KR101762753B1

KR101762753B1 - 면역반응을 증강시키기 위한 조성물 및 그 방법

Info

Publication number: KR101762753B1
Application number: KR1020107011572A
Authority: KR
Inventors: 제임스 존스톤; 보제나 코작; 그래햄 버튼
Original assignee: 아비바젠 인코포레이티드.; 내셔날 리서치 카운실 오브 캐나다
Priority date: 2007-10-26
Filing date: 2008-10-23
Publication date: 2017-08-04
Anticipated expiration: 2028-10-23
Also published as: US20110217244A1; JP2011500733A; CN101909611A; DK2214656T3; EP2214656B1; CA2704098C; KR20100102594A; JP2015110596A; ES2716474T3; JP6262158B2; EP2214656A1; WO2009052629A1; NZ585620A; AU2008316225B2; US10449247B2; CA2704098A1; PL2214656T3; AU2008316225A1; EP2214656A4

Abstract

감염의 치료를 위해 객체에 면역반응을 증강시키거나 면역화 객체에서 항원에 대한 면역반응을 증강시키기 위한 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분의 용도. 또한 산화적으로 변형된 카로테노이드를 포함하는 약학적 조성물 및 키트를 개시한다.

Description

면역반응을 증강시키기 위한 조성물 및 그 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS FOR ENHANCING IMMUNE RESPONSE}

본 발명은 면역반응을 증강하기 위한 카로테노이드 산화물(carotenoid oxidation products)의 용도에 관한 것이다.

다세포생물은 감염원(infectious agents)에 대한 두 가지 일반적인 면역시스템(general systems of immunity)을 발전시켜왔다. 두 가지 시스템은 선천성 또는 자연 면역(“선천성 면역”이라고도 알려짐) 및 적응성(획득) 또는 특이 면역이다. 두 시스템 사이의 주요 차이점은 감염원을 인식하는 메커니즘이다. 선천성 면역 시스템은 미생물에 존재하는 보존된 분자 패턴들의 인식을 위해 생식계열-코딩된 수용체(germline-encoded receptors)의 세트를 이용한다. 이러한 분자 패턴들은 다음을 포함하는 미생물의 특정 구성성분(constituents)에서 발생한다: 지질다당류(lipopolysaccharides), 펩티도글리칸(peptidoglycans), 리포타이코산(lipoteichoic acids), 포스파티딜콜린(phosphatidyl cholines), 리포단백질(lipoproteins), 박테리아 DNAs, 바이러스 단일 및 이중-가닥 RNAs, 비메틸화된(unmethylated) CpG-DNAs를 포함하는 박테리아-특이 단백질(bacteria-specific proteins), 만난(mannans), 및 다양한 다른 박테리아 및 진균 세포벽 구성성분(components). 이러한 분자 패턴들은 식물 알칼로이드(plant alkaloids)와 같은 다른 분자들에서도 발생한다. 이러한 선천성 면역 인식의 타겟들은 감염된 숙주 생물이 아닌 미생물에 의해 생산되기 때문에 병원체 관련 분자 패턴(Pathogen Associated Molecular Patterns, PAMPs)이라 부른다. PAMPs를 인식하는 선천성 면역 시스템의 수용체들은 패턴 인식 수용체(Pattern Recognition Receptors, PRRs)라고 부른다 (Janeway et al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 54:1 (1989); Medzhitov et al., Curr. Opin. Immunol. 94:4 (1997) 참조). 이러한 수용체들은 구조가 변화하여 여러 가지 서로 다른 단백질 패밀리에 속한다. 이러한 수용체들의 일부 (예컨대, CD14, DEC205, collectins)는 PAMPs를 직접적으로 인식하는 반면, 다른 수용체들 (예컨대, 보체수용체(complement receptors))은 PAMP 인식에 의해 생성된 산물을 인식한다. 이러한 수용체 패밀리의 멤버들은, 일반적으로, 세 가지 타입으로 분류될 수 있다: (1) 혈장(plasma)에서 순환하는 체액성 수용체(humoral receptors); (2) 면역-세포 표면에 발현된 세포내이입성 수용체(endocytic receptors), 및 (3) 세포 표면 또는 세포내(intracellularly) 중 어느 하나에서 발현될 수 있는 신호전달 수용체(signaling receptors). (Medzhitov et al., Curr. Opin. Immunol. 94:4 (1997); Fearon et al., Science 272:50 (1996)).

세포의 PRRs는 대식세포(macrophages), 수지상세포(dendritic cells), B 림프구(B lymphocytes) 및 표면상피(surface epithelia)와 같은, 적응성 면역에서 전문적인(professional) 항원-제시세포(antigen-presenting cells, APC)로서 기능을 하는 세포들을 포함하는, 선천성 면역 시스템의 효과기세포(effector cells) 상에서 발현된다. 이러한 발현 프로파일(expression profile)은 PRRs가 선천성 효과기 메커니즘(effector mechanisms)을 직접적으로 유도할 수 있게 하고, 또한 이하 기술된, 염증성 사이토카인(inflammatory cytokines) 및 케모카인(chemokines)과 같은, 내생적 신호(endogenous signals) 세트의 발현을 유도함으로써 감염원의 존재시 숙주 생물을 경고한다. 이러한 후자의 기능은 효과기의 능률적인 가동(mobilization)으로 침입자와 싸우게 한다.

그에 반해서, 척추동물에서만 발견되는 적응성 면역 시스템은, 각각의 개별 생물의 성장(development) 동안 체성 메커니즘(somatic mechanisms)에 의해 생산되는 두 가지 타입의 항원 수용체를 이용한다. 상기 두 가지 타입의 항원 수용체는 T-세포 수용체(T-cell receptor, TCR) 및 면역글로불린 수용체(immunoglobulin receptor, IgR)인데, 이들은 두 가지 특수화된 세포 타입, T-림프구 및 B-림프구 상에서 각각 발현된다. 이러한 항원 수용체들의 특이성(specificities)은 체성 유전자 재배열(somatic gene rearrangement), 수용체 서브유닛(subunits)의 랜덤 페어링(random pairing)의 과정들, 및 재배열 시 코딩 영역에 뉴클레오티드들의 주형-독립적 추가(template-independent addition)에 의해 림프구들의 성숙 시 랜덤하게 발생된다.

선천성 면역 시스템은 적응성 면역반응의 개시의 조절 및 적절한 세포 효과기 반응의 유도에서 결정적인 역할을 한다 (Fearon et al., Science 272:50 (1996)). 미경험 T-림프구(naive T-lymphocyte)의 활성은 두 가지 별개의 신호를 필요로 한다는 것이 지금은 잘 입증되어 있다: 하나는 TCR에 의해 인식된 특이적 항원 펩티드이고, 다른 하나는 공동자극신호(co-stimulatory signal)라고 불리는 B7인데, 이는 APCs 상에 발현되고 T-세포 상에 발현된 CD28 분자에 의해 인식된다 (Lenschow et al., Anna. Rev. Immunol. 14:233 (1996)). 미경험 CD4+ T-림프구들의 활성화는 둘 모두의 신호, 즉 특이적 항원 및 B7 분자가 동일한 APC 상에 발현되는 것을 필요로 한다. 미경험 CD4 T-세포가 B7 신호의 부재시 항원을 인식한다면, T-세포는 세포사멸(apoptosis)에 의해 죽게될 것이다. 따라서 APCs 상에서 B7 분자들의 발현은 미경험 CD4 T-림프구가 활성화될 것인지를 조절한다. CD4 T-세포들이 세포독성 기능(cytotoxic functions)을 위한 CD8 T-세포들의 활성화를 조절하기 때문에, B7 분자들의 발현은 적응성 면역반응이 활성화될 것인지를 결정한다. 선청성 면역 시스템은 B7 발현의 조절에서 결정적인 역할을 한다 (Fearon et al., Science 272:50 (1996); Medzhitov et al., Cell 91:295 (1997)). 앞서 언급한 바와 같이, 선천성 면역 인식은 PAMPs를 인식하는 PRRs에 의해 매개된다. PRRs에 의한 PAMPs의 인식은 B7, 사이토카인 및 케모카인과 같은, 림프구들의 활성화에 필요한 신호들을 코딩하는 유전자들을 포함하는, 다양한 유도성 면역반응 유전자들의 발현을 조절하는 신호전달경로의 활성화를 초래한다 (Medzhitov et al., Cell 91:295 (1997); Medzhitov et al., Nature 388:394 (1997)). 따라서 PAMPs의 인식에 따른 PRR에 의한 B7 발현 유도는 자기/비자기 구별(self/nonself discrimination)을 설명하고 미생물-유도 항원에 대한 특이적 T-세포들만이 정상적으로 활성화된다는 것을 입증한다. 이러한 메커니즘은 정상적으로 자기-항원(self-antigens)에 대한 특이적 자가반응성 림프구(autoreactive lymphocytes)의 활성화를 방지한다.

B7 분자 및 케모카인의 발현을 조절하는 선천성 면역 시스템의 수용체들은 최근에 동정되었다 (Medzhitov et al., Nature 388:394 (1997); Rock et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA, 95:588 (1998)). 이러한 수용체들은, 트로소필라 배아(Drosophila embryos)에서의 등배쪽 패턴화(dorsoventral patterning) 및 성체 파리에서의 면역반응 모두와 관련이 있는 드로소필라 톨단백질(Drosophila Toll protein)과 상동성이기 때문에 명명된, 톨-유사 수용체(Toll-like receptors, TLRs)의 패밀리에 속한다 (Lemaitre et al., Cell 86:973 (1996)). 포유동물에서, 이러한 TLRs는 박테리아 산물인, LPS, 펩티도글리칸(peptidoglycan), 및 지질단백질(lipoprotein)과 같은 PAMPs를 인식하는 것으로 밝혀졌다 (Schwandner et al., J. Biol. Chem. 274:17406 (1999); Yoshimura et al., J. Immunol. 163:1 (1999); Aliprantis et al., Science 285:736 (1999)).

백신들은 전통적으로 감염원에 의해 유발된 질병에 대하여 보호하기 위한 수단으로서 사용되고 있고, 백신 기술이 발달함에 따라, 백신들은 추가적으로 포유동물 생식력(mammalian fertility)의 조절, 호르몬 작용의 조절, 및 종양의 예방 또는 치료를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 적용에 사용되고 있다. 질병에 대하여 보호하는데 사용되는 백신들의 1차 목적은 특정 미생물에 대한 면역 기억(immunological memory)을 유도하는 것이다. 더 나아가, 백신들은 특이적 항원들이 미생물에 속하던지 종양 세포 또는 다른 질병에 감염된 또는 비정상적 세포에 의해 발현되던지 간에 그들에 대한 면역반응을 유도하는데 필요하다. 항원에 대한 특이적 표면 수용체를 갖는 B- 및 T-림프구의 분열 및 분화는 특이성 및 기억 모두를 발생시킨다.

보호적 면역반응을 유도하는 백신을 위해서는, 다음의 요건들을 만족시켜야 한다: 1) 예방접종(vaccination)에 따른 보호적 면역의 타겟이 될 특이적 항원(들) 또는 그 단편(들)을 포함하여야 한다; 2) 면역 시스템에 의해 인식될 수 있는 형태, 예컨대 면역 인식 이전에 분해(degradation)에 대한 저항성이 있는 형태로서, 이러한 항원들이 존재하여야 한다; 그리고 3) B-세포 분화 및 다른 면역 효과기 기능들을 차례로 유도하는, CD4+ T-세포에 항원을 제공하는 APCs를 활성화시켜야 한다.

전통적인 백신들은 스스로 심각한 감염을 유도할 수 없지만, 숙주에 접종 시 변형되지 않은 (또는 치명적인) 종(species)을 중화시킬 수 있는, 약독화되거나 사멸화된 바이러스 또는 박테리아와 같은 미생물의 현탁물질(suspensions)을 포함한다. 상기 용어의 사용은 현재 활성 면역 예방(immunologic prophylaxis)(예컨대, 치명적인 균주의 사멸된 미생물의 조제 또는 약독화된 (변이체 또는 돌연변이체) 균주의 살아있는 미생물; 미생물, 진균, 식물, 원생동물, 또는 후생동물 파생물(derivatives) 또는 산물(products); 및 합성 백신)에 사용할 목적의 필수적인 임의의 조제에까지 확장되어 있다. 백신의 예들은 천연두(smallpox)에 대하여 접종하기 위한 우두 바이러스(cowpox virus), 파상풍(tetanus)을 예방하기 위한 파상풍 톡소이드, 백일해(whooping cough, pertussis)를 예방하기 위한 전-불활성화 박테리아(whole-inactivated bacteria), 연쇄상구균성 폐렴(streptococcal pneumonia)을 예방하기 위한 다당류 서브유닛(polysaccharide subunits), 및 B형 감염(hepatitis B)을 예방하기 위한 재조합 단백질들을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.

약독화된 백신들은 보통 면역성이긴 하나, 그들의 사용은 그들의 효능이 특이적이고, 발병력(virulence)에 대한 분자 결정기(molecular determinants)의 상세한 정보를 필요로 하기 때문에 제한된다. 더욱이, 백신에서 약독화된 병원체의 사용은 대부분의 경우 인간에서 그들의 안전성을 방해하는 다양한 위험 요소와 관련되어 있다.

반면에, 합성 백신이 갖는 문제점은, 그들이 종종 비-면역성 또는 비-보호적이라는 것이다. 합성 백신의 면역원성(immunogenicity)을 증가시키기 위한 사용가능한 애주번트(adjuvants)의 사용은 애주번트 스스로 유도되는 허용불가한 부작용(side effects)으로 인하여 거의 선택(option)되지 않는다.

애주번트는 항원의 면역원성을 증가시키는 임의의 기질이다. 알룸(alum)과 같은 화학제들이 종종 애주번트로 고려되지만, 그들은 실질적으로 담체(carriers)에 가까워 항원을 안정화하거나 및/또는 그들의 항원-제시세포들과의 상호작용을 촉진함으로써 작용할 것이다. 최선의 애주번트는 선천성 면역 시스템을 활성화시키기 위하여 미생물의 능력을 모방한 것이다. 순수한 항원들은 림프구의 활성화에 필요한 공동자극 신호 (예컨대, B7.1 또는 B7.2)를 유도하지 못하기 때문에 면역반응을 유도하지 않는다. 따라서 애주번트 활성의 주요 메커니즘은 미생물, 또는 미생물-유사물, 즉 애주번트들의 일정한 구성성분들(routine constituents)인 PAMPs를 운반하는 구성요소들에 의한 공동자극 신호의 유도에 기인하는 것으로 여겨지고 있다 (see Janeway et al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 54: 1 (1989)). 상술한 바와 같이, PRRs에의한 이러한 PAMPs의 인식은 (B7과 같은) 림프구 활성화 및 (효과기 사이토카인들) 분화에 필요한 신호들을 유도한다. 면역원성을 증강시키기 위하여 백신 제형에 애주번트를 편입시키는 것의 이익은 이러한 약제들이 유해한(adverse) 국소 및/또는 전신 반응을 유도할 위험에 대해 신중하게 평가되어야 한다. 국소 유해반응은 주사 부위에서 국소 염증, 및 드물게, 육아종(granuloma) 또는 무균성 농양(sterile abscess) 형성의 유도를 포함한다. 실험실 동물에서 관찰되는 애주번트에 대한 전신 반응은 불안(malaise), 열(fever), 애주번트 관절염(adjuvant arthritis), 및 앞포도막염(anterior uveitis)을 포함한다 (Allison et al., MoI. Immunol. 28:279 (1991); Waters et al., Infect. Immun., 51:816 (1986)). 이러한 반응들은 종종 애주번트가 유도하는 사이토카인 프로파일에 기인할 수 있다. 따라서 프로인트 완전 또는 프로인트 불완전 애주번트(Freund's Complete or Freund's Incomplete Adjuvant)와 같은 많은 강력한 애주번트들은 독성이 있으므로 인간 백신이 아닌, 동물 연구 목적에만 유용하다. 알룸은 선천성 면역 자극제(stimulant)가 아니어서 상대적으로 제한된 효능을 갖지만, 과도한 염증을 유발하지 않기 때문에, 현재 임상 애주번트로서 사용이 승인되어 있다.

따라서 전염증반응(proinflammatory response)을 유도하지 않고 항원들의 면역원성을 증가시키는 애주번트가 필요하다. 또한 숙주에 의한 감염에 대해 더 빠르고 효과적인 반응을 유도하거나, 또는 항생물질(antibiotics)의 효능을 증강하는 선천성 및 적응성 면역 시스템을 항원에 대하여 감작하게(sensitizing), 또는 프라이밍(priming)할 수 있는 면역 시스템 조절인자가 필요하다.

본 발명은 산화적으로 변형된 카로테노이드 및 그 성분의 투여를 위한 조성물, 방법 및 키트를 제공한다. 상기 조성물은 객체의 선천성 및 적응성 면역 시스템을 감작시키는데 유용할 수 있으므로 감염을 치료하거나 면역화(immunization)에 애주번트로서 사용될 수 있다.

하나의 양태에서, 본 발명은 객체에 감염 치료에 충분한 양의 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분을 투여함으로써 감염을 갖는 객체의 치료방법을 특징으로 한다.

관련된 양태에서, 본 발명은 객체에 감염 치료에 충분한 양의 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분을 투여함으로써 감염을 갖거나 감염 위험성을 갖는 인간 객체의 치료방법을 특징으로 한다.

관련된 다른 양태에서, 본 발명은 객체에 감염 치료에 충분한 양의 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분을 투여함으로써 감염을 갖거나 감염 위험성을 갖는 객체의 치료방법을 특징으로 하며, 상기 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분은 정맥내, 안구내, 근육내, 국소적, 피하, 또는 비강내로 투여된다.

본 발명은 객체에 유효량의 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분을 투여함으로써 감염을 갖는 객체에서 면역반응의 증강방법을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 객체에 유효량의 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분을 투여함으로써 감염을 갖거나 감염 위험성을 갖는 인간 객체에서 면역반응의 증강방법을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 객체에 유효량의 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분을 투여함으로써 감염을 갖거나 감염 위험성을 갖는 인간 객체에서 면역반응의 증강방법을 특징으로 하며, 상기 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분은 정맥내, 안구내, 근육내, 국소적, 피하 또는 비강내 투여된다.

상기 방법들의 특정 구현예에서, 상기 감염은 박테리아, 바이러스, 진균 또는 기생충에 의한 것이다. 예를 들어, 상기 감염은 지역사회-획득 폐렴(community-acquired pneumonia), 상부 및 하부 기도 감염(upper and lower respiratory tract infection), 피부 및 연조직 감염(skin and soft tissue infection), 급성 세균성 중이염(acute bacterial otitis media), 세균성 폐렴(bacterial pneumonia), 복합 감염(complicated infection), 신우신염(pyelonephritis), 복강내 감염(intra-abdominal infection), 세균성 패혈증(bacterial sepsis), 중추신경계 감염(central nervous system infection), 세균혈증(bacteremia), 상처 감염(wound infection), 복막염(peritonitis), 수막염(meningitis), 화상후 감염(infections after burn), 비뇨생식기관 감염(urogenital tract infection), 골반염 질환(pelvic inflammatory disease), 심내막염(endocarditis), 또는 혈관내 감염(intravascular infection)일 수 있다. 상기 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분은 눈 감염의 치료를 위해 안구내로 투여될 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분은 경구 감염의 치료를 위해 상기 객체의 입에 국소적으로 투여된다.

상기 방법의 또 다른 구현예에서, 상기 객체는 감염으로 진단되지는 않았으나 감염 위험성을 갖는다. 선택적으로, 상기 방법들은 감염을 갖는 객체의 치료에 사용된다.

상기 양태들의 임의의 특정 구현예에서, 상기 방법은 객체에 항생제를 투여하는 것을 더 포함하며, 상기 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분 및 상기 항생제는 동시에 또는 각각 14일, 10일, 7일 또는 3일 이내에 투여된다.

관련 양태에서, 본 발명은 (i) 객체에 유효량의 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분을 투여하고, (ii) 상기 객체에 항원을 투여하는 것을 포함하며, 상기 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분은 상기 항원 이전에 투여되는 것을 포함하는 면역화 객체에서 항원에 대한 적응성 면역반응의 증강방법을 특징으로 한다.

본 발명은 또한 객체에 유효량의 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분을 투여하는 것을 포함하는 면역화 객체에서 항원에 대한 적응성 면역반응의 증강방법을 특징으로 한다.

본 발명은 또한 객체에 유효량의 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분을 투여하는 것을 포함하며, 상기 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분은 정맥내, 안구내, 근육내, 국소적, 피하 또는 비강내 투여되는, 면역화 객체에서 항원에 대한 적응성 면역반응의 증강방법을 특징으로 한다.

관련 양태에서, 본 발명은 (i) 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분을 포함하는 약학적 조성물, (ii) 항원을 포함하는 약학적 조성물, 및 (iii) 상기 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분, 및 객체의 면역화를 위한 상기 항원의 투여 지시서를 포함하는, 면역화 객체에서 항원에 대한 적응성 면역반응 증강용 키트를 특징으로 한다.

적응성 면역반응의 증강이 유도되는 상기 임의의 방법들 또는 키트들에서, 상기 항원은, 예를 들어, 박테리아, 바이러스, 진균 또는 기생충과 같은 병원체로부터 유래될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 항원은 탄수화물(carbohydrate), 당지질(glycolipid), 당단백질(glycoprotein), 지질, 단백질, 지질단백질(lipoprotein), 인지질(phospholipid) 또는 폴리펩티드(polypeptide)이다. 상기 병원체는, 예를 들어, 생 또는 약독화된 생 바이러스일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 병원체는 탄저병(anthrax), 인플루엔자(influenza), 소아마비(polio), 홍역(measles), 광견병(rabies) 또는 본 명세서에 기술된 임의의 병원체이다. 적응성 면역반응의 증강이 유도되는 상기 임의의 방법들 또는 키트들에서, 상기 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분은 항원 투여 14일, 10일, 8일, 6일, 4일, 3일, 2일 또는 심지어 1일 이내에 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 항원은 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분 전에 투여된다. 다른 구현예에서, 상기 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분은 항원 전에 투여된다. 또 다른 구현예에서, 상기 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분은 항원과 동시에 투여된다.

관련 양태에서, 본 발명은 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분 및 항원을 포함하는 약학적 조성물을 특징으로 한다. 상기 약학적 조성물은, 예를 들어, 경구, 정맥내, 근육내, 안구내, 국소, 피하 또는 비강내 투여용으로 제제화될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 항원은, 예를 들어, 박테리아, 바이러스, 진균 똔느 기생충과 같은 병원체로부터 유래될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 항원은 탄수화물, 당지질, 당단백질, 지질, 단백질, 지질단백질, 인지질 또는 폴리펩티드이다. 상기 병원체는, 예를 들어, 생 또는 약독화된 생 바이러스일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 병원체는 탄저병, 인플루엔자, 소아마비, 홍역, 광견병 또는 본 명세서에 기술된 임의의 병원체이다.

다른 양태에서, 본 발명은 (i) 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분을 포함하는 약학적 조성물, 및 (ii) 감염을 갖거나 감염 위험성을 갖는 객체의 치료를 위한 상기 조성물의 투여 지시서를 포함하는 키트를 특징으로 한다. 특정 구현예에서, 상기 감연은 박테리아, 바이러스, 진균 또는 기생충에 의한 것이다. 예를 들어, 상기 감염은 지역사회-획득 폐렴, 상부 및 하부 기도 감염, 피부 및 연조직 감염, 급성 세균성 중이염, 세균성 폐렴, 복합 감염, 신우신염, 복강내 감염, 세균성 패혈증, 중추신경계 감염, 세균혈증, 상처 감염, 복막염, 수막염, 화상후 감염, 비뇨생식기관 감염, 골반염 질환, 심내막염 및 혈관내 감염일 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 키트는 객체에 항생제 투여를 위한 지시서를 더 포함한다.

본 발명은 또한 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분을 포함하는 치약을 특징으로 한다. 상기 치약은 본 명세서에 기술된 바와 같이, 치약을 만드는데 유용한 것으로 알려진 임의의 부형제(excipients)와 함께 제제화될 수 있다.

본 발명은 또한 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분을 포함하는 구강세정제를 특징으로 한다. 상기 구강세정제는 본 명세서에 기술된 바와 같이, 구강세정제를 만드는데 유용한 것으로 알려진 임의의 부형제와 함께 제제화될 수 있다. 본 발명은 또한 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분을 포함하고 눈에의 투여용으로 제제화된 약학적 조성물을 특징으로 한다. 상기 약학적 조성물은, 예를 들어, 점안액(an ophthalmic drop), 안고약(ophthalmic salve), 안연고(opthalmic ointment), 안스프레이(ophthalmic spray), 결막하 주사(subconjunctival injection) 또는 유리체내 주사(intravitreal injection), 콘택트 렌즈(contact lens), 결막 삽입(conjunctival insert), 또는 안구 삽입(ocular insert)일 수 있다. 상기 약학적 조성물은 본 명세서에 기술된 바와 같이, 눈에 전달하기 위한 제제를 만드는데 유용한 것으로 알려진 임의의 부형제와 함께 제제화될 수 있다.

상기 임의의 방법들, 조성물들 및 키트들에서, 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분은 산화적으로 변형된 카로테노이드의 중합체 성분을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분은 2-메틸-6-옥소-2,4-헤파디에날, 디하이드로액티니디올리드, β-사이클로시트랄, β-이오논, β-이오논 5,6-에폭사이드, 4-옥소-β-이오논, β- 이오닐리덴 아세탈데하이드, β-이오닐리덴 아세탈데하이드 5,6-에폭사이드, 4-옥소-β-이오닐리덴 아세탈데하이드, β-아포-13-카로테논, β-아포-13-카로테논 5,6-에폭사이드, 4-옥소-β-아포-13- 카로테논, 레티날, 레티날 5,6-에폭사이드, 또는 그 혼합물들을 포함하는 산화적으로 변형된 카로테노이드의 성분을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분은 2-메틸-6-옥소-2,4-헤파디에날을 포함한다. 바람직하게는, 상기 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분은 산화적으로 변형된 카로테노이드이다. 특정 구현예에서, 상기 산화적으로 변형된 카로테노이드는 β-카로틴, 리코펜, 레티노인산 또는 칸타크산틴의 산화물이다. 상기 임의의 방법들, 조성물들 및 키트들에서, 상기 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분은 경구적, 정맥내, 근육내, 안구내, 국소적, 피하, 비강내, 또는 본 명세서에 기술된 투여의 임의의 다른 경로에 의해 투여될 수 있다.

상기 임의의 방법들, 조성물들 및 키트들에서, 상기 객체는 인간, 길들여진 애완동물 (예컨대, 개, 고양이, 말 또는 새), 또는 예를 들어 양, 돼지, 소 (예컨대, 젖소 또는 육우)를 포함하는 가축, 가금류 (예컨대, 칠면조 또는 닭), 또는 어류 (예컨대, 틸라피아, 메기, 송어 또는 연어)일 수 있다.

본 명에서에서 사용된, “유효량”은 객체의 선천성 또는 적응성 면역 시스템을 감작시켜 감염에 대한 면역반응을 증강시키는 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분의 양을 지칭한다.

용어 “충분한 양”은 감염을 치료 또는 예방하거나 감염에 관련된 질환의 치료에 필요한, 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분의 양을 지칭한다. 감염에 의해 유도되거나 원인이 되는 조건들의 치료 또는 예방 처치를 위하여 본 발명을 실시하는데 사용되는 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 투여 수단, 객체의 나이, 체중, 건강상태에 따라 달라진다. 결국, 상기 주치의 또는 수의사가 적절한 양 및 복용법을 결정할 것이다. 이러한 양은 “충분한 양”을 나타낸다.

본 명세서에 사용된 “카로테노이드”는 식물, 조류(algae), 박테리아, 및 새 및 조개와 같은 특정 동물에서 발견될 수 있는 테르페노이드 그룹(terpenoid group)의 자연적으로-발생한 색소들을 지칭한다. 카로테노이드는 카로틴들(carotenes)을 포함하며, 이는 탄화수소 (예, 산소 없는) 및 그들의 산화된 유도체 (예, 크산토필)이다. 카로테노이드의 예들은 리코펜; β-카로틴; 제아잔틴; 에키네논; 이소제아잔틴; 아스타잔틴; 칸타크산틴; 루테인; 시트라나산틴; β-아포-8'-카로테닌산 에틸에스터; 알록산틴, 아포카로테놀, 아스타신, 아스타잔틴, 캡산틴, 캡소루빈, 카로테네디올, 카로테네트리올, 카로테놀, 크립토잔틴, 데카프레녹산틴, 에필루테인, 푸코산틴, 알로히드록시 카로테노이드, 히드록시카로테논, 히드록시에키네논, 히드록시리코펜, 루테인, 리코잔틴, 뉴로스포린, 피토엔, 피토플루오엔, 로도핀, 스페로이덴, 톨루엔, 비올라잔틴, 및 제아잔틴과 같은 히드록시카로테노이드; 및 아포카로테논산과 같은 카복실릭 카로테노이드, β-아포-8'-카로테논산, 아자프린, 빅신, 카복실카로틴, 크로세틴, 디아포카로테논산, 뉴로스포라잔틴, 노르빅신, 및 리코페논산을 포함한다.

본 명세서에 사용된 “성분”은 중합체 물질 또는 2-메틸-6-옥소-2,4-헤파디에날, 디하이드로액티니디올리드, β-사이클로시트랄, β-이오논, β-이오논 5,6-에폭사이드, 4-옥소-β-이오논, β- 이오닐리덴 아세탈데하이드, β-이오닐리덴 아세탈데하이드 5,6-에폭사이드, 4-옥소-β-이오닐리덴 아세탈데하이드, β-아포-13-카로테논, β-아포-13-카로테논 5,6-에폭사이드, 4-옥소-β-아포-13- 카로테논, 레티날, 레티날 5,6-에폭사이드, 또는 그 혼합물로부터 선택된 화합물 중 어느 하나의 산화적으로 변형된 카로테노이드 혼합물의 활성 산화된 성분을 지칭한다. 산화적으로 변형된 카로테노이드의 성분들은 그들이 동물에서 감염을 치료하거나 면역반응을 증강시킬 수 있는 것에서 활성이다. 산화적으로 변형된 카로테노이드의 특정 분획이 감염을 치료하거나 및/또는 면역반응을 증강시킬 수 있는지를 분석하는 방법들은 실시예에서 제공된다. 성분들에서 산화적으로 변형된 카로테노이드 혼합물들을 분획하는 방법들은 U.S. Patent No. 5,475,006 및 U.S.S.N. 08/527,039에 개시되어 있고, 이들 각각은 본 명세서에 참조로서 편입된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, “면역반응의 증강”은 처치 전 동일한 객체와 비교하여 본 명세서에 기술된 바와 같이, 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분으로 처치된 객체의 CD14의 발현에서의 증가 또는 THP-1 세포에서 식세포 활성의 증가를 지칭한다.

용어 “감염”은 미생물 (예컨대, 박테리아, 진균 또는 바이러스)에 의한 숙주의 침입을 의미한다. 예를 들어, 상기 감염은 포유동물의 체내 또는 표면에 정상적으로 존재하는 미생물의 과도한 성장 또는 포유동물 내부 또는 표면에 정상적으로 존재하지 않는 미생물의 성장을 포함할 수 있다. 나아가, 감염은 미생물 개체군의 존재시 숙주 몸체에 손상을 주는 임의의 상태일 수 있다. 어떤 경우에는, 미생물 성장이 적당할 수 있지만, 그 손상은 그 미생물에 의한 다양한 독성 구성성분들의 생산에 의해 유발된다. 드문 경우에서, 미생물은 숙주의 외부에서 성장하고, 섭취되는 톡신을 생산하며, 그 손상은 전적으로 이러한 미생물 톡신의 활성의 결과이다. 따라서 미생물 개체군의 과도한 양이 객체의 체내 또는 표면에 존재할 경우, 또는 미생물 개체군의 존재가 상기 객체의 세포 또는 다른 조직을 손상시키고 있는 경우, 객체는 감염으로 “고통”을 겪는다.

본 명세서에서 사용된 “산화적으로 변형된 카로테노이드”는 6 내지 8 몰 당량(molar equivalents)의 산소 또는 다른 산화제에서 유래한 동일한 양의 산소와 반응되어, 그 결과 매우 낮은 분자량의 산화적 분해 산물 및 큰 비율의 중합체 물질 (예, 1,000 달톤 이상의 분자량을 갖는 산화적으로 변형된 카로테노이드의 성분)의 혼합물이 되는 카로테노이드를 지칭한다. 상기 결과의 반응은 약 100 내지 8,000 달톤 범위의 분자량을 갖는 분자종(molecular species)을 포함하는 혼합물을 생산한다. 상기 중합체 물질은 형성된 다양한 산화적 단편들의 많은 가능한 화학적 재조합에 의해 형성되는 것으로 여겨진다. 산화적으로 변형된 카로테노이드를 제조하는 방법들은 U.S. Patent No. 5,475,006 및 U.S. S.N. 08/527,039에 개시되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 참조로서 편입된다. 본 명세서에서 사용된, 용어 “OxBC”는 특별히 β-카로틴에서 유래된 산화적으로 변형된 카로테노이드를 지칭한다.

용어 “약학적 조성물”은 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분을 포함하는 조성물을 의미하고, 포유동물에서 질병의 치료 또는 예방에 대한 최적치료계획(therapeutic regimen)의 일환으로 (예컨대, GMP 규정에 따라 인간 투여용으로 적절하게 제조되는) 약제의 제조방법 및 판매를 규제하는 정부기관의 요건을 갖춘 방법으로 하나 이상의 약학적-등급의 부형제들과 제제화된다. 약학적 조성물은, 예를 들어, 유닛 투여량 형태 (예컨대, 타블렛, 캡슐, 캅셀, 젤캡 또는 시럽)로서 경구 투여용; 국소 투여용 (예컨대, 크림, 젤, 로션 또는 연고); 정맥내 투여용 (예컨대, 입자성 색전증이 없는 무균액 및 정맥내 사용에 적합한 용매 시스템); 본 명세서에 기술된 임의의 다른 제제로 제제화될 수 있다.

용어 “객체”는 인간, 개, 고양이, 말, 양, 돼지, 소, 가금류 및 어류를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 임의의 척추동물을 의미한다.

본 명세어에 사용된, 용어 “치료”는 예방 및/또는 치료 목적으로 약학적 조성물을 투여하는 것을 지칭한다. “질병을 예방한다”는 것은 아직 병들지 않았지만 특정 질병에 민감하거나 다른 상태로 위험성을 갖는 객체의 예방적 치료를 지칭한다. “질병을 치료한다” 또는 “치료적 처치”를 위한 사용은 객체의 상태를 개선 또는 안정화하기 위해 이미 질병으로 고통 받고 있는 객체에 처치를 실시하는 것을 지칭한다. 요컨대, 특허청구범위 및 구현예에서, 치료는 치료 또는 예방 중 하나의 목적으로 객체에 투여하는 것이다. 본 명세서에서 사용된, “위험성을 갖는”은 감염되기 쉬운 객체를 지칭한다. 객체는 예를 들어, (i) 약화된 면역 시스템을 갖거나 (ii) 미생물에 노출 (예컨대, 외과적 시술, 교사 또는 건강한 근로자와 같은 공중과의 지속적 접촉, 또는 발병된/감염된 환경에 노출에 의한 결과로서)에 의하여 감염되기 쉬운 상태일 수 있다.

2-메틸-6-옥소-2,4-헤파디에날의 합성 및 정제는 U.S.S.N. 08/527,039에 보고되어 있다. 2-메틸-6-옥소-2,4-헤파디에날의 조제를 위한 더욱 편리한 5단계 합성법은 2003년 5월 22일에 공개된 U.S.S.N. 10/196,695에서 제공된다.

본 발명의 조성물들 및 방법들은 감염에 대하여 객체의 선천성 및 적응성 면역 시스템을 감작시키는데 사용될 수 있다. 본 발명의 다른 특징 및 이점은 이하 발명의 상세한 설명, 도면 및 특허청구범위로부터 명확해질 것이다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 산화적으로 변형된 카로테노이드 및 그 성분의 투여를 위한 조성물들, 방법들 및 키트들을 제공한다. 상기 조성물들은 감염에 대하여 객체에 선천성 및 적응성 면역반응을 감작시키는데 사용될 수 있다.

치료법

본 발명은 감염에 대하여 객체의 선천성 및 적응성 면역 시스템을 감작시키는 방법을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 치료법은 단독 또는 다른 치료법 (예, 항생제 치료법과 조합으로)과 병행하여 실시될 수 있고 집, 개인병원, 임상, 병원 외래 병동, 또는 병원에서 제공될 수 있다. 치료 기간은 치료될 질병 또는 이상의 타입, 환자의 나이 및 상태, 환자 질병의 단계 및 타입, 및 환자가 치료에 어떻게 반응하는지에 따른다.

미생물 감염의 치료

본 발명의 방법들 및 조성물들은, 예를 들어, 기도 감염(respiratory tract infections), 급성 세균성 중이염(acute bacterial otitis media), 세균성 폐렴(bacterial pneumonia), 요로감염(urinary tract infections), 복합 감염(complicated infections), 신우신염(pyelonephritis), 복강내 감염(intra-abdominal infections), 세균성 패혈증(bacterial sepsis), 피부 및 피부구조 감염(skin and skin structure infections), 연조직 감염(soft tissue infections), 중추신경계 감염(central nervous system infections), 세균혈증(bacteremia), 상처 감염(wound infections), 복막염(peritonitis), 수막염(meningitis), 화상후 감염(infections after burn), 비뇨생식기관 감염(urogenital tract infections), 골반염 질환(pelvic inflammatory disease), 심내막염(endocarditis), 혈관내 감염(intravascular infections), 및 본 명세서에 개시된 임의의 다른 감염을 치료하는데 사용될 수 있다.

항원 면역원성의 증가

본 발명의 방법들 및 조성물들은 항원 (예, 면역화에 사용되는 애주번트로서)의 면역원성을 증가시키는데 사용될 수 있다. 객체가 면역화될 수 있는 질병들은 바이러스성 질병, 알러지성 증상(allergic manifestation), 박테리아 또는 점막 표면을 통해 침투하거나 서식하는 다른 병원체들에 의해 유발된 질병, AIDS, 전신 홍반성 루푸스(systemic Lupus Erythe-matosus)와 같은 자가면역질환 및 암과 같은, 면역화에 의해 치료 또는 예방될 수 있는 모든 질병들을 포함한다. 본 발명을 이용하여 치료 또는 예방될 수 있는 바이러스성 감염의 예들은 EBV 및 VZV와 같은 DNA 바이러스, 및 특히 헤르페스비리대(herpesviridae), 예들 들어, HSV 및 HCMV, 아데노비리대(adenoviridae), HPV와 같은 파포바비리대(papovaviridae), HBV와 같은 헤파드나비리데(hepadnaviridae), 피코르바비리대(picorvaviridae)와 같은 RNA 바이러스에 의한 감염, 특히 폴리바이러스 및 HAV, 리노바이러스(rhinoviruses) 및 FMDV, 토가비리대(togaviridae), 플라비비리대(flaviviridae), 코로나비리대(coronaviridae), RSV와 같은 파라믹소비리대(paramyxoviridae), 인플루엔자 바이러스와 같은 오르소미오비리대(orthomyoxoviridae), 및 레트로비리대(retroviridae), 특히 HIV에 의한 감염을 포함한다.

조합 치료법

The methods, kits, and compositions of the invention may also include an antibiotic. 본 발명의 방법들, 키트들 및 조성물들은 또한 항생제를 포함할 수 있다. 예들 들어, 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분은, 아미카신(amikacin), 아프라마이신(apramycin), 아르베카신(arbekacin), 밤베르마이신(bambermycins), 부티로신(butirosin), 디베카신(dibekacin), 디히드로스트렙토마이신(dihydrostreptomycin), 포르티마이신(fortimicin(s)), 프라디오마이신(fradiomycin), 젠타마이신(gentamicin), 이스파마이신(ispamicin), 카나마이신(kanamycin), 마이크로노마이신(micronomicin), 네오마이신(neomycin), 네오마이신 운데실레네이트(neomycin undecylenate), 네틸마이신(netilmicin), 파로모마이신(paromomycin), 리보스타마이신(ribostamycin), 시소마이신(sisomicin), 스펙티노마이신(spectinomycin), 스트렙토마이신(streptomycin), 스트렙토니코자이드(streptonicozid) 및 토브라마이신(tobramycin)와 같은 아미노글리코시드(aminoglycosides); 아지담페니콜(azidamfenicol), 클로람페니콜(chloramphenicol), 클로람페니콜 팔미레이트(chloramphenicol palmirate), 클로람페니콜 판토테네이트(chloramphenicol pantothenate), 플로르페니콜(florfenicol) 및 티암페니콜(thiamphenicol)과 같은 암페니콜(amphenicols); 리팜핀(rifampin), 피라부틴(rifabutin), 리파펜틴(rifapentine) 및 리팍시민(rifaximin)과 같은 안사마이신(ansamycins); 이미디노실린(amidinocillin), 암디노실린(amdinocillin), 피복실(pivoxil), 아목시실린(amoxicillin), 암피실린(ampicillin), 아스폭시실린(aspoxicillin), 아지도실린(azidocillin), 아즐로실린(azlocillin), 바캄피실린(bacampicillin), 벤질페니실린산(benzylpenicillinic acid), 벤질페니실린(benzylpenicillin), 카르베니실린(carbenicillin), 카르페실린(carfecillin), 카린다실린(carindacillin), 클로메토실린(clometocillin), 클록사실린(cloxacillin), 시클라실린(cyclacillin), 디클록사실린(dicloxacillin), 디페니실린(diphenicillin), 에피실린(epicillin), 펜베니실린(fenbenicillin), 플록시실린(floxicillin), 헤타실린(hetacillin), 레남피실린(lenampicillin), 메탐피실린(metampicillin), 메티실린(methicillin), 메즐로실린(mezlocillin), 나프실린(nafcillin), 옥사실린(oxacillin), 페나메실린(penamecillin), 페네타메이트 히드리오다이드(penethamate hydriodide), 페니실린 G 베네타민(penicillin G benethamine), 페니실린 G 벤자틴(penicillin G benzathine), 페니실린 G 벤즈히드릴아민(penicillin G benzhydrylamine), 페니실린 G 칼슘(penicillin G calcium), 페니실린 G 히드라가민(penicillin G hydragamine), 페니실린 G 칼륨(penicillin G potassium), 페니실린 G 프로카인(penicillin G, procaine), 페니실린 N, 페니실린 O, 페니실린 V, 페니실린 V 벤자틴, 페니실린 V 히드라바민, 페니메피시클린(penimepicycline), 페네티실린(phenethicillin), 피페라실린(piperacillin), 피바피실린(pivapicillin), 프로피실린(propicillin), 퀴나실린(quinacillin), 설베니실린(sulbenicillin), 탈람피실린(talampicillin), 테모실린(temocillin) 및 티카르실린(ticarcillin)과 같은 β-락탐(β-Lactams); 이미페넴(imipenem)과 같은 카르바페넴(carbapenems); 1-카바(데티아) 세팔로스포린(1-carba (dethia) cephalosporin), 세팍터(cefactor), 세파드록실(cefadroxil), 세파만돌(cefamandole), 세파트리진(cefatrizine), 세파제돈(cefazedone), 세파졸린(cefazolin), 세픽심(cefixime), 세프메녹심(cefmenoxime), 세포디짐(cefodizime), 세포니시드(cefonicid), 세포페라존(cefoperazone), 세포라니드(ceforanide), 세포탁심(cefotaxime), 세포티암(cefotiam), 세프피미졸(cefpimizole), 세프피리미드(cefpirimide), 세프포독심 프록세틸(cefpodoxime proxetil), 세프록사딘(cefroxadine), 세프설도딘(cefsulodin), 세프타지딤(ceftazidime), 세프테람(cefteram), 세프테졸(ceftezole), 세프티부텐(ceftibuten), 세프티족심(ceftizoxime), 세프트리악손(ceftriaxone), 세푸록심(cefuroxime), 세푸조남(cefuzonam), 세파세트릴 나트륨(cephacetrile sodium), 세팔렉신(cephalexin), 세팔로글리신(cephaloglycin), 세팔로리딘(cephaloridine), 세팔로스로린(cephalosporin), 세팔로틴(cephalothin), 세파피린 나트륨(cephapirin sodium), 세프라딘(cephradine), 피브세팔렌신(pivcefalexin), 세팔로틴(cephalothin), 세파클로르(cefaclor), 세포테탄(cefotetan), 세프프로질(cefprozil), 로라카르베프(loracarbef), 세페타메트(cefetamet) 및 세페핌(cefepime)과 같은 세팔로스포린(cephalosporins); 세프부페라존(cefbuperazone), 세프메타졸(cefmetazole), 세프미녹스(cefminox), 세페탄(cefetan) 및 세폭시틴(cefoxitin)과 같은 세파마이신(cephamycins); 아즈트레오난(aztreonam), 카루모남(carumonam) 및 티게모난(tigemonan)과 같은 모노박탐(monobactams); 플로목세프(flomoxef) 및 목소락탐( moxolactam)과 같은 옥사페펨(oxacephems); 클린다마이신(clindamycin) 및 린코마이신(lincomycin)과 같은 린코사이드(lincosamides); 아지드로마이신(azithromycin), 카르보마이신(carbomycin), 클라리트로마이신(clarithromycin), 에리트로마이신(erythromycin(s)) 및 유도체, 조사마이신(josamycin), 류코마이신(leucomycins), 미데카마이신(midecamycins), 미오카마이신(miokamycin), 올레안도마이신(oleandomycin), 프리마이신(primycin), 로키타마이신(rokitamycin), 로사라미신(rosaramicin), 록시트로마이신(roxithromycin), 스피라마이신(spiramycin) 및 트로레안도마이신(troleandomycin)과 같은 마크로라이드(macrolides); 암포마이신(amphomycin), 바시트라신(bacitracin), 카프레오마이신(capreomycin), 콜리스틴(colistin), 엔듀라시딘(enduracidin), 에닐로마이신(enylomycin), 푸사푼진(fusafungine), 그라미시딘(gramicidin(s)), 그라미시딘 S, 미카마이신(mikamycin), 폴리믹신(polymyxin), 폴리믹신 β-메타네설포닌산(polymyxin .β- methanesulfonic acid), 프리스티나마이신(pristinamycin), 리스토세틴(ristocetin), 테이코플라닌(teicoplanin), 티오스트렙톤(thiostrepton), 튜베락티노마이신(tuberactinomycin), 티로시딘(tyrocidine), 티로트리신(tyrothricin), 반코마이신(vancomycin), 비오마이신(viomycin(s)), 버지니아마이신(virginiamycin) 및 징크 바시트라신(zinc bacitracin)과 같은 폴리펩티드(polypeptides); 스피사이클린(spicycline), 클로르테트라사이클린(chlortetracycline), 클로모사이클린(clomocycline), 디메클로사이클린(demeclocycline), 독시사이클린(doxycycline), 구아메사이클린(guamecycline), 리메사이클린(lymecycline), 메클로사이클린(meclocycline), 메타사이클린(methacycline), 미노사이클린(minocycline), 옥시테트라사이클린(oxytetracycline), 페니메피사이클린(penimepicycline), 피파사이클린(pipacycline), 롤리테트라사이클린(rolitetracycline), 산사이클린(sancycline), 세노시클린(senociclin) 및 테트라사이클린(tetracycline)과 같은 테트라사이클린(tetracyclines); 및 브로디모프림(brodimoprim), 테트록소프림(tetroxoprim) 및 트리메토프림(trimethoprim)과 같은 2,4-디아미노피리미딘(2,4-diaminopyrimidines); 푸랄타돈(furaltadone), 푸라졸리움(furazolium), 니푸라덴(nifuradene), 니푸라텔(nifuratel), 니푸르폴린(nifurfoline), 니푸르피리놀(nifurpirinol), 니푸르프라진(nifurprazine), 니푸르토이놀(nifurtoinol) 및 니트로푸란토인(nitrofurantoin)과 같은 니트로푸란(nitrofurans); 아미플록사신(amifloxacin), 시녹사신(cinoxacin), 시프로플록사신(ciprofloxacin), 디플록사신(difloxacin), 에녹사신(enoxacin), 플레록사신(fleroxacin), 플루메퀸(flumequine), 로메플록사신(lomefloxacin), 밀록사신(miloxacin), 날리딕스산(nalidixic acid), 노르플록사신(norfloxacin), 오플록사신(ofloxacin), 옥솔린산(oxolinic acid), 페르플록사신(perfloxacin), 피페미드산(pipemidic acid), 피로미드산(piromidic acid), 록소사신(rosoxacin), 테마플록사신(temafloxacin) 및 토수플록사신(tosufloxacin)과 같은 퀴놀론(quinolones); 아세틸 설파메톡시피라진(acetyl sulfamethoxypyrazine), 아세틸 설피속사졸(acetyl sulfisoxazole), 아조설파미드(azosulfamide), 벤질설파미드(benzylsulfamide), 클로라미드-β(chloramine-β), 클로라민-T(chloramine-T), 디클로라민-T(dichloramine-T), 포르모설파티아졸(formosulfathiazole), N2-포닐-설피소미딘(N2- fonnyl-sulfisomidine), N4-β-D-글루코실설파닐아미드(N4-β-D-glucosylsulfanilamide), 마페니드(mafenide), 4'-(메틸-설파모일)설파닐아닐라이드(4'-(methyl-sulfamoyl)sulfanilanilide), p-니트로설파티아졸(p-nitrosulfathiazole), 노프릴설파미드(noprylsulfamide), 프탈리설파세타미트(phthalylsulfacetamide), 프탈리설파티아졸(phthalylsulfathiazole), 살라조설파디미딘(salazosulfadimidine), 숙시닐설파디아졸(succinylsulfathiazole), 설파벤자미드(sulfabenzamide), 설파세타미드(sulfacetamide), 설파클로르피리다진(sulfachlorpyridazine), 설파크리소이딘(sulfachrysoidine), 설파시틴(sulfacytine), 설파디아진(sulfadiazine), 설파디크라미드(sulfadicramide), 설파디메톡신(sulfadimethoxine), 설파독신(sulfadoxine), 설파에티돌(sulfaethidole), 설파구아니딘(sulfaguanidine), 설파구아놀(sulfaguanol), 설파렌(sulfalene), 설팔록스산(sulfaloxic acid), 설파메라진(sulfamerazine), 설파메테르(sulfameter), 설파메타진(sulfamethazine), 설파메티졸(sulfamethizole), 설파메토미딘(sulfamethomidine), 설파메톡사졸(sulfamethoxazole), 설파메톡시피리다진(sulfamethoxypyridazine), 설파메트롤(sulfametrole), 설파미도크리소이딘(sulfamidochrysoidine), 설파목솔(sulfamoxole), 설파닐아미드(sulfanilamide), 설파닐아미도메타네설폰산 트리에탄올아민 염(sulfanilamidomethanesulfonic acid triethanolamine salt), 4-설파닐아미도살리시클산(4-sulfanilamidosalicyclic acid), N4-설파닐릴설파닐아미드(N4-sulfanilylsulfanilamide), 설파닐릴우레아(sulfanilylurea), N-설파닐릴-3,4-자일라미드(N-sulfanilyl-3,4-xylamide), 설파니트란(sulfanitran), 설파페린(sulfaperine), 설파페나졸(sulfaphenazole), 설파프록시린(sulfaproxyline), 설파피라진(sulfapyrazine), 설파피리딘(sulfapyridine), 설파소미졸(sulfasomizole), 설파시마진(sulfasymazine), 설파티아졸(sulfathiazole), 설파티오우레아(sulfathiourea), 설파톨아미드(sulfatolamide), 설피소미딘(sulfisomidine) 및 설피속사졸(sulfisoxazole)과 같은 설폰아미드(sulfonamides); 아세댑손(acedapsone), 아세디아설폰(acediasulfone), 아세토설폰(acetosulfone), 댑손(dapsone), 디아티모설폰(diathymosulfone), 글루코설폰(glucosulfone), 솔라설폰(solasulfone), 숙시설폰(succisulfone), 설파닐산(sulfanilic acid), p-설파닐릴벤질아민(p-sulfanilylbenzylamine), p,p'-설포닐디아닐린-N,N'디갈락토시드(p,p'-sulfonyldianiline- N,N'digalactoside), 설폭손(sulfoxone) 및 티아졸설폰(thiazolsulfone)과 같은 설폰(sulfones); 댑토마이신(daptomycin)과 같은 리포펩티드(lipopeptides); 리네졸리드(linezolid)와 같은 옥사졸리돈(oxazolidones); 텔리트로마이신(telithromycin)과 같은 케톨라이드(ketolides); 및 클로폭톨(clofoctol), 헥세딘(hexedine), 마가이닌(magainins), 메테나민(methenamine), 메테나민 언히드로메틸렌-시트레이트(methenamine anhydromethylene-citrate), 메테나민 히푸레이트(methenamine hippurate), 메테나민 만델레이트(methenamine mandelate), 메테나민 서브살리실레이트(methenamine subsalicylate), 니트록솔린(nitroxoline), 스쿠알라민(squalamine), 지보몰(xibomol), 시클로세린(cycloserine), 뮤피로신(mupirocin) 및 튜베린(tuberin)과 같은 다양한 항생제에서 선택된 항생제와 함께 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 항생제 치료법과 조합으로, 상기 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분의 사용은, 바람직하게는 미생물의 내성 균주에 대한 항생제의 효능을 증강시켜, 항생제와 함께 처리 시 미생물의 내성 균주 형성의 가능성을 감소시키고 및/또는 항생제 축적을 감소시킬 수 있다. 이는 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분으로 미생물에 대한 숙주 면역반응을 증강시킴으로써 달성될 수 있다.

투여 및 제제화

본 발명은 감염에 대하여 객체의 선천성 및 적응성 면역 시스템을 감작시키기 위한 조성물들, 키트들 및 방법들을 특징으로 한다. 산화적으로 변형된 카로테노이드에 있어서, 국소적 투여 범위는 1일당 체중의 약 5 μg/kg에서 약 50 mg/kg까지이다. 바람직하게는, 체중의 5 μg/kg 내지 5 mg/kg, 또는 체중의 5 μg/kg 내지 0.5 mg/kg 사이의 투여량이 투여된다. 산화적으로 변형된 카로테노이드의 성분에 있어서, 국소적 투여 범위는 1일당 체중의 약 0.05 μg/kg에서 약 500 μg/kg까지이다. 바람직하게는, 체중의 0.05 μg/kg 내지 50 μg/kg, 또는 체중의 0.05 μg/kg 내지 5 μg/kg 사이의 투여량이 투여된다. 투여되는 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분의 1회 용량(dosage)은 동물의 종(species), 식이 및 나이와 같은 변수에 따른다. 실시예 1에 개시된 바와 같이, 표준 시험(standard trials)은 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분의 투여량 및 투여 횟수를 최적화하는데 사용될 수 있다.

산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분은, 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제와 인간, 가정내 애완동물, 가축 또는 다른 동물들에 투여될 수 있다. 투여는 국소적(topical), 비경구적(parenteral), 정맥내(intravenous), 동맥내(intra-arterial), 피하(subcutaneous), 근육내(intramuscular), 두 개강내(intracranial), 안와내(intraorbital), 안구내(ocular), 뇌실내(intraventricular), 관절낭내(intracapsular), 척수내(intraspinal), 시스터널내(intracisternal), 복강내(intraperitoneal), 비강내(intranasal), 에어로졸(aerosol), 좌약(suppositories), 또는 경구 투여일 수 있다. 특정 제제화에서, 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분은 유닛 투여량 형태로 제공될 수 있다.

치료적 제제는 액상 또는 현탁액의 형태일 수 있고; 경구 투여용으로서, 제제는 타블렛 또는 캡슐의 형태일 수 있으며; 비강내 투여용으로서, 파우더, 점비액, 점이제 또는 에어로졸의 형태일 수 있다.

제제를 제조하기 위한 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려진 방법들은, 예를 들어, "Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (20th ed., ed. A.R. Gennaro, 2000, Lippincott Williams & Wilkins)에서 개시되어 있다. 비경구적 투여용 제제는, 예를 들어, 부형제, 무균수 또는 생리식염수, 폴리에틸렌글리콜과 같은 폴리알킬렌글리콜, 식물성 오일 또는 경화된 나프탈렌(hydrogenated napthalenes)을 포함할 수 있다. 생체적합성, 생분해성 락티드 중합체(lactide polymer), 락티드/글리코리드 공중합체(lactide/glycolide copolymer), 또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체(polyoxyethylene-polyoxypropylene copolymers)가 상기 화합물의 방출을 조절하는데 사용될 수 있다. 나노입자화 제제 (예컨대, 생분해성 나노입자, 고형 지질 나노입자, 리포솜)는 상기 화합물의 생체분포(biodistribution)를 조절하는데 사용될 수 있다. 다른 잠재적으로 유용한 비경구적 전달시스템은 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체 입자(ethylene-vinyl acetate copolymer particles), 삼투압 펌프(osmotic pumps), 삽입융합시스템(implantable infusion systems) 및 리포솜을 포함할 수 있다. 흡입용 제제는 부형제, 예를 들어, 락토오스를 포함하거나, 수용액, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르(polyoxyethylene-9-lauryl ether), 글리콜레이트(glycholate) 및 데옥시콜레이트(deoxycholate)일 수 있거나, 점비액 또는 젤 형태의 투여용 유성 용액(oily solutions)일 수 있다. 상기 제제에서 상기 화합물의 농도는 투여되는 약제의 투여량 및 투여 경로를 포함하여 여러 인자들에 따라 달라질 것이다.

방출 조절된 제제에서 화합물의 투여가 유용한데, 이때 처방 I의 화합물은 (i) 좁은 치료 지수(therapeutic index)(예컨대, 해로운 부작용 또는 독성 반응을 초래하는 혈장 농도와 치료적 효과를 유도하는 혈장 농도 사이의 차이가 작다; 일반적으로, 치료 지수, TI는 평균유효량(median effective dose, ED50)에 대한 반수치사량(median lethal dose, LD50)의 비율로서 정의된다); (ii) 위장관에서 좁은 흡수창(absorption window); 또는 (iii) 짧은 생물학적 반감기를 가지기 때문에, 하루에 자주 투여하는 것이 치료적 수준의 혈장 농도를 유지하는데 필요하다.

많은 전략들이 상기 방출의 속도가 치료적 화합물의 물질대사의 속도를 능가하는 조절된 방출을 얻기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, 조절된 방출은 제제화 파라미터 및, 예컨대 적절한 조절된 방출 조성물 및 코팅물질을 포함하는 성분들의 적절한 선택에 의해 얻을 수 있다. 예들은 딘일 또는 복수의 유닛 타블렛 또는 캡슐 조성물, 유제, 현탁액, 에멀젼, 마이크로캡슐, 마이크로스피어, 나노입자, 패치 및 리포솜을 포함한다.

경구용 제제는 비-독성의 약학적으로 허용가능한 부형제와 혼합된 활성성분을 포함하는 타블렛을 포함한다. 이러한 부형제들은, 예를 들어, 삽입 희석제 또는 필러 (예컨대, 수크로오스 및 솔비톨), 윤활제, 활택제 및 항접착제 (예컨대, 마그네슘 스테아레이트, 징크 스테아레이트, 스테아르산, 실리카, 경화된 식물성 오일 또는 탈크)일 수 있다.

경구용 제제는 또한 저작성 타블렛, 타블렛, 캐플렛, 캡슐 (예, 딱딱한 젤라틴 캡슐로서 상기 활성성분은 삽입 고형 희석제와 혼합되고, 소프트 젤라틴 캡슐로서 상기 활성성분은 물 또는 오일 매질과 혼합된다)로서 유닛 용량 형태로 제공될 수 있다.

산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분은 2003년 5월 22일에 공개된 U.S.S.N. 10/196,695에 개시된 바와 같이 약학적으로 혀용가능한 희석제, 담체 또는 부형제와 함께 제형화될 수 있다.

경구 위생 제제

산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분은, 일반적인 경구 위생에 유용하고, 특히 플라크, 치은염 및 구취를 유발하는 미생물을 사멸시키기 위한 구강세정제 또는 치약으로 제제화될 수 있다. 상기 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분은, 0.0001 내지 1 w/w %, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 0.1 w/w %일 수 있다.

본 발명의 구강세정제는 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분과 기존의 구강세정제와 조합하여 용이하게 제조될 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 구강세정제는 물, 플루오르화물, 향료, 알코올, 과산화수소, 티몰, 유칼리프톨, 헥세티딘, 메틸 살리실레이트, 멘톨, 클로르헥시딘 글루코네이트, 벤잘코늄 클로라이드, 세틸피리디늄 클로라이드, 메틸파라벤, 과산화수소, 도미펜 브로마이드, 효소, 칼슘, 아연, 및/또는 감미료 (예, 솔비톨, 수크랄로스 또는 사카린 나트륨)를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 치약은 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분과 기존의 치약과 조합하여 용이하게 제조될 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 치약은 플루오르화물 (예, 플루오르화나트륨 또는 모노플루오로인산 나트륨), 재광화제(remineralizing agent) (예, 히드록시아파타이트(hydroxyapatite), 무정형 인산칼슘(amorphous calcium phosphate), 탄산칼슘), 기포제 (예, 로릴황산나트륨), 탄산나트륨, 효소, 비타민, 허브, 칼슘, 칼슘 소듐 포스포실리케이트(calcium sodium phosphosilicate), 과산화수소, 항균제 (트리클로산, 염화아연), 증점제 (예, 글리세린), 및/또는 항료 (예, 스피어민트, 페퍼민트, 레귤러민트 등)를 더 포함할 수 있다.

안과용 제제

본 발명의 안과용 약학적 조성물은 기존 안과용 제제에 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분을 첨가하여 제조될 수 있다. 선택적으로 상기 안과용 약학적 조성물은 버퍼, 계면활성제, 안정화제, 보존제, 안과용 습윤제 및/또는 안과용 희석제를 포함한다. 안과용 용액에 통상적으로 사용되는 습윤제는 카복시메틸셀룰로오스(carboxymethylcellulose), 히드록시피로필 메틸셀룰로오스(hydroxypropyl methylcellulose), 글리세린, 만니톨, 폴리비닐 알코올 또는 히드록시에틸셀룰로오스(hydroxyethylcellulose)를 포함하고 상기 희석제는 물, 증류수, 무균수 또는 인공눈물일 수 있으며, 상기 습윤제는 약 0.001% 내지 10% 양으로 존재한다. 상기 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분은, 0.0001 내지 1 w/w %, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 0.1 w/w %일 수 있다. 상기 안과용 조성물은, 예를 들어, 결막염, 각막찰과상(corneal abrasion), 전염성 각막궤양(ulcerative infectious keratitis), 상피성 각막염(epithelial keratitis), 스트로마 각막염(stromal keratitis) 또는 헤르페스바이러스-관련 각막염을 초래하는 눈의 감염 (예, 박테리아, 바이러스, 진균 또는 아메바, 또는 기생충)의 치료에 사용될 수 있다.

안과용 액제 및 안과용 연고제의 예들은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 잘 알려진 다수의 널리 사용되는 방법들을 이용하여 이러한 조제에 따라 제제화될 수 있다. 안과용 액제의 경우에는, 예를 들어, 증류수, 수성 염기(aqueous base) 또는 임의의 다른 허용가능한 염기; 염화나트륨 및 농축 글리세롤과 같은 등장화제; 인산나트륨 및 아세트산나트륨과 같은 버퍼; 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노올레이트(polyoxyethylene sorbitan monooleate), 스테아릭 폴리옥실 40(stearic polyoxyl 40) 및 폴리옥시에틸렌 경화피마자유(polyoxyethylene hydrogenated castor oil)와 같은 계면활성제; 구연산나트륨 및 소듐 에데테이트(sodium edetate)와 같은 안정화제; 벤잘코늄 클로라이드(benzalkonium chloride), 티메로살(thimerosal), 클로로부탄올(chlorobutanol), 염화나트륨, 붕산(boric acid), 파라히드록시벤조산 에스테르(parahydroxybenzoic acid esters) (솔베이트, 벤조아테, 프로피오네이트), 클로로부탄올, 벤질 알코올, 머큐리얼(mercurials), 파라벤(paraben)과 같은 보존제; 등, 그리고 필요하다면 이들의 혼합물을 이용하여 제조될 수 있다. 벤잘코늄 클로라이드 및 티메르살이 보존제로 바람직하다.

상기 안과용 제제는 pH를 조정하기 위해 산과 염기; 솔비톨, 글리세린 및 덱스트로스와 같은 등장화 부여제; 소듐 카복시메틸셀룰로오스(sodium carboxymethylcellulose), 마이크로크리스탈린 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리비닐 알코올 및 다른 검(gums)과 같은 다른 점도 부여제; 계면활성제, 담즙산(bile acids)과 같은 적절한 흡수 증강제; 항산화제, 유사 중아황산염 및 아스코르브산염과 같은 안정화제; 소듐 에데테이트와 같은 금속 킬레이트제; 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 약제 용해도 증강제를 포함하는 것으로 변경될 수 있다. 이러한 추가적인 성분들은 적당한 안정성을 갖는 통상적인 액제를 만드는데 도움이 되기 때문에 수요가 있는 즉시 합성할 필요가 없다.

본 발명의 안과용 제제는 무균 수성 담체(sterile aqueous carrier), 고약(salve) 또는 연고(ointment)일 수 있다. 고약 및 연고는 전형적으로 무균의 약학적으로 허용가능한 고약 또는 연고 기재에 용해 또는 현탁된, 산화적으로 변형된 카로테노이드 또는 그 성분을 포함한다. 고약 또는 연고 조성물에서, 무수 라놀린(anhydrous lanolin)도 상기 제제에 포함될 수 있다. 티메로살 또는 클로로부탄올은 항미생물제로서 상기 제제에 첨가될 수 있다.

이하 실시예들은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 본 명세서에서 청구되는 방법들 및 조성물들을 어떻게 실시하고, 제조하고, 평가하는지에 관한 완벽한 상세한 설명을 제공하기 위하여 개시되며, 본 발명을 순수하게 예시하기 위한 것으로 본 발명의 범위를 이에 제한하지는 않는다.

도 1은 OxBC로 처리하기 전 LPS로 배양시킨 일차 말초 혈액 단핵구(PBM)에서 TNF(A), IL-1β(B) 및 IL-6(C) 수준을 나타낸 그래프이다. 일차 PBM은 지시된 농도의 OxBC로 처리하기 전 LPS(15 ng/ml)로 24 시간 동안 배양하였다. 24 시간 후, CM을 수확하고, TNF(A), IL-1β(B) 및 IL-6(C) 수준을 ELISA로 관찰하였다(*p<0.05, **p<0.02, Students t-test). 염증성 사이토카인 IL-1β의 발현이 증가된 것은 미생물 감염에 대한 반응을 증강시키는 OxBC의 능력을 의미하며, 정제시킨 인간 단핵구를 OxBC 처리에 반응하는 LPS에 노출시켰다.
도 2는 OxBC로 처리하기 전 LPS로 배양시킨 일차 PBM에서 IL-8(A) 및 IL-12(B) 수준을 나타낸 그래프이다. 일차 PBM은 지시된 농도의 OxBC로 처리하기 전 LPS(15 ng/ml)로 24 시간 동안 배양하였다. 24 시간 후, CM을 수확하고, IL-8(A) 및 IL-12(B) 수준을 ELISA로 관찰하였다(*p<0.05, **p<0.02, Students t-test). 조절 사이토카인 IL-8의 발현은 LPS 처리 후 OxBC로 노출시킨 인간 단핵구에서 증가되었으며, 이는 OxBC가 향균 활성을 증가시키는 능력을 가짐을 의미한다.
도 3은 OxBC-처리된 THP-1 세포에서 CD14 발현을 나타낸 그래프이다. THP-1 단핵구를 지시된 농도의 OxBC 또는 DMSO 대조군으로 배양하였다. FACS 분석은 24 시간 동안 사후-처리 후 수행하였다. 측정 값은 DMSO와 비교하여 배수 변화로 나타내었다. 포볼 미리스테이트 아세테이트(PMA)는 25 ng/ml(*p<0.001, DMSO 대조군 대비 Student's t-test)를 사용하였다. OxBC는 미생물 성분에 결합하고, 감염에 대한 선천성 면역 반응을 일으키는 수용체인 CD14의 발현을 촉진한다.
도 4는 OxBC-처리된 THP-1 세포에서 CD40L 및 CD86 발현을 나타낸 그래프이다. THP-1 단핵구를 지시된 농도의 OxBC 또는 DMSO 대조군으로 배양하였다. FACS 분석은 24 시간 동안 사후-처리 후 수행하였다. 측정 값은 DMSO와 비교하여 배수 변화로 나타내었다. 포볼 미리스테이트 아세테이트(PMA)는 25 ng/ml(*p<0.001, DMSO 대조군 대비 Student's t-test)를 사용하였다. OxBC는 항원 제시 및 림프구 반응의 자극에 관련된 표면 수용체의 발현을 증가시키므로, 따라서 면역 유도에 반응하는 단핵구의 활성을 증가시킨다.
도 5는 OxBC 처리 후 LPS 처리한 THP-1 세포에서 분화 항원 발현을 나타낸 그래프이다. THP-1 단핵구를 지시된 농도의 OxBC 또는 DMSO 대조군으로 24 시간 동안 배양한 후, 5 일 후 15 ng/ml의 LPS로 처리하였다. 측정 값은 OxBC로 처리하지 않은 대조군과 비교하여 배수 변화로 나타내었다(*p<0.02, 처리하지 않은 대조군 대비 Student's t-test). LPS 처리 전 낮은 농도의 OxBC로의 단핵구의 처리는 선천성 면역에 관여하는 수용체의 발현에 대해 상당한 영향을 미치지 않는다.
도 6은 OxBC 처리 후 LPS 처리한 THP-1 세포에서 보조 자극 분자 발현을 나타낸 그래프이다. THP-1 단핵구를 지시된 농도의 OxBC 또는 DMSO 대조군으로 24 시간 동안 배양한 후, 5 일 후 15 ng/ml의 LPS로 처리하였다. 측정 값은 OxBC로 처리하지 않은 대조군과 비교하여 배수 변화로 나타내었다(*p<0.05, **p<0.005, ***p<0.001, 처리하지 않은 대조군 대비 Student's t-test). 낮은 농도의 OxBC 처리는 미생물에 대한 적응성 반응 유도에 참여하는 단핵구의 능력을 증강시키는 경향이 있다.
도 7은 OxBC로 처리한 THP-1 세포에서 식균 작용을 나타낸 그래프이다. THP-1 단핵구를 지시된 농도의 OxBC 또는 DMSO 대조군으로 24 시간 동안 배양하였으며, 이후 재생시키기 위해 24 시간 동안 배지로만 허락하였다. 식균 작용은 재생 시간 후 평가하였다. 측정 값은 대조군과 비교하여 배수 변화로 나타내었다. PMA는 25 ng/ml 사용하였다. *p<0.05, **p<0.02, ***p<0.002, 대조군 대비 Student's t-test. OxBC는 THP-1 세포에서 탐식 활성을 상당히 증가시키며, 이는 향균 활성을 증가시킴을 의미한다.
도 8은 OxBC를 처리하고, LPS로 자극시킨 THP-1 세포에서 식균 작용을 나타낸 그래프이다. THP-1 단핵구를 LPS(15 ng/ml)로 처리하기 전 지시된 농도의 OxBC 또는 DMSO 대조군으로 24 시간 동안 배양하였다. 식균 작용은 LPS 자극 24 시간 후 평가하였다. 측정 값은 대조군과 비교하여 배수 변화로 나타내었다. PMA는 25 ng/ml 사용하였다. *p<0.05, **p<0.02, ***p<0.002, 대조군 대비 Student's t-test. OxBC로 처리된 THP-1 세포는 처리하지 않은 대조군과 비교하여 LPS 처리 후 탐식 활성을 보다 크게 증가시킨다.
도 9는 OxBC를 처리하고, LPS로 자극시킨 일차 PBM에서 식균 작용을 나타낸 그래프이다. 일차 PBM을 LPS(15 ng/ml)로 처리하기 전 지시된 농도의 OxBC 또는 DMSO 대조군으로 24 시간 동안 배양하였다. 식균 작용은 LPS 자극 24 시간 후 평가하였다. 측정 값은 대조군과 비교하여 배수 변화로 나타내었다. *p<0.05, ***p<0.002, 대조군 대비 Student's t-test. 일차 인간 단핵구는 LPS 처리에 반응하는 그들의 탐식 활성을 증가시킴으로써 OxBC 처리에 반응한다.

실시예 1. 산화적으로 변형된 카로테노이드(OxBC) 보충한 후, 단핵구 사이토카인(monocyte cytokine) 프로파일의 평가.

하기 결과들은 OxBC가 단핵구 식세포(mononuclear phagocyte)에서 사이토카인 반응을 활성화함을 증명한다. 산화적으로 변형된 카로테노이드는 세포가 병원체 침입과 같은 공격(challenge)에 대해 반응하고, 공격받은 세포에서 향균(antimicrobial) 활성을 증가시키도록 개시(prime)하는 능력을 갖는다.

비특이적 면역의 주요 성분인 염증(inflammation)은 손상된 조직을 수리하고, 감염, 독성 또는 알레르기성 약물에 대항하여 방어하는 인체에 의해 일차 생리적 과정을 형성하는 이벤트들의 복합된 결과이다. 염증성(pro-inflammatory) 반응의 유도 및 증식을 조절하는 정확한 메커니즘들은 대부분 불명확하게 남아있지만, 고유 면역 세포들로부터 방출된 케모카인(chemokine) 및 가용성 매개체(soluble mediator)는 대표적인 일차 매개체이다. 수 많은 연구들은 β-카로틴과 같은 미량 영양소(micronutrient)들이 사이토카인 및 다른 염증성 매개체들의 생성을 활성화시킴으로서 외현적(overt) 염증성의 반응에 대한 그들의 기여(contribution)를 포함하는 다양한 대식세포 기능에 상당한 영향을 미칠 수 있음을 보여준다. 따라서, 본 발명자들은 인간의 단핵구 및 림프구에 의한 염증성(종양 괴사 인자(TNF)-α, 인터루킨(IL)-lβ, IL-6 및 인터페론(IFN)-γ) 및 면역조절(IL- 12, IL-8 및 단핵구 화학유인단백(MCP)-I) 사이토카인의 생성에 대한 OxBC의 효과를 평가하였다.

방법:

화합물 준비:

OxBC는 β-카로틴으로부터 준비하였으며(U.S. Patent No. 5,475,006 참조), 사용하기 전에 -20 ℃에서 보관하였다. 스톡 솔루션(동일한 카로틴의 50 mM)은 26.85mg OxBC를 DMSO에 용해시킴으로서 준비하였으며, -80 ℃에서 500 μl 분량씩 저장하였다. 사용할 OxBC 200 μM 용액은 적절한 배양 배지에 희석시켜 준비하였으며, 여과(0.22 μm pore size)하여 살균하였다. 실험 및 대조군 시료에서 테스트된 동일한 양의 OxBC와 혼합된 DMSO의 양은 표 1에 나타내었다. 동일한 양의 DMSO 부형제는 대조군으로 사용하였다.

표 1: OxBC의 농도 및 혼합된 DMSO 값

세포 주

인간 THP-1 단핵구모양 세포(급성 단핵구 백혈병)는 American Type Tissue Collection(#TIB-202)으로부터 얻었다. 세포는 2mM L-글루타민, 10mM HEPES, 1.0mM 피루브산 나트륨, 10% 소 태아혈청 및 항생제가 포함된 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. 말초 혈액 단백구(PBM) 및 림프구(PBL)는 Miltenyi Biotec MACs의 자성 분리 시스템을 이용하여 각각 양성 및 음성 선택을 PBMC로부터 분리하였다. PBM은 2mM L-글루타민, 10mM HEPES, 1.0mM 피루브산 나트륨, 20% 소 태아혈청 및 항생제가 포함된 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. PBL은 10% 소 태아혈청을 사용한 것을 제외하고는 동일한 배지에 접종하였다. 특정 세포 밀도 및 실험 조건은 하기에 설명하였다.

실험 조건

세포는 순수 처리(naive challenge) 및 LPS 처리(LPS challenge) 모델로 평가하였다. 순수(naive) 연구를 위해, 세포를 시간 프레임 변화에 따라 OxBC에 직접적으로 노출시켰으며, 배양 배지(CM)에서의 사이토카인 발현을 ELISA로 평가하였다. LPS 처리를 위해, 세포를 지정된 시간에 OxBC와 초기 배양하였으며, OxBC를 제거할 때 화합물이 결핍된 신선한 배지로 교체하였다. 서로 다른 시점(time point)에서 사후 처리는, CM에서 사이토카인 수준을 ELISA로 평가하기 전 세포에 LPS(15 ng/ml)를 24시간 동안 처리하였다. LPS 처리 시나리오(scenario)의 변화는, 일차 PBM을 24 시간 동안 LPS로 초기 처리한 것이다. 상기 초기 자극 후, LPS-처리된 세포는 ELISA 분석을 위해 CM을 수확하기 전에 24 시간 동안 OxBC에 노출시켰다.

효소-결합 면역흡착 검사법(ELISA)

CM 내의 사이토카인 수준 분석은 엔도젠 인간 ELISA 키트(Pierce)를 이용하여 제조사의 지시서에 따라 수행하였다. CM은 세포 파면을 제거하기 위해 원심분리하여 준비하였으며, 사이토카인의 수준이 각각의 분석에서 선형 범위로 떨어지는 것을 확인하기 위해 Nanosep 3K centrifugal concentrators (Pall)을 이용하여 농축시키고 완전 배지(complete medium)로 희석시켜 순수하게(neat) 사용하였다. 적절한 경우, 시료를 -80℃에 저장하고, 사용하기 전에 상온에서 평행상태(equilibration)로 점진적으로 해동하였다. 간략히 말하면, 중요한 사이토카인에 특이적인 항체를 흡착시키기 위해 50 μl 시료를 마이크로플레이트 각각의 웰(well)에 첨가하고, 1-3 시간 동안 상온에서 배양하였다. 비특이적으로 결합한 물질을 제거하기 위해 상기 플레이트를 세 번 세척하고, 중요 사이토카인에 특이적인 바이오틴이 부착된 항체와 1-3 시간 동안 추가 배양하였다. 세척 후, 플레이트를 스텝타비딘-양고추냉이 퍼록시다아제(steptavidin-horse radish peroxidase) 시약으로 30 분 동안 배양한 다음, 추가적으로 세척하였다. 세척된 플레이트를 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 기질로 30 분 동안 배양하여 반응을 정지시키고, 450 nm(550 nm 참조)에서 흡광도를 측정하였다. 참조 곡선(Reference curve)은 제공된 재조합 표준을 이용하여 각각의 사이토카인에 대해 생성시켰다.

결과 및 고찰

일차 원리 증명(proof-of-principl) 연구는 THP-1 세포를 OxBC, PMA(25 ng/ml) 및 부형제(DMSO)로 24 시간 동안 처리 또는 미처리(mock)하여 수행하였다. OxBC의 직접적인 자극은 염증성의 사이토카인 수준을 인지할 수 있는 효과가 없으나(표 2 참고), 조절 사이토카인 MCP-1 및 IL-8의 적당한 증가는 탐지가능하다. 상기 연구는 덜 풍부한 사이토카인의 탐지를 증가시키려는 시도로 시료의 농도 및 넓은 범위의 OxBC 농도(2.5, 7.5 및 12.5 μM)를 포함하도록 확대하였다. 12.5 μM의 OxBC는, MCP-1(58.1±8.8%) 및 IL-8(42.1±1.0%) 발현의 증가를 유도하는 것으로 관찰되었으나, 다른 사이토카인의 수준에는 그렇지 않았다. 게다가, 화합물의 낮은 농도에서는 MCP-1 및 IL-8 발현에 변화가 없음이 탐지되었다. 사이토카인으로써 MCP-1 및 IL-8 기능은 감염 또는 상처 부위에 면역 세포를 보충시키는 것이다. 예컨대, IL-8은 주로 염증성의 반응 내에서 호중구(neutrophil)를 보충시키며, 또한 호중구 동원 인자(NRF)라고도 불린다. 반면 MCP-1은 주로 다른 단핵구를 보충시키는 기능을 한다. 단핵구/대식세포에 의한 사이토카인의 발현은 침입된 병원체의 항원 또는 식균 작용 탐지에 반응하여 유도된다.

표 2: 원리 증명 사이토카인 방출 분석

표 3: OxBC 처리 후 사이토카인 프로파일

순수 단핵구모양 세포를 처리할 때, OxBC는 염증성의 사이토카인 발현에 대해 한정된 효과를 나타낸다. 본 발명자들은 다음으로 염증성 자극 즉, 리포폴리사카라이드(LPS)에 대한 단핵구 반응을 변형시키는 화합물의 능력을 평가하였다. 상기 능력을 평가하기 위해, THP-1 세포에서 이차 원리 증명(proof-of-principle) 연구를 수행하였으며, 상기 세포를 OxBC(0.1, 0.5, 1.0 μM)로 24 시간 동안 전처리하여 5 일 동안 배양한 후, TNF 발현을 ELISA로 측정하기 전에 LPS로 24 시간 동안 추가 자극을 주었다. 낮은 농도의 OxBC는 숙주 내에서 더 면밀한 유효성(availability) 모델을 위해 선택하였으며, 반면 TNF는 원형 염증성 사이토카인(prototypical proinflammatory cytokine)으로써 선택하였다. 표 4에 나타낸 것과 같이, OxBC로 전처리하고 LPS 처리 후 TNF 발현은 평가된 모든 농도에서 약 25 % 까지 상향 조절되었다. 상기 연구는 그 후에 유사한 프라임 및 처리 모델을 이용하여 다른 염증성 사이토카인에 대해서도 확대시켰다. 세포를 0.1 또는 0.5 μM의 OxBC (표 5 참조)로 처리한 경우, IL-6 및 IL-1β는 발현이 증가되었으나 IFNγ는 그렇지 않았다. 중요한 것은 1.0 μM의 화합물에서는 사이토카인 발현에 아무런 변화가 없음이 관찰되었다. IL-6은 급성 단계의 열병 반응의 가장 중요한 매개체 중 하나이다; 그러나 상기 사이토카인은 또한 미생물의 저항을 유지하기 위해 요구된다. TNF 및 IL-1β는 선천성 면역 및 염증성 반응에서 중추 다면발현 사이토카인(pivotal pleiotropic cytokine)이며, 식세포 및 림프구의 기능을 조절한다. 유사하게, OxBC 전처리 후 LPS 처리는 조절 사이토카인 IL-8의 발현을 상향 조절 시키는 것으로 관찰되었다. 특히, IL-8 발현은 LPS로만 자극시킨 세포와 비교하여, 0.1 및 0.5 μM의 OxBC로 전처리한 경우 각각 33±4% 및 49±5%까지 증가되었다. 그러나 1 μM의 화합물로 전처리하고 배양하는 경우 아무런 변화가 관찰되지 않았다.

표 4: OxBC 프라임 및 LPS 유도 후 TNF 발현(원리 증명)

표 5: OxBC 프라임 및 LPS 유도 후 염증성 사이토카인 발현

단핵구는 선천성 면역 반응의 가장 중요한 효력 세포(effector cell) 이기 때문에, 본 발명자들은 다음으로 OxBC가 사전에 LPS 처리로 노출시킨 일차 PBM에서 염증성 사이토카인 발현에 영향을 미치는지에 대해 평가하였다. PBM을 LPS(15 ng/ml)로 24 시간 동안 초기 처리한 후, ELISA 분석을 위해 CM을 수집하기 전에 추가적으로 다양한 농도의 OxBC로 24 시간 동안 자극하였다. OxBC 처리 후 IL-6 발현에는 변화가 없음이 탐지되었으며, 반면 TNF 수준은 단지 화합물의 농도가 낮을 경우 증가되었다(약 25%)(도 1 참조). 그러나, IL-1β 발현은 OxBC 농도가 5 μM 이상일 경우 지속적으로 증가되었으며, 최대 약 50% 증가됨이 탐지되었다(도 1). 조절 사이토카인, IL-8 및 IL-12의 평가는 OxBC로 전처리한 세포에서는 IL-12 발현에 아무런 변화가 없음이 관찰되었으며, IL-8 발현은 2.5 μM 이상의 OxBC 농도에서 처리하지 않은 단핵구에 비례하여 상당한 증가가 나타났다(도 2).

실시예 2. 산화적으로 변형된 카로테노이드 (OxBC) 처리 후 단핵구에 대한 면역-관련 표면 수용체의 발현 평가.

다음의 결과는 OxBC 처리가 단핵구의 활성에 관여하는 모든 분화 마커, CD14, CD51, CD16 및 CD36의 발현 증가에 관련됨을 증명한다. 게다가, 림프구 보조자극 분자 CD86(i.e., B7) 및 CD40L의 발현 증가가 관찰되는 것은 면역 시스템의 선천성 및 적응성 아암(arms)을 활성화시킬 수 있는 능력을 암시하는 것이다. LPS 처리 모델에서 단핵구를 낮은 농도의 OxBC로 처리하였을 경우, 모든 분화 마커에서 작은 변화가 탐지되었다. 그러나, OxBC 처리는 LPS 처리에 따른 반응에 대해 보조자극 표면 수용체의 발현이 증가된 것과 관련된다.

미분화된 단핵구는 대식세포로 분화되면서 사이즈 증가, 세포 확산 및 입자성(granularity)이 나타나며, 형태는 둥글게 되고 작은 것을 잃는다. 또한 몇몇 분화 항원(differentiation antigen)은 단핵구로 식별되며, 선천성 및 특정 면역에 관련된 다양한 생물학적 기능에 관여한다. 이러한 표면 항원의 발현 개요는 단핵구로 분화함으로써 변화하며, 혼합된 집단에서 성숙한 대식세포의 수를 정량하는 수단으로 유세포 분석(flow cytometry)을 제공한다. 상기의 연구를 위해, 분화 및 선천성 기능은 세포 유착(인테그린 CDl lb/CD18 및 CD51), 미생물 성분의 결합(CD14, LPS 수용체), 청소(scavenging) 및 식균 작용(CD36) 및 세포 매개성 면역 반응 (CD 16, low affinity IgG receptor required for antibody-dependent cell killing)과 같은 이러한 프로세스들의 기능을 하는 대표적인 표면 잔기(moieties)들의 수준을 평가함으로써 평가하였다. 전형적으로 상기 수용체들은 순수 단핵구 에서 낮은 수준으로 발현되며 자극 하에서 성향 조절된다. 단핵구의 적응성 면역 기능에 대한 OxBC의 영향을 평가하기 위해, MHC class Ⅱ 분자, HLA-DR 및 HLA-DP의 표면 발현을 평가하였다. 상기 분자들은 항원 제시에 관련된 특이적인 단핵구 세포 표면 마커이다. 유사하게, 다른 세포 표면 분자의 발현은 보조자극 림프구 항원 B7-2 (CD86), CD40 및 CD40L을 포함하는 T-cell에 항원을 제시하는 역할에 의해 결정된다.

방법

화합물 준비

실시예 1에 설명된 것과 같이 OxBC 스톡을 준비하였다.

세포 주 및 조건

인간 THP-1 단핵구모양 세포(급성 단핵구 백혈병)는 American Type Tissue Collection(#TIB-202)으로부터 얻었다. 세포는 2mM L-글루타민, 10mM HEPES, 1.0mM 피루브산 나트륨, 10% 소 태아혈청 및 항생제가 포함된 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. 세포를 OxBC로 처리하기 전에 24 시간 동안 접종한 후(5×10⁵ cells/well, 6-웰 배양 플레이트), 분석을 위해 세 가지 프로토콜에 따라 수확하였다: 1) 세포를 OxBC(2.5, 7.5 또는 12.5 μM)로 24 시간 동안 처리한 후, 표면 수용체 발현을 평가하였다; 2) 세포를 OxBC(0.1, 0.5 또는 1.0 μM)로 24 시간 동안 처리하고, 분석 전, 어는 지점에 OxBC가 결핍된 신선한 배지로 5 일 동안 공급하였다; 및 3) 세포를 OxBC(0.1, 0.5 또는 1.0 μM)로 24 시간 동안 처리한 후, 어는 지점에 OxBC가 결핍된 신선한 배지로 5 일 동안 공급하였다. 그 후, 분석 전에 처리된 세포를 LPS (15 ng/ml)로 24 시간 동안 자극하였다. 동일한 퍼센트(v/v)의 DMSO 만을 배양시킨 세포는 대조군으로 사용하였다. LPS 자극을 사용하지 않은 연구에서는, PMA(25 ng/ml)를 단핵구 분화의 양성 자극기(stimulator)로써 이용하였다.

FACS 분석

인간 CDl1b, CD14, CD16, CD36, CD51/CD61, HLA(broad isoforms), HLA-B₇, CD86, CD40, CD40L 및 CD3에 대항하는 피코에리트린(PE)-라벨링된 일차 항체들은 AbCam으로부터 얻었다. 수용체 발현은 직접 면역형광 라벨링 및 유세포 분석을 이용하여 평가하였다. 간단히 말해서, 차가운 버퍼(10% FBS를 함유하는 PBS 및 1% 소디움아자이드)에서 삼중으로 분할한 세포를 일차 항체(10-20 μl)로 낮은 조명(low light) 조건하에서 상온에서 45 분 동안 배양하였다. 세포를 세 번 세척한 후, FacsAria 세포 소터(cell sorter)를 이용하여 분석하기 위해 500 μl의 버퍼로 현탁시켰다. 항체로만 라벨링된 세포 및 라벨링되지 않은 세포들은 대조군으로써 사용하였다.

결과 및 고찰

THP-1 세포를 OxBC로 24 시간 동안 처리하고, 분화 항원의 발현을 직접-라벨링된 유세포 분석으로 평가하였다. 표 6 및 도 3에 나타낸 것과 같이, OxBC 처리의 가장 눈에 띄는 특징은 평가된 농도 범위에서 원형 단핵구 분화 항원, CD14의 발현이 상향 조절된 것이다. PMA의 효과와 비교한 결과, 상기의 효과는 투여량-의존적이며, 12.5 μM의 OxBC를 사용할 경우 최대 2-배 증가되었다. CD14는 막-관련된 당단백질이며, 박테리아 LPS를 탐지하는 톨-유사 수용체(TLR)-4와 공동수용체로써 작용한다. 이렇기에, 이는 사이토카인 분비 및 염증성 반응을 포함하는 박테리아 감염에 대한 선천성 면역 반응을 매개하는 중추 역할을 수행한다. 따라서, OxBC에 의한 그것의 상향 조절은 화합물이 근본적인 선천성 경로를 활성화시키는 능력을 가짐을 나타낸다. CD14 이외에, 발현이 상향 조절된 CD51(37%), 인테그린은 활성화 후 내피 세포(endothelial cell)에의 단핵구의 유착을 수반시키며, CD16(39%), Fc 수용체는 항체-유도된 세포 살해를 지지하는 항체들을 인지한다. 이는 OxBC 농도가 12.5 μM 일 때 탐지된다. 합쳐서 생각해보면, 상기 결과들은 OxBC가 단핵구모양 세포에 분화 자극을 가할 수 있는 증거를 제공한다. 대조군으로써 CD3로 염색시킨 림프구 마커는 THP-1 세포에 수용체를 발현하지 않음을 기록하여야만 한다(데이터 나타내지 않음).

표 6: THP-1 세포에서 분화 항원 발현

CD11b, 골수 세포(myeloid cell)에서 선택적으로 발현된 인테그린은 단핵구 활성 및 염증성 사이토카인 방출을 이끄는 신호를 생성하며, CD36, 식균 작용의 개시에 관여하는 표면 잔기는 균일(uniformity)에 도달한 수준에서 단핵구모양 세포상에서 구성적으로(constitutively) 발현된다. 따라서, 본 발명자들은 또한 상기 분자들을 염색한 후 수용체 밀도를 측정함으로써 형광 강도를 평가하였다. 이는 잠재적인 효과의 분실을 피하기 위한 것이며, 그렇지 않으면 대량의 양성-라벨링된(positively-labeled) 세포에 의해 약화된다. 표 7에 나타낸 것과 같이, CD36 발현은 12.5 μM의 OxBC를 처리한 후 약 37% 까지 증가된 반면, CD11b 수준은 소량의 정도만 증가되었다. 비교해보면, PMA는 2 내지 4 배 범위의 훨씬 더 큰 마진(margin)으로 두 수용체의 밀도를 증가시킨다.

표 7: 수용체 밀도

표면 수용체들의 발현은 항원 제시와 관련되며, 림프구 반응의 자극 또한 유세포 분석으로 평가하였다. HLA B7-2(aka CD86) 및 CD40L의 발현은 7.5 및 12.5 μM의 OxBC의 처리에 의해 상향 조절된다(표 8, 도 4). CD86은 CD28과 상호작용을 통한 대식세포에 의해서 T-cell의 활성을 위해 요구되는 보조 자극 신호를 제공한다. 상기 상호작용은 활성화된 대식세포에 의해 제시된 항원에 대항하여 반응하는 효력 T 세포(effector T cell)를 준비시키는 것이다. CD40L 또는 CD154는 TNF 수퍼패밀리(TNF superfamily)에 속하는 요소이며, 항원 제시 세포에 CD40을 결합시키고, 보조 자극 분자로서 작용한다. CD40L은 CD4⁺ T 림프구에서 가장 많이 발현된다; 그러나 최근 연구 결과들은 CD40L이 단핵구/대식세포를 포함하는 다른 면역 효력 세포에서 또한 발현된다고 설명하고 있으며, 여기서 발현된 CD40L은 대식세포의 활성 수준을 증가시키고, 식균 작용 및 사이토카인을 생성시키는 활성들을 증강시킨다. 따라서, CD14와 같이, 상기 두 분자는 면역 유도에 반응하는 단핵구를 활성화시키는 능력을 증가시키는 작용을 한다.

표 8: THP-1 단핵구에 대한 보조 자극 분자들의 발현

본 발명자들은 다음으로 낮은 농도의 OxBC(≤1μM)로 24 시간 동안 처리한 후, LPS 처리한지 약 5 일 후 수용체 발현을 평가하였다. LPS 처리를 부재하는 경우에서, 상기 농도의 OxBC로의 세포 처리는 상기 화합물의 높은 농도에서 평가된 어떠한 수용체들의 발현에 효과가 없음을 기록하여야만 한다(데이터 나타내지 않음). 유사하게, 0.1 μM에서 CD11b 발현을 제외하고는, OxBC-처리 및 무처리 후 LPS로 자극시킨 세포 사이에서 분화 항원의 발현에 대한 상당한 변화가 관찰되지 않았다(도 5). 반면에, 항원 제시에 관련된 보조 자극 분자 즉, HLA(DP/DR/DP) 및 CD86의 발현은 무처리된 조건과 비교하여 OxBC-처리 후 LPS 처리한 배양에서 상당히 증가되었다(도 6). 유사하게, CD40 발현의 우위(preponderance)는 전체 세포 집단 내에서 OxBC 처리에 의해 상향 조절되지 않으나, 무처리된 조건과 비교하여 OxBC 처리된 세포의 일부 부분 집단(subpopulation)에서는 CD40이 더 부유하게 발현되었다. 따라서, 낮은 농도의 OxBC 처리는 미생물에 대한 적응성(adaptive) 반응 유도에 참여하는 단핵구의 능력을 증강시킴을 보여준다.

실시예 3. 인간 단핵구에 처리된 산화적으로 변형된 카로테노이드(OxBC)에 의해 나타난 식균 작용 활성의 평가.

다음의 결과는 OxBC 처리가 식균 작용을 증가시키는 것과 관련됨을 증명한다. 본 연구는 OxBC가 일차 인간 단핵구 및 확립된 THP-1 단핵구모양 세포의 배양에서 식균 작용 활성에 영향을 미치는지에 대해 관찰하기 위해 디자인 되었다. 증가된 식균 작용은 OxBC만 처리된 순수 단핵구 배양에서 분명히 나타난다. 그러나, OxBC의 영향은 OxBC로 전처리한 후 LPS로 처리하여 배양하는 경우 더 크다. 상기 결과는 OxBC가 LPS 처리에 대해 반응하는 탐식 활성이 증가된 단핵구를 준비시키는 능력을 가짐을 나타낸다.

식균 작용은 미생물-선천성 면역 상호작용의 표준 모델(classic model)로써 작용하는 선천성 면역 방어의 근본적인 매커니즘이다. 상기 기능을 성취하기 위해, 식세포를 입자 인지(particle recognization) 및 내면화(internalization)에 참여하는 수용체의 광역 항균 스펙트럼(broad spectrum)에 제시하였다. 상기 수용체들 중 일부는 식균 작용을 일으키는 세포내 신호를 전달할 수 있다. 그러나, 청소 수용체(scavenger receptor)(eg. CD36)와 같은 다른 수용체는 타겟(targer)과의 결합에 참여하거나 내면화의 효율을 증가시키는 역할을 한다. 현혹적인(deceptively) 복잡한 과정은, 식세포-미생물 접촉은 세포 골격 재배열, 막 소통(membrane trafficking)의 변화, 미생물 살해 메커니즘의 활성, 염증성 및 항염증성 사이토카인 및 케모카인의 생성, 세포사멸의 활성 및 적응성 면역 반응에 대해 효율적인 항원 제시를 위해 요구되는 분자의 생성과 같이 다양한 세포 과정을 일으키는 다수의 세포내 신호를 요구한다. 따라서, 식균 작용은 단핵구 기능 및 선천성 항미생물 방어의 조절을 위해 필수적인 과정이다. 실시예 1 및 2의 연구는 OxBC가 단핵구 배양에서 다양한 선천성 반응을 활성화시키는 능력을 지님을 설명하였다. 이러한 수많은 반응들은 식균 작용에 의해 일어날 수 있음을 제시하였으며, 본 발명자들은 다음으로 단핵구에서 탐식 활성에 영향을 미치는 OxBC의 능력을 평가하였다.

방법

화합물 준비

실시예 1에 설명된 것과 같이 OxBC 스톡을 준비하였다.

세포 주 및 조건

인간 THP-1 단핵구모양 세포(급성 단핵구 백혈병)는 American Type Tissue Collection(#TIB-202)으로부터 얻었다. 세포는 2mM L-글루타민, 10mM HEPES, 1.0mM 피루브산 나트륨, 10% 소 태아혈청 및 항생제가 포함된 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. 일차 말초 혈액 단핵구(PBM)는 Miltenyi Biotec MACs의 자성 분리 시스템을 이용하여 혼합된 말초 혈액 단핵 세포를 준비함으로써 분리하였다. PBM은 20% 소 태아혈청을 사용한 것을 제외하고는 THP-1 세포를 배양시킨 배지와 동일한 배지로 배양하였다. 세포를 하기에 설명된 것과 같이 OxBC, PMA(25 ng/ml) 및/또는 LPS(15 ng/ml)을 처리하기 전에 24 시간 동안 접종하였다(1×10⁵ cells/well, 96-웰 배양 플레이트). 동일한 퍼센트(v/v)의 DMSO로만 배양한 세포는 대조군으로 사용하였다.

식균 작용 분석

단핵구 배양에서 식균 작용은 형광-라벨링된 E. coli(strain K12) 박테리아 입자의 섭취를 기반으로한 Vybrant phagocytosis assay kit(Invitrogen, #V6694)를 이용하여 평가하였다. 간략히 말하면, 처리된 세포를 Hank's buffered salt solution(HBSS)에서 100 μl 부유물(suspension)의 형광 생입자(bioparticle)와 37 ℃에서 5 시간 동안 배양시켰다. 배양 후, 부유물을 제거하고, 1분 내에 100 μl의 2% 트리판 블루 용액으로 교체하였다. 상기 트리판 블루 용액을 제거한 후, 섭취된 입자의 수를 형광 마이크로플레이트 리더(480 nm excitation, 520 nm emission)를 이용하여 측정하였다. 단지 배지만을 포함(세포 없음)하는 웰(well)은 각각의 동일한 복제 실험에 대한 음성 반응 대조군으로 사용하였다. 식균 작용 활성을 결정하기 전 THP-1 및 PBM에 대해 세 가지 처리 시나리오로 연구하였다: (1) 세포를 OxBC 또는 PMA로 24 시간 동안 간단히 처리하였다; (2) 세포를 OxBC 및 PMA로 24 시간 동안 처리하고, 화합물을 제거시킬 때 세포를 완전 배지로 24 시간 동안 추가 배양하였다; 및 (3) 세포를 OxBC 또는 PMA로 24 시간 동안 처리하고, 화합물을 제거시킬 때 세포를 LPS를 함유한 완전 배지로 24 시간 동안 추가 배양하였. THP-1 세포에 대한 추가 시나리오는 세포를 OxBC 또는 PMA로 24 시간 동안 처리하고, 화합물을 제거시킬 때 세포를 재생시키기 위해 완전 배지로 72 시간 동안 허락하여 연구하는 것이다. 재생 후, 식균 작용을 측정하기 전에 세포를 LPS로 24 시간 동안 처리하였다.

결과 및 고찰

단핵구에서 식균 작용에 대한 OxBC의 영향은 이전에 상당한 독성 결과가 나타나지 않았던 농도 및 시간 경과를 이용하여 확립된 단핵구모양 세포 주인 인간 THP-1 세포에서 최초 평가되었다. 순수 THP-1 세포에 OxBC를 24 시간 동안 처리하는 경우 평가된 어떠한 농도에서도 탐식 활성에 상당한 변화가 없었다. 반면에, PMA 처리는 조절 배지에 비례하여 탐식 활성이 12.94±2.05 배 증가된 것과 관련된다. 그러나, 식균 작용을 평가하기 전 THP-1 세포를 회복시키기 위해 24 시간 동안 OxBC를 허락하는 경우 탐식 활성에 영향을 미침을 발견하였다. 상당히 증가된 탐식 작용은 대조군과 비교하여 2.5, 5 또는 7.5 μM(1.34, 2.67 or 4.02 μg/ml)의 OxBC로 처리하여 배양한 THP-1에서 관찰되었으며, PMA로의 처리는 상기 효과의 약 절반만 관찰되었다(도 7). 중요한 것은, 10 μM(5.38 μg/ml)의 OxBC를 처리하고 배양하는 경우 식균 작용 범위를 감소시키며, 이는 독성 효과 때문에 가능하다.

실시예 1 및 2는 OxBC가 LPS와 같은 이차 자극에 대한 반응을 증가시키는 단핵구를 준비시킬 수 있음을 설명한다. OxBC로 처리한 THP-1 세포는 처리하지 않은 대조군에 비해 LPS 처리 후 탐식 활성이 더 증가한 것은 상기 관찰과 일치한다(도 8). 2.5 μM(1.34 μg/ml) 이상 농도의 OxBC로의 전처리는 PMA로 처리된 단핵구에서 관찰된 것과 같이 유사한 수준으로 식균 작용을 증가시킨다.

유사한 결과는 일차 PBM으로 평가한 경우에도 관찰되었다. OxBC를 24 시간 동안 처방하고 24 시간 동안 재생시켰을 때, 약 35% 까지의 일반적인 탐식 활성의 증가는 대조군에 비례하여 OxBC 처리된 세포에서 탐지되었다. 증가가 관찰됨에도 불구하고, 상기 결과는 반복 사이의 변이성(variability) 때문에 통계적 중요성에 도달하는 데에는 실패하였다. 비록 반복수가 증가하더라도 변이성을 감소시킴으로써 상기 반응을 더 상당한 수준으로 향상시킬 수 있으며, 이러한 선택은 수많은 일차 세포들이 요구되기 때문에 실행 가능하지 않다. 그러나, THP-1 세포로부터 OxBC는 LPS 처리에 대해 반응하는 PBM을 준비시키는 것으로 발견되었다. 도 9에 나타낸 것과 같이, PMA로 얻어진 최대 수준과 비교하여 OxBC의 전처리는 LPS 자극으로 증가된 탐식 반응과 관련된다.

탐식 활성은 또한 THP-1 세포에서 OxBC 처리 후 72 시간 동안 재상시킴을 허락함으로써 평가되었다. 다소 증가한 식균 작용은 OxBC 만을 처리한 세포에서 관찰되었다 하더라도, 상기 반응은 PMA-처리된 배양에서 명백한 탐식 활성이 크게 증가한 것에 의해 오버쉐도우(overshadow) 된다. 비교해보면, OxBC 전처리는 또한 72 시간 후에 전달된 LPS 자극에 반응하는 THP-1 세포를 준비시키는 것으로 발견되었다. 상당히 증가된 탐식 활성은 5 μM(2.67 μg/ml) 이상의 농도의 OxBC를 전처리한 단핵구에서 탐지되었으며, 이는 단핵구를 OxBC에 초기 노출시킨 후 OxBC 처리 효과가 며칠 동안 지속됨을 의미한다.

OxBC는 일차 및 확립된 단핵구의 탐식 활성을 직접적으로 증가시키는 능력을 가진다. 그러나, 면역 시스템에 대한 OxBC의 큰 영향은 뒤따른 LPS 처리에 대한 반응에 대해 더 강한 탐식 반응을 갖는 단핵구를 준비시키는 능력을 나타내는 것이다.

다른 구현예들

모든 간행물 및 특허 출원 및 상기의 사항이 언급한 특허들은 참조로 통합된다.

반면, 특정 구현예와 관련하여 설명한 본 발명은 추가 수정을 할 수 있음을 이해하여야 한다. 그러므로, 본 출원은 본 발명의 어떤한 변형, 용도 또는 적용을 다루기 위해 계획되었으며, 그 다음 일반적으로 본 발명의 원리들은 본 발명의 상세한 설명 이외의 것들, 이미 알려져 있는 범위 내의 것 또는 기술에 속하는 통상적인 것들을 포함한다. 다른 구현예들은 청구항 내에 작성하였다.

Claims

6 내지 8 몰당량(molar equivalents)의 산소와 β-카로틴의 반응에 의해 형성된 중합체 물질을 면역반응의 증강에 충분한 양으로 포함하는 박테리아 감염을 갖는 객체에서 면역반응의 증강용 약학적 조성물.
6 내지 8 몰당량의 산소와 β-카로틴의 반응에 의해 형성된 중합체 물질을 면역반응의 증강에 충분한 양으로 포함하는 박테리아 감염을 갖거나 박테리아 감염 위험성을 갖는 인간 객체에서 면역반응의 증강용 약학적 조성물.
6 내지 8 몰당량의 산소와 β-카로틴의 반응에 의해 형성된 중합체 물질을 면역반응의 증강에 충분한 양으로 포함하고, 정맥내, 안구내, 근육내, 국소적, 피하 또는 비강내로 투여되는 것을 특징으로 하는 박테리아 감염을 갖거나 박테리아 감염 위험성을 갖는 객체에서 면역반응의 증강용 약학적 조성물.
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제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 감염은 지역사회-획득 폐렴, 상부 및 하부 기도 감염, 피부 및 연조직 감염, 급성 세균성 중이염, 세균성 폐렴, 복합 감염, 신우신염, 복강내 감염, 세균성 패혈증, 중추신경계 감염, 세균혈증, 상처 감염, 복막염, 수막염, 화상후 감염, 비뇨생식기관 감염, 골반염 질환, 심내막염 및 혈관내 감염으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 눈 감염의 치료를 위해 안구내로 투여되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 경구 감염의 치료를 위해 상기 객체의 입에 국소적으로 투여되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 경구적, 정맥내, 근육내, 안구내, 국소적, 피하 또는 비강내로 투여되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 객체는 박테리아 감염으로 진단되지는 않았으나 박테리아 감염 위험성을 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 객체는 박테리아 감염을 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 항생제를 더 포함하며, 상기 중합체 물질 및 상기 항생제는 동시에 또는 각각 14일 이내에 투여되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
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(i) 6 내지 8 몰당량의 산소와 β-카로틴의 반응에 의해 형성된 중합체 물질을 포함하는 약학적 조성물, 및 (ii) 상기 약학적 조성물의 투여 지시서를 포함하는 박테리아 감염을 갖거나 박테리아 감염 위험성을 갖는 객체에서 면역반응의 증강을 위한 키트.
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제29항에 있어서, 상기 감염은 지역사회-획득 폐렴, 상부 및 하부 기도 감염, 피부 및 연조직 감염, 급성 세균성 중이염, 세균성 폐렴, 복합 감염, 신우신염, 복강내 감염, 세균성 패혈증, 중추신경계 감염, 세균혈증, 상처 감염, 복막염, 수막염, 화상후 감염, 비뇨생식기관 감염, 골반염 질환, 심내막염 및 혈관내 감염으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.
제29항에 있어서, 상기 객체에 항생제의 투여를 위한 지시서를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
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제11항에 있어서, 상기 항생제는 아미노글리코시드(aminoglycosides); 암페니콜(amphenicols); 안사마이신(ansamycins); β-락탐(β-Lactams); 카르바페넴(carbapenems); 세팔로스포린(cephalosporins); 세파마이신(cephamycins); 모노박탐(monobactams); 옥사페펨(oxacephems); 린코사이드(lincosamides); 마크로라이드(macrolides); 폴리펩티드(polypeptides); 테트라사이클린(tetracyclines); 2,4-디아미노피리미딘(2,4-diaminopyrimidines); 니트로푸란(nitrofurans); 퀴놀론(quinolones); 설폰아미드(sulfonamides); 설폰(sulfones); 리포펩티드(lipopeptides); 및 케톨라이드(ketolides)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제41항에 있어서, 상기 항생제는 아미카신(amikacin), 아프라마이신(apramycin), 아르베카신(arbekacin), 밤베르마이신(bambermycins), 부티로신(butirosin), 디베카신(dibekacin), 디히드로스트렙토마이신(dihydrostreptomycin), 포르티마이신(fortimicin(s)), 프라디오마이신(fradiomycin), 젠타마이신(gentamicin), 이스파마이신(ispamicin), 카나마이신(kanamycin), 마이크로노마이신(micronomicin), 네오마이신(neomycin), 네오마이신 운데실레네이트(neomycin undecylenate), 네틸마이신(netilmicin), 파로모마이신(paromomycin), 리보스타마이신(ribostamycin), 시소마이신(sisomicin), 스펙티노마이신(spectinomycin), 스트렙토마이신(streptomycin), 스트렙토니코자이드(streptonicozid), 토브라마이신(tobramycin), 아지담페니콜(azidamfenicol), 클로람페니콜(chloramphenicol), 클로람페니콜 팔미레이트(chloramphenicol palmirate), 클로람페니콜 판토테네이트(chloramphenicol pantothenate), 플로르페니콜(florfenicol), 티암페니콜(thiamphenicol), 리팜핀(rifampin), 피라부틴(rifabutin), 리파펜틴(rifapentine), 리팍시민(rifaximin), 이미디노실린(amidinocillin), 암디노실린(amdinocillin), 피복실(pivoxil), 아목시실린(amoxicillin), 암피실린(ampicillin), 아스폭시실린(aspoxicillin), 아지도실린(azidocillin), 아즐로실린(azlocillin), 바캄피실린(bacampicillin), 벤질페니실린산(benzylpenicillinic acid), 벤질페니실린(benzylpenicillin), 카르베니실린(carbenicillin), 카르페실린(carfecillin), 카린다실린(carindacillin), 클로메토실린(clometocillin), 클록사실린(cloxacillin), 시클라실린(cyclacillin), 디클록사실린(dicloxacillin), 디페니실린(diphenicillin), 에피실린(epicillin), 펜베니실린(fenbenicillin), 플록시실린(floxicillin), 헤타실린(hetacillin), 레남피실린(lenampicillin), 메탐피실린(metampicillin), 메티실린(methicillin), 메즐로실린(mezlocillin), 나프실린(nafcillin), 옥사실린(oxacillin), 페나메실린(penamecillin), 페네타메이트 히드리오다이드(penethamate hydriodide), 페니실린 G 베네타민(penicillin G benethamine), 페니실린 G 벤자틴(penicillin G benzathine), 페니실린 G 벤즈히드릴아민(penicillin G benzhydrylamine), 페니실린 G 칼슘(penicillin G calcium), 페니실린 G 히드라가민(penicillin G hydragamine), 페니실린 G 칼륨(penicillin G potassium), 페니실린 G 프로카인(penicillin G, procaine), 페니실린 N, 페니실린 O, 페니실린 V, 페니실린 V 벤자틴, 페니실린 V 히드라바민, 페니메피시클린(penimepicycline), 페네티실린(phenethicillin), 피페라실린(piperacillin), 피바피실린(pivapicillin), 프로피실린(propicillin), 퀴나실린(quinacillin), 설베니실린(sulbenicillin), 탈람피실린(talampicillin), 테모실린(temocillin), 티카르실린(ticarcillin), 이미페넴(imipenem), 1-카바(데티아) 세팔로스포린(1-carba (dethia) cephalosporin), 세팍터(cefactor), 세파드록실(cefadroxil), 세파만돌(cefamandole), 세파트리진(cefatrizine), 세파제돈(cefazedone), 세파졸린(cefazolin), 세픽심(cefixime), 세프메녹심(cefmenoxime), 세포디짐(cefodizime), 세포니시드(cefonicid), 세포페라존(cefoperazone), 세포라니드(ceforanide), 세포탁심(cefotaxime), 세포티암(cefotiam), 세프피미졸(cefpimizole), 세프피리미드(cefpirimide), 세프포독심 프록세틸(cefpodoxime proxetil), 세프록사딘(cefroxadine), 세프설도딘(cefsulodin), 세프타지딤(ceftazidime), 세프테람(cefteram), 세프테졸(ceftezole), 세프티부텐(ceftibuten), 세프티족심(ceftizoxime), 세프트리악손(ceftriaxone), 세푸록심(cefuroxime), 세푸조남(cefuzonam), 세파세트릴 나트륨(cephacetrile sodium), 세팔렉신(cephalexin), 세팔로글리신(cephaloglycin), 세팔로리딘(cephaloridine), 세팔로스로린(cephalosporin), 세팔로틴(cephalothin), 세파피린 나트륨(cephapirin sodium), 세프라딘(cephradine), 피브세팔렌신(pivcefalexin), 세팔로틴(cephalothin), 세파클로르(cefaclor), 세포테탄(cefotetan), 세프프로질(cefprozil), 로라카르베프(loracarbef), 세페타메트(cefetamet), 세페핌(cefepime), 세프부페라존(cefbuperazone), 세프메타졸(cefmetazole), 세프미녹스(cefminox), 세페탄(cefetan), 세폭시틴(cefoxitin), 아즈트레오난(aztreonam), 카루모남(carumonam), 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댑토마이신(daptomycin), 리네졸리드(linezolid), 텔리트로마이신(telithromycin), 클로폭톨(clofoctol), 헥세딘(hexedine), 마가이닌(magainins), 메테나민(methenamine), 메테나민 언히드로메틸렌-시트레이트(methenamine anhydromethylene-citrate), 메테나민 히푸레이트(methenamine hippurate), 메테나민 만델레이트(methenamine mandelate), 메테나민 서브살리실레이트(methenamine subsalicylate), 니트록솔린(nitroxoline), 스쿠알라민(squalamine), 지보몰(xibomol), 시클로세린(cycloserine), 뮤피로신(mupirocin) 및 튜베린(tuberin)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제29항, 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 면역반응의 증강은 객체에서 IL-8의 발현의 증가를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제29항, 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 면역반응의 증강은 객체에서 MCP-1의 발현의 증가를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제29항, 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 면역반응의 증강은 객체에서 선천성 면역시스템의 활성화를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제29항, 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 면역반응의 증강은 객체에서 적응성 면역시스템의 활성화를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제29항, 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 면역반응의 증강은 객체에서 식균 작용의 증가를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.