KR100547585B1 - 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 5'-이노신산의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 유전자로 형질전환된 5'-이노신산을 생산하는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물 및 이를 이용한 5'-이노신산의 제조방법을 제공한다. 또한 본 발명은 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)의 피루베이트 키나제를 코딩하는 유전자를 제공한다.

코리네박테리움 암모니아게네스, 5'-이노신산, 피루베이트 키나제

Description

코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 5'-이노신산의 제조방법{Microorganisms of Corynebacterium and processes for the preparation of 5'-inosinic acid using the same}

도1은 pyk 유전자의 클로닝 과정을 나타낸다.

도2는 클로닝된 pECCG117-pyk 벡터를 나타낸다.

본 발명은 서열번호 1의 유전자로 형질전환된 5'-이노신산을 생산하는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물 및 이를 이용한 5'-이노신산의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)의 피루베이트 키나제를 코딩하는 유전자(이하 "pyk 유전자"라 함)에 관한 것이다.

5'-이노신산(5'-inosinic acid)은 핵산 생합성 대사계의 중간물질로서, 동식물의 체내에서 생리적으로 중요한 역할을 수행할 뿐 아니라 식품, 의약품 및 각종 의료적 이용 등 다방면에 이용되고 있고, 특히, 글루타민산 나트륨과 같이 사용하면 맛의 상승효과가 커서 정미성 조미료로 각광을 받고 있는 핵산계 조미료 중 하 나이다. 현재, 5'-이노신산은 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 균주, 예를 들어 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)를 발효시킴으로써 제조하는 방법이 알려져 있다 (대한민국 특허공개 제2003-42972호 등).

피루베이트 키나제(pyruvate kinase)는 미생물에서 해당과정에서 포스포에놀 피루베이트(phosphoenol pyruvate)로부터 피루베이트(pyruvate)를 생성하는 효소이다. (Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology: 2nd edition: 191~ 192). 피루베이트 키나제는 균주 내의 해당과정 중 박테리아의 성장과 여러 대사물질의 전구체로서 중요한 역할을 하는 피루베이트를 생성하는 효소로서 피루베이트가 제대로 생성되지 못하면 성장이 지연되거나 여러 대사물질이 합성되지 못하므로 정상적인 성장을 못하게 된다. 다른 일부 미생물에서의 pyk 유전자의 서열은 일부 보고된 바 있으나, 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)에서의 pyk 유전자의 서열은 아직 보고된 바 없다.

한편, 본 발명자들은 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 균주로부터 5'-이노신산을 고역가로 생산할 수 있는 개선된 균주를 개발하고자 연구하던 중, 놀랍게도 피루베이트 키나제(pyruvate kinase)를 코딩하는 유전자 서열을 포함하는 벡터로 형질전환시켰을 때 5'-이노신산이 고역가로 생산된다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 상기 발견에 기초한 것으로, 본 발명은 서열번호 1의 유전자 또는 서열번호 1의 유전자와 90% 이상의 상동성을 갖고 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물의 피루베이트 키나제(pyruvate kinase)를 코딩하는 유전자로 형질전환된 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 미생물을 이용한 5'-이노신산의 제조방법을 제공하는 것을 포함한다.

또한, 본 발명의 목적은 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)의 피루베이트 키나제를 코딩하는 유전자를 제공하는 것을 포함한다.

본 발명의 일 태양에 따라, 서열번호 1의 유전자 또는 서열번호 1의 유전자와 90% 이상의 상동성을 갖고 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물의 피루베이트 키나제(pyruvate kinase)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 5'-이노신산을 생산하는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물을 형질전환시켜 얻어진 미생물이 제공된다.

본 발명자들은 5'-이노신산을 생성하는 미생물로 알려져 있는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물 예를 들어, 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) ATCC 6872의 염색체 서열분석을 수행하였으며, 피루베이트 키나제를 코딩하는 유전자 즉, pyk 유전자가 약 1,410bp의 서열번호 1의 염기서열을 갖는다는 것을 밝혀내었다. 또한, 상기 유전자에 대하여 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻어진 유전자 단편을 사용하여 재조합 벡터를 제조 한 다음, 5'-이노신산을 생산하는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물을 형질전환시켜 얻어진 균주로부터 5'-이노신산을 높은 역가로 생성하는 균주를 분리하였다.

바람직하게는, 본 발명의 미생물은 약 2,023bp의 서열번호 2의 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 5'-이노신산을 생산하는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물을 형질전환시켜 얻어진 미생물이다. 서열번호 2의 염기서열은 약 400bp의 프로모터, pyk 구조 유전자 서열, 및 약 200bp의 터미네이터를 포함하고 있으며, 본 발명의 미생물은 서열번호 2의 염기서열을 갖는 플라스미드의 형태로 pyk 유전자를 과발현한다.

상기 재조합 벡터는 상기 서열번호 1의 유전자를 중합효소연쇄반응을 통하여 얻은 서열번호 2의 유전자를 DNA 제한효소, 예를 들어 XbaI 및 BamHI 등으로 절단하고, 동일한 DNA 제한효소로 절단한 벡터에 DNA T4 리가아제 등을 사용하여 삽입시켜 제조할 수 있다. 사용가능한 벡터는 특별히 제한되는 것은 아니며, 공지된 발현벡터를 사용할 수 있다. 바람직하게는, pECCG117 벡터(Biotechnology letters vol 13, No.10, p.721-726(1991) 또는 대한민국 특허공고 제92-7401호)를 사용할 수 있으며, 따라서, 상기 재조합 벡터는 상기 pECCG117 벡터에 서열번호 2의 유전자를 삽입시켜 제조한 pECCG117-pyk 벡터가 바람직하다.

상기 재조합 벡터, 예를 들어 pECCG117-pyk 벡터를 사용하여 선형 DNA단편을 통상적인 일렉트로포레이션(electroporation)을 방법을 이용하여 미생물 균주(예를 들어, 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) KFCC-10617, 대한민국 특허공고 제1990-3739호)에 전달하고, 선별마커인 항생제 카나마이신(kanamycine)를 포함하는 배지에서 배양하여 선별할 수 있다. 선별된 변이주 내의 pECCG117-pyk 벡터의 삽입은 PCR을 통하여 확인 할 수 있다. 상기 유전자의 클로닝 과정을 간략히 나타내면 도1과 같다.

더욱 바람직하게는, 본 발명의 미생물은 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJHJ01(KCCM-10529)이다.

본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 본 발명의 미생물을 배양하고, 그 배양액으로부터 5'-이노신산을 분리하는 단계를 포함하는 5'-이노신산의 제조방법이 제공된다.

상기 본 발명의 미생물은 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민등을 함유한 통상의 배지내에서 호기성 조건하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.

탄소원으로서는 글루코오스, 프럭토오스, 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀)등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있고, 질소원으로서는 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄과 같은 각종 무기질소원 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크, 또는 그의 분해생성물등 유기질소원이 사용될 수 있다. 무기화합물로는 인산1수소칼륨, 인산2수소칼륨, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘등이 사용될 수 있으며, 이외에 필요에 따라 비타민 및 영양요구성 염기등이 첨가될 수 있다. 배양은 호기적 조건하에서 예를 들면, 진탕배양 또는 통기교반배양에 의해, 바람직하게는 20∼40℃의 온도에서 수행될 수 있다. 배지의 pH는 배양하는 동안 중성근처에서 유지하는 것이 바람직하며, 배양은 5∼6일 동안 수행할 수 있으며 직접발효법에 의해서 축적된 5-이노신산을 통상의 방법으로 회수할 수 있다.

상기 본 발명의 제조방법에 따라 5'-이노신산을 제조할 경우, 높은 수율로 5'-이노신산을 제조할 수 있다.

본 발명의 또다른 태양에 따라, 상기 서열번호 1의 유전자 또는 서열번호 1의 서열과 90% 이상의 상동성을 가지고 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)의 피루베이트 키나제를 코딩하는 유전자가 제공된다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. pyk 유전자의 클로닝

중합효소연쇄반응을 통하여 얻은 서열번호 1의 유전자 단편을 제한효소 XbaI(New England Biolabs, Beverly, MA)과 BamHI(New England Biolabs, Beverly, MA)으로 절단하였다. 리가아제(New England Biolabs, Beverly, MA)를 이용하여 상기 유전자 단편을 XbaI과 BamHI 제한효소로 절단시킨 선상의 pECCG117 벡터에 접합하였다. 접합된 DNA를 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) KFCC-10617)에 일렉트로포레이션(electroporation)을 통하여 형질전 환하여 1리터 당 카나마이신(kanamycin)은 5 ㎎ 되게 항생제가 포함된 CM 고체배지(육즙 10g/L, 효모엑기스 10g/L, 박토펩톤 10g/L, 염화나트륨 2.5g/L, 박토아가 1.7%, pH 7.0)에서 자란 단일 콜로니들을 회수하였다. 회수된 콜로니들을 동일한 항생제가 첨가된 CM 배지에서 배양한 균체로부터 플라스미드를 분리하여 포함된 플라스미드의 크기를 일차로 확인하고 2차로 pECCG117의 다중클로닝 부위의 양끝단을 포함하는 프라이머를 이용하여 콜로니 PCR을 수행하여 삽입된 DNA의 크기를 통해 형질전환 여부를 확인하여 pyk 유전자 단편이 포함된 재조합 플라스미드 pECCG117-pyk(7.9 kb)를 제작하였다. 이를 간략하게 나타내면 도1과 같으며, 클로닝된 pECCG117-pyk 벡터는 도2와 같다.

여기에 사용된 프라이머들은 각각 다음과 같다.

프라이머 pyk-F (서열번호 3) : 5'-CTA GTC TAG AAC ACG CTG GGC CGA TTC TTC ATT G-3'

프라이머 pyk-B (서열번호 4) : 5'-ACC GGG ATC CGG CCA GCT CAC CCA TAC CC-3'

pECCG117-pyk 벡터를 사용하여 선형 DNA단편을 일렉트로포레이션 방법으로 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) KFCC-10617에 전달하고, 선별마커인 항생제 카나마이신(kanamycine)를 포함하는 배지에서 배양하여 pyk 유전자를 포함하는 균주를 선별하였으며, 이 과정을 통해 선별된 pyk 유전자를 포함하는 균주를 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJHJ01로 명명하였고, 2003년 11월 17일 한국미생물보존센터에 기탁하였다(수탁번 호: KCCM-10529).

실시예 2. 삼각 플라스크 발효역가 시험

종배지 3ml을 지름18mm 시험관에 분주하고 가압살균한 후 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJHJ01(KCCM-10529)를 접종하고 30℃ 온도에서 24시간 진탕배양하여 종배양액으로 사용하였다. 발효배지 27ml를 500ml 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 120℃ 온도에서 10분간 가압살균하여 종배양액 3ml을 접종한 다음 5∼6일간 배양하였다. 회전수는 분당 200회, 온도32℃, pH7.2으로 조절하였다. 배지내 5'-이노신산 축적량을 모균주인 KFCC-10617 과 비교한 결과는 하기 표1과 같으며, 본 발명에 따른 균주의 경우 5'-이노신산 축적량이 약 13 % 향상된 것을 알 수 있다. 상기 종배지 및 발효배지의 조성은 다음과 같다.

종배지 : 포도당 5%, 펩톤0.5%, 육즙 0.5%, 효모엑기스 1%, 염화나트륨 0.25%, 아데닌 100mg/l, 구아닌100mg/l, pH7.2

플라스크 발효배지: 글루타민산 나트륨 0.1%, 암모늄클로라이드 1%, 황산마그네슘1 .2%, 염화칼슘 0.01%, 황산철 20mg/l, 황산망간 20mg/l, 황산아연 20mg/l, 황산구리 5mg/l, L-시스테인 23mg/l, 알라닌 24mg/l, 니코틴산 8mg/l, 비오틴 45㎍/l, 티아민염산 5mg/l, 아데닌 30mg/l, 인산(85%) 1.9%, 과당, 포도당 및 당밀을 혼합하여 환원당으로 8% 되게 첨가하여 사용

	농도(g/l)	대조군 대비 증가율((%)
대조군(KFCC-10617)	10.61 ± 0.127	-
pECCG117	9.39 ± 0.22	-11.5
pECCG117-pyk	12.07 ± 0.180	13.8

본 발명에 따른 서열번호 1의 유전자를 갖는 5'-이노신산을 생산하는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물은 5'-이노신산을 고수율 및 고농도로 배양액중에 직접 축적시키는 미생물로서, 이를 이용한 본 발명의 제조방법은 높은 수율로 5'-이노신산을 제조할 수 있도록 한다.

<110> CJ Corp. <120> Microoranisms of Corynebacterium and processes for the preparation of 5'-inosinic acid using the same <130> PN052457 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1419 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 1 atgctggata gaagaacaaa aattgtctgt actctgggcc ccgctgtcgc cagcgaggac 60 gccattttac gtcttgttca agacggcatg aatgttgccc gtcttaactt ctcccacggc 120 gaccactccg atcatgaaca gaactaccac tgggtacgtt ctgcaaccga cgctaccggc 180 cgtgcagtgg gtatcctggc ggacttgcaa ggcccgaaga tccgcctagg ccgctttgtt 240 aatggcgcgg aacagtggga taacgatgaa atcgtgcgca ttaccgtcga ggatgtcgaa 300 ggtacccacg atcgtgtctc cacgacctat aagaacctcg cgaaggatgc caagccgggc 360 gatcgcctgc ttatcgatga cggcaaggta gccattgagt gcatcgaagt cgatggcaac 420 gatgttgtct gccgcgtgac cgaaggcgga ccagtctcta acaacaaggg cgtatccttg 480 cctggcatgg atatttccgt gccagcgttg agtgagaagg atatcgcgga cctgcgcttt 540 gccttgaagc tgggcgtaga ctttatcgct ttgtctttcg tgcgttcgcc tgctgatatt 600 gacctggttc acgcgattat ggatgaggaa ggccgtcgcg ttcctgtcat cgcgaagctg 660 gagaagcctg aagcagttga cgcgcttgaa tccatcatct tggcattcga cgccgtcatg 720 gttgctcgtg gtgacttggg cgttgaggtc ccactggagc aggttccact ggtacaaaag 780 cgtgccgtgc agattgctcg cgagaatgcg aagcccgtca tcgtggcaac ccagatgctg 840 gattccatga ttgaaaactc ccgcccaact cgcgcggagg catcggatgt cgcgaacgcg 900 gtactcgatg gtgcagatgc cgttatgctc tctggtgaga cttctgtggg cgttgacccg 960 cacaacgtgg tgcgcaccat ggcgcgcatc gtgcagcgtg cagagaccga tggccgcgtg 1020 ccaccgctat cgcatgttcc acgcaccaag cgtggcgtta tttcctactc ggcgcgtgat 1080 attgccgagc gtctgaatgc gaaggcaatc gtagctttca ccacctcggg tgacacggct 1140 aagcgcgttg ctcgtttgca ctcgcacttg ccgctgttgg tctttactcc acatgaagcc 1200 gtgcgttccc agctcgcgct gacgtggggt gcgcagacct tcttgaccaa ggatgtggaa 1260 tccaccgacg caatgatgtt ggcgatggat aaggcactgc tggaaatgga agactacgaa 1320 gaaggcgact tggtcgtcgt tgtagcgggt accccagctg gtattgctgg aaataccaac 1380 atgattcacg cacacgaact cggcgaagac gttagctaa 1419 <210> 2 <211> 2023 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 2 acacgctggg ccgattcttc attgaaaata tgcgcgccga tgaagcaacc atgatctttg 60 gcttccgcat caacgcgatt gtctccgtcg tcgtctttgt catcggcgtc attgtcttcc 120 tgagcctcaa gaaaggacag gaaacaccgg aggaagtcga tccgaaatac caggccaagc 180 tcgcagcaga aaaagaaacc gccgcagagg gcctagagag ctcgagcgct ggtaaaaacc 240 tgcatccata tccgaaacag taaaacagtc ctaccgggta cttttgtttc tgtttgatta 300 tttttgcctt gctggtggcg aaagtgatgg cagcagcttt aaaacacggg taggttggga 360 cacgttgaat accgctagag ataaagaggt aaggcactca tatgctggat agaagaacaa 420 aaattgtctg tactctgggc cccgctgtcg ccagcgagga cgccatttta cgtcttgttc 480 aagacggcat gaatgttgcc cgtcttaact tctcccacgg cgaccactcc gatcatgaac 540 agaactacca ctgggtacgt tctgcaaccg acgctaccgg ccgtgcagtg ggtatcctgg 600 cggacttgca aggcccgaag atccgcctag gccgctttgt taatggcgcg gaacagtggg 660 ataacgatga aatcgtgcgc attaccgtcg aggatgtcga aggtacccac gatcgtgtct 720 ccacgaccta taagaacctc gcgaaggatg ccaagccggg cgatcgcctg cttatcgatg 780 acggcaaggt agccattgag tgcatcgaag tcgatggcaa cgatgttgtc tgccgcgtga 840 ccgaaggcgg accagtctct aacaacaagg gcgtatcctt gcctggcatg gatatttccg 900 tgccagcgtt gagtgagaag gatatcgcgg acctgcgctt tgccttgaag ctgggcgtag 960 actttatcgc tttgtctttc gtgcgttcgc ctgctgatat tgacctggtt cacgcgatta 1020 tggatgagga aggccgtcgc gttcctgtca tcgcgaagct ggagaagcct gaagcagttg 1080 acgcgcttga atccatcatc ttggcattcg acgccgtcat ggttgctcgt ggtgacttgg 1140 gcgttgaggt cccactggag caggttccac tggtacaaaa gcgtgccgtg cagattgctc 1200 gcgagaatgc gaagcccgtc atcgtggcaa cccagatgct ggattccatg attgaaaact 1260 cccgcccaac tcgcgcggag gcatcggatg tcgcgaacgc ggtactcgat ggtgcagatg 1320 ccgttatgct ctctggtgag acttctgtgg gcgttgaccc gcacaacgtg gtgcgcacca 1380 tggcgcgcat cgtgcagcgt gcagagaccg atggccgcgt gccaccgcta tcgcatgttc 1440 cacgcaccaa gcgtggcgtt atttcctact cggcgcgtga tattgccgag cgtctgaatg 1500 cgaaggcaat cgtagctttc accacctcgg gtgacacggc taagcgcgtt gctcgtttgc 1560 actcgcactt gccgctgttg gtctttactc cacatgaagc cgtgcgttcc cagctcgcgc 1620 tgacgtgggg tgcgcagacc ttcttgacca aggatgtgga atccaccgac gcaatgatgt 1680 tggcgatgga taaggcactg ctggaaatgg aagactacga agaaggcgac ttggtcgtcg 1740 ttgtagcggg taccccagct ggtattgctg gaaataccaa catgattcac gcacacgaac 1800 tcggcgaaga cgttagctaa tcaccgcctc gcttaaagcc gctagctcac tgtgagttag 1860 cggctctagt gttgcgtggg ggaagttact agcggaacct gtccgcgcat tagtattcgg 1920 gcggtgcgaa tcagcgaggt tgatgttagc tcgccgttgt cgtagttcgc cgcagcgata 1980 accgcaccgg aaggcgtgcc caggcgggta tgggtgagct ggc 2023 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 ctagtctaga acacgctggg ccgattcttc attg 34 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 accgggatcc ggccagctca cccataccc 29

Claims (6)

1. 서열번호 1의 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 5'-이노신산을 생산하는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물을 형질전환시켜 얻어진 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물.
2. 제1항에 있어서, 상기 재조합 벡터가 서열번호 2의 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물.
3. 제2항에 있어서, 상기 재조합 벡터가 pECCG117-pyk인 것을 특징으로 하는 미생물.
4. 제3항에 있어서, 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJHJ01(KCCM-10529)인 것을 특징으로 하는 미생물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 배양하고, 그 배양액으로부터 5'-이노신산을 분리하는 단계를 포함하는 5'-이노신산의 제조방법.
6. 서열번호 1의 유전자.

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