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KR100576341B1 - 5'-뉴클레오티다제를 코딩하는 유전자가 불활성화된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 5'-이노신산의 제조방법 - Google Patents

5'-뉴클레오티다제를 코딩하는 유전자가 불활성화된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 5'-이노신산의 제조방법 Download PDF

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KR100576341B1
KR100576341B1 KR1020030091342A KR20030091342A KR100576341B1 KR 100576341 B1 KR100576341 B1 KR 100576341B1 KR 1020030091342 A KR1020030091342 A KR 1020030091342A KR 20030091342 A KR20030091342 A KR 20030091342A KR 100576341 B1 KR100576341 B1 KR 100576341B1
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corynebacterium
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microorganism
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nucleotidase
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김성준
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Abstract

본 발명은 5'-이노신산을 생산하는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물로서, 서열번호 1의 유전자 또는 서열번호 1의 서열과 90% 이상의 상동성을 가지고 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물의 5'-뉴클레오티다제(5'-nucleotidase)를 코딩하는 유전자가 불활성화된 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물 및 이를 이용한 5'-이노신산의 제조방법을 제공한다. 또한 본 발명은 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물의 5'-뉴클레오티다제를 코딩하는 유전자 및 상기 유전자를 치환함으로써 5'-뉴클레오티다제를 불활성화시키는 유전자를 제공한다.
코리네박테리움 암모니아게네스, 5'-이노신산, 5'-뉴클레오티다제

Description

5'-뉴클레오티다제를 코딩하는 유전자가 불활성화된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 5'-이노신산의 제조방법{Microorganisms of Corynebacterium having an enactivated gene encoding 5'-nucleotidase and processes for the preparation of 5'-inosinic acid using the same}
도1은 ushA를 불활성화시키는 유전자의 클로닝 과정을 나타낸다.
도2는 pBSF-ushA를 염색체 DNA로 삽입함으로써 ushA를 불활성화시키는 과정을 나타낸다.
본 발명은 5'-이노신산(5'-inosinic acid)을 생산하는 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속 미생물로서, 5'-뉴클레오티다제(5'-nucleotidase)를 코딩하는 유전자(이하 "ushA 유전자"라 함)가 불활성화된 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속 미생물 및 이를 이용한 5'-이노신산의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물의 5'-뉴클레오티다제를 코딩하는 유전자 및 상기 유전자를 치환함으로써 5'-뉴클레오티다제를 불활성화시키는 유전자에 관한 것이다.
5'-이노신산은 핵산 생합성 대사계의 중간물질로서, 동식물의 체내에서 생리적으로 중요한 역할을 수행할 뿐 아니라 식품, 의약품 및 각종 의료적 이용 등 다방면에 이용되고 있고, 특히, 글루타민산 나트륨과 같이 사용하면 맛의 상승효과가 커서 정미성 조미료로 각광을 받고 있는 핵산계 조미료 중 하나이다. 현재, 5'-이노신산은 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 균주, 예를 들어 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)를 발효시킴으로써 제조하는 방법이 알려져 있다 (대한민국 특허공개 제2003-42972호 등).
한편, ushA 유전자는 미생물에서 핵산을 분해함으로써 핵산 농도를 감소시키는 작용을 한다고 보고된 바 있다(Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology: 2nd edition: 561∼579). 따라서, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 균주를 배양하여 5'-이노신산을 제조하는 경우에도 균주의 발효과정에서 ushA 유전자가 발현되어 5'-뉴클레오티다제가 생성되게 되므로, 결과적으로 5'-이노신산의 수율이 저하되는 문제가 발생하게 된다.
따라서, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 균주에서 ushA 유전자가 발현되는 것을 억제하거나 불활성화할 경우, 5'-이노신산를 높은 수율로 제조할 수 있을 것으로 기대된다. 그러나, 현재까지 다른 일부의 미생물에서의 ushA 유전자의 서열은 보고된 바 있으나, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물의 ushA 유전자는 아직 보고되어 있지 아니하며, 더욱이 ushA를 불활성화시킨 변이주도 보고된 바 없다.
본 발명은 상기 선행기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물의 ushA 유전자가 불활성화된 미생물 및 이를 이용한 5'-이노신산의 제조방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 ushA 유전자 및 이와 치환되어 ushA 유전자를 불활성화시키는 유전자를 제공한다.
따라서, 본 발명은 5'-이노신산을 생산하는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물로서, 5'-뉴클레오티다제(5'-nucleotidase)를 코딩하는 유전자가 불활성화된 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 미생물을 이용한 5'-이노신산의 제조방법을 제공하는 것을 포함한다.
또한, 본 발명의 목적은 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물의 5'-뉴클레오티다제를 코딩하는 유전자를 제공하는 것을 포함한다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물의 5'-뉴클레오티다제를 코딩하는 유전자를 치환함으로써 ushA 유전자를 불활성화시키는 유전자를 제공하는 것을 포함한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 5'-이노신산을 생산하는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물로서, 서열번호 1의 유전자 또는 서열번호 1의 서열과 90% 이상의 상동성을 가지고 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물의 5'-뉴클레오티다제(5'-nucleotidase)를 코딩하는 유전자가 불활성화된 코 리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물이 제공된다.
본 발명자들은 5'-이노신산을 생성하는 미생물로 알려져 있는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물 예를 들어, 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) ATCC 6872의 염색체 서열분석을 수행하였으며, 5'-뉴클레오티다제를 코딩하는 유전자의 DNA염기서열을 분석하였다. 그 결과, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물의 ushA 유전자는 약 2 kb의 서열번호 1의 염기서열을 갖는다는 것을 밝혀냈다.
따라서, 본 발명에 따른 미생물은 상기 서열번호 1의 유전자가 불활성화된 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물이며, 서열번호 1의 유전자에 대한 통상의 치환, 결실, 및/또는 삽입에 의해 서열번호 1의 서열과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 가지고 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물의 5'-뉴클레오티다제를 코딩하는 유전자가 불활성화된 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물을 포함한다.
본 발명의 미생물은 상기 서열번호 1의 유전자 또는 서열번호 1의 서열과 90% 이상의 상동성을 가지고 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물의 5'-뉴클레오티다제를 코딩하는 유전자가 치환(replacement)에 의해 불활성화된 미생물이 바람직하다. 상기 치환은 약 1.1kb의 서열번호 2의 유전자에 의해 이루어지는 것이 바람직하며, 또한 서열번호 2의 유전자에 대한 통상의 치환, 결실, 및/또는 삽입에 의해 서열번호 2의 유전자와 약 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 갖고, 코리네박테리움 암 모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)의 5'-뉴클레오티다제(ushA) 활성을 가지지 않는 단백질을 코딩하는 유전자에 의해 이루어지는 것을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 미생물은 상기 서열번호 2의 유전자 또는 서열번호 2의 서열과 80% 이상의 상동성을 가지고, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물의 5'-뉴클레오티다제 활성을 가지지 않는 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 5'-이노신산을 생산하는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물을 형질전환시키고, 5'-뉴클레오티다제가 불활성화된 균주를 선별하여 얻어진 미생물이다.
상기 재조합 벡터는 상기 서열번호 2의 유전자 또는 서열번호 2의 서열과 80% 이상의 상동성을 가지고, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물의 5'-뉴클레오티다제 활성을 가지지 않는 단백질을 코딩하는 유전자를 중합효소연쇄반응(Polymerase Chaine Reaction, PCR)을 통하여 증폭한 DNA 단편의 양 말단을 DNA 제한효소, 예를 들어 XbaI 및 BamHI 등으로 절단하고, 동일한 DNA 제한효소로 절단한 벡터에 DNA T4 리가아제 등을 사용하여 삽입시켜 제조할 수 있다. 사용가능한 벡터는 특별히 제한되는 것은 아니며, 공지된 발현벡터를 사용할 수 있다. 바람직하게는 본 발명자들이 개발한 pBSG 벡터를 사용할 수 있다(수탁번호: KCCM-10532). 이렇게 제조된 플라스미드 벡터는 대장균(Escherichia coli)에 통상적인 일렉트로포레이션(electroporation) 방법을 이용하여 전달할 수 있으며, 공지의 방법에 따라 재조합 벡터를 수거할 수 있다(Quiagen plasmid preparation KIT). 따라서, 상기 재조합 벡터는 상기 pBSG 벡터에 서열번호 2의 유전자를 삽입 시켜 제조한 pBSG-ushA가 바람직하다.
상기 선형 DNA단편을 통상적인 일렉트로포레이션(electroporation)을 방법을 이용하여 미생물 균주(예를 들어, 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJHB100(KCCM-10330), 대한민국 특허공개 제2003-42972호)에 전달하고, 재조합 벡터, 예를 들어 pBSG-ushA 벡터에 위치하는 미생물 염색체와의 상동부위와 상동인 미생물 염색체 상의 부위에서 상동 재조합에 의하여 상기 pBSG-ushA 벡터를 미생물 균주 염색체의 ushA 유전자의 내부에 치환시켜 ushA 유전자를 불활성화시킨 후 미생물 변이주를 선별마커인 항생제 젠타마이신(gentamycine)를 포함하는 배지에서 배양하여 선별할 수 있다. 선별된 변이주 내의 동성 재조합에 의한 pBSG-ushA의 유전체 내로의 삽입을 PCR을 통하여 확인 할 수 있다. 상기 유전자의 클로닝 과정을 간략히 나타내면 도1과 같다.
더욱 바람직하게는, 본 발명의 미생물은 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJWS01(KCCM-10528)이다.
본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 본 발명의 미생물을 배양하고, 그 배양액으로부터 5'-이노신산을 분리하는 단계를 포함하는 5'-이노신산의 제조방법이 제공된다.
상기 본 발명의 미생물은 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민등을 함유한 통상의 배지내에서 호기성 조건하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
탄소원으로서는 글루코오스, 프럭토오스, 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으 로 전환된 당밀)등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있고, 질소원으로서는 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄과 같은 각종 무기질소원 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크, 또는 그의 분해생성물등 유기질소원이 사용될 수 있다. 무기화합물로는 인산1수소칼륨, 인산2수소칼륨, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘등이 사용될 수 있으며, 이외에 필요에 따라 비타민 및 영양요구성 염기등이 첨가될 수 있다. 배양은 호기적 조건하에서 예를 들면, 진탕배양 또는 통기교반배양에 의해, 바람직하게는 20∼40℃의 온도에서 수행될 수 있다. 배지의 pH는 배양하는 동안 중성근처에서 유지하는 것이 바람직하며, 배양은 5∼6일 동안 수행할 수 있으며 직접발효법에 의해서 축적된 5-이노신산을 통상의 방법으로 회수할 수 있다.
상기 본 발명의 제조방법에 따라 5'-이노신산을 제조할 경우, 핵산을 분해하는 효소인 ushA 유전자가 불활성됨으로써, 높은 수율로 5'-이노신산을 제조할 수 있다.
본 발명의 또다른 태양에 따라, 상기 서열번호 1의 유전자 또는 서열번호 1의 서열과 90% 이상의 상동성을 가지고 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물의 5'-뉴클레오티다제를 코딩하는 유전자가 제공된다.
본 발명의 또다른 태양에 따라, 상기 서열번호 2의 유전자 또는 서열번호 2의 서열과 80% 이상의 상동성을 가지고, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물의 5'-뉴클레오티다제 활성을 가지지 않는 단백질을 코딩하는 유전자가 제공된다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. ushA 유전자의 클로닝
BSG-ushA 벡터를 도1에 간략하게 나타낸 바와 같이 제작하였다. pBSG 벡터는 Gm R 및 sacB 유전자를 포함한다.
중합효소연쇄반응을 통하여 얻은 서열번호 2의 유전자 단편을 제한효소 XbaI(New England Biolabs, Beverly, MA)과 BamHI(New England Biolabs, Beverly, MA)으로 절단하였다. 리가아제(New England Biolabs, Beverly, MA)를 이용하여 상기 유전자 단편을 XbaI과 BamHI 제한효소로 절단시킨 선상의 pBSG 벡터에 접합하였다. 접합된 DNA를 대장균 GM2525(Escherichia coli genetic stock center, Yale University, New Haven, Connecticut)에 일렉트로포레이션(electroporation)을 통하여 형질전환하여 1리터 당 젠타마이신(gentamycin)은 5 ㎎ 되게 항생제가 포함된 LB 고체배지(효모엑기스 10 g/L, 박토트립톤 10g/L, 염화나트륨 10 g/L, 박토아가 1.7%, pH 7.0)에서 자란 단일 콜로니들을 회수하였다. 회수된 콜로니들을 동일한 항생제가 첨가된 LB 배지에서 배양한 균체로부터 플라스미드를 분리하여 포함된 플라스미드의 크기를 일차로 확인하고 2차로 다시 Xba I과 BamHI으로 2중 절단하여 1107 bp 크기의 DNA 절편이 나오는지를 확인함으로써 ushA 유전자 단편이 포함된 재조합 플라스미드 pBSG-ushA(5.5 kb)를 제작하였다.
여기에 사용된 프라이머들은 각각 다음과 같다.
프라이머 ushA-F (서열번호 3) : 5`-ACGGCGTCAAGGTGGGATTT-3`
프라이머 ushA-B (서열번호 4) : 5`-GGGTGCCTTCGGTGCTGATAC-3`
실시예 2. 모균주 CJHB100(KCCM-10330)의 젠타마이신(gentamycin: 이하 Gm) 최소저해농도 분석
우선 접종시 농도를 104 CFU/ul되도록 준비하기 위해서 3ml 의 종배지에서, 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJHB100(KCCM-10330)을 12시간 배양 (108 ∼107 CFU/㎕l)시키고, 젠타마이신의 최소저해 농도를 확인할 한천 영양배지(펩톤 1%, 육즙 1%, 염화나트륨 0.25%, 효모엑기스 1%, 한천 2% pH7.2)를 제조하였다. 20ml의 한천배지를 플래이트에 각각, 5, 4, 3, 1.5, 1, 0.8, 0.4, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001 mg/l 이 되도록 첨가하였다. 상기 3ml의 종배지에서 자란 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJHB100(KCCM-10330)를 106 배 희석하여 준비한 플래이트에 도말하였다. 도말한 플래이트를 32℃에서 96 시간 동안 배양한 결과 젠타마이신 0.005mg/L 이상에서는 균주가 자라지 않았으며 상기 결과로부터 ushA 유전자가 불활성화된 균주를 선별하는데, 최소저해농도인 0.005mg/L 보다 10배 높은 0.05mg/L을 사용하였다.
실시예 3. 재조합 플라스미드의 삽입으로 염색체 상의 ushA 유전자가 불활성된 균주의 선별
대장균 GM2525로부터 분리한 재조합 플라스미드 pBSG-ushA를 사용하여 5'-이노신산 생산균주인 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJHB100(KCCM-10330)에 형질전환하여 0.05 mg/L 젠타마이신이 첨가된 CM 고체배지 (효모엑기스 10 g/L, 박토트립톤 10g/L, 염화나트륨 2.5 g/L, 박토아가 1.7%, 아데닌 100mg/L, 구아닌 100mg/L, pH 7.0)에 도말하여 32℃에서 96시간 동안 배양하였다. 단일 콜로니들 중합효소연쇄반응을 통해서 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJHB100(KCCM-10330)의 염색체의 특정 위치에 삽입된 재조합 균주를 선별하였다. 여기에 사용된 프라이머는 다음과 같으며, pBSG-ushA를 염색체 DNA로 삽입함으로써 ushA 유전자를 불활성화하는 과정은 도2와 같다.
프라이머 ushA-FC (서열번호 5) : 5'-GCTGGGCGCGAATGTCACCTTA-3'
프라이머 ushA-FB (서열번호 6) : 5'-GAAAGACCGCCCGCTGTTGAGAC-3'
상기 과정을 통해 선별된 염색체 상의 ushA 유전자가 불활성된 균주를 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJWS01로 명명하였으며, 2003년 11월 17일 한국미생물보존센터에 기탁하였다(수탁번호: KCCM-10528).
실시예 4. 삼각플라스크 발효역가 시험
종배지 3ml을 지름18mm 시험관에 분주하고 가압살균한 후 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJWS01(KCCM-10528)를 접종하고 30 ℃ 온도에서 24시간 진탕배양하여 종배양액으로 사용하였다. 발효배지 27ml를 500ml 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 120℃ 온도에서 10분간 가압살균하여 종배양액 3ml을 접종한 다음 5∼6일간 배양하였다. 회전수는 분당 200회, 온도32℃, pH7.2으로 조절하였다. 배지내 5'-이노신산 축적량은 모균주인 CJHB100(KCCM-10330)보다 약 5 % 향상되었다. 상기 종배지 및 발효배지의 조성은 다음과 같다.
종배지 : 포도당 5%, 펩톤 0.5%, 육즙 0.5%, 효모엑기스 1%, 염화나트륨 0.25%, 아데닌 100mg/l, 구아닌100mg/l, pH7.2
플라스크 발효배지: 글루타민산 나트륨 0.1%, 암모늄클로라이드 1%, 황산마그네슘1 .2%, 염화칼슘 0.01%, 황산철 20mg/l, 황산망간 20mg/l, 황산아연 20mg/l, 황산구리 5mg/l, L-시스테인 23mg/l, 알라닌 24mg/l, 니코틴산 8mg/l, 비오틴 45㎍/l, 티아민염산 5mg/l, 아데닌 30mg/l, 인산(85%) 1.9%, 과당, 포도당 및 당밀을 혼합하여 환원당으로 8% 되게 첨가하여 사용
실시예 5. 5-L 발효조에서의 발효역가 실험
실시예 43의 종배지 50ml를 500ml 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 가압살균한 후 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJWS01(KCCM-10528)를 접종하고 30℃에서 24시간 동안 진탕배양하여 종배양액으로 사용하였다. 발효조 종배지 1000ml를 2.5L-발효조에 넣고 120℃에서 15분간 가압살균하여 종배양액 50ml를 접종한 다음, 1∼2일간 배양하였다. 회전수는 분당 900회, 온도 28∼34℃, pH7.2 으로 조절하였다. 또한, 발효조 본배지 1250ml을 5L-발효조 에 넣고 120℃에서 15분간 가압살균하여 발효조 종배지액 250ml을 접종한 다음, 배양하면서 배양액내에 환원당이 2%가 되었을때 1차 및 2차, 3차, 4차 추가당을 과당, 포도당 및 당밀을 혼합하여 최종 환원당으로 각각 32% 되도록 첨가하여 5∼6일간 배양하였다. 회전수는 분당 900회, 온도32℃, pH7.2으로 조절하였다. 이때 배지내 5'-이노신산 축적량은 모균주인 CJHB100(KCCM-10330)보다 4 % 향상되었다. 상기 발효조 종배지 및 발효조 본배지의 조성은 다음과 같다.
발효조 종배지: 포도당 5.4%, 펩톤 1%, 효모엑기스 2%, 인산제1칼륨 0.1%, 인산제2칼륨 0.1%, 황산마그네슘 0.1%, 황산암모늄 0.5%, 황산철 80mg/l, 황산아연 40mg/l, 황산망간 40mg/l, L-시스테인 80mg/l, 칼슘판토테네이트 60mg/l, 티아민 염산염 20mg/l, 비오틴 240㎍/l, 아데닌 1200mg/l, 구아닌 1200mg/l (pH7.2)
발효조 본배지: 염화칼슘 120mg/l, 황산구리 8mg/l, 황산마그네슘 1.5%, 황산철 24mg/l, 황산아연 24mg/l, 황산망간 20mg/l, L-시스테인 26.4mg/l, 글루타민산 나트륨 0.12%, 티아민 염산염 6mg/l, 비오틴 40㎍/l, 니코틴산 50mg/l, 알라닌 145mg/l, 아데닌 200mg/l, 인산(85%) 4.3%, 과당, 포도당 및 당밀을 혼합하여 환원당으로 32% 되게 첨가하여 사용 (pH7.2)
본 발명에 따른 5'-뉴클레오티다제(5'-nucleotidase)를 코딩하는 유전자가 불활성화된 코리네박테리움 속 미생물은 5'-이노신산을 고수율 및 고농도로 배양액중에 직접 축적시키는 미생물로서, 이를 이용한 본 발명의 제조방법은 높은 수율로 5'-이노신산을 제조할 수 있도록 한다.
<110> CJ Corp. <120> Microoranisms of Corynebacterium having an enactivated gene encoding 5'-nucleotidase and processes for the preparation of 5'-inosinic acid using the same <130> PN052456 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1929 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 1 atgggggcgg ccaagctcaa ggaactgatt gagtacgtta atcaggacca ggaatacatc 60 atgactacct ccggcgataa cgtcggcggt agcgctttcg tctcggcaat cgctgatgat 120 gagccaaccc tagatgtcct caacatgctc ggcgttgacg tctctgcggt aggtaaccat 180 gaattcgacc gcggctatga cgatttgctc ggtcgtattg ctgaaaaatc cgcctaccca 240 ttgctgggcg cgaatgtcac cttaaacggt gaaccgatgt tggatgcttc ctacgttcaa 300 gaaattgacg gcgtcaaggt gggatttgtc ggtactgtga ccaccttgac taaggacaag 360 gtcgcaccat ccgcagttga aggtgtggag ttttctgacc ccgtcgaggc tacgaataag 420 gaatctgacc gtctgaagga atctggcgaa gcagacgttg ttgtagcgct catgcacgag 480 gacgcgcagc agtacgctgc tggcttcaac aacaatgtgg atatcctttt cggaggcgac 540 tctcaccagc gctcgcaggg catcatcgaa cgtgatggtg cgcagccact gcactgggcg 600 caggggcatg aatatggcaa ggttctccaa gacgccgata tttcctttaa caaggacacc 660 ggcgaaattg agtccgtcga aatcacccag tacgaccgct cgatgcctga ggttgaagca 720 ctagcccctg atgcagaaat tgccgctcgc gtggcagccg ctgaggcaga agctgaagag 780 cttggagcta aagttgtcgg ccagatggac cgcgctactt tccgtggtca agatgagggc 840 gcaggagcgg ggagcaaccg cggtgttgaa tctacgttga actcgctaat tgctgatgcc 900 aaccgcgcat cagttgctaa ggcgactggt gcggacgtgg atttgggcat tatgaatgct 960 ggtggcgtac gtgctgacct tcctgcaggc gatgtcactt tccaggatgt gcttaccgtg 1020 cagcctttcg gcaattcgat tgcatacggc actttgaccg gccaagatat tttggatgct 1080 ttggaagctc agtggcagcc aggatcgtct cgtccacgct tggctttggg tctatctgct 1140 ggatttgagt acgcctacga cccaactgca gagcaaggcc agcgcgttat ctccgcgacc 1200 ttggatggcg aagaaattga cccatcagcg gaatacactg ttgcaacttc cacgttcctc 1260 ttcgatggtg gcgacaactt cgcatctctg gccaatgtcc aaaacctcac tgacgtgggc 1320 tacatggact actcagttct caatgactac atcaaagatg gcgcagaggt acaggaaggc 1380 cagtctgata tcggtatcag caccgaaggc accctggcag ctggtgaaga agttaccttc 1440 aacctcacct cgcttaacta cactatggaa gaagatccac aagccaccac agcgaccgtc 1500 accgtgggcg acgtgcaaga aaccgccgat atcgacgctc agtggaatgc tgaagaagat 1560 ccgcagaaga atgaatttgg ccgtgctagc gtaacgctga ctctgccaga ggacattgag 1620 gaaaccgact tggttaccgt aaccaccgat gccggcaccg agattactgt gccgctgagg 1680 gccttgggca ccaacgaggg cacggacggc ggctccaatc ctggcagcag cgcacctggc 1740 acaggtaagg gctcttctcg gggtgcttcg gctgctgcag gaatcgctgg agtgttggca 1800 gcgattgcgg gcatcgccgc gtttattggt ctgaacggtc agtttgatca gttcatccca 1860 gctaacatgc agcgcgctct tggtgacctg cgcagtcagc tcaacgaggt tagccacatc 1920 aaattctag 1929 <210> 2 <211> 1066 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 2 gtcggtactg tgaccacctt gactaaggac aaggtcgcac catccgcagt tgaaggtgtg 60 gagttttctg accccgtcga ggctacgaat aaggaatctg accgtctgaa ggaatctggc 120 gaagcagacg ttgttgtagc gctcatgcac gaggacgcgc agcagtacgc tgctggcttc 180 aacaacaatg tggatatcct tttcggaggc gactctcacc agcgctcgca gggcatcatc 240 gaacgtgatg gtgcgcagcc actgcactgg gcgcaggggc atgaatatgg caaggttctc 300 caagacgccg atatttcctt taacaaggac accggcgaaa ttgagtccgt cgaaatcacc 360 cagtacgacc gctcgatgcc tgaggttgaa gcactagccc ctgatgcaga aattgccgct 420 cgcgtggcag ccgctgaggc agaagctgaa gagcttggag ctaaagttgt cggccagatg 480 gaccgcgcta ctttccgtgg tcaagatgag ggcgcaggag cggggagcaa ccgcggtgtt 540 gaatctacgt tgaactcgct aattgctgat gccaaccgcg catcagttgc taaggcgact 600 ggtgcggacg tggatttggg cattatgaat gctggtggcg tacgtgctga ccttcctgca 660 ggcgatgtca ctttccagga tgtgcttacc gtgcagcctt tcggcaattc gattgcatac 720 ggcactttga ccggccaaga tattttggat gctttggaag ctcagtggca gccaggatcg 780 tctcgtccac gcttggcttt gggtctatct gctggatttg agtacgccta cgacccaact 840 gcagagcaag gccagcgcgt tatctccgcg accttggatg gcgaagaaat tgacccatca 900 gcggaataca ctgttgcaac ttccacgttc ctcttcgatg gtggcgacaa cttcgcatct 960 ctggccaatg tccaaaacct cactgacgtg ggctacatgg actactcagt tctcaatgac 1020 tacatcaaag atggcgcaga ggtacaggaa ggccagtctg atatcg 1066 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 acggcgtcaa ggtgggattt 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 gggtgccttc ggtgctgata c 21 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 gctgggcgcg aatgtcacct ta 22 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 gaaagaccgc ccgctgttga gac 23

Claims (9)

  1. 5'-이노신산을 생산하는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물로서, 서열번호 1의 유전자가 치환, 결실, 또는 삽입에 의해 불활성화된 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 유전자가 서열번호 2의 유전자에 의한 치환에 의해 불활성화된 것을 특징으로 하는 미생물.
  3. 삭제
  4. 제2항에 있어서, 상기 서열번호 2의 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pBSG-ushA로 5'-이노신산을 생산하는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물을 형질전환시키고, 5'-뉴클레오티다제가 불활성화된 균주를 선별하여 얻어진 미생물.
  5. 삭제
  6. 제4항에 있어서, 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJWS01(KCCM-10528)인 것을 특징으로 하는 미생물.
  7. 제1항, 제2항, 제4항, 및 제6항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 배양하고, 그 배양액으로부터 5'-이노신산을 분리하는 단계를 포함하는 5'-이노신산의 제조방법.
  8. 서열번호 1의 유전자.
  9. 서열번호 2의 유전자.
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