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CN100529060C - 具有提高l-赖氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物及使用其生产l-赖氨酸的方法 - Google Patents

具有提高l-赖氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物及使用其生产l-赖氨酸的方法 Download PDF

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CN100529060C
CN100529060C CNB2006101631425A CN200610163142A CN100529060C CN 100529060 C CN100529060 C CN 100529060C CN B2006101631425 A CNB2006101631425 A CN B2006101631425A CN 200610163142 A CN200610163142 A CN 200610163142A CN 100529060 C CN100529060 C CN 100529060C
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Abstract

提供了一种其内含有失活的内源NCgl1835基因并且生产L-赖氨酸的棒状杆菌属微生物，和利用其生产L-赖氨酸的方法。

Description

具有提高L-赖氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物及使用其生产L-赖氨酸的方法
相关专利申请的相互参考
本申请要求于2005年11月30日提交于韩国知识产权局的韩国专利申请号10-2005-0115906的权益，将其全部内容并入作为参考。
发明背景
发明领域
本发明涉及一种具有提高L-赖氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物及使用其生产L-赖氨酸的方法。
相关领域的描述
棒状杆菌属(Corynebacterium genus)微生物，尤其是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是革兰氏阳性微生物，用于生产L-氨基酸。L-氨基酸，尤其是L-赖氨酸广泛应用于动物饲料和医学供给，通过发酵棒状杆菌属微生物生产。这样，棒状杆菌属微生物对于生产L-氨基酸是重要的，而且因此已经开展了大量的关于改进生产L-氨基酸的方法的研究。
本研究包括一种改良生产L-氨基酸的棒状杆菌属微生物的方法，所述改良是利用重组DNA技术破坏特定的基因或者减弱特定基因的表达。例如，美国专利号6,872,553公开了一种利用棒状杆菌属微生物通过发酵生产L-赖氨酸的方法。方法包含：培养棒状杆菌属微生物，所述微生物具有被减弱的编码烯醇丙酮酸磷酸(PEP)羧基激酶(pck)的DNA，所述微生物通过培养至少一个突变体而来，所述突变体选自由下列组成的组：至少一个碱基对插入进DNA的插入突变，至少一个碱基从DNA序列中缺失的缺失突变，在DNA中引入一个无义密码子或者与那些没有减弱的棒状杆菌属微生物相比具有减弱的烯醇丙酮酸磷酸(PEP)羧基激酶(pck)活性的碱基对转换和颠换突变；从微生物培养基或细胞中浓缩所需的L-氨基酸产物；和分离L-氨基酸。
另外，大量的通过扩增基因来研究参与L-氨基酸生物合成的每个基因是如何影响L-氨基酸的产量的，并以此来改良棒状杆菌属微生物的研究已经开展(Eggeling，Amino Acids 6，261-272(1994))。并且，棒状杆菌属微生物能够通过引入来自其它细菌的外源基因来改良。例如，日本专利出版物hei7-121228公开了一种生产L-谷氨酸和L-脯氨酸的方法。所述方法包括培养棒状杆菌属或短杆菌属微生物，所述微生物包含含有参与柠檬酸合成的合酶的遗传信息的DNA片段和载体DNA的重组构建，和从培养基中生产L-谷氨酸和L-脯氨酸。
然而，对于具有提高L-赖氨酸生产能力的微生物的需求仍然存在。
发明概述
本发明提供了一种具有提高L-赖氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物。
本发明还提供了一种使用所述微生物生产L-赖氨酸的方法。
附图简述
以附图作为参考，通过详细描述其可实施的实施方案，本发明的上述及其他特征及优点将会更加明显：
图1是pCR-1835载体图，约500bp的NCgl1835基因片段克隆于其中。
发明详述
本发明提供了一种其内含有失活的内源NCgl1835基因并且生产L-赖氨酸的棒状杆菌属微生物。
在本发明的微生物中，内源NCgl1835基因是一种存在于棒状杆菌属微生物中的内源性的基因，作为转录调控因子(EC：2.7.1.63)广为人知。此基因的活性是通过对谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组的完整序列分析预测的。优选的，该基因可能具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列。
在本发明的微生物中，具有失活的内源NCgl1835基因的棒状杆菌属微生物可以是谷氨酸棒杆菌ATCC 13032，嗜热水解蛋白棒状杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)FERM BP-1539，谷氨酸棒杆菌KFCC 10881，和谷氨酸棒杆菌KFCC 11001，但并不局限于这些。
在本发明中，失活可以通过本领域的技术人员熟知的任意失活方法实现。在本发明中，术语“失活”意指与野生株相比NCgl1835基因的表达降低到低水平，或产生了不表达的基因或基因表达的产物没有活性或尽管表达但是活性降低。
在棒状杆菌属微生物中，失活可以由至少一种选自由下列突变组成的组引起：至少一个碱基对插入到NCgl1835基因的插入突变，至少一个碱基对从NCgl1835基因序列中缺失的缺失突变，将无义密码子引入到NCgl1835基因的碱基对转换和颠换突变。
在棒状杆菌属微生物中，失活的NCgl1835基因可以通过用包含部分NCgl1835基因和抗性标记的载体转化棒状杆菌属微生物，并且在抗性标记存在的情况下培养转化的微生物而筛选。优选的，载体是pCR-1835载体，包含序列为SEQ ID NO：2的NCgl1835基因片段。将包含部分基因序列的载体转化微生物，并且当转化微生物在选择性标记存在的情况下培养时，部分基因序列与微生物的内源基因间发生同源重组。微生物的内源基因被同源的重组构建重组，并且在重组的基因中，通过筛选标记只有包含抗性标记的重组子被筛选出来。结果是，得到了内源NCgl1835基因失活的棒状杆菌属微生物。但是，根据本发明的现有的实施方案的获得棒状杆菌属微生物的方法并不局限于同源重组，并且可以是本领域中的普通技术人员熟知的任何一种方法。
棒状杆菌属微生物可以是谷氨酸棒杆菌KFCC 10881-CJP5101(保藏号KCCM-10708P)。
本发明还提供了一种根据本发明的实施方案生产L-赖氨酸的方法，方法包含：在培养物或细胞中培养棒状杆菌属微生物生产L-赖氨酸；和从培养物中收集L-赖氨酸。
在根据本发明的现有实施方案的生产L-赖氨酸的方法中，棒状杆菌属微生物可以使用本领域中普通技术人员熟知的任何一种培养基条件和方法培养。培养棒状杆菌属微生物的培养基的例子可以是美国细菌学会(Washington D.C.，USA，1981)的Manual of Methods for GeneralBacteriology中公开的培养基。能够应用于培养基的碳水化合物原料包括下列：糖和碳水化合物如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，淀粉和纤维素；油和脂肪如大豆油，向日葵油，蓖麻油，和椰子油；脂肪酸如棕榈酸，硬脂酸和亚麻酸；醇类如丙三醇，乙醇；和有机酸如醋酸。上面提到的糖源可以单独使用也可组合使用。氮源的例子包括下列：蛋白胨，酵母提取物，肉膏，麦芽汁，玉米浆，大豆汁，和尿素或者无机化合物如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵，和硝酸铵。上面提到的氮源可以单独使用也可组合使用。磷源的例子包括下列：磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，或其相应的钠盐。还有，培养基可以包含金属盐，如硫酸镁或硫酸铁，其对于生长是必需的。另外，除了上面的成分，可以使用对于生长必需的物质如氨基酸和维生素。而且，在培养基中可以加入适当的前体。上面这些成分可以在培养的过程中一次或以连续方式加入培养基中。
培养基的pH值可以通过使用碱性化合物如氢氧化钠，氢氧化钾或氨，或酸性化合物如磷酸或硫酸来控制。而且，消泡剂如脂肪酸聚乙二醇酯的使用可以抑制泡沫的形成。氧气或者一种包含氧气的气体如空气可以注入培养基中以保持好气条件。培养基的温度可以是20到45℃，优选25到40℃。培养可以一直进行直到生产出所需的L-赖氨酸的量，但是培养最好进行10到160小时。
通过分批，补料分批，重复补料分批或间歇式方法培养可以连续进行。本领域的普通技术人员非常熟悉这些方法，并且本发明并不局限于这些方法。
L-氨基酸可以通过阴离子交换色谱法和茚三酮衍生化法分离和分析。
为了改良棒状杆菌属微生物及使用其生产L-赖氨酸的方法，本发明的发明者进行了一个这样的实验，在L-赖氨酸存在的情况下培养谷氨酸棒杆菌ATCC 13032，通过双向电泳分析所表达的蛋白质，然后将得到的结果与对照实验的结果相比较，对照实验是在没有L-赖氨酸的情况下培养微生物并分析所表达的蛋白质。结果是，在L-赖氨酸的情况下，蛋白过量表达，也就是，假定的其表达受L-赖氨酸诱导的蛋白被证实。基于得到的蛋白的信息，通过从国家卫生研究院(NIH)核酸序列数据库证实上述蛋白的信息证实上述蛋白就是NCgl1835，NCgl2053等。
另外，证实了在L-赖氨酸存在的情况下该基因的表达是否确实被诱导。首先，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增假定的基因的启动子区的核苷酸区。然后，将扩增的启动子核苷酸与lacZ基因融合制备基因-lacZ融合基因启动子，所述lacZ基因的启动子被移除。其后，将得到的融合基因插入到载体中，用载体转化微生物，在L-赖氨酸存在的情况下培养转化的微生物，通过分析β-半乳糖苷酶的活性以证实lacZ蛋白是否表达。结果是，证实了基因的表达确实受到L-赖氨酸的诱导。
但是，这些基因是如何影响生产L-赖氨酸的微生物中的L-赖氨酸的生物合成的是未知的。除了证实了基因，本发明的发明者们还通过失活棒状杆菌属微生物的内源NCgl1835基因测量了L-赖氨酸的产量，并且证实生产L-赖氨酸的能力得到提高。
在下文中，以下面的实施例作为参考将进一步描述本发明。这些实施例仅为了说明本发明，而非限制本发明的范围。
实施例
在下面的实施例中，为了证实NCgl1835基因是如何影响L-赖氨酸产量的，所述基因其表达在L-赖氨酸存在的情况下被诱导，L-赖氨酸的产量通过失活谷氨酸棒杆菌KFCC 10881的内源NCgl1835基因，并且培养该微生物而测量。
实施例1：失活棒状杆菌属微生物内源NCgl1835基因的载体的制备
为了制备一个包含部分NCgl1835基因序列和抗性标记的载体，使用SEQ ID Nos：3和4的寡核苷酸作为引物，以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032染色体DNA为模板，进行了PCR，扩增了约500bp(SEQ ID NO：2)的NCgl1835基因片段(SEQ ID NO：1中的129-628的核苷酸)。PCR在96℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃聚合30秒，重复30次。使用TOPO克隆试剂盒(Invitrogen，USA)将扩增到的NCgl1835基因片段克隆到大肠杆菌质粒pCR2.1，得到pCR-1835质粒。图1图示了pCR-1835载体，其中克隆进了约500bp的NCgl1835基因片段。
实施例2：失活了谷氨酸棒杆菌KFCC 10881的内源NCgl1835基因的、生 产L-赖氨酸的微生物的制备
使用Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52：541-545中公开的转化方法，利用电脉冲方法将由实施例1制备的pCR-1835质粒转化进谷氨酸棒杆菌KFCC 10881，一种生产L-赖氨酸的微生物。为了证实转化微生物中NCgl1835基因是否被破坏，使用培养2天后的转化微生物的染色体DNA进行了PCR。以转化微生物的染色体DNA为模板，以SEQ ID Nos：5和6的寡核苷酸为引物进行了PCR，扩增了约5,040bp的包含pCR-1835质粒的NCgl1835基因片段(SEQ ID NO：1的100-671间的核苷酸)。结果是，由于同源重组间的杂交，pCR-1835质粒被插入到染色体DNA内源NCgl1835基因的中间部分，得到的微生物证实了NCgl1835基因被破坏。该微生物被命名为谷氨酸棒杆菌KFCC 10881-CJP5101。
根据布达佩斯条约，谷氨酸棒杆菌KFCC 10881-CJP5101于2005年11月16日提交到韩国微生物保藏中心(KCCM)，保藏登记号为KCCM-10708P。
实施例3：利用谷氨酸棒杆菌KFCC 10881-CJP5101生产L-赖氨酸
培养实施例2制备谷氨酸棒杆菌KFCC 10881-CJP5101来生产L-赖氨酸。
首先，谷氨酸棒杆菌KFCC 10881，作为亲株，将谷氨酸棒杆菌KFCC10881-CJP5101接种到其下含有25ml移种培养基的250ml corner-baffledflask中，然后在30℃以200rpm振荡培养20小时。将得到的1ml移种培养基接种到含有24ml下面的生产培养基的250ml corner-baffled flask中，然后在30℃以200rpm振荡培养120小时。培养结束后，通过高效液相色谱(HPLC，Waters 2457)测量L-赖氨酸的产量。结果是，在谷氨酸棒杆菌KFCC 10881和谷氨酸棒杆菌KFCC 10881-CJP5101培养基中的L-赖氨酸的量，以L-赖氨酸中的盐酸化物盐的量来表示，分别是45g/l和50g/l。
移种培养基(pH 7.0)
20g粗糖，10g蛋白胨，5g酵母提取物，1.5g尿素，4g KH2PO4，8gK2HPO4，0.5g MgSO4 7H2O，100μg生物素，1,000μg盐酸硫胺素，2,000μg泛酸钙，2,000μg烟酰胺(基于1L蒸馏水)
生产培养基(pH 7.0)
100g粗糖，40g(NH4)2SO4，2.5g大豆蛋白，5g固体玉米浆，3g尿素，1g KH2PO4，0.5g MgSO4 7H2O，100μg生物素，1,000μg盐酸硫胺素，2,000μg泛酸钙，3,000μg烟酰胺，30g CaCO3(基于1L蒸馏水)
实施例4：从谷氨酸棒杆菌KFCC 10881-CJP5101培养物中收集L-赖氨酸
通过向1L赖氨酸发酵液中加入盐酸将发酵液pH调至pH2.0，并且钙离子转化为CaSO4和CaCl2，所述发酵液通过在含有糖蜜和粗糖的培养基中培养谷氨酸棒杆菌KFCC 10881-CJP5101获得。然后，通过使培养基以向上的方向流动将其吸附到可以以铵的形式再生的阳离子交换树脂(Diaion SK-L10)中。用去离子水冲洗以去除阳离子交换树脂内的残留细菌后，用2N的氨水洗脱树脂收集高浓缩的L-赖氨酸。将收集到的溶液调节pH至5.0，冷却到20℃浓缩和结晶。通过离心分离完全结晶的胶状物得到第一湿产物，将母液批量浓缩和结晶得到第二湿产物。将第一和第二湿产物混合，并且干燥混合产物得到了L-赖氨酸含量为98.5％的47.5g干燥的L-赖氨酸产物。
根据本发明的棒状杆菌属微生物中，由于失活了微生物的内源NCgl1835基因，提高了其L-赖氨酸的产量。
根据本发明，L-赖氨酸可以高产量生产。
尽管将本发明的具体实施例作为参考特异地说明了本发明，本领域的普通技术人员应当理解的是在没有离开后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的前提下，可以在其中做出各种形式和内容的改变。
序列表
<110>CJ株式会社
<120>具有提高L-赖氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物
     及使用其生产L-赖氨酸的方法
<130>PN065634
<160>6
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>753
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌ATCC 13032
<220>
<221>基因
<222>(1)..(753)
<223>NCgl1835基因
<400>1
atgactgaga ctggatttgg aattgatatc ggtggctccg gcatcaaagg cgcccgcgtt         60
aaccttaaga ccggtgagtt tattgatgaa cgcataaaaa tcgccacccc taagccagca        120
accccagagg ctgtcgccga agtagtcgca gagattattt ctcaagccga atgggagggt        180
ccggtcggaa ttaccctgcc gtcggtcgtt cgcgggcaga tcgcgctatc cgcagccaac        240
attgacaagt cctggatcgg caccgatgtg cacgaacttt ttgaccgcca cctaaatggc        300
cgagagatca ccgttctcaa tgacgcagac gccgccggca tcgccgaagc aacctttggc        360
aaccctgccg cacgcgaagg cgcagtcatc ctgctgaccc ttggtacagg tattggatcc        420
gcattccttg tggatggcca actgttcccc aacacagaac tcggtcacat gatcgttgac        480
ggcgaggaag cagaacacct tgcagcagca tccgtcaaag aaaacgaaga tctgtcatgg        540
aagaaatggg cgaagcacct gaacaaggtg ctgagcgaat acgagaaact tttctcccca        600
tccgtcttca tcatcggtgg cggaatttcc agaaagcacg aaaagtggct tccattgatg        660
gagctagaca ctgacattgt cccagctgag ctgcgcaatc gagccggaat cgtaggagct        720
gccatggcag taaaccaaca cctcacccca taa                                     753
<210>2
<211>500
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于构建破坏载体的Ncgl1835片段
<400>2
ggctgtcgcc gaagtagtcg cagagattat ttctcaagcc gaatgggagg gtccggtcgg         60
aattaccctg ccgtcggtcg ttcgcgggca gatcgcgcta tccgcagcca acattgacaa        120
gtcctggatc ggcaccgatg tgcacgaact ttttgaccgc cacctaaatg gccgagagat        180
caccgttctc aatgacgcag acgccgccgg catcgccgaa gcaacctttg gcaaccctgc        240
cgcacgcgaa ggcgcagtca tcctgctgac ccttggtaca ggtattggat ccgcattcct        300
tgtggatggc caactgttcc ccaacacaga actcggtcac atgatcgttg acggcgagga        360
agcagaacac cttgcagcag catccgtcaa agaaaacgaa gatctgtcat ggaagaaatg        420
ggcgaagcac ctgaacaagg tgctgagcga atacgagaaa cttttctccc catccgtctt        480
catcatcggt ggcggaattt                                                    500
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增NCgl1835基因部分区域(129-628nt)的引物1
<400>3
ggctgtcgcc gaagtagtcg                                                    20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增NCgl1835基因部分区域(129-628nt)的引物2
<400>4
aaattccgcc accgatgatg                                                    20
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增NCgl1835基因部分区域(100-671nt)的引物3
<400>5
atcgccaccc ctaagccagc                                                        20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增NCgl1835基因部分区域(100-671nt)的引物4
<400>6
gtgtctagct ccatcaatgg                                                        20

Claims (2)

1.一种其内具有失活的内源NCgl1835基因并且生产L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)种的微生物，其中所述微生物是谷氨酸棒杆菌KCCM-10708P。
2.一种生产L-赖氨酸的方法，包含：在培养物或细胞中培养根据权利要求1的谷氨酸棒杆菌种的微生物以生产L-赖氨酸；并且从培养物中收集L-赖氨酸。
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