CN1208091C - 用固定化溶剂或固定化溶剂－去污剂灭活病毒的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用溶剂或溶剂-去污剂灭活病毒的方法，其特征在于所述溶剂和/或溶剂-去污剂固定在载体上。所述载体是由作为活性物质的活性炭或二氧化硅制成的。本发明的方法可简单并连续地操作，而且成本低廉、安全可靠。

Description

用固定化溶剂或固定化溶剂-去污剂灭活病毒的方法

发明领域

本发明涉及一种用固定化有机溶剂(Solvant，以下简称S)和/或去污剂(Detergent，以下简称D)在水溶液中灭活病毒的方法。

背景技术

自二十世纪七十年代以来，由于食品、药品的病毒污染而导致严重的医疗健康后果的事件已成为公众日益关心的问题。科学技术界为了解决这个问题，做了大量的工作，各种病毒灭活处理方法迅速发展起来。目前广泛应用的病毒灭活处理方法有以下几种。

1、巴斯德灭病毒法

巴斯德灭病毒法(液态在60℃加温10小时)是最经典的病毒灭活方法之一，利用病毒分子与目标产品分子在热稳定性质上的差异进行选择的病毒灭活。例如，血浆制品的主要产品之一白蛋白在世界范围内应用该方法灭病毒已有近半个世纪的历史，并有着公认的好结果。在抗凝血酶III等其它一些血浆制品的生产中，该方法也是公认高效的病毒灭活方法。

然而，使用该方法对水溶液进行病毒灭活虽可有效灭活模式病毒，但某些目标产品的生物活性的损失也较为严重，需要使用大剂量的稳定剂，使得在灭病毒后往往必须设置一个超滤工序来控制稳定剂的量。因此，该方法不能设置在生产线终端(除白蛋白外)，不能解决二次污染的问题。在产品活性损失及专门设置一道去稳定剂工艺的情况下，工艺成本增加较大。

2、SD灭病毒法

SD(Solvant-Detergent)处理是目前世界上应用最广泛的病毒灭活方法之一，该方法是将液态SD剂或SD剂的水溶液加入到水溶液中进行病毒灭活反应。该方法首先在凝血因子(FVIII、FIX等)的病毒灭活方面显示了强大的效率。自二十世纪九十年代初开始，SD法已用于工业规模的灭病毒血浆的生产，而且该方法还可广泛用于其它生物制品的病毒灭活。

然而，SD法的灭病毒谱受到限制，其只对脂包膜病毒的灭活有效，对非脂包膜病毒则无能为力。其次，该方法的应用须由一个SD剂去除工艺相随，不能设置在生产线终端，因而不能解决二次污染问题。由于要增设一个或二个专门用于去除SD剂的工艺措施，也增加了工艺成本。

3、低pH法

利用病毒分子与待制备的制品分子在酸性介质中的稳定性差异，使可能存在的病毒大分子(酸稳定性较差的病毒大分子)失活。但该方法主要对脂包膜病毒有效，且由于是在酸性介质中进行，该方法对其他生物制剂的副作用较大，因而主要用于免疫球蛋白的病毒灭活。对pH敏感的产品，该方法不适用。

4、膜过滤法

利用病毒分子与待制备的制品分子在流体力学尺寸上的差异，使可能存在的病毒大分子从制品中分离出来。但该方法主要作为一种补充性的病毒灭活处理方法，用于加强分子尺寸较小的蛋白制剂的病毒安全性，而且生产成本非常高。

5、光动力学法

以单原子氧作为活性基础的光动力学法，是目前灭病毒血浆生产中研究得最多的方法之一。由于该方法可以作为生产终端，有可能解决二次污染。在光动力学灭活病毒处理中，本发明的发明人之一在1998年申请的一项中国专利(专利公开号：CN1224657A)中公开了一种病毒灭活的方法，其中用浓度为2-200mM的单一水溶性萘类过氧化物或它们的混合物在15～80℃下与待处理的生物制剂接触5～200分钟。该方法需要特别光源系统，使其广泛应用受到限制。

在目前条件下，开发一种操作简单、连续、成本低廉、安全可靠的病毒灭活方法，仍是科学技术追求的目标。

发明内容

因此，本发明的目的在于提供一种具有以上所述优点的病毒灭活方法。

根据本发明提供一种用溶剂或溶剂-去污剂灭活病毒的方法，其特征在于所述溶剂或溶剂-去污剂固定在由活性炭制成的载体上，而且所述病毒选自于脂包膜病毒。

所述载体的活性物质为活性炭或二氧化硅，其可为颗粒状、纤维状、毡状或滤板状。而溶剂或溶剂-去污剂是通过物理或化学作用固定于所述载体上的。

本发明的方法用于通过注射或口服而最终与人体接触的水溶液。该水溶液包括但不限于血浆及血浆衍生物、生物制品、天然植物制品。

具体实施方式

由美国纽约血液中心发明的SD病毒灭活方法，及后来经他人开发的衍生方法，例如，只加入S的灭病毒方法以及S与酒精共用的病毒灭活方法等，在本发明中都统称SD法。SD法是将液态病毒灭活剂(S或SD)直接分散在水溶液中进行病毒灭活。此方法需要较长的病毒灭活反应时间，在室温条件下一般为6小时以上，而且还需要专门的除去SD剂的步骤。

在我们申请的一项中国专利(题目为“作为新型解吸剂的表面活性剂及其活性炭解吸方法”，专利申请号为00120625.7)中，我们发现活性炭对去污剂有吸附作用。在我们已经申请的另一项中国专利(题目为“一种除去作为病毒灭活剂的有机溶剂和/或去污剂的方法”，专利申请号为01104343.1)中，我们发明了利用含活性炭的活性物质进行SD剂去除的方法。尽管因此使得除SD剂的工艺成本大为下降，但对灭病毒反应本身并未触及。随着我们研究的深入，我们发现，使用固定化SD进行灭病毒处理，可有效地降低灭病毒反应时间，提高生产过程的连续性，减少除SD剂的工艺投入。

虽然不想囿于任何理论的限制，但我们认为当可能含有脂胞膜病毒的流体介质由含有SD的固相载体的反应器中通过时，病毒分子与SD分子发生反应，使病毒分子结构受损，并由此使病毒分子失活。如果从反应介质流出的流体介质中的SD分子浓度超过标准，还可在反应器中加设一个吸附SD剂的固相载体，以除去足够量的SD剂，满足SD剂的残留标准。

在本发明的方法中，用于灭活病毒的SD剂可物理或者化学性地固定在合适的载体上，优选通过物理方法进行固定。所述载体的活性物质包括但不限于活性炭和二氧化硅。其中活性炭例如是活性炭粉、活性炭滤板、活性炭纤维、或活性炭纤维毡的形式，而二氧化硅例如可以是Aerosil或含Aerosil的滤板的形式。

对于本发明中的有机溶剂S，本领域技术人员已知的任何溶剂都是合适的，其包括但不限于在水溶液病毒灭活中常用的TNbP(三正丁基磷酸酯)。

对于本发明中的去污剂D，本领域技术人员已知的任何去污剂都是合适的，其包括但不限于在水溶液病毒灭活中常用的吐温类去污剂(例如Tween-80)和Triton类去污剂(例如Triton×100)。

可用本发明的方法灭活的病毒一般是指脂包膜病毒，其包括但不限于爱滋病病毒、乙肝病毒、丙肝病毒以及本领域技术人员已知的其它脂包膜肝炎病毒等。

可用本发明的方法进行处理的水溶液包括但不限于水、血浆及血浆衍生物、生物制品、药物、保键用品等。

本发明的方法的实施条件没有具体的限制，但一般情况下pH为2.0-12.0，温度为-5至60℃，而流体动力学条件(流速、压力)则可根据病毒灭活验证实验来确定。

实施例1：固定化SD的制备

用以下预先制好的材料进行本实施例的实施：1)活性炭滤板(例如AKS4或AKS5，德国Seitz Schenk公司)，2)活性炭毡(例如ZC-1200A，中国紫川炭纤维有限公司)和3)含Aerosil的除脂滤板(例如Delipid，美国CUNO公司)。这些材料首先被制成为直径6cm、厚度4.2mm的滤器。将TNbP/Triton×100调配成1％(V/V)的水溶液。然后使此流动相在室温以下以5ml/min的流速分别通过上述固定相，并在相同条件下反复循环40分钟。S或SD在不同材料上的固定化量可通过调节加入该水溶液的用作脱吸剂的表面活性剂的剂量来控制(参考我们的另一份题目为“作为新型解吸剂的表面活性剂及其活性炭解吸方法”的发明，其专利申请号为00120625.7)。具体实验条件及结果见以下表1所示。

                        表1：SD剂在固定载体相上的吸附

固定相	SD剂溶液				最终滤过液		固定化SD
									S(V/V)	D(V/V)	酒精(V/V)	体积	S(V/V)	D(V/V)	S(V/V)	D(V/V
	AKS4	1％	1％	10％	25ml	0.15％	0.21％	1.79％									1.66％
ZC-1200A									1％	1％	25％	25ml	0.18％	0.23％	1.73％	1.62％
	DELIPID	1％	1％	0	25ml	0.25％	0.16％	1.58％									1.77％
AKS4									1％	0	15％	25ml	0.14％	0	1.81％	0

实施例2：固定化SD剂的制备

在制备活性炭板、活性纤维毡及Delipid滤板的过程中，在成型烘干前即将SD剂加入到原材料混合物中进行混合。在此情况下，SD剂将定量地吸附在活性炭粉或Aerosil颗粒等物质上，再经滤板、纤维毡的正常制备工艺，即获得固定化SD剂。其关键的实验参数与实验结果见以下表2所示：

                   表2：SD固定相的制备条件及结果

SD固定相	滤板混合物		滤板中SD量
					TNbP量	Trtion×100	S	D
	SD活性炭板	1％(w/w)	1％(w/w)	1％(v/v)					1％(v/v)
SD除脂滤板					1％(w/w)	1％(w/w)	0.3％(v/v)	1％(v/v)

注：所有的计量均是以每立方米滤板所含或释出的量为标准

实施例3：人丙种球蛋白的病毒灭活

150ml含有模式病毒(HIV初始滴度为10^4.2，VSV初始滴度10^4.8，sindbis病毒初始滴度10^5.1)的人丙种球蛋白(蛋白含量8％，pH4.5)溶液，在流速为100-300Lm^-2、压力≤1bar的条件下分别通过：A)含1.81％(V/V)TNbP的活性炭滤板(厚度：4.2mm，直径：6cm)；B)含1.58％(V/V)TNbP和1.77％(V/V)Triton×100(V/V)的除脂滤板(厚度：4.2mm，直径：6cm)；C)含1.79％(V/V)TNBP和1.66％(V/V)Triton×100的活性炭/硅藻土混合物(混合物重量比为50/50，反应器厚度为4.2mm，直径：6cm)。每一个固定化SD装置后接一个活性炭滤器(厚度4.2mm，直径：6cm，AKS4，德Seitz Schenk公司)。所得的滤液收集后作进一步的分析，其结果见表3和4所示。

                  表3：模式病毒的灭活

	A	B	C
				HIV	≥104.1	≥104.1	≥104.1
VSV	≥104.7	≥104.7	≥104.7
				Sindbis病毒	≥105.0	≥105.0	≥105.0

                         表4：人丙种球蛋白的分析

指标	固定化SD处理前	固定化SD处理后
					A	B	C
		抗HBV活性(IU/ml)	53	49*				48*	45*
抗体活性(IU/ml)	24				18.5*	19*	17.3*
		单体+二聚体	100	100				100	100
多聚体	0				0	0	0

^*：稀释效应

此外，三种反应器滤液中TNBP的含量均小于5ppm。

实施例4：全血浆的病毒灭活

150ml含有以下表5所列的模式病毒的人全血浆(蛋白含5.7％，pH7.85)，在流速为100-300LM^-2，压力≤1bar的条件下先后通过经生理盐水平衡的含1.79％(V/V)TNbP和1.66％(V/V)Triton×100的活性炭滤板(同实施例3)及另一不含SD剂的活性炭滤板(厚度4.2mm，直径6cm，AKS4，德国Seitz Schenk公司)，所得滤液在收集后作进一步的分析，其结果见表5和6所示。

                    表5：模式病毒的灭活

病毒	初始滴度	检出滴度	灭活
				HIV	104.2	≤100.1	≥104.1
VSV	104.8	≤100.1	≥104.7
				仙台病毒	105.1	≤100.1	≥105.0

             表6：经过滤血浆的分析结果

分析	结果
		蛋白回收率	≥95％
TNBP	5ppm
		Triton×100	＜10ppm
醋酸纤维电泳分析	固定化SD处理前后无区别
		凝血八因子回收率	≥70％

实施例5：基因工程蛋白质反应的病毒灭活

含有以下表7所列的模式病毒的重组Alpha干扰素(干扰素浓度115万IU/ml，pH7.0)在流速为1ml/min条件下重复实施例4的步骤，但仅使用固定有SD剂的活性炭滤板，上清液收集后作进一步的分析，其结果见以下表7所示。

                表7：重组干扰素中的病毒灭活

病毒	初始滴度	检出滴度	灭活
				HIV	104.2	≤100.1	≥104.1
VSV	104.8	≤100.1	≥104.7
				仙台病毒	105.1	≤100.1	≥105.0

Claims (2)

1、用溶剂或溶剂-去污剂灭活病毒的方法，其特征在于所述溶剂或溶剂-去污剂固定在由活性炭制成的载体上，而且所述病毒选自于脂包膜病毒。

2、如权利要求1所述的方法，其中所述载体为颗粒状、纤维状、毡状或滤板状。