特に５０％を超えて、及び５５％をさえ超えて低減されることが可能となる。

特定の実施形態では、本発明の方法は、感染細胞の細胞培養上清を収集することにより得られるウイルス回収物を提供し、該ウイルス回収物中では、定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）により測定して、３０塩基対長のＤＮＡ断片の量が、ＤＮＡ分解ステップを実施せずに得られたウイルス回収物と比較して、４０％を超えて、特に５０％を超えて、その中でも特に５５％を超えて低減されている。

第２の実施形態によると、少なくとも１つの宿主細胞核酸分解ステップは、細胞感染後に収集されるウイルス回収物中で実施される。特に、エンドヌクレアーゼは、収集されたウイルス回収物を含有する容器に添加することができる。ウイルス回収物が、ウイルス接種後の数日間にわたって連日収集される場合、連日の回収物は貯溜される。その後、エンドヌクレアーゼを、貯溜後に添加することができる。

第３の実施形態によると、少なくとも１つの宿主細胞核酸分解ステップは、ウイルス単離段階中に実施される。この分解ステップは、ウイルス単離段階の任意の好適な段階で行うことができる。

本発明の方法により生産されるウイルス又はウイルス抗原は、それらの生産方法に関わりなく、ウイルス精製に使用される標準技術を使用して、更なる精製に供することができる。例えば、細胞培養ベースのウイルスのウイルス単離段階は、限外ろ過、超遠心分離（密度勾配超遠心分離を含む）、クロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー等）等の多くの様々なろ過、濃縮、及び／又は他の分離ステップ、並びに吸着ステップを様々な組合せで含むことができる。特に、そのような精製は、残留宿主細胞核酸が実質的に存在しない最終精製産物を得るために、分解された宿主細胞核酸を除去することを可能にする。「実質的に」とは、最終精製産物、つまり最終精製ウイルス又はそのウイルス抗原が、１０ｎｇ未満のＤＮＡ、特に５ｎｇ未満のＤＮＡ、その中でも特に１ｎｇ未満のＤＮＡ、更に特に０．１ｎｇ未満のＤＮＡ、好適には１００ｐｇ未満のＤＮＡ、より好適には１０ｐｇ未満のＤＮＡを含むことを意味する。

１つの実施形態では、本発明による方法は、感染細胞の細胞培養上清を収集することにより得られるウイルス回収物に最初に存在するＤＮＡ含有量と比較して、総ＤＮＡ含有量を、少なくとも２００００倍、好適には少なくとも４００００倍、より好適には少なくとも５００００倍低減することを可能にする。

更なる実施形態では、本発明による方法は、感染細胞の細胞培養上清を収集することにより得られるウイルス回収物に最初に存在するＤＮＡ含有量と比較して、総ＤＮＡ含有量を、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）アッセイで測定して、９０％を超えて、特に９５％を超えて、その中でも特に９９％を超えて、及び９９．９％をさえ超えて低減することを可能にする。

１つの実施形態では、本発明の方法は、ウイルス単離段階中に、ウイルス回収物の清澄化、限外ろ過／ダイアフィルトレーション、超遠心分離、及びクロマトグラフィー、又はそれらの任意の組合せから選択される少なくとも１つのステップを含む。所望の純度レベルに応じて、上記ステップは、いかようにも組合せることができる。

特定の実施形態では、本発明の方法は、ウイルス単離段階中に、少なくとも、ウイルス回収物の清澄化ステップ、濃縮液を提供するための限外ろ過／ダイアフィルトレーションステップ、及び１つ又は２つの超遠心分離ステップを含む。

ウイルスを含有する感染細胞の細胞培養上清を収集した後、提供されたウイルス回収物は、浮遊完全細胞又は細胞残渣等の細胞性物質からウイルスを分離するために清澄化することができる。清澄化は、ろ過ステップにより実施することができる。好適なフィルターには、セルロースフィルター、再生セルロースフィルター、無機ろ過助剤と組合せたセルロース繊維、無機ろ過助剤及び有機樹脂と組合せたセルロースフィルター、又はそれらの任意の組合せ、及びポリマー性フィルターを使用することができる。必須ではないが、例えば、適切な公称孔径を有するフィルター、特に減少する公称孔径を有するフィルターを使用して、大きな沈殿物及び細胞残渣の除去から始めることを可能にし、サイズに応じて不純物を連続的に及び徐々に除去することを含む２段階又は３段階等の多重ろ過プロセスを実施してもよい。加えて、比較的細かいフィルター又は遠心分離を使用する単一段階作業を、清澄化に使用することもできる。より一般的には、限定されないが、デッドエンドろ過（dead-end filtration）、デプスろ過（depth filtration）、精密ろ過、又は遠心分離を含み、その後のステップで膜及び／又は樹脂を詰まらせない好適な清澄性のろ過液を提供する任意の清澄化手法が、本発明の清澄化ステップで使用できる。１つの実施形態では、ウイルス清澄化ステップは、デプスろ過により、具体的には、例えば、５μｍ−０．５μｍ−０．２μｍの公称多孔度を有する３つの異なるデプスフィルターで構成される３段階連続ろ過を使用して実施される。別の実施形態では、ウイルス回収物は、遠心分離により前清澄化され、その後デプスろ過、例えば、０．５μｍ−０．２μｍの公称多孔度を有する２つの異なるフィルターで構成される連続ろ過を使用して清澄化される。

本発明によると、ウイルスを濃縮するため、及び／又は緩衝液を交換するために、ウイルス懸濁液を限外ろ過（緩衝液交換に使用される場合は、ダイアフィルトレーションと呼ばれる場合もある）に供することができる。このステップは、接種後数日にわたって灌流により収集されたウイルス回収物を貯溜する場合のように、精製しようとするウイルスが希釈されている場合に特に有利である。本発明の方法によりウイルスを濃縮するために使用されるプロセスは、希釈液はウイルス懸濁液から除去されるがウイルスはフィルターを通り抜けることができず、それによりウイルス調製物中の濃縮形態が維持できるように、希釈液を強制的にフィルターに通してウイルスの濃度を増加させる任意のろ過プロセスを含むことができる。

限外ろ過はダイアフィルトレーションを含んでもよい。ダイアフィルトレーションは、塩、糖、非水性溶媒の除去及び交換、低分子量物質の除去、イオン及び／又はｐＨ環境の迅速な変化にとって理想的な方法である。微細溶質は、限外ろ過速度と等しい速度で、限外ろ過されている溶液に溶媒を添加することにより最も効率的に除去される。これにより、一定容積の溶液から微細種が洗浄され、保持されたウイルスが単離される。下流のステップが、最適な反応を得るために特定の緩衝液の使用を必要とする場合、ダイアフィルトレーションは特に有利である。例えば、エンドヌクレアーゼを用いて宿主細胞核酸を分解する前にダイアフィルトレーションステップを実施することにより、そのエンドヌクレアーゼに特異的で最適な緩衝液中でエンドヌクレアーゼ反応を実施することが可能になる場合がある。スクロース勾配超遠心分離後のスクロース、又はホルムアルデヒドによるウイルス不活性化ステップ後のホルムアルデヒド等の望ましくない化合物を除去することが求められる場合、濃縮及びダイアフィルトレーションを、精製プロセスの任意の好適なステップで実施することもできる。この系は、３つの別個のプロセス流、すなわち供給溶液（ウイルスを含む）、透過液、及び濃縮液で構成される。応用例に応じて、異なる孔径を有するフィルターを使用することができる。本発明では、濃縮液は、ウイルスを含有しており、必要に応じて、更なる精製ステップに使用することができる。膜組成は、限定されないが、再生セルロース、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、又はそれらの誘導体であってもよい。膜は、平板（フラットスクリーンとも呼ばれる）であってもよく、又は中空繊維であってもよい。

１つの実施形態では、本発明の方法のウイルス単離段階は、少なくとも１つの限外ろ過／ダイアフィルトレーションステップ、好適には少なくとも２つの限外ろ過／ダイアフィルトレーションステップを含む。

１つの特定の実施形態では、少なくとも１つの宿主細胞核酸分解ステップが、限外ろ過／ダイアフィルトレーション後に得られる濃縮液にエンドヌクレアーゼを添加することにより実施される。

特定の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、細胞培養段階中、及び限外ろ過／ダイアフィルトレーションがウイルス単離段階中に実施された後に得られる濃縮液の両方に添加される。

本発明の方法により得られるウイルス懸濁液は、密度勾配遠心分離、例えばスクロース勾配超遠心分離及び／又はクロマトグラフィー等の当業者に一般的に公知の方法によりさらに精製することができる。しかしながら、１つの実施形態では、本発明の方法のウイルス単離ステップは、いかなるクロマトグラフィーステップも含んでいない。

したがって、ある実施形態では、ウイルス単離段階は、ウイルスを単離するために一般的に使用される技術であり当技術分野で公知である、少なくとも１つのスクロース勾配超遠心分離ステップを含む。

特定の実施形態では、本発明の方法のウイルス単離ステップは、少なくとも２つのスクロース勾配超遠心分離ステップを含む。

別の実施形態では、ウイルス単離段階は、少なくとも２つの超遠心分離ステップを含み、それらのうち１つは、スクロース勾配超遠心分離ステップであってもよい。

本発明の方法によると、スクロース勾配超遠心分離等の精製ステップをウイルス分割ステップと組合せることが可能である。特に、分割剤をスクロース勾配に添加することができる。この実施形態は、ウイルスの精製及び分割の両方が単一作業で可能になるため、本発明の方法のステップの総数を最小限に抑えることが望ましい場合、特に好適である。したがって、ある実施形態では、少なくとも１つのスクロース勾配超遠心分離が実施される場合、スクロース勾配は分割剤をさらに含む。

あるいは、本発明の方法のウイルス分割ステップは、バッチで実施される。

陰イオン性又は陽イオン性のイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過又はゲル浸透等のサイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト、又はそれらの任意の組合せを含むクロマトグラフィーによりウイルスを単離することも可能である。上記で言及したように、クロマトグラフィーステップは、密度勾配超遠心分離等の他の精製ステップと組合せて実施することができる。当業者であれば、これらのプロセスを認識し、これら追加的ステップを使用する正確な方法を変化させて、本発明の方法を最適化することができる。

ゲルろ過クロマトグラフィーは、本発明の方法により生産されるウイルス又はウイルス抗原に混入する宿主細胞タンパク質の排除をさらに向上させることが望ましい場合、特にウイルス精製段階の終わりで使用することがより好適である場合がある。当業者であれば、この技術に精通しており、生産されるウイルス及び使用する細胞に応じて条件を変化させる方法を知っているであろう。当業者であれば、例えば、ウエスタンブロット分析又はＴｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）アッセイ等の当技術分野で公知の任意のタンパク質検出法を使用することにより宿主細胞タンパク質含量をモニター及び評価する方法を知っているであろう。イオン性界面活性剤の存在下でゲルろ過クロマトグラフィーを実施する場合、宿主細胞タンパク質混入物質の分離は、より良好に達成される。界面活性剤は、イオン性又は両性イオン性のいずれであってもよく、特にエンピゲンであってもよい。エンピゲンは、精製ウイルス又はウイルス抗原の完全性を保ちつつ、宿主細胞不純物の効率的な分離を可能にする能力があるため、その使用はより好適である。界面活性剤は、デオキシコレート、サルコシン、ラウリルサルコシンナトリウム、エンピゲン、又はそれらの任意の組合せから選択することができる。界面活性剤は、様々なサブステップで添加することができる。例えば、界面活性剤は、精製を必要とするウイルス又はウイルスタンパク質含有試料に最初に添加してもよい。その後、その結果生じた混合物をゲルろ過にかけてもよく、又は界面活性剤は、最初に、ある期間、試料中でインキュベートしたままにしておいてもよい。また、界面活性剤は平衡緩衝液中に存在していてもよい。界面活性剤は、様々なサブステップで使用される場合、必ずしも同一である必要はない。例えば、試料中で使用される界面活性剤は、平衡緩衝液中で使用されるものとは異なっていてもよい。同じサブステップ内では、界面活性剤は、それらの１つ又は複数の混合物であると理解することもできる。１つの実施形態では、両性イオン性界面活性剤の存在下で実施される少なくとも１つのサイズ排除クロマトグラフィーステップ、例えばゲルろ過を含む、細胞培養で生産されたウイルス又はそのウイルス抗原を精製するための方法が提供される。

１つの実施形態では、本発明の方法のウイルス単離段階は、ゲルろ過クロマトグラフィーを含む。更なる実施形態では、ゲルろ過は、両性イオン性界面活性剤の存在下で実施され、両性イオン性界面活性剤は、精製しようとする試料中、又は平衡緩衝液中、又はその両方に存在していてもよい。界面活性剤は、様々な濃度で使用することができる。特に、０．００１％〜１％で、その中でも特に０．００５％〜０．５％で、その中でも特に０．１％で使用される。

ある実施形態では、ウイルス単離段階は、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及びそれらの組合せから選択される少なくとも１つのクロマトグラフィーステップを含む。

特定の実施形態では、ウイルス単離段階は、少なくとも１つのスクロース勾配超遠心分離と少なくとも１つのクロマトグラフィーステップとの組合せ、特にヒドロキシアパタイト又はサイズ排除を含む。この組合せは、品質を維持しつつ、ウイルス又はウイルス抗原回収の増加を可能にするので、２つのスクロース勾配超遠心分離ステップの実施と比べてより単純で有利な代替法として使用することができる。ウイルスの分割が望ましい場合、分割は、上述のようにスクロース勾配に分割剤を添加することによりスクロース勾配超遠心分離中で行ってもよく、又は下記で考察されているように特に超遠心分離後にバッチ法で行ってもよい。

したがって、本発明は、少なくとも１つのスクロース勾配超遠心分離ステップ及び１つのクロマトグラフィーステップ、具体的にはヒドロキシアパタイトを含む、細胞培養で生産されたウイルス又はそのウイルス抗原を精製するための方法も企図する。

本発明によると、ウイルス単離段階中に実施される少なくとも１つの宿主細胞核酸分解ステップは、エンドヌクレアーゼ及び／又はアルキル化剤を、精製中に行う任意の好適なステップに添加することにより実施することができる。例えば、エンドヌクレアーゼは、限外ろ過ステップの後で添加してもよい。界面活性剤が分割剤として使用される場合、界面活性剤が存在すると、最適条件下での酵素作用を妨げる凝集体の形成からＤＮＡを分離するのに役立つと予測されるため、エンドヌクレアーゼを、ウイルス分割ステップの後で添加することもできる。

ウイルス単離段階の終わりで、ウイルス調製物は、好適にはろ過滅菌法にかけられるが、これは免疫原性組成物又はワクチン等の医薬品等級物質のプロセスに一般的であり、当業者に公知である。そのようなろ過滅菌は、例えば好適には、０．２２μｍフィルターで調製物をろ過することにより実施することができる。無菌調製した後、ウイルス又はウイルス抗原は、臨床使用の準備が整ったことになる。

本発明は、更に、本発明による方法により取得可能なウイルス、本発明による方法により取得可能なウイルス又はウイルス抗原を含む組成物、及び医学におけるそれらの使用に関する。それらは、ヒト又は動物に投与するためのワクチンをもたらす任意の公知の方法により製剤化することができる。したがって、このタイプのウイルス又はウイルス抗原を含む、ワクチン等の免疫原性組成物も、本発明により企図される。

本発明は、ウイルス又はウイルス抗原、特に細胞培養産生ウイルス又はそのウイルス抗原を含み、残留宿主細胞ＤＮＡの含有量が、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）アッセイにより測定して、１０ｎｇ未満、好適には５ｎｇ未満、及びより好適には１ｎｇ未満、特に１００ｐｇ未満、及びその中でも特に１０ｐｇ未満である組成物、例えばワクチン用量等の免疫原性組成物も提供する。

本発明は、ウイルス又はウイルス抗原、特に細胞培養産生ウイルス又はそのウイルス抗原を含み、任意の残留宿主細胞ＤＮＡが、５００塩基対未満、好適には３００塩基対未満、より好適には２００塩基対未満、及び１００塩基対未満でさえあるサイズを有する組成物、例えばワクチン用量等の免疫原性組成物も提供する。

ある実施形態では、本発明のウイルス及び組成物は、サイズが６０塩基対であるＤＮＡ断片の含有量が、定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）で測定して、１ｎｇ未満、特に０．５ｎｇ未満、その中でも特に０．１ｎｇ、及び０．０１ｎｇ未満でさえあることを示す。

更なる実施形態では、本発明のウイルス及び組成物は、サイズが３００塩基対であるＤＮＡ断片の含有量が、定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）で測定して、１ｎｇ未満、特に０．５ｎｇ未満、その中でも特に０．１ｎｇ、及び０．０１ｎｇ未満でさえあることを示す。

また更なる実施形態では、本発明のウイルス及び組成物は、サイズが３００塩基対であるＤＮＡ断片の含有量が、定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）で測定して、１ｎｇ未満、特に０．５ｎｇ未満、その中でも特に０．１ｎｇ、及び０．０１ｎｇ未満でさえあり、そのサイズが６０塩基対であるＤＮＡ断片の含有量が、１ｎｇ未満、特に０．５ｎｇ未満、その中でも特に０．１ｎｇ、及び０．０１ｎｇ未満でさえあることを示す。

本発明の方法で使用するに好適な例示的エンドヌクレアーゼには、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ（商標）、ＤＮａｓｅＩ、又は当技術分野で一般的に使用される任意の他のＤＮａｓｅ及び／若しくはＲＮａｓｅが含まれる。１つの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、特定のヌクレオチド間の内部リン酸ジエステル結合を加水分解することにより迅速に核酸を加水分解し、それにより細胞ＤＮＡを断片化するＢｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）である。

エンドヌクレアーゼが使用される濃度、温度、及びインキュベーション時間は、それが使用されるステップに依存する。それは、エンドヌクレアーゼを使用するための最適条件を見出す当業者の能力内にある。エンドヌクレアーゼは、好ましくは１〜３００単位／ｍｌの範囲内で使用される。非限定的な例として、細胞培養に添加される場合、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）は、１〜１０単位／ｍｌ、特に１〜３単位／ｍｌの様々な濃度で、好適には１単位／ｍｌの濃度で使用される。製造業者によると、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）は、その核酸分解活性の最適温度は３７℃であることが判明しているが、０〜４２℃の温度範囲にわたって効果的である。しかしながら、温度によっては、インキュベーション時間を調整することが推奨されている。原則として、より低温度では、同じ結果を達成するためにより長いインキュベーション時間が必要とされる（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ社製のＢｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）パンフレットを参照）。細胞培養に添加される場合、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）反応は、細胞培養に使用される温度で行う。後のウイルス生産プロセスで実施される場合、ウイルス含有懸濁液はより濃縮されているはずであり、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）は、より高い濃度、例えば、５０〜３００単位／ｍｌ、好適には６０〜２００単位／ｍｌの様々な範囲、特に１００単位／ｍｌで使用してもよい。非限定的な例として、ウイルス精製段階の任意のステップにおいて、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）反応用のインキュベーション時間及び温度は、３７℃で１時間であってもよい。

本発明で使用されるアルキル化剤には、アルキルラジカルを化合物に導入する物質が含まれる。特に、アルキル化剤は、ＢＰＬ又はエチレンイミン等のモノアルキル化剤である。国際公開第２００７／０５２１６３号パンフレットでは、最終産物に付随したままのあらゆる残留機能性細胞培養ＤＮＡを分解するためのＢＰＬの使用が開示されている。ＢＰＬは、種々の生体分子と反応し、特に、ウイルスゲノムの核酸塩基を修飾し、その複製を阻止する（Budowsky et al. 1993, Vaccine, 11(3): 343-348）。ＢＰＬは、無毒性産物であるβ−プロピオン酸及びラケート（lacate）の異性体へと完全に加水分解されるため、３７℃で２時間加熱することにより迅速に不活化することができる。ＢＰＬは、その反応を停止するのに中和剤を必要としない。過剰なＢＰＬは、チオ硫酸塩を添加することにより、ウイルス完全性を維持しつつ容易に中和することができる。ＢＰＬ処理の最適条件は、核酸、特にＤＮＡの分解に及ぼすＢＰＬの効果を様々な条件においてモニターすることにより決定されるだろう。核酸分解を測定するための方法は、下記に記述及び考察されている。これらの方法は、ＤＮＡサイズの測定に依存する。したがって、ＤＮＡ分解効率を評価しようとする場合、例えば、分解ステップに移行する前にＤＮＡサイズを測定し、分解ステップに移行し、そして分解ステップを行った後でＤＮＡサイズを測定することが可能である。ＤＮＡ分解ステップ前後にサイズを比較し、分解後にＤＮＡサイズの減少が観察されれば、そのステップの有効性が示されることになる。

宿主細胞核酸分解は、１％未満のＢＰＬで達成することができる。好適には、ＢＰＬは、０．０１％〜０１％の範囲の濃度、より好適には０．５％の濃度で使用される。アルキル化剤は、好適には緩衝化溶液に添加され、ｐＨ溶液は、５〜１０の間に維持される。より好適には、溶液のｐＨは、６〜９の間に維持される。更により好適には、溶液のｐＨは、７〜８の間に維持される。インキュベーション時間は、様々であってもよい。特に、ＢＰＬは、好適には終夜インキュベートされる。ＢＰＬは、広範囲の温度で活性である。本発明の１つの実施形態では、ＢＰＬは、２〜８℃の範囲の温度でインキュベートされる。別の実施形態では、ＢＰＬは室温でインキュベートされる。

１つの実施形態では、ＢＰＬは、クエン酸含有リン酸緩衝液中で使用される。

ＢＰＬには、単一作業内で２つの効果を達成するという利点、すなわち混入宿主細胞核酸を分解すること、及びウイルス調製物を不活化することを可能にするという利点がある。しかしながら、本発明による方法は、ＢＰＬの単一使用に限定されておらず、上述のように複数のＢＰＬステップが企図される。ＢＰＬは、本方法の任意の好適なステップで添加することができる。ＢＰＬを細胞培養に添加するのではなく、ウイルス単離段階の任意のステップに添加されるのが好ましい。加えて、ＢＰＬとは異なる不活化剤を使用することも、本発明の範囲内にある。本発明の方法では、ＢＰＬステップは、好適には１つのエンドヌクレアーゼステップと組合せて使用される。特に、エンドヌクレアーゼは、細胞培養段階中に又はウイルス回収物に添加され、ＢＰＬは、ウイルス単離段階中に添加される。例えば、ＢＰＬは、清澄化されたウイルス回収物に添加される。つまりウイルス回収物が清澄化ステップにかけられた後で添加される。あるいは、ＢＰＬステップは、好適には２つのエンドヌクレアーゼステップと組合せて使用される。特に、１つのヌクレアーゼステップは、細胞培養段階中に実施され、第２のステップは、ウイルス単離段階中に、例えば、清澄化されたウイルス回収物が限外ろ過／ダイアフィルトレーションにより濃縮された後で実施され、ＢＰＬは、ウイルス単離段階の任意のステップで、特に第２のエンドヌクレアーゼステップの直後に添加される。１つの実施形態では、ＢＰＬは、清澄化された回収物に添加され、清澄化された回収物は、限外ろ過により濃縮され、エンドヌクレアーゼは、限外ろ過システムから取り出した濃縮液に添加される。

本発明の免疫原性組成物、特にワクチンは、一般的にはサブビリオン形態、例えば、脂質エンベロープが溶解されているか又は分解されている分割ウイルスの形態で、又は１つ若しくは複数の精製ウイルスタンパク質（サブユニットワクチン）の形態で製剤されるだろう。代案として、免疫原性組成物は、全ウイルス、例えば生弱毒化全ウイルス、又は不活化全ウイルスを含んでいてもよい。

インフルエンザウイルス等のウイルスを分割する方法は、当技術分野で周知である（国際公開第０２／２８４２２号パンフレット）。ウイルスの分割は、分解濃度の分割剤を用いて、感染性（野生型又は弱毒化）か又は非感染性（不活化）かに関わらず、全ウイルスを分解又は断片化することにより実施される。分割剤には、一般的に、脂質膜を分解及び溶解可能な作用剤が含まれる。伝統的に、分割インフルエンザウイルスは、トリ−ｎ−ブチルホスフェート、又はＴｗｅｅｎ（商標）と組合せたジエチルエーテル（「Ｔｗｅｅｎ−エーテル」分割として知られている）等の溶媒／界面活性剤処理を使用して生産され、このプロセスは、幾つかの生産設備で未だに使用されている。現在使用されている他の分割剤には、界面活性剤又はタンパク質分解酵素又は胆汁酸塩、例えばデオキシコール酸ナトリウムが含まれる。分割剤として使用することができる界面活性剤には、陽イオン性界面活性剤、例えば臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、他のイオン性界面活性剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、タウロデオキシコレート、又はＴｗｅｅｎ若しくはトリトンＸ−１００等の非イオン性界面活性剤、又は任意の２つ以上の界面活性剤の組合せが含まれる。

１つの実施形態では、分割剤はデオキシコレートである。別の実施形態では、分割剤はトリトンＸ−１００である。更なる実施形態では、本発明による方法では、分割剤としてトリトンＸ−１００及びラウリル硫酸ナトリウムの組合せが使用される。

分割プロセスは、バッチプロセス、連続プロセス、又は半連続プロセスとして実施することができる。バッチで実施される場合、分割ウイルスは、クロマトグラフィーステップ等の、界面活性剤を除去するための追加的精製ステップが必要とされる場合がある。精製ステップと同時に分割を実施することが可能であるため、分割ステップそれ自体は実施する必要はない。例えば、界面活性剤は、上述のように、超遠心分離によりウイルスを精製することを目的としたスクロース勾配に添加することができる。

スクロース勾配から収集された分割ウイルス貯留は、例えば、細胞の５０％を感染可能なウイルスの量を表す、貯留の組織培養感染量（ＴＣＩＤ_５０／ｍｌ）を測定することにより一般的に検出されるような、依然として感染性であるウイルスの残留画分を含有している場合がある。試験しようとする感染性試料について一連の連続希釈を実施し、各希釈の一部を感染可能な細胞への接種に使用する。ウイルスが感染性である場合に複製できるように、細胞を数日間インキュベートした後、ウイルスの存在は、当業者に公知の２つの読み取り法、つまり細胞の細胞変性効果（ＣＰＥ）の分析及び／又は培養液上清で実施されるニワトリ赤血球による血球凝集反応アッセイにより検出することができる。その後、ウイルス力価は、Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法により計算される（Reed, L.J. and Muench, H., 1938, The American Journal of Hygiene 27: 493-497）。

ウイルス感染力の排除をさらに増加させることが望ましい場合、スクロース勾配超遠心分離ステップから分割ウイルス貯留を収集した後、高濃度の非イオン性界面活性剤の存在下で分割ウイルスを保管するステップを、随意に実施することができる。この保管ステップで使用される界面活性剤は、スクロース勾配超遠心分離ステップで使用されるものと同一であっても又は異なっていてもよい。界面活性剤の濃度は、０．１％から１％まで、好適には０．２％から０．５％まで変動してもよく、より好適には０．３％である。保管は、任意の温度で行うことができ、特に４℃〜３７℃、その中でも特に室温で行うことができる。保管は、１〜５日間継続してもよく、より具体的には３日間である。１つの実施形態では、スクロース勾配超遠心分離ステップであり、該スクロース勾配がウイルスを分割するための界面活性剤を含むステップと、１〜５日間０．１％〜０．５％の非イオン性界面活性剤、特にトリトンＸ−１００の存在下で該スクロース勾配から収集された分割ウイルス貯留のインキュベーションステップとを含む、細胞培養で生産されたウイルス又はそのウイルス抗原を精製するための方法が提供される。

別の実施形態では、界面活性剤を含有するスクロース勾配超遠心分離ステップが実施される宿主細胞核酸を分解するための本発明による方法は、０．１％〜０．５％、特に０．３％の非イオン性界面活性剤、特にトリトンＸ−１００の存在下でスクロース勾配から収集されたウイルス貯留の連続保管ステップをさらに含む。

ワクチンの安全性のため、精製プロセスの様々なステップにわたってウイルス懸濁液の感染力を低減することが必要とされる場合がある。ウイルスの感染力は、ウイルスが細胞系で複製する能力により決定される。したがって、本発明による方法は、随意に、少なくとも１つのウイルス不活化ステップを含む。以前に記述されているように、不活化は、本方法の任意の好適なステップでＢＰＬを使用することにより実施することができる。あるいは、不活化は、加熱、ホルムアルデヒド、又はＵＶ等の当技術分野で公知の他の不活化剤を用いて達成することができる。特定の実施形態では、本発明による方法は、ＢＰＬ、ホルムアルデヒド、及びＵＶから選択される１つ又は複数の不活化剤を用いてウイルスを不活化することをさらに含む。１つの特定の実施形態では、本発明による方法は、少なくとも１つのＢＰＬ処理ステップをさらに含む。特定の実施形態では、本発明による方法は、少なくとも１つのＢＰＬ処理ステップ及び少なくとも１つのホルムアルデヒド処理ステップをさらに含む。ホルムアルデヒド及びＢＰＬは、連続して任意の順序で使用することができ、例えばホルムアルデヒドは、ＢＰＬの後に使用される。ウイルス不活化の条件は様々であってもよく、組織培養感染量（ＴＣＩＤ_５０／ｍｌ）を測定することにより残留ウイルス感染力を評価することにより特に決定されるだろう。

ワクチンを含む本発明の免疫原性組成物は、随意にワクチン用に通例となっている添加剤、特に組成物を受容する患者で誘発される免疫応答を増加させる物質、つまりいわゆるアジュバントを含有することができる。

１つの実施形態では、免疫原性組成物は、好適な医薬担体と混合された、本発明により取得可能なウイルス又はそのウイルス抗原を含む。特定の実施形態では、それらはアジュバントをさらに含む。

アジュバント組成物は、代謝可能な油及び乳化剤を含む水中油型乳剤を含んでいてもよい。任意の水中油型組成物がヒト投与に好適であるためには、乳剤系の油相は、代謝可能な油で構成されていなければならない。代謝可能な油という用語の意味は、当技術分野で周知である。代謝可能とは、「代謝により変換することが可能である」と定義することができる（Dorland’s Illustrated Medical Dictionary, W.B. Sanders Company, 第25版 (1974)）。油は、任意の植物油、魚油、動物油、又は合成油であってもよく、受容者に毒性でなく、代謝により変換が可能である。ナッツ、種子、及び穀物は、植物油の一般的供給源である。合成油も本発明の一部であり、ＮＥＯＢＥＥ（登録商標）等の市販の油が含まれていてもよい。

特に好適な代謝可能な油は、スクアレンである。スクアレン（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン）は、鮫肝油中に多量に見出され、オリーブ油、麦芽油、米糠油、及び酵母中により少量見出される不飽和油であり、本発明で使用するために特に好ましい油である。スクアレンは、コレステロール生合成の中間体であるという事実により、代謝可能な油である（メルクインデックス、第１０版、エントリー番号８６１９）。本発明の更なる実施形態では、代謝可能な油は、免疫原性組成物中に、組成物の全容積の０．５％〜１０％（容積／容積）の量で存在する。

水中油型乳剤は、乳化剤をさらに含む。乳化剤は、適切にはポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートであってもよい。さらに前記乳化剤は、好適には、ワクチン又は免疫原性組成物中に、組成物の全容積の０．１２５〜４％（容積／容積）存在する。

本発明の水中油型乳剤は、随意にトコールを含む。トコールは、当技術分野で周知であり、欧州特許第０３８２２７１号明細書に記述されている。好適には、トコールは、α−トコフェロール又はα−トコフェロールスクシナート（ビタミンＥスクシナートとしても知られている）等のその誘導体であってもよい。前記トコールは、好適にはアジュバント組成物中に、免疫原性組成物の全容積の０．２５％〜１０％（容積／容積）の量で存在する。

水中油型乳剤を生成する方法は、当業者に周知である。一般的には、その方法は、油相（随意にトコールを含む）をＰＢＳ／ＴＷＥＥＮ８０（商標）溶液等の界面活性剤と混合し、その後ホモジナイザーを使用して均質化することを含み、少量の液体を均質化するには、混合物を注射器針に２回通すことを含む方法が好適であることは、当業者であれば明らかだろう。同様に、当業者であれば、マイクロ流動化器（microfluidiser）（Ｍ１１０Ｓマイクロ流体装置、最高５０回通過、最大圧力入力６ｂａｒ（約８５０ｂａｒの出力圧力）で２分間）による乳化プロセスを調整して、より少量又はより大量の乳剤を生成することができるだろう。この調整は、要求直径の油滴で調製が達成されるまで、結果的に生じる乳剤の測定を含む日常的な実験作業により達成することができるだろう。

水中油型乳剤では、油及び乳化剤は水性担体中にある。水性担体は、例えばリン酸緩衝生理食塩水であってもよい。

特に、本発明の水中油型乳剤系は、サブミクロン範囲の小さな油滴サイズを有する。好適には、液滴サイズは、直径が１２０〜７５０ｎｍの範囲、特に１２０〜６００ｎｍのサイズであろう。更により具体的には、水中油型乳剤は、強度(intensity)で少なくとも７０％が、５００ｎｍ未満の直径であり、特に強度で少なくとも８０％が、３００ｎｍ未満の直径であり、その中でも特に強度で少なくとも９０％が、１２０〜２００ｎｍの範囲の直径である油滴を含有する。

油滴サイズ、つまり直径は、本発明によると、強度により与えられる。油滴サイズの直径を強度により決定するには幾つかの方法がある。強度は、サイズ測定装置、好適には、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ４０００又は好適にはＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ３０００ＨＳ等の動的光散乱を使用することにより測定される。詳細な手順は、実施例ＩＩ．２に示されている。第１の可能性は、動的光散乱（ＰＣＳ−光子相関分光法）によりｚ平均直径ＺＡＤを決定することであり、この方法では、多分散性指数（ＰＤＩ）がさらにもたらされ、ＺＡＤ及びＰＤＩは両方ともキュミュラントアルゴリズムで算出される。これらの値は、粒子屈折率に関する知識を必要としない。第２の手段は、別のアルゴリズムであるＣｏｎｔｉｎ、又はＮＮＬＳ、又は自動化「Ｍａｌｖｅｒｎ」アルゴリズム（サイズ測定装置により提供される初期設定アルゴリズム）のいずれかにより全粒度分布を決定することにより、油滴の直径を計算することである。ほとんどの場合、複雑な組成物の粒子屈折率は未知であるため、強度分布のみが考慮され、必要に応じて、強度平均はこの分布からもたらされる。

アジュバント組成物は、トール様受容体（ＴＬＲ）４アゴニストをさらに含んでいてもよい。「ＴＬＲ４アゴニスト」とは、リガンドとして直接的に、又は内在性若しくは外来性リガンドの生成により間接的に、ＴＬＲ４シグナル伝達経路を介してシグナル伝達応答を引き起こすことが可能な成分を意味する（Ｓａｂｒｏｅ ｅｔ ａｌ， ＪＩ２００３ ｐ１６３０−５）。ＴＬＲ４は、リピドＡ誘導体、特にモノホスホリルリピドＡ、又はその中でも特に３脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）であってもよい。

３Ｄ−ＭＰＬは、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ社によるＭＰＬ（登録商標）の商標で入手可能であり、ＩＦＮ−ｇ（Ｔｈ１）表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞応答を主に促進する。３Ｄ−ＭＰＬは、英国特許出願公開第２ ２２０ ２１１号明細書に開示されている方法により生成することができる。化学的には、これは、３、４、５、又は６つのアシル化鎖を有する３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡの混合物である。特に、本発明のアジュバント組成物では、小粒子３Ｄ−ＭＰＬが使用される。小粒子３Ｄ−ＭＰＬは、０．２２μｍフィルターで滅菌ろ過することができるような粒子サイズを有する。そのような調製物は、国際公開第９４／２１２９２号パンフレットに記述されている。リピドＡの合成誘導体は公知であり、ＴＬＲ４アゴニストであると考えられており、これらに限定されないが、以下のものを含む：
ＯＭ１７４（２−デオキシ−６−Ｏ−［２−デオキシ−２−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラ−デカノイルアミノ］−４−Ｏ−ホスホノ−β−Ｄ−グルコピラノシル］−２−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］−α−Ｄ−グルコピラノシルジヒドロゲンホスフェート）、（国際公開第９５／１４０２６号パンフレット）
ＯＭ２９４ ＤＰ （３Ｓ，９Ｒ）−３−［（Ｒ）−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９（Ｒ）−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］デカン−１，１０−ジオール，１，１０−ビス（ジヒドロゲノホスフェート）（国際公開第９９／６４３０１号パンフレット及び国際公開第００／０４６２号パンフレット）
ＯＭ１９７ ＭＰ−Ａｃ ＤＰ（３Ｓ−、９Ｒ）−３−［（Ｒ）−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］デカン−１，１０−ジオール，１−ジヒドロゲノホスフェート１０−（６−アミノヘキサノアート）（国際公開第０１／４６１２７号パンフレット）
使用することができる他のＴＬＲ４リガンドは、国際公開第９８５０３９９号パンフレット又は米国特許第６３０３３４７号明細書（ＡＧＰを調製するためのプロセスも開示されている）で開示されているもの等のアルキルグルコサミニドホスフェート（ＡＧＰ）、又は米国特許第６７６４８４０号明細書で開示されているようなＡＧＰの薬学的に許容される塩である。幾つかのＡＧＰは、ＴＬＲ４アゴニストであり、幾つかは、ＴＬＲ４アンタゴニストである。両方ともアジュバントとして有用であると考えられる。加えて、さらに好適なＴＬＲ−４アゴニストは、米国特許出願公開第２００３／０１５３５３２号明細書及び米国特許出願公開第２２０５／０１６４９８８号明細書で開示されている。

本発明は、ワクチンを含むインフルエンザウイルス免疫原性組成物を調製するために特に好適である。種々の形態のインフルエンザウイルスが、現在入手可能である。それらは、一般的に、生ウイルス又は不活化ウイルスのいずれかに基づく。不活化ワクチンは、全ビリオン、分割ビリオン、又は精製された表面抗原（ＨＡを含む）に基づいていてもよい。インフルエンザ抗原は、ビロソーム（無核酸のウイルス様リポソーム粒子）の形態で提示することもできる。

ウイルス不活性化法及び分割法は上述されており、インフルエンザウイルスに適用可能である。

ワクチンに使用するためのインフルエンザウイルス株は、季節毎に変化する。現行の大流行間期では、ワクチンは、典型的には２つのインフルエンザＡ型株及び１つのインフルエンザＢ型株を含んでいる。三価ワクチンが典型的であるが、四価等のより高い価数も本発明で企図される。本発明は、大流行株（つまりワクチン受容者及び一般ヒト集団が免疫学的に未感作である菌株）に由来するＨＡを使用することもでき、大流行株のインフルエンザワクチンは一価であってもよく、大流行株で補完された通常の三価ワクチンに基づいていてもよい。

本発明の組成物は、インフルエンザＡ型ウイルス及び／又はインフルエンザＢ型ウイルスを含む、１つ又は複数のインフルエンザウイルス株に由来する抗原（複数可）を含んでいてもよい。特に、２つのインフルエンザＡ型ウイルス株及び１つのインフルエンザＢ型ウイルス株に由来する抗原を含む三価ワクチンが、本発明により企図される。

本発明の組成物は、一価組成物、つまり１つの菌株タイプのみ、つまり季節性株のみ又は大流行株のみを含むものに制限されない。本発明は、季節性株及び／又は大流行株の組合せを含む多価性組成物も包含する。特に、３つの季節性株及び１つの大流行株を含み、アジュバント化されていもよい四価組成物は、本発明の範囲内にある。本発明の範囲内にある他の組成物は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、及びＢ型株等の、２つのＡ型株及び１つのＢ型株を含む三価組成物、並びにＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ、及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ等の異なる系統の２つのＡ型株及び２つのＢ型株を含む４価組成物である。

ＨＡは、現行の不活化インフルエンザワクチンの主な免疫原であり、ワクチン用量は、典型的にはＳＲＤにより測定されるＨＡレベルを基準にすることにより正規化される。既存のワクチンは典型的には１株当たり約１５μｇのＨＡを含有しているが、例えば、小児用には、又は大流行の状況においては、又はアジュバントを使用する場合は、より低い用量を使用することができる。半量（つまり１株当たり７．５μｇのＨＡ）又は４分の１量等の分割量が使用されており、同様により高い用量、特に３倍又は９倍の用量も使用されている。したがって、本発明の免疫原性組成物は、１インフルエンザ株当たり０．１〜１５０μｇ、特に０．１〜５０μｇ、例えば０．１〜２０μｇ、０．１〜１５μｇ、０．１〜１０μｇ、０．１〜７．５μｇ、０．５〜５μｇ等のＨＡを含んでいてもよい。特定の用量には、１株当たり約１５、約１０、約７．５、約５μｇ、１株当たり約３．８μｇ、及び１株当たり約１．９μｇが含まれる。

特定の菌株のインフルエンザウイルスが精製されれば、例えば、上述のような三価ワクチンを製作するために、他の菌種に由来するウイルスと混合することができる。ウイルスを混合し、ＤＮＡを分解し、多価性混合物からそれを精製するのではなく、各菌株を別々に処理し、一価性バルクを混合して、最終多価性混合物を得ることがより好適である。

本方法で使用される核酸分解処理は、本方法により生産されるウイルス又はウイルス抗原の免疫原性の保存を可能にするため、本発明の方法は、特に有用である。特に、本発明の方法により生産されるインフルエンザウイルス、その中でも特にＨＡ抗原は、従来の卵で生産されるＨＡ抗原と少なくとも同じ程度に免疫原性である。免疫原性を評価する方法は、そのための古典的な技術に精通している当業者の知識の一部である。

残留宿主細胞核酸の測定は、当業者の通常の能力内にある。ＤＮＡ量及びＤＮＡサイズを両方とも測定するために使用されるアッセイは、典型的には検証済アッセイであろう。検証済アッセイの性能特性は、数学的及び数量化可能な用語で記述することができ、その考え得る誤差発生源が特定されているだろう。このアッセイは、一般的には、正確性、精度、特異性等の特徴について試験されているだろう。このアッセイが、例えば既知の標準量の宿主細胞ＤＮＡに対して較正され試験されていれば、定量的ＤＮＡ測定を日常的に実施することができる。例としては、ＤＮＡ定量化の３つの主要技術を使用することができる。第１の方法であるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社製のＴｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）系は、そのサイズに関わりなく全ＤＮＡの存在の検出を可能にする感度の高い正確な方法である。したがって、本発明の意味では、「全ＤＮＡ」という用語は、任意のサイズのＤＮＡとして理解されるべきである。しかしながら、この方法では、検出される残留ＤＮＡのサイズを特定することは可能ではない。残留宿主細胞ＤＮＡのサイズを特徴付けるためには、サザンブロット等のハイブリダイゼーション法及び定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）を使用することができる。これらの技術は全て、本発明の方法の様々なステップにわたって残留宿主細胞ＤＮＡの量及びサイズをモニターするために使用することができる。サザンブロットは、残留宿主細胞ＤＮＡのサイズ分布の視覚化を直接的な方法で可能にする。サイズ分布は、既知量の適切な標準ＤＮＡ、例えば宿主細胞ゲノムＤＮＡと比較して、例えば、ＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒ（Ｓｔｏｒｍ ８６０型；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）により、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ分析ソフトウェア（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を使用して半定量化することができる。言い換えれば、サザンブロット分析は、試験される試料内に存在するＤＮＡのサイズ（複数可）及び量を決定することを可能にする。その一方で、Ｑ−ＰＣＲは、任意の所望サイズの任意の所望の特定配列を標的とすることが可能であり、試験される試料中のその存在が定量化される。本発明による方法は、残留宿主細胞ＤＮＡのサイズ及び量を大きく低減することが目的であるため、予測される残留ＤＮＡが非常に少量である故に、残留ＤＮＡを測定するために使用される方法の感度が問題となる場合がある。特に、大量の出発物質が必要とされる場合があり、ＤＮＡ濃縮ステップの実施が必要とされる場合がある。この種の問題を克服する非限定的な方法は、ウイルス生産に使用された宿主細胞のゲノムに非常に豊富に存在する適切なサイズの配列をＱ−ＰＣＲで標的とすることである。例えば、２つの高度反復配列がイヌゲノムで同定されており、そのサイズは、それぞれ６３塩基対及び３１４塩基対である。試験される試料がイヌ腎臓に由来するＭＤＣＫ細胞を起源とする場合、これら配列を選択することにより、アッセイの感度が増加する。これら２つの配列は、短鎖散在反復ＤＮＡ配列（ＳＩＮＥ）及び長鎖散在反復ＤＮＡ配列（ＬＩＮＥ）と呼ばれる（Bentolila et al. 1999, Mamm. Genome 10(7):699-705）。これらＳＩＮＥ及びＬＩＮＥ配列は、アヒル等の他の種でも同定されている（Walker, J.A., et al. 2004. Genomics. 83(3): 518-527）。したがって、任意の所望の種のゲノムの任意の適切な配列を選択すること、Ｑ−ＰＣＲによりその配列の増幅を可能にするプライマーを設計すること、及び残留ＤＮＡのサイズ分布及び量を評価するための分析ツールとしてその配列を使用することは、本発明の範囲内にある。アッセイの感度を増加させることにより、出発物質の量及びその物質中のＤＮＡ濃度は、もはやそれほど重要ではなくなる。例えば、生産プロセスの任意のステップで得られたウイルス調製物、特に、本発明による方法の終わりで取得された精製ウイルスから、いかなる以前のＤＮＡ抽出及び／又は濃縮ステップに移行せずに、直接Ｑ−ＰＣＲを実施することが可能であり得る。試験される試料中に潜在的な阻害分子が存在するため、反応中にＰＣＲ阻害が起こる場合があるので、各Ｑ−ＰＣＲ反応は重複して実施することが望ましい場合がある。２つの反応のうちの１つには、Ｑ−ＰＣＲ阻害がもしあればそれを推定し、必要に応じて最終値を修正するために、ウイルス生産に使用したものと同じ供給源に由来する既知量のＤＮＡを混ぜる（spike）べきである。ＤＮＡ抽出／濃縮のステップが実施される場合、そのステップ中に潜在的な物質の損失が生じる場合があるため、ＤＮＡ回収の効率を評価することが有用である場合がある。例えば、損失の程度がＤＮＡ断片のサイズにより変わる場合があるため、ＤＮＡ抽出／濃縮に移行する前に、既知量の種々のサイズの特定の外部ＤＮＡ増幅産物を試料に混ぜてもよい。標的配列を増幅するためのＱ−ＰＣＲと平行に、様々な外部ＤＮＡ増幅産物を増幅するＱ−ＰＣＲを実施して、混ぜられた断片のＤＮＡ回収率を決定する。回収が完全でない場合、所望の標的配列の量を推定する最終値は、試料中に存在するＤＮＡの量を正確に反映し、それを過小評価しないように、回収率に従って修正される。Ｑ−ＰＣＲは、任意の所望の長さの任意の所望のＤＮＡ配列を定量化することが可能であり、単一試料内の多数の異なる配列の定量化を可能にする有利な技術である。Ｑ−ＰＣＲ反応に移行する際は、幾つかのプライマー組を、同じ反応チューブ内で混合してもよく、又はプライマー組の数と一致する数の一定量に同一試料を等分してもよく、そのためＰＣＲ条件は、各プライマー組の特徴により変わる場合がある。

したがって、本発明の態様によると、細胞培養ベースのウイルス生産方法の様々なステップにわたってＤＮＡプロファイルをモニターすることが可能である。特に、全ＤＮＡ量は、例えばＴｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）アッセイでＤＮＡ量を測定することによりモニターすることができ、全ＤＮＡ量を低減させるにあたって、各ステップの効率及びプロセス全体の全体的効率をそれぞれ反映する、当該プロセスの各ステップの除去倍率及び総除去倍率を確立することが可能である。任意の所望のサイズの任意の特定配列の量も、適切な組のプライマーを設計し、Ｑ−ＰＣＲによりそれらを増幅することにより、ウイルス生産プロセスにわたってモニターすることができる。また、残留細胞ＤＮＡの分布は、サザンブロット分析により、プロセスの任意の時点で評価することができる。

ある実施形態では、本発明の方法により得られるウイルス又はそのウイルス抗原は、１ｎｇ未満、特に０．５ｎｇ未満、その中でも特に０．１ｎｇ未満、及び０．０１ｎｇ未満でさえある６０塩基対長のＤＮＡ断片を含む。

更なる実施形態では、本発明のウイルス又はそのウイルス抗原は、０．５ｎｇ未満、特に０．１ｎｇ未満、及び０．０１ｎｇ未満でさえある３００塩基対長のＤＮＡ断片を含む。

また更なる実施形態では、本発明のウイルス及びウイルス抗原は、１ｎｇ未満、特に０．５ｎｇ未満、その中でも特に０．１ｎｇ未満、及び０．０１ｎｇ未満でさえある６０塩基対長のＤＮＡ断片、並びに０．５ｎｇ未満、その中でも特に０．１ｎｇ未満、及び０．０１ｎｇ未満でさえある３００塩基対長のＤＮＡ断片を含む。

本発明は、下記の非限定的な例を参照することによりさらに説明される。

ウイルス単離段階中にエンドヌクレアーゼを用いて実施された１つのＤＮＡ分解ステップの存在下における、ＭＤＣＫ細胞でのインフルエンザウイルスの生産（ＪＰ１１５−Ｊｉａｎｇｓｕ Ｂ型株、ＮＣＰ１１７−Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ Ａ型株）
１．ウイルス増殖
ＭＤＣＫ接着細胞を、３６．５℃で、２０リットルの撹拌バイオリアクター規模の灌流培養法によりマイクロキャリア上で増殖させた。増殖段階の後、適切な細胞密度（７×１０^６細胞／ｍｌ超）に到達したら、インフルエンザウイルス（１×１０^−５の感染多重度）を灌流法で細胞に接種し、温度を３３℃に切替えた。ウイルスを、接種後の３及び４日目（ＪＰ１１５）に、又は接種後の３、４、及び５日目（ＮＣＰ１１７）に、灌流により細胞培養培地を収集することによって回収した。灌流回収物を貯留し、次の処理まで２〜８℃の範囲の温度で保管した。

２．ウイルス単離
ａ）ウイルス回収物を、５μｍ−０．５μｍ−０．２μｍの公称多孔度を有する３つの異なるデプスフィルターで構成される連続ろ過で清澄化した。清澄化された回収物を、２〜８℃の範囲の温度で終夜保管した。

ｂ）その後、清澄化された回収物を、７５０ｋＤの中空糸膜で限外ろ過することにより１０倍に濃縮し、１２５ｍＭクエン酸及び０．００１％トリトンＸ−１００ ｐＨ７．４を含有する５容積のＰＢＳ、及び１０ｍＭトリス、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１００μＭ ＣａＣｌ_２、０．００１％トリトンＸ−１００ ｐＨ８の４容積に対してダイアフィルトレートした。

ｃ）濃縮液を限外ろ過システムから取り出し、水浴で３７℃まで暖めた。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）（Ｍｅｒｃｋ社製）を２７０単位／ｍｌ（ＪＰ１１５）又は１３５単位／ｍｌ（ＮＣＰ１１７）の終濃度で濃縮液に添加することにより、ＤＮＡ分解を実施し、混合物を３７℃で１時間インキュベートした。

ｄ）次に、４００ｍｌのローターを使用して、限外ろ過濃縮液をスクロース勾配（０〜５５％）超遠心分離にかけ、ウイルス及び夾雑物をそれぞれの密度に到達するまで勾配を移動させる。濃縮液を全て勾配に負荷したら、６０分間の取扱時間で、ほとんどのウイルスを勾配内でその密度に到達させることが可能である。ウイルス粒子を少数の画分内に濃縮した。産物画分は、１２５ｍＭクエン酸及びスクロースを含有するＰＢＳ ｐＨ ７．４に入れた。精製された全ビリオンを、およそ２８〜５０％の範囲のスクロースから貯留した。この範囲は、抗ＨＡ及び抗ＭＤＣＫ抗体を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析からのプロファイルに基づいて決定された。全ビリオンを貯留した画分を、２〜８℃の範囲の温度で保管し、その後ＰＢＳ ｐＨ７．４（ＮＣＰ１１７）又はＰＯ_４ ６６ｍＭ ｐＨ７．４（ＪＰ１１５）で９〜１０倍に希釈した。

ｅ）ウイルスをさらに精製し、同時にウイルスを分割するため、第２のスクロース勾配超遠心分離を実施した。１％トリトンＸ−１００、１％デオキシコレート、及び０．５ｍＭα−トコフェリル水素スクシナートの組合せ（ＪＰ１１５）、又は１％トリトンＸ−１００及び０．５％ラウリル硫酸ナトリウムの組合せ（ＮＣＰ１１７）をスクロース層に添加して、界面活性剤ミセル障壁を達成した。この界面活性剤障壁に進入する全ウイルスが分割された。ウイルス膜タンパク質赤血球凝集素（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含有するウイルス断片は、ミセル密度部分に移動した。残りのビリオン、宿主細胞タンパク質夾雑物の幾つか及びＤＮＡは、ウイルスタンパク質と共には貯留されないより高いスクロース濃度の画分に移動した。およそ１５〜４０％スクロースの範囲の画分に存在するウイルスタンパク質を貯留した。この範囲は、抗ＨＡ及び抗ＭＤＣＫ抗体を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析からのプロファイルに基づいて決定された。ウイルスタンパク質を含有する画分貯留は、ＰＢＳ ｐＨ７．４に入れた。その後、この貯留を全タンパク質含有量についてアッセイし、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０及びα−トコフェリル水素スクシナート０．１ｍＭ ｐＨ７．４（ＮＣＰ１１７）を含有するＰＢＳ又はＰＯ_４ ６６ｍＭ ｐＨ７．４（ＪＰ１１５）で、２５０μｇタンパク質／ｍｌに希釈した。

ｆ）ホルムアルデヒドを、界面活性剤で不活化されたウイルス貯留に添加して、ウイルスをさらに不活化した。ホルムアルデヒドは、２５０μｇの全タンパク質につき５０μｇの比率で添加する。ホルムアルデヒド添加直後に、０．２μｍ滅菌等級ろ過を実施した。インキュベーションは、無菌条件下、室温で７２時間継続する。

ｇ）ホルムアルデヒド不活化からの産物を、２００ｍＭ ＮａＣｌ（ＪＰ１１５）又は２５０ｍＭ（ＮＣＰ１１７）で補完し、陰イオン交換膜でろ過して、膜に結合する残留ＤＮＡを除去した。ＮａＣｌの添加は、産物が膜に結合するのを防止するものであり、したがって前記産物は、膜通過画分に収集される。

ｈ）バイオビーズ−ＳＭ２、つまり界面活性剤吸着に対して高度に特異的な区域を有する微孔ジビニル−ベンゼン架橋ポリスチレンを、陰イオン交換膜通過画分にバッチで添加し、撹拌しながら室温で１時間インキュベートした。このステップの終わりで、バイオビーズ−ＳＭ２を取り除いた。

ｉ）その後、ウイルスタンパク質を濃縮し、３０ｋＤのセルロース再生平板Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製）を使用して、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０及び０．１ｍＭα−トコフェリル水素スクシナートを含有するＰＢＳ ｐＨ７．４に対してダイアフィルトレーションし、残留スクロース及びホルムアルデヒド量を低減した。

ｊ）その結果生じたバルクを、クラス１００の無菌区域で０．２μｍ膜によりろ過した。必要に応じて、バルクを、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０及び０．０１％トリトンＸ−１００を含有するＰＢＳ ｐＨ７．４でろ過中に希釈して、全タンパク質濃度をおよそ４５０μｇ／ｍｌに調整した。その結果生じた無菌製剤を、一価精製バルクと称した。

エンドヌクレアーゼ及びＤＮＡアルキル化剤を用いて実施された複数ステップのＤＮＡ分解の存在下における、ＭＤＣＫ細胞でのインフルエンザウイルス生産
１．ウイルス増殖
ＭＤＣＫ接着細胞を、３６．５℃で、２０リットルの撹拌バイオリアクター規模の灌流培養法によりマイクロキャリア上で増殖させた。増殖段階の後、適切な細胞密度（７×１０^６細胞／ｍｌ超）に到達したら、インフルエンザウイルス（１×１０^−５の感染多重度）を灌流法で細胞に接種し、温度を３３℃に切替えた。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）（Ｍｅｒｃｋ社製）を、下記条件のうちの１つに従って添加した。

（ｉ）接種後３日目及び４日目に灌流中１．５単位／ｍｌの終濃度（ＪＰ１２５−Ｊｉａｎｇｓｕ Ｂ型株、ＮＣＰ１２７−Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ Ａ型株、ＤＦＣ１ＡＦＡ００２−Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ Ａ菌株、ＤＦＣ２ＡＦＡ００１−Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａ型株、及びＤＦＣ３ＡＰＡ００２−Ｊｉａｎｇｓｕ Ｂ型株）、
（ｉｉ）接種後１、２、３、及び４日目にバイオリアクター中１単位／ｍｌの終濃度（Ｂ００５−Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａ型株）、
（ｉｉｉ）回収物貯留中で３単位／ｍｌの終濃度を得るため、灌流の４日目（ＪＰ１２８−Ｊｉａｎｇｓｕ Ｂ型株）。

ウイルスを、接種後３、４、及び５日目に条件（ｉ）及び（ｉｉ）で、又は２、３、４、及び５日目に条件（ｉｉｉ）で、灌流により細胞培養培地を収集することによって回収した。灌流回収物を貯留し、次の処理まで４℃で保管した。

条件（ｉｖ）では、接種後３、４、及び５日目の灌流回収物を貯留した後、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）（Ｍｅｒｃｋ社製）を、１０単位／ｍｌの終濃度でウイルス回収物（ＮＣＰ１２４−Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ Ａ型株）に添加した。その結果生じた混合物を、室温で１時間インキュベートした。

２．ウイルス単離
清澄化の前に０．０２％の終濃度でＴｗｅｅｎ８０をＮＣＰ１２７ウイルス回収物に添加したこと以外は実施例１のようにステップａ）及びｂ）に従って、異なるウイルス回収物を清澄化し、限外ろ過にかけた。

ｃ）濃縮液を全て限外ろ過システムから取り出し、水浴で３７℃まで暖めた。ＤＮＡ分解は、１００単位／ｍｌ（ＮＣＰ１２４）、２００単位／ｍｌ（ＪＰ１２５及びＤＦＣ３ＡＰＡ００２）、又は１３５単位／ｍｌ（ＮＣＰ１２７、ＪＰ１２８、ＤＦＣ１ＡＦＡ００２、及びＤＦＣ２ＡＦＡ００１）の終濃度で、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）（Ｍｅｒｃｋ社製）を濃縮液に添加することにより実施し、混合物を３７℃で１時間インキュベートした。

残りの単離は、下記の改変を有するステップｄ）〜ｊ）に従って実施例１に記述されているように実施した。

− β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）処理ステップを、ステップｄ）の前（ＮＣＰ１２４、ＮＣＰ１２７、ＤＦＣ１ＡＦＡ００２、ＤＦＣ２ＡＦＡ００１、及びＤＦＣ３ＡＰＡ００２）、又は直後（ＪＰ１２５及びＪＰ１２８）のいずれかで実施し、その間にＢＰＬを、０．０５％の終濃度（ＮＣＰ１２４、ＤＦＣ１ＡＦＡ００２、ＤＦＣ２ＡＦＡ００１、及びＤＦＣ３ＡＰＡ００２）又は０．１％の終濃度（ＪＰ１２５）で添加し、２〜８℃の範囲の温度（ＪＰ１２５及びＮＣＰ１２４）又は室温（ＤＦＣ１ＡＦＡ００２、ＤＦＣ２ＡＦＡ００１、及びＤＦＣ３ＡＰＡ００２）で終夜インキュベートした。

− ＮＣＰ１２４試料は、第２のＢｅｎｚｏｎａｓｅ分解前、すなわち清澄化ステップａ）の直後、かつ限外ろ過ステップｂ）の前に、第１のＢＰＬ処理ステップも有しており、ＢＰＬは０．０５％の終濃度で添加し、２〜８℃の範囲の温度で終夜インキュベートした。

− ＮＣＰ１２４試料に由来する全ウイルスを、ステップｅ）で、トリトンＸ−１００ １．５％＋ラウリル硫酸ナトリウム １％の混合物の存在下で分割した。

− ステップｅ）の分割超遠心分離の後、試料ＤＦＣ１ＡＦＡ００２、ＤＦＣ２ＡＦＡ００１、及びＤＦＣ３ＡＰＡ００２をろ過し、０．３％のトリトンＸ−１００で補完し、ステップｆ）でさらに処理する前に室温で７２時間保管しておいた。

残留ＤＮＡのサイズ及び量を測定するための方法
１．ＭＤＣＫ細胞に由来するＤＮＡのＤＮＡ試料処理
ウイルス回収物又は精製バルク（３０ｍｌ）を、表示されているように、０．１％ＳＤＳの存在下において１００μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫを用いて５５℃でまず終夜処理し、その後標準的なフェノール／クロロホルム抽出を行った。その後、その結果生じた溶液を、Ｃｅｎｔｒｉｐｌｕｓ遠心ろ過デバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、ＹＭ−３０ ４４２２）を使用して濃縮した。次に、試料を５％ＲＮａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて９０分間３７℃で処理し、その後Ｍｉｃｒｏｃｏｎ遠心ろ過デバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、ＹＭ−５０ ４２４１６）を使用して、第２の濃縮ステップを行った。最終容積を２つの画分に分割し、第１の画分は、アガロースゲル及びサザンブロット分析によるＤＮＡ視覚化を目的とし、第２の画分は、Ｑ−ＰＣＲ定量化を目的とした。

２．ＥＢ６６（登録商標）細胞に由来するＤＮＡのＤＮＡ試料処理
精製バルク（４ｍｌ）を、０．１％ＳＤＳの存在下で２００μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫを用いて５５℃で２時間処理した。その後、ＤＮＡを、製造業者の説明書に従ってＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｎｕｃｌｉｓｅｎｓ Ｍａｇｎｅｔｉｃキット（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社製）で抽出する。

３．ＭＤＣＫ細胞及びＥＢ６６（登録商標）細胞に由来するＤＮＡに適用可能なアガロースゲル
ＤＮＡ試料を、臭化エチジウムを含有する１．２５％アガロースゲルに負荷し、ＤＮＡを紫外線で視覚化した。画像を撮影した。

４．ＭＤＣＫ細胞由来のＤＮＡを増幅するために特異的に設計されたＱ−ＰＣＲ
ａ）設計：それぞれ６３塩基対（ｂｐ）及び３１４ｂｐの２つの高度反復イヌ配列を特異的に増幅及び定量化するように設計された定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）ベースの手法を開発した。これら２つの配列は、それぞれ短鎖散在反復ＤＮＡ配列（ＳＩＮＥ）及び長鎖散在反復ＤＮＡ配列（ＬＩＮＥ）である。ＬＩＮＥ及びＳＩＮＥ配列を増幅するために使用されたプライマー及びプローブは、表１に列挙されている。

ＳＩＮＥ Ｑ−ＰＣＲは、蛍光性の副溝結合（ＭＧＢ）プローブを使用するＴａｑＭａｎに基づくＰＣＲであり、ＬＩＮＥ Ｑ−ＰＣＲは、Ｓｙｂｅｒｇｒｅｅｎに基づくＰＣＲである。これらの２つのＰＣＲは、それぞれ６３ｂｐ及び３１４ｂｐの増幅産物を産生することが予測される。

Ｑ−ＰＣＲによる定量曲線を確立するための適切な陽性対照を生成するために、ＭＤＣＫ細胞のゲノムＤＮＡを、製造業者の推奨に従ってＱｉａｇｅｎ社製ゲノム抽出キット（カタログ番号１３３６２）により抽出及び精製した。その後、抽出したＤＮＡは、制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩで同時消化するか、又はＰｓｔ１で消化するかのいずれかであった。その後、その結果生じたＤＮＡ断片を、製造業者の推奨に従ってＴｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）アッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）（第４節を参照）により定量化した。これら陽性対照を下述のように使用して、残留ＭＤＣＫ ＤＮＡの定量化用であり、ＰＣＲ阻害を検出するように設計された検証実験および実験用でもある標準曲線を確立した。

その後、最終容積が５０μｌに達するように、試料をＴａｑＧｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼキット混合物（Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）に添加した。ＰＣＲ反応を、ＡＢＩ７９００型サーモサイクラーで実施し、５０℃で２分間の第１のステップ、その後９５℃で１０分間の変性ステップで開始し、次いで９４℃で１５秒間の第１のステップ、その後に６０℃で１分間の第２のステップを含む４０サイクルを行った。

ｂ）Ｑ−ＰＣＲ阻害の検出：ＰＣＲ阻害がＱ−ＰＣＲ実験中に起こらないことを評価するために、各Ｑ−ＰＣＲを重複して実施した。これら２つの反応のうちの１つでは、既知量の消化ＭＤＣＫ ＤＮＡを混ぜ、Ｑ−ＰＣＲ阻害を評価するために使用した。阻害を計算し、ＳＩＮＥ及びＬＩＮＥ Ｑ−ＰＣＲ定量化データを補正するための値として使用した。

ｃ）ＤＮＡ回収率の決定：ＤＮＡ断片回収の効率に及ぼす抽出／濃縮手順（第１節のＤＮＡ試料処理を参照）の効果を、種々の長さの４つの外部ＤＮＡ増幅産物：（ｉ）ライノウイルス５’ＮＣ配列に由来する６５９ｂｐの増幅産物、（ｉｉ）パラインフルエンザ１型ウイルスのＭ遺伝子に由来するヒト３０５ｂｐ増幅産物、（ｉｉｉ）アデノウイルスＢＣのヘキソン遺伝子に由来する１３８ｂｐの増幅産物、及び（ｉｖ）ヒトポリオーマウイルスゲノムのｇｐ２遺伝子に由来する８７ｂｐの増幅産物を試料に混ぜることにより評価した。これら外部ＤＮＡ増幅産物（各１００ｎｇ）を、３０ｍｌの精製バルクに添加した。Ｑ−ＰＣＲでイヌＬＩＮＥ及びＳＩＮＥ配列を特異的に増幅するのと並行して、４つの異なる外部ＤＮＡを標的とするＱ−ＰＣＲを実施して、混ぜた４つの断片のＤＮＡ回収率を決定した。回収率を計算し、ＳＩＮＥ及びＬＩＮＥ Ｑ−ＰＣＲ定量化データを補正するための値として使用した。

ｄ）Ｑ−ＰＣＲ検証：両Ｑ−ＰＣＲの効率、再現性、感度、及び特異性を決定した。ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩで同時消化されたか又はＰｓｔＩで消化されたＭＤＣＫ ＤＮＡの連続１０倍希釈（０．０１ｐｇ〜１０^３ｐｇの範囲）を、これら実験で使用した。希釈物は、２人の専門家により調製されており、各希釈は重複して試験されているので、両Ｑ−ＰＣＲの効率、再現性、及び感度の決定が可能だった。特異性は、両Ｑ−ＰＣＲから生じる増幅産物をアガロースゲルに負荷して、予測サイズの固有バンドが観察できることを確認することにより決定した。

結果 − 結論
結果は、図１Ａに示されているように、優れた線形性を実証し、そこからＳＩＮＥ及びＬＩＮＥ Ｑ−ＰＣＲの効率が、それぞれ１００％及び８５％であると計算された。ＳＩＮＥ及びＬＩＮＥ Ｑ−ＰＣＲの再現性を反映するＲ^２値は、それぞれ０．９９９及び０．９９８９であると計算され、両試験の感度が１０ｆｇのＤＮＡであること、つまり試験される試料内の１０ｆｇ未満の量のＤＮＡは検出されないことが決定された。

Ｑ−ＰＣＲ中に生成される蛍光シグナルが標的ＳＩＮＥ及びＬＩＮＥ配列の増幅に特異的だったことを実証するため、Ｑ−ＰＣＲ産物をアガロースゲルに負荷し、予測される６３ｂｐ（ＳＩＮＥ Ｑ−ＰＣＲ）及び３１４ｂｐ（ＬＩＮＥ Ｑ−ＰＣＲ）断片の存在を実証した。結果は、図１Ｂに示されており、両Ｑ−ＰＣＲの予測分子量の固有バンドの明白な視覚化を可能にした。

本発明で開発されたＱ−ＰＣＲは、抽出／濃縮手順から生じた試料内の非常に少量の残留ＤＮＡを検出するように設計されているので、この手順がＤＮＡ回収率に影響を及ぼす場合があるかどうかを調査することは非常に重要である。実施された上述のような混合実験全てから、１３８ｂｐ、３０５ｂｐ、及び６５９ｂｐの断片はおよそ５０％の回収率（異なる実験から得られた回収率に基づいて計算された平均）で検出されたが、８７ｂｐの断片は２５％未満の回収率で検出されたことが計算により求められた。

５．ＥＢ６６（登録商標）細胞由来のＤＮＡを増幅するために特異的に設計されたＱ−ＰＣＲ
共通のプローブ（Ｐ１２３）、共通の順方向プライマー（ＴＭＦ１２３）、及び３つの異なる逆方向プライマー（ＴＭＲ１００、ＴＭＲ２００、及びＴＭＲ３００）を使用することにより、９９塩基対（ｂｐ）、１８５塩基対（ｂｐ）、及び２８０塩基対（ｂｐ）のアヒル配列を特異的に増幅し定量化するように設計された定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）ベースの手法（図１Ｃを参照）を開発した。これら３つの配列は、アヒルゲノムの長鎖散在反復ＤＮＡ配列（ＬＩＮＥ）内に位置する。これら３つの配列を増幅するために使用されるプライマー及びプローブは、表２に列挙されている。

Ｑ−ＰＣＲでは、特定のＰＣＲ産物がＰＣＲサイクル中で蓄積していくにつれて、その検出が可能になるように蛍光発光性プローブが使用される。蛍光発光性プローブは、共有結合で結合された５’−リポーター色素及び３’−消光体色素を有するオリゴヌクレオチドで構成される。ＰＣＲ反応中に、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性は、蛍光発光性プローブを切断する。５’蛍光リポーター色素が放出され、ＰＣＲ産物の蓄積は、蛍光を測定することにより検出することができる。配列生成の上昇は、リアルタイムでモニターされ、データは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製（ＡＢＩ）７９００ＨＴサーモサイクラーのソフトウェアによりＰＣＲの全体にわたって収集される。残留宿主細胞ＤＮＡの絶対量は、既知量のＥＢ６６（登録商標）ゲノムＤＮＡから生成された標準曲線を使用して計算することができる。この目的のために、１０^８個のＥＢ６６（登録商標）細胞に由来するゲノムＤＮＡを、製造業者の説明書に従って、ゲノム−チップＧ５００（Ｑｉａｇｅｎ社製）を使用して、血液及び細胞培養ＤＮＡ ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ社製）で抽出し、ＤＮＡを滅菌水中に溶出した。その後、ＤＮＡを制限酵素Ｐｓｔ１／Ｓｓｐ１で同時消化した。消化した後、ＤＮＡを古典的フェノール／クロロホルムで処理し、その後エタノール沈澱ステップを行って精製した。その後、ＤＮＡを水中に溶出し、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）アッセイで定量化した（第５節を参照）。標準曲線は、１ｎｇから開始して１０ｆｇまで連続１０倍希釈した消化ＥＢ６６（登録商標）ゲノムＤＮＡでＱ−ＰＣＲ反応を実施することにより確立した。

３つのＱ−ＰＣＲ反応の再現性及び感度を確立するために、同時消化され定量化されたＥＢ６６（登録商標）ゲノムＤＮＡの希釈物を、上述のように調製した。９９ｂｐ、１８５ｂｐ、及び２８０ｂｐの３つの配列を増幅するためのＱ−ＰＣＲを、独立して各希釈毎に重複して実施した。ＰＣＲ反応を、ＡＢＩ７９００型サーモサイクラーで実施し、５０℃で２分間の第１のステップ、その後９５℃で１０分間の変性ステップで開始し、次いで９４℃で１５秒間の第１のステップ、その後に６０℃で１分間の第２のステップを含む４０サイクルを行った。各Ｑ−ＰＣＲ反応について得られた結果は、表３に示されている。

結果 − 結論
３つのＱ−ＰＣＲは、同じ線形性及び同じ感度を示す。再現性を反映するＲ^２値は、９９ｂｐ、１８５ｂｐ、及び２８０ｂｐ配列について、それぞれ０．９９９４、０．９９９３、及び０．９９８９であると計算され、３つの試験の感度が１０ｆｇのＤＮＡであること、つまり試験される試料内の１０ｆｇ未満の量のＤＮＡは検出されないことが決定された。

ＰＣＲ阻害がＱ−ＰＣＲ実験中に起こらないことを評価するために、各Ｑ−ＰＣＲを重複して実施した。これら２つの反応のうちの１つには、既知量の消化ＥＢ６６（登録商標）ＤＮＡを混ぜ、Ｑ−ＰＣＲ阻害を評価するために使用した。もし何らかの阻害が存在すればそれを計算し、Ｑ−ＰＣＲ定量化データを補正するための値として使用した。ＤＮＡ断片回収の効率に及ぼす、抽出／濃縮手順（第２節ＤＮＡ試料の処理を参照）の影響を、抽出／濃縮の前に、試験される精製バルクに既知量の種々の長さの外部ＤＮＡ増幅産物を混ぜることにより評価した。その後、混合されたバルクからＤＮＡを抽出し、濃縮した。Ｑ−ＰＣＲで９９ｂｐ、１８５ｂｐ、及び２８０ｂｐの配列を特異的に増幅することと並行して、様々な外部ＤＮＡ増幅産物を標的とするＱ−ＰＣＲを実施して、混合された断片のＤＮＡ回収率を決定した。回収率を計算し、９９ｂｐ、１８５ｂｐ、及び２８０ｂｐについて得られたＱ−ＰＣＲ定量化データを補正するための値として使用した。

６．ＭＤＣＫ細胞に由来するＤＮＡを分析するためのサザンブロット／ＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒ
濃縮ＤＮＡをアガロースゲルに負荷し、断片を毛細管移動によりナイロン膜に移動させた。移動した残留ＤＮＡ断片を検出するためのプローブを調製するために、抽出されたＭＤＣＫ ＤＮＡを、製造業者の推奨に従って制限酵素Ｓａｕ３Ａで消化した。その結果生じた断片を、ランダムプライム標識キット（Ｒｏｃｈｅ社製）を使用して、α−［^３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識した。膜を５０℃で終夜ハイブリダイズし、その後洗浄し、乾燥し、Ｘ線フィルムを感光させるために使用した。ＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒ半定量化の場合、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）アッセイにより測定された連続希釈した既知量のＳａｕ３消化ＭＤＣＫ ＤＮＡもサザンブロット分析にかけた。ハイブリダイズした膜で感光された放射線感受性スクリーンを、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ分析ソフトウェア（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を備えたＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒ（Ｓｔｏｒｍ８６０型、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用して分析した。

７．ＭＤＣＫ細胞及びＥＢ６６（登録商標）細胞に由来するＤＮＡの分析に適用可能なＴｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）アッセイ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製のＴｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）系は、ピコグラムレベルの全ＤＮＡの定量化アッセイであり、生物学的医薬品中のＤＮＡ混入レベルをモニターするために使用されている（Briggs, J. and Panfili,P.R.,1991, Anal. Chem. 63(9):850-859）。典型的なアッセイには、ビオチン化一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、ウレアーゼ結合抗一本鎖ＤＮＡ抗体、及びＤＮＡ間の反応複合体の非配列特異的形成が関与する。アッセイ成分は全て、製造業者から入手可能な完全Ｔｏｔａｌ ＤＮＡアッセイキットに含まれており、反応は製造業者の推奨に従って実施される。手短かに言えば、沸騰によりＤＮＡを変性させた後、試験される試料を液相中で、２つのＤＮＡ結合タンパク質＋ストレプトアビジンの結合体を含有する単一の試薬と混合する。モノクローナル抗ＤＮＡ抗体は、ウレアーゼに直接結合し、大腸菌一本鎖結合タンパク質はビオチンに結合する。両結合タンパク質は、一本鎖ＤＮＡに対して高い親和性を有し、配列特異性は弱い。ストレプトアビジンは、ビオチン化膜上に形成された複合体を特異的に捕捉するために使用され、ウレアーゼは、酵素性シグナル生成のために使用される。液相インキュベーション中に、ＤＮＡ、ストレプトアビジン、及びウレアーゼを含有する複合体が形成される。その後、これら複合体を、ろ過によりビオチン化膜上に捕捉する。膜を洗浄した後で膜上に保持されているウレアーゼの量は、試料中のＤＮＡの量と定量的に関連している。シグナル検出は、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ読取器中で、捕捉された複合体を含有する膜を尿素溶液と接触させることにより行う。

感染細胞の細胞培養上清を収集することにより得られたインフルエンザウイルス回収物中に存在する残留ＭＤＣＫ細胞ＤＮＡプロファイルの比較 − ウイルス増殖段階中にエンドヌクレアーゼを用いて実施された１つのＤＮＡ分解ステップ対ＤＮＡ分解ステップなし
ウイルス増殖段階中に１つのＤＮＡ分解ステップを実施する効果を評価するために、実施例１（ＤＮＡ分解ステップを行わない；ＪＰ１１５及びＮＣＰ１１７）及び実施例２（１つのＤＮＡ分解ステップ；ＪＰ１２５）により得られた回収物を、直接アガロースゲルに負荷するか、又は実施例３において指定されているようにＤＮＡ試料をＱ−ＰＣＲ分析用に調製するかのいずれかを行った。

ＤＮＡプロファイルを、実施例３の第３節及び第４節に指定されているように、（ｉ）アガロースゲル及び（ｉｉ）Ｑ−ＰＣＲにより分析した。

アガロースゲルの画像は図３に示されている。

Ｑ−ＰＣＲにより得られたデータは、表４に列挙されている。

結果 − 結論
図３に示されているアガロースゲルには、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）ステップが実施されていないレーン、つまりＪＰ１１５試料（図３に示されているゲルのレーン２を参照）及びＮＣＰ１１７試料（図２に示されているゲルのレーン５を参照）のおよそ２００００ｂｐサイズに、主要な強いＤＮＡバンドがあり、高いＤＮＡ含有量を示している。

１つのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）処理ステップが、ウイルス増殖段階中に実施された例の場合、つまりＪＰ１２５試料（レーン８）及びＮＣＰ１２７試料（レーン１１）において、２００〜５６０ｂｐのスミア又はかすかなバンドがあり、はるかに低いＤＮＡ含有量及びサイズであることをゲルが示している。

Ｑ−ＰＣＲにより得られた結果は、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）で処理しなかった細胞培養（ＪＰ１１５）から生じたウイルス回収物とは対照的に、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）で処理した細胞培養（ＪＰ１２５）から生じたウイルス回収物において著しいＤＮＡ含有量の低減を示しており、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）の添加は、６３ｂｐ長のＤＮＡの場合は２．５倍（ＪＰ１２５）、３１４ｂｐ長のＤＮＡの場合は６倍（ＪＰ１２５）の低減をもたらしている。そのようなＤＮＡ減少倍数値を示す本発明による方法は、ウイルス単離段階に移行する前に、６３ｂｐ長のＤＮＡ及び３１４ｂｐ長のＤＮＡをそれぞれ６０％及び８０％超低減することを可能にする。並行して、ＳＲＤアッセイ（実施例９を参照）による同じウイルス回収物内に存在するＨＡ量を測定する場合、ＤＮＡ量を４５μｇのＨＡに対して正規化することが可能であり、このＨＡ量は、各株のＨＡを１５μｇ含有する三価ワクチンの予測通常ＨＡ量である（表４の最後の行）。

したがって、ウイルス増殖段階中のＢｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）ステップは、（ｉ）ＤＮＡサイズに肯定的な効果を及ぼし、２００００ｂｐより大きいＤＮＡバンド強度の強い低減が観察され、（ｉｉ）ＤＮＡ含有量を著しく低減し、使用されるプローブ次第であるが２．５倍〜６倍の範囲の低減を示し、（ｉｉｉ）混入ＤＮＡに関してウイルス純度を増加させ、および（ｉｖ）ＤＮＡの混入レベル及びサイズの低減によりワクチンの安全性を増加させる。

エンドヌクレアーゼを用いて実施された２つのＤＮＡ分解ステップ後と１つのＤＮＡ分解ステップ後の、残留ＭＤＣＫ細胞ＤＮＡプロファイルの比較
２つのＤＮＡ分解ステップ、つまりウイルス増殖段階中のＤＮＡ分解及びウイルス単離段階中のＤＮＡ分解を実施する効果を評価するために、実施例１及び２に記述されているウイルス単離プロセスのステップｃ）で生じるＤＮＡ分解の前後で、実施例３において指定されているようにしてＤＮＡ試料を調製した。これは、ＤＮＡ濃度をＱ−ＰＣＲ分析により決定することができ、ひいてはＤＮＡ ｌｏｇ低減の計算を可能にするためである。

ＤＮＡプロファイルを、実施例３の第４節に詳述される方法でＱ−ＰＣＲにより分析した。結果は表５に示されている。

結果 − 結論
ＪＰ１１５実験の場合、限外ろ過濃縮液のＢｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）処理は、６３ｂｐ長断片に関しては２ｌｏｇのＤＮＡ Ｌｏｇ低減、３１４ｂｐ長断片に関しては１ｌｏｇの低減を誘導した。

Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）をウイルス増殖段階中にさらに添加したＪＰ１２５実験の場合、両プローブ、６３ｂｐ及び３１４ｂｐのＤＮＡ ｌｏｇ低減は、２〜３ｌｏｇの範囲である。したがって、第１のＤＮＡ分解がウイルス増殖段階中に既に実施されていた場合、限外ろ過濃縮液のＢｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）処理は、より高いＤＮＡ ｌｏｇ低減を誘導した。ｌｏｇ低減は、３１４ｂｐプローブに関してより重要であることも留意されるべきである。

したがって、ウイルス増殖段階中のＤＮＡ分解ステップは、限外ろ過後のＤＮＡ分解ステップ中ではるかにより効果的なＤＮＡ分解を可能にする。

細胞培養産生インフルエンザウイルスの精製バルク中の残留ＭＤＣＫ細胞ＤＮＡの量の比較 − 複数のＤＮＡ分解ステップ対１つのＤＮＡ分解ステップ
宿主細胞ＤＮＡ除去に及ぼす、複数のＤＮＡ分解ステップ実施の効果を評価するために、ＤＮＡ含有量を、試料ＪＰ１１５及びＪＰ１２５のウイルス単離プロセスの終わりで、つまり対応する精製バルク中で測定した。表６に示されているように、ＤＮＡ含有量を古典的Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）アッセイにより、実施例３の第７節で指定されているように分析した。

結果 − 結論
ｎｇ／４５μｇＨＡで表されているＤＮＡ量を得るために、精製バルク中のＨＡ含有量を、ＳＲＤアッセイ（実施例９を参照）により並行して決定し、得られたＤＮＡ値を、各株のＨＡを１５μｇ含有する三価ワクチンの予測通常用量である４５μｇＨＡに対して正規化した。

このように、ＪＰ１１５の精製バルクで測定された最終ＤＮＡ量は０．７ｎｇであり、ＪＰ１２５の精製バルクは０．２１ｎｇ未満の全ＤＮＡを示した。これらの値は、当局により指定されている１０ｎｇ／用量の制限より著しく低い。さらに、これらの値は、複数のＤＮＡ分解ステップ、つまりエンドヌクレアーゼによる２つのステップ及びＤＮＡアルキル化剤による１つのステップを実施することにより（ＪＰ１２５）、エンドヌクレアーゼを用いて実施された１つの分解ステップのみの実施と比較して（ＪＰ１１５）、精製バルク中の全ＤＮＡの３．３倍の減少を得ることが可能になることを示す。

ＤＦＣ１ＡＦＡ００２、ＤＦＣ２ＡＦＡ００１、及びＤＦＣ３ＡＰＡ００２の実験は、ＪＰ１２５と同様に、２つのエンドヌクレアーゼステップ及び１つのＤＮＡアルキル化剤ステップの組合せに基づく複数のＤＮＡ分解ステップの追加的な実験である。精製バルク中の最終ＤＮＡ量の測定は、ＪＰ１１５と比較して、０．２〜０．４０ｎｇ／４５μｇＨＡの範囲の同様に低い量を示した。

細胞培養産生インフルエンザウイルスの精製バルク中の残留ＭＤＣＫ細胞ＤＮＡのサイズ分布の比較 − 複数のＤＮＡ分解ステップ対１つのＤＮＡ分解ステップ
細胞培養産生インフルエンザウイルスの精製バルク中に依然として存在する残留宿主細胞ＤＮＡのサイズに関するより多くの情報を得るために、実施例３の第１節に記述されているように、試料ＪＰ１１５、ＪＰ１２５、ＮＣＰ１２４、ＤＦＣ１ＡＦＡ００２、ＤＦＣ２ＡＦＡ００１、及びＤＦＣ３ＡＰＡ００２に由来する３０ｍｌの精製バルクから、ＤＮＡ試料を調製した。それら残留宿主細胞ＤＮＡプロファイルを、下記の方法により、表示されている方法で分析した。

ＤＮＡサイズを、実施例３の第６節に記述されているように、サザンブロット分析及びＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒ半定量化により分析した。

代替的な独立アッセイとして、それぞれ６３ｂｐ長及び３１４ｂｐ長の残留断片を定量化するために、実施例３の第４節で指定されているように、ＳＩＮＥ及びＬＩＮＥプライマーを用いて同じＤＮＡ試料でも、Ｑ−ＰＣＲを行った。実施例３の第４節のｂ）及び第４節のｃ）に示されているような、得られた値を、回収及び阻害実験のデータに照らして補正した。

サザンブロット画像は、図４に示されている。サザンブロット／ＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒ半定量化及びＱ−ＰＣＲ分析の結果は、表７に示されている。

結果 − 結論
本プロセスにおいてウイルス単離段階中で１つのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）ステップのみを実施する場合、ＪＰ１１５試料では、高い量の残留ＤＮＡ（図４Ａに示されているスキャンのレーン６を参照）が検出され、３００ｂｐを超える多数の断片があることを、図４のサザンブロット画像から視覚的に推定することができる。

しかしながら、２つのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）ステップ及び１つＢＰＬステップを組合せた場合、残留宿主細胞ＤＮＡのレベル及び断片のサイズは、ＪＰ１２５試料に見ることができるように、非常に低い（図４Ａに示されているスキャンのレーン８を参照）。１００〜２００ｂｐ長の範囲の断片が、ほんのわずかに検出可能だった。

この低いＤＮＡ含有量は、試料ＮＣＰ１２４（図４Ｂに示されているスキャンのレーン５を参照）等の、２つのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）ステップ及び１つのＢＰＬステップを含む他の試料でも観察されている。

ＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒによる半定量化は、１００〜３００塩基対の範囲の残留ＤＮＡ断片の量が、０．００３〜０．０２７ｎｇ／用量の範囲だったことを示した（表７、最初の列）。ＤＮＡ用量は、精製バルク中でのＳＲＤアッセイ（実施例９を参照）によりＨＡ含有量を並行して決定することにより得た。その後、１用量当たりのＤＮＡ値を、各株のＨＡを１５μｇ含有する三価ワクチンの予測通常用量である４５μｇのＨＡに対して正規化した。得られた値は、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）アッセイにより既に測定されたように、当局により指定されている制限値（１０ｎｇ／用量）よりはるかに低かった。３００塩基対より上の残留宿主細胞ＤＮＡ断片の定量化は、ＤＮＡ断片サイズのこの集団が、検出可能でないか（ＤＦＣ１ＡＦＡ００２）、又は０．００１〜０．００６ｎｇ／用量の範囲であるかのいずれかであったため、このＤＮＡ断片サイズの集団が希少だったことを示した（表７、２番目の列）。これらの結果は、本プロセスの効率が、残留宿主細胞ＤＮＡサイズを、主により低い３００〜２００塩基対の断片サイズに低減することを実証する。１つのＤＮＡ分解ステップのみを実施した試料ＪＰ１１５を、２つのＤＮＡ分解ステップを実施した試料ＪＰ１２５と比較した場合、３００ｂｐより大きな断片又は１００〜３００ｂｐの範囲の断片のいずれを考慮しても、２つのステップを実施した場合に、はるかに低いＤＮＡ量が観察される。実際、３００ｂｐより大きなＤＮＡ断片の場合は１８０倍の低減、つまり０．１８ｎｇ（ＪＰ１１５）対０．００１ｎｇ未満（ＪＰ１２５）が観察され、１００〜３００ｂｐの範囲のＤＮＡ断片の場合は３０倍の低減、つまり０．３３ｎｇ（ＪＰ１１５）対０．０１１ｎｇ（ＪＰ１２５）が観察された。

６３塩基対及び３１４塩基対、つまりそれぞれＳＩＮＥ及びＬＩＮＥ配列の残留ＤＮＡ断片を標的とするＱ−ＰＣＲ分析は、６３塩基対断片が、０．００３〜０．０６５ｎｇ／用量の範囲のレベルで検出されたことを示した（表７、３番目の列）。３１４塩基対断片は、ほとんどの場合、Ｑ−ＰＣＲ試験の検出限界未満であった。検出限界は、最初にＰＣＲチューブに存在する必要があった量である１０ｆｇであった（表７、最後の４番目の列）。本実験の状況では、そのような最低値は、０．００１ｎｇ／４５μｇＤＮＡの最低値に相当する。サザンブロット実験で観察されたように、ＪＰ１１５（１つのＤＮＡ分解ステップ）をＪＰ１２５（２つのＤＮＡ分解ステップ）と比較した場合、６０ｂｐ長の断片又は３００ｂｐ長の断片のいずれを考慮しても、２つのステップが実施された場合に、より大きいＤＮＡ量の低減が観察された。実際、３００ｂｐ長のＤＮＡ断片の場合は３４０倍の低減（０．３４対０．００１）が観察され、６０ｂｐ長のＤＮＡ断片の場合は８０倍の低減（０．５６対０．００７）が観察された。これらの結果は、サザンブロット実験で観察されたように、ＤＮＡサイズも大きく低減することを示す。実際、これら低い値は、ＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒ半定量化で得られた値により確認されている。

したがって、精製バルク中の残留ＤＮＡを特徴付けることにより、本生産プロセスが、本プロセスに由来する全ＤＮＡを非常に低レベルに（残留ＤＮＡの量は、ｐｇ／用量の範囲にある）容易に低減するだけでなく、このＤＮＡを小さなサイズ断片（３００ｂｐ未満）に分解することが実証され、これによりワクチンの安全性がさらに保証される。

エンドヌクレアーゼ及びＤＮＡアルキル化剤を用いて実施された複数のＤＮＡ分解ステップ後のＤＮＡ除去
試料ＪＰ１２５及びＮＣＰ１２４のウイルス単離プロセス中に、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）アッセイにより、表８に示されるような様々なステップにおいて、実施例３の第６節で指定されている方法で、ＤＮＡ含有量を分析した。第１のステップからのＤＮＡ量をその次のステップからのＤＮＡ量で除算して得られる除去倍率を計算して、混入ＤＮＡの除去における各ステップの効率を評価した。混入ＤＮＡを除去するプロセス全体の全体的効率を評価するため、総除去倍率も計算した。

結果 − 結論
幾つかのプロセスステップがＤＮＡ除去に寄与するが、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）ステップ及び超遠心分離ステップの寄与は明らかに重要である。濃縮液をＢｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）分解にかけた後で、ＤＮＡ量の劇的な減少が観察されたため（ＪＰ１２５試料）、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）が、ＤＮＡ分解をもたらすという結論をこの実験から間接的に導くことができる。分解後及びＤＮＡ量の測定前では、更なる精製ステップは実施されず、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）アッセイは、長さが８００塩基対を超えるＤＮＡ断片の最適な検出を保証するに過ぎないため、観察された減少はＤＮＡ分解を反映する（Briggs and Panfili, 1991, Anal. Chem. 63(9): 850-859）。長さが８００塩基対未満であるＤＮＡ断片は、サイズによっては、このアッセイでは効果的に検出されない場合がある。

５８５００及び４１０００の総除去倍数を有する本発明による方法は、感染細胞の細胞培養上清を収集することにより得られたウイルス回収物に最初に存在していた量と比較して、残留宿主細胞ＤＮＡを９９．９９％を超えて低減することを可能にする。

エンドヌクレアーゼ及びＤＮＡアルキル化剤を用いて実施された複数のＤＮＡ分解ステップ後のＨＡ収率
試料ＮＣＰ１２４及びＪＰ１２５のウイルス単離プロセスの主なステップにおいて、表９に示されているように、下述のようなＳＲＤ法によりＨＡ収率を計算した。得られた値は全て、前のステップで得られた値と比較されている。

ＨＡ含有量を測定するために使用されたＳＲＤ法
ガラス板（１２．４×１０ｃｍ）を、ＮＩＢＳＣにより推奨されている濃度の抗インフルエンザＨＡ血清を含有するアガロースゲルでコーティングする。ゲルをセットした後、７２個の試料ウエル（直径３ｍｍ）をアガロースに打抜き、１０μｌの適切な希釈された参照及び試料をウエルに負荷する。プレートを、室温（２０〜２５℃）の加湿チャンバー内で２４時間インキュベートする。その後、プレートを、ＮａＣｌ溶液に終夜浸漬し、蒸留水で短期間洗浄する。その後ゲルを圧迫して乾燥する。完全に乾燥したら、プレートをクーマシーブリリアントブルー溶液で１０分間染色し、明らかにはっきりとした染色帯域が目に見えるようになるまで、メタノール及び酢酸の混合物で２回脱染する。プレートを乾燥した後、抗原ウエルを取り囲む染色帯域の直径を、直角に交わる２つの方向で測定する。あるいは、表面を測定する機器を使用することもできる。表面に対する抗原希釈物の用量反応曲線を構築し、結果は、標準傾斜比アッセイ法（standard slope-ratio assay method）に従って計算される（Finney, D.J. (1952) Statistical Methods in Biological Assay. London: Griffin, Quoted in: Wood, JM, et al (1977). J. Biol. Standard. 5, 237-247）。

エンドヌクレアーゼ及びＤＮＡアルキル化剤を用いて実施された複数のＤＮＡ分解ステップを含むウイルス単離プロセス中のＨＡ純度変化
試料ＮＣＰ１２４及びＪＰ１２５のウイルス単離プロセスの主なステップにおいて、全タンパク質に対してＳＲＤ法により検出可能な特定の量のＨＡを表すＳＲＤ／タンパク質比率を、表１０に示されているように計算した。全タンパク質の濃度は、古典的ローリー法により測定する。

結果は表１０に示されている。

ウイルス単離プロセス中の精製変化を表すために、「精製倍率」も計算した。結果は表１１に示されている。

エンドヌクレアーゼ及びＤＮＡアルキル化剤を用いて実施された複数のＤＮＡ分解ステップに供された、ＭＤＣＫで生産されたインフルエンザウイルス抗原の免疫原性
試料ＮＣＰ１２４の免疫原性を、（ｉ）インフルエンザ抗原と全く接触していない血清反応陰性小児の免疫学的状態を再現することを目的とした未感作マウスモデル中、及び（ｉｉ）以前にインフルエンザ抗原と遭遇している血清反応陽性高齢ヒトの免疫学的状態をより緊密に再現することを目的とした初回刺激を受けたマウスモデル中で評価した。

免疫原性を、赤血球凝集阻害力価及びｉｎ ｖｉｔｒｏ中和力価を分析することにより評価した。全ての実験で、免疫原性を、卵由来の不活化全インフルエンザウイルスの免疫原性と比較した。

１１．１ 赤血球凝集阻害（ＨＩ）試験
このＨＩ試験の原理は、特定の抗インフルエンザ抗体が、インフルエンザウイルス赤血球凝集素複合体（ＨＡ）によりニワトリ赤血球（ＲＢＣ）の血球凝集を阻害する能力に基づく。血清（５０μｌ）を、２００μｌのＲＤＥ（受容体破壊酵素）を用いて１６時間３７℃で処理する。１５０μｌの２．５％クエン酸Ｎａで反応を停止させ、血清を５６℃で３０分間不活化する。１：１０稀釈液を、１００μｌのＰＢＳを添加することにより調製する。その後、２５μｌのＰＢＳで２５μｌの血清（１：１０）を希釈することにより、２倍の連続希釈物を９６ウエルプレート（Ｖ形底）に調製する。２５μｌの基準抗原を、２５μｌ当たり４血球凝集単位の濃度で各ウエルに添加する。抗原及び抗血清希釈物を、マイクロタイタープレート振とう機を使用して混合し、室温で６０分間インキュベートする。その後、５０μｌのニワトリ赤血球（ＲＢＣ）（０．５％）を添加し、ＲＢＣを室温で１時間沈殿させる。ＨＩ力価は、ウイルス誘導性赤血球凝集を完全に阻害する最後の血清希釈物の逆数に相当する。

１１．２ Ｉｎ ｖｉｔｒｏ中和アッセイ
加熱不活性化血清の連続２倍希釈物（５０μｌ）を、９６ウエルプレート中で５０μｌの各基準抗原と共に、室温で１時間３０分間インキュベートした。その後、１００μｌのＭＤＣＫ細胞（２．４×１０^５細胞／ｍｌ）をウエルに添加し、３５℃で７日間インキュベートした。インキュベーション後、ウイルス誘導性細胞変性効果を、顕微鏡で視覚的に各ウエル毎に得点化した。中和力価は、細胞変性効果を完全に阻害する血清の最高希釈物の逆数として表した。

１１．３ 未感作マウスモデル
０日目に、細胞由来のインフルエンザウイルス抗原（試料ＮＣＰ２４；１．５μｇのＨＡ含有量）又は卵由来のインフルエンザウイルス抗原（１．５μｇのＨＡ含有量）で、マウスを筋肉内経路により免疫した。２８日目に、同一の第２の免疫をマウスに与えた。

ＨＩ抗体反応（第１１．１節の方法により決定された）を、第１の免疫の２８日後及び第２の免疫の１４日後に収集された血清試料で測定した。試料を、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９ Ｈ１Ｎ１株の血球凝集を阻害するそれらの能力について試験した。結果は、図５Ａに示されている。

細胞培養に基づくインフルエンザウイルス抗原と卵由来のインフルエンザウイルス抗原との間で統計学的な違いは観察されず、同様の反応が得られた。

中和抗体反応（第１１．２節の方法により決定された）を、第１の免疫の２８日後及び第２の免疫の１４日後に収集された血清試料で測定した。試料を、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９ Ｈ１Ｎ１株に対するそれらの中和活性について試験した。結果は、図５Ｂに示されている。

卵由来のインフルエンザウイルス抗原と比較して、より高い中和力価が、細胞培養に基づくインフルエンザウイルス抗原で観察された。

したがって、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）及びＢＰＬの添加は、細胞由来のインフルエンザウイルス抗原の免疫原性に否定的な影響を及ぼさず、この実験では、より高い中和応答抗体を導いた。

１１．４ 初回刺激を受けたマウスモデル
０日目に、５μｇの不活化全インフルエンザウイルス（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｄｏｎｉａ／２０／９９ Ｈ１Ｎ１）で、マウスを鼻腔内経路により初回刺激した。 ２８日目に、細胞由来のインフルエンザウイルス抗原（試料ＮＣＰ２４；１．５μｇのＨＡ含有量）又は卵由来のインフルエンザウイルス抗原（１．５μｇのＨＡ含有量）で、マウスを鼻腔内経路によりワクチン接種した。

ＨＩ抗体反応（第１１．１節の方法により決定された）を、初回刺激の２８日後及びワクチン接種の１４日後に収集された血清試料で測定した。試料を、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９ Ｈ１Ｎ１株の血球凝集を阻害するそれらの能力について試験した。結果は、図６Ａに示されている。

細胞培養に基づくインフルエンザウイルス抗原と比較して、より高いＨＡ抗体反応が、卵由来のインフルエンザウイルス抗原で観察された。

中和抗体反応（第１１．２節による方法で決定された）を、ワクチン接種の１４日後に収集された血清試料で測定し、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９ Ｈ１Ｎ１株に対するそれらの中和活性を試験した。結果は、図６Ｂに示されている。

全卵ウイルスによる初回刺激後では、同じような中和力価が、細胞培養に基づくインフルエンザウイルス抗原及び卵由来のインフルエンザウイルス抗原で観察された。

分割スクロース勾配超遠心分離後の界面活性剤保管ステップの実施
ＭＤＣＫ細胞でのウイルス増殖、並びにウイルス回収及びウイルス単離は、主に、以下のように改変して実施例２に記述されているように実施した。

− ウイルス単離段階のステップｃ）で、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）を１３５単位／ｍｌの終濃度で濃縮液に添加した。

− ウイルス単離段階のステップｅ）で、第２のスクロース勾配超遠心分離を、１．５％トリトンＸ−１００（ＮＣＰ１１１）又は１％トリトンＸ−１００＋０．５％ＳＬＳ（ＮＹＰ１２１）の存在下で実施した。

ステップｄ）の超遠心分離ローターを排出した後、ＨＡ含有画分を集めた。

試料ＮＣＰ１１１に由来するその結果生じた貯留を、全タンパク質含有量についてアッセイし、ＰＢＳ−トリトンＸ−１００ ０．５％−ビタミンＥスクシナート ０．１ｍＭ ｐＨ７．４緩衝液で２回希釈し、無菌条件下、０．２２μｍ膜で２０ｍｌ／分でろ過し、２５０μｇ／ｍｌの最終タンパク濃度に達するように同じ緩衝液でさらに希釈した。その後、トリトンＸ−１００で希釈した貯留を、室温で７２時間インキュベートしておいたか、又はしなかった。

対照は、２５０μｇ／ｍｌに希釈した貯留を、トリトンＸ−１００を添加せずに、２〜８℃の範囲の温度で７２時間インキュベートすることにより製作した。

試料ＮＹＰ１２１に由来するその結果生じた貯留を、全タンパク質含有量についてアッセイした。表１３に示されているように、０〜０．５％の範囲の濃度のトリトンＸ−１００で補完されたＰＢＳ−αトコフェリル水素スクシナート ０．１ｍＭ ｐＨ７．４緩衝液で、２５０μｇ／ｍｌの最終タンパク濃度に達するように等量ずつ希釈し、０．２２μｍの膜でろ過した。その後、トリトンＸ−１００で希釈した貯留を、室温で７２時間インキュベートした。

試料ＮＣＰ１１１及びＮＹＰ１２１の感染力に及ぼす、トリトンｘ−１００の存在下におけるそのような保管の効果を、細胞の５０％を感染可能なウイルスの量を表すＴＣＩＤ５０／ｍｌ（組織培養感染量）を計算することにより分析した。

結果は表１２及び１３に示されている。

結果
トリトンＸ−１００を含有しない緩衝液で超遠心貯留を希釈した場合、４℃で７２時間後に、残留ウイルスが検出された。１．９０のＴＣＩＤ５０／ｍｌ力価が観察されたからである。トリトンＸ−１００を添加したが保管を実施しなかった場合、同様の観察がなされた。１．８のＴＣＩＤ５０／ｍｌ力価が観察されたからである。０．５％トリトンＸ−１００を含有する緩衝液中で室温でインキュベートした場合、観察されたＴＣＩＤ５０／ｍｌ力価は、０．８未満、つまりアッセイの検出限界未満であり、残留ウイルス感染力が除去されたことが示された。

結果
０．１％トリトンＸ−１００を含有しない緩衝液又はトリトンＸ−１００を含有する緩衝液で超遠心分離貯留を希釈した場合、室温で７２時間後に、残留ウイルスが検出される。０．３％トリトンＸ−１００を含有する緩衝液で稀釈した場合、０．８未満のＴＣＩＤ５０／ｍｌ力価が観察された。０．５％トリトンＸ−１００で、緩衝液毒性が観察され、この実験から１．８未満の力価を推定することができた。

結論
したがって、トリトン（ＮＣＰ１１１）又はトリトン及びＳＬＳ混合物（ＮＹＰ１２１）のいずれかを分割界面活性剤として含むスクロース勾配から収集された分割ウイルス貯留は、著しい残留感染力を有する。分割が生じた後、分割ウイルスを４℃で（ＮＣＰ１１１）又は室温で（ＮＹＰ１２１）最長７２時間インキュベーションすることでは、低残留濃度の分割界面活性剤が存在するにもかかわらず、残留感染力を除去するのは可能ではない。この問題は、分割ステップ後に依然として存在する感染性ウイルスをさらに不活化するために、ウイルス調製物を界面活性剤の存在下で数日間保管することにより解決できる。

実際、分割ウイルス貯留の希釈緩衝液にトリトンＸ−１００を添加することにより、残留感染力を低減することが可能であるが、感染力を検出不能なレベルに低減するためには、０．３％の最低濃度が必要とされる。

両性イオン性界面活性剤の存在下におけるゲルろ過クロマトグラフィーによるウイルスタンパク質からのＭＤＣＫタンパク質の分離
ＭＤＣＫ細胞でのウイルス増殖、並びにウイルス回収及びウイルス単離は、主に、以下のように改変して実施例２に記述されているように実施した。

− 限外ろ過ステップｉ）の後、０．１％の終濃度のエンピゲンを、限外ろ過システムから取り出した濃縮液に添加する。混合物を１５分間撹拌し、その後ＰＢＳ−０．１％ＳＬＳ緩衝液で平衡化されたセファクリルＳ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に負荷する。分離は、室温で３０ｃｍ／ｈの線流速で実施する。画分を収集し、抗ＨＡ及び抗ＭＤＣＫ抗体を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットにより分析する。ウイルスタンパク質を含有する画分を貯溜し、主としてＭＤＣＫタンパク質を含有する他の画分を廃棄する。

タンパク質夾雑物の分析も、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）アッセイにより行い、濃縮水及び平衡緩衝液に添加された界面活性剤は、０．１％の終濃度のＳＬＳだった。ゲルろ過のステップの前後の試料ＮＣＰ１２４で得られた結果は、表１２に示されている。

結果及び結論
界面活性剤の存在下におけるゲルろ過ステップの実施を、残留ＭＤＣＫタンパク質含有量をさらに減少させるために導入した。試料（濃縮液）に０．１％エンピゲンを添加すること、及び平衡緩衝液中にＳＬＳが存在することにより、界面活性剤の完全な非存在下で実施された同じプロトコールと比較して、抗ＭＤＣＫ抗体を使用したウエスタンブロットにより明らかにされるように、夾雑物のより良好な分離が可能になる。０．１％エンピゲンを、０．１％デオキシコレート又は０．１％サルコシンと置き換えても、同じ分離効果が観察される。

界面活性剤の存在下でゲルろ過ステップを実施した後に残留ＭＤＣＫタンパク質の減少が観察されることが、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）アッセイにより得られた結果によって確認され、ゲルろ過をしない場合と比較して、その量は５０％を超えて低減される。

ウイルスを単離するためのスクロース勾配超遠心分離ステップ及びクロマトグラフィーステップの組合せ
ＭＤＣＫ細胞でのウイルス増殖、並びにウイルス回収及びウイルス単離は、主に、以下のように２つの組の改変をして実施例２に記述されているように実施した。

１４．１
− 第２のスクロース勾配超遠心分離分割ステップｅ）を省く。

− ウイルスの分割をバッチで実施する。

− ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを実施する。

室温で、第１のスクロース勾配貯留を、０．５％の最終界面活性剤濃度に達するように、撹拌しながらＰＢＳ ｐＨ７．４−トリトンＸ−１００で希釈する。混合を２分間実施し、その後１５分間静置する。この作業を１回繰り返す。Ａｃｒｏｐａｋ ５００（Ｐａｌｌ社製、カタログ番号１２９９１）０．８＋０．２μｍフィルターモジュールを使用して、分割された物質を清澄化する。５０ｍｌのＰＢＳ ｐＨ７．４−トリトンＸ−１００ ０．５％で膜をすすぎ、タンパク質回収を最適化する。その後、ろ過された物質を、クロマトグラフィーステップの前に、１ＭのＰＯ_４、ｐＨ７．０、ＮａＣｌ ０．２Ｍで希釈する。４０ｍｌのヒドロキシアパタイトカラムＸＫ１６／２０を５０ｍＭのＰＯ_４、ｐＨ７．０、ＮａＣｌ １００ｍＭ緩衝液で平衡化する。供給液を２００ｃｍ／ｈの線速度で注入する。ウイルスタンパク質を、通過画分内に収集する。０．２２μｍろ過の後、ホルムアルデヒド不活性化を、実施例１のステップｆ）に従って実施し、残りのステップｇ）〜ｊ）に従ってプロセスを継続する。

１４．２
− 第１のスクロース勾配超遠心分離ステップｄ）を省く。

− ヒドロキシアパタイト又はセファクリルＨＲ２００クロマトグラフィーを実施する。

１４．２．１
ステップｅ）の分割超遠心分離後に収集された勾配貯留を希釈し、０．２２μｍろ過し、実施例１のステップｆ）に従ってホルムアルデヒドで不活化する。実施例１のステップｇ）及びｈ）を実施した後、セファクリルＨＲ２００ゲル浸透クロマトグラフィーを実施した。０．１％サルコシルの添加後に、供給液を、ＰＢＳ ｐＨ７．４−０．１％サルコシルで平衡された１７５０ｍｌのＸＫ５０カラムに、３０ｃｍ／ｈの線流速で負荷する。ウイルスタンパク質を含有する画分を貯溜し、３０ｋＤａの限外ろ過膜で濃縮し、０．２２μｍフィルターでろ過する。

１４．２．２
あるいは、ステップｅ）の分割超遠心分離後の勾配貯留を、４００ｍＭ ＮａＰＯ_４ ｐＨ７．０−０．１Ｍ ＮａＣｌで希釈し、その後１０ｍＭ ＮａＰＯ_４ ｐＨ７．０−０．１Ｍ ＮａＣｌで平衡化された７０ｍｌのヒドロキシアパタイトＸＫ１６カラムに１００ｃｍ／ｈの線速度で注入する。クロマトグラフィー物を０．２２μｍろ過して、プロセスを終了する。

結果
１４．１
バッチで分割した後のヒドロキシアパタイトにより、３１％のＨＡ精製収率がもたらされ、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）による宿主細胞タンパク質夾雑物含有量は１５％であり、ＳＲＤ／タンパク質比率は２９％である。Ｄｎａ含有量は規格未満である（１．５６ｎｇ／４５μｇＨＡ）。３０°Ｘで２８日後の安定性データは、１００％のＨＡ回収率を示す。ＨＡ（ＳＲＤによるステップ収率１００％）の損失も他のウイルスタンパク質（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色）の損失も、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの後で観察することができないが、少数の夾雑物が除去される。したがって、このプロセスは、２つの超遠心分離ステッププロセスより単純であるという長所を提供する。精製抗原の品質（残留宿主細胞タンパク質及びＤＮＡ）は、２つのスクロース勾配超遠心分離ステッププロセスで得られるものに匹敵する。しかしながら、精製ＨＡの収率はおよそ２倍増加する。

１４．２．１
分割超遠心分離ステップ後にセファクリルＨＲ２００ゲル浸透クロマトグラフィーを実施することにより、１８％のＨＡ精製収率がもたらされ、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）による宿主細胞タンパク質夾雑物含有量は４％であり、ＳＲＤ／タンパク質比率は３２％である。ＤＮＡ含有量は規格未満である（１．８７ｎｇ／４５μｇＨＡ）。収率は２つのスクロース勾配超遠心分離ステッププロセスの収率に匹敵する。しかしながら、残留宿主細胞タンパク質夾雑物のレベルは著しく低減される。

１４．２．２
分割スクロース勾配超遠心分離ステップ後にヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを実施することにより、２５％のＨＡ精製収率がもたらされ、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）による宿主細胞タンパク質夾雑物含有量は２３％であり、ＳＲＤ／タンパク質比率は２２％である。この選択肢は、２つのスクロース勾配超遠心分離ステッププロセスより良好な収率を可能にする。しかしながら、純度（ＳＲＤ／タンパク質比率及び宿主細胞タンパク質残留物）は、若干より低い。

結論
連続して実施された２つの超遠心分離ステップに基づく、実施例１及び２に記述されているプロセスの代わりに、クロマトグラフィーステップと組合せて１つの超遠心分離ステップのみを実施することが実現可能である。分割は、超遠心分離によるウイルス濃度及び単離後に、スクロース勾配又はバッチのいずれかで実施することができる。この選択肢は、単離プロセスにわたってより良好な抗原収率を可能にする。

エンドヌクレアーゼ及びＤＮＡアルキル化剤を用いて実施された、複数のＤＮＡ分解ステップの存在下におけるＥＢ６６（登録商標）細胞でのインフルエンザウイルス生産
本発明による方法が別の細胞タイプで使用することができ、ＭＤＣＫ細胞で実施するのと少なくとも同じ効率でＤＮＡを分解し除去することを実証するために、インフルエンザウイルスを、ＥＢ６６（登録商標）（国際公開第２００８／１２９０５８号パンフレット）で生産し、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）を用いて実施される複数のＤＮＡ分解ステップとＢＰＬの組合せに基づく実験を、部分的に実施例２に記述されている実験に基づいて実施した。

手短かに言えば、ＥＢ６６（登録商標）細胞を、バッチ法で懸濁状態で増殖させた。それらにＨ５Ｎ１を感染させ、数日後に細胞培養培地を収集することによりウイルスを回収した。ウイルスを細胞に接種した後、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）を細胞培養培地に添加した。ウイルス回収物を精澄化し、精澄化した回収物をＢＰＬで処理した。ＢＰＬで処理した回収物を限外ろ過により濃縮した後、限外ろ過システムから取り出した濃縮液にＢｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）を添加した。その後ウイルスを、特に、２つの連続したスクロース勾配超遠心分離によりさらに精製した。第２のスクロース勾配超遠心分離のスクロース勾配は、ウイルスを分割するためにもトリトンＸ−１００を含有していた。その後、残留宿主細胞ＤＮＡを、陰イオン交換膜でウイルス調製物をろ過することにより調製物から除去した。その結果生じたウイルス調製物を精製バルクと称した。

精製バルク中の残留ＥＢ６６（登録商標）細胞ＤＮＡの特徴付け
精製バルク中の全ＤＮＡ量の濃度を、実施例３の第７節に記述されているようにＴｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）アッセイにより測定した。精製バルクに残っている残留宿主細胞ＤＮＡのサイズ分布を決定するために、９９ｂｐ、１８５ｂｐ、及び２８０ｂｐのＤＮＡ断片の濃度を、実施例３の第５節に記述されているように、それぞれのプライマーを用いた定量ＰＣＲにより分析した。並行して、精製バルク中のＨＡ濃度を、ＳＲＤアッセイにより決定した（実施例９を参照）。その後、ＤＮＡ値を、各株のＨＡを１５μｇ含有する三価ワクチンの予測通常用量である４５μｇＨＡに対して正規化した。得られた結果は、表１５及び表１６に示されている。

結果 − 結論
本発明の方法による複数のＤＮＡ分解ステップをＥＢ６６（登録商標）細胞で実施することにより、非常に少量の残留宿主細胞ＤＮＡを含むウイルスの精製バルクが提供される。Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）アッセイによりサイズに関わりなく測定され、４５μｇのＨＡに対して正規化された全ＤＮＡ量は、３６．９ｐｇと低い。ＭＤＣＫ細胞に由来し０．２〜０．４ｎｇ／４５μｇＨＡの範囲の残留宿主細胞ＤＮＡを示す精製バルクに関連して実施例６で得られた結果と比較し、ＥＢ６６（登録商標）細胞で得られた値は、少なくとも５倍、最大１０倍少ない。

９９ｂｐ、１８５ｂｐ、及び２８０ｂｐのＤＮＡ配列を標的とするＱ−ＰＣＲ結果も非常に良好な結果をもたらした。２８０ｂｐの断片に関しては、精製バルク中に３．１ｐｇのＤＮＡ／４５μｇＨＡしか検出されず、１８５ｂｐ及び８０ｂｐの断片に関しては、精製バルク中に６．２ｐｇのＤＮＡ／４５μｇＨＡしか検出されなかったからである。これらの結果は、ＭＤＣＫ細胞に由来する精製バルク中で観察されたＤＮＡ量と同じ範囲内にあり（実施例６）、ウイルスがＭＤＣＫ細胞で生産される場合だけでなく、ウイルスがＥＢ６６（登録商標）細胞で生産される場合でも、本発明の方法が低量ＤＮＡの結果をもたらすことを示している。また、得られた結果は、保健当局による１０ｎｇＤＮＡ／ワクチン用量の規格よりはるかに低い。

Claims (51)

1. 細胞培養により生産されるウイルス又はそのウイルス抗原に付随する宿主細胞核酸を分解するための方法であって、ｉ）エンドヌクレアーゼ、及びｉｉ）ＤＮＡアルキル化剤から選択される化合物を用いる少なくとも２つの核酸分解ステップを含む方法。
2. 細胞培養中でウイルス又はそのウイルス抗原を生産するための方法であって
   （ａ）細胞培養培地中で培養された細胞集団を準備するステップと、
   （ｂ）細胞集団にウイルスを接種するステップと、
   （ｃ）ウイルスの複製が可能になるように細胞集団を培養するステップと、
   （ｄ）生産されたウイルスを収集して、それによりウイルス回収物を準備するステップと、
   （ｅ）ウイルスを単離するステップと
   を含み、ｉ）エンドヌクレアーゼ、及びｉｉ）ＤＮＡアルキル化剤から選択される化合物を用いる少なくとも２つの宿主細胞核酸分解ステップを含む方法。
3. 少なくとも１つの宿主細胞核酸分解ステップが、ステップ（ｄ）の前に実施される、請求項２に記載の方法。
4. 少なくとも１つの宿主細胞核酸分解ステップが、エンドヌクレアーゼを用いて実施される、請求項３に記載の方法。
5. 細胞にウイルスを接種した後で、エンドヌクレアーゼが培養下の細胞に添加される、請求項３に記載の方法。
6. 細胞集団がバイオリアクターで培養される、請求項２〜５のいずれかに記載の方法。
7. エンドヌクレアーゼがバイオリアクターに添加される、請求項６に記載の方法。
8. 培養培地が灌流により供給される、請求項２〜７のいずれかに記載の方法。
9. エンドヌクレアーゼが灌流培地に添加される、請求項８に記載の方法。
10. 少なくとも１つの宿主細胞核酸分解ステップが、ステップ（ｄ）の後に得られるウイルス回収物にエンドヌクレアーゼを添加することにより実施される、請求項２に記載の方法。
11. 少なくとも１つの宿主細胞核酸分解ステップが、ウイルス単離ステップ中に実施される、請求項２〜１０のいずれかに記載の方法。
12. ウイルス単離ステップが、ウイルス回収物の清澄化、限外ろ過／ダイアフィルトレーション、超遠心分離、及びクロマトグラフィー、又はそれらの任意の組合せから選択される少なくとも１つのステップを含む、請求項２〜１１のいずれかに記載の方法。
13. ウイルス単離ステップが、ウイルス回収物清澄化ステップ、濃縮液を生成するための限外ろ過／ダイアフィルトレーションステップ、及び１つ又は２つの超遠心分離ステップの組合せを少なくとも含む、請求項１２に記載の方法。
14. 少なくとも１つの超遠心分離ステップが、スクロース勾配超遠心分離ステップである、請求項１３に記載の方法。
15. 単離ステップが、少なくとも１つのスクロース勾配超遠心分離ステップを含む、請求項１２〜１３のいずれかに記載の方法。
16. 少なくとも１つの宿主細胞核酸分解ステップが、エンドヌクレアーゼを用いて実施される、請求項１１〜１５のいずれかに記載の方法。
17. エンドヌクレアーゼが、限外ろ過／ダイアフィルトレーションの後に得られる濃縮液に添加される、請求項１６に記載の方法。
18. 少なくとも１つの宿主細胞核酸分解ステップが、ＤＮＡアルキル化剤を用いて実施される、請求項１１〜１５のいずれかに記載の方法。
19. ＤＮＡアルキル化剤が、清澄化されたウイルス回収物に添加される、請求項１８に記載の方法。
20. ＤＮＡアルキル化剤が、限外ろ過／ダイアフィルトレーションの後に得られる濃縮液に添加される、請求項１８に記載の方法。
21. スクロース勾配が分割剤をさらに含む、請求項１５〜２０のいずれかに記載の方法。
22. 分割剤が、デオキシコレート又はラウリル硫酸ナトリウムと随意に混合されたトリトンＸ−１００である、請求項２１に記載の方法。
23. バッチで実施されるウイルス分割ステップをさらに含む、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
24. デオキシコレート又はラウリル硫酸ナトリウムと随意に混合されたトリトンＸ−１００が、分割ステップで使用される、請求項２３に記載の方法。
25. ＤＮＡアルキル化剤を添加することをさらに含む、請求項２〜１７のいずれかに記載の方法。
26. ＤＮＡアルキル化剤が、ウイルス単離ステップ中に添加される、請求項２５に記載の方法。
27. アルキル化剤がβ−プロピオラクトンである、請求項１〜２６のいずれかに記載の方法。
28. 培養下の細胞が、哺乳動物細胞及びトリ細胞からなる群から選択される、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
29. 細胞がＭＤＣＫ細胞である、請求項２８に記載の方法。
30. 細胞が、アヒル胚性幹細胞に由来するトリ細胞である、請求項２８に記載の方法。
31. 細胞がＥＢ６６（登録商標）細胞である、請求項３０に記載の方法。
32. ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項１〜３１のいずれかに記載の方法。
33. インフルエンザウイルスが、大流行株又は潜在的大流行株である、請求項３２に記載の方法。
34. ウイルスを１つ又は複数の不活性化剤で不活化することをさらに含む、請求項１〜３３のいずれかに記載の方法。
35. 不活性化剤がホルムアルデヒドである、請求項３４に記載の方法。
36. 請求項１〜３５のいずれかに記載の方法により取得可能なウイルス又はそのウイルス抗原を含む組成物。
37. 宿主細胞残留ＤＮＡ含有量が、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）アッセイで測定して、１０ｎｇ未満、又は５ｎｇ未満、又は１ｎｇ未満、又は１００ｐｇ未満、又は１０ｐｇ未満である、請求項３６に記載の組成物。
38. 宿主細胞残留ＤＮＡのサイズが、サザンブロットで測定して、５００塩基対未満、又は３００塩基対未満、又は２００塩基対未満、又は１００塩基対未満である、請求項３６又は３７に記載の組成物。
39. Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）アッセイで測定して、１０ｎｇ未満、又は５ｎｇ未満、又は１ｎｇ未満、又は１００ｐｇ未満、又は１０ｐｇ未満の残留宿主細胞ＤＮＡ含有量を有する細胞培養産生ウイルス又はそのウイルス抗原を含む組成物。
40. サザンブロットで測定して、サイズが５００塩基対未満、又は３００塩基対未満、又は２００塩基対未満、又は１００塩基対未満である残留宿主細胞ＤＮＡ含量を有する細胞培養産生ウイルス又はそのウイルス抗原を含む組成物。
41. 定量ＰＣＲで測定して、長さが６０塩基対であるＤＮＡ断片の含有量が、１ｎｇ未満、又は０．５ｎｇ未満、又は０．１ｎｇ未満、又は０．０１ｎｇ未満である、請求項３６〜４０のいずれかに記載の組成物。
42. 定量ＰＣＲで測定して、長さが３００塩基対であるＤＮＡ断片の含有量が、１ｎｇ未満、又は０．５ｎｇ未満、又は０．１ｎｇ未満、又は０．０１ｎｇ未満である、請求項３６〜４１のいずれかに記載の組成物。
43. 長さが６０塩基対であるＤＮＡ断片の含有量が、１ｎｇ未満、又は０．５ｎｇ未満、又は０．１ｎｇ未満、又は０．０１ｎｇ未満であり、長さが３００塩基対であるＤＮＡ断片の含有量が、１ｎｇ未満、又は０．５ｎｇ未満、又は０．１ｎｇ未満、又は０．０１ｎｇ未満である、請求項３６〜４２のいずれかに記載の組成物。
44. 好適な医薬担体と混合された請求項３６〜４３のいずれかに記載の組成物を含む免疫原性組成物。
45. アジュバントをさらに含む、請求項４４に記載の免疫原性組成物。
46. 医薬品に使用するための請求項３６〜４５のいずれかに記載の組成物。
47. ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項３６〜４５のいずれかに記載の組成物。
48. インフルエンザ感染の治療又は予防に使用するための請求項４７に記載の組成物。
49. 細胞培養で生産されたウイルス又はそのウイルス抗原を精製するための方法であって、
    （ａ）スクロース勾配が、ウイルスを分割するために界面活性剤を含む、スクロース勾配超遠心分離ステップ、及び
    （ｂ）スクロース勾配から収集された分割ウイルスの貯留を、０．１％〜０．５％の非イオン性界面活性剤の存在下で１〜５日間インキュベートするステップ
    を少なくとも含む方法。
50. 両性イオン性界面活性剤の存在下で実施される少なくとも１つのサイズ排除クロマトグラフィーステップを含む、細胞培養で生産されるウイルス又はそのウイルス抗原を精製するための方法。
51. 細胞培養で生産されたウイルス又はそのウイルス抗原を精製するための方法であって、
    （ａ）１つのスクロース勾配超遠心分離ステップ、及び
    （ｂ）１つのクロマトグラフィーステップ
    を少なくとも含む方法。

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