ES2991988T3

ES2991988T3 - Detergentes compatibles con el medio ambiente para la inactivación de virus con envoltura lipídica

Info

Publication number: ES2991988T3
Application number: ES18796419T
Authority: ES
Inventors: Jean-Baptiste Farcet; Johanna Kindermann; Björn Tille; Thomas R Kreil
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2017-10-30
Filing date: 2018-10-30
Publication date: 2024-12-05
Anticipated expiration: 2038-10-30
Also published as: KR102651043B1; EP3704178B1; JP2021501163A; CN111511800B; BR112020008414A2; SG11202003793WA; RU2020117357A; US20210032567A1; KR20200071127A; EP3704178A1; CN111511800A; WO2019086463A1; MX2020004151A; AU2018357917B2; CO2020006181A2; AU2018357917A1; RU2020117357A3; JP7432506B2; CA3080656A1

Abstract

La presente invención se refiere a métodos para inactivar un virus con envoltura lipídica utilizando detergentes compatibles con el medio ambiente, y a métodos para preparar un fármaco biofarmacéutico utilizando detergentes compatibles con el medio ambiente. La invención también proporciona detergentes compatibles con el medio ambiente. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Detergentes compatibles con el medio ambiente para la inactivación de virus con envoltura lipídica

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para inactivar un virus con envoltura lipídica usando detergentes compatibles con el medio ambiente, y a métodos para preparar un fármaco biofarmacéutico usando detergentes compatibles con el medio ambiente. La invención también proporciona detergentes compatibles con el medio ambiente.

Antecedentes

El uso de fármacos biofarmacéuticos ha seguido aumentando en importancia como método para tratar muchas enfermedades, trastornos o afecciones que afectan la salud de un individuo. Los fármacos biofarmacéuticos normalmente se obtienen mediante purificación a partir de un fluido biológico o mediante producción recombinante en células huésped, tales como líneas celulares de mamíferos. Sin embargo, en tales procesos de producción biofarmacéutica, la contaminación viral plantea un problema importante. La contaminación viral puede introducirse en el proceso de producción biofarmacéutica mediante los fluidos biológicos que se van a purificar o mediante el uso de productos de origen animal. A diferencia de la contaminación bacteriana, la contaminación viral es difícil de detectar. Sin embargo, si la contaminación viral pasa desapercibida y se incorpora virus infeccioso a la formulación del fármaco biofarmacéutico, supone un riesgo importante para la salud de los pacientes. Por tanto, la inactivación viral es de suma importancia en la producción biofarmacéutica.

En muchos procesos de producción biofarmacéutica, se utilizan detergentes para la inactivación de virus. A menudo, estos detergentes se combinan con disolventes en el llamado tratamiento disolvente/detergente (S/D). El detergente Triton X-100 se utiliza desde hace muchos años para el tratamiento S/D de productos comerciales.

Sin embargo, estudios ecológicos recientes han sugerido que Triton X-100 y sus productos de descomposición pueden comportarse potencialmente como disruptores endocrinos en organismos acuáticos, lo que genera preocupaciones desde una perspectiva de impacto ambiental (véase "Documento de soporte de ECHA para la identificación de 4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenol, etoxilados como sustancias extremadamente preocupantes porque, debido a su degradación a una sustancia extremadamente preocupante (4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenol) con propiedades de alteración endocrina, provocan probables efectos graves en el medio ambiente que suscitan un nivel de preocupación equivalente al de los CMR y los PBT/vPvB", adoptado el 12 de diciembre de 2012). Por ello se necesitan detergentes alternativos y compatibles con el medio ambiente para la inactivación viral.

Conley et al. (Biotechnol Bioeng 114(4): 813-820; 2017) han evaluado detergentes zwitteriónicos ecológicos para la inactivación de virus con envoltura. Tiller et al. (Anal Biochem 141(1): 262-266; 1984) han informado que la hidrogenación de Triton X-100 elimina su fluorescencia y absorción de luz ultravioleta preservando al mismo tiempo sus propiedades detergentes. Sin embargo, estos detergentes se diferencian estructuralmente de los detergentes de acuerdo con la presente invención.

Descripción de la invención

La presente invención satisface las necesidades descritas anteriormente y resuelve los problemas mencionados anteriormente en la técnica proporcionando las realizaciones que se describen a continuación:

La actividad tóxica de Triton X-100 surge del resto fenol que tiene la capacidad de acoplarse en ciertos receptores endocrinos de organismos de vida marina. Consistentemente, basándose en las predicciones de la actividad disruptora endocrinaen sílice,para ninguno de los detergentes de éter de polioxietileno no fenólicos según la presente invención se ha encontrado evidencia alguna de que sean activos como disruptores endocrinos.

Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que los detergentes de éter de polioxietileno no fenólicos, compatibles con el medio ambiente, inactivan eficazmente los virus con envoltura lipídica en el tratamiento S/D. Los inventores también han sintetizado un detergente de éter de polioxietileno no fenólico, compatible con el medio ambiente, que inactiva eficazmente los virus con envoltura lipídica en el tratamiento S/D y con un único detergente. Por lo tanto, los inventores descubrieron que se pueden usar detergentes de éter de polioxietileno no fenólicos, compatibles con el medio ambiente, como se definen en las reivindicaciones adjuntas, en los métodos para inactivar virus con envoltura lipídica de la presente invención.

Por consiguiente, la presente invención proporciona detergentes de éter de polioxietileno no fenólicos, compatibles con el medio ambiente, así como medios mejorados para inactivar virus con envoltura lipídica proporcionando las realizaciones preferidas definidas en las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Eficiencia de inactivación de virus de bajas concentraciones de Triton X-100 reducido o Triton N-101 reducido en el tratamiento S/D de líquido que contiene IVIG a 17°C ± 1°C. Se usó una mezcla de tres componentes para obtener concentraciones finales de 0,04%-0,06% de Triton X-100 reducido o Triton N-101 reducido, 0,01%-0,02% de Polisorbato 80, 0,01%-0,02% de TnBP (comparación lado a lado con la misma concentración de Triton X-100). La inactivación del virus a lo largo del tiempo está indicada por el factor de reducción del virus (RF) para dos series con VIH (A y B, respectivamente). La inactivación del virus del tratamiento S/D usando Triton X-100 reducido ("TX-100 red.") o Triton N-101 reducido ("TN-101 red.") se comparó con la inactivación del virus del tratamiento S/D usando Triton X-100 ("TX-100").

Figura 2: Eficiencia de inactivación de virus de bajas concentraciones de Triton X-100 reducido o Triton N-101 reducido en el tratamiento S/D de líquido que contiene IVIG a 17°C ± 1°C. Se usó una mezcla de tres componentes para obtener concentraciones finales de 0,04%-0,06% de Triton X-100 reducido o Triton N-101 reducido, 0,01%-0,02% de Polisorbato 80, 0,01%-0,02% de TnBP (comparación lado a lado con la misma concentración de Triton X-100). La inactivación del virus a lo largo del tiempo está indicada por el factor de reducción del virus (RF) para dos series con PRV (A y B, respectivamente). La inactivación del virus del tratamiento S/D usando Triton X-100 reducido ("TX-100 red.") o Triton N-101 reducido ("TN-101 red.") se comparó con la inactivación del virus del tratamiento S/D usando Triton X-100 ("TX-100").

Figura 3: Eficiencia de inactivación de virus de bajas concentraciones de Brij C10 en el tratamiento S/D de líquido que contiene IVIG a 17°C ± 1°C. Se usó una mezcla de tres componentes para obtener concentraciones finales de 0,04%-0,06% de Brij C10, 0,01%-0,02% de Polisorbato 80, 0,01%-0,02% de TnBP (comparación lado a lado con la misma concentración de Triton X-100). La inactivación del virus a lo largo del tiempo está indicada por el factor de reducción del virus (RF) para dos series con VIH (A y B, respectivamente). La inactivación de virus del tratamiento S/D usando Brij C10 se comparó con la inactivación de virus del tratamiento S/D usando Triton X-100 ("TX-100").

Figura 4: Eficiencia de inactivación de virus de bajas concentraciones de Brij C10 en el tratamiento S/D de líquido que contiene IVIG a 17°C ± 1°C. Se usó una mezcla de tres componentes para obtener concentraciones finales de 0,04%-0,06% de Brij C10, 0,01%-0,02% de Polisorbato 80, 0,01%-0,02% de TnBP (comparación lado a lado con la misma concentración de Triton X-100). La inactivación del virus a lo largo del tiempo está indicada por el factor de reducción del virus (RF) para dos series con PRV (A y B, respectivamente). La inactivación de virus del tratamiento S/D usando Brij C10 se comparó con la inactivación de virus del tratamiento S/D usando Triton X-100 ("TX-100").

Figura 5: Eficiencia de inactivación de virus de bajas concentraciones de Brij C10 en el tratamiento S/D de líquido que contiene IVIG a 17°C ± 1°C. Se usó una mezcla de tres componentes para obtener concentraciones finales de 0,04%-0,06% de Brij C10, 0,01%-0,02% de Polisorbato 80, 0,01%-0,02% de TnBP (comparación lado a lado con la misma concentración de Triton X-100). La inactivación del virus a lo largo del tiempo está indicada por el factor de reducción del virus (RF) para dos series con BVDV (A y B, respectivamente). La inactivación de virus del tratamiento S/D usando Brij C10 se comparó con la inactivación de virus del tratamiento S/D usando Triton X-100 ("TX-100").

Figura 6: Eficiencia de inactivación de virus de bajas concentraciones de Brij C10 en el tratamiento S/D de líquido que contiene albúmina sérica humana (HSA) a 1°C ± 1°C. Se usó una mezcla de tres componentes para obtener concentraciones finales de 0,08%-0,1% de Brij C10, 0,02%-0,03% de Polisorbato 80, 0,02%-0,03% de TnBP (comparación lado a lado con la misma concentración de Triton X-100). La inactivación del virus a lo largo del tiempo está indicada por el factor de reducción del virus (RF) para dos series con X-MuLV (A y B, respectivamente). La inactivación de virus del tratamiento S/D usando Brij C10 se comparó con la inactivación de virus del tratamiento S/D usando Triton X-100 ("TX-100").

Figura 7: Eficiencia de inactivación de virus de bajas concentraciones de Brij C10 en el tratamiento S/D de líquido que contiene HSA a 1°C ± 1°C. Se usó una mezcla de tres componentes para obtener concentraciones finales de 0,08%-0,1% de Brij C10, 0,02%-0,03% de Polisorbato 80, 0,02%-0,03% de TnBP (comparación con datos existentes para Triton X-100). La inactivación del virus a lo largo del tiempo está indicada por el factor de reducción del virus (RF) para dos series con BVDV (A y B, respectivamente). La inactivación de virus del tratamiento S/D usando Brij C10 se comparó con la inactivación de virus del tratamiento S/D usando Triton X-100 ("TX-100").

Figura 8: Eficiencia de inactivación de virus de bajas concentraciones de Brij C10 en el tratamiento S/D de líquido que contiene HSA a 19°C ± 1°C. Se usó una mezcla de tres componentes para obtener concentraciones finales de 0,08%-0,1% de Brij C10, 0,02%-0,03% de Polisorbato 80, 0,02%-0,03% de TnBP (comparación lado a lado con la misma concentración de Tritón X-100). La inactivación del virus a lo largo del tiempo está indicada por el factor de reducción del virus (RF) para dos series con X-MuLV (A y B, respectivamente). La inactivación de virus del tratamiento S/D usando Brij C10 se comparó con la inactivación de virus del tratamiento S/D usando Triton X-100 ("TX-100").

Figura 9: Eficiencia de inactivación de virus de bajas concentraciones de polietoxilato de alcohol 4-tercoctilbencílico en el tratamiento S/D de líquido que contiene IVIG a 17°C ± 1°C. Se usó una mezcla de tres componentes para obtener concentraciones finales de 0,04%-0,06% de polietoxilato de alcohol 4-tercoctilbencílico, 0,01%-0,02% de Polisorbato 80, 0,01%-0,02% de TnBP (comparación lado a lado con la misma concentración de Triton X-100). La inactivación del virus a lo largo del tiempo está indicada por el factor de reducción del virus (RF) para dos series con PRV (A y B, respectivamente). La inactivación de virus del tratamiento S/D usando polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico se comparó con la inactivación de virus del tratamiento S/D usando Triton X-100 ("TX-100"). Obsérvese que en (A), ambos detergentes muestran una cinética de inactivación idéntica. Los símbolos rellenos muestran valores con infectividad remanente, los símbolos no rellenos muestran factores de reducción por debajo del límite de detección.

Figura 10: Eficiencia de inactivación de virus de bajas concentraciones de polietoxilato de alcohol 4-tercoctilbencílico en el tratamiento S/D de líquido que contiene albúmina sérica humana (HSA) a 1°C ± 1°C. Se usó una mezcla de tres componentes para obtener concentraciones finales de 0,08%-0,1% de polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico, 0,02%-0,03% de Polisorbato 80, 0,02%-0,03% de TnBP (comparación lado a lado con la misma concentración de Triton X-100). La inactivación del virus a lo largo del tiempo está indicada por el factor de reducción del virus (RF) para dos series con X-MuLV (A y B, respectivamente). La inactivación de virus del tratamiento S/D usando polietoxilato de alcohol 4-tercoctilbencílico se comparó con la inactivación de virus del tratamiento S/D usando Triton X-100 ("TX-100"). Los símbolos rellenos muestran valores con infectividad remanente, los símbolos no rellenos muestran factores de reducción por debajo del límite de detección.

Figura 11: Eficiencia de inactivación de virus de bajas concentraciones de polietoxilato de alcohol 4-tercoctilbencílico en el tratamiento S/D de líquido que contiene HSA a 19°C ± 1°C. Se usó una mezcla de tres componentes para obtener concentraciones finales de 0,08%-0,1% de polietoxilato de alcohol 4-tercoctilbencílico, 0,02%-0,03% de Polisorbato 80, 0,02%-0,03% de TnBP (comparación lado a lado con la misma concentración de Triton X-100). La inactivación del virus a lo largo del tiempo está indicada por el factor de reducción del virus (RF) para dos series con X-MuLV (A y B, respectivamente). La inactivación de virus del tratamiento S/D usando polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico se comparó con la inactivación de virus del tratamiento S/D usando Triton X-100 ("TX-100"). Los símbolos rellenos muestran valores con infectividad remanente, los símbolos no rellenos muestran factores de reducción por debajo del límite de detección.

Figura 12: (A) Eficiencia de inactivación de virus de bajas concentraciones de polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico o Triton X-100 reducido o Brij C10 en el tratamiento con detergente de tampón que contiene HSA a 14°C ± 1°C. Se usó un tratamiento con un único detergente para obtener concentraciones finales de 0,09%-0,11% de polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico o Triton X-100 reducido o Brij C10 (comparación lado a lado con la misma concentración de Triton X-100). La inactivación del virus a lo largo del tiempo está indicada por el factor medio de reducción de virus (RF) para dos series con BVDV. La inactivación de virus del tratamiento con un único detergente usando polietoxilato de alcohol 4-tercoctilbencílico o Triton X-100 reducido ("TX-100 red.") o Brij C10 se comparó con la inactivación de virus del tratamiento con un único detergente usando Triton X-100 (" TX-100"). Obsérvese que el polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico y Triton X-100 reducido tienen la misma cinética de inactivación que Triton X-100. Los símbolos rellenos muestran valores con infectividad remanente, los símbolos no rellenos muestran factores de reducción por debajo del límite de detección. (B) Eficiencia de inactivación de virus de bajas concentraciones de polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico o Triton X-100 reducido en el tratamiento con detergente de tampón que contiene HSA a 14°C ± 1°C. Se usó un tratamiento con un único detergente para obtener concentraciones finales de 0,02%-0,04% de polietoxilato de alcohol 4-tercoctilbencílico o Triton X-100 reducido (comparación lado a lado con la misma concentración de Triton X-100). La inactivación del virus a lo largo del tiempo está indicada por el factor medio de reducción de virus (RF) para dos series con BVDV. Se comparó la inactivación del virus del tratamiento con un único detergente utilizando polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico o Triton X-100 reducido ("TX-100 red.") con la inactivación del virus del tratamiento con un único detergente utilizando Triton X-100 ("TX-100"). Los símbolos rellenos muestran valores con infectividad remanente, los símbolos no rellenos muestran factores de reducción por debajo del límite de detección.

Figura 13: (A) Eficiencia de inactivación de virus de bajas concentraciones de polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico o Triton X-100 reducido en el tratamiento con detergente de un líquido que contiene IVIG a 17°C ± 1°C. Se usó un tratamiento con un único detergente para obtener concentraciones finales de 0,09%-0,11% de polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico o Triton X-100 reducido (comparación lado a lado con la misma concentración de Tritón X-100). La inactivación del virus a lo largo del tiempo está indicada por el factor medio de reducción de virus (RF) para dos series con BVDV. Se comparó la inactivación del virus del tratamiento con un único detergente utilizando polietoxilato de alcohol 4-tercoctilbencílico o Triton X-100 reducido ("TX-100 red.") con la inactivación del virus del tratamiento con un único detergente utilizando Triton X-100 ("TX-100"). Los símbolos rellenos muestran valores con infectividad remanente, los símbolos no rellenos muestran factores de reducción por debajo del límite de detección. (B) Eficiencia de inactivación de virus de bajas concentraciones de polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico o Triton X-100 reducido en el tratamiento con detergente de un líquido que contiene IVIG a 17°C ± 1°C. Se usó un tratamiento con un único detergente para obtener concentraciones finales de 0,02%-0,04% de polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico o Triton X-100 reducido (comparación lado a lado con la misma concentración de Triton X-100). La inactivación del virus a lo largo del tiempo está indicada por el factor medio de reducción de virus (RF) para dos series con BVDV. Se comparó la inactivación del virus del tratamiento con un único detergente utilizando polietoxilato de alcohol 4-tercoctilbencílico o Triton X-100 reducido ("TX-100 red.") con la inactivación del virus del tratamiento con un único detergente utilizando Triton X-100 ("TX-100"). Los símbolos rellenos muestran valores con infectividad remanente, los símbolos no rellenos muestran factores de reducción por debajo del límite de detección.

Figura 14: Eficiencia de inactivación de virus de bajas concentraciones de polietoxilato de alcohol 4-tercoctilbencílico o Triton X-100 reducido en el tratamiento con detergente de un líquido que contiene Factor VIII a 23°C ± 1°C. Se usó un tratamiento con un único detergente para obtener concentraciones finales de 0,09%-0,11% de polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico o Triton X-100 reducido (comparación lado a lado con la misma concentración de Triton X-100). La inactivación del virus a lo largo del tiempo está indicada por el factor medio de reducción de virus (RF) para dos series con BVDV. Se comparó la inactivación del virus del tratamiento con un único detergente utilizando polietoxilato de alcohol 4-tercoctilbencílico o Triton X-100 reducido ("TX-100 red.") con la inactivación del virus del tratamiento con un único detergente utilizando Triton X-100 ("TX-100"). Los símbolos rellenos muestran valores con infectividad remanente, los símbolos no rellenos muestran factores de reducción por debajo del límite de detección.

Descripción detallada de la invención

A menos que se defina lo contrario a continuación, los términos utilizados en la presente invención se entenderán de acuerdo con su significado común conocido por el experto en la técnica.

Definiciones

Las expresiones "virus que tiene una envoltura lipídica", "virus con envoltura lipídica" y "virus con envoltura" se usan indistintamente en la presente memoria y tienen el significado conocido por un experto en la técnica. Por ejemplo, los virus con envoltura lipídica pueden ser Herpesviridae tales como el virus de la pseudorrabia (PRV), el virus del herpes simple, el virus de la varicela-zoster, el citomegalovirus o el virus de Epstein-Barr; Hepadnaviridae tales como el virus de la hepatitis B; Togaviridae tales como el virus sindbis, el virus de la rubéola o el alfavirus; Arenaviridae tales como el virus de la coriomeningitis linfocítica; Flaviviridae tales como el virus del Nilo Occidental, el virus de la diarrea viral bovina (BVDV), el virus del dengue, el virus de la hepatitis C o el virus de la fiebre amarilla; Orthomyxoviridae tales como el virus de la influenza A, el virus de la influenza B, el virus de la influenza C, el isavirus o el togotovirus; Paramixoviridae tales como el virus sendai, el virus del sarampión, el virus de las paperas, el virus respiratorio sincitial, el virus de la peste bovina o virus del moquillo canino; Bunyaviridae tales como el virus de la encefalitis de California o el hantavirus; Rhabdoviridae tales como el virus de la estomatitis vesicular o el virus de la rabia; Filoviridae tales como el virus del Ébola o el virus de Marburg; Coronaviridae tales como el virus corona o el coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS); Bornaviridae tales como el virus de la enfermedad de Borna; o Arteriviridae tales como arterivirus o virus de la arteritis equina; Retroviridae tales como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus linfotrópico T humano 1 (HTLV-1) o el virus de la leucemia murina xenotrópica (X-MuLV); Poxviridae tales como el virus vaccinia o el Orthopoxvirus variolae (Variolavirus).

La expresión "inactivar un virus que tiene una envoltura lipídica" como se usa en la presente memoria se refiere a alterar la capacidad del virus con envoltura lipídica para infectar células. Como entenderá un experto en la técnica, la capacidad de un virus con envoltura lipídica para infectar células, es decir, la infectividad de un virus con envoltura lipídica, normalmente se evalúa determinando el número de partículas víricas infecciosas en un líquido. Por lo tanto, la expresión "inactivar un virus que tiene una envoltura lipídica" o "inactivar un virus con envoltura lipídica" como se usa en la presente memoria se refiere a reducir el número de partículas víricas infecciosas en una disolución.

En la presente memoria la expresión "valor de reducción Log10" o "LRV" se usa indistintamente con la expresión "factor de reducción de virus", "factor de reducción", "RF" o "R". En una realización, el "valor de reducción Log10" o "LRV" se puede utilizar como una medida de la reducción de partículas víricas infecciosas en un líquido. Como se usa en la presente memoria, el "valor de reducción Log10" o "LRV" se define como el logaritmo (en base 10) de la razón de partículas víricas infecciosas antes de la inactivación del virus con respecto a partículas víricas infecciosas después de la inactivación del virus. El valor LRV es específico de un tipo determinado de virus. Es evidente para un experto en la técnica que cualquier valor de reducción Log10 (LRV) por encima de cero es beneficioso para mejorar la seguridad de métodos y procesos tales como métodos y procesos de producción biofarmacéutica. El valor de reducción Log10 (LRV) que se consigue mediante los métodos según la presente invención se determina como sabe un experto en la técnica. Por ejemplo, el LRV se puede determinar determinando el número de partículas víricas infecciosas en un líquido antes y después de someter el líquido al método para la inactivación de virus según la presente invención.

El experto conocerá numerosos métodos para medir partículas víricas infecciosas en un líquido. Por ejemplo, y sin que ello pretenda ser limitante, las concentraciones de partículas víricas infecciosas en un líquido se pueden medir preferiblemente mediante ensayo de placa o mediante el ensayo TCID<50>, más preferiblemente mediante el ensayo TCID<50>. Un "ensayo TCID<50>", como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un ensayo de dosis infecciosa en cultivo de tejidos. El ensayo TCID<50>es una prueba de dilución de punto final, en donde el valor TCID<50>representa la concentración viral necesaria para inducir la muerte celular o cambios patológicos en el 50% de los cultivos celulares inoculados.

El término "tensioactivo" como se usa en la presente memoria se refiere a compuestos que reducen la tensión superficial entre dos líquidos o entre un líquido y un sólido. Los tensioactivos pueden actuar como detergentes, agentes humectantes, emulsionantes, agentes espumantes y dispersantes.

En relación con la invención, términos tales como "añadir a", "adicionar a" o "añadido a" en relación con un disolvente, detergente y/o líquido mencionados en primer y segundo lugar abarcan una situación donde el disolvente, detergente y/o líquido mencionado en primer lugar se añade al disolvente, detergente y/o líquido mencionado en segundo lugar. Sin embargo, estos términos también pretenden abarcar una situación en la que el disolvente, detergente y/o líquido mencionado en segundo lugar se añade al disolvente, detergente y/o líquido mencionado en primer lugar. Por lo tanto, términos tales como "añadir a", "adicionar a" o "añadido a" no pretenden especificar si el disolvente, detergente y/o líquido mencionado en primer lugar se va a añadir al disolvente, detergente y/o líquido mencionado en segundo lugar. o líquido, o viceversa.

Como sabrá un experto en la técnica, el término "detergente" se utiliza según su significado general conocido en la técnica e incluye en particular tensioactivos que pueden permeabilizar las membranas lipídicas. Por ejemplo, se ha sugerido que los detergentes Triton X-100 y el desoxicolato solubilizan proteínas de membrana anfipáticas uniéndose a los segmentos hidrófobos de las proteínas (véase Simons et al., 1973). Los detergentes se clasifican en tres grandes grupos, según su carga eléctrica. Los detergentes aniónicos comprenden un grupo hidrófilo aniónico, es decir, cargado negativamente. Son detergentes aniónicos de ejemplo bromuro de tetradeciltrimetilamonio, bromuro de dodeciltrimetilamonio, laureth sulfato de sodio, dodecilsulfato de sodio (SDS), cetrimida y bromuro de hexadeciltrimetilamonio. Los detergentes catiónicos comprenden un grupo hidrófilo catiónico, es decir, cargado positivamente. Los detergentes catiónicos de ejemplo son cloruro de benzalconio, bromuro de cetil trimetamonio (CTAB), cloruro de cetilpiridinio (CPC) y cloruro de bencetonio (BZT). La expresión "detergentes no iónicos", como se utiliza en la presente memoria, se refiere a detergentes que no tienen carga positiva o negativa. Los detergentes no iónicos de ejemplo son ésteres de sorbitán (monolaurato de sorbitán, monopalmitato de sorbitán, monoestearato de sorbitán, tristearato de sorbitán, monooleato de sorbitán, trioleato de sorbitán), polisorbatos (monolaurato de sorbitán de polioxietileno (20) (Polisorbato 20), monopalmitato de sorbitán de polioxietileno (20), monoestearato de sorbitán de polioxietileno (20), tristearato de sorbitán de polioxietileno (20), trioleato de sorbitán de polioxietileno (20), monooleato de sorbitán de polioxietileno (20) (Tween 80/Polisorbato 80)), poloxámeros (poloxámero 407, poloxámero 188) y cremóforo. Los detergentes incluyen, sin que ello pretenda ser limitante, Triton N-101 reducido, Triton X-100 reducido y Brij C10.

La expresión "no fenólico" como se usa en la presente memoria se usa indistintamente con la expresión "libre de fenol". Un detergente no fenólico como se usa en la presente invención se refiere a un detergente que no contiene ningún grupo funcional fenol. El término "aromático" tiene el significado conocido por el experto en la técnica. Un detergente que no es aromático como se usa en la presente invención se refiere a un detergente que no contiene ningún anillo aromático.

La expresión "compatible con el medio ambiente" como se utiliza en la presente memoria tiene el significado conocido por un experto en la técnica. En una realización preferida de la invención, con respecto a los detergentes, la expresión "compatible con el medio ambiente" indica que el detergente no se comporta como un disruptor endocrino. Los disruptores endocrinos son sustancias exógenas que alteran las funciones del sistema endocrino y, en consecuencia, causan efectos adversos para la salud en un organismo intacto o su progenie, o (sub)poblaciones. El experto conocerá diversos métodos para identificar disruptores endocrinos. Puede encontrar más información sobre los disruptores endocrinos y su evaluación, p. ej., en el "Documento de apoyo de la ECHA para la identificación del 4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenol, etoxilado como sustancias extremadamente preocupantes porque, debido a su degradación a una sustancia extremadamente preocupante (4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenol) con propiedades de alteración endocrina, causan probables efectos graves en el medio ambiente que dan lugar a un nivel de preocupación equivalente al de los CMR y PBT/vPvB”, adoptada el 12 de diciembre de 2012, que queda incorporada en su totalidad y a todos los efectos; o en el folleto "Evaluación global del estado de la ciencia de los disruptores endocrinos" (WHO/PCS/EDC/02.2), que se incorpora al presente en su totalidad y para todos los efectos, publicado por el Programa Internacional sobre Seguridad Química. de la Organización Mundial de la Salud.

El término "disolvente" como se utiliza en la presente memoria tiene el significado conocido por un experto en la técnica. En una realización preferida de la invención, se utilizan disolventes orgánicos en los métodos de la presente invención. Los disolventes orgánicos particularmente útiles crean un entorno que promueve el contacto entre un detergente y la envoltura lipoproteica de un virus con envoltura lipídica. Como tal, en los métodos de la presente invención se usa preferiblemente un disolvente orgánico que promueva dicho contacto, incluido, sin que ello pretenda ser limitante, un éter, un alcohol, un alquilfosfato como un dialquilfosfato o un trialquilfosfato, o cualquier combinación de los mismos.

Los disolventes de éter útiles en los métodos descritos en la presente memoria incluyen aquellos que tienen la fórmula R1-O-R2, en donde R1 y R2 son independientemente alquilo C1-C18 o alquenilo C1-C18 que pueden contener un átomo de oxígeno o azufre. , preferiblemente alquilo C1-C18 o alquenilo C1-C18. Los ejemplos no limitantes de éteres incluyen éter dimetílico, éter dietílico, éter etilpropílico, éter metilbutílico, éter metilisopropílico y éter metilisobutílico. Los disolventes alcohólicos útiles en el método descrito en la presente memoria incluyen aquellos que tienen grupos alquilo C1-C8 o grupos alquenilo C1-C8. Los ejemplos no limitantes de alcoholes incluyen metanol, etanol, propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol, n-pentanol y los isopentanoles. Los disolventes de alquilfosfato útiles en el método descrito en la presente memoria incluyen aquellos que tienen grupos alquilo C1-C18 o grupos alquenilo C1-C18, cualquiera de los cuales puede contener un átomo de oxígeno o azufre. Los ejemplos no limitantes de alquilfosfatos incluyen dialquilfosfatos como di-(n-butil)fosfato, di-(t-butil)fosfato, di-(n-hexil)fosfato, di-(2-etilhexil)fosfato, di-(n- decil)fosfato o etildi(nbutil)fosfato; y trialquilfosfatos como tri-(n-butil)fosfato, tri-(t-butil)fosfato, tri-(n-hexil)fosfato, tri-(2-etilhexil)fosfato o tri-(n-decil)fosfato.

La expresión "medicamento biológico" como se utiliza en la presente memoria se conoce en la técnica y se refiere a un producto cuya sustancia activa es una sustancia biológica, p. ej., una sustancia biológica producida por células o microorganismos de mamíferos. Como se usa en la presente memoria, el medicamento biológico usado en los métodos de la invención no se limita al producto final fabricado sino que preferiblemente también incluye productos intermedios en cualquier etapa del proceso de fabricación.

La expresión "fármaco biofarmacéutico" como se utiliza en la presente memoria tiene el significado conocido por un experto en la técnica. Los fármacos biofarmacéuticos incluyen tanto fármacos biofarmacéuticos recombinantes como fármacos biofarmacéuticos de otras fuentes, tales como fármacos biofarmacéuticos obtenidos a partir de plasma humano.

Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "filtro de profundidad" tiene el significado conocido en la técnica. En particular, un filtro de este tipo (p. ej., un filtro de profundidad de densidad de gradiente) consigue la filtración dentro de la profundidad del material filtrante. Una clase común de tales filtros son aquellos que comprenden una matriz aleatoria de fibras unidas (o fijadas de otro modo) para formar un complejo y tortuoso laberinto de canales de flujo. La separación de partículas en estos filtros generalmente resulta del atrapamiento o adsorción en la matriz de fibra. Los medios de filtración en profundidad más utilizados para el bioprocesamiento de caldos de cultivo celular y otras materias primas son las fibras de celulosa, un coadyuvante de filtración como el DE y un aglutinante de resina cargado positivamente. Los medios filtrantes de profundidad, a diferencia de los filtros absolutos, retienen partículas en todo el medio poroso, lo que permite la retención de partículas tanto más grandes como más pequeñas que el tamaño de los poros. Se cree que la retención de partículas implica tanto la exclusión por tamaño como la adsorción a través de interacciones hidrófobas, iónicas y de otro tipo.

La expresión "purificar un fármaco biofarmacéutico" como se usa en la presente memoria tiene el significado conocido por un experto en la técnica, y se refiere a separar el fármaco biofarmacéutico de otras sustancias que pueden estar comprendidas en la mezcla de la presente invención. En una realización preferida de la invención, la expresión "purificar un fármaco biofarmacéutico" se refiere a separar el fármaco biofarmacéutico del detergente de la presente invención.

El término "cromatografía" se utiliza según su significado conocido en la técnica. Incluye cualquier técnica de cromatografía que separa un analito de interés (p. ej., una molécula diana tal como un fármaco biofarmacéutico) de otras moléculas presentes en una mezcla. Por lo general, el analito de interés se separa de otras moléculas como resultado de diferencias en las velocidades a las que las moléculas individuales de la mezcla migran a través de un medio estacionario bajo la influencia de una fase móvil, o en procesos de unión y elución.

Las expresiones "resina de cromatografía" y "medio de cromatografía" se usan indistintamente en la presente memoria y se refieren a cualquier tipo de fase (p. ej., una fase sólida) que separa un analito de interés (p. ej., una molécula diana tal como un fármaco biofarmacéutico) de otras moléculas presentes en una mezcla. Por lo general, el analito de interés se separa de otras moléculas como resultado de diferencias en las velocidades a las que las moléculas individuales de la mezcla migran a través de un medio estacionario bajo la influencia de una fase móvil, o en procesos de unión y elución. Ejemplos de diversos tipos de medios de cromatografía incluyen, por ejemplo, resinas de intercambio catiónico, membranas de intercambio catiónico, resinas de afinidad, resinas de intercambio aniónico, membranas de intercambio aniónico, resinas de interacción hidrófobas y monolitos de intercambio iónico.

La expresión "formulación farmacéutica" como se usa en la presente memoria tiene el significado conocido por un experto en la técnica y se refiere a cualquier formulación que sea adecuada para la administración a un paciente. Las formulaciones farmacéuticas se pueden preparar según métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, para cualquier fármaco biofarmacéutico que esté presente en la formulación, un experto podrá elegir y añadir ingredientes adicionales preferidos, incluidos tampones, estabilizadores, tensioactivos, antioxidantes, agentes quelantes y/o conservantes, etc.

La expresión "mezcla de disolvente/detergente" como se utiliza en la presente memoria tiene el significado conocido por el experto en la técnica. En una forma de realización preferida, la mezcla de disolvente/detergente utilizada de acuerdo con la invención contiene al menos un disolvente distinto del agua y al menos un detergente. El disolvente usado de acuerdo con la invención es preferiblemente un disolvente orgánico y, lo más preferiblemente, es fosfato de tri-n-butilo. El número de disolventes y/o detergentes diferentes contenidos en la mezcla no está particularmente limitado. Por ejemplo, la mezcla de disolvente/detergente puede estar compuesta de fosfato de tri-n-butilo, polisorbato 80 y un detergente de éter de polioxietileno según la presente invención.

Debe entenderse que el término "entre" cuando se utiliza para indicar un intervalo numérico en la presente invención incluye los límites inferior y superior indicados del intervalo respectivo. Por ejemplo, cuando se indica que una temperatura está entre 0°C y 10°C, esto incluye las temperaturas de 0°C y 10°C. De manera similar, cuando se indica que una variable x es un número entero entre, p. ej., 4 y 16, esto incluye los números enteros 4 y 16.

Debe entenderse que el término "1 hora" como se utiliza en la presente memoria no se limita a exactamente 60 minutos. Como se utiliza en la presente memoria, se debe entender que el término "1 hora" se refiere a 60 minutos ± 5 minutos, preferiblemente 60 minutos ± 2 minutos.

Realizaciones

El método para inactivar un virus que tiene una envoltura lipídica según la presente invención comprende la etapa de añadir un detergente a un líquido para preparar una mezcla de dicho detergente y dicho líquido y una etapa de incubar dicha mezcla para inactivar dicho virus. Como se ha descrito anteriormente, la expresión "inactivar un virus que tiene una envoltura lipídica" como se usa en la presente memoria se refiere a reducir la concentración de partículas víricas infecciosas en una disolución. En el método para inactivar un virus que tiene una envoltura lipídica según la presente invención, es preferible que el método alcance al menos un valor de reducción (LRV) de 1 Log 10 para al menos un virus, o al menos un valor de reducción (LRV) de 2 Log 10 para al menos un virus, o al menos un valor de reducción (LRV) de 3 Log10 para al menos un virus, o al menos un valor de reducción (LRV) de 4 Log 10 para al menos un virus, o al menos un valor de reducción (LRV) de 5 Log 10 para al menos un virus, o al menos un valor de reducción (LRV) de 6 Log 10 para al menos un virus, o al menos un valor de reducción (LRV) de 7 Log 10 para al menos un virus, o al menos al menos un valor de reducción (LRV) de 8 Log10 para al menos un virus, más preferiblemente al menos un valor de reducción (LRV) de 4 Log 10 para al menos un virus. Por supuesto, es evidente para un experto en la técnica que cualquier valor de reducción Log10 (LRV) para al menos un virus es beneficioso, porque mejora la seguridad, p. ej., del proceso de producción biofarmacéutica. Los LRV a los que se refiere la invención son LRV de un virus con envoltura.

Debe entenderse que aunque los métodos de la presente invención son generalmente para inactivar virus con envoltura lipídica, los detergentes de acuerdo con la presente invención también pueden inactivar virus sin envoltura, por ejemplo si tales virus sin envoltura adquieren una envoltura lipídica en algún momento durante su ciclo de replicación. Por lo tanto, la expresión "inactivar un virus que tiene una envoltura lipídica" no pretende excluir la posibilidad de que en los métodos de la invención, también se puedan inactivar virus sin envoltura además de virus que tienen una envoltura lipídica.

En el método para inactivar un virus que tiene una envoltura lipídica según la presente invención, se añade un detergente a un líquido para preparar una mezcla de dicho detergente y dicho líquido, y dicha mezcla se incuba para inactivar dicho virus. Debe entenderse que dicho líquido del método de la presente invención puede ser cualquier tipo de líquido o una mezcla de varios líquidos, incluyendo una disolución, una suspensión o una mezcla de varias suspensiones y/o disoluciones. Por ejemplo, y sin que ello pretenda ser limitante, dicho líquido de acuerdo con la presente invención puede ser sangre o puede contener sangre o una fracción de sangre, puede ser plasma o puede contener plasma o una fracción de plasma, puede ser suero o puede contener suero o una fracción de suero, puede ser medio de cultivo celular o puede contener medio de cultivo celular, puede ser un tampón o puede contener un tampón. El líquido también puede ser un intermedio de proceso, p. ej., un intermedio de proceso en la preparación de un fármaco biofarmacéutico.

El líquido de acuerdo con la presente invención puede contener un virus que tenga una envoltura lipídica, o puede sospecharse que contiene un virus que tenga una envoltura lipídica (p. ej. en caso de que sea sangre o contenga sangre o una fracción de sangre, plasma o contenga plasma o una fracción de plasma, suero o contenga suero o una fracción de suero, o si contiene un fármaco biofarmacéutico producido en cultivo celular). En una realización preferida de la presente invención de acuerdo con todas las demás realizaciones de la invención, dicho líquido de acuerdo con la presente invención contiene virus que tiene una envoltura lipídica. El origen de dicho virus que tiene una envoltura lipídica en dicho líquido de acuerdo con la presente invención no está particularmente limitado. Por ejemplo, el virus puede originarse a partir de sangre humana que puede usarse para preparar el líquido de acuerdo con la presente invención, o a partir de plasma humano que puede usarse para preparar el líquido de acuerdo con la presente invención, o a partir de suero humano que puede usarse para preparar el líquido de acuerdo con la presente invención, o a partir de un medio de cultivo celular que puede usarse para preparar el líquido de acuerdo con la presente invención. En particular, si el virus se origina a partir de un medio de cultivo celular que se usa para preparar el líquido de acuerdo con la presente invención, el virus puede originarse a partir de componentes de origen animal de dicho medio de cultivo celular, tal como albúmina sérica bovina.

En el método para inactivar un virus que tiene una envoltura lipídica según la presente invención, se añade un detergente a un líquido para preparar una mezcla de dicho detergente y dicho líquido. Dicho detergente es un éter de polioxietileno como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Los éteres de polioxietileno son conocidos por un experto en la técnica y tienen la siguiente estructura según la Fórmula A:

(Fórmula A);

en donde n es igual o superior a uno.

Como será evidente para un experto en la técnica, los éteres de polioxipropileno pueden tener propiedades muy similares a las de los éteres de polioxietileno de acuerdo con la presente invención.

Los éteres de polioxipropileno son conocidos por un experto en la técnica y tienen la siguiente estructura según la Fórmula B:

(Fórmula B);

en donde n es igual o superior a uno.

Como se menciona en la presente memoria, un "éter de polioxietileno" de acuerdo con la invención es preferiblemente un éter de polioxietileno según su significado común en la técnica. Alternativamente, un éter de polioxietileno de acuerdo con la invención también puede ser un polioxiéter, donde una parte, preferiblemente la mayoría del número total de moléculas de polioxiéter son moléculas de éter de polioxietileno, pero donde otra parte, preferiblemente la minoría del número total de las moléculas de polioxiéter, son polímeros mixtos que comprenden unidades de oxietileno y oxipropileno y/o polímeros que comprenden unidades de oxipropileno. En este caso, la expresión "la mayoría del número total de moléculas de polioxiéter son moléculas de éter de polioxietileno" significa que al menos el 50% del número total de moléculas de polioxiéter son moléculas de éter de polioxietileno. Preferiblemente, al menos el 60% del número total de moléculas de polioxiéter son moléculas de éter de polioxietileno. Más preferiblemente, al menos el 70% del número total de moléculas de polioxiéter son moléculas de éter de polioxietileno. Aun más preferiblemente, al menos el 80% del número total de moléculas de polioxiéter son moléculas de éter de polioxietileno. Aun más preferiblemente, al menos el 90% del número total de moléculas de polioxiéter son moléculas de éter de polioxietileno. Lo más preferiblemente, al menos el 95% del número total de moléculas de polioxiéter son moléculas de éter de polioxietileno. Aun alternativamente, un éter de polioxietileno de acuerdo con la invención también puede ser un polioxiéter mixto, que comprende una mayoría (p. ej., al menos 60%, preferiblemente al menos 70%, más preferiblemente al menos 80%, aún más preferiblemente al menos 90% y, lo más preferiblemente, al menos 95%) de unidades de oxietileno y una minoría de unidades de oxipropileno.

Los detergentes para uso de acuerdo con los métodos de la presente invención son no fenólicos.

Los detergentes de éter de polioxietileno de acuerdo con la presente invención se pueden sintetizar mediante una reacción de etoxilación. La etoxilación es un proceso industrial realizado sobre alcoholes (alternativamente se pueden usar aminas) para generar etoxilatos de alcohol (también conocidos como éteres de polioxietileno). La reacción se produce haciendo pasar óxido de etileno a través del alcohol a alta temperatura (p. ej., alrededor de 180°C) y bajo alta presión (p. ej., bajo 1-2 bar de presión), con una base (tal como hidróxido de potasio, KOH) que sirve como un catalizador. El proceso es altamente exotérmico.

alta temperatura

alta presión

catalizador = base

La reacción conduce a la formación de un producto con una amplia polidispersidad de longitud unitaria repetida (el valor de n en la ecuación anterior es una longitud promedio del polímero).

A escala de laboratorio, se pueden producir detergentes de éter de polioxietileno formando primero un buen grupo saliente (tal como Cl, Br, I, OMs u OTf) a partir del grupo hidroxilo del alcohol y luego haciendo reaccionar este sustrato con un polietilenglicol monodesprotonado. Alternativamente, se puede instalar un buen grupo saliente (tal como Cl, Br, I, OMs u OTf) en la cadena de polietilenglicol que se hace reaccionar en una segunda etapa con un alcohol desprotonado.

LG = grupo saliente

Los métodos de ejemplo para la síntesis de éteres de polioxietileno se describen en detalle, p. ej., en la patente de EE.UU. n°. 1.970.578 y Di Serio et al. (2005).

Si bien TX-100, Triton N-101 reducido, Triton X-100 reducido y Brij C10 son éteres de polioxietileno alquílico (= la reacción de etoxilación se realiza con gas de óxido de etileno), también es posible realizar una reacción similar a escala industrial utilizando óxido de propileno (=propoxilación). La única diferencia sería la sustitución del grupo metilo en la cadena de PEG:

La etoxilación y la propoxilación también se pueden combinar en el mismo proceso y conducir a un producto mixto, tal como un polioxiéter polimérico mixto que comprende unidades de oxietileno y oxipropileno.

La actividad tóxica de Triton-X100 surge del resto fenol que tiene la capacidad de acoplarse en ciertos receptores endocrinos de organismos de vida marina. Al insertar un grupo metileno entre el anillo aromático y la cadena de PEG, la funcionalidad fenol de Triton-X100 ya no está presente en la nueva estructura. Además, una vez que la cadena de PEG se descompone después de ser liberada al medio ambiente, el alcohol bencílico revelado se oxidará fácilmente al ácido benzoico correspondiente. Este metabolito tiene una polaridad y una estructura geométrica completamente diferente a la de un derivado de fenol, lo que evitará cualquier inhibición en los receptores endocrinos.

Basándose en las consideraciones anteriores, los presentes inventores sintetizaron éteres de polioxietileno no fenólicos y probaron su actividad antiviral (véanse los Ejemplos 4 a 10). Por tanto, la presente descripción proporciona éteres de polioxietileno no fenólicos de la siguiente Fórmula general (VIII):

En la Fórmula (VIII) R representa un grupo hidrocarburo que tiene una cadena lineal de 2 a 12 átomos de carbono y uno o más grupos metilo como sustituyentes en dicha cadena lineal, m representa un número entero de 1 a 4, y A representa un residuo de polioxietileno, opcionalmente con la condición de que se excluye el 29-[4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenil]-3,6,9,12,15,18,21,24,27-nonaoxanonacosan-1-ol que tiene la siguiente fórmula estructural.

En la Fórmula (VIII), R representa un grupo hidrocarburo que tiene una cadena lineal de 2 a 12, preferiblemente de 2 a 8, más preferiblemente de 2 a 6 y, lo más preferiblemente, 4 átomos de carbono y uno o más, preferiblemente de 2 a 6 y, lo más preferiblemente, 4 grupo(s) metilo como sustituyente(s) en dicha cadena lineal.

Preferiblemente, R representa un grupo hidrocarburo que tiene una cadena lineal de 2 a 12, preferiblemente de 2 a 8, más preferiblemente de 2 a 6 y, lo más preferiblemente, 4 átomos de carbono y 2 grupo(s) metilo como sustituyente(s) en dicha cadena lineal; un grupo hidrocarburo que tiene una cadena lineal de 2 a 12, preferiblemente de 2 a 8, más preferiblemente de 2 a 6 y, lo más preferiblemente, 4 átomos de carbono y 4 grupo(s) metilo como sustituyente(s) en dicha cadena lineal; o un grupo hidrocarburo que tiene una cadena lineal de 2 a 12, preferiblemente de 2 a 8, más preferiblemente de 2 a 6 y, lo más preferiblemente, 4 átomos de carbono y 6 grupo(s) metilo como sustituyente(s) en dicha cadena lineal.

Lo más preferiblemente, R representa un grupo 2,4,4-trimetil-pent-2-ilo.

En la Fórmula (VIII) m representa un número entero de 1 a 4, preferiblemente un número entero de 1 a 2 y, lo más preferiblemente, un número entero de 1.

En la Fórmula (VIII) A representa un residuo de polioxietileno, preferiblemente un residuo de polioxietileno que comprende 2-20 unidades de oxietileno, más preferiblemente un residuo de polioxietileno que comprende de 4 a 16 unidades de oxietileno, incluso más preferiblemente un residuo de polioxietileno que comprende de 8 a 12 unidades de oxietileno y, lo más preferiblemente, un residuo de polioxietileno que comprende 9 o 10 unidades de oxietileno.

Un aspecto preferido del compuesto de Fórmula general (VIII) es un compuesto en donde R representa un grupo hidrocarburo que tiene una cadena lineal de 2 a 6 átomos de carbono y de 2 a 4 grupos metilo como sustituyentes en dicha cadena lineal; m representa un número entero de 1 a 2; y A representa un residuo de polioxietileno que comprende de 8 a 12 unidades de oxietileno.

Otro aspecto preferido del compuesto de Fórmula general (VIII) es un compuesto en donde R representa un grupo hidrocarburo que tiene una cadena lineal de 2 a 6 átomos de carbono y de 2 a 4 grupos metilo como sustituyentes en dicha cadena lineal; m representa un número entero de 1; y A representa un residuo de polioxietileno que comprende de 8 a 12 unidades de oxietileno.

El compuesto de la presente invención es el siguiente compuesto:

en donde m es igual a 1 y z es un número entero seleccionado del siguiente grupo: z = 1 a 5.

Una realización preferida específica de acuerdo con la presente invención es el siguiente compuesto:

en donde n es un número entero entre 4 y 16, preferiblemente en donde n es igual a 9 o 10.

El compuesto de Fórmula (VIII) se puede sintetizar mediante métodos sintéticos comúnmente conocidos, tales como los descritos en el libro de texto de química orgánica práctica de Vogel (5a edición, 1989, A.I. Vogel, A.R. Tatchell, B.S. Furnis, A.J. Hannaford, P.W.G. Smith). Por ejemplo, el polietoxilato de alcohol 4-tercoctilbencílico se puede preparar convirtiendo un fenol que comprende un sustituyente correspondiente al grupo R de fórmula general (VlII) en el ácido benzoico o ácido homobenzoico correspondiente, reduciendo el grupo ácido a un grupo alcohol y haciendo reaccionar el alcohol para formar un éter de polietilenglicol (también conocido como éter de polioxietileno; éter POE). En este caso, el óxido de etileno o un polietilenglicol adecuado pueden servir como base para introducir la funcionalidad de éter de polietilenglicol (Esquema 1; se pueden encontrar ejemplos representativos de procedimientos experimentales que son eficaces para llevar a cabo transformaciones individuales, por ejemplo, en Bioorganic & Medicinal Chemistry, 16(9), 4883-4907, 2008; Journal of Medicinal Chemistry, 48(10), 3586-3604, 2005; Journal of Physical Chemistry B, 107(31), 7896-7902; 2003; Journal of Nanoparticle Research, 15(11), 2025/1-2025/12, 12 pp., 2013; y PCT Int. Appl., 2005016240, 24 Feb 2005.).

De manera alternativa, se puede acceder al compuesto de Fórmula general (VIII) a través de la alquilación de tolueno, seguida de la funcionalización del grupo metilo bencílico y una reacción adicional para formar un éter de polietilenglicol (Esquema 2; se pueden encontrar ejemplos representativos de procedimientos experimentales que son efectivos para llevar a cabo transformaciones individuales, por ejemplo, en Russian Journal of Applied Chemistry, 82(6), 1029-1032, 2009; Journal of Organic Chemistry, 79(1), 223-229, 2014; y Chemistry - A European Journal, 23(60), 15133-15142, 2017)). También se prevé la alquilación directa del alcohol bencílico para obtener un intermedio adecuado para introducir la funcionalidad del éter de polietilenglicol (Esquema 3; se pueden encontrar ejemplos representativos de procedimientos experimentales para las transformaciones correspondientes, por ejemplo, en Russian Journal of Organic Chemistry, 51(11), 1545-1550, 2015).

Los éteres de polioxietileno como se definen en las reivindicaciones adjuntas se pueden utilizar en los métodos para inactivar un virus que tiene una envoltura lipídica según la presente invención.

Como se ha descrito anteriormente, y como será evidente para un experto en la técnica, la síntesis de éteres de polioxietileno generalmente produce productos con una amplia polidispersidad de longitudes de unidades de repetición de polioxietileno. Por lo tanto, cuando se indica el número de unidades de repetición de polioxietileno para los éteres de polioxietileno de la presente invención, este número se refiere a la longitud promedio de la unidad de repetición de polioxietileno. La longitud promedio de la unidad de repetición de polioxietileno se refiere al número promedio de unidades de repetición de polioxietileno de todas las moléculas de éter de polioxietileno de una muestra. Por ejemplo, en un aspecto del método para inactivar un virus que tiene una envoltura lipídica de la presente descripción, se añade un detergente a un líquido para preparar una mezcla de dicho detergente y dicho líquido, en donde dicho detergente puede ser un éter de polioxietileno que tiene la siguiente estructura según la Fórmula (III):

en donde n es igual

En este aspecto, n = 10 en la Fórmula (III) anterior será el número promedio de unidades de repetición de polioxietileno de todas las moléculas de éter de polioxietileno que se añaden al líquido de acuerdo con la presente descripción.

Los detergentes de éter de polioxietileno utilizados en los métodos para inactivar un virus que tiene una envoltura lipídica según la presente invención tienen un número promedio de unidades de repetición de polioxietileno de 2 a 100, de 2 a 50, de 2 a 20, o de 4 a 16, o de 9 o 10. Preferiblemente, el número promedio de unidades de repetición de polioxietileno es de 4 a 16, más preferiblemente 9 o 10 y, lo más preferiblemente, 10.

Como será evidente para un experto en la técnica, en los detergentes de éter de polioxietileno/polioxipropileno de acuerdo con la presente invención, un grupo metilo puede estar unido al grupo hidroxilo terminal de la fracción de polioxietileno/polioxipropileno (es decir, el grupo hidroxilo terminal puede estar bloqueado). Tal bloqueo del grupo hidroxilo terminal puede facilitar la síntesis. Esto es particularmente útil para compuestos que no se obtienen mediante etoxilación o propoxilación, tal como los compuestos obtenidos de acuerdo con el Esquema 1 o el Esquema 2 anteriores. Las estructuras con una fracción de polioxietileno/polioxipropileno bloqueada con metilo se denominan habitualmente derivados de mPEG, como lo ilustran las siguientes estructuras de ejemplo:

Poli(etilenglicol) (PEG) Metoxipolietilenglicol (mPEG)

Como será evidente para un experto en la técnica, la síntesis de éteres de polioxietileno generalmente también produce productos con una amplia polidispersidad de longitudes de unidades de repetición de polioxietileno. Por lo tanto, cuando se indica el número de unidades de repetición de polioxipropileno para los éteres de polioxipropileno de acuerdo con la presente descripción, este número se refiere a la longitud promedio de la unidad de repetición de polioxipropileno. Como se ha descrito anteriormente para los éteres de polioxietileno, la longitud promedio de la unidad de repetición de polioxipropileno se refiere al número promedio de unidades de repetición de polioxipropileno de todas las moléculas de éter de polioxipropileno de una muestra.

Los detergentes de éter de polioxipropileno utilizados de acuerdo con la presente descripción tienen un número promedio de unidades de repetición de polioxipropileno de 2 a 100, de 2 a 50, de 2 a 20, o de 5 a 15, o de 9 o 10. Preferiblemente, el número promedio de unidades de repetición de polioxietileno es de 5 a 15, más preferiblemente 9 o 10 y, lo más preferiblemente, 10.

En un aspecto de la presente descripción, el éter de polioxietileno que se utiliza en los métodos para inactivar un virus que tiene una envoltura lipídica según la presente descripción tiene la siguiente estructura según la Fórmula (II):

En un aspecto preferido de la presente descripción, el compuesto representado por la Fórmula (II) anterior es Triton X-100 reducido disponible comercialmente (n.° CAS 92046-34-9).

En un aspecto de la presente descripción, el éter de polioxietileno que se utiliza en los métodos para inactivar un virus que tiene una envoltura lipídica según la presente descripción tiene la siguiente estructura según la Fórmula (IV):

En un aspecto preferido de la presente descripción, el compuesto representado por la Fórmula (IV) anterior es Triton N-101 reducido disponible comercialmente (n.° CAS 123359-41-1).

En un aspecto de la presente descripción, el éter de polioxietileno que se utiliza en los métodos para inactivar un virus que tiene una envoltura lipídica según la presente descripción tiene la siguiente estructura según la Fórmula (VI):

en donde x es igual a 15.

En un aspecto preferido de la presente descripción, el compuesto representado por la Fórmula (VI) anterior es Brij C10 disponible comercialmente (n.° CAS 9004-95-9).

De acuerdo con todos los demás aspectos de la descripción, en los métodos para inactivar un virus que tiene una envoltura lipídica de la presente descripción, los éteres de polioxietileno también pueden reemplazarse por éteres de monooxietileno. En un aspecto preferido de la descripción, dichos éteres de monooxietileno tienen la siguiente estructura según la Fórmula C:

en donde x, y y z son números enteros que se seleccionan independientemente de los siguientes grupos: x = 0 a 5

y = 0 a 5

z = 0 a 20

Preferiblemente, dichos éteres de monooxietileno tienen la siguiente estructura según la Fórmula D:

De acuerdo con todos los demás aspectos de la descripción, la presente descripción también proporciona éteres de monooxietileno correspondientes a los éteres de polioxietileno proporcionados por la presente descripción. En un aspecto preferido de la descripción, dichos éteres de monooxietileno tienen la siguiente estructura según la Fórmula F:

en donde R representa un grupo hidrocarburo que tiene una cadena lineal de 2 a 12 átomos de carbono y uno o más grupos metilo como sustituyentes en dicha cadena lineal; m representa un número entero de 1 a 4, y A representa un residuo de polioxietileno.

En otro aspecto preferido, el éter monooxietileno de Fórmula F es el siguiente compuesto:

Los éteres de monooxietileno anteriores con las estructuras según la Fórmula F se pueden utilizar en los métodos para inactivar un virus que tiene una envoltura lipídica según la presente descripción.

En los métodos para inactivar un virus que tiene una envoltura lipídica según la presente invención, se añade un detergente a un líquido para preparar una mezcla de dicho detergente y dicho líquido. En una realización de la invención, los detergentes de éter de polioxietileno se añaden al líquido para producir una concentración final de aproximadamente 0,03% (p/p) a 10% (p/p), preferiblemente de aproximadamente 0,05% (p/p) a 10% (p/p), más preferiblemente de aproximadamente 0,1% (p/p) a 10% (p/p), incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,5% (p/p) a 5% (p/p), lo más preferiblemente de aproximadamente 0,5% (p/p) a 2% (p/p) de detergente de éter de polioxietileno en el líquido.

En una realización preferida de los métodos para inactivar un virus que tiene una envoltura lipídica de la presente invención, los éteres de polioxietileno que se utilizan en los métodos son adecuados para la inactivación de dicho virus que tiene una envoltura lipídica. La inactivación, como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la interrupción de la capacidad del virus con envoltura lipídica para infectar células. Como será evidente para un experto en la técnica, la capacidad de un virus con envoltura lipídica para infectar células, es decir, la infectividad de un virus con envoltura lipídica, normalmente se evalúa determinando el número de partículas víricas infecciosas en una disolución. Se describen en la presente memoria métodos de ejemplo para determinar la cantidad de partículas víricas infecciosas en una disolución.

En una realización, en el método para inactivar un virus que tiene una envoltura lipídica de la presente invención, la etapa de añadir un detergente y un disolvente a un líquido se lleva a cabo de manera que se prepara una mezcla de disolvente/detergente para la inactivación de dicho virus. Preferiblemente, dicho disolvente es un disolvente orgánico y aún más preferiblemente, dicho disolvente es fosfato de tri-n-butilo. Se entiende que la concentración del detergente y el tipo y concentración del disolvente pueden ser elegidos apropiadamente por un experto, teniendo en cuenta, por ejemplo, los virus potenciales presentes en el líquido, el LRV deseado, las propiedades del fármaco biofarmacéutico que puede estar presente en el líquido y las características del proceso de fabricación del fármaco biofarmacéutico que puede estar presente en el líquido (p. ej., a qué temperatura se llevará a cabo la inactivación). Normalmente, las concentraciones finales de un disolvente orgánico y un único detergente durante la incubación de acuerdo con la invención son de aproximadamente 0,01% (p/p) a aproximadamente 5% (p/p) de disolvente orgánico y de aproximadamente 0,05% (p/p) a aproximadamente 10% (p/p) de detergente, preferiblemente de aproximadamente 0,1% (p/p) a aproximadamente 5% (p/p) de disolvente orgánico y de aproximadamente 0,1% (p/p) a aproximadamente 10% (p/p) de detergente, más preferiblemente de aproximadamente 0,1% (p/p) a aproximadamente 1% (p/p) de disolvente orgánico y de aproximadamente 0,5% (p/p) a aproximadamente 5% (p/p) de detergente, lo más preferiblemente de aproximadamente 0,1% (p/p) a aproximadamente 0,5% (p/p) de disolvente orgánico y de aproximadamente 0,5% (p/p) a aproximadamente 2% (p/p) de detergente.

En otra realización, en el método para inactivar un virus que tiene una envoltura lipídica de la presente invención, la etapa de añadir un detergente (y opcionalmente también un disolvente) a un líquido se lleva a cabo de manera que se añade un detergente adicional al líquido. Preferiblemente, dicho detergente adicional es monooleato de polioxietileno (80) sorbitán (también conocido como, p. ej., polisorbato 80 o TWEEN 80). Preferiblemente, dicho disolvente es un disolvente orgánico y aún más preferiblemente, dicho disolvente es fosfato de tri-n-butilo. Se entiende que la concentración del detergente de acuerdo con la presente invención, el tipo y concentración del detergente adicional así como el tipo y concentración del disolvente pueden ser elegidos apropiadamente por un experto, teniendo en cuenta, por ejemplo, los virus potenciales presentes en el líquido, el LRV deseado, las propiedades del fármaco biofarmacéutico que puede estar presente en el líquido y las características del proceso de fabricación del fármaco biofarmacéutico que puede estar presente en el líquido (p. ej., a qué temperatura se llevará a cabo la inactivación). Normalmente, la concentración final de un disolvente orgánico es de aproximadamente 0,01% (p/p) a aproximadamente 5% (p/p), la concentración final del detergente de acuerdo con la presente invención es de aproximadamente 0,05% (p/p) a aproximadamente 10% (p/p), y la concentración final del detergente adicional es de aproximadamente 0,01% (p/p) a aproximadamente 5% (p/p). Preferiblemente, la concentración final de un disolvente orgánico es de aproximadamente 0,1% (p/p) a aproximadamente 5% (p/p), la concentración final del detergente de acuerdo con la presente invención es de aproximadamente 0,1% (p/p) a aproximadamente 10% (p/p), y la concentración final del detergente adicional es aproximadamente 0,1% (p/p) a aproximadamente 5% (p/p). Más preferiblemente, la concentración final de un disolvente orgánico es de aproximadamente 0,1% (p/p) a aproximadamente 1% (p/p), la concentración final del detergente de acuerdo con la presente invención es de aproximadamente 0,5% (p/p) a aproximadamente 5% (p/p), y la concentración final del detergente adicional es de aproximadamente 0,1% (p/p) a aproximadamente 1% (p/p). Lo más preferiblemente, la concentración final de un disolvente orgánico es de aproximadamente 0,1% (p/p) a aproximadamente 0,5% (p/p), la concentración final del detergente de acuerdo con la presente invención es de aproximadamente 0,5% (p/p) a aproximadamente 2% (p/p), y la concentración final del detergente adicional es de aproximadamente 0,1% (p/p) a aproximadamente 0,5% (p/p).

En otra realización de acuerdo con la invención, sólo se utiliza un detergente. Por ejemplo, en una realización del método de la invención, en la etapa a) no se añade ningún otro detergente que no sea el detergente de la invención. En otra realización del método de la invención, en el método no se añade ningún otro detergente que no sea el detergente de la invención. En otra realización de acuerdo con la invención, cuando se usa un detergente de la invención en un método para la inactivación de un virus que tiene una envoltura lipídica, no se usa ningún otro detergente que no sea el detergente de la invención. Una ventaja de estas realizaciones es que un único detergente se puede eliminar más fácilmente en etapas (del método) posteriores. Por ejemplo, un único detergente se puede eliminar más fácilmente en comparación con los tres componentes utilizados en un tratamiento estándar con disolvente/detergente (S/D), que normalmente incluye dos detergentes y un disolvente, en particular un disolvente orgánico. Así pues, en otra realización de acuerdo con la invención, la composición que comprende un detergente de la invención no comprende ningún otro detergente distinto de dicho detergente.

En otra realización de acuerdo con la invención, no se utiliza ningún disolvente orgánico. Por ejemplo, en una realización del método de la invención, en la etapa a) no se añade ningún disolvente orgánico. En otra realización de acuerdo con la invención, cuando se usa un detergente de la invención en un método para la inactivación de un virus que tiene una envoltura lipídica, no se usa ningún disolvente orgánico. En otra realización de acuerdo con la invención, la composición que comprende un detergente de la invención no comprende ningún disolvente orgánico.

Como se ha esbozado anteriormente, el método para inactivar un virus que tiene una envoltura lipídica según la presente invención es particularmente útil en procesos de producción biofarmacéutica, en donde la ausencia de virus activo (es decir, infeccioso) en el producto final tiene que estar asegurada para garantizar la seguridad del paciente. Por lo tanto, en una realización, en los métodos para inactivar un virus que tiene una envoltura lipídica según la presente invención, se añade un detergente a un líquido que comprende un producto medicinal biológico o un fármaco biofarmacéutico, preferiblemente un fármaco biofarmacéutico. En una realización preferida de la presente invención, dicho fármaco biofarmacéutico no es una vacuna viral. Los fármacos biofarmacéuticos de acuerdo con la invención no están particularmente limitados. Incluyen tanto fármacos biofarmacéuticos recombinantes como fármacos biofarmacéuticos de otras fuentes, tales como fármacos biofarmacéuticos obtenidos a partir de plasma humano. Los fármacos biofarmacéuticos de acuerdo con la invención incluyen, sin que ello pretenda ser limitante, factores sanguíneos, inmunoglobulinas, enzimas de reemplazo, vacunas, vectores de terapia génica, factores de crecimiento y sus receptores. En una realización preferida, el fármaco biofarmacéutico es una proteína terapéutica. Los factores sanguíneos preferidos incluyen factor I (fibrinógeno), factor II (protrombina), factor tisular, factor V, factor VII y factor VIIa, factor VIII, factor IX, factor X, factor XI, factor XII, factor XIII, factor de von Willebrand (FvW), precalicreína, cininógeno de alto peso molecular (HMWK), fibronectina, antitrombina III, cofactor de heparina II, proteína C, proteína S, proteína Z, plasminógeno, alfa 2-antiplasmina, activador tisular del plasminógeno (tPA), urocinasa, inhibidor del activador de plasminógeno 1 (PAI1) e inhibidor del activador de plasminógeno 2 (PAI2). El factor VIII es un factor sanguíneo particularmente preferido, y el factor VIII recombinante es aún más preferido. Se pretende que los factores sanguíneos que se pueden usar de acuerdo con la presente invención incluyan variantes de polipéptidos funcionales y polinucleótidos que codifican los factores sanguíneos o codifican dichas variantes de polipéptidos funcionales. Las inmunoglobulinas preferidas incluyen inmunoglobulinas de plasma humano, anticuerpos monoclonales y anticuerpos recombinantes. Los fármacos biofarmacéuticos de acuerdo con la invención son preferiblemente las respectivas proteínas humanas o humanas recombinantes o variantes funcionales de las mismas.

Como se ha indicado anteriormente, el fármaco biofarmacéutico de acuerdo con la presente invención también puede ser un vector de terapia génica, incluido un vector de terapia génica viral. Como será evidente para un experto en la técnica, los métodos para inactivar un virus que tiene una envoltura lipídica de la presente invención generalmente no inactivan virus sin envoltura. Por lo tanto, en una realización preferida, donde el fármaco biofarmacéutico de acuerdo con la presente invención es un vector de terapia génica viral, tal vector de terapia génica viral está basado en un virus sin envoltura. En una realización preferida, tal vector de terapia génica viral está basado en virus adenoasociados (AAV).

De acuerdo con todas las demás realizaciones de la presente invención, el método para inactivar un virus que tiene una envoltura lipídica de la presente invención puede comprender, después de la etapa de incubar dicha mezcla para inactivar dicho virus, una etapa de purificar dicho fármaco biofarmacéutico. Preferiblemente, dicha purificación comprende separar dicho fármaco biofarmacéutico de dicho(s) detergente(s). El experto conocerá diversos métodos para separar un fármaco biofarmacéutico de uno o más detergentes. Tales métodos pueden ser seleccionados por un experto en la técnica teniendo en cuenta las propiedades del fármaco biofarmacéutico, la fuente de la que se obtiene (p. ej., de forma recombinante o de otras fuentes como, p. ej., plasma humano) y la aplicación biofarmacéutica deseada (p. ej., si se administrará por vía subcutánea o intravenosa, etc.). Por ejemplo, un fármaco biofarmacéutico se puede separar del(de los) detergente(s) usando cromatografía, tal como cromatografía de intercambio aniónico o cromatografía de intercambio catiónico. En una realización, dicha purificación a partir de dicho(s) detergente(s) comprende más de una purificación cromatográfica.

De acuerdo con todas las demás realizaciones de la presente invención, el método para inactivar un virus que tiene una envoltura lipídica de la presente invención puede comprender una etapa de filtrar dicha mezcla, preferiblemente con un filtro de profundidad. Esta etapa de filtrado se puede llevar a cabo antes de la etapa de añadir un detergente a un líquido para preparar una mezcla de dicho detergente y dicho líquido. Alternativamente, esta etapa de filtración se puede llevar a cabo entre la etapa de añadir un detergente a un líquido para preparar una mezcla de dicho detergente y dicho líquido y la etapa de incubar dicha mezcla para inactivar dicho virus.

En otra realización de acuerdo con todas las demás realizaciones de la presente invención, en los métodos para inactivar un virus que tiene una envoltura lipídica, la etapa de incubar dicha mezcla para inactivar dicho virus se puede llevar a cabo de una manera que dicha mezcla se incube durante al menos 10 min, durante al menos 30 min, durante al menos 1 hora, durante al menos 2 horas, durante al menos 4 horas, durante al menos 12 horas o durante al menos 24 horas.

En otra realización de acuerdo con todas las demás realizaciones de la presente invención, en la etapa de incubar dicha mezcla para inactivar dicho virus, dicha mezcla se incuba a una temperatura baja, tal como una temperatura entre 0°C y 15°C, entre 0°C y 10°C, entre 0°C y 8°C, entre 0°C y 6°C, entre 0°C y 4°C, o entre 0°C y 2°C , preferiblemente entre 0°C y 10°C. En una realización alternativa de acuerdo con todas las demás realizaciones de la presente invención, en la etapa de incubar dicha mezcla para inactivar dicho virus, dicha mezcla se incuba a temperatura ambiente o cerca de ella, tal como a una temperatura entre 16°C y 25°C, entre 18°C y 24°C, o entre 20°C y 23°C.

Debe entenderse que la forma en que se llevarán a cabo las etapas del método de la presente invención no está particularmente limitada. En particular, las etapas del método se pueden llevar a cabo de manera discontinua. Alternativamente, las etapas del método también se pueden llevar a cabo de forma semicontinua o continua.

Como se ha esbozado anteriormente, el método para inactivar un virus que tiene una envoltura lipídica según la presente invención es particularmente útil en procesos de producción biofarmacéutica. Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un método para preparar un fármaco biofarmacéutico, comprendiendo dicho método las etapas del método para inactivar un virus que tiene una envoltura lipídica de acuerdo con la presente invención y cualquiera de sus realizaciones. Preferiblemente, el método para preparar un fármaco biofarmacéutico de acuerdo con la presente invención comprende una etapa de preparación de una formulación farmacéutica que comprende dicho fármaco biofarmacéutico, que se realiza posteriormente a las etapas del método para inactivar un virus que tiene una envoltura lipídica según la presente invención. Dicha formulación farmacéutica se puede preparar de acuerdo con estándares conocidos para la preparación de formulaciones farmacéuticas. Por ejemplo, la formulación se puede preparar de manera que se pueda almacenar y administrar apropiadamente, p. ej. usando componentes farmacéuticamente aceptables tales como vehículos, excipientes o estabilizadores. Dichos componentes farmacéuticamente aceptables no son tóxicos en las cantidades utilizadas cuando se administra la formulación farmacéutica a un paciente.

Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que los detergentes de éter de polioxietileno según la presente invención son particularmente útiles para inactivar virus que tienen una envoltura lipídica. Por tanto, la presente invención también se refiere al uso de los detergentes de éter de polioxietileno descritos según la presente invención en cualquier método para la inactivación de un virus que tiene una envoltura lipídica. Preferiblemente, dicho método para dicha inactivación de dicho virus es un método que utiliza un tratamiento con disolvente/detergente, en donde dicho tratamiento con disolvente/detergente comprende el uso de dicho detergente de la presente invención. En otra realización, dicha inactivación del virus es una inactivación del virus en un líquido que comprende un fármaco biofarmacéutico.

Dado que los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que los detergentes de éter de polioxietileno no fenólicos según la presente invención son particularmente útiles para inactivar virus que tienen una envoltura lipídica, la presente invención también se refiere a los detergentes de éter de polioxietileno según la presente invención, y a una composición que comprende un detergente de éter de polioxietileno según la presente invención. En otra realización, la composición que comprende un detergente de éter de polioxietileno según la presente invención comprende además un fármaco biofarmacéutico y/o un disolvente orgánico y/o un detergente adicional.

También se describe un kit para la inactivación del virus, que comprende un detergente de éter de polioxietileno según la presente invención o la composición que comprende un detergente de éter de polioxietileno según la presente invención, y que comprende además una resina de cromatografía para una purificación cromatográfica. En otro aspecto, dicho kit comprende además un filtro de profundidad.

La presente invención proporciona éteres de polioxietileno no fenólicos. Como se ha descrito anteriormente, estos éteres de polioxietileno se pueden usar en los métodos para inactivar un virus que tiene una envoltura lipídica según la presente invención. Sin embargo, estos éteres de polioxietileno no fenólicos, así como todos los demás éteres de polioxietileno no fenólicos de acuerdo con la presente invención, también se pueden usar para otros fines diversos, p. ej. para aquellos en los que se usa comúnmente Triton X-100. Por ejemplo, los éteres de polioxietileno no fenólicos de acuerdo con la presente invención se pueden utilizar en el laboratorio. En el laboratorio se pueden utilizar, p. ej., para lisar células para extraer proteínas u orgánulos, o para permeabilizar las membranas de células vivas; para permeabilizar membranas de células eucariotas no fijadas (o ligeramente fijadas); para solubilizar proteínas de membrana en su estado nativo junto con detergentes zwitteriónicos tales como CHAPS; como parte del tampón de lisis (generalmente en una disolución al 5% en tampón de lisis alcalino) en la extracción de ADN; para reducir la tensión superficial de disoluciones acuosas durante la inmunotinción (generalmente a una concentración de 0,1-0,5% en tampón TBS o PBS); para restringir la expansión de colonias de Aspergillus nidulans en microbiología; para descelularizar tejidos de origen animal; o para eliminar SDS de geles SDS-PAGE antes de renaturalizar las proteínas dentro del gel. Los éteres de polioxietileno no fenólicos de acuerdo con la presente invención se pueden usar en la industria electrónica, p. ej. como agente humectante para las lamas para mejorar y acelerar algunos procedimientos y operaciones. Los éteres de polioxietileno no fenólicos de acuerdo con la presente invención pueden tener usos médicos, p. ej., se pueden utilizar como sustituto del espermicida Nonoxinol 9, o como excipiente farmacéutico, o como ingrediente en la vacuna contra la influenza (Fluzone). Los éteres de polioxietileno no fenólicos de acuerdo con la presente invención se pueden usar en varios tipos de compuestos de limpieza, que van desde productos industriales de alta resistencia hasta detergentes suaves; se pueden utilizar como ingrediente en líquidos limpiadores de discos de vinilo caseros junto con agua destilada y alcohol isopropílico; se pueden utilizar durante la limpieza de discos diamantados; se pueden utilizar en formulaciones para la polimerización de emulsiones; se pueden utilizar en neumáticos; se pueden utilizar en agentes de lavado y limpieza; se pueden utilizar en la industria como productos químicos de partida para la producción de polímeros o colas; se pueden utilizar en limpiadores domésticos o industriales, en pinturas o revestimientos, en pasta o papel, en yacimientos petrolíferos, en textiles, en agroquímicos, en fluidos para trabajar metales; se pueden utilizar para la dispersión de materiales de carbono para materiales compuestos blandos; o se pueden utilizar en el enchapado de metal.

A continuación, la presente invención se ilustrará mediante ejemplos, sin limitarse a ellos.

Ejemplos

Como se ha esbozado anteriormente, estudios ecológicos recientes han planteado preocupaciones ambientales con respecto al uso de Triton X-100 en procesos de producción biofarmacéutica. Basándose en consideraciones estructurales, los presentes inventores han identificado detergentes candidatos de manera alternativas útiles a Triton X-100 que no se han asociado con un impacto ambiental negativo. En particular, los presentes inventores han identificado sorprendentemente los éteres de polioxietileno de manera alternativas adecuadas a Triton X-100 para inactivar virus con envoltura lipídica mediante tratamiento con disolvente/detergente (S/D) durante la producción biofarmacéutica. En los siguientes experimentos, se probó la idoneidad de detergentes candidatos de ejemplo para el tratamiento S/D en líquidos que contienen inmunoglobulina intravenosa (IVIG) y albúmina sérica humana (HSA). Además, en los siguientes experimentos se sintetizó polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico y se probó la idoneidad del polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico y otros éteres de polioxietileno para el tratamiento S/D así como para el tratamiento con un único detergente en varios artículos de prueba.

Ejemplo 1: Inactivación de VIH y PRV usando Triton X-100 reducido o Triton N-101 reducido en líquidos que comprenden inmunoglobulina intravenosa (Ejemplo de referencia)

La idoneidad de Triton X-100 reducido o Triton N-101 reducido para el tratamiento S/D para inactivar los virus con envoltura lipídica, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y el virus de la pseudorrabia (PRV) en líquidos que comprenden inmunoglobulina intravenosa (IVIG) se probó y se comparó con Triton X-100. Para ello, se añadió virus a líquidos que contenían IVIG. Los líquidos que contenían virus que comprendían IVIG se incubaron luego con mezclas S/D que comprendían concentraciones bajas de Triton X-100 reducido, Triton N-101 reducido o Triton X-100 durante varios períodos de tiempo, y se determinó la infectividad remanente de los virus. Se usaron Triton X-100 reducido, Triton N-101 reducido y Triton X-100 en concentraciones bajas para evaluar la cinética de inactivación del virus, es decir, la eficiencia de la inactivación del virus (expresada por el RF) a lo largo del tiempo. Como será evidente para un experto en la técnica, en procesos de producción comerciales tales como la producción biofarmacéutica, los detergentes que incluyen Triton X-100 reducido o Triton N-101 reducido se pueden usar en concentraciones significativamente más altas, lo que acelerará la cinética de inactivación del virus y también se espera que aumente el LRV alcanzado.

Materiales

Líquido que comprende IVIG

Un líquido que comprendía IVIG (líquido que contiene IVIG) se congeló en hielo seco y se almacenó a < -60°C hasta su uso en el plazo de un año a partir de la fecha de recogida.

Virus

El virus de la pseudorabia (PRV; Familia Herpesviridae; con envoltura; dsDNA; 0 = 120-200 nm) se usó como modelo para grandes virus de ADN con envoltura.

El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH; Familia Retroviridae; con envoltura; ssRNA; 0 = 80-100 nm) se usó como un virus diana relevante y un modelo para otros virus de ARN (ácido ribonucleico) con envoltura lipídica como el VIH-2.

Tabla 1: Reservas de virus utilizadas en los experimentos.

Cepa del Fuente Propagado en Valorado en virus Línea Fuente Línea Fuente celular celular

PRV Universidad Eberhard Karls, Vero ECACC1 Vero ECACC1 Kaplan Tubinga, Alemania 84113001 84113001 1 ECACC: Colección europea de cultivos celulares autenticados, Salud pública Inglaterra Porton Down, Salisbury, SP40JG Reino Unido

VIH NIAID2 n.° 398 H9 ECACC1 AA2 NIAID2 n.° 135 VIH-1 IIIB 85050301

1 ECACC: Colección europea de cultivos celulares autenticados, Salud pública Inglaterra Porton Down. Salisbury. SP40JG UK

2 NIAID: Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas, 5601 Fishers Lane, MSC 9806, Bethesda MD 20892-9806 EE. UU.

Las reservas de virus se caracterizaron antes de su uso. Esta caracterización incluyó la determinación de la valoración del virus mediante al menos diez valoraciones independientes y la especificación de un intervalo de valoraciones de virus de aceptación para su uso como control positivo, la determinación del contenido de proteína de las reservas de virus, pruebas de PCR para la identidad del virus y la contaminación con otros virus y micoplasmas y pruebas de agregación de virus con filtros que no permiten el paso de grandes agregados de virus. Sólo se utilizaron cepas de virus que pasaron las pruebas de identidad/contaminación por PCR sin agregación significativa (es decir, la diferencia en las valoraciones de infectividad entre la cepa de virus y la cepa filtrada fue menor que 1,0 log).

Mezclas de reactivos Tritón X-100 reducido o Tritón N-101 reducido

Los componentes S/D Polisorbato 80 (PS80, Crillet 4 HP, Tween 80) y Tri-n-butil-fosfato (TnBP) se combinaron con el detergente respectivo (es decir, Triton X-100, Triton X-100 reducido o Triton N-101 reducido) en la siguiente proporción (véase la Tabla 2 a la Tabla 4):

Tabla 2: Cantidad de componentes para la mezcla de reactivos S/D con Triton X-100

Tabla 3: Cantidad de componentes para la mezcla de reactivos S/D con Triton X-100 reducido

Tabla 4: Cantidad de componentes para la mezcla de reactivos S/D con Tritón N-101 reducido

Cada mezcla se agitó durante al menos 15 minutos. Las mezclas de reactivos S/D se almacenaron a temperatura ambiente para su uso en el plazo de un año. Antes de su uso, la mezcla de reactivos S/D respectiva se agitó nuevamente durante al menos 15 minutos para asegurar la homogeneidad.

Métodos

La capacidad de inactivación del virus y la robustez del tratamiento S/D se evaluaron en condiciones desfavorables para la inactivación del virus, es decir, con tiempos de incubación cortos y a temperaturas relativamente bajas. Como será evidente para un experto en la técnica, en procesos de producción comerciales tales como la producción biofarmacéutica, se pueden usar tiempos de incubación más largos y temperaturas más altas, lo que acelerará la cinética de inactivación del virus y también puede aumentar el LRV logrado. Además, como ya se mencionó anteriormente, se usaron concentraciones bajas de componentes S/D. Como será evidente para un experto en la técnica, en procesos de producción comerciales tales como la producción biofarmacéutica, se pueden usar concentraciones más altas de los componentes S/D, lo que acelerará la cinética de inactivación del virus y también puede aumentar el LRV logrado.

Dado que la concentración de proteína no tiene un impacto significativo sobre la inactivación del virus durante el tratamiento S/D (véase también Dichtelmüller et al., 2009), no se investigó la solidez con respecto al contenido de proteína.

Se descongeló el líquido que contenía IVIG y todas las etapas posteriores se llevaron a cabo en una cabina de bioseguridad de clase II. El líquido que contenía IVIG se incubó con agitación a una temperatura de 17°C ± 1°C usando una vasija de doble pared conectada a un criostato para la incubación. Luego, el líquido que contenía IVIG se filtró a través de un filtro de profundidad de 0,2 pm con un área de filtrado efectiva de 25 cm2 (Zeta Plus® VR06, Cuno/3M o equivalente) conectado a un portafiltro de acero inoxidable Sartorius (SM16249) usando nitrógeno presurizado a una presión diana de 0,9 bar (límite: 0,5 bar-1,5 bar). Para el acondicionamiento, el material del filtro se revistió previamente con 55 l/m2 de la suspensión Hyflo Supercel (5,0 g ± 0,05 g de Hyflo Supercel por litro; conductividad ajustada a 3,5 mS/cm (intervalo especificado: 2,5-6,0 mS/cm). utilizando NaCl 3 M) (a una presión de < 0,5 bar) antes de la filtración del líquido. Durante la filtración, se enfrió el portafiltro y el filtrado se recogió a una temperatura diana de < 18°C usando una vasija de doble pared conectada a un criostato. La vasija se enfrió para el filtrado. En caso de obstrucción del filtro, se utilizaron filtros nuevos preacondicionados para continuar la filtración del líquido remanente. Después de la filtración, se midieron la temperatura (diana: < 18°C) y el volumen.

Después de medir el volumen del líquido que contiene IVIG, se ajustó con agitación con tampón de dilución frío (+2°C a 8°C) (disolución de NaCl con conductividad diana de 3,5 mS/cm (intervalo: 2,5 mS /cm-6,0 mS/cm)) hasta una absorbancia diana calculada de 28,9 AU<280>-<320>/cm (intervalo: 14,5-72,3 AU<280>-<320>/cm). Teniendo en cuenta la posterior incorporación de virus 1:31, esto dio como resultado un valor de absorbancia diana calculado de 28 AU<280>-<320>/cm (intervalo: 14-70 AU<280>-<320>/cm) para la incubación con reactivos S/D después de la filtración.

El líquido que contiene IVIG filtrado y ajustado con proteínas se ajustó nuevamente con agitación a 17°C ± 1°C usando una vasija de doble pared conectada a un criostato. Este intervalo de temperatura se mantuvo con agitación hasta el final de la incubación del líquido que contenía IVIG filtrado con los reactivos S/D y se registró continuamente. Al volumen determinado del líquido que contenía IVIG filtrado, transferido a un matraz con tapa de rosca cuyo peso de tara se había determinado, se le incorporó virus a una razón de 1:31, p. ej., 30 ml de líquido que comprendía IVIG se enriquecieron con 1 ml de disolución madre de virus. El líquido que contenía IVIG incorporado se incubó adicionalmente con agitación continua a 17°C ± 1°C. Entre 1 y 2 minutos después de la incorporación, se tomaron muestras para la valoración del virus (0,5 ml de control de incorporación, SC y 2 ml de control de retención, HC).

Después de la extracción, el control de retención (HC) se mantuvo a la misma temperatura, es decir, a 17°C ± 1°C, que el material de proceso enriquecido después de la adición de los reactivos S/D, es decir, se almacenó en el mismo círculo de enfriamiento que la vasija con el líquido que contenía IVIG, hasta el final del tratamiento S/D. La temperatura del líquido de enfriamiento se determinó antes de la inserción de la muestra de control de retención y, nuevamente, poco antes de que se retirara el control de retención para su valoración después del tratamiento S/D.

El peso del líquido que contenía IVIG incorporado se determinó para calcular la cantidad de mezcla de reactivo S/D que debía añadirse. El material pesado se reajustó, en caso necesario, con agitación a 17°C ± 1°C. La mezcla de reactivos S/D respectiva se añadió al líquido que contenía IVIG para dar una concentración final de 0,05% del detergente de éter de polioxietileno respectivo. La mezcla de reactivos S/D se añadió con agitación en 1 minuto usando una jeringa, y la cantidad real de mezcla de reactivos S/D añadida se determinó volviendo a pesar la jeringa. El líquido que contenía IVIG incorporado se incubó adicionalmente con reactivos S/D con agitación continua a 17°C ± 1°C durante 59 ± 1 minutos. Durante la incubación, se tomaron muestras de 1 ml para la valoración del virus después de 1-2 min, 10 ± 1 min, 30 ± 1 min y 59 ± 1 min. Para evitar una mayor inactivación del virus por los reactivos S/D después de la extracción de muestras, las muestras se diluyeron inmediatamente 1:20 con medio de cultivo celular frío (de 2°C a 8°C) (es decir, 1 volumen de muestra más 19 volúmenes de medio de cultivo celular).

Para valorar las muestras, se prepararon diluciones seriadas de 0,5 log de las muestras en el medio de cultivo de tejidos apropiado y se añadieron 100 pl de cada dilución a cada uno de los 8 pocillos de una placa de microvaloración sembrada con la línea celular indicadora respectiva. Las células se incubaron durante 7 días a 36,0°C (punto de ajuste) antes de evaluar el efecto citopático mediante inspección visual bajo un microscopio. Las dosis infecciosas medianas en cultivos de tejidos (TCID<50>) se calcularon según la distribución de Poisson y se expresaron como log<1>ü[TCID<50>/ml].

El cálculo de la capacidad de eliminación del virus se llevó a cabo según la siguiente fórmula:

donde,

R = factor de reducción de virus

V<1>= volumen de material de partida [ml]

T<1>= concentración de virus en el material de partida [TCID<50>/ml]

V<2>= volumen de material después de la inactivación del virus [ml]

T<2>= concentración de virus después de la inactivación del virus [TCID<50>/ml]

Los volúmenes y las valoraciones de cada muestra enriquecida antes y después del tratamiento se usaron para calcular R. Siempre que no se detectó ningún virus, se tomó el límite de detección como el título de virus para el cálculo.

Resultados

Cuando se realizó el tratamiento S/D de un líquido que contiene IVIG usando una mezcla de Triton X-100 reducido, PS80 y TnBP o una mezcla de Triton N-101 reducido, PS80 y TnBP, el VIH se inactivó por un factor de reducción de virus (RF) de al menos 4 en 10 minutos (FIG. 1A). Se obtuvieron resultados similares en un experimento repetido (FIG. 1B).

En experimentos adicionales, cuando el tratamiento S/D de un líquido que contiene IVIG se realizó usando una mezcla de Triton X-100 reducido, PS80 y TnBP o una mezcla de Triton N-101 reducido, PS80 y TnBP , PRV fue inactivado por un RF de aproximadamente 4 en 10 minutos (FIG. 2A). Se obtuvieron resultados similares en un experimento repetido (FIG. 2B).

Estos experimentos muestran que reemplazar Triton X-100 por Triton X-100 reducido o Triton N-101 reducido para el tratamiento S/D de líquidos que contienen fármacos biofarmacéuticos da como resultado una inactivación eficiente de virus con envoltura lipídica, incluso a concentraciones bajas de los detergentes.

Ejemplo 2: Inactivación de VIH, PRV y BVDV usando Brij C10 en líquidos que comprenden inmunoglobulina intravenosa (Ejemplo de referencia)

Materiales y métodos

Los experimentos se realizaron como se ha descrito para el Ejemplo 1 anterior. Sin embargo, para el tratamiento S/D se probó una mezcla S/D que comprendía Brij C10 y se comparó con una mezcla S/D que comprendía Triton X-100. La composición de la mezcla S/D que comprendía Triton X-100 se preparó como se ha descrito en el Ejemplo 1 anterior. La composición de la mezcla S/D que comprendía Brij C10 se preparó de la siguiente manera.

Los componentes S/D Polisorbato 80 (PS80, Crillet 4 HP, Tween 80) y Tri-n-butil-fosfato (TnBP) se combinaron con el detergente Brij C10 en las siguientes proporciones (véase la Tabla 5):

Tabla 5: Cantidad de componentes para la mezcla de reactivos S/D con Brij C10

La mezcla se agitó durante al menos 15 minutos. La mezcla de reactivos S/D se almacenó a temperatura ambiente para su uso en el plazo de un año. Antes de su uso, la mezcla de reactivos S/D se agitó nuevamente durante al menos 15 minutos para asegurar la homogeneidad.

La mezcla de reactivos S/D respectiva se añadió al líquido que contenía IVIG para dar una concentración final de 0,05% del detergente de éter de polioxietileno respectivo.

Además, también se probó la inactivación del virus BVDV:

Tabla 6: Reservas de virus utilizadas en los experimentos.

Resultados

Cuando se realizó el tratamiento S/D de un líquido que contiene IVIG usando una mezcla de Brij C10, PS80 y TnBP, el VIH se inactivó mediante un factor de reducción de virus (RF) superior a 4 en 10 minutos (FIG. 3A). Se obtuvieron resultados similares en un experimento repetido (FIG. 3B).

En experimentos adicionales, cuando se realizó el tratamiento S/D de un líquido que contenía IVIG usando una mezcla de Brij C10, PS80 y TnBP, el PRV se inactivó mediante un RF de alrededor de 4 en 10 minutos (FIG.

4A). Se obtuvieron resultados similares en un experimento repetido (FIG. 4B).

En experimentos adicionales, cuando se realizó el tratamiento S/D de un líquido que contenía IVIG usando una mezcla de Brij C10, PS80 y TnBP, el BVDV se inactivó mediante un RF de alrededor de 5 en 10 minutos (FIG.

5A). Se obtuvieron resultados similares en un experimento repetido (FIG. 5B).

Estos experimentos muestran que reemplazar Triton X-100 por Brij C10 para el tratamiento S/D de líquidos que contienen fármacos biofarmacéuticos da como resultado una inactivación eficiente de virus con envoltura lipídica, incluso a concentraciones bajas del detergente.

Ejemplo 3: Inactivación de X-MuLV y BVDV usando Brij C10 en líquidos que comprenden albúmina sérica humana (Ejemplo de referencia)

La idoneidad de Brij C10 para el tratamiento S/D para inactivar los virus con envoltura lipídica, el virus de la leucemia murina xenotrópica (X-MuLV) y el virus de la diarrea viral bovina (BVDV) en líquidos que comprenden albúmina sérica humana (HSA) como proteína modelo para un fármaco biofarmacéutico y se comparó con Triton X-100. Para ello, se añadió virus a líquidos que contenían HSA. Los líquidos que contenían virus que comprendían HSA se incubaron luego con mezclas S/D que comprendían bajas concentraciones de Brij C10 durante varios períodos de tiempo, y se determinó la infectividad remanente de los virus. Se utilizó Brij C10 en concentraciones bajas para poder evaluar la cinética de inacción del virus, es decir, la eficiencia de la inactivación del virus (expresada por el RF) a lo largo del tiempo. Como será evidente para un experto en la técnica, en procesos de producción comerciales tales como la producción biofarmacéutica, se puede usar Brij C10 a concentraciones significativamente más altas, lo que acelerará la cinética de inactivación del virus y también puede aumentar el RF logrado.

Materiales

Líquido que comprende HSA

Se usó un líquido que contiene albúmina sérica humana (HSA) como modelo para un líquido que contiene un fármaco biofarmacéutico.

Virus

El virus de la leucemia murina xenotrópica (X-MuLV; familia Retroviridae; virus ssRNA con envoltura; 0 = 80 110 nm) se usó como modelo para partículas retrovirales endógenas y virus de ARN con envoltura. Además, se utilizó BVDV.

Cepa del virus Fuente Propagado en Valorado en

Línea celular Fuente Línea celular Fuente

X-MulV ATCC 1 VR-1447 M. dunni ATCC1 CRL-2017 PG4 ATCC 1 CRL-2032 pNFS Th-1

1ATCC: Colección americana de cultivos tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110 EE. UU.

Tabla 7: Reservas de virus utilizadas en los experimentos.

Mezcla de reactivos Brij C10

Los componentes S/D Polisorbato 80 (PS80, Crillet 4 HP, Tween 80) y tri-n-butil-fosfato (TnBP) se combinaron con el detergente respectivo (es decir, Triton X-100 o Brij C10) en la siguiente proporción (véase de la Tabla 8 a la Tabla 9):

Tabla 8: Cantidad de componentes para la mezcla de reactivos S/D con Triton X-100

Tabla 9: Cantidad de componentes para la mezcla de reactivos S/D con Brij C10

Métodos

Todas las etapas siguientes se llevaron a cabo en una cabina de bioseguridad de clase II. El material de partida se incubó con agitación a una temperatura de 1°C ± 1°C usando una vasija de doble pared conectada a un criostato para la incubación. Luego se filtró el líquido que contenía HSA a través de un filtro de jeringa de membrana de PVDF de 0,2 pm (un filtro de PVDF hidrófilo, Millipak 60 o equivalente). Después de la filtración, se midieron la temperatura y el volumen.

El líquido que contenía HSA filtrado se ajustó nuevamente con agitación a 1°C ± 1°C usando una vasija de doble pared conectada a un criostato. Este intervalo de temperatura se mantuvo con agitación hasta el final de la incubación del líquido que contenía HSA filtrado con los reactivos S/D y se registró continuamente. Al volumen determinado del líquido que contenía HSA filtrado, transferido a un matraz con tapa de rosca cuyo peso de tara se había determinado, se le incorporó virus a una razón de 1:31, p. ej., 48 ml de líquido que contenía HSA se enriquecieron con 1,6 ml de disolución madre de virus. El líquido que contenía HSA incorporado se incubó adicionalmente con agitación continua a 1°C ± 1°C. Entre 1 y 2 minutos después de la incorporación, se tomaron muestras para la valoración del virus (0,5 ml de control de incorporación, SC y 2 ml de control de retención, HC).

Después de la extracción, el control de retención (HC) se mantuvo a la misma temperatura, es decir, a 1°C ± 1°C, que el líquido que contenía HSA incorporado después de la adición de los reactivos S/D, es decir, se almacenó en el mismo círculo de enfriamiento que la vasija con el líquido que contenía HSA, hasta el final del tratamiento S/D. La temperatura del líquido de enfriamiento se determinó antes de la inserción de la muestra de control de retención y, nuevamente, poco antes de que se retirara el control de retención para su valoración después del tratamiento S/D.

El peso del líquido que contenía HSA incorporado se determinó para calcular la cantidad de mezcla de reactivo S/D que debía añadirse. El material pesado se reajustó, en caso necesario, con agitación a 1°C ± 1°C. La mezcla de reactivos S/D respectiva se añadió al líquido que contenía HSA para dar una concentración final de 0,08% a 0,1% (p/p) del detergente de éter de polioxietileno respectivo. La mezcla de reactivos S/D se añadió con agitación en 1 minuto usando una jeringa, y la cantidad real de mezcla de reactivos S/D añadida se determinó volviendo a pesar la jeringa. El líquido que contenía HSA incorporado se incubó adicionalmente con reactivos S/D con agitación continua a 1°C ± 1°C durante 59 ± 1 minutos. Durante la incubación, se tomaron muestras de 1 ml para la valoración del virus después de 1-2 min, 10 ± 1 min, 30 ± 1 min y 59 ± 1 min. Para evitar una mayor inactivación del virus por los reactivos S/D después de la extracción de muestras, las muestras se diluyeron inmediatamente 1:20 con medio de cultivo celular frío (de 2°C a 8°C) (es decir, 1 volumen de muestra más 19 volúmenes de medio de cultivo celular).

La valoración de las muestras y el cálculo de la capacidad de eliminación del virus se realizaron como se ha descrito para el Ejemplo 1 anterior.

Resultados

Cuando el tratamiento S/D de un líquido que contiene HSA se realizó a 1°C ± 1°C usando una mezcla de Brij C10, PS80 y TnBP, X-MuLV se inactivó mediante un factor de reducción de virus (RF) superior a 2 en 60 minutos (FIG. 6A). Se obtuvieron resultados similares en un experimento repetido (FIG. 6B).

En experimentos adicionales, cuando el tratamiento S/D de un líquido que contiene HSA se realizó a 1°C ± 1°C usando una mezcla de Brij C10, PS80 y TnBP, el BVDV se inactivó mediante un factor de reducción del virus (RF) de alrededor de 4 en 10 minutos (FIG. 7A). Se obtuvieron resultados similares en un experimento repetido (FIG. 7B).

Se realizaron experimentos adicionales exactamente como se describe en la sección de materiales y métodos de este ejemplo, solo que el tratamiento S/D del líquido que contiene HSA se realizó a 19°C ± 1°C en lugar de a 1°C ± 1°C. Cuando el tratamiento S/D de un líquido que contiene HSA se realizó a 19°C ± 1°C usando una mezcla de Brij C10, PS80 y TnBP (Brij C10), X-MuLV se inactivó mediante un factor de reducción de virus (RF) superior a 3 en 10 minutos (FIG. 8A). Se obtuvieron resultados similares en un experimento repetido (FIG. 8B).

Estos experimentos muestran que reemplazar Triton X-100 por Brij C10 para el tratamiento S/D de líquidos que contienen fármacos biofarmacéuticos da como resultado una inactivación eficiente de los virus con envoltura lipídica a temperatura ambiente o alrededor de ella y a temperaturas tan bajas como 1°C ± 1°C, incluso a bajas concentraciones de los detergentes.

Ejemplo 4: Síntesis de polietoxilato I de alcohol 4-terc-octilbencílico (Método 1)

Síntesis del intermedio III:

Se puso fenol II (170,3 g, 800 mmol) en un matraz de 2 litros de 3 bocas equipado con un termómetro interior y una barra agitadora. Se añadió CH<2>Ch anhidro (1000 ml) al matraz y se inició la agitación. Después de la disolución del material de partida, la disolución se enfrió a 0°C. Después de la disolución total, se añadió NEt<3>(225 ml, 1,6 mol) en 10 min. Se añadió una disolución de Tf<2>O (256 g, 907 mmol) en CH<2>Ch (180 ml) a 0°C a la mezcla de reacción durante 120 min y la reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Se añadió una disolución saturada de NaHCO<3>(400 ml) y se extrajo la mezcla de reacción. La fase orgánica se lavó repetidamente con agua (2 x 400 ml) y salmuera (500 ml). Después, la fase orgánica se concentró a vacío. Se añadió tolueno (300 ml) al residuo y el producto en bruto se concentró para producir 314 g de líquido negro en bruto. Este residuo se cargó sobre un lecho corto de SiO<2>y se eluyó con éter de petróleo/EtOAc (de 0 a 2%). La concentración de las fracciones puras produjo 269,5 g (rendimiento: 99,6%) de un aceite transparente e incoloro. Rf = 0,74 (éter de petróleo/EtOAc al 5%).

Síntesis del intermedio IV:

Se disolvió triflato III (269 g, 795 mmol) en DMF anhidro y desgasificado (1,3 l) y se añadieron secuencialmente Zn(CN<)2>(95,3 g, 795 mmol) y Pd(PPh<3)4>(25 g, 21,5 mmol). La mezcla de reacción se calentó a 80°C durante 3 horas seguido de la eliminación de la DMF a vacío. Se añadió tolueno (300 ml) al residuo y el producto en bruto se concentró para producir 432 g de residuo negro. Este producto en bruto se cargó sobre un lecho corto de SiO<2>y se eluyó con éter de petróleo/EtOAc (de 0 a 10%). La concentración de las fracciones puras produjo 128,1 g (rendimiento: 74,8%) de un aceite transparente e incoloro. Rf = 0,23 (éter de petróleo/EtOAc al 2%).

Síntesis del intermedio V:

Se disolvió nitrilo IV (127,6 g, 592,5 mmol) en MeOH (500 ml), se añadió NaOH acuoso 4 M (750 ml) y la mezcla se llevó a reflujo y se mantuvo a esta temperatura (80°C) durante la noche. Se añadió NaOH acuoso 10 M (150 ml) adicional a la mezcla caliente y la disolución se calentó más durante 20 horas. Después de enfriar a temperatura ambiente, el contenido de la vasija de reacción se transfirió a un vaso de precipitados grande y se enfrió en un baño de hielo. Se añadió HCl acuoso 4 M (1,1 l) en 30 minutos, en este punto el pH era ácido como lo indica el papel de pH y había precipitado un sólido blanco. El precipitado se filtró y se aclaró con agua (500 ml). La torta húmeda se transfirió a un matraz de 2 litros y se secó a vacío durante 3 días para producir 127,5 g (rendimiento: 91,9%) de un polvo blanco. Rf = 0,42 (éter de petróleo/EtOAc 2:1).

Síntesis del intermedio VI:

Se suspendió ácido carboxílico V (127 g, 542 mmol) en mTHF seco (1,2 l) y se enfrió a -10°C. Se añadió una disolución de LiAlH<4>en THF (1 M, 575 ml, 575 mmol) durante 60 min, después la reacción se calentó lentamente hasta temperatura ambiente y se agitó adicionalmente durante la noche. El contenido de la vasija de reacción se transfirió a un vaso de precipitados grande y el exceso de hidruro se enfrió cuidadosamente con hielo (15 g). Se añadió HCl acuoso 3 M (500 ml) en 20 minutos; en este punto el pH era ácido como lo indica el papel de pH. Se añadió EtOAc (300 ml) a la mezcla en bruto y las 2 fases se agitaron vigorosamente. La fase acuosa se volvió a extraer dos veces con EtOAc (300 ml y 500 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron sucesivamente con una disolución acuosa saturada de NaHCO3 (300 ml), agua (300 ml) y salmuera (500 ml). Después, la fase orgánica se concentró a vacío. Se añadió tolueno (300 ml) al residuo y el producto en bruto se concentró para producir 123,3 g de un aceite amarillento transparente. Este residuo se cargó sobre un lecho corto de SiO<2>y se eluyó con éter de petróleo/EtOAc (de 0 a 15%). La concentración de las fracciones puras produjo 85,3 g (rendimiento: 71,4%) de un sólido blanco amorfo. Rf = 0,37 (éter de petróleo/EtOAc 4:1).

Síntesis del intermedio VII:

Se disolvió alcohol bencílico VI (84,8 g, 385 mmol) en CH<2>Ch anhidro(1 l) y se enfrió en un baño de hielo/agua. Se añadió NEts (110 ml, 770 mmol) seguido de la adición lenta de una disolución de MsCI (45 ml, 577 mmol) en CH<2>Cl<2>anhidro (25 ml) durante 60 min. La reacción se calentó lentamente hasta temperatura ambiente y se agitó adicionalmente durante la noche. Se añadió una disolución acuosa saturada de NaHCO<3>(420 ml) y la mezcla de reacción se agitó vigorosamente. La fase orgánica se lavó repetidamente con agua (2 x 500 ml) y salmuera (300 ml). Después, la fase orgánica se concentró a vacío. Al residuo se le añadieron tolueno (200 ml) y CH<2>Cl<2>(100 ml) y el producto en bruto se concentró para producir 90 g (rendimiento: 78,4%) de un semisólido naranja. Rf = 0,71 (éter de petróleo/EtOAc 4:1).

Síntesis de I:

Se disolvió PEG400 (360 g, 900 mmol) en THF anhidro (1 l) y se añadió tBuOK (90 g, 802 mmol) a temperatura ambiente en porciones durante 15 min y la mezcla se agitó durante 60 min a temperatura ambiente y se enfrió en un baño de hielo. Mientras tanto, se suspendió el mesilato VII (89,5 g, 300 mmol) en THF (300 ml) y la disolución de color naranja lechoso se añadió a la disolución de PEG400 desprotonado enfriada durante 20 min. La reacción se calentó lentamente hasta temperatura ambiente y se agitó adicionalmente durante la noche. Se añadió hielo (500 g) así como HCl acuoso 1 M (820 ml). El THF se eliminó a vacío y se añadió EtOAc (1 l). Las fases se agitaron y la fase orgánica se lavó sucesivamente con agua (2 x 500 ml). La fase acuosa se volvió a extraer con EtOAc (300 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con agua (500 ml) y se concentraron a vacío. Se añadió tolueno (250 ml) al residuo y el producto en bruto se concentró para producir 125,2 g de un aceite amarillento transparente. Este residuo se cargó sobre un lecho corto de SiO<2>y se eluyó con CH<2>Ch/MeOH (de 0 a 8%). La concentración de las fracciones puras produjo 107,5 g (rendimiento: 59,5%) de un aceite transparente de color marrón claro. Rf = 0,37-0,22 (CH<2>C<h>/MeOH 20:1).<M s>(ESI): m/z =[M+H]+= 573.5, 617,5 (100%), 661,6; [M+Ac]- = 631,4, 675,4 (100%), 719,5. RMN 1H (600 MHz, CDCh): 5 = 7,33 (d,J= 8,3 Hz, 2H), 7,23 (d,J= 8,3 Hz, 2H), 4,52 (s, 2H), 3,72-3,58 (m, 33H), 2,54 (br s, 1H), 1,72 (s, 2H), 1,34 (s, 6H), 0,70 (s, 9H). RMN 13C (150 MHz, CDCh): 5 = 149,7, 135,1, 127,4 (2C), 126,2 (2C), 73,2, 72,6, 70,7 (m), 70.5, 69,4, 61,9, 57,0, 38,6, 32,5, 31,9 (3C), 31,6 (2C).

Ejemplo 5a: Síntesis de polietoxilato I de alcohol 4-terc-octilbencílico (Método 2)

Se enfriaron tolueno (35 ml, 328 mmol) y H<2>SO<4>concentrado (10 ml) a 0°C en un matraz de fondo redondo. Una mezcla de tolueno (27 ml, 256 mmol) y diisobutileno (como una mezcla 3:1 de 2,4,4-trimetil-1-penteno 2,4,4-trimetil-2-penteno, 10 ml, 64 mmol) se añadió lentamente a la mezcla de reacción durante 2 horas. La reacción se agitó adicionalmente a 0°C durante 2 horas. Se añadió agua (100 ml). Después de la separación de fases, la fase orgánica se lavó con una disolución acuosa saturada de NaHCO<3 ( 1 0 0>ml), se secó sobre MgSO<4>y se concentró para producir 14 g de un aceite incoloro transparente. El aceite se puso en un matraz de fondo redondo de 100 ml y se destiló en un aparato de destilación de recorrido corto (1-10<-1>mbar). Se recogió la fracción (8,1 g, rendimiento 61,9%) que destiló entre 62 y 70°C. Rf = 0,65 (éter de petróleo 40-60<1 0 0>%).

Se disolvió tolueno X p-sustituido (500 mg, 2,45 mmol) en acetonitrilo (ACN) (5 ml). Se añadió N-bromosuccinimida (NBS) (460 mg, 2,57 mmol) y después de la disolución, el matraz de fondo redondo Duran de 25 ml se puso a 15 cm de distancia de la lámpara halógena (300 W). Después de 60 minutos de irradiación (temperatura de reacción = 45°C), se eliminó el disolvente. Se añadió éter de petróleo 40-60 (25 ml) y precipitó un sólido. La fase líquida se lavó con agua (2 x 20 ml), se secó sobre MgSO<4>y se concentró para producir 540 mg (rendimiento: 77,9%) de un aceite en bruto amarillento. Rf = 0,43 (éter de petróleo 40-60 100%).

Se disolvió PEG400 (2,25 g, 5,61 mmol) en THF anhidro (5 ml) a temperatura ambiente. Se añadió en porciones tBuOK (420 mg, 3,74 mmol) durante 1 min y la mezcla se agitó durante 90 min y después se enfrió a 0°C en un baño de hielo/agua. Mientras tanto, el intermedio XI de bromuro de bencilo (530 mg, 1,87 mmol) se suspendió en THF (2 ml) y la disolución se añadió a la disolución de PEG400 desprotonado enfriada. La reacción se calentó lentamente hasta temperatura ambiente y se agitó adicionalmente durante la noche. Se añadió HCl (1 M, 20 ml) a la mezcla de reacción así como EtOAc (50 ml) y agua (20 ml). La disolución se transfirió a un embudo de decantación y se extrajo vigorosamente. Después de la separación de fases, la fase orgánica se lavó sucesivamente con agua (5 x 15 ml) y finalmente se secó sobre MgSO<4>para producir 0,8 g de residuo oleoso en bruto. Este residuo se cargó encima de una columna de SiO<2>y se eluyó con CH<2>Ch/MeOH (de 0 a<8>%). La concentración de las fracciones puras produjo 588 mg (rendimiento: 52,2%) de un aceite amarillento claro. Rf = 0,37-0,22 (CH<2>Ch/MeOH 20:1).

Ejemplo 5b: Síntesis de polietoxilato I de alcohol 4-terc-octilbencílico (variantes del método 2)

Etapa 1:

Esta etapa se llevó a cabo de la siguiente manera:

se enfriaron tolueno (750 ml, 7,04 mol) y H<2>SO<4>concentrado (20 ml, 0,375 mol) a 0°C en un matraz de fondo redondo. Se añadió lentamente a la mezcla de reacción durante 90 min una mezcla de tolueno (250 ml, 2,35 mol) y diisobutileno (como una mezcla 3:1 de 2,4,4-trimetil-1-penteno 2,4,4-trimetil-2-penteno, 200 ml, 1,28 mol). La reacción se agitó adicionalmente a 0°C y se calentó a temperatura ambiente durante la noche. Se añadió hielo (400 g) y la mezcla se transfirió a un embudo de decantación. Después de la separación de fases, la fase orgánica se lavó sucesivamente con una disolución acuosa saturada de NaHCO<3>(300 ml) y agua (2 x 250 ml). La fase orgánica se concentró para producir 199,1 g de un aceite transparente e incoloro. El aceite se puso en un matraz de fondo redondo de 500 ml y se destiló en un aparato de destilación de recorrido corto (20 mbar). Se recogieron las fracciones que destilaron entre 138°C y 161°C (134,1 g, Rendimiento 51,4%). Rf = 0,65 (éter de petróleo 40-60 100%). RMN 1H (600 MHz, CDCh): 5 = 7,28 (d,J= 8,2 Hz, 2H), 7,10 (d,J= 8,2 Hz, 2H), 2,34 (s, 3H), 1,75 (s, 2H), 1,38 (s,<6>H), 0,75 (s, 9H). RMN 13C (150 MHz, CDCla): 5 = 147,3, 134,7, 128,6 (2C), 126,1 (2C), 57,1, 38,4, 32,5, 31,9 (3C), 31,7 (2C), 21,0.

Alternativamente, esta etapa se llevó a cabo de la siguiente manera:

se agitaron tolueno (400 ml, 3,83 mol) y ácido nonafluoro-1-butanosulfónico (4 ml, 24 mmol) a temperatura ambiente en un matraz de fondo redondo. Se añadió lentamente a la mezcla de reacción durante 60 min una mezcla de tolueno (200 ml, 1,92 mol) y diisobutileno (como una mezcla 3:1 de 2,4,4-trimetil-1-penteno 2,4,4-trimetil-2-penteno, 100 ml, 0,64 mol). La reacción se agitó adicionalmente a temperatura ambiente durante la noche. Se añadió una disolución acuosa saturada de NaHCO<3>(200 ml) y la mezcla se agitó durante 20 min. La mezcla se transfirió a un embudo de decantación y se descartó la fase acuosa. La fase orgánica se lavó sucesivamente con agua (3 x 300 ml). La fase orgánica se concentró para producir 132,5 g de un aceite transparente e incoloro. El aceite se puso en un matraz de fondo redondo de 500 ml y se destiló en un aparato de destilación de recorrido corto (26-16 mbar). Se recogieron las fracciones que destilaron entre 115°C y 135°C (80,5 g, Rendimiento 62%). Rf = 0,65 (éter de petróleo 40-60 100%). RMN 1H (600 MHz, CDCh): 5 = 7,28 (d,J= 8,2 Hz, 2H), 7,10 (d,J= 8,2 Hz, 2H), 2,34 (s, 3H), 1,75 (s, 2H), 1,38 (s,<6>H), 0,75 (s, 9H). RMN 13C (150 MHz, CDCh): 5 = 147,3, 134,7, 128,6 (2C), 126,1 (2C), 57,1, 38,4, 32,5, 31,9 (3C), 31,7 (2C), 21,0.

Etapa 2:

Esta etapa se llevó a cabo de la siguiente manera:

se disolvió tolueno X p-sustituido (63,6 g, 311 mmol) en acetonitrilo (ACN) (650 ml). Se añadió N-bromosuccinimida (NBS) (58,2 g, 327 mmol) y después de la disolución, el matraz de fondo redondo Duran de 2 l se puso a 5-25 cm de distancia de la lámpara halógena (300 W) mientras se agitaba (350 rpm). Después de<6>horas de irradiación (temperatura de reacción = hasta 46°C), el disolvente se eliminó a vacío. Se añadió éter de petróleo 40-60 (450 ml) y precipitó un sólido oscuro. La fase líquida se concentró para producir un residuo marrón oscuro (75 g). Este residuo se cargó en la parte superior de un lecho corto de SO<2>y se eluyó con éter de petróleo 40-60 (100%). La concentración de las fracciones puras produjo 43,8 g (rendimiento: 49,7%) de un aceite transparente de color naranja. Rf = 0,43 (éter de petróleo 40-60100%). RMN 1H (600 MHz, CDCh): 5 = 7,34 (d,J= 8,4 Hz, 2H), 7,30 (d,J= 8,4 Hz, 2H), 4,50 (s, 2H), 1,74 (s, 2H), 1,36 (s,<6>H), 0,72 (s, 9H). RMN 13C (150 MHz, CDCh): 5 = 150,9, 134,8, 128,6 (2C), 126,7 (2C), 57,0, 38,7, 33,9, 32,5, 31,9 (3C), 31,6 (2C).

Alternativamente, esta etapa se llevó a cabo de la siguiente manera:

se disolvió tolueno X p-sustituido (85,2 g, 417 mmol) en trifluorotolueno (830 ml). Otros disolventes tales como ésteres o alcanos (EtOAc y hexano) también son eficaces. Se añadió N-bromosuccinimida (NBS) (74,2 g, 417 mmol) así como AIBN (azobis(isobutironitrilo) (3,4 g, 21 mmol) mientras se agitaba (450 rpm). La mezcla se calentó a 80°C durante 5 horas. El disolvente se extrajo a vacío. Se añadió éter de petróleo 40-60 (350 ml) y precipitó un sólido blanco. La fase líquida se concentró para producir un residuo naranja transparente (108 g). Este residuo se cargó en la parte superior de un lecho corto de SiO<2>y se eluyó con éter de petróleo 40-60 (100%). La concentración de las fracciones puras produjo 64,1 g (rendimiento: 54,3%) de un aceite transparente casi incoloro que cristalizó para formar agujas incoloras, lo que indica una alta pureza del producto. Rf = 0,43 (éter de petróleo 40-60 100%). RMN 1H (600 MHz, CDCh): 5 = 7,34 (d,J= 8,4 Hz, 2H), 7,30 (d,J= 8,4 Hz, 2H), 4,50 (s, 2H), 1,74 (s, 2H), 1,36 (s, 6H), 0,72 (s, 9H). RMN 13C (150 MHz, CDCla): 5 = 150,9, 134,8, 128,6 (2C), 126,7 (2C), 57,0, 38,7, 33,9, 32,5, 31,9 (3C), 31,6 (2C). Se espera que el uso de AIBN (azobis(isobutironitrilo) como iniciador de radicales contribuya a la alta pureza del producto que se obtiene en esta etapa de reacción.

Etapa 3:

Esta etapa se llevó a cabo de la siguiente manera:

PEG400 (184,1 g, 460 mmol) se disolvió en THF anhidro (550 ml) a temperatura ambiente. Se añadió tBuOK (27,2 g, 245 mmol) en porciones durante 15 min y la mezcla se agitó durante 90 min. Mientras tanto, el intermedio de bromuro de bencilo XI (43,5 g, 153 mmol) se suspendió en THF (300 ml) y la disolución se añadió a la disolución de PEG400 desprotonada enfriada. La reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Se añadió HCl (1 M, 270 ml) a la mezcla de reacción. Se eliminaron los volátiles y se añadió EtOAc (600 ml). La disolución se transfirió a un embudo de decantación y se extrajo vigorosamente. Después de la separación de fases, la fase acuosa se extrajo adicionalmente con EtOAc (300 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron sucesivamente con agua/salmuera (1:1, 3 x 300 ml) y finalmente se concentraron para producir 90,4 g de residuo oleoso en bruto de color naranja. Este residuo se cargó encima de una columna de SiO<2>y se eluyó con CH<2>Ch/MeOH (de 0 a 8%). La concentración de las fracciones puras produjo 82,2 g (rendimiento: 89,0%) de un aceite marrón claro transparente. Rf = 0,37-0,22 (CH<2>Ch/MeOH 20:1).<M s>(ESI): m/z =[M+H]+= 573,5, 617,5 (100%), 661,6; [M+Ac]- = 631,4, 675,4 (100%), 719,5. RMN 1H (600 MHz, CDCta): 5 = 7,33 (d,J= 8,3 Hz, 2H), 7,23 (d,J= 8,3 Hz, 2H), 4,52 (s, 2H), 3,72-3,58 (m, 33H), 2,54 (br s, 1H), 1,72 (s, 2H), 1,34 (s, 6H), 0,70 (s, 9H). RMN 13C (150 MHz, CDCta): 5 = 149,7, 135,1, 127,4 (2C), 126,2 (2C), 73,2, 72,6, 70,7 (m), 70,5, 69,4, 61,9, 57,0, 38,6, 32,5, 31,9 (3C), 31,6 (2C).

Alternativamente, esta etapa se llevó a cabo de la siguiente manera:

PEG400 (475 g, 1,19 mol) se disolvió en TBME (metil-terc-butiléter) (1,0 l) a temperatura ambiente. Se añadió tBuOK (43,2 g, 385 mmol) en porciones durante 20 min y la mezcla se agitó durante 90 min. Mientras tanto, el intermedio de bromuro de bencilo XI (84 g, 297 mmol) se suspendió en TBME (250 ml) y la disolución se añadió a la disolución de PEG400 desprotonada a temperatura ambiente. La reacción se agitó durante 3 horas a temperatura ambiente. Se añadieron hielo (200 g) y HCl (1 M, 400 ml) a la mezcla de reacción. La disolución se transfirió a un embudo de decantación y se añadieron EtOAc (1 l) y agua (500 ml) y se extrajo vigorosamente. Después de la separación de fases, la fase orgánica se lavó sucesivamente con agua/salmuera (1:1, 3 x 500 ml) y finalmente se concentró para producir 165 g de residuo aceitoso en bruto de color naranja. Este residuo se cargó encima de una columna de SiO<2>y se eluyó con CH<2>Ch/MeOH (de 0 a 10%). La concentración de las fracciones puras produjo 151,7 g (rendimiento: 84,9%) de un aceite marrón claro transparente. Rf = 0,37-0,22 (CH<2>Cl<2>/MeOH 20:1). MS (ESI): m/z =[M+H]+= 573,5, 617,5 (100%), 661,6; [M+Ac]- = 631,4, 675,4 (100%), 719,5. RMN 1H (600 MHz, CDCta): 5 = 7,33 (d,J= 8,3 Hz, 2H), 7,23 (d,J= 8,3 Hz, 2H), 4,52 (s, 2H), 3,72-3,58 (m, 33H), 2,54 (br s, 1H), 1,72 (s, 2H), 1,34 (s, 6H), 0,70 (s, 9H). RMN 13C (150 MHz, CDCta): 5 = 149,7, 135,1, 127,4 (2C), 126,2 (2C), 73,2, 72,6, 70,7 (m), 70,5, 69,4, 61,9, 57,0, 38,6, 32,5, 31,9 (3C), 31,6 (2C). Se espera que el uso de TBME (metil-terc-butiléter) como disolvente, el tiempo de reacción moderado de 3 horas (que se espera que minimice los productos secundarios de la reacción), la mayor escala de fabricación y la pureza del material de partida (es decir, el intermedio de bromuro de bencilo XI) contribuyan al alto rendimiento observado en esta etapa de reacción.

Ejemplo 6: Inactivación de PRV utilizando polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico en líquidos que comprenden inmunoglobulina intravenosa

Materiales y métodos

Los experimentos se realizaron como se ha descrito en el Ejemplo 1. Sin embargo, para el tratamiento S/D se probó una mezcla S/D que comprendía el polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico producido en el Ejemplo 5a y se comparó con una mezcla S/D que comprendía Tritón X-100. La composición de la mezcla S/D que comprendía Triton X-100 se preparó como se ha descrito en el Ejemplo 1 anterior. La composición de la mezcla S/D que comprendía polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico se preparó de la siguiente manera.

Los componentes S/D polisorbato 80 (PS80, Crillet 4 HP, Tween 80) y tri-n-butil-fosfato (TnBP) se combinaron con el detergente polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico producido en el Ejemplo 5a en las siguientes proporciones (véase la Tabla 10):

Tabla 10: Cantidad de componentes para la mezcla de reactivos S/D de polietoxilato de alcohol 4-tercoctilbencílico (abreviado como "4-TOBAPE")

Sólo se probó la inactivación del virus PRV.

Resultados

Cuando se realizó un tratamiento S/D de un líquido que contenía IVIG utilizando una mezcla de polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico, PS80 y TnBP, el PRV se inactivó mediante un factor de reducción de virus (RF) de alrededor de 4 en 1-2 minutos (FIG. 9A). Se obtuvieron resultados similares en un experimento repetido (FIG. 9B).

Estos experimentos muestran que reemplazar Triton X-100 por polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico para el tratamiento S/D de líquidos que contienen fármacos biofarmacéuticos da como resultado una inactivación eficiente de virus con envoltura lipídica, incluso a concentraciones bajas del detergente.

Ejemplo 7: Inactivación de X-MuLV utilizando polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico en líquidos que comprenden albúmina sérica humana

Materiales y métodos

Los experimentos se realizaron como se ha descrito en el Ejemplo 3 anterior. Sin embargo, para el tratamiento S/D se probó una mezcla S/D que comprendía polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico y se comparó con una mezcla S/D que comprendía Triton X-100. La composición de la mezcla S/D que comprendía Triton X-100 se preparó como se ha descrito en el Ejemplo 3 anterior. La composición de la mezcla S/D que comprendía polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico se preparó de la siguiente manera.

Los componentes S/D polisorbato 80 (PS80, Crillet 4 HP, Tween 80) y tri-n-butil-fosfato (TnBP) se combinaron con el detergente polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico en las siguientes proporciones (véase la Tabla 11):

Tabla 11: Cantidad de componentes para la mezcla de reactivos S/D con polietoxilato de alcohol 4-tercoctilbencílico (abreviado como "4-TOBAPE")

La mezcla de reactivos S/D respectiva se añadió al líquido que contenía HSA para dar una concentración final de 0,1% del detergente de éter de polioxietileno respectivo.

Sólo se probó la inactivación del virus X-MuLV.

Resultados

Cuando se realizó un tratamiento S/D de un líquido que contenía HSA a 1°C ± 1°C utilizando una mezcla de polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico, PS80 y TnBP, X-MuLV se inactivó mediante un factor de reducción de virus (RF) superior a 2 en 10 minutos (FIG. 10A). Se obtuvieron resultados similares en un experimento repetido (FIG. 10B).

Se realizaron experimentos adicionales exactamente como se describe en la sección de materiales y métodos de este ejemplo, solo que el tratamiento S/D del líquido que contiene HSA se realizó a 19°C ± 1°C en lugar de a 1°C ± 1°C. Cuando se realizó un tratamiento S/D de un líquido que contenía HSA a 19°C ± 1°C utilizando una mezcla de polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico, PS80 y TnBP, X-MuLV se inactivó mediante un factor de reducción del virus (RF) superior a 2 en 10 minutos (FIG. 11A), y mediante un RF de alrededor de 4 en 30 minutos. Se obtuvieron resultados similares en un experimento repetido (FIG. 11B).

Estos experimentos muestran que reemplazar Triton X-100 por polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico para el tratamiento S/D de líquidos que contienen fármacos biofarmacéuticos da como resultado una inactivación eficiente de los virus con envoltura lipídica a temperatura ambiente o alrededor de ella y a temperaturas tan bajas como 1°C ± 1°C, incluso a bajas concentraciones de los detergentes.

Ejemplo 8: Inactivación de BVDV utilizando polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico. Triton X-100 reducido o Brii C10 en un tampón que contiene HSA

Se probó la idoneidad del polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico, Triton X-100 reducido o Brij C10 para el tratamiento con un único detergente para inactivar el virus de la diarrea viral bovina (BVDV) con envoltura lipídica en un tampón que contiene albúmina sérica humana (HSA) como proteína modelo para un anticuerpo terapéutico y se comparó con Triton X-100. Para este fin, se añadieron bajas concentraciones del detergente respectivo a un tampón que contenía HSA y luego la mezcla se enriqueció con el virus. Después de la incubación durante varios períodos de tiempo, se determinó la infectividad remanente del virus. Se utilizaron los detergentes respectivos en concentraciones bajas para poder evaluar la cinética de inacción del virus, es decir, la eficiencia de la inactivación del virus (expresada por el RF) a lo largo del tiempo. Como será evidente para un experto en la técnica, en procesos de producción comerciales tales como la producción biofarmacéutica, los detergentes se pueden usar a concentraciones significativamente más altas, lo que acelerará la cinética de inactivación del virus y también puede aumentar el RF logrado.

Materiales

Tampón que contiene HSA

Se utilizó un tampón que contenía albúmina sérica humana (HSA) como modelo para un anticuerpo terapéutico.

Virus

Tabla 12: Reservas de virus utilizadas en los experimentos.

Cepa del virus Fuente Propagado en Valorado en

Línea celular Fuente Línea celular Fuente

BVDV ATCC 1 VR-1422 MDBK ATCC 1 CRL-22 BT ATCC 1 CRL-1390 Nadl________________________________________ _____________

Las reservas de virus se caracterizaron antes de su uso. Esta caracterización incluyó la determinación de la valoración del virus mediante al menos diez valoraciones independientes y la especificación de un intervalo de valoraciones de virus de aceptación para su uso como control positivo, la determinación del contenido de proteína de las reservas de virus, pruebas de PCR para la identidad del virus y la contaminación con otros virus y micoplasmas y pruebas de agregación de virus con filtros que no permiten el paso de grandes agregados de virus. Sólo se utilizaron cepas de virus que pasaron las pruebas de identidad/contaminación por PCR sin agregación significativa (es decir, la diferencia en las valoraciones de infectividad entre la cepa de virus y la c e p a f i l t r a d a f u e m e n o r q u e 1 , 0 l o g ) .

D e t e r g e n t e s

5 A n t e s d e u s a r e l d e t e r g e n t e r e s p e c t i v o , o u n a d i l u c i ó n 1 : 1 0 d e l m i s m o ( e s d e c i r , 1 g ± 2 % d e l d e t e r g e n t e r e s p e c t i v o m á s 9 g ± 2 % d e a g u a d e s t i l a d a ) , s e a g i t ó d u r a n t e a l m e n o s 1 5 m i n u t o s p a r a a s e g u r a r l a h o m o g e n e i d a d .

M é t o d o s

1 0

L a c a p a c i d a d d e i n a c t i v a c i ó n d e l v i r u s y l a r o b u s t e z d e l t r a t a m i e n t o S / D s e e v a l u a r o n e n c o n d i c i o n e s d e s f a v o r a b l e s p a r a l a i n a c t i v a c i ó n d e l v i r u s , e s d e c i r , c o n t i e m p o s d e i n c u b a c i ó n c o r t o s y a t e m p e r a t u r a s r e l a t i v a m e n t e b a j a s . C o m o s e r á e v i d e n t e p a r a u n e x p e r t o e n l a t é c n i c a , e n p r o c e s o s d e p r o d u c c i ó n c o m e r c i a l e s t a l e s c o m o l a p r o d u c c i ó n b i o f a r m a c é u t i c a , s e p u e d e n u s a r t i e m p o s d e i n c u b a c i ó n m á s l a r g o s y t e m p e r a t u r a s 1 5 m á s a l t a s , l o q u e a c e l e r a r á l a c i n é t i c a d e i n a c t i v a c i ó n d e l v i r u s y t a m b i é n p u e d e a u m e n t a r e l L R V l o g r a d o .

A d e m á s , c o m o y a s e h a m e n c i o n a d o a n t e r i o r m e n t e , s e u s a r o n c o n c e n t r a c i o n e s b a j a s d e l o s d e t e r g e n t e s r e s p e c t i v o s . C o m o s e r á e v i d e n t e p a r a u n e x p e r t o e n l a t é c n i c a , e n p r o c e s o s d e p r o d u c c i ó n c o m e r c i a l e s t a l e s c o m o l a p r o d u c c i ó n b i o f a r m a c é u t i c a , s e p u e d e n u s a r c o n c e n t r a c i o n e s m á s a l t a s d e l o s d e t e r g e n t e s r e s p e c t i v o s , l o q u e a c e l e r a r á l a c i n é t i c a d e i n a c t i v a c i ó n d e l v i r u s y t a m b i é n p u e d e a u m e n t a r e l L R V l o g r a d o .

2 0

D a d o q u e l a c o n c e n t r a c i ó n d e p r o t e í n a n o t i e n e u n i m p a c t o s i g n i f i c a t i v o s o b r e l a i n a c t i v a c i ó n d e l v i r u s ( v é a s e t a m b i é n D i c h t e l m ü l l e r e t a l . , 2 0 0 9 ) , n o s e i n v e s t i g ó l a s o l i d e z c o n r e s p e c t o a l c o n t e n i d o d e p r o t e í n a .

E l t a m p ó n q u e c o n t e n í a H S A s e t r a n s f i r i ó a u n m a t r a z c o n t a p a d e r o s c a c u y o p e s o d e t a r a s e h a b í a d e t e r m i n a d o . S e d e t e r m i n ó e l p e s o d e l t a m p ó n q u e c o n t e n í a<h>S<a>( e n e l m a t r a z c e r r a d o ) p a r a c a l c u l a r l a 3 0 c a n t i d a d d e d e t e r g e n t e ú n i c o q u e s e d e b í a a ñ a d i r . S e a ñ a d i ó l a c a n t i d a d n e c e s a r i a d e d e t e r g e n t e ( [ m g ] ) , o l a c a n t i d a d r e s p e c t i v a d e u n a d i l u c i ó n 1 : 1 0 d e l m i s m o , p o r g d e t a m p ó n q u e c o n t e n í a H S A p a r a p r o d u c i r l a s s i g u i e n t e s c o n c e n t r a c i o n e s f i n a l e s d e l d e t e r g e n t e r e s p e c t i v o : 0 , 1 % ± 0 , 0 1 % ( p / p ) o 0 , 0 3 % ± 0 , 0 1 % ( p / p ) . E l d e t e r g e n t e s e a ñ a d i ó c o n a g i t a c i ó n d u r a n t e 1 m i n u t o u s a n d o u n a j e r i n g a , y l a c a n t i d a d r e a l a ñ a d i d a s e d e t e r m i n ó v o l v i e n d o a p e s a r l a j e r i n g a . E l t a m p ó n q u e c o n t e n í a H S A s e a g i t ó a d i c i o n a l m e n t e d e s p u é s d e 3 5 c o m p l e t a r l a a d i c i ó n d e l d e t e r g e n t e d u r a n t e a l m e n o s 1 0 m i n u t o s . E l t a m p ó n q u e c o n t e n í a H S A m e z c l a d o c o n e l d e t e r g e n t e s e f i l t r ó a t r a v é s d e u n f i l t r o d e m e m b r a n a d e s ú p e r j e r i n g a d e 0 , 2 p m ( o e q u i v a l e n t e ) y e l f i l t r a d o s e r e c o g i ó a u n a t e m p e r a t u r a d i a n a d e 1 4 ° C ± 1 ° C u t i l i z a n d o u n a v a s i j a d e d o b l e p a r e d c o n e c t a d a a u n c r i o s t a t o . L a v a s i j a s e e n f r i ó p a r a e l f i l t r a d o . E n c a s o d e o b s t r u c c i ó n d e l f i l t r o , s e u t i l i z a r o n f i l t r o s n u e v o s p a r a c o n t i n u a r l a f i l t r a c i ó n d e l t a m p ó n q u e c o n t e n í a H S A . D e s p u é s d e l a f i l t r a c i ó n , s e m i d i e r o n l a t e m p e r a t u r a ( d i a n a : 4 0 1 4 ° C ± 1 ° C ) y e l v o l u m e n .

E l t a m p ó n f i l t r a d o q u e c o n t e n í a H S A c o n e l d e t e r g e n t e r e s p e c t i v o s e a j u s t ó c o n a g i t a c i ó n a 1 4 ° C ± 1 ° C u s a n d o u n a v a s i j a d e d o b l e p a r e d c o n e c t a d a a u n c r i o s t a t o . E s t e i n t e r v a l o d e t e m p e r a t u r a s e m a n t u v o c o n a g i t a c i ó n h a s t a e l f i n a l d e l a i n c u b a c i ó n d e l t a m p ó n q u e c o n t e n í a H S A c o n e l d e t e r g e n t e y s e r e g i s t r ó c o n t i n u a m e n t e . E l 4 5 v o l u m e n d e t e r m i n a d o d e l t a m p ó n q u e c o n t e n í a H S A c o n d e t e r g e n t e s e i n c o r p o r ó a u n a r a z ó n d e 1 : 3 1 , p . e j . , 4 8 m l d e t a m p ó n q u e c o n t e n í a h S a s e e n r i q u e c i e r o n c o n 1 , 6 m l d e d i s o l u c i ó n m a d r e d e v i r u s . E l t a m p ó n e n r i q u e c i d o q u e c o n t e n í a H S A s e i n c u b ó a d i c i o n a l m e n t e c o n a g i t a c i ó n c o n t i n u a a 1 4 ° C ± 1 ° C d u r a n t e 5 9 ± 1 m i n u t o s . D u r a n t e l a i n c u b a c i ó n , s e t o m a r o n m u e s t r a s p a r a l a v a l o r a c i ó n d e l v i r u s a l o s 1 - 2 m i n , 5 ± 1 m i n , 2 9 ± 1 m i n y 5 9 ± 1 m i n . P a r a e v i t a r u n a m a y o r i n a c t i v a c i ó n d e l v i r u s p o r e l d e t e r g e n t e d e s p u é s d e l a e x t r a c c i ó n 5 0 d e l a m u e s t r a , l a s m u e s t r a s s e d i l u y e r o n i n m e d i a t a m e n t e 1 : 2 0 c o n m e d i o d e c u l t i v o c e l u l a r f r í o ( d e 2 ° C a 8 ° C ) ( e s d e c i r , 1 v o l u m e n d e m u e s t r a m á s 1 9 v o l ú m e n e s d e m e d i o d e c u l t i v o c e l u l a r ) .

L o s c o n t r o l e s d e i n c o r p o r a c i ó n y r e t e n c i ó n s e r e a l i z a r o n e l m i s m o d í a : e l t a m p ó n q u e c o n t e n í a H S A s e f i l t r ó c o m o s e h a d e s c r i t o a n t e r i o r m e n t e , p e r o s i n l a a d i c i ó n p r e v i a d e d e t e r g e n t e . L u e g o , e l f i l t r a d o s e a j u s t ó a 1 4 ° C 5 5 ± 1 ° C c o n a g i t a c i ó n c o m o s e h a d e s c r i t o a n t e r i o r m e n t e . E l t a m p ó n q u e c o n t e n í a H S A s e i n c o r p o r ó a u n a r a z ó n d e 1 : 3 1 y s e i n c u b ó a d i c i o n a l m e n t e a 1 4 ° C ± 1 ° C d u r a n t e 5 9 ± 1 m i n u t o s c o m o s e h a d e s c r i t o a n t e r i o r m e n t e . E n t r e 1 y 2 m i n u t o s d e s p u é s d e l a i n c o r p o r a c i ó n , s e t o m ó u n a m u e s t r a p a r a l a v a l o r a c i ó n d e l v i r u s ( c o n t r o l d e i n c o r p o r a c i ó n ) . D e s p u é s d e l a i n c u b a c i ó n d u r a n t e 5 9 ± 1 m i n u t o s , s e t o m ó u n a m u e s t r a p a r a l a v a l o r a c i ó n d e l v i r u s ( e s d e c i r , l a m u e s t r a d e c o n t r o l d e r e t e n c i ó n ) ( H C ) .

6 0

L a v a l o r a c i ó n d e l a s m u e s t r a s y e l c á l c u l o d e l a c a p a c i d a d d e e l i m i n a c i ó n d e l v i r u s s e r e a l i z a r o n c o m o s e h a d e s c r i t o p a r a e l E j e m p l o 1 a n t e r i o r .

R e s u l t a d o s

6 5

C u a n d o e l t r a t a m i e n t o c o n u n ú n i c o d e t e r g e n t e d e u n t a m p ó n q u e c o n t i e n e H S A s e r e a l i z ó a 1 4 ° C ± 1 ° C u s a n d o Tritón X-100 al 0,1% ± 0,01%, Brij C10, polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico o Tritón X-100 reducido, el BVDV fue inactivado por un factor de reducción de virus (RF) de alrededor de 5 en 5 minutos (FIG. 12A). Cuando el tratamiento con un único detergente de un tampón que contenía HSA se realizó a 14°C ± 1°C usando Triton X-100 al 0,03% ± 0,01%, polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico o Triton X-100 reducido, el BVDV fue inactivado por un factor de reducción de virus (RF) superior a 3 en 5 minutos y superior a 4 en 29 minutos. (FIG. 12B).

Estos experimentos indican que el tratamiento con un único detergente de líquidos que contienen fármacos biofarmacéuticos usando Triton X-100, Brij C10, polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico o Triton X-100 reducido da como resultado una inactivación eficiente de virus con envoltura lipídica, incluso con bajas concentraciones de detergentes.

Ejemplo 9: Inactivación de BVDV usando polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico o Triton X-100 reducido en líquido que contiene IVIG

La idoneidad del polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico o Triton X-100 reducido para el tratamiento con un único detergente para inactivar el virus de la diarrea viral bovina (BVDV) con envoltura lipídica en líquidos que comprenden inmunoglobulina intravenosa (IVIG) se probó y comparó con Triton X-100. Para ello, se añadió virus a líquidos que contenían IVIG. Los líquidos que contenían virus que comprendían IVIG se incubaron luego con bajas concentraciones de Triton X-100 reducido, polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico o Triton X-100 durante varios períodos de tiempo, y se determinó la infectividad remanente de los virus. Se usaron Triton X-100 reducido, polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico y Triton X-100 en concentraciones bajas para evaluar la cinética de inactivación del virus, es decir, la eficiencia de la inactivación del virus (expresada por el RF) a lo largo del tiempo. Como será evidente para un experto en la técnica, en procesos de producción comerciales tales como la producción biofarmacéutica, los detergentes que incluyen Triton X-100 reducido o polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico se pueden usar en concentraciones significativamente más altas, lo que acelerará la cinética de inactivación del virus y también se espera que aumente el LRV logrado.

Materiales

Líquido que comprende IVIG

Virus

Tabla 13: Reservas de virus utilizadas en los experimentos.

Cepa del virus Fuente Propagado en Valorado en

Línea celular Fuente Línea celular Fuente

BVDV ATCC 1 VR-1422 MDBK ATCC 1 CRL-22 BT ATCC 1 CRL-1390 Nadl__________ _____________ _____________

Detergentes

Antes de usar el detergente respectivo, o una dilución 1:10 del mismo (es decir, 1 g ± 2% del detergente respectivo más 9 g ± 2% de agua destilada), se agitó durante al menos 15 minutos para asegurar la homogeneidad.

Métodos

La capacidad de inactivación del virus y la robustez del tratamiento S/D se evaluaron en condiciones desfavorables para la inactivación del virus, es decir, con tiempos de incubación cortos y a temperaturas relativamente bajas. Como será evidente para un experto en la técnica, en procesos de producción comerciales tales como la producción biofarmacéutica, se pueden usar tiempos de incubación más largos y temperaturas más altas, lo que acelerará la cinética de inactivación del virus y también puede aumentar el LRV logrado. Además, como ya se ha mencionado anteriormente, se usaron concentraciones bajas de los detergentes respectivos. Como será evidente para un experto en la técnica, en procesos de producción comerciales tales como la producción biofarmacéutica, se pueden usar concentraciones más altas de los detergentes respectivos, lo que acelerará la cinética de inactivación del virus y también puede aumentar el LRV logrado.

Dado que la concentración de proteína no tiene un impacto significativo sobre la inactivación del virus (véase también Dichtelmüller et al., 2009), no se investigó la solidez con respecto al contenido de proteína.

Se descongeló el líquido que contenía IVIG y todas las etapas posteriores se llevaron a cabo en una cabina de bioseguridad de clase II. El líquido que contenía IVIG se incubó con agitación a una temperatura de 17°C ± 1°C usando una vasija de doble pared conectada a un criostato para la incubación. Luego, el líquido que contenía IVIG se filtró a través de un filtro de profundidad de 0,2 pm con un área de filtrado efectiva de 25 cm2 (Cuno VR06 o equivalente) conectado a un portafiltro de acero inoxidable Sartorius (SM16249) usando nitrógeno presurizado a una presión diana de 0,9 bar (límite: 0,5 bar-1,5 bar). Para el acondicionamiento, el material del filtro se revistió previamente con 55 l/m2 de la suspensión Hyflo Supercel (5,0 g ± 0,05 g de Hyflo Supercel por litro; conductividad ajustada a 3,5 mS/cm (intervalo especificado: 2,5-6,0 mS/cm) utilizando NaCl 3 M) (a una presión de < 0,5 bar) antes de la filtración del líquido. Durante la filtración, se enfrió el portafiltro y el filtrado se recogió a una temperatura diana de 17°C ± 1°C usando una vasija de doble pared conectada a un criostato. La vasija se enfrió para el filtrado. En caso de obstrucción del filtro, se utilizaron filtros nuevos preacondicionados para continuar la filtración del líquido remanente. Después de la filtración se midió el volumen.

Después de medir el volumen del líquido que contiene IVIG, se ajustó con agitación con tampón de dilución frío (de 2°C a 8°C) (disolución de NaCl con conductividad diana de 3,5 mS/cm (intervalo: 2,5 mS /cm-6,0 mS/cm)) hasta una absorbancia diana calculada de 28,9 AU<280>-<320>/cm (intervalo: 14,5 - 72,3 AU<280>-<320>/cm). Teniendo en cuenta la posterior incorporación de virus 1:31, esto dio como resultado un valor de absorbancia diana calculado de 28 AU<280>-<320>/cm (intervalo: 14-70 AU<280>-<320>/cm) para la incubación con el detergente de la filtración.

El líquido que contiene IVIG filtrado y ajustado con proteínas se ajustó nuevamente con agitación a 17°C ± 1°C usando una vasija de doble pared conectada a un criostato Este intervalo de temperatura se mantuvo con agitación hasta el final de la incubación del líquido que contiene IVIG filtrado con el detergente y se registró continuamente. Al volumen determinado del líquido que contenía IVIG filtrado, transferido a un matraz con tapa de rosca cuyo peso de tara se había determinado, se le incorporó virus a una razón de 1:31, p. ej., 30 ml de líquido que contenía IVIG se enriquecieron con 1 ml de disolución madre de virus. El líquido que contenía IVIG incorporado se incubó adicionalmente con agitación continua a 17°C ± 1°C. Entre 1 y 2 minutos después de la incorporación, se tomaron muestras para la valoración del virus (control de incorporación, SC, y control de retención, HC).

Después de la extracción, el control de retención (HC) se mantuvo a la misma temperatura, es decir, a 17°C ± 1°C, que el líquido que contenía IVIG incorporado después de la adición del detergente, es decir, se almacenó en el mismo círculo de enfriamiento que la vasija con el líquido que contenía IVIG, hasta el final del tratamiento con detergente. La temperatura del líquido de enfriamiento se determinó antes de la inserción de la muestra de control de retención y, nuevamente, poco antes de que se retirara el control de retención para su valoración después del tratamiento con detergente.

El peso del líquido que contenía IVIG incorporado se determinó para calcular la cantidad de detergente que debía añadirse. El material pesado se reajustó, en caso necesario, con agitación a 17°C ± 1°C. Se añadió la cantidad necesaria de detergente ([mg]), o la cantidad respectiva de una dilución 1:10 del mismo, por g de tampón que contenía IVIG para producir las siguientes concentraciones finales del detergente respectivo: 0,1% ± 0,01% (p/p) o 0,03% ± 0,01% (p/p). El detergente se añadió con agitación durante 1 minuto usando una jeringa, y la cantidad real de detergente añadido se determinó volviendo a pesar la jeringa. El líquido que contenía IVIG incorporado se incubó adicionalmente con el detergente respectivo con agitación continua a 17°C ± 1°C durante 59 ± 1 minutos. Durante la incubación, se tomaron muestras de 1 ml para la valoración del virus después de 1-2 min, 10 ± 1 min, 30 ± 1 min y 59 ± 1 min. Para evitar una mayor inactivación del virus por los reactivos S/D después de la extracción de muestras, las muestras se diluyeron inmediatamente 1:20 con medio de cultivo celular frío (de 2°C a 8°C) (es decir, 1 volumen de muestra más 19 volúmenes de medio de cultivo celular).

Resultados

Cuando el tratamiento con un único detergente de un líquido que contenía IVIG se realizó a 17°C ± 1°C usando Tritón X-100 al 0,1% ± 0,01%, polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico o Triton X-100 reducido, el BVDV fue inactivado por un factor de reducción de virus (RF) de alrededor de 5 en 10 minutos (FIG. 13A). Cuando el tratamiento con un único detergente de un líquido que contenía IVIG se realizó a 17°C ± 1°C usando Triton X-100 al 0,03% ± 0,01%, polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico o Triton X-100 reducido, el BVDV fue inactivado por un factor de reducción de virus (RF) superior a 3 en 10 minutos y superior a 4 en 30 minutos. (FIG. 13B).

Estos experimentos confirman que el tratamiento con un único detergente de líquidos que contienen fármacos biofarmacéuticos usando Triton X-100, polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico o Triton X-100 reducido da como resultado una inactivación eficiente de virus con envoltura lipídica, incluso con bajas concentraciones de los detergentes.

Ejemplo 10: Inactivación de BVDV usando polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico o Triton X-100 reducido en líquido que contiene FVIII

La idoneidad del polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico o Triton X-100 reducido para el tratamiento con un único detergente para inactivar el virus de la diarrea viral bovina (BVDV) con envoltura lipídica en líquidos que comprenden Factor VIII derivado de plasma (pdFVIII) se probó y comparó con Triton X-100. Para ello, se añadió virus a líquidos que comprendían pdFVIII. Los líquidos que contenían virus que comprendían pdFVIII se incubaron luego con bajas concentraciones de Triton X-100 reducido, polietoxilato de alcohol 4-tercoctilbencílico o Triton X-100 durante varios períodos de tiempo, y se determinó la infectividad remanente de los virus. Se usaron Triton X-100 reducido, polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico y Triton X-100 en concentraciones bajas para evaluar la cinética de inactivación del virus, es decir, la eficiencia de la inactivación del virus (expresada por el RF) a lo largo del tiempo. Como será evidente para un experto en la técnica, en procesos de producción comerciales tales como la producción biofarmacéutica, los detergentes que incluyen Triton X-100 reducido o polietoxilato de alcohol 4-terc-octilbencílico se pueden usar en concentraciones significativamente más altas, lo que acelerará la cinética de inactivación del virus y también se espera que aumente el LRV logrado.

Materiales

Líquido que comprende pdFVIII

Un líquido que comprendía pdFVIII (líquido que contiene pdFVIII) se congeló en hielo seco y se almacenó a < -60°C hasta su uso en el plazo de un año a partir de la fecha de recogida.

Virus

Tabla 14: Reservas de virus utilizadas en los experimentos.

Cepa del virus Fuente Propagado en Valorado en

Línea celular Fuente Línea celular Fuente

BVDV ATCC 1 VR-1422 MDBK ATCC 1 CRL-22 BT ATCC 1 CRL-1390 Nad1_______________________________________ _____________

Detergentes

Métodos

La capacidad de inactivación del virus y la robustez del tratamiento con un único detergente se evaluaron en c o n d i c i o n e s d e s f a v o r a b l e s p a r a l a i n a c t i v a c i ó n d e l v i r u s , e s d e c i r , c o n t i e m p o s d e i n c u b a c i ó n c o r t o s . C o m o s e r á e v i d e n t e p a r a u n e x p e r t o e n l a t é c n i c a , e n p r o c e s o s d e p r o d u c c i ó n c o m e r c i a l e s t a l e s c o m o l a p r o d u c c i ó n b i o f a r m a c é u t i c a , s e p u e d e n u s a r t i e m p o s d e i n c u b a c i ó n m á s l a r g o s , l o q u e a c e l e r a r á l a c i n é t i c a d e i n a c t i v a c i ó n d e l v i r u s y t a m b i é n p u e d e a u m e n t a r e l L R V l o g r a d o . A d e m á s , c o m o y a s e h a m e n c i o n a d o a n t e r i o r m e n t e , s e 5 u s a r o n c o n c e n t r a c i o n e s b a j a s d e l o s d e t e r g e n t e s r e s p e c t i v o s . C o m o s e r á e v i d e n t e p a r a u n e x p e r t o e n l a t é c n i c a , e n p r o c e s o s d e p r o d u c c i ó n c o m e r c i a l e s t a l e s c o m o l a p r o d u c c i ó n b i o f a r m a c é u t i c a , s e p u e d e n u s a r c o n c e n t r a c i o n e s m á s a l t a s d e l o s d e t e r g e n t e s r e s p e c t i v o s , l o q u e a c e l e r a r á l a c i n é t i c a d e i n a c t i v a c i ó n d e l v i r u s y t a m b i é n p u e d e a u m e n t a r e l L R V l o g r a d o .

1 0 D a d o q u e l a c o n c e n t r a c i ó n d e p r o t e í n a n o t i e n e u n i m p a c t o s i g n i f i c a t i v o s o b r e l a i n a c t i v a c i ó n d e l v i r u s d u r a n t e e l t r a t a m i e n t o S / D ( v é a s e t a m b i é n D i c h t e l m ü l l e r e t a l . , 2 0 0 9 ) , n o s e i n v e s t i g ó l a s o l i d e z c o n r e s p e c t o a l c o n t e n i d o d e p r o t e í n a .

4 5 L a v a l o r a c i ó n d e l a s m u e s t r a s y e l c á l c u l o d e l a c a p a c i d a d d e e l i m i n a c i ó n d e l v i r u s s e r e a l i z a r o n c o m o s e h a d e s c r i t o p a r a e l E j e m p l o 1 a n t e r i o r .

R e s u l t a d o s

E s t o s e x p e r i m e n t o s c o n f i r m a n q u e e l t r a t a m i e n t o c o n u n ú n i c o d e t e r g e n t e d e l í q u i d o s q u e c o n t i e n e n f á r m a c o s 5 5 b i o f a r m a c é u t i c o s u s a n d o T r i t o n X - 1 0 0 , p o l i e t o x i l a t o d e a l c o h o l 4 - t e r c - o c t i l b e n c í l i c o o T r i t o n X - 1 0 0 r e d u c i d o d a c o m o r e s u l t a d o u n a i n a c t i v a c i ó n e f i c i e n t e d e v i r u s c o n e n v o l t u r a l i p í d i c a , i n c l u s o c o n b a j a s c o n c e n t r a c i o n e s d e l o s d e t e r g e n t e s .

E j e m p l o 1 1 : P r u e b a s d e t o x i c o l o g í a

6 0

<B a s á n d o s e e n d a t o s>in silico,<p a r a n i n g u n o d e l o s d e t e r g e n t e s s e g ú n l a i n v e n c i ó n s e h a e n c o n t r a d o n i n g u n a>e v i d e n c i a d e q u e s e a a c t i v o c o m o d i s r u p t o r e n d o c r i n o .

A p l i c a b i l i d a d i n d u s t r i a l :

6 5

L o s m é t o d o s , p r o c e s o s y p r o d u c t o s d e l a i n v e n c i ó n s o n c o m e r c i a l m e n t e ú t i l e s , p . e j . , p a r a l a i n a c t i v a c i ó n compatible con el medio ambiente de virus con envoltura lipídica en procesos de fabricación industrial. Por ejemplo, la invención se puede utilizar en la producción industrial de productos biofarmacéuticos. Por tanto, la invención es industrialmente aplicable.

REFERENCIAS

Dichtelmüller et al. (2009): Robustness of solvent/detergent treatment of plasma derivatives: a data collection from Plasma Protein Therapeutics Association member companies. Transfusion 49(9): 1931-1943.

Di Serio et al. (2005): Comparison of Different Reactor Types Used in the Manufacture of Ethoxylated, Propoxylated Products. Ind. Eng. Chem. Res. 44(25): 9482-9489.

Documento de apoyo de la ECHA para la identificación del 4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenol, etoxilado como sustancia extremadamente preocupante porque, debido a su degradación a una sustancia extremadamente preocupante (4-(1,1, 3,3-tetrametilbutil)fenol) con propiedades de alteración endocrina, provocan probables efectos graves en el medio ambiente que suscitan un nivel de preocupación equivalente al de los CMR y los PBT/vPvB, adoptado el 12 de diciembre de 2012

Folleto "Global Assessment of the Sate-of-the-Science of Endocrine Disruptors" (WHO/PCS/EDC/02.2), publicado por el Programa Internacional sobre Seguridad Química de la Organización Mundial de la Salud

Simons et al. (1973): Solubilization of the membrane proteins from Semliki Forest virus with Triton X100. J Mol Biol. 80(1):119-133.

Patente de EE.UU n.° 1,970,578

Libro de texto de química orgánica práctica de Vogel ((5a edición, 1989, A.I. Vogel, A.R. Tatchell, B.S. Furnis, A.J. Hannaford, P.W.G. Smith)

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Claims

REIVINDICACIONES 1. Un compuesto que es el siguiente compuesto:

en donde m es igual a 1 y z es un número entero seleccionado del siguiente grupo: z = 1 a 5.
2. El compuesto de la reivindicación 1, en donde el compuesto es el siguiente compuesto:

en donde n es un número entero entre 4 y 16, preferiblemente en donde n es igual a 9 o 10.
3. Un método para inactivar un virus que tiene una envoltura lipídica, comprendiendo el método las siguientes etapas: a) añadir un detergente a un líquido para preparar una mezcla de dicho detergente y dicho líquido; y b) incubar dicha mezcla para inactivar dicho virus; en donde dicho detergente es un éter de polioxietileno, en donde dicho detergente es un detergente no fenólico y en donde dicho detergente es el compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.
4. El método de la reivindicación 3, en donde dicho detergente es compatible con el medio ambiente.
5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 4, en donde la etapa a) comprende además añadir un disolvente a dicho líquido, y en donde en la etapa a), se prepara una mezcla de disolvente/detergente para la inactivación de dicho virus añadiendo dicho detergente y dicho disolvente a dicho líquido.
6. El método de la reivindicación 5, en donde dicho disolvente es un disolvente orgánico y en donde dicho disolvente es opcionalmente fosfato de tri-n-butilo.
7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en donde dicho líquido comprende un producto medicinal biológico y/o un fármaco biofarmacéutico.
8. El método de la reivindicación 7, en donde dicho fármaco biofarmacéutico es: (a) un factor sanguíneo, una inmunoglobulina tal como un anticuerpo monoclonal, una enzima de reemplazo, una vacuna, un vector de terapia génica, un factor de crecimiento o un receptor del factor de crecimiento; (b) una proteína terapéutica; (c) un factor sanguíneo y, en donde, dicho factor sanguíneo es factor I (fibrinógeno), factor II (protrombina), factor tisular, factor V, factor VII o VIIa, factor VIII, factor IX, factor X, factor XI, factor XII, factor XIII, factor de von Willebrand (FvW), precalicreína, cininógeno de alto peso molecular (HMWK), fibronectina, antitrombina III, cofactor de heparina II, proteína C, proteína S, proteína Z, plasminógeno, alfa 2-antiplasmina, activador tisular del plasminógeno (tPA), urocinasa, inhibidor del activador de plasminógeno 1 (PAI1) e inhibidor del activador de plasminógeno 2 (PAI2); y/o (d) factor VIII, preferiblemente factor VIII humano recombinante.
9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, en donde: (a) antes de la etapa a) o entre la etapa a) y la etapa b), dicho método comprende además una etapa de filtrar dicho líquido o mezcla con un filtro de profundidad; (b) en la etapa b), dicha mezcla se incuba durante al menos 1 hora; y/o (c) en la etapa b), dicha mezcla se incuba a una temperatura de entre 0°C y 10°C, o en donde dicha mezcla se incuba a una temperatura de entre 16°C y 25°C.
10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, que además comprende, después de la etapa b), una etapa de c) purificar dicho fármaco biofarmacéutico; y en donde: (i) dicha purificación comprende separar dicho fármaco biofarmacéutico de dicho detergente; (ii) dicha purificación comprende separar dicho fármaco biofarmacéutico de dicho detergente adicional; y/o (iii) dicha purificación de dicho fármaco biofarmacéutico comprende purificar dicho fármaco biofarmacéutico mediante al menos una purificación cromatográfica y dicha al menos una purificación cromatográfica es opcionalmente mediante cromatografía de intercambio aniónico y/o mediante cromatografía de intercambio catiónico.
11. Un método para preparar un fármaco biofarmacéutico, comprendiendo dicho método el método según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en donde dicho fármaco biofarmacéutico es como se define en una cualquiera de dichas reivindicaciones 7 a 10.
12. El método de la reivindicación 11, que comprende además, después de dicho método de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, una etapa de preparación de una formulación farmacéutica que comprende dicho fármaco biofarmacéutico.
13. Uso de un detergente en un método para la inactivación de un virus que tiene una envoltura lipídica, en donde el detergente es el compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.
14. El uso de la reivindicación 13, en donde dicho método para dicha inactivación de dicho virus es un método que utiliza un tratamiento con disolvente/detergente, comprendiendo dicho tratamiento con disolvente/detergente el uso de dicho detergente que es el compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.
15. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 13 a 14, en donde dicha inactivación de virus es una inactivación de virus en un líquido que comprende un fármaco biofarmacéutico como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8.
16. Una composición que comprende un detergente, en donde el detergente es el compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.
17. La composición de la reivindicación 16, que comprende además un disolvente orgánico como se define en la reivindicación 6.
18. Un método para sintetizar un compuesto de la siguiente Fórmula general (VIII),

en donde R representa un grupo hidrocarburo que tiene una cadena lineal de 2 a 12 átomos de carbono y uno o más grupos metilo como sustituyentes en dicha cadena lineal, m es igual a 1, y A representa un residuo de polioxietileno, en donde el método comprende las etapas de A) convertir un fenol de la siguiente Fórmula general (IX) en donde R es como se ha definido anteriormente Fórmula (IX) en un alcohol de la siguiente Fórmula general (X) en donde R y m son como se han definido anteriormente

y B) convertir el alcohol de Fórmula general (X) en un éter de polioxietileno de Fórmula general (VIII) como se ha definido anteriormente; en donde el compuesto de Fórmula (VIII) es el siguiente compuesto:

en donde m es igual a 1 y z es un número entero seleccionado del siguiente grupo: z = 1 a 5.
19. Un método para sintetizar un compuesto de la siguiente Fórmula general (VIII),

en donde R representa un grupo hidrocarburo que tiene una cadena lineal de 2 a 12 átomos de carbono y uno o más grupos metilo como sustituyentes en dicha cadena lineal, m es igual a 1, y A representa un residuo de polioxietileno, en donde el método comprende las etapas de (1) hacer reaccionar tolueno para obtener un tolueno sustituido de la siguiente Fórmula general (XI) en donde R es como se ha definido anteriormente

(2) convertir el tolueno sustituido de Fórmula general (XI) en un compuesto de la siguiente Fórmula general (XII), en donde R y m son como se han definido anteriormente y X se selecciona del grupo que comprende un grupo hidroxilo, un átomo de bromo, un átomo de yodo y un átomo de cloro Fórmula (XII) y (3) convertir el compuesto de Fórmula general (XII) en un éter de polioxietileno de Fórmula general (VIII) como se ha definido anteriormente; en donde el compuesto de Fórmula (VIII) es el siguiente compuesto: polioxietileno en donde m es igual a 1 y z es un número entero seleccionado del siguiente grupo: z = 1 a 5.
20. Un método para sintetizar un compuesto de la siguiente Fórmula general (VIIIa),

en donde R representa un grupo hidrocarburo que tiene una cadena lineal de 2 a 12 átomos de carbono y uno o más grupos metilo como sustituyentes en dicha cadena lineal, y A representa un residuo de polioxietileno, en donde el método comprende las etapas de (I) convertir el alcohol bencílico en un compuesto de la siguiente Fórmula general (XIII), en donde R es como se ha definido anteriormente Fórmula (XIII) y (II) convertir el compuesto de Fórmula general (XIII) en un éter de polioxietileno de Fórmula general (Villa) como se ha definido anteriormente; en donde el compuesto de Fórmula (ViIIa) es el siguiente compuesto:

en donde m es igual a 1 y z es un número entero seleccionado del siguiente grupo: z = 1 a 5.
21. El método de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 en donde el compuesto de Fórmula (VIII) es el siguiente compuesto:

en donde n es un número entero entre 4 y 16, preferiblemente en donde n es igual a 9 o 10.
22. El método de cualquiera de las reivindicaciones 19 y 21, en donde: (i) la conversión en la etapa (2) es una reacción radicalaria que utiliza AIBN (azobis(isobutironitrilo) como iniciador radicalario; y/o (ii) X es un átomo de bromo.
23. El método de cualquiera de las reivindicaciones 19 y 21 a 22, en donde: (a) la conversión en la etapa (2) utiliza N-bromosuccinimida (NBS) como reactivo; (b) la conversión en la etapa (3) utiliza TBME (metil-terc-butiléter) como disolvente; (c) la conversión en la etapa (3) tiene lugar durante al menos 2 horas, preferiblemente a temperatura ambiente; (d) la conversión en la etapa (3) tiene lugar durante no más de 5 horas, preferiblemente a temperatura ambiente; y/o (e) la conversión en la etapa (3) tiene lugar durante 3 horas, preferiblemente a temperatura ambiente.