JPH02291295A - ヒト上皮細胞成長因子レセプターに特異的なモノクローナル抗体及びそれを用いた治療剤 - Google Patents
ヒト上皮細胞成長因子レセプターに特異的なモノクローナル抗体及びそれを用いた治療剤Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分！？）
本発明は、新規なハイブリッドセルライン、特にヒトＥ
ＧＦレセプターを発現するヒト腫瘍細胞の生育を阻止す
ることのできる上皮細胞成長因子（ａｐｉｄａデｍ（Ｌ
Ｅ （ｌｒｏｗ ｔ ｈｆａｃｔｏデ）（ＥＧＦ）に
対するヒトレセプターに特異性を有するモノクローナル
抗体の産生のためのー・イブリツドセルライン及びその
ようＫして産生された抗体及びその抗体を有効成分とし
て含有する医薬及びその抗体を有効成分として含有する
と共Ｋ抗新生物剤を含有する医薬Ｋ関する。
ＧＦレセプターを発現するヒト腫瘍細胞の生育を阻止す
ることのできる上皮細胞成長因子（ａｐｉｄａデｍ（Ｌ
Ｅ （ｌｒｏｗ ｔ ｈｆａｃｔｏデ）（ＥＧＦ）に
対するヒトレセプターに特異性を有するモノクローナル
抗体の産生のためのー・イブリツドセルライン及びその
ようＫして産生された抗体及びその抗体を有効成分とし
て含有する医薬及びその抗体を有効成分として含有する
と共Ｋ抗新生物剤を含有する医薬Ｋ関する。
（従来技術）
細胞の生育は可溶性の成長因子と細胞膜レセプターとの
相互作用により制御されている。
相互作用により制御されている。
上皮細胞の細胞分裂刺激（毒ｉｔｏｇａｎｉｃ ｓバ惰
１＆＆αｔｉ扉〕の最初のステップは上皮細胞成長因子
レセプター（ＥＧＦレセプター）として知られる膜のグ
リコプロテインに上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）が特異的
に結合することである。
１＆＆αｔｉ扉〕の最初のステップは上皮細胞成長因子
レセプター（ＥＧＦレセプター）として知られる膜のグ
リコプロテインに上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）が特異的
に結合することである。
（Ｃａｒｐｍｎｔａｒ．ｍｔ ａｌ．ｅ Ｅｐｉｄ
ａｒｍａｌ ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｅＡｎｎｓａ
ｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｉｏｃｈａｍ．，Ｖｏｌ． ４８
ｅ１９３−２１６（１９７９））。ＥＧＦレセプターは
１，１ ８ ６個のアミノ酸からなっており、それは６
２１個の残基からなる細胞外の部分と５４２個の残基か
もなる細胞質内の部分とに分けられ、それらは２３個の
残基からなる単一の疎水性の細胞膜を横断するセグメン
トによって結合されている＠（ Ｕｔ ｌｒｉｃｈｓ
ａ ｔ ａｔ ． ，Ｅｓｍａｎ Ｅｐｉｄａｒｍａｌ
Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ａＤＮＡ Ｓａ
ｑｓｍｎｃａ ａｎｄ ノｈａｒｒａｎ蓼Ｅｍｐｒ
ａａａｉｏｎ ｏｆ ｔｈａ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｇ
ａｎｇ ｉｎ Ａ−４ ３ １ Ｅｐｉｄａｒｍ
ｏｉｄ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｃａｌｌｓ，Ｎａｔ
ｓｒａｒＦｏｊ．３０９，４１８−４２５（１９８６）
）。ＥＧＦレセプターの細胞外の部分は４個のドメイン
に分けることができる。最近、２個のシステインのドメ
インＫよってその側面を接した残基３３３か５４６０の
ドメイン■がレセブタ−のＥＧＦ結合部分を含んでいる
らしいことが示されｔ４（ Ｌａｚａｍｔ ａｌ．，Ｌ
ｏｃａｌｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ＭｙｊｏｒＲｅｃ
ｅｐｔｏｒ − Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ
ｆｏｒＥｐｉｄｍｒｗ＋ａＬＧｒｏｓｎｔｈ Ｆ
ａｃｔｏｒ ｂｙ Ａｆｆｉｎｉｎ Ｌａｂａｌ
ｌｉｎｙ＊Ｍｏｌ．ａｎｄ Ｃａｌｌ Ｂｉｏｌ．Ｖｏ
ｌ．８．１８３１−１８３４（１９８８））。ＥＧＦの
ドメイン瓜への結合は多面的発現反応（ ｐｌａｉｏｔ
ｒｏｐｉｃ ｒａｓｐｏｎａａａ）を引き起こし、ＤＮ
Ａ合成及び細胞増殖に導びく。
ａｒｍａｌ ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｅＡｎｎｓａ
ｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｉｏｃｈａｍ．，Ｖｏｌ． ４８
ｅ１９３−２１６（１９７９））。ＥＧＦレセプターは
１，１ ８ ６個のアミノ酸からなっており、それは６
２１個の残基からなる細胞外の部分と５４２個の残基か
もなる細胞質内の部分とに分けられ、それらは２３個の
残基からなる単一の疎水性の細胞膜を横断するセグメン
トによって結合されている＠（ Ｕｔ ｌｒｉｃｈｓ
ａ ｔ ａｔ ． ，Ｅｓｍａｎ Ｅｐｉｄａｒｍａｌ
Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ａＤＮＡ Ｓａ
ｑｓｍｎｃａ ａｎｄ ノｈａｒｒａｎ蓼Ｅｍｐｒ
ａａａｉｏｎ ｏｆ ｔｈａ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｇ
ａｎｇ ｉｎ Ａ−４ ３ １ Ｅｐｉｄａｒｍ
ｏｉｄ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｃａｌｌｓ，Ｎａｔ
ｓｒａｒＦｏｊ．３０９，４１８−４２５（１９８６）
）。ＥＧＦレセプターの細胞外の部分は４個のドメイン
に分けることができる。最近、２個のシステインのドメ
インＫよってその側面を接した残基３３３か５４６０の
ドメイン■がレセブタ−のＥＧＦ結合部分を含んでいる
らしいことが示されｔ４（ Ｌａｚａｍｔ ａｌ．，Ｌ
ｏｃａｌｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ＭｙｊｏｒＲｅｃ
ｅｐｔｏｒ − Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ
ｆｏｒＥｐｉｄｍｒｗ＋ａＬＧｒｏｓｎｔｈ Ｆ
ａｃｔｏｒ ｂｙ Ａｆｆｉｎｉｎ Ｌａｂａｌ
ｌｉｎｙ＊Ｍｏｌ．ａｎｄ Ｃａｌｌ Ｂｉｏｌ．Ｖｏ
ｌ．８．１８３１−１８３４（１９８８））。ＥＧＦの
ドメイン瓜への結合は多面的発現反応（ ｐｌａｉｏｔ
ｒｏｐｉｃ ｒａｓｐｏｎａａａ）を引き起こし、ＤＮ
Ａ合成及び細胞増殖に導びく。
ヒト腫瘍細胞がＥＧＦレセプターを過剰に発現している
ことが各種のヒト膝瘍細胞において見出されて１−例え
ば膀胱の腫瘍の癌様の細胞は比較的多数のＥＧＦレセプ
ターを持っていることが示されている。（ Ｎｍａｌ＊
ｍｔ ａｌ−ｓＥｐｉｄａｒｎ＊ａｌ Ｇｒｏｓｎｔ
ｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎＥｓ
ｒｎａｎ Ｂｌａｄｄｅｒ Ｃａｎｃｅｒ ： Ｃ
ｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆノｎ＊ａｓｉｅａ ａｎ
ｄ Ｓｂｐａｒｆｉｃｉａｌ ＴｕｍｏｒｓｅＬａ
ｎｃａｔよＶｏｌ．１ ，３６６−３６７ （１９８５
））。乳癌細胞はＥＧＦレセプター密度と腫瘍の大きさ
との間に正の相互関係を持ち、分化の程度とは負の相互
関係を待つことを示している。
ことが各種のヒト膝瘍細胞において見出されて１−例え
ば膀胱の腫瘍の癌様の細胞は比較的多数のＥＧＦレセプ
ターを持っていることが示されている。（ Ｎｍａｌ＊
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ｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎＥｓ
ｒｎａｎ Ｂｌａｄｄｅｒ Ｃａｎｃｅｒ ： Ｃ
ｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆノｎ＊ａｓｉｅａ ａｎ
ｄ Ｓｂｐａｒｆｉｃｉａｌ ＴｕｍｏｒｓｅＬａ
ｎｃａｔよＶｏｌ．１ ，３６６−３６７ （１９８５
））。乳癌細胞はＥＧＦレセプター密度と腫瘍の大きさ
との間に正の相互関係を持ち、分化の程度とは負の相互
関係を待つことを示している。
（ Ｓａｉｎｓｂｕｒｙｅａｔ ａｌ ．．Ｅｐｉ
ｄｍｒｔｙｈａｌ ＧｒｏｗｔルＦａｃｔｏｒ Ｒ
ｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ Ｏｓｔｒｏｇａｎ
Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ＠ｎ Ｈ％ｆｌＬｎ％ Ｂｒａ
ａＪ ｔ Ｃｎｎ６ ａ ｒ ｅ Ｌ（ＬｆＬＣ ａ
ｇ 歩Ｐ Ｏ ｌ − １ ｍ３６４−３６６
（ １ ９８５ ）：Ｐｒｅｓａｎｃａ ｏｆ Ｅ
ｐｉｄａｒｍａｌＧｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒ
＠ｃｅｐｔｏｒ ａｍ （Ｌ％ Ｉｎｄｉｃａｔ
ｏｒｏｆ Ｐｏｏｒ Ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｉｎ Ｐ
ａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＢｒｅａｓｔＣ，ａｎｃａ
ｒ．Ｊ．ｃｌｉｎ．Ｐａｔル，，Ｊ’ｏＪ．３８，１２
２５−１２２８；ＥｐｉｄａｒｍαＪ − Ｇｒｏ
ｖｔル ー Ｆａｃｔｏｒ ＲａｃａｐｓｏｒＳｔａ
ｔｕｓ ａｓ Ｐｒａｄｉｃｔｏｒ Ｏ／ Ｅ
ａｒｌｙ Ｒａｃｓｒｒａｎｅａａｎｄ Ｄｍａｇ
ｈ Ｆｒｏｍ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｍｒ＊Ｌ
ａｎｃｍ霧ｍＦｏｊ．ｌ，１３９８−１４００（１９８
７））。異なったレベルのＥＧＦレセプターを有する無
胸腺マウスにヒト外陰部類表皮癌（ ｈｕｍａｎ ｗｓ
Ｌｖａｌ ａｐｉｄａｒｍｏｔｄＣαｒｅｉ％０惧α
）（，｛４３１）のクローン化変異株を移植しての一連
の朧瘍形成性の観察の結果、Ｊ！１！瘍形成性は直接に
ＥＧＦレセプターの発現レベルに相互関係を持つことが
見出されｆ． （Ｓａｎｔｏｎ．ｅｔ ａｔ．，Ｅｌｌ
ａｃｔａ （１／Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ
Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｃｏｎｃａ’ｎｔｒａ
ｔｓｏｎ ｏ’ｎ ｒｓｍｏｒｔｇ＊ｎｓｃｔｔｙ Ｏ
／ Ａ４３ｉＣａｌｌｓ ｉｎ Ｎｓｄｍ Ｍｉｃａ．
Ｃａｎｃａｒ Ｒａａ．．Ｖｏｌｍ４６．４７０１−４
７００（１９８６））。こうして、ＥＧＦレセプターの
過剰な発現は、癌細胞の腫瘍形成のもととなる役割をは
たしているとされてきている。
ｄｍｒｔｙｈａｌ ＧｒｏｗｔルＦａｃｔｏｒ Ｒ
ｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ Ｏｓｔｒｏｇａｎ
Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ＠ｎ Ｈ％ｆｌＬｎ％ Ｂｒａ
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（ １ ９８５ ）：Ｐｒｅｓａｎｃａ ｏｆ Ｅ
ｐｉｄａｒｍａｌＧｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒ
＠ｃｅｐｔｏｒ ａｍ （Ｌ％ Ｉｎｄｉｃａｔ
ｏｒｏｆ Ｐｏｏｒ Ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｉｎ Ｐ
ａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＢｒｅａｓｔＣ，ａｎｃａ
ｒ．Ｊ．ｃｌｉｎ．Ｐａｔル，，Ｊ’ｏＪ．３８，１２
２５−１２２８；ＥｐｉｄａｒｍαＪ − Ｇｒｏ
ｖｔル ー Ｆａｃｔｏｒ ＲａｃａｐｓｏｒＳｔａ
ｔｕｓ ａｓ Ｐｒａｄｉｃｔｏｒ Ｏ／ Ｅ
ａｒｌｙ Ｒａｃｓｒｒａｎｅａａｎｄ Ｄｍａｇ
ｈ Ｆｒｏｍ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｍｒ＊Ｌ
ａｎｃｍ霧ｍＦｏｊ．ｌ，１３９８−１４００（１９８
７））。異なったレベルのＥＧＦレセプターを有する無
胸腺マウスにヒト外陰部類表皮癌（ ｈｕｍａｎ ｗｓ
Ｌｖａｌ ａｐｉｄａｒｍｏｔｄＣαｒｅｉ％０惧α
）（，｛４３１）のクローン化変異株を移植しての一連
の朧瘍形成性の観察の結果、Ｊ！１！瘍形成性は直接に
ＥＧＦレセプターの発現レベルに相互関係を持つことが
見出されｆ． （Ｓａｎｔｏｎ．ｅｔ ａｔ．，Ｅｌｌ
ａｃｔａ （１／Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ
Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｃｏｎｃａ’ｎｔｒａ
ｔｓｏｎ ｏ’ｎ ｒｓｍｏｒｔｇ＊ｎｓｃｔｔｙ Ｏ
／ Ａ４３ｉＣａｌｌｓ ｉｎ Ｎｓｄｍ Ｍｉｃａ．
Ｃａｎｃａｒ Ｒａａ．．Ｖｏｌｍ４６．４７０１−４
７００（１９８６））。こうして、ＥＧＦレセプターの
過剰な発現は、癌細胞の腫瘍形成のもととなる役割をは
たしているとされてきている。
ＥＧＦレセプター密度の癌細胞の生物的なふるまいに及
ぼす影響というものは、該レセプターとそのりガンドー
すなわち、ＥＧＦまたはトランスホーミング成長因子（
ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａ
ｃｔｏｒ ）（ ＴＧＦ ）との相互作用によって仲介
されうる。大部分の細胞において、ＥＧＦがＥＧＦレセ
プターの特定の領域に結合した場合、細胞はその分裂刺
激を受ける。腫瘍性の細胞の上皮細胞成長因子レセプタ
ーにモノクローナル抗体を結合させることによりヌード
マウスκ異橿移植した腫瘍細胞Ａ４３１のｉｎ ＊ｉｖ
ｏでの生長阻害をなしたことを二つのグループが報告し
ている●Ｍａｍｓｉ．ａｌ ａｌ．はＥｇＧ ２ ａ及
びＩＱＧ ｌイソタイプの抗一ＥＧＦレセプターモノク
ローナル抗体による処置によって、無胸腺マウスに皮下
移植されたＡ４３１細胞のＪＩＩｉ［瘍形成を完全に阻
止したことを、その処理を腫瘍細胞の接種した日から始
めて示めした。（Ｍａｓｓｉｅａｔ ａｌ．ａＧｒｏ
ｗｔｋ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ Ｏ／ ＃ｓｓａｓ
ＴｓｔｎｏｒＣａｌｌｓ ＜ｓ Ａｔｈｙｍｉｃ Ｍ
ｉｃｅ ｂｙ Ａｎｔｉ−ＥｐｉｄｇｒｍａｌＧデｏｗ
ｔｈ Ｆａｃｓｏｒ Ｒａｃａｐｔｏｒ Ｍｏｎ
ｏｃｌｏｎαｌＡｎｔｔｂｏｄｉｇａ＊Ｃｏｎｃａｒ
Ｒａｓ．，Ｐｏｔ．４４，１００２ −１００７（１９
８４年） ；Ｍａｃｈａｎｉｓｍ ｏｆＡｎｔｉｔｓｍ
ｏｒＡｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｍｉｃｅ ｆｏｒ
Ａｎｔｉ−ＥｐｉｄａｒｍａｌＧｒｏｗｔｈ Ｆ
ａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｍｏｎｏｃｌｏｎ
αＩＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｉｌ’ｉｔｈ Ｄ９ｆｍ
ｒａｎ＊ ノｓｏｔｙｐａａ．（１９８６））。Ｒｏ
ｄｍｃｋ，ａｔ ａｌはＭａａｓｉのノｑＧ２Ｃイソタ
イプのものと異なるモノクローナル抗体を使用し、それ
はＡ４ ３ １＃ｌ８胞のＥＧＦレセプターに結合し、
マウスにＡｍ移植された，４４３１＃１胞の臘瘍の生胃
を完全に阻止し？４ （ Ｒｏｄｅ ａ ｋ 参ａ
ｔ 虹− ＃ ｒ謁ｏｒ Ｇｙ ０１１１ｔｈＭｏｄ
ｓｌａｔｉｏｎ ｂｙ ａ Ｍｏｎｏｃｔｏｎａｌ Ａ
ｔ＞ｔ４ｂｏｄｙ ｔｏｔｈｅ ＥｐイｄｏｒＷ＆
ａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐ
ｔｏｒ ：ノｔｍｓｎｏｌｏｇｔｅａｌｌｙ Ｒａ
ｄｉａｔｅｄ ａｎｄ ＥｆｆａｅｔｏｒＣａｌｌ
−１ｎｄｍｐｍｎｄｍｎ＠Ｅｆｆｅｃｔｓ，Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｒａｍ．，Ｆｏｊ．４７，３６９２−３６９６（１
９８７））。
ぼす影響というものは、該レセプターとそのりガンドー
すなわち、ＥＧＦまたはトランスホーミング成長因子（
ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａ
ｃｔｏｒ ）（ ＴＧＦ ）との相互作用によって仲介
されうる。大部分の細胞において、ＥＧＦがＥＧＦレセ
プターの特定の領域に結合した場合、細胞はその分裂刺
激を受ける。腫瘍性の細胞の上皮細胞成長因子レセプタ
ーにモノクローナル抗体を結合させることによりヌード
マウスκ異橿移植した腫瘍細胞Ａ４３１のｉｎ ＊ｉｖ
ｏでの生長阻害をなしたことを二つのグループが報告し
ている●Ｍａｍｓｉ．ａｌ ａｌ．はＥｇＧ ２ ａ及
びＩＱＧ ｌイソタイプの抗一ＥＧＦレセプターモノク
ローナル抗体による処置によって、無胸腺マウスに皮下
移植されたＡ４３１細胞のＪＩＩｉ［瘍形成を完全に阻
止したことを、その処理を腫瘍細胞の接種した日から始
めて示めした。（Ｍａｓｓｉｅａｔ ａｌ．ａＧｒｏ
ｗｔｋ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ Ｏ／ ＃ｓｓａｓ
ＴｓｔｎｏｒＣａｌｌｓ ＜ｓ Ａｔｈｙｍｉｃ Ｍ
ｉｃｅ ｂｙ Ａｎｔｉ−ＥｐｉｄｇｒｍａｌＧデｏｗ
ｔｈ Ｆａｃｓｏｒ Ｒａｃａｐｔｏｒ Ｍｏｎ
ｏｃｌｏｎαｌＡｎｔｔｂｏｄｉｇａ＊Ｃｏｎｃａｒ
Ｒａｓ．，Ｐｏｔ．４４，１００２ −１００７（１９
８４年） ；Ｍａｃｈａｎｉｓｍ ｏｆＡｎｔｉｔｓｍ
ｏｒＡｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｍｉｃｅ ｆｏｒ
Ａｎｔｉ−ＥｐｉｄａｒｍａｌＧｒｏｗｔｈ Ｆ
ａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｍｏｎｏｃｌｏｎ
αＩＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｉｌ’ｉｔｈ Ｄ９ｆｍ
ｒａｎ＊ ノｓｏｔｙｐａａ．（１９８６））。Ｒｏ
ｄｍｃｋ，ａｔ ａｌはＭａａｓｉのノｑＧ２Ｃイソタ
イプのものと異なるモノクローナル抗体を使用し、それ
はＡ４ ３ １＃ｌ８胞のＥＧＦレセプターに結合し、
マウスにＡｍ移植された，４４３１＃１胞の臘瘍の生胃
を完全に阻止し？４ （ Ｒｏｄｅ ａ ｋ 参ａ
ｔ 虹− ＃ ｒ謁ｏｒ Ｇｙ ０１１１ｔｈＭｏｄ
ｓｌａｔｉｏｎ ｂｙ ａ Ｍｏｎｏｃｔｏｎａｌ Ａ
ｔ＞ｔ４ｂｏｄｙ ｔｏｔｈｅ ＥｐイｄｏｒＷ＆
ａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐ
ｔｏｒ ：ノｔｍｓｎｏｌｏｇｔｅａｌｌｙ Ｒａ
ｄｉａｔｅｄ ａｎｄ ＥｆｆａｅｔｏｒＣａｌｌ
−１ｎｄｍｐｍｎｄｍｎ＠Ｅｆｆｅｃｔｓ，Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｒａｍ．，Ｆｏｊ．４７，３６９２−３６９６（１
９８７））。
しかしながら、現在までヒト口部類上皮癌（ｈｕｍｎｏ
ｒａｌ ａｐｔｄａｒｍｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｔｎ
ａ ） （ ＫＢ ）あるいは区ト乳房上皮細胞（ ｈ
ｓｍａｎ ｆＩＬａｍｍαｒν−ｐｉｔん−１ｉα１）
（１８４，４ｘ＃４及び１８４ＡＩＮ４−Ｔ一併せて［
１８４Ｊという）のｉｎ ｗｓｔｒｏ ９たはｉｎ ｖ
ｉｓａでの生育を阻止することを誰一人としていない。
ｒａｌ ａｐｔｄａｒｍｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｔｎ
ａ ） （ ＫＢ ）あるいは区ト乳房上皮細胞（ ｈ
ｓｍａｎ ｆＩＬａｍｍαｒν−ｐｉｔん−１ｉα１）
（１８４，４ｘ＃４及び１８４ＡＩＮ４−Ｔ一併せて［
１８４Ｊという）のｉｎ ｗｓｔｒｏ ９たはｉｎ ｖ
ｉｓａでの生育を阻止することを誰一人としていない。
ＫＢ及び１８４細胞は共にＥＧＦ−レセプターＫ関連し
た研究に用いられ工い一 ＫＢ及び１８４細胞は実質的にＡ４３１細胞とは異なっ
ている。特にそれらは上皮細胞成長因子罠対する生育応
答において異なっている。ＫＢ及び１８４細胞は高濃度
の上皮細胞成長因子により生育刺激されるが、，４４３
１１ｆｌｌ胞は高濃度の上皮細胞成長因子κよクては生
育の阻害を受ける。
た研究に用いられ工い一 ＫＢ及び１８４細胞は実質的にＡ４３１細胞とは異なっ
ている。特にそれらは上皮細胞成長因子罠対する生育応
答において異なっている。ＫＢ及び１８４細胞は高濃度
の上皮細胞成長因子により生育刺激されるが、，４４３
１１ｆｌｌ胞は高濃度の上皮細胞成長因子κよクては生
育の阻害を受ける。
これらの違い並びＫ抗−ＥＧＦ−レセプター抗体がｉｇ
｛督０での皿瘍の生育を阻止するところのメカ二ズムの
完全な理解がなされていないことは、Ａ４３１細胞のＥ
ＧＦレセプターに結合し、そしてヌードマウスに異種移
植されたＡ４３１細胞に抗腫瘍活性を示したモノクロー
ナル抗体が同様にヌードマウスに異種移植されたＫＢ細
胞あるいは１８４細胞に対し抗膿瘍活性を示すのかどう
か正確Ｋ決定することをさまたげている。
｛督０での皿瘍の生育を阻止するところのメカ二ズムの
完全な理解がなされていないことは、Ａ４３１細胞のＥ
ＧＦレセプターに結合し、そしてヌードマウスに異種移
植されたＡ４３１細胞に抗腫瘍活性を示したモノクロー
ナル抗体が同様にヌードマウスに異種移植されたＫＢ細
胞あるいは１８４細胞に対し抗膿瘍活性を示すのかどう
か正確Ｋ決定することをさまたげている。
加えて、ヒトの昶瘍細胞はまた上皮細胞成長因子によっ
て生育刺激を受けることから、ＫＢ及び１８４細胞は、
Ａ４３１細胞よりもよりＥＧＦＫ対する応答において代
表的なパターンを提供するものであり、事実ＥＧＦレセ
プターを発現するヒトＩｌｔ瘍細胞モデルとして使用さ
れている。
て生育刺激を受けることから、ＫＢ及び１８４細胞は、
Ａ４３１細胞よりもよりＥＧＦＫ対する応答において代
表的なパターンを提供するものであり、事実ＥＧＦレセ
プターを発現するヒトＩｌｔ瘍細胞モデルとして使用さ
れている。
（Ｗｉｌｌｉｔｖｇｔａｎ．ｇ ａｌ．Ｊ．ｃａｌｌ
Ｂｉｏｌ．．Ｖｏｌ ． ９ ４ ，２０７−２１２（
１９８２））， 腫瘍治療の第一目標は膝瘍細胞をすべて殺すことである
。
Ｂｉｏｌ．．Ｖｏｌ ． ９ ４ ，２０７−２１２（
１９８２））， 腫瘍治療の第一目標は膝瘍細胞をすべて殺すことである
。
細胞を殺してしまう治療用剤は、細胞毒（ ｃｙｔｏｔ
ｏｚｉｃ）として定義されている。細胞を殺すというよ
りは単に細胞の増殖を妨害する治療用剤は、細胞増殖抑
制剤（ｅｙｔｏｓｔａｔｉｃ）として定義されている。
ｏｚｉｃ）として定義されている。細胞を殺すというよ
りは単に細胞の増殖を妨害する治療用剤は、細胞増殖抑
制剤（ｅｙｔｏｓｔａｔｉｃ）として定義されている。
ＥＧＦレセプターに結合するモノクローナル抗体率独に
よる処置は単ＫＭ胞が増えることを阻止しているだけで
、これからモノクローナル抗体は細胞増殖抑制剤として
作用している。モノクローナル抗体の細胞増殖抑制作用
を持つのみということを克服するため、ヒト上皮細胞成
長因子レセプターの細胞外のドメインに特異性を有する
モノクローナル抗体をマクロファージあるいはマウスの
補体と組み合わせ、Ａ４３１細胞に対する細胞毒反応を
得ている。
よる処置は単ＫＭ胞が増えることを阻止しているだけで
、これからモノクローナル抗体は細胞増殖抑制剤として
作用している。モノクローナル抗体の細胞増殖抑制作用
を持つのみということを克服するため、ヒト上皮細胞成
長因子レセプターの細胞外のドメインに特異性を有する
モノクローナル抗体をマクロファージあるいはマウスの
補体と組み合わせ、Ａ４３１細胞に対する細胞毒反応を
得ている。
（ ｎ（！８１＆８ ＃ ＃ ｇ ｎｌ − ，Ａｆ，
（ｔ ｈｃＬｎｓ ８１１６ ０ｆ Ａｎ ｇ Ｓ
ｇ ％ｆｎＯ ｒＡｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｍｉｃ
ｅ ｆｏｒ Ａｎｔｉ−ＥｐｔｄｍｒｖｈａｌＧｒ
ｏｓｏｔｈ Ｆａ８ｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｍｏｓ
ｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ
Ｄｉｆｆａｖａｎｔ ノａｏｔｏｐａａ．Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｒａｓｍａｒｃｈ＊Ｖｏｌ ．４６ ｓ ５
５ ９ ２−５ ５ ９ ８（１９８６））。
（ｔ ｈｃＬｎｓ ８１１６ ０ｆ Ａｎ ｇ Ｓ
ｇ ％ｆｎＯ ｒＡｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｍｉｃ
ｅ ｆｏｒ Ａｎｔｉ−ＥｐｔｄｍｒｖｈａｌＧｒ
ｏｓｏｔｈ Ｆａ８ｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｍｏｓ
ｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ
Ｄｉｆｆａｖａｎｔ ノａｏｔｏｐａａ．Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｒａｓｍａｒｃｈ＊Ｖｏｌ ．４６ ｓ ５
５ ９ ２−５ ５ ９ ８（１９８６））。
それ自体投与して用いられる抗新生物形成剤あるいは化
学療法剤は細胞毒剤として有用である。例えばドキソル
ビシン（アドリア７イシン）及びシスプラチンのような
抗新生物形成剤の利用は当該分野でよく知られている。
学療法剤は細胞毒剤として有用である。例えばドキソル
ビシン（アドリア７イシン）及びシスプラチンのような
抗新生物形成剤の利用は当該分野でよく知られている。
しかしながらこれらのものは単独で用いた場合患者に対
して毒性があるあるいは副作用があるような量でのみ効
果があるのである。シスプラチンは４週問おきに１回１
００■／一の量を静脈内κ投与されそしてアドリアマイ
シンは２１日おきに１回６０−７５〜／一の量を静脈内
Ｋ投与される。
して毒性があるあるいは副作用があるような量でのみ効
果があるのである。シスプラチンは４週問おきに１回１
００■／一の量を静脈内κ投与されそしてアドリアマイ
シンは２１日おきに１回６０−７５〜／一の量を静脈内
Ｋ投与される。
（発明の開示〕
本発明は、ヒトＥＧＦレセプターの発現及びヒトＥＧＦ
による細胞分裂刺激により特徴づけられたヒト腫瘍細胞
の生育を阻止し、該魔瘍細胞のヒトＥＧＦレセプターの
細胞外のドメインに結合し、そして該細胞のヒトＥＧＦ
レセプターの細胞外のドメインに結合して抗原抗体複合
体となることによりヒト口部類表反癌（ｉＢ）細胞また
はヒト乳房上皮細胞（１８４）の生育を阻止することの
できるモノクローナル抗体に関する。
による細胞分裂刺激により特徴づけられたヒト腫瘍細胞
の生育を阻止し、該魔瘍細胞のヒトＥＧＦレセプターの
細胞外のドメインに結合し、そして該細胞のヒトＥＧＦ
レセプターの細胞外のドメインに結合して抗原抗体複合
体となることによりヒト口部類表反癌（ｉＢ）細胞また
はヒト乳房上皮細胞（１８４）の生育を阻止することの
できるモノクローナル抗体に関する。
本発明は、新規なハイブリドーマセルライン（ｋｙｂｒ
ｉｄｏｍαｃａｌｌ ｌｉｎａａλＡＴＣＣ ＢＢ９
１６３及び９７６４に関し、それらはそれぞれその生育
培地の上溝液の成分として高い特異性を有するモノクロ
ーナル抗体、９６及び１０８を与える。セルラインＡＴ
ＣＣＩＩＢ９７６３及び９７６４は、１９８８年７月２
５日ＫＡｍａｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ ＣｓＬｔｓｒｍＣ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ １ ２ ３ ０ Ｐａｒ
ｋｌａ替ｎ Ｄｒｉｖｅ ，ＲｏｃｋｅｔｔｉｎｇＭ
Ｄ ２０８５２ Ｋ寄託された。この寄託はブタペスト
条約に基づいてなされｔｓ．該カルチャーは試料の分譲
に係る最新の請求のあった後すくな《とも５年間及びい
かなる場合であってもこの寄託の日の後３０年間は継続
して入手しうる。本発明は、ヒトＥＧＦレセプターを発
現するヒト腫瘍細胞の細胞膜上に見出されるＥＧＦレセ
プターに特異的に結合することにより該腫瘍細胞の生育
を阻止する新規なモノクローナル抗体を産生ずるセルラ
インを提供するものである。
ｉｄｏｍαｃａｌｌ ｌｉｎａａλＡＴＣＣ ＢＢ９
１６３及び９７６４に関し、それらはそれぞれその生育
培地の上溝液の成分として高い特異性を有するモノクロ
ーナル抗体、９６及び１０８を与える。セルラインＡＴ
ＣＣＩＩＢ９７６３及び９７６４は、１９８８年７月２
５日ＫＡｍａｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ ＣｓＬｔｓｒｍＣ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ １ ２ ３ ０ Ｐａｒ
ｋｌａ替ｎ Ｄｒｉｖｅ ，ＲｏｃｋｅｔｔｉｎｇＭ
Ｄ ２０８５２ Ｋ寄託された。この寄託はブタペスト
条約に基づいてなされｔｓ．該カルチャーは試料の分譲
に係る最新の請求のあった後すくな《とも５年間及びい
かなる場合であってもこの寄託の日の後３０年間は継続
して入手しうる。本発明は、ヒトＥＧＦレセプターを発
現するヒト腫瘍細胞の細胞膜上に見出されるＥＧＦレセ
プターに特異的に結合することにより該腫瘍細胞の生育
を阻止する新規なモノクローナル抗体を産生ずるセルラ
インを提供するものである。
更に、本発明は、
（１３ マウスなヒＩ−ＥＧＦレセプターを発現する
細胞で免疫し； （１３ 該マウスから牌臓を取り出し、脾臓細胞の懸
濁物な作成し； （１１υ 融合促進剤の存在下該胛臓細胞とマクスミエ
ローマ細胞（ ｍｏｓａａ ｍｙａｌｏｔｈａ ｃａｌ
ｌｍ ）とを融合せしめ；ＧＶ）融合しなかったミエロ
ーマ細胞が生育できない培地を含む分離クエル中で融合
細胞を希釈培養し：（Ｖ） ハイブリドーマを含有す
る各ウェル中の上溝液中のヒトＥＧＦレセプターＫ対す
る抗体の存在を側定し；＆ｉ） ヒトＥＧＦレセプタ
ーの細胞外のドメインにＭ会する抗体を産生ずるハイブ
リドーマを選別しクローン化し；そして Ｑ１０ 該クローン上にある上清液から抗体を回収す
る工程からなることを特徴とする ヒトＥＧＦレセプターの細胞外のドメインに結合し、そ
してヒトＥＧＦレセプターを発現すると共にＥＧＦによ
り細胞分裂刺激を受けるヒト癌細胞の生育を阻止するこ
とのできるモノクローナル抗体の製造法Ｋ関する。
細胞で免疫し； （１３ 該マウスから牌臓を取り出し、脾臓細胞の懸
濁物な作成し； （１１υ 融合促進剤の存在下該胛臓細胞とマクスミエ
ローマ細胞（ ｍｏｓａａ ｍｙａｌｏｔｈａ ｃａｌ
ｌｍ ）とを融合せしめ；ＧＶ）融合しなかったミエロ
ーマ細胞が生育できない培地を含む分離クエル中で融合
細胞を希釈培養し：（Ｖ） ハイブリドーマを含有す
る各ウェル中の上溝液中のヒトＥＧＦレセプターＫ対す
る抗体の存在を側定し；＆ｉ） ヒトＥＧＦレセプタ
ーの細胞外のドメインにＭ会する抗体を産生ずるハイブ
リドーマを選別しクローン化し；そして Ｑ１０ 該クローン上にある上清液から抗体を回収す
る工程からなることを特徴とする ヒトＥＧＦレセプターの細胞外のドメインに結合し、そ
してヒトＥＧＦレセプターを発現すると共にＥＧＦによ
り細胞分裂刺激を受けるヒト癌細胞の生育を阻止するこ
とのできるモノクローナル抗体の製造法Ｋ関する。
本発明は、また上記した工程（ＶＩＤを省き、さらなる
工程ｃｌｉｉｌ） Ｍクローンをマウス腹腔内圧移植し
、（ｉＸ） 該マウスから腫瘍化した腹水または血清
を採取し、そして該腹水または血清は所望の抗体ｙ！′
含んでいるを含むことを特徴とするモノクローナル抗体
の製造法に関するＯ 本発明はまた、ヒトＥＧＦレセプターを発現し且つヒト
ＥＧＦによって細胞分裂刺激を受けるヒト腫瘍細胞の生
育を阻止するのに有効な量の新規モノクローナル抗体の
いづれか一つと共に医薬担体を含んでなる治療用組成物
にも関するＯ また、驚くべきことに新規なモノクローナル抗体のうち
の一つとドキソルビシンあるいはシスプラテンのような
抗新生物形成剤とを一緒に用いると、ヒトＥＧＦレセプ
タ−を発現し且つヒトＥＧＦにより細胞分裂刺激を受け
るヒト癌細胞の生育の阻止という点で、単独で抗新生物
形成剤として新規モノクローナル抗体を用いるよりはよ
り有効であることを発見した。本発明者らによる新規な
モノクローナル抗体を用いてのこの配合しての処置法は
、それが２種の抗癌剤を組み合わせたもので、それぞれ
は異なったメカニズムによって作用し、ヒトの腫瘍細胞
に細胞毒性を発揮することから優れたものである。この
ような方法は、一方では薬物に対する抵抗性を増大させ
るとか、一方では腫瘍細胞を抗体に反応しないようにす
るその腫瘍細胞の抗原性における変化とかのような臨床
上生起する間趙を解決することができる。さらにまた、
驚くべきことにその抗新生物形成剤は、それが単独で投
与された時必要なそして患者にとって有毒なあるいは則
作用のある童よりも実買的に比較的少ない量で投与しう
ることが見出された。ドキソルビシンあるいはシスプラ
チン以外のプレオマイシン硫散塩、カルムスチン（ ｃ
ａｔｔｍｓａｔｉｎａ ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏ
ｒａ−ｔｎｂｓａｉｌ）及びシクロホスファミドヒドロ
キシウレアのよ５な抗新成物形成剤もまた新規モノクロ
ーナル抗体と一緒に使用することができる。上記であげ
たものは、単Ｋ例としてあげたものであって、本発明の
範囲を限定することを意図したものではない。
工程ｃｌｉｉｌ） Ｍクローンをマウス腹腔内圧移植し
、（ｉＸ） 該マウスから腫瘍化した腹水または血清
を採取し、そして該腹水または血清は所望の抗体ｙ！′
含んでいるを含むことを特徴とするモノクローナル抗体
の製造法に関するＯ 本発明はまた、ヒトＥＧＦレセプターを発現し且つヒト
ＥＧＦによって細胞分裂刺激を受けるヒト腫瘍細胞の生
育を阻止するのに有効な量の新規モノクローナル抗体の
いづれか一つと共に医薬担体を含んでなる治療用組成物
にも関するＯ また、驚くべきことに新規なモノクローナル抗体のうち
の一つとドキソルビシンあるいはシスプラテンのような
抗新生物形成剤とを一緒に用いると、ヒトＥＧＦレセプ
タ−を発現し且つヒトＥＧＦにより細胞分裂刺激を受け
るヒト癌細胞の生育の阻止という点で、単独で抗新生物
形成剤として新規モノクローナル抗体を用いるよりはよ
り有効であることを発見した。本発明者らによる新規な
モノクローナル抗体を用いてのこの配合しての処置法は
、それが２種の抗癌剤を組み合わせたもので、それぞれ
は異なったメカニズムによって作用し、ヒトの腫瘍細胞
に細胞毒性を発揮することから優れたものである。この
ような方法は、一方では薬物に対する抵抗性を増大させ
るとか、一方では腫瘍細胞を抗体に反応しないようにす
るその腫瘍細胞の抗原性における変化とかのような臨床
上生起する間趙を解決することができる。さらにまた、
驚くべきことにその抗新生物形成剤は、それが単独で投
与された時必要なそして患者にとって有毒なあるいは則
作用のある童よりも実買的に比較的少ない量で投与しう
ることが見出された。ドキソルビシンあるいはシスプラ
チン以外のプレオマイシン硫散塩、カルムスチン（ ｃ
ａｔｔｍｓａｔｉｎａ ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏ
ｒａ−ｔｎｂｓａｉｌ）及びシクロホスファミドヒドロ
キシウレアのよ５な抗新成物形成剤もまた新規モノクロ
ーナル抗体と一緒に使用することができる。上記であげ
たものは、単Ｋ例としてあげたものであって、本発明の
範囲を限定することを意図したものではない。
本発明は、また有効量の抗新生物形成剤及び有効量の新
規モノクローナル抗体のいづれか一つを、ヒトＥＧＦレ
セプターを発現し且つヒトＥＧＦにより細胞分裂刺激を
受けるヒト履瘍細胞を持つヒト癌患者に投与し、そして
そこで該抗体は腫瘍細胞のヒトＥＧＦレセプターの細胞
外のドメインに結合して、抗原一抗体複合体を形成する
ことからなる該腫瘍細胞の生育阻止方法を提供する。
規モノクローナル抗体のいづれか一つを、ヒトＥＧＦレ
セプターを発現し且つヒトＥＧＦにより細胞分裂刺激を
受けるヒト履瘍細胞を持つヒト癌患者に投与し、そして
そこで該抗体は腫瘍細胞のヒトＥＧＦレセプターの細胞
外のドメインに結合して、抗原一抗体複合体を形成する
ことからなる該腫瘍細胞の生育阻止方法を提供する。
次なるより詳細な説明を、添附された図面と一緒Ｋ参照
して本発明をよりよ《埋解すれば本発明及び多《のそれ
に付随した利点のより完全な認識が容易に得られよう。
して本発明をよりよ《埋解すれば本発明及び多《のそれ
に付随した利点のより完全な認識が容易に得られよう。
この記載は本発明を特定のものに限定するためと解すべ
きてな《、当業者がなしうるような変形も本発明の範囲
内であると考えられるべきものである。
きてな《、当業者がなしうるような変形も本発明の範囲
内であると考えられるべきものである。
第１図はモノクローナル抗体１０８０Ｆ（αｂ）ｔ及び
Ｆ（ａｈ）調製物のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す。非還元条件下
でゲル泳動はなされた。α）未処理モノクローナル抗体
１０８、ｂ）未精製ＦＣａｂ）’ｔ、フラグメント調製
物、Ｃ）精製Ｆ（αｂ）ｔ％ ｄ） Ｆａｂフラグメ
ント リ分子童マーカ、ＫＤ． 第２図はＫＢＩＩａ胞への１１ｍｌモノクローナル抗体
１０８及びそのフラグメントとＥＧＦとの競合結合を示
す。ＫＢｗＵ胞は３Ｘ１０−＠，Ｍの”Ｉモノクローナ
ル抗体（１ｘ１０ｓｃｐｍ／ｒｒｌ ）の存在下、異な
った濃度のＥＧＦ（●）、非標［％／ク０−ナルＫ体１
０ ８ （０）、七ｆ）Ｆ（ａｈ）’，、７ラグメン
ト（▲）あるいはＦａｂ’ ７ラグメント（■）の存在
下に培養した。（３個の独立した測定値の平均）。
Ｆ（ａｈ）調製物のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す。非還元条件下
でゲル泳動はなされた。α）未処理モノクローナル抗体
１０８、ｂ）未精製ＦＣａｂ）’ｔ、フラグメント調製
物、Ｃ）精製Ｆ（αｂ）ｔ％ ｄ） Ｆａｂフラグメ
ント リ分子童マーカ、ＫＤ． 第２図はＫＢＩＩａ胞への１１ｍｌモノクローナル抗体
１０８及びそのフラグメントとＥＧＦとの競合結合を示
す。ＫＢｗＵ胞は３Ｘ１０−＠，Ｍの”Ｉモノクローナ
ル抗体（１ｘ１０ｓｃｐｍ／ｒｒｌ ）の存在下、異な
った濃度のＥＧＦ（●）、非標［％／ク０−ナルＫ体１
０ ８ （０）、七ｆ）Ｆ（ａｈ）’，、７ラグメン
ト（▲）あるいはＦａｂ’ ７ラグメント（■）の存在
下に培養した。（３個の独立した測定値の平均）。
第３図はモノクローナル抗体１０８のＫＢ細胞への結合
をセルソーター分析したものである。
をセルソーター分析したものである。
第４図はヌードマウス罠移植されたＫＢＩＩｍ胞に対す
るｎｓ１モノクローナル抗体１０８の付着を示す。
るｎｓ１モノクローナル抗体１０８の付着を示す。
第５図はＫＢ細胞のコロニー形成におけるＥＧＦ及びモ
ノクローナル抗体１０８の及ぼす効果を示す。コロニー
形成のアツセイは５！力例Ｋ記載されているようにして
異なった濃度のＥＧＦ（拳）及びモノクローナル抗体１
ｏ８（■〕の存在下Ｋ行われ丸 第６図は、ヌードマウスに移植されたＫＢ細胞に対する
モノクローナル抗体１０８及びそのフラグメントの抗腫
瘍活性を示している。各群は少な《とも６匹のマウスか
らなっていた。マウスは腫瘍の接種の後第１日目、第５
日目、第１２日目及び第１８日目にその静脈内に、１１
１ｇのモノクローナル抗体１０８（■）、１〜のＤＮＰ
に対するモノクローナル抗体（０）、０．６６１１１＆
のモノクローナル抗体１０８の’（５ｂ）’＊ｓフラグ
メント（▲）、あるいはＦａｂ’ フラグメント（◆
）を投与して処理された。また、Ｍ瘍細胞を注射した後
１日して２■のモノクローナル抗体１０８で１回処理し
た（●）。
ノクローナル抗体１０８の及ぼす効果を示す。コロニー
形成のアツセイは５！力例Ｋ記載されているようにして
異なった濃度のＥＧＦ（拳）及びモノクローナル抗体１
ｏ８（■〕の存在下Ｋ行われ丸 第６図は、ヌードマウスに移植されたＫＢ細胞に対する
モノクローナル抗体１０８及びそのフラグメントの抗腫
瘍活性を示している。各群は少な《とも６匹のマウスか
らなっていた。マウスは腫瘍の接種の後第１日目、第５
日目、第１２日目及び第１８日目にその静脈内に、１１
１ｇのモノクローナル抗体１０８（■）、１〜のＤＮＰ
に対するモノクローナル抗体（０）、０．６６１１１＆
のモノクローナル抗体１０８の’（５ｂ）’＊ｓフラグ
メント（▲）、あるいはＦａｂ’ フラグメント（◆
）を投与して処理された。また、Ｍ瘍細胞を注射した後
１日して２■のモノクローナル抗体１０８で１回処理し
た（●）。
第７図はヌードマウスの腹腔内に移植されたＫＢａ胞に
対する１ ０ ８ ｍＡｂの抗腫瘍活性を示すものであ
る。７匹のマウスは腫瘍の接種の後第１日目、第４日目
及び第７日目くその静脈内に０．５■のモノクローナル
抗体ｌυ８（−−−）またはＤ！ＷＰに対する抗体（８
匹のマウス）？：投与して処理された。
対する１ ０ ８ ｍＡｂの抗腫瘍活性を示すものであ
る。７匹のマウスは腫瘍の接種の後第１日目、第４日目
及び第７日目くその静脈内に０．５■のモノクローナル
抗体ｌυ８（−−−）またはＤ！ＷＰに対する抗体（８
匹のマウス）？：投与して処理された。
第８図はヌードマウスの静脈内に注射されたＫＢＩａ胞
に対する１ ０ ８ ｍＡｌ）の抗腫瘍活性な示丁もの
である。
に対する１ ０ ８ ｍＡｌ）の抗腫瘍活性な示丁もの
である。
ａ）微小転移巣を示している１．５Ｘ１０” 個のＭ
Ｅ細胞を静脈内圧注射した後６日後の肺の組織：Ｘ２５
０倍。リマウスは腫瘍の接種後第６日目、第９日目及び
第１３日目に０．５ダのモノクローナル抗体１０８を静
脈内投与されて処置された。それぞれの点は、動物の肺
を通して異なった深さで採取された一連の部分の分析を
示している。
Ｅ細胞を静脈内圧注射した後６日後の肺の組織：Ｘ２５
０倍。リマウスは腫瘍の接種後第６日目、第９日目及び
第１３日目に０．５ダのモノクローナル抗体１０８を静
脈内投与されて処置された。それぞれの点は、動物の肺
を通して異なった深さで採取された一連の部分の分析を
示している。
第９図は、皮下に移植されたＫＢ細胞に対する１０８ｍ
Ａｂのドキソルビシンと組み合わせた場合の抗腫瘍活性
を示している。０．４５１１１１９のモノクローナル抗
体１０８と３７．５μ２のドキソルビシンを４回すなわ
ち、ＮＬ筋の注入後２４時間して及び３〜４日の間隔を
おいて３回これを繰り返して投与した。
Ａｂのドキソルビシンと組み合わせた場合の抗腫瘍活性
を示している。０．４５１１１１９のモノクローナル抗
体１０８と３７．５μ２のドキソルビシンを４回すなわ
ち、ＮＬ筋の注入後２４時間して及び３〜４日の間隔を
おいて３回これを繰り返して投与した。
第ｌθ図及び第１１図は皮下に移植されたＫＢ細胞に対
する１０８ｓＡ＆のシスプラチンと組み合わせた場合の
抗腺瘍活性を示している。第ｌＯ図においては１．８９
のモノクローナル抗体１０８及び１００μタのシスプラ
チンを含有するもので１回投与処置された。第１１図で
は、マウスは腫瘍の移植後２０時間して１回、静脈内に
、１９１１１９のモノクローナル抗体１０８及び０．１
■のシスプラチン（Ａｂｉｃ＊Ｒ（Ｌｔｌ＆αｔ−Ｇａ
ｎ．ｌａデα＃１を投与処理された。各物質は別々に注
射された。ＰＢＳ（●）、モノクローナル抗体（▲）、
シスプラチン（■）、及びモノクローナル抗体＋シスプ
ラチン（◆）。
する１０８ｓＡ＆のシスプラチンと組み合わせた場合の
抗腺瘍活性を示している。第ｌＯ図においては１．８９
のモノクローナル抗体１０８及び１００μタのシスプラ
チンを含有するもので１回投与処置された。第１１図で
は、マウスは腫瘍の移植後２０時間して１回、静脈内に
、１９１１１９のモノクローナル抗体１０８及び０．１
■のシスプラチン（Ａｂｉｃ＊Ｒ（Ｌｔｌ＆αｔ−Ｇａ
ｎ．ｌａデα＃１を投与処理された。各物質は別々に注
射された。ＰＢＳ（●）、モノクローナル抗体（▲）、
シスプラチン（■）、及びモノクローナル抗体＋シスプ
ラチン（◆）。
第１２図は細胞の生胃に及ぼすＥＧＦの効果を示してい
る。Ａ）１８４ＡＩＮ４１１ａ胞。Ｂ）ＭＤＡ−４６８
１ａ胞。
る。Ａ）１８４ＡＩＮ４１１ａ胞。Ｂ）ＭＤＡ−４６８
１ａ胞。
１８４ＡＩＮ４細胞は３本の２４−ウェルプレートのウ
ェルに入れられ（ ｓ，ｏ ｏ ｏ個／ウェル冫、ＥＧ
Ｆを加えられた。ＭＤＩ−４６８細胞は３本の２４−ウ
ェルプレートのウェルに入れられ（ ｓ，ｏ ｏ ｏ個
／ウェル）、１晩付着させておかれた。次の日にＥＧＦ
を加えた。培地′％：４８時間後に交換し、４日後に細
胞を数え瓢平均（±ＳＤ）細胞数を示し島 第１３−は、付着依存性の細胞の生育の抗−ＥＧＦレセ
プター抗体（ａＥＧＰＲ）の阻害を示すものである。１
８４ＡＩＮ４細胞（Ａ及びＢ）及びＭＤＡ−４６８細胞
（Ｃ及びＤ）は３本の２４−ウェルプレートのウェルκ
入れられ（ ５，０ ０ ０個／ウェル）、抗体を加え
る前に付着させておかれた。１８４ＡＩＮ４の生育培地
はｌ ｎｐ庫Ｅ Ｇ Ｆを含有していム４８時間後生育
培地を交換し、４日後に細胞を数えた。細胞数（平均士
ＳＤ）のコトロールに対する％ ヲ示シｔＳ４９ ６
１ｇＭ （ ＠ ）、４２１ｇＭ（０）、非特異的なノ
ｙＭ（Δ）、２ ２ ５ １９Ｇ（＠）、１０８１ｇ（
；Ｃ口）、非特異的なＩ（ＩＧ（▲）。
ェルに入れられ（ ｓ，ｏ ｏ ｏ個／ウェル冫、ＥＧ
Ｆを加えられた。ＭＤＩ−４６８細胞は３本の２４−ウ
ェルプレートのウェルに入れられ（ ｓ，ｏ ｏ ｏ個
／ウェル）、１晩付着させておかれた。次の日にＥＧＦ
を加えた。培地′％：４８時間後に交換し、４日後に細
胞を数え瓢平均（±ＳＤ）細胞数を示し島 第１３−は、付着依存性の細胞の生育の抗−ＥＧＦレセ
プター抗体（ａＥＧＰＲ）の阻害を示すものである。１
８４ＡＩＮ４細胞（Ａ及びＢ）及びＭＤＡ−４６８細胞
（Ｃ及びＤ）は３本の２４−ウェルプレートのウェルκ
入れられ（ ５，０ ０ ０個／ウェル）、抗体を加え
る前に付着させておかれた。１８４ＡＩＮ４の生育培地
はｌ ｎｐ庫Ｅ Ｇ Ｆを含有していム４８時間後生育
培地を交換し、４日後に細胞を数えた。細胞数（平均士
ＳＤ）のコトロールに対する％ ヲ示シｔＳ４９ ６
１ｇＭ （ ＠ ）、４２１ｇＭ（０）、非特異的なノ
ｙＭ（Δ）、２ ２ ５ １９Ｇ（＠）、１０８１ｇ（
；Ｃ口）、非特異的なＩ（ＩＧ（▲）。
第１４図は，ＥＧＦによる付着依存性の細胞の生育のＧ
ＥＧＰＲ阻害の逆転を示すものである。細胞は３本の２
４−ウェルプレートのウェルの中に入れられた（ ５，
０ ０ ０個／クエ，Ａ／）。１８４ＡＩＮ４細胞（Ａ
及びＢ）はＥＧＦ及び抗体を加える前にＥＧＦを含まな
い培地中で４時間付着させておかれた。ＭＤＡ − ４
６ ８細胞（Ｃ及びＤ）は一晩置いておかれた。抗体
を２０ｎＨの終濃度となるよ５Ｋ加えた。培地を４８時
間後交換し、４日後に細胞を数えた。
ＥＧＰＲ阻害の逆転を示すものである。細胞は３本の２
４−ウェルプレートのウェルの中に入れられた（ ５，
０ ０ ０個／クエ，Ａ／）。１８４ＡＩＮ４細胞（Ａ
及びＢ）はＥＧＦ及び抗体を加える前にＥＧＦを含まな
い培地中で４時間付着させておかれた。ＭＤＡ − ４
６ ８細胞（Ｃ及びＤ）は一晩置いておかれた。抗体
を２０ｎＨの終濃度となるよ５Ｋ加えた。培地を４８時
間後交換し、４日後に細胞を数えた。
細胞数を平均（±ＳＤ）で示した。９ ６ １１Ｍ（●
）、４２Ｊｇ＆（○）、非特異的なＩＱＭ（Δ）、２２
５１９Ｇ（麿）、１０８ｌｙＧｃ口）、非特異的なノｐ
（△）。
）、４２Ｊｇ＆（○）、非特異的なＩＱＭ（Δ）、２２
５１９Ｇ（麿）、１０８ｌｙＧｃ口）、非特異的なノｐ
（△）。
第１５図はモノクローナルａＥＧＦＲＶｃよる１８４，
４１Ｎ４−Ｔのコロニー形成の阻害を示すものである。
４１Ｎ４−Ｔのコロニー形成の阻害を示すものである。
細胞は実施例■ＣＥ）に記載したように軟寒天中で、２
０％Ｍ●ＥＧＦＲまたは２ ０ ｎｕ非特異的な抗体の
存在下ＥＧＦ濃度を増大させながら生育させ？−．＝６
０μ鶴より大きいコａ二−の数を平均（±ＳＤ）で示し
た。Ａ） ＩＱＧ２２２５１ｇＧ（●）、１ ０ ８
１ｇＧＣＯ）、非特異的なＩ（ＩＧ （Δ）Ｏ Ｂ）
１ＱＭ： ９ ６ １９ＭＣＯ）、４ ２ １（ＩＭ
（●）、非特異的なｉｇｘ（Δ）。
０％Ｍ●ＥＧＦＲまたは２ ０ ｎｕ非特異的な抗体の
存在下ＥＧＦ濃度を増大させながら生育させ？−．＝６
０μ鶴より大きいコａ二−の数を平均（±ＳＤ）で示し
た。Ａ） ＩＱＧ２２２５１ｇＧ（●）、１ ０ ８
１ｇＧＣＯ）、非特異的なＩ（ＩＧ （Δ）Ｏ Ｂ）
１ＱＭ： ９ ６ １９ＭＣＯ）、４ ２ １（ＩＭ
（●）、非特異的なｉｇｘ（Δ）。
第１６図はＭＤＡ−４５ ８コロニーの形成に及ぼすＧ
ＥＧＦＨの効果を示すものである。細胞は実施例■ＣＣ
）に記載したように軟寒天中でｓ ２ ０ ｎ Ｍのａ
ＥＧＦＲまたは非特異的な抗体の存在下ＥＧＦ濃度を増
大させながら生育させた。細胞はｆたＥＧＦ単独下でも
生育させた。６０μ溝より大きいコロ二−の数を平均（
±ＳＤ）で示した。
ＥＧＦＨの効果を示すものである。細胞は実施例■ＣＣ
）に記載したように軟寒天中でｓ ２ ０ ｎ Ｍのａ
ＥＧＦＲまたは非特異的な抗体の存在下ＥＧＦ濃度を増
大させながら生育させた。細胞はｆたＥＧＦ単独下でも
生育させた。６０μ溝より大きいコロ二−の数を平均（
±ＳＤ）で示した。
Ａ）ノｌＧ＝２２５１９Ｇ（●）、ｌ Ｏ ８ １ｒｔ
ＧＣΔ）、非特異的ナ７ｇＧ（Ａ）、ＥＧＦ単ａ（０）
。Ｂ） Ｉ（ＩＭ：９ ６ １９Ｍ（Δ）、４２１ｙＭ
ｃ●）、非特異的なノｙＭ（▲）、ＥＧＦ単独（０）。
ＧＣΔ）、非特異的ナ７ｇＧ（Ａ）、ＥＧＦ単ａ（０）
。Ｂ） Ｉ（ＩＭ：９ ６ １９Ｍ（Δ）、４２１ｙＭ
ｃ●）、非特異的なノｙＭ（▲）、ＥＧＦ単独（０）。
第１７図は、ＭＤＡ＋４５ ８細胞に結合するρ！１Ｉ
」ＥＧＦに及ぼすａＥＧＦＲの効釆を示丁ものである。
」ＥＧＦに及ぼすａＥＧＦＲの効釆を示丁ものである。
２４−ウェルプレート中の集密的（ ｃｏｎｆｌｓａｓ
ｔ）ＭＤＡ −４６８細胞をヨウ素化したＥＧＦ（１％
Ｍ）及び非標識抗体またはＥＧＦの濃度を太き《しなが
ら２．５時間４℃でインキエペートした。２または３つ
の別々の実験からの二つの側定の平均（±ＳＤ）１ｋ示
した。Ａ）２２５ノｙＧｃΔ）、１０８７９Ｇ（◇）、
非特異的なノｙＧＣ）、ＥＧＦ標準（●）。
ｔ）ＭＤＡ −４６８細胞をヨウ素化したＥＧＦ（１％
Ｍ）及び非標識抗体またはＥＧＦの濃度を太き《しなが
ら２．５時間４℃でインキエペートした。２または３つ
の別々の実験からの二つの側定の平均（±ＳＤ）１ｋ示
した。Ａ）２２５ノｙＧｃΔ）、１０８７９Ｇ（◇）、
非特異的なノｙＧＣ）、ＥＧＦ標準（●）。
Ｂ）ＩＱＭ＝９６ｌｇ＆（●）、４ ２ １９Ｍ （△
）、非特異的なＩＱＭ（▼）、ＥＧＦ標準（０）。
）、非特異的なＩＱＭ（▼）、ＥＧＦ標準（０）。
実施例ｌ．
Ｂａｌｂ／ｅ ”ウス’ｌｊ（ＣＭ ７ １細胞１たは
ＣＨ７ｌｌ＠胞膜調製物の腹腔内への注射により免疫し
た。ＣＥ７ｌ細胞はＥＧＦ−Ｒ ｃＤＮＡの切断された
かたちのもの（ＥＧＦ−Ｒの細胞内のドメインの大都分
が欠失したもの）を有するプラスミドでトランスフエク
トされたチャイニーズハムスター卵巣細胞である。（Ｌ
ｔｎｖｎａｈ．ａｔ ａｌ．．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈａｍ
．，ｉ’ｏｌ．２６０．１２４９０（１９８６））。こ
のトランスフエクトされた細胞は、ほ＄２１０”個の変
異ＥＧＦ一Ｒ分子／細胞を発現する。ｃｎ−７１細胞を
選ぶことにより、ＥＧＦ−Ｈの細胞外のドメインに対す
る抗体を分壓するハイブリドーマのみを最初リスクリー
ニング試験で選択できそしてヒトＥＧＦ−Ｒ分子に結合
しているヒトに特異的な糖類に対して向けられた抗体を
選択することを避けることができる。
ＣＨ７ｌｌ＠胞膜調製物の腹腔内への注射により免疫し
た。ＣＥ７ｌ細胞はＥＧＦ−Ｒ ｃＤＮＡの切断された
かたちのもの（ＥＧＦ−Ｒの細胞内のドメインの大都分
が欠失したもの）を有するプラスミドでトランスフエク
トされたチャイニーズハムスター卵巣細胞である。（Ｌ
ｔｎｖｎａｈ．ａｔ ａｌ．．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈａｍ
．，ｉ’ｏｌ．２６０．１２４９０（１９８６））。こ
のトランスフエクトされた細胞は、ほ＄２１０”個の変
異ＥＧＦ一Ｒ分子／細胞を発現する。ｃｎ−７１細胞を
選ぶことにより、ＥＧＦ−Ｈの細胞外のドメインに対す
る抗体を分壓するハイブリドーマのみを最初リスクリー
ニング試験で選択できそしてヒトＥＧＦ−Ｒ分子に結合
しているヒトに特異的な糖類に対して向けられた抗体を
選択することを避けることができる。
マウスを第Ｏ日目、第１３日目及び第３２日目の３回免
疫した。２匹の最も応答性の良いマウスそれぞれに３回
ＣＥ７１細胞を３日続け″′Ｃ融合前に腹腔内注射して
免疫を促進増強した。次に６５日目にマウスの肺臓細砲
をＮＳｌミエローマ細胞（比率５７１）と、融合剤とし
てＰＥＧ４０００（Ｍａｒｃｋ ）を用い、Ｋｏｈｌａ
ｒ及びＭｉｌｓｇａｉｎの一般法に従って融合せしめた
。（ Ｋｏｈｌ ａｔ ａｎｄ ＭｉｌｓｔａｉｎｅＥ
＊ｒ．Ｊ．Ｉｍｎａｗｎ．．ｌ’ｏｌ． ６ ，５１
１ ５１９（１９７６））。
疫した。２匹の最も応答性の良いマウスそれぞれに３回
ＣＥ７１細胞を３日続け″′Ｃ融合前に腹腔内注射して
免疫を促進増強した。次に６５日目にマウスの肺臓細砲
をＮＳｌミエローマ細胞（比率５７１）と、融合剤とし
てＰＥＧ４０００（Ｍａｒｃｋ ）を用い、Ｋｏｈｌａ
ｒ及びＭｉｌｓｇａｉｎの一般法に従って融合せしめた
。（ Ｋｏｈｌ ａｔ ａｎｄ ＭｉｌｓｔａｉｎｅＥ
＊ｒ．Ｊ．Ｉｍｎａｗｎ．．ｌ’ｏｌ． ６ ，５１
１ ５１９（１９７６））。
融合生成物をヒボキサンチンーアミノプテリンーテミジ
ン（ＨＡＴ）選択培地の代わりにヒポキサンテンーアザ
セリン（ＨＡ ）選択培地（Ｇ．Ｂｓｔ百ｎ．ａｔ ａ
ｌ．，ＣｕｒｒａｎｔＴｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ αｎｄ ノｍｔｎｓｎｏｌｏ
ｇｙ，Ｖｏｊ．８１．２７−３６（１９７８））で希釈
し、９６ウェルプレートに分けて入れた。
ン（ＨＡＴ）選択培地の代わりにヒポキサンテンーアザ
セリン（ＨＡ ）選択培地（Ｇ．Ｂｓｔ百ｎ．ａｔ ａ
ｌ．，ＣｕｒｒａｎｔＴｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ αｎｄ ノｍｔｎｓｎｏｌｏ
ｇｙ，Ｖｏｊ．８１．２７−３６（１９７８））で希釈
し、９６ウェルプレートに分けて入れた。
最初にラジオイムノアッセイによって生育してぃるハイ
ブリドー７のウェル中の培地の甲に特異抗体があるか否
か分析した。ＥＧＦレセプターを発現している細胞ある
いはＥＧＦレセプターを発現していない細胞を９６ウェ
ルプレート中に入れた。果蜜状態下、それらを１回結合
培地（ ＤＭＥＭ， ２ ０ ｍｋｌ Ｅｍｐａｓ，
０．２％ＢＳＡ）で洗滌し、異なった生育ハイプリドー
マから得られた１００μｌのカルチャーの上清と一緒に
し室温で９０分間インキユペートした。次に細胞を結合
培地で３回洗滌し、１００μＥのヨウ素化したヤギの抗
マウス免疫グロブリン（ ２ ５ ０，０ ０ ０ｃｐ
ｍ／ １ ０ ０μＥ）ｇと共にさらに室温で６０分間
インキユベートした。ＰＢＳ（リン酸塩緩衝塩液、ｐＨ
７．５）で３回洗った後、細胞をクエルからこすり取り
、それらの表面に結合した放射活性なガンマ線カウンタ
ーを用いて測定した。抗体のＥＧＦレセプターを発現し
ている細胞（ヒトＥＧＦ−Ｒ ＤＩＶＡ構築物でトラ
ンスフエクトされたＡ４３ｌ，ヒト繊維芽胞細またはマ
ウス３Ｔ３細胞）の表面への特異的な結合能をこの方法
で側定し、さらにＥＧＦ−Ｒを発現していない細胞（マ
ウス３Ｔ３細胞の特定のクローン）への結合能と比較し
た。陽性のハイブリドーマを限界希釈をしてクローン化
し、さらに異なった種（ヒト、マウス、ニワトリ）のセ
ルラインのライゼートから得られたＵＳメテオニンまた
はＡＩＰで標識されたＥＧＦ−Ｒを免疫沈殿させうるか
どうかを側定して調べた。このためＫ１ヤギ抗マウス免
疫グロブリンを、プロテインＡ−セファロースに、ヤギ
抗マウス抗体溶液とプロテインＡ−セファロースビーズ
とを室温で３０分間インキユベートすることにより結合
させた。次にこれを３回２０ｓＪ／ Ｂ−ｐｍｓ．ｐ８
７．４で抗った。次にさらにヤギマウス１ｇ コートし
たプロテインＡ−セ７アロースビーズを３０分間富温で
ハイブリドー１のカルチャーの上清液と共にインキエベ
ートし、ＥＮＴ（４衝液（ ２ ０ 愼ＭＩｉｍｐａｓ
＃ １５ ０ｓ＆ ＮａＣｌ．０．１％ Ｔｒｉｔｏ
ｎＸ−１００、１０％グリセロール）で３回洗滌し、そ
して、可溶化緩衝液（ｌ％ ＴデｉｔｏｎＸ−１００、
１ ５ ０ ｓ＆ ＮａＣｌ， ２ ０ ｆｉｊｎ
Ｈｏｐｅｓ、１．５ｍ＃ＥＧＴＡ， １．５ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ，，１０％ｆリセｏ−Ａ／、プロテアーゼ阻害剤
としてアブロチニン、ロイペプテン及ヒＰＭＳＦ）でも
って細胞の単層な溶菌化し、２イゼートを遠心して核ペ
レットを除去して得られたいろいろな細胞ライゼートと
４℃で１時間インキュベートしｔ，， ３Ｒｐで標識す
るため、免疫沈殿物をＩＩＮＴＧで３回洗い、次に１５
分間”Ｆ ＡＴＰＭＨ （ ５ ｍＭ ＆／！！及Ｕ
３ ｐ Ｃｉ ／”Ｐ ＡＩＰ試料を含むＥＮＴＧ）
と共にインキエペートした。次に電気泳動試料用緩衝ｇ
．を加え、７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに
かける前に試料を１０分間９５℃で煮沸し瓢モノクロー
ナル抗体１０８、９６及び４２はすべてヒトＥＧＦ−Ｈ
に対し％異性を持つことが見出された。これらの抗体は
またＥＧＦ−Ｒを発現している細胞の表面にヨク素化さ
れたＥＧＦが結合するのを阻害する能力について調べら
れた。これら３ｍの抗体はＥＧＦの該レセプターへの結
合を阻害するが、その阻害の程度は９６）１０８）４２
というものであった。
ブリドー７のウェル中の培地の甲に特異抗体があるか否
か分析した。ＥＧＦレセプターを発現している細胞ある
いはＥＧＦレセプターを発現していない細胞を９６ウェ
ルプレート中に入れた。果蜜状態下、それらを１回結合
培地（ ＤＭＥＭ， ２ ０ ｍｋｌ Ｅｍｐａｓ，
０．２％ＢＳＡ）で洗滌し、異なった生育ハイプリドー
マから得られた１００μｌのカルチャーの上清と一緒に
し室温で９０分間インキユペートした。次に細胞を結合
培地で３回洗滌し、１００μＥのヨウ素化したヤギの抗
マウス免疫グロブリン（ ２ ５ ０，０ ０ ０ｃｐ
ｍ／ １ ０ ０μＥ）ｇと共にさらに室温で６０分間
インキユベートした。ＰＢＳ（リン酸塩緩衝塩液、ｐＨ
７．５）で３回洗った後、細胞をクエルからこすり取り
、それらの表面に結合した放射活性なガンマ線カウンタ
ーを用いて測定した。抗体のＥＧＦレセプターを発現し
ている細胞（ヒトＥＧＦ−Ｒ ＤＩＶＡ構築物でトラ
ンスフエクトされたＡ４３ｌ，ヒト繊維芽胞細またはマ
ウス３Ｔ３細胞）の表面への特異的な結合能をこの方法
で側定し、さらにＥＧＦ−Ｒを発現していない細胞（マ
ウス３Ｔ３細胞の特定のクローン）への結合能と比較し
た。陽性のハイブリドーマを限界希釈をしてクローン化
し、さらに異なった種（ヒト、マウス、ニワトリ）のセ
ルラインのライゼートから得られたＵＳメテオニンまた
はＡＩＰで標識されたＥＧＦ−Ｒを免疫沈殿させうるか
どうかを側定して調べた。このためＫ１ヤギ抗マウス免
疫グロブリンを、プロテインＡ−セファロースに、ヤギ
抗マウス抗体溶液とプロテインＡ−セファロースビーズ
とを室温で３０分間インキユベートすることにより結合
させた。次にこれを３回２０ｓＪ／ Ｂ−ｐｍｓ．ｐ８
７．４で抗った。次にさらにヤギマウス１ｇ コートし
たプロテインＡ−セ７アロースビーズを３０分間富温で
ハイブリドー１のカルチャーの上清液と共にインキエベ
ートし、ＥＮＴ（４衝液（ ２ ０ 愼ＭＩｉｍｐａｓ
＃ １５ ０ｓ＆ ＮａＣｌ．０．１％ Ｔｒｉｔｏ
ｎＸ−１００、１０％グリセロール）で３回洗滌し、そ
して、可溶化緩衝液（ｌ％ ＴデｉｔｏｎＸ−１００、
１ ５ ０ ｓ＆ ＮａＣｌ， ２ ０ ｆｉｊｎ
Ｈｏｐｅｓ、１．５ｍ＃ＥＧＴＡ， １．５ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ，，１０％ｆリセｏ−Ａ／、プロテアーゼ阻害剤
としてアブロチニン、ロイペプテン及ヒＰＭＳＦ）でも
って細胞の単層な溶菌化し、２イゼートを遠心して核ペ
レットを除去して得られたいろいろな細胞ライゼートと
４℃で１時間インキュベートしｔ，， ３Ｒｐで標識す
るため、免疫沈殿物をＩＩＮＴＧで３回洗い、次に１５
分間”Ｆ ＡＴＰＭＨ （ ５ ｍＭ ＆／！！及Ｕ
３ ｐ Ｃｉ ／”Ｐ ＡＩＰ試料を含むＥＮＴＧ）
と共にインキエペートした。次に電気泳動試料用緩衝ｇ
．を加え、７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに
かける前に試料を１０分間９５℃で煮沸し瓢モノクロー
ナル抗体１０８、９６及び４２はすべてヒトＥＧＦ−Ｈ
に対し％異性を持つことが見出された。これらの抗体は
またＥＧＦ−Ｒを発現している細胞の表面にヨク素化さ
れたＥＧＦが結合するのを阻害する能力について調べら
れた。これら３ｍの抗体はＥＧＦの該レセプターへの結
合を阻害するが、その阻害の程度は９６）１０８）４２
というものであった。
実施例ｎ
口部類表皮癌から訪導されたＫＢ肚瘍セルラインはＡｎ
＊ａｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ ＴｉｓｓＳ＆ａ Ｃ
ｓｔｔ＊ｒａ Ｃｏｔｔｍｃｔｉｏｎから入手された
。その細胞は、５６℃で３０分間インキユベートするこ
とにより補体活性をなくしたｌＯ％ウシ胎児血清を補な
ったＤ耐ｂａｃＣｏの修飾Ｅασｌ一培地中で生育させ
、そしてグルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン
及びピルビン酸ナトリウム中３７℃、５％ＣＯ，；９５
ラ空気下に生育させた。
＊ａｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ ＴｉｓｓＳ＆ａ Ｃ
ｓｔｔ＊ｒａ Ｃｏｔｔｍｃｔｉｏｎから入手された
。その細胞は、５６℃で３０分間インキユベートするこ
とにより補体活性をなくしたｌＯ％ウシ胎児血清を補な
ったＤ耐ｂａｃＣｏの修飾Ｅασｌ一培地中で生育させ
、そしてグルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン
及びピルビン酸ナトリウム中３７℃、５％ＣＯ，；９５
ラ空気下に生育させた。
Ｂ．ヒト乳房上皮細胞（ｌ８４細胞）及びヒト乳癌細胞
１８４ＡＩＮ４及び１８４ＡＩＮ４−Ｔヒト乳房上皮細
胞はＭａｒｔｋａ Ｓｇａｔｎｐｌａｒ，Ｌａｗｒｅ
ｎｃｅ Ｂｍｒｋａ１ｍｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂ
ａｒｋａｌｍｙ＊ＣＡ．により提供された０１８４ＡＬ
Ｎ４細胞は、グルタミン（０．６〜／ＩＬｔ）、ウシ胎
児血清（０．５％）、ヒドロコルチゾン（０．５μＰ／
ａｊ ）、インシュリン（ ５ μｙ／ｒｕ ）及びＥ
ＧＦ（ｌＯｎｙ／Ｒｔ）を補なったｌＭＥＭ及び５％
ＣＯ，中で３７℃で保持されｔム１８４ＡＩＮ４−Ｔは
、グルタミン（０．６■／紅）、ゲンタマイシン（４Ｑ
ＩＩ＃９／ａｇ）及びｌＯチクシ胎児血清を補なったｌ
ＭＥＭ （ Ｂｉｏｆｌｓｉｄａ，Ｒｏｃｋｒｔｌｌａ
，ＭＤ）及び５％ ＣＯ，中３７℃で保持された。ＭＤ
Ａ−４６８細胞は、１８４ＡＩＮ４−’Ｉ”細胞と同じ
条汗及び培地中で培養された。
１８４ＡＩＮ４及び１８４ＡＩＮ４−Ｔヒト乳房上皮細
胞はＭａｒｔｋａ Ｓｇａｔｎｐｌａｒ，Ｌａｗｒｅ
ｎｃｅ Ｂｍｒｋａ１ｍｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂ
ａｒｋａｌｍｙ＊ＣＡ．により提供された０１８４ＡＬ
Ｎ４細胞は、グルタミン（０．６〜／ＩＬｔ）、ウシ胎
児血清（０．５％）、ヒドロコルチゾン（０．５μＰ／
ａｊ ）、インシュリン（ ５ μｙ／ｒｕ ）及びＥ
ＧＦ（ｌＯｎｙ／Ｒｔ）を補なったｌＭＥＭ及び５％
ＣＯ，中で３７℃で保持されｔム１８４ＡＩＮ４−Ｔは
、グルタミン（０．６■／紅）、ゲンタマイシン（４Ｑ
ＩＩ＃９／ａｇ）及びｌＯチクシ胎児血清を補なったｌ
ＭＥＭ （ Ｂｉｏｆｌｓｉｄａ，Ｒｏｃｋｒｔｌｌａ
，ＭＤ）及び５％ ＣＯ，中３７℃で保持された。ＭＤ
Ａ−４６８細胞は、１８４ＡＩＮ４−’Ｉ”細胞と同じ
条汗及び培地中で培養された。
Ｃ．９６１（ＩＭ及びＩ Ｏ ８ １ｇＧ２ａハイブリ
ドーマセルラインの培養 １ ０ ８ １９Ｇ２αハイブリドーマセルラインはＥ
ＧＦレセプターを発現しているＣＨ７１細胞でマウスを
免疫して生成させ、ＫＢセルラインと同じ条件下Ｖｃｆ
＠養した。
ドーマセルラインの培養 １ ０ ８ １９Ｇ２αハイブリドーマセルラインはＥ
ＧＦレセプターを発現しているＣＨ７１細胞でマウスを
免疫して生成させ、ＫＢセルラインと同じ条件下Ｖｃｆ
＠養した。
９ ６ １９Ｍ ハイブリドーマセルラインは、１０８
１ｇＧ２ａハイブリドーマセルラインに対して記載した
のと同じ方法で生成させた。
１ｇＧ２ａハイブリドーマセルラインに対して記載した
のと同じ方法で生成させた。
実施例■
Ａ．動物からのモノクローナル抗体１０８の精製１ ０
８ １ｇＧ２ａハイブリドーマ細胞を注射した動物の
腹水を４℃でｌＯ分間−ｐｐｍｎｄｏｒｆ ｃａｎｔｒ
ｉｆ％ｇ＃中で遠心して澄んだ液とした。４℃で飽和硫
酸アンモニウムをゆっくりと箔加してｐＨ７．５で２４
時間かけて最後には４５％（Ｖ／Ｖ）の濃度までにしモ
ノクローナル抗体を沈殿させた。沈殿を１５分間１０，
０００ｙで遠心して染め、５０％Ｖ／Ｖの硫酸アンモニ
ウム液、ｐＨ ７．５、４℃で２回洗滌した。さらに０
．１４Ａｆ｝リス緩衝液、ｐＨ８．０中のセ７７ｏ−ｘ
ｃＬプロテインＡ （ Ｐｈａｒｒｎａｅｔａ）の７７
イニテイクロマトグラ７イーによって精製し、０． １
Ｍクエン酸塩緩衝液、ｐＨ ３．０で溶出し、次にＰ
ＢＳに対して徹底的に透析してモノクローナル抗体１０
８を得た。
８ １ｇＧ２ａハイブリドーマ細胞を注射した動物の
腹水を４℃でｌＯ分間−ｐｐｍｎｄｏｒｆ ｃａｎｔｒ
ｉｆ％ｇ＃中で遠心して澄んだ液とした。４℃で飽和硫
酸アンモニウムをゆっくりと箔加してｐＨ７．５で２４
時間かけて最後には４５％（Ｖ／Ｖ）の濃度までにしモ
ノクローナル抗体を沈殿させた。沈殿を１５分間１０，
０００ｙで遠心して染め、５０％Ｖ／Ｖの硫酸アンモニ
ウム液、ｐＨ ７．５、４℃で２回洗滌した。さらに０
．１４Ａｆ｝リス緩衝液、ｐＨ８．０中のセ７７ｏ−ｘ
ｃＬプロテインＡ （ Ｐｈａｒｒｎａｅｔａ）の７７
イニテイクロマトグラ７イーによって精製し、０． １
Ｍクエン酸塩緩衝液、ｐＨ ３．０で溶出し、次にＰ
ＢＳに対して徹底的に透析してモノクローナル抗体１０
８を得た。
で２回洗滌した。次に沈殿を溶解し、５０ｓＭ｝＋７ス
−８、Ｑ， ５ Ｍ ＮａＣｌ３に対して徹底的に透
析した。５０ｍＡｆトリス、ｐＥ ７，８、Ｏ、５Ｍ
ＮａＣｌ中で平衡化したセフアクリル５−３０００を使
用してゲルＰ過によってこのものを精製し亀モノクロー
ナル抗体ｍＡｂ９６を含有するピークをプールして、Ｐ
ＢＳに対して透析した。
−８、Ｑ， ５ Ｍ ＮａＣｌ３に対して徹底的に透
析した。５０ｍＡｆトリス、ｐＥ ７，８、Ｏ、５Ｍ
ＮａＣｌ中で平衡化したセフアクリル５−３０００を使
用してゲルＰ過によってこのものを精製し亀モノクロー
ナル抗体ｍＡｂ９６を含有するピークをプールして、Ｐ
ＢＳに対して透析した。
実施例■
９ ６ １９Ｍハイブリドーマ細胞を注射した動物の腹
水を４１？：ｒｌｓ分間３ ０ ０ ０ ＲＰＭＴ ｌ
ｏｗ ｓｐｅｅｄ ｃａｎｔｒｉｆｓｇｇ中で遠ＩＬ？
シて澄んだ液とした。４℃で飽和硫酸アンモニウム液を
ゆつ《りと加え、ｐＨ７．５で２４時間かけて最後には
４ｓ％（Ｖ／ｌの濃度までにしてモノクローナル抗体を
沈殿させた。沈殿を１ ０，０ ０ ０ ｊ’で１５分
間遠心して集め、ｐＨ ７．５、４℃で５０％Ｖ／Ｖの
硫酸アンモニウム液モノクローナル抗体１ ０ ８ （
５Ｑ／ａｔ ）のＱ，ｌＡｆ酢酸ナトリウム緩衝ｇｐ
Ｈ ３．９の＃ｇを３７℃で７時間４％蹄贋ペプシン（
Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｅｉｏｅ五−ｍｉｃαｌ Ｃ
ｏｒｐｏｒａ−ｔｉｏｎ＋Ｎａｗ Ｊｅｒｓｅｙ）存在
下消化した。２ Ｍ トＩＪ ステｐ’／を８．０にあ
わせて消化を止め、次に４℃でＰＢＳに対して透析した
。残りの未反応のノＱＧ分子をプロテインＡアフイニテ
イクロマトグラフイーによって除去した。Ｆｃ部及びよ
り小さなフラグメントをセファロースＧ− ｌｏｏのゲ
ル戸過により除去した。単価Ｆａｂ’ ７ラグメントを
調製するため、Ｆ（ａｈ）５ （ ２”９／” ）を３
７℃で１時間２０ｗＪ／｝リス緩衝液、ｐＨ８．２甲で
１０ｍＭジチオスレイトールで還元した。３７℃で３０
分間４０ｍＭヨードアセトアミド液でアルキル化し、次
に４℃でＰＢＳに対して徹底的に透析した。ドデシル硫
酸ナトリウムボリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ、第１図参照）によっていろいろなフラグメ
ントの純度及び消化が完結していることを分析した。モ
ノクローナル抗体１０８の１！５７−標へ化をクロラミ
ンＴ法（Ｈｕｎｔｅｒ ａｎｄ Ｇｒｇａｎｗｏｏｄ．
Ｐｒａｐａｒａ−ｔｉｏｎ ｏｆ ”’ Ｉｏｄｉｎｅ
Ｌａｂａｌｌｍｄ Ｅｕｍａｎ ＧｒｏｗｔｈＥｏｒ
ｍｏｎｄ ｏｆ Ｈｉｇｈ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｃｔ
ｉ＊ｉｔｙｒ１’／ａｔｗｒａ，Ｖｏｌ．１９６，４６
５−６，（１９６２））によって行った。通常約３ Ｘ
Ｉ Ｏ’ ｃｐｒｍ／μノＩＱＧの比活性のものが得
られた。１＊”ｌ ａｍ１ ０８ のＫＢｍｍ上ｔｌｃ
％ｂｔ”Ｌ．ｒＳＥ Ｃ Ｆレセプターへの結倉と競合
しうる点で天然の筐エのモノクローナル抗体１０８と比
較してモノクローナル抗体１０８０Ｆ（αｂ）；及びＦ
（αｂ）フラグメンＮ工允分に免疫反応性を有していた
（第２図蕗照）。
水を４１？：ｒｌｓ分間３ ０ ０ ０ ＲＰＭＴ ｌ
ｏｗ ｓｐｅｅｄ ｃａｎｔｒｉｆｓｇｇ中で遠ＩＬ？
シて澄んだ液とした。４℃で飽和硫酸アンモニウム液を
ゆつ《りと加え、ｐＨ７．５で２４時間かけて最後には
４ｓ％（Ｖ／ｌの濃度までにしてモノクローナル抗体を
沈殿させた。沈殿を１ ０，０ ０ ０ ｊ’で１５分
間遠心して集め、ｐＨ ７．５、４℃で５０％Ｖ／Ｖの
硫酸アンモニウム液モノクローナル抗体１ ０ ８ （
５Ｑ／ａｔ ）のＱ，ｌＡｆ酢酸ナトリウム緩衝ｇｐ
Ｈ ３．９の＃ｇを３７℃で７時間４％蹄贋ペプシン（
Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｅｉｏｅ五−ｍｉｃαｌ Ｃ
ｏｒｐｏｒａ−ｔｉｏｎ＋Ｎａｗ Ｊｅｒｓｅｙ）存在
下消化した。２ Ｍ トＩＪ ステｐ’／を８．０にあ
わせて消化を止め、次に４℃でＰＢＳに対して透析した
。残りの未反応のノＱＧ分子をプロテインＡアフイニテ
イクロマトグラフイーによって除去した。Ｆｃ部及びよ
り小さなフラグメントをセファロースＧ− ｌｏｏのゲ
ル戸過により除去した。単価Ｆａｂ’ ７ラグメントを
調製するため、Ｆ（ａｈ）５ （ ２”９／” ）を３
７℃で１時間２０ｗＪ／｝リス緩衝液、ｐＨ８．２甲で
１０ｍＭジチオスレイトールで還元した。３７℃で３０
分間４０ｍＭヨードアセトアミド液でアルキル化し、次
に４℃でＰＢＳに対して徹底的に透析した。ドデシル硫
酸ナトリウムボリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ、第１図参照）によっていろいろなフラグメ
ントの純度及び消化が完結していることを分析した。モ
ノクローナル抗体１０８の１！５７−標へ化をクロラミ
ンＴ法（Ｈｕｎｔｅｒ ａｎｄ Ｇｒｇａｎｗｏｏｄ．
Ｐｒａｐａｒａ−ｔｉｏｎ ｏｆ ”’ Ｉｏｄｉｎｅ
Ｌａｂａｌｌｍｄ Ｅｕｍａｎ ＧｒｏｗｔｈＥｏｒ
ｍｏｎｄ ｏｆ Ｈｉｇｈ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｃｔ
ｉ＊ｉｔｙｒ１’／ａｔｗｒａ，Ｖｏｌ．１９６，４６
５−６，（１９６２））によって行った。通常約３ Ｘ
Ｉ Ｏ’ ｃｐｒｍ／μノＩＱＧの比活性のものが得
られた。１＊”ｌ ａｍ１ ０８ のＫＢｍｍ上ｔｌｃ
％ｂｔ”Ｌ．ｒＳＥ Ｃ Ｆレセプターへの結倉と競合
しうる点で天然の筐エのモノクローナル抗体１０８と比
較してモノクローナル抗体１０８０Ｆ（αｂ）；及びＦ
（αｂ）フラグメンＮ工允分に免疫反応性を有していた
（第２図蕗照）。
災施例Ｖ
ハイブリドーマ１０８の上清液の抗体Ｍ曾活注を間接螢
光免疫分析法により測定した。ＫＢ＃ｌｆｌ胞（試科当
り２Ｘ１０’個）をアツセイ前に２４時間トリブシン処
理し、試験管（ｐ”ａｔｃｏｎ＊ボリスチレン製丸底試
験管）に入れた。
光免疫分析法により測定した。ＫＢ＃ｌｆｌ胞（試科当
り２Ｘ１０’個）をアツセイ前に２４時間トリブシン処
理し、試験管（ｐ”ａｔｃｏｎ＊ボリスチレン製丸底試
験管）に入れた。
アツセイ前に、ＫＢ細胞懸濁液を冷ＰＢＳでｖｃ滌し、
４℃で４５分間１０８ハイブリドーマの上清と共にイン
キュベ−｝Ｌ，ｒ，＝１％ウシ血清アルブミンを含有す
るＰＢＳで洗った後，４℃で４５分間フルオレツセイン
標識したウサギ抗マウスＩ（ＩＧと共にその細胞をイン
キユベートした。細胞試料をＰＢＳに懸濁し、螢光セル
ソータ−（ＦＡＣＳ ｌ、Ｂｍｃｔｉｎ Ｄｉｃｋａ
ｎａｏｎ．Ｍｏｓｎｔａｉｎｖｉｅｗ，Ｃａ，ＵＳＡ）
でもって分析した（第３図参照）。レセプター発現の均
一性を、ヒトＢ型肝炎ウイルスに対して作製されたハイ
ブリドーマ（７Ｈ０１）の上清で観察された染色がない
ということと比較して少な《とも９６チの細胞において
陽性の染色があることによク【示した。４℃での抗体結
合バラメーターのＳｅａｔｃｈａｒｄ分析は平均２Ｘｌ
Ｏ’結合部位／細胞及び１． ８ Ｘ １ ０ −”
ｊｆ−’ ノｆ Ｄヲ示シｆ；ＫＥ細胞（２４ウェルプ
レート中の１０５個／ウェル；ＮＵＮＣ）を２４時間生
胃させ、ＰＢＳで洗滌し、４℃、あるいは呈温で１時間
１％ウシ血清アルブミンを含有するＤＭＥＭ中天然のま
まの抗体またはそのフラグメントの各極の濃度のものと
、１２１７ モノクローナル抗体１０８（約Ｉ Ｘ １
０＠ｃｐＳ／ＩＬＩ）存在下にインキエベートした。
４℃で４５分間１０８ハイブリドーマの上清と共にイン
キュベ−｝Ｌ，ｒ，＝１％ウシ血清アルブミンを含有す
るＰＢＳで洗った後，４℃で４５分間フルオレツセイン
標識したウサギ抗マウスＩ（ＩＧと共にその細胞をイン
キユベートした。細胞試料をＰＢＳに懸濁し、螢光セル
ソータ−（ＦＡＣＳ ｌ、Ｂｍｃｔｉｎ Ｄｉｃｋａ
ｎａｏｎ．Ｍｏｓｎｔａｉｎｖｉｅｗ，Ｃａ，ＵＳＡ）
でもって分析した（第３図参照）。レセプター発現の均
一性を、ヒトＢ型肝炎ウイルスに対して作製されたハイ
ブリドーマ（７Ｈ０１）の上清で観察された染色がない
ということと比較して少な《とも９６チの細胞において
陽性の染色があることによク【示した。４℃での抗体結
合バラメーターのＳｅａｔｃｈａｒｄ分析は平均２Ｘｌ
Ｏ’結合部位／細胞及び１． ８ Ｘ １ ０ −”
ｊｆ−’ ノｆ Ｄヲ示シｆ；ＫＥ細胞（２４ウェルプ
レート中の１０５個／ウェル；ＮＵＮＣ）を２４時間生
胃させ、ＰＢＳで洗滌し、４℃、あるいは呈温で１時間
１％ウシ血清アルブミンを含有するＤＭＥＭ中天然のま
まの抗体またはそのフラグメントの各極の濃度のものと
、１２１７ モノクローナル抗体１０８（約Ｉ Ｘ １
０＠ｃｐＳ／ＩＬＩ）存在下にインキエベートした。
次に細胞を洗滌し、０． ５ Ｎ ＮａＯＥ液で可溶化
し、その放射活性をカウンター（Ｋｏｎｔｏｎ， Ｓ
ｗｉｔｇａｒｌａｎｄ ）で測定した。非特異的な結合
は、１００倍過剰量の非標識モノクローナル抗体を加え
て測定した。結果を、非標識抗体と共にインキユベート
した細胞に結合した放射活性の、冷抗体を加えることな
しにインキエペートした細胞に結合した放射活性に対す
るパーセンテイジとして表わしへＥＧＦは、最大で約７
０Ｓ’！で抗体のレセプターへの結合と競合している。
し、その放射活性をカウンター（Ｋｏｎｔｏｎ， Ｓ
ｗｉｔｇａｒｌａｎｄ ）で測定した。非特異的な結合
は、１００倍過剰量の非標識モノクローナル抗体を加え
て測定した。結果を、非標識抗体と共にインキユベート
した細胞に結合した放射活性の、冷抗体を加えることな
しにインキエペートした細胞に結合した放射活性に対す
るパーセンテイジとして表わしへＥＧＦは、最大で約７
０Ｓ’！で抗体のレセプターへの結合と競合している。
（第２図参照）。
Ｃ− ｉｎ ｓｉｖｏでの放射能標識されたモノクロ
ーナル抗体１０８の分布 ＫＢ細胞（４Ｘ１０’個）をヌードマウス（５−６週令
）の背部に皮下接種した。１４日後腫瘍が約１．２ｃｍ
の直径に達した時Ｉｌｌ ｌ モノクローナル抗体１０
８を静脈内あるいは腹腔内に注射した（ ｓｘ １ ０
＠Ｃｐｓ：３Ｘ１ ０’ Ｃｐｓ／μＦ ）。コント
ロールとしてヒトＢ型肝炎ウイルスに対する１！１７−
モノクローナル抗体７８０１ ノｇＧ２ａを用いた。
ーナル抗体１０８の分布 ＫＢ細胞（４Ｘ１０’個）をヌードマウス（５−６週令
）の背部に皮下接種した。１４日後腫瘍が約１．２ｃｍ
の直径に達した時Ｉｌｌ ｌ モノクローナル抗体１０
８を静脈内あるいは腹腔内に注射した（ ｓｘ １ ０
＠Ｃｐｓ：３Ｘ１ ０’ Ｃｐｓ／μＦ ）。コント
ロールとしてヒトＢ型肝炎ウイルスに対する１！１７−
モノクローナル抗体７８０１ ノｇＧ２ａを用いた。
抗体を投与して４日たってから動物を殺して、各種組織
甲の放射活性を側定した。少なくとも各群あたり４匹の
動物の平均を示し島 （第４図ε照）。
甲の放射活性を側定した。少なくとも各群あたり４匹の
動物の平均を示し島 （第４図ε照）。
標識化したモノクローナル抗体１０８の静脈及び腹腔内
への投与では共に抗体は腫瘍部分に集まっていた。コン
トロールｌｇＧの投与の場合静脈内投与では腫瘍部では
何らの濃度もなかったが、腹腔内投与の方では腫瘍の縁
部に少し存在してい總静脈内投与後９６時間での腫瘍部
に蓄積した投与物のパーセンテージはそれぞれモノクロ
ーナル抗体１０８で７．８±１．１１モノクローナル抗
体７８０１（コントロール抗体）で０．８十０．１であ
り、腹腔内投与ではそれぞれモノクローナル抗体１０Ｂ
で７．５＋０．４、モノクローナル抗体７ＥＯ１で１．
８±０．２であった。
への投与では共に抗体は腫瘍部分に集まっていた。コン
トロールｌｇＧの投与の場合静脈内投与では腫瘍部では
何らの濃度もなかったが、腹腔内投与の方では腫瘍の縁
部に少し存在してい總静脈内投与後９６時間での腫瘍部
に蓄積した投与物のパーセンテージはそれぞれモノクロ
ーナル抗体１０８で７．８±１．１１モノクローナル抗
体７８０１（コントロール抗体）で０．８十０．１であ
り、腹腔内投与ではそれぞれモノクローナル抗体１０Ｂ
で７．５＋０．４、モノクローナル抗体７ＥＯ１で１．
８±０．２であった。
実施例■
２４−ウェルプレート中の洗滌され集密的ＭＤＡ−４６
８細胞単層を４℃で２．５時間各種濃度の結合緩衝液（
ＩＭＥＭ、０．１％ Ｂ Ｓ Ａ， ５ ０ ＳＭ Ｅ
ａｐａｓ）中の抗体または非標ＲＥＧＦと共にあるいは
それらなしにインキュペートシ丸〔１重り〕ＥＧＦ（Ｓ
．Ａ．８０−１ ６０ｐＣイ／μノ、！ＣＮＲａｄｉｏ
ｃｈａｍｉｃａｌｓ，ＣＡ）をＰ：濃度１ｓ＆となるよ
う加えた。インキュベーション後、阜ＷＩ細胞を１５１
ＬＭし、浴菌用緩衝液（１０ｍＡｆ｝リス、１ ｍｕ
Ｅ Ｄ Ｔ Ａ， ０． ５ ％ Ｓ ＤＳ，ｐＨ ７
．４ ）でもって可溶化し、放射活性をガンマ線カウン
ター（ Ｌ Ａ Ｂ − Ｐｈａｙｓαｃｉａ）を用い
て測定しｔム４種の抗体すべて標識化したＥＧＦの結合
を阻害することができたが、非特異的なｌ（ＩＧまたは
ＩＱＭは無効であった。細胞の生長を阻害するのに最も
有効であった２棟の抗体（１２５１ＱＭ及び２２５１９
Ｇ）もまたＣ””１：ＥＧＦの結合を阻害するのに最も
効果があった。これらの抗体は非標ＲＥＧＦよりも多く
の程度まで〔Ｉ”ｌ）ＥＧＦの結合を阻害することかで
１−（第１７図参照）冥施例■ ＫＢ細胞を２ＸＩＯ”細胞／皿の濃度でペトリ皿（５０
Ｘ １ ５ ｎＭ”、ｌＶｔｌＮｃ ）甲にまいた。１
６〜２４時間後、培地を、ＥＧＦを含むあるいは含まな
いモノクローナル抗体１０８の天然のものあるいはフラ
グメント化したものの各８１濃度のものを含有する新鮮
なもので置きかえた。６日目Ｋカルチャーを上記の成分
を含有する新鮮な培地に再び植えた。１５日目にＰＢＳ
で洗滌し、４％Ｖ ／ ＶホルムアルデヒドのＰＢＳ液
で１５分間固定し、ヘマトキシリンで染色した。次に形
成されたコロニー数（２５細胞）を測定した。
８細胞単層を４℃で２．５時間各種濃度の結合緩衝液（
ＩＭＥＭ、０．１％ Ｂ Ｓ Ａ， ５ ０ ＳＭ Ｅ
ａｐａｓ）中の抗体または非標ＲＥＧＦと共にあるいは
それらなしにインキュペートシ丸〔１重り〕ＥＧＦ（Ｓ
．Ａ．８０−１ ６０ｐＣイ／μノ、！ＣＮＲａｄｉｏ
ｃｈａｍｉｃａｌｓ，ＣＡ）をＰ：濃度１ｓ＆となるよ
う加えた。インキュベーション後、阜ＷＩ細胞を１５１
ＬＭし、浴菌用緩衝液（１０ｍＡｆ｝リス、１ ｍｕ
Ｅ Ｄ Ｔ Ａ， ０． ５ ％ Ｓ ＤＳ，ｐＨ ７
．４ ）でもって可溶化し、放射活性をガンマ線カウン
ター（ Ｌ Ａ Ｂ − Ｐｈａｙｓαｃｉａ）を用い
て測定しｔム４種の抗体すべて標識化したＥＧＦの結合
を阻害することができたが、非特異的なｌ（ＩＧまたは
ＩＱＭは無効であった。細胞の生長を阻害するのに最も
有効であった２棟の抗体（１２５１ＱＭ及び２２５１９
Ｇ）もまたＣ””１：ＥＧＦの結合を阻害するのに最も
効果があった。これらの抗体は非標ＲＥＧＦよりも多く
の程度まで〔Ｉ”ｌ）ＥＧＦの結合を阻害することかで
１−（第１７図参照）冥施例■ ＫＢ細胞を２ＸＩＯ”細胞／皿の濃度でペトリ皿（５０
Ｘ １ ５ ｎＭ”、ｌＶｔｌＮｃ ）甲にまいた。１
６〜２４時間後、培地を、ＥＧＦを含むあるいは含まな
いモノクローナル抗体１０８の天然のものあるいはフラ
グメント化したものの各８１濃度のものを含有する新鮮
なもので置きかえた。６日目Ｋカルチャーを上記の成分
を含有する新鮮な培地に再び植えた。１５日目にＰＢＳ
で洗滌し、４％Ｖ ／ ＶホルムアルデヒドのＰＢＳ液
で１５分間固定し、ヘマトキシリンで染色した。次に形
成されたコロニー数（２５細胞）を測定した。
第４図はＫＢＩ１ｌｌ胞に及ほ丁増加する設度のＥＧＦ
及びモノクローナル抗体１０８の効果を示している。Ｋ
Ｂａ胞をＥＧＦ（１６０ｎＭ）にさらすと、その成長因
子なしでインキエベートされた細胞に比較して植えた後
１５日して（処理を開始してから１４日後）測定したコ
ロニー数は１５０％まで増加していた。加えてＥＧＦは
ＫＢ細胞のコロニーの大きさを増加させた。同様の芙験
をモノクローナル抗体１０８（１．６μＭ）の存在下行
なうと、細胞のコロニー数はコントロール値の３０％に
まで減少させた。さらに、コロニー数を５０％壇大させ
るような濃度のＥＧＦと共に１００倍過剰量のモノクロ
ーナル抗体１０８ではそのコロニー数ヲコントロール値
の２０％にまで減少させた。
及びモノクローナル抗体１０８の効果を示している。Ｋ
Ｂａ胞をＥＧＦ（１６０ｎＭ）にさらすと、その成長因
子なしでインキエベートされた細胞に比較して植えた後
１５日して（処理を開始してから１４日後）測定したコ
ロニー数は１５０％まで増加していた。加えてＥＧＦは
ＫＢ細胞のコロニーの大きさを増加させた。同様の芙験
をモノクローナル抗体１０８（１．６μＭ）の存在下行
なうと、細胞のコロニー数はコントロール値の３０％に
まで減少させた。さらに、コロニー数を５０％壇大させ
るような濃度のＥＧＦと共に１００倍過剰量のモノクロ
ーナル抗体１０８ではそのコロニー数ヲコントロール値
の２０％にまで減少させた。
同じ条件下では、モノクローナル抗体１０８０Ｆ（αｂ
）；フラグメントではＫＢのコロニー数に何の影響も与
えなかった。しかし、ＥＧＦに対して１００倍過剰な鼠
を用いた時、Ｆ（αｂ）７フラグメントは形成されたコ
ロニーの数Ｋ及ぼすＥＧＦの効果を打ち消すことができ
た（１５０％〜１０３％）。同じ濃度のジニトロフエニ
ルＣＤＩＶＰ）ＩＩＣ対するモノクローナル抗体とのイ
ンキュベートでは形成されたコロニー数に何らの影響も
なかった。（第５図参照）。
）；フラグメントではＫＢのコロニー数に何の影響も与
えなかった。しかし、ＥＧＦに対して１００倍過剰な鼠
を用いた時、Ｆ（αｂ）７フラグメントは形成されたコ
ロニーの数Ｋ及ぼすＥＧＦの効果を打ち消すことができ
た（１５０％〜１０３％）。同じ濃度のジニトロフエニ
ルＣＤＩＶＰ）ＩＩＣ対するモノクローナル抗体とのイ
ンキュベートでは形成されたコロニー数に何らの影響も
なかった。（第５図参照）。
Ｂ．ヌードマウスにおけるモノクローナル抗体１０８及
びＫＢ細胞（２ｘ１ｇｍ）をヌードマウスに皮下注射し
、次に腫瘍細胞の注射の後第１日目から始めて１回また
は数回間隔をおいたモノクローナル抗体１０８の投与を
行なった。
びＫＢ細胞（２ｘ１ｇｍ）をヌードマウスに皮下注射し
、次に腫瘍細胞の注射の後第１日目から始めて１回また
は数回間隔をおいたモノクローナル抗体１０８の投与を
行なった。
腫瘍パラメーターを週に２回カリパスでもって測定し、
その容積を次式に従って計算した： 朧瘍谷積（ｓＡｆ３）一長さＸ輸Ｘ高さ。
その容積を次式に従って計算した： 朧瘍谷積（ｓＡｆ３）一長さＸ輸Ｘ高さ。
側定値を確認するため、動物を殺した時に腫瘍の容積と
腫瘍の重量との相互関係を評価した。
腫瘍の重量との相互関係を評価した。
ヌードマウスにおけるＫＢＩｌａｌ胞の生育の阻止能を
その抗体について測定しｆ４（第６図お照）。腫瘍接種
後第１日目、第５日目、第１２日目及び第１８日目に動
物を工１ｌｋ９のモノクローナル抗体１０８あるいはコ
ントロールのジニトロフエニルに対するモノクローナル
抗体のいずれかを受けた。フラグメントＦ（αｂ）ｌ及
びＦａｂ’は抗体と等価の量投与された。コントロール
のモノクローナル抗体で処理された群と比較してモノク
ローナル抗体１０８で処理された群は顕著に腫瘍の拡大
及び生育を阻害した（７’（０．０１７、スチューデン
トテスト）。Ｆ（αｂ）ｌは腫瘍の生育に影響を及ぼす
ことが見出されたが、全抗体よりも効果が劣っていた＜
ｐ＜ｏ．ｏｓ、第１２日目、第１７日目、第２２日目及
び第２５日目のスチェーデントテスト）。Ｆａｂ’ フ
ラグメントは腫瘍の庄育に何の影響も与えなかった。腫
瘍細胞の江射後第１日目に天然のままのモノクローナル
抗体１０８の２■の１回の投与は、ＭＬｓの接橿後第１
日目、第５日目、第１２日目及び第１８日目にそれぞれ
１ｍｇづつ計４回処理されたものと同じ効果を有してい
ることが見出された。別の実験において、動物を０．６
６ｍｇのＦＣａｂ）ｊフラグメントで１回投与処理した
時、抗腫瘍効果はわずかに劣るけれども、コントロール
群と処理群との間には顕著な差異がＭａｎｎ Ｖ／ｈｉ
ｔｎａｙ分析法（第９日目、第１２日目、第１４日目、
第１７日目でＰ（０．０３）及びスチューデントテスト
＜ａｔｕｄｇｎｔ ｔｅｓｔ ）（第９日目、第
１２日目でＰ＜ｏ．ｏｓ）を用いて見出された。動物を
殺した時に腫瘍は測定され、次Ｋ重量測定のため取り出
された。腫瘍の容積と腫瘍の重量との間の関係係数は０
．９ ５ （ Ｐ（０．０００１）であった。
その抗体について測定しｆ４（第６図お照）。腫瘍接種
後第１日目、第５日目、第１２日目及び第１８日目に動
物を工１ｌｋ９のモノクローナル抗体１０８あるいはコ
ントロールのジニトロフエニルに対するモノクローナル
抗体のいずれかを受けた。フラグメントＦ（αｂ）ｌ及
びＦａｂ’は抗体と等価の量投与された。コントロール
のモノクローナル抗体で処理された群と比較してモノク
ローナル抗体１０８で処理された群は顕著に腫瘍の拡大
及び生育を阻害した（７’（０．０１７、スチューデン
トテスト）。Ｆ（αｂ）ｌは腫瘍の生育に影響を及ぼす
ことが見出されたが、全抗体よりも効果が劣っていた＜
ｐ＜ｏ．ｏｓ、第１２日目、第１７日目、第２２日目及
び第２５日目のスチェーデントテスト）。Ｆａｂ’ フ
ラグメントは腫瘍の庄育に何の影響も与えなかった。腫
瘍細胞の江射後第１日目に天然のままのモノクローナル
抗体１０８の２■の１回の投与は、ＭＬｓの接橿後第１
日目、第５日目、第１２日目及び第１８日目にそれぞれ
１ｍｇづつ計４回処理されたものと同じ効果を有してい
ることが見出された。別の実験において、動物を０．６
６ｍｇのＦＣａｂ）ｊフラグメントで１回投与処理した
時、抗腫瘍効果はわずかに劣るけれども、コントロール
群と処理群との間には顕著な差異がＭａｎｎ Ｖ／ｈｉ
ｔｎａｙ分析法（第９日目、第１２日目、第１４日目、
第１７日目でＰ（０．０３）及びスチューデントテスト
＜ａｔｕｄｇｎｔ ｔｅｓｔ ）（第９日目、第
１２日目でＰ＜ｏ．ｏｓ）を用いて見出された。動物を
殺した時に腫瘍は測定され、次Ｋ重量測定のため取り出
された。腫瘍の容積と腫瘍の重量との間の関係係数は０
．９ ５ （ Ｐ（０．０００１）であった。
Ｃ．腹腔内での鹿瘍の成長
転移形態の犬Ｂ腫瘍を細胞を静脈内（ ＜．ｖ．）に注
射することによって得ることができた。１．５Ｘ１０’
個のＫＢ細胞を注射されたマウスは、その移植後４−６
週間で肺にａ瘍結節を作った。この腫瘍モデルは、腫瘍
細胞で内部器官に浸透していくという臨床上の条件に似
たものである。
射することによって得ることができた。１．５Ｘ１０’
個のＫＢ細胞を注射されたマウスは、その移植後４−６
週間で肺にａ瘍結節を作った。この腫瘍モデルは、腫瘍
細胞で内部器官に浸透していくという臨床上の条件に似
たものである。
このことは癌治療の上での主要の問題点である。ＫＥ細
胞の注射につづいて、その腫瘍の注射の後第６日目、第
９日目及び第１３日目に．５ダのモノクローナル抗体１
０８を計３回静脈内注射した。実験の終りに、肺を取り
出し、４チホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに埋
め込んだ。
胞の注射につづいて、その腫瘍の注射の後第６日目、第
９日目及び第１３日目に．５ダのモノクローナル抗体１
０８を計３回静脈内注射した。実験の終りに、肺を取り
出し、４チホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに埋
め込んだ。
４−５μ鶴の厚さに連続してスライスし、ヘマトキシリ
ンで染色した。肺を通るいろいろな深さの転移性の結節
の数が元顕微鏡検査分析法により得られた。動物が有し
ていた肺の腫瘍から３株の転移性細胞クローンを率離し
、そのレセプターレベルをアツセイし、レセプターの発
現があることがわかった。抗体による処理は肺の腫房の
結節の数を、それぞれのコントロールの１５％に１で減
少させた。（Ｐ＜０．０ ５ ＭａｎｎＪ’ｈｉｔｎａ
ｙ 分析法）。（第８図参照）実施例■ による阻止 １８４ＡＩＮ４及びＭＤＡ − ４ ６ ８細胞を３本
の２４一ウェルプレートのウェルの中に入れ（ ５，０
０ ０／ウェル）、抗体を加える前に付着させておい
た。１８４ＡＩＮ４の生育培地は１ツ／ｒｎｔ ＥＧＦ
及びＥＧＦと共に同時に生育培地中に加えられたいろい
ろな量のＥＧＦＲ抗体を含んでいた。ＭＤＡ−４６８の
生育培地はどんなＥＧＦも含んでいなかった。生育培地
を４８時間後に交換し、４日後に細胞を側定し島生育英
験の最後に細胞をトリブシンーＥＤＴＡでもって収穫し
、Ｐａｒｔｉｃｔａ Ｄａｔαセルカウンター（Ｐａｒ
ｔｉｃｌｅ Ｄａｔａ，ｌｎｃ．．Ｅｌｍｈｓｒｓｔ，
ＩＬ）を用いて副定した。コントロール細胞数％（平
均士ＳＤ）で示した。９６１９Ｍ（●）、４ ２ １ｇ
Ｍ（０）、非特異的なｌｇＭ（△）、２２５１ｇＧ（■
）、１０８ｌｇＧ（口）、非特異的ナノｙＧＣ▲）。（
第１３図参照）。
ンで染色した。肺を通るいろいろな深さの転移性の結節
の数が元顕微鏡検査分析法により得られた。動物が有し
ていた肺の腫瘍から３株の転移性細胞クローンを率離し
、そのレセプターレベルをアツセイし、レセプターの発
現があることがわかった。抗体による処理は肺の腫房の
結節の数を、それぞれのコントロールの１５％に１で減
少させた。（Ｐ＜０．０ ５ ＭａｎｎＪ’ｈｉｔｎａ
ｙ 分析法）。（第８図参照）実施例■ による阻止 １８４ＡＩＮ４及びＭＤＡ − ４ ６ ８細胞を３本
の２４一ウェルプレートのウェルの中に入れ（ ５，０
０ ０／ウェル）、抗体を加える前に付着させておい
た。１８４ＡＩＮ４の生育培地は１ツ／ｒｎｔ ＥＧＦ
及びＥＧＦと共に同時に生育培地中に加えられたいろい
ろな量のＥＧＦＲ抗体を含んでいた。ＭＤＡ−４６８の
生育培地はどんなＥＧＦも含んでいなかった。生育培地
を４８時間後に交換し、４日後に細胞を側定し島生育英
験の最後に細胞をトリブシンーＥＤＴＡでもって収穫し
、Ｐａｒｔｉｃｔａ Ｄａｔαセルカウンター（Ｐａｒ
ｔｉｃｌｅ Ｄａｔａ，ｌｎｃ．．Ｅｌｍｈｓｒｓｔ，
ＩＬ）を用いて副定した。コントロール細胞数％（平
均士ＳＤ）で示した。９６１９Ｍ（●）、４ ２ １ｇ
Ｍ（０）、非特異的なｌｇＭ（△）、２２５１ｇＧ（■
）、１０８ｌｇＧ（口）、非特異的ナノｙＧＣ▲）。（
第１３図参照）。
Ｂ．１８４ＡＩＮ４細胞に対する９６のコロニー阻止ア
ツセイ １８４ＡＩＮ４−Ｔａ胞を０．４％Ｂａｃｔｏ−Ａｇａ
ｒ（Ｄｉｆｃｏ＊Ｄａｔｒｏｉｔ＊Ｍｌ ）、ＩＭＥＭ
％ １ ０％ Ｆｉｌｓ及び処置を宮有する半固体寒天
培地中に懸濁した。細胞を３本の１紅ＩＭＥＭ，０．６
％寒天及び１０％ＦＢＳを含有する３５＋ｉ＋培養皿に
入れた（ １ ０，０ ０ ０個／皿）。１〇一１４日
間３７℃で５％ ＣＯ，中で２０ｎＭ ａＥＧＦＲまた
は２０ｎＭ非特異的な抗体の存在下そしてＥＧＦの濃度
を大きくしながらその皿をインキユペートした。６０μ
常より大きなコロニーの数を平均（±．５ＬＪ）で示し
た。Ａ）ノＩＧ：２２５ １ＱＧ（Ｋｎ）、ｌｏ８１
ｙＧＣＯ）、非特異的な１ｇＧ（Δ）。 Ｅ） Ｉｇ
Ｍ： ９６１１ＭＣＯ）、 ４ ２ １１Ｍ（●）、
非特異的なＩｇＭ（△）。直径が６０μ溝より大きな細
胞のコロニーｋＺＢａｕｓｃｈ ＆ Ｌｏｎｈｂコロニ
ーカウンターヲ用イて側定した。（第１５図参照） セイ ＭＤＡ−４６８細胞を０．４％ Ｂａｃｔｏ−Ａｇａｒ
（Ｄ９ｃｏ＊Ｄｏｔデｏｉｔ．ＭＩ）、ノＭＥＮ，ＩＯ
％ＦＢＳ及び処置を含有する半固体寒天培地中に懸濁し
島細胞を３本の１ｍｚノＭＥＮ、０．６％寒天及び１０
％ＦＢＳを含有する３５龍培養皿中に入れた（ １ ０
，０ ０ ０個／皿）。１０−１４日間３７℃で５％
ＣＯ！中で２０ｎＭ ａＥＧＦＲ １たｋｔ２０ｎＭ非
特異的な抗体の存在下そしてＥＧＦの濃度を大きくしな
がらその皿をインキユペートした。６０μ倶より大きな
コロニーの数を平均（±ＳＤ）で示した。
ツセイ １８４ＡＩＮ４−Ｔａ胞を０．４％Ｂａｃｔｏ−Ａｇａ
ｒ（Ｄｉｆｃｏ＊Ｄａｔｒｏｉｔ＊Ｍｌ ）、ＩＭＥＭ
％ １ ０％ Ｆｉｌｓ及び処置を宮有する半固体寒天
培地中に懸濁した。細胞を３本の１紅ＩＭＥＭ，０．６
％寒天及び１０％ＦＢＳを含有する３５＋ｉ＋培養皿に
入れた（ １ ０，０ ０ ０個／皿）。１〇一１４日
間３７℃で５％ ＣＯ，中で２０ｎＭ ａＥＧＦＲまた
は２０ｎＭ非特異的な抗体の存在下そしてＥＧＦの濃度
を大きくしながらその皿をインキユペートした。６０μ
常より大きなコロニーの数を平均（±．５ＬＪ）で示し
た。Ａ）ノＩＧ：２２５ １ＱＧ（Ｋｎ）、ｌｏ８１
ｙＧＣＯ）、非特異的な１ｇＧ（Δ）。 Ｅ） Ｉｇ
Ｍ： ９６１１ＭＣＯ）、 ４ ２ １１Ｍ（●）、
非特異的なＩｇＭ（△）。直径が６０μ溝より大きな細
胞のコロニーｋＺＢａｕｓｃｈ ＆ Ｌｏｎｈｂコロニ
ーカウンターヲ用イて側定した。（第１５図参照） セイ ＭＤＡ−４６８細胞を０．４％ Ｂａｃｔｏ−Ａｇａｒ
（Ｄ９ｃｏ＊Ｄｏｔデｏｉｔ．ＭＩ）、ノＭＥＮ，ＩＯ
％ＦＢＳ及び処置を含有する半固体寒天培地中に懸濁し
島細胞を３本の１ｍｚノＭＥＮ、０．６％寒天及び１０
％ＦＢＳを含有する３５龍培養皿中に入れた（ １ ０
，０ ０ ０個／皿）。１０−１４日間３７℃で５％
ＣＯ！中で２０ｎＭ ａＥＧＦＲ １たｋｔ２０ｎＭ非
特異的な抗体の存在下そしてＥＧＦの濃度を大きくしな
がらその皿をインキユペートした。６０μ倶より大きな
コロニーの数を平均（±ＳＤ）で示した。
Ａ） １ＱＧ： ２ ２ ５ ｊＱＧ（●）
、 １ ０ ８ ノｙＧ（Δ）、非砕芋異的なノｙＧ
ｃ▲）、ＥＧＦ単独（０）。Ｂ） ｌｙＭ ： ９ ６
ｔｇｍ（Δ）、４２ノｒｔＭ（●）、非特異的なノｙ
Ｍｃ▲）、ＥＧＦ単独（０）。直径が６０μ鴬より大き
な細胞のコロニーはＢａｔ＆ｓｅ：ｈ ＆ Ｌｏｔｙ＋
ｂコロニーカウンターを用いて測定した。
、 １ ０ ８ ノｙＧ（Δ）、非砕芋異的なノｙＧ
ｃ▲）、ＥＧＦ単独（０）。Ｂ） ｌｙＭ ： ９ ６
ｔｇｍ（Δ）、４２ノｒｔＭ（●）、非特異的なノｙ
Ｍｃ▲）、ＥＧＦ単独（０）。直径が６０μ鴬より大き
な細胞のコロニーはＢａｔ＆ｓｅ：ｈ ＆ Ｌｏｔｙ＋
ｂコロニーカウンターを用いて測定した。
（第１６図参照）。
実施例■
ＫＢ細胞を注射して皮下に腫瘍をつくった。腫瘍を注射
した後２４時間目及び３−４日の間隔を置いて３回，０
．４５〜のモノクローナル抗体１０８と３７．５μノの
ドキソルビシン（アドリアマイシン）を計４回投与した
。ＭＡ瘍の容積をコントロールと比較した：リン酸塩緩
衝液、抗体単独あるいは楽剤単独。（第９図参照） モノクローナル抗体１０８のシスプラチンと共に投与し
た場仕の有用性 ａ） １．８’ｎ９のモノクローナル抗体１０８及び
１００Ｑシスプラチンでもって皮下に２ＸｌＯ”個のＫ
Ｂ細胞を接種後２４時間して１回投与処理した。結果を
第ｌＯ図に示す。
した後２４時間目及び３−４日の間隔を置いて３回，０
．４５〜のモノクローナル抗体１０８と３７．５μノの
ドキソルビシン（アドリアマイシン）を計４回投与した
。ＭＡ瘍の容積をコントロールと比較した：リン酸塩緩
衝液、抗体単独あるいは楽剤単独。（第９図参照） モノクローナル抗体１０８のシスプラチンと共に投与し
た場仕の有用性 ａ） １．８’ｎ９のモノクローナル抗体１０８及び
１００Ｑシスプラチンでもって皮下に２ＸｌＯ”個のＫ
Ｂ細胞を接種後２４時間して１回投与処理した。結果を
第ｌＯ図に示す。
ｂ）膿瘍の移植後２０時間目に１．９■のモノクローナ
ル抗体１０８と０．１μノのシスプラテンを別々の注射
器で静脈内に１回投与処理した。配合治療の場会にはそ
れぞれのもの単独による治療に比して顕著に優れていた
（Ｐ（０．０２、スチューデントテスト、Ｐ＜ｏ．ｏ
Ｏ ７ Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｍｓｙ分析法〕。（第］ｌ
図参照）
ル抗体１０８と０．１μノのシスプラテンを別々の注射
器で静脈内に１回投与処理した。配合治療の場会にはそ
れぞれのもの単独による治療に比して顕著に優れていた
（Ｐ（０．０２、スチューデントテスト、Ｐ＜ｏ．ｏ
Ｏ ７ Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｍｓｙ分析法〕。（第］ｌ
図参照）
第１図はモノクローナル抗体ｌｏ８のＦ（αｂ）ｌ及び
Ｆ（ａｈ）調製物のドデシル硫酸ナトリウム＜ＳＵＳ）
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す。非還元条件下
でゲル泳動はなされた。α）未処理モノクローナル抗体
１０８、ｂ）未精製Ｆ（αｂ）ｌフラグメン｝．９！ｌ
裂物、Ｃ）精製Ｆ（ａｂ＞７ ， ｄ） Ｆａｂ ７
ラグメント、リ分子量マーカーＫＤ０ 第２図はＫＢ細胞への１１１１モノクローナル抗体１０
８及びそのフラグメントとＥＧＦとの競合結合を示す。 ＫＢ細胞は３ｘ１０−”ＡｆｏｌハＩモノクローナル抗
体（ｌｘ１ ０ ’ ６ ｐｖｈ／ａｌｊ ） （’）
存在下、異ナ’：）だ’ｌｌｋＦｌｆ） Ｅ Ｇ Ｆ
（ ＠ ）、非標識モノクローナル抗体１０８（０）、
そのＦ（αｂ）Ｉ，フラグメント（▲）あるいはＦａｂ
’フラグメント（■）の存在下に培養した。（３個の独
文した測定値の平均）。 第３図はモノクローナル抗体１０８のＫ．ＢｌｆＡ胞へ
の結合をセルソーター分析したものである。 第４図はヌードマウスに移植されたＡＢ＠胞に対する１
１５７モノクローナル抗体１０８の付着を示す。 第５図はＫＢ細胞のコロニー形成におけるＥＧＦ及びモ
ノクローナル抗体１０８の及ぼす効果を示す。コロニー
形成のアツ七イは実施例に記載されているようＫして異
なつた濃度のＥＧＦ（●）及びモノクローナル抗体１０
８（■）の存在下Ｋ行われ瓢 第６図は、ヌードマウスに移植されたＫＢ細胞に対する
モノクローナル抗体１０８及びそのフラグメントの抗腫
瘍活性を示している。各群は少なくとも６匹のマウスか
らなっていヘマウスは雑瘍の接種の後第１日目、第５日
目、第１２日目及び第１８日目にその静脈内に、１ηの
モノクローナル抗体１０８（−）、１１ｎ９０ＤＮＰに
対するモノクローナル抗体（０）、０．６６１９のモノ
クローナル抗体１０８０Ｆ（αｂ）１％フラグメント（
▲）、あるいはＦａｂ’ フラグメント（◆）を投与
して処理された。また、臘瘍細胞を注射した後１日に２
■のモノクローナル抗体１０８で１回処理した（●）。 第７図はヌードマウスの腹腔内に移植されたＫＢＩＩｊ
ＪＪ胞に対する１ ０ ８ ｍＡｂの抗朧瘍活性を示す
ものである。７匹のマウスは腫瘍の接種の後第１日目、
第４日目及び第７日目にその静脈内にｏ．ｓａ９のモノ
クローナル抗体１０８（−−−）またはＤＮＰに対する
抗体（８匹のマウス）を投与して処理され島 ＷＪｓ図はヌードマウスの静脈内に注射されたＫＢ細胞
に対する１０８％Ａｈの抗腫瘍活性を示すものである。 Ｃ）微小転移巣を示しているｌ．５Ｘ１０’個のＫＢ細
胞を静脈内に注射した後６日後の肺の組織：ｘ２ｓｏ倍
。ｂ）マウスは腫瘍の接種後第６日目、第９日目及び第
１３日目に０．５ダのモノクローナル抗体１０ｇを静脈
内投与されて処置された。それぞれの点は、動物の肺を
通して異なった深さで採取された一連の部分の分析を示
している。 第９図は、反下に移植されたＫＢＩ１１１胞に対する１
０８ｔｎＡｂのドキソルビシンと組み合わせた場合の抗
腫瘍活性を示している。０．４５〜のモノクローナル抗
体１０８と３７．５μノのドキソルピシンを４回すなわ
ち、腫瘍の注入後２４時間して及び３〜４日の間隔をお
いて３回これを繰り返して投与した。 第ｌＯ図及び第１１図は皮下に移植されたＫＢ細胞に対
する１０８ｓＡｂのシスプラチンと組み合わせた場合の
抗豚瘍活性を示している。第ｌＯ図においては１６８タ
のモノクローナル抗体１０８及び１００μノのシスプラ
チンを含有するもので１回投与処置されへ第１１図では
、マウスは腫瘍の移植後２０時間して１回、静脈内に、
１９ｒＲ９のモノクローナル抗体１０８及び０．１Ｍｇ
のクスプラテン（ Ａｉｃ ，Ｒａ館ローＧａｔＬ ＊
ノ１デα−ｌ）を投与処理された。各物質は別々に注射
された。ＰＢＳ（●）、モノクローナル抗体（▲）、シ
スプラチン（■〕、及びモノクローナル抗体＋シスプラ
チン（◆）。 第１２図は細胞の生育に及ぼすＥＧＦの効果を示してぃ
る。Ａ）１８４ＡＩＮ４細胞。Ｂ）ＭＤＡ−４６８細胞
。 １８４，４ｌ／Ｖ４［胞は３本の２４−ウェルプレート
のウェルに入れられ（ ５，０ ０ ０個／ウェル）、
ＥＧＦを加えられた。ＭＤＡ−４６８細胞は３本の２４
−ウェルプレートのウェルに入れられ（ ｓ，ｏ ｏ
ｏ個／クエル）、１晩付着させておかれた。次の日にＥ
ＧＦを加えた。培地を４８時間後に交換し、４日後に細
胞を数えた。平均（±ＳＤ）細胞数を示し瓢 第１３図は、付着依存性の細胞の生育の抗一ＥＧＦレセ
プター抗体（ａＥＧＰＲ）の阻害を示すものである。１
８４Ａ １ １Ｖ ４＃ｌ胞（Ａ及びＢ）及びＭＤＡ−
４６８ｍＵ（ Ｃ及びＤ）は３本の２４−クエルプレー
トのウェルに入れられ（ ５，０ ０ ０個／クエル）
、抗体を加える前に付着させておかれた。１８４ＡＩＮ
４の生育培地はｌｓＰ／ＩＬｔのＥＧＦを含有してい−
／，．４８時間後生育培地を交換し、４日後に細胞を数
えた。細胞数（平均士ＳＤ）のコントロールＫ対するチ
を示した。９６ ノｙＭ（●）、４’ｌｌＱＭ（○）、
非特異的なＩＱＭ（Δ）、２２５１ＱＧ（■）、１０８
７ｇＧ（口）、非特異的なＩＱＧ（▲）。 第１４図は、ＥＧＦによる付着依存性の細胞の生育のａ
Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ阻害の逆転を示すものである。細胞は
３本の２４−ウェルプレートのウェルの中に入れられた
（ ５．０ ０ ０個／ウェル）。１８４Ａｘｓ４細Ｒ
＜Ａ及びＢ）はＥＧＦ及び抗体を加える前にＥＧＦを含
まない培地中で４時間付着させておかれた。ＭＤＡ−４
６８細胞（Ｃ及びＤ）は一晩置いておかれた。抗体を２
０ｎＨの終濃度となるように加えた。培地を４８時間後
交換し、４日後に細胞を数えた。細胞数を平均（±ＳＤ
）で示した。９５１９Ｍ（●）、４’ｌｌ（ＩＭ（○）
、非特異的なノｙＭｃΔ冫、２２５ノｇＧ（■）、１０
８１ｇＧＣ口）、非特異的なＩＱＧ（Δ）。 第１５図はモノクローナルａＥＧＦＲによる１８４，｛
１Ｎ４−Ｔのコロニー形成の阻害な示丁ものである。細
胞は実施例■ＣＢ）に記載したように軟寒天中で、２Ｑ
．Ｍ ．ＥＧＦＲまたは２０ｎＭ非特異的な抗体の存
在下ＥＧＦ濃度を増大させながら生育させた。６０μ偽
より大きいコロニーの数を平均（±ＳＤ）で示しｐ４Ａ
） ！ＱＧ：２２５ノｙＧ（●）、ｌ０８１ｇＧ（○
）、非特異的なＩ（；ＩＧ（Δ）。Ｂ）ＩｇＭ：９６
１９ＭＣＯ）、４２１９Ｍ（●）、非特異的な！ＱＭ（
Δ）。 第１６図はＭＤＡ−４６８コロニーの形成に及ぼすａ
Ｅ Ｇ Ｆ Ｒの効果を示すものである。細胞は実施例
■（Ｃ）に記載したように軟寒天中で、２０ｎＭのａＥ
ＧＦＲ１たは非特異的な抗体の存在下ＥＧＦ＠度を増大
させながら生育させへ細胞はまたＥＧＦ単独下でも生育
させた。６０μ慣より大きいコロニーの数を平均（±Ｓ
Ｄ）で示した。 Ａ） ｔｇｃ； ： ２ ２ ｓ ＩｇＧｃ●）、１
０８１ｙＧＣ△）、非特異的なノｙＧｃ▲）、ＥＧＦ単
独（０）。Ｂ）ＩＱＭ：９６ノＱＭ（Δ）、４ ２ １
９Ｍ（●）、非特異的なＩｇＭ（▲）、ＥＧＦ単独（○
）。 第１７図は、ｕＤＡ−４６８Ｍ胞に結合する（ｌｆｆｉ
ｆｉ７１ＥＧＦに及ぼすαＥＧＦＨの効果を示すもので
ある。２４−ウェルプレート中の集密的ＭＤＡ−４６８
細胞をヨウ素化したＥＧＦ（１ｎＭ）及び非標職抗体ま
たはＥＧＦの漠・度を大きくしながら２．５時間４℃で
インキエベートした。 ２ｆたは３つの別々の実験からの二つの１１１１１定の
平均（士ＳＤ）を示した。Ａ）２２５ノｙＧ（Δ）、ｌ
０８１ｇＧ（◇）、非特異的なＩＱＧ（）、ＥＧＦ標準
（●）。Ｂ）ノＱＭ： ９６ １１Ｍ（●）、４ ２
１９Ｍ（△）、非特異的なＪ（；ＩＭ（▼）、ＥＧＦ．
−ｆｉ準（０）．図面の浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ． ２ １度（ｍｏｌｅ／Ｉ） ＦＩＧ． ５ ＦＩＧ．４ ＦＩＧ．７ ２ｏ 時間（日） ＦＩＧ．９ 腫瘍移植後の時間（日） Ｆ１α，８ｋＩ ＥＧＦ （ｒ＋鯖》 ＦＩＧ． １３ ＬｇＭ（ｎＭｌ ＬｑＭ ＴｎＭ＋ １０８． ４Ｍａｂ，ｃ ｉ ｓ−ＤＤＰ及びそれらの配合物の効
果腫瘍移植後の時間（日） ＦＩＧ．１０ 腫瘍生育日数 ＦＩＧ．Ｉｌ コロニー 細胞数 （翼１０−３１ 〜 Ａ の ｏ ｏ ｏ ロ 一 〜 ＣｉｌＡＣｊｌ ｏｏｏｏｏｏ ＦＩＧ． １７ リガンド濃度 （ｎＭｌ ＦＩＧ． １６ ＥＧＦｌｎＭ） 手続補正書 平成１年１０月２５日 手続補正書 平成２年５月１７日 特許庁長官 吉 田 文 毅 殿 １事件の表示 平成１年特許願第２３７３９４号 ２．発明の名称 特許庁長官 吉 田 文 教 殿 １．事件の表示 平成１年特許願第２３７３９７号 ２．発明の名称 ３補正をする者 事件との関係
Ｆ（ａｈ）調製物のドデシル硫酸ナトリウム＜ＳＵＳ）
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す。非還元条件下
でゲル泳動はなされた。α）未処理モノクローナル抗体
１０８、ｂ）未精製Ｆ（αｂ）ｌフラグメン｝．９！ｌ
裂物、Ｃ）精製Ｆ（ａｂ＞７ ， ｄ） Ｆａｂ ７
ラグメント、リ分子量マーカーＫＤ０ 第２図はＫＢ細胞への１１１１モノクローナル抗体１０
８及びそのフラグメントとＥＧＦとの競合結合を示す。 ＫＢ細胞は３ｘ１０−”ＡｆｏｌハＩモノクローナル抗
体（ｌｘ１ ０ ’ ６ ｐｖｈ／ａｌｊ ） （’）
存在下、異ナ’：）だ’ｌｌｋＦｌｆ） Ｅ Ｇ Ｆ
（ ＠ ）、非標識モノクローナル抗体１０８（０）、
そのＦ（αｂ）Ｉ，フラグメント（▲）あるいはＦａｂ
’フラグメント（■）の存在下に培養した。（３個の独
文した測定値の平均）。 第３図はモノクローナル抗体１０８のＫ．ＢｌｆＡ胞へ
の結合をセルソーター分析したものである。 第４図はヌードマウスに移植されたＡＢ＠胞に対する１
１５７モノクローナル抗体１０８の付着を示す。 第５図はＫＢ細胞のコロニー形成におけるＥＧＦ及びモ
ノクローナル抗体１０８の及ぼす効果を示す。コロニー
形成のアツ七イは実施例に記載されているようＫして異
なつた濃度のＥＧＦ（●）及びモノクローナル抗体１０
８（■）の存在下Ｋ行われ瓢 第６図は、ヌードマウスに移植されたＫＢ細胞に対する
モノクローナル抗体１０８及びそのフラグメントの抗腫
瘍活性を示している。各群は少なくとも６匹のマウスか
らなっていヘマウスは雑瘍の接種の後第１日目、第５日
目、第１２日目及び第１８日目にその静脈内に、１ηの
モノクローナル抗体１０８（−）、１１ｎ９０ＤＮＰに
対するモノクローナル抗体（０）、０．６６１９のモノ
クローナル抗体１０８０Ｆ（αｂ）１％フラグメント（
▲）、あるいはＦａｂ’ フラグメント（◆）を投与
して処理された。また、臘瘍細胞を注射した後１日に２
■のモノクローナル抗体１０８で１回処理した（●）。 第７図はヌードマウスの腹腔内に移植されたＫＢＩＩｊ
ＪＪ胞に対する１ ０ ８ ｍＡｂの抗朧瘍活性を示す
ものである。７匹のマウスは腫瘍の接種の後第１日目、
第４日目及び第７日目にその静脈内にｏ．ｓａ９のモノ
クローナル抗体１０８（−−−）またはＤＮＰに対する
抗体（８匹のマウス）を投与して処理され島 ＷＪｓ図はヌードマウスの静脈内に注射されたＫＢ細胞
に対する１０８％Ａｈの抗腫瘍活性を示すものである。 Ｃ）微小転移巣を示しているｌ．５Ｘ１０’個のＫＢ細
胞を静脈内に注射した後６日後の肺の組織：ｘ２ｓｏ倍
。ｂ）マウスは腫瘍の接種後第６日目、第９日目及び第
１３日目に０．５ダのモノクローナル抗体１０ｇを静脈
内投与されて処置された。それぞれの点は、動物の肺を
通して異なった深さで採取された一連の部分の分析を示
している。 第９図は、反下に移植されたＫＢＩ１１１胞に対する１
０８ｔｎＡｂのドキソルビシンと組み合わせた場合の抗
腫瘍活性を示している。０．４５〜のモノクローナル抗
体１０８と３７．５μノのドキソルピシンを４回すなわ
ち、腫瘍の注入後２４時間して及び３〜４日の間隔をお
いて３回これを繰り返して投与した。 第ｌＯ図及び第１１図は皮下に移植されたＫＢ細胞に対
する１０８ｓＡｂのシスプラチンと組み合わせた場合の
抗豚瘍活性を示している。第ｌＯ図においては１６８タ
のモノクローナル抗体１０８及び１００μノのシスプラ
チンを含有するもので１回投与処置されへ第１１図では
、マウスは腫瘍の移植後２０時間して１回、静脈内に、
１９ｒＲ９のモノクローナル抗体１０８及び０．１Ｍｇ
のクスプラテン（ Ａｉｃ ，Ｒａ館ローＧａｔＬ ＊
ノ１デα−ｌ）を投与処理された。各物質は別々に注射
された。ＰＢＳ（●）、モノクローナル抗体（▲）、シ
スプラチン（■〕、及びモノクローナル抗体＋シスプラ
チン（◆）。 第１２図は細胞の生育に及ぼすＥＧＦの効果を示してぃ
る。Ａ）１８４ＡＩＮ４細胞。Ｂ）ＭＤＡ−４６８細胞
。 １８４，４ｌ／Ｖ４［胞は３本の２４−ウェルプレート
のウェルに入れられ（ ５，０ ０ ０個／ウェル）、
ＥＧＦを加えられた。ＭＤＡ−４６８細胞は３本の２４
−ウェルプレートのウェルに入れられ（ ｓ，ｏ ｏ
ｏ個／クエル）、１晩付着させておかれた。次の日にＥ
ＧＦを加えた。培地を４８時間後に交換し、４日後に細
胞を数えた。平均（±ＳＤ）細胞数を示し瓢 第１３図は、付着依存性の細胞の生育の抗一ＥＧＦレセ
プター抗体（ａＥＧＰＲ）の阻害を示すものである。１
８４Ａ １ １Ｖ ４＃ｌ胞（Ａ及びＢ）及びＭＤＡ−
４６８ｍＵ（ Ｃ及びＤ）は３本の２４−クエルプレー
トのウェルに入れられ（ ５，０ ０ ０個／クエル）
、抗体を加える前に付着させておかれた。１８４ＡＩＮ
４の生育培地はｌｓＰ／ＩＬｔのＥＧＦを含有してい−
／，．４８時間後生育培地を交換し、４日後に細胞を数
えた。細胞数（平均士ＳＤ）のコントロールＫ対するチ
を示した。９６ ノｙＭ（●）、４’ｌｌＱＭ（○）、
非特異的なＩＱＭ（Δ）、２２５１ＱＧ（■）、１０８
７ｇＧ（口）、非特異的なＩＱＧ（▲）。 第１４図は、ＥＧＦによる付着依存性の細胞の生育のａ
Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ阻害の逆転を示すものである。細胞は
３本の２４−ウェルプレートのウェルの中に入れられた
（ ５．０ ０ ０個／ウェル）。１８４Ａｘｓ４細Ｒ
＜Ａ及びＢ）はＥＧＦ及び抗体を加える前にＥＧＦを含
まない培地中で４時間付着させておかれた。ＭＤＡ−４
６８細胞（Ｃ及びＤ）は一晩置いておかれた。抗体を２
０ｎＨの終濃度となるように加えた。培地を４８時間後
交換し、４日後に細胞を数えた。細胞数を平均（±ＳＤ
）で示した。９５１９Ｍ（●）、４’ｌｌ（ＩＭ（○）
、非特異的なノｙＭｃΔ冫、２２５ノｇＧ（■）、１０
８１ｇＧＣ口）、非特異的なＩＱＧ（Δ）。 第１５図はモノクローナルａＥＧＦＲによる１８４，｛
１Ｎ４−Ｔのコロニー形成の阻害な示丁ものである。細
胞は実施例■ＣＢ）に記載したように軟寒天中で、２Ｑ
．Ｍ ．ＥＧＦＲまたは２０ｎＭ非特異的な抗体の存
在下ＥＧＦ濃度を増大させながら生育させた。６０μ偽
より大きいコロニーの数を平均（±ＳＤ）で示しｐ４Ａ
） ！ＱＧ：２２５ノｙＧ（●）、ｌ０８１ｇＧ（○
）、非特異的なＩ（；ＩＧ（Δ）。Ｂ）ＩｇＭ：９６
１９ＭＣＯ）、４２１９Ｍ（●）、非特異的な！ＱＭ（
Δ）。 第１６図はＭＤＡ−４６８コロニーの形成に及ぼすａ
Ｅ Ｇ Ｆ Ｒの効果を示すものである。細胞は実施例
■（Ｃ）に記載したように軟寒天中で、２０ｎＭのａＥ
ＧＦＲ１たは非特異的な抗体の存在下ＥＧＦ＠度を増大
させながら生育させへ細胞はまたＥＧＦ単独下でも生育
させた。６０μ慣より大きいコロニーの数を平均（±Ｓ
Ｄ）で示した。 Ａ） ｔｇｃ； ： ２ ２ ｓ ＩｇＧｃ●）、１
０８１ｙＧＣ△）、非特異的なノｙＧｃ▲）、ＥＧＦ単
独（０）。Ｂ）ＩＱＭ：９６ノＱＭ（Δ）、４ ２ １
９Ｍ（●）、非特異的なＩｇＭ（▲）、ＥＧＦ単独（○
）。 第１７図は、ｕＤＡ−４６８Ｍ胞に結合する（ｌｆｆｉ
ｆｉ７１ＥＧＦに及ぼすαＥＧＦＨの効果を示すもので
ある。２４−ウェルプレート中の集密的ＭＤＡ−４６８
細胞をヨウ素化したＥＧＦ（１ｎＭ）及び非標職抗体ま
たはＥＧＦの漠・度を大きくしながら２．５時間４℃で
インキエベートした。 ２ｆたは３つの別々の実験からの二つの１１１１１定の
平均（士ＳＤ）を示した。Ａ）２２５ノｙＧ（Δ）、ｌ
０８１ｇＧ（◇）、非特異的なＩＱＧ（）、ＥＧＦ標準
（●）。Ｂ）ノＱＭ： ９６ １１Ｍ（●）、４ ２
１９Ｍ（△）、非特異的なＪ（；ＩＭ（▼）、ＥＧＦ．
−ｆｉ準（０）．図面の浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ． ２ １度（ｍｏｌｅ／Ｉ） ＦＩＧ． ５ ＦＩＧ．４ ＦＩＧ．７ ２ｏ 時間（日） ＦＩＧ．９ 腫瘍移植後の時間（日） Ｆ１α，８ｋＩ ＥＧＦ （ｒ＋鯖》 ＦＩＧ． １３ ＬｇＭ（ｎＭｌ ＬｑＭ ＴｎＭ＋ １０８． ４Ｍａｂ，ｃ ｉ ｓ−ＤＤＰ及びそれらの配合物の効
果腫瘍移植後の時間（日） ＦＩＧ．１０ 腫瘍生育日数 ＦＩＧ．Ｉｌ コロニー 細胞数 （翼１０−３１ 〜 Ａ の ｏ ｏ ｏ ロ 一 〜 ＣｉｌＡＣｊｌ ｏｏｏｏｏｏ ＦＩＧ． １７ リガンド濃度 （ｎＭｌ ＦＩＧ． １６ ＥＧＦｌｎＭ） 手続補正書 平成１年１０月２５日 手続補正書 平成２年５月１７日 特許庁長官 吉 田 文 毅 殿 １事件の表示 平成１年特許願第２３７３９４号 ２．発明の名称 特許庁長官 吉 田 文 教 殿 １．事件の表示 平成１年特許願第２３７３９７号 ２．発明の名称 ３補正をする者 事件との関係
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ヒトＥＧＦレセプターの発現及びヒトＥＧＦによる
細胞分裂刺激により特徴づけられたヒト腫瘍細胞の生育
を阻止し、該腫瘍細胞のヒトＥＧＦレセプターの細胞外
のドメインに結合し、そして該細胞のヒトＥＧＦレセプ
ターの細胞外のドメインに結合して抗原−抗体複合体と
なることによりヒト口部類表皮癌（ＫＢ）細胞またはヒ
ト乳房上皮細胞（１８４）の生育を阻止することのでき
るモノクローナル抗体。 ２、該抗体がハイブリドーマセルラインＡＴＣＣ ＨＢ
９７６４によつて産生された１０８であるか、あるいは
該抗体がハイブリドーマセルラインＡＴＣＣ ＨＢ９７
６３によつて産生された９６である請求項１に記載のモ
ノクローナル抗体。 ３、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマセルライン。 ４、（ｉ）マウスをヒトＥＧＦレセプターを発現する細
胞で免疫し； （ｉｉ）該マウスから脾臓を取り出し、脾臓細胞の懸濁
物を作成し； （ｉｉｉ）融合促進剤の存在下該脾臓細胞とマウスミエ
ローマ細胞とを融合せしめ； （ｉｖ）融合しなかつたミエローマ細胞が生育できない
培地を含む分離ウェル中で融合細胞を希釈培養し；（ｖ
）ハイブリドーマを含有する各ウェル中の上清液中のヒ
トＥＧＦレセプターに対する抗体の存在を測定し；（ｖ
ｉ）ヒトＥＧＦレセプターの細胞外のドメインに結合す
る抗体を産生するハイブリドーマを選別しクローン化し
； そして （ｖｉｉ）該クローン上にある上清液から抗体を回収す
る工程からなることを特徴とする ヒトＥＧＦレセプターの細胞外のドメインに結合して抗
原−抗体複合体となり、そしてヒトＥＧＦレセプターを
発現すると共にＥＧＦにより細胞分裂刺激を受けるヒト
癌細胞の生育を阻止することのできるモノクローナル抗
体の製造方法。 ５、該工程（ｖｉｉ）が省かれそして該方法はさらに（
ｖｉｉ）該クローンをマウス腹腔内に移植し；（ｉｘ）
該マウスから腫瘍化した腹水または血清を採取し、そし
て該腹水または血清が所望の抗体を含んでいる工程から
なる請求項４に記載の方法。 ６、ヒトＥＧＦレセプターを発現すると共にヒトＥＧＦ
により細胞分裂刺激を受けるヒト腫瘍細胞の生育を阻止
しうるモノクローナル抗体を有効成分として含有する抗
腫瘍剤。 ７、該抗体が該細胞のヒトＥＧＦレセプターの細胞外の
ドメインに結合して抗原−抗体複合体となることにより
ヒト口部類表皮癌（ＫＢ）細胞またはヒト乳房上皮細胞
（１８４）の生育を阻止することができることにより特
徴づけられるものである請求項６に記載の抗腫瘍剤。 ８、該モノクローナル抗体がハイブリドーマセルライン
ＡＴＣＣ ＨＢ９７６４によつて産生された１０８であ
るか、あるいは該モノクローナル抗体がハイブリドーマ
セルラインＡＴＣＣ ＨＢ９７６３によつて産生された
９６である請求項６または７に記載の抗腫瘍剤。 ９、さらに抗新生物形成剤を含有している請求項６〜８
のうちのいずれか一つに記載の抗腫瘍剤。 １０、該新生物形成剤がドキソルビシンまたはシスプラ
チンである請求項９に記載の抗腫瘍剤。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US24473788A | 1988-09-15 | 1988-09-15 | |
| US244737 | 1988-09-15 | ||
| US31910989A | 1989-03-03 | 1989-03-03 | |
| US319109 | 1989-03-03 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001243418A Division JP3732426B2 (ja) | 1988-09-15 | 2001-08-10 | 抗腫瘍剤と共にモノクローナル抗体を用いた治療剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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